JP6692343B2 - 薬物としての使用のための抗ｃｄ４５ｒｃ抗体 - Google Patents

Description

発明の分野：
本発明は、免疫療法の分野にある。特に、本発明は、ＣＤ４５ＲＣ^＋細胞と関連付けられる移植拒絶、自己免疫疾患、遺伝子治療の過程において発現されるタンパク質及び／又は治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答、アレルギーならびにリンパ腫又は癌を防止又は処置する際での使用のための単離された抗ＣＤ４５ＲＣ抗体に関する。

発明の背景：
種々の疾患の処置における１つのアプローチは、病原性白血球の排除又は不活性化、及び病理学的免疫応答を不活性化するための寛容の誘導についての可能性を達成することである。細胞、組織、又は臓器移植拒絶の防止及び自己免疫疾患の処置では、それぞれ免疫学的寛容の誘導又は回復のいずれかが要求される。全体的に、自己免疫障害に関連付けられる寛容の崩壊及び移植拒絶に関連付けられる同種移植片についての寛容の欠如は、主にＴ細胞媒介性免疫応答であると考えられる。

大半のヒト疾患において、モノクローナル抗体治療のための細胞標的の同定は重要な課題を表す。なぜなら、そのような治療はますます使用されており、移植において顕著な成功を収めているからである（１）。そのような新たな戦略は、また、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）の誘導に関連付けられる一般的な免疫抑制よりむしろ、特異的な免疫抑制を可能にする（１、２）。タンパク質ＣＤ４５は、造血細胞により発現される高度にグリコシル化された膜貫通型チロシンホスファターゼであり、Ｔ及びＢ細胞抗原受容体シグナル伝達の必須レギュレーターとして記載されている。ＣＤ４５の細胞質ドメインはＬｃｋ及びＪＡＫの活性を調節し、これらは、Ｔ細胞及びＢ細胞による抗原認識のシグナル伝達プロセスの必須成分である。エクソン４（Ａ）、エクソン５（Ｂ）、及びエクソン６（Ｃ）の選択的スプライシングにより生成されるＣＤ４５タンパク質のいくつかのアイソフォームがある（ＣＤ４５ ｍＲＮＡ中のエクソン４及び６の包含が厳密に調節されているのに対し、エクソン５の包含は確率論的に見える）。これらの異なる細胞外ドメインは、サイズ及び電荷において異なる（３、４）。個体は異なるレベルのＣＤ４５アイソフォームを発現し（５）、異なるＣＤ４５アイソフォームの機能は明らかではないが、これらのアイソフォームの差次的発現はＴ細胞の活性化レベルと関連付けられており、ナイーブＴ細胞対メモリＴ細胞の解離を可能にする （６）。重要なことに、アイソフォーム発現のこのパターンは種全体で高度に保存されており、その機能的役割及び重要性を強調する（７）。

ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、及びＣＤ４５ＲＣアイソフォームは主にナイーブ細胞により発現され、最も短いアイソフォームであるＣＤ４５ＲＯは、活性化／メモリＴ細胞により発現される。ＣＤ４５ＲＣ^＋細胞もＡ及びＢアイソフォームを発現するのに対し、ＣＤ４５ＲＣ⁻は発現しない（８）。ＣＤ４５ＲＯ活性化／メモリＴ細胞も復帰し、Ａ、Ｂ又はＣアイソフォームを再び発現することができる（８）。一般的に、ＣＤ４５Ｒ（即ち、Ａ、Ｂ、又はＣ）の高分子形態を伴うＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞は、ＡＢＣ（低及び変動）、ＡＢ、ＢＣ、Ｂ、及びＯエクソンについてのｍＲＮＡを発現した。ＣＤ４及びＣＤ８^＋Ｔ細胞ＣＤ４５ＲＯ^＋は、エクソンＢについて高レベルのメッセージを有し、二重エクソンＡＢ及びＢＣの変動発現を伴った（８）。

マウス及び霊長類において、ＣＤ４Ｔｒｅｇの集団をＣＤ４５ＲＢ^ｌｏｗとして定義することができることが示されている。抗ＣＤ４５ＲＢ抗体を用いたマウスの処置では、腎臓同種移植拒絶を防止及び逆転することができる（９、１０）。この抗体は、また、非肥満糖尿病マウスモデルにおいて糖尿病の発症を防止することが示された（１１）。２つの異なるＣＤ４５ＲＢ特異的ｍＡｂを比較すると、寛容誘導のために効果的であった抗体も最も効果的な末梢細胞枯渇能を示したことが見出されている（９）。また、免疫寛容原性ｍＡｂは、脾臓リンパ球膜上のチロシンホスファターゼ活性を刺激することができ、それにより、この抗体での可能な免疫調節能が示唆された。最後に、彼らは、ＣＤ４５ＲＢ ｍＡｂの機構が、アポトーシス細胞死の誘導又はシグナル伝達装置の調節不全のいずれかであり、エフェクター細胞機能の欠如、それに続く活性化誘導性細胞死を起こすことを記載した。

ＣＤ４５ＲＣが齧歯類及びヒトにおいて記載されている（１２）。齧歯類において、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方のＣＤ４５ＲＣ^＋が、移植拒絶及び臓器炎症を促進することが可能である強力なＴｈ１エフェクター細胞であることが示されており（１３、１４）、検出不能又は低レベルのＣＤ４５ＲＣを発現するＴ細胞は、Ｔｈ２及び調節性Ｔ細胞であり、同種移植拒絶、ＧＶＨＤ、及び細胞媒介性自己免疫疾患を阻害する（１５〜１７）。

ＣＤ４０Ｉｇ（ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を遮断することが可能な融合分子）を用いた処置によって、ラットにおける調節性ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＣ^{−／ｌｏｗ}Ｔ細胞の誘導を通じて、移植片の生存の不確定な延長が提供されることが最近示されている（１６、１８）。これらのＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＣ^{−／ｌｏｗ}Ｔｒｅｇ細胞だけがドミナントドナー特異的寛容を移入することができる。ＣＤ４０Ｉｇ処置動物からのＣＤ８^＋Ｔｒｅｇ細胞の寛容原性効果は、脾臓の移植内皮細胞及び樹状細胞（ＤＣ）によるＩＦＮγの産生及びインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の発現に依存していることも示されている（１６、１９、２０）。ヒトにおいて、ＣＤ４５ＲＣ^ｈｉｇｈＣＤ８Ｔ細胞における増加は、最近、移植片生存の減少と相関してきた（２１）。ヒトＣＤ４５ＲＣ^＋Ｔ細胞のサブセットが、ポリクローナル刺激後に異なるサイトカインプロファイルを示し、これらの細胞の頻度が、脈管炎を伴う患者において不均衡であることも示されている（５）。

国際特許出願ＷＯ ９８／１１９１８は、主に、上に記載する結果に対応する抗ＣＤ４５ＲＢ抗体（９、１１）及び、非常に簡潔に、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体を用いて得られた結果に基づく、免疫調節のためのＣＤ４５Ｒ白血球抗原に対する抗体の使用に関する。それにもかかわらず、前記出願では、抗ＣＤ４５ＲＣ抗体が、一般的な用語において、移植拒絶の防止及び／又は処置ならびに自己免疫疾患の処置において有用でありうることも示唆されている。しかし、予防的又は治療的効果はこの文書中では具体的に評価されていない。そのような疾患の提案された防止及び／又は治療は、このように、絶対的には裏付けられていない。

さらに、抗ブタＣＤ４５ＲＣ（ＩｇＭ、ＭＩＬ１５）は、抗ＣＤ４５及び抗ＣＤ４５ＲＡ Ａｂとの比較において、ヒトＰＢＭＣをブタＰＢＭＣとインキュベートしたＭＬＲアッセイにおいて、異種免疫応答を遮断する際に有効でないことも１５年後に結論付けられている（２５）。最も重要なことに、アイソタイプＩｇＭコントロール抗体は、このアッセイにおいて使用されておらず、このように、異種応答の小さな１５%阻害は、非特異的結合に起因しなければならず、抗ブタＣＤ４５ＲＣ（ＭＩＬ１５）抗体が、抗−ＣＤ４５（Ｋ２５２．ＩＥ４）及び抗ＣＤ４５ＲＡ（ＭＩＬ１３）抗体とは対照的に、免疫異種応答を調節せず、異種移植後にヒト抗ブタＴ細胞応答を調節するために使用することができなかったことを実証する。

したがって、その結果、今日まで、抗ＣＤ４５ＲＣ抗体、特に抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体の直接投与が、治療において、特に、それを必要とする患者において同種異系移植拒絶（例えばＧＶＨＤなど）を防止するために有用でありうることは、当業者に開示又はさらに示唆されてこなかった。

発明の概要：
第１の態様において、本発明は、薬物としての使用のための単離された抗ＣＤ４５ＲＣ抗体に関する。

第２の態様において、本発明は、それを必要とする患者において免疫寛容を誘導する際での使用のための、単離された抗ＣＤ４５ＲＣ抗体に関する。

第３の態様において、本発明は、それを必要とする患者において移植拒絶を防止又は低下する際での使用のための、単離された抗ＣＤ４５ＲＣ抗体に関する。

第４の態様において、本発明は、それを必要とする患者において、ＣＤ４５ＲＣ^＋細胞に関連付けられる自己免疫疾患、治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答、アレルギーリンパ腫、又は癌を防止又は処置する際での使用のための単離された抗ＣＤ４５ＲＣ抗体に関する。

第５の態様において、本発明は、単離された抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体及び医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬的組成物に関する。

第６の態様において、本発明は、単離された抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体及び免疫抑制薬を含む医薬的組成物又はキット・オブ・パーツ組成物に関する。

第７の態様において、本発明は、それを必要とする患者において、調節性Ｔ細胞を増殖及び／又は増強する際での使用のための単離された抗ＣＤ４５ＲＣ抗体に関する。

発明の詳細な説明
本発明者らは、寛容原性調節性Ｔ細胞を増加させながら、攻撃的なエフェクターＴ細胞又はＢ細胞を減少させる能力を有する抗体を提供する際、この必要性を満たす。

本発明は、実際に、移植寛容の誘導が抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体を用いた処置で得られるという発見に基づいている。したがって、本発明者らは、２．５日毎に１０〜２０日間投与した抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体（ＯＸ２２クローン）を使用してＣＤ４５ＲＣを発現する細胞集団を標的化し、ラット心臓移植モデルにおける同種移植片の生存のためのそのような戦略の効力及び利点を実証した。本発明者らは、短期抗ＣＤ４５ＲＣ抗体処置が、慢性拒絶の徴候を伴わず、エフェクターＴ細胞の阻害に関連付けられる持続的な同種移植片の生存、ならびに増加した活性の調節性Ｔ細胞の誘導をもたらすこと、及び、この寛容が二次照射されたレシピエントに移入することができることを示した。ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔｒｅｇの両方が寛容を移入した。さらに、本発明者らは、抗ドナー抗体応答が完全に阻害され、同族抗原に対する免疫応答は保存されていることを実証した。まとめると、本発明者らは、強力な能動寛容原性細胞機構を誘導することが可能である移植における新たな免疫抑制治療として、短期抗ＣＤ４５ＲＣ処置の可能性を初めて示した。

定義：
本明細書を通して、いくつかの用語が用いられ、以下の段落において定義される。

本明細書において使用する通り、用語「ＣＤ４５」（ＣＤ４５Ｒ又はＰＴＰＲＣとしても公知である）は、異なるアイソフォームで存在する膜貫通糖タンパク質を指す。ＣＤ４５のこれらの別個のアイソフォームは、ＣＤ４５細胞外領域の一部をコードする３つの可変エクソンの選択的スプライシングから生じるそれらの細胞外ドメイン構造において異なる（３）。ＣＤ４５の種々のアイソフォームは異なる細胞外ドメインを有するが、しかし、約３００残基の２つの相同な高度に保存されたホスファターゼドメインを有する同じ膜貫通及び細胞質セグメントを有する。

本明細書において使用する通り、用語「ＣＤ４５ＲＣ」は、当業者に周知の２００−２２０kDの単鎖Ｉ型膜糖タンパク質を指す（３）。それは、チロシンホスファターゼＣＤ４５のエクソン６スプライス変異体（エキソンＣ）である。ＣＤ４５ＲＣアイソフォームは、Ｂ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の大部分及びＣＤ４^＋Ｔ細胞のサブセットで発現するが、しかし、骨髄細胞では発現しない。ＣＤ４５及びそのアイソフォームは、Ｔリンパ球及びＢリンパ球上のリンパ球ホスファターゼ関連リンタンパク質（ＬＰＡＰ）と非共有結合的に会合する。ＣＤ４５は、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、及びＣＤ４を含むいくつかの他の細胞表面抗原と関連付けられることが報告されている。ＣＤ４５は、シグナル伝達リンパ球の活性化に含まれる。

一部のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、異なるアイソフォーム（抗ＣＤ４５Ｒ）の全てに共通するＣＤ４５の部分中のエピトープを認識するが、他のｍＡｂは制限された特異性を有し、選択的にスプライスされたエクソン（Ａ、Ｂ、又はＣ）に依存して認識する。例えば、エクソンＡの産物を認識するｍＡｂは、結果的に抗ＣＤ４５ＲＡと命名され、エクソンＢの産物を認識するｍＡｂは、結果的に抗ＣＤ４５ＲＢと命名され、エクソンＣの産物を認識するｍＡｂは、結果的に抗ＣＤ４５ＲＣと命名される。したがって、ＣＤ４５ＲＣに特異的に結合する抗体は、表Ａに列挙する通り、配列番号２により定義され、ヌクレオチド配列の配列番号１（エキソン６、アイソフォームＣ）によりコードされるポリペプチド配列に結合する：

「単離された抗体」は、本明細書において使用する通り、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体（例、ＣＤ４５ＲＣタンパク質に特異的に結合する単離抗体は、 ＣＤ４５ＲＣタンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を含まない）を指すことを意図する。ヒトＣＤ４５ＲＣタンパク質に特異的に結合する単離抗体は、しかし、他の抗原（例えば他の種からのＣＤ４５ＲＣタンパク質など）に交差反応性を有しうる。さらに、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まないこともできる。

本発明に従い、「抗体」又は「免疫グロブリン」は同じ意味を有し、本発明において等しく使用される。本明細書において使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（即ち、抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）を指す。そのようなものとして、用語「抗体」は、抗体分子全体だけでなく、抗体フラグメントならびに抗体及び抗体フラグメントの変異体（誘導体を含む）も包含する。天然抗体において、２つの重鎖が、ジスルフィド結合により互いに連結され、各々の重鎖は、ジスルフィド結合により軽鎖に連結される。軽鎖の２つの型、ラムダ（１）及びカッパ（ｋ）がある。抗体分子の機能活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（又はアイソタイプ）がある：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ。各々の鎖は、別個の配列ドメインを含む。軽鎖は２つのドメイン、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は４つのドメイン、可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３、集合的にＣＨとして言及される）を含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域によって、抗原への結合認識及び特異性が決定される。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、重要な生物学的特性、例えば抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動性、補体結合、及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合などを付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１つの軽鎖及び１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基の間での構造的相補性に存在する。抗体結合部位は、主に超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基で作製される。時には、非超可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）からの残基が、全体的なドメイン構造及び、故に、結合部位に影響する。相補性決定領域又はＣＤＲは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を一緒に定義するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は、各々、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３とそれぞれ命名される３つのＣＤＲを有する。抗原結合部位は、従って、重鎖及び軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列を指す。

本発明の文脈において、抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体は、好ましくは、ＩｇＧアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４など）を有する。

用語「Ｆａｂ」は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントを表示し、それにおいて、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分及びＬ鎖全体が、ＩｇＧをプロテアーゼ（パパイン）を用いて処理することにより得られたフラグメントの間で、ジスルフィド結合を通じて一緒に結合されている。用語「Ｆ（ａｂ’）２」は、約１００，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントを指し、それは、ＩｇＧをプロテアーゼ（ペプシン）を用いて処理することにより得られたフラグメントの間で、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたＦａｂよりもわずかに大きい。用語「Ｆａｂ’」は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントを指し、それは、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することにより得られる。一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドコードリンカーにより連結されたＶＨ及びＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合物から通常発現される、共有結合的に連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合により安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。二価及び多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖの会合により自発的に形成されることができる、又はペプチドリンカーにより一価ｓｃＦｖを共役することにより生成されることができる（例えば二価ｓｃ（Ｆｖ）２など）。用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を伴う小さな抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合し、２つの抗原結合部位を作るように強いられる。

ＣＤ４５ＲＣ表面マーカーに対して向けられた抗体は、例えば、とりわけ、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ科（ラクダ、ラムダ、ラマ）、及びマウスなどより選択された宿主動物に適当な抗原又はエピトープ（例えば配列番号２のペプチドなど）を投与することにより、公知の方法に従って産生することができる。当技術分野において公知の種々のアジュバントを使用し、抗体産生を増強することができる。本発明の実行において有用な抗体はポリクローナルでありうるが、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、培養中での連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して調製及び単離することができる。産生及び単離のための技術は、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶハイブリドーマ技術を含むが、これらに限定されない。あるいは、一本鎖抗体の産生について記載された技術（例、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）は、ＣＤ４５ＲＣ表面マーカーに対する一本鎖抗体を産生するように適合することができる。

本発明に従った有用な抗体は、また、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（インタクトな抗体分子のペプシン消化により生成することができる）及びＦａｂフラグメント（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントならびに上記のｓｃＦｖ及びｄｓＦｖのジスルフィド架橋を還元することにより生成することができる）を含むが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ及び／又はｓｃＦｖ発現ライブラリーを構築し、ＣＤ４５ＲＣ表面マーカーに対する所望の特異性を有するフラグメントの迅速な同定を可能にすることができる。本発明に従った有用な抗体は、これらのフラグメントから作製された異なる抗体フォーマット、特にキメラ化抗体又はヒト化抗体、多特異的抗体、及び／又は多価抗体のフォーマットも含む。本明細書において言及する「抗体フォーマット」は、抗原の型を特異的に認識する、ドメイン及び領域、例えば、ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ）からの重鎖単鎖抗体（ＶＨＨ）の可変ドメインなどの異なる組み合わせに対応する。

本発明により熟慮されるＣＤ４５ＲＣ抗原に結合する抗体の例は、マウスモノクローナル抗体ＯＸ−２２（抗ラットＣＤ４５ＲＣ）、ＯＸ−３２（抗ラットＣＤ４５ＲＣ）、ＭＴ２（抗ヒトＣＤ４５ＲＣ）、及びＲＰ１／１２（抗ラットＣＤ４５ＲＣ）を含む。

ＣＤ４５ＲＣに対して向けられたモノクローナル抗体は当業者に周知である（例えばSanta Cruz Biotechにより商品化されている抗体など）。本発明により熟慮されるＣＤ４５ＲＣ抗原に結合する抗体の例は、モノクローナル抗体ＯＸ−２２又はその誘導体などの抗体を含む。そのようなモノクローナル抗体は当業者に周知であり、Spickett et al. 1983において最初に記載されており、いくつかの企業により商品化されている。

一実施形態において、抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体は抗ヒトＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体である。本発明により熟慮されるヒトＣＤ４５ＲＣ抗原に結合する抗体の例は、モノクローナル抗体ＭＴ２又はその誘導体及びモノクローナル抗体ＲＰ１／１２又はその誘導体などの抗体を含む。そのようなモノクローナル抗体は当業者に周知であり、いくつかの企業により商品化されている。

表現「ＭＴ２の誘導体」は、ヒトＣＤ４５ＲＣに特異的に結合し、ＭＴ２の６つのＣＤＲを含む抗ＣＤ４５ＲＣ抗体を指す。

一実施形態において、ＭＴ２の誘導体は、ＭＴ２のＶＬ鎖及びＶＨ鎖を含む抗体である。

別の実施形態において、ＭＴ２の誘導体は、ＭＴ２の可変ドメインを含むキメラ抗体又はヒト化抗体である。

表現「ＲＰ１／１２の誘導体」は、ヒトＣＤ４５ＲＣに特異的に結合し、ＲＰ１／１２の６つのＣＤＲを含む抗ＣＤ４５ＲＣ抗体を指す。

一実施形態において、ＲＰ１／１２の誘導体は、ＲＰ１／１２のＶＬ鎖及びＶＨ鎖を含む抗体である。

別の実施形態において、ＲＰ１／１２の誘導体は、ＲＰ１／１２の可変ドメインを含むキメラ抗体又はヒト化抗体である。

用語「キメラ抗体」は、動物抗体、典型的にはマウス抗体の部分と、ヒト抗体の部分との遺伝子操作された融合体を指す。一般的に、キメラ抗体は、約３３%のマウスタンパク質及び６７%のヒトタンパク質を含む。動物抗体により誘発されたヒト抗動物抗体応答を低下させるために開発されたため、それらでは、動物抗体の特異性と、ヒト抗体の効率的なヒト免疫系相互作用を組み合わせている。

ヒト化抗体及びそれからの抗体フラグメントは、また、公知の技術に従って調製することができる。「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンから由来する最小配列を含む非ヒト（例、齧歯類）キメラ抗体の形態である。大半の場合について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲ）からの残基が、非ヒト種（ドナー抗体）（例えばマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類など）の超可変領域からの残基により置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中又はドナー抗体中に見出されない残基を含みうる。これらの改変は、抗体性能をさらに改良するために作製される。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの一部も含む。ヒト化抗体を作製するための方法は、例えば、Winter（米国特許第５，２２５，５３９号）及びBoss（Celltech、米国特許第４，８１６，３９７号）により記載されている。

本発明のヒトキメラ抗体は、以前に記載した通りにＶＬ及びＶＨドメインをコードする核酸配列を得て、それらを、ヒト抗体ＣＨ及びヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクター中に挿入することによりヒトキメラ抗体発現ベクターを構築し、発現ベクターを動物細胞中に導入することによりコード配列を発現させることにより産生することができる。ヒトキメラ抗体のＣＨドメインとして、それは、ヒト免疫グロブリンに属する任意の領域でよいが、ＩｇＧクラスのものが適切であり、ＩｇＧクラスに属するサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４など）のいずれか１つも使用することができる。また、ヒトキメラ抗体のＣＬとして、それは、Ｉｇに属する任意の領域でよく、カッパクラス又はラムダクラスのものを使用することができる。キメラ抗体を産生するための方法は従来の組換えＤＮＡを含み、遺伝子トランスフェクション技術は当技術分野において周知である（特許文献ＵＳ５，２０２，２３８及びＵＳ５，２０４，２４４を参照のこと）。

本発明のヒト化抗体は、以前に記載された通りにＣＤＲドメインをコードする核酸配列を得て、それらを（ｉ）ヒト抗体のものと同一の重鎖定常領域及び（ｉｉ）ヒト抗体のものと同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクター中に挿入することによりヒト化抗体発現ベクターを構築し、発現ベクターを動物細胞中に導入することにより遺伝子を発現させることにより産生されうる。ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子及び抗体軽鎖をコードする遺伝子が別々のベクター上に存在する型、又は、両者が同一ベクター上に存在する型（タンデムタイプ）のいずれかでありうる。ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易性、動物細胞中への導入の容易性、ならびに動物細胞における抗体Ｈ及びＬ鎖の発現レベルのバランスの点から、タンデム型のヒト化抗体発現ベクターが好ましい。タンデム型ヒト化抗体発現ベクターは、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８などを含む。

モノクローナル抗体のＣＤＲを同定するための方法は、当技術分野において周知である（Antibody Engineering: Methods and Protocols, 2004を参照のこと）。

別の実施形態において、ＭＴ２又はＲＰ１／１２抗体のアミノ酸配列改変も熟慮される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましいであろう。ヒト化抗体が、非ヒト動物から由来する抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲだけをヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲ中へ単に移植することにより産生された場合、その抗原結合活性は、 非ヒト動物から由来する本来の抗体のものとの比較において低下する。非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのいくつかのアミノ酸残基は、ＣＤＲ中だけでなくＦＲ中でも、抗原結合活性と直接的又は間接的に関連付けられると考えられる。故に、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲから由来する異なるアミノ酸残基を用いたこれらのアミノ酸残基の置換によって、結合活性が低下しうる。この問題を解決するために、ヒトＣＤＲを移植した抗体において、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列の間で、抗体への結合に直接的に関連付けられる、又はＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用する、又は抗体の三次元構造を維持し、抗原への結合に直接的に関連付けられるアミノ酸残基を同定する試みがなされなければならない。低下した抗原結合活性は、同定されたアミノ酸を、非ヒト動物から由来する本来の抗体のアミノ酸残基で置換することにより増加させることができうる。改変及び変化を、本発明の抗体及びそれらをコードするＤＮＡ配列の構造において作ってもよく、依然として望ましい特徴を有する抗体をコードする機能的分子を得ることができる。アミノ配列において変化を作る際、アミノ酸の疎水性指数を考慮してもよい。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際での疎水性アミノ酸指数の重要性は、当技術分野において一般的に理解されている。アミノ酸の相対的な疎水性の特徴は、結果として得られたタンパク質の二次構造に寄与し、それは、次に、タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定義することが受け入れられている。各々のアミノ酸は、それらの疎水性及び電荷特性に基づいて疎水性指数が割り当てられており、それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。

好ましい実施形態において、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。ヒトＣＤ４５ＲＣに対して向けられたそのような完全ヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりむしろ、ヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックマウス又はトランスクロモソームマウスを使用して生成することができる。これらのトランスジェニックマウス及びトランスクロモソームマウスは、本明細書においてそれぞれＨｕＭＡｂマウス（登録商標）及びＫＭマウス（登録商標）として言及するマウスを含み、本明細書において、まとめて「ヒトＩｇマウス」として言及する。

HuMAb Mouse（登録商標）（Medarex（登録商標））は、内因性のμ及びκ鎖遺伝子座を不活性化する標的変異と一緒に、再編成されていないヒト重鎖（μ及びγ）ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含む（Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859を参照のこと）。したがって、マウスはマウスＩｇＭ又はκの発現低下を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子はクラススイッチ及び体細胞変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧＫモノクローナル抗体を生成する（Lonberg et al. (1994), supra; reviewed in Lonberg (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101: Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93、及びHarding and Lonberg (1995) Ann. N Y. Acad. Sci. 764:536-546）。HuMAbマウス（登録商標）の調製及び使用、ならびにそのようなマウスにより保有されるゲノム改変は、Taylor et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen et al. (1993) International Immunology 5: 647-656；Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724；Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117-123；Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830；Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920；Taylor et al.(1994) International Immunology 6: 579-591；及びFishwild et al.(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851にさらに記載されており、これらの全ての内容は、その全体が参照により具体的に本明細書に組み入れられる。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，７８９，６５０号；第８７７，３９７号；第５，６６１，０１６号；第５，８１４，３１８号；第５，８７４，２９９号；第５，７７０，４２９号；及び第５，５４５，８０７号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／０３９１８；ＷＯ ９３／１２２２７；ＷＯ ９４／２５５８５；ＷＯ ９７／１３８５２；ＷＯ ９８／２４８８４；ＷＯ ９９／４５９６２及びＷＯ ０１／１４４２４を参照のこと。その内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

本発明の完全ヒト抗体は、導入遺伝子及びトランスコモソーム上にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウス（例えばヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖トランスクロモソームを保有するマウスなど）を使用して産生することもできる。このマウスは、本明細書において「ＫＭマウス」として言及され、ＰＣＴ公報ＷＯ ０２／４３４７８において詳細に記載されている。このマウスの改変形態は、内因性ＦｃγＲＩＩＢ受容体遺伝子のホモ接合破壊をさらに含み、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８でも記載されており、本明細書において「ＫＭ／ＦＣＧＲ２Ｄマウス（登録商標）」として言及される。また、ＨＣｏ７又はＨＣｏ２重鎖導入遺伝子のいずれか又は両方を伴うマウスを使用することができる。

追加のトランスジェニック動物の実施形態は、Xenomouse（Abgenix, Inc.、米国特許第５，９３９，５９８号；第６，０７５，１８１号；第６，１１４，５９８号；第６，１５０，５８４号及び第６，１６２，９６３号）を含む。さらなる実施形態は、「ＴＣマウス」（Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Set USA 97:722-727）及びヒト重鎖及び軽鎖トランスクロモソームを保有するウシ（Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894；ＰＣＴ公報ＷＯ ０２／０９２８１２）を含む。

さらに追加のトランスジェニック動物の実施形態は、OmniRat（商標）（OMT, Inc.、ＰＣＴ公報ＷＯ２００８／１５１０８１；Geurts et al. (2009) Science. Jul 24; 325(5939): 433及びMenoret at al. (2010) Eur J Immunol. Oct; 40(10): 2932-41）を含む。これらの特許及び刊行物の内容は、その全体が参照により具体的に本明細書に組み入れられる。

一実施形態において、抗ＣＤ４５ＲＣ抗体は、その結合部位についてインビボでＣＤ４５ＲＣと競合することにより免疫応答を調節する抗体である。

そのような抗ＣＤ４５ＲＣ調節抗体は、抗体フラグメント及びこれらのフラグメントから作製された異なる抗体フォーマット、特にキメラ化抗体もしくはヒト化抗体、多特異性抗体、及び／又は多価抗体のフォーマットを含む。

別の実施形態において、抗ＣＤ４５ＲＣ抗体はＣＤ４５ＲＣ^＋細胞枯渇抗体である。

本明細書において使用する通り、用語「ＣＤ４５ＲＣ^＋細胞枯渇抗体」は、それらが前記細胞表面マーカーに結合する場合、ＣＤ４５ＲＣ^＋細胞（好ましくはＣＤ４５ＲＣ）の表面上のＣＤ４５ＲＣ^＋細胞表面マーカーに結合し、それらの破壊又は枯渇を媒介する（即ち、それを用いて処置された患者において循環ＣＤ４５ＲＣ^＋Ｔ細胞レベルを低下させる）抗体として定義される。そのような枯渇は、種々の機構、例えば抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、ＣＤ４５ＲＣ^＋細胞増殖の阻害及び／又はＣＤ４５ＲＣ^＋細胞死の誘導（例、アポトーシスを介した）などを介して達成されうる。ＣＤ４５ＲＣ^＋細胞を枯渇させる抗体、より好ましくは、抗ＣＤ４５ＲＣ抗体は、場合により、細胞傷害剤と共役又は融合させる。この用語は、抗体フラグメント及びこれらのフラグメントから作製された異なる抗体フォーマット、特にキメラ化抗体又はヒト化抗体、多特異的抗体、及び／又は多価抗体のフォーマットを含む。本発明において言及する「抗体フォーマット」は、抗原の型を特異的に認識する、ドメイン及び領域、例えば、ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ）からの重鎖単鎖抗体（ＶＨＨ）の可変ドメインなどの異なる組み合わせに対応する。

本明細書において使用する通り、用語「ＣＤ４５ＲＣ^＋細胞表面マーカー」又は「ＣＤ４５ＲＣ^＋細胞抗原」は、それに結合する抗ＣＤ４５ＲＣ薬剤（例えば抗体又はアプタマーなど）を用いて標的化することができるＣＤ４５ＲＣ^＋細胞（Ｔ細胞及びＢ細胞を含む）の表面上に発現される抗原を指す。例示的なＣＤ４５ＲＣ^＋Ｔ細胞表面マーカーは、以前に記載した通りのＣＤ４５ＲＣ又は前記Ｔ細胞の集団を特徴付ける他の抗原を含むが、これらに限定されない。特定の目的のＣＤ４５ＲＣ^＋Ｔ細胞表面マーカーは、哺乳動物の他の非ＣＤ４５ＲＣ^＋Ｔ細胞と比較して、ＣＤ４５ＲＣ^＋Ｔ細胞上に優先的に発現される。

次に、上に記載する通りのＣＤ４５ＲＣ細胞表面マーカーに対して向けられた抗体を産生した後、当業者は、ＣＤ４５ＲＣ^＋細胞を枯渇させるもの、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、ＣＤ４５ＲＣ^＋細胞増殖の阻害、又はＣＤ４５ＲＣ^＋細胞死の誘導（例、アポトーシスを介した）を介してＣＤ４５ＲＣ^＋細胞を枯渇させる抗体を容易に選択することができる。

用語「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、特定の細胞傷害性細胞（例、ＮＫ細胞、好中球、単球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合した分泌抗体によって、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合することが可能になり、その後に標的細胞を死滅させる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロＡＤＣＣアッセイ（例えば米国特許第５，５００，３６２号又は第５，８２１，３３７号に記載されているものなど）を実施してもよい。

用語「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）は、補体の存在における標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化は、それらの同族抗原に結合している抗体への補体系の第１成分の結合により開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ（例、Gazzano-Santoro et al. (1997)において記載される通り）を実施してもよい。

特定の実施形態において、抗ＣＤ４５ＲＣ抗体は、細胞傷害剤又は増殖阻害剤に共役されたＣＤ４５ＲＣ表面マーカーに対して向けられた抗体でありうる。

したがって、本発明では、細胞傷害剤又は増殖阻害剤に共役されたＣＤ４５ＲＣ表面マーカーに対する抗体を含む免疫複合体の使用が熟慮される。「成長阻害剤」は、本明細書において使用する場合、インビトロ又はインビボのいずれかで細胞、特にＣＤ４５ＲＣ^＋細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を指す。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を遮断する薬剤（例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘導する薬剤など）を含む。古典的なＭ期遮断剤は、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンなど）を含む。Ｇ１を停止させる薬剤はＳ期停止中にも溢流する（例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、及び５−フルオロウラシルなど）。本明細書において使用する用語「細胞傷害剤」は、細胞の機能を阻害又は防止し、ならびに／あるいは細胞の破壊を起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^ｌ８６、Ｒｅ^ｌ８８、Ｓｍ^ｌ５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びそれらのフラグメント（例えば核酸分解酵素など）、抗生物質、及び毒素（例えば小分子毒素又は細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素活性毒素など）（それらのフラグメント及び／又は変異体（例、ゲロニン、リシン、サポリン、及び以下に開示する種々の抗腫瘍剤又は抗癌剤）を含む）を含むことを意図する。

本発明の抗体と細胞傷害性薬剤又は成長阻害剤との共役は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤（Ｎ−スクシンイミジル（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン‐１‐カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばアジピン酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒドなど）、ビス‐アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル） ヘキサンジアミンなど）、ビス‐ジアゾニウム誘導体（例えばビス‐（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）‐エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（例えばトリエン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を含むが、これらに限定されない）を使用して作製してもよい。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al. (1987)において記載されている通りに調製することができる。炭素標識１−イソチオシアナトベンジルメチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射ヌクレオチドの共役のための例示的なキレート剤である（ＷＯ ９４／１１０２６）。

治療方法及び使用：
本発明は、それを必要とする患者において免疫寛容を誘導する際での使用のための方法及び組成物（医薬的組成物など）を提供する。

本発明は、また、それを必要とする患者において移植拒絶を防止又は低下する際での使用のための方法及び組成物を提供する。

本発明は、さらに、その患者においてＣＤ４５ＲＣ^＋細胞に関連付けられる自己免疫疾患、治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答、アレルギー及びリンパ腫又は癌を防止又は処置する際での使用のための方法及び組成物を提供する。

第１の態様において、本発明は、薬物としての使用のための単離された抗ＣＤ４５ＲＣ抗体に関する。

特定の実施形態において、抗ＣＤ４５ＲＣ抗体は、抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体、特に上に記載する抗ヒトＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体である。

第２の態様において、本発明は、それを必要とする患者において免疫寛容を誘導する際での使用のための単離された抗ＣＤ４５ＲＣ抗体に関する。

特定の実施形態において、抗ＣＤ４５ＲＣ抗体は、抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体、特に上に記載する抗ヒトＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体である。

本明細書において使用する通り、用語「免疫寛容」は、他の物質又は組織に対する免疫応答を保存しながら、免疫応答を誘発する能力を有する特定の物質又は組織への免疫系の無反応状態を指す。

本明細書において使用する通り、用語「免疫応答」は、Ｔ細胞媒介性免疫応答及び／又はＢ細胞媒介性免疫応答を含む。例示的な免疫応答は、Ｔ細胞応答（例、サイトカイン産生及び細胞傷害性）を含み、また、用語「免疫応答」は、Ｔ細胞活性化、例えば、抗体産生（体液性応答）及びサイトカイン応答性細胞（例、マクロファージ）の活性化により間接的に影響される免疫応答を含む。免疫応答に含まれる免疫細胞は、リンパ球、例えばＢ細胞及びＴ細胞（ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋、Ｔｈ１、及びＴｈ２細胞）など；抗原提示細胞（例、専門抗原提示細胞、例えば樹状細胞など）；ナチュラルキラー細胞；骨髄細胞、例えばマクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球、及び顆粒球などを含む。

別の態様において、本発明は、それを必要とする患者において調節性Ｔ細胞を増殖及び／又は増強する際での使用のための単離された抗ＣＤ４５ＲＣ抗体に関する。

本明細書中において使用する通り、用語「調節性Ｔ細胞」（Ｔｒｅｇ）は、異常な又は過剰の免疫応答を抑制し、免疫寛容において役割を果たすＴ細胞を指す。調節性Ｔ細胞は、典型的には、「フォークヘッドボックスＰ３（Ｆｏｘｐ３^＋）調節性Ｔ細胞」及び「ＣＤ４５ＲＣ^ｌｏｗ細胞」である。本明細書において使用する通り、用語「フォークヘッドボックスＰ３（Ｆｏｘｐ３^＋）調節性Ｔ細胞」又は「Ｆｏｘｐ３^＋Ｔｒｅｇ細胞」は、その特徴的なマーカーが転写因子Ｆｏｘｐ３である、ヒト及び齧歯類（ラット又はマウス）におけるＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の２〜１０%を指す。

本明細書において使用する通り、用語「増殖する」は、所与の細胞集団（例、免疫細胞、例えばＴｒｅｇ細胞など）を変換及び／又は増幅させるプロセスを指す。

本明細書において使用する通り、用語「増強する」は、所与の細胞集団の機能を増加させるプロセス（例、以下の実施例のセクションにおいて詳述するＴｒｅｇ細胞の抑制能力を増加させるプロセス）を指す。

一実施形態において、前記Ｔｒｅｇ細胞はＦｏｘｐ３^＋及び／又はＣＤ４５ＲＣ^ｌｏｗＴｒｅｇ細胞である。

第３の態様において、本発明は、それを必要とする患者において移植拒絶を防止又は低下する際での使用のための単離された抗ＣＤ４５ＲＣ抗体に関する。

特定の実施形態において、抗ＣＤ４５ＲＣ抗体は、抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体、特に上に記載する抗ヒトＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体である。

本明細書において使用する通り、用語「移植拒絶を防止又は低下させる」は、免疫移植拒絶の防止又は阻害、ならびに免疫移植拒絶の発症又は進行を遅延させることを包含することを意味する。この用語は、また、患者において移植片の生存を延長させること、又は患者において移植の失敗を逆転させることを包含することを意味する。さらに、この用語は、免疫移植拒絶の症状を寛解させること（例えば、免疫拒絶に関連付けられる免疫学的合併症、例えば、間質性線維症、慢性移植片動脈硬化症、又は血管炎などを寛解させることを含む）を包含することを意味する。

本明細書において使用する通り、用語「移植拒絶」は、急性及び慢性移植拒絶の両方を包含する。「急性拒絶」は、移植組織が免疫学的に異物である場合での、組織移植レシピエントの免疫系による拒絶である。急性拒絶は、レシピエントの免疫細胞による移植組織の浸潤により特徴付けられ、それによって、そのエフェクター機能が行われ、移植組織が破壊される。急性拒絶の発症は迅速であり、一般的に、移植手術後の数週間以内にヒトにおいて生じる。一般的に、急性拒絶は、免疫抑制薬（例えばラパマイシン、シクロスポリン、抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体など）を用いて阻害又は抑制することができる。「慢性拒絶」は、一般的に、急性拒絶の成功した免疫抑制の存在においてでさえ、移植後の数ヶ月〜数年以内にヒトにおいて生じる。線維症は、全ての型の臓器移植片の慢性拒絶における共通因子である。

用語「移植」及びそのバリエーションは、移植が同系（ドナー及びレシピエントが遺伝的に同一である場合）、同種異系（ドナー及びレシピエントが異なる遺伝的起源であるが、しかし、同じ種である場合）、又は異種（ドナー及びレシピエントが異なる種からである場合）を問わず、レシピエント中への移植片（グラフトとも呼ぶ）の挿入を指す。このように、典型的なシナリオにおいて宿主はヒトであり、移植片は、同じ又は異なる遺伝的起源のヒトから由来する同種移植片である。別のシナリオにおいて、移植片は、移植された種とは異なる種（系統学的に広く分けられた種からの動物を含む）から由来する（例えば、ヒト宿主中に移植されたヒヒの心臓）。

特定の実施形態において、移植拒絶は同種異系移植拒絶である。したがって、一実施形態において、移植片のドナーはヒトである。移植片のドナーは、生きたドナー又は死んだドナー（すなわち、死体ドナー）でありうる。

一実施形態において、移植片は臓器、組織、又は細胞である。

本明細書において使用する通り、用語「臓器」は、生物内で特定の機能又は機能を実施する固体血管新生臓器を指す。用語「臓器」は、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、皮膚、子宮、骨、軟骨、小腸又は大腸、膀胱、脳、乳房、血管、食道、ファロピウス管、胆嚢、卵巣、膵臓、前立腺、胎盤、脊髄、四肢（上肢及び下肢を含む）、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿管、尿道、子宮を含むが、これらに限定されない。本明細書において使用する通り、用語「組織」は、ヒト又は動物における任意の型の組織を指し、血管組織、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、神経組織、泌尿生殖器組織、胃腸組織、結合組織（腱及び靭帯を含む）、羊膜組織、絨毛組織、硬膜、心膜、筋肉組織、腺組織、顔面組織、眼組織を含むが、これらに限定されない。

本発明の特定の実施形態において、移植片は心臓同種移植片である。

本明細書において使用する通り、用語「細胞」は、目的の細胞について濃縮された組成物、好ましくは前記細胞の少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、さらにより好ましくは少なくとも６５%を含む組成物を指す。

特定の実施形態において、細胞は、骨髄、末梢血、又は臍帯血から由来する多分化能造血幹細胞；又は異なる細胞系統（例えば心筋細胞、ベータ−膵臓細胞、肝細胞、ニューロンなど）の多能性（即ち、胚性幹細胞 （ＥＳ）又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ））もしくは多分化能幹細胞由来の分化細胞からなる群より選択される。

一実施形態において、細胞組成物は、同種異系造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）のために使用され、このように、通常は骨髄、末梢血、又は臍帯血から由来する多分化能造血幹細胞を含む。

ＨＳＣＴは、白血病及びリンパ腫を伴う患者のために治癒的でありうる。しかし、同種異系ＨＣＴの重要な限界は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発生であり、それは、この治療を受けるヒトの約３０〜５０%において重度の形態で生じる。

本発明の抗体は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を防止又は低下させる際に有用である。

したがって、一実施形態において、それを必要とする患者は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）／骨髄増殖性症候群；リンパ腫（例えばホジキン及び非ホジキンリンパ腫など）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及び多発性骨髄腫からなる群より選択される疾患に罹患している。

別の態様において、本発明は、ＣＤ４５ＲＣ^＋細胞に関連付けられる自己免疫疾患、遺伝子療法の過程で発現されるタンパク質又は治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答、アレルギー及びリンパ腫又は癌をその患者において防止又は処置する際での使用のための単離された抗ＣＤ４５ＲＣ抗体に関する。

特定の実施形態において、抗ＣＤ４５ＲＣ抗体は、上に記載する通りの抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体である。

本明細書において使用する通り、用語「防止する」、「防止する」、及び「防止」は、個体が所定の期間にわたって疾患、障害又は状態の症状を発症する機会を低下させるための、疾患、障害、又は状態の少なくとも１つの症状を最終的に発現しうるが、しかし、まだそのようになっていない個体への治療の投与を指す。そのような低下は、例えば、患者における疾患、障害、又は状態の少なくとも１つの症状の遅延した発症において反映されうる。

本明細書において使用する通り、用語「処置する」、「処置すること」、又は「処置」は、患者の疾患、欠陥、障害、又は有害な状態の症状の頻度及び／又は重症度を低下させる試みにおける個体への治療の投与を指す。

本明細書において使用する通り、用語「自己免疫疾患」は、免疫系が、正常な宿主の一部である抗原（すなわち自己抗原）に対する免疫応答（例えば、Ｂ細胞又はＴ細胞応答）を産生する疾患を指し、結果としての組織損傷を伴う。自己免疫疾患において、宿主の免疫系は特定の抗原を「自己」として認識せず、免疫反応が、抗原を発現する宿主の組織に対して開始される。

ヒトに影響を与える例示的な自己免疫疾患は、関節リウマチ、若年性少関節炎、コラーゲン誘導性関節炎、アジュバント誘導性関節炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、実験的な自己免疫性脳脊髄炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎）、自己免疫性胃萎縮症、尋常性天疱瘡、乾癬、白斑、１型糖尿病、非肥満糖尿病、重症筋無力症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性唾液腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、アジソン病、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、後天性血友病、血栓性血小板減少性紫斑病などを含む。

本明細書において使用する通り、用語「治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答」は、遺伝子治療の過程で発現されるタンパク質、及び／又は治療用タンパク質、例えば第ＶＩＩＩ因子（血友病Ａ）など及び他の凝固因子、酵素補充療法、モノクローナル抗体（例、ナタリズマブ、リツキシマブ、インフリキシマブ）、ポリクローナル抗体、酵素又はサイトカイン（例、ＩＦＮβ）に向けられた任意の望ましくない免疫反応を指す。

例えば、このアプローチを実際に適用し、免疫応答を抑制する、特に対応する遺伝子欠損を伴う個体において遺伝子治療によりそれらの発現が回復した場合、特定のタンパク質への免疫反応を防止することができる。このように、本発明に従った単離された抗ＣＤ４５ＲＣ抗体を使用し、遺伝子治療によりその再構成を達成しつつ、変異のために患者に通常存在しないタンパク質に対する免疫反応性を防止してもよい。

さらに、タンパク質治療は、より広範になりつつある医療用イノベーションの領域であり、患者への治療用産物としてタンパク質（例えば酵素、抗体、又はサイトカインなど）の直接的な適用を含む。そのような医薬の送達における主要な障害の１つは、治療用タンパク質それ自体に対して向けられた免疫応答を含む。タンパク質ベースの治療薬の投与は、しばしば、免疫抑制薬の投与を伴い、それは、タンパク質のより長い寿命、従って、生物の細胞及び組織中へのタンパク質の取り込み増加を促進するために使用される。一般的な免疫抑制薬は、しかし、行われる免疫抑制の非特異的性質のために不利であり、患者において望ましくない副作用をもたらしうる。従って、このアプローチを適用し、治療用タンパク質及びペプチド、例えば治療用抗体、サイトカイン、酵素、又は患者に投与される他のタンパク質などに対する免疫応答を抑制することができる。

本明細書において使用する通り、用語「アレルギー」又は「アレルギー」は、免疫系の障害（又は不適切な反応）を指す。アレルギー反応は、アレルゲンとして公知である通常は無害な環境物質に対して生じる。これらの反応は獲得され、予測可能であり、迅速である。厳密には、アレルギーは、過敏症の４つの形態のうちの１つであり、Ｉ型（又は即時型）過敏症と呼ばれる。それは、ＩｇＥとして公知の型の抗体による肥満細胞及び好塩基球と呼ばれる特定の白血球の過剰な活性化により特徴付けられ、極度の炎症反応をもたらす。一般のアレルギー反応は、湿疹、蕁麻疹、枯草熱、喘息、食物アレルギー、及び刺咬昆虫（例えばスズメバチ及びミツバチなど）の毒液に対する反応を含む。

医薬的組成物
本発明は、また、本発明の単離された抗ＣＤ４５ＲＣ抗体（例えば抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体など）を含む医薬的組成物に関する。

一実施形態において、医薬的組成物は、単離された抗ヒトＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体を含む。

特定の一実施形態において、医薬的組成物は、ＭＴ２又はその誘導体、ＲＰ１／１２又はその誘導体、及び医薬的に許容可能な賦形剤からなる群より選択される単離された抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体を含む。

従って、本発明の抗体は、医薬的に許容可能な賦形剤、及び、場合により徐放性マトリックス（例えば生分解性ポリマーなど）と組み合わせて治療組成物を形成することができる。「医薬的に」又は「医薬的に許容可能な」は、哺乳動物、特にヒトに適宜投与された場合、有害な、アレルギー性の、又は他の都合悪い反応を産生しない分子実体及び組成物を指す。医薬的に許容可能な担体又は賦形剤は、任意の型の非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料又は製剤補助剤を指す。医薬的組成物の形態、投与経路、投与量、及び投与計画は、処置すべき状態、病気の重症度、患者の年齢、体重、及び性別などに自然に依存する。本発明の医薬的組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、又は眼内投与などのために製剤化することができる。

好ましくは、医薬的組成物は、注射することが可能な製剤のための医薬的に許容可能な溶媒を含む。これらは、特に、場合に依存して、滅菌水又は生理食塩水の添加時に、注射可能な溶液の構成を可能にする、等張性の滅菌生理食塩水（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、もしくは塩化マグネシウムなど、又はそれらの塩の混合物）又は乾燥した、特に凍結乾燥した組成物でありうる。投与のために使用される用量は、種々のパラメーターの関数として、特に、使用される投与様式、関連病理、又は、所望の処置期間の関数として適合させることができる。医薬的組成物を調製するために、有効量の抗体を、医薬的に許容可能な担体又は水性媒体中に溶解又は分散させてもよい。注射可能な使用のために適切な医薬的形態は、滅菌水溶液又は分散液；製剤（ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む）；及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、簡単な注射可能性が存在する範囲で流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば細菌及び真菌など）の汚染作用に対して保存されなければならない。

投与される投与量は、個々の必要性、所望の効果、及び選択された投与経路に依存する。投与される投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康、及び体重、同時処置（仮にある場合）、処置の頻度、及び所望の効果の性質に依存することが理解されている。各々の処置のために要求される総投与量は、複数回投与又は単回投与により投与してもよい。

投与のために使用される用量は、種々のパラメーターの関数として、特に、使用される投与様式、関連病理、又は所望の処置期間の関数として適合させることができる。例えば、所望の治療効果を達成するために要求されるレベルよりも低いレベルで抗体の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは、当業者の十分に範囲内である。しかし、抗体の１日投与量は、０．０１〜１０００mg/成人/日の広い範囲にわたり変動しうる。好ましくは、組成物は、処置される被験体への投与量の症候調節のために０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０、及び５００mgの活性成分を含む。医薬は、典型的には、約０．０１mg〜約５００mgの活性成分、好ましくは約１mg〜約１００mgの活性成分を含む。薬物の有効量は、通常、０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重/日、特に約０．００１mg/kg〜１０mg/kg体重/日の投与量レベルで供給される。

本発明の医薬的組成物は免疫抑制薬をさらに含んでもよい。

一実施形態において、免疫抑制薬は、細胞増殖抑制剤、例えばラパマイシン（ｍＴＯＲ）阻害剤及びラパマイシン（シロリムス）の哺乳動物の標的など；アルキル化剤（シクロホスファミド）及び代謝拮抗物質（アザチオプリン、メルカプトプリン、及びメトトレキサート）；治療用抗体（例えば抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体、抗ＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）、及び抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）など）；カルシニューリン阻害剤（シクロスポリン）；グルココルチコイド及びミコフェノール酸モフェチルからなる群より選択される。

本発明は、寛容のインビボ誘導の方法に関する。この方法は、移植された臓器、組織、又は細胞の拒絶を防止するための前処置のインビボ治療及び免疫応答を逆転させるための移植後のインビボ治療を含む。

本発明は、治療有効量の抗ＣＤ４５ＲＣ抗体（例えば抗ＣＤ４５Ｒモノクローナル抗体など）を患者に投与する工程を含む、それを必要とする患者において免疫寛容を誘導するための方法に関する。

本発明は、治療有効量の抗ＣＤ４５ＲＣ抗体（例えば抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体など）を患者に投与する工程を含む、それを必要とする患者において調節性Ｔ細胞を増殖及び／又は増強するための方法に関する。

本発明は、また、治療有効量の抗ＣＤ４５ＲＣ抗体（例えば抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体など）を患者に、移植の前に及び／又は同時に及び／又はその後に投与する工程を含む、それを必要とする患者において移植拒絶を防止又は低下するための方法に関する。

特定の実施形態において、移植拒絶は同種異系移植拒絶である。

本発明は、また、治療有効量の抗ＣＤ４５ＲＣ抗体（例えば抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体）を患者に、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の前に及び／又は同時に及び／又はその後に投与する工程を含む、それを必要とする患者においてＧＶＨＤを防止又は低下するための方法に関する。

本明細書中で使用される場合、「前に」という用語は、移植前に、例えば移植の２０、１５、１０、５日前に、目的の抗体がレシピエント患者に投与されることを意味する。

本明細書中で使用される場合、「同時に」という用語は、目的の抗体が移植と同じ日にレシピエント患者に投与されることを意味する。

本明細書において使用する通り、用語「その後に」は、目的の抗体が、移植後、例えば移植後２、３、４、５、６、又は７日目に、レシピエント患者に投与されることを意味する。

本発明は、また、移植された患者（レシピエント）における移植片の生存を改善するための方法に関し、前記方法は、前記患者に、治療有効量の抗ＣＤ４５ＲＣ抗体（例えば抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体など）を投与する工程を含む。

本発明は、また、それを必要とする患者においてＧＶＨＤを防止又は低下するための方法に関し、（ａ）治療有効量の抗ＣＤ４５ＲＣ抗体を用いて同種異系造血幹細胞（又は造血幹細胞移植片）を前処理する；及び（ｂ）工程（ａ）で得られた前処理された同種異系造血幹細胞を、それを必要とする患者に投与する工程を含む。

したがって、本発明は、また、抗ＣＤ４５ＲＣ抗体を用いて処理した同種異系造血幹細胞（又は造血幹細胞移植片）の集団に関する。

本発明は、また、ＣＤ４５ＲＣ^＋細胞に関連付けられる自己免疫疾患、治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答、アレルギー、及びリンパ腫又は癌を、それを必要とする患者において防止又は処置する方法に関し、前記患者に治療有効量の抗ＣＤ４５ＲＣ抗体（例えば抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体など）を投与する工程を含む。

「治療有効量」により、処置される疾患を防止、処置、又は緩徐化することが可能な抗体の濃度を達成するために十分な量を意味する。そのような濃度は、当業者により日常的に決定されることができる。実際に投与されるポリペプチドの量は、典型的には、関連する状況（処置される状態、選択された投与経路、投与される実際の化合物、患者の年齢、体重、及び応答、被験体の症状の重症度などを含む）に照らして医師又は獣医により決定される。投与量は、投与されるポリペプチドの安定性に依存しうることも当業者により理解されるであろう。

一実施形態において、抗ＣＤ４５ＲＣ抗体（例えば抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体など）を用いた処置は、１を上回るサイクルで投与され、即ち、抗ＣＤ４５ＲＣ抗体（例えば抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体など）の投与は、 少なくとも１回繰り返される。

例えば、２〜１０サイクル又はそれ以上を、特定の患者の状態及び応答に依存して投与してもよい。間隔、即ち、２つのその後のサイクルの開始間の時間は、典型的には数日間である。

キット・オブ・パーツ組成物：
抗ＣＤ４５ＲＣ抗体（例えば抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体など）及び免疫抑制薬を１つの製剤内で組み合わせ、同時に投与することができる。しかし、それらは、別々の組成物を使用して別々に投与してもよい。それらは、異なる時間に投与してもよいことにさらに注意する。

本発明は、このように、単離された抗ＣＤ４５ＲＣ抗体及び免疫抑制薬を含むキット・オブ・パーツ組成物に関する。

本発明は、また、それを必要とする患者において移植拒絶を防止又は低下させる際での使用のための抗ＣＤ４５ＲＣ抗体及び免疫抑制薬を含むキット・オブ・パーツ組成物に関する。

特定の実施形態において、移植拒絶は同種異系移植拒絶である。

本発明は、さらに、それを必要とする患者において、ＣＤ４５ＲＣ^＋細胞に関連付けられる自己免疫疾患、同種免疫応答、アレルギー及びリンパ腫又は癌を防止又は処置する際での使用のための、抗ＣＤ４５ＲＣ抗体及び免疫抑制薬を含むキット・オブ・パーツ組成物に関する。

用語「キット」、「産物」、又は「組み合わせ調製物」は、本明細書において使用する通り、上で定義された組み合せパートナーが、独立して、又は異なる量の組み合わせパートナーとの異なる固定された組み合わせの使用により（即ち、同時に又は異なる時点で）投与することができるという意味において「キット・オブ・パーツ」を特に定義する。キット・オブ・パーツのパーツは、例えば、同時に又は時間的にずらして、すなわち、キット・オブ・パーツの任意のパーツについて異なる時間点で、等しい又は異なる時間間隔で投与することができる。組み合せ調製物中に投与される組み合せパートナーの総量の比率は変えることができる。組み合わせパートナーは、同じ経路又は異なる経路により投与することができる。投与が連続的である場合、第１のパートナーは、例えば、第２のパートナーの１、２、３、４、５、６、７日前に投与されうる。

本発明を、以下の図面及び実施例によりさらに例証する。しかし、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。

抗ＣＤ４５ＲＣ短期処置後の寛容誘導。レシピエントは、処置されていない（ｎ＝９）、又はＬＥＷ．１Ｗ／ＬＥＷ．１Ａ株の組み合わせで５日間（ｎ＝３）、１０日間（ｎ＝３）、もしくは２０日間（ｎ＝３）処置された、又は処置されていない、あるいは、処置されていない（ｎ＝４）、又はＬＥＷ．１Ａ／ＬＥＷ．１Ｗ株の組み合わせで２０日間処置された。抗ＣＤ４５ＲＣ ｍＡｂ（ＯＸ２２）を０．８mg/kg/注射で静脈内投与した。＊＊未処置に対してｐ＜０．０１。 １０日間の抗ＣＤ４５ＲＣ処置の間及びその後の血液中のリンパ球表現型解析。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ４５ＲＣ処置レシピエントから０日目、４日目、及び１０日目に回収し、亜集団の絶対数についてフローサイトメトリーにより分析した。 調節性細胞が、長期生存抗ＣＤ４５ＲＣ処置レシピエントの脾臓中で増加する。脾細胞を、ナイーブ脾細胞と比較し、抗ＣＤ４５ＲＣ処置レシピエントから１２０日目に回収し、亜集団の絶対数についてフローサイトメトリーにより分析した。 寛容の養子移入。ＬＥＷ．１Ａレシピエントは、−１日目に致死的に放射線照射（４．５Ｇｙ）し、心臓同種移植片及び長期生存抗ＣＤ４５ＲＣ処置レシピエントからの脾細胞又は選別亜集団の静脈内注射を０日目に受けた。移植片の生存を腹部触診によりモニターした。 抗ＣＤ４５ＲＣ処理後のＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＣ^{−／ｌｏｗ}Ｔｒｅｇの抑制能力の増加。ドナーＬＥＷ．１Ｗ ｐＤＣを用いて刺激したＣＦＳＥ標識ＬＥＷ．１Ａ分裂ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を、ｄ１２０ ＬＥＷ．１Ａナイーブ又は抗ＣＤ４５ＲＣ処理ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＣ^{−／ｌｏｗ}の非存在下又は存在における６日間の培養後に異なるエフェクター／サプレッサー比で分析した。 抗ＣＤ４５ＲＣ ｍＡｂ処置は、ＧＶＨＤのモデルにおける致死率及び体重減少を低下させる。２００．１０^６個の脾細胞を受けたラットを、抗ＣＤ４５ＲＣ ｍＡｂ又はアイソタイプコントロールで処置して、ＧＶＨＤを防止するための効力を評価した。所与の日に生存していたラットについての平均体重減少（初期のパーセンテージ）を＋／− ＳＥＭで示した。＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝３

実施例１：短期抗ＣＤ４５ＲＣ抗体処置は、強力な調節性細胞の誘導に関連付けられる移植寛容をもたらす。
材料＆方法

動物及び心臓移植モデル：心臓同種移植を、以前に記載された通り（１６、２２、２３）、全ＭＨＣ非適合性雄ＬＥＷ−１Ｗ及びＬＥＷ−１Ａラットで実施した。心臓の生存は、腹壁を通じた触診により評価し、心拍は＋＋＋からまでグレード表示した。

実験は、動物実験のための地域倫理委員会により承認された。

抗ＣＤ４５ＲＣ投与：ＯＸ２２（ＩｇＧ１抗ラットＣＤ４５ＲＣ）マウスハイブリドーマを使用し、抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体を産生した。抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体を、移植後０〜５、１０、又は２０日目に０．８mg/kg/２．５日の用量で静脈内に与えた。コントロールＩｇＧ１（３Ｇ８、抗ヒトＣＤ１６、ラットとの交差反応なし）を同じ用量で使用した。

組織病理学的研究：組織標本を、移植後１２０日目の慢性拒絶について、以前に記載された通りに分析した。簡単には、組織をパラホルムアルデヒド中に固定し、パラフィン包埋し、厚さ５μmの切片に切断し、ヘマトキシリン−エオシン−サフランで染色した。

リンパ球の調製、亜集団の分離、及び養子移入：１２０日目に脾臓を採取し、脾臓細胞又は亜集団を以前に記載された通りに精製した（１６）。細胞移入は、ＬＥＷ．１Ａ致死量以下照射（４．５Ｇｙ日−１）レシピエントへのＬＥＷ．１Ａの移植日での全脾細胞又は精製された亜集団の静脈内注射により実施した。

モノクローナル抗体及び染色：Ｔ細胞及びｐＤＣを、以前に記載された通りに精製及び選別した（２０）。フローサイトメトリー及び細胞選別を、European Collection of Cell Culture（英国ソールズベリー）から得られたＴ細胞（ＴＣＲαβ、クローンＲ７／３）、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞（クローンＯＸ３５及びＯＸ３９）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（クローンＯＸ８）、ＣＤ８^＋又はＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＣ^ｌｏｗＴ細胞（クローンＯＸ８及びＯＸ２２）、及びＣＤ４^＋ＣＤ４５Ｒ^＋８５Ｃ７^＋ｐＤＣ（クローンＨｉｓ２４、ＯＸ３５、及び８５Ｃ７）、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ４５ＲＡ^＋Ｂ細胞（ＯＸ３３）に対する抗体を使用して実施した。全てのビオチン標識ｍＡｂ を、ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−ＰＥ−Ｃｙ７（BD Biosciences）又はストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ４０５を使用して可視化した。Canto IIサイトメーター（BD Biosciences、カリフォルニア州マウンテンビュー）を使用して蛍光を測定し、データをFLOWJOソフトウェア（Tree Star, Inc.、ＵＳＡ）を使用して分析した。細胞は、ＤＡＰＩ生存細胞を選択することにより死細胞を除くそれらの形態別に最初にゲーティングした。

混合リンパ球反応：ナイーブＬｅｗｉｓ １Ａ ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ナイーブＬｅｗｉｓ １Ｗ同種異系ｐＤＣ、及び処置された同系Ｌｅｗｉｓ １Ａ ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＣ^ｌｏｗ Ｔｒｅｇｓサブセットを以前に記載された通りに選別した（１９）。ＣＦＳＥ標識ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の増殖を、生細胞（ＤＡＰＩ陰性）の間のＴＣＲ^＋ＣＤ４^＋細胞（Ｒ７／３−ＡＰＣ、Ｏｘ３５−ＰＥＣＹ７）でゲーティングすることにより、６日後にフローサイトメトリーにより分析した。

抗体検出：同種抗体。ドナー脾臓をコラゲナーゼＤで消化し、４００μlのＥＤＴＡ ０．１mMで停止させ、赤血球を溶解した。レシピエントの血清を１／８希釈でドナー脾細胞に加えて、抗ラットＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Jackson ImmunoResearch Labs INC、米国ボルチモア）、抗ラットＩｇＧ１（ＭＣＡ１９４、Serotec）、抗ラット ＩｇＧ２ａ（ＭＣＡ２７８、Serotec）又は抗ラットＩｇＧ２ｂ（ＳＴＡＲ１１４Ｆ、Serotec）及び抗ＭｓＩｇ−ＦＩＴＣ（１１５−０９５−１６４、Jackson ImmunoResearch）とインキュベートした。FACS Canto（BD Biosciences、カリフォルニア州マウンテンビュー）を使用して蛍光を測定し、データを、FLOWJOソフトウェア（Tree Star, Inc.、ＵＳＡ）を使用して分析した。テストした血清の蛍光の幾何平均（ＭＦＩ）を、コントロールとしての５つのナイーブルイス１Ａ血清ＭＦＩの平均値で割った。

抗ＫＬＨ抗体の免疫化及び検出：キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、Sigma Aldrich、ミズーリ州セントルイス）を、移植の１００日後に足蹠に注射した（２００μlの完全フロイントアジュバント中に乳化した５０μg）。抗ＫＬＨ ＩｇＭ及びＩｇＧ Ａｂを、それぞれ免疫化後の４日目及び１３日目に、以前に記載された通りにＥＬＩＳＡにより検出した（１８）。

統計分析：一元配置ＡＮＯＶＡ Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定及びＤｕｎｎポストテストを同時培養実験のために使用し、二元配置ＡＮＯＶＡ検定及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉポストテストをドナー指向抗体について適用し、脾細胞表現型の特徴付け及びＭａｎｔｅｌ Ｃｏｘ検定を使用して生存曲線を分析した。

結果
短期抗ＣＤ４５ＲＣ抗体処置後の寛容誘導：本発明者らは、ＣＤ４５ＲＣ表面マーカーの無又は低発現を伴うＣＤ８^＋Ｔ細胞の存在及び可能性を以前に実証しているため、抗ＣＤ４５ＲＣＭＡｂを使用した標的化戦略によって、心臓移植レシピエントにおいて寛容が促進されると推測した。このよに、本発明者らは、移植ラットレシピエント（心筋同種移植片ＭＨＣミスマッチ、ＬＥＷ．１Ａに移植されたＬＥＷ．１Ｗ）に２０、１０、又は５日間２．５日毎に抗ＣＤ４５ＲＣ抗体（ＯＸ２２、０．８mg/kg/静脈内）を投与し、移植の日から開始した。本発明者らは、抗ＣＤ４５ＲＣ抗体を用いて２０又は１０日間処置したレシピエントにおいて、対照未処置レシピエント及び５日間処置したレシピエントと比較し、不確定な同種移植片の生存を得て（図１）、抗ＣＤ５４５ＲＣ抗体を用いた短期治療によって、 不確定な同種移植片の生存が促進されることを実証した。

インビボでの抗ＣＤ４５ＲＣ抗体の寛容原性の可能性をさらにテストするために、レシピエントに、同種移植拒絶（ＬＥＷ．１Ｗに移植されたＬＥＷ．１Ａ）のより強い組み合わせで移植し、２０日間にわたり抗ＣＤ４５ＲＣ抗体を投与した。この移植片の組み合わせにおいて、本発明者らは、また、全てのレシピエントにおける不確定な同種移植片の生存を観察し（図１）、抗ＣＤ４５ＲＣ処置の高い抑制効果を実証した。

心臓組織病理学的分析によって、２０日間の抗ＣＤ４５ＲＣ処置レシピエントにおいて、１２０日目での線維症、浸潤、及び血管硬化症の完全な非存在が明らかになり、この短期処置によって、急性拒絶及び慢性拒絶の両方を効率的に阻害することが実証された。

最後に、本発明者らは、これらのレシピエントにおいて、移植後１２０日目に、抗ドナー抗体の存在及び外因性抗原（ＫＬＨ）に対する抗体応答を増強する能力を分析した。本発明者らは、コントロールと比較し、抗ＣＤ４５ＲＣ抗体で２０日間処置したレシピエントにおいて、抗ドナーＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２Ｂ抗体の完全な非存在を観察した。対照的に、本発明者らは、外来抗原（ＣＦＡと混合したＫＬＨ）を伴う２０日間処理した長期生存レシピエントの１２０日目の免疫化によって、ナイーブレシピエントと比較し、ＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の両方の高レベル産生がもたらされたことを観察した。

まとめると、本発明者らは、抗ＣＤ４５ＲＣ抗体処置が、同族抗原に対する抗体応答を獲得するレシピエントの免疫及び能力を損なうことなく、急性拒絶及び慢性拒絶の両方を阻害することを実証した。

短期抗ＣＤ４５ＲＣ抗体処置によって、一時的なリンパ球低下をもたらされたが、しかし、調節性集団が増加した：移植後０、４、及び１０日目に１０日間処置されたレシピエントの血液中の細胞サブセットの表現型に対する抗ＣＤ４５ＲＣ抗体の効果を分析するために、本発明者らは異なる細胞サブセットを分析した（図２）。本発明者らは、４日目にＣＤ４５ＲＣ^＋細胞の完全な非存在及びＴ細胞及びＢ細胞のわずかな減少を観察した（ＣＤ４５ＲＣは両方の集団により発現されるためである）。１０日目に、本発明者らは、全てのサブセットが正常レベルに戻ることを観察し、本発明者らは、Ｔ ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＣ⁻集団、Ｔ ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＣ⁻集団、及びＢ^＋ＣＤ４５ＲＣ⁻集団ならびにＭＤＳＣにおける強い増加を観察した（図２）。

１０日間及び２０日間の抗ＣＤ４５ＲＣ処置から得られた長期寛容誘導を考慮して、本発明者らは、脾臓におけるＴ＋ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＣ^{−／ｌｏｗ}細胞、Ｔ＋ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＣ^{−／ｌｏｗ}細胞、又はＢ＋ＣＤ４５ＲＣ^{−／ｌｏｗ}細胞の割合を分析した。処置後１２０日目に、脾臓におけるレシピエントの表現型の分析により、Ｔ細胞及び特にＴ ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＣ^{ｉｎｔ／−}、Ｔ ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＣ⁻の絶対数における強い濃縮が明らかになり、他の細胞サブセットは改変されなかった（図３）。

まとめると、本発明者らは、抗ＣＤ４５ＲＣ処置によって、ＣＤ４５ＲＣ^＋のＴ及びＢ細胞の一時的な減少がもたらされ、Ｔ^＋ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＣ^{−／ｌｏｗ}、Ｔ^＋ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＣ^{−／ｌｏｗ}、及びＢ^＋ＣＤ４５ＲＣ^{−／ｌｏｗ}が初期及び１２０日目に増加することを実証し、寛容誘導における調節性細胞についての役割が示唆された。

短期抗ＣＤ４５ＲＣ抗体処理によって、ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＣ^{−／ｌｏｗ}Ｔｒｅｇの増強及び移入寛容がもたらされた：抗ＣＤ４５ＲＣ抗体を用いた短期処理によって強力な抑制性制御細胞の誘導がもたらされることをインビボで確認するために、本発明者らは、二次照射された心臓移植レシピエント中への脾細胞又は亜集団の養子細胞移入を実施した（図４）。本発明者らは、１５０．１０^ｅ６脾細胞の養子細胞移入によって、ナイーブ脾細胞を用いて移入されたレシピエント又は非移入レシピエントと比較し、全てのレシピエントにおいて不確定の同種移植片の生存がもたらされたことを観察した。寛容誘導に関与する亜集団をさらに決定するために、本発明者らは、ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＣ^{−／ｌｏｗ}、ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＣ^{−／ｌｏｗ}、及びＢ^＋ＣＤ４５ＲＣ^{−／ｌｏｗ}細胞を選別し、養子細胞移入を実施した。本発明者らは、Ｂ細胞を用いて養子移入したレシピエントにおいて同種移植片の生存のわずかな延長を観察したが、本発明者らは、ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＣ^ｌｏｗＴｒｅｇ細胞及びＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＣ^ｌｏｗＴ細胞を用いてトランスフェクトしたレシピエントにおいて１００%の移植生存を観察し、０〜２０日目までのＣＤ４５ＲＣ^＋細胞の枯渇によって、強い抑制能を伴う調節性細胞が誘導され、活性化されたことを実証する。

本発明者らが以前に記載した通り、ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＣ^ｌｏｗＴｒｅｇｓの抑制活性を特徴付け（１９）、ナイーブＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＣ^ｌｏｗＴｒｅｇｓに対して抗ＣＤ４５ＲＣ Ａｂを用いて誘導されたＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＣ^ｌｏｗＴｒｅｇｓの抑制能をさらに評価して比較するためのエクスビボアッセイ、ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＣ^ｌｏｗＴｒｅｇを１２０日目に選別し、アッセイにおいて用量依存的に加え、ＣＦＳＥ標識ＣＤ４^＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞をドナー由来形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）と同時培養した（図５）。Ｔｒｅｇｓの非存在において、本発明者らはＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔｅｆｆ細胞の強い増殖を観察した。この増殖は、本発明者らが以前に記載した通り（１９）、ナイーブＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＣ^ｌｏｗＴｒｅｇｓの存在において低下した。興味深いことに、ｄ１２０レシピエントからの抗ＣＤ４５ＲＣ誘導性ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＣ^ｌｏｗＴｒｅｇｓの存在において、本発明者らは、少なくともエフェクター：サプレッサー比が１６：１になるまで、用量依存的な様式において、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔｅｆｆ細胞の増殖のほぼ完全な阻害を観察し、強い抑制性ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＣ^ｌｏｗＴｒｅｇｓを誘導する際でのＡｂ治療の強い可能性が実証された。
実施例２：抗ＣＤ４５ＲＣ ｍＡｂ処置によって、ＧＶＨＤのモデルにおける致死率及び体重減少が低下する。
材料＆方法

インビボでの移植片対宿主病の誘導：２４時間前に処置した同系又は同種異系ラットに２００．１０^６個の脾細胞を静脈内注射し、致死量以下の７．８Gyで全身照射した。レシピエントは、抗ＣＤ４５ＲＣ ｍＡｂ（ＯＸ２２）又は無関係のコントロールｍＡｂを０日目から開始し、３日毎に２mg/kg/注射を受けた。レシピエントを毎日体重測定し、体重減少のパーセンテージがそれらの最初の体重の＞２０%であった際に屠殺した。

結果
抗ＣＤ４５ＲＣ ｍＡｂ処置によって、ＧＶＨＤのモデルにおける致死率及び体重減少が低下する：抗ＣＤ４５ＲＣの投与が急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発生を防止することができるか否かを決定するために、レシピエントは、致死量以下の全身照射に続き、同系又は同種異系脾細胞を受けた。抗ＣＤ４５ＲＣ又は無関係な対照ｍＡｂを次に３日毎に腹腔内投与した。本発明者らは、同系脾細胞を受けたレシピエントで体重が減少し始めたが、しかし、次に、全身照射から回復し、実験終了まで体重が増加したことを観察した。興味深いことに、同種異系脾細胞及び抗ＣＤ４５ＲＣ抗体が投与されたレシピエントは、コントロールである無関係の抗体が投与されたレシピエントよりも体重減少が有意に少なく、コントロール群では＞２０%体重減少し、１２日目までに屠殺され、まとめると、ＧＶＨＤを制御する際での抗ＣＤ４５ＲＣ療法の可能性が実証される（図６）。

参考文献：
本願を通して、種々の参考文献によって、本発明が関係する最先端技術が記載される。これらの参考文献の開示は、参照により本開示中に組み入れられる。

Claims (11)

1. ＣＤ４５ＲＣ^＋細胞枯渇抗体であり、単離された抗ＣＤ４５ＲＣ抗体を含む、抗ＣＤ４５ＲＣ抗体を必要とするヒト患者において同種異系造血幹細胞移植により発症する移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止又は低下するための医薬組成物であって、前記ＣＤ４５ＲＣ^＋細胞枯渇抗体が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、ＣＤ４５ＲＣ^＋細胞増殖の阻害、及び／又はＣＤ４５ＲＣ^＋アポトーシス細胞死の誘導を媒介する、前記医薬組成物。
2. 抗体が、抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体又はそのフラグメントである、請求項１記載の医薬組成物。
3. 抗ＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体が、抗ヒトＣＤ４５ＲＣモノクローナル抗体である、請求項２記載の医薬組成物。
4. 抗ＣＤ４５ＲＣ抗体が、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、請求項１〜３のいずれか一項記載の医薬組成物。
5. 抗ＣＤ４５ＲＣ抗体が、キメラ抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
6. 抗ＣＤ４５ＲＣ抗体が、ＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
7. 抗ＣＤ４５ＲＣ抗体が、ＩｇＧ４アイソタイプである、、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
8. ＧＶＨＤが、急性又は慢性ＧＶＨＤである、請求項１に記載の医薬組成物。
9. ヒト患者が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）／骨髄増殖性症候群；リンパ腫からなる群より選択される疾患の処理のために同種異系造血幹細胞を移植されている、請求項１に記載の医薬組成物。
10. さらに、免疫抑制薬を含む、請求項１〜９のいずれか一項記載の医薬組成物。
11. 免疫抑制薬が、細胞増殖抑制剤；アルキル化剤、代謝拮抗物質；治療用抗体；カルシニューリン阻害剤；グルココルチコイド及びミコフェノール酸モフェチルからなる群より選択される、請求項１０記載の医薬組成物。