CN106061999B

CN106061999B - Il-21抗体

Info

Publication number: CN106061999B
Application number: CN201580012207.3A
Authority: CN
Inventors: J.戴维斯; F.玛格里尼; A.P.马丁; N.莫扎法里安; C.N.帕特尔; O.施雷德尔
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2015-03-13
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2035-03-13
Also published as: KR20160124166A; ES2774422T3; MX2016012120A; TWI646105B; US9394362B2; SG11201606705QA; NZ722518A; KR101859857B1; WO2015142637A1; IL246909A0; MA39342A1; JP2017093435A; JP2016520088A; CA2939543A1; AU2015231777B2; ECSP16075416A; MA39342B2; AP2016009450A0; JP6053989B2; EP3119806B1

Abstract

本发明涉及对人IL‑21具有高结合亲和力并中和人IL‑21的经工程改造的人源化抗体，使用所述抗体治疗其中需要拮抗或中和IL‑21的作用的病症（诸如自身免疫病症）的方法，用于重组生产所述抗体的组合物和方法，以及包含所述抗体的药物组合物。

Description

IL-21抗体

本发明涉及对人IL-21具有高结合亲和力并中和人IL-21的经工程改造的人源化抗体，使用所述抗体治疗其中需要拮抗或中和IL-21的作用的病症（诸如自身免疫病症）的方法，用于重组生产所述抗体的组合物和方法，以及包含所述抗体的药物组合物。

WO2010/055366公开了来源于转基因小鼠的人抗体，其据称会结合并中和人IL-21。一种具体抗体是来源于克隆362.78的抗体。

Maurer, M., 等人(Generation and characterization of human anti-humanIL-21 neutralizing monoclonal antibodies, 4 MAbs 69 (2012))描述了来源于人IgG转基因小鼠的一组人抗-人IL-21单克隆抗体（包括来源于克隆362.78的抗体）的生成和初步表征。在患有系统性红斑狼疮(SLE)和克罗恩氏病的患者中进行了在WO2010/055366、US20130323259A1和Maurer等人中描述的抗-IL-21抗体（即“mAb 362.78”，其也被称作NN8828和NNC114-0006或NNC-0000-0006）的临床研究。

WO2012/098113声称，已经形成了与单克隆抗体362.78的Fab片段(NNC 0114-0005)（所述抗体以前已经在WO2010/055366中提及）形成复合物的人IL-21的晶体结构，并使用X-射线方法进行了分析。

本文中公开的发明试图提供上述抗-IL-21抗体的替代方案。所述抗体可能非常适合用于治疗自身免疫病症或疾病诸如原发性舍格伦综合征(pSS)、舍格伦综合征(SS)和系统性红斑狼疮(SLE)、格雷夫斯病、I型糖尿病和其它，针对它们的治疗很少且医学需要仍然是世界性的。强烈需要具有比患者的目前护理标准更好的安全特性的更有效治疗。

具体地，本发明提供了抗体，其具有在本文中被称作Ab327的抗体的经工程改造的和人源化的重链可变结构域和轻链可变结构域作为重链和轻链可变结构域。

本发明提供了具有一种或多种以下特性的抗体：1)以高亲和力结合人IL-21和食蟹猴IL-21 (在37℃，通过KinExA溶液平衡结合，分别K_D = 0.8±0.5 x 10^-12 M和0.3±0.1x 10^-12 M)；2)以中等亲和力结合小鼠和大鼠IL-21 (在37℃，通过KinExA溶液平衡结合，分别K_D = 2.4±1.3 x 10^-7和2.3±0.2 x 10^-7 M)；3)基本上不结合任何其它人γ-共同链家族成员(IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15)；4)在特定pan-STAT-IM9-萤光素酶报告物测定中以比阳性对照hIL-21R-Fc构建体低约6倍的IC50中和人和食蟹猴IL-21活性(分别~46.7 pM和-41pM相对于~271 pM)；5)以约1.15 nM的IC50中和人IL-21诱导的体外原代人B细胞的增殖；6)中和人IL-21诱导的体外原代人B细胞的浆细胞分化；7)有效地阻断注射了人IL-21的小鼠中脾(包括B和T细胞亚群)的几种细胞类型的快速和瞬时繁殖；和/或8)对于药物生产、贮存和治疗用途而言是足够稳定的。

根据本发明的第一方面，提供了结合人IL-21的抗体，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中所述LCVR在CDRL1处包含SEQ ID NO: 7、在CDRL2处包含SEQ IDNO: 8并且在CDRL3处包含SEQ ID NO: 9，且其中所述HCVR在CDRH1处包含SEQ ID NO: 10、在CDRH2处包含SEQ ID NO: 11并且在CDRH3处包含SEQ ID NO: 12。

优选地，根据本发明的抗体包含抗体重链和抗体轻链，其中所述重链包含具有SEQID NO: 1的HCVR，并且其中所述轻链包含具有SEQ ID NO:2的LCVR。

本发明还提供了结合人IL-21的抗体，其包含两条抗体重链和两条抗体轻链，其中每条重链均包含重链可变结构域，其氨基酸序列是SEQ ID NO:1的序列，并且其中每条轻链均包含轻链可变结构域，其氨基酸序列是SEQ ID NO:2的序列。

优选地，本发明的抗体由两条抗体重链和两条抗体轻链组成，其中每条重链均包含重链可变结构域，其氨基酸序列是SEQ ID NO:1的序列，并且其中每条轻链均包含轻链可变结构域，其氨基酸序列是SEQ ID NO:2的序列。

一个特定实施方案是抗体Ab327，它是一种经工程改造的和人源化的针对人IL-21的抗体，其每条重链的氨基酸序列均是SEQ ID NO:3的序列，并且其每条轻链的氨基酸序列均是SEQ ID NO:4的序列。

本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的抗体和药学上可接受的赋形剂。

本发明还包括用于表达本发明的抗体的DNA分子，其编码本发明的抗体的重链和轻链。具体地，根据本发明的另一个方面提供了一种DNA分子，其包含编码抗体重链的多核苷酸，所述抗体重链的氨基酸序列是SEQ ID NO:3的序列。本发明还提供了一种包含多核苷酸的DNA分子，所述多核苷酸的序列是SEQ ID NO:5的序列。该多核苷酸序列对应于所述抗体重链。

根据本发明的另外的方面提供了DNA分子，其包含编码抗体轻链的多核苷酸，所述抗体轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO:4的序列。本发明还提供了一种包含多核苷酸的DNA分子，所述多核苷酸的序列是SEQ ID NO:6的序列。该多核苷酸序列对应于所述抗体轻链。

根据本发明的另一个方面，提供了DNA分子，其包含编码抗体重链的多核苷酸并且包含编码抗体轻链的多核苷酸，所述抗体重链的氨基酸序列是SEQ ID NO:3的序列，所述抗体轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO:4的序列。本发明还提供了一种DNA分子，所述DNA分子包含其序列为SEQ ID NO:5的序列的多核苷酸且包含其序列为SEQ ID NO:6的序列的多核苷酸。

本发明包括用于通过重组方式表达本发明的抗体的哺乳动物细胞。具体地，本发明提供了用上述的本发明的DNA分子转化的哺乳动物细胞。

本发明的另一个方面包括用于生产抗体的方法，所述抗体包含两条抗体重链和两条免疫球蛋白轻链，其中两条重链中的每者的氨基酸序列均是SEQ ID NO:3的序列，并且两条轻链中的每者的氨基酸序列均是SEQ ID NO:4的序列，并且所述方法包括：a)在表达所述抗体的条件下培养如上所述的本发明的哺乳动物细胞，以及b)回收表达的抗体。本发明包括可通过上面刚刚描述的本发明的方法得到的抗体。

本发明包括使用所述抗体、特别是用于治疗自身免疫(AI)病症、特别是原发性舍格伦综合征(pSS)、舍格伦综合征(SS)、系统性红斑狼疮、格雷夫斯氏病或I型糖尿病的方法，制备所述抗体的方法，编码所述抗体的多核苷酸，用于转化宿主细胞和用于表达所述抗体的、包含所述核苷酸的载体，用于表达所述抗体的宿主细胞，通过在哺乳动物宿主系统中的重组表达方法制备的抗体，以及所述抗体的药物组合物，所述药物组合物包含所述抗体和药学上可接受的赋形剂。

所述抗体可预见的特定用途是治疗AI病症、特别是AI病症诸如原发性舍格伦综合征(pSS)、舍格伦综合征(SS)、系统性红斑狼疮、格雷夫斯氏病或I型糖尿病。本发明包括用在治疗中、用在治疗自身免疫病症中、用在治疗原发性舍格伦综合征(pSS)、舍格伦综合征(SS)、系统性红斑狼疮、格雷夫斯氏病或I型糖尿病中、和特别是用在治疗原发性舍格伦综合征(pSS)、舍格伦综合征(SS)或系统性红斑狼疮中的抗体。本发明包括本发明的抗体在生产药物上的用途，所述药物用于治疗自身免疫病症；用于治疗原发性舍格伦综合征(pSS)、舍格伦综合征(SS)、系统性红斑狼疮、格雷夫斯氏病或I型糖尿病；用于治疗原发性舍格伦综合征(pSS)、舍格伦综合征(SS)；或用于治疗系统性红斑狼疮。具体地，本发明包括本发明的抗体在药物生产中的用途，所述药物用于治疗自身免疫病症；原发性舍格伦综合征(pSS)、舍格伦综合征(pSS)、系统性红斑狼疮、格雷夫斯氏病或I型糖尿病；原发性舍格伦综合征(pSS)、舍格伦综合征(SS)；或系统性红斑狼疮。

附图说明

图1 显示了通过ELISA证实的Ab327与人IL-21和结合人共同-γ链受体的其它配体的结合。

图2 证实了Ab327会中和人IL-21诱导的体外原代人B细胞的增殖。

图3 用IL-21抗体或同种型对照抗体治疗42天的、植入了人外周血单核细胞(PBMC)的严重免疫受损的NSG小鼠(NOD-scid IL-2Rγnull)的相对于基线的体重变化的平均百分比。治疗发生在箭头指示的点。符号：-■- Ab327 (10 mg/kg)；--▼-- Ab327 (1mg/kg)；--□--；同种型对照(10 mg/kg)；-●- 无移植物植入。

图4 用IL-21抗体或同种型对照抗体治疗的、植入了人外周血单核细胞(PBMC)的严重免疫受损的NSG小鼠(NOD-scid IL-2Rγnull)的相对于基线的体重变化的平均百分比。治疗发生在箭头指示的点。符号：-■- Ab327 (10 mg/kg)；--□--；同种型对照(10 mg/kg)；-●- 无移植物植入。

图5和6 通过mRNA分析(图5)和组织学分析(图6，画出了淋巴细胞的轮廓线)证实了使用抗-小鼠IL-21抗体的治疗会减轻NOD小鼠的唾液腺中的淋巴细胞浸润。

图7A和7B 证实了替代抗体728会预防NOD小鼠中的自身免疫糖尿病发展。治疗开始于7周龄(A)（作为预防）或13周龄(B)（在前糖尿病阶段）。将每组的糖尿病发病率计算为在250 mg/dl范围内的两个连续读出，并显示为每组的糖尿病小鼠的百分比(A：mIgG1 n=12；Ab728 n=12和B：mIgG1 n=8；Ab728 n=11)。将糖尿病发病率评分为存活曲线数据，且它时序检验证实是不同的(A: p=0.0007和B: p=0.002)。

本发明的抗体的用途

白介素(IL)-21由不同的T细胞子集生产且结合由特定受体（被称作IL-21受体(IL-21R)）和共同γ-链亚基组成的复合受体。人IL-21在体内从162-氨基酸前体分子产生。成熟人IL-21由前体蛋白的残基30-162 (133个氨基酸)组成。典型的I类细胞因子（IL-21）具有以上-上-下-下拓扑学排列的四-螺旋束结构。使用前体162-氨基酸蛋白的编号，认为所述螺旋由下列残基组成：A螺旋：41-56，B螺旋：69-84，C螺旋：92-105，和D螺旋：135-148。该结构与其它1型细胞因子家族成员（最明显地IL-2、IL-4和IL-15）的结构密切相关。

在IL-21与受体复合物的结合和随后的受体活化以后，通过Jak-STAT信号传递通路发生信号传递。IL-21R链以高亲和力结合IL-21并提供结合能的大部分。然而，与共同γ-链的相互作用是信号传递所必需的。IL-21和IL-21R之间的相互作用由存在于A和C螺旋中的残基以及紧接在IL-21的C螺旋之后的CD环的小部分介导(O. Hamming, 等人, CrystalStructure of Interleukin-21 Receptor (IL-21R) Bound to IL-21 Reveals ThatSugar Chain Interacting with WSXWS Motif Is Integral Part of IL-21R, 287 J.Biol. Chem. 9454-9460 (2012))。

IL-21是一种对固有和适应性免疫应答（诸如淋巴细胞增殖的刺激、CD8+ T细胞和NK细胞细胞毒性的促进、以及B细胞向浆细胞的分化）具有多效影响的I类细胞因子。IL-21由活化的CD4+ T细胞、特别是Th17和T滤泡辅助细胞、以及天然杀伤细胞分泌。它在通过前反馈机制促进Th17和T滤泡辅助细胞的发育中起重要作用。此外，在有抗原存在下，IL-21与其它细胞因子合作以增加CD8+ T细胞的细胞毒性并促进CD8+ 细胞的增殖。IL-21也会影响B细胞的抗体产生。IL-21具有多种作用，包括增加T细胞的增殖、驱动B细胞分化成记忆细胞并终末分化的浆细胞、以及提高天然杀伤细胞的活性。在某些人类病症和疾病中，可能需要阻断IL-21的活性。具体地，阻断IL-21与其受体的结合的抗体在治疗这样的病症和疾病中将是需要的。

鉴于其性能，本发明的抗体可能非常适合用于治疗这样的自身免疫病症或疾病：其中T细胞- B细胞相互作用、Th17细胞、T滤泡辅助细胞、浆细胞和活化的CD8和NK细胞起主要致病作用。容易归入这类的疾病是原发性舍格伦综合征(pSS)、舍格伦综合征(SS)和系统性红斑狼疮(SLE)，针对它们的治疗很少且大的医学需要仍然是世界性的。其它潜在适应症包括格雷夫斯氏病和I型糖尿病。

舍格伦综合征是一种缓慢进展的全身性自身免疫病，见于0.5−1.0%的人口中，其主要影响中年妇女，但它也可以发生在任何年龄段的男性和女性中。原发性舍格伦综合征(pSS)和舍格伦综合征(SS)的特征在于外分泌腺（尤其是唾液腺和泪腺）的慢性炎症。pSS的主要体征是口和眼干燥(“Sicca综合征”)，且组织学标志是外分泌腺的局部淋巴细胞浸润，其可以通过小唇唾液腺活检来确定。Sicca体征影响生活质量并在所涉及的粘膜层中造成局部并发症。严重口干是一种令人不悦的和令人失能的状况。然而，腺外表现发生在许多患者中，且可能涉及几乎任何器官。目前尚无被批准用于治疗pSS和SS的疾病改善剂。药物治疗会解决征状并提供支持疗法。需要对于pSS和SS患者而言具有更好安全特性的更有效疗法。使用本发明的抗体的药理学干预可能影响失调的免疫系统（其似乎与pSS和SS发病机制有因果关系）的若干方面，并从而可以给患者提供显著的临床益处。该疗法也可能减少对慢性的(非特异性的)免疫抑制剂的需要，从而提供pSS和SS患者的生活质量的改善。

治疗和施用

术语“治疗”、“进行治疗”或“治疗……”等包括抑制、减慢、停止或逆转患者中的现有征状、病症、疾病或障碍的进展或严重程度。术语“患者”表示人。术语“有效量”表示本发明的抗体的量或剂量，其在以单次或多次剂量施用给患者后，会在患者中提供期望的作用。通过使用已知技术和通过观察结果，主治诊断医生或健康护理专业人员作为本领域技术人员可以容易地确定有效量。在确定患者的有效量时，可能考虑许多因素，包括患者的大小、年龄和一般健康；涉及的具体疾病或障碍；疾病、病症或障碍的严重程度；个体患者的应答；施用模式；施用的制备物的生物利用度特征；选择的剂量方案；伴随药物的使用；及其它有关因素。

本发明的抗体旨在向人胃肠外施用以治疗自身免疫病症。皮下和静脉内途径是优选的。在施用之前，可将抗体配制成基于水的药物溶液。健康专业人员可以施用加载静脉内剂量。通常，预期施用通过皮下注射进行，由患者自己施用或由另一个人（诸如健康护理专业人员）施用。对于皮下注射，可以使用自动注射器或预充注射器。剂量可以是固定的（也就是说，对于每个患者，相同质量的活性抗体），或可以基于体重(质量)。基于体重(质量)，剂量优选地是在0.01-30 mg抗体/千克患者体重(质量)的范围内。更优选地，所述剂量是在0.1-20 mg抗体/千克患者体重(质量)的范围内。预期给药频率是每周或更低频率，取决于在人体中的实际药代动力学和药效动力学。治疗的持续时间随许多因素而变化，且由患者的诊断医生或治疗保健提供者基于本领域的经验和技能来确定。治疗的频率和持续时间可以随指征而变化。

本发明的抗体的结构

本发明的抗体具有全长人IgG抗体的典型三级和四级结构。当在合适的哺乳动物宿主细胞中生物合成时，本发明的抗体将作为由两条重链和两条轻链组成的分子来分泌，所述链通过链内和链间二硫键以平常方式共价地结合在一起，其中所述重链彼此结合，且一条轻链结合所述重链中的每一条。链内和链间二硫键的位置是众所周知的。

每条重链均含有四个结构域：从N-至C-末端，重链可变结构域、IgG CH1、IgG CH2和IgG CH3结构域。在CH1和CH2之间的铰链区含有连接两条重链的一个或多个链间二硫键。每条轻链均含有两个结构域：从N-至C-末端，轻链可变结构域和轻链恒定结构域(CL)结构域。优选的是，所述重恒定结构域是人IgG4或其变体。优选的是，所述轻恒定结构域是人κ。所述可变区一起负责结合人IL-21并中和人IL-21活性的功能特性。本发明的抗体的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中提供。本发明的一种抗体（Ab327）的恒定结构域在SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4内给出。在SEQ ID NO:3的Asn294处的N-连接的糖基化位点可以被糖基化。

所述抗体的重链(HC)的氨基酸序列由在其C-末端与适当的人重链恒定结构域(CH1、CH2和CH3)或人重链恒定结构域的在结构上类似的变体融合的本发明的重链可变结构域（SEQ ID NO:1）组成，所述变体可以具有众所周知的一个或多个用于提高稳定性或减少效应功能的突变。具有与稳定性和/或减少的效应功能有关的突变的人IgG4恒定结构域的变体是优选的。SEQ ID NO:3提供了Ab327的重链的氨基酸序列。

轻链(LC)的氨基酸序列由在其C-末端与适当的人轻链恒定结构域(CL)或其在结构上类似的变体融合的本发明的轻链可变结构域（SEQ ID NO:2）组成。人κ轻链恒定结构域是优选的。SEQ ID NO:4提供了Ab327的轻链的氨基酸序列。为了表达Ab327，由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6给出的DNA序列可以分别用于HC和LC。

根据Kabat惯例指定CDR L1、L3和H2，并根据North惯例指定CDR L2、H1和H3。KabatEA, 等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, U.S.Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991);North B, 等人, J Mol Biol 2011年2月18日; 406(2): 228-256。

本发明的抗体的生产

可以通过众所周知的方法生物合成、纯化和配制本发明的抗体用于施用。使用预定的HC:LC载体比率（如果使用两种载体）或同时编码重链和轻链的单一载体系统，用用于分泌抗体的表达系统瞬时地或稳定地转染适当的宿主细胞，诸如HEK 293或CHO。适合用于从这些常用的宿主细胞表达和分泌抗体的载体是众所周知的。

在表达和分泌抗体以后，将培养基澄清以除去细胞，并将澄清的培养基使用许多常用技术中的任一种进行纯化。例如，可以将所述培养基应用于已经用缓冲液诸如磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)平衡过的蛋白A柱。将所述柱洗涤以除去非特异性的结合组分。例如通过pH梯度(诸如0.1 M磷酸钠缓冲液pH 6.8至0.1 M柠檬酸钠缓冲液pH 2.5)来洗脱结合的抗体。检测抗体级分，诸如通过SDS-PAGE，然后合并。进一步纯化是任选的，取决于预期用途。可以使用常用技术将所述抗体浓缩和/或无菌过滤。通过常用技术可以有效地减少或除去除了所述抗体以外的其它物质，诸如宿主细胞和生长培养基组分、以及所述抗体的可溶性聚集体和多聚体，所述普通技术包括尺寸排阻、疏水相互作用、阳离子交换、阴离子交换、亲和色谱法或羟磷灰石色谱法。通过这些色谱法步骤以后抗体的纯度通常大于95%。可以将产物在4℃储存、在-70℃冷冻，或可以冻干。

如下表达在本文描述的研究中使用的Ab327：在分别包含SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6的DNA序列的单独重链和轻链表达DNA载体的共转染以后，在HEK293细胞中瞬时表达；或者在包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的DNA序列（其分别编码重链和轻链）的单个DNA载体的转染以后，在CHO细胞中稳定地表达。将从5天的HEK293培养物或14天的CHO大量培养物收获的培养基澄清，并将得到的粗制上清液通过蛋白A色谱法纯化。Ab327与蛋白A树脂结合，并使用低pH缓冲液洗脱。将洗脱的抗体如下进一步纯化：对于从HEK293的瞬时转染产生的物质，使用制备型尺寸排阻色谱法(SEC)；或对于从CHO的稳定转染产生的物质，使用多模态阴离子-交换色谱法(Capto adhere®GE Healthcare Life Sciences)作为精制步骤。通过SDS-PAGE、分析型SEC-HPLC和LC/MS分析，评价Ab327的最终纯度。使用Endosafe-PTS分析，证实内毒素水平<1EU/mg。将纯化的Ab327在4℃储存在PBS（磷酸盐缓冲盐水）（pH 7.2）中。

本发明的抗体的药物组合物

根据众所周知的配制蛋白和抗体用于胃肠外施用、特别是用于皮下或静脉内施用的方法，将纯化的抗体配制成药物组合物。可以将抗体抗体与适当的药学上可接受的赋形剂一起冻干，然后在使用之前用基于水的稀释剂随后重构。或者，可以将抗体抗体配制在水溶液中并在使用之前储存最多达1至3年。在任一种情况下，所述抗体的药物组合物的储存形式和注射形式将可能含有一种或多种药学上可接受的赋形剂，所述赋形剂是除了所述抗体以外的成分。一种成分是否是药学上可接受的取决于它对安全性和有效性的影响或对药物组合物的安全性、纯度和效力的影响。如果判断一种成分对安全性或有效性(或对安全性、纯度或效力)具有足够的不利影响以确保它不用在用于施用给人的组合物中，那么它就不是药学上可接受的而不能用在所述抗体的药物组合物中。

所述抗体的溶液组合物通常是基于水的，且除了水以外，它还可以含有赋形剂诸如缓冲系统、防腐剂（如果意图多次使用）、螯合剂、用于调节组合物的张度以接近人组织的张度的张度剂、和/或一种或多种增溶剂或稳定剂，诸如去污剂、表面活性剂等。实现用于在溶液中长期贮存的适当稳定的制剂可以是非常具有挑战性的。使用实验设计方法，通过改变例如pH、包括(或不包括)各种赋形剂以及赋形剂的类型和浓度，可以改善溶解度和化学和物理稳定性。关于配制药物的一般信息的来源是：Remington: The Science andPractice of Pharmacy。W. Wang, 等人, Antibody Structure, Instability, andFormulation, 96 J. Pharm. Sci. 1-26 (2007)是关于配制抗体的有用的一般来源。

现在将参考附图描述本发明的不同优选特征和实施方案，其仅仅作为非限制性实施例和测定。

实施例1

抗体生成、工程化和人源化以获得Ab327

在小鼠足垫免疫接种和抗-IL-21可变区的克隆以后，分离小鼠抗-人IL-21抗体,15H12。使用标准免疫接种规程用商业得到的人IL-21免疫Balb/c小鼠。在最终的无佐剂强化以后3-5天，收获淋巴结和/或脾，并生成单细胞混悬液。使用生物素酰化的或荧光团标记的IL-21通过标准分选方法富集抗原特异性的细胞，并与饲养细胞一起共培养2周，然后克隆小鼠可变结构域。使用抗-IL-21捕获ELISA鉴别抗体，并在体外测定中证实其会阻断并中和IL-21，对人和食蟹猴IL-21具有约5 pM的K_D。用山羊抗-人κ抗体捕获Fab抗体片段，然后针对结合生物素标记的IL-21（其又通过碱性磷酸酶标记的中和亲和素来检测）的能力进行筛选。

针对与小鼠和人IL-21二者的结合进一步优化所述抗体以得到小鼠抗体15M2。为此，将分离的鼠VH和VL 15H12的CDR通过诱变而随机化，并将得到的抗体使用ELISA针对与人和小鼠IL-21的结合进行筛选。然后合并增强亲和力的突变以产生15M2，然后将其使用框架文库方案人源化。对于框架文库而言，合成了12个人VH框架种系基因(1-24、1-46、1-69、2-5、3-15、3-23、3-53、3-72、4-04、4-39、5-51和6-01)和8个人VL框架基因(A-19、A-26、A-27、B-2、B-3、L-2、L-12和O-2)（其含有15M2的CDR），并克隆进重链和轻链人IgG4表达载体中。在具有全部96种重链和轻链组合的293 HEK瞬时转染以后，在用抗-人κ抗体从上清液捕获人IgG以后，在溶液中通过ELISA针对与人IL-21（直接包被在平板上）和与生物素酰化的IL-21的结合来测定上清液。考虑到可展性（developability）和ELISA活性，选择具有来源于抗体15M2的CDR的人源化抗体（其利用1-46重链人框架和O2人轻链框架）用于进一步优化。它对人IL-21的K_D是约0.5 pM。

人源化抗体的分析鉴别出一个轻链CDR脱酰胺化位点(Asn92)和一个重链CDR异构化位点(Asp55)。为了除去这些化学降解热点，生成了经工程改造的含有重链Asp55Glu和轻链Asn92His突变的抗体。这些突变造成亲和力的一些损失，达到对于人和食蟹猴IL-21的约2 pM K_D。确定了亲和力的损失归因于Asp55Glu突变。因此，维持重链中的Asp55残基以及轻链中的Asn92His突变。合理的工程改造原则指导通过工程改造重链中的邻近邻居Ser56残基而进一步优化亲和力。由此，选择经工程改造的含有Ser56Val突变的抗体，其同时减少Asp55异构化并提高亲和力。最终的抗体对人和食蟹猴IL-21二者具有大约0.5 pM的亲和力。将恒定区选择为人IgG4，其具有点突变以阻止半-抗体形成(S225P)并且减少效应功能(F231A/L232A)。计算机环境Epivax分析证实没有可辨别的免疫原性热点。关于最终的经工程改造的人源化抗体(“Ab327”)的序列信息示于下表1中。

表1

Ab327的溶解度和稳定性特征

在10 mM柠檬酸盐pH 6 (C6)和10 mM柠檬酸盐pH 6 + 150 mM NaCl (C6N)制剂中均评估了Ab327与溶解度和稳定性相关的物理化学性能。对于C6制剂，溶解度≥122.9 mg/mL，而在C6N制剂中的溶解度≥130.9 mg/mL。在10 mM柠檬酸盐、150 mM NaCl、0.02%吐温80、pH6制剂(C6NT)中确定100 mg/mL的Ab327的粘度为5.8 cP。

在25℃的10 mM柠檬酸盐pH 6缓冲液中4周以后，Ab327的化学和物理异质性的变化较低，通过分析型阳离子交换色谱法(CEX)观察到主峰面积的变化小于5%。在相同条件下，通过分析尺寸排阻色谱法(SEC)观察到<0.5%高分子量(HMW)聚集体生长。柠檬酸盐pH 6稳定性样品在40℃4周以后在基于细胞的测定中没有表现出生物活性的损失。

在4℃、25℃和40℃的C6中4周以后通过肽标定LC-MS分析所述抗体用于表征CDR化学降解热点。LC-MS分析表明在40℃的重链CDR残基Asp55相对于4℃对照样品没有显著异构化。鉴别出与4℃对照样品相比在25℃4周以后生长超过0.5%的其它共同CDR降解，并且统共在所有6个CDR中总计小于5%。

在C6中用1 mg/mL快速冻融研究和50 mg/mL缓慢冻融研究评估了Ab327的物理稳定性。在两项研究中，吐温80的存在均减少了10微米大小颗粒的形成。在高浓度研究中，150mM NaCl盐的存在减少了HMW聚集体形成。对于低浓度研究，在有盐和吐温80存在下HMW聚集体为0.7%。综上所述，Ab327在这些测试中似乎具有良好的溶液特性（包括粘度、溶解度和稳定性）以进入人体研究。

Ab327的功能特性

通过ELISA证实Ab327与人IL-21和其它人共同-γ链受体家族成员的结合

该研究的目的是，与共同-γ(γc)链受体细胞因子的其它成员相比，确定Ab327与人IL-21的结合特异性。细胞因子受体γc-链家族由6个成员（IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21）组成。该家族的所有成员均通过含有γc亚基的受体复合物而传递信号。使用ELISA确定Ab327结合其它人γc链细胞因子家族成员的特异性。简而言之，将Ab327捕获在用山羊抗-人κIgG包被的ELISA板上。然后将从100 nM至780 pM滴定的生物素标记的细胞因子加入所述板在37℃保持1小时，并使用碱性磷酸酶标记的中和亲和素检测任何结合的细胞因子。商购可得的针对IL-2的小鼠单克隆抗体和针对IL-4、IL-7、IL-9和IL-15的山羊多克隆抗体（用驴抗-山羊IgG捕获）在结合生物素酰化的细胞因子和用中和亲和素检测以后产生阳性信号。然而，对于Ab327而言，除了人IL-21以外(参见下面表2，其通过ELISA表明了Ab327和结合人共同-γ链受体的其它配体的结合，显示为在560 nm的光密度(OD)测量结果。也参见图1)，没有观察到可检测信号。这些结果表明，Ab327对IL-21是特异性的，且不会结合其它人γc链受体家族细胞因子。

表2

Ab327对人、食蟹猴、小鼠、大鼠和兔IL-21的结合亲和力

Ab327是一种经工程改造的人源化的单克隆IgG4抗体，其结合并中和人IL-21。本研究的目的是，确定Ab327对人、食蟹猴、小鼠、大鼠和兔IL-21的结合亲和力(序列在下面给出)。使用KinExA 3000仪器在37℃确定Ab327对这些不同IL-21物种的表观结合亲和力(K_D)。使用固定抗体浓度方案和IL-21的2倍系列稀释物进行KinExA溶液平衡结合实验。在分析之前将样品在37℃平衡6-36小时。使用Dylight 649-结合的抗-人IgG Fc多克隆抗体，检测平衡的样品中的游离抗体。使用KinExA Pro软件，将得到的游离抗体百分比相对于抗原浓度数据拟合至“亲和力, 标准”结合模型，并确定最佳拟合结合亲和力值(K_D)。

来自三个独立实验(人、食蟹猴、小鼠和大鼠)或来自单个测定(兔IL-21)的平均K_D以及标准偏差汇总在下表3中(Ab327的表观溶液平衡结合亲和力(K_D))。

表3

在37℃，Ab327分别以0.8±0.5x10^-12 M和0.3±0.1x10^-12 M的平均(n=3)亲和力结合人和食蟹猴IL-21。Ab327分别以2.4±1.3x10^-7 M、2.3±0.2x10^-7 M和>2x10^-7 M的亲和力结合小鼠、大鼠和兔IL-21。基于与小鼠和大鼠IL-21的相同样品所观察到的结合信号相比更小的结合信号，估计与兔IL-21的结合。基于这些结果，Ab327对人和食蟹猴IL-21具有大约皮摩尔水平的亲和力，但是对小鼠、大鼠和兔IL-21具有相对较弱的亲和力。

Ab327在体外IM9 泛-STAT-萤光素酶报告物测定中抑制人和食蟹猴IL-21

IL-21活化JAK-家族蛋白酪氨酸激酶，所述激酶介导转录的信号转导蛋白和活化剂(STAT)的、IL-21依赖性活化。使用IM9细胞评估了IL-21的活化STAT途径的能力。用泛-STAT-萤光素酶报告物构建体稳定地转染IM9细胞，其为来源于多发性骨髓瘤患者的血液的、EBV转化的B成淋巴细胞样细胞系，且其天然地表达IL-21受体(IL-21R)及其共受体(γc)。使用IM9-泛STAT-萤光素酶报告物测定，本实验的目的是确定Ab327是否可以抑制IL-21依赖性的STAT活化。

在烧瓶内的培养基(RPMI1640, 10%FBS, 1X青霉素/链霉素, 100 μg/mL Zeocin，用于选择泛-STAT-萤光素酶报告物)中常规地培养IM9-泛STAT-萤光素酶细胞(具有泛-STAT萤光素酶报告物的IM9细胞亚克隆1B10/3G2)。对于测定，将细胞以50,000个细胞/50 μL/孔接种在TC-处理过的平板中并在37℃温育过夜。然后，在有来自不同物种的重组IL-21蛋白存在下用Ab327处理细胞。评价了0-6670 pM的Ab327剂量范围(终浓度是基于Ab327的MW = 150 kDa)。将来自不同物种的重组IL-21加入每个孔中至66.67 pM的终浓度(基于MW= 15 kDa)。使用人IL-21R:Fc嵌合体(R&D Systems, 目录号991-R2)作为阳性对照，并使用人IgG4作为阴性对照。评价了0-47520 pM的阳性和阴性对照的剂量范围。一式三份地进行测试。将96-孔平板放入组织培养箱(37℃、95%相对湿度、5%CO₂)中保持4小时。加入100 μL/孔的One-Glo萤光素酶溶液以停止测定。使用光度计(Perkin Elmer Victor3)读出平板。

将结果表达为IC50 (半数最大抑制浓度)，并使用数据的4-参数S形拟合(Sigma图)进行计算。来自三个独立实验的平均IC50和标准偏差报告在下表4中。

表4

在测试的范围内，Ab327以剂量依赖性的方式完全抑制人和食蟹猴IL-21诱导的STAT活性。Ab327的抑制大于用阳性对照(hIL-21R:Fc)观察到的抑制，Ab327具有46.7±2.4的IC50（相对于阳性对照的271±15.6）。同种型对照抗体(hIgG4)不抑制泛-STAT活性(数据未显示)。综上所述，Ab327在体外有效地中和人和食蟹猴IL-21活性，但是它在这些条件下没有中和小鼠、大鼠或兔IL-21 (序列在上面给出) (N.N.D.= 没有检测出中和)。

Ab327中和人IL-21诱导的体外原代人B细胞的增殖

B细胞的主要功能是产生中和并清除病原体的抗体。产生抗体的B细胞由原初B细胞在生发中心(GC)反应过程中产生。当B细胞遇到特定抗原并接收来自T滤泡辅助细胞的关于生长、存活、选择和分化的指令信号时，建立GC。在那些信号中，B细胞由CD40和众多细胞因子刺激，其中IL-21是促进增殖、同种型转换、浆细胞分化和抗体分泌的关键因子。目的是确定Ab327是否能够抑制IL-21诱导的原代人B细胞的增殖。

从印第安纳血液中心（Indiana Blood Center）得到来自5位健康供体的血沉棕黄层。通过Ficoll-Paque梯度分离从血沉棕黄层分离PBMC，并用抗-CD19磁珠(MiltenyiBiotec)阳性地选择CD19+ B细胞。回收的群体的纯度通常> 90%。为了评估培养的细胞的增殖性应答，将纯化的CD19+ 细胞以50万个细胞/mL (10万个细胞/孔)与适当的刺激物(含有1 mM丙酮酸钠、非必需氨基酸、10 mM HEPES pH 7.0、100 U/mL青霉素和100µg/mL链霉素的RPMI-1640/10%FBS)一起在96-孔平底培养板中在37℃和5%CO₂下培养5天。将分离的B细胞与3.33 nM的人IL-21 (基于MW =15k Da)和2µg/mL的抗-人CD40 (BD Pharmingen)的组合一起温育。评价了Ab327 (从0.1 nM至26.7 nM)、人IL-21R:Fc嵌合体(从0.1 nM至213.3nM, R&D Systems)或人IgG4 (从0.1 nM至26.7 nM)的剂量范围。在培养起始时加入所有刺激和处理。培养5天以后，使用液体闪烁计数器测量[甲基-3H]胸苷摄取。

将结果表达为最大增殖的百分比，以没有抗体存在下IL-21介导的刺激为100%。使用数据的4-参数S形拟合，计算当50%的IL-21诱导的应答被Ab327抑制时的浓度(IC50)。Ab327以剂量依赖性的方式抑制IL-21诱导的原代人B细胞的增殖。该抑制远远大于用阳性对照（人IL-21R-Fc构建体）观察到的抑制，所述阳性对照在使用的最高浓度(26.7 nM)不能完全抑制IL-21诱导的增殖(参见图2)。计算的Ab327的IC50为1.15±0.25 nM (5个独立实验的平均值±SD)。阴性对照抗体(同种型对照hIgG4)不抑制IL-21诱导的原代B细胞的增殖。表5显示Ab327能够中和人IL-21诱导的体外原代人B细胞的增殖。数字显示了增殖的人B细胞的百分比±SDEV。综上所述，Ab327抑制IL-21诱导的体外原代人B细胞的增殖。

表5

^*抑制剂浓度(nM)

^**每种处理的%重量变化。

Ab327中和人IL-21诱导的体外原代人B细胞的浆细胞分化

抗原和T细胞提供的信号的整合(CD40-CD40L相互作用和细胞因子的产生)会调节B细胞向浆母细胞的分化。对于人B细胞分化而言重要的细胞因子之一是IL-21，其诱导浆细胞产生和从活化的原初和记忆B细胞分泌抗体。已经证实，IL-21诱导活化的B细胞上的CD25(IL-2R)表达，从而使那些细胞对IL-2的分化促进效应敏感化，由此实现IL-2和IL-21之间的协作相互作用以增进浆母细胞产生和抗体分泌。目的是确定Ab327是否能够抑制IL-21诱导的原代人B细胞在体外向浆细胞的分化。

如上所述得到血沉棕黄层。将纯化的B细胞以75万个细胞/mL (15万个细胞/孔)与适当的刺激物(含有1mM丙酮酸钠、非必需氨基酸、10 mM HEPES pH 7.0、100U/mL青霉素和100µg/mL链霉素的RPMI-1640/10%FBS)一起在96-孔平底培养板中在37℃和5%CO₂下培养6天。将分离的B细胞与3.33 nM人IL-21、1µg/mL抗-人CD40 (BD Pharmingen)、100 U/mL人IL-2 (Proleukin, Hanna's Pharmaceutical Supply Co.)和/或26.7 nM Ab327或26.7nM人IgG4抗体(阴性对照)的组合一起温育。培养以后6天，将细胞用染色缓冲液(2%FBS/PBS)洗涤，并与对人CD38、IgD、CD19、CD27有特异性的抗体(均来自BD Biosciences)一起在4℃温育40分钟。使用FC-500流式细胞计(Beckman Coulter)进行五色流式细胞术分析。将表达高水平的CD38和低水平的IgD的细胞鉴别为浆细胞(参见下表6)。

由于在供体之间存在高可变性，下面显示的结果表达为由IL-21的添加诱导的浆细胞(CD38高+IgD低细胞)的相对数目的增加倍数，其中将来源于培养基+ 抗-CD40 + IL-2中的每种供体的浆细胞的值设定为等于一(1)。将数据显示为对来自5位健康供体的原代人B细胞的效应的“增加倍数”。

表6

用抗-CD40和IL-2的组合培养的新鲜B细胞几乎不含有CD38高/IgD低的浆细胞。相反，在有IL-21存在下，纯化的B细胞与抗-CD40和IL-2的共刺激导致大量分化成浆细胞。阴性对照抗体(同种型hIgG4)不能抑制IL-21活性。Ab327抑制IL-21诱导的原代人B细胞的浆细胞分化(n=5供体，p=0.008，不成对t检验，Ab327相对于IgG4同种型抗体)。综上所述，Ab327抑制人IL-21诱导的体外浆细胞分化。

Ab327中和小鼠中的人IL-21活性

向小鼠中注射IL-21会导致使用特定标志物清楚地鉴别的脾中的若干种细胞类型(包括B和T细胞的亚群)的快速和瞬时扩张。本实验的目的是研究Ab327是否能够抑制小鼠中人IL-21的生物活性。

在第1天给8-10周龄雌性C57Bl6小鼠(每组n=5)腹膜内(i.p.)注射Ab327 (1 mg/小鼠)或同种型(hIgG4, 1 mg/小鼠)对照抗体。在第2和3天，小鼠接受50 μg重组人IL-21 /小鼠/天或PBS的腹膜内注射。在第4天，制备脾细胞的细胞悬浮液，并在裂解红血细胞以后确定细胞的总数。通过流式细胞术使用细胞表面标志物Gr-1和Sca-1确定IL-21-响应性细胞的相对百分比。通过将IL-21-响应性细胞(Gr-1低Sca-1+ 细胞)的百分比乘以脾中细胞的总数，计算每个脾的IL-21-响应性细胞的总数。

下表7中的结果显示为五只小鼠中的每一只的脾中的IL-21响应细胞(x10⁶)的总数。

表7

注射人IL-21造成了IL-21响应细胞的增加。与接受阴性对照抗体的动物相比，Ab327的存在减少了那些细胞的数目(p<0.0001, 不成对t检验，Ab327 + IL-21相对于IgG4+ IL-21和IgG4 + PBS相对于IgG4 + IL-21)。通过定量ELISA确认了每组内对Ab327和阴性对照抗体的暴露。结论是，Ab327有效地中和体内人IL-21的生物活性。

Ab327在NGS小鼠的人T细胞活化的体内模型中表现出功效

以前已经证实，中和人IL-21会阻止人T-细胞活化模型（其中将人外周血单核细胞(PBMC)移植进严重免疫受损的NSG小鼠中）中疾病的进展(NOD-scid IL-2Rγnull; HippenKL, 等人. Blocking IL-21 signaling ameliorates xenogeneic GVHD induced byhuman lymphocytes. Blood 2012; 119: 619)。NSG小鼠缺乏T、B和NK细胞，并且也具有减弱的巨噬细胞和树突细胞的功能。人PBMC的移植导致明显的人T-细胞活化及其向小鼠皮肤、肝、肠、肺和肾中的浸润。这伴有最终导致死亡的消耗综合征(Hippen, 2012)。该模型的优点是，所述疾病由人免疫细胞和人细胞因子驱动，因而允许在体内调查缺乏对其它物种的交叉反应性的抗体。本研究的目的是，当以预防模式(在移植物植入时开始施用)或治疗模式(在移植物植入后21天开始施用)施用时，在人T-细胞活化模型中证实Ab327的体内功效和疾病改善活性。

在移植物植入之前，基于基线体重测量结果将雌性NSG小鼠分组(n=10/组)。在第0天，给小鼠静脉内注射10⁷个从得自圣地亚哥血库的血沉棕黄层分离出的人PBMC。对于预防模式(图3)，在移植物植入时和此后每周一次地给小鼠皮下施用1或10 mg/kg Ab327或10mg/kg hIgG4同种型对照抗体。测量体重，并每周2-3次监测总体外观和健康。在第19天，通过剪尾巴得到血液，并通过流式细胞术分析人CD45+ 细胞的移植物植入。对于治疗模式(图4)，基于流式细胞术数据和体重将没有接受任何治疗的动物重新分配至匹配的组群组。在移植物植入以后第21天，给小鼠皮下施用10 mg/kg Ab327或10 mg/kg hIgG4同种型对照抗体，然后此后每周1次。将四只没有植入移植物的小鼠作为“未经处理的对照或没有植入移植物的”小鼠。将体重变化计算为基线重量的百分比(第(x)天重量/第0天重量* 100)。将结果显示为随时间从基线的体重变化百分比。

对于预防模式，用人同种型对照抗体(参见图3, 空心正方形)治疗的小鼠早在细胞转移以后20天即发展出消耗表型。在转移以后第45天，同种型对照组中的平均重量减轻相对于基线大于10%，且大多数小鼠处于痛苦中，因而终止研究。在移植物植入当天开始的使用10 mg/kg/周Ab327 (图3, 实心正方形)的治疗(预防模式)完全消除了消耗表型。小鼠继续增加重量，该重量与没有植入移植物的小鼠相当。它们的重量在统计上显著地不同于同种型对照组(p=0.000846和p< 0.001，分别是Ab327相对于同种型和没有植入移植物的小鼠相对于同种型，双因素方差分析，重复测量)。1 mg/kg/周剂量的Ab327 (图3，实心三角形)具有部分效果，因为它似乎减慢重量减轻的进展。然而，在该组中的小鼠的重量与同种型对照没有统计上的不同。表8显示了用IL-21抗体或同种型对照抗体治疗45天的、植入了人外周血单核细胞(PBMC)的严重免疫受损的NSG小鼠(NOD-scid IL-2Rγnull)中相对于基线的体重变化百分比的平均值±SDEV。治疗与PBMC的移植物植入同时开始。在Ab327 10mg/kg组和同种型对照组之间存在显著差异。

表8

^**每种处理的%重量变化

^***移植物植入以后的天数。

如上面所指出的，在移植物植入以后大约20天开始，人PBMC的施用导致消耗性疾病。为了研究阻断人IL-21是否能够停止进行中的恶化疾病(治疗模式)，在移植物植入以后第21天开始，用10 mg/kg/周的Ab327或hIgG4同种型对照治疗小鼠。如在图4中所示，施用人IgG4同种型对照抗体(空心正方形)的小鼠继续损失重量。另一方面，在疾病发作以后开始的Ab327治疗(移植物植入后21天，图4，实心正方形)有效地减弱消耗表型。在该组中的平均重量在统计上显著地不同于同种型对照组(p=0.042，双因素方差分析，重复测量)。重量减轻和疾病的严重程度的差异不是由于人细胞向小鼠中的移植物植入的差异。在研究结束时外周人CD45+ 细胞数目以及脾中的人细胞在Ab327治疗的小鼠中稍微高于同种型对照治疗的动物。总之，Ab327在T-细胞体内活化的异种模型中表现出功效和疾病改善活性。表9显示了用IL-21抗体或同种型对照抗体治疗的、植入了人外周血单核细胞(PBMC)的严重免疫受损的NSG小鼠(NOD-scid IL-2Rγnull)中相对于第21天的体重变化百分比的平均值±SDEV。治疗在第21天开始。在Ab327 10mg/kg组和同种型对照组之间存在显著差异。

表9

^**每种处理的%重量变化

^***移植物植入以后的天数。

Ab327的药代动力学

在雄性食蟹猴中单次静脉内或皮下施用3 mg/kg剂量以后表征了Ab327的药代动力学。收集血清样品直到给药后1008小时(6周)。在使用两种ELISA方法(总人IgG或抗原捕获)定量抗体以后生成浓度-时间曲线。总人IgG方法利用ELISA形式来测量抗-IL-21抗体的浓度。将标准品、对照品和测试样品与已经固定在微孔滴定板上的AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗-人IgG (包被Ab)一起温育。温育以后，将小鼠抗-人IgG4-HRP (辣根过氧化物酶)加入孔中。一旦洗掉未结合的酶，就将SureBlue®TMB (四甲基联苯胺)底物溶液加入孔中。通过加入酸性溶液停止显色，并在450 nm（将波长校正设定至650 nm）测量光密度。

抗原捕获方法利用ELISA形式来测量抗-IL-21抗体的浓度。将标准品、对照品和测试样品与已经固定在抗生蛋白链菌素包被的微孔滴定板上的人IL-21-生物素一起温育。温育以后，将小鼠抗-人IgG4-HRP (辣根过氧化物酶)加入孔中。一旦洗掉未结合的酶，就将SureBlue®TMB (四甲基联苯胺)底物溶液加入孔中。通过加入酸性溶液停止显色，并在450nm（将波长校正设定至650 nm）测量光密度。测定范围是5-500 ng/mL。

药代动力学结果(平均值)提供在下面表10和表11中。每组中动物的数量是2。

表10

静脉内施用值

缩写= t1/2 - 半衰期，AUC0-t–从0至最后一个可测量的浓度的曲线下面积，AUC0-inf–从0至无穷大的曲线下面积，外推AUC%- 从最后一个可测量的浓度外推至无穷大的AUC0-inf的百分比，CLss -总肌体清除率的估计值，Vss–在稳态时分布体积的估计值。*在72-168小时之间计算终末半衰期。

表11

皮下施用值

缩写= t1/2 - 半衰期，Tmax–在最大浓度处的时间, Cmax - 最大浓度,AUC0-t–从0至最后一个可测量的浓度的曲线下面积，AUC0-inf–从0至无穷大的曲线下面积，外推AUC%- 从最后一个可测量的浓度外推至无穷大的AUC0-inf的百分比，CLss/F–清除率/生物利用度, F%-使用平均3 mg/kg静脉内剂量作为参照的生物利用度= (AUC0-inf皮下/AUC0-inf静脉内)/(剂量-静脉内/剂量-皮下)*100。*在96-336小时之间计算终末半衰期。

给雄性食蟹猴单次静脉内或皮下施用Ab327以后，浓度-时间曲线提示抗-药物抗体(ADA)形成，并在4/4猴中确认了ADA。平均终末半衰期是105-249小时，并从72-168小时之间的斜率来计算以避免ADA的显著影响。平均清除率为0.43-0.48 ml/h/kg，其刚好落在0.2-0.4 ml/h/kg的典型单克隆抗体清除率范围之外。

皮下施用以后，生物利用度为72-74%，其落在单克隆抗体的典型范围(50-100%)内。尽管形成了ADA，但Ab327在猴中的药代动力学相对类似于单克隆抗体与可溶性配体结合所预计的药代动力学，清除率稍微高于正常值。

基于这些研究，结论是，Ab327在人类中具有在人源化的IgG4抗体的预期范围内的药代动力学。基于猴清除率的异速生长定标预计的人清除率是0.3 mL/hr/kg (0.02 L/hin a 70 kg人)，且在人类中的生物利用度预计为50-75%。

使用抗-小鼠IL-21抗体的治疗减轻了NOD小鼠的唾液腺中的淋巴细胞浸润

因为Ab327不中和啮齿动物IL-21，所以开发了用于临床前疾病模型的替代分子。抗体Ab728是一种特异性地结合小鼠IL-21的鼠IgG1单克隆抗体。鼠IL-21与Ab728的结合亲和力是1 pM。Ab728能够在体内和体外测定中完全中和鼠IL-21。

非肥胖糖尿病(NOD)小鼠被广泛地用作舍格伦综合征的模型，因为它在唾液腺中自发地发生淋巴细胞浸润。以前的研究证实，具有IL-21 shRNA慢病毒的NOD小鼠的下颌下腺中IL-21水平的局部抑制会延缓舍格伦综合征样征状的发展(Liu H, 等人.Localsuppression of IL-21 in submandibular glands retards the development of Sjögren's syndrome in non-obese diabetic mice. J Oral Pathol Med 2012; 41:728)。本实验的目的是研究Ab728（Ab327的替代物）的全身施用是否能够预防或减弱NOD小鼠中的舍格伦综合征发展。

从7周龄开始，用Ab728或同种型对照mIgG1 (20 mg/kg/周)治疗雌性NOD小鼠。在18周龄将小鼠处死并收获唾液腺。将一块唾液腺用1.6%PFA 20%蔗糖在4℃固定过夜，包埋在OCT中并在-80℃保存直到通过免疫荧光进行分析。将另一块在液氮中冷冻用于mRNA研究。

在NOD小鼠中，在下颌下唾液腺和泪腺中的局灶性炎症从大约8周龄开始发展。病灶在结构和细胞组成方面表现得与在某些人唾液腺中发现的浸润相当，具有T和B细胞的存在。为了研究抗-IL-21治疗是否会减轻NOD唾液腺中的淋巴细胞浸润，进行了免疫荧光染色。简而言之，将唾液腺的8 μm冷冻切片用PBS洗涤，然后与纯化的第一抗体一起在室温温育1 h，随后与适当的标记的第二抗体一起温育30 min。第一抗体是得自BD Biosciences的抗-CD3 (T细胞)和抗-B220 (B细胞)。第二抗体是得自Jackson ImmunoResearchLaboratories的Alexa Fluor 488山羊抗-大鼠IgG和DyLight 594山羊抗-亚美尼亚仓鼠。使用DAPI来鉴别细胞核。

用mIgG1对照抗体治疗的NOD小鼠显示出存在典型的淋巴单核细胞浸润，其排列为具有T和B淋巴细胞的导管周聚集体(图6)，在组构上高度类似于在舍格伦综合征患者中发现的淋巴细胞病灶。Ab728治疗不仅有效地减少了观察到的病灶的数目，还有效地减小了其尺寸。

据信，舍格伦综合征中淋巴样聚集体的发展由淋巴样趋化因子CXCL13及其相应受体CXCR5的异位产生来调节，它们调节B细胞和CD4+ T滤泡辅助(TFH)细胞的再循环和在生发中心结构中的定位。已经证实，IL-21参与TFH和生发中心结构的维持。IL-21也控制CD8+T淋巴细胞的活化，它们被认为通过穿孔蛋白和颗粒蛋白酶来破坏靶细胞。为了研究抗-IL-21治疗是否会减少那些标志物的表达，通过在Trizol中匀浆化随后用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen, Inc.)从冷冻的唾液腺中分离出总RNA。从在260 nm的分光光度测量吸收确定RNA浓度。使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (PE Applied Biosystems)将RNA反转录成cDNA。所有反应一式三份地进行以确定测定的mRNA的相对丰度。IL-21(Mm00517640_m1)、CXCR5 (Mm00432086_m1)、CXCL13 (Mm04214185_s1)、CCR9(Mm02620030_s1)、颗粒蛋白酶B (Mm00442834_m1)和CD8 (Mm01182107_g1)的引物探针组得自PE Applied Biosystems。将GusB (Mm00446956_m1)测量为内源性对照以将基因表达水平的可变性归一化。使用Delta Ct方法分析表达数据。将各个Ct值计算为一式三份测量结果的平均值。

与mIgG1对照抗体治疗的小鼠相比，CXCL13、CXCR5、IL-21、CD8和颗粒蛋白酶BmRNA转录物在Ab728治疗的小鼠中在统计上显著地被下调。图5显示了小鼠的唾液腺中的mRNA分析。可以看出，治疗调节在所述疾病中涉及的蛋白的表达。总之，施用抗-小鼠IL-21抗体(Ab728)会减少向唾液腺中的淋巴细胞浸润并延迟NOD小鼠的SS-样征状的发生。

抗-mIL-21 (Ab728)治疗会预防NOD小鼠中的糖尿病

Ab728是一种特异性地结合小鼠IL-21的鼠IgG1单克隆抗体。鼠IL-21与替代物Ab728的结合亲和力是1 pM。Ab728能够在体内和体外测定中完全中和鼠IL-21。

人I型糖尿病是一种由胰腺胰岛中产生胰岛素的β细胞的自体反应破坏引起的自身免疫病，其导致随后丧失胰岛素产生。非肥胖糖尿病(NOD)小鼠品系会发生类似的疾病，且也充当用于研究在自身免疫应答的起始和传播中涉及的机制的模型系统。组织学研究已经证实，直到大约3至4周龄时才在胰岛中观察到免疫细胞浸润，此时雄性和雌性小鼠开始表现出围绕胰岛的单核浸润(周围胰岛炎)。这些浸润发展并侵入胰岛(胰岛炎)，随后是高血糖症以及约在12周龄开始充分显现的糖尿病。

以前的研究显示，NOD小鼠中IL-21信号传递的缺失会导致几乎完全消除疾病的发生(Spolski R, 等人.IL-21 signaling is critical for the development of type Idiabetes in the NOD mouse. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105:14028, 2008)。本实验的目的是研究Ab728的全身施用是否能够预防或减弱NOD小鼠中的糖尿病发生。

在疾病过程的不同时期用Ab728或同种型对照mIgG1 (20 mg/kg/周)治疗雌性NOD小鼠。一组小鼠在7周龄开始治疗(预防研究，图7A)，且另一组动物在13周龄开始治疗(晚期临床前阶段，图7B)。在两种情形中，均跟踪小鼠的糖尿病发展直到小鼠为37周龄。为了跟踪糖尿病的发展，每周监测血糖水平，并且如果血糖在连续两次测量中超过250 mg/dl则认为动物患有糖尿病。通过定量ELISA确认对Ab728的暴露。

用mIgG1对照抗体治疗的NOD小鼠，当其在13-15周龄之间时开始发生糖尿病，且75%的小鼠在37周龄之前发展至明显的糖尿病(12只用于预防的小鼠中的9只，且8只用于晚期临床前阶段的小鼠中的6只- 参见图7A和图7B)。相反，抗-IL-21治疗显著地延迟了糖尿病进展。当治疗在7周龄开始时，12只小鼠中仅1只(8%, 图7A, p=0.0007)发生糖尿病，且当治疗在晚期临床前阶段开始时，11只小鼠中仅1只(9%, 图7B, p=0.002)发展至明显的糖尿病。

总之，抗-小鼠IL-21抗体(Ab728)的施用有效地阻止了NOD小鼠中的糖尿病发生。

序列

Ab327氨基酸序列

在实施例和测定中使用了以下序列。

人IL-21 - UniprotKB/Swiss-Prot数据库条目#Q9HBE4

食蟹猴 IL-21 - -内部克隆的序列；在公共数据库中不存在

小鼠IL-21 - UniprotKB/Swiss-Prot数据库条目#Q9ES17

大鼠 IL-21 - UniprotKB/Swiss-Prot数据库条目#A3QPB9

兔IL-21 - (市售试剂- R&D Systems, 目录号7274-RB/CF)

用于表达Ab327的DNA

序列表

<110> Eli Lilly and Company

<120> IL-21 抗体

<130> X20141

<150> 61/968550

<151> 2014-03-21

<160> 17

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Leu Ile Asp Thr Ser Asp Val Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Gly Pro Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe His Thr Leu Arg Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Leu Ile Asp Thr Ser Asp Val Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Gly Pro Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440

<210> 4

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe His Thr Leu Arg Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 5

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 5

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60

tcctgcaagg catctggcta cacattcact gactactgga tgcactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggactg attgatactt ctgatgttta tactatctac 180

aatcaaaagt tcaagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagatatggg 300

cccctggcta tggactactg gggccagggc accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 360

aagggcccat cggtcttccc gctagcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 420

gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480

ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540

tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 600

aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 660

cccccatgcc caccctgccc agcacctgag gccgccgggg gaccatcagt cttcctgttc 720

cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780

gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 840

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 900

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960

tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1020

cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggaaagc 1140

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1200

ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1260

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1320

tctctgggt 1329

<210> 6

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 6

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctattac acatcaagat tacactcagg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag tttcacacgc ttcggacgtt cggcggaggg 300

accaaggtgg agatcaaaag aactgtggcg gcgccatctg tcttcatctt cccgccatct 360

gatgagcagt tgaaatccgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420

agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480

agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540

agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600

agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgc 639

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 7

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 8

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 9

Gln Gln Phe His Thr Leu Arg Thr

1 5

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 10

Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Trp Met His

1 5 10

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 11

Leu Ile Asp Thr Ser Asp Val Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 12

Ala Arg Tyr Gly Pro Leu Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 此蛋白质为重组生产的并且与智人序列相同。

<400> 13

Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp

1 5 10 15

Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala

20 25 30

Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile

50 55 60

Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn

65 70 75 80

Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser

85 90 95

Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu

100 105 110

Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser

115 120 125

Glu Asp Ser

130

<210> 14

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 此蛋白质为重组生产的并且与食蟹猴序列相同。

<400> 14

Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp

1 5 10 15

Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Asp Pro Glu Phe Leu Pro Ala

20 25 30

Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Ile Ser Cys Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile

50 55 60

Ile Asn Leu Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Ser Pro Ser Thr Gly

65 70 75 80

Ala Glu Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser

85 90 95

Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu

100 105 110

Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser

115 120 125

Glu Asp Ser

130

<210> 15

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 此蛋白质为重组生产的并且与小家鼠序列相同。

<400> 15

His Lys Ser Ser Pro Gln Gly Pro Asp Arg Leu Leu Ile Arg Leu Arg

1 5 10 15

His Leu Ile Asp Ile Val Glu Gln Leu Lys Ile Tyr Glu Asn Asp Leu

20 25 30

Asp Pro Glu Leu Leu Ser Ala Pro Gln Asp Val Lys Gly His Cys Glu

35 40 45

His Ala Ala Phe Ala Cys Phe Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro Ser Asn

50 55 60

Pro Gly Asn Asn Lys Thr Phe Ile Ile Asp Leu Val Ala Gln Leu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Leu Pro Ala Arg Arg Gly Gly Lys Lys Gln Lys His Ile Ala

85 90 95

Lys Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Arg Thr Pro Lys Glu Phe

100 105 110

Leu Glu Arg Leu Lys Trp Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu

115 120 125

Ser

<210> 16

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 此蛋白质为重组生产的并且与褐家鼠序列相同。

<400> 16

His Lys Ser Ser Pro Gln Arg Pro Asp His Leu Leu Ile Arg Leu Arg

1 5 10 15

His Leu Met Asp Ile Val Glu Gln Leu Lys Ile Tyr Glu Asn Asp Leu

20 25 30

Asp Pro Glu Leu Leu Thr Ala Pro Gln Asp Val Lys Gly Gln Cys Glu

35 40 45

His Glu Ala Phe Ala Cys Phe Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro Ser Asn

50 55 60

Thr Gly Asn Asn Lys Thr Phe Ile Asn Asp Leu Leu Ala Gln Leu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Leu Pro Ala Lys Arg Thr Gly Asn Lys Gln Arg His Met Ala

85 90 95

Lys Cys Pro Ser Cys Asp Leu Tyr Glu Lys Lys Thr Pro Lys Glu Phe

100 105 110

Leu Glu Arg Leu Lys Trp Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu

115 120 125

Ser

<210> 17

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 此蛋白质为重组生产的并且与家兔序列相同。

<400> 17

His Lys Ser Ser Ser Lys Gly Gln Asp Arg Tyr Met Ile Arg Met His

1 5 10 15

Gln Leu Leu Asp Ile Val Asp Gln Leu Gln Ser Asp Val Asn Asp Leu

20 25 30

Asp Pro Asp Phe Leu Pro Ala Pro Gln Asp Val Gln Lys Gly Cys Glu

35 40 45

Gln Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Pro Ala Asn

50 55 60

Ala Gly Asp Asn Gly Lys Arg Ile Ser Ser Leu Ile Lys Gln Leu Lys

65 70 75 80

Arg Lys Leu Pro Ser Thr Lys Ser Lys Lys Thr Gln Lys His Arg Pro

85 90 95

Thr Cys Pro Ser Cys Tyr Ser Tyr Glu Lys Lys Asn Leu Lys Glu Phe

100 105 110

Leu Glu Arg Leu Lys Ser Leu Ile Gln Lys Met Ile His Gln His Leu

115 120 125

Leu Glu His Leu Arg

130

Claims

1.结合人IL-21的抗体，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中所述LCVR在CDRL1处为SEQ ID NO: 7、在CDRL2处为SEQ ID NO: 8并且在CDRL3处为SEQ ID NO: 9，并且其中所述HCVR在CDRH1处为SEQ ID NO: 10、在CDRH2处为SEQ ID NO: 11并且在CDRH3处为SEQ ID NO: 12。

2.根据权利要求1的抗体，所述抗体包含抗体重链和抗体轻链，其中所述重链包含具有SEQ ID NO: 1的HCVR，并且其中所述轻链包含具有SEQ ID NO:2的LCVR。

3.根据权利要求1或权利要求2的抗体，所述抗体由两条抗体重链和两条抗体轻链组成，其中每条重链均包含重链可变结构域，其氨基酸序列是SEQ ID NO:1的序列，并且其中每条轻链均包含轻链可变结构域，其氨基酸序列是SEQ ID NO:2的序列。

4.根据权利要求1或权利要求2的抗体，其中每条重链的氨基酸序列均是SEQ ID NO:3的序列，并且每条轻链的氨基酸序列均是SEQ ID NO:4的序列。

5.DNA分子，其包含编码抗体重链的多核苷酸并且包含编码抗体轻链的多核苷酸，所述抗体重链的氨基酸序列是SEQ ID NO:3的序列，所述抗体轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO:4的序列。

6.根据权利要求5的DNA分子，其中所述编码抗体重链的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:5的序列，并且其中所述编码抗体轻链的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:6的序列。

7.用根据权利要求5或权利要求6的DNA分子转化的哺乳动物细胞，所述转化的哺乳动物细胞能够表达包含两条抗体重链和两条免疫球蛋白轻链的抗体，其中所述两条重链中的每者的氨基酸序列均是SEQ ID NO:3的序列，并且所述两条轻链中的每者的氨基酸序列均是SEQ ID NO:4的序列。

8.用于生产抗体的方法，所述抗体包含两条抗体重链和两条免疫球蛋白轻链，其中所述两条重链中的每者的氨基酸序列均是SEQ ID NO:3的序列，并且所述两条轻链中的每者的氨基酸序列均是SEQ ID NO:4的序列，并且所述方法包括：

a. 在表达所述抗体的条件下培养根据权利要求7的哺乳动物细胞，以及

b. 回收所述表达的抗体。

9.可通过根据权利要求8的方法得到的抗体。

10.根据权利要求1至4或9中任一项的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗患者中的自身免疫病症，其包括向所述患者施用有效剂量的根据权利要求1至4或9中任一项的抗体。

11.根据权利要求10的用途，其中所述自身免疫病症是原发性舍格伦综合征、舍格伦综合征、系统性红斑狼疮、格雷夫斯氏病或I型糖尿病。

12.根据权利要求11的用途，其中所述自身免疫病症是原发性舍格伦综合征或舍格伦综合征。

13.根据权利要求11的用途，其中所述自身免疫病症是系统性红斑狼疮。

14.药物组合物，其包含根据权利要求1、2或9中任一项的抗体和药学上可接受的赋形剂。