CN116874591A - 用于产生针对肽-mhc复合物的治疗性抗体的经过基因修饰的非人动物、其制造方法和用途 - Google Patents

用于产生针对肽-mhc复合物的治疗性抗体的经过基因修饰的非人动物、其制造方法和用途 Download PDF

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Abstract

利用编码人或人源化MHC分子或缔合的分子，例如β2微球蛋白的序列对非人动物进行基因修饰，并且所述非人动物对所述序列的表达诱导对从中获得所述人或人MHC分子的相应人HLA的耐受性。当此类HLA呈递对非人动物来说具有抗原性的肽时，这些非人动物所展示的耐受性允许这些动物对相应人HLA产生特异性抗体应答。特异性靶向所关注的pMHC复合物并且不结合于MHC分子的此类抗体应答可用于靶向免疫突触的组分的免疫治疗模态中，这提供了相互作用的特异性。

Description

用于产生针对肽-MHC复合物的治疗性抗体的经过基因修饰的 非人动物、其制造方法和用途
本申请是申请号为201980021918.5、申请日为2019年3月22日、发明名称为“用于产生针对肽-MHC复合物的治疗性抗体的经过基因修饰的非人动物、其制造方法和用途”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2019/023609的国家阶段申请，该国际申请要求以下美国临时专利申请号的优先权权益：2018年3月24日提交的第62/647,720号及2018年3月24日提交的第62/647,724号，每个申请以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本文公开了进行基因修饰的非人动物(例如啮齿动物(例如大鼠、小鼠等))，其耐受人(源化)MHC分子(例如但不限于空人(源化)MHC分子)，或者其肽结合部分(例如MHC分子的肽结合槽)，以使得当人(源化)MHC分子呈递对非人动物来说是外来物的肽或者与肽复合时，例如当人(源化)MHC分子为肽/MHC(pMHC)复合物的一部分时非人动物可对人(源化)MHC分子产生稳固的B细胞应答，其中所述肽对非人动物来说是异源的。此类动物可用于产生针对病原性pMHC复合物的治疗性抗原结合蛋白，例如在人HLA的背景下呈递的自身免疫原性人自身肽。
背景技术
虽然T细胞在适应性抗感染或抗肿瘤应答中发挥重要作用，但它们也在例如自身免疫和移植排斥应答等不适应免疫应答中起作用。一般来讲，T细胞介导的免疫应答涉及T细胞与抗原呈递细胞(APC)之间的紧密接触。几个分子之配对与触发T细胞活性的免疫突触的形成有关，所述分子包括但不限于(a)T细胞上的T细胞受体(TCR)，其特异性结合于APC上的主要组织相容性复合物(MHC)分子的肽结合槽中呈递的肽；和(b)与APC上的B7分子配对的CD28(T细胞上)。TCR与CD3分子一起形成TCR复合物，并在TCR与肽-MHC(pMHC)复合物配对时，通过CD3传送信号。通过TCR复合物与T细胞上的CD28进行信号传导引起T细胞的活化。
治疗疾病之免疫治疗性方法用于体内调控T细胞活性，例如下调自身免疫和移植排斥应答等。然而，此类方法通常缺乏特异性，因为许多免疫疗法通过结合CD3和/或共刺激分子的配对等，靶向通过TCR复合物进行的信号传导。此类方法常常引起不合需要的副作用，例如活性过高的免疫应答或通用免疫抑制。因此，利用TCR与pMHC复合物之间的独特相互作用的疗法可以提供在体内调节特定T细胞活性的能力，并且基于T细胞调节提供新的治疗。
发明内容
公开了进行基因修饰并耐受人HLA分子和/或β2微球蛋白并且还能够产生人或人源化抗体的非人动物(例如哺乳动物，例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠)。(1)这些非人动物对人HLA分子的耐受性与(2)这些非人动物提供人源化抗原结合蛋白的能力这两方面允许它们用作分离细胞的独特平台，可用于体外研究，例如同种异体反应的研究，和/或用于产生特异性结合于所关注肽-MHC复合物的人或人源化抗原结合蛋白，只有所述抗原结合蛋白准备好作为有用的治疗剂。因此，本文还提供了制备和使用本文所公开的非人动物以及细胞、组织、核酸和从中分离的抗原结合蛋白的方法。
在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物包含(a)编码人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分的核苷酸序列；和(b)(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座，任选地其中(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座中的至少一个未重排，其中经过基因修饰的非人动物表达所述人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，其中经过基因修饰的非人动物表达包含人或人源化重链可变结构域和/或人或人源化轻链可变结构域的免疫球蛋白，并且其中所述非人动物耐受人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，使得当用包含(i)对非人动物来说为异源的肽与(ii)从中获得所述人或人源化MHC分子的人HLA分子或其一部分复合的抗原肽-MHC(pMHC)复合物进行免疫接种时，非人动物产生特异性B细胞应答。在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物进一步包含抗原肽-MHC(pMHC)复合物，所述复合物包含对非人动物来说为异源的肽与从中获得人或人源化MHC分子的人HLA分子缔合。在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物进一步包含(c)一种抗原肽-MHC(pMHC)复合物，所述复合物包含(i)对非人动物来说为异源的肽与(ii)从中获得人或人源化MHC分子的人HLA分子或其一部分缔合；以及(d)特异性结合抗原pMHC并且不结合从中获得人或人源化MHC分子的人HLA分子的人或人源化抗原结合蛋白。
在一些实施方案中，人或人源化MHC分子选自由以下组成的群组：人或人源化MHCI类分子、人或人源化MHC II类α分子、人或人源化MHC II类β分子或其任何组合。在一些实施方案中，人或人源化MHC分子是人或人源化MHC I类分子。在一些实施方案中，人或人源化MHC分子源自选自由以下组成的群组的HLA I类分子：HLA-A分子、HLA-B分子、HLA-C分子和其任何组合。在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物在其基因组中，任选地在内源β2微球蛋白基因座上进一步包含编码人或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列，其中所述非人动物表达所述人或人源化β2微球蛋白，使得所述非人动物耐受β2微球蛋白本身或与人或人源化I类分子缔合的β2微球蛋白。
在一些实施方案中，人或人源化MHC分子为人或人源化MHC II类分子，任选地其中所述人或人源化MHC分子来源于选自由HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR分子和其任何组合组成的群组的HLA II类分子的α和/或β链，或至少肽结合槽。
在一些实施方案中，人或人源化MHC分子为人HLA分子。在一些实施方案中，非人动物在内源MHC基因座处包含编码人HLA分子的核苷酸序列，任选地其中该核苷酸序列替换编码内源MHC分子的内源核酸序列。在一些实施方案中，非人动物在异位基因座处包含编码人HLA分子的核苷酸序列。在一些实施方案中，非人动物在ROSA26基因座处包含编码人HLA分子之核苷酸序列。在一些实施方案中，非人动物针对内源MHC基因座、异位基因座或ROSA26基因座处的核苷酸序列是纯合的。在一些实施方案中，非人动物针对内源MHC基因座、异位基因座或ROSA26基因座处的核苷酸序列是杂合的。
在一些实施方案中，人或人源化MHC分子为人源化MHC分子，例如嵌合MHC分子。在一些实施方案中，非人动物在内源MHC基因座处包含编码嵌合MHC分子的核苷酸序列，任选地其中该核苷酸序列替换编码内源MHC分子的内源核酸序列。在一些实施方案中，非人动物在异位基因座处包含编码嵌合MHC分子的核苷酸序列。在一些实施方案中，非人动物在ROSA26基因座处包含编码嵌合MHC分子之核苷酸序列。在一些实施方案中，非人动物针对内源MHC基因座、异位基因座或ROSA26基因座处的编码嵌合MHC分子的核苷酸序列是纯合的。在一些实施方案中，非人动物针对内源MHC基因座、异位基因座或ROSA26基因座处的编码嵌合MHC分子的核苷酸序列是杂合的。
在一些实施方案中，核苷酸序列编码嵌合人/非人MHC分子，所述嵌合人/非人MHC分子包含可操作地连接于内源MHC分子的跨膜和胞浆结构域的人HLA分子的胞外结构域。在一些实施方案中，核苷酸序列编码：(i)嵌合人/非人MHC I类分子，所述嵌合人/非人MHC I类分子包含可操作地连接于内源非人MHC类别分子，例如内源鼠类H-2K多肽、内源鼠类H-2D多肽或内源鼠类H-DL多肽的跨膜和胞浆结构域的选自由HLA-A、HLA B和HLA-C组成的群组的人MHC I类分子的α1、α2和α3结构域；和/或(ii)嵌合人/非人MHC II类分子，所述嵌合人/非人MHC II类分子包含可操作地连接于内源非人MHC II类α分子，例如内源鼠类H-2Aα多肽或内源鼠类H-2Eα多肽的跨膜和胞浆结构域的人HLA II类α多肽的α1和α2结构域，和/或可操作地连接于内源非人MHC II类β分子，例如内源鼠类H-2Aα多肽或内源鼠类H-2Eα多肽的跨膜和胞浆结构域的人HLA I类β多肽的β1和β2结构域。
在一些实施方案中，编码人或人源化MHC分子的核苷酸序列不破坏内源非人MHC基因座。在一些实施方案中，编码人或人源化MHC分子的核苷酸序列整合至在内源MHC基因座外部的基因座中。在一些实施方案中，此类整合不破坏任何其它内源基因的功能性。在一个实施方案中，核苷酸序列放至内源ROSA26基因座中。
在一些实施方案中，非人动物针对编码人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分的核苷酸序列是杂合的。
在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物在内源重链基因座处包含与内源重链恒定区呈可操作连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白重链可变区。在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物在内源重链基因座处包含与内源重链恒定区呈可操作连接的受限未重排的人(源化)重链可变区。在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物在内源重链基因座处包含共同重链编码序列。在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物在内源重链基因座处包含与内源重链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)重链可变区。在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物在内源重链基因座处包含只有重链的免疫球蛋白编码序列。在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物在内源重链基因座处包含编码杂交免疫球蛋白链的未重排的人(源化)杂交重链序列。在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物在内源轻链基因座处包含与内源轻链恒定区呈可操作连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区。在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物在内源轻链基因座处包含共同轻链编码序列。在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物在内源轻链基因座处包含与内源轻链恒定区呈可操作连接的受限未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区。在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物在内源轻链基因座处包含与内源轻链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)轻链可变区。在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物在内源轻链基因座处包含与内源轻链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的重排人(源化)轻链可变区。
在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物包含功能性ADAM6基因，任选地其中所述功能性ADAM6基因为内源ADAM6基因。
在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物表达外源末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)基因。
在一些实施方案中，制造前述技术方案中任一项的经过基因修饰的非人动物的方法包含对该非人动物的基因组进行修饰以包含(a)编码人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分的核苷酸序列，和(b)(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座，任选地其中(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座中的至少一个未重排，其中所述经过基因修饰的非人动物
耐受所述人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，使得当用包含(i)对非人动物来说为异源的肽与(ii)从中获得所述人或人源化MHC分子的人HLA分子或其一部分复合的肽-MHC复合物进行免疫接种时，非人动物产生特异性B细胞应答，并能够提供包含人或人源化重链可变结构域和/或人或人源化轻链可变结构域的人或人源化抗原结合蛋白。在一些实施方案中，所述方法包含
(a)
(i)将编码人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分的核苷酸序列插入至第一异位基因座中，或
(ii)用编码人(源化)MHC I多肽的核苷酸序列替换在内源非人动物MHC I基因座处的编码非人动物MHC I多肽的核苷酸序列，和/或用编码人(源化)MHC II分子的核苷酸序列替换在内源非人动物MHC II基因座处的编码非人动物MHC II分子的核苷酸序列，
任选地其中所述人(源化)MHC I分子包含人MHC I的α1、α2和α3结构域以及至少内源非人MHC I多肽的跨膜和胞浆结构域，
任选地其中所述人(源化)MHC II分子包含人MHC II的α1、α2、β1和β2结构域以及至少内源啮齿动物MHC II多肽的跨膜和胞浆结构域，以及
(b)
(i)将(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座插入至第二异位基因座中或
(ii)
(A)在内源非人重链基因座处用未重排的人免疫球蛋白可变(VH)基因区段替换内源非人免疫球蛋白可变(VH)基因区段，并且任选地分别用未重排的人免疫球蛋白多样性(DH)基因区段和/或未重排的人免疫球蛋白接合(JH)基因区段替换内源非人免疫球蛋白多样性(DH)和/或内源非人接合(JH)基因区段，其中未重排的人VH和任选的DH和JH基因区段可操作地连接于内源重链恒定区基因序列，和/或
(B)在内源非人轻链基因座处用任选地重排形成VL/JL基因序列的人轻链可变(VL)基因区段和人轻链接合(JL)基因区段替换内源非人轻链可变(VL)基因区段和内源非人轻链接合(JL)基因区段，其中人VL和接合JL基因区段可操作地连接于内源轻链恒定区基因序列，
其中所述(a)分别编码非人MHC I和/或非人MHC II分子的核苷酸序列和(b)VH、DH、JH、VL和JL基因区段
(I)通过依序同源重组在单个非人胚胎干(ES)细胞中插入或替换，或
(II)在分别用于产生第一非人动物和第二非人动物的第一和第二ES细胞中插入或替换，并且其中所述方法进一步包含繁殖所述第一非人动物和所述第二非人动物。
在一些实施方案中，制造经过基因修饰的非人动物的方法包含向所述非人动物施用抗原pMHC复合物，所述复合物包含对非人动物来说为异源的肽与从中获得人或人源化MHC分子的人HLA分子缔合。在一些实施方案中，抗原pMHC复合物连接至辅助T细胞表位。在一些实施方案中，辅助T细胞表位包含PADRE，例如如示为SEQ ID NO:28。
在一些实施方案中，产生特异性结合所关注的抗原pMHC复合物的抗原结合蛋白或编码其的核酸序列的方法包含将如本文所述的经过基因修饰的非人动物维持在足够使非人动物对所关注的抗原pMHC复合物发起免疫应答的条件中，其中所关注的抗原pMHC复合物包含对非人动物来说为异源并且在从中获得人或人源化MHC分子的人HLA或其一部分的情况下呈递的肽。在一些实施方案中，所述方法包含以下作为第一步骤：用所关注的抗原pMHC复合物对非人动物进行免疫接种，并且任选地增强经过免疫接种的非人动物的免疫应答，任选地其中免疫接种和/或增强包含向非人动物施用连接至辅助T细胞表位，例如PADRE(SEQ ID NO:28)的所关注的pMHC复合物。
在一些实施方案中，获得编码人免疫球蛋白重链可变结构域和/或人免疫球蛋白轻链可变结构域的核酸的方法包含：从如本文所述的非人动物分离包含编码由非人动物的淋巴细胞表达的人免疫球蛋白可变结构域或由淋巴细胞产生的杂交瘤的重排的人免疫球蛋白可变区基因序列的核酸，其中由淋巴细胞表达的人免疫球蛋白可变结构域或由淋巴细胞产生的杂交瘤与其同源可变结构域缔合，形成对抗原pMHC复合物具有特异性的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述方法进一步包含用所关注的抗原pMHC复合物对非人动物进行免疫接种并使非人动物对抗原发起免疫应答，然后获得核酸。在一些实施方案中，所获得的重排的人免疫球蛋白可变区基因序列包含至少一个体细胞超突变。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含可操作地连接于重排的人免疫球蛋白可变区基因序列的人恒定区基因序列。在一些实施方案中，人重链恒定区基因序列包含在5.5至6.0范围内的pH值下增加IgG重链恒定区氨基酸序列的CH2-CH3区对新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力的修饰，其中所述修饰为选自由以下组成的群组的IgG重链恒定区氨基酸序列中的突变：M428L、N434S、V259I、V308F、N434A、M252Y、S254T、T256E、T250Q、H433K、N434Y和其组合。本文还描述了例如用于表达编码对抗原pMHC复合物具有特异性的人免疫球蛋白重链和/或轻链的核酸的哺乳动物宿主细胞。
在一些实施方案中，获得表达人免疫球蛋白重链可变结构域和/或人免疫球蛋白轻链可变结构域的细胞的方法包含从如本文所述的非人动物分离淋巴细胞，其中所述淋巴细胞表达形成对抗原pMHC复合物具有特异性的抗原结合结构域的人免疫球蛋白可变结构域。在一些实施方案中，所述方法包含从分离的淋巴细胞产生杂交瘤。
在一些实施方案中，如本文所述的分离的细胞，例如生殖细胞、胚胎干细胞、体细胞(例如B细胞)包含(a)编码人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分的核苷酸序列，和(b)(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座。在一些实施方案中，(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座中的至少一个未重排。在一些实施方案中，根据本文描述的方法获得分离的细胞。
在一些实施方案中，体外制造人免疫球蛋白可变结构域的方法包含在细胞中表达包含编码由如本文所述的非人动物的淋巴细胞表达的人免疫球蛋白可变结构域或由淋巴细胞产生的杂交瘤的重排的人免疫球蛋白可变区基因序列的第一核酸，其中由淋巴细胞表达的人免疫球蛋白可变结构域或由淋巴细胞产生的杂交瘤与其同源可变结构域缔合，形成对抗原pMHC复合物具有特异性的抗原结合结构域。在一些实施方案中，第一核酸进一步包含可操作地连接于重排的人免疫球蛋白可变区基因序列的人免疫球蛋白恒定区基因序列。在一些实施方案中，人免疫球蛋白恒定区基因序列为重链恒定区基因序列并且包含在5.5至6.0范围内的pH值下增加IgG重链恒定区氨基酸序列的CH2-CH3区对新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力的修饰，其中所述修饰为选自由以下组成的群组的IgG重链恒定区氨基酸序列中的突变：M428L、N434S、V259I、V308F、N434A、M252Y、S254T、T256E、T250Q、H433K、N434Y和其组合。
附图说明
图1A-1C为本发明的示例性实施方案，其提供嵌合MHC I和MHC II基因座，例如如在内源H-2K基因座处的嵌合HLA-A2/H-2K基因座(图1A)、如在内源H-2E基因座处的嵌合HLA-DR2/H-2E基因座(图1B)和如在内源β2M基因座处的人源化β2M基因座(图1C)的示意图(不按比例)。除非另有指示，否则人序列被描绘为空心形状并且小鼠序列被描绘为实心形状。条纹形状表示来源于与内源基因座不同的小鼠品系的H-2E基因序列的外显子1和其下游的内含子的一部分。在Cre介导的盒去除前(图1C)和在Cre去除盒后(图1A和1B)的条件性基因敲除的新霉素磷酸转移酶盒用相应标记的箭头描绘。
图2提供编码单链MHC分子(SEQ ID NO:23)的本发明的示例性转基因(SEQ ID NO:22)的示意图(不按比例)，所述单链MHC分子包含在ROSA26(Gt(ROSA)26Sor)基因座处与人β2微球蛋白(B2m)缔合的全长成熟HLA-A2(A2)多肽(例如HLA-A2的氨基酸25-365)。除非另有指示，否则人序列被描绘为空心形状，小鼠序列被描绘为实心形状，并且既非人也非小鼠序列的序列用多种图案描绘。实心箭头指示内源小鼠ROSA26基因座的外显子。5'HB和3'HB：ROSA 26基因中的用于通过同源重组插入编码单链HLA-A2/β2M复合物(SEQ ID NO:23)的B2m-G4Sx4-HLA-A2转基因(SEQ ID NO:22)的同源框。SA：共有剪接受体。ROR：小鼠ROR信号序列。G4Sx4：GGGS连接子(SEQ ID NO:21)，SV40PA：来自SV40病毒的聚腺苷酸化信号。LoxP-新-LoxP：在Cre介导的盒去除前的条件性基因敲除的新霉素磷酸转移酶盒。
图3展示来自本发明的示例性实施方案的结果，其中针对结合与人β2微球蛋白缔合成单链pMHC复合物的HLA-A的肽结合槽中所呈递的不相关或相关肽(肽A(不相关)、肽B(相关)或肽C(不相关))的抗体的滴度(y轴)测试来自用编码包含HLA-A的肽结合槽中呈递的肽B与人β2微球蛋白缔合的免疫原的核苷酸序列进行免疫接种的测试小鼠(包含编码人源化MHC I分子(HLA-A2/H-2K)、人源化β2微球蛋白、未重排的人源化免疫球蛋白重链基因座和人源化共同轻链基因座Vκ1-39/Jκ的核苷酸序列；●)或对照小鼠(包含功能性(例如鼠类)ADAM6基因和人源化重链和轻链基因座；■)的血清。血清中结合个别pMHC复合物的抗体的滴度计算为结合信号超过背景2倍的内插血清稀释系数。
图4展示来自本发明的示例性实施方案的结果，其中针对结合与人β2微球蛋白缔合成单链pMHC复合物的HLA-A的肽结合槽中所呈递的不相关或相关肽(肽A(不相关)、肽B(相关)或肽C(不相关))的抗体的滴度(y轴)测试来自用包含HLA-A的肽结合槽中呈递的肽B与人β2微球蛋白缔合的单链pMHC复合物免疫原进行免疫接种的测试小鼠(包含编码人源化MHC I分子(HLA-A2/H-2K)、人源化β2微球蛋白、未重排的人源化免疫球蛋白重链基因座和人源化共同轻链基因座Vκ1-39/Jκ的核苷酸序列；●)或对照小鼠(包含功能性(例如鼠类)ADAM6基因和人源化重链和轻链基因座；■)的血清。血清中结合个别pMHC复合物的抗体的滴度(y轴)计算为结合信号超过背景2倍的内插血清稀释系数。
图5展示来自本发明的示例性实施方案的结果，其中针对结合于与人β2微球蛋白缔合成单链pMHC复合物的HLA-A的肽结合槽中所呈递的不相关或相关肽(肽A(不相关)、肽B(相关)或肽C(不相关))，测试来自用包含HLA-A的肽结合槽中呈递的肽B与人β2微球蛋白缔合的免疫原进行免疫接种并用包含HLA-A的肽结合槽中所呈递的肽B与人β2微球蛋白和辅助T细胞表位(PADRE)缔合的另一重组多肽提供增强剂的测试小鼠(包含编码人源化MHC I分子(HLA-A2/H-2K)、人源化β2微球蛋白、未重排的人源化免疫球蛋白重链基因座和人源化共同轻链基因座Vκ1-39/Jκ的核苷酸序列)的血清。血清中结合个别pMHC复合物的抗体的抗体滴度(y轴)计算为结合信号超过背景2倍的内插血清稀释系数。
具体实施方式
如本文中所示，不耐受人HLA和人β2微球蛋白分子，但用在HLA分子的情况下所呈递的所关注的肽，即所关注的pMHC复合物进行免疫接种的对照非人动物引发对所关注的pMHC复合物的抗体滴度。图3-4(正方形符号)。然而，不耐受和经过免疫接种的对照动物的血清也包含对不相关的pMHC复合物(例如在相同情况呈递的不相关的肽)的可比较的抗体滴度，非人动物未针对所述不相关的pMHC复合物进行免疫接种，这表明针对所关注的pMHC复合物产生的应答不是特异性应答。参见图3-4(正方形符号)。
相比之下，耐受人HLA和人β2微球蛋白分子或至少其肽结合槽(例如其胞外部分)并用来源于人HLA分子的所关注的pMHC复合物进行免疫接种的非人动物对所关注的pMHC复合物引发的抗体滴度比对不相关的pMHC复合物大。参见图3-5。因此，本文中显示，耐受人HLA和人β2微球蛋白分子(或至少其肽结合槽(例如其胞外部分))的非人动物提供在体内对所关注的pMHC产生特异性免疫应答的平台，从中可选择主导化合物。此类平台相比于涉及对所关注的pMHC产生非特异性免疫应答的不耐受动物的平台有所改良。因此，本文提供了一种非人动物，对其进行基因修饰以耐受人HLA分子，使得当用包含在人HLA分子情况下呈递的所关注的肽的所关注的pMHC复合物进行免疫接种时，非人动物能够对所关注的pMHC复合物产生特异性B细胞应答。
在示例性实施方案中，非人动物经过基因修饰以耐受人HLA分子、其一部分和/或其单链衍生物，但不耐受包含与非人动物所耐受的人HLA分子缔合(例如由其呈递)的抗原肽(例如对经过基因修饰的非人动物来说为异源的肽)的抗原肽-MHC(pMHC)复合物。因为非人动物不耐受此类抗原pMHC复合物，所以如本文所公开的经过基因修饰的动物不仅可用于分离对人HLA分子、其一部分和/或其单链衍生物无应答的免疫细胞，例如用于体外研究，而且还可用于产生特异性结合于所关注的抗原pMHC复合物的抗原结合蛋白、特别是人或人源化抗原结合蛋白。此类特异性(人或人源化)抗原结合蛋白可用于治疗人类疾病的疗法中，例如防止自身反应性TCR与包含自身反应性自身抗原的pMHC复合物之间形成免疫突触(例如用于预防和/或治疗自身免疫性病症、移植物抗宿主病、移植排斥反应等)，靶向感染了病原体(例如病毒)的细胞，以及经由在细胞表面上表达的pMHC复合物呈递病毒肽等。除描述耐受人或人源化HLA分子、其一部分和/或其单链衍生物的非人动物和制造此类非人动物的方法之外，还公开了向非人动物施用抗原pMHC复合物以产生抗pMHC抗体应答以及制造此类抗原pMHC复合物的方法。
定义
除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语都具有与所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。
除非上下文明确地另外指明，否则单数形式“一”和“所述”包括复数个指代物。因此，例如提及“一种方法”包括本文所述类型的和/或在阅读本公开后对所属领域的技术人员将变得显而易见的一种或多种方法和/或一个或多个步骤。
术语“约”或“大致”包括在值的有意义的范围内。术语“约”或“大致”涵盖的可允许的变化取决于研究的特定系统，并且所属领域的普通技术人员可容易地理解。
术语“主要组织相容性复合体”和“MHC”涵盖术语“人白细胞抗原”或“HLA”(对于人MHC分子，后两个术语一般保留)、天然存在的MHC分子、MHC分子的个别链(例如MHC I类α(重)链、β2微球蛋白、MHC II类α链和MHC II类β链)、MHC分子的此类链的个别亚基(例如MHCI类α链的α1、α2和/或α3亚基、MHC II类α链的α1-α2亚基、MHC II类β链的β1-β2亚基)以及其部分(例如肽结合部分，例如肽结合槽)、突变体和多种衍生物(包括融合蛋白)，其中此类部分、突变体和衍生物保留呈现抗原肽以由T细胞受体(TCR)、例如抗原特异性TCR识别的能力。MHC I类分子包含由重α链的α1和α2结构域形成的肽结合槽，所述肽结合槽可以装载约8-10个氨基酸的肽。尽管MHC的两个类别结合肽内约9个氨基酸(例如5至17个氨基酸)的核心的事实，但MHC II类肽结合槽(II类MHCα多肽的α1结构域与II类MHCβ多肽的β1结构域缔合)的端部开放性允许更宽范围的肽长度。结合MHC II类的肽通常长度在13个与17个氨基酸之间变化，不过更短或更长的长度也非常普遍。因此，肽可以在MHC II类肽结合槽内移位，在任何给定时间改变哪个9聚体直接位于槽内。本文使用了具体MHC变体的常规鉴定。在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物包含编码人(源化)MHC分子的核苷酸，所述人(源化)MHC分子包含至少人肽结合槽(例如肽结合部分)并且在另外的实施方案中包含至少人HLA I类/人β2微球蛋白分子和/或人HLA II类分子的胞外结构域。
术语“耐受(tolerized)”、“耐受性”、“耐受(tolerization)”等是指动物，例如如本文所公开的经过基因修饰的非人动物无法对物质发起免疫应答，或对物质发起免疫应答的能力降低。一般来说，动物对其在胚胎发生期间和/或出生时表达的自身的蛋白质或分子耐受、展现耐受性、经历耐受等，例如动物不会或不太可能对其自身的从其基因组、例如其生殖系基因组表达的蛋白质或分子发起免疫应答。通过对动物进行基因修饰以在其基因组，例如生殖系基因组中包含人(源化)MHC分子，在表达“空”人(源化)MHC分子时，动物对空人(源化)MHC分子变得耐受、展现耐受性、经历耐受等，如同所述人(源化)MHC分子是其自身的蛋白质一样。在HLA分子、MHC分子、人(源化)MHC分子等的上下文中“空”包括在肽结合槽内无肽下，或在对于表达HLA分子、MHC分子、人(源化)MHC分子等的动物来说是内源的肽下表达的HLA分子、MHC分子、人(源化)MHC分子等。举例来说，在动物中空MHC分子可包括从动物的基因组，例如生殖系基因组表达并呈递内源动物自身蛋白或其部分的人(源化)MHC分子。
非人动物的基因组可被视为“体细胞基因组”，例如可为在非人动物的体细胞中发现的基因组，或可被视为“生殖系基因组”，例如可为在非人动物的生殖细胞中发现并传递至非人动物的后代的基因组。熟练技术人员容易认识到，在生殖系基因组中未重排的免疫球蛋白重链和/或轻链可变区基因座能够在非人动物的体细胞(例如B细胞)中重排，形成编码免疫球蛋白可变结构域的重排的免疫球蛋白可变区基因座。因此，可在非人动物的生殖系基因组中发现示例性实施方案中的未重排的重链和/或轻链基因座，并且可例如在非人动物的B细胞中发现从其衍生的重排的序列。
术语“非人动物”等是指不是人的任何脊椎动物生物体。在一些实施方案中，非人动物是圆口类的鱼、硬骨鱼、软骨鱼(例如鲨鱼或鳐)、两栖动物、爬行动物、哺乳动物和鸟类。在一些实施方案中，非人动物为哺乳动物。在一些实施方案中，非人哺乳动物为灵长类动物、山羊、绵羊、猪、狗、奶牛或啮齿动物。在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，例如大鼠或小鼠。
术语“人源化”、“嵌合”、“人/非人”等是指非人类来源并且以经过修饰(例如人源化、嵌合、人/非人等)的分子保留其生物功能和/或维持执行所保留的生物功能的结构的方式，一部分已经被相应人分子的相应部分替换的分子(例如核酸、蛋白质等)。人源化分子可以被认为是来源于人分子，其中人源化分子由包含编码人分子(或其一部分)的核酸序列的核苷酸编码。相比之下，“人”等涵盖只来源于人的分子，例如分别只包含人核苷酸和氨基酸序列的人核苷酸或蛋白质。术语“人(源化)”用于反映人(源化)分子可为(a)人分子或(b)人源化分子。
在一些实施方案中，人(源化)MHC分子包含，或非人动物表达并耐受包含至少人HLA分子的人肽结合槽的人(源化)MHC分子，其中人(源化)MHC分子保留在人肽结合槽中呈递抗原的能力和/或人(源化)MHC分子维持人HLA分子的人肽结合槽的结构。在一些实施方案中，人(源化)MHC分子包含，或非人动物表达并耐受包含至少人HLA分子的人胞外结构域的人(源化)MHC分子，其中人(源化)MHC分子保留呈递抗原的能力和/或人(源化)MHC分子维持人HLA分子的人胞外结构域的结构，以允许形成肽结合槽。在一些实施方案中，人(源化)MHC分子包含以下，或非人动物表达并耐受包含以下的人(源化)MHC分子：人HLA I类多肽的人肽结合槽(例如至少人HLA I类多肽的α1和α2结构域，例如人HLA I类多肽的胞外部分，例如至少全长成熟人HLA I类多肽)，其中人(源化)MHC I类多肽保留在人肽结合槽中呈递抗原的能力和/或呈递抗原所需的结构。在一些实施方案中，人(源化)MHC分子包含以下，或非人动物表达并耐受包含以下的人(源化)MHC分子：人HLA I类多肽的人肽结合槽(例如至少人HLA I类多肽的α1和α2结构域，例如人HLA I类多肽的胞外部分，例如至少全长成熟人HLAI类多肽)，其中人(源化)MHC I类分子保留在人肽结合槽中呈递抗原的能力和/或呈递抗原所需的结构，并且其中人(源化)MHC I类分子进一步包含使MHC I类分子稳定的人或人源化β2微球蛋白。
术语“抗原”是指当引入至免疫活性宿主中时被宿主的免疫系统识别并引发宿主的免疫应答的任何试剂(例如蛋白质、肽、多糖、糖蛋白、糖脂、核苷酸、其部分或其组合)。T细胞受体识别在主要组织相容性复合体(MHC)的情况下呈递的肽，作为免疫突触的一部分。肽-MHC(pMHC)复合物被TCR识别，其中肽(抗原决定子)和TCR独特型提供相互作用的特异性。因此，术语“抗原”涵盖在MHC、例如肽-MHC复合物、例如pMHC复合物的情况下呈递的肽。在MHC上呈现的肽也可以称为“表位”或“抗原决定子”。术语“肽”、“抗原决定子”、“表位”等不仅涵盖由抗原呈递细胞(APC)天然呈递的“肽”、“抗原决定子”、“表位”，而且还可以是任何期望的肽，只要例如当适当呈递至免疫系统的细胞时其被经过基因修饰的非人动物的免疫细胞识别即可。举例来说，还可以使用具有人工制备的氨基酸序列的肽作为表位。
“肽-MHC复合物”、“pMHC复合物”、“肽在槽中”等包括
(i)MHC分子，例如人和/或人源化(例如“人(源化)”)MHC分子或其部分(例如其肽结合槽，和例如其胞外部分)，和
(ii)抗原肽，
其中所述MHC分子和所述抗原肽以使pMHC复合物可特异性结合T细胞受体的方式形成复合物。pMHC复合物涵盖细胞表面表达的pMHC复合物和可溶性pMHC复合物。在示例性实施方案中，在基因组、例如生殖系基因组中包含编码人(源化)MHC分子或至少其人肽结合槽的核苷酸序列的非人动物变得耐受空人(源化)MHC分子或其空人肽结合槽。在向非人动物施用抗原pMHC复合物，例如包含与对pMHC复合物所施用的宿主非人动物来说是外来的肽复合的人(源化)MHC分子复合物时，非人动物能够对抗原pMHC复合物产生抗体应答。接着可以分离此类特异性抗原结合蛋白并用作治疗剂，特异性调节T细胞受体与抗原pMHC的特异性相互作用。在示例性实施方案中，包含与非人动物耐受的MHC分子复合的肽(对pMHC复合物所施用的宿主非人动物来说是外来的)的可溶性pMHC复合物可因所施用pMHC复合物的可溶性而未引发T细胞免疫应答。然而，此类可溶性pMHC复合物仍可被视为抗原性的，因为其可引发B细胞介导的免疫应答，所述免疫应答产生特异性结合可溶性pMHC复合物的抗原结合蛋白。
短语“基因区段”或“区段”包括对可变(V)基因区段(例如免疫球蛋白轻链可变(VL)基因区段或免疫球蛋白重链可变(VH)基因区段)、免疫球蛋白重链多样性(DH)基因区段或接合(J)基因区段，例如免疫球蛋白轻链接合(JL)基因区段或免疫球蛋白重链接合(JL)基因区段的提及，其在免疫球蛋白基因座处包括未重排的序列，所述未重排的序列可以参与重排(由例如内源重组酶介导)以形成重排的轻链VL/JL或重排的重链VH/DH/JH序列。除非另外指示，否则未重排的V、D和J区段包含根据12/23规则允许VL/JL重组或VH/DH/JH重组的重组信号序列(RSS)。
术语“抗原结合蛋白”、“免疫球蛋白”、“抗体”、“抗体”、“结合蛋白”等是指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab′)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、内抗体、微型抗体、双功能抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对抗原特异性TCR的抗Id抗体)和以上各抗体中的任一抗体的表位结合片段。术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”也指共价双功能抗体，例如美国专利申请公布20070004909中所公开的共价双功能抗体，以全文引用的方式并入本文中；和Ig-DARTS，例如美国专利申请公布20090060910中公开的Ig-DARTS，以全文引用的方式并入本文中。pMHC结合蛋白是指特异性结合pMHC复合物的抗原结合蛋白、免疫球蛋白、抗体等。
术语“特异性结合”、“以特异性方式结合”、“抗原特异性”等指示参与特异性结合的分子(1)能够在生理条件下稳定结合，例如缔合，例如形成分子间非共价键，和(2)不能够在生理条件下形成与指定结合对外的其它分子的稳定结合。因此，以特异性方式结合于pMHC复合物的抗原结合蛋白(例如免疫球蛋白、抗体等)指示pMHC结合蛋白与pMHC复合物形成稳定的分子间非共价键。因此，特异性结合，例如以特异性方式结合于包含与第一MHC分子复合的第一肽的特定pMHC复合物的pMHC结合蛋白
(i)在生理条件下不稳定地结合于包含在第一MHC分子的情况下呈递的第二肽的pMHC复合物，其中第一和第二肽不相同，例如在与第一MHC分子的肽结合槽缔合时呈现不同独特型(构形结构)，
(ii)可以干扰(例如阻断)(a)特异性地识别在第一MHC分子的情况下呈递的第一肽的第一TCR与(b)包含第一肽和第一MHC分子的pMHC复合物之间的相互作用，但
(iii)将不干扰(a)特异性地识别在第一MHC分子的情况下呈递的第二肽的第二TCR或(b)包含在第一MHC分子的情况下呈递的第二肽的pMHC复合物之间的相互作用，其中第一和第二肽不同，例如在与第一MHC分子的肽结合槽缔合时呈现不同独特型(构形结构)。特异性结合包含第一肽和第一MHC分子的pMHC复合物的pMHC结合蛋白也可以或独立地结合在第一MHC分子的情况下呈递第一肽的第一细胞，但不结合在第一MHC分子的情况下呈递第二肽的第二细胞，其中第一和第二肽不同，在与MHC分子的肽结合槽缔合时呈现不同独特型(构象结构)。特异性结合还可以通过在低微摩尔至皮摩尔范围内的平衡解离常数(KD)来表征。高特异性可在低纳摩尔范围内，其中极高特异性在皮摩尔范围内。用于确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域众所周知的，并且包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。
“个体”或“受试者”或“动物”是指人、兽医学动物(例如猫、犬、母牛、马、绵羊、猪等)和疾病的实验动物模型(例如小鼠、大鼠)。在一个实施方案中，受试者是人。
术语“蛋白质”在本文中使用，涵盖所有类别的天然存在的和合成的蛋白质，包括所有长度的蛋白质片段、融合蛋白和经过修饰的蛋白质，包括但不限于糖蛋白，以及所有其它类型的经过修饰的蛋白质(例如由磷酸化、乙酰化、豆蔻酰化、棕榈酰化、糖基化、氧化、甲酰化、酰胺化、聚谷氨酰化、ADP-核糖基化、聚乙二醇化、生物素化等产生)。
除非另外规定，否则术语“核酸”和“核苷酸”涵盖DNA和RNA。
术语“滴度”、“抗体滴度”、“抗体的滴度”等是指共享特征，例如同种型的抗体样品(例如在从受试者获得的血清中)的能力，以特异性或非特异性方式结合于抗原的能力等。从受试者收集的血清中的抗体滴度的测定方法是本领域已知的。在一些实施方案中，从受试者收集的血清中的抗体滴度计算为结合信号超过背景2倍的内插血清稀释系数。在一些实施方案中，表达并耐受人(源化)MHC分子的非人动物在用所关注的pMHC复合物(例如，在从中获得人(源化)MHC分子的HLA分子的情况下呈递的所关注的肽)免疫接种时可产生或的确产生特异性应答(例如特异性免疫应答，例如特异性B细胞应答，例如特异性抗体应答)。在一些实施方案中，如果非人动物在用所关注的pMHC复合物免疫接种时对所关注的pMHC复合物产生的抗体滴度大于对不相关的pMHC复合物的抗体滴度，应答被认为是“特异性应答”等。在一些实施方案中，如果非人动物在用所关注的pMHC复合物免疫接种时对所关注的pMHC复合物产生的抗体滴度比对不相关的pMHC复合物的抗体滴度大至少2倍，应答被认为是特异性应答等。在一些实施方案中，如果非人动物在用所关注的pMHC复合物免疫接种时对所关注的pMHC复合物产生的抗体滴度比对不相关的pMHC复合物的抗体滴度大至少5倍，应答被认为是特异性应答等。在一些实施方案中，如果非人动物在用所关注的pMHC复合物免疫接种时对所关注的pMHC复合物产生的抗体滴度比对不相关的pMHC复合物的抗体滴度大至少10倍，应答被认为是特异性应答等。在一些实施方案中，如果非人动物在用所关注的pMHC复合物免疫接种时对所关注的pMHC复合物产生的抗体滴度比对不相关的pMHC复合物的抗体滴度明显大，应答被认为是特异性应答等。
术语“可操作地连接”等是指一种并接关系，其中所描述的组分处于允许其以其预期方式起作用的关系中。举例来说，如果未重排的可变区基因区段能够重排形成结合恒定区基因一起表达成抗原结合蛋白的多肽链的重排的可变区基因，那么未重排的可变区基因区段“可操作地连接”至相连恒定区基因。“可操作地连接”至编码序列的控制序列以这样的方式连接，使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。“可操作地连接的”序列包括与所关注的基因邻接的表达控制序列和以反式或相距一定距离发挥作用来控制所关注的基因(或所关注的序列)的表达控制序列。术语“表达控制序列”包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列是影响它们所连接的编码序列的表达和加工所必需的。“表达控制序列”包括：合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，例如剪接和聚腺苷酸化信号；使胞质mRNA稳定的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强多肽稳定性的序列；以及当需要时，增加多肽分泌的序列。这种控制序列的性质根据宿主生物体而不同。例如，在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，而在真核生物中，通常此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括其存在对于表达和加工来说是必需的组分，并且还能够包括存在有利的其它组分，例如前导序列和融合搭配物序列。
术语“投药”等是指并包括将组合物施用于受试者或系统(例如细胞、器官、组织、生物体或其相关组分或一组组分)。技术人员将理解，施用途径可以根据例如组合物所施用于的受试者或系统、组合物的性质、施用目的等而变化。例如，在某些实施方案中，针对动物受试者(例如，针对人或啮齿动物)的施用可以是支气管施用(包括通过支气管滴注)、面颊施用、肠内施用、真皮间施用、动脉内施用、真皮内施用、胃内施用、髓内施用、肌肉内施用、鼻内施用、腹膜内施用、鞘内施用、静脉内施用、心室内施用、粘膜施用、鼻腔施用、口服、直肠施用、皮下施用、舌下施用、局部施用、气管施用(包括通过气管内滴注)、透皮施用、阴道施用和/或玻璃体施用。在一些实施方案中，施用可以涉及间歇给药。在一些实施方案中，施用可以涉及连续给药(例如，灌注)达至少一段选定的时间。
术语“来源于”当用于重排的可变区基因或“来源于”未重排的可变区和/或未重排的可变区基因区段的可变结构域时，是指将重排的可变区基因或可变结构域的序列追溯到一组未重排的可变区基因区段(其重排形成表达可变结构域的重排的可变区基因)的能力(在适用的情况下，说明剪接差异和体细胞突变)。例如，发生过体细胞突变的重排的可变区基因不改变它来源于未重排的可变区基因区段的事实。
术语“内源基因座”或“内源基因”是指在引入如本文所述的断裂、缺失、置换、改变或修饰之前可在亲本或参考生物体中发现的遗传基因座。在一些实施方案中，内源基因座具有天然存在的序列。在一些实施方案中，内源基因座为野生型基因座。在一些实施方案中，内源基因座为经工程化的基因座。
术语“异源”是指来自不同来源的试剂或实体。举例来说，当在提及具体细胞或生物体中存在的多肽、基因或基因产物时使用时，所述术语明确了相关多肽、基因或基因产物：1)通过人力工程化；2)通过人力(例如经由基因工程)引入至细胞或生物体(或其前体)中；和/或3)并非是相关细胞或生物体(例如相关细胞类型或生物体类型)中天然产生或存在的。“异源”还包括通常存在于特定天然细胞或生物体中，但已经在非天然相关联的并且在一些实施方案中非内源性的调控元件(例如，启动子)的控制下例如通过突变或替换而进行了改变或修饰的多肽、基因或基因产物。
根据本文中的公开内容，在本领域的技术范围内可以采用常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。在文献中全面解释了这些技术。参见例如Sambrook,Fritsch和Maniatis,《分子克隆：实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第二版.Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989(本文中“Sambrook等人,1989”)；《DNA克隆：一种实用的方法(DNA Cloning:A PracticalApproach)》,第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait等人1984)；《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》[B.D.Hames和S.J.Higgins编辑(1985)]；《转录和翻译(Transcription AndTranslation)》[B.D.Hames和S.J.Higgins编辑(1984)]；《动物细胞培养(Animal CellCulture)》[R.I.Freshney编辑,(1986)]；《固定化细胞和酶(Immobilized Cells AndEnzymes)》[IRL Press,(1986)]；B.Perbal,《分子克隆实用指南(A Practical Guide ToMolecular Cloning)》(1984)；Ausubel,F.M.等人(编辑).《分子生物学现代方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》.John Wiley&Sons公司,1994，每个出版物以全文引用的方式并入本文中。这些技术包括定点诱变，参见例如Kunkel,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》82:488-492(1985)；美国专利第5,071,743号,Fukuoka等人,《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)》263:357-360(1999)；Kim和Maas,《生物技术(BioTech.)》28:196-198(2000)；Parikh和Guengerich,《生物技术》24:4 28-431(1998)；Ray和Nickoloff,《生物技术》13:342-346(1992)；Wang等人,《生物技术》19:556-559(1995)；Wang和Malcolm,《生物技术》26:680-682(1999)；Xu和Gong,《生物技术》26:639-641(1999)；美国专利第5,789,166号和第5,932,419号,Hogrefe,《策略(Strategies)》l4.3:74-75(2001)；美国专利第5,702,931号、第5,780,270号和第6,242,222号,Angag和Schutz,《生物技术》30:486-488(2001)；Wang和Wilkinson,《生物技术》29:976-978(2000)；Kang等人,《生物技术》20:44-46(1996)；Ogel和McPherson,《蛋白质工程(Protein Engineer.)》5:467-468(1992)；Kirsch和Joly,《核酸研究(Nucl.Acids.Res.)》26:1848-1850(1998)；Rhem和Hancock,《细菌学杂志(J.Bacteriol.)》178:3346-3349(1996)；Boles和Miogsa,《当代遗传学(Curr.Genet.)》28:197-198(1995)；Barrenttino等人,《核酸研究)22:541-542(1993)；Tessier和Thomas,《分子生物学方法(Meths.Molec.Biol.)》57:229-237；以及Pons等人,《分子生物学方法》67:209-218；每个公布以全文引用的方式并入本文中。
耐受人或人源化MHC分子
在示例性实施方案中，经过基因修饰的非人动物，例如哺乳动物，例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠，表达并耐受至少一个空的人或人源化MHC分子或至少其空的人肽结合槽，但当人(源化)MHC分子与抗原、例如异源肽复合时可产生针对人(源化)MHC分子的抗原结合蛋白，例如包含人或人源化可变结构域的抗原结合蛋白。在一些实施方案中，通过对非人动物进行基因修饰以在其基因组中包含编码人(源化)MHC分子或至少其人肽结合槽的核苷酸序列，使得非人动物表达人(源化)MHC分子或至少其人肽结合槽作为空的人(源化)MHC分子或其空的人肽结合槽来实现非人动物对空的人(源化)MHC分子的耐受。经过基因修饰以包含编码人(源化)MHC分子的核苷酸的相同动物可进一步进行修饰以包含表达人或人源化抗原结合蛋白，例如具有人或人源化可变结构域的抗原结合蛋白的人源化免疫球蛋白重链和/或轻链基因座。
MHC分子通常分为两类：I类和II类MHC分子。MHC I类分子是包含糖蛋白重链(在本文中也称为α链)的整体膜蛋白，其具有三个胞外结构域(即α1、α2和α3)和两个胞内结构域(即跨膜结构域(TM)和胞浆结构域(CYT))。重链与称为β2微球蛋白(β2m或β2M)的可溶性亚基非共价缔合。MHC II类分子或MHC II类蛋白是包含呈非共价缔合的一个α链和一个β链的异二聚体整体膜蛋白。α链具有两个胞外结构域(α1和α2)和两个胞内结构域(TM结构域和CYT结构域)。β链含有两个胞外结构域(β1和β2)和两个胞内结构域(TM结构域和CYT结构域)。
I类和II类MHC分子的结构域组织形成MHC分子的抗原决定性结合位点，例如肽结合部分或肽结合槽。肽结合槽是指MHC蛋白的一部分，其形成肽、例如抗原决定物可结合的腔。肽结合槽的构象能够在肽结合时改变，以使得对TCR结合于肽-MHC(PmHC)复合物来说重要的氨基酸残基能够适当对准。
在一些实施方案中，MHC分子包括足以形成肽结合槽的MHC链片段。例如，I类蛋白的肽结合槽可包含能够形成两个β折叠片层和两个α螺旋的重链的α1和α2结构域的部分。包括β2微球蛋白链的一部分可稳定MHC I类分子。虽然对于大多数型式的MHC II类分子来说，α和β链的相互作用可以在不存在肽的情况下发生，但MHC I类的双链分子不稳定，直到结合槽填充有肽。II类蛋白质的肽结合槽可包含能够形成两个β折叠片层和两个α螺旋的α1和β1结构域的部分。α1结构域的第一部分形成第一β折叠片层，并且α1结构域的第二部分形成第一α螺旋。β1结构域的第一部分形成第二β折叠片层，并且β1结构域的第二部分形成第二α螺旋。具有接合在蛋白质的结合槽中的肽的II类蛋白的X射线结晶结构显示，接合肽的一端或两端可突出在MHC蛋白之外(Brown等人,第33-39页,1993,《自然(Nature)》,第364卷；以全文引用的方式并入本文中)。因此，II类的α1和β1α螺旋的端部形成开放腔，使得结合于结合槽的肽的端部未被埋入腔中。此外，II类蛋白的X射线结晶结构显示，MHCβ链的N末端以非结构化方式从MHC蛋白的侧面明显突出，因为β链的前4个氨基酸残基无法通过X射线晶体学分配。
许多人和其它哺乳动物MHC是本领域众所周知的。
在一些实施方案中，非人动物包含第一、第二和/或第三核苷酸序列中的至少一种，所述核苷酸序列中的每一个编码选自选自由以下组成的群组的不同的人或人源化MHCII多肽：人或人源化MHC IIα多肽、人或人源化MHC IIβ多肽和人或人源化MHC Iα多肽；非人动物还可以包含人或人源化β2微球蛋白，例如在那些实施方案中，当其包含编码人或人源化MHC Iα多肽的核苷酸序列时。在本文中使用第一、第二和第三的名称不应被解释为将本文所公开的非人动物限制为需要所有三个核苷酸序列或任何人或人源化MHC多肽的存在呈任何特定次序。
在各种实施方案中，本文提供了一种经过基因修饰的非人动物，例如哺乳动物，例如啮齿动物(例如小鼠或大鼠)，其在基因组中包含编码人或人源化MHC I多肽的核苷酸序列，和/或编码人或人源化MHC II蛋白的核苷酸序列或至少其人肽结合槽。MHC I核苷酸序列可编码完全人MHC I多肽(例如人HLAI类分子)，或部分人和部分非人的人源化MHC I多肽(例如嵌合人/非人MHC I多肽)，并且MHC II核苷酸序列可编码完全人MHC I多肽(例如人HLAI类分子)，或部分人和部分非人的人源化MHC II类蛋白质(例如嵌合人/非人MHC II蛋白质，例如包含嵌合人/非人MHC IIα和β多肽)。
在本文中的实例中，显示从内源基因座表达包含可操作地连接于非人MHC I分子的跨膜和胞浆结构域的人HLAI类分子的人胞外部分(包含人肽结合结构域)的嵌合人/非人MHC I分子的经过基因修饰的动物在人HLA I类分子的人胞外部分，例如人肽结合结构域为空的时耐受其，且当其与抗原、例如对非人动物来说为异源的肽时能够对人肽结合结构域产生特异性免疫应答。参见例如实例。因此，在一些实施方案中，非人动物，例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠，
(1)例如从内源MHC基因座表达嵌合人/非人MHC分子，所述嵌合人/非人MHC分子包含(a)至少人类肽结合槽，例如人HLA分子的人胞外部分，其可操作地连接于(b)非人MHC I分子的非人跨膜和胞浆结构域，以及
(2)耐受至少人HLA分子的胞外部分。
美国专利第9,591,835号和第9,615,550号中公开了一种经过基因修饰的非人动物，所述非人动物在其基因组中，例如在内源基因座处包含编码嵌合人/非人MHC I多肽的核苷酸序列，每个公布以全文引用的方式并入本文中。美国专利第8,847,005号和第9,043,996号中公开了一种经过基因修饰的非人动物，所述非人动物在其基因组中，例如在内源基因座处包含编码人源化、例如嵌合人/非人MHC II多肽的核苷酸序列，每个公布以全文引用的方式并入本文中。美国专利第10,154,658号中公开了一种经过基因修饰的非人动物，所述非人动物在其基因组中，例如在内源基因座处包含编码人源化、例如嵌合人/非人MHC I多肽的核苷酸序列，并且在其基因组中，例如在内源基因座处包含编码人源化、例如嵌合人/非人MHC II多肽的核苷酸序列，所述专利以全文引用的方式并入本文中。
在各种实施方案中，本文提供了一种经过基因修饰的非人动物，所述非人动物在其基因组中，例如在其生殖系基因组中，例如在一个或多个内源MHC基因座处包含：
(i)编码嵌合人/非人MHC I多肽的第一核苷酸序列，所述嵌合人/非人MHC I多肽包含包括人MHC I多肽的胞外部分(或其一部分，例如一个或多个胞外结构域，例如肽结合槽)的人部分，所述人部分可操作地连接于包含非人MHC I多肽、例如内源MHC I多肽的跨膜和胞浆结构域的非人部分；和/或
(ii)编码嵌合人/非人MHC IIα多肽的第二核苷酸序列，所述嵌合人/非人MHC IIα多肽包含可操作地连接于非人部分的人部分，其中所述嵌合MHC IIα多肽的人部分包含人MHC II类分子的α多肽的胞外部分(或其一部分，例如一个或多个胞外结构域，例如α1结构域)；以及编码嵌合人/非人MHC IIβ多肽的第三核苷酸序列，所述嵌合人/非人MHC IIβ多肽包含可操作地连接于非人部分的人部分，其中嵌合MHC IIβ多肽的人部分包含人MHC II类分子的β多肽的胞外部分(或其一部分，例如一个或多个胞外结构域，例如至少β1结构域)；
其中所述非人动物表达嵌合人/非人MHC I和/或MHC II蛋白，并耐受嵌合人/非人MHC I和/或MHC II蛋白。在一个实施方案中，第一、第二和/或第三核苷酸序列分别位于内源非人MHC I、MHC IIα和MHC IIβ基因座处。在一个实施方案中，其中非人动物是小鼠，第一、第二和/或第三核苷酸序列位于小鼠染色体17上的内源小鼠MHC基因座处。在一个实施方案中，第一核苷酸序列位于内源非人MHC I基因座处。在一个实施方案中，第二核苷酸序列位于内源非人MHC IIα基因座处。在一个实施方案中，第三核苷酸序列位于内源非人MHCIIβ基因座处。
在一个实施方案中，嵌合人/非人MHC I多肽包含可操作地连接于非人部分的人部分，其中所述人部分包含至少人MHC I多肽的肽结合槽。在一个实施方案中，嵌合多肽的人部分包含人MHC I分子的胞外部分。在此实施方案中，嵌合多肽的人部分包含人MHC I分子的α链的胞外结构域。在一个实施方案中，嵌合多肽的人部分包含人MHC I分子的α1和α2结构域。在另一个实施方案中，嵌合多肽的人部分包含人MHC I分子的α1、α2和α3结构域。
在一个实施方案中，嵌合MHC IIα多肽的人部分和/或嵌合MHC IIβ多肽的人部分分别包含人MHC IIα多肽和/或人MHC IIβ多肽的肽结合结构域，例如人MHC II蛋白的MHCIIα和β多肽。在一个实施方案中，嵌合MHC IIα和/或β多肽的人部分分别包含人MHC IIα和/或β多肽的胞外部分，例如人MHC II蛋白的MHC IIα和β多肽。在一个实施方案中，嵌合MHCIIα多肽的人部分包含人MHC IIα多肽的α1结构域；在另一个实施方案中，嵌合MHC IIα多肽的人部分包含人MHC IIα多肽的α1和α2结构域。在另外的实施方案中，嵌合MHC IIβ多肽的人部分包含人MHC IIβ多肽的β1结构域；在另一个实施方案中，嵌合MHC IIβ多肽的人部分包含人MHC IIβ多肽的β1和β2结构域。
在示例性实施方案中，非人动物包含、表达并耐受嵌合人/非人MHC分子。在一个实施方案中，其中人部分分别包含人MHC I、MHC IIα和/或MHC IIβ分子的胞外部分，所述人部分可操作地连接于非人部分，其中嵌合人/非人MHC I、MHC IIα和/或MHC IIβ多肽的非人部分包含内源非人(例如啮齿动物，例如小鼠、大鼠等)MHC I、MHC IIα和/或MHC IIβ多肽的跨膜和/或胞浆结构域。因此，嵌合人/非人MHC I多肽的非人部分可包含内源非人MHC I多肽的跨膜和/或胞浆结构域。嵌合MHC IIα多肽的非人部分可包含内源非人MHC IIα多肽的跨膜和/或胞浆结构域。嵌合人/非人MHC IIβ多肽的非人部分可包含内源非人MHC IIβ多肽的跨膜和/或胞浆结构域。在一个实施方案中，非人动物是小鼠，并且嵌合MHC I多肽的非人部分来源于小鼠H-2K蛋白。在一个实施方案中，非人动物是小鼠，并且嵌合MHC IIα和β多肽的非人部分来源于小鼠H-2E蛋白。因此，嵌合MHC I多肽的非人部分可以包含来源于小鼠H-2K的跨膜和胞浆结构域，并且嵌合MHC IIα和β多肽的非人部分可以包含来源于小鼠H-2E蛋白的跨膜和胞浆结构域。虽然实例中考虑特定的H-2K和H-2E序列，但是本文涵盖任何合适的序列，例如多态性变体、保守/非保守氨基酸取代等。
在一个实施方案中，嵌合人/小鼠MHC I多肽的人部分包含人MHC I(例如人HLA-A，例如人HLA-A2，例如人HLA-A2.1)的肽结合结构域或胞外结构域。人MHC I的肽结合槽可以包含α1和α2结构域。或者，人MHC I的肽结合槽可以包含α1、α2和α3结构域。在一个实施方案中，人MHC I的胞外结构域包含人MHC Iα链的胞外结构域。在一个实施方案中，内源小鼠MHCI基因座是H-2K(例如H-2Kb)基因座，并且嵌合MHC I多肽的小鼠部分包含小鼠H-2K(例如H-2Kb)多肽的跨膜和胞浆结构域。因此，在一个实施方案中，本发明的小鼠在其内源小鼠MHCI基因座处包含编码嵌合人/小鼠MHC I的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人部分包含人HLA-A2(例如，HLA-A2.1)多肽的胞外结构域，并且小鼠部分包含小鼠H-2K(例如，H-2Kb)多肽的跨膜和胞浆结构域(参见例如SEQ ID NO:24)，并且小鼠表达嵌合人/小鼠HLA-A2/H-2K蛋白。在其它实施方案中，嵌合MHC I多肽的小鼠部分可以来源于其它小鼠MHC I，例如H-2D、H-2L等；并且嵌合MHC I多肽的人部分可以来源于其它人MHC I，例如HLA-B、HLA-C等。
在一个实施方案中，嵌合人/小鼠MHC IIα多肽的人部分包含人MHC IIα肽结合或胞外结构域并且嵌合人/小鼠MHC IIβ多肽的人部分包含人MHC IIβ肽结合或胞外结构域。人MHC IIα多肽的肽结合结构域可包含α1结构域并且人MHC IIβ多肽的肽结合结构域可包含β1结构域；因此，嵌合MHC II分子的肽结合结构域可包含人α1和β1结构域。人MHC IIα多肽的胞外结构域可包含α1和α2结构域并且人MHC IIβ多肽的胞外结构域可包含β1和β2结构域；因此，嵌合MHC II分子的胞外结构域可以包含人α1、α2、β1和β2结构域。在一个实施方案中，嵌合MHC II分子的小鼠部分包含小鼠MHC II，例如小鼠H-2E的跨膜和胞质结构域(例如，小鼠H-2Eα和β链的跨膜和胞质结构域)。因此，在一个实施方案中，本发明的小鼠在其内源小鼠MHC II基因座处包含编码嵌合人/小鼠MHC IIα的核苷酸序列，其中嵌合MHC IIα多肽的人部分包含来源于人MHC II的α链(例如，HLA-DR2的α链)的胞外结构域，并且小鼠部分包含来源于小鼠MHC II(例如H-2E)的α链的跨膜和胞浆结构域；并且小鼠在其内源小鼠MHCII基因座处包含编码嵌合人/小鼠MHC IIβ的核苷酸序列，其中嵌合MHC IIβ多肽的人部分包含来源于人MHC II的β链(例如HLA-DR2的β链)的胞外结构域，并且小鼠部分包含来源于小鼠MHC II(例如，H-2E)的β链的跨膜和胞浆结构域；例如，其中小鼠表达嵌合人/小鼠HLA-DR2/H-2E蛋白。在其它实施方案中，嵌合MHC II蛋白的小鼠部分可以来源于其它小鼠MHCII，例如H-2A等；并且嵌合MHC II蛋白的人部分可以来源于其它人MHC II，例如HLA-DQ等。
在一些实施方案中，嵌合人/非人多肽可以使得其包含人或非人前导序列(信号)序列。在一个实施方案中，嵌合MHC I多肽包含内源MHC I多肽的非人前导序列。在一个实施方案中，嵌合MHC IIα多肽包含内源MHC IIα多肽的非人前导序列。在一个实施方案中，嵌合MHC IIβ多肽包含内源MHC IIβ多肽的非人前导序列。在替代实施方案中，嵌合MHC I、MHCIIα和/或MHC IIβ多肽分别包含来自另一种非人动物，例如另一种啮齿动物或另一种小鼠品系的MHC I、MHC IIα和/或MHC IIβ多肽的非人前导序列。因此，编码嵌合MHC I、MHC IIα和/或MHC IIβ多肽的核苷酸序列可以分别可操作地连接于编码非人MHC I、MHC IIα和/或MHC IIβ前导序列的核苷酸序列。在又一个实施方案中，嵌合MHC I、MHC IIα和/或MHC IIβ多肽分别包含人MHC I、人MHC IIα和/或人MHC IIβ多肽的人前导序列(例如，分别人HLA-A2、人HLA-DRα和/或人HLA-DRβ1*1501的前导序列)。
在一些实施方案中，嵌合人/非人MHC I、MHC IIα和/或MHC IIβ多肽可在其人部分中分别包含人MHC I、人MHC IIα和/或人MHC IIβ多肽的完全或基本上完全的胞外结构域。因此，人部分可以包含编码人MHC I、人MHC IIα和/或人MHC IIβ多肽(例如，人HLA-A2、人HLA-DRα和/或人HLA-DRβ1*1501)的胞外结构域的氨基酸的至少80％、至少85％、至少90％、例如95％或更多。在一个实例中，人MHC I、人MHC IIα和/或人MHC IIβ多肽的基本上完全的胞外结构域缺乏人前导序列。在另一个实例中，嵌合人/非人MHC I、嵌合人/非人MHC IIα和/或嵌合人/非人MHC IIβ多肽包含人前导序列。
此外，在一些实施方案中，嵌合MHC I、MHC IIα和/或MHC IIβ多肽可以可操作地连接于(例如，在调控控制下表达)内源非人启动子和调控元件，例如小鼠MHC I、MHC IIα和/或MHC IIβ调控元件。这种布置将促进非人动物中，例如在非人动物中的免疫应答期间嵌合MHC I和/或MHC II多肽的适当表达。
尽管本文提供的实例显示了对从内源MHC基因座表达的嵌合人/非人MHC分子的人肽结合结构域的耐受，但是在从异位基因座表达人MHC分子(或其功能性肽结合结构域)的非人动物中也发生这样的耐受(数据未示出)。另外，从异位基因座表达并耐受空的人MHC分子(或其空肽结合结构域)的非人动物在用与抗原肽、例如对非人动物来说为异源的肽复合的从中获得所表达的人MHC分子的人HLA分子(或其肽结合结构域和/或其衍生物)免疫接种时，所述非人动物能够针对所述人HLA分子(或其肽结合结构域，或其衍生物)产生特异性免疫应答。
不希望受理论束缚，据信非人动物的耐受在人或人源化MHC分子表达时发生。因此，人或人源化MHC分子无需从内源基因座表达。因此，在各种实施方案中，本文提供了一种经过基因修饰的非人动物，所述非人动物在其基因组中包含编码人(源化)MHC I多肽(或其部分和/或衍生物)的第一核苷酸序列、编码人(源化)MHC IIα多肽(或其部分和/或衍生物)的第二核苷酸序列和/或编码人(源化)MHC IIβ多肽(或其部分和/或衍生物)的第三核苷酸序列；其中所述非人动物表达人(源化)MHC I、MHC IIα和/或MHC IIβ多肽(或其部分和/或衍生物)并耐受所述人(源化)多肽或部分和/或衍生物。在一个实施方案中，第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和/或第三核苷酸序列分别不破坏内源非人MHC I、MHC IIα和MHC IIβ基因座，例如位于异位基因座，例如ROSA26基因座处。在一些实施方案中，经过基因修饰的小鼠在异位基因座、例如ROSA26基因座处包含编码嵌合人/小鼠MHC I的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人部分包含人HLA-A2(例如HLA-A2.1)多肽的胞外结构域，并且小鼠部分包含小鼠H-2K(例如H-2Kb)多肽的跨膜和胞浆结构域(参见例如SEQ ID NO:24)，并且小鼠表达并耐受嵌合人/小鼠HLA-A2/H-2K蛋白。
此外，如果来自异位基因座，那么可以表达完全人MHC分子或完全人部分和/或其衍生物。因此，在各种实施方案中，本文提供了一种经过基因修饰的非人动物，所述非人动物在其基因组中包含编码完全人MHC I多肽(或其完全人部分和/或衍生物)的第一核苷酸序列、编码完全人MHC IIα多肽(或其完全人部分和/或衍生物)的第二核苷酸序列和/或编码完全人MHC IIβ多肽(或其完全人部分和/或衍生物)的第三核苷酸序列；其中所述非人动物表达完全人MHC I、MHC IIα和/或MHC IIβ多肽(或其完全人部分和/或衍生物)并耐受所述多肽或其完全人部分和/或衍生物。在一个实施方案中，第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和/或第三核苷酸序列分别不破坏内源非人MHC I、MHC IIα和MHC IIβ基因座，任选地不破坏任何内源基因座，例如位于异位基因座，例如ROSA26基因座处。
在一些实施方案中，人或人源化MHC I多肽可来源于以下核酸，例如人或人源化MHC I多肽由以下核酸编码，所述核酸编码或包含编码选自由以下组成的群组的功能性人HLA分子的核苷酸序列的一部分：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G和其组合。人或人源化MHC IIα或β多肽可以来源于由HLA-DP、-DQ和-DR基因座编码的功能性人HLA分子的α或β多肽。常用HLA抗原和等位基因的列表描述于Shankarkumar等人((2004)《人类白细胞抗原(HLA)系统(The Human Leukocyte Antigen(HLA)System)》,《国际人类遗传学杂志(Int.J.Hum.Genet.)》4(2):91-103)，其以全文引用的方式并入本文中。Shankarkumar等人还提出了本领域中使用的HLA命名法的简要说明。关于HLA命名法和各种HLA等位基因的额外信息可见于Holdsworth等人(2009)《HLA字典2008：HLA-A、-B、-C、-DRB1/3/4/5以及DQB1等位基因以及它们与血清限定的HLA-A、-B、-C、-DR以及-DQ抗原的关联的总结(The HLAdictionary 2008:a summary of HLA-A,-B,-C,-DRB1/3/4/5,and DQB1alleles andtheir association with serologically defined HLA-A,-B,-C,-DR,and-DQantigens)》,《组织抗原(Tissue Antigens)》73：95-170以及最近由Marsh等人的最新更新(2010)HLA系统的因素的命名法(Nomenclature for factors of the HLAsystem),2010,《组织抗原》75：291-455，每个出版物以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，MHC I或MHC II多肽可以来源于任何功能性人HLA-A、B、C、DR或DQ分子。因此，在示例性实施方案中，人或人源化MHC I和/或II多肽可来源于任何功能性人HLA分子。在一些实施方案中，在细胞表面上表达的所有MHC I和MHC II多肽包含来源于人HLA分子的部分。
特别感兴趣的是多态性人HLA等位基因，已知其与许多人类疾病，例如人自身免疫疾病相关。事实上，已鉴定到HLA基因座中的特定多态性，其与类风湿性关节炎、I型糖尿病、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、多发性硬化、重症肌无力、格雷夫斯病(Graves'disease)、系统性红斑狼疮、乳糜泻病、克罗恩氏病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎和其它自身免疫疾病的发展相关。参见例如Wong和Wen(2004)《HLA转基因小鼠可以告诉我们自身免疫糖尿病什么？(What can the HLA transgenic mouse tell us aboutautoimmune diabetes？)》,《糖尿病学(Diabetologia)》47:1476-87；Taneja和David(1998)《HLA转基因小鼠作为疾病和免疫性的人源化小鼠模型(HLA Transgenic Mice asHumanized Mouse Models of Disease and Immunity)》,《临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》101:921-26；Bakker等人(2006),《延伸的人MHC中疾病关联研究的高分辨率HLA和SNP单倍型图(A high-resolution HLA and SNP haplotype map for diseaseassociation studies in the extended human MHC)》,《自然·遗传学(NatureGenetics)》38:1166-72和补充信息；以及《国际MHC和自身免疫遗传学网络(InternationalMHC and Autoimmunity Genetics Network)》(2009)MHC区域内针对7种免疫介导的疾病的多种敏感性变体的定位(Mapping of multiple susceptibility variants within theMHC region for 7immune-mediated diseases)》,《美国国家科学院院刊》。USA 106:18680-85，各出版物以全文引用的方式并入本文中。因此，在一些实施方案中，人或人源化MHC I和/或II多肽可来源于已知与特定疾病，例如自身免疫疾病相关联的人HLA分子。
在一个特定实施方案中，人或人源化MHC I多肽来源于人HLA-A。在一个特定实施方案中，HLA-A多肽是HLA-A2多肽(例如和HLA-A2.1多肽)。在一个实施方案中，HLA-A多肽是由HLA-A*0201等位基因，例如HLA-A*02:01:01:01等位基因编码的多肽。HLA-A*0201等位基因通常在北美群体中使用。尽管本发明的实例描述了此特定HLA序列，但是本文涵盖任何合适的HLA-A序列，例如，在人群中表现出的HLA-A2的多态性变体、具有一个或多个保守或非保守氨基酸修饰的序列、由于遗传密码的简并而不同于本文的示例性实施方案中的序列的核苷酸序列等。
在另一个特定实施方案中，人或人源化MHC I多肽来源于选自HLA-B和HLA-C的人MHC I。在一个实施方案中，它来源于HLA-B，例如HLA-B27。在另一个实施方案中，它来源于HLA-A3、HLA-B7、HLA-Cw6等。
在一个特定的实施方案中，人或人源化MHC IIα和β多肽来源于人HLA-DR，例如HLA-DR2。通常，HLA-DRα链是单态的，例如HLA-DR蛋白的α链由HLA-DRA基因(例如，HLA-DRα*01基因)编码。另一方面，HLA-DRβ链具有多态性。因此，HLA-DR2包含由HLA-DRA基因编码的α链和由HLA-DR1β*1501基因编码的β链。本文涵盖任何合适的HLA-DR序列，例如在人群中表现出的多态性变体、具有一种或多种保守或非保守氨基酸修饰的序列等。
在一些实施方案中，人或人源化MHC IIα和/或β多肽可由已知与常见人类疾病相关联的HLA等位基因的核苷酸序列或其部分编码。这样的HLA等位基因包括但不限于HLA-DRB1*0401、-DRB1*0301、-DQA1*0501、-DQB1*0201、DRB1*1501、-DRB1*1502、-DQB1*0602、-DQA1*0102、-DQA1*0201、-DQB1*0202、-DQA1*0501以及它们的组合。关于HLA等位基因/疾病关联的总结，参见Bakker等人(2006)，同上，以全文引用的方式并入本文中。
在另外的实施方案中，本发明的非人动物，例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠，包含(例如在内源β2微球蛋白基因座处)编码人或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列。β2微球蛋白或MHC I类蛋白的轻链(也缩写为“β2M”)是小型(12kDa)非糖基化蛋白，主要用于稳定MHC Iα链。在美国专利第9,615,550号中详细描述了人或人源化β2微球蛋白动物的产生，所述专利以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列可以包含与人β2微球蛋白基因的仅一部分，例如帮助稳定人(源化)MHC I分子的至少一部分对应的核苷酸残基。在一些实施方案中，编码人β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包含整个人β2微球蛋白基因。或者，在一些实施方案中，核苷酸序列可包含编码人β2微球蛋白的氨基酸21-119(即，与成熟人β2微球蛋白对应的氨基酸残基)中所示的氨基酸序列的核苷酸残基。在替代实施方案中，核苷酸序列可包含编码人β2微球蛋白的氨基酸23-115中所示的氨基酸序列，例如人β2微球蛋白的氨基酸23-119中所示的氨基酸序列的核苷酸残基。人β2微球蛋白的核酸序列和氨基酸序列在Gussow等人,(1987)《β2-微球蛋白基因.转录单元的主要结构和定义(Theβ2-Microglobulin Gene.Primary Structure and Definition of theTranscriptional Unit)，《免疫学杂志(J.Immunol)》.139:3131-38，其以全文引用的方式并入本文中。
因此，在一些实施方案中，人或人源化β2微球蛋白多肽可以包含人β2微球蛋白多肽的氨基酸23-115中所示的氨基酸序列，例如人β2微球蛋白多肽的氨基酸23-119中所示的氨基酸序列，例如人β2微球蛋白多肽的氨基酸21-119中所示的氨基酸序列。或者，人β2微球蛋白可以包含人β2微球蛋白多肽的氨基酸1-119。
在一些实施方案中，编码人或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列包含人β2微球蛋白基因的外显子2至外显子4中所示的核苷酸序列。或者，核苷酸序列包含人β2微球蛋白基因的外显子2、3和4中所示的核苷酸序列。在此实施方案中，外显子2、3和4中所示的核苷酸序列可操作地连接以允许基因的正常转录和翻译。因此，在一个实施方案中，人序列包含与人β2微球蛋白基因的外显子2至外显子4对应的核苷酸序列。在一特定实施方案中，人序列包含与人β2微球蛋白基因的外显子2至在外显子4之后约267bp对应的核苷酸序列。在一特定实施方案中，人序列包含人β2微球蛋白基因的约2.8kb。
因此，在一些实施方案中，人或人源化β2微球蛋白多肽可以由包含人β2微球蛋白的外显子2至外显子4中所示的核苷酸序列，例如与人β2微球蛋白基因的外显子2至外显子4对应的核苷酸序列的核苷酸序列编码。或者，在一些实施方案中，多肽可以由包含人β2微球蛋白基因的外显子2、3和4中所示的核苷酸序列的核苷酸序列编码。在一特定实施方案中，人或人源化β2微球蛋白多肽由人β2微球蛋白基因的外显子2至在外显子4之后约267bp对应的核苷酸序列编码。在另一个特定实施方案，人或人源化多肽由包含人β2微球蛋白基因的约2.8kb的核苷酸序列编码。因为β2微球蛋白基因的外显子4含有5'非翻译区，所以人或人源化多肽可以由包含β2微球蛋白基因的外显子2和3的核苷酸序列编码。
另外，在一些实施方案中，包含编码人或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列的非人动物也包含非人β2微球蛋白基因的外显子1中所示的核苷酸序列。因此，在一特定实施方案，非人动物在其基因组中包含编码人或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含非人β2微球蛋白的外显子1和人β2微球蛋白基因的外显子2、3和4。因此，人或人源化β2微球蛋白多肽由非人β2微球蛋白基因的外显子1和人β2微球蛋白基因的外显子2、3和4(例如，人β2微球蛋白基因的外显子2和3)编码。
在一些实施方案中，编码人或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列在内源非人动物β2微球蛋白基因座处。在一些实施方案中，人β2微球蛋白的核苷酸序列在内源非人β2微球蛋白基因座处替换编码内源非人β2微球蛋白的对应核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，与人β2微球蛋白基因的外显子2至外显子4对应的核苷酸序列在内源小鼠β2微球蛋白基因座处替换与小鼠β2微球蛋白基因的外显子2至外显子4对应的内源小鼠序列(参见图1C)。在一些实施方案中，核苷酸序列包含人β2微球蛋白基因的外显子2、3和4中所示的核苷酸序列替换小鼠β2微球蛋白基因的外显子2、3和4中所示的核苷酸序列等
在一些实施方案中，编码人或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列不破坏内源非人β2微球蛋白基因座，例如位于异位基因座，例如ROSA26基因座处。
在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物在其基因组中，在异位基因座，例如ROSA26基因座处，包含第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列，其中第一核苷酸序列编码包含任选地与人或人源化β2微球蛋白(或其一部分)可操作地连接、例如融合的HLA I类分子(例如至少人MHC I类分子的α1和α2结构域)的功能性肽结合部分的单链多肽，并且其中第二核苷酸序列编码包含HLA II类分子(例如至少人MHC II类分子的α1和β1结构域)的功能性肽结合部分的单链多肽。在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物例如在异位基因座处包含编码单链多肽的第一核苷酸序列，所述单链多肽包含与人β2微球蛋白融合的人HLA-A2多肽(例如，全长成熟HLA-A2多肽)的至少功能性肽结合部分(参见例如图2)。在一些实施方案中，包含与人β2微球蛋白融合的人HLA-A2多肽(例如，全长成熟HLA-A2多肽)的至少功能性肽结合部分的单链多肽包含如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的经过基因修饰的非人动物在异位基因座、ROSA26基因座处包含编码包含与人(源化)β2微球蛋白融合的人HLA-A2分子的至少功能性肽结合部分的人(源化)MHC I类分子的核苷酸序列，例如如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列，或其简并变体。在一些实施方案中，本文所述的经过基因修饰的非人动物在异位基因座，例如ROSA26基因座处包含编码嵌合MHC多肽，例如SEQ IDNO:24所示的HLA-A2/H2-K多肽的核苷酸序列。
本领域的普通技术人员将理解，尽管一些实施方案包括特定的核苷酸和氨基酸序列来产生基因工程化的动物，但是具有一个或多个保守或非保守氨基酸取代的序列或由于遗传密码的简化而不同于本文的实施方案的序列也被视为在本发明的范围内。
因此，在一些实施方案中，提供一种表达人(源化)MHC I类α多肽核酸序列的非人动物，其中由于遗传密码的简并，人(源化)MHC I类α多肽核酸序列或其一部分与人MHC I类α多肽核酸序列不相同，但是至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一特定实施方案中，人(源化)MHC I类α多肽核酸序列与本文例示的实施方案的人MHC I类α多肽核酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方案中，所表达的人(源化)MHC I类α多肽序列包含一个或多个保守取代。在一个实施方案中，人(源化)MHC I类α多肽序列包含一个或多个非保守取代。
另外，在一些实施方案中，提供了一种表达人(源化)β2微球蛋白序列的非人动物，其中由于遗传密码的简并，人(源化)β2微球蛋白序列或其一部分与人β2微球蛋白序列不相同，但是至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一特定实施方案中，人(源化)β2微球蛋白序列与本文例示的实施方案的人β2微球蛋白序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方案中，人(源化)β2微球蛋白序列包含一个或多个保守取代。在一个实施方案中，人(源化)β2微球蛋白序列包含一个或多个非保守取代。
在一些实施方案中，提供了一种表达人(源化)MHC II类α多肽核酸序列的非人动物，其中由于遗传密码的简并，人(源化)MHC II类α多肽核酸序列或其一部分与人MHC I类α多肽核酸序列不相同，但是至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方案中，所表达的人(源化)MHC II类α多肽序列包含一个或多个保守取代。在一个实施方案中，人(源化)MHC II类α多肽序列包含一个或多个非保守取代。
在一些实施方案中，提供了一种表达人(源化)MHC II类β多肽核酸序列的非人动物，其中由于遗传密码的简并，人(源化)MHC II类β多肽核酸序列或其一部分与人MHC I类α多肽核酸序列不相同，但是至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方案中，所表达的人(源化)MHC II类α多肽序列包含一个或多个保守取代。在一个实施方案中，人(源化)MHC II类α多肽序列包含一个或多个非保守取代
在一些实施方案中，非人动物针对第一、第二和/或第三核苷酸序列是杂合的，其中每一个核苷酸序列编码选自由以下组成的群组的不同人或人源化MHC多肽：人或人源化MHC IIα多肽、人或人源化MHC IIβ多肽和人或人源化MHC Iα多肽或其部分。在一些实施方案中，非人动物针对第一、第二和/或第三核苷酸序列是纯合的，其中每一个核苷酸序列编码选自由以下组成的群组的不同人或人源化MHC多肽：人或人源化MHC IIα多肽、人或人源化MHC IIβ多肽和人或人源化MHC Iα多肽或其部分。
人或人源化B细胞免疫应答
在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物除包含第一、第二和/或第三核苷酸序列之外，还例如包含人或人源化免疫球蛋白重链和/或轻链基因座，使得非人动物能够提供包含人或人源化抗原结合结构域、例如人或人源化可变结构域的人或人源化抗原结合蛋白，其中每一个核苷酸序列编码选自由以下组成的群组的不同人或人源化MHC多肽：人或人源化MHC IIα多肽、人或人源化MHC IIβ多肽和人或人源化MHC Iα多肽或其部分。
包含人可变区基因区段的免疫球蛋白基因座是本领域已知的，并且可见于例如美国专利第5,633,425号；第5,770,429号；第5,814,318号；第6,075,181号；第6,114,598号；第6,150,584号；第6,998,514号；第7,795,494号；第7,910,798号；第8,232,449号；第8,502,018号；第8,697,940号；第8,703,485号；第8,754,287号；第8,791,323号；第8,809,051号；第8,907,157号；第9,035,128号；第9,145,588；9,206,263号；第9,447,177号；第9,551,124号；第9,580,491号和第9,475,559号；其中每个专利以全文引用的方式并入本文中；以及美国专利公布第20100146647号、第20110195454号、第20130167256号、第20130219535号、第20130326647号、第20130096287号和第2015/0113668号，其中每个公开以全文引用的方式并入本文中；以及PCT公开第WO2007117410号、第WO2008151081号、第WO2009157771号、第WO2010039900号、第WO2011004192号、第WO2011123708号和第WO2014093908号，其中每个公开以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，如本文所公开的非人动物除编码人或人源化MHC分子的核苷酸序列之外，还包含外源引入的完全人免疫球蛋白转基因，所示转基因能够在小鼠中在前体B细胞中重排(Alt等人,1985,《转基因小鼠中的免疫球蛋白基因(Immunoglobulin genesin transgenic mice)》,《遗传学趋势(Trends Genet)》1:231-236；以全文引用的方式并入本文中)。在这些实施方案中，可(随机)插入完全人免疫球蛋白转基因并且也可以敲除内源免疫球蛋白基因(Green等人,1994,《来自经人Ig重链和轻链YAC工程化的小鼠的抗原特异性人单克隆抗体(Antigen-specific human monoclonal antibodies from miceengineered with human Ig heavy and light chain YACs)》,《自然·遗传学(NatGenet)》7:13-21；Lonberg等人,1994,来自包含四种不同基因修饰的小鼠的抗原特异性人抗体(Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinctgenetic modifications)》,《自然(Nature)》368:856-859；Jakobovits等人,2007,《从XenoMouse技术到帕尼单抗，来自转基因小鼠的首个完全人类抗体产物(From XenoMousetechnology to panitumumab,the first fully human antibody product fromtransgenic mice)》,《自然·生物技术(Nat Biotechnol)》25:1134-1143)；每个出版物以全文引用的方式并入本文中)，例如其中例如通过使每个内源基因座的小而关键的部分的目标性缺失，接着引入人免疫球蛋白基因座作为随机结合的大转基因或微型染色体，使内源免疫球蛋白重链和κ轻链基因座失活(Tomizuka等人,2000,《双重反式染色体小鼠：含有Ig重链和κ基因座的两种个别人染色体片段的维持和完全人类抗体的表达(Double trans-chromosomic mice:maintenance of two individual human chromosome fragmentscontaining Ig heavy and kappa loci and expression of fully humanantibodies)》,《美国国家科学院院刊(PNAS USA)》97:722-727；以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，人或人源化免疫球蛋白重链和轻链基因座分别在内源免疫球蛋白重链和轻链基因座处。先前已经描述了用于用人种系免疫球蛋白可变基因基因座对小鼠种系免疫球蛋白可变基因基因座进行大量原位基因替换，同时保持小鼠产生子代的能力的方法。参见例如美国专利第6,596,541号和第8,697,940号，每个专利以全文引用的方式并入。具体地讲，描述了小鼠重链和κ轻链免疫球蛋白可变基因基因座的六兆碱基用其人对应部分精确替换，同时保持小鼠恒定区完整。因此，已经建立了整个种系免疫球蛋白可变谱经同等人种系免疫球蛋白可变序列精确替换，同时维持小鼠恒定区的小鼠。人可变区连接于小鼠恒定区，形成嵌合人-小鼠免疫球蛋白基因座，所述基因座重排并以生理学上适当的水平表达。所表达的抗体是“反向嵌合体”，即，它们包含人可变区序列和小鼠恒定区序列。具有表达具有人或人源化可变区和小鼠恒定区的抗体的人源化免疫球蛋白可变区的这些小鼠称为小鼠。/>
人源化小鼠表现出与野生型小鼠基本上不可区分的完全功能性体液免疫系统。它们在B细胞发育的所有阶段均显示正常细胞群体。它们表现出正常的淋巴器官形态。/>小鼠的抗体序列表现出正常V(D)J重排和正常体细胞超突变频率。这些小鼠中的抗体群体反映由正常类别转换(例如，正常同种型顺式转换)产生的同种型分布。对/>小鼠进行免疫接种产生稳固的体液免疫应答，其产生具有适合用作治疗候选物的人免疫球蛋白可变结构域的大型多样化抗体谱。此平台提供了用于制造药学上可接受的抗体和其它抗原结合蛋白的天然亲和力成熟的人免疫球蛋白可变区序列的丰富来源。还显示用人VH基因区段替换甚至单一内源VH基因区段也可以产生包含人源化免疫球蛋白可变结构域的免疫应答。参见例如Tien等人(2016)《细胞(Cell)》166:1471-84；以全文引用的方式并入本文中。正是用人免疫球蛋白可变序列精确替换小鼠免疫球蛋白可变序列使得人免疫球蛋白可变序列以反向嵌合方式与内源非人恒定区基因序列可操作地连接，从而允许制造/>小鼠。
以反向嵌合方式进行修饰的小鼠包括经过修饰以在内源免疫球蛋白基因座处包含可操作地连接于内源恒定区的人(源化)可变区(例如包含(D)、J和一个或多个人V基因区段)，例如
(a)在内源重链基因座处：
(i)与内源重链恒定区呈可操作连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白重链可变区，其中未重排的人(源化)免疫球蛋白重链可变区包含多个未重排的人重链可变区VH基因区段(例如所有功能性人的未重排的人VH基因区段)、一个或多个未重排的免疫球蛋白重链DH基因区段和一个或多个未重排的免疫球蛋白重链JH基因区段，
任选地，其中所述一个或多个未重排的免疫球蛋白重链DH基因区段和一个或多个未重排的免疫球蛋白重链JH基因区段为一个或多个未重排的人免疫球蛋白重链DH基因区段(例如所有功能性人DH基因区段)和/或一个或多个未重排的人免疫球蛋白重链JH基因区段(例如所有功能性人JH基因区段)；
(ii)与内源重链恒定区呈可操作连接的受限的未重排的人(源化)重链可变区，其中所述受限的未重排的人(源化)重链可变区基本上由以下组成：与一个或多个未重排的免疫球蛋白重链DH基因区段和一个或多个未重排的免疫球蛋白重链JH基因区段可操作地连接的单一未重排的人重链可变区VH基因区段，任选地其中一个或多个未重排的免疫球蛋白重链DH基因区段和一个或多个未重排的免疫球蛋白重链JH基因区段分别为一个或多个未重排的人免疫球蛋白重链DH基因区段和/或一个或多个未重排的人免疫球蛋白重链JH基因区段；
(iii)共同重链编码序列，其包含与内源重链恒定区呈可操作连接的重排的人(源化)重链可变区序列，其中重排的人(源化)重链可变区序列包含与免疫球蛋白重链DH基因区段一起重排的人重链可变区VH基因区段，免疫球蛋白重链D[g2]H[/g2]基因区段与免疫球蛋白重链JH基因区段一起重排，
任选地其中免疫球蛋白重链JH基因区段或免疫球蛋白重链DH基因区段分别为人免疫球蛋白重链DH基因区段和/或人免疫球蛋白重链JH基因区段；
(iv)与内源重链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)重链可变区，其中所述经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)重链可变区包含未重排的免疫球蛋白重链可变基因序列，所述未重排的免疫球蛋白重链可变基因序列在互补决定区3(CDR3)编码序列中包含至少一个非组氨酸密码子经组氨酸密码子取代或插入至少一个组氨酸密码子；
(v)只有重链的免疫球蛋白编码序列，所述只有重链的免疫球蛋白编码序列包含与内源重链恒定区呈可操作连接的未重排的人(源化)重链可变区，其中内源重链恒定区包含(1)与轻链缔合的编码IgM同种型的完整内源IgM基因,和(2)缺乏编码功能性CH1结构域的序列的非IgM基因，例如IgG基因，其中非IgM基因编码缺乏能够与轻链恒定结构域共价缔合的CH1结构域的非IgM同种型；或
(vi)编码杂交免疫球蛋白链的未重排的人(源化)杂交重链序列，其中所述未重排的人(源化)杂交重链序列包含与内源重链恒定区呈可操作连接的未重排的人轻链可变(VL)和未重排的接合(JL)基因区段，
任选地其中所述内源重链恒定区包含(1)与轻链缔合的编码IgM同种型的完整内源IgM基因，和(2)缺乏编码功能性CH1结构域的序列的非IgM基因，例如IgG基因，其中非IgM基因编码缺乏能够与轻链恒定结构域共价缔合的CH1结构域的非IgM同种型；
和/或
(b)在内源轻链基因座处：
(i)与内源轻链恒定区呈可操作连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区，其中未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区包含多个未重排的人轻链可变区VL基因区段(例如所有功能性人的未重排的人VL基因区段)和一个或多个未重排的免疫球蛋白轻链JL基因区段，
任选地其中所述一个或多个未重排的免疫球蛋白轻链JL基因区段为一个或多个未重排的人免疫球蛋白轻链JL基因区段(例如所有功能性人JHL基因区段)，
任选地其中所述内源免疫球蛋白轻链基因座为内源免疫球蛋白轻链κ(κ)基因座，所述未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区包含人可变κ(Vκ)和接合κ(Jκ)基因区段，并且其中所述内源轻链恒定区为内源κ链恒定区序列和/或其中所述内源免疫球蛋白轻链基因座为内源免疫球蛋白轻链λ(λ)，所述未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区包含人可变λ(Vλ)和接合λ(Jλ)基因区段，并且所述内源轻链恒定区为内源λ链恒定区序列，任选地其中所述内源免疫球蛋白轻链λ基因座包含(a)一个或多个人Vλ基因区段，(b)一个或多个人Jλ基因区段,和(c)一个或多个人Cλ基因区段，其中(a)和(b)可操作地连接于(c)和啮齿动物免疫球蛋白轻链恒定(Cλ)基因区段，并且其中所述内源免疫球蛋白λ轻链基因座进一步包含：一个或多个啮齿动物免疫球蛋白λ轻链强化子(Eλ),和一个或多个人免疫球蛋白λ轻链强化子(Eλ)，任选地包含三个人Eλ；
(ii)共同轻链编码序列，其包含与内源轻链恒定区呈可操作连接的重排的人(源化)轻链可变区序列，其中重排的人(源化)轻链可变区序列包含与免疫球蛋白轻链JL基因区段一起重排的人轻链可变区VL基因区段；
(iii)与内源轻链恒定区呈可操作连接的受限的未重排的人(源化)轻链可变区，其中所述受限的未重排的人(源化)轻链可变区包含可操作地连接于一个或多个未重排的人免疫球蛋白轻链接合(JL)基因区段的至多两个未重排的人免疫球蛋白轻链可变(VL)基因区段；
(iv)与内源轻链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)轻链可变区，其中所述经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)轻链可变区包含未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变基因序列，所述未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变基因序列在互补决定区3(CDR3)编码序列中包含至少一个非组氨酸密码子经组氨酸密码子取代或插入至少一个组氨酸密码子；或
(v)与内源轻链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的重排的人(源化)轻链可变区，其中所述经过组氨酸修饰的重排的人(源化)轻链可变区包含重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变基因序列，所述重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变基因序列在互补决定区3(CDR3)编码序列中包含至少一个非组氨酸密码子经组氨酸密码子取代或插入至少一个组氨酸密码子，
任选地，其中所述小鼠进一步包含
(i)人(源化)免疫球蛋白重链基因座，其包含功能性ADAM6基因，使得小鼠展现非人动物的野生型繁殖力；和/或
(ii)用于增加抗原受体多样性的外源末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)基因，任选地使得重排的可变区基因的至少10％包含非模板添加，
先前已经描述。参见例如美国专利8,697,940号；第8,754,287号；第9,204,624号；第9,334,334号；第9,801,362号；第9,332,742号；和第9,516,868号；美国专利公布20110195454、20120021409、20120192300、20130045492；20150289489；20180125043；20180244804；PCT公布第WO2017210586号和第WO2011163314号；Lee等人(2014)《自然生物技术(Nature Biotechnology)》32:356；各以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，本发明包括基因组、例如种系基因组包含以下的经过基因修饰的非人动物：
内源免疫球蛋白基因座，其包含包括人VH基因区段、人DH基因区段和人JH基因区段的免疫球蛋白重链可变区，其中所述免疫球蛋白重链可变区可操作地连接于恒定区，和/或
内源链基因座，其包含包括人VL基因区段和人JL基因区段的免疫球蛋白轻链可变区，其中所述免疫球蛋白轻链可变区可操作地连接于恒定区。
在一些实施方案中，本发明包括基因组、例如种系基因组包含以下的经过基因修饰的非人动物：
内源免疫球蛋白重链基因座，其包含包括人VH基因区段、人DH基因区段和人JH基因区段的免疫球蛋白重链可变区，其中所述免疫球蛋白重链可变区可操作地连接于恒定区，和/或
内源免疫球蛋白轻链基因座，其包含包括人VL基因区段和人JL基因区段的免疫球蛋白轻链可变区，其中所述免疫球蛋白轻链可变区可操作地连接于恒定区。
在一些实施方案中，非人动物，例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠，除编码人或人源化MHC的核苷酸序列之外，在其基因组中还包含在内源免疫球蛋白重链基因座处一个或多个内源VH、DH和JH区段经一个或多个人VH、DH和JH区段替换，其中所述一个或多个人VH、DH和JH区段可操作地连接于内源免疫球蛋白重链基因；以及任选地例如在内源非人轻链基因座处，未重排或重排的人VL和人JL区段，其可操作地连接于非人，例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠，或人免疫球蛋白轻链恒定(CL)区域基因，使得非人动物耐受所述人或人源化MHC分子并响应于免疫原，例如抗原pMHC复合物而产生反向嵌合抗体。
在某些实施方案中，表达并耐受人或人源化MHC分子的经过基因修饰的非人动物还在其基因组、例如种系基因组中包含如下免疫球蛋白基因座(外源或内源)，所述免疫球蛋白基因座含有包含一个或多个未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段的免疫球蛋白可变区和包含免疫球蛋白恒定区基因的免疫球蛋白恒定区，并且其中所述一个或多个未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段可操作地连接于免疫球蛋白恒定区基因。在一些实施方案中，表达并耐受人或人源化MHC分子的非人动物在其基因组、例如种系基因组中包含多种此类免疫球蛋白基因座。例如，在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物在其基因组、例如种系基因组中包含编码人或人源化MHC分子的核苷酸序列以及一个或多个免疫球蛋白基因座(包括经过基因修饰的重排或未重排的免疫球蛋白基因座)，使得小鼠制备人、人源化、部分人和/或反向嵌合(人可变和非人恒定区)抗体。
一般来讲，经过基因修饰的免疫球蛋白基因座包含可操作地连接于免疫球蛋白恒定区的免疫球蛋白可变区(包含免疫球蛋白可变区基因区段)。在一些实施方案中，经过基因修饰的免疫球蛋白基因座包含可操作地连接于重链恒定区基因的一个或多个人未重排的免疫球蛋白重链可变区基因区段。在一些实施方案中，经过基因修饰的免疫球蛋白基因座包含可操作地连接于重链恒定区基因的人未重排的免疫球蛋白轻链、例如κ基因区段，参见例如美国专利第9,516,868号，以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，经过基因修饰的免疫球蛋白基因座包含可操作地连接于κ链恒定区基因的人未重排的免疫球蛋白重链可变区基因区段。在一些实施方案中，经过基因修饰的免疫球蛋白基因座包含可操作地连接于κ链恒定区基因的人未重排的免疫球蛋白可变区κ基因区段。在一些实施方案中，经过基因修饰的免疫球蛋白基因座包含可操作地连接于κ链恒定区基因的人未重排的免疫球蛋白可变区λ基因区段。在一些实施方案中，经过基因修饰的免疫球蛋白基因座包含可操作地连接于λ链恒定区基因的人未重排的免疫球蛋白可变区λ基因区段。
在某些实施方案中，非人动物在内源重链基因座处包含与内源重链恒定区呈可操作连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白重链可变区，其中免疫球蛋白可变区含有一个或多个未重排的人Ig重链可变区基因区段。在一些实施方案中，一个或多个未重排的人Ig可变区基因区段包含至少一个人免疫球蛋白重链可变(VH)区段、一个或多个免疫球蛋白重链多样性(DH)区段(任选地一个或多个未重排的人DH区段)和一个或多个免疫球蛋白重链接合(JH)区段(任选地一个或多个未重排的人JH区段)。在一些实施方案中，未重排的人Ig可变区基因区段包含多个未重排的人VH区段、一个或多个未重排的(人)DH区段和一个或多个未重排的(人)JH区段。在一些实施方案中，未重排的人Ig可变区基因区段包含至少3个VH基因区段、至少18个VH基因区段、至少20个VH基因区段、至少30个VH基因区段、至少40个VH基因区段、至少50个VH基因区段、至少60个VH基因区段、至少70个VH基因区段或至少80个VH基因区段。在一些实施方案中，未重排的人Ig基因区段包括所有功能性人DH基因区段。在一些实施方案中，未重排的人Ig基因区段包括所有功能性人JH基因区段。例如以下中提供了包含Ig重链基因区段的示例性可变区：Macdonald等人,《美国国家科学院院刊》。USA 111:5147-52和补充信息，其以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，本文提供的非人动物在内源重链基因座处包含与包含至少非人IgM基因的内源重链恒定区呈可操作连接的受限的未重排的人(源化)重链可变区，其中受限的未重排的人(源化)重链可变区的特征在于单个人VH基因区段、多个DH基因区段(例如人DH基因区段)和多个JH基因区段(例如人JH基因区段)，其中受限的免疫球蛋白重链基因座能够重排和形成多个不同重排，其中每个重排来源于单个人VH基因区段、DH区段之一和JH区段之一，并且其中每个重排编码不同重链可变结构域(例如如美国专利公布第20130096287号中所述，以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，单个人VH基因区段为VH1-2或VH1-69。
在某些实施方案中，非人动物在内源轻链基因座处包含与内源轻链恒定区呈可操作连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区。在一些实施方案中，未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区含有未重排的人Igκ可变区基因区段。在一些实施方案中，未重排的人(源化)免疫球蛋白可变区包含多个未重排的人Vκ区段和一个或多个未重排的人JK区段。在一些实施方案中，未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段包含所有人Jκ区段。在一些实施方案中，免疫球蛋白可变区基因区段包含四个功能性Vκ区段和所有人Jκ区段。在一些实施方案中，免疫球蛋白可变区基因区段包含16个功能性Vκ区段和所有人Jκ区段(例如，所有功能性人Vκ区段和Jκ区段)。在一些实施方案中，未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段包含所有人Vκ区段和所有人Jκ区段。例如以下中提供了包含Igκ基因区段的示例性可变区：Macdonald等人,《美国国家科学院院刊》USA 1 11:5147-52和补充信息，其以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，与内源轻链恒定区呈可操作连接的受限的未重排的人(源化)轻链可变区的特征在于所述未重排的人(源化)轻链可变区包含至多两个人VL基因区段和多个JL基因区段(例如双轻链小鼠或DLC，如美国专利第9,796,788号中所述，以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，VL基因区段是Vκ基因区段。在一些实施方案中，VL基因区段是Vλ基因区段。在一些实施方案中，Vκ基因区段是IGKV3-20和IGKV1-39。在一些实施方案中，非人动物在小鼠的内源κ轻链基因座包含可操作地连接于小鼠轻链恒定区的正好两个未重排的人Vκ基因区段和五个未重排的人Jκ基因区段，任选地其中正好两个未重排的人Vκ基因区段为人Vκ1-39基因区段和人Vκ3-20基因区段，其中五个未重排的人Jκ基因区段为人Jκ1基因区段、人Jκ2基因区段、人Jκ3基因区段、人Jκ4基因区段和人Jκ5基因区段，其中未重排的人κ轻链基因区段能够重排和编码抗体的人可变结构域，并且任选地，进一步其中非人动物不包含能够重排形成免疫球蛋白轻链可变区的内源Vκ基因区段。
在某些实施方案中，与内源轻链恒定区呈可操作连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区含有未重排的人Igλ可变区基因区段。在一些实施方案中，未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段包含多个人Vλ区段和一个或多个人Jλ区段。在一些实施方案中，未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段包含一个或多个人Vλ区段、一个或多个人Jλ区段和一个或多个人Cλ恒定区序列。在一些实施方案中，未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段包含所有人Vλ区段。在一些实施方案中，未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段包含所有人Jλ区段。例如以下中提供了包含Igλ基因区段的示例性可变区：美国专利第9,035,128号和第6,998,514号，每个专利以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，与内源轻链恒定区呈可操作连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区包含(a)一个或多个人Vλ基因区段、(b)一个或多个人Jλ基因区段和(c)一个或多个人Cλ基因区段，其中(a)和(b)可操作地连接于(c)和内源(例如啮齿动物)Cλ基因区段，并且其中内源免疫球蛋白λ轻链基因座进一步包含：一个或多个啮齿动物免疫球蛋白λ轻链强化子(Eλ)和一个或多个人免疫球蛋白λ轻链强化子(Eλ)，任选地包含三个人Eλ。
在某些实施方案中，与内源轻链恒定区呈可操作连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区包含可操作地连接于内源(例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠)Cκ基因的未重排的人Igλ可变区基因区段，使得非人动物表达包含来源于Vλ和Jλ基因区段的人λ可变结构域序列与内源κ恒定结构域融合的免疫球蛋白轻链，参见例如美国专利第9,226,484号，以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，包含未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段的免疫球蛋白可变区还包括人免疫球蛋白可变区基因间序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白可变区包括非人(例如啮齿动物、大鼠、小鼠)Ig可变区基因间序列。在一些实施方案中，基因间序列是内源物种来源。
在一些实施方案中，免疫球蛋白可变区是重排的重链可变区(通用重链可变区或共同重链编码序列)。在一些实施方案中，重排的Ig重链可变区基因是人重排的Ig重链可变区基因。示例性重链的Ig重链可变区在以下中提供：美国专利公布第20140245468号和美国专利第9,204,624号和第9,930,871号，各以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，包含通用重链可变区的非人生物体用于产生双特异性抗体。在一些实施方案中，非人动物在内源免疫球蛋白重链基因座处包含共同重链编码序列，例如可操作地连接于内源免疫球蛋白恒定区基因序列的重排的人免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，例如可操作地连接于内源重链恒定区基因序列的重排的人免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，其中重排的重链可变区核苷酸序列编码VH3-23/X1X2/JH的序列，其中X1为任何氨基酸，并且X2为任何氨基酸，其中非人动物表达来源于连接于内源重链恒定区基因序列的重排的人免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列并且任选地与人免疫球蛋白轻链可变结构域同源的免疫球蛋白重链可变结构域，例如VH3-23/X1X2/JH基因。
在一些实施方案中，免疫球蛋白可变区是重排的轻链可变区(通用轻链可变区)。在一些实施方案中，重排的Ig轻链可变区基因是人重排的Ig轻链可变区基因。示例性重排的Ig轻链可变区在以下中提供：例如美国专利第9,969,814号、第10,130,181号和第10,143,186号和美国专利公布第20120021409号、第20120192300号、第20130045492号、第20130185821号、第20130302836号和第20150313193号，各以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，包含通用轻链可变区的非人生物体(“通用轻链”生物体)用于产生双特异性抗体。在一些实施方案中，共同轻链编码序列包含可操作地连接于内源轻链恒定区的单个重排的人免疫球蛋白轻链Vκ/Jκ序列，其中单个重排的人免疫球蛋白轻链Vκ/Jκ序列为(i)包含人Vκ1-39基因区段与人Jκ5基因区段融合的人Vκ1-39/Jκ5序列，或(ii)包含人Vκ3-20基因区段与人Jκ1基因区段融合的人Vκ3-20/Jκ1序列。
在一些实施方案中，免疫球蛋白可变区为包括插入和/或替换组氨酸密码子的轻链和/或重链免疫球蛋白可变区，所述组氨酸密码子的插入和/或替换被设计成引入pH依赖性结合特性至在此类非人生物体中产生的抗体中。在一些此类实施方案中，组氨酸密码子在编码CDR3的核酸序列中插入和/或替换。各种这样的轻链和/或重链免疫球蛋白基因座在美国专利第9,301,510号、第9,334,334号和第9,801,362号和美国专利申请公布第20140013456号中提供，各以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，与内源轻链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的重排的人(源化)轻链可变区包含包括人Vκ和Jκ区段序列的单个重排的人免疫球蛋白轻链可变区基因序列，任选地其中Vκ区段序列来源于人Vκ1-39或Vκ3-20基因区段，并且其中单个重排的人免疫球蛋白轻链可变区基因序列包含Vκ区段序列的至少一个非组氨酸密码子经组氨酸密码子取代，所述组氨酸密码子在选自由以下组成的群组的位置表达：105、106、107、108、109、111和其组合(根据IMGT编号)。在一些实施方案中，与内源重链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)重链可变区包含未重排的人(源化)免疫球蛋白重链可变基因序列，所述未重排的人(源化)免疫球蛋白重链可变基因序列在互补决定区3(CDR3)编码序列中包含至少一个非组氨酸密码子经组氨酸密码子取代或插入至少一个组氨酸密码子。在一些实施方案中，未重排的人(源化)免疫球蛋白重链可变基因序列包含未重排的人VH、未重排的人DH或合成DH，和未重排的人JH基因区段，任选地其中未重排的人DH或合成DH基因区段包含至少一个非组氨酸密码子经组氨酸密码子取代或插入至少一个组氨酸密码子。在一些实施方案中，与内源重链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)轻链可变区包含未重排的VL和未重排的JL基因区段。在一些实施方案中，经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)轻链可变区包含至多两个未重排的人VL(例如至多两个Vκ基因区段)和一个或多个未重排的JL(例如Jκ)基因区段，其中至多两个人VL基因区段中的每一个在CDR3编码序列包含包含至少一个非组氨酸密码子经组氨酸密码子取代或插入至少一个组氨酸密码子。在一些实施方案中，所述至多两个未重排的人Vκ基因区段为各自包含非组氨酸密码子经组氨酸密码子一次或多次取代的人Vκ1-39和Vκ3-20基因区段，并且其中人Vκ和Jκ基因区段能够重排并且人Vκ和Jκ基因区段编码在选自由以下组成的群组的位置包含一个或多个组氨酸的人轻链可变结构域：105、106、107、108、109、111(根据IGMT编号)和其组合，其中一个或多个组氨酸来源于一次或多次取代。
在一些实施方案中，免疫球蛋白恒定区包含重链恒定区基因。在一些实施方案中，重链恒定区基因是人重链恒定区基因。在一些实施方案中，重链恒定区基因是内源物种来源。在一些实施方案中，重链恒定区基因是小鼠恒定区基因或大鼠恒定区基因。在一些实施方案中，恒定区基因是人和非人序列的混合物。例如，在一些实施方案中，恒定区基因编码人CH1区和非人(例如内源物种来源、小鼠、大鼠)CH2和/或CH3区。在一些实施方案中，重链恒定区基因是Cμ、Cδ、Cγ(Cγl、Cγ2、Cγ3、Cγ4)、Cα或Cε恒定区基因。在一些实施方案中，恒定区基因是内源恒定区基因。在一些实施方案中，恒定区基因编码突变的CH1区域，使得非人动物表达只有重链的抗体(参见例如美国专利第8,754,287号、美国专利申请公布第2015/0289489号，各以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，例如，在目标是产生重链以制备双特异性抗体的情况下(例如，在通用或双轻链生物体中)，重链的Fc结构域包含促进重链异二聚体形成和/或抑制重链同二聚体形成的修饰。这样的修饰例如在以下中提供：美国专利第5,731,168号、第5,807,706号、第5,821,333号、第7,642,228号和第8,679,785号以及美国专利公开第2013/0195849号，各以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，免疫球蛋白恒定区包含轻链恒定区基因。在一些实施方案中，轻链恒定区基因是κ恒定区基因。在一些实施方案中，轻链恒定区基因是λ恒定区基因。在一些实施方案中，轻链恒定区基因是内源物种来源。在一些实施方案中，轻链恒定区基因是小鼠恒定区基因或大鼠恒定区基因。在一些实施方案中，轻链恒定区基因是人和非人序列的混合物。
在一些实施方案中，包含人可变区基因区段的免疫球蛋白可变区和可变区基因区段可操作地连接于的免疫球蛋白恒定区基因位于内源免疫球蛋白基因座处。在一些实施方案中，内源免疫球蛋白基因座是内源重链基因座。在一些实施方案中，内源免疫球蛋白基因座是内源κ基因座。在一些实施方案中，内源免疫球蛋白基因座是内源λ基因座。在一些实施方案中，人可变区基因区段可操作地连接于的恒定区基因是内源恒定区基因。
在一些实施方案中，本文提供的非人动物的基因组中的一个或多个内源免疫球蛋白基因座或一个或多个内源基因座(例如可变区和/或恒定区)的一部分失活。可使用本领域已知的任何方法使内源免疫球蛋白可变区基因基因座和其部分失活，包括但不限于基因座或其一部分从生物体的基因组缺失、用不同核酸序列替换基因座或其一部分、基因座的一部分倒置和/或基因座的一部分移到非人生物体基因组中的另一位置。在一些实施方案中，基因座的失活仅是部分失活。在一些实施方案中，基因座的可变区是失活的，但恒定区保持功能(例如，因为其可操作地连接于非内源可变区基因区段)。
在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物包括失活的内源免疫球蛋白重链基因座。在一些实施方案中，内源免疫球蛋白重链基因座或其一部分通过内源重链基因座的内源可变区的至少一部分的缺失、替换、移位和/或倒置而失活。在一些实施方案中，缺失、替换、移位和/或倒置的内源重链基因座的可变区的至少一部分包含可变区的J区段。在一些实施方案中，内源免疫球蛋白重链基因座或其部分通过内源重链基因座的内源恒定区的至少一部分的缺失、替换、移位和/或倒置而失活。在一些实施方案中，缺失、替换、移位和/或倒置的恒定区的内源重链基因座的至少一部分包含内源恒定区的Ομ基因。
在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物包括失活的内源免疫球蛋白κ链基因座。在一些实施方案中，内源免疫球蛋白κ链基因座或其一部分通过内源κ链基因座的内源可变区的至少一部分的缺失、替换、移位和/或倒置而失活。在一些实施方案中，缺失、替换、移位和/或倒置的内源κ链基因座的可变区的至少一部分包含可变区的J区段。在一些实施方案中，内源免疫球蛋白κ链基因座或其一部分通过内源κ链基因座的内源恒定区的至少一部分的缺失、替换、移位和/或倒置而失活。在一些实施方案中，缺失、替换、移位和/或倒置的内源κ链基因座的恒定区的至少一部分包含内源恒定区的Cκ基因。
在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物包括失活的内源免疫球蛋白λ链基因座。在一些实施方案中，内源免疫球蛋白λ链基因座或其一部分通过内源λ链基因座的内源可变区的至少一部分的缺失、替换、移位和/或倒置而失活。在一些实施方案中，内源λ链基因座中的至少一个V-J-C基因簇的至少一部分缺失、替换、移位和/或倒置。在一些实施方案中，内源免疫球蛋白λ基因座或其一部分通过内源λ链基因座的内源恒定区的至少一部分的缺失、替换、移位和/或倒置而失活。在一些实施方案中，缺失、替换、移位和/或倒置的内源λ链基因座的恒定区的至少一部分包含内源恒定区的C基因。
在各种实施方案中，免疫球蛋白基因座修饰不影响非人动物的繁殖力。在一些实施方案中，重链基因座包含功能性，例如内源ADAM6a基因、ADAM6b基因或两者，并且基因修饰不影响内源ADAM6a基因、ADAM6b基因或两者的表达和/或功能。在一些实施方案中，基因修饰的非人动物的基因组还包含位于异位的功能性，例如内源ADAM6a基因、ADAM6b基因，或两者。表达外源ADAM6a和/或ADAM6b的示例性非人动物在以下中描述：美国专利第8,642,835号和第8,697,940号，各以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物还包含外源末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)以增加抗原受体多样性。在PCT公布WO 2017210586中描述了表达外源TdT的示例性非人动物，所述公布以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物包含并表达编码人或人源化MHC分子的核苷酸序列，并且表达具有人可变结构域的抗体(例如，来源于(由其编码)重排的人可变区基因区段的人可变结构域)，但缺乏特异性结合空的人或人源化MHC的抗体。在一些实施方案中，人或人源化可变结构域是人或人源化重链可变结构域。在一些实施方案中，抗体是只有重链的抗体。在一些实施方案中，人或人源化可变结构域是人或人源化轻链可变结构域。在一些实施方案中，由非人动物产生的抗体具有人或人源化重链可变结构域以及人或人源化轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗体具有人或人源化重链恒定结构域。在一些实施方案中，抗体具有人或人源化轻链恒定结构域。在一些实施方案中，重链和/或轻链恒定结构域是非人源的。例如，在一些实施方案中，重链恒定结构域是内源物种来源。在一些实施方案中，重链恒定结构域是小鼠或大鼠来源。在一些实施方案中，轻链恒定结构域是内源物种来源。在一些实施方案中，轻链恒定结构域是小鼠或大鼠来源。
非人动物、组织和细胞
在一些实施方案中，本发明的经过基因修饰的非人动物可选自由以下组成的群组：小鼠、大鼠、兔子、猪、牛(例如，母牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(例如，绒、恒河猴)。对于不容易获得合适的经过基因修饰的ES细胞的那些非人动物，采用其它方法来制备包含基因修饰的非人动物。此类方法包括例如修饰非ES细胞基因组(例如成纤维细胞或诱导的多能细胞)并利用核转移来将经过基因修饰的基因组转移至合适的细胞，例如卵母细胞，以及在适于形成胚胎的条件下在非人动物中孕育经过修饰的细胞(例如，经过修饰的卵母细胞)。
在一个实施方案中，非人动物是哺乳动物。在一个实施方案中，非人动物是例如跳鼠总科(Dipodoidea)或鼠总科(Muroidea)的小型哺乳动物。在一个实施方案中，经过基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方案中，啮齿动物是选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方案中，啮齿动物是选自鼠总科。在一个实施方案中，经过基因修饰的动物是来自选自以下的科：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠(New World rats and mice)、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、棘鼠、冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、白尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠(Malagasy rats and mice))、刺睡鼠科(Platacanthomyidae)(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一特定实施方案中，经过基因修饰的啮齿动物是选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、棘鼠和冠鼠。在一个实施方案中，经过基因修饰的小鼠是来自鼠科的成员。在一个实施方案中，非人动物是啮齿动物。在一特定实施方案中，啮齿动物是选自小鼠和大鼠。在一个实施方案中，非人动物是大鼠。在一个实施方案中，非人动物是小鼠。
在一个实施方案中，非人动物是啮齿动物，其是选自以下的C57Bl品系的小鼠：C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola。在另一实施方案中，小鼠是选自由以下品系组成的群组的129品系：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如Festing等人(1999)《129品系小鼠的命名法修订版(Revisednomenclature for strain 129mice)》,《哺乳动物基因组(Mammalian Genome)》10:836，还参见Auerbach等人(2000)《129/SvEv和C57BL/6衍生的小鼠胚胎干细胞系的建立和嵌合体分析(Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-Derived MouseEmbryonic Stem Cell Lines)》)。在一实施方案中，经过基因修饰的小鼠是前述129品系和前述C57BL/6品系的混合物。在另一特定实施方案中，小鼠是前述129品系的混合物，或前述BL/6品系的混合物。在一特定实施方案中，混合物中的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一实施方案中，小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在另一实施方案中，小鼠是BALB品系与另一种前述品系的混合物。如本文提供的非人动物可为来源于上述品系的任何组合的小鼠。
在过去十年中建立了大鼠ES细胞的靶向修饰等位基因的种系传递。参见例如美国公布第20140235933号和第20140310828号；Tong等人(2010)《自然(Nature)》467:211-215，Tong等人(2011)《自然实验手册(Nat Protoc.)》6(6):doi:10.1038/nprot.2011.338，每个参考文献以全文引用的方式并入本文中。因而，在一个实施方案中，大鼠是选自威斯塔大鼠(Wistar rat)、LEA品系、史泊格多利品系(Sprague Dawley strain)、费舍尔品系(Fischerstrain)、F344、F6和深灰鼠(Dark Agouti)。在一个实施方案中，大鼠品系是两种或更多种选自由以下组成的群组的品系的混合物：威斯塔、LEA、史泊格多利、费舍尔、F344、F6和深灰鼠。
因此，在本发明的一个实施方案，提供了一种经过基因修饰的小鼠，其中小鼠例如在其基因组中，例如在其种系基因组中，包含
(a)编码人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分的核苷酸序列，以及
(b)(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座，任选地其中(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座中的至少一个未重排，
其中所述经过基因修饰的非人动物表达所述人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，
其中所述经过基因修饰的非人动物表达包含人或人源化重链可变结构域和/或人或人源化轻链可变结构域的免疫球蛋白，并且
其中所述非人动物耐受人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，使得其在用抗原肽-MHC(pMHC)复合物进行免疫接种时产生特异性B细胞应答，所述抗原肽-MHC(pMHC)复合物包含(i)对非人动物来说为异源的肽与(ii)从中获得所述人或人源化MHC分子的人HLA分子或其一部分复合。
在一些实施方案中，小鼠包含编码第一完全人或嵌合人/鼠类MHC多肽(例如MHCIIα)的第一核苷酸序列、编码第二完全人或嵌合人/鼠类MHC多肽(例如MHC IIβ),的第二核苷酸序列和/或编码第三完全人或嵌合人/鼠类MHC多肽(例如MHC I)的第三核苷酸序列，以及任选地编码人或人源化β2微球蛋白的β2微球蛋白基因座，以及
(a)在内源重链基因座处：
(i)与内源重链恒定区呈可操作连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白重链可变区；
(ii)与内源重链恒定区呈可操作连接的受限的未重排的人(源化)重链可变区；
(iii)共同重链编码序列；
(iv)与内源重链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)重链可变区；
(v)只有重链的免疫球蛋白编码序列；或
(vi)编码杂交免疫球蛋白链的未重排的人(源化)杂交重链序列；
和/或
(b)在内源轻链基因座处：
(i)与内源轻链恒定区呈可操作连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区；
(ii)共同轻链编码序列；
(iii)与内源轻链恒定区呈可操作连接的受限的未重排的人(源化)轻链可变区；
(iv)与内源轻链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)轻链可变区；或
(v)与内源轻链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的重排的人(源化)轻链可变区，
任选地，其中所述小鼠进一步包含
(i)包含功能性ADAM6基因的人(源化)免疫球蛋白重链基因座，使得小鼠表现出野生型繁殖力；和/或
(ii)用于增加抗原受体多样性的外源末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)基因，任选地使得至少10％的重排的可变区基因包含非模板添加。
除经过基因修饰的动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)之外，还提供了一种组织或细胞，其中所述组织或细胞来源于一些实施方案的非人动物，例如其中所述组织或细胞包含(a)编码第一完全人或嵌合人/鼠类MHC多肽(例如MHC IIα)的第一核苷酸序列、编码第二完全人或嵌合人/鼠类MHC多肽(例如MHC IIβ)的第二核苷酸序列和/或编码第三完全人或嵌合人/鼠类MHC多肽(例如MHC I)的第三核苷酸序列，以及任选地编码人或人源化β2微球蛋白的β2微球蛋白基因座，和(b)其中当细胞不为B细胞时，(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座，任选地其中(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座中的至少一个未重排。
在一些实施方案中，组织或细胞表达人或人源化MHC分子和人或人源化抗原结合蛋白和/或编码人或人源化抗原结合蛋白的一个或多个可变结构域的核酸，其中所述抗原结合蛋白特异性结合对组织或细胞所源自的非人动物来说具有抗原性的pMHC复合物，例如其中pMHC复合物包含与非人动物一般耐受的人MHC(或其部分)复合的抗原肽。在某些实施方案中，细胞是CHO细胞。在一些实施方案中，细胞为由从一些实施方案的非人动物分离的B细胞与骨髓瘤细胞融合获得的杂交瘤或四源杂交瘤。在一些实施方案中，组织为抗原结合蛋白或编码其的核酸序列，其中所述抗原结合蛋白特异性结合对抗原结合蛋白所源自的非人动物来说具有抗原性的pMHC复合物，例如其中pMHC复合物包含与非人动物一般耐受的人MHC(或其部分)复合的抗原肽。
除基因工程化的非人动物以外，还提供了非人胚胎(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠胚胎)，其中非人胚胎包含如可以在示例性实施方案中用于产生非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)的供体ES细胞。在一个实施方案中，非人胚胎包含ES供体细胞，所述ES供体细胞包含人或人源化MHC I(例如MHC Iα)核苷酸序列、人或人源化MHC II(例如MHC IIα和/或MHC IIβ)核苷酸序列、(未)重排的人或人源化免疫球蛋白基因座(例如重链和/或轻链可变基因座)和/或人或人源化β2微球蛋白基因序列和宿主胚胎细胞。
在一些实施方案中，非人动物(例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠)细胞或基因组可用于产生非人动物，例如多能细胞、胚胎干(ES)细胞、生殖细胞等，其中所述细胞或基因组包含
(a)编码人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分的核苷酸序列，和
(b)(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座，任选地其中(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座中的至少一个未重排，
使得所得到的经过基因修饰的非人动物表达所述人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，
使得所得到的经过基因修饰的非人动物表达包含人或人源化重链可变结构域和/或人或人源化轻链可变结构域的免疫球蛋白，并且
使得所得到的非人动物耐受人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，从而使得其在用抗原肽-MHC(pMHC)复合物进行免疫接种时产生特异性B细胞应答，所述抗原肽-MHC(pMHC)复合物包含(i)对非人动物来说为异源的肽与(ii)从中获得所述人或人源化MHC分子的人HLA分子或其一部分复合。
在一些示例性实施方案中，细胞或基因组包含编码第一完全人或嵌合人/鼠类MHC多肽(例如MHC IIα)的第一核苷酸序列、编码第二完全人或嵌合人/鼠类MHC多肽(例如MHCIIβ),的第二核苷酸序列和/或编码第三完全人或嵌合人/鼠类MHC多肽(例如MHC I)的第三核苷酸序列，以及任选地编码人或人源化β2微球蛋白的β2微球蛋白基因座，以及
(a)在内源重链基因座处：
(i)与内源重链恒定区呈可操作连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白重链可变区；
(ii)与内源重链恒定区呈可操作连接的受限的未重排的人(源化)重链可变区；
(iii)共同重链编码序列；
(iv)与内源重链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)重链可变区；
(v)只有重链的免疫球蛋白编码序列；或
(vi)编码杂交免疫球蛋白链的未重排的人(源化)杂交重链序列；
和/或
(b)在内源轻链基因座处：
(i)与内源轻链恒定区呈可操作连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区；
(ii)共同轻链编码序列；
(iii)与内源轻链恒定区呈可操作连接的受限的未重排的人(源化)轻链可变区；
(iv)与内源轻链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)轻链可变区；或
(v)与内源轻链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的重排的人(源化)轻链可变区，
任选地，其中所述细胞或基因组进一步包含
(i)包含功能性ADAM6基因的人(源化)免疫球蛋白重链基因座，使得小鼠表现出野生型繁殖力；和/或
(ii)用于增加抗原受体多样性的外源末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)基因，使得任选地至少10％的重排的可变区基因包含非模板添加。
尽管以下实例描述了基因组包括用编码嵌合人/小鼠HLA-A2/H-2K的核酸序列替换编码小鼠H-2K蛋白质的核酸序列的基因工程化动物，但本领域技术人员将理解，类似的策略可以用于引入其它人(源化)MHC I和II基因(其它HLA-A、HLA-B和HLA-C；以及其它HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ基因，例如在内源基因座或异位基因座处，例如在ROSA26基因座处)。还提供了在内源MHC基因座处包含多种嵌合人/非人(例如，人/啮齿动物，例如人/小鼠)MHC I和MHC II基因的此类动物。这样的嵌合MHC I和MHC II蛋白的实例在美国公布第20130111617号、第20130185819号、第20130185820号和第20140245467号和美国专利第8,847,005号中描述，各以全文引用的方式并入本文中。
还提供了包含本发明的实施方案的非人动物的染色体或其片段的非人细胞。在一个实施方案中，非人细胞包含本发明的非人动物实施方案的细胞核。在一个实施方案中，非人细胞由于核转移而包含染色体或其片段。
制造经过基因修饰的非人动物
还提供了一种制造基因工程化非人动物(例如，基因工程化啮齿动物，例如小鼠或大鼠)的方法。一般来说，所述方法包含修饰非人动物的基因组、例如种系基因组以包含(a)编码第一嵌合人/非人MHC多肽的第一核酸序列、编码第二嵌合人/非人MHC多肽的第二核酸序列、编码第三嵌合人/非人MHC多肽的第三核酸序列和/或编码人或人源化β2微球蛋白多肽的β2微球蛋白基因座，和(b)编码人或人源化抗体的免疫球蛋白重链和轻链基因座。在一些实施方案中，修饰包含靶向编码内源MHC多肽胞外结构域、β2微球蛋白全部或一部分和免疫球蛋白可变区的序列，并分别用人MHC胞外结构域、人β2微球蛋白全部或一部分和人免疫球蛋白可变区替换其。
在一些实施方案中，修饰可包含繁殖相同物种的动物，例如交配。在其它实施方案中，修饰包含在一个或多个ES细胞中的依序同源重组。在一些实施方案中，ES细胞来源于经过基因修饰以包含所需的基因修饰的一个或多个(但并非全部)的非人动物，并且此类ES细胞中的同源重组完成基因修饰。在其它实施方案中，修饰可包含ES细胞中育种与同源重组的组合，例如使动物与相同物种的另一种(或更多种)动物交配，其中一些或全部非人动物可由经由单个同源重组或依序同源重组事件进行基因修饰的ES细胞产生，并且其中一些ES细胞可从包含本文所公开的基因修饰中的一种或多种的非人动物分离。在一些实施方案中，修饰包含单个ES细胞中的依序同源重组。
在一些实施方案中，所述方法利用使用VELOCIGENE㈢技术制造的靶向构建体，将所述构建体引入至ES细胞中，并使用VELOCIMQL㈢技术将靶向ES细胞克隆引入至小鼠胚胎中(参见例如美国专利第7,294,754号和Poueymirou等人(2007)《自然生物技术》25：91-99，每个参考文献以全文引用的方式并入本文中)。靶向构建体可以包含靶向待替换的内源序列的5'和/或3'同源臂、插入序列(替换内源序列)和一个或多个选择盒。选择盒是插入靶向构建体中以促进整合相关构建体的细胞(例如ES细胞)的选择的核苷酸序列。本领域中已知多种合适的选择盒。通常，选择盒在特定抗生素(例如Neo、Hyg、Pur、CM、SPEC等)存在下实现阳性选择。此外，选择盒可以通过重组位点侧接，所述重组位点允许在用重组酶处理时删除选择盒。常用的重组位点是loxP和Frt，分别由Cre和Flp酶识别，但本领域中已知其它重组位点。选择盒可位于构建体中编码区外的任何位置。在一个实施方案中，选择盒位于人DNA片段的5'末端中。在另一个实施方案中，选择盒位于人DNA片段的3'末端。在另一个实施方案中，选择盒位于人DNA片段内。在另一个实施方案中，选择盒位于人DNA片段的内含子内。在另一个实施方案中，选择盒位于人和小鼠DNA片段的接合处。F0代小鼠基本上完全来源于供体基因靶向的ES细胞，从而允许即时表型分析。通过使用等位基因分析的修改版(Valenzuela等人(2003)《小鼠基因组的高通量工程化联合高分辨率表达分析(High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolutionexpression analysis)》,《自然生物技术》21(6):652-659，以全文引用的方式并入本文中)进行基因分型来鉴定独立地负载人或人源化MHC I类基因、人或人源化β2微球蛋白基因和/或人或人源化MHCII类基因以及人源化免疫球蛋白基因座的(完全来源于供体ES细胞的F0小鼠)，所述分析检测这些独特基因序列的存在。通过所述方法产生的杂合小鼠可以繁殖成纯合的。
在一些实施方案中，包含人或人源化MHC I、β2微球蛋白、MHC II分子的非人动物与相同物种的第二非人动物交配，其中第二非人动物包含未重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或未重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座。例如，包含人或人源化MHCI、β2微球蛋白、MHC II分子的小鼠可以与第二小鼠交配，所述第二小鼠包含(a)在内源重链基因座处：
(i)与内源重链恒定区呈可操作连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白重链可变区；
(ii)与内源重链恒定区呈可操作连接的受限的未重排的人(源化)重链可变区；
(iii)共同重链编码序列；
(iv)与内源重链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)重链可变区；
(v)只有重链的免疫球蛋白编码序列；或
(vi)编码杂交免疫球蛋白链的未重排的人(源化)杂交重链序列；
和/或
(b)在内源轻链基因座处：
(i)与内源轻链恒定区呈可操作连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区；
(ii)共同轻链编码序列；
(iii)与内源轻链恒定区呈可操作连接的受限的未重排的人(源化)轻链可变区；
(iv)与内源轻链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)轻链可变区；或
(v)与内源轻链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的重排的人(源化)轻链可变区，
任选地，其中所述第二小鼠进一步包含
(i)包含功能性ADAM6基因的人(源化)免疫球蛋白重链基因座，使得小鼠表现出野生型繁殖力；和/或
(ii)用于增加抗原受体多样性的外源末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)基因，使得任选地至少10％的重排的可变区基因包含非模板添加。
在另一个实施方案中，插入人或人源化MHC I、MHC II和/或β2微球蛋白的构建体参与经过基因修饰以包含未重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或未重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座的非人动物ES细胞中的同源重组(在内源MHC I、MHC II和/或β2微球蛋白基因座处或在异位基因座处)。或者，用于插入的构建体包含未重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或未重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座，其参与经过基因修饰以包含编码人或人源化MHC I、MHC II和/或β2微球蛋白的核苷酸序列的非人动物ES细胞中的同源重组。在一个实施方案中，用编码嵌合人/小鼠MHC I、MHC II和/或β2微球蛋白的核酸序列靶向和替换内源MHC I、MHC II和/或β2微球蛋白序列的构建体，或用于插入单链MHC I/β2微球蛋白和/或单链MHC II蛋白的构建体参与ES细胞中的同源重组，所述ES细胞还可包含
(a)在内源重链基因座处：
(i)与内源重链恒定区呈可操作连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白重链可变区；
(ii)与内源重链恒定区呈可操作连接的受限的未重排的人(源化)重链可变区；
(iii)共同重链编码序列；
(iv)与内源重链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)重链可变区；
(v)只有重链的免疫球蛋白编码序列；或
(vi)编码杂交免疫球蛋白链的未重排的人(源化)杂交重链序列；
和/或
(b)在内源轻链基因座处：
(i)与内源轻链恒定区呈可操作连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区；
(ii)共同轻链编码序列；
(iii)与内源轻链恒定区呈可操作连接的受限的未重排的人(源化)轻链可变区；
(iv)与内源轻链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)轻链可变区；或
(v)与内源轻链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的重排的人(源化)轻链可变区，
任选地，其中所述ES细胞进一步包含
(i)包含功能性ADAM6基因的人(源化)免疫球蛋白重链基因座；和/或
(ii)用于增加抗原受体多样性的外源末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)基因，使得。
在本发明的各种实施方案中，编码嵌合人/非人MHC I和MHC II多肽的序列位于内源非人MHC基因座(例如，小鼠H-2K和/或H-2E基因座)处。在一个实施方案中，这导致内源MHC基因或其一部分经编码人或人源化MHC I多肽的核酸序列代替，例如替换。由于编码MHCI、MHC IIα和MHC IIβ多肽的核酸序列在染色体上的位置彼此接近，以便实现在一个动物中MHC I和MHC II的人源化最大的成功(如果需要)，所以MHC I和MHC II基因座应当依序靶向。因此，本文还提供了产生经过基因修饰的非人动物的方法，所述非人动物包含编码嵌合人/非人MHC I、MHC IIα和MHC IIβ多肽的核酸序列。
因此，在一些实施方案中，提供了一种用于产生包含嵌合人/非人MHC的经过基因修饰的动物的核苷酸构建体。在一个实施方案中，核酸构建体包含：5'和3'非人同源臂、包含人MHC基因序列(例如，人HLA-A2或人HLA-DRS基因序列)的人DNA片段以及侧接重组位点的选择盒。在一个实施方案中，人DNA片段是包含人MHC基因(例如，人HLA-A2或HLA-DR2基因)的内含子和外显子两者的基因组片段。在一个实施方案中，非人同源臂与非人MHC基因座(例如，MHC I或MHC II基因座)同源。
在一个实施方案中，5'和3'非人同源臂包含分别在内源非人(例如鼠科)MHC I类或II类基因基因座的5'和3'位置(例如，小鼠MHC I基因的第一前导序列的5'和α3外显子的3'，或小鼠H-2Ab1基因上游和小鼠H-2Ea基因下游)的基因组序列。在一个实施方案中，内源MHC I类基因座选自小鼠H-2K、H-2D和H-2L。在一特定实施方案，内源MHC I类基因座是小鼠H-2K。在一个实施方案中，内源MHC II基因座选自小鼠H-2E和H-2A。在一个实施方案中，工程化MHC II构建体允许替换小鼠H-2E和H-2A基因。在一个实施方案中，小鼠不表达来自其H-2D基因座的功能性内源MHC多肽。在一些实施方案中，小鼠进行工程化以缺乏内源H-2D基因座的全部或一部分。在另一个实施方案中，小鼠不在细胞表面上表达任何功能性内源MHCI和MHC II多肽。在一个实施方案中，只有小鼠在细胞表面上表达的MHC I和MHC II是嵌合人/小鼠MHC I和MHC II。
本公开还提供了用于制造基因组包含编码人或人源化β2微球蛋白多肽的β2个微球蛋白基因座的基因工程化的非人动物(例如，基因工程化的啮齿动物，例如小鼠或大鼠)的方法。在一个实施方案中，所述方法产生基因组在内源β2微球蛋白基因座处包含编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列的基因工程化的啮齿动物，例如小鼠。在一些情况下，小鼠不从内源小鼠β2微球蛋白基因座表达功能性小鼠β2微球蛋白。
还提供了一种用于产生基因工程化的非人动物的核苷酸构建体。在一些实施方案中，核苷酸构建体可以包含：5'和3'非人同源臂、包含β2微球蛋白序列的人DNA片段和侧接重组位点的选择盒。在一个实施方案中，人DNA片段是包含人β2微球蛋白基因的内含子和外显子两者的基因组片段。在一个实施方案中，非人同源臂与非人β2微球蛋白基因座同源。基因组片段可以包含人β2微球蛋白基因的外显子2、3和4。在一种情况下，基因组片段从5'至3'包含：外显子2、内含子、外显子3、内含子和外显子4，所有都是人β2微球蛋白序列的。选择盒可以位于构建体中β2微球蛋白编码区外部的任何地方，例如，其可以位于人β2微球蛋白的外显子4的3'。5'和3'非人同源臂可以分别包含内源非人β2微球蛋白基因的5'和3'的基因组序列。在另一个实施方案中，5'和3'非人同源臂分别包含在内源非人基因的外显子2的5'和外显子4的3'的基因组序列。
本发明的另一个实施方案涉及一种修饰非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)的β2微球蛋白基因座以表达人或人源化的β2微球蛋白多肽的方法。一种修饰非人动物、例如小鼠的β2微球蛋白基因座以表达人或人源化β2微球蛋白多肽的方法包含在内源β2微球蛋白基因座处用编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列替换编码小鼠β2微球蛋白的核苷酸序列。在此类方法的一个实施方案中，非人动物、例如小鼠不从内源非人、例如小鼠β2微球蛋白基因座表达功能性β2微球蛋白多肽。在一些特定实施方案中，编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包含人β2微球蛋白基因的外显子2至4中所示的核苷酸序列。在其它实施方案中，编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包含人β2微球蛋白基因的外显子2、3和4中所示的核苷酸序列。
本公开还提供了用于制造基因工程化的非人动物(例如基因工程化的啮齿动物，例如小鼠或大鼠)的方法，所述非人动物的基因组在异位基因座，例如ROSA26基因座处包含编码单链β2微球蛋白/MHC复合物的序列，所述复合物包含人(源化)β2微球蛋白和人(源化)MHC I类α多肽、人(源化)MHC I类α多肽和/或人(源化)β2微球蛋白。在一个实施方案中，所述方法产生一种基因工程化的啮齿动物，例如大鼠或小鼠，所述啮齿动物的基因组在不是内源MHC I或β2微球蛋白基因座的内源基因座、例如内源ROSA26基因座处包含编码单链β2微球蛋白/MHC复合物的核苷酸序列，所述复合物包含人(源化)β2微球蛋白和人(源化)MHC复合物、人(源化)MHC I类α多肽和/或人(源化)β2微球蛋白。靶向ROSA基因座的方法是本领域熟知的。参见例如Stefano Casola,《用于miRNA表达的小鼠模型：ROSA26基因座(MouseModels for miRNA expression:the ROSA26Locus)》,《分子生物学方法(Methods inMolecular Biology)》第667卷:145-163(S.Monticelli编辑2010)，以全文引用的方式并入本文中。
还提供了一种用于产生基因工程化的非人动物的核苷酸构建体。在一些实施方案中，核苷酸构筑体可包含：5'和3'非人同源臂、编码包含人(源化)β2微球蛋白和人(源化)MHC I类α多肽的单链β2微球蛋白/MHC复合物(例如如SEQ ID NO:23中所示的单链β2微球蛋白/HLA-A2复合物)的核苷酸序列以及侧接重组位点的选择盒。在一些实施方案中，核苷酸构筑体可包含：5'和3'非人同源臂、编码人(源化)MHC I类α多肽的核苷酸序列和侧接重组位点的选择盒。在一些实施方案中，核苷酸构筑体可包含：5'和3'非人同源臂、编码人(源化)β2微球蛋白的核苷酸序列和侧接重组位点的选择盒。5'和3'非人同源臂可包含侧接内源ROSA26内含子的基因组序列。
在一些实施方案中，经过基因修饰的非人动物(例如小鼠)可以包含编码以下的基因的一或两个拷贝：人或人源化MHC I；人或人源化β2微球蛋白；人或人源化MHC II(例如MHC IIα和/或MHC IIβ)；以及人或人源化免疫球蛋白重链和轻链。因此，在一些实施方案中，对于这些基因的任何或全部，非人动物可以是杂合的或纯合的。因为修饰非人动物以包含人或人MHC I、人或人源化β2微球蛋白、人或人源化MHC II(例如MHC IIα和/或MHC IIβ)的非限制性目的是使非人动物耐受人或人源化MHC分子，所以不需要这些基因的纯合性。因此，在一些实施方案中，非人动物针对编码人或人源化MHC分子的核苷酸序列可以是杂合的。相比之下，因为修饰非人动物的免疫球蛋白基因座的非限制性目的是产生针对所关注的抗原pMHC复合物的人或人源化抗体，所以在一些实施方案中，非人动物针对经过修饰的免疫球蛋白基因座可以是纯合的。
在完成基因靶向后，筛选ES细胞或经过基因修饰的非人动物以确认成功地并入所关注的外源核苷酸序列或表达外源多肽。本领域的技术人员已知多种技术，且包括(但不限于)DNA印迹(Southern blotting)、长PCR、定量PCR(例如使用TAQMAN㈢的实时PCR)、荧光原位杂交、RNA印迹(Northern blotting)、流式细胞测量术、威斯登分析(Westernanalysis)、免疫细胞化学、免疫组织化学等。在一个实例中，负载所关注的基因修饰的非人动物(例如小鼠)可通过使用Valenzuela等人.(2003),上文中所述的等位基因分析的修改版针对小鼠等位基因的丧失和/或人等位基因的获得进行筛选来鉴定。本领域的技术人员已知其它用于鉴定经过基因修饰的动物中的特定核苷酸或氨基酸序列的分析法。
所关注的抗原肽-MHC复合物
对本文所述的MHC蛋白耐受的小鼠用抗原肽-MHC复合物免疫接种以产生pMHC特异性抗原结合蛋白。在一些实施方案中，可用作抗原肽-MHC(pMHC)复合物的一部分的MHC包括天然存在的全长MHC，以及MHC的个别链(例如MHC I类α(重)链、β2微球蛋白、MHCII类α链和MHCII类β链)、MHC的此类链的个别亚基(例如MHC I类α链的α1-α3亚基、MHCII类α链的α1-α2亚基、MHCII类β链的β1-β2亚基)以及其片段、突变体和多种衍生物(包括融合蛋白)，其中此类片段、突变体和衍生物保留呈现抗原决定子以被抗原特异性TCR识别的能力。
天然存在的MHC由人类染色体6上的基因簇编码。MHC包括但不限于HLA特异性，例如A(例如A1-A74)、B(例如B1-B77)、C(例如C1-C11)、D(例如D1-D26)、DR(例如DR1-DR8)、DQ(例如DQ1-DQ9)和DP(例如DP1-DP6)。HLA特异性包括A1、A2、A3、A11、A23、A24、A28、A30、A33、B7、B8、B35、B44、B53、B60、B62、DR1、DR2、DR3、DR4、DR7、DR8和DR 11。
天然存在的MHC I类分子通过细胞结合来源于蛋白水解蛋白质、尤其内源合成蛋白质的肽。相应地获得的小型肽被输送到内质网中，在内质网中，它们与MHC I类分子缔合，然后通过高尔基体发送并呈现在细胞表面上以被细胞毒性T淋巴细胞识别。
天然存在的MHC I类分子由与β2微球蛋白缔合的α(重)链组成。重链由亚基α1-α3组成。β2微球蛋白与重链的α3亚基缔合。在某些实施方案中，β2微球蛋白和α3亚基通过共价结合缔合。在某些实施方案中，β2微球蛋白和α3亚基非共价地缔合。重链的α1和α2亚基折叠以形成用于有待展现和被TCR识别的肽，例如抗原决定子的槽。
I类分子通常与长约8-9个氨基酸(例如7-11个氨基酸)的肽缔合，例如结合。所有人均具有三种与六种之间的不同I类分子，这些分子可各自结合许多不同类型的肽。
在一些实施方案中，pMHC复合物包含(i)I类MHC多肽或其片段、突变体或衍生物，以及任选地，(ii)β2微球蛋白多肽或其片段、突变体或衍生物。在一个特定实施方案，I类MHC多肽通过肽连接子来与β2微球蛋白多肽缔合，例如连接。
在一个特定实施方案，I类MHC多肽是选自由HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G组成的群组的人I类MHC多肽。在另一特定实施方案，I类MHC多肽是选自由H-2K、H-2D、H-2L、H2-IA、H2-IB、H2-IJ、H2-IE和H2-IC组成的群组的鼠类I类MHC多肽。
在一些实施方案中，抗原pMHC复合物的MHC I类α重链是完全人的。在一些实施方案中，抗原pMHC复合物的MHC I类α重链被人源化。人源化MHC I类α重链描述于例如美国专利公布第2013/0111617号、第2013/0185819号和第2014/0245467号中。在一些实施方案中，MHC I类α重链包含人胞外结构域(人α1、α2和/或α3结构域)和另一种物种的胞浆结构域。在一些实施方案中，I类α重链多肽是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-K或HLA-L。在一些实施方案中，HLA-A序列可以是HLA-A*0201序列。在各种实施方案中，肽-MHC可包括MHC I类重链的所有结构域。
在一些实施方案中，抗原pMHC复合物包含β2微球蛋白。在一些实施方案中，β2微球蛋白是完全人的。在一些实施方案中，β2微球蛋白被人源化。人源化β2微球蛋白多肽描述于例如美国专利公布第2013/0111617号和第2013/0185819号，每个公布以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，抗原pMHC复合物的MHC I类分子包含人(源化)β2微球蛋白(β2m或Β2M)多肽中和人(源化)MHC I类α重链中的突变，使得二硫键可在人(源化)Β2M与人(源化)MHC I类α重链之间形成。在一些实施方案中，二硫键连接以下残基对之一：人(源化)Β2M残基12、人(源化)MHC I类α重链残基236；人(源化)Β2M残基12、人(源化)MHC I类α重链残基237；人(源化)Β2M残基8、人(源化)MHC I类α重链残基234；人(源化)Β2M残基10、人(源化)MHC I类α重链残基235；人(源化)Β2M残基24、人(源化)MHC I类α重链残基236；人(源化)Β2M残基28、人(源化)MHC I类α重链残基232；人(源化)Β2M残基98、人(源化)MHC I类α重链残基192；人(源化)Β2M残基99、人(源化)MHC I类α重链残基234；人(源化)Β2M残基3、人(源化)MHC I类α重链残基120；人(源化)Β2M残基31、人(源化)MHC I类α重链残基96；人(源化)Β2M残基53、人(源化)MHC I类α重链残基35；人(源化)Β2M残基60、人(源化)MHC I类α重链残基96；人(源化)Β2M残基60、人(源化)MHC I类α重链残基122；人(源化)Β2M残基63、人(源化)MHC I类α重链残基27；人(源化)Β2M残基Arg3、人(源化)MHC I类α重链残基Gly 120；人(源化)Β2M残基His31、人(源化)MHC I类α重链残基Gln96；人(源化)Β2M残基Asp53、人(源化)MHC I类α重链残基Arg35；人(源化)Β2M残基Trp60、人(源化)MHC I类α重链残基Gln96；人(源化)Β2M残基Trp60、人(源化)MHC I类α重链残基Asp 122；人(源化)Β2M残基Tyr63、人(源化)MHC I类α重链残基Tyr27；人(源化)Β2M残基Lys6、人(源化)MHCI类α重链残基Glu232；人(源化)Β2M残基Gln8、人(源化)MHC I类α重链残基Arg234；人(源化)Β2M残基Tyr 10、人(源化)MHC I类α重链残基Pro235；人(源化)Β2M残基Serl l、人(源化)MHC I类α重链残基Gln242；人(源化)Β2M残基Asn24、人(源化)MHC I类α重链残基Ala236；人(源化)Β2M残基Ser28、人(源化)MHC I类α重链残基Glu232；人(源化)Β2M残基Asp98、人(源化)MHC I类α重链残基His 192；人(源化)Β2M残基Met99、人(源化)MHC I类α重链残基Arg234和/或人(源化)Β2M残基Arg 12、人(源化)MHC I类α重链残基Gly237。参见例如国际专利申请公布WO/2015195531，以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，抗原决定性氨基酸序列可以是可与MHC I类分子缔合，例如被MHC I类分子呈递的肽的氨基酸序列。在某些实施方案中，序列可包含6至20个相连氨基酸。在某些实施方案中，肽序列可以是蛋白质片段，其中蛋白质来源于例如细胞蛋白的一部分，例如与自身免疫疾病相关的蛋白质，并且其中肽可结合于MHC I类重链。
在一些实施方案中，MHC的至少一条链与肽缔合成融合蛋白。在一个实施方案中，MHC和肽通过连接子序列缔合。例如，单链分子从氨基到羧基端可以包含抗原决定子、β2微球蛋白序列和I类α(重)链序列。或者，单链分子从氨基到羧基端可以包含抗原决定子、I类α(重)链序列和β2微球蛋白序列。先前已描述了呈单链三聚体的pMHC复合物的产生和使用。参见例如美国专利第8,895,020号；美国专利第8,992,937号；Hansen等人(2010)《免疫学趋势》31:363-69；Truscott等人(2007)《免疫学杂志》178:6280-89；Mitaksov等人(2007)《化学生物(Chem Biol)》14:909-22，各以全文引用的方式并入本文中单链pMHC复合物还可以在氨基端处包含信号肽序列。在某些实施方案中，在肽序列与β2微球蛋白序列之间可以存在连接子序列。在某些实施方案中，在β2微球蛋白序列与I类α(重)链序列之间可以存在连接子序列。单链分子还可以在氨基端处包含信号肽序列，以及在肽序列与β2微球蛋白序列之间延伸的第一连接子序列，和/或在β2微球蛋白序列和I类重链序列之间延伸的第二连接子序列。
在一些实施方案中，单链pMHC复合物可包含在肽配位体区段与β2微球蛋白区段之间的第一柔性连接子。例如，连接子可从肽配位体区段的羧基端延伸至β2微球蛋白区段的氨基端并连接。在一些实施方案中，连接子经结构化以允许所连接的肽配位体折叠到结合槽中，从而产生功能性MHC-抗原肽。在一些实施方案中，所述连接子可包含至少3个氨基酸、最多约15个氨基酸(例如，20个氨基酸)。在一些实施方案中，单链分子可以包含插入在β2微球蛋白与MHC I重链区段之间的第二柔性连接子。例如，连接子可从β2微球蛋白区段的羧基端延伸至MHC I重链区段的氨基端并连接。在某些实施方案中，β2微球蛋白和MHC I重链可折叠到结合槽中，从而产生可以在促进T细胞扩增中起作用的分子。
pMHC复合物中使用的合适的连接子可具有许多合适长度的任一种，例如1个氨基酸(例如，Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可为1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。示例性连接子包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)(SEQ ID NO：1)和(GGGS)(SEQ ID NO：2)，其中n为至少一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其它柔性连接子。可以使用甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物；Gly和Ser均是相对未结构化的，因此可充当组分之间的中性拴绳。可使用甘氨酸聚合物；甘氨酸可获得比甚至丙氨酸显著更多的phi-psi空间，并且比具有较长侧链的残基的限制少得多(参见Scheraga,《计算化学评述(Rev.Computational Chem.)》1 1173-142(1992)，以全文引用的方式整体并入本文中)。示例性连接子可包含包括但不限于以下的氨基酸序列：GGSG(SEQ ID NO:3)、GGSGG(SEQ IDNO:4)、GSGSG(SEQ ID NO:5)、GSGGG(SEQ ID NO:6)、GGGSG(SEQ ID NO:7)、GSSSG(SEQ IDNO:8)、GCGASGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:9)、GCGASGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:10)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:11)、GGGASGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:12)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:13)或GGGASGGGGS(SEQ ID NO:14)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:15)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:16)、GCGGS(SEQ ID NO:21)等。在一些实施方案中，连接子多肽包括半胱氨酸残基，其可以与第二多肽中存在的半胱氨酸残基形成二硫键。
在某些实施方案中，单链pMHC复合物可包含经由二硫桥(即，两个半胱氨酸之间的二硫键)共价连接到MHC I类α(重)链的肽。参见例如美国专利第8,992,937号和第8,895,020号，各以全文引用的方式并入本文。在某些实施方案中，二硫键包含位于从抗原肽的羧基端延伸的连接子内的第一半胱氨酸，和位于MHC I类重链(例如，具有用于抗原肽的非共价结合位点的MHC I类α(重)链)内的第二半胱氨酸。在某些实施方案中，第二半胱氨酸可为MHC I类α(重链)中的突变(添加或取代)。在某些实施方案中，单链分子可包含一条连续多肽链以及二硫桥。在某些实施方案中，单链分子可包含两条连续多肽链，其通过二硫桥作为唯一共价连接来连接。在一些实施方案中，连接序列可以包含除半胱氨酸之外的至少一个氨基酸，包括一个或多个甘氨酸、一个或多个丙氨酸和/或一个或多个丝氨酸。在一些实施方案中，单链分子从N端至C端包含MHC I类肽(例如抗原肽)、包含第一半胱氨酸的第一连接子、人(源化)β2-微球蛋白序列、第二连接子和包含第二半胱氨酸的人(源化)MHC I类重链序列，其中第一半胱氨酸和第二半胱氨酸包含二硫桥。在一些实施方案中，第二半胱氨酸是选自由T80C、Y84C和N86C组成的群组的人(源化)MHC I类重链的氨基酸的取代(Y84C是指成熟蛋白中的位置108处的突变，其中成熟蛋白缺乏信号序列。或者，当蛋白质仍包括24聚体信号序列时，该位置代之以称为Y108C)。
在某些实施方案中，如果pMHC复合物包含在肽的C端与β2微球蛋白之间延伸的Gly-Ser连接子中的第一半胱氨酸以及在近侧重链位置中的第二半胱氨酸，那么二硫桥可连接pMHC复合物的I类槽中的抗原肽。
在一些实施方案中，β2微球蛋白序列可以包含全长(人或非人)β2微球蛋白序列。在某些实施方案中，β2微球蛋白序列缺乏前导肽序列。因而，β2微球蛋白序列可以包含约99个氨基酸，并且可以是人β2微球蛋白序列(Genebank AF072097.1)。
在一些实施方案中，pMHC复合物包含与人β2微球蛋白融合的人HLA I类分子。在一些实施方案中，与人β2微球蛋白融合的人HLA I类分子包含一个或多个连接子，例如连接HLA分子和β2微球蛋白的连接子和/或连接肽至与人β2微球蛋白融合的人HLA I类分子的连接子。在一些实施方案中，编码pMHC复合物的核苷酸序列可以包含编码人HLA和β2微球蛋白的序列。在一些实施方案中，编码pMHC复合物的核苷酸序列可以包含编码人HLA和β2微球蛋白和一个或多个连接子的序列。在一些实施方案中，编码pMHC复合物的核苷酸序列可以包含编码人HLA和β2微球蛋白的序列，以及编码标签(例如，绿色荧光蛋白)或标签(例如，c-myc、组氨酸标签等)的序列。在一些实施方案中，编码pMHC复合物的核苷酸序列可以包含编码人HLA和β2微球蛋白的序列、编码连接子的序列以及编码标记或标签的序列。编码示例性人HLA和β2微球蛋白和一个或多个连接子的核苷酸序列的非限制性实例示为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19。由其编码的氨基酸序列分别示为SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20。
所关注的肽可以附连到SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20的N端GCGGS连接子序列(SEQ ID NO:21)，其中连接子的半胱氨酸与人HLA-A2多肽的Y108C氨基酸形成二硫桥。因此，在一些实施方案中，非人动物用氨基酸序列包含如SEQ ID NO:18所示的序列或如SEQID NO:20所示的序列的pMHC复合物免疫接种和/或加强。在一些实施方案中，非人动物用编码具有包含如SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20所示的序列的氨基酸序列的pMHC复合物的DNA免疫接种。
在一些实施方案中，辅助T细胞表位，例如PADRE可与单链pMHC复合物的C端连接。参见例如美国专利第6,413,935号和Alexander J.等人(1994)《免疫性(Immunity)》1:751-61，各以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，PADRE直接连接至单链pMHC复合物的C端。在实施方案中，PADRE通过连接子连接至单链pMHC复合物的C端。在一些实施方案中，本文所述的免疫方案包含向非人动物施用在C端连接至PADRE的单链pMHC复合物。在一些实施方案中，在C端连接至PADRE的单链pMHC复合物包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，pMHC复合物可以是如以下中所公开的pMHC复合物：美国专利第4,478,82号、第6,011,146号、第8,895,020号、第8,992,937号；WO 96/04314；Mottez等人《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》181:493-502,1995；Madden等人《细胞(Cell)70:1035-1048,1992；Matsumura等人,Science 257:927-934,1992；Mage等人,《美国国家科学院院刊》89:10658-10662,1992；Toshitani等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Nat'l Acad.Sci.)》93:236-240,1996；Chung等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》163:3699-3708,1999；Uger和Barber,《免疫学杂志》160:1598-1605,1998；Uger等人,《免疫学杂志》162,第6024-6028页,1999；White等人,《免疫学杂志》162:2671-2676,1999；每个公布以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，pMHC复合物包含II类MHC多肽或其片段、突变体或衍生物。在一个特定实施方案，MHC包含II类MHC分子或其片段、突变体或衍生物的α和β多肽。在一个特定实施方案，α和β多肽通过肽连接子连接。在一个特定实施方案，MHC包含选自由HLA-DP、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DM和HLA-DO组成的群组的人II类MHC分子的α和β多肽。
MHC II类分子通常由两条多肽链α和β组成。链可来自DP、DQ或DR基因组。存在约40种已知的不同人MHC II类分子。所有均具有相同的基础结构，但在分子结构上有微妙的不同。MHC II类分子结合13-18个氨基酸长度的肽。
在一些实施方案中，抗原pMHC复合物包含一个或多个MHC II类α链。在一些实施方案中，MHC II类α链是完全人的。在一些实施方案中，MHC II类α链被人源化。人源化MHC II类α链描述于例如美国专利第8,847,005号和第9,043,996号和美国专利公布第2014/0245467号中。在一些实施方案中，人源化MHC II类α链多肽包含人胞外结构域和另一种物种的胞浆结构域。在一些实施方案中，II类α链是HLA-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA、HLA-DQC或HLA-DRA。在一些实施方案中，II类α链多肽是人源化HLA-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA、HLA-DQA和/或HLA-DRA。
在一些实施方案中，病毒颗粒包含一个或多个MHC II类β链。在一些实施方案中，MHC II类β链是完全人的。在一些实施方案中，MHC II类β链多肽被人源化。人源化MHC II类β链多肽描述于例如美国专利第8,847,005号和第9,043,996号和美国专利公布第2014/0245467号中。在一些实施方案中，人源化MHC II类β链包含人胞外结构域和另一种物种的胞浆结构域。在一些实施方案中，II类β链是HLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB、HLA-DQB或HLA-DRB。在一些实施方案中，II类β链是人源化HLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB、HLA-DQB和/或HLA-DRB。
在一些实施方案中，抗原pMHC复合物中包含的抗原决定子(例如肽)可包含能够以使得pMHC复合物可结合TCR的方式例如以特定方式，与MHC蛋白结合的任何肽。
实例包括通过水解而产生的肽，并且最典型地是合成产生的肽，包括随机产生的肽、特别设计的肽，以及其中氨基酸位置中的至少一些在若干肽中保守并且剩余位置是随机的肽。
在本质上，通过水解产生的肽在抗原结合于MHC蛋白之前进行水解。I类MHC通常呈递来源于在细胞的细胞质中主动合成的蛋白质的肽。相比之下，II类MHC通常呈递来源于进入细胞内源通路的外源蛋白质或来源于在ER中合成的蛋白质的肽。细胞内运输允许肽变得与MHC蛋白相关联。
肽与MHC肽结合槽的结合可控制由TCR识别的MHC和/或肽氨基酸残基或由如本文公开的基因修饰的动物产生的pMHC结合蛋白的空间布置。这种空间控制部分地归因于在肽和MHC蛋白之间形成的氢键。基于肽结合各种MHC的方式，可确定主要MHC锚定氨基酸和在不同肽之间变化的表面暴露的氨基酸。在一些实施方案中，MHC结合肽的长度为5至40个氨基酸残基，例如6至30个氨基酸残基，例如8至20个氨基酸残基，例如9个与11个氨基酸残基之间，包括长度在5个与40个氨基酸之间的任何大小的肽，以整数递增(即，5、6、7、8、9...40)。虽然天然MHC II类结合肽在约9-40个氨基酸变化，但在几乎所有情况下，肽可截短至9-11个氨基酸核心而不损失MHC结合活性或T细胞识别。
肽包括包含选自由与自身免疫疾病相关的人自身蛋白、致病源的蛋白质(例如，细菌、病毒或寄生生物体)、过敏原和肿瘤相关蛋白组成的群组的蛋白质的至少一部分，例如抗原决定子。在一个实施方案中，pMHC复合物包含与自身免疫疾病相关的人自身蛋白的抗原决定子。在另一个实施方案中，pMHC复合物包含过敏原的抗原决定子。在另一个实施方案中，pMHC复合物包含细菌的抗原决定子。在另一个实施方案中，pMHC复合物包含病毒的抗原决定子。在另一个实施方案中，pMHC复合物包含寄生虫的抗原决定子。
通过柔性连接子将肽附连至MHC I类或MHC II类分子具有确保肽在生物合成、运输和呈现过程中占据MHC并保持与MHC缔合的优势。作为替代方法，在一些实施方案中，MHC和肽分开表达。
特异性结合所关注的抗原pMHC复合物的抗原结合蛋白、核酸构建体、细胞和其制造方法
在一个实施方案中，提供了编码特异性结合抗原pMHC复合物的抗原结合结构域的可变结构域的核酸和表达核酸的细胞。
在一个实施方案中，提供了来自非人动物的核酸序列用于制造供制造人治疗剂用的细胞系的用途。在一个实施方案中，人治疗剂是包含人抗原结合结构域和人Fc区的结合蛋白。
在一个实施方案中，提供了一种表达系统，其包含哺乳动物宿主细胞，所述哺乳动物宿主细胞包含：编码包含与人CH区域融合的体细胞突变的人重链可变结构域的多肽的核酸和/或编码包含与人CL区域融合的体细胞突变的人轻链可变结构域的多肽的核酸，其中VH和VL结构域是同源的。
在一个实施方案中，合适的宿主细胞选自B细胞、杂交瘤、四源杂交瘤、CHO细胞、COS细胞、293细胞、Hela细胞和表达病毒核酸序列的人视网膜细胞(例如PERC.6TM细胞(Creative Biolabs))。
在一个实施方案中，提供了一种用于制造结合蛋白的方法，其从如本文所公开的非人动物分离细胞或核酸，其中所述细胞或核酸包含或编码特异性结合所关注的pMHC复合物的抗原结合蛋白。在一些实施方案中，所述方法进一步包含以及将编码人重链或轻链可变区序列的核苷酸序列(可编码经过组氨酸修饰的人重链可变结构域和/或经过组氨酸修饰的人轻链可变结构域，也可以或独立地为通用轻链可变结构域)与编码人CH或CL区域的基因同框选殖，以形成人结合蛋白序列，并在合适细胞中表达人结合蛋白序列。
在一个实施方案中，非人动物已经用所关注的pMHC复合物免疫接种，并且人抗原结合结构域特异性结合(例如，KD在微摩尔、纳摩尔或皮摩尔范围内)所关注的pMHC复合物的表位。在一个实施方案中，在非人动物中编码VH和/或VL结构域的核苷酸序列发生体细胞突变。
在一个实施方案中，提供了一种用于制造结合所关注的pMHC复合物的抗原结合蛋白的方法，所述方法包含：
(1)将非人动物用所关注的pMHC复合物进行免疫接种，其中所述非人动物在其基因组中包含
(i)编码人(源化)MHC分子或至少其肽结合部分的核苷酸序列，以及
(ii)(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座，使得所述非人动物能够提供包含人或人源化抗原结合结构域、例如人或人源化可变结构域的人或人源化抗原结合蛋白，
任选地，其中(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座中的至少一个未重排；
(2)允许所述非人动物对所关注的pMHC复合物或连接至载体的所关注的pMHC复合物发起免疫应答；
(3)从所述免疫非人动物分离细胞(例如，淋巴细胞)，其中所述细胞包含编码人重链和轻链轻链可变结构域的第一免疫球蛋白可变区核酸序列和第二免疫球蛋白可变区核酸序列(其中每一个可独立地为经过组氨酸修饰的并且轻链可变结构域可以是共同轻链可变结构域)，所述重链和轻链可变结构域形成特异性结合所关注的pMHC复合物的抗原结合结构域；
(4)鉴定编码免疫球蛋白重链和轻链可变结构域的免疫球蛋白重链和轻链可变区核酸序列，所述免疫球蛋白重链和轻链可变结构域在配对时特异性结合所关注的pMHC复合物或连接至载体的所关注的pMHC复合物；以及
(5)在适于表达抗原结合蛋白的表达系统中表达(d)的核酸序列，以形成抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含结合所关注pMHC复合物的重链和轻链可变结构域的二聚体。
在一些实施方案中，提供了一种用于制造结合所关注的pMHC复合物的抗原结合蛋白的方法，所述方法包含：
(1)将非人动物用所关注的pMHC复合物进行免疫接种，其中所述非人动物在其基因组中包含
(i)编码人(源化)MHC分子或至少其肽结合部分的核苷酸序列，以及
(ii)(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座，使得所述非人动物能够提供包含人或人源化抗原结合结构域、例如人或人源化可变结构域的人或人源化抗原结合蛋白，
任选地，其中(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座中的至少一个未重排；
(2)获得分别编码特异性结合所关注的pMHC的抗体的人(源化)免疫球蛋白重链可变结构域和/或人(源化)免疫球蛋白轻链可变结构域的人(源化)免疫球蛋白重链可变区序列和/或人(源化)免疫球蛋白轻链可变区序列，
(c)采用人(源化)免疫球蛋白重链可变区序列和/或人(源化)免疫球蛋白轻链可变区序列产生结合pMHC的抗体。
在一些实施方案中，从非人动物(例如，从脾或淋巴结)回收细胞(例如B细胞)。细胞可与骨髓瘤细胞系融合以制备无限增殖杂交瘤细胞系，并且对这些杂交瘤细胞系进行筛选和选择以鉴定出产生对用于免疫接种的抗原具有特异性的含有杂交重链的抗体的杂交瘤细胞系。
在一个实施方案中，免疫接种包含用所关注的pMHC复合物对非人动物进行初免(例如施用)，允许非人动物休息一段时间，并用所关注的pMHC复合物对非人动物再次免疫接种(例如增强免疫应答)。在一些实施方案中，所述方法包含同时用辅助T细胞表位，例如全DR T辅助表位(PADRE)对非人动物进行免疫接种和/或增强。参见例如美国专利第6,413,935号和Alexander J.等人(1994)《免疫性》1:751-61，各以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，所述方法包含用所关注的pMHC复合物对非人动物进行初免，并且用连接至辅助T细胞表位(例如PADRE)的所关注的pMHC复合物增强免疫动物。在一些实施方案中，所述方法包含用连接至辅助T细胞表位的所关注的pMHC复合物对非人动物进行初免和增强。在包含用PADRE进行初免和/或增强的实施方案中，非人动物为包含C57/Bl6基因背景的小鼠，例如为选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10C和C57BL/Ola的C57BL品系的小鼠，或为上述C57BL/6品系与例如129、BALB等另一品系的混合物。在一些实施方案中，在非人动物初免和非人动物增强之间的时间段为几天、至少一周、至少两周、至少三周、至少四周或至少一个月。
在一个实施方案中，提供一种在非人动物中制造的免疫球蛋白可变区(VR)(例如包含重排的人VH/DH/JH基因序列或重排的人VL/JL基因序列，其可以分别和独立地为经过组氨酸修饰的重排的人VH/DH-/JH基因序列或重排的人VL/JL基因序列，后者也可以或独立地为共同重排的人VL/JL基因序列)。在一个实施方案中，重排的VH/DH/JH基因序列与一个或多个人重链恒定区序列(例如选自人或小鼠CH1、铰链、CH2、CH3和其组合)融合，或重排的VL/JL基因序列与人轻链恒定区序列融合。本文还提供了在本发明的实施方案的非人动物中制造和/或由从非人动物分离的核酸序列编码的结合蛋白的免疫球蛋白可变结构域氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供在本发明的实施方案的非人动物中制造或来源于在本发明的实施方案的小鼠中制造的序列的结合蛋白或其抗原结合片段(例如Fab、F(ab)2、scFv)。
双特异性结合蛋白
提供了包含特异性结合所关注的pMHC复合物的人可变结构域的免疫球蛋白样结合蛋白。还提供了表达此类结合蛋白的细胞、制造其的小鼠以及相关方法和组合物。
在一些实施方案中，结合蛋白和编码其的核苷酸序列可用于制备多特异性结合蛋白，例如双特异性结合蛋白。在此实施方案中，包含第一重链可变结构域的第一多肽可与包含第二重链可变结构域的第二多肽缔合。当第一重链可变结构域和第二重链可变结构域特异性结合不同表位时，可使用两个重链可变结构域制造双特异性结合分子。CH区可相同或不同。在一个实施方案中，例如，CH区中的一个可以进行修饰以便消除蛋白A结合决定子，而其它重链恒定区不如此进行修饰(参见美国专利第8,586,713B2号，以全文引用的方式并入本文中)。这种特定的布置简化了双特异性结合蛋白与例如均二聚体的混合物(例如第一多肽或第二多肽的均二聚体)的分离。在一些实施方案中，双特异性pMHC结合蛋白关于蛋白A结合可以是异二聚体的，并且可以包含
a.第一多肽，其从N端至C端包含选择性结合第一表位的第一表位结合区、包含选自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的第一CH3区的免疫球蛋白恒定区，其中所述第一CH3区结合蛋白A；以及
b.第二多肽，其从N端至C端包含选择性结合第二表位的第二表位结合区、包含选自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的第二CH3区的免疫球蛋白恒定区，其中第二CH3区包含减少或消除第二CH3区与蛋白A的结合的修饰。在一些实施方案中，修饰选自由以下组成的群组：IMGT外显子编号系统中的(a)95R和(b)95R和96F，或EU编号系统中的(a')435R和(b')435R和436F。在一些实施方案中，第二CH3区还包含选自由以下组成的群组的一至五个修饰：IMGT外显子编号系统中的16E、18M、44S、52N、57M和82I，或EU编号系统中的356E、358M、384S、392N、397M和422I。
在一个实施方案中，使用所述方法和组合物制造双特异性结合蛋白。在此实施方案中，与CH区融合的第一VH和与CH区融合的第二VH各独立地与相同同种型的人IgG序列(例如人IgG1、IgG2或IgG4)同框克隆。第一VH特异性结合第一pMHC复合物，并且第二VH特异性结合第二pMHC复合物。第一表位和第二表位可在不同pMHC上，或在相同pMHC复合物上。
在一个实施方案中，与第一VH融合的CH区的IgG同种型和与第二VH融合的CH区的IgG同种型是相同同种型，但不同之处在于一种IgG同种型包含至少一个氨基酸取代。在一个实施方案中，至少一个氨基酸取代使得负载取代的重链与缺乏取代的重链相比不能或基本上不能结合蛋白A。
在一个实施方案中，第一CH区包含选自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的第一CH3结构域；并且CH区包含选自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的第二CH3结构域，其中所述第二CH3结构域包含减少或消除第二CH3结构域与蛋白A结合的修饰(参见美国专利8,586,713B2，以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，第二CH3结构域包含根据EU编号系统编号的435R修饰。在另一实施方案中，第二CH3结构域进一步包含根据EU编号系统编号的436F修饰。
在一个实施方案中，第二CH3结构域为包含选自由根据EU编号系统编号的D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I组成的群组的修饰的人IgG1的CH3结构域。
在一个实施方案中，第二CH3结构域为包含选自由根据EU编号系统编号的N384S、K392N和V422I组成的群组的修饰的人IgG2的CH3结构域。
在一个实施方案中，第二CH3结构域为包含选自由根据EU编号系统编号的Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I组成的群组的修饰的人IgG4的CH3结构域。
在一个实施方案中，结合蛋白包含具有如本文所述的一种或多种修饰的CH区，其中所述结合蛋白的恒定区在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。在一特定实施方案中，CH区包含在人中不呈递免疫原性表位的氨基酸序列。在另一个特定实施方案中，结合蛋白包含在野生型人重链中未发现的CH区，并且CH区不包含产生T细胞表位的序列。
在一个实施方案中，Fc结构域可被修饰成具有改变的Fc受体结合，这又影响效应子功能。包括Fc结构域的工程化的重链恒定区(CH)是嵌合的。像这样，嵌合的CH区组合来源于多于一种免疫球蛋白同种型的CH结构域。例如，嵌合的CH区包含与来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4分子的CH3结构域的部分或全部组合的源自人IgG1、人IgG2或人IgG4分子的CH2结构域的部分或全部。嵌合CH区也可以含有嵌合铰链区。举例来说，嵌合铰链可以包含与来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下铰链”序列(根据EU编号，位置228至236的氨基酸残基)组合的来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上铰链”氨基酸序列(根据EU编号，位置216至227的氨基酸残基)。在一些实施方案中，嵌合铰链区包含来源于人IgG1或人IgG4上铰链的氨基酸残基和来源于人IgG2下铰链的氨基酸残基。
对于某些疗法来说，Fc结构域可以进行工程化，以激活正常Fc效应子功能的全部、一些或不激活，而不影响含Fc的蛋白(例如抗体的)所需药代动力学特性。关于包含嵌合CH区且具有改变的效应子功能的蛋白质的实例，参见以引用的方式并入本文中的美国专利第9,359,437号。在一些实施方案中，pMHC结合蛋白包含重组多肽，所述重组多肽包含重链恒定(CH)区，所述CH区从N端至C端包含CH1结构域、嵌合铰链、CH2结构域和CH3结构域，其中：(a)CH1结构域从位置212至215(EU编号)包含氨基酸序列DKKV或DKRV，(b)嵌合铰链从位置216至227(EU编号)包含人IgG1或人IgG4上铰链氨基酸序列并且从位置228至236(EU编号)包含人IgG2下铰链氨基酸序列PCPAPPVA(SEQ ID NO:29),(c)CH2结构域从位置237至340(EU编号)包含包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的人IgG4CH2结构域氨基酸序列，并且(d)CH3结构域从位置341至447(EU编号)包含人IgG1或人IgG4CH3结构域序列。
在一些实施方案中，双特异性抗体可以具有各具有共同轻链作为同源VL结构域的第一VH和第二VH。
破坏对内源肽的耐受性
用抗原pMHC对非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)进行免疫接种以获得特异性pMHC结合蛋白取决于非人动物中的内源蛋白质与被呈递用来使非人动物的免疫系统能够将所关注的pMHC复合物识别为非自身(即，外来)的异源蛋白质之间序列的差异。与自身pMHC具有高度同源性的针对pMHC的抗体的产生可能是一项困难的任务，因为对自身pMHC具有免疫学耐受性。破坏对与所关注的肽同源的自身肽的耐受性的方法是熟练技术人员众所周知的，参见例如以全文引用的方式并入本文中的美国公布第20170332610号。在一些实施方案中，破坏对内源肽的耐受性的方法包含修饰本文中的非人动物以使与所关注的肽具有高度同源性的自身肽包含缺失，例如基因敲除突变。
药物组合物
在某些实施方案中，本文提供了一种组合物，例如药物组合物，其含有与药学上可接受的载体一起配制的至少一种pMHC结合蛋白。
本文所提供的药物组合物可以专门配制用于以固体或液体形式施用，包括适用于以下各项的那些：(1)经口施用，例如大剂量药液(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂(例如目标是经颊、舌下和全身吸收的片剂)、大丸剂、散剂、颗粒、用于施加至舌的糊剂；或(2)例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射的肠胃外施用，例如无菌溶液或悬浮液或持续释放制剂。
在一些实施方案中，适用于肠胃外施用的本文所提供的药物组合物包含本发明的某些实施方案的一种或多种治疗剂与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非性水溶液、分散液、悬浮液或乳液，或可在临使用之前复原成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末的组合，其可含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。
可用于本文所提供的药物组合物中的合适水性载体和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如但不限于甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯，例如油酸乙酯。可以例如通过使用如卵磷脂等包衣材料，通过在分散液的情况下维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
在某些实施方案中，组合物包含浓度产生适合于期望剂量的w/v的pMHC结合蛋白。pMHC结合蛋白可以如下浓度存在于组合物中：至少1mg/mL、至少5mg/mL、至少10mg/mL、至少15mg/mL、至少20mg/mL、至少25mg/mL、至少30mg/mL、至少35mg/mL、至少40mg/mL、至少45mg/mL、至少50mg/mL、至少55mg/mL、至少60mg/mL、至少65mg/mL、至少70mg/mL、至少75mg/mL、至少80mg/mL、至少85mg/mL、至少90mg/mL、至少95mg/mL、至少100mg/mL、至少105mg/mL、至少110mg/mL、至少115mg/mL、至少120mg/mL、至少125mg/mL、至少130mg/mL、至少135mg/mL、至少140mg/mL、至少150mg/mL、至少200mg/mL、至少250mg/mL或至少300mg/mL。在一些实施方案中，pMHC结合蛋白可以1mg/mL至300mg/mL的浓度存在于组合物中。在一些实施方案中，pMHC结合蛋白可以5mg/mL至250mg/mL的浓度存在于组合物中。在一些实施方案中，pMHC结合蛋白可以10mg/mL至200mg/mL的浓度存在于组合物中。在一些实施方案中，pMHC结合蛋白可以15mg/mL至150mg/mL的浓度存在于组合物中。在一些实施方案中，pMHC结合蛋白可以20mg/mL至140mg/mL的浓度存在于组合物中。在一些实施方案中，pMHC结合蛋白可以25mg/mL至135mg/mL的浓度存在于组合物中。在一些实施方案中，pMHC结合蛋白可以30mg/mL至130mg/mL的浓度存在于组合物中。在一些实施方案中，pMHC结合蛋白可以35mg/mL至125mg/mL的浓度存在于组合物中。在一些实施方案中，pMHC结合蛋白可以40mg/mL至120mg/mL的浓度存在于组合物中。在一些实施方案中，pMHC结合蛋白可以45mg/mL至115mg/mL的浓度存在于组合物中。在一些实施方案中，pMHC结合蛋白可以50mg/mL至110mg/mL的浓度存在于组合物中。
在一些实施方案中，，组合物包含一种或多种根据所治疗的具体适应症所需要的活性化合物，通常是具有不会彼此不利影响的互补活性的活性化合物。此类额外活性化合物适宜以对预期目的有效的量组合存在。
在一些实施方案中，组合物通过以下方式制备：将pMHC结合蛋白与任选的生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，所述载体、赋形剂或稳定剂包括但不限于缓冲剂、糖类、盐、表面活性剂、增溶剂、多元醇、稀释剂、粘合剂、稳定剂、盐、亲脂性溶剂、氨基酸、螯合剂、防腐剂等(Goodman和Gilman的《治疗学的药理学基础(The Pharmacological Basis ofTherapeutics)》,第12版,L.Brunton等人和《雷明顿的药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》,第16版,Osol,A.编(1999))，呈所需最终浓度的冻干组合物或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者来说无毒，并且包括缓冲剂，例如组氨酸、磷酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、乙酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六羟季铵；氯化苯甲烃铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于10至15个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包括海藻糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEEN、聚山梨醇酯80、或聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，缓冲剂为组氨酸、柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸或乙酸盐。糖赋形剂可以是海藻糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖或棉子糖。表面活性剂可以是聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯80或Pluronic F68。盐可以是NaCl、KC1、MgC12或CaC12。
在一些实施方案中，组合物包含缓冲剂或pH调节剂以提高对pH的控制。这种组合物的pH可介于约3.0与约9.0之间、约4.0与约8.0之间、约5.0与约8.0之间、约5.0与约7.0之间、约5.0与约6.5之间、约5.5与约8.0之间、约5.5与约7.0之间或约5.5与约6.5之间。在另一实施方案中，这种组合物具有约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5或约9.0的pH。在一特定实施方案中，组合物具有约6.0的pH。
在一些实施方案中，组合物包含缓冲剂或pH调节剂以提高对pH的控制。这种组合物的pH可介于3.0与9.0之间、4.0与8.0之间、5.0与8.0之间、5.0与7.0之间、5.0与6.5之间、5.5与8.0之间、5.5与7.0之间或5.5与6.5之间。在另一实施方案中，这种组合物具有3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0的pH。在一特定实施方案中，组合物具有6.0的pH。
本领域的技术人员理解，组合物的pH通常不应等于用于组合物中的具体pMHC结合蛋白的等电点。通常，缓冲剂是由有机或无机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括但不限于有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐；Tris、缓血酸胺盐酸盐或磷酸盐缓冲剂。另外，氨基酸组分也可以起缓冲作用。可用于组合物中作为缓冲剂的代表性氨基酸组分包括但不限于甘氨酸和组氨酸。在某些实施方案中，缓冲剂选自组氨酸、柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸和乙酸盐。在一特定实施方案中，缓冲剂为组氨酸。在另一个特定实施方案，缓冲剂为柠檬酸盐。在又一个特定实施方案，缓冲剂为甘氨酸。缓冲剂的纯度应为至少98％、或至少99％、或至少99.5％。如本文所用，在组氨酸和甘氨酸的背景下的术语“纯度”是指如本领域所理解的组氨酸或甘氨酸的化学纯度，例如如以下中所述：《默克指数(The Merck Index)》,第13版,O'Neil等人编(Merck&Co.,2001)，以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施方案中，组合物包含组氨酸作为缓冲剂。在某些实施方案中，组氨酸以至少约1mM、至少约5mM、至少约10mM、至少约20mM、至少约30mM、至少约40mM、至少约50mM、至少约75mM、至少约100mM、至少约150mM或至少约200mM组氨酸的浓度存在于组合物中。在另一个实施方案中，组合物包含介于约1mM与约200mM之间、约1mM与约150mM之间、约1mM与约100mM之间、约1mM与约75mM之间、约10mM与约200mM之间、约10mM与约150mM之间、约10mM与约100mM之间、约10mM与约75mM之间、约10mM与约50mM之间、约10mM与约40mM之间、约10mM与约30mM之间、约20mM与约75mM之间、约20mM与约50mM之间、约20mM与约40mM之间或约20mM与约30mM之间的组氨酸。在另一实施方案中，组合物包含约1mM、约5mM、约10mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约150mM或约200mM组氨酸。在一特定实施方案中，组合物可以包含约10mM、约25mM，或无组氨酸。
在某些实施方案中，组合物包含组氨酸作为缓冲剂。在某些实施方案中，组氨酸以至少1mM、至少5mM、至少10mM、至少20mM、至少30mM、至少40mM、至少50mM、至少75mM、至少100mM、至少150mM或至少200mM组氨酸的浓度存在于组合物中。在另一个实施方案中，组合物包含介于1mM与200mM之间、1mM与150mM之间、1mM与100mM之间、1mM与75mM之间、10mM与200mM之间、10mM与150mM之间、10mM与100mM之间、10mM与75mM之间、10mM与50mM之间、10mM与40mM之间、10mM与30mM之间、20mM与75mM之间、20mM与50mM之间、20mM与40mM之间或20mM与30mM之间的组氨酸。在另一个实施方案中，组合物包含1mM、5mM、10mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、150mM或200mM组氨酸。在一特定实施方案中，组合物可以包含10mM、25mM，或无组氨酸。
在一些实施方案中，组合物包含碳水化合物赋形剂。碳水化合物赋形剂可充当例如粘度增强剂、稳定剂、膨胀剂、增溶剂等。碳水化合物赋形剂通常以按重量或体积计约1％至约99％之间，例如介于约0.1％至约20％之间、介于约0.1％至约15％之间、介于约0.1％至约5％之间、介于约1％至约20％之间、介于约5％至约15％之间、介于约8％至约10％之间、介于约10％与约15％之间、介于约15％与约20％之间、介于0.1％至20％之间、介于5％至15％之间、介于8％至10％之间、介于10％与15％之间、介于15％与20％之间、介于约0.1％至约5％之间、介于约5％至约10％之间或介于约15％至约20％之间存在。在另外其它特定实施方案中，碳水化合物赋形剂以1％、或1.5％、或2％、或2.5％、或3％、或4％、或5％、或10％、或15％或20％存在。
在一些实施方案中，组合物包含碳水化合物赋形剂。碳水化合物赋形剂可充当例如粘度增强剂、稳定剂、膨胀剂、增溶剂等。碳水化合物赋形剂通常以按重量或体积计1％至约99％之间，例如介于0.1％至20％之间、介于0.1％至15％之间、介于0.1％至5％之间、介于1％至20％之间、介于5％至15％之间、介于8％至10％之间、介于10％与15％之间、介于15％与20％之间、介于0.1％至20％之间、介于5％至15％之间、介于8％至10％之间、介于10％与15％之间、介于15％与20％之间、介于0.1％至5％之间、介于5％至10％之间或介于15％至20％之间存在。在另外其它特定实施方案中，碳水化合物赋形剂以1％、或1.5％、或2％、或2.5％、或3％、或4％、或5％、或10％、或15％或20％存在。
在一些实施方案中，组合物包含碳水化合物赋形剂。适用于组合物中的碳水化合物赋形剂包括但不限于单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糊精、葡聚糖、淀粉等；及糖醇，例如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(葡糖醇)等。在某些实施方案中，用于本文所提供的组合物中的碳水化合物赋形剂选自蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露醇和棉子糖。在一特定实施方案中，碳水化合物赋形剂是海藻糖。在另一个特定实施方案，碳水化合物赋形剂是甘露醇。在又一特定实施方案，碳水化合物赋形剂是蔗糖。在另一个特定实施方案，碳水化合物赋形剂是棉子糖。碳水化合物赋形剂的纯度应为至少98％、或至少99％、或至少99.5％。
在一些实施方案中，组合物包含海藻糖。在某些实施方案中，组合物包含至少约1％、至少约2％、至少约4％、至少约8％、至少约20％、至少约30％或至少约40％的海藻糖。在另一个实施方案中，组合物包含介于约1％与约40％之间、介于约1％与约30％之间、介于约1％与约20％之间、介于约2％与约40％之间、介于约2％与约30％之间、介于约2％与约20％之间、介于约4％与约40％之间、介于约4％与约30％之间或介于约4％与约20％之间的海藻糖。在另一个实施方案中，组合物包含约1％、约2％、约4％、约6％、约8％、约15％、约20％、约30％或约40％的海藻糖。在一特定实施方案中，组合物包含约4％、约6％或约15％的海藻糖。
在一些实施方案中，组合物包含海藻糖。在某些实施方案中，组合物包含至少1％、至少2％、至少4％、至少8％、至少20％、至少30％或至少40％的海藻糖。在另一个实施方案中，组合物包含介于1％与40％之间、介于1％与30％之间、介于1％与20％之间、介于2％与40％之间、介于2％与30％之间、介于2％与20％之间、介于4％与40％之间、介于4％与30％之间或介于4％与20％之间的海藻糖。在另一个实施方案中，组合物包含1％、2％、4％、6％、8％、15％、20％、30％或40％的海藻糖。在一特定实施方案中，组合物包含4％、6％或15％的海藻糖。
在某些实施方案中，组合物包含赋形剂。在一特定实施方案中，组合物包含至少一种选自以下的赋形剂：糖、盐、表面活性剂、氨基酸、多元醇、螯合剂、乳化剂和防腐剂。在某些实施方案中，组合物包含盐，例如选自以下的盐：NaCl、KC1、CaC12和MgC12。在一特定实施方案中，组合物包含NaCl。
在一些实施方案中，组合物包含氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸或氨基酸盐。组合物可以包含至少约1mM、至少约10mM、至少约25mM、至少约50mM、至少约100mM、至少约150mM、至少约200mM、至少约250mM、至少约300mM、至少约350mM或至少约400mM的氨基酸。在另一个实施方案中，组合物可包含介于约1mM与约100mM之间、介于约10mM与约150mM之间、介于约25mM与约250mM之间、介于约25mM与约300mM之间、介于约25mM与约350mM之间、介于约25mM与约400mM之间、介于约50mM与约250mM之间、介于约50mM与约300mM之间、介于约50mM与约350mM之间、介于约50mM与约400mM之间、介于约100mM与约250mM之间、介于约100mM与约300mM之间、介于约100mM与约400mM之间、介于约150mM与约250mM之间、介于约150mM与约300mM之间或介于150mM与约400mM之间的氨基酸。在另一个实施方案中，组合物包含约1mM、1.6mM、25mM、约50mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM或约400mM的氨基酸。
在一些实施方案中，组合物包含氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸或氨基酸盐。组合物可包含至少1mM、至少10mM、至少25mM、至少50mM、至少100mM、至少150mM、至少200mM、至少250mM、至少300mM、至少350mM或至少400mM的氨基酸。在另一个实施方案中，组合物可包含介于1mM与100mM之间、介于10mM与150mM之间、介于25mM与250mM之间、介于25mM与300mM之间、介于25mM与350mM之间、介于25mM与400mM之间、介于50mM与250mM之间、介于50mM与300mM之间、介于50mM与350mM之间、介于50mM与400mM之间、介于100mM与250mM之间、介于100mM与300mM之间、介于100mM与400mM之间、介于150mM与250mM之间、介于150mM与300mM之间或介于150mM与400mM之间的氨基酸。在另一实施方案中，组合物包含1mM、1.6mM、25mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM或400mM的氨基酸。
在一些实施方案中，组合物包含表面活性剂。如本文所用，术语“表面活性剂”是指具有两亲性结构的有机物质；即其由具有相反溶解性趋势的基团，通常油溶性烃链和水溶性离子基团构成。表面活性剂可根据将表面活性部分的电荷分类成阴离子、阳离子和非离子表面活性剂。表面活性剂通常用作润湿、乳化、溶解和分散剂以用于多种医药组合物和生物材料制剂。可以任选地添加药学上可接受的表面活性剂至组合物中以减少聚集，如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(polyoxamer)(例如，泊洛沙姆188)；Triton；辛基糖苷钠；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油醇基-或硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油醇基-或硬脂基-肌氨酸；亚油醇基-、肉豆蔻基-或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺丙基-、椰油酰胺丙基-、亚油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油酰基-牛磺酸钠或甲基油基-牛磺酸二钠；以及系列(MonaIndustries,Inc.,Paterson,N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇和乙二醇与丙二醇的共聚物(例如PF68等)。在某些实施方案中，组合物包含聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80。如果泵或塑料容器用于施用组合物，那么表面活性剂尤其有用。药学上可接受的表面活性剂的存在减轻蛋白质聚集的倾向。组合物可包含聚山梨醇酯，其浓度范围介于约0.001％至约1％，或约0.001％至约0.1％，或约0.01％至约0.1％之间。在其它特定实施方案中，组合物包含聚山梨醇酯，其浓度为0.001％、或0.002％、或0.003％、或0.004％、或0.005％、或0.006％、或0.007％、或0.008％、或0.009％、或0.01％、或0.015％、或0.02％。组合物可包含聚山梨醇酯，其浓度范围介于0.001％至1％、或0.001％至0.1％或0.01％至0.1％之间。在其它特定实施方案中，组合物包含聚山梨醇酯，其浓度为0.001％、或0.002％、或0.003％、或0.004％、或0.005％、或0.006％、或0.007％、或0.008％、或0.009％、或0.01％、或0.015％、或0.02％。
在一些实施方案中，组合物包含其它赋形剂和/或添加剂，包括但不限于稀释剂、粘合剂、稳定剂、亲脂溶剂、防腐剂、佐剂等。药学上可接受的赋形剂和/或添加剂可用于本文提供的组合物中。常用的赋形剂/添加剂，例如药学上可接受的螯合剂(例如但不限于EDTA、DTPA或EGTA)可任选地添加到组合物中以减少聚集。如果使用泵或塑料容器来施用组合物，那么这些添加剂尤其有用。
在一些实施方案中，组合物包含防腐剂。可以任选地添加任何适合浓度，例如介于0.001％至5％之间或其中的任何范围或值的防腐剂至组合物中，例如苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚硝酸苯基汞、苯氧基乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(例如但不限于六水合物)、对羟基苯甲酸烷酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、氯化苯甲烃铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或其混合物。组合物中使用的防腐剂的浓度是足以产生微生物作用的浓度。此类浓度取决于所选的防腐剂并且容易由熟练技术人员确定。
在一些实施方案中，组合物与人的血液等渗，其中所述组合物具有基本上与人的血液相同的渗透压。此类等渗组合物通常将具有从250mOSm到350mOSm的渗透压。等渗性可通过例如使用蒸汽压或冰冻型渗透计来测量。通过使用张力改性剂调节组合物的张力。“张力改性剂”是可以添加到组合物中以提供组合物的等渗性的那些药学上可接受的惰性物质。适用于本文所提供的组合物中的张力性改性剂包括但不限于糖、盐和氨基酸。
在某些实施方案中，组合物是基本上不含内毒素和/或相关致热物质的无热原组合物。内毒素包括被限制在微生物内部并且仅在微生物破裂或死亡时才释放的毒素。致热物质还包括来自细菌和其它微生物的外膜的诱发发热的热稳定性物质。这两种物质如果施用于人都会导致发热、低血压和休克。由于潜在的有害作用，所以必须从静脉内施用的药物溶液中清除少量的内毒素。食品和药物管理局(“FDA”)已经关于静脉内药物施加设定单个一小时时间内每公斤体重每剂5内毒素单位(EU)的上限(《美国药典委员会(The UnitedStates Pharmacopeial Convention)》,《药典论坛(Pharmacopeial Forum)》26(1):223(2000))。当治疗性蛋白质以每公斤体重数百或数千毫克的量施用时，与所关注蛋白质(例如抗体)的情况一样，必须去除痕量的有害和危险的内毒素。在一些实施方案中，组合物中的内毒素和热原水平小于10EU/mg，或小于5EU/mg，或小于1EU/mg，或小于0.1EU/mg，或小于0.01EU/mg，或小于0.001EU/mg。
在一些实施方案中，当用于体内施用时，药物组合物应为无菌的。组合物可以通过各种灭菌方法进行灭菌，包括无菌过滤、辐射等。在某些实施方案中，组合物经过预先消毒的0.22微米过滤器进行过滤器灭菌。用于注射的无菌组合物可根据常规药物实践进行配制，如在以下中所述：“《雷明顿的药物科学(Remington:The Science&Practice ofPharmacy)”,第21版,Lippincott Williams&Wilkins,(2005)，以全文引用的方式并入本文中。
包含pMHC结合蛋白(例如本文公开的那些)的组合物通常将以冻干形式或溶液存储。预期包含pMHC结合蛋白的无菌组合物被放置到具有无菌接入端口的容器中，例如具有允许取出组合物的接头，例如可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。在某些实施方案中，组合物作为预填充的注射器提供。
在某些实施方案中，组合物是冻干制剂。术语“冻干”或“冻干的”包括已经进行干燥程序的物质，其中已去除掉至少50％的水分。
无论所选的施用途径如何，可以合适的水合形式使用的本文提供的试剂，和/或本文提供的药物组合物通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。
尽管已参照多个实施方案具体地显示和描述本发明，但本领域的技术人员应理解，可在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本文所公开的各种实施方案的形式和细节作出修改，并且本文所公开的各种实施方案不打算用作对权利要求书范围的限制。
本发明提供的各个方面的实施方案也通过以下任意一个段落进行了描述。
实施方案1.一种经过基因修饰的非人动物，其基因组包含
(a)编码人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分的核苷酸序列；和
(b)(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座，任选地其中所述(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座中的至少一个未重排，
其中所述经过基因修饰的非人动物表达所述人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，
其中所述经过基因修饰的非人动物表达包含人或人源化重链可变结构域和/或人或人源化轻链可变结构域的免疫球蛋白，并且
其中所述非人动物耐受所述人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，使得当用包含(i)对所述非人动物来说为异源的肽与(ii)从中获得所述人或人源化MHC分子的人HLA分子或其一部分复合的抗原肽-MHC(pMHC)复合物进行免疫接种时，所述非人动物产生特异性B细胞应答。
实施方案2.如实施方案1所述的经过基因修饰的非人动物，其中所述人或人源化MHC分子选自由以下组成的群组：人或人源化MHC I类分子、人或人源化MHC II类α分子、人或人源化MHC II类β分子或其任何组合，和/或
其中所述经过基因修饰的非人动物包含
(a)在内源重链基因座处：
(i)与内源重链恒定区呈可操作连接的未重排的人或人源化免
疫球蛋白重链可变区；
(ii)与内源重链恒定区呈可操作连接的受限的未重排的人或人
源化重链可变区；
(iii)共同重链编码序列；
(iv)与内源重链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的未
重排的人或人源化重链可变区；
(v)只有重链的免疫球蛋白编码序列；或
(vi)编码杂交免疫球蛋白链的未重排的人或人源化杂交重链序列；
和/或
(b)在内源轻链基因座处：
(i)与内源轻链恒定区呈可操作连接的未重排的人或人源化免
疫球蛋白轻链可变区；
(ii)共同轻链编码序列；
(iii)与内源轻链恒定区呈可操作连接的受限的未重排的人或
人源化轻链可变区；
(iv)与内源轻链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的未重排的人或人源化轻链可变区；或
(v)与内源轻链恒定区呈可操作连接的经过组氨酸修饰的重排的人或人源化轻链可变区。
实施方案3.如实施方案1或实施方案2所述的经过基因修饰的非人动物，其中所述非人动物进一步包含功能性ADAM6基因，任选地其中所述功能性ADAM6基因为内源ADAM6基因。
实施方案4.如前述实施方案中任一项所述的经过基因修饰的非人动物，其中所述非人动物进一步表达外源末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)基因。
实施方案5.如前述实施方案中任一项所述的经过基因修饰的非人动物，其中所述人或人源化MHC分子为人或人源化MHC I类分子，任选地其中所述人或人源化MHC分子来源于选自由HLA-A分子、HLA-B分子、HLA-C分子和其任何组合组成的群组的HLA I类分子。
实施方案6.如实施方案5所述的经过基因修饰的非人动物，其在其基因组中，任选地在内源β2微球蛋白基因座处，进一步包含编码人或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列，
其中所述非人动物表达所述人或人源化β2微球蛋白，使得所述非人动物耐受所述β2微球蛋白本身或与所述人或人源化I类分子缔合的β2微球蛋白。
实施方案7.如实施方案1至4中任一项所述的经过基因修饰的非人动物，其中所述人或人源化MHC分子为人或人源化MHC II类分子，任选地其中所述人或人源化MHC分子来源于选自由HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR分子和其任何组合组成的群组的HLA II类分子的α和/或β链，或至少肽结合槽。
实施方案8.如前述实施方案中任一项所述的经过基因修饰的非人动物，其中所述核苷酸序列编码完全人HLA分子，
任选地其中所述核苷酸序列不破坏内源非人MHC基因座，任选地其中所述核苷酸序列放至内源ROSA26基因座中。
实施方案9.如实施方案1至7中任一项所述的经过基因修饰的非人动物，其中所述核苷酸序列编码嵌合人/非人MHC分子，所述嵌合人/非人MHC分子包含可操作地连接于内源MHC分子的跨膜和胞浆结构域的人HLA分子的胞外结构域，任选地其中所述核苷酸序列编码
(i)嵌合人/非人MHC I类分子，所述嵌合人/非人MHC I类分子包含可操作地连接于内源非人MHC i类分子，例如内源鼠类H-2K多肽、内源鼠类H-2D多肽或内源鼠类H-DL多肽的跨膜和胞浆结构域的选自由HLA-A、HLA B和HLA-C组成的群组的人MHC I类分子的α1、α2和α3结构域；和/或
(ii)嵌合人/非人MHC II类分子，所述嵌合人/非人MHC II类分子包含可操作地连接于内源非人MHC II类α分子，例如内源鼠类H-2Aα多肽或内源鼠类H-2Eα多肽的跨膜和胞浆结构域的人HLA II类α多肽的α1和α2结构域，和/或可操作地连接于内源非人MHC II类β分子，例如内源鼠类H-2Aα多肽或内源鼠类H-2Eα多肽的跨膜和胞浆结构域的人HLA I类β多肽的β1和β2结构域。
实施方案10.如前述实施方案中任一项所述的经过基因修饰的非人动物，其进一步包含抗原肽-MHC(pMHC)复合物，所述复合物包含对所述非人动物来说为异源的肽与从中获得所述人或人源化MHC分子的人HLA分子缔合。
实施方案11.如前述实施方案中任一项所述的经过基因修饰的非人动物，其进一步包含
(c)抗原肽-MHC(pMHC)复合物，所述复合物包含(i)对所述非人动物来说为异源的肽与(ii)从中获得所述人或人源化MHC分子的人HLA分子或其一部分缔合，和
(d)特异性结合所述抗原肽-MHC并且不结合从中获得所述人或人源化MHC分子的所述人HLA分子的人或人源化抗原结合蛋白。
实施方案12.如前述实施方案中任一项所述的经过基因修饰的非人动物，其中所述非人动物针对所述编码人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分的核苷酸序列是杂合的。
实施方案13.如前述实施方案中任一项所述的经过基因修饰的非人动物，其中所述非人动物是啮齿动物，例如大鼠或小鼠。
实施方案14.如前述实施方案中任一项所述的经过基因修饰的非人动物，其中所述非人动物是小鼠。
实施方案15.一种制造如前述实施方案中任一项所述的经过基因修饰的非人动物的方法，所述方法包含对其基因组进行修饰以包含
(a)编码人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分的核苷酸序列，和
(b)(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座，任选地其中所述(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座中的至少一个未重排，
其中所述经过基因修饰的非人动物
A.耐受所述人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，使得当用包含(i)对所述非人动物来说为异源的肽与(ii)从中获得所述人或人源化MHC分子的人HLA分子或其一部分复合的肽-MHC复合物进行免疫接种时，所述非人动物产生特异性B细胞应答，并
B.能够提供包含人或人源化重链可变结构域和/或人或人源化轻链可变结构域的人或人源化抗原结合蛋白。
实施方案16.如实施方案15所述的方法，其中所述方法包含：
(a)
(i)将编码人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分的核苷酸序列插入至第一异位基因座中，或
(ii)在内源非人动物MHC I基因座处用编码嵌合人/非人MHC I多肽的核苷酸序列替换编码非人动物MHC I多肽的核苷酸序列，和/或在内源非人动物MHC II基因座处用编码嵌合人/非人MHC II分子的核苷酸序列替换编码非人动物MHC II分子的核苷酸序列，其中所述嵌合人/非人MHC I分子包含人MHC I的α1、α2和α3结构域以及至少内源非人MHC I多肽的跨膜和胞浆结构域，其中所述嵌合人/非人MHC II分子包含人MHC II的α1、α2、β1和β2结构域以及至少内源啮齿动物MHC II多肽的跨膜和胞浆结构域，以及
(b)
(i)将(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)
重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座插入至第二异位基因座
中或
(ii)
(A)在内源非人重链基因座处用未重排的人免疫球蛋白可变(VH)基因区段替换内源非人免疫球蛋白可变(VH)基因区段，并且任选地分别用未重排的人免疫球蛋白多样性(DH)基因区段和/或未重排的人免疫球蛋白接合(JH)基因区段替换内源非人免疫球蛋白多样性(DH)和/或内源非人接合(JH)基因区段，其中所述未重排的人VH和任选的DH和JH基因区段可操作地连接于内源重链恒定区基因序列，和/或
(B)在内源非人轻链基因座处用任选地重排形成VL/JL基因序列的人轻链可变(VL)基因区段和人轻链接合(JL)基因区段替换内源非人轻链可变(VL)基因区段和内源非人轻链接合(JL)基因区段，其中所述人VL和接合JL基因区段可操作地连接于内源轻链恒定区基因序列，
其中所述(a)分别编码非人MHC I和/或非人MHC II分子的核苷酸序列和(b)VH、DH、JH、VL和JL基因区段
(I)通过依序同源重组在单个非人胚胎干(ES)细胞中插入或替换，或
(II)在分别用于产生第一非人动物和第二非人动物的第一和第二ES细胞中插入或替换，并且其中所述方法进一步包含繁殖所述第一非人动物和所述第二非人动物。
实施方案17.如实施方案15或实施方案16所述的方法，其进一步包含向所述非人动物施用抗原pMHC复合物，所述复合物包含对所述非人动物来说为异源的肽与从中获得所述人或人源化MHC分子的人HLA分子缔合，任选地其中所述抗原pMHC复合物连接至辅助T细胞表位，任选地其中所述辅助T细胞表位为PADRE。
实施方案18.一种产生特异性结合所关注的抗原pMHC复合物的抗原结合蛋白或编码其的核酸序列的方法，所述方法包含将如实施方案1至14中任一项所述的非人动物或根据如实施方案15至17中任一项所述的方法制造的非人动物维持在足够使所述非人动物对所述所关注的抗原pMHC复合物发起免疫应答的条件下，其中所述所关注的抗原pMHC复合物包含对非人动物来说为异源并且在从中获得所述人或人源化MHC分子的人HLA或其一部分的情况下呈递的肽。
实施方案19.如实施方案18所述的方法，其包含以下作为第一步骤：用所述所关注的抗原pMHC复合物对所述非人动物进行免疫接种，并且任选地增强所述经过免疫接种的非人动物的免疫应答，任选地其中免疫接种和/或增强包含向所述非人动物施用连接至辅助T细胞表位的所述所关注的pMHC复合物，任选地其中所述辅助T细胞表位包含示为SEQ IDNO:28的PADRE。
实施方案20.一种获得编码人免疫球蛋白重链可变结构域和/或人免疫球蛋白轻链可变结构域的核酸的方法，所述方法包含：
从如实施方案10至14中任一项所述的非人动物分离包含重排的人免疫球蛋白可变区基因序列的核酸，所述重排的人免疫球蛋白可变区基因序列编码由所述非人动物的淋巴细胞或由所述淋巴细胞产生的杂交瘤表达的人免疫球蛋白可变结构域，
其中由所述淋巴细胞或由所述淋巴细胞产生的杂交瘤表达的所述人免疫球蛋白可变结构域与其同源可变结构域缔合，形成对所述抗原pMHC复合物具有特异性的抗原结合结构域。
实施方案21.如实施方案20所述的方法，其进一步包含用所关注的抗原pMHC复合物对所述非人动物进行免疫接种并使所述非人动物对所述抗原发起免疫应答，然后获得所述核酸。
实施方案22.如实施方案20或实施方案21所述的方法，其中所获得的重排的人免疫球蛋白可变区基因序列包含至少一个体细胞超突变。
实施方案23.一种核酸，所述核酸包含通过如实施方案20至22中任一项所述的方法产生的重排的人免疫球蛋白重链可变区基因序列。
实施方案24.如实施方案23所述的核酸，其中所述核酸进一步包含可操作地连接于所述重排的人免疫球蛋白可变区基因序列的人恒定区基因序列。
实施方案25.如实施方案22或实施方案24所述的核酸，其中所述人重链恒定区基因序列包含在5.5至6.0范围内的pH值下增加IgG重链恒定区氨基酸序列的CH2-CH3区对新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力的修饰，其中所述修饰为选自由以下组成的群组的IgG重链恒定区氨基酸序列中的突变：M428L、N434S、V259I、V308F、N434A、M252Y、S254T、T256E、T250Q、H433K、N434Y和其组合。
实施方案26.一种宿主细胞，其包含如实施方案23至25中任一项所述的核酸。
实施方案27.一种获得表达人免疫球蛋白重链可变结构域和/或人免疫球蛋白轻链可变结构域的细胞的方法，所述方法包含：
从如实施方案10至14中任一项所述的非人动物分离淋巴细胞，其中所述淋巴细胞表达形成对所述抗原pMHC复合物具有特异性的抗原结合结构域的人免疫球蛋白可变结构域。
实施方案28.如实施方案27所述的方法，其进一步包含从所述分离的淋巴细胞产生杂交瘤。
实施方案29.一种分离的细胞，例如生殖细胞、胚胎干细胞、体细胞(例如B细胞)，其包含
(a)编码人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分的核苷酸序列，和
(b)(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座，其中所述非人动物能够提供包含人或人源化抗原结合结构域的人或人源化抗原结合蛋白，任选地其中所述人或人源化抗原结合结构域包含人或人源化可变结构域，
任选地其中所述(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座中的至少一个未重排，
任选地其中所述分离的细胞根据如实施方案27或实施方案28所述的方法获得。
实施方案30.一种体外制造人免疫球蛋白可变结构域的方法，其包含：
在细胞中表达包含编码人免疫球蛋白可变结构域的重排的人免疫球蛋白可变区基因序列的第一核酸，所述人免疫球蛋白可变结构域由如实施方案10至14中任一项所述的非人动物的淋巴细胞或由所述淋巴细胞产生的杂交瘤表达，
其中由所述淋巴细胞或由所述淋巴细胞产生的杂交瘤表达的所述人免疫球蛋白可变结构域与其同源可变结构域缔合，形成对所述抗原pMHC复合物具有特异性的抗原结合结构域。
实施方案31.如实施方案30所述的方法，其中所述第一核酸进一步包含可操作地连接于所述重排的人免疫球蛋白可变区基因序列的人免疫球蛋白恒定区基因序列。
实施方案32.如实施方案31所述的方法，其中所述人免疫球蛋白恒定区基因序列为重链恒定区基因序列并且包含在5.5至6.0范围内的pH值下增加IgG重链恒定区氨基酸序列的CH2-CH3区对新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力的修饰，其中所述修饰为选自由以下组成的群组的IgG重链恒定区氨基酸序列中的突变：M428L、N434S、V259I、V308F、N434A、M252Y、S254T、T256E、T250Q、H433K、N434Y和其组合。
实施方案33.一种人免疫球蛋白重链可变结构域，其根据如实施方案30至32中任一项的方法制造。
实例
仅出于说明性目的提供以下实例并且不打算限制本发明的范围。
实例1
在ES细胞中，使用繁殖技术和依序同源重组中的任一种或两种，建立包含以下的小鼠：(1)人或人源化MHC I基因座、人或人源化β2微球蛋白基因座和/或人或人源化MHC II基因座(此类人源化基因座的非限制性实例参见例如图1-2)和(2)人源化免疫球蛋白重链和/或轻链基因座(参见例如Macdonald等人,(2014)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》111:5147-52；以全文引用的方式并入本文中)。这些小鼠表达并耐受人或人源化MHC I/β2微球蛋白分子和/或人或人源化MHC II分子。将小鼠用所关注的肽-MHC(pMHC)复合物免疫接种，所述pMHC复合物包含对小鼠具有抗原性的肽和小鼠所耐受的人或人源化MHC。小鼠另外且任选地用所关注的pMHC复合物来增强，增强剂也任选地连接至辅助T细胞表位。将从人源化免疫球蛋白重链和/或轻链基因座表达的人或人源化抗体从免疫小鼠的血清中分离出来，测试与pMHC复合物结合的特异性。
产生具有C57BL背景并包含编码与人源化β2微球蛋白(参见例如图1A和1C；也参见美国专利第9,591,835号和第9,615,550号，每个专利以全文引用的方式并入)、人源化免疫球蛋白重链基因座(参见例如Macdonald(2014),见上文)和人源化共同轻链基因座(参见例如美国专利10,143,186；第号10,130,081和第号9,969,814；美国专利公布第20120021409号、第20120192300号、第20130045492号、第20130185821号、第20130302836号和第20150313193号，每个公布以全文引用的方式并入)缔合的人源化MHC I分子(HLA-A2/H-2K)的核苷酸序列的测试小鼠。将这些测试小鼠和包含功能性(例如鼠类)ADAM6基因(参见例如美国专利第8,642,835号和第8,697,940号；每个公布以全文引用的方式并入)和人源化免疫球蛋白重链和轻链基因座的对照小鼠用单链pMHC复合物进行免疫接种，所述pMHC复合物包含在HLA-A2/β2m分子的情况下呈递的异源肽(肽B)，其中免疫原作为示为SEQ ID NO:26的蛋白质免疫原施用(图4)，或作为包含示为SEQ ID NO:27的氨基酸序列的编码单链pMHC复合物的DNA施用(图3)。使用pMHC复合物免疫原与标准佐剂(图3-4)或使用pMHC复合物免疫原联合T辅助肽(PADRE；图5)，经由不同途径以变化的时间间隔对小鼠进行增强。在免疫起始前从小鼠收集免疫前血清。定期对小鼠放血，并测定对应抗原的抗血清滴度。
使用ELISA测定血清中对抗在HLA-A2的情况下呈递的不相关(肽A或肽C)和相关抗原的抗体滴度。将九十六孔微滴定板(Thermo Scientific)用磷酸盐缓冲盐水(PBS，IrvineScientific)中5μg/ml的抗myc抗体涂布过夜。将平板用含有0.05％ Tween 20(PBS-T，Sigma-Aldrich)的磷酸盐缓冲盐水洗涤，并在室温下用PBS中250μl0.5％牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich)封闭1小时。将平板用PBS-T洗涤，并且用2μg/ml包含在HLA-A2的背景下呈递的相关肽B或不相关抗原肽A或肽C的经c-myc标记的单链pMHC复合物涂布。
将免疫前和免疫抗血清在0.5％ BSA-PBS中连续稀释三倍并且在室温下添加到平板中1小时。将平板洗涤并将山羊抗小鼠IgG-Fc-辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(Jackson Immunoresearch)添加至平板中并在室温下温育1小时。将平板洗涤并使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)/H2O2作为底物，根据制造商的建议程序来显影，并使用分光光度计(Victor,Perkin Elmer)记录450nm下的吸光度。使用Graphpad PRISM软件计算抗体滴度。抗体滴度计算为结合信号超过背景2倍的内插血清稀释系数。
在对照小鼠中，当用在HLA-A的情况下编码肽B的DNA免疫原或包含其的蛋白质免疫原进行免疫接种时，引起结合含有肽B的单链pMHC的抗体滴度，图3-4，所述对照小鼠包括不耐受嵌合HLA-A2/H-2K多肽和/或人或人源化β2微球蛋白的群组。然而，这些对照小鼠的血清也包含针对在HLA-A的情况下呈递的不相关的肽(肽A或肽C)的抗体滴度，与针对含有肽B的单链pMHC的抗体滴度相当(图3-4)。因而，虽然不耐受的动物能够产生针对所关注的pMHC复合物的免疫应答，但是这种免疫应答可以被视为是非特异性免疫应答，因为抗体滴度与含有肽B的单链pMHC和含有不相关肽的单链pMHC相当。
相比之下，来自耐受人(源化)HLA-A和β2微球蛋白分子并用单链肽B/HLA-A/β2M复合物进行免疫接种的测试小鼠的血清引起针对含有肽B的单链pMHC的抗体滴度。(图4)针对包含肽B的pMHC复合物的抗体滴度大于针对包含不相关肽A或C的HLA-A/β2M复合物的抗体滴度(图4)。类似地，当编码肽B/HLA-A/β2M复合物的DNA用作免疫原时，观测到较高的针对相关肽B单链蛋白质的抗体滴度(与不相关的pMHC复合物相比)(图3)。在第三群组中，与针对不相关的pMHC复合物的抗体滴度相比，也引起较高的针对免疫原的滴度，其中向测试小鼠施用包含肽B的单链pMHC复合物的初免注射液，接着用包含连接至PADRE辅助T细胞表位的肽B的单链pMHC复合物增强(图5)。另外，从ROSA26基因座表达单链HLA-A2/β2M多肽(SEQID NO:23)的小鼠(参见例如图2)类似地耐受空的HLA-A2/β2M分子，并且当用pMHC/肽B复合物蛋白(在PADRE存在或不存在下)进行免疫接种和增强时，与针对呈递不相关肽的pMHC复合物的抗体滴度相比，产生较高的针对呈递肽B的pMHC复合物的抗体滴度(数据未示)。
实例2
从除相应内源基因座以外的基因座、例如ROSA26基因座表达MHC I类、MHC II类和/或β2M分子的小鼠耐受空的MHC I类、MHC II类和/或β2M分子，并且当与不耐受空的MHCI类、MHC II类和/或β2M分子的小鼠比较时，产生较高的针对免疫原、例如编码单链pMHC复合物的DNA的抗体滴度。
本文中的数据证实与不耐受人HLA I类和人β2微球蛋白分子的对照非人动物相比，使非人动物耐受人HLA I类和人β2微球蛋白分子或其部分增强经过修饰的非人动物对所关注的pMHC产生特异性抗体应答的能力。

Claims (10)

1.一种人免疫球蛋白可变结构域，所述人免疫球蛋白可变结构域通过在细胞中表达包含重排的人免疫球蛋白可变区基因序列的第一核酸而制造，所述重排的人免疫球蛋白可变区基因序列编码由非人动物的淋巴细胞或由所述淋巴细胞产生的杂交瘤表达的人免疫球蛋白可变结构域，
其中所述非人动物包含
(i)编码人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分的核苷酸序列；和
(ii)(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)
重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座，任选地其中所述(未)
重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座中的至少一个未重排，
其中所述经过基因修饰的非人动物表达所述人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，
其中所述经过基因修饰的非人动物表达包含人或人源化重链可变结构域和/或人或人源化轻链可变结构域的免疫球蛋白，和
其中所述非人动物耐受所述人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，使得当用抗原肽-MHC(pMHC)复合物进行免疫接种时，所述非人动物产生特异性B细胞应答，所述抗原pMHC复合物包含(a)与所述非人动物异源的肽，和(b)所述人或人源化MHC分子所来源的人HLA分子或其一部分，所述(a)与(b)复合，
其中所述由淋巴细胞或由其产生的杂交瘤表达的人免疫球蛋白可变结构域缔合于其同源可变结构域，以形成对所述抗原pMHC复合物具有特异性的抗原结合结构域，任选地其中所述免疫球蛋白可变结构域是免疫球蛋白重链可变结构域。
2.一种包含人免疫球蛋白重链可变结构域和/或人免疫球蛋白轻链可变结构域的宿主细胞，所述宿主细胞通过包括从非人动物分离核酸的方法获得，所述核酸包含重排的人免疫球蛋白可变区基因序列，所述重排的人免疫球蛋白可变区基因序列编码由所述非人动物的淋巴细胞或由所述淋巴细胞产生的杂交瘤表达的人免疫球蛋白可变结构域，其中所述非人动物包含
(i)编码人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分的核苷酸序列；和
(ii)(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)
重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座，任选地其中所述(未)
重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座中的至少一个未重排，
其中所述经过基因修饰的非人动物表达所述人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，
其中所述经过基因修饰的非人动物表达包含人或人源化重链可变结构域和/或人或人源化轻链可变结构域的免疫球蛋白，和
其中所述非人动物耐受所述人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，使得当用抗原肽-MHC(pMHC)复合物进行免疫接种时，所述非人动物产生特异性B细胞应答，所述抗原pMHC复合物包含(a)与所述非人动物异源的肽，和(b)所述人或人源化MHC分子所来源的人HLA分子或其一部分，所述(a)与(b)复合，
其中所述由淋巴细胞或由其产生的杂交瘤表达的人免疫球蛋白可变结构域缔合于其同源可变结构域，以形成对所述抗原pMHC复合物具有特异性的抗原结合结构域。
3.一种获得表达人免疫球蛋白重链可变结构域和/或人免疫球蛋白轻链可变结构域的细胞的方法，其包括
分离包含根据权利要求1或2所述的人免疫球蛋白重链可变结构域和/或人免疫球蛋白轻链可变结构域的淋巴细胞，
其中所述淋巴细胞表达人免疫球蛋白可变结构域，其形成对所述抗原pMHC复合物具有特异性的抗原结合结构域。
4.一种根据权利要求3所述的方法获得的分离细胞，例如生殖细胞、胚胎干细胞、体细胞(例如B细胞)。
5.一种获得表达人免疫球蛋白重链可变结构域和/或人免疫球蛋白轻链可变结构域的细胞的方法，其包括
分离包含根据权利要求1或2所述的核酸的淋巴细胞，其中所述淋巴细胞表达人免疫球蛋白可变结构域，其形成对所述抗原pMHC复合物具有特异性的抗原结合结构域。
6.一种根据权利要求5所述的方法获得的分离细胞，例如生殖细胞、胚胎干细胞、体细胞(例如B细胞)。
7.一种制造人免疫球蛋白可变结构域的体外方法，其包括
在细胞中表达包含重排的人免疫球蛋白可变区基因序列的第一核酸，所述第一核酸通过包括从非人动物分离核酸的方法获得，所述核酸包含重排的人免疫球蛋白可变区基因序列，所述重排的人免疫球蛋白可变区基因序列编码由所述非人动物的淋巴细胞或由所述淋巴细胞产生的杂交瘤表达的人免疫球蛋白可变结构域，其中所述非人动物包含
(i)编码人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分的核苷酸序列；和
(ii)(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)
重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座，任选地其中所述(未)
重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座中的至少一个未重排，
其中所述经过基因修饰的非人动物表达所述人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，
其中所述经过基因修饰的非人动物表达包含人或人源化重链可变结构域和/或人或人源化轻链可变结构域的免疫球蛋白，和
其中所述非人动物耐受所述人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，使得当用抗原肽-MHC(pMHC)复合物进行免疫接种时，所述非人动物产生特异性B细胞应答，所述抗原pMHC复合物包含(a)与所述非人动物异源的肽，和(b)所述人或人源化MHC分子所来源的人HLA分子或其一部分，所述(a)与(b)复合，
其中所述由淋巴细胞或由其产生的杂交瘤表达的人免疫球蛋白可变结构域缔合于其同源可变结构域，以形成对所述抗原pMHC复合物具有特异性的抗原结合结构域。
8.一种编码人免疫球蛋白重链可变结构域和/或人免疫球蛋白轻链可变结构域的核酸，所述核酸通过包括从非人动物分离核酸的方法获得，所述核酸包含重排的人免疫球蛋白可变区基因序列，所述重排的人免疫球蛋白可变区基因序列编码由所述非人动物的淋巴细胞或由所述淋巴细胞产生的杂交瘤表达的人免疫球蛋白可变结构域，其中所述非人动物包含
(i)编码人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分的核苷酸序列；和
(ii)(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)
重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座，任选地其中所述(未)
重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座中的至少一个未重排，
其中所述经过基因修饰的非人动物表达所述人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，
其中所述经过基因修饰的非人动物表达包含人或人源化重链可变结构域和/或人或人源化轻链可变结构域的免疫球蛋白，和
其中所述非人动物耐受所述人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，使得当用抗原肽-MHC(pMHC)复合物进行免疫接种时，所述非人动物产生特异性B细胞应答，所述抗原pMHC复合物包含(a)与所述非人动物异源的肽，和(b)所述人或人源化MHC分子所来源的人HLA分子或其一部分，所述(a)与(b)复合，
其中所述由淋巴细胞或由其产生的杂交瘤表达的人免疫球蛋白可变结构域缔合于其同源可变结构域，以形成对所述抗原pMHC复合物具有特异性的抗原结合结构域。
9.一种包含编码人免疫球蛋白重链可变结构域和/或人免疫球蛋白轻链可变结构域的核酸的宿主细胞，所述宿主细胞通过包括从非人动物分离核酸的方法获得，所述核酸包含重排的人免疫球蛋白可变区基因序列，所述重排的人免疫球蛋白可变区基因序列编码由所述非人动物的淋巴细胞或由所述淋巴细胞产生的杂交瘤表达的人免疫球蛋白可变结构域，其中所述非人动物包含
(i)编码人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分的核苷酸序列；和
(ii)(未)重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)
重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座，任选地其中所述(未)
重排的人或人源化免疫球蛋白重链基因座和/或(未)重排的人或人源化免疫球蛋白轻链基因座中的至少一个未重排，
其中所述经过基因修饰的非人动物表达所述人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，
其中所述经过基因修饰的非人动物表达包含人或人源化重链可变结构域和/或人或人源化轻链可变结构域的免疫球蛋白，和
其中所述非人动物耐受所述人或人源化MHC分子或至少其肽结合部分，使得当用抗原肽-MHC(pMHC)复合物进行免疫接种时，所述非人动物产生特异性B细胞应答，所述抗原pMHC复合物包含(a)与所述非人动物异源的肽，和(b)所述人或人源化MHC分子所来源的人HLA分子或其一部分，所述(a)与(b)复合，
其中所述由淋巴细胞或由其产生的杂交瘤表达的人免疫球蛋白可变结构域缔合于其同源可变结构域，以形成对所述抗原pMHC复合物具有特异性的抗原结合结构域。
10.一种制造非人动物的方法，用于制造非人动物的方法中的核酸，如此制造的非人动物制造免疫球蛋白的用途，如此制造的免疫球蛋白和编码其的核酸以及表达此类免疫球蛋白的细胞和/或编码其的核酸，其特征在于其任何实施方案或任何适用的权利要求类别，例如，专利申请中最初描述、公开或说明的主题所涵盖的产品、工艺或用途应用。
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