PT2152880E - Composições e métodos para inibição de genes de imunoglobulinas endógenas e produção de anticorpos idiótipos humanos transgénicos - Google Patents

Composições e métodos para inibição de genes de imunoglobulinas endógenas e produção de anticorpos idiótipos humanos transgénicos Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
Composições e métodos para inibição de genes de imunoglobulinas endógenas e produção de anticorpos idiótipos humanos transgénicos
CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A invenção está relacionada com animais transgénicos que têm um ou mais loci de imunoglubina endógena desactivada e com métodos para fazer o mesmo. Além disso, a invenção também está relacionada com composições e métodos para a produção de anticorpos humanizados e anticorpos totalmente humanos utilizando esses animais transgénicos e ainda com anticorpos assim produzidos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] Os anticorpos são uma classe importante de produtos farmacêuticos que foram utilizados com êxito no tratamento de várias doenças e condições humanas, incluindo doenças infecciosas, cancro, doenças alérgicas e doença do enxerto contra hospedeiro, bem como na prevenção da rejeição de transplantes.
[0003] Um problema associado à aplicação terapêutica de imunoglubina não-humana é a potencial imunogenicidade da mesma nos pacientes humanos. De modo a reduzir a imunogenicidade de tais preparados, foram desenvolvidas várias estratégias para a produção de anticorpos parcialmente humanos (humanizados) ou totalmente humanos. 1 A capacidade de produzir anticorpos transgénicos com um idiótipo humano em animais não-humanos é particularmente desejável já que determinantes de ligação de antigénio se encontram no âmbito da região idiótipa e pensa-se que idiótipos não-humanos contribuem para a imunogenicidade das terapêuticas de anticorpos actuais. Um idiótipo humano é uma consideração especialmente importante no que respeita às terapêuticas de anticorpos anticlonais, que consiste num único idiótipo fornecido a uma concentração relativamente elevada em oposição à variedade de idiótipos fornecidos em concentrações mais reduzidas através de uma mistura de anticorpos policlonais.
[0004] Enquanto um número de abordagens à produção de anticorpos transgénicos humanizados em animais não humanos foram descritas, um dos maiores problemas encontrados em muitas dessas abordagens é a produção de anticorpos endógenos, seja preferencialmente ou em combinação com anicorpos transgénicos no animal hospedeiro. Vários esquemas de clonagem recombinantes foram utilizados em tentativas de interromper a produção de imunoglobulina endógena em animais hospedeiros como forma de abordar este problema. Contudo, a desactivação funcional dos genes da imunoglobulina apresenta muitos obstáculos em muitas espécies de vertebrados.
[0005] Por exemplo, enquanto ratos mutantes homogéneos com loci JH eliminados foram produzidos com êxito utilizando uma recombinação homóloga, ES ou outras células pluripotentes sustentáveis em que a recombinação homóloga pode ser efectuada em loci endógenos inactivos não estão prontamente disponíveis na maioria das espécies vertebradas. 2 [0006] Além disso, as mutações que interferem com a expressão de superfície mas não com uma reorganização produtiva da imunoglubina dos segmentos do gene VJ ou VDJ são insuficientes para desactivar completamente a expressão de Ig endógena. Isto é exemplificado pelo facto de os ratos mutantes homozigóticos com uma membrana exão interrompida da cadeia pesada μ (os chamados ratos μΜΤ) não conseguem produzir IgM ou IgG, mas ainda conseguem produzir quantidades significativas de IgA (Macpehrson et al. Nature Immunol 2(7) :625-631 (2001) . Além disso, o soro dos ratos mutantes heterozigóticos contém IgM e IgG codificado por ambos os alelos, o alelo de tipo selvagem e o alelo μΜΤ mutado (Kitamura e Rajewky, Nature 356:154-156 (1992) . Isto deve-se ao facto de a primeira reorganização no decorrer do desenvolvimento da célula B ser a união dos segmentos dos genes DH e JH em ambos os cromossomas homólogos, gerando uma célula pró-B. Se, nos ratos μΜΤ/+, uma célula pro-B for submetida a VH-DHJH subsequentes que unem em primeiro lugar o locus de IgH mutado e a união estiver no quadro ("produtivo"), a célula pré-B pode exprimir uma cadeia μ da forma segregada, mas não pode exprimir μ ligada à membrana. Como a expressão de μ ligada à membrana é necessária para a exclusão alélica, uma tal célula continua a poder ser submetida a uma ligação VH-DHJH no locus de IgH de tipo selvagem; e se esta segunda reorganização também for produtiva, a célula exprime duas cadeias μ diferentes, uma das quais é ligada à membrana. 0 soro destes ratos contém a IgM derivada de ambos os alelos. Além disso, a IgG derivada de ambos os alelos pode ser encontrada no soro destes ratos porque a mudança é frequentemente induzida em concomitância em ambos os loci de IgH de uma célula B. 3 [0007] A exclusão alélica incompleta também é observada em animais com loci de imunoglubina transgénica funcional e loci de imunoglubina endógena mutada que pode ainda reorganizar os segmentos dos genes VDJ ou VJ de forma produtiva. Uma célula B que reorganiza VH-DHJH num ou em ambos os loci endógenos mutados pode ainda reorganizar loci de imunoglubina transgénica de forma produtiva. Uma tal célula B exprime imunoglubina transgénica ligada à membrana e desenvolve-se atingindo uma célula B madura. Durante o desenvolvimento da célula B a alternância do isotipo no locus endógeno mutado poderá resultar numa célula B que expressa imunoglubina endógena. De acordo com isto, tais mutações são insuficientes para a desactivação completa da expressão de imunoglubina endógena em animais com loci de imunoglubina transgénica.
[0008] Mendez et al (1997 Nature Genetics, 15; "Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice") construiu dois YACs do tamanho de duas megabases que contêm grandes fragmentos contínuos do loci de imunoglubina da cadeia pesada e leve K e introduziu-os em ratos com Ig desactivada para produzir anticorpos humanos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0009] A presente invenção está relacionada com animais transgénicos, com células germinativas, com ovócitos fertilizados e com embriões. Contudo, animais humanos, células germinativas humanas, ovócitos humanos e embriões humanos não estão incluídos no âmbito da invenção. Respectivamente, a seguinte descrição deve ser lida tendo em conta que exclui tal matéria humana do âmbito da 4 protecção.
[0010] Um dos maiores problemas associados à produção de anticorpos transgénicos humanizados em animais não-humanos foi a produção preferencial ou co-produção de anticorpos endógenos no anfitrião. A invenção actual resolve este problema fornecendo animais transgénicos que acolhem pelo menos um locus de Ig artificial e que não têm a capacidade de produzir imunoglubina endógena. Estes animais são altamente úteis para a produção de anticorpos transgénicos humanizados e totalmente humanos. Os métodos utilizados para gerar tais animais transgénicos são eficazes em muitas espécies, incluindo espécies a partir das quais células ES ou células pluripotentes sustentáveis não estão actualmente prontamente disponíveis e em que a recombinação homóloga e a inactivação de genes não são prontamente efectuados.
[0011] A presente invenção deriva em parte da descoberta de que a meganuclease pode ser utilizada para a ablação de loci de imunoglubina endógena para gerar animais transgénicos úteis para a produção de anticorpos transgénicos humanizados e totalmente humanos. Além disso, duas meganucleases distintas que se destinam a locais genómicos diferentes podem ser utilizadas para eliminar de forma eficaz uma grande porção de um locus de imunoglubina (até vários kb) , assim assegurando a completa desactivação do locus e garantindo, ainda, que os animais transgénicos que são portadores da mutação da linha germinal não geram quaisquer células B capazes de produzir imunoglubina endógena.
[0012] Em conformidade, num aspecto, a invenção fornece animais transgénicos que incluem pelo menos um locus de Ig artificial e que têm pelo menos um locus de Ig 5 endógeno desactivado da linha germinal. Os animais utilizados na invenção são animais de laboratório pequenos, particularmente aves, roedores e doninhas. Os loci artificiais utilizados na invenção incluem pelo menos um segmento de gene V humano. Numa versão preferida, um locus de Ig artificial inclui (i) uma região V com pelo menos um segmento de gene V humano que codifica uma linha germinal ou uma sequência de aminoácido da região V humana hipermutada; (ii) um ou mais segmentos de genes J; e (iii) um ou mais genes de região constante, em que o locus de Ig artificial é funcional e capaz de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubina no animal transgénico.
[0013] Numa versão, o animal transgénico inclui um locus de cadeia pesada de Ig endógeno desactivado. Numa versão preferida, o animal transgénico tem ambos os loci de cadeia pesada de Ig endógenos desactivados e, de forma correspondente, não transporta um locus de cadeia pesada de Ig endógena funcional.
[0014] Numa versão, o animal transgénico inclui um locus de cadeia leve de Ig endógeno desactivado. Numa versão preferida, o animal transgénico tem ambos os loci de cadeia leve de Ig endógenos desactivados e, de forma correspondente, não transporta um locus de cadeia leve de Ig endógeno funcional.
[0015] Numa versão preferida, o animal transgénico não tem uma cadeia pesada de Ig endógena funcional e um locus de cadeia leve de Ig funcional.
[0016] Numa versão, o animal transgénico inclui pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial. Numa versão, o animal transgénico não tem um locus de cadeia 6 leve de Ig funcional e inclui pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial.
[00177] Numa versão, o animal transgénico inclui pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
[0018] Numa versão, o animal transgénico inclui pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
[0019] Numa versão preferida, loci de Ig artificiais são funcionais e capazes de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubina no animal transgénico, cujo repertório de imunoglubina inclui imunoglubina com idiótipo humano.
[0020] Numa versão, um ou mais genes constantes regionais dos loci de Ig artificial incluem pelo menos um gene regional constante não humano e são funcionais e capazes de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubina quimérica no animal transgénico, cujo repertório de imunoglubina inclui imunoglubina quimérica com idiótipo humano.
[0021] Numa versão, um ou mais genes constantes regionais dos loci de Ig artificial incluem pelo menos um gene regional constante humano e são funcionais e capazes de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubina no animal transgénico, cujo repertório de imunoglubina inclui imunoglubina com idiótipo humano.
[0022] Num aspecto, a invenção fornece descendentes de animais transgénicos da invenção. Numa versão preferida, os descendentes incluem pelo menos um locus IG artificial e têm pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado da linha germinal. Num aspecto, a invenção fornece animais 7 transgénicos capazes de gerar células de germes viáveis com pelo menos um locus de Ig endógeno que está desactivado.
[0023] Numa versão, tais animais transgénicos incluem uma construção para expressão de meganuclease genómica, de preferência uma construção com uma região de controlo de expressão induzivel ligada de forma operacional ao ácido nucleico de codificação da meganuclease, em que a meganuclease codificada reconhece uma sequência-alvo de meganuclease presente dentro ou próxima de um locus de Ig endógeno do animal transgénico. Quando o animal transgénico é sexualmente maduro e inclui células germinativas viáveis e a construção da expressão da meganuclease genómica pode ser utilizada para desactivar o locus de Ig endógeno pretendido nessas células germinativas, in vitro ou in vivo, sem comprometer a viabilidade subsequente, os animais F1 que são portadores de uma mutação da linha germinal num locus de Ig podem ser derivados a partir dai.
[0024] Numa versão, o animal transgénico inclui também pelo menos um locus de Ig artificial.
[0025] Num aspecto, a invenção fornece animais transgénicos que incluem células germinativas viáveis com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado. Numa versão, o animal transgénico inclui também pelo menos um locus de Ig artificial.
[0026] Num aspecto, a invenção fornece animais transgénicos que incluem células germinativas viáveis com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado, incluindo a derivação de um animal transgénico a partir de uma célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig endógeno produzido de acordo com o método da invenção, ou 8 uma célula germinativa descendente da mesma, em que o animal transgénico não é humano.
[0027] Numa versão, a invenção fornece métodos para produzir animais transgénicos que incluem pelo menos um locus de Ig artificial e que têm pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado da linha germinal. Numa versão preferida, o animal transgénico é nulizigótico para uma cadeia leve de Ig endógeno e/ou uma cadeia pesada de Ig endógeno.
[0028] Preferencialmente, um locus de Ig endógeno é desactivado numa célula germinativa principal, ou a célula germinativa de um predecessor, através da expressão de uma meganuclease do mesmo. Os métodos incluem a produção de uma meganuclease na célula germinativa, em que a meganuclease reconhece uma sequência pretendida pela meganuclease presente em ou próxima de um locus de Ig endógeno e desactiva de forma selectiva o locus de Ig pretendido na célula germinativa assim produzindo uma célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado. Uma tal célula germinativa com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado é utilizado para produzir um animal com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado da linha germinal. Numa versão, a célula germinativa, ou aquilo com o qual está combinada, inclui pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial. Numa versão, a célula germinativa, ou aquilo com o qual está combinada, inclui pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial. Numa versão, a célula germinativa, ou aquilo com o qual está combinada, inclui pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial. 9 [0029] Numa versão, os métodos envolvem a introdução de uma construção de expressão de meganuclease ou um ácido nucleico de codificação de meganuclease na célula germinativa.
[0030] Numa versão preferida, a célula germinativa inclui uma construção de expressão de meganuclease genómica, que inclui uma região de controlo de expressão ligada de forma operacional a um ácido nucleico de codificação da meganuclease. Numa versão preferida, a célula germinativa inclui uma construção de expressão de meganuclease genómica induzivel e os métodos envolvem a indução de expressão do ácido nucleico de codificação meganuclease na célula germinativa. Numa versão, os métodos envolvem a repetição do passo de induzir a expressão do ácido nucleico de codificação meganuclease na célula germinativa. Numa versão, a indução é efectuada in vivo. Numa versão, a indução é efectuada in vitro. Numa versão, a célula germinativa inclui uma construção de expressão meganuclease genómica, que inclui uma região de controlo de expressão que exibe actividade especifica de célula germinativa.
[0031] As células germinativas resultantes podem ser utilizadas para gerar um animal F1 com pelo menos um locus de Ig endógeno com linha germinal desactivada. 0 animal F1 pode incluir um ou mais loci artificiais ou podem ser cruzados de modo a gerar tais animais incluindo pelo menos um locus de Ig artificial.
[0032] Numa versão alternativa, o método envolve a introdução de uma construção de expressão meganuclease ou um ácido nucleico de codificação meganuclease num ovócito fertilizado ou embrião e a geração de uma célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig 10 desactivado no animal fundador resultante. 0 animal fundador pode ser utilizado para gerar um animal F1 com pelo menos um locus de Ig endógeno com linha germinal desactivada. 0 animal F1 pode incluir um ou mais loci de
Ig artificiais ou pode ser animais incluindo pelo menos [0033] Numa versão, a pretendida está presente ou do gene J.
[0034] Numa versão, a pretendida está presente ou do gene da região constante preferida, o gene da imunoglubina μ. cruzado de modo a gerar tais um locus de Ig artificial. sequência de meganuclease está próxima de um segmento sequência de meganuclease está próxima de um segmento de imunoglubina. Numa versão região constante codifica [0035] Numa versão, os métodos envolvem a análise das células germinativas para averiguar a sua viabilidade e a desactivação de um locus de Ig endógeno. Numa versão, os métodos envolvem a análise das células germinativas para averiguar a presença de um locus de Ig artificial.
[0036] Nos métodos aqui descritos, o cruzamento de animais é preferencialmente entre animais com loci endógenos desactivados, de forma a gerar animais que sejam nulizigót icos para a cadeia leve de Ig endógeno e/ou cadeia pesada de Ig endógeno.
[0037] Numa versão preferida, os métodos incluem ainda a utilização de uma segunda meganuclease. A segunda meganuclease reconhece uma segunda sequência alvo de meganuclease presente ou próxima no locus de Ig endógeno e separa de forma selectiva o locus de Ig endógeno em conjunto com a primeira meganuclease mas num local 11 diferente do da primeira meganuclease, assim desactivando pelo menos um locus de Ig endógeno.
[0038] Numa versão preferida, a célula germinativa inclui uma segunda construção de expressão de meganuclease genómica, que inclui uma região de controlo de expressão ligada de forma operacional a um segundo ácido nucleico codificante de meganuclease. Numa versão preferida, a região de controlo de expressão é uma região de controlo de expressão induzivel e o método também inclui a expressão de indução do segundo ácido nucleico codificante da meganuclease na célula germinativa, em que a segunda meganuclease codificada é produzida e, em conjunto com a primeira meganuclease, desactiva de forma selectiva o locus de Ig pretendido na célula germinativa. Numa versão, os métodos envolvem a repetição do passo de induzir a expressão do ácido nucleico de codificação da segunda meganuclease na célula germinativa. Numa versão, a indução é efectuada in vivo. Numa versão, a indução é efectuada in vitro. Numa versão, a construção de expressão da segunda meganuclease genómica inclui uma região de controlo de expressão que exibe actividade específica de célula germinativa.
[0039] Numa versão alternativa, os métodos envolvem a introdução de uma construção de expressão da segunda meganuclease ou um ácido nucleico codificante de uma segunda meganuclease na célula germinativa.
[0040] Numa versão alternativa, os métodos envolvem a introdução de uma construção de expressão de uma segunda meganuclease ou um ácido nucleico codificante de uma segunda meganuclease num ovócito fertilizado ou embrião e a geração de uma célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig desactivado no animal fundador resultante. 12 0 animal fundador pode ser utilizado para gerar um animal F1 com pelo menos um locus de Ig endógeno com linha germinal desactivada. 0 animal Fl pode incluir um ou mais loci de Ig artificiais ou pode ser cruzado de modo a gerar tais animais incluindo pelo menos um locus de Ig artificial.
[0041] Numa versão preferida, a primeira e a segunda meganuclease procuram os segmentos do gene J. Numa versão, as sequência-alvo da primeira e da segunda meganuclease são, em conjunto, a montante e a jusante de um ou mais segmentos de genes J no âmbito do locus de Ig endógeno, e a clivagem através da primeira e da segunda meganuclease produz a eliminação de um segmento de DNA genómico que inclui os segmentos do referido gene J.
[0042] Noutra versão, a primeira e a segunda meganuclease procuram os segmentos do gene da região constante. Numa versão, as sequências pretendidas da primeira e da segunda meganuclease são, em conjunto, a montante e a jusante de um ou mais segmentos de genes da região constante de imunoglubina, e a clivagem através da primeira e da segunda meganuclease produz a eliminação de um segmento de DNA genómico que inclui os segmentos da referida região constante. Numa versão preferida, o gene da região constante codifica a imunoglubina μ.
[0043] Nos métodos aqui descritos, os loci artificiais utilizados incluem pelo menos um segmento do gene V humano. Numa versão preferida, um locus de Ig artificial inclui (i) uma região V com pelo menos um segmento de gene V humano que codifica uma linha germinal ou uma sequência de aminoácido da região V humana hipermutada; (ii) um ou mais segmentos de genes J; e (iii) um ou mais genes de região constantes, em que o locus de Ig 13 artificial é funcional e capaz de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubina no animal transgénico.
[0044] Numa versão, pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial é incorporado no genoma de um animal transgénico da invenção. Numa versão, o animal transgénico não tem um locus de cadeia leve de Ig funcional.
[0045] Numa versão, pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial é incorporado no genoma de um animal transgénico da invenção.
[0046] Numa versão, pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial são incorporados no genoma de um animal transgénico da invenção.
[0047] Numa versão preferida, loci artificiais são funcionais e capazes de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubina no animal transgénico, cujo repertório de imunoglubina inclui imunoglubina com idiótipo humano.
[0048] Numa versão, um ou mais genes constantes regionais do loci de Ig artificial incluem pelo menos um gene regional constante não humano e são funcionais e capazes de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubina quimérica no animal transgénico, cujo repertório de imunoglubina inclui imunoglubina quimérica com idiótipo humano.
[0049] Numa versão, um ou mais genes constantes regionais do loci de Ig artificial incluem pelo menos um gene regional constante humano e são funcionais e capazes de se submeter à reorganização genética e de produzir um 14 repertório de imunoglubina no animal transgénico, cujo repertório de imunoglubina inclui imunoglubina com idiótipo humano.
[0050] Um animal transgénico da invenção pode ser produzido através do cruzamento de um animal transgénico com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado da linha germinal com um segundo animal transgénico com pelo menos um locus de Ig artificial que inclui (i) uma região V com pelo menos um segmento de gene V humano que codifica uma linha germinal ou uma sequência de aminoácido da região V humana hipermutada; (ii) um ou mais segmentos de genes J; e (iii) um ou mais genes de região constantes, em que o locus de Ig artificial é funcional e capaz de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubina no animal transgénico. 0 cruzamento pode ser efectuado por raça animal ou por combinar gâmetas, incluindo manipulações in vitro.
[0051] 0 segundo animal transgénico pode incluir pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial de Ig.
[0052] 0 segundo animal transgénico pode incluir pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial de Ig.
[0053] Incluídos na apresentação estão os primeiros e os segundos animais transgénicos que têm falta de um locus de cadeia leve de Ig funcional e em que o segundo animal transgénico inclui um locus de cadeia pesada de Ig artificial. Os animais podem ser cruzados de forma a produzir um F1 a que falta um locus de cadeia leve de Ig funcional e inclui um locus de cadeia pesada de Ig artificial. 15 [0054] O segundo animal transgénico pode incluir pelo menos dois loci de Ig artificial, incluindo pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial. Os loci artificiais do segundo animal transgénico podem ser funcionais e capazes de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubina no animal transgénico Fl, cujo repertório de imunoglubina inclui imunoglubina com idiótipo humano. Um ou mais genes da região constante do loci de Ig artificial do Segundo animal transgénico incluem pelo menos um gene da região constante não humano e são funcionais e capazes de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubina quimérica no animal transgénico, cujo repertório de imunoglubina inclui imunoglubina quimérica com idiótipo humano. Um ou mais genes da região constante do loci de Ig artificial do segundo animal transgénico incluem pelo menos um gene humano da região constante e são funcionais e capazes de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubina quimérica no animal transgénico, cujo repertório de imunoglubina inclui imunoglubina quimérica com idiótipo humano e região constante humana.
[0055] De modo semelhante, os métodos podem incluir o cruzamento de um segundo animal transgénico com pelo menos um locus de Ig artificial com um animal transgénico da invenção que seja capaz de gerar uma célula germinal viável com pelo menos um locus de Ig endógeno que esteja desactivado. 0 segundo animal transgénico pode incluir pelo menos dois loci de Ig artificiais, incluindo pelo menos um locus de cadeia artificialmente pesado e pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial. 16 [0056] Numa versão, os métodos incluem a introdução de pelo menos um locus de Ig artificial na célula germinativa com pelo menos um locus de Ig endógeno que foi ou é capaz de ser desactivado pela actividade de uma ou mais meganucleases, em que pelo menos um locus de Ig artificial inclui (i) uma região V com pelo menos um segmento de gene V humano que codifica uma linha germinal ou uma sequência de aminoácido da região V humana hipermutada; (ii) um ou mais segmentos de genes J; e (iii) um ou mais genes de região constantes, em que o locus de Ig artificial é funcional e capaz de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubina no animal transgénico derivado da célula germinativa. Além disso, os métodos também incluem a derivação de um animal transgénico F1 que inclui pelo menos um locus de Ig artificial e tendo pelo menos um locus de Ig endógeno de uma linha germinativa desactivada que tenha sido desactivado pela acção de uma ou mais meganucleases a partir da célula germinativa assim produzida.
[0057] Numa versão, o pelo menos um locus de Ig artificial inclui pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial.
[0058] Numa versão, as células germinativas não têm um locus de cadeia leve de Ig funcional e o locus de Ig artificial introduzido na célula germinativa é um locus de cadeia pesada de Ig.
[0059] Numa versão, o pelo menos um locus de Ig artificial inclui pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial. 17 [0060] Numa versão preferida, pelo menos dois loci artificial são introduzidos na célula germinativa, incluindo pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial. Numa versão, os loci de Ig artificiais são funcionais e capazes de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubina no animal transgénico F1 derivado, cujo repertório de imunoglubina inclui imunoglubina com idiótipo humano. Numa versão, um ou mais genes constantes regionais do loci de Ig artificial incluem pelo menos um gene regional constante não humano e são funcionais e capazes de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubina quimérica no animal transgénico, cujo repertório de imunoglubina inclui imunoglubina quimérica com idiótipo humano. Numa versão, um ou mais genes constantes regionais do loci de Ig artificial incluem pelo menos um gene regional constante humano e são funcionais e capazes de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubina no animal transgénico, cujo repertório de imunoglubina inclui imunoglubina com idiótipo humano.
[0061] Numa versão, os métodos envolvem a análise das células germinativas para averiguar a viabilidade e a desactivação de um locus de Ig. Numa versão, os métodos envolvem a análise das células germinativas para averiguar a presença de um locus de Ig artificial.
[0062] Numa versão, os métodos incluem a introdução de pelo menos um locus de Ig artificial num ovócito fertilizado ou embrião derivado de uma célula germinativa com pelo menos um locus de Ig endógeno que foi ou é capaz de ser desactivado pela acção de uma ou mais 18 meganucleases, em que pelo menos um locus de Ig artificial inclui (i) uma região V com pelo menos um segmento de gene V humano que codifica uma linha germinal ou uma sequência de aminoácido da região V humana hipermutada; (ii) um ou mais segmentos de genes J; e (iii) um ou mais genes de região constantes, em que o locus de Ig artificial é funcional e capaz de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubina no animal transgénico fundador, ou num dos seus descendentes, derivado do ovócito ou embrião fertilizado. Além disso, os métodos também incluem a derivação do ovócito ou embrião fertilizado do animal transgénico fundador e, opcionalmente, dos seus descendentes, de forma a produzir um animal transgénico que inclua pelo menos um locus de Ig artificial e com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado da linha germinativa que tenha sido desactivado pela acção de uma ou mais meganucleases.
[0063] Numa versão, o pelo menos um locus de Ig artificial inclui pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial.
[0064] Numa versão, o pelo menos um locus de Ig artificial inclui pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
[0065] Numa versão, o ovócito ou embrião fertilizado não tem um locus de cadeia leve de Ig funcional e o locus de Ig artificial introduzido no ovócito ou embrião fertilizado é um locus de cadeia pesada de Ig.
[0066] Numa versão preferida, pelo menos dois loci artificial são introduzidos no ovócito ou embrião fertilizado, incluindo pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia 19
Numa versão, leve de Ig artificial. Numa versão, os loci de Ig artificiais são funcionais e capazes de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubina no animal transgénico fundador, ou num dos seus descendentes, cujo repertório de imunoglubina inclui imunoglubina com idiótipo humano. Numa versão, um ou mais genes constantes regionais do loci de Ig artificial incluem pelo menos um gene regional constante não humano e são funcionais e capazes de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubina quimérica no animal transgénico fundador, ou num dos seus descendentes, cujo repertório de imunoglubina inclui imunoglubina quimérica com idiótipo humano. Numa versão, um ou mais genes constantes regionais do loci de Ig artificial incluem pelo menos um gene regional constante humano e são funcionais e capazes de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubina no animal transgénico fundador, ou num dos seus descendentes, cujo repertório de imunoglubina inclui imunoglubina com idiótipo humano.
[0067] Num aspecto, a invenção fornece métodos para produzir animais transgénicos capazes de gerar células de germes viáveis com pelo menos um locus de Ig endógeno que está desactivado. Numa versão preferida, os métodos incluem a geração de um animal transgénico com uma construção de expressão meganuclease genómica, em que a construção de expressão inclui uma região de controlo de expressão ligada de forma operacional a um ácido nucleico de codificação meganuclease. Numa versão preferida, a construção é uma construção de expressão meganuclease induzivel que pode ser induzida de forma a exprimir o ácido nucleico de codificação meganuclease numa célula germinativa. 20 [0068] Num aspecto, a invenção fornece métodos para a produção de um animal transgénico com uma célula germinativa viável em que pelo menos um locus de Ig endógeno está desactivado. Os métodos incluem a desactivação do locus de Ig endógeno na célula germinativa ou numa célula germinativa principal ou ovócito fertilizado ou embrião derivado do mesmo, através da expressão de uma meganuclease ai contida.
[0069] Num aspecto, a invenção fornece uma célula germinativa viável em que pelo menos um locus de Ig endógeno pode ser desactivado. Numa versão preferida, a célula germinativa inclui uma construção de expressão de meganuclease genómica, em que a construção de expressão inclui uma região de controlo de expressão ligada de forma operacional a um ácido nucleico codificante da meganuclease. Numa versão preferida, a construção é uma construção de expressão de meganuclease induzivel que pode ser induzida de forma a exprimir o ácido nucleico codificante da meganuclease numa célula germinativa.
[0070] Numa versão, a célula germinativa inclui pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial.
[0071] Numa versão, a célula germinativa inclui pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
[0072] Numa versão, a célula germinativa inclui pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
[0073] Num aspecto, a invenção fornece uma célula germinativa viável em que pelo menos um locus de Ig endógeno está desactivado.
[0074] Numa versão, a célula germinativa inclui pelo menos um locus de cadeia artificialmente pesada de Ig. 21 [0075] Numa versão, a célula germinativa inclui pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
[0076] Numa versão, a célula germinativa inclui pelo menos um locus de cadeia artificialmente pesada de Ig e pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
[0077] Num aspecto, a invenção fornece métodos para a produção de uma célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado. Os métodos envolvem a expressão de pelo menos uma meganuclease numa célula germinativa, ovócito fertilizado ou embrião, de modo a gerar uma célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado. A meganuclease assim expressa reconhece uma sequência-alvo da meganuclease presente em ou próxima do dito locus de Ig endógeno.
[0078] Numa versão, em que a meganuclease está expressa numa célula germinativa, a célula germinativa em que a meganuclease está expressa resulta numa célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado. Em alternativa, uma célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig desactivado poderá ser obtida a partir de um animal derivado da célula germinativa em que a meganuclease foi expressa.
[0079] Numa versão, em que a meganuclease é expressa num ovócito fertilizado ou num embrião, a célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado pode ser obtida a partir de um animal derivado do ovócito fertilizado ou embrião em que a meganuclease foi expressa.
[0080] Numa versão, o pelo menos um locus de Ig endógeno está desactivado in vitro. Numa versão, o pelo menos um locus de Ig endógeno está desactivado in vivo. 22 [0081] Numa versão, a célula germinativa inclui também pelo menos um locus de Ig artificial. Numa versão, o pelo menos um locus de Ig artificial inclui pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial. Numa versão, o pelo menos um locus de Ig artificial inclui pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
[0082] Numa versão, pelo menos dois loci artificial são introduzidos na célula germinativa, incluindo pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
[0083] A invenção também proporciona métodos para criar anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais e hibridomas. Este aspecto da invenção tem origem na produção de anticorpos nos animais transgénicos actualmente apresentados que transportam um ou mais loci artificiais e que têm um ou mais loci de Ig endógeno desactivado através da actividade da meganuclease.
[0084] Numa versão, os anticorpos são apenas de cadeia pesada, que são produzidos utilizando animais transgénicos com falta de um locus de cadeia leve de Ig funcional e incluem um locus de cadeia pesada artificial, atingido através dos métodos aqui descritos.
[0085] Num aspecto, a invenção fornece métodos para produzir anticorpos utilizando os animais transgénicos aqui fornecidos. Os métodos incluem imunizar um animal transgénico da invenção que tenha pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado e que transporte pelo menos um locus de Ig artificial com um imunogeno, tal como aqui descrito. Numa versão preferida, o animal transgénico é nulizigótico para uma cadeia pesada de Ig endógeno e/ou uma cadeia leve de Ig endógeno e, respectivamente, 23 incapaz de produzir imunoglubina endógena. Numa versão, o animal transgénico não tem um locus de cadeia leve de Ig funcional e inclui um locus de cadeia pesada de Ig artificial.
[0086] Num aspecto, a invenção fornece métodos para produzir anticorpos monoclonais.
[0087] Numa versão, os métodos incluem (i) imunizar um animal transgénico da invenção que tenha pelo menos um locus de Ig endógeno e que seja portador de pelo menos um locus de Ig artificial com um imunogeno, tal como aqui descrito; (i i) isolar uma célula que produza anticorpos monoclonais do animal transgénico em que a célula que produz o anticorpo monoclonal produz um anticorpo monoclonal que liga especificamente ao imunogeno; e (iii) utilizar a célula que produz anticorpos monoclonais para produzir o anticorpo monoclonal que liga especificamente ao imunogeno ou utilizar a célula que produz anticorpos monoclonais para produzir uma célula hibridoma que produz o anticorpo monoclonal e utilizar a célula de hibridoma para produzir o anticorpo monoclonal.
[0088] Numa versão, os métodos incluem (i) imunizar um animal transgénico que tenha pelo menos um locus de Ig endógeno e que seja portador de pelo menos um locus de Ig artificial com um imunogeno, tal como aqui descrito; (ii) isolar uma célula que produza anticorpos monoclonais do animal transgénico em que a célula que produz o anticorpo monoclonal produz um anticorpo monoclonal que liga especificamente ao imunogeno; e (iii) isolar da célula que produz anticorpos monoclonais um ácido nucleico de anticorpo monoclonal que codifica o anticorpo monoclonal que liga especificamente ao imunogeno; e (iv) utilizar o ácido nucleico do anticorpo monoclonal para produzir o 24 anticorpo monoclonal que liga especificamente ao imunogeno.
[0089] 0 anticorpo monoclonal pode ter um idiótipo humano.
[0090] Também estão apresentados anticorpos monoclonais assim produzidos.
[0091] Também são apresentados ácidos nucleicos isolados que codificam tais anticorpos monoclonais.
[0092] Num aspecto, a invenção fornece métodos para produzir anticorpos monoclonais totalmente humanos. Os métodos incluem (i) imunizar um animal transgénico da invenção que tenha pelo menos um locus de Ig endógeno e que seja portador de pelo menos um locus de Ig artificial com um imunogeno, tal como aqui descrito; (ii) isolar uma célula que produza anticorpos monoclonais do animal transgénico em que a célula que produz o anticorpo monoclonal produz um anticorpo monoclonal que liga especificamente ao imunogeno; e (iii) isolar da célula que produz anticorpos monoclonais um ácido nucleico de anticorpo monoclonal que codifica o anticorpo monoclonal que liga especificamente ao imunogeno; e (iv) modificar o ácido nucleico do anticorpo monoclonal para produzir um ácido nucleico recombinante que codifica um anticorpo monoclonal totalmente humano; e (v) utilizar o ácido nucleico recombinante que codifica um anticorpo monoclonal totalmente humano para produzir o anticorpo monoclonal codificado totalmente humano.
[0093] Também estão apresentados anticorpos monoclonais totalmente humanos assim produzidos. 25 [0094] Também estão apresentados ácidos nucleicos recombinantes que codificam anticorpos monoclonais totalmente humanos e métodos para os produzir.
[0095] Numa versão, um imunogeno utilizado nos métodos aqui descritos inclui um organismo causador de doenças ou uma porção antigénica do mesmo.
[0096] Numa versão, um imunogeno utilizado nos métodos aqui descritos é um antigeno endógeno para os humanos. Numa versão alternativa, um imunogeno utilizado nos métodos aqui descritos é um antigeno exógeno para os humanos.
[0097] Também são apresentados métodos para neutralizar ou modular a actividade de uma entidade antigénica num componente de corpo humano. Numa versão, os métodos incluem o contacto de um componente do corpo com uma composição antisoro policlonal da invenção, em que a composição policlonal antisoro inclui moléculas de imunoglubina que se ligam de forma especifica e neutralizam ou modulam a actividade da entidade antigénica.
[0098] Também são apresentados métodos que incluem o contacto com o componente do corpo com um anticorpo monoclonal da invenção, em que o anticorpo monoclonal se liga especificamente e neutraliza ou modula a actividade da entidade antigénica.
[0099] Numa versão preferida, o anticorpo monoclonal é um anticorpo monoclonal totalmente humano.
[0100] Numa versão, a entidade antigénica é de um organismo que causa uma doença infecciosa. 26 [0101] Numa versão, a entidade antigénica é uma molécula de superfície celular.
[0102] Numa versão, a entidade antigénica é uma citocina humana ou uma chemoquina humana.
[0103] Numa versão, a entidade antigénica é uma molécula de superfície celular numa célula cancerígena maligna.
[0104] Num aspecto, a invenção fornece células derivadas de animais transgénicos da invenção.
[0105] Também são apresentadas células derivadas do baço de animais transgénicos da invenção.
[0106] Também são apresentadas células B derivadas de animais transgénicos da invenção, cujas células B são capazes de produzir anticorpos com idiótipo humano.
[0107] Também são apresentadas células germinativas derivadas de animais transgénicos da invenção.
[0108] Num aspecto, A invenção fornece métodos para tornar as hibridomas capazes de produzir anticorpos com idiótipos humanos. Os métodos incluem a utilização de células derivadas de animais transgénicos da invenção.
[0109] Também estão apresentados hibridomas assim produzidos.
[0110] Também estão apresentados anticorpos com idiótipo humano, cujos anticorpos são produzidos por uma hibridoma da apresentação.
[0111] Também são apresentadas composiçoes farmacêuticas que incluem um anticorpo da apresentação, cujo anticorpo tem um idiótipo humano. 27 [0112] Também sao apresentados métodos para tratar um paciente com necessidade de tratamento, incluindo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica da invenção ao paciente.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0113] A Figura 1 mostra uma representação esquemática de uma cadeia pesada artificial que consiste numa região V, D e J, um estimulador intrónico de rato e vários genes de região constante artificiais. Genes de região constante artificiais contêm exões que codificam um domínio CHI humano e domínios CH2, 3 e 4 de ratos. A geração de membrana e as sequências de polipeptida citoplásmica são codificadas por exões de ratos.
Figura 2. Esquema da interacção de I-Scel com o DNA a 3' do final da sequência de reconhecimento.
[0114] Figure 3. Esquema da interacção do terminal 5' da sequência de reconhecimento de I-Scel com I-Scel.
[0115] Figura 4. Esquema do mecanismo de reconhecimento da sequência do I-Crel (de Nucleic Acids Res., 34, 4791- 4800) .
[0116] Figura 5. Diagrama esquemático da estratégia para alterar a sequência de reconhecimento do I-Crel.
[0117] Figura 6. Proteínas de dedos de zinco (ZFP) concebidas contra sequências de codificação de IgM de ratos foram expressas em células, DNA cromossómico foi preparado e a região adequada do locus de IgM foi amplificado por PCR. Os produtos da reacção foram 28
analisados por electroferese em gel de poliacrilamida. A figura mostra um exemplo típico que demonstra a actividade de clivagem.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0118] Por "locus de imunoglubina artificial" entende-se um locus de imunoglubina que inclui fragmentos de loci de imunoglubina humanos e não humanos, incluindo vários segmentos de gene de imunoglubina, que incluem pelo menos um segmento de gene da região variável (V) , um ou mais segmentos do gene J, um ou mais segmentos do gene D no caso de um locus de cadeia pesada e um ou mais segmentos de gene de região constante. Na presente invenção, pelo menos um dos segmentos do gene V codifica uma linha germinal ou sequência de aminoácidos da região V humana hipermutada. Numa versão preferida, um locus de imunoglubina artificial da invenção é funcional e capaz de se reorganizar e produzir um repertório de imunoglubinas. Numa versão preferida, pelo menos um segmento do gene D é um segmento do gene D humano. "Locus de Ig artificial" tal como utilizado aqui pode referir-se a um loci desorganizado, a um loci parcialmente reorganizado e um loci reorganizado. Loci artificiais incluem loci de cadeia artificialmente leves e pesados. Numa versão, um locus de Ig artificial inclui um gene de região C não humano e é capaz de produzir um repertório de imunoglubina incluindo imunoglubinas quiméricas com uma região C não humana. Numa versão, um locus de Ig artificial inclui um gene de região C humano e é capaz de produzir um repertório de imunoglubina incluindo imunoglubinas com uma região C humana. Numa versão, um locus artificial inclui um "gene de região constante 29 artificial", com o qual se entende um gene de região constante que inclui sequências nucleótidas derivadas de genes de regiões constantes humanos e não humanos. Por exemplo, um gene de região constante C artificial exemplar é um gene de região constante codificante de um domínio humano de IgG CHI e um domínio de rato de IgG CH2 e CH3.
[0119] Em algumas versões, um locus de cadeia pesado de
Ig artificial tem falta de CHI, ou uma sequência equivalente que permite à imunoglubina resultante contornar a imunoglubina típica: associação chaperona. Tais loci artificiais preocupam-se com a produção de anticorpos apenas de cadeia pesada em animais transgénicos que não têm um locus de cadeia leve de Ig funcional e assim não exprimem uma cadeia leve de Ig funcional. Tais loci de cadeia pesada de Ig artificiais são utilizados em métodos aqui descritos para produzir animais transgénicos sem um locus de cadeia leve de Ig funcional e incluindo um locus de cadeia pesada de Ig artificial, cujos animais são capazes de produzir anticorpos apenas de cadeia pesada. Em alternativa, um locus de Ig artificial pode ser manipulado in situ de forma a interromper a CHI ou uma região equivalente e a gerar um locus de cadeia pesada de Ig artificial que trata da produção de anticorpos apenas de cadeia pesada. Relativamente à produção de anticorpos apenas de cadeia pesada em ratinhos com uma deficiência na cadeia leve, consultar por exemplo Zou et al. , JEM, 204:3271-3283, 2007 .
[0120] Por "idiótipo humano" entende-se uma sequência polipeptida presente num anticorpo humano codificado pela imunoglubina de um segmento do gene V. O termo "idiótipo humano" tal como utilizado aqui tanto inclui sequências 30 que ocorrem de forma natural de um anticorpo humano como sequências sintéticas substancialmente idênticas ao polipéptido encontrado em anticorpos humanos que ocorrem de forma natural. Por "substancialmente" entende-se que o grau da identidade da sequência de aminoácido é de pelo menos cerca de 85%-95%. De preferência, o grau da identidade da sequência de aminoácido é superior a 90%, ainda melhor se for superior a 95%.
[0121] Por um "anticorpo quimérico" ou uma "imunoglubina quimérica" entende-se uma molécula de imunoglubina que inclui uma parte de sequência polipéptida de imunoglubina humana (ou uma sequência polipéptida codificada por uma segmento de gene de Ig humano) e uma parte de sequência polipéptida de imunoglubina não humana. As moléculas de imunoglubina quimérica da presente invenção são imunoglubinas com regiões Fc não humanas ou regiões Fc artificiais e idiótipos humanos. Tais imunoglubinas podem ser isoladas de animais da invenção que foram manipulados de forma a produzir moléculas de imunoglubina quimérica.
[0122] Por "região Fc artificial" entende-se uma região Fc codificada por um gene da região constante artificial.
[0123] 0 termo "segmento de gene de Ig" tal como utilizado aqui refere-se a segmentos de DNA que codifica várias partes de uma molécula de Ig, que estão presentes na linha germinal de animais não humanos e humanos e que são juntados nas células B para formar genes de Ig reorganizados. Assim, os segmentos do gene de Ig tal como utilizados aqui incluem segmentos do gene V, segmentos do gene D, segmentos do gene J e segmentos do gene da região C.
[0124] 0 termo "segmento do gene de Ig humano" tal como utilizado aqui inclui sequências de um segmento de gene 31 de Ig humano que ocorrem de forma natural, formas degeneradas de sequências de um segmento de gene de Ig humano que ocorrem de forma natural e sequências sintéticas que codificam uma sequência polipéptida substancialmente idêntica ao polipéptido codificado por uma sequência que ocorre de forma natural de um segmento do gene de Ig humano. Por "substancialmente" entende-se que o degrau da identidade da sequência de aminoácido é de pelo menos cerca de 85%-95%. De preferência, o grau da identidade da sequência de aminoácido é superior a 90%, ainda melhor se for superior a 95%.
[0125] Por "meganuclease" entende-se uma endodeoxiribonuclease que reconhece os locais de reconhecimento longos no DNA, de preferência pelo menos 12, ainda melhor se for pelo menos 13, ainda melhor se for pelo menos 14, ainda melhor se for pelo menos 15, ainda melhor se for pelo menos 16, ainda melhor se for pelo menos 17 e ainda melhor se for pelo menos 18 nucleótidos de comprimento. As meganucleases incluem nucleases de dedos de zinco, endonucleases homing que ocorrem de forma natural e nucleases de dedos de zinco personalizados e endonucleases de homing. O que é necessário para utilizar nesta invenção é que a meganuclease reconhece uma sequência alvo da meganuclease presente em ou próxima a um locus de Ig endógeno no animal de estudo de modo a que uma mutação funcional possa ser introduzida no locus de Ig através da acção da meganuclease. Para mais informações sobre meganucleases, consultar, por exemplo, as publicações de candidatura a patente americanas n.°s 20060206949, 20060153826, 20040002092, 20060078552 e 20050064474.
[0126] As nucleases de dedos de zinco com especificidade alterada podem ser geradas através da combinação de dedos 32 de zinco individuais com tripletos-alvo diferentes. A especificidade de endonucleases homing que ocorrem de forma natural pode ser alterada através de manipulação da proteína baseada na estrutura. Por exemplo, consultar Proteus and Carroll, nature biotechnology 23(8):967-97, 2005.
[0127] Um animal com um "locus de Ig com linha germinal desactivada" ou "locus de Ig endógeno com linha germinal desactivada" ou "mutação da linha germinal num locus de Ig endógeno", tem um locus de Ig endógeno desactivado em cada célula, i.e., cada célula somática e germinativa. Na presente invenção, animais com loci de linha germinativa desactivada são produzidos por mutação, tal como efectuado pela acção de uma meganuclease numa célula germinativa que dá origem ao animal resultante ou a um antecessor do mesmo.
[0128] Produção de células germinativas viáveis e animais transgénicos com loci de Ig endógenos desactivados [0129] Na presente invenção, as meganucleases são utilizadas para desactivar loci de Ig endógenos de modo a produzir células germinativas viáveis com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado. Os métodos envolvem a expressão de pelo menos uma meganuclease numa célula germinativa, ovócitos fertilizados ou embrião de modo a gerar uma célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado. A meganuclease assim expressa reconhece uma sequência alvo da meganuclease presente em ou próxima a um locus de Ig endógena no animal de estudo.
[0130] Numa versão, em que a meganuclease é expressa numa célula germinativa, a célula germinativa em que a 33 meganuclease é expressa numa célula germinativa produz uma célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig endógena desactivada. Em alternativa, uma célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado pode ser obtida a partir de um animal derivado de uma célula germinativa em que a meganuclease foi expressa.
[0131] Numa versão, em que a meganuclease é expressa num ovócito fertilizado ou num embrião, a célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado pode ser obtido a partir de um animal derivado do ovócito fertilizado ou do embrião em que meganuclease foi expressa.
[0132] A invenção também proporciona métodos para a produção de animais transgénicos que incluem pelo menos uma locus de Ig endógena com linha germinativa desactivada. Os métodos incluem fazer derivar um animal transgénico de uma célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado produzido de acordo com os métodos aqui descritos.
[0133] Numa versão, a célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado inclui também um locus de Ig artificial e o animal transgénico assim produzido inclui um locus de Ig artificial.
[0134] Numa versão, os métodos também incluem a introdução de um locus de Ig artificial na célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado ou uma célula germinativa descendente do mesmo ou um ovócito fertilizado ou um embrião derivado do mesmo e o animal transgénico assim produzido inclui um locus de Ig artificial. 34 [0135] Numa versão, os métodos incluem a combinação de uma célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig desactivado, ou uma célula germinativa descendente do mesmo, com uma gâmeta que inclui um locus de Ig artificial e o animal transgénico assim produzido inclui um locus de Ig artificial.
[0136] Desactivaçao dos loci de Ig endógenos [0137] A desactivação dos loci de Ig endógenos é feita utilizando meganucleases especificas para segmentos de gene de imunoglubina em loci de cadeias pesadas e/ou leves endógenas ao animal de estudo. Numa versão podem ser induzidas quebras na cadeia dupla de DNA por injecção de uma meganuclease nas células germinativas, ovócitos fertilizados ou embriões. Em alternativa, os vectores de expressão ou o ácido nucleico que codifica uma meganuclease e que é capaz de ser expresso em células germinativas, ovócitos fertilizados ou embriões podem ser injectados nas mesmas.
[0138] Numa versão, o método envolve a transfecção de células germinativas, que podem incluir percussores do mesmo como células estaminais espermatagoniais, in vitro ou in vivo, com uma meganuclease que codifica ácido nucleico ou construção de expressão. Por exemplo, consultar Ryu et al. , J. Androl., 28:353-360, 2007; Orwig et al., Biol. Report, 67:874-879, 2002.
[0139] Numa versão preferida, uma construção de expressão de meganuclease é integrada no genoma do animal de estudo. A expressão do transgene que codifica a meganuclease nas células germinativas resultará em quebras da dupla cadeia nos loci de Ig endógenos e a subsequente mutação do local de restrição. Acasalar tais 35 animais transgénicos resulta em descendentes com loci de imunoglubina mutados/desactivados.
[0140] Numa versão altamente preferida da presente invenção, uma construção de expressão de meganuclease regulável é integrada no genoma do animal de estudo, cuja construção regulável pode ser induzida nas células germinativas. Tais construções proporcionam a minimização dos efeitos citotóxicos associados à expressão de uma meganuclease particular através de uma expressão controlada por promotores induziveis, por exemplo, promotores induzidos por calor, promotores induzidos por radiação, operão de tetraciclina, promotores induziveis por hormonas e promotores induziveis pela dimerização de transactivadores, entre outros. Por exemplo, consultar Vilaboa et al., Current Gene Therapy, 6:421-438, 2006.
[0141] Em alternativa, a expressão da meganuclease pode ser induzida num embrião derivado da célula germinativa.
[0142] Numa versão, uma única meganuclease é expressa numa célula germinativa, em que a meganuclease reconhece uma sequencia-alvo em ou próxima a um locus de imunoglubina endógena para a célula germinativa do animal de estudo. Numa versão preferida, a sequência de meganuclease pretendida está dentro de ou próxima a um segmento do gene J. Noutra versão preferida, a sequência-alvo da meganuclease está dentro de ou próxima de um gene da região constante da imunoglubina. Numa versão preferida, o gene da região constante da imunoglubina codifica a imunoglubina μ.
[0143] Numa versão preferida, pelo menos duas meganucleases com sequências-alvo distintas são utilizadas. As pelo menos duas meganucleases são expressas numa célula germinativa, em que as 36 meganucleases reconhecem uma sequência-alvo dentro ou próxima de a um locus de imunoglubina endógena da célula germinativa do animal de estudo.
[0044] Numa versão preferida, a primeira e a segunda meganuclease procuram os segmentos do gene J. Numa versão, as sequência pretendidas da primeira e da segunda meganuclease são, em conjunto, a montante a jusante de um ou mais segmentos de genes J no âmbito do locus de Ig endógeno, e a clivagem através da primeira e da segunda meganuclease produz a eliminação de um segmento de DNA genómico que inclui os segmentos do referido gene J.
[0145] Noutra versão, a primeira e a segunda meganuclease procuram os segmentos do gene da região constante. Numa versão, as sequências pretendidas da primeira e da segunda meganuclease são, em conjunto, a montante e a jusante de um ou mais segmentos de genes da região constante de imunoglubina, e a clivagem através da primeira e da segunda meganuclease produz a eliminação de um segmento de DNA genómico que inclui os segmentos da referida região constante. Numa versão preferida, o gene da região constante codifica a imunoglubina μ.
[0146] Numa versão, uma cadeia pesada de Ig endógena e/ou um locus de cadeia leve ou grandes partes do mesmo são eliminadas do genoma do animal de estudo. Tais animais são também referidos como incluindo um locus endógeno que foi desactivado.
[0147] Numa versão, pelo menos uma meganuclease é utilizada para perturbar a região CHI de um locus de cadeia pesada de Ig, deixando o restante do locus intacto e capaz de produzir uma cadeia pesada de Ig que contorne a imunoglubina típica: associação de chaperona. De preferência, esta focalização no CHI é efectuado num 37 animal sem um locus de cadeia leve de Ig funcional. Tal focalização em tais animais é útil para a produção de anticorpos apenas de cadeia pesada.
[0148] Numa versão, mais de uma meganuclease é utilizada para focalizar o CHI no âmbito do locus da cadeia pesada de Ig.
[0149] Numa versão, sao utilizadas duas meganucleases que reconhecem locais adjacentes. Numa versão, os locais são elementos de um palíndroma. Numa versão, as duas meganucleases são ligadas através de um ligador.
[0150] Em versões preferidas, as estratégias de criação são concebidas para obter animais que são nulizigóticos para uma cadeia leve de Ig endógena e/ou uma cadeia pesada de Ig endógena.- [0151] Animais transgénicos que incluem construções de expressão de meganuclease genómica reguláveis [0152] Num aspecto, a invenção fornece animais transgénicos que incluem pelo menos uma construção de expressão de meganuclease genómica regulável.
[0153] Os animais transgénicos são seleccionados a partir de pequenos animais de laboratório, principalmente aves (galinhas, perus, codornízes, patos, faisões ou gansos, entre outros), roedores (p. ex., ratos, hamsters e porquinhos da índia) e doninhas (p.ex., toirões).
[0154] Numa versão preferida, a construção de expressão da meganuclease genómica regulável inclui uma região de controlo de expressão ligada de forma operacional a um ácido nucleico codificante da meganuclease. A região de controlo de expressão induzível é induzivelmente funcional numa célula germinativa do animal transgénico 38 particular e a meganuclease codificada é selectiva para uma sequência-alvo da meganuclease situada dentro ou próxima de um locus de imunoglubina endógena do animal de estudo.
[0155] Uma construção de expressão da meganuclease regulável proporciona a minimização dos efeitos citotóxicos associados à expressão de uma meganuclease particular através de uma expressão controlada por promotores induzíveis, por exemplo, promotores induziveis por calor, promotores induzíveis por radiação, operão de tetraciclina, promotores induzíveis por hormonas e promotores induzíveis pela dimerização de transactivadores, entre outros.
[0156] Numa versão preferida, um animal transgénico da invenção inclui duas construções de expressão da meganuclease genómica regulável, incluindo dois ácidos nucleicos diferentes que codificam duas meganucleases diferentes que reconhecem duas sequências alvo diferentes. As duas meganucleases em conjunto são utilizadas para eliminar um segmento de DNA genómico de um locus de Ig endógeno e assim desactivar o mesmo.
[0157] Os animais transgénicos que incluem pelo menos uma construção de expressão da meganuclease podem ser produzidos através de meios bem conhecidos na indústria. Por exemplo, um vector transgénico que contém uma região de controlo de expressão induzivel ligada de forma operacional a um ácido nucleico de codificação meganuclease pode ser introduzido em células receptoras e, de seguida, integradas no genoma das células receptoras através de integração aleatória ou específica.
[0158] Para uma integração aleatória, um tal vector transgénico pode ser introduzido numa célula receptora 39 através de tecnologia transgénica padrão. Por exemplo, um vector transgénico pode ser directamente injectado no pronúcleo de um ovócito fertilizado. Um vector transgénico também pode ser introduzido pela co-incubação de esperma com o vector transgénico antes da fertilização do ovócito. Os animais transgénicos podem ser desenvolvidos a partir de ovócitos fertilizados. Outra forma de introduzir um vector transgénico é através da transfecção de células estaminais embriónicas ou outras células pluripotentes (por exemplo, células germinativas primordiais) e, de seguida, injectar as células geneticamente modificadas nos embriões em desenvolvimento. Em alternativa, um vector transgénico (nú ou em combinação com os reagentes facilitadores) pode ser directamente injectado num embrião em desenvolvimento. Noutra versão, o vector transgénico é introduzido no genoma de uma célula e um animal é derivado a partir da célula em transfecção através da clonagem de transferência nuclear.
[0159] Para uma integração especifica, um tal vector transgénico pode ser introduzido em células de recepção adequadas como células estaminais embriónicas ou células somáticas já diferenciadas. De seguida, as células em que o transgene foi integrado no genoma animal no local-alvo através da recombinação homóloga podem ser seleccionadas pelos métodos habituais. As células seleccionadas podem em seguida ser fundidas com células de unidades de transferência nuclear enucleadas, p. ex. ovócitos ou células estaminais embriónicas, células que são omnipotentes e capazes de formar um neonato funcional. A fusão é efectuada de acordo com técnicas convencionais que estão bem estabelecidas. Consultar, por exemplo, Cibelli et al., Science (1998) 280:1256 Zhou et al. 40
Science (2003) 301: 1179. A enucleação de ovócitos e a transferência nuclear também pode ser efectuada através da microcirurgia utilizando pipetas de injecção. (Consultar, por exemplo, Wakayama et al. , Nature (1998) 394:369.) As células resultantes são então cultivadas no meio adequado e transferidas em recipientes sincronizados para a geração de animais transgénicos. Em alternativa, as células geneticamente modificadas podem ser injectadas nos embriões em desenvolvimento.
[0160] Numa versão, uma meganuclease é utilizada para aumentar a frequência da recombinação homóloga num local-alvo através da quebra da cadeia dupla de DNA.
[0161] Animais transgénicos que incluem loci de Ig artificiais e que são capazes de produzir anticorpos com idiótipos humanos [0162] Num aspecto, a invenção apresenta animais transgénicos capazes de produzir imunoglubina com idiótipos humanos, bem como métodos para fazer o mesmo.
[0163] Os animais transgénicos principalmente utilizados são seleccionados a partir de aves (galinhas, perus, codornízes, patos, faisões ou gansos, entre outros), roedores (p. ex., ratos, hamsters e porquinhos da índia) e doninhas (p.ex., toirões).
[0164] Os animais transgénicos utilizados para a produção de anticorpos humanizados na invenção são portadores de mutações ao nível da linha germinal nos loci de Ig endógenos que foram afectados pela actividade de uma ou mais meganucleases. Numa versão preferida, os animais transgénicos são nulizigóticos para uma cadeia pesada de Ig endógeno e/ou uma cadeia leve de Ig endógeno. Além disso, estes animais são portadores de 41 pelo menos um locus de Ig artificial que é funcional e capaz de produzir um repertório de moléculas de imunoglubina no animal transgénico. Os loci de Ig artificiais utilizados na invenção incluem pelo menos um segmento de gene V humano.
[0165] Numa versão preferida, os animais transgénicos são portadores de, pelo menos, um locus de cadeia pesada de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia artificialmente leve de Ig que são ambos funcionais e capazes de produzir um repertório de moléculas de imunoglubina no animal transgénico, cujo repertório de moléculas de imunoglubina inclui anticorpos com idiótipo humano. Numa versão, são utilizados loci artificiais que incluem pelo menos um gene C não humano e são utilizados animais capazes de produzir anticorpos quiméricos com um idiótipo humano e uma região constante não humana. Numa versão, são utilizados loci artificiais que incluem pelo menos um gene C humano e são utilizados animais capazes de produzir anticorpos com um idiótipo humano e uma região constante humana.
[0166] Noutra versão preferida, os animais transgénicos são portadores de, pelo menos, um locus de cadeia pesada de Ig artificial e não têm um locus de cadeia funcionalmente leve. Tais animais encontram uso na produção de anticorpos de cadeia apenas pesada.
[0167] A produção de tais animais transgénicos envolve a integração de um ou mais loci de Ig de cadeia pesada artificial e um ou mais loci de Ig de cadeia leve artificial no genoma de um animal transgénico com pelo menos um locus de Ig endógeno que foi ou será desactivado pela acçao de uma ou mais meganucleases. Preferencialmente, os animais transgénicos são 42 nulizigóticos para uma cadeia pesada de Ig endógeno e/ou uma cadeia leve de Ig endógeno e, respectivamente, incapaz de produzir imunoglubina endógena. Independentemente da localização cromossomática, um locus de Ig artificial da presente invenção tem a capacidade de se submeter à reorganização genética e assim produzir um repertório diversificado de moléculas de imunoglubina. Um locus de Ig com a capacidade de se submeter à reorganização genética é também referido aqui como um locus de Ig "funcional" e os anticorpos com uma diversidade gerada por um locus de Ig funcional são também aqui referidos como "anticorpos" funcionais ou um repertório funcional de anticorpos.
[0168] Os loci artificiais utilizados para gerar tais animais transgénicos incluem cada um vários segmentos do gene de imunoglubina, um ou mais segmentos do gene D no caso de um locus de cadeia pesada e um ou mais genes da região constante. Na presente invenção, pelo menos um dos segmentos do gene V codifica uma linha germinal ou sequência de aminoácidos da região V humana hipermutada. Respectivamente, tais animais transgénicos têm a capacidade de produzir um repertório diversificado de moléculas de imunoglubina, o que inclui anticorpos com um idiótipo humano.
[0169] Numa versão, os loci artificiais utilizados incluem pelo menos um segmento do gene da região C não humano. Respectivamente, tais animais transgénicos têm a capacidade de produzir um repertório diversificado de moléculas de imunoglubina, o que inclui anticorpos quiméricos com um idiótipo humano.
[0170] Numa versão, os loci artificiais utilizados incluem pelo menos um segmento do gene da região C 43 humano. Respectivamente, tais animais transgénicos têm a capacidade de produzir um repertório diversificado de moléculas de imunoglubina, o que inclui anticorpos com um idiótipo humano e uma região constante humana.
[0171] Numa versão, os loci artificiais utilizados incluem pelo menos um gene da região constante artificial. Por exemplo, um gene de região constante C artificial exemplar é um gene de região constante codificando um domínio humano IgG CHI e um domínio de rato IlgG CH2 e CH3. Respectivamente, tais animais transgénicos têm a capacidade de produzir um repertório diversificado de moléculas de imunoglubina, o que inclui anticorpos com um idiótipo humano e uma região constante artificial que inclui os componentes humano e não humano.
[0172] 0 vector transgénico que contém um locus artificial é introduzido na célula ou células de recepção e depois integradas no genoma da célula ou células de recepção através de integração aleatória ou específica.
[0173] Para uma integração aleatória, um vector transgénico que contém um locus artificial pode ser introduzido numa célula receptora através de tecnologia transgénica padrão. Por exemplo, um vector transgénico pode ser directamente injectado no pronúcleo de um ovócito fertilizado. Um vector transgénico também pode ser introduzido pela co-incubação de esperma com o vector transgénico antes da fertilização do ovócito. Os animais transgénicos podem ser desenvolvidos a partir de ovócitos fertilizados. Outra forma de introduzir um vector transgénico é através da transfecção de células estaminais embriónicas ou outras células pluripotentes (por exemplo, células germinativas primordiais) e, de seguida, injectar as células geneticamente modificadas 44 um nos embriões em desenvolvimento. Em alternativa, vector transgénico (nú ou em combinação com os reagentes facilitadores) pode ser directamente injectado num embrião em desenvolvimento. Em último caso, os animais transgénicos quiméricos são produzidos a partir de embriões que contêm o transgene artificial integrado no genoma de pelo menos algumas células somáticas do animal transgénico. Noutra versão, o vector transgénico é introduzido no genoma de uma célula e um animal é derivado a partir da célula em transfecção através da clonagem de transferência nuclear.
[0174] Numa versão preferida, um transgene que contém um locus de Ig artificial é aleatoriamente integrado no genoma das células receptoras (como ovócitos fertilizados ou embriões em desenvolvimento). As células receptoras são derivadas de um animal com pelo menos um locus de Ig endógeno que foi desactivado pela acção de uma ou mais meganucleases. Em alternativa, os animais transgénicos que são portadores de um loci de imunoglubina artificial podem ser cruzados com animais transgénicos com pelo menos um locus de Ig endógeno que foi desactivado pela acção de uma ou mais meganucleases. Independentemente do método em particular utilizado, numa versão preferida, os descendentes são nulizigóticos para cadeia de Ig leve ou pesada endógena e, respectivamente, são obtidas imunoglubinas incapazes de produzir imunoglubinas endógenas e capazes de produzir imunoglubinas transgénicas.
[0175] Para uma integração especifica, um tal vector transgénico pode ser introduzido em células de recepção adequadas tal como células estaminais embriónicas, outras células pluripotentes ou células somáticas já diferenciadas. De seguida, as células em que o transgene 45
foi integrado no genoma animal e substituiu o locus de Ig endógeno correspondente através da recombinação homóloga podem ser seleccionadas pelos métodos habituais. As células seleccionadas podem em seguida ser fundidas com células de unidades de transferência nuclear enucleadas, p. ex. ovócitos ou células estaminais embriónicas, células que são omnipotentes e capazes de formar um neonato funcional. A fusão é efectuada de acordo com técnicas convencionais que estão bem estabelecidas. Consultar, por exemplo, Cibelli et al., Science (1998) 280:1256; Zhou et al. Science (2003) 301: 1179. A enucleação de ovócitos e a transferência nuclear também pode ser efectuada através da microcirurgia utilizando pipetas de injecção. (Consultar, por exemplo, Wakayama et al. , Nature (1998) 394:369.) As células resultantes são então cultivadas no meio adequado e transferidas em recipientes sincronizados para a geração de animais transgénicos. Em alternativa, as células geneticamente modificadas seleccionadas podem ser injectadas nos embriões em desenvolvimento que são subsequentemente desenvolvidos em animais quiméricos.
[0176] Numa versão, uma meganuclease é utilizada para aumentar a frequência da recombinação homóloga num local-alvo através da clivagem de quebra de DNA de cadeia dupla. Para integração em loci de imunoglubina endógena pode ser utilizada uma meganuclease especifica de um local. Numa versão, uma meganuclease que se destina a um locus de Ig endógeno é utilizada para aumentar a frequência de uma recombinação homóloga e a substituição de um locus de Ig endógeno ou partes do mesmo com um locus de Ig artificial ou partes do mesmo. 46 [0177] Numa versão, o animal transgénico nao tem um locus de cadeia leve de Ig funcional e inclui um locus de cadeia pesada de Ig artificial.
Loci de Ig artificial [0178] A presente invenção é também direccionada para a utilização de um loci de Ig artificial na criação de animais transgénicos capazes de produzir imunoglubinas com idiótipo humano.
[0179] Cada locus de Ig artificial inclui vários segmentos do gene de imunoglubina, que inclui pelo menos um segmento do gene da região V, um ou mais segmentos do gene J, um ou mais segmentos do gene D no caso de um locus de cadeia pesada e um ou mais genes da região constante. Na presente invenção, pelo menos um dos segmentos do gene V codifica uma linha germinal ou sequência de aminoácidos da região V humana hipermutada. Respectivamente, tais animais transgénicos têm a capacidade de produzir um repertório diversificado de moléculas de imunoglubina, o que inclui anticorpos com um idiótipo humano. Em loci de cadeia pesada segmentos do gene D derivados de humanos ou não humanos podem ser incluídos no loci de Ig artificial. Os segmentos do gene em tais loci são justapostos uns em relação aos outros numa configuração não organizada (ou "a configuração da linha germinal") ou numa configuração reorganizada de forma parcial ou total. Os loci de Ig artificiais têm a capacidade de se submeter à reorganização genética (se os segmentos do gene não estiverem totalmente reorganizados) no animal de estudo assim produzindo um repertório diversificado de imunoglubinas com idiótipos humanos.
[0180] Os elementos regulatórios como promotores, aceleradores, regiões de intercâmbio, sinais de 47 recombinação, entre outros, podem ser de origem humana ou não humana. 0 que é necessário é que os elementos sejam operáveis nas espécies animais relevantes, de modo a tornar os loci artificiais funcionais.
[0181] Também apresentamos construções transgénicas que contêm um locus de cadeia pesada artificial capaz de se submeter à reorganização genética no animal hospedeiro, assim produzindo um repertório diversificado de cadeias pesadas com idiótipos humanos. Um locus de cadeia pesada artificial do transgene contém uma região V com pelo menos um segmento do gene V humano. De preferência, a região V inclui pelo menos cerca de 5-100 segmentos do gene V (ou "VH") de cadeia pesada humanos. Tal como descrito acima, um segmento VH humano envolve sequências que ocorrem de forma natural de um segmento do gene Vh humano, degenera formas de sequências que ocorrem de forma natural de um segmento de gene VH humano, bem cimo sequências sintéticas que codificam substancialmente uma sequência polipéptida (i.e., pelo menos cerca de 85%-95%) idêntica ao polipéptido do domínio V de uma cadeia pesada humana.
[0182] Numa versão preferida, o locus de cadeia pesada artificial contém pelo menos um ou vários genes da região constante de ratos, p. ex., Cõ, Cp e Cy (incluindo qualquer uma das subclasses de Cy).
[0183] Noutra versão preferida, o locus de cadeia pesada artificial contém genes da região constante artificial. Numa versão preferida, tais genes da região constante artificial codificam um domínio humano CHI e domínios de ratos CH2 CH3, ou domínios humano CHI e de rato CH2, CH3 e CH4. Uma cadeia pesada híbrida com um domínio CHI 48 humano emparelha de forma eficaz com uma cadeia leve totalmente humana.
[0184] Noutra versão preferida, o locus de cadeia pesada artificial contém genes da região constante sem domínios CHI. Numa versão preferida, tais genes artificiais da região constante codificam IgM e/ou IgG truncados sem o domínio CHI mas incluindo os domínios CH2 e CH3 ou CHI, CH2, CH3 e CH4. As cadeias pesadas sem os domínios CHI não se podem efectivamente emparelhar com cadeias de Ig leves e formar anticorpos de cadeia apenas pesada.
[0185] Também apresentamos construções transgénicas que contêm um locus de cadeia leve artificial capaz de se submeter à reorganização genética no animal hospedeiro, assim produzindo um repertório diversificado de cadeias leves com idiótipos humanos. Um locus de cadeia leve artificial do transgene contém uma região V com pelo menos um segmento do gene V humano, p. ex., uma região V com pelo menos um gene humano VL e/ou pelo menos um segmento VJ humano reorganizado. De preferência, a região V inclui pelo menos cerca de 5-100 segmentos do gene V (ou "VL") de cadeia leve humanos. Consistentemente, um segmento VL humano envolve sequências que ocorrem de forma natural de um segmento do gene VL humano, degenera formas de sequências que ocorrem de forma natural de um segmento de gene VL humano, bem cimo sequências sintéticas que codificam substancialmente uma sequência polipéptida (i.e., pelo menos cerca de 85%-95%) idêntica ao polipéptido do domínio V de uma cadeia leve humana. Numa versão, o locus de Ig da cadeia leve artificial tem uma região C com pelo menos um gene C de ratos (p. ex., CÀ ou Ck de ratos). 49 [0186] Outro aspecto da presente invenção está direccionado para os métodos para criar um vector transgénico que contém um locus artificial. Tais métodos envolvem o isolamento de loci de Ig ou fragmentos do mesmo, e combinando o mesmo com um ou mais fragmentos de DNA que incluem sequências que codificam elementos de região V humanos. Os segmentos do gene de Ig estão inseridos no locus de Ig artificial ou uma parte do mesmo através de ligação ou recombinação homóloga de modo a reter a capacidade do locus para se submeter a uma reorganização genética efectiva no animal de estudo.
[0187] De preferência, um locus de Ig não humano é isolado analisando uma biblioteca de plasmídeos, cosmideos, YACs ou BACs, entre outros, preparados a partir do DNA genómico do mesmo. Clones do YAC podem ser portadores de fragmentos de DNA de até 2 megabases, assim um locus de cadeia pesada animal ou uma grande parte do mesmo pode ser isolada num clone do YAC ou reconstruídos de modo a serem contidos num clone do YAC. Clones do BAC são capazes de ser portadores de fragmentos de DNA de dimensões inferiores (cerca de 50-500 kb). Contudo, vários clones BAC que contêm fragmentos sobrepostos de um locus de Ig podem ser alterados em separado e subsequentemente injectados em conjunto numa célula receptora animal, em que os fragmentos que se sobrepõem se recombinam na célula animal recipiente de modo a gerar um locus de Ig contínuo.
[0188] Os segmentos do gene de Ig humano podem ser integrados no locus de Ig num (p. ex., um clone de BAC) através de uma variedade de métodos, incluindo a ligação aos fragmentos de DNA ou a inserção de fragmentos de DNA através da recombinação homóloga. A integração de segmentos do gene de Ig humano é efectuada de modo a que 50 o segmento do gene de Ig seja ligado de forma operacional à sequência do animal hospedeiro no transgene de modo a produzir um locus de Ig humanizado funcional, i locus de ig capaz de reorganização genética que produção de um repertório diversificado de anticorpos com idiótipos humanos. Uma recombinação homóloga pode ser efectuada em bactérias, levedura e outras células com uma frequência elevada de eventos de recombinação homóloga. YACs e Bacs manipulados podem ser prontamente isolados das células e utilizados na criação de animais transgénicos.
[0189] Imunoglubinas com idiótipo humano [0190] Assim que é criado um animal transgénico capaz de produzir imunoglubinas com idiótipo humano, as imunoglubinas e as preparações de anticorpos contra um antigeno podem ser prontamente obtidas imunizando o animal com o antigeno. "Composição antisoro policlonal" tal como é aqui utilizado inclui preparações de anticorpos policlonais purificados por afinidade.
[0191] Pode ser utilizada uma variedade de antigenos para imunizar um animal transgénico. Tais antigenos incluem mas não estão limitados a microorganismos, p. ex., vírus e organismos unicelulares (como bactérias e fungos), vivos, atenuados ou mortos, fragmentos dos microorganismos ou moléculas antigénicas isoladas dos microorganismos.
[0192] Os antigenos bacteriais preferidos para utilização na imunização de um animal inclui antigenos purificados de Staphylococcus aureus como polisacarídeos capsulares de tipo 5 e 8, versões recombinantes dos factores de virulência como alfa-toxinas, proteínas de ligação por adesão, proteínas de ligação por colagénio e 51 proteínas de ligação por fibronectina. Os antigenos bacteriais preferidos também incluem uma versão atenuada de S. aureus, Pseudomonas aeruginosa, enterococus, enterobactérias e Klebsiella pneumoniae ou sobrenadante da cultura destas células bacterianas. Outros antigenos bacterianos que podem ser utilizados na imunização incluem lipopolisacarídeo purificado (LPS), antigenos capsulares, polisacarídeos capsulares e/ou versões recombinantes das proteínas de membrana exterior, proteínas de ligação por fibronectina, endotoxina e exotoxina de Pseudomonas aeruginosa, enterococus, enterobactéria e Klebsiella pneumoniae.
[0193] Os antigenos preferidos para a geração de anticorpos contra fungos inclui a versão atenuada de fungos ou proteínas de membrana exterior dos mesmos, cujos fungos incluem mas não estão limitados a Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis e Cryptococcus neoformans.
[0194] Os antigenos preferidos para utilizar na imunização de modo a gerar anticorpos contra vírus incluem as proteínas de envelope e as versões atenuadas dos vírus que incluem, mas não estão limitadas a, vírus sincitiais respiratórios (RSV) (particularmente a proteína F) , virus da hepatite C (HCV), vírus da hepaptite B (HBV), citomegalovírus (CMV), EBV e HSV.
[0195] Anticorpos específicos para o cancro podem ser gerados imunizando os animais transgénicos com células tumorais isoladas ou linhas celulares tumorais bem como antigenos associados ao tumor que incluem mas não estão limitados a antigeno Her-2-neu (anticorpos que são úteis para o tratamento de cancro da mama); antigenos CD20, CD22 e CD53 (anticorpos contra úteis para o tratamento de 52 linfomas da célula B), antigeno da membrana específica da próstata (PMSA) (anticorpos úteis para o tratamento do cancro da próstata) e molécula 17-1A (anticorpos úteis para o tratamento do cancro do colón).
[0196] Os antigéneos podem ser administrados a um animal transgénico de qualquer forma conveniente, com ou sem um adjuvante, e podem ser administrados de acordo com um horário pré-estabelecido.
[0197] Para criar um anticorpo monoclonal, células do baço são isoladas do animal transgénico imunizado e utilizadas na fusão celular com linhas celulares transformadas para a produção de hibridomas ou anticorpos que codificam cDNAs são clonados através de técnicas padrão da biologia molecular e expressas em células transfectadas. Os procedimentos para criar anticorpos monoclonais estão bem estabelecidos no art. Consultar, p. ex., a candidatura a patente europeia 0 583 980 AI ("Method For Generating Monoclonal Antibodies From Rabbits"), patente americana n.° 4,977,081 ("Stable Rabbit-Mouse Hybridomas And Secretion Products Thereof"), WO 97/16537 ("Stable Chicken B-cell Line And Method of Use Thereof") e EP 0 491 057 BI ("Hybridoma Which Produces Avian Specific Immunoglobulin G") . A produção in vitro de anticorpos monoclonais a partir de moléculas de cDNA clonadas foi descrita por Andris-Widhopf et al., "Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display", J Immunol Methods 242:159 (2000) e por Burton, D. R., "Phage display", Immunotechnology 1:87 (1995).
[0198] Assim que os anticorpos monoclonais quiméricos com idiótipos humanos foram gerados, tais anticorpos quiméricos podem ser facilmente convertidos em anticorpos 53 totalmente humanos utilizando as técnicas padrão da biologia molecular. Os anticorpos monoclonais totalmente humanos não são imunogénicos em humanos e são adequados para utilização no tratamento terapêutico de sujeitos humanos.
Os anticorpos da invenção incluem anticorpos apenas de cadeia pesada [0199] Numa versão, os animais transgénicos que não têm um locus de cadeia leve de Ig funcional e que incluem um locus de cadeia pesada artificial, são imunizados com antigeno de forma a produzir apenas anticorpos de cadeia pesada que se ligam de forma especifica ao antigeno.
[0200] Também sao apresentados células que produzem anticorpos derivados de tais animais, bem como ácidos nucleicos derivados dos mesmos. Também são apresentados hibridomas derivados dos mesmos. Também são apresentados anticorpos de cadeia apenas pesada totalmente humanos, bem como ácidos nucleicos de codificação, derivados dos mesmos.
[0201] Ensinamentos sobre anticorpos de cadeia apenas pesada podem ser encontrados no art. Por exemplo, consultar as publicações PCT WO02085944, WO02085945, W02006008548 e W02007096779. Consultar também US 5,840,526; US 5,874,541 ; US 6,005,079; US 6,765,087; US 5,800,988; EP 1589107; WO 9734103; e US 6,015,695.
Composições farmacêuticas [0202] Noutra versão da presente invenção, anticorpos monoclonais ou policlonais são misturados com um suporte farmaceuticamente adequado para a administração a pacientes, de modo a proporcionar uma composição farmacêutica. 54 [0203] Os pacientes tratados com as composiçoes farmacêuticas da invenção são preferencialmente mamíferos, ainda mais preferencialmente humanos, apesar de utilizações veterinárias também serem contempladas.
[0204] Os suportes farmaceuticamente aceitáveis que possam ser aplicados nas presentes composições farmacêuticas podem ser qualquer um dos solventes, meios de dispersão, agentes isotónicos, entre outros. Excepto se os meios, agentes, diluentes ou suportes convencionais forem prejudiciais para o recipiente ou para a eficácia terapêutica dos anticorpos contidos no mesmo, a sua utilização nas composições farmacêuticas da presente invenção é adequada.
[0205] 0 suporte pode ser líquido, semi-sólido, p. ex. pastas, ou sólido. Os exemplos de suportes incluem óleos, água, soluções salinas, álcool, açúcar, gel, lípidos, liposomas, resinas, matrizes porosas, ligantes, guarnições, revestimentos, conservantes e similares, ou combinações dos mesmos. Métodos de tratamento [0206] Também são apresentados métodos para o tratamento de doenças em vertebrados, preferencialmente mamíferos, preferencialmente primatas, sendo os sujeitos humanos especialmente preferidos, através da administração de uma composição purificada de anticorpos da invenção adequada ao tratamento de tal doença.
[0207] As composições de anticorpos podem ser utilizadas para ligar e neutralizar ou modular uma entidade antigénica nos tecidos do corpo humano que causa ou contribui para a doença ou que elicite respostas imunes anormais ou indesejadas. Uma "entidade antigénica" é aqui 55 definida para contornar quaisquer moléculas de superfície solúveis ou celulares incluindo proteínas, bem como células ou organismos que causam doenças infecciosas ou agentes que sejam pelo menos capazes de se ligar a um anticorpo e, de preferência, também sejam capazes de estimular uma resposta immune.
[0208] A administração de uma composição de anticorpos contra um agente infeccioso enquanto monoterapia ou em combinação com quimioterapia resulta na eliminação das partículas infecciosas. Uma única administração de anticorpos diminui o número de partículas infecciosas geralmente entre 10 e 100 vezes, mais frequentemente mais de 1000 vezes. Do mesmo modo, a terapia de anticorpos em pacientes com uma doença maligna aplicada enquanto monoterapia ou em combinação com quimioterapia reduz o número de células malignas geralmente entre 10 a 100 vezes ou mais de 1000 vezes. A terapia pode ser repetida ao longo de período mais prolongado de modo a assegurar a completa eliminação das partículas infecciosas, células malignas, etc. Em alguns casos, a terapia com preparações de anticorpos será continuada durante períodos mais prolongados na ausência de quantidades detectáveis de partículas infecciosas ou células indesejáveis.
[0209] Do mesmo modo, a utilização de terapia de anticorpos para a modulação de respostas imunes pode consistir numa única ou em várias administrações de anticorpos terapêuticos. A terapia pode ser continuada durante períodos longos de tempo na ausência de quaisquer sintomas da doença. 56
Experimental
Evolução dirigida de endonucleases homing específicas para sequências de imunoglubina de ratos [0210] Uma análise de sequências exão de IgM de ratos resultou na identificação de várias sequências-alvo para endonucleases de retorno manipuladas. Ao utilizar uma endonuclease homing do I-Scel, duas sequências-alvo foram identificadas, uma no âmbito do exão II da IgM de ratos (CGTGGATCACAGGGGTCT) e a outra no âmbito do exão III da IgM de ratos (CTGGGATAACAGGAAGGA). Estes locais partilham 61% (11 de 18 bases) da identidade da sequência com a sequência de reconhecimento natural de I-Scel (TAGGGATAACAGGGTAAT).
[0211]
Tabela 1 - Sequências alvo dos exões IgM no rato (os aminoácidos diferentes estão sublinhados)
Alvo Sequência Similaridade Posição T3 CGTGGATCACAGGGGTCT 61% Exão II T 4 CTGGGATAACAGGAAGGA 61% Exão III Selvagem TAGGGATAACAGGGTAAT
[0212] Para a manipulação de endonucleases homing especificas para estas sequências-alvo utilizámos uma selecção altamente sensível para a evolução direccionada das endonucleases homing que une clivagem de DNA 57 enzimático com a sobrevivências das células hospedeiras (descritas em detalhe por Chen e Zhao, Nucleic Acid Research 33(18):el54, 2005). Uma estratégia de co- evolução in vitro foi utilizada para manipular variantes de I-Scel com especificidade da sequência alvo. Tal como mostrado na tabela 2, para uma sequência-alvo T3, duas novas sequências, T3il e T3i2, foram seleccionadas como sequências intermédias, enquanto para a sequência T4, duas novas sequências, T4il e T4i2, foram seleccionadas como sequências intermédias. As sequências T3il e T4il foram clonadas para o relatório plasmídeo de modo a gerar pll-LacY-T3il e pll-LacY-T4il, respectivamente.
[0213]
Tabela 2. Sequências em três passos (os diferentes nucleótidos estão sublinhados)
j T 4 i1 j TAGGGATAACAGGGAGGA ÍT4Í2 j CTGGGATAACAGGAAGGA |t4 jCTGGGATAACAGGAAGGA
Passo 1 |T3il |TAGGGATAACAGGGGTCT Passo2 |T3i2 jCGTGGATAACAGGGGTCT Passo3 |τ3 ICGTGGATCACAGGGGTCT
[0214] Para obter mutantes do I-Scel com especificidade de sequência T3il ou T4il, foi executada em primeiro lugar a modulação molecular de modo a identificar os resíduos a serem utilizados para criar uma biblioteca especifica através da mutagénese de saturação. Tal como mostrado na Figura 2, o I-Scel liga-se ao terminal 3' de T3il ou T4il através de um laço relaxado que se encontra no sulco menor do DNA. Os resíduos Glyl3, Prol4, Asnl5 e Lys20 estão próximos deste terminal 3' e Asnl5 liga directamente à última timina no terminal 3' da sequência 58 de reconhecimento de tipo selvagem através de ligações de hidrogénio. Uma biblioteca de mutantes com todas as combinações possíveis de substituições de aminoácidos nestes quatro resíduos seleccionados foi construída por mutagénesis de saturação. De modo a gerar uma biblioteca suficientemente grande, a reacção de ligação e os procedimentos de transformação de DNA foram optimizados através de várias tentativas. Foi criada uma biblioteca com 2,9 106 mutantes.
[0215] A biblioteca foi analisada para encontrar mutantes do I-Scel com actividade crescente em relação à sequência T3il. Quando comparado com a ronda 0 (tipo selvagem do I-Scel), a primeira ronda de análise gerou mutantes com actividade crescente em relação à sequência T3il desde que a taxa de sobrevivência celular foi aumentada em 10 vezes. 0 enriquecimento dos mutantes potencialmente positivos na ronda 2 e 3 mostraram ainda mais melhorias na taxa de sobrevivência celular. Do mesmo modo, a biblioteca foi analisada para encontrar mutantes do I-Scel com actividade crescente em relação à sequência T4il. A análise para encontrar mutantes gerou mutantes com maior actividade em relação à sequência T4il.
[0216] Em paralelo, foi concebida uma segunda biblioteca de mutantes do I-Scel que tenham por alvo o terminal 5' da sequência de reconhecimento. A primeira biblioteca criada através de mutagénesis de saturação foi focada naqueles resíduos que interagem com o terminal 3' dos quatro nucleótidos da sequência de reconhecimento do I-Scel. Baseado na modulação molecular, Trpl49, Aspl50, Tyrl51 e Asnl52 1 encontram-se no maior sulco formada pelos nucleótidos com o terminal 5'. Asnl52 interage directamente com T(-7) através da ligação de hidrogénio. Aspl50 e Tyrl52 interagem T oposto a A(-6) indirectamente 59 através de uma molécula de água. Trpl49 e Tyrl51 interagem com a espinha de fosfato. Assim, estes quatro resíduos são importantes para a especificidade da sequência de I-Scel e a mutagénesis de saturação simultânea nestes quatro resíduos foi efectuada para criar uma segunda biblioteca de I-Scel.
[0217] Mais co-evolução destas enzimas resulta na geração de novas meganucleases específicas para sequências alvo nos exões II e III de Igm de ratos (CGTGGATCACAGGGGTCT e CTGGGATAACAGGAAGGA) [0218] Manipulação do I-Crel com especificidade de sequência definida [0219] Para a manipulação de endonucleases de retorno específicas para estas sequências alvo utilizámos uma selecção altamente sensível para a evolução direccionada das endonucleases de retorno que une a clivagem de DNA enzimático com as sobrevivências das células hospedeiras (descritas em detalhe por Chen e Zhao, Nucleic Acid Research 33(18):el54, 2005). Além disso, foi concebida uma estratégia geral para manipular o mutante do I-Crel com uma especificidade de sequência. 0 I-Crel reconhece uma sequência alvo de uma forma pseudo-palindrómica. As bases palindrómicas são directamente reconhecidas pelo I-Crel e podem ser difíceis de alterar (J. Mol. Biol., 280, 345-353) (Fig. 4).
[0220] Esta propriedade impede a manipulação directa de derivados do I-Crel que reconhecem uma sequência não palindrómica. Para ultrapassar este problema, a sequência alvo foi dividida em metade esquerda (metade superior) e metade direita (metade inferior) . 0 I-Crel está optimizado para as sequências intermédias do palindroma da metade esquerda e do palindroma da metade direita, 60 respectivamente (Figura 4). Em seguida, os mutantes do I-Crel, optimizados para as sequências intermédias, são manipuladas de forma a reconhecer o palindroma da sequência alvo. Finalmente, o mutante do I-Crel optimizou-se, respectivamente, para a metade esquerda e o da metade direita será co-expresso para clivar a sequência alvo. Além disso, a fusão do mutante optimizado da metade esquerda com o mutante optimizado da metade direita por um ligador polipéptido é examinada.
[0221] Uma sequência alvo no âmbito do exão IV (CAACTGATCCTGAGGGAGTCGG) que partilha 59% da identidade da sequência com a sequência de reconhecimento natural da endonuclease homing do I-Crel foi identificada. Subsequentemente, com base na identidade das bases palindrómicas no âmbito da sequência alvo do ICrel original, duas sequências, T5 e T6, foram seleccionadas como sequências alvo para a manipulação do I-Crel.
[0222] Sequência de reconhecimento do I-Crel e 2 sequências alvo: •11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 First half Second half ·. a ' ·;? - B j cl li'D :d ' Homology Original ÇpA -A )'A A C G T ci G T G A ! g A fC A G TtT TV’G*Í total palindromic T5 th Ai A Avj A T <6 τ iC' c T T G ' A d ,Gf G T f T Ç; A Gí . { 50.0¾ 543¾ T6 C;|À' A -è T G A"': T Cí c T G A L* G >.G A G · T .¾ G : Gjf 59.1¾ 57.1%
Palindromic bases are highlighted. Conserved bases are written in bold face.
[0223] As duas sequências alvo, T5 e T6, foram clonadas em plasmideos repórter. O gene I-Crel foi clonado no plasmideo pTrc e sequenciado para confirmar que não foram introduzidas mutações durante a amplificação PCR. 0 sistema de selecção do I-Crel é avaliado para as taxas de sobrevivência celular. 61 [0224] Além disso, a modulação molecular foi efectuada e os resíduos das proteínas que contactam directamente com o substrato de DNA foram identificados. Além disso, concebemos as sequências intermédias para experiências de co-evolução ín vitro.
Resíduos alvo para a mutagénesis de saturação [0225]
Resíduo alvo Resíduo alvo YN-TS5-L Q26 e S32 YN-TS6-L Q26, K28 e R68 YN-TS5-RÍ1 R68, R70 e D75 YN-TS6-RÍ1 Q44 e R68 YN-TS5-RÍ2 Q26 e K28 YN-TS6-RÍ2 N30, Y33 e Q38 YN-TS5-RÍ3 N30, Y33 e Q38 -........................................- ..............................................-..............
[0226] Subsequentemente, as bibliotecas dos mutantes ICrel são geradas e analisadas para encontrar derivados de ICrel com novas sequências alvo. Mais co-evolução destas enzimas resulta na geração de novas meganucleases específicas para uma sequência alvo no âmbito do exão IV da IgM de ratos (CAACTGATCCTGAGGGAGTCGG).
[0227] Manipulação de nucleases de dedos de zinco [0228] Proteínas de dedos de zinco (ZFP) foram concebidas contra sequências codificantes de IgM de rato (exões 1-4) e montadas tal como descrito (Zhang, L. et al. Synthetic zing finger transcription factor action at an endogenous chromosomal site. Activation of the human erythropoietin gene. J. Biol. Chem 275:33850-33860, 2000, 62
and Liu, P.Q. et al. Regulation of an endogenous locus against a panei of designed zinc finger proteins targeted to accessible chromatin regions. Activation of vascular endothelial growth factor. J Biol. Chem. 2765:11323-11334, 2001), para gerar as seguintes regiões de ZFP 63
64 [0229] ZFPs codificantes de DNA foram clonados num
vector de expressão. As células C6 de ratos foram obtidas a partir da American Type Culture Collection e criadas, tal como recomendado, num suporte F-12 (Invitrogen) suplementado com 5% de soro de vitelo fetal qualificado (FCS, hiclona) , 15% de soro de cavalo (Invitrogen) e 5mM de glutamina. As células foram dissociadas de plástico utilizando protease TrypLE Select (Invitrogen). Para a transfecção, 200 000 células C6 foram misturadas com 400ng de DNA plamida e 20pL de solução Amaxa SF. As células foram transfectadas para um Amaxa Nucleofector II Shuttle utilizando o programa 96 FF-137 e recuperada num suporte F-12 de 0,1 L quente e suplementado. Três e nove dias a seguir à transfecção as células foram colhidas e o DNA cromossomal foi preparado com uma solução de Quick Extract 1.0 (Epicentre). A região adequada do locus de IgM foi amplificado com PCR utilizando uma polymerase de DNA de alta-fidelidade Accuprime (Invitrogen). As reacções de PCR foram aquecidas até 94° e depois arrefecidas de forma gradual até atingir a temperatura ambiente. Aproximadamente 200ng do DNA recozido foi misturado com 0,33pL de enzima CEL-I (Transgenomic) e incubado durante 20 minutos a 42°. Os produtos da reacção foram analisados através da electroforese de gel de poliacrilamida numa solução tampão de IX Tris-borate-EDTA. Um exemplo típico que demonstra actividade de clivagem é mostrada na Figura 6.
[0230] Geração de ratos com locus de cadeia pesada endógenoa desactivado utilizando plasmideos de expressão codificantes de uma meganuclease 65
[0231] Uma sequência de cDNA codificante de uma meganuclease específica para um exão de rato Cp é clonada num vector de expressão onde a expressão é controlada pela sequência do operador de tetraciclina. 0 DNA plasmídeo é linearizado pela digestão da enzima de restrição e purificado. Os ovócitos de rato são fertilizados com esperma de ratos com um transgene codificante de um transactivador contrário de resposta à tetraciclina. DNA plasmídeo de DNA é injectado no pronucleico de tais ovócitos de ratos fertilizados. Subsequentemente, os embriões de ratos são transferidos para mães de acolhimento e gerados até ao fim. Os recém-nascidos são analisados para encontrar presença de transgeno codificante de meganuclease através de PCR utilizando DNA isolado de amostras de tecido. Os animais fundadores transgénicos masculinos são acolhidos durante quarto meses quando atingem a maturidade sexual. A expressão da meganuclease em animais transgénicos é induzida pela administração diária de doxiciclina durante 1 a 7 dias. Subsequentemente, o esperma é recolhido duas vezes por semana e analisado através de PCR. Os animais masculinos que produzem esperma mutado são utilizados para fins reprodutivos. Os descendentes com Cp de rato mutado são identificados através de análise de PCR para obter amostras de tecido.
[0232] Geração de ratos com locus de cadeia pesada endógeno desactivado através de microinjecção de ovócitos fertilizados com DNA plasmídeo codificante de uma meganuclease específica [0233] Uma sequência de cDNA codificante de uma meganuclease específica para um exão de rato Cp é clonada para um vector de expressão onde a expressão é controlada através de um promoter CAG. DNA plasmídeo purificado é injectado no pronucleico de ovócitos de rato fertilizados. Subsequentemente, os embriões de rato são transferidos para mães de acolhimento e gerados até ao fim. Os recém-nascidos são analisados para procurar a presença de exões de IgM mutados através de PCR e sequenciamento directo. Em alternativa, os animais que contêm as células com os exões de IgM mutados são identificados através da incubação de produtos de PCR aquecidos e arrefecidos com enzima CEL-I e subsequente electroforese de gel. 67

Claims (25)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um método para produzir uma célula germinativa viável não humana com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado, incluindo a expressão de pelo menos uma meganuclease numa célula germinativa, ovócito fertilizado ou embrião, de modo a gerar uma célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig desactivado em que a dita meganuclease reconhece uma sequência alvo de meganuclease presente em ou próxima do dito locus de Ig endógeno.
  2. 2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita sequência alvo da meganuclease está presente em ou próxima de (a) um segmento do gene J no âmbito do pelo menos um locus de Ig endógeno referido ou (b) um gene da região constante de imunoglubina.
  3. 3. 0 método de acordo com a reivindicação 1, incluindo além disso a expressão de uma segunda meganuclease na dita célula germinativa, ovócito fertilizado ou embrião, em que a segunda meganuclease reconhece uma segunda sequência alvo da meganuclease presente em ou próxima do dito locus de Ig endógeno.
  4. 4. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita célula germinativa, ovócito fertilizado ou ovócito inclui uma construção de expressão de meganuclease genómica que inclui uma região de control de expressão induzivel ligada de forma operacional a um ácido nucleico codificante da dita meganuclease, e em que a dita meganuclease é expressa na dita célula germinativa, ovócito fertilizado ou embrião induzindo a construção da expressão da dita meganuclease genómica, em que opcionalmente o método também inclui a repetição do passo 1 de induzir a expressão da dita construção de expressão da meganuclease genómica.
  5. 5. 0 método de acordo com a reivindicação 4, em que a dita célula germinativa, ovócito fertilizado ou embrião inclui a construção de expressão de uma segunda meganuclease genómica incluindo uma segunda região de controlo de expressão induzivel ligada de forma operacional a um ácido nucleico codificante da segundo meganuclease, em que a dita segunda meganuclease codificada reconhece a sequência alvo da segunda meganuclease presente no dito locus de Ig endógeno, em que o dito método inclui ainda a indução da expressão do ácido nucleico codificante da segunda meganuclease na dita célula germinativa, ovócito fertilizado ou embrião.
  6. 6. Um método para produzir um animal transgénico incluindo pelo menos um locus de Ig endógeno com linha germinal desactiva, incluindo a derivação de um animal transgénico a partir de uma célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado através do método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, ou uma célula germinativa descendente da mesma, em que o animal transgénico não é humano.
  7. 7. 0 método de acordo com a reivindicação 6, em que a dita célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado inclui ainda um locus de Ig artificial, em que o dito animal transgénico inclui um locus de Ig artificial.
  8. 8. 0 método de acordo com a reivindicação 6, incluindo ainda a introdução de um locus de Ig artificial na dita célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado, ou uma célula germinativa descendente da mesma ou um ovócito fertilizado ou embrião 2 derivado do mesmo, em que o dito animal transgénico inclui um locus de Ig artificial.
  9. 9. 0 método de acordo com a reivindicação 6, em que a dita derivação de um animal transgénico a partir de uma célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado incluindo a combinação da dita célula germinativa viável, ou uma célula germinativa descendente da mesma, com uma gâmeta que inclui um locus de Ig artificial, em que o dito animal transgénico inclui um locus de Ig artificial.
  10. 10. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, em que o dito locus de Ig artificial inclui (i) uma região V com pelo menos um segment do gene V humano codificante de uma linha germinativa ou uma sequência de aminoácido hipermutado da região V humana; (ii) um ou mais segmentos do gene J; e (iii) um ou mais segmentos do gene da região constante, em que o dito locus de Ig artificial é funcional e capaz de se submeter à reorganização genética e de produzir um repertório de imunoglubinas artificiais num animal transgénico derivado das ditas células germinativas.
  11. 11. 0 método de acordo com a reivindicação 9, em que a dita gâmeta tem pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado.
  12. 12. Uma célula germinativa viável com pelo menos um locus de Ig endógeno desactivado que pode ser obtido através de um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5.
  13. 13. Um animal transgénico que inclui uma construção de expressão da meganuclease, em que a dita construção inclui uma região de control de expressão induzivel 3 ligada de forma operacional a um ácido nucleico codificante de meganuclease, e em que a dita segunda meganuclease codificada reconhece uma sequência alvo da meganuclease presente em ou próxima de um locus de Ig endógeno do dito animal transgénico, e em que o dito locus de Ig endógeno foi desactivado pela acção da dita meganuclease, e em que, opcionalmente, o genoma do dito animal transgénico inclui ainda pelo menos um locus de Ig artificial, em que o animal transgénico não é humano.
  14. 14. 0 animal transgénico de acordo com a reivindicação 13, em que o dito animal transgénico não tem um locus de cadeia leve de Ig funcional, ou um locus de cadeia pesada de Ig endógeno.
  15. 15. 0 animal transgénico da reivindicação 13, em que o dito animal transgénico é capaz de produzir imunoglubinas com idiótipo humano.
  16. 16. 0 animal transgénico da reivindicação 13, em que o dito animal transgénico não tem um locus de cadeia leve de Ig e inclui um locus de cadeia pesada de Ig artificial, e em que o dito animal transgénico é capaz de produzir anticorpos apenas de cadeia pesada.
  17. 17. 0 animal transgénico da reivindicação 13, em que o dito animal transgénico inclui pelo menos um locus de cadeia de Ig com pelo menos um gene da região C sem sequências que codificam um domínio CHI funcional e sem um locus de cadeia leve de Ig funcional.
  18. 18. Um método para produzir anticorpos que inclui a imunização do animal transgénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17 com um imogeno. 4
  19. 19. Um método para produzir anticorpos apenas de cadeia pesada, incluindo a imunização de um animal transgénico de acordo com a reivindicação 16 a 17.
  20. 20. Um método para produzir um anticorpo monoclonal, incluindo (i) imunizar um animal transgénico de acordo com qualquer uma das reivinidcações 13 a 17 com um imunogeno, (i i) isolar uma célula que produz anticorpos monoclonais a partir do dito animal transgénico em que a dita célula que produz anticorpos monoclonais produz um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao dito imunogeno; e (iii) utilizar a dita célula que produz anticorpos monoclonais para produzir os ditos anticorpos monoclonais para produzir uma célula de hibridoma que produza os ditos anticorpos monoclonais e utilizar a dita célula de hibridoma para produzir os ditos anticorpos monoclonais.
  21. 21. Um método para produzir anticorpos monoclonais, incluindo (i) imunizar o animal transgénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17 com um imunogeno, (ii) isolar uma célula que produz anticorpos a partir do dito animal transgénico em que a dita célula que produz anticorpos produz um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao dito imunogeno; e (iii) isolar da dita célula que produz anticorpos monoclonais um ácido nucleico de anticorpos monoclonais que codifica o dito ácido nucleico de anticorpos monoclonais que se liga especificamente ao dito imunogeno; e (iv) utilizar o dito ácido nucleico de anticorpos monoclonais para produzir o dito anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao dito imunogeno, em que o opcionalmente dito anticorpo monoclonal tem um idiótipo humano. 5
  22. 22. Um método para produzir um anticorpo monoclonal totalmente humano, incluindo (i) imunizar o animal transgénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17 com um imunogeno, (ii) isolar uma célula que produz anticorpos monoclonais a partir do dito animal transgénico em que a dita célula que produz anticorpos monoclonais produz um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao dito imunogeno; (iii) isolar um ácido nucleico do anticorpo monoclonal da dita célula que produz anticorpos monoclonais que codifica o dito anticorpo que se liga especificamente ao dito imunogeno; (iv) modificar o dito ácido nucleico do anticorpo monoclonal para produzir um ácido nucleico recombinante codificante de um anticorpo monoclonal totalmente humano; e (v) utilizar o dito ácido nucleico recombinante codificante de um anticorpo monoclonal totalmente humano para produzir o anticorpo monoclonal totalmente humano codificado.
  23. 23. 0 método de qualquer uma das reivindicações 20 a 22, que inclui a expressão do dito anticorpo.
  24. 24. O método de qualquer uma das reivindicações 20 a 23, em que o método inclui também um passo para purificar o dito anticorpo.
  25. 25. O método da reivindicação 24, em que o método inclui ainda a mistura os anticorpos purificados com um suporte farmacêutico adequado para administração aos pacientes. 6
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Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1864998B2 (en) 2004-07-22 2022-06-22 Erasmus University Medical Center Rotterdam Binding molecules
KR102096731B1 (ko) 2007-06-01 2020-04-02 오픈 모노클로날 테크놀로지, 인코포레이티드 내생적 면역글로불린 유전자를 억제하고 트랜스제닉 인간 이디오타입 항체를 생산하기 위한 방법 및 조성물
JP2012501641A (ja) * 2008-09-08 2012-01-26 セレクティス グルタミンシンセターゼ遺伝子からのｄｎａ標的配列を切断するメガヌクレアーゼ変異型及びその使用
KR102362774B1 (ko) * 2008-09-30 2022-02-15 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 인간 이외의 포유동물
WO2010065123A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
DK2379727T3 (en) * 2008-12-18 2017-01-16 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam NON-HUMAN TRANSGENE ANIMALS EXPRESSING HUMANIZED ANTIBODIES AND USE THEREOF
GB0905023D0 (en) * 2009-03-24 2009-05-06 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules
WO2011004192A1 (en) 2009-07-08 2011-01-13 Genome Research Limited Animal models and therapeutic molecules
US20120204278A1 (en) 2009-07-08 2012-08-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CN102711449B (zh) 2009-12-10 2015-01-07 瑞泽恩制药公司 生产重链抗体的小鼠
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
PT2501817E (pt) 2010-02-08 2015-11-04 Regeneron Pharma Rato de cadeia leve comum
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
ES2641920T3 (es) * 2010-03-31 2017-11-14 Ablexis, Llc Ingeniería genética de animales no humanos para la producción de anticuerpos quiméricos
CN103228130B (zh) * 2010-06-17 2016-03-16 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
US10793829B2 (en) 2010-07-26 2020-10-06 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
CA2806233C (en) 2010-07-26 2021-12-07 Trianni, Inc. Transgenic animals and methods of use
US10662256B2 (en) 2010-07-26 2020-05-26 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
RU2612903C2 (ru) 2010-08-02 2017-03-13 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Мыши, у которых вырабатываются связывающие белки, содержащие vl-домены
CA2829606C (en) 2011-03-09 2020-06-02 Cell Signaling Technology, Inc. Methods and reagents for creating monoclonal antibodies
SG194089A1 (en) * 2011-04-27 2013-11-29 Amyris Inc Methods for genomic modification
ES2758051T3 (es) 2011-08-05 2020-05-04 Regeneron Pharma Ratones con cadena ligera universal humanizada
CN103945689B (zh) 2011-09-19 2016-10-19 科马布有限公司 免疫球蛋白基因多样性的操纵及多抗体治疗剂
JP6185916B2 (ja) * 2011-09-21 2017-08-23 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 導入遺伝子発現を制御するための方法および組成物
EP2761008A1 (en) 2011-09-26 2014-08-06 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
SI2627773T1 (sl) 2011-10-17 2017-12-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Omejena težka veriga imunoglobulinov pri miših
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
IN2014DN09261A (pt) 2012-04-25 2015-07-10 Regeneron Pharma
JP6279562B2 (ja) * 2012-06-12 2018-02-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド 条件付きノックアウト対立遺伝子を生成するための方法および組成物
EP3912464A1 (en) 2012-06-12 2021-11-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized non-human animals with restricted immunoglobulin heavy chain loci
ES2813609T3 (es) * 2012-12-14 2021-03-24 Open Monoclonal Tech Inc Polinucleótidos que codifican anticuerpos de roedores con idiotipos humanos y animales que los contienen
SI2840892T1 (en) 2013-02-20 2018-08-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Animals other than humans with modified immunoglobulin heavy chain sequences
US9980470B2 (en) 2013-03-14 2018-05-29 Erasmus University Medical Center Antibody production
US10993420B2 (en) 2013-03-15 2021-05-04 Erasmus University Medical Center Production of heavy chain only antibodies in transgenic mammals
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
WO2014172458A1 (en) * 2013-04-16 2014-10-23 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Activating an alternative pathway for homology-directed repair to stimulate targeted gene correction and genome engineering
HUE040575T2 (hu) 2013-04-16 2019-03-28 Regeneron Pharma A patkány genom célzott módosítása
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
CN105683365A (zh) 2013-10-01 2016-06-15 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
AU2014360811B2 (en) 2013-12-11 2017-05-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a genome
SG11201607203XA (en) 2014-03-21 2016-09-29 Regeneron Pharma Non-human animals that make single domain binding proteins
CA2941514A1 (en) 2014-03-21 2015-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vl antigen binding proteins exhibiting distinct binding characteristics
CN111138540B (zh) 2014-04-30 2023-07-25 韩诺生物制药株式会社 治疗自身免疫疾病的结合fcrn的抗体
US10336825B2 (en) 2014-04-30 2019-07-02 Hanall Biopharma Co., Ltd. Antibody binding to FcRn for treating autoimmune diseases
GB201407852D0 (en) 2014-05-02 2014-06-18 Iontas Ltd Preparation of libraries od protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules
HUE049776T2 (hu) 2014-06-06 2020-10-28 Regeneron Pharma Módszerek és készítmények egy célzott lókusz módosítására
ES2901074T3 (es) 2014-06-26 2022-03-21 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para modificaciones genéticas objetivo y métodos de uso
EP3174902B1 (en) 2014-08-01 2019-04-17 Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) An anti-cd45rc antibody for use as drug
SI3221457T1 (sl) 2014-11-21 2019-08-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Postopki in sestavki za ciljno genetsko modifikacijo z uporabo vodilnih RNK v parih
AU2015364427B2 (en) 2014-12-19 2021-05-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for targeted genetic modification through single-step multiple targeting
EP3271403A1 (en) 2015-03-19 2018-01-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
CA2981077A1 (en) * 2015-04-03 2016-10-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of genome editing of b-cells
WO2017020291A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Novel anti-pd-l1 antibodies
IL293385A (en) 2015-08-11 2022-07-01 Omniab Inc New anti–pd–1 antibodies
US20170058052A1 (en) * 2015-08-24 2017-03-02 Trianni, Inc. Enhanced production of immunoglobulins
US10813346B2 (en) 2015-12-03 2020-10-27 Trianni, Inc. Enhanced immunoglobulin diversity
IL260743B2 (en) 2016-02-04 2024-03-01 Trianni Inc Advanced production of antibodies
HUE061619T2 (hu) 2016-06-03 2023-07-28 Regeneron Pharma Exogén terminális dezoxinukleotid-transzferázt expresszáló rágcsálók
KR102507537B1 (ko) 2016-09-14 2023-03-08 테네오원, 인코포레이티드 Cd3 결합 항체
JP2020502991A (ja) 2016-09-20 2020-01-30 ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド 新規抗ｐｃｓｋ９抗体
WO2018065552A1 (en) 2016-10-06 2018-04-12 Innate Pharma Anti-cd39 antibodies
AR110414A1 (es) 2016-12-21 2019-03-27 Cephalon Inc Anticuerpos que se unen específicamente a il-15 humana y usos de estos
AU2017382251A1 (en) 2016-12-21 2019-07-11 Teneobio, Inc. Anti-BCMA heavy chain-only antibodies
EP3642236A1 (en) 2017-06-20 2020-04-29 TeneoOne, Inc. Anti-bcma heavy chain-only antibodies
KR20200018498A (ko) 2017-06-20 2020-02-19 테네오바이오, 인코포레이티드 항-bcma 중쇄-단독 항체
KR20200045520A (ko) 2017-09-07 2020-05-04 오거스타 유니버시티 리서치 인스티튜트, 인크. 프로그래밍된 세포사 단백질 1에 대한 항체
RU2020112490A (ru) 2017-09-13 2021-10-13 Тенеобио, Инк. Антитела из тяжелых цепей, связывающиеся с эктоферментами
EP3498293A1 (en) 2017-12-15 2019-06-19 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Treatment of monogenic diseases with an anti-cd45rc antibody
AU2018392088A1 (en) 2017-12-22 2020-08-13 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to CD22
SG11202006042SA (en) 2017-12-27 2020-07-29 Teneobio Inc Cd3-delta/epsilon heterodimer specific antibodies
KR20200135397A (ko) 2018-03-24 2020-12-02 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 펩티드-mhc 복합체에 대한 치료 항체를 생성하기 위한 유전적으로 변형된 비인간 동물, 이의 제조 방법
US20210230253A1 (en) * 2018-06-13 2021-07-29 Crystal Bioscience Inc. Transgenic chicken that makes antibodies with long cdr-h3s stabilized by multiple disulfide bridges and diversified by gene conversion
US20210230629A1 (en) * 2018-06-13 2021-07-29 Crystal Bioscience Inc. Camelization of a human variable domain by gene conversion
CA3103646C (en) 2018-06-14 2023-06-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals capable of engineered dh-dh rearrangement and uses thereof
KR20210032311A (ko) 2018-07-20 2021-03-24 테네오바이오, 인코포레이티드 Cd19에 결합하는 중쇄 항체
SG11202100663VA (en) 2018-08-01 2021-02-25 Cephalon Inc Anti-cxcr2 antibodies and uses thereof
EP3626265A1 (en) 2018-09-21 2020-03-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-human cd45rc antibodies and uses thereof
CN113614107A (zh) 2019-01-23 2021-11-05 Encefa公司 Cd31竞争剂及其用途
KR20210133234A (ko) 2019-02-18 2021-11-05 바이오사이토젠 파마슈티컬스 (베이징) 컴퍼니 리미티드 인간화 면역글로불린 유전자좌를 갖는 유전적으로 변형된 비-인간 동물
WO2020234399A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Novel anti-cd25 antibodies
MX2021015337A (es) 2019-06-14 2022-01-18 Teneobio Inc Anticuerpos multiespecificos de cadena pesada que se unen a cd22 y cd3.
EP4034561A2 (en) 2019-09-27 2022-08-03 Starkage Therapeutics Senescent cell-associated antigen-binding domains, antibodies and chimeric antigen receptors comprising the same, and uses thereof
CA3163549A1 (en) 2019-12-02 2021-06-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Peptide-mhc ii protein constructs and uses thereof
IL297601A (en) 2020-04-29 2022-12-01 Teneobio Inc Multispecific heavy chain antibodies with modified heavy chain constant regions
EP4211155A1 (en) 2020-09-11 2023-07-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification and production of antigen-specific antibodies
CN116917318A (zh) 2020-11-20 2023-10-20 法国国家健康和医学研究院 抗cd25抗体
WO2022106663A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-cd25 antibodies
CN116848254A (zh) 2020-12-16 2023-10-03 瑞泽恩制药公司 表达人源化Fcα受体的小鼠
WO2022140219A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding anchor modified antibodies and uses thereof
WO2023170207A1 (en) 2022-03-09 2023-09-14 Alderaan Biotechnology Anti-cd160 transmembrane isoform antibodies
US11926669B2 (en) 2022-05-30 2024-03-12 Hanall Biopharma Co., Ltd. Anti-FcRn antibody or antigen binding fragment thereof with improved stability
WO2024062019A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Synabs Anti-ccr8 antibodies and uses thereof

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4977081A (en) 1987-05-04 1990-12-11 Adi Diagnostics, Inc. Stable rabbit-mouse hybridomas and secretion products thereof
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US5574205A (en) * 1989-07-25 1996-11-12 Cell Genesys Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
EP1690934A3 (en) * 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6673986B1 (en) * 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) * 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6713610B1 (en) * 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) * 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6657103B1 (en) * 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5411881A (en) 1990-07-10 1995-05-02 Nkk Corporation Chicken-specific immunoglobulin G-producing hybridoma
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2089661C (en) 1990-08-29 2007-04-03 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US7041871B1 (en) 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
AU664976B2 (en) 1990-08-29 1995-12-14 Gene Pharming Europe Bv Homologous recombination in mammalian cells
DE4119749A1 (de) 1991-06-15 1992-12-17 Claas Ohg Verfahren zum entholzen von flachs und flachsaufbereitungsmaschine zur durchfuehrung dieses verfahrens
SG48760A1 (en) 1992-07-24 2003-03-18 Abgenix Inc Generation of xenogenetic antibodies
EP0583980A1 (en) 1992-08-20 1994-02-23 Eli Lilly And Company Method for generating monoclonal antibodies from rabbits
ATE452207T1 (de) 1992-08-21 2010-01-15 Univ Bruxelles Immunoglobuline ohne leichte ketten
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
US5795974A (en) 1993-12-10 1998-08-18 University Of Utah Research Foundation Mycoplasma arthritidis superantigen
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
ATE390933T1 (de) 1995-04-27 2008-04-15 Amgen Fremont Inc Aus immunisierten xenomäusen stammende menschliche antikörper gegen il-8
WO1997016537A1 (en) 1995-10-30 1997-05-09 Spectral Diagnostics, Inc. Stable chicken b-cell line and method of use thereof
US5716081A (en) 1996-03-11 1998-02-10 Automotive Products (Usa), Inc. Spring clip for quick connect coupling
EP0942968B1 (en) * 1996-12-03 2008-02-27 Amgen Fremont Inc. Fully human antibodies that bind EGFR
GB9823930D0 (en) 1998-11-03 1998-12-30 Babraham Inst Murine expression of human ig\ locus
CA2354542A1 (en) * 1998-12-31 2000-07-06 The J. David Gladstone Institutes Transgenic rodents and rodent cell lines expressing hiv co-receptors
US6833268B1 (en) * 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
JP2004500843A (ja) * 2000-04-24 2004-01-15 ワイエス トランスジェニック動物
CA2634294A1 (en) * 2000-08-03 2002-02-14 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Production of humanized antibodies in transgenic animals
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
TWI313299B (en) * 2000-11-30 2009-08-11 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
GB0115256D0 (en) 2001-06-21 2001-08-15 Babraham Inst Mouse light chain locus
CA2457317A1 (en) 2001-08-20 2003-02-27 Merck & Co., Inc. Transgenic rodents as animal models for modulation of b1 bradykinin receptor protein
DE60236182D1 (de) * 2001-09-14 2010-06-10 Cellectis Zufällige integration von polynukleotide nach in vivo linearisierung
ES2645563T3 (es) 2001-11-30 2017-12-05 Amgen Fremont Inc. Animales transgénicos que portan genes de cadena ligera de Ig humana
WO2003078619A1 (en) 2002-03-15 2003-09-25 Cellectis Hybrid and single chain meganucleases and use thereof
ATE531796T1 (de) * 2002-03-21 2011-11-15 Sangamo Biosciences Inc Verfahren und zusammensetzungen zur verwendung von zinkfinger-endonukleasen zur verbesserung der homologen rekombination
GB0228210D0 (en) 2002-12-03 2003-01-08 Babraham Inst Single chain antibodies
AU2004208031B2 (en) * 2003-01-28 2009-10-08 Cellectis Use of meganucleases for inducing homologous recombination ex vivo and in toto in vertebrate somatic tissues and application thereof.
US20040158880A1 (en) * 2003-02-05 2004-08-12 Roland Buelow Suppression of endogenous immunoglobulin expression in transgenic non-human animals expressing humanized or human antibodies
GB2398784B (en) 2003-02-26 2005-07-27 Babraham Inst Removal and modification of the immunoglobulin constant region gene cluster of a non-human mammal
NO345763B1 (no) * 2003-06-16 2021-07-19 Celltech R&D Inc Immunogen og antistoffer spesifikke for sklerostin, samt farmasøytiske preparater for å øke benmineralisering.
CN1852925A (zh) 2003-07-15 2006-10-25 人类多克隆治疗公司 人源化免疫球蛋白基因座
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US20050153392A1 (en) * 2003-08-11 2005-07-14 Roland Buelow Transgenesis with humanized immunoglobulin loci
WO2005038001A2 (en) * 2003-10-14 2005-04-28 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Improved transgenesis by sperm-mediated gene transfer
WO2005085427A1 (ja) 2004-03-04 2005-09-15 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. ラット胚性幹細胞
EP1864998B2 (en) 2004-07-22 2022-06-22 Erasmus University Medical Center Rotterdam Binding molecules
US20080184380A1 (en) * 2004-10-22 2008-07-31 Therapeutic Human Polyclonals Inc. Suppression of Endogenous Immunoglobulin Expression in Non-Human Transgenic Animals
CA3079874C (en) * 2004-10-22 2023-01-03 Revivicor, Inc. Ungulates with genetically modified immune systems
CA2599875A1 (en) 2005-03-03 2006-09-08 Takeda Pharmaceutical Company Limited Preventive/therapeutic agent for cancer
WO2006097784A1 (en) 2005-03-15 2006-09-21 Cellectis I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof
DK1863909T3 (da) 2005-03-15 2010-08-30 Cellectis I-CreI-meganukleasevarianter med modificeret specificitet, fremgangsmåde til fremstilling og anvendelser deraf
WO2007060495A1 (en) * 2005-10-25 2007-05-31 Cellectis I-crei homing endonuclease variants having novel cleavage specificity and use thereof
US7491866B2 (en) 2005-11-09 2009-02-17 Board Of Regents University Of Texas System Transgenic rats and spermatogonial stem cells
JP5184374B2 (ja) 2006-01-25 2013-04-17 エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム 対立遺伝子排除
JP5514539B2 (ja) 2006-03-31 2014-06-04 メダレックス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー ヒト抗体の調製に用いるためのキメラ抗体を発現するトランスジェニック動物
KR102096731B1 (ko) 2007-06-01 2020-04-02 오픈 모노클로날 테크놀로지, 인코포레이티드 내생적 면역글로불린 유전자를 억제하고 트랜스제닉 인간 이디오타입 항체를 생산하기 위한 방법 및 조성물
SI2840892T1 (en) * 2013-02-20 2018-08-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Animals other than humans with modified immunoglobulin heavy chain sequences

Also Published As

Publication number Publication date
CA2688834A1 (en) 2008-12-11
WO2008151081A8 (en) 2010-02-04
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EP2336329B8 (en) 2012-11-21
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CN101784664B (zh) 2013-04-10
JP2018000201A (ja) 2018-01-11
NZ581396A (en) 2012-07-27
US20090098134A1 (en) 2009-04-16
CN102850452A (zh) 2013-01-02
IL220209A (en) 2013-11-28
PT2602323T (pt) 2018-04-02
DK2602323T3 (en) 2018-04-16
IL202302A0 (en) 2011-08-01
JP2020125360A (ja) 2020-08-20
CA3054224A1 (en) 2008-12-11
IL220209A0 (en) 2012-07-31
EP2152880A1 (en) 2010-02-17
PT2336329E (pt) 2012-12-24
ATE522611T1 (de) 2011-09-15
CN101784664A (zh) 2010-07-21
EP2602323B1 (en) 2018-02-28
HK1135138A1 (en) 2010-05-28
US10072069B2 (en) 2018-09-11
AU2008259939B2 (en) 2014-03-13
KR20100037027A (ko) 2010-04-08
JP2014027947A (ja) 2014-02-13
JP2015204840A (ja) 2015-11-19
CY1120383T1 (el) 2019-07-10
EP2152880A4 (en) 2010-06-16
LT2602323T (lt) 2018-04-10
KR101703299B1 (ko) 2017-02-06
IL202302A (en) 2013-07-31
JP6220827B2 (ja) 2017-10-25
ES2372718T3 (es) 2012-01-25
HRP20180506T1 (hr) 2018-05-04
ES2664218T3 (es) 2018-04-18
US20100212035A1 (en) 2010-08-19
EP2336329A1 (en) 2011-06-22
JP2010529042A (ja) 2010-08-26
KR20150101475A (ko) 2015-09-03
WO2008151081A1 (en) 2008-12-11
US9388233B2 (en) 2016-07-12
US20160311888A1 (en) 2016-10-27
PL2152880T3 (pl) 2012-03-30
KR102096731B1 (ko) 2020-04-02
CA2688834C (en) 2020-01-07
JP6712254B2 (ja) 2020-06-17
EP2152880B1 (en) 2011-08-31
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EP2336329B1 (en) 2012-10-10
SG10201509853UA (en) 2015-12-30
ES2393826T3 (es) 2012-12-28
DK2336329T3 (da) 2013-01-07
US20120090041A1 (en) 2012-04-12
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US8907157B2 (en) 2014-12-09
SI2602323T1 (en) 2018-05-31
AU2008259939A1 (en) 2008-12-11
US20210253673A1 (en) 2021-08-19
DK2152880T3 (da) 2011-11-28
KR101661357B1 (ko) 2016-09-29
US8703485B2 (en) 2014-04-22

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