CN101784664A - 用于抑制内源性免疫球蛋白基因和生产转基因人独特型抗体的组合物和方法 - Google Patents

用于抑制内源性免疫球蛋白基因和生产转基因人独特型抗体的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及缺乏内源性Ig并能够产生转基因抗体的转基因动物，及其制备方法。本发明还涉及在这样的动物中生产转基因抗体的方法，和由此生产的转基因抗体。

Description

用于抑制内源性免疫球蛋白基因和生产转基因人独特型抗体的组合物和方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2007年6月1日提交的美国临时专利申请系列号60/941,619和2008年4月11日提交的美国临时专利申请系列号61/044,324的优先权，在此将这两篇美国临时专利申请全部引入作为参考。
发明概述
本发明涉及具有一个或多个失活内源性免疫球蛋白基因座的转基因动物及其制备方法。本发明还涉及使用该转基因动物生产人源化和完全人抗体的组合物和方法，以及由此生产的抗体。
发明背景
抗体是一类重要的药品，已经成功地用于各种人类疾病和病症的治疗中，包括传染病、癌症、过敏性疾病和移植物抗宿主疾病，以及用于预防移植排斥中。
与非人免疫球蛋白的治疗应用相关的一个问题是该物质在人患者中潜在的免疫原性。为了降低这类制剂的免疫原性，已经研发了用于生产部分人(人源化)和完全人抗体的各种策略。在非人动物中产生具有人独特型的转基因抗体的能力是特别理想的，因为抗原结合决定簇位于独特型区域内，并且认为非人独特型有助于目前的抗体治疗的免疫原性。关于单克隆治疗，人独特型是尤其重要的考虑因素，与由多克隆抗体混合物以较低浓度递送的多种独特型相反其由以相对较高浓度递送的单个独特型组成。
尽管已经描述了在非人动物中生产人源化转基因抗体的多种方法，但是在许多这样的方法中遇到的一个主要问题是宿主动物中内源性抗体的产生，择优地或与转基因抗体结合产生。已经使用了各种重组克隆方案来尝试破坏宿主动物中的内源性免疫球蛋白产生，以解决这个问题。然而，在许多脊椎动物物种中，免疫球蛋白基因的功能失活存在许多障碍。
例如，尽管已经使用同源重组成功地产生了JH-基因座缺失的纯合突变小鼠，但从大多数的脊椎动物物种不容易获得其中可以进行同源重组以灭活内源性基因座的ES或其他持续性多能细胞。
此外，干扰免疫球蛋白VDJ或VJ基因区段的细胞表面表达但不干扰其生产性重排的突变不足以完全灭活内源性Ig表达。通过具有破坏的μ重链膜外显子的纯合突变小鼠(所谓MT小鼠)不能产生IgM或IgG，但仍然产生显著量的IgA的事实举例说明了这一点(Macpehrson等，Nature Immunol 2(7)：625-631(2001)。此外，纯合突变小鼠的血清含有由两个等位基因(野生型等位基因和突变的MT等位基因)编码的IgM和IgG(Kitamura和Rajewky，Nature 356：154-156(1992)。这归因于以下事实：B-细胞发育过程中的第一次重排是两个同源染色体上的DH-和JH-基因区段的连接，生成前-B细胞。如果，在μMT/+小鼠中，前-B细胞首先经历随后在突变的IgH基因座中的VH-DH JH连接，并且该连接是符合读框的(“生产性的”)，那么所得到的前-B细胞能够表达分泌形式的μ链，但不能表达膜结合的μ。因为膜结合的μ表达需要等位基因排斥，所以这样的细胞仍然能够在野生型IgH基因座中经历VH-DHJH连接；并且如果这种第二次重排也是产生性的，那么该细胞表达两种不同的μ链，其中之一是膜结合的。该小鼠的血清含有源自两个等位基因的IgM。此外，可以在该小鼠的血滑中发现源自两个等位基因的IgG，因为在B细胞的两个IgH基因座上常常伴随地诱导转换。
在带有仍然可以生产性地重排VDJ或VJ基因区段的功能性转基因免疫球蛋白基因座和突变的内源性免疫球蛋白基因座的动物中也观察到不完全的等位基因排斥。在一个或两个突变的内源性基因座中重排VH-DHJH的B细胞仍然可以生产性地重排转基因免疫球蛋白基因座。这样的B细胞表达膜结合的转基因免疫球蛋白并发育成成熟的B细胞。在B细胞发育过程中，突变的内源性基因座的同种型转换可能形成表达内源性免疫球蛋白的B细胞。因此，这样的突变不足以使带有转基因免疫球蛋白基因座的动物中的内源性免疫球蛋白表达完全灭活。
发明概述
与在非人动物中生产人源化转基因抗体相关的主要问题是宿主中内源性抗体的择优生产或共同生产。本发明通过提供带有至少一个人工Ig基因座并缺乏产生内源性免疫球蛋白能力的转基因动物解决了这个问题。这些动物对于生产人源化和完全人转基因抗体非常有用。用于生产这样的转基因动物的方法在许多物种中是有效的，包括目前从其不容易获得ES细胞或持续性多能细胞和其中不容易进行同源重组和基因敲除的物种。
本发明部分源于以下发现：大范围核酸酶可以用于功能性地切除内源性免疫球蛋白基因座，以生产用于生产人源化和完全人转基因抗体的转基因动物。此外，可以使用靶向不同基因组位点的两种不同的大范围核酸酶来有效地缺失大部分的免疫球蛋白基因座(高达几kb)，由此确保该基因座的完全失活和进一步确保带有种系突变的转基因动物不产生任何能够产生内源性免疫球蛋白的B细胞。
因此，在一个方面中，本发明提供了含有至少一个人工Ig基因座并具有至少一个种系失活的内源性Ig基因座的转基因动物。用于本发明中的动物是小的实验室动物，特别是禽类、啮齿动物和鼬鼠。用于本发明中的人工基因座含有至少一个人V基因区段。在优选的实施方案中，人工Ig基因座含有(i)具有至少一个编码种系或超突变的人V-区氨基酸序列的人V基因区段的V区；(ii)一个或多个J基因区段；和(iii)一个或多个恒定区基因，其中人工Ig基因座是功能性的并且能够在转基因动物中经历基因重排和产生一组免疫球蛋白。
在一个实施方案中，转基因动物含有失活的内源性Ig重链基因座。在优选的实施方案中，转基因动物具有两个失活的内源性Ig重链基因座，因此不携带功能性的内源性Ig重链基因座。
在一个实施方案中，转基因哺乳动物含有失活的内源性Ig轻链基因座。在优选的实施方案中，转基因动物具有两个失活的内源性Ig轻链基因座，因此不携带功能性内源Ig轻链基因座。
在优选的实施方案中，转基因动物缺乏功能性的内源性Ig重链基因座和功能性的Ig轻链基因座。
在一个实施方案中，转基因动物含有至少一个人工Ig重链基因座。在一个实施方案中，转基因动物缺乏功能性的Ig轻链基因座并含有至少一个人工Ig重链基因座。
在一个实施方案中，转基因动物含有至少一个人工Ig轻链基因座。
在一个实施方案中，转基因动物含有至少一个人工Ig重链基因座和至少一个人工Ig轻链基因座。
在优选的实施方案中，人工Ig基因座是功能性的，并且能够在转基因动物中经历基因重排和产生一组免疫球蛋白，该组免疫球蛋白包括具有人独特型的免疫球蛋白。
在一个实施方案中，人工Ig基因座的一个或多个恒定区基因含有至少一个非人恒定区基因，并且是功能性的，能够在转基因动物中经历基因重排和产生一组嵌合免疫球蛋白，该组嵌合免疫球蛋白包括具有人独特型的嵌合免疫球蛋白。
在一个实施方案中，人工Ig基因座的一个或多个恒定区基因含有至少一个人恒定区基因，并且功能性的，能够在转基因动物中经历基因重排和产生一组免疫球蛋白，该组免疫球蛋白包括具有人独特型和人恒定区的免疫球蛋白。
在一个方面中，本发明提供本发明的转基因动物的后代。在优选的实施方案中，后代含有至少一个人工Ig基因座并具有至少一个种系失活的内源性Ig基因座。
在一个方面中，本发明提供能够产生活的生殖细胞的转基因动物，该生殖细胞具有至少一个失活的内源性Ig基因座。
在一个实施方案中，这样的转基因动物含有基因组大范围核酸酶表达构建体，优选具有可操作地连接大范围核酸酶编码核酸的诱导型表达控制区的构建体，其中编码的大范围核酸酶识别存在于或接近于转基因动物的内源性Ig基因座的大范围核酸酶靶序列。当转基因动物性成熟并含有活的生殖细胞时，可以在体外或体内将基因组大范围核酸酶表达构建体用来灭活这些生殖细胞中的靶向内源性Ig基因座，而不损害其生存力，确保可以从其产生在Ig基因座携带种系突变的F1动物。
在一个实施方案中，转基因动物进一步含有至少一个人工Ig基因座。
在一个方面中，本发明提供含有活的生殖细胞的转基因动物，生殖细胞中至少一个内源性Ig基因座是失活的。在一个实施方案中，转基因动物进一步含有至少一个人工Ig基因座。
在一个方面中，本发明提供了产生本发明的转基因动物的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了生产转基因动物的方法，该动物含有至少一个人工Ig基因座并具有至少一个种系失活的内源性Ig基因座。在优选的实施方案中，转基因动物对于内源性Ig轻链和/或内源性Ig重链是失效合子的。
优选，通过在其中表达大范围核酸酶，内源性Ig基因座在亲本生殖细胞或前辈的生殖细胞中是失活的。该方法包括在生殖细胞中产生大范围核酸酶，其中大范围核酸酶识别存在于或接近于内源性Ig基因座的大范围核酸酶靶序列，并选择性地灭活生殖细胞中的靶向Ig基因座，由此产生具有至少一个失活内源性Ig基因座的活生殖细胞。将这样具有至少一个失活内源性Ig基因座的生殖细胞用于产生具有至少一个种系失活的内源性Ig基因座的动物。在一个实施方案中，生殖细胞，或与其结合的生殖细胞，含有至少一个人工Ig重链基因座。在一个实施方案中，生殖细胞，或与其结合的生殖细胞，含有至少一个人工Ig轻链基因座。在一个实施方案中，生殖细胞，或与其结合的生殖细胞，含有至少一个人工Ig轻链基因座和至少一个人工Ig重链基因座。
在一个实施方案中，该方法包括将大范围核酸酶表达构建体或大范围核酸酶编码核酸引入生殖细胞中。
在优选的实施方案中，生殖细胞含有基因组大范围核酸酶表达构建体，其含有可操作地连接大范围核酸酶编码核酸的表达控制区。在优选的实施方案中，生殖细胞含有诱导型基因组大范围核酸酶表达构建体，并且该方法包括诱导大范围核酸酶编码核酸在生殖细胞中的表达。在一个实施方案中，该方法包括重复诱导大范围核酸酶编码核酸在生殖细胞中表达的步骤。在一个实施方案中，在体内进行诱导。在另一个实施方案中，在体外进行诱导。在一个实施方案中，生殖细胞含有基因组大范围核酸酶表达构建体，其含有呈现出生殖细胞特异性活性的表达控制区。
可以将所得到的生殖细胞用来产生具有至少一个种系失活的内源性Ig基因座的F1动物。该F1动物可以含有一个或多个人工Ig基因座，或可以杂交，以产生含有至少一个人工Ig基因座的动物。
在备选的实施方案中，该方法包括将大范围核酸酶表达构建体或大范围核酸编码核酸引入到受精卵母细胞或胚胎中，并在所得到的建立者动物中产生具有至少一个失活Ig基因座的活生殖细胞。该建立者动物可以用来生产具有至少一个种系失活的内源性Ig基因座的F1动物。该F1动物可以含有一个或多个人工Ig基因座，或可以杂交，以产生含有至少一个人工Ig基因座的动物。
在一个实施方案中，大范围核酸酶靶序列存在于或接近于J基因区段。
在一个实施方案中，大范围核酸酶靶序列存在于或接近于免疫球蛋白恒定区基因区段。在优选的实施方案中，恒定区基因编码免疫球蛋白μ。
在一个实施方案中，该方法包括为生存力和内源性Ig基因座的失活而筛选生殖细胞。在一个实施方案中，该方法包括为人工Ig基因座的存在而筛选生殖细胞。
在在此的方法中，动物的杂交优选在具有失活的内源性基因座之间，以产生对于内源性Ig轻链和/或内源性Ig重链是失效合子的动物。
在优选的实施方案中，该方法进一步包括使用第二个大范围核酸酶。第二个核酸酶识别存在于或接近于内源性Ig基因座的第二个大范围核酸酶靶序列，并与第一个大范围核酸酶一起选择性地切割内源性Ig基因座，但切割位点不同于第一个大范围核酸酶的切割位点，由此灭活至少一个内源性Ig基因座。
在优选的实施方案中，生殖细胞含有第二个基因组大范围核酸酶表达构建体，其含有可操作地连接第二个大范围核酸酶编码核酸的表达控制区。在优选的实施方案中，该表达控制区是诱导型表达控制区，并且该方法进一步包括诱导第二个大范围核酸酶编码核酸在生殖细胞中的表达，由此产生所编码的第二个大范围核酸酶，并且，与第一个大范围核酸酶一起，在生殖细胞中选择性地灭活靶向Ig基因座。在一个实施方案中，该方法包括重复诱导第二个大范围核酸酶编码核酸在生殖细胞中表达的步骤。在一个实施方案中，在体内进行诱导。在一个实施方案中，在体外进行诱导。在一个实施方案中，第二个基因组大范围核酸酶表达构建体含有呈现出生殖细胞特异性活性的表达控制区。
在备选的实施方案中，该方法包括将第二个大范围核酸酶表达构建体或第二个大范围核酸酶编码核酸引入生殖细胞中。
在备选的实施方案中，该方法包括将第二个大范围核酸酶表达构建体或第二个大范围核酸酶编码核酸引入到受精卵母细胞或胚胎中，并在所得到的建立者动物中产生具有至少一个失活Ig基因座的活生殖细胞。建立者动物可以用来产生具有至少一个种系灭活的内源性Ig基因座的F1动物。F1动物可以含有一个或多个人工Ig基因座，或可以杂交，以产生含有至少一个人工Ig基因座的动物。
在优选的实施方案中，第一个和第二个大范围核酸酶靶向J基因区段。在一个实施方案中，第一个和第二个大范围核酸酶合起来的靶序列是内源性Ig基因座内的一个或多个J基因区段的上游和下游，并通过第一个和第二个编码的大范围核酸酶的切割来产生含有一个或多个J基因区段的基因组DNA区段的缺失。
在另一个实施方案中，第一个和第二个大范围核酸酶靶向恒定区基因区段。在一个实施方案中，第一个和第二个大范围核酸酶靶向序列一起位于一个或多个免疫球蛋白恒定区基因区段的上游和下游，并且由第一个和第二个编码的大范围核酸酶的切割产生含有一个或多个免疫球蛋白恒定区基因区段的基因组DNA区段的缺失。在优选的实施方案中，恒定区基因编码免疫球蛋白μ。
在在此的方法中，所用的人工基因座含有至少一个人V基因区段。在优选的实施方案中，人工Ig基因座含有(i)具有至少一个编码种系或超突变的人V-区氨基酸序列的人V基因区段的V区；(ii)一个或多个J基因区段；和(iii)一个或多个恒定区基因，其中人工Ig基因座是功能性的，并且能够在转基因动物中经历基因重排和产生一组免疫球蛋白。
在一个实施方案中，将至少一个人工Ig重链基因座引入到本发明的转基因动物的基因组中。在一个实施方案中，转基因动物缺乏功能性Ig轻链基因座。
在一个实施方案中，将至少一个人工Ig轻链基因座引入到本发明的转基因动物的基因组中。
在一个实施方案中，将至少一个人工Ig重链基因座和至少一个人工Ig轻链基因座引入到本发明的转基因动物的基因组中。
在优选的实施方案中，人工Ig基因座是功能性的，并且能够在转基因动物中经历基因重排和产生一组免疫球蛋白，该组免疫球蛋白包括具有人独特型的免疫球蛋白。
在一个实施方案中，人工Ig基因座的一个或多个恒定区基因含有至少一个非人恒定区基因，并且是功能性的，能够在转基因动物中经历基因重排和产生一组嵌合免疫球蛋白，该组嵌合免疫球蛋白包括具有人独特型的嵌合免疫球蛋白。
在一个实施方案中，人工Ig基因座的一个或多个恒定区基因含有至少一个人恒定区基因并且是功能性的，能够在转基因动物中经历基因重排和产生一组免疫球蛋白，该组免疫球蛋白包括具有人独特型和人恒定区的免疫球蛋白。
在一个实施方案中，制备本发明的转基因动物的方法包括将具有至少一个种系灭活的内源性Ig基因座的转基因动物与具有至少一个人工Ig基因座的第二个转基因动物杂交，以产生F1转基因动物，该人工Ig基因座含有(i)具有至少一个编码种系或超突变的人V-区氨基酸序列的人V基因区段的V区；(ii)一个或多个J基因区段；和(iii)一个或多个恒定区基因，其中F1转基因动物含有第二个转基因动物的至少一个人工Ig基因座，并且其中来自第二个转基因动物的人工Ig基因座是功能性的，能够在F1转基因动物中经历基因重排和产生一组免疫球蛋白。可以通过动物育种或通过其他结合配子来进行杂交，包括体外操作。
在一个实施方案中，第二个转基因动物含有至少一个人工Ig重链基因座。
在一个实施方案中，第二个转基因动物含有至少一个人工Ig轻链基因座。
在一个实施方案中，第一个和第二个转基因动物缺乏功能性Ig轻链基因座，而第二个转基因动物含有人工Ig重链基因座。可以将动物杂交，以产生缺乏功能性Ig轻链基因座但含有人工Ig重链基因座的F1。
在一个实施方案中，第二个转基因动物含有至少两个人工Ig基因座，包括至少一个人工Ig重链基因座和至少一个人工Ig轻链基因座。在一个实施方案中，第二个转基因动物的人工Ig基因座是功能性的，并且能够在F1转基因动物中经历基因重排和产生一组免疫球蛋白，该组免疫球蛋白包括具有人独特型的免疫球蛋白。在一个实施方案中，第二个转基因动物的人工Ig基因座的一个或多个恒定区基因含有至少一个非人恒定区基因并且是功能性的，能够在F1转基因动物中经历基因重排和产生一组嵌合免疫球蛋白，该组嵌合免疫球蛋白包括具有人独特型的嵌合免疫球蛋白。在一个实施方案中，第二个转基因动物的人工Ig基因座的一个或多个恒定区基因含有至少一个人恒定区基因，并且是功能性的，能够在F1转基因动物中经历基因重排和产生一组免疫球蛋白，该组免疫球蛋白包括具有人独特型和人恒定区的免疫球蛋白。
相似地，在一个实施方案中，该方法包括将具有至少一个人工Ig基因座的第二个转基因动物与本发明的转基因动物杂交，本发明的转基因动物能够产生具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞。在优选的实施方案中，第二个转基因动物含有至少两个人工Ig基因座，包括至少一个人工Ig重链基因座和至少一个人工Ig轻链基因座。
在一个实施方案中，该方法包括将至少一个人工Ig基因座引入具有至少一个已经或能够通过一个或多个大范围核酸酶的活性灭活的内源性Ig基因座的生殖细胞中，其中至少一个人工Ig基因座含有(i)具有至少一个编码种系或超突变的人V-区氨基酸序列的人V基因区段的V区；(ii)一个或多个J基因区段；和(iii)一个或多个恒定区基因，其中人工Ig基因座是功能性的，并且能够在源自生殖细胞的转基因动物中经历基因重排和产生一组人工免疫球蛋白。该方法进一步包括从由此产生的生殖细胞产生F1转基因动物，该F1转基因动物含有至少一个人工Ig基因座并具有至少一个种系灭活的内源性Ig基因座，该灭活的内源性基因座已经通过一个或多个大范围核酸酶的作用被灭活。
在一个实施方案中，至少一个人工Ig基因座包括至少一个人工Ig重链基因座。
在一个实施方案中，生殖细胞缺乏功能性Ig轻链基因座，并且引入到生殖细胞中的人工Ig基因座是Ig重链基因座。
在一个实施方案中，至少一个人工Ig基因座包括至少一个人工Ig轻链基因座。
在优选的实施方案中，将至少两个人工基因座引入到生殖细胞中，包括至少一个人工Ig重链基因座和至少一个人工Ig轻链基因座。在一个实施方案中，人工Ig基因座是功能性的，并且能够在所产生的F1转基因动物中经历基因重排和产生一组免疫球蛋白，该组免疫球蛋白包括具有人独特型的免疫球蛋白。在一个实施方案中，人工Ig基因座的一个或多个恒定区基因含有至少一个非人恒定区基因并且是功能性的，能够在所产生的F1转基因动物中经历基因重排和产生一组嵌合免疫球蛋白，该组嵌合免疫球蛋白包括具有人独特型的嵌合免疫球蛋白。在一个实施方案中，人工Ig基因座的一个或多个恒定区基因含有至少一个人恒定区基因并且是功能性的，能够在所产生的F1转基因动物中经历基因重排和产生一组免疫球蛋白，该组免疫球蛋白包括具有人独特型和人恒定区的免疫球蛋白。
在一个实施方案中，该方法包括为内源性Ig基因座的生存力和失活而筛选生殖细胞。在一个实施方案中，该方法包括为人工Ig基因座的存在而筛选生殖细胞。
在一个实施方案中，该方法包括将至少一个人工Ig基因座引入到受精卵母细胞或胚胎，该卵母细胞或胚胎源自具有至少一个已经或能够通过一个或多个大范围核酸酶的作用灭活的内源性Ig基因座的生殖细胞，其中至少一个人工Ig基因座含有(i)具有至少一个编码种系或超突变的人V-区氨基酸序列的人V基因区段的V区；(ii)一个或多个J基因区段；和(iii)一个或多个恒定区基因，其中人工Ig基因座是功能性的，并且能够在源自受精卵母细胞和胚胎的建立者转基因动物或其后代中经历基因重排和产生一组人工免疫球蛋白。该方法进一步包括从受精卵母细胞或胚胎产生建立者转基因动物及其任选的后代，以产生含有至少一个人工Ig基因座和具有至少一个已经通过一个或多个大范围核酸酶的作用灭活的种系灭活内源性Ig基因座的转基因动物。
在一个实施方案中，至少一个人工Ig基因座包括至少一个人工Ig重链基因座。
在一个实施方案中，至少一个人工Ig基因座包括至少一个人工Ig轻链基因座。
在一个实施方案中，受精卵母细胞或胚胎缺乏功能性Ig轻链基因座，并且引入到受精卵母细胞或胚胎中的人工Ig基因座是Ig重链基因座。
在优选的实施方案中，将至少两个人工基因座引入到受精卵母细胞或胚胎中，包括至少一个人工Ig重链基因座和至少一个人工Ig轻链基因座。在一个实施方案中，人工Ig基因座是功能性的，并且能够在建立者转基因动物或其后代中经历基因重排和产生一组免疫球蛋白，该组免疫球蛋白包括具有人独特型的免疫球蛋白。在一个实施方案中，人工Ig基因座的一个或多个恒定区基因含有至少一个非人恒定区基因并且是功能性的，能够在建立者转基因动物或其后代中经历基因重排和产生一组嵌合免疫球蛋白，该组免疫球蛋白包括具有人独特型的嵌合免疫球蛋白。在一个实施方案中，人工Ig基因座的一个或多个恒定区基因含有至少一个人恒定区基因并且是功能性的，能够在建立者转基因动物或其后代中经历基因重排和产生一组嵌合免疫球蛋白，该组免疫球蛋白包括具有人独特型和人恒定区的免疫球蛋白。
在一个方面中，本发明提供了生产能够产生活生殖细胞的转基因动物的方法，在所述活生殖细胞中至少一个内源性Ig基因座是失活的。在优选的实施方案中，该方法包括生产具有基因组大范围核酸酶表达构建体的转基因动物，其中表达构建体含有可操作地连接大范围核酸酶编码核酸的表达控制区。在优选的实施方案中，该构建体是可以诱导以在生殖细胞中表达大范围核酸酶编码核酸的诱导型基因组大范围核酸酶表达构建体。
在一个方面中，本发明提供了生产具有活生殖细胞的转基因哺乳动物的方法，在所述活生殖细胞中至少一个内源性Ig基因座是失活的。该方法包括通过在其中表达大范围核酸酶，使生殖细胞，或从其产生的亲本生殖细胞或受精卵母细胞或胚胎中的内源性Ig基因座失活。
在一个方面中，本发明提供了活的生殖细胞，其中至少一个内源性Ig基因座能够被灭活。在优选的实施方案中，该生殖细胞含有基因组大范围核酸酶表达构建体，其中表达构建体含有可操作地连接大范围核酸酶编码核酸的表达控制区。在优选的实施方案中，构建体是可以诱导以在生殖细胞中表达大范围核酸酶编码核酸的诱导型基因组大范围核酸酶表达构建体。
在一个实施方案中，生殖细胞含有至少一个人工Ig重链基因座。
在一个实施方案中，生殖细胞含有至少一个人工Ig轻链基因座。
在一个实施方案中，生殖细胞含有至少一个人工Ig重链基因座和至少一个人工Ig轻链基因座。
在一个方面中，本发明提供了活的生殖细胞，其中至少一个内源性Ig基因座是失活的。
在一个实施方案中，生殖细胞含有至少一个人工Ig重链基因座。
在一个实施方案中，生殖细胞含有至少一个人工Ig轻链基因座。
在一个实施方案中，生殖细胞含有至少一个人工Ig重链基因座和至少一个人工Ig轻链基因座。
在一个方面中，本发明提供生产具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞的方法。该方法包括在生殖细胞、受精卵母细胞或胚胎中表达至少一个大范围核酸酶，以产生具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞。因此表达的大范围核酸酶识别存在于或接近于所述内源性Ig基因座的大范围核酸酶靶序列。
在一个实施方案中，其中在生殖细胞中表达大范围核酸酶，其中表达大范围核酸酶的生殖细胞产生具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞。可替换地，具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞可以获自如下的动物：该动物源自其中表达大范围核酸酶的生殖细胞。
在一个实施方案中，其中在受精卵母细胞或胚胎中表达大范围核酸酶，具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞可以获自如下的动物：该动物源自其中表达大范围核酸酶的受精卵母细胞或胚胎。
在一个实施方案中，在体外将至少一个内源性Ig基因座灭活。在一个实施方案中，在体内将至少一个内源性Ig基因座灭活。
在一个实施方案中，生殖细胞进一步含有至少一个人工Ig基因座。在一个实施方案中，至少一个人工Ig基因座包括至少一个人工Ig重链基因座。在一个实施方案中，至少一个人工Ig基因座包括至少一个人工Ig轻链基因座。
在一个实施方案中，将至少两个人工Ig基因座引入到生殖细胞中，包括至少一个人工Ig重链基因座和至少一个人工Ig轻链基因座。
本发明还提供了多克隆抗体、单克隆抗体、杂交瘤，及其制备方法和使用方法，其源于在本发明中公开的携带一个或多个人工基因座并具有一个或多个通过大范围核酸酶活性灭活的内源性Ig基因座的转基因动物中抗体的产生。
在一个实施方案中，抗体是仅有重链的抗体，使用通过在此所述的方法获得的缺乏功能性Ig轻链并含有人工重链基因座的转基因动物来生产。
在一个方面中，本发明提供使用在此提供的转基因动物来生产抗体的方法。该方法包括用免疫原来免疫本发明的转基因动物，如在此所述的，该动物具有至少一个失活的内源性Ig基因座并携带至少一个人工Ig基因座。在优选的实施方案中，转基因动物对于内源性Ig重链和/或内源性Ig轻链是失效合子的，因此，不能产生内源性免疫球蛋白。在一个实施方案中，转基因动物缺乏功能性Ig轻链基因座并含有人工Ig重链基因座。
在一个实施方案中，本发明提供如此生产的多克隆抗血清组合物。本发明的多克隆抗血清优选含有具有人独特型的抗体。在优选的实施方案中，多克隆抗血清含有基本上由具有人独特型的抗体组成的抗体。
在一个方面中，本发明提供生产单克隆抗体的方法。
在一个实施方案中，该方法包括(i)用免疫原来免疫本发明的转基因动物，如在此所述的，该动物具有至少一个失活的内源性I g基因座并携带至少一个人工Ig基因座；(ii)从转基因动物中分离单克隆抗体生成细胞，其中单克隆抗体生成细胞产生特异性结合免疫原的单克隆抗体；和(iii)使用单克隆抗体产生细胞来生产特异性结合免疫原的单克隆抗体，或使用单克隆抗体产生细胞来生产能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，使用该杂交瘤细胞来生产单克隆抗体。
在一个实施方案中，该方法包括(i)用免疫原来免疫本发明的转基因动物，如在此所述的，该动物具有至少一个失活的内源性Ig基因座并携带至少一个人工Ig基因座；(ii)从转基因动物中分离单克隆抗体生成细胞，其中单克隆抗体生成细胞产生特异性结合免疫原的单克隆抗体；(iii)从单克隆抗体产生细胞分离编码特异性结合免疫原的单克隆抗体的单克隆抗体核酸；和(iv)使用单克隆抗体核酸来生产特异性结合免疫原的单克隆抗体。
在优选的实施方案中，单克隆抗体具有人独特型。
在一个方面中，本发明提供如此生产的单克隆抗体。
在一个方面中，本发明提供编码该单克隆抗体的分离核酸。
在一个方面中，本发明提供了生产完全人单克隆抗体的方法。该方法包括(i)用免疫原来免疫本发明的转基因动物，如在此所述的，该动物具有至少一个失活的内源性Ig基因座并携带至少一个人工Ig基因座；(ii)从转基因动物中分离单克隆抗体生成细胞，其中单克隆抗体生成细胞产生特异性结合免疫原的单克隆抗体；(iii)从单克隆抗体产生细胞分离编码特异性结合免疫原的单克隆抗体的单克隆抗体核酸；(iv)修饰单克隆抗体核酸来产生编码完全人单克隆抗体的重组核酸；和(v)使用编码完全人单克隆抗体的重组核酸来生产所编码的完全人单克隆抗体。
在一个方面中，本发明提供如此生产的完全人单克隆抗体。
在一个方面中，本发明提供编码完全人单克隆抗体的重组核酸，及其生产方法。
在一个实施方案中，在此方法中所用的免疫原含有致病生物体或其抗原部分。
在一个实施方案中，在此方法中所用的免疫原是人内源性的抗原。在备选的实施方案中，在此方法中所用的免疫原是人外源性的抗原。
在一个方面中，本发明提供了中和或调节人体组分中的抗原实体活性的方法。在一个实施方案中，该方法包括使身体部分与本发明的多克隆抗血清组合物接触，其中多克隆抗血清组合物含有特异性结合并中和或调节抗原实体活性的免疫球蛋白分子。
在一个实施方案中，该方法包括将身体部分与本发明的单克隆抗体接触，其中单克隆抗体特异性结合并中和或调节抗原实体活性。
在优选的实施方案中，单克隆抗体是完全人单克隆抗体。
在一个实施方案中，抗原实体来自引起传染病的生物体。
在一个实施方案中，抗原实体是细胞表面分子。
在一个实施方案中，抗原实体是人细胞因子或人趋化因子。
在一个实施方案中，抗原实体是恶性肿瘤细胞上的细胞表面分子。
在一个方面中，本发明提供源自本发明转基因动物的细胞。
在优选的实施方案中，本发明提供源自本发明转基因动物脾的细胞。
在优选的实施方案中，本发明提供源自本发明转基因动物的B细胞，该B细胞能够产生具有人独特型的抗体。
在优选的实施方案中，本发明提供源自本发明转基因动物的生殖细胞。
在一个方面中，本发明提供制备杂交瘤的方法，该杂交瘤能够生产具有人独特型的抗体。该方法包括使用源自本发明转基因动物的细胞。
在一个方面中，本发明提供如此生产的杂交瘤。
在一个方面中，本发明提供具有人独特型的抗体，该抗体是通过本发明的杂交瘤产生的。
在一个方面中，本发明提供含有本发明抗体的药物组合物，该抗体具有人独特型。
在一个方面中，本发明提供治疗需要该治疗的患者的方法，包括将治疗有效量的本发明的药物组合物给药于患者。
附图简述
图1显示了人工重链的示意图，该人工重链由人V-、D和J-区、大鼠内含增强子和几个人工恒定区基因组成。人工恒定区基因含有编码人CH1结构域和大鼠CH2、3和4结构域的外显子。大鼠外显子编码跨膜和胞质多肽序列。
图2.I-SceI和识别序列的3’端的DNA相互作用的图示。
图3.I-SceI识别序列的5’端与I-SceI相互作用的图示。
图4.I-CreI的序列识别机制的图示(来自Nucleic Acids Res.，34，4791-4800)。
图5.改变I-CreI识别序列的策略的示意图。
图6.在细胞中表达了针对编码大鼠IgM的序列设计的锌指蛋白(ZFP)，制备了染色体DNA，并且将IgM基因座的合适区域进行PCR扩增。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析反应产物。该图显示了证明切割活性的典型实例。
发明详述
“人工免疫球蛋白基因座”意指含有人和非人免疫球蛋白基因座的免疫球蛋白基因座，包括多个免疫球蛋白基因区段，其包括至少一个可变区(V)基因区段，一个或多个J基因区段，就重链基因座而言一个或多个D基因区段，和一个或多个恒定区基因区段。在本发明中，至少一个V基因区段编码种系或超突变的人V-区氨基酸序列。在优选的实施方案中，本发明的人工免疫球蛋白基因座是功能性的并且能够重排和产生一组免疫球蛋白。在优选的实施方案中，至少一个D基因区段是人D基因区段。如在此所用的“人工Ig基因座”可以指的是未重排的基因座，部分重排的基因座和重排的基因座。人工Ig基因座包括人工Ig轻链基因座和人工Ig重链基因座。在一个实施方案中，人工Ig基因座含有非人C区基因并且能够产生一组免疫球蛋白，包括具有非人C区的嵌合免疫球蛋白。在一个实施方案中，人工Ig基因座含有人C区基因并且能够产生一组免疫球蛋白，包括具有人C区的免疫球蛋白。在一个实施方案中，人工Ig基因座含有“人工恒定区基因”，其意指含有源自人和非人恒定区基因的恒定区基因。例如，示例性人工C恒定区基因是编码人IgG CH1结构域以及大鼠IgG CH2和CH3结构域的恒定区基因。
在一些实施方案中，人工Ig重链基因座缺乏CH1，或使所得到的免疫球蛋白绕开典型的免疫球蛋白：伴侣蛋白结合的等价序列。这样的人工基因座提供了在转基因动物中生产只有重链的抗体，该抗体缺乏功能性Ig轻链基因座并因此不表达功能性Ig轻链。将这样的人工Ig重链基因座用于在此的方法中来产生缺乏功能性Ig轻链基因座并包含人工Ig重链基因座的转基因动物，该动物能够产生只有重链的抗体。或者，可以在原位操作人工Ig基因座以破坏CH1或等价区，并产生人工Ig重链基因座，提供了生产只有重链的抗体。关于在轻链缺失小鼠中生产只有重链的抗体，参见，例如，Zou等，JEM，204：3271-3283，2007。
“人独特型”意指存在于人抗体上的由免疫球蛋白V-基因区段编码的多肽序列。如在此所用的术语“人独特型”包括天然存在的人抗体序列，以及合成的与天然存在的人抗体中发现的多肽基本上相同的序列。“基本上”意指氨基酸序列同一性的程度为至少约85％-95％。优选，氨基酸序列同一性的程度高于90％，更优选高于95％。
“嵌合抗体”或“嵌合免疫球蛋白”意指含有一部分人免疫球蛋白多肽序列(或由人Ig基因区段编码的多肽序列)和一部分非人免疫球蛋白多肽序列的免疫球蛋白分子。本发明的嵌合免疫球蛋白分子是具有非人Fc-区或人工Fc-区和人独特型的免疫球蛋白。这样的免疫球蛋白可以分离自本发明已经工程化来生产嵌合免疫球蛋白分子的动物。
“人工Fc-区”意指由人工恒定区基因编码的Fc-区。
如在此所用的术语“Ig基因区段”指的是编码Ig分子各个部分的DNA区段，其存在于非人动物和人的种系中，并且在B细胞中合在一起形成重排的Ig基因。因此，如在此所用的Ig基因区段包括V基因区段、D基因区段、J基因区段和C区基因区段。
如在此所用的术语“人Ig基因区段”包括天然存在的人Ig基因区段的序列，天然存在的人Ig基因区段的简并形式以及合成的编码与通过天然存在的人Ig基因区段序列编码的多肽基本上相同的多肽序列的序列。“基本上”意指氨基酸序列同一性的程度为至少约85％-95％。优选，氨基酸序列同一性的程度高于90％，更优选高于95％。
“大范围核酸酶”意指识别DNA中长识别位点，优选至少12，更优选至少13，更优选至少14，更优选至少15，更优选至少16，更优选至少17，最优选至少18个核苷酸长的内切脱氧核糖核酸酶。大范围核酸酶包括锌指核酸酶，天然存在的归巢内切核酸酶和定制工程化的锌指核酸酶和归巢内切核酸酶。本发明中的使用所需要的是大范围核酸酶识别存在于或接近于主体动物中的内源性Ig基因座的大范围核酸酶靶序列，使得通过大范围核酸酶的作用可以将功能性突变引入到Ig基因座中。对于大范围核酸酶的更多讨论，参见，例如，美国专利申请公开号20060206949，20060153826，20040002092，20060078552和20050064474。
可以通过使各个锌指与不同的三联体靶结合来生产具有改变的特异性的锌指核酸酶。可以通过基于结构的蛋白质工程化来改变天然存在的归巢内切核酸酶的特异性。例如，参见，Proteus和Carroll，nature biotechnology 23(8)：967-97，2005。
具有“种系失活的Ig基因座”或“种系失活的内源性Ig基因座”或“内源性Ig基因座的种系突变”的动物在每个细胞(即，每个体细胞和生殖细胞)中具有失活的内源性Ig基因座。在本发明中，通过突变来产生具有种系失活基因座的动物，如通过生殖细胞中的大范围核酸酶的作用来进行，该生殖细胞产生所得到的动物或其前辈。
具有失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞和转基因动物的产生
在本发明中，使用大范围核酸酶来灭活内源性Ig基因座，使得产生具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞。该方法包括在生殖细胞、受精卵母细胞或胚胎中表达至少一个大范围核酸酶，以产生具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞。因此表达的大范围核酸酶识别存在于或接近于主体动物中的内源性Ig基因座的大范围核酸酶靶序列。
在一个实施方案中，其中大范围核酸酶在生殖细胞表达，其中表达大范围核酸酶的生殖细胞产生具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞。或者，可以从源自其中表达大范围核酸酶的生殖细胞的动物中获得具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞。
在一个实施方案中，其中大范围核酸酶在受精卵母细胞或胚胎中表达，可以从源自其中表达大范围核酸酶的受精卵母细胞或胚胎的动物中获得具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞。
本发明还提供生产含有至少一个种系失活的内源性Ig基因座的转基因动物的方法。该方法包括从根据在此的方法产生的具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞生产转基因动物。
在一个实施方案中，具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞进一步含有人工Ig基因座，并且如此产生的转基因动物含有人工Ig基因座。
在一个实施方案中，该方法进一步包括将人工Ig基因座引入到具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞，或其生殖细胞后代或从其产生的受精卵母细胞或胚胎中，并且如此产生的转基因动物含有人工Ig基因座。
在一个实施方案中，该方法包括将具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞，或其生殖细胞后代与含有人工Ig基因座的配子结合，并且如此产生的转基因动物含有人工Ig基因座。
内源性Ig基因座的灭活
使用对主体动物内源性的重链和/或轻链基因座中的免疫球蛋白基因区段特异性的大范围核酸酶来进行内源性Ig基因座的灭活。在一个实施方案中，通过将大范围核酸酶注射到生殖细胞、受精卵母细胞或胚胎中来诱导双链断裂。或者，可以将编码大范围核酸酶并能够在生殖细胞、受精卵母细胞或胚胎中表达的表达载体或核酸注入其中。
在一个实施方案中，该方法包括用大范围核酸酶编码核酸或表达构建体在体外或在体内转染生殖细胞，其可以包括其前身，如精原干细胞。例如，参见，Ryu等，J.Androl.，28：353-360，2007；Orwig等，Biol.Report，67：874-879，2002。
在优选的实施方案中，将大范围核酸酶表达构建体整合到主体动物的基因组中。编码大范围核酸酶的转基因在生殖细胞中的表达将导致内源性Ig基因座中的双链断裂，并导致随后的限制性位点突变。这样的转基因动物的交配产生具有突变的/失活的免疫球蛋白基因座的后代。
在本发明的非常优选的实施方案中，将可调控的大范围核酸酶表达构建体整合到主体动物的基因组中，该可调控构建体在生殖细胞中是可诱导的。这样的构建体提供了与特定大范围核酸酶通过诱导型启动子的受控表达的表达相关的细胞毒性作用的最小化，诱导型启动子例如为热诱导型启动子、辐射诱导型启动子、四环素操纵子、激素诱导型启动子和通过反式激活蛋白的二聚作用可诱导的启动子等。例如，参见，Vilaboa等，Current Gene Therapy，6：421-438，2006。
或者，可以在源自该生殖细胞的胚胎中诱导大范围核酸酶表达。
在一个实施方案中，在生殖细胞中表达单个大范围核酸酶，其中大范围核酸酶识别在主体动物的生殖细胞内源性的免疫球蛋白基因座之中或附近的靶序列。在优选的实施方案中，大范围核酸酶靶序列在J基因区段之中或附近。在另一个优选的实施方案中，大范围核酸酶靶序列在免疫球蛋白恒定区基因之中或附近。在优选的实施方案中，免疫球蛋白恒定区基因编码免疫球蛋白μ。
在优选的实施方案中，使用至少两种具有不同靶序列的大范围核酸酶。这至少两种大范围核酸酶在生殖细胞中表达，其中大范围核酸酶识别在主体动物的生殖细胞内源性的免疫球蛋白基因座之中或附近的不同靶序列。
在优选的实施方案中，第一个和第二个大范围核酸酶靶向J基因区段。在一个实施方案中，第一个和第二个大范围核酸酶靶向序列一起位于内源性Ig基因座内的一个或多个J基因区段的上游和下游，并且由第一个和第二个编码的大范围核酸酶的切割产生含有一个或多个J基因区段的基因组DNA区段的缺失。
在另一个实施方案中，第一个和第二个大范围核酸酶靶向恒定区基因区段。在一个实施方案中，第一个和第二个大范围核酸酶靶序列一起位于一个或多个免疫球蛋白恒定区基因区段的上游和下游，并且由第一个和第二个编码的大范围核酸酶的切割产生含有一个或多个免疫球蛋白恒定区基因区段的基因组DNA区段的缺失。在优选的实施方案中，恒定区基因编码免疫球蛋白μ。
在一个实施方案中，从主体动物的基因组中缺失完整的内源性Ig重链和/或Ig轻链基因座，或其大部分。这样的动物也称为含有已经被灭活的内源性基因座。
在一个实施方案中，使用至少一种大范围核酸酶来破坏内源性Ig重链基因座的CH1区，使剩余的基因座保持完整并能够产生绕开了典型的免疫球蛋白：伴侣蛋白结合的Ig重链。优选，在缺乏功能性Ig轻链基因座的动物中进行这种CH1靶向。该动物中的这种靶向用于产生只有重链的抗体。
在一个实施方案中，使用超过一种的大范围核酸酶来靶向Ig重链基因座内的CH1。
在一个实施方案中，使用两种识别邻近位点的大范围核酸酶。在一个实施方案中，该位点是回文序列的元件。在一个实施方案中，这两种大范围核酸酶通过连接物拴系。
在优选的实施方案中，设计所用的育种策略来获得对于内源性Ig轻链和/或内源性Ig重链为失效合子的动物。
含有可调控的基因组大范围核酸酶表达构建体的转基因动物
在一个方面中，本发明提供含有至少一个可调控的基因组大范围核酸酶表达构建体的转基因动物。
从小的实验室动物选择转基因动物，特别是禽类(鸡、火鸡、鹌鹑、鸭、雉或鹅等)、啮齿动物(例如，大鼠、仓鼠和豚鼠)和鼬鼠(例如，白鼬)。
在优选的实施方案中，可调控的基因组大范围核酸酶表达构建体含有可操作地连接大范围核酸酶编码核酸的诱导型表达控制区。该诱导型表达控制区在特定转基因动物的生殖细胞中是可诱导功能性的，并且所编码的大范围核酸酶对于位于或接近于主体动物的内源性免疫球蛋白基因座的大范围核酸酶靶序列是选择性的。
可调控大范围核酸酶表达构建体提供了与特定大范围核酸酶通过诱导型启动子的受控表达的表达相关的细胞毒性作用的最小化，诱导型启动子例如为热诱导型启动子、辐射诱导型启动子、四环素操纵子、激素诱导型启动子和通过反式激活蛋白的二聚作用可诱导的启动子等。
在优选的实施方案中，本发明的转基因动物含有两个可调控的基因组大范围核酸酶表达构建体，含有编码识别两个不同靶序列的两种不同大范围核酸酶的两种不同核酸。这两种大范围核酸酶联合起作用使内源性Ig基因座的基因组DNA区段缺失并由此将其灭活。
可以通过本领域公知的方法来制造含有至少一个可调控的基因组大范围核酸酶表达构建体的转基因动物。例如，将含有可操作地连接大范围核酸酶编码核酸的诱导型表达控制区的转基因载体引入到一个或几个受体细胞中，然后通过随机整合或靶向整合将其整合到一个或几个受体细胞的基因组中。
对于随机整合，可以通过标准转基因策略将这样的转基因载体引入到受体细胞中。例如，可以将转基因载体直接注入受精卵母细胞的原核中。还可以通过在卵母细胞受精前将精子和转基因载体共同培养来引入转基因载体。转基因动物可以从受精卵母细胞产生。另一种引入转基因载体的方式是通过转染胚胎干细胞或其他多能细胞(例如，原生殖细胞)并随后将遗传修饰的细胞注入发育中的胚胎中。或者，可以将转基因载体(裸露的或与促进试剂结合)直接注入发育中的胚胎中。在另一个实施方案中，将转基因载体引入到细胞的基因组中，并且通过核移植克隆从转染的细胞产生动物。
对于靶向整合，可以将这样的转基因载体引入到合适的受体细胞，如胚胎干细胞或已经分化的体细胞中。此后，可以通过标准方法来选择通过同源重组已经将转基因在靶向的位点整合到动物基因组中的细胞。然后可以将选定的细胞与去核的核移植单位细胞(例如，卵母细胞或胚胎干细胞，全能性的并且能够形成功能性新生儿的细胞)融合。按照完全确立的常规技术来进行融合。参见，例如，Cibelli等，Science(1998)280：1256，Zhou等，Science(2003)301：1179。也可以使用注射移液管通过显微外科来进行卵母细胞的去核和核移植。(参见，例如，Wakayama等，Nature(1998)394：369)。然后将所得到的细胞在合适的培养基中培养，并转移至同步的受体中，用于产生转基因动物。或者，可以将选定的遗传修饰的细胞注入发育中的胚胎中。
在一个实施方案中，使用大范围核酸酶来提高在靶位点通过双链DNA切割的同源重组的频率。
含有人工Ig基因座和能够产生具有人独特型的抗体的转基因动物
在一个方面中，本发明提供能够产生具有人独特型的免疫球蛋白的转基因动物，及其制备方法。
所用的转基因动物特别地选自禽类(鸡、火鸡、鹌鹑、鸭、雉或鹅等)、啮齿动物(例如，大鼠、仓鼠和豚鼠)和鼬鼠(例如，白鼬)。
用于本发明的人源化抗体生产的转基因动物在内源性Ig基因座携带种系突变，该种系突变已经通过一个或多个大范围核酸酶的活性来实现。在优选的实施方案中，转基因动物对于内源性Ig重链和/或内源性Ig轻链是失效合子的。此外，这些动物携带至少一个人工Ig基因座，其是功能性的并且能够在转基因动物中产生一组免疫球蛋白分子。本发明中所用的人工Ig基因座包括至少一个人V基因区段。
在优选的实施方案中，转基因动物携带至少一个人工Ig重链基因座和至少一个人工Ig轻链基因座，各自都是功能性的并且能够在转基因动物中产生一组免疫球蛋白分子，该组免疫球蛋白分子包括具有人独特型的抗体。在一个实施方案中，使用了包括至少一个非人C基因的人工基因座，并且提供了能够产生具有人独特型和非人恒定区的嵌合抗体的动物。在一个实施方案中，使用了包括至少一个人C基因的人工基因座，并且提供了能够产生具有人独特型和人恒定区的抗体的动物。
在另一个优选的实施方案中，转基因动物携带至少一个人工Ig重链基因座，并缺乏功能性Ig轻链基因座。这样的动物在只有重链的抗体的生产中发现了用途。
这样的转基因动物的产生包括将一个或多个人工重量Ig基因座和一个或多个人工轻链Ig基因座整合到具有至少一个内源性Ig基因座的转基因动物的基因组中，该内源性Ig基因座已经或将要通过一个或多个大范围核酸酶的作用来灭活。优选，转基因动物对于内源性Ig重链和/或内源性Ig轻链是失效合子的，因此，不能够产生内源性免疫球蛋白。与染色体位置无关，本发明的人工Ig基因座具有经历基因重排并由此产生多样的免疫球蛋白分子的能力。具有经历基因重排能力的Ig基因座在此也称为“功能性”Ig基因座，通过功能性Ig基因座产生的具有不同组性的抗体也称为“功能性”抗体或“功能性”组的抗体。
用于产生这样的转基因动物的人工基因座各自包括多个免疫球蛋白基因区段，其包括至少一个V区基因区段，一个或多个J基因区段，就重链基因座而言一个或多个D基因区段，和一个或多个恒定区基因。在本发明中，至少一个V基因区段编码种系或超突变的人V区氨基酸序列。因此，这样的转基因动物具有产生不同组的免疫球蛋白分子的能力，其包括具有人独特型的抗体。
在一个实施方案中，所用的人工基因座含有至少一个非人C区基因区段。因此，这样的转基因动物具有产生不同组的免疫球蛋白分子的能力，其包括具有人独特型的嵌合抗体。
在一个实施方案中，所用的人工基因座含有至少一个人C区基因区段。因此，这样的转基因动物具有产生不同组的免疫球蛋白分子的能力，其包括具有人独特型和人恒定区的抗体。
在一个实施方案中，所用的人工基因座含有至少一个人工恒定区基因。例如，示例性人工C恒定区基因是编码人IgG CH1结构域以及大鼠IgG CH2和CH3结构域的恒定区基因。因此，这样的转基因动物具有产生不同组免疫球蛋白分子的能力，其包括具有人独特型和含有人和非人组分的人工恒定区的抗体。
将含有人工Ig基因座的转基因载体引入到一个或多个受体细胞中，然后通过随机整合或靶向整合将其整合到一个或多个受体细胞的基因组中。
对于随机整合，可以通过标准的转基因技术将含有人工Ig基因座的转基因载体引入到受体细胞中。例如，可以将转基因载体直接注入受精卵母细胞的原核中。还可以通过在卵母细胞受精前将精子和转基因载体共同培养来引入转基因载体。转基因动物可以从受精卵母细胞产生。另一种引入转基因载体的方式是通过转染胚胎干细胞或其他多能细胞(例如，原生殖细胞)并随后将遗传修饰的细胞注入发育中的胚胎中。或者，可以将转基因载体(裸露的或与促进试剂结合)直接注入发育中的胚胎中。最终，从含有整合到转基因动物的至少一些体细胞的基因组中的人工Ig转基因的胚胎产生嵌合转基因动物。在另一个实施方案中，将转基因载体引入到细胞的基因组中，并且通过核移植克隆从转染的细胞产生动物。
在优选的实施方案中，将含有人工Ig基因座的转基因随机整合到受体细胞(如受精卵母细胞或发育中的胚胎)的基因组中。受体细胞源自具有至少一个内源性Ig基因座已经通过一种或多种大范围核酸酶的作用灭活的动物。或者，可以将携带人工免疫球蛋白基因座的转基因动物与具有至少一个内源性Ig基因座已经通过一种或多种大范围核酸酶的作用灭活的转基因动物杂交。与所用的特定方法无关，在优选的实施方案中，获得了对于内源性Ig重链和/或Ig轻链为失效合子的并因此不能产生内源性免疫球蛋白而能产生转基因免疫球蛋白的后代。
对于靶向整合，可以将转基因载体引入到合适的受体细胞，如胚胎干细胞、其他多能细胞或已经分化的体细胞中。此后，可以通过标准方法来选择通过同源重组已经将转基因整合到动物基因组中并已经替代对应的内源性Ig基因座的细胞。然后可以将选定的细胞与去核的核移植单位细胞(例如，卵母细胞或胚胎干细胞，全能性的并且能够形成功能性新生儿的细胞)融合。按照完全确立的常规技术来进行融合。参见，例如，Cibelli等，Science(1998)280：1256；Zhou等，Science(2003)301：1179。也可以使用注射移液管通过显微外科来进行卵母细胞的去核和核移植。(参见，例如，Wakayama等，Nature(1998)394：369)。然后将所得到的细胞在合适的培养基中培养，并转移至同步的受体中，用于产生转基因动物。或者，可以将选定的遗传修饰的细胞注入发育中的胚胎中，其随后发育成嵌合动物。
在一个实施方案中，使用大范围核酸酶来提高在靶位点通过双链DNA切割的同源重组的频率。为了整合到内源性免疫球蛋白基因座中，可以使用位点特异性大范围核酸酶。在一个实施方案中，使用靶向内源性Ig基因座的大范围核酸酶来提高同源重组的频率和人工Ig基因座或其部分对内源性Ig基因座或其部分的替代。
在一个实施方案中，转基因动物缺乏功能性Ig轻链基因座，但含有人工Ig重链基因座。
人工Ig基因座
本发明进一步涉及人工Ig基因座及其在制造能够产生具有人独特型的免疫球蛋白的转基因动物中的用途。
每个人工Ig基因座含有多个免疫球蛋白基因区段，其包括至少一个V区基因区段，一个或多个J基因区段，就重链基因座而言一个或多个D基因区段，和一个或多个恒定区基因。在本发明中，至少一个V基因区段编码种系或超突变的人V区氨基酸序列。因此，这样的转基因动物具有产生不同组的免疫球蛋白分子的能力，其包括具有人独特型的抗体。在重链基因座中，在人工Ig基因座中可以包括人或非人衍生的D-基因区段。在未重排构象(或“种系构象”)或部分或完全重排的构象中，该基因座的基因区段是相互并列的。人工Ig基因座具有在主体动物中经历基因重排的能力(如果基因区段没有完全重排)，并由此产生具有人独特型的不同组的免疫球蛋白。
调控元件，如启动子、增强子、转换区、重组信号等，可以是人或非人来源的。所需要的是该元件在所涉及的动物物种中可操作，以赋予人工基因座功能性。
在一个方面中，本发明提供含有能够在宿主动物中经历基因重排并由此产生不同组的具有人独特型的重链的人工重链基因座的转基因构建体。转基因的人工重链基因座含有具有至少一个人V基因区段的V-区。优选，V-区包括至少约5-100人重链V(或“VH”)基因区段。如上所述，人VH区段包括天然存在的人VH基因区段的序列，天然存在的人VH基因区段序列的简并形式以及编码与人重链V结构域多肽基本上相同(即，至少约85％-95％)的多肽序列的合成序列。
在优选的实施方案中，人工重链基因座含有至少一个或几个大鼠恒定区基因，例如，Cδ、Cμ和Cγ(包括任何Cγ亚类)。
在另一个优选的实施方案中，人工重链基因座含有人工恒定区基因。在优选的实施方案中，该人工恒定区基因编码人CH1结构域以及大鼠CH2CH3结构域，或人CH1以及大鼠CH2、CH3和CH4结构域。具有人CH1结构域的杂交重链与全长人轻链有效地配对。
在另一个优选的实施方案中，人工重链基因座含有缺乏CH1结构域的人工恒定区基因。在优选的实施方案中，这样的人工恒定区基因编码缺乏CH1结构域但含有CH2和CH3，或CH1、CH2、CH3和CH4结构域的截短IgM和/或IgG。缺乏CH1结构域的重链不能与Ig轻链有效配对，形成了只有重链的抗体。
在另一个方面中，本发明提供含有能够在宿主动物中经历基因重排并由此产生不同组的具有人独特型的轻链的人工轻链基因座的转基因构建体。转基因的人工轻链基因座含有具有至少一个人V基因区段的V-区，例如，具有至少一个人VL基因和/或至少一个重排的人VJ区段的V-区。优选，V-区包括至少约5-100人轻链V(或“VL”)基因区段。一致地，人VL区段包括天然存在的人VL基因区段的序列，天然存在的人VL基因区段序列的简并形式以及编码与人轻链V结构域多肽基本上相同(即，至少约85％-95％)的多肽序列的合成序列。在一个实施方案中，人工轻链Ig基因座具有带有至少一个大鼠C基因(例如，大鼠Cλ或Cκ)的C-区。
本发明的另一个方面涉及制备含有人工Ig基因座的转基因载体的方法。这样的方法包括分离Ig基因座或其片段，并将其与一个或几个含有编码人V区元件的序列的DNA片段结合。通过连接或同源重组将一个或几个Ig基因区段插入到人工Ig基因座或其部分中，以这样的方式来保留基因座在主体动物中经历有效的基因重排的能力。
优选，通过筛选从相同物种的基因组DNA制得的质粒、粘粒、YAC或BAC等的文库来分离非人Ig基因座。YAC克隆可以携带至多2个巨碱基的DNA片段，因此可以在一个YAC克隆中分离完整的动物重链基因座或其大部分，或将其构建以包含于一个YAC克隆中。BAC克隆能够携带较小大小(约50-500kb)的DNA片段。然而，可以分开改变含有I g基因座重叠片段的多个BAC克隆，并随后一起注射到动物受体细胞中，其中重叠片段在受体动物细胞中重新结合，以产生连续的Ig基因座。
可以通过各种方法将人Ig基因区段整合到载体(例如，BAC克隆)上的Ig基因座中，这样的方法包括DNA区段的连接，或通过同源重组的DNA区段的插入。以这样的方式进行人Ig基因区段的整合，使得人Ig基因区段可操作地连接宿主动物的转基因序列来产生功能性人源化Ig基因座，即，能够基因重排的Ig基因座，其导致产生不同组的具有人独特型的抗体。可以在细菌、酵母和其他具有高频率同源重组事件的细胞中进行同源重组。工程化的YAC和BAC可以容易地从细胞中分离出来并用于制备转基因动物。
具有人独特型的免疫球蛋白
一旦制得能够产生具有人独特型的免疫球蛋白的转基因动物，就可以通过用抗原免疫动物容易地获得针对抗原的免疫球蛋白和抗体制剂。如在此所用的“多克隆抗血清组合物”包括亲和性纯化的多克隆抗体制剂。
各种抗原可以用来免疫转基因动物。这样的抗原包括，但不限于，活的、减毒的或死亡的微生物，例如，病毒和单细胞生物体(如细菌和真菌)，微生物的区段或从微生物分离的抗原性分子。
用于免疫动物的优选细菌抗原包括从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)纯化的抗原，如5型和8型荚膜多糖，重组形式的毒力因子，如α-毒素，粘附素结合蛋白，胶原结合蛋白和粘连蛋白结合蛋白。优选的细菌抗原还包括减毒形式的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肠球菌、肠细菌和肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)，或来自这些细菌细胞的培养物上清液。可以用于免疫的其他细菌抗原包括来自铜绿假单胞菌、肠球菌、肠细菌和肺炎克雷伯杆菌的纯化脂多糖(LPS)、荚膜抗原、荚膜多糖和/或重组形式的外膜蛋白、粘连蛋白结合蛋白、内毒素和外毒素。
用于产生抗真菌抗体的优选抗原包括减毒形式的真菌或其外膜蛋白，该真菌包括，但不限于，白假丝酵母(Candida albicans)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)。
用于免疫以产生抗病毒抗体的优选抗原包括包膜蛋白和减毒形式的病毒，其包括，但不限于，呼吸道合胞病毒(RSV)(特别是F-蛋白)、丙肝病毒(HCV)、乙肝病毒(HBV)、巨细胞病毒(CMV)、EBV和HSV。
可以通过用分离的肿瘤细胞或肿瘤细胞系以及肿瘤相关抗原免疫转基因动物来产生癌症特异性的抗体，肿瘤相关抗原包括，但不限于，Her-2-neu抗原(针对其的抗体可用于治疗乳癌)；CD20、CD22和CD53抗原(针对其的抗体可用于治疗B细胞淋巴瘤)，前列腺特异性膜抗原(PMSA)(针对其的抗体可用于治疗前列腺癌)和17-1A分子(针对其的抗体可用于治疗结肠癌)。
可以以任何方便的方式将抗原给予转基因动物，使用或不使用佐剂，并且可以根据预定的时间表来给予。
为了制备单克隆抗体，从免疫过的转基因动物分离脾细胞，并用于与转化的细胞系融合，用于生产杂交瘤，或通过标准分子生物学技术克隆cDNA编码抗体并在转染的细胞中表达。用于制备单克隆抗体的程序是本领域公知的。参见，例如，欧洲专利申请0583980A1(“从兔产生单克隆抗体的方法”)，美国专利号4,977,081(“稳定的兔-鼠杂交瘤及其分泌产物”)，WO97/16537(“稳定的鸡B-细胞系及其使用方法”)和EP 0491057B1(“产生禽类特异性免疫球蛋白G的杂交瘤”)，在此将其公开内容引入作为参考。Andris-Widhopf等“Methods for the generation of chicken monoclonal antibodyfragments by phage display”，J Immunol Methods 242：159(2000)，和Burton，D.R.，“Phage display”，Immunotechnology 1：87(1995)已经描述了在体外从克隆的cDNA分子产生单克隆抗体。
一旦产生具有人独特型的嵌合单克隆抗体，就可以使用标准分子生物学技术将这样嵌合抗体容易地转化成完全人抗体。完全人单克隆抗体在人体内不是免疫原性的并适用于人患者的治疗。
本发明的抗体包括只有重链的抗体
在一个实施方案中，用抗原免疫缺乏功能性Ig轻链基因座但含有人工重链基因座的转基因动物，来产生特异性结合抗原的只有重链的抗体。
在一个实施方案中，本发明提供源自这些动物的单克隆抗体产生细胞，以及从其产生的核酸。还提供了从其产生的杂交瘤。还提供了完全人的只有重链的抗体，以及从其产生的编码核酸。
关于只有重链的抗体的教导可以在本领域中找到。例如，参见，PCT公开WO02085944、WO02085945、WO2006008548和WO2007096779。还可以参见US5,840,526；US5,874,541；US6,005,079；US6,765,087；US5,800,988；EP1589107；WO9734103和US6,015,695。
药物组合物
在本发明进一步的实施方案中，将纯化的单克隆或多克隆抗体与适于给药于患者的合适药物载体混合，以提供药物组合物。
用本发明的药物组合物治疗患者优选是哺乳动物，更优选人，尽管也包括脊椎动物使用。
可以用于本发明药物组合物中的药物学上可接受的载体可以是随便什么溶剂、分散介质、等渗剂等。只要任何常规的介质、试剂、稀释剂或载体对受体或对其中所含抗体的治疗有效性是无害的，其在本发明的药物组合物中的使用是合适的。
该载体可以是液体、半固体(例如，糊状物)或固体载体。载体的实例包括油、水、盐溶液、醇、糖、凝胶、脂质、脂质体、树脂、多孔基质、粘合剂、填充剂、包衣剂、防腐剂等，或其组合。
治疗方法
在本发明另外的方面中，提供了通过将本发明纯化的抗体组合物给药于需要治疗该疾病的脊椎动物，来治疗疾病的方法，所述脊椎动物优选是哺乳动物，优选灵长类动物，人是特别优选的实施方案。
抗体组合物可以用于结合和中和或调节人体组织内导致或引起疾病或引发不利或异常免疫应答的抗原实体。在此将“抗原实体”限定为包括任何可溶性的或结合细胞表面的分子，包括蛋白质，以及至少能够结合抗体并优选还能够刺激免疫应答的细胞或引起传染病的生物体或物质。
作为单一治疗或与化疗联合的针对传染因子的抗体组合物的给药导致传染颗粒的消除。单次给药抗体通常将传染粒子的数量降低10至100倍，更常见超过1000倍。相似地，患有恶性疾病的患者中作为单一治疗或与化疗联合使用的抗体治疗通常将恶性细胞的数量减少10至100倍，或超过1000倍。治疗可以在延长的时间段内重复进行以确保完全消除传染粒子、恶性细胞等。在一些情况中，使用抗体制剂的治疗在可检测量的传染粒子或不良细胞不存在的情况下将持续延长的时间段。
相似地，抗体治疗用于调节免疫应答的使用可以由单次或多次给药治疗性抗体构成。可以在任何疾病症状不存在的情况下将治疗持续延长的时间段。
主体治疗可以连同化疗一起使用，其剂量足以抑制传染病或恶性肿瘤。在自体免疫疾病患者或移植接受者中，抗体治疗可以连同免疫抑制治疗一起使用，其剂量足以抑制免疫反应。
所有引用文献在此特意以其整体引入作为参考。
实验
大鼠免疫球蛋白序列特异性的归巢内切核酸酶的定向进化
大鼠IgM外显子序列的分析导致鉴定了几个用于工程化归巢内切核酸酶的靶切割序列。使用归巢内切核酸酶I-SceI，鉴定了两个靶序列，一个在大鼠IgM外显子II内(CGTGGATCACAGGGGTCT)，另一个在大鼠IgM外显子III内(CTGGGATAACAGGAAGGA)。这些位点与I-SceI的天然识别序列(TAGGGATAACAGGGTAAT)共享61％(18个碱基中的11个)的序列同一性。
表1.大鼠IgM外显子中的靶序列(不同的核苷酸是带下划线的)
  目标 序列   相似性   位置
  T3 CGTGGATCACAGGGGTCT 61％   外显子II
  T4 CTGGGATAACAGGAAGGA 61％   外显子III
Figure GPA00001014001000341
为了这些靶序列特异性的归巢内切核酸酶的工程化，我们使用了高度敏感性的选择，用于将酶促DNA切割与宿主细胞存活联系起来的归巢内切核酸酶的定向进化(由Chen和Zhao详细描述，Nucleic AcidResearch 33(18)：e154，2005)。使用体外协同进化策略来工程化具有靶序列特异性的I-SceI变体。如表2中所示的，对于靶序列T3，选择了两个新的序列，T3i1和T3i2，作为中间产物序列，而对于靶序列T4，选择了两个新的序列，T4i1和T4i2，作为中间产物序列。将T3i1和T4i1序列克隆至报告质粒中，分别产生p11-LacY-T3i1和p11-LacY-T4i1。
表2.三个步骤中的序列(不同的核苷酸是带下划线的)
 步骤1   T3i1   TAGGGATAACAGGGGTCT   T4i1 TAGGGATAACAGGGAGGA
 步骤2   T3i2   CGTGGATAACAGGGGTCT   T4i2 CTGGGATAACAGGAAGGA
 步骤3   T3   CGTGGATCACAGGGGTCT   T4 CTGGGATAACAGGAAGGA
为了获得具有T3i1或T4i1序列特异性的I-SceI突变体，首先进行分子模型来鉴定待用于通过饱和诱变形成聚焦文库的残基。如图2中所示，I-SceI通过位于DNA小沟中的松环结合到T3i1或T4i1的3’端上。残基Gly13、Pro14、Asn15和Lys20接近该3’端，而Asn15通过氢键直接结合到野生型识别序列3’端的最后一个胸腺嘧啶上。通过饱和诱变构建含有在这四个选择的残基上所有可能的氨基酸取代组合的突变体文库。为了产生足够大的文库，通过几个试验来优化连接反应和DNA转化程序。形成了由2.9×106个突变体组成的文库。
筛选文库中对T3i1序列具有提高活性的I-SceI突变体。与第0轮(野生型I-SceI)相比较，第一轮筛选筛选产生了对T3i1序列具有提高活性的突变体，因为细胞存活率提高了10倍。第2轮和第3轮中潜在阳性突变体的富集显示了细胞存活率的进一步改善。相似地，筛选文库中对T4i1序列具有提高活性的I-SceI突变体。突变体的筛选产生了具有对T4i1序列具有提高活性的突变体。
平行地，设计了靶向识别序列5’端的I-SceI突变体的第二个文库。使用饱和诱变形成的第一个文库聚焦于与I-SceI识别序列的四个核苷酸的3’端相互作用的那些残基。基于分子模型，Trp149、Asp150、Tyr151和Asn152位于由5’端核苷酸形成的小沟中。Asn152通过氢键与T(-7)直接相互作用。Asp150和Tyr152通过水分子与T间接相互作用，T与A(-6)相对。Trp149和Tyr151与磷酸酯主链相互作用。因此，这四个残基对于I-SceI的序列特异性是重要的，同时对这四个残基进行饱和诱变，以形成第二个I-SceI突变体文库。
此外，这些酶的协同进化导致产生了对大鼠IgM外显子II和III中的靶序列(CGTGGATCACAGGGGTCT和CTGGGATAACAGGAAGGA)特异性的新大范围核酸酶。
具有限定序列特异性的I-Cre的工程化
为了对新靶序列特异性的归巢内切核酸酶的工程化，我们使用了高度敏感性的选择，用于将酶促DNA切割与宿主细胞存活联系起来的归巢内切核酸酶的定向进化(由Chen和Zhao详细描述，Nucleic AcidResearch 33(18)：e154，2005)。此外，设计了用于工程化具有限定序列特异性的I-CreI突变体的一般策略。I-CreI以假回文方式识别靶序列。回文碱基由I-CreI直接识别，并且难以被改变(J.Mol.Biol.280，345-353)(图4)。
这种特性阻碍了识别非回文序列的I-CreI衍生物的直接工程化。为了克服这个问题，将靶序列分成左半部分(上游一半)和右半部分(下游一半)。各自对左半部分回文序列和右半部分回文序列的中间产物序列将I-CreI优化(图4)。然后，将对中间产物序列优化的I-CreI突变体工程化，以识别靶序列回文序列。最后，对将要共同表达的左半部分和右半部分各自优化I-CreI突变体，以切割靶序列。此外，检查了左半部分优化的突变体与右半部分优化的突变体通过多肽连接物的融合。
鉴定了外显子IV内的靶序列(CAACTGATCCTGAGGGAGTCGG)，其与归巢核酸内切酶I-CreI的天然识别序列具有59％的序列同一性。随后，基于原始ICreI靶序列内的回文碱基的鉴定，选择了两个序列，T5和T6，作为I-CreI工程化的靶序列。
I-CreI识别序列和2个靶序列
Figure GPA00001014001000361
回文碱基是突出显示的。保守碱基是粗体书写的。
将这两个靶序列，T5和T6，克隆至受体质粒中，将I-CreI基因克隆至pTrc质粒中，并测序来证实在PCR扩增过程中没有引入突变。评级I-CreI选择系统的细胞存活率。
此外，进行分子模型化，并鉴定直接接触DNA底物的蛋白质残基。此外，我们设计了用于体外协同进化实验的中间产物序列。
用于饱和诱变的靶残基
  靶残基   靶残基
  YN-TS5-L   Q26和S32   YN-TS6-L   Q26、K28和R68
  YN-TS5-Ri1   R68、R70和D75   YN-TS6-Ri1   Q44和R68
  YN-TS5-Ri2   Q26和K28   YN-TS6-Ri2   N30、Y33和Q38
  YN-TS5-Ri3   N30、Y33和Q38
最后，产生ICreI突变体的文库并筛选具有新靶序列的ICreI衍生物。这些酶的进一步协同进化导致产生了对大鼠IgM外显子IV内的靶序列(CAACTGATCCTGAGGGAGTCGG)特异性的新大范围核酸酶。
锌指核酸酶的工程化
设计锌指蛋白(ZFP)以针对编码大鼠IgM的序列(外显子1-4)并按照所述的装配(Zhang，L.等，Synthetic zing fingertranscription factor action at an endogenous chromosomal site.Activation of the human erythropoietin gene，J.Biol.Chem275：33850-33860，2000；和Liu，P.Q.等，Regulation of anendogenous locus against a panel of designed zinc fingerproteins targeted to accessible chromatin regions，Activationof vascular endothelial growth factor.J Biol.Chem.2765：11323-11334，2001)来产生以下的ZFP部分。
Figure GPA00001014001000371
将编码ZFP的DNA克隆至表达载体中。从美国典型培养物保藏中心获得大鼠C6细胞并按照推荐的在补充5％胎牛血清(FCS，Hyclone)、15％马血清(Invitrogen)和5mM谷氨酰胺的F-12培养基(Invitrogen)中生长。使用TrypLE选择蛋白酶(Invitrogen)使细胞与塑料器皿分离。为了转染，将200,000个C6细胞与400ng质粒DNA和20μL Amaxa溶液SF混合。使用程序96FF-137，将细胞在Amaxa Nucleofector II Shuttle中转染，并回收到0.1L温热的补充的F-12培养基中。在转染后三天和九天，收集细胞并使用快速提取溶液1.0(Epicentre)制备染色体DNA。使用Accuprime高保真度DNA聚合酶(Invitrogen)对合适的IgM基因座区域进行PCR扩增。将PCR反应加热至94℃，然后逐渐冷却至室温。将大约200ng退火的DNA与0.33μL CEL-I酶(Transgenomic)混合并在42℃温育20分钟。通过在1×Tris-硼酸盐-EDTA缓冲液中的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析反应产物。图6中显示了证明切割活性的典型实例。
使用编码大范围核酸酶的表达质粒产生具有灭活的内源性重链基因座的大鼠
将编码大鼠Cμ外显子特异性的大范围核酸酶的cDNA序列克隆至表达载体中，其中表达通过四环素操纵子序列来控制。通过限制酶消化将质粒DNA线性化并纯化。将大鼠卵母细胞用来自具有编码四环素-应答性逆转录活化子的转基因的大鼠的精子受精。将纯化的质粒DNA注入该受精的大鼠卵母细胞的前核中。随后，将大鼠胚胎转移至代孕母体中并生产。使用分离自组织样品的DNA通过PCR分析新生儿中编码大范围核酸酶的转基因的存在。将雄性转基因建立者动物圈养四个月，直至其达到性成熟。通过每日给予强力霉素来诱导转基因动物中大范围核酸酶的表达，持续一至七天。随后，每周收集精子两次并通过PCR分析。将产生突变精子的雄性动物用于育种。通过组织样品的PCR分析来鉴定具有突变大鼠Cμ的后代。
通过用编码特异性大范围核酸酶的质粒DNA微注射受精卵母细胞产生具有灭活的内源性重链基因座的大鼠
将编码大鼠Cμ外显子特异性的大范围核酸酶的cDNA序列克隆至表达载体中，其中表达通过CAG-启动子来控制。将纯化的质粒DNA注入受精的大鼠卵母细胞的前核中。随后，将大鼠胚胎转移至代孕母体中并生产。通过PCR和直接测序分析新生儿中突变的IgM外显子的存在。或者，通过加热和冷却的PCR产物与CEL-I酶一起培养和随后的凝胶电泳来鉴定含有带有突变的IgM外显子的细胞的动物。

Claims (34)

1.生产具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞的方法，包括在生殖细胞、受精卵母细胞或胚胎中表达至少一个大范围核酸酶，以产生具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞，其中所述大范围核酸酶识别存在于或接近于所述内源性Ig基因座的大范围核酸酶靶序列。
2.生产含有至少一个种系失活的内源性Ig基因座的转基因动物的方法，包括从根据权利要求1的方法生产的具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞或其生殖细胞后代产生转基因动物，其中所述转基因动物选自禽类、啮齿动物和鼬鼠。
3.根据权利要求2的方法，其中所述具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞进一步含有人工Ig基因座，由此所述转基因动物含有人工Ig基因座。
4.根据权利要求2的方法，进一步包括将人工Ig基因座引入所述具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞，或其生殖细胞后代或从其产生的受精卵母细胞或胚胎中，由此所述转基因动物含有人工Ig基因座。
5.根据权利要求2的方法，其中所述从具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞产生转基因动物包括将所述活生殖细胞，或其生殖细胞后代与含有人工Ig基因座的配子结合，由此所述转基因动物含有人工Ig基因座。
6.根据权利要求3-5任一项的方法，其中所述人工Ig基因座含有(i)具有至少一个编码种系或超突变的人V-区氨基酸序列的人V基因区段的V区；(ii)一个或多个J基因区段；和(iii)一个或多个恒定区基因区段，其中所述人工Ig基因座是功能性的并且能够在源自所述生殖细胞的转基因动物中经历基因重排和产生一组人工免疫球蛋白。
7.根据权利要求5的方法，其中所述配子具有至少一个失活的内源性Ig基因座。
8.根据权利要求1的方法，其中所述大范围核酸酶靶序列存在于或接近于所述至少一个内源性Ig基因座内的J基因区段。
9.根据权利要求1的方法，其中所述大范围核酸酶靶序列存在于或接近于免疫球蛋白恒定区基因。
10.根据权利要求1的方法，进一步包括在所述生殖细胞、受精卵母细胞或胚胎中表达第二个大范围核酸酶，其中所述第二个大范围核酸酶识别存在于或接近于所述内源性Ig基因座的第二个大范围核酸酶靶序列。
11.根据权利要求1的方法，其中所述生殖细胞、受精卵母细胞或胚胎含有基因组大范围核酸酶构建体，该构建体含有可操作地连接所述大范围核酸酶编码核酸的诱导型表达控制区，并且其中通过诱导所述基因组大范围核酸酶表达构建体的表达在所述生殖细胞、受精卵母细胞或胚胎中表达所述大范围核酸酶。
12.根据权利要求11的方法，包括重复诱导所述基因组大范围核酸酶表达构建体表达的步骤。
13.根据权利要求11的方法，其中所述生殖细胞、受精卵母细胞或胚胎含有第二个基因组大范围核酸酶表达构建体，该构建体含有可操作地连接第二个大范围核酸酶编码核酸的第二个诱导型表达控制区，其中所述第二个编码的大范围核酸酶识别存在于所述内源性Ig基因座中的第二个大范围核酸酶靶序列，其中所述方法进一步包括诱导所述编码第二个大范围核酸酶的核酸在所述生殖细胞、受精卵母细胞或胚胎中表达。
14.通过根据权利要求1的方法生产的具有至少一个失活的内源性Ig基因座的活生殖细胞。
15.通过根据权利要求2的方法生产的转基因动物。
16.通过根据权利要求3-5任一项的方法生产的转基因动物。
17.根据权利要求15或16的转基因动物，其中所述转基因动物缺乏功能性的内源性Ig轻链基因座。
18.根据权利要求15或16的转基因动物，其中所述转基因动物缺乏功能性的内源性Ig重链基因座。
19.权利要求16的转基因动物，其中所述转基因动物能够产生具有人独特型的免疫球蛋白。
20.权利要求16的转基因动物，其中所述转基因动物缺乏功能性Ig轻链基因座并含有人工Ig重链基因座，并且其中所述转基因动物能够产生只有重链的抗体。
21.权利要求16的转基因动物，其中所述转基因动物含有至少一个Ig重链基因座，其具有至少一个C-区基因，该基因缺乏编码功能性CH1结构域的序列，并缺乏功能性Ig轻链基因座。
22.含有基因组大范围核酸酶表达构建体的转基因动物，其中所述构建体含有可操作地连接大范围核酸酶编码核酸的诱导型表达控制区，并且其中所述编码的大范围核酸酶识别存在于或接近于所述转基因动物的内源性Ig基因座的大范围核酸酶靶序列，其中所述转基因动物选自禽类、啮齿动物和鼬鼠。
23.权利要求22的转基因动物，其中所述转基因动物的基因组进一步含有至少一个人工Ig基因座。
24.生产抗体的方法，包括用免疫原免疫根据权利要求16的转基因动物。
25.通过权利要求24的方法生产的多克隆抗血清组合物。
26.生产单克隆抗体的方法，包括(i)用免疫原免疫根据权利要求16的转基因动物，(ii)从所述转基因动物分离单克隆抗体产生细胞，其中所述单克隆抗体产生细胞产生特异性结合所述免疫原的单克隆抗体；和(iii)使用所述单克隆抗体产生细胞来产生特异性结合所述免疫原的所述单克隆抗体，或使用所述单克隆抗体产生细胞来生产产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞，和使用所述杂交瘤细胞来生产所述单克隆抗体。
27.生产单克隆抗体的方法，包括(i)用免疫原免疫根据权利要求16的转基因动物，(ii)从所述转基因动物分离单克隆抗体产生细胞，其中所述单克隆抗体产生细胞产生特异性结合所述免疫原的单克隆抗体；(iii)从所述单克隆抗体产生细胞分离编码特异性结合所述免疫原的所述单克隆抗体的单克隆抗体核酸；和(iv)使用所述单克隆抗体核酸来生产特异性结合所述免疫原的所述单克隆抗体。
28.根据权利要求26或27的方法，其中所述单克隆抗体具有人独特型。
29.生产完全人单克隆抗体的方法，包括(i)用免疫原免疫根据权利要求16的转基因动物，(ii)从所述转基因动物分离单克隆抗体产生细胞，其中所述单克隆抗体产生细胞产生特异性结合所述免疫原的单克隆抗体；(iii)从所述单克隆抗体产生细胞分离编码特异性结合所述免疫原的所述单克隆抗体的单克隆抗体核酸；(iv)修饰所述单克隆抗体核酸来产生编码完全人单克隆抗体的重组核酸；和(v)使用所述编码完全人单克隆抗体的重组核酸来生产所编码的完全人单克隆抗体。
30.通过根据权利要求26、27或29任一项的方法生产的单克隆抗体。
31.中和人体组分中的抗原实体的方法，所述方法包括使所述身体部分与根据权利要求25的多克隆抗血清组合物接触，其中所述多克隆抗血清组合物含有特异性结合并中和所述抗原实体的免疫球蛋白分子。
32.中和人体组分中的抗原实体的方法，所述方法包括使所述身体部分与根据权利要求30的单克隆抗体接触，其中所述单克隆抗体特异性结合并中和所述抗原实体。
33.生产只有重链的抗体的方法，包括免疫根据权利要求20或21的转基因动物。
34.通过根据权利要求33的方法生产的只有重链的抗体。
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