MX2007014565A - Anticuerpos anti-il2. - Google Patents

Anticuerpos anti-il2.

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Stefan Pflanz
Jorg Volkland
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Abstract

La invencion se refiere a un anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento del mismo que se enlaza especificamente a la interleucina 2 humana IL2, en donde el anticuerpo monoclonal humanizado neutraliza la actividad de la IL2 humana mediante el enlace a la IL2 humana antes de, durante y/o susbsecuente al enlace de la IL2 humana al receptor de IL2 humana, y en donde la region variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humanizado comprende en su segunda region estructural la secuencia de aminoacidos contigua KAPKA en las posiciones de aminoacidos 42-46.

Description

ANTICUERPOS ANTI-IL2 CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de los mismos que se enlazan específicamente a la citocina humana IL2. La invención se refiere además a los polinucleótidos que codifican, a las composiciones farmacéuticas que comprenden, y a los usos médicos que involucran tales anticuerpos y fragmentos de los mismos ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La IL2 humana es una proteína de 133 aminoácidos (15.4 kDa) que no posee homología de secuencia significativa a cualcniera de otros factores. La IL2 es sintetizada como una proteína precursora de 153 aminoácidos con los primeros 20 aminoácidos amino-terminales que funcionan como una secuencia de señal secretora hidrofóbica. La proteína contiene un enlace disulfuro simple (posiciones de unión Cys58 / 3JD5 ) esenciales para la actividad biológica. Las actividades biológicas de IL2 son mediadas por un rec ptor de membrana que es expresado casi exclusivamente sobre células T activadas pero no en reposo. El receptor de IL2 completo consiste de tres subunidades de proteína transmembranal tipo I: alfa, beta y gamma: un receptor funcional de menor afinidad puede ser constituido por las proteínas SF. S1874S2 receptoras beta y gamma únicamente. Las células B en reposo y los Leucocitos mononucleares en reposo raramente expresan este re¡ceptor. La expresión del receptor IL2, en particular de la subunidad alfa, es modulada por múltiples factores, por ejemplo, IL5, IL6 y el factor de inducción de L2R/p55. IL2 de ratón y de humano provocan ambas proliferación de las células T de las especies homologas con una alta eficiencia. La IL2 humana es funcional también sobre células de ratón, pero no viceversa. La IL2 es un factor de crecimiento para todas las sub-poblaciones de linfoc tos T. Este es un factor de proliferación no especí ico de antígeno para células T, que induce progresión del ci lo celular en células en reposo y de este modo permite la expansion clonal de los linfocitos T activados. La IL2 tambiéij promueve la proliferación y diferenciación de células B actijadas . Como con la proliferación de células T, esta actividad también requiere la presencia de factores adicio?ales, por ejemplo, IL4. Debido a sus efectos sobre las células T y células B, la L-2 es un regulador central de las respuestas inmunes. La impfrtancia central de la IL2 en el inicio y amplificación de las respuestas inmunes adaptativas es bien ilustrada por la efii iencia clínica de los fármacos que son los más comunes utilizádos para suprimir respuestas inmunes indeseables tales como rechazos de trasplantes . Los fármacos inmunosupresores de cíe osporina A y FK506 (tacrolimus) inhiben la producción de IL2 para perturbar la señalización a través del receptor de cél las T, mientras que la rapamicina (sirolimus) inhibe la señalización a través del receptor de IL2. La ciclosporina A y la rapamicina actúan smergícamente para limitar las respuestas inmunes al prevenir la expansión clonal de las células T impulsada por IL2. Jo obstante, todos estos compuestos se dirigen a las vías de señalización intracelulares que no exclusivamente interfieren con la IL2, sino también con otros factores, Esto ianplica que la aplicación clínica de estos fármacos impone un riesgo considerable de efectos colaterales i .ndeseables debido a su especificidad objetivo limitada. Múltiples ejemplos de inhibidores de anticuerpos de la acti.vidad de IL2 son también conocidos en la técnica, por ejempl Ci el anticuerpo comercial de daclizumab (Zenapax®, Proteir. Design Lab, Inc.). No obstante, inhibidores de anticuerpo conocidos de la actividad de IL2 ejercen su efecto biológi co mediante el enlace del receptor de IL2 , en vez de al antígeno mismo. Dada las aplicaciones clínicas import?ites de los inhibidores de la actividad de IL-2, un objetivo de la presente invención es proporcionar inhibidores especí icos alternativos de la actividad de IL-2. SUMARIO DE LA INVENCIÓN En consecuencia, un aspecto de la invención proporqiona un anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento del mi_*Jmo que se enlace específicamente a la interleucina 2 humana (IL-2) en donde el anticuerpo monoclonal humanizado neutraliza la actividad de la IL2 humana mediante el enlace a la IL2 humana antes de, durante y/o subsecuente al enlace de la IL2 humana al receptor de IL2 humana, y en donde la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humanizado, comprende en su segunda región estructural la secuencia de aminoácidos contigua KAPKA, preferentemente en las posiciones de aminoácidos 42-46. Como se utiliza en la presente, los términos "anticuerpo monoclonal humanizado" o "anticuerpo humanizado" o "inmanoglobulina humanizada" o variantes gramaticalmente relacionadas de los mismos, se utilizan intercambiablemente para referirse a una molécula que comprende un sitio de enlace al antígeno derivado de una o más inmunoglobulinas no humanas, la molécula comprende además al menos una porción, por ejemplo, algunas de las regiones estructurales del dominic variable de cadena ligera o pesada derivado de una o más irmunoglobulinas humanas o las secuencias de línea terminal de las mismas. Un "anticuerpo humanizado" como se utiliza en la presente, incluye una inmunoglobulina del dominic variable de cadena ligera humanizada, y una inmunoclobulina del dominio variable de cadena pesada, humaniziada . El anticuerpo humanizado puede incluir una germinal humana V-kappa y V-lambda) . Mientras que la numeración preferida (por ejemplo las po.siciones de aminoácidos 42-46) de la secuencia de aminoác:idos KAPKA (por ejemplo, Lys-Ala-Pro-Lys-Ala) es proporc:ionada aquí para facilidad de correlación con la referencia citada anteriormente, se debe entender que las identidades de los aminoácidos dentro de esta secuencia parcial en vez de la numeración de secuencia en y por si misma, es determinante para la actividad del anticuerpo monocldnal humanizada de la invención. Como una persona experta, en la técnica sabe, existen múltiples convenciones para la numeración de secuencias de anticuerpo de línea ger?r?nc.1 humana, siendo la referencia anteriormente citada (VBase) únicamente una de éstas. Por lo tanto, la secuencia parcial de aminoácidos KAPKA comprendida dentro de la segunda región estructural de ciertas regiones variables de cadena ligera de línea germinal humana puede ser asignada con otra numeración de acuerdo a una convención de numeración diferente de aquella especificada en la cita anterior. En tal caso, la secuencia parcial de aminoácidos KAPKA poseería una numeración diferente de las posiciones de aminoácidos preferí.das 42-46, mientras que la secuencia correspondiente a las posiciones de aminoácidos preferidas 42-46 bajo esta otra convención de numeración probablemente sería una secuencia de aminoácidos diferente de KAPKA. En tal caso, como una persona experta en la técnica comprenderá, la secuencia de aminoácidos parcial con la secuencia "correcta" (KAPKA) pero de numeiracion desviada (algo diferente de las posiciones de ammoacidos preferidas 42-46, debería ser considerada como una característica esencial de la invención en vez de otra secuencia parcial de aminoácidos, la numeración de la cual es "correeta" (posiciones de aminoácidos 42-46), pero la identidad de la cual no es KAPKA. Se ha observado sorprendentemente que los anticuerpos o fragmentos de los mismos que carecen de la secuencia de consenso KAPKA en la segunda región estructural de cadena ligera, en particular que carecen del residuo de alanina terminal en este tramo, son capaces de enlazarse específicamente a IL2, pero no son capaces de neutralizar su actividad Este es especialmente el caso cuando las regiones CDR com rendiidas en las regiones variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo monoclonal humanizado son como se descrihen en las SEQ ID Nos.: 1-3 (para las CDRs 1-3 de la región variable de cadena ligera, respectivamente) , y las SEQ ID Nos . : 4-6 (para la CDRs 1-3 de la región variable de cadena pesada, respectivamente) . Sin estar comprometidos por alguna teoría, los inventores atribuyen a esta pérdida de actividad neutralizadora después de la omisión de la secuencia de consenso KAKPA, en particular después de la sustitucion del residuo de alanina terminal en este tramo, con otro aminoácido diferente de la alanina, a una desestabilización y/o a reacomodos conformacionales que tienen un efecto adverso sobre la neutralización, pero no sobre la actividad de enlace. El término "se enlaza específicamente" o las exprésiiones gramaticalmente relacionadas tales como "enlace específico", "enlace específico", "enlazador específico", etc., como se utilizan en la presente, se refieren a la habilidad del anticuerpo monoclonal humanizado o el fragmento del mismo para discriminar entre la IL2 humana y cualquier número de otros antígenos potenciales diferentes de la IL2 humana, a un grado tal que, a partir de un combinado de una pluralidad de antígenos diferentes como potenciales socios de enlace, únicamente la IL2 es enlazada, o es significativamente enlazada. Dentro del significado de la invenci.ón, la IL2 humana es "significativamente" enlazada, cuando de entre un combinado de una pluralidad de diferentes antígenos igualmente accesibles como socios de enlace potenciales, la IL2 humana, es enlazada al menos 10 veces, preferentemente 50 veces, más preferentemente 100 veces o más frecuentemente (en un sentido cinético) que otros antígenos diferentes de la IL2 humana. Como una persona experta en la técnica comprende, tales mediciones cinéticas pueden ser realizadas por ejemplo en un aparato Biacore, El anticuerpo humanizado o el fragmento del mismo de acuerdo al mismo es monoclonal. Como se utiliza en la presente, el término "monoclonal" se debe entender que posee el signJificado típicamente adscrito en éste en la técnica, a saber, un anticuerpo que reconoce un epitopo simple sobre el antígeno enlazado. Esto es en contraste al anticuerpo policlonal , el cual representa una colección de distintos anticuerpos que se enlazan al mismo antígeno, aunque en diferentes epitopos sobre este antígeno. Por esta razón, una molécula simple de antígeno puede ser simultáneamente enlazadla por múltiples moléculas del anticuerpo policlonal específico para este antígeno, pero únicamente por una molécula simple de un anticuerpo monoclonal particular específico para este antígeno; después del enlace por una molécula simple del anticuerpo monoclonal, el epitopo enlaz :a o es bloqueado y por lo tanto ya no está disponible para e enlace por otra molécula de anticuerpo monoclonal idéntica La naturaleza monoclonal del anticuerpo lo hace particulármente bien adecuado para el uso como un agente terapéutico, ya que tal anticuerpo existirá como una especie molecular homogénea, simple, la cual puede ser bien caracterizada y reproduciblemente elaborada y purificada. Estos factores dan como resultado un producto cuya actividad biológica puede predecirse con un alto nivel de precisión, una cor sideración muy importante si tal molécula va a ganar aprobacion regulatoria para la administración terapéutica en mamíferos, en particular en humanos. Como se utiliza en la presente, "neutralización", "neutralizador", "neutralizar", y variantes gramaticalmente relacionadas de los mismos, se refieren a la atenuación parcial o completa de o de los efectos biológicos de IL2.
Tal atenuación parcial o completa del o de los efectos biológieos de IL2 resulta de la modificación, interrupción y/o abrogación de la transducción de señal mediada por IL2, cuando es manifestada, por ejemplo, en la señalización intracelular, la proliferación celular, la liberación de las sustancias solubles, la supra- o subregulación de la activación del gen intracelular, por ejemplo, que da como resultado la expresión de receptores superficiales para los ligandos diferentes de IL2. Como una persona experta en la técnica entiende, existen múltiples medios de determinar si un agente, por ejemplo, un anticuerpo en cuestión o fragmento del mismo va a ser clasificado como un neutralizador. En general, esto puede ser logrado mediante una prueba in vi tro estándar realizada en general como sigue: En un primer experimento de proliferación, una línea celular, el grado de proliferación de la cual se sabe que depende de la actividad de IL2 , es incubada en una serie de muestras con concentraciones variantes de IL2, después de cuya incubación se mide el grado de proliferación de la línea celular. A partir de esta medición, se determina la concentración de IL2 que permitió la proliferación media máxima de las células. Un segundo experimento de proliferación es luego realizado em leanjdo en cada una de una serie de muestras, el mismo número de células que se utilizaron en el primer experimento de proliferación, la concentración anteriormente determinada de IL5 , y esta vez, concentraciones variantes de un anti .cuerpo o fragmento del mismo sospechosas de ser un neutralizador de IL2. La proliferación celular es nuevamente medida para determinar la concentración del anticuerpo o fragmenjto del mismo, suficiente para efectuar la inhibición media-máxima del crecimiento. Si la gráfica resultante de la inhibicion del crecimiento versus concentración del anti .cuerpo (o fragmento del mismo) es de forma sigmoidal, entone ;es ha sido efectuado cierto grado de inhibición del crecimiento dependiente del anticuerpo, por ejemplo, la actividad de la IL2 ha sido neutralizada en cierto grado. En tal caso, el anticuerpo o fragmento del mismo va a ser consíderado como un "neutralizador" en el sentido de la presente invención. Un ejemplo de una línea celular, el grado ce proliferación de la cual se sabe que depende de la actividad de IL2, es la línea celular CTLL2- comercialmente di .sponible de LGC Promochem. Otro ejemplo más de una línea celular adecuada es NK92 (DSMZ) . Sorprendentemente, el anticuerpo monoclonal humanizado de la invención neutraliza la actividad de la IL2 humana mediante el enlace a la IL2 humana antes de, durante y/o subsecuente al enlace de la IL2 humana al receptor de IL2 humana . Este modo de neutralización es altamente inesperado, Convencionalmente, la neutralización mediada por el anticuerpo de la actividad biológica de un ligando, dependíendo dicha actividad biológica del enlace del ligando a un receptor, es efectuada al prevenir la formación de tal complej o ligando-receptor. De acuerdo a este escenario clásico para la neutralización, un anticuerpo neutralizador se enlaza al ligando o al receptor en un sitio en la interconexión ligando-receptor. De esta manera, la presencia del anticuerpo previene estérica y/o electrostáticamente la ón del complejo ligando-receptor: el complejo ligando receptor no es formado, y la actividad biológica normalmente atribuida al enlace por el ligando a su receptor, no es efectuada. El modo de neutralización observado para un anticuerpo monoclonal humanizado de acuerdo a la invención, difiere agudamente de este escenario clásico en que la abrogacion de la actividad biológica normalmente atribuible a IL2 no depende de la prevención de la formación del complejo entre IL2 y su receptor. Esto significa que la actividad biológica de IL2 es abrogada no obstante de si IL2 ha sido o no enlazada al receptor de IL2 , implicando que el epitopo reconocido por un anticuerpo monoclonal humanizado de la invención, no está localizado sobre la porción de la IL2 que interactúa con el receptor de IL2. Como tal, la neutralización de IL2 puede ser lograda con un anticuerpo monoclonal humanizado de la invención por medios de diversos modos . De acuerdo a un primer modo, el anticuerpo se enlaza a IL2 en solución antes de la formación del complejo entre I 2 y su receptor, de modo que la transducción de la señal mediada por IL2 no tiene lugar en el caso en que IL2 se enlaza a su receptor. De acuerdo a un segundo modo, el anticuerpo se enlaza a IL2 al mismo tiempo que IL2 forma un complejo con su receptor. Nuevamente aquí, la formación simultánea de un complejo ternario receptor-lL2-anticuerpo no da como resultado alguna, o al menos ninguna transducción de señal significativa. De acuerdo a un tercer modo, IL2 ha formado ya un complejo con su receptor, y el anticuerpo se enlaza a IL2 mientras que IL2 existe en el complejo con su receptor sobre la superficie de una célula que posee el receptor de IL2. En este tercer escenario, la transducción de señal mediada por IL2 que tiene ya lugar antes del enlace de IL2 por el anticuerpo, es abrogada una vez que el anticuerpo es enlazado. Tal neutralización no clásica, por ejemplo la neutralización como es efectuada por un anticuerpo monoclonal humanizado de la invención, es muy sorprendente, y tiene varias |ventajas terapéuticas Primeramente, ya que un anticuerpo monoclonal humaniz;ado de la invención reconoce un epitopo de IL2 que no participa directamente en contacto con el receptor de IL2, no surge ninguna competencia entre el anticuerpo terapéutico por una parte, y el receptor de IL2 por otra parte. Esto tiene el efecto de que menores concentraciones del anticuerpo terapéutico pueden ser administradas a un paciente, que las que pocrían ser de otro modo posibles si una competencia de enlace para el mismo epitopo fuera a existir entre el anticuerpo y el receptor de IL2. Esto incrementa efectivamente la eficacia terapéutica de un anticuerpo monoclo al humanizado de la invención, ya que la concentración administrada puede ser reducida (con relación a aquella necesaria, dado un modo clásico de neutralización) , sin pérdida del efecto biológico. La administración de una menor cantidad del agente terapéutico es altamente deseable, no solamente desde el punto de vista de tolerancia del paciente, sino también desde un punto de vista económico, ya que la carga de costo de una terapia dada es reducida o, de manera contraria, un número mayor de pacientes puede beneficiarse de una cantidad dada del anticuerpo terapéutico, En segundo lugar, como se alude anteriormente, la habilidad de un anticuerpo monoclonal humanizado de la invención para enlazarse a y neutralizar la actividad biológica de IL2 ya en el complejo con su receptor, tiene la gran ventaja de que una transducción de señal mediada por IL2 ya corriendo, puede ser apagada sin IL2 teniendo primeramente que disociarse de su socio de enlace del receptor. Esto tiene el efecto final de que la actividad biológica de neutralización deseada de un anticuerpo monoclonal humanizado de la invención, es realizada más rápidamente in vivo que lo que es posible para otros neutralizadores de anticuerpo, clásicos que primeramente deben competir con el receptor de IL2 para el enlace al epitopo sobre IL2 antes de promover cualquier efecto terapéutico. Esta velocidad de acción puede ser especialmente ventajosa en escenarios agudos tales como el rechazo inmune de trasplantes de órganos, un campo conocido de la terapia anti-IL2. Una tercera ventaja de tal modo atípico de neutralización como se describe anteriormente, se refiere al hecho de que los receptores de IL2 están localizados sobre la superfieie de las células T. Las células T mismas producen IL2 y también responden a IL2 mediante proliferación, con lo cual se potencia su propia proliferación. En ciertas respues tas inflamatorias agudas, tal rechazo de tejido después de una operación de trasplante, es deseable no solamente para reducir la magnitud de la respuesta inflamajtoria atribuible a las células T existentes, sino también para reducir el número de células T que generan la respuesta inmune. Un anticuerpo monoclonal humanizado de la invención es especialmente efectivo para lograr este objetivo Como se explicó anteriormente, la actividad biológica de IL2 ya enlazada a su receptor sobre la superficié de la célula T será abrogada. No obstante, después de tal abrogación, un anticuerpo monoclonal humanizado de la invención permanecerá típicamente enlazado a IL2 (ef mismo enlazado al receptor de IL2) por un cierto tiempo, dirigiendo de este modo la célula T para la destrucción vía la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo ("ADCC", por sus siglas en inglés). En ADCC, una célula objetivo que es recubierta con inmunoglobulina es muerta por una célula efectora con receptores de Fc que reconoqen la porción Fc de la inmunoglobulina que recubre la célula objetivo. En la mayoría de los casos, las células efectoras que participan en ADCC son células asesinas naturales ("NK", por sus siglas en inglés) que poseen sobre su superficie, por ejemplo, el receptor de Fc, Fc-gamma-RIII . De est& manera, únicamente las células recubiertas por la ?nmunog[lobulina son muertas, de modo que la especificidad de la mulerte celular correlaciona directamente con la especiri icidad de enlace del anticuerpo. En el contexto de la presente invención, entonces, las células T que se han llegado! a recubrir con un anticuerpo monoclonal humanizado de la invención vía IL2 en complejo con su receptor, se vuelven células objetivo o diana en el sentido anterior, que son luego llisadas por ejemplo por una célula NK. El efecto es una atenuación rápida y efectiva de la respuesta inmune atribui le a las células que poseen los receptores de IL2 tales como las células T. De acuerdo a una modalidad de la invención, al menos una de la primera, tercera, y/o cuartas regiones estructurales de cadena ligera comprendida en el anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo corresponde (n) a una secuencia de línea germinal humana, para esa o esas regiones. De acuerdo a una modalidad adicional de la invenci-Ón, la región variable de cadena ligera o un anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento del mismo de la invención comprende en su región CDR1 una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No. : 1. De acuerdo a una modalidad adicional de la invención, la región variable de cadena ligera de un anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento del mismo de la invención comprende en su región CDR2 una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No.: 2. De acuerdo a una modalidad adicional de la invención, la región variable de cadena ligera de un anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento del mismo de la invención, comprende en su región CDR3 una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No.: 3. De acuerdo a una modalidad adicional de la invención la región variable de cadena ligera de un anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento del mismo de la invención comprende además en su región CDRl una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No. : 1, en su región CDR2 una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No.: 2 y en su región CRD3 una secuencia de aminoáclidos como se describe en la SEQ ID No.: 3. De acuerdo a una modalidad adicional de la invención, la región variable de cadena pesada comprende en su región CDRl una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No . : 4. De acuerdo a una modalidad adicional de la invencion, la región variable de cadena pesada comprende en su región CDR2 una secuencia de aminoácidos como se describb en la SEQ ID No.: 5. De acuerdo a una modalidad adicional de la invención, la región variable de cadena pesada comprende en su región CDR3 una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No. : 6. De acuerdo a una modalidad adicional de la invenci 5n, la región variable de cadena pesada comprende en su región CDRl una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No. : 4, en su región CDR2 una secuencia de aminoác idos como se describe en la SEQ ID No. : 5 y en su región CDR3 una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No . : 6. De acuerdo a una modalidad adicional de la invención, la región variable de cadena ligera de un anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento del mismo de la invención, comprende además en un región CDRl una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No.: 1, en su región CDR2 una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No.: 2 y en su región CDR3 una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No.: 3, y la región variable de cadena pesada comprende en su región CDRl una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No.: 4 en su región CDR2 una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No.: 5, y en su región CDR3 una región de amir.oácidos como se describe en la SEQ ID No.: 6. Estas regiones CDR han sido encontradas como especialmente ventajosas en el enlace a y neutralización en el efecto biológico de IL2 de la manera descrita anteriormente. De acuerdo a una modalidad adicional de la invención, la secuencia de aminoácidos de la región estructural de la primera cadena ligera, las secuencias de ammoacidos remanentes de la región estructural de la segunda cadena ligera, y la secuencia de aminoácidos de la región estructural de la tercera cadena ligera corresponden a cualquiera de aquellas del subgrupo de línea germinal humano VK1 en los locus 012, 02, 018, 08, A30, Ll , L15, L4 , L18, L5, L19, La, L23, L9 , Lll ó L12 ; o del subgrupo de línea germinal humana de VLl en el locus la; o cualquiera de aquellos del subgrupo de línea germinal humana VL2 en los locus 2c, 2e, 2a2, 2b2 En esta modalidad, las "secuencias de aminoácjidos remanentes de la región estructural de la segunda cadena ligera" se refiere a aquellos aminoácidos en la región estructural de la segunda cadena ligera diferentes de la secuendia KAPKA. Utilizando la numeración de la base de datos Vbase, entonces, "las secuencias de aminoácidos remanentes de la región estructural de la segunda cadena ligera" denota los aminoácidos en las posiciones 35-41 y 47- 49 inclusive de la segunda región estructural de cadena ligera, no obstante, de si esta región estructura de cadena ligera es una región estructural V-kappa o V-lambda (ver figuras 7a y 8a para la numeración de las secuencias de línea germinal humanas con relación a la región estructural V-kappa y V-lambda, respectivamente. En esta modalidad, se prefiere la incorporación adicional en la cuarta región estructural de cadena ligera de una secuencia correspondiente a aquella en la secuencia de línea germinal humana JK4, en particular FGGGTKVfEIK. Otras secuencias de aminoácidos adecuadas para el uso como la cuarta región estructural de cadena ligera incluye pero no están limitadas a FGQGTKVEIK, FGQGTKLEIK, FGPGTKVDIK, FGQGTRLEIK, FGTGTKVTVL, FGGGTKLTVL y FGGGTQLTVL.
De acuerdo a una modalidad adicional, al menos una de la órimera, segunda y/o tercera regiones estructurales de cadena pesada comprendidas en el anticuerpo monoclonal humano o fragriento del mismo, corresponden a una secuencia de línea germin4l para esa o esas regiones . De acuerdo a una modalidad adicional, la secuencia de amijoácidos de la primera región estructural de cadena pesada, la secuencia de aminoácidos de la segunda región estructural de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos de la tercera región estructural de cadena pesada corresponden a cualquiera de aquellas del subgrupo de línea germinal humano VH3 , en particular en el locus 3-07, donde la secuencia de ammoaqidos de la primera región estructural de cadena pesada es E/QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS, la secuencia de aminoáqidos de la segunda región estructural de cadena pesada es WVRQAPGKGLEWVA y la secuencia de aminoácidos de la tercera región estructural de cadena pesada es RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR . La secuencia de aminoácidos de la cuarta región estructural de cadena pesada puede ser venta osamente elegida, por ejemplo, en combinación con la¡ tres secuencias estructurales citadas anteriormente, dentro del locus de línea germinal 3-07, a partir de una de las iguientes secuencias: WGQGTLVTVSS, WGRGTLVTVSS, WGQGTMVfTVSS, WGQGTLVTVSS, WGQGTLVTVSS y WGQGTTVTVSS. En una modalidad preferida, el anticuerpo funciones efectoras in vivo tales como ADCC y la citotojiicidad dependiente del complemento ("CDC"). El mecanismo de ADCC es descrito anteriormente en la presente. En CDC, dos inmunoglobulinas idénticas se enlazan a dos antíger.os idénticos (por ejemplo, aquí IL2 sobre una célula T) o ICL superficie de una célula objetivo que sus respectivas porcior.es Fc entran en estrecha proximidad una con la otra. Este escenario atrae las proteínas del complemento, entre ellas las proteínas del complemento, por ejemplo, Clq, C3 , C4 y C9, la última de las cuales crea un poro en la célula objetivo. La célula objetivo o célula diana es muerta por esta perforación. Al mismo tiempo, la célula o células objetivo también se llegan a decorar en otros sitios sobre sus superficies . Esta decoración atrae células efectoras, las cueles matan luego a la célula o células objetivo, de una manera análoga a aquella descrita anteriormente, en el contexto del mecanismo de ADCC (ver por ejemplo, Gelderman et al. (2004). Trends Immunology 25, 158-64). Venta osamente, el anticuerpo IgG es un anticuerpo IgGl o un anticuerpo IgG4, los formatos del cual son preferidos, ya que su mecanismo de acción in vivo es particularmente bien comprendido y caracterizado. Esto es especialmente el caso para los anticuerpos IgGl . De acuerdo a una modalidad adicional de la invención, el fragmento del anticuerpo monoclonal humanizado puede er un scFv, un anticuerpo de dominio simple, un Fv, un diacueijpo , un diacuerpo tándem, un fab, un Fab' o un F(ab)2. Estos formatos pueden ser divididos en general en dos súbelas;es, a saber aquellas que consisten de una cadena polipeótídica simple, y aquellas que comprenden al menos dos cadenas polipeptídicas. Los miembros de la primera subclase incluyan un scFv (que comprende una región VH y una región VL uni a a una cadena polipeptídica simple vía un ligador polipéótido) ; y un anticuerpo de dominio simple (que comprende un dominio variable de anticuerpo simple que se enlaza específicamente a la IL2 humana) . Los miembros de la última subclase incluyen un Fv (que comprende una región VH y una reóiion VL como cadenas polipeptídicas separadas que no son coyalentemente asociadas una con la otra) , un diacuerpo (que cemprende dos cadenas polipeptídicas no covalentemente asociac.as , cada una de las cuales comprende dos regiones variabl es de anticuerpo - normalmente una VH y una VL por cadena polipeptídica - y acomodadas tal que, después de la asociac ion no covalente de una VH sobre una cadena poli Lpeptídica con la VL sobre la otra cadena polipeptídica respect iva y viceversa, resulta una molécula de anticuerpo bivaler te) ; un diacuerpo en tándem (anticuerpo Fv de cadena simple biespecíficos que comprenden cuatro regiones variables de i moglobulina covalentemente enlazadas, a saber - VH y VL de dos diferentes especificidades, que forman un homodímero que es dos veces más grande que el diacuerpo descrito anteriormente) ; una región Fab (que comprende como una caleña polipeptídica, una cadena ligera de anticuerpo entera, la misma comprendiendo una región VL y la región constarte de cadena ligera completa y, como otra cadena polipeptídica, una parte de una cadena pesada de anticuerpo que comprende una región VH completa y parte de la región constarte de cadena pesada, las dos cadenas polipeptídicas están intermolecularmente conectadas vía un enlace disulfuro intercatenario) ; una región Fab' (como Fab, descrita anteriormente, excepto con enlaces disulfuro reducidos adicionales, comprendidos sobre la cadena pesada del anticuerpo); y una región F(ab)2 (que comprende dos moléculas Fab' , cada molécula Fab' está enlazada a la otra molécula Fab' respectiva, vía enlaces disulfuro intercatenarios) . En general, los fragmentos de anticuerpo del tipo anteriormente descrito permite mayor flexibilidad en el diseño, por ejemplo, las propiedades farmacocinéticas de un anticuerpo, deseadas para la administración terapéutica a las exigencias particulares a la mano. Por ejemplo, puede ser deseable reducir el tamaño del anticuerpo administrado, con el fin de incrementar el grado de penetración tisular cuando se trata en tejidos que se sabe están pobremente vascularizados (por ejemplo, articulaciones) . Bajo ciertas circunstancias, puede ser también deseable incrementar la velocidad a la cual el anticuerpo terapéutico es eliminado del cuerpo, la velocidad en geneiral es acelerable al disminuir el tamaño el anticuerpo adminis trado. De acuerdo a una modalidad adicional de la invenci ón, el anticuerpo monoclonal humanizado puede estar present e en formas monovalentes, monoespecífica o multiv4lente, mono- o multiespecífica, en particular divalerite mono- o biespecífica. En general, una forma multivc.lente monoespecífica, en particular un anticuerpo monoes ecífico bivalente puede traer consigo la ventaja terapéutica de que la neutralización efectuada por tal anticuerpo es potenciada por los efectos de avidez, por ejemplo, el enlace a las múltiples moléculas del mismo antíge?o, aquí la IL2 humana, por el mismo anticuerpo. Varias formas monoespecíficas monovalentes del anticuerpo de la invención han sido descritas anteriormente (por ejemplo, una sc:*"*v, una Fv o un anticuerpo de dominio simple) . Un multiespecífico multivalente, una forma multiespecífica bivalente, en particular las formas biespecíficas bivalentes del anticuerpo monoclonal humanizado anti-IL2 humana de la i venci .ón, pueden incluir una igG completa en la cual un brazo de enlace se enlaza a la IL2 humana, mientras que el otro bifazo de enlace se enlaza a otro diferente antígeno de la IL2 humana. Una forma multiespecífica, multivalente adicional, en particular la forma biespecífica bivalente puede ser venta osamente un anticuerpo biespecífico humanizado de cadena simple, por ejemplo, una construcción de anticuerpo humanizado recombinante que comprende dos entidades scFv como se describe anteriormente, conectadas en una cadena polipeptídica contigua por un espaciador polipeptídico corto entre las dos entidades scFV como es conocic.o en la técnica. Aquí, una porción scFv del anticuerpo de cadena simple biespecífico comprendido dentro del anticuerpo de cadena simple biespecífico se enlazará a la IL2 humana como se describe anteriormente, mientras que la otra porción scFV respectiva de este anticuerpo de cadena simple biespecífico se enlazará a otro antígeno determinado como de beneficio terapéutico. De acuerdo a una modalidad adicional, el anticuerpo monoclcnal humanizado o los fragmentos del mismo, pueden ser derivados, con un polímero orgánico, con una o más moléculas de polietilenglicol ("PEG"). Como es conocido en la técnica, tal deñvatización puede ser ventajosa en la modulación de las propiedades farmacodinámicas de los anticuerpos o fragmentos de los mismos. Un scFv es un fragmento de anticuerpo especialmente preferido (monoespecífico monovalente) especialmente un scFv que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No.: 11 o en la SEQ ID No. : 12. Un aspecto adicional de la invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de homología, preferentemente al menos 80, 90 o aún mejor al menos 95% de homología, con un aminoácido, como se describe en cualquiera de las SEQ ID Nos.: 1-12. La homología puede ser detjerminada mediante programas estándares de alineamiento de sec encia tales como Vector NTl (InforMax®, Maryland, Estadoe Unidos) . Tales programas comparan las secuencias alineadas en una base aminoácido por aminoácido, y pueden ser establecidos a diversos niveles de exigencia para la comparación (por ejemplo, aminoácido idéntico, sustitución conservadora de aminoácido, etc.). Como el término se utiliza en la presente, dos aminoácidos en cuestión son considerados como una "sustitución conservadora" uno del otro, si éstos pertenecen al mismo grupo principal. A manera de ejemplo no limitante, dos diferentes aminoácidos que pertenecen al grupo de aminoácidos no polares, podrían ser considerados una "sustitución conservadora" uno del otro, incluso si estos dos aminoácidos no fueron idénticos, en donde un aminoácido no polar por una parte y un aminoácido básico por la otra parte podrían no ser considerados una "sustitución conservadora" uno del otro. Panel 3.1 de "Molecular Biology of the Cell", 4fl. Edición (2002), por Alberts , Jonson, Lewis, Raff, Roberts y Walter agrupan los aminoácidos en cuatro grupos principales: ácidos, no polares, polares no cargados y básicos. Tal agravamiento puede ser utilize.do para los propósitos de determinar, para los fines de la presente invención, si un aminoácido particular es una "susti ución conservadora" de otro aminoácido en cuestión. Otro aspecto más de la invención proporciona una molécul a polinucleotídica. Esta molécula polinucleotídica comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuenc ia de aminoácidos como se describe en cualquiera de las SEQ ID Nos.: 1-12 o una secuencia nucleotídica que muestr, al menos 60%, preferentemente al menos 65, 70, 75, 80, 8 , 90 ó 95% de homología con la secuencia de núcleo idos. Aquí, la homología puede ser determinada por la comparteion de una molécula polinucleotídica que comprende una sequenci:a nucleotídica que codifica para una secuencia de aminoác idos de cualquiera de las SEQ ID Nos.: 1-12, como una molécul a polinucleotídica que tiene una secuencia de núcleo idos en cuestión ("secuencia de prueba") por alineac ion de secuencia, y en donde un nucleótido en la secuenc ia de prueba es considerado homólogo si éste es ya sea idéntico al nucleótido correspondiente en la secuencia de núcleo idos que codifica para una secuencia de aminoácidos corres*pondiente de cualquiera de las SEQ ID Nos.: 1-12, o si una o más desviaciones de nucleótidos en la secuencia de prueba proveniente de o de los nucleótidos correspondientes en la secuencia de nucleótidos que codifica para una secuenc ia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID Nos.: 1- 12, da como resultado un triplete de nucleótidos el cual, cuando es traducido, da como resultado un aminoácidos el cual es ya ?ea idéntico a (debido a un triplete degenerado) o una sustitución conservadora del aminoácido correspondiente en la secuenc ia de aminoácidos correspondiente de cualquiera de las SEQ IJ Nos : 1-12. Aquí, el término "sustitución conservadora" se debe entender como se describe anteriormente . Un aspecto adicional de la invención proporciona una composición farmacéutica que incluye un anticuerpo monoclqnal humanizado o fragmento del mismo o una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia nucleotídica que codifida para una secuencia de aminoácidos como se describe en cualquiera de las SEQ ID Nos.: 1-12 o que codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de ammoacidos que posee al menos 70% de homología a cualquiera de las SEQ ID Nos.: 1-12, en donde la "homología" debe entenderse como se explicó anteriormente en la presente, De acuerdo con esta invención, el término "composición farmacéutica" se refiere a una composición para la administración en un paciente mamífero, preferentemente un paciente humano. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende una composición para la inyección o infusión parenteral. Tal inyección o infusión parenteral gragea) , una cápsula, una solución, una suspensión y/o una emulsion Alternativamente, la administración puede ser rectal, y puede ser aplicada por ejemplo, como un suposi orio, una cápsula rectal y/o un ungüento o pomada. AlterncLtivamente, la administración puede ser intranasal, y puede ser aplicada por ejemplo, como gotas, un ungüento o pomada y/o un rocío. Alternativamente, la administración puede ser pulmonar, por ejemplo, vía la o las membranas mucosas; de los bronquios y/o los alvéolos, y puede ser apli .cada por ejemplo, como un aerosol y/o un inhalante. Al .ternativamente, la administración puede ser conjuntival, y puede ser aplicada por ejemplo, como gotas oftálmicas, un ungüent:o oftálmico y/o un enjuague oftálmico. Al .terneitivamente, la administración puede ser efectuada vía la o las membranas mucosas del tracto urogenital, por ejempl , puede ser intravaginal o intrauretral, y puede ser apli .cada por ejemplo, como un supositorio, un ungüento y/o una adu a. Se debe entender que las alternativas de admini tración anteriormente mencionadas no son mutuamente exclusiivas, y que una combinación de cualquier número de ellas puede constituir un régimen terapéutico efectivo. La composición farmacéutica de la presente invenc: ón puede comprender además un portador farmacéutico. Los ej mplos de portadores farmacéuticos adecuados son bien conocídos en la técnica e incluyen soluciones salinas lactate.do, o aceites fijos. Los vehículos adecuados para la administración intravenosa o intraarterial incluyen reabastlecedores nutrientes y de fluidos, reabastecedores de electrolitos (tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer), y similares. Los conservadores y otros aditivos pueden también estar presentes tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes, y similares. Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender portadores proteicos por enemplo como albúmina sérica o inmunoglobulina, preferemtemente de origen humano. Se considera que la composición farmacéutica de la invención puede comprender además del anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento del mismo (como se describe en esta invención) , agentes biológicamente activos adicionales, dependiendo del uso pretendido de la composición farmacéutica. Tales agentes pueden ser fármacos que actúan sobre el sistema gastrointestinal, fármacos que actúan como citostáticos, fármacos que previenen la hiperuricemia, fármacos que inhiben las inmunorreacciones (por ejemplo, corticoesteroides) , fármacos que modulan la respuesta inflamatoria, fármacos que actúan sobre el sistema circulatorio y/o agentes tales como citocir.as conocidas en la técnica. Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un uso de un anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento del mismo como se describe anteriormente en la presente o de una molécula polinucleotídica como se describe anteriormente en la presente, en la fabricación de un medicamento, que comprende opcionalmente, uno o más agentes anti-ir.flamatorios adicionales para el tratamiento de enfermedades inflamatorias en mamíferos, preferentemente en humanoe| . Venta osamente, tales enfermedades inflamatorias son elegidas del grupo que consiste artritis reumatoide (RA) , asma, esclerosis múltiple (MS) , enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , síndrome de insuficiencia respiratoria aguda (ARDS), fibrosis pulmonar idiomática (IPF) enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) , uveitis, degeneración macular, colitis, psoriasis, degeneración Waleriana, síndrome antifosfolípido (APS) , síndrome coronario agudo, restenosis, ateroesclerosis, policondritis de recidiva (RP), hepatitis aguda o crónica, implantes ortopédicos fallidos, glomerulonefritis, lupus, trastornos autoinmunes, pancreatitis aguda o espondilitis anquilosante (AS) . Un aspecto adicional de la invención proporciona un uso de un anticuerpo monoclonal humanizado o fragmentos del mismo, como se describe anteriormente en la presente o de una molécula polinucleotídica como se describe anteriormente en la presente en la fabricación de un medicamento, que comprende opcionalmente uno o más agentes anticancerosos adicionales, para el tratamiento de una enfermedad tumoral u implantes ortopédicos fallidos, glomerulonefritis, lupus, trastornos autoinmunes, pancreatitis aguda o espondilitis anquilosante (AS) . Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para tratar una enfermedad tumoral en la cual un anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento del mismo como se describe anteriormente en la presente o una molécula polinucleotídica como se describe anteriormente en la presente, se administra (opcionalmente junto con uno o más agentes anti-cancerosos adicionales) a un mamífero, preferentemente a un sujeto humano en una cantidad suficiente en un periodo de tiempo suficiente para prevenir y/o mejorar la enfermedad tumoral u otra condición con apoptosis celular retardaba, supervivencia o proliferación celular incrementada. Preferentemente la enfermedad tumoral es un cáncer, el cáncer es preferentemente una leucemia, mieloma múltipl|e, carcinoma gástrico o carcinoma de piel. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La invención será descrita ahora por medio de las siguienjtes figuras y ejemplos no limitantes. Un panorama general de las figuras es como sigue: Figura 1 Enlace al antígeno retenido después de la humanización de la región VL Figura 2 Pérdida de la actividad neutralizadora después de la inmunización de la región VL comerc almente disponible como una terapéutica certif cada. Ejemplo la: Expresión recombinante de E. coli La hIL2 madura (por ejemplo, que codifica para los residuos de aminoácidos APTSSS... IISTLT) fue clonada como una estructura de lectura abierta simple ("ORF") dentro del vector de expresión procariótico de Pbad (Invitrogen) utilizando la PCR estándar y la tecnología de biología molecul ar. En el extremo 5' tres nucleótidos que codifican para una metionina fueron agregados, sobre el extremo 3' fue inserte.do en la secuencia de nucleótidos antes del codón de detenci ón que fusiona un marcador de hexahistidina al extremo C de 1 proteína. Esta construcción fue utilizada para transformar E. coli competente (cepa BL21 de (DE3), Strategene) utilizando las mstrucciones proporcionadas por el fabricante. Las bacteri as fueron desarrolladas en medio LB estándar a una densidad de OD (600 nm) = 0.5, luego se agregó L-arabinosa a una co?centración de 0.2% p/v para disparar la expresión por 5 hora,s La cosecha de E. coli fue realizada mediante centrifugación por 10,000 g por 15 minutos. Luego la fraccico?n insoluble (cuerpos de inclusión) fue preparada utiliz do el reactivo de BugBuster y el protocolo (Novagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los cuerpos de inclusión fueron solubilizados en clorhidrato de guanidina 6 M ("GuHCl"), y fueron luego diluidos a 0.1 mg/ml con un amortiguador que contenía GuHCl 2 M (pH = 8.0) /glutatione 1 mM-ox/glutatione-red 10 mM y se incubó por 16 horas a 202C. Después de la incubación, el pH fue ajµstado a 6.0 por la adición lenta de ácido acético glacial) mientras que se agitaba vigorosamente. Finalmente, dirigen a una proteína soluble secretada, tal como la citocina a hIL2, reconocen un epitopo que está al menos parcialmente traslapado con el epitopo reconocido con un componente del receptor de citocina correspondiente. De este modo, el mAb compite directamente con el receptor para el enlace a la citocina. Este mecanismo de acción implica que la neutralización puede ser efectivamente lograda. El mAb debe ser aplicado a una dosis suficientemente alta con el fin de no dompetir con el receptor de citocina. Ejemplc 2a : Punto inicial - ? anticuerpo monoclonal anti-hIL2 cqmercialmente disponible como proteína Para obtener un entendimiento del grado al cual los difere?tes mAbs anti-hIL2 podrían neutralizarse como se mencionó anteriormente, los mAbs anti-hIL2 fueron producidos mediante inmunización de ratones, seguido por la cosecha de célulae del bazo, y fusión de hibridoma, todo de acuerdo a los protocolos estándares. Además, los mAbs anti-hIL2 comerc almente disponibles fueron adquiridos. La herramienta de los mAbs disponibles fue utilizada para comparar las caractérísticas de los diferentes anticuerpos en tres ensayo**} : el enlace al antígeno soluble como se probó por ELISA, enlace al antígeno asociado a la superficie celular como s probó por FACS, y capacidad para la neutralización de la bioacttividad de hIL2 como se probó por un ensayo de prolif ¿ración celular.
El ensayo de ELISA fue realizado como sigue: Todas las incubaciones fueron realizadas a 209C.
Las placas de ELISA de 96 pozos recubiertas con estreptavidina (Nunc) fueron utilizadas para acoplar la proleucina biotinilada con PEG, 01 µg en 100 µl de PBS-TB (solución salina amortiguada con fosfato, pH = 7.4, 0.05% v/v de Tween 20, 1% de p/v de BSA) por pozo por 30 minutos Luego, la placa se lavó tres veces con 200 µl por pozo de PBS-T (solución salina amortiguada con fosfato, pH = 7.4, Tween- 0 al 0.05% v/v). Las diferentes muestras del mAb fueron agregadas, 100 µl por pozo y las muestras fueron incubadas por 1 hora. Luego, la placa fue lavada 3 veces con 200 µl por pozo de PBS-T. El anticuerpo de detección aplicado fue un mAb de cabra conjugado a HRP anti-lgG humana (Jackson Um unoresearch) , diluida 1:1000 en PBS-TB, 100 µl por pozo e incubación por 1 hora. Luego, la placa fue lavada 3 veces con 200 µl por pozo de PBS-T. El enlace del anticuerpo al antígeno fue cuantificado finalmente por incubación con el sustrato de HRP: 100 µL de 2,2'-azino-di [ácido 3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico] ("ABTS") amorti?ruador de sustrato (Roche Diagnostics, tabletas de ABTS) y la placa se incubaron por 5 a 10 minutos hasta que se desarrolló un colorante verde. La tinción fue medida a 405 nm sobre un vector de placas de 96 pozos. El ensayo de FACS fue realizado como sigue: Para el crecimiento óptimo bajo las condiciones de cultivo celular, la línea de células de li?foma asesinas naturales, humanas, NKL, depende de la presencia de aproximadamente 5 ng/ml de hIL2 en el mefio (medio Basal de Iscove (Biochrom AG) ; 10% v/v de¡ suero fetal bovino (Biochrom AG); 100 µg/ml de penicilina/estreptomicina (Biochrom AG) ) . Las células NKL, 1 x 10° por ml , fueron privadas de hIL2 por horas en la preparación del experimento mediante cultivo del medio libre de hIL2 Inmediatamente antes del experimento, las células fueron lavadas con el medio libre de hIL2. Todas las siguientes incubaciones fueron realizadas a 49C por 30 minutos; para el lavado, el amortiguador de PBS-F (soluc ion salina amortiguada con fosfato, suero fetal bovino al 3% v/v) se utilizó a 49C, también, Primeramenté, se incubaron 2 x 105 células NKL en 200 µl de medio, con 1 µg de hIL2 humana recombinante o se dejaron sin hIL2 bajo las mismas condiciones, Subsecuentemente, las células fueron lavadas 3 veces cada vez con 2 ml de PBS-F. Luego, 2 x 105 células fueron incubadas con diferentes mAbs de ratón anti-hIL2 , 1 µg en 200 µl de medio, a 4aC por 30 minutos. Las células fueron lavadas nuevamente 3 veces, como se indicó anteriormente, y al final se incubaron con un mAb de cabra de detección anti-lgG de ratón, conjug ado a FITC (Jackson Immunoresearch) , diluido 1 :1000 en 200 µl de PBS-F. Después de tres lavados adicionales, la fluorescencia celular de las células que mantienen hIL2 sobre su superficie versus las células simples se analizó sobre una máquina de FACS. El ensayo de proliferación fue realizado como sigue: Para el crecimiento óptimo bajo condiciones de cu Ltivo celular, la línea celular CTL murina, CTLL-2 (LGCPromochem) depende de la presencia de aproximadamente 5 ng/ml de hIL2 en el medio (medio basal de Iscove (Biochrom AG) ; 10% de v/v de suero fetal bovino (Biochrom AG ) ; 100 µg/ml de penici lina/estreptomicina (Biochrom AG); 2-mercap toetanol 0.5 mM (Gibco) ) . La hIL2 de ratón y de humano funcionan igualmente bien manteniendo la super ivencia y proliferación de las células CTLL-2. Las células CTLL-2, 1 x 106 por ml , fueron privadas de h::L2 por 12 horas, en la preparación del experimento por cultivo en el medio libre de hIL2. Inmediatamente antes del experimento, las células fueron lavadas con el medio libre de hIL2.
Una laca de cultivos de tejidos de 96 pozos fue utilizada para realizar el experimento de proliferación y para evaluar la inhibición de la bioactividad de hiL2 por diferentes mAbs. Un volumen de ensayo final de 200 µl fue aplicado por pozo, este volumei incluyó: 5 x 104 células CTLL, 2 ng/ml de hIL2 (para permitir aproximadamente la proliferación media máxima y los diferentes mAbs anti-hIL2 a una concentración de 5000 ng/ml, 1000 ng/ml, 200 ng/ml y 40 ng/ml . Todas las muestras fueron preparadas por tripli cado. Las mezclas respectivas fueron incubadas a 48 horas a 379C en una cámara humidificada en presencia de 5% de dióxido de carbono Luego, las células viables fueron detectadas utilizando una lectura de colorante fluorescente AlamarBlue (Biosoirce Internacional) y un lector de placas de f luorescencia de 96 pozos de acuerdo a la recomendación del fabricante. Se encontró que el mAb202 (comercialmente disponible de R&D Systems) (i) se enlaza al antígeno solubl e, (ii) se enlaza al antígeno asociado a la superficie celular, y (iii) neutraliza eficientemente la bioactividad de hIL2. Entre los anticuerpos probaclos, únicamente el mAb 202 calificó en los tres ensayos, y por lo tanto, fue considerado un candidato promisorio de acuerdo a las características definidas anteriormente y fue por lo tanto elegido como un punto inicial para los experimentos subsiguientes.
Ejemplo, 2b: Determinación de la secuencia primaria del anticuerpo anti-hIL2 mediante secuenciamiento: identificación de las [secuencias a partir de la región variable de la cadena pesada ("VH") y la región variable de la cadena ligera ( "VL" ) Debido a la falta de disponibilidad del clon de hibridolma mAb202, el mAb fue secuenciado para identificar las secuencias de aminoácidos de VH y VL. Para este fin, fueron preparados fragmentos Fab de mAb202. Estos fragmentos fueron sometidos a digestión proteolítica con HPLC en línea para la separacion de los péptidos. Subsecuentemente, los péptidos individuales fueron analizados con respecto a la composición y secuencia de los aminoácidos por una espectrometría de masa MS/MS. Este procedimiento condujo a la identificación de las secuencias de proteína de VH y VL. Ejemplo 2c : Control para la funcionalidad retenida: fusión de las regiones secuenciadas VH/VL con regiones constantes de ratón, conocidas Se deseó una verificación funcional de los result dos de secuenciamiento obtenidos a partir del secuencbiamiento de la proteína, mAb202 descrita anteri rmente. De este modo, un gen que codifica para la VH seouenciada fue sintetizado y clonado dentro de un vector de expresión que proporciona las regiones const :antes de una igGl de ratón. De igual modo, un gen que codifica para la VL secuenciada fue sintetizada y clonado de un vector de expresión, proporcionando un dominio C kapa de expresión. Estos dos vectores de expresión podrían permitir idealmente la reconstrucción del mAl>202 original, la funcionalidad del cual podría ser luego probada nuevamente como se describe anteriormente. Después; de la co-expresión de ambos vectores en las células; 293, un mAb anti-IL2 fue detectado en los sobrenadantes celulares con características comparables a aquellas observadas con el mAb202 original. La concordancia de la actividad (por ELISA así como en ensayo de proliferación utilizando una línea celular CTLL-2) observada para el mAb reconstruido después del secuenciamiento de la proteína, con aquellos del mAb202 progenitor, puede ser tomada como una confirmación de que las sei uencias determinadas para las regiones VH y VL de este anticuerpo, eran correctas. Ejempl(p 2d: Humanización de la cadena pesada La intención de la humanización es retener complejamente la especificidad de enlace y la actividad biológ.Lca de un anticuerpo, mientras que al mismo tiempo se reduce al mínimo el contenido de la secuencia no humana presente en un mAb. El último objetivo da como resultado un anticuerpo que es menos probable que promueva una respuesta inmune cuando se administre a un sujeto humano, que su anticuerpo progenitor, de origen no de ratón la secuencia estructural VL humana más estrechamente relacionada fue buscada. Las tres CDRs fueron retenidas. La estructµra VL humana 012 /Jk4 pareció ser el pariente más cercano en secuencia. Un total de 22 residuos de aminoácidos fueron diferentes en las estructuras VL entre la VL de ratón y 012/Jk4 humana. La siguiente alineación muestra una comparación directa entre las estructuras de ratón y humana 012 /Jk4 originales; las secuencias CDR originales están 10 subrayadas, la identidad de aminoácidos entre ambas secuenqias es indicada por un asterisco, VIeratón DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVG YQQKPGQSPKA IYSASFRYS 012/Jk4 DIQ QSPSS SASVGDRVTITCKASQNVGTNVGWYQQKPGKAPKL IYSASFRYS * * **** * ****** ******************** ** ********** i c Vteratón GVPDRFTGSGSGTDFSLTISNVKSED AEYFCQQYYTYPYTFGGGTK EIK 012/Jk4 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISS QPEDFATYYCQQYYTYPYTFGGGTKVEIK *** ** ******* *+** ** * * **************** *** Las construcciones que contienen la VL de ratón original o la VL humanizada, en lo subsiguiente del texto 20 sera respectivamente denominadas como cLC (cadena ligera quimérpjca que comprende una VL de ratón y Ckapa humana) y hLC (cadena ligera humanizada que comprende una VL que contiene CDR de ratón dentro de una estructura VL humana y Ckapa humana) . Para los propósitos dé expresión de proteína 25 recombilnante de la cadena ligera humanizada, las estructuras de lectura abierta que codifican para la VL humanizada en combinajción con el dominio Ck humano fueron clonadas dentro de un vector adecuado (Raum T et al. (2001) Cáncer Immunol I munother. 50, 141-50) Ejemplo 2e.l: Permutación de las secuencias de humano y de ratón fomo regiones estructurales completas; evaluación del enlace y neutralización por un ensayo de proliferación Después de que había sido realizada la humanización exitosa de la cadena pesada y la cadena ligera, las caract rísticas de los mAbs humanizados resultantes, fueron probadas en comparación al mAb quimérico, por ejemplo, la molécula de anticuerpo que contiene los dominios variables completamente murinos. Ya que el mAb quimérico mostró neutralización de la bioactividad de IL2 comparable al mAb origineJ , éste se utilizó como una referencia para estos experimentos . Los pares de vectores de expresión que codifican para las cadenas pesada y ligera fueron utilizados para la co-transfección transitoria de las células 293 (el protocolo aplicado fue idéntico al procedimiento de transfección descrito en el ejemplo lb, excepto que las células fueron transfectadas con dos plásmidos simult neamente) . Después de la expresión en células 293, cantidades comparables de las diferentes versiones del mAb en los sobrenadantes celulares fueron verificadas por una ELISA anti-hlgG que se llevó a cabo como sigue: Una placa de ELISA de 96 pozos (Nunc) fue incubada con un dilución 1:2,000 en PBS del mAb anti-hlgG (Abcam LTD) , 1 .00 µl por pozo, 12 horas a 42C. Cada pozo fue lavado 3 vece con 200 µl de amortiguador PBS-T y luego 100 µl de los sobrenadantes puros cosechados de las células 293 y la dilución en serie de los sobrenadantes en el medio se llenaron dentro de cada pozo y se incubaron por 1 hora a 209C. Nuevamente, cada pozo fue lavados 3 veces con 200 µl de amortiguador PBS-T. Una dilución 1:1,000 en PBS-TB, del mAb de cabra anti-lgG humana conjugada a HRP (Jackson Immonoresearch) fueron agregados a los pozos, 100 µl por pozo se incubaron por 1 hora a 20SC. Luego la placa fue lavada 3 veces con 200 µl por pozo de PBS-T. El enlace del anticuerpo al hlgG finalmente fue cuantificado por incubación con el sustrato HRP: 100 µl del amortiguador de sustrato ABTS (Roche Diagnoetics, tabletas de ABTS) y la placa se incubaron por 5 a 10 minutos hasta que el colorante verde se reveló. La tinció? fue medida a 405 nm sobre un lector de placas de 96 pozos. Únicamente los sobrenadantes con cantidades comparables del mAb fueron utilizadas para todos los experimentos subsiguientes. El enlace al antígeno de los diversas mAbs fueron probados mediante ELISA (ver arriba) . Las características de los mAbs generados respecto al enlace del antígeno soluble y respecto a la neutralización de la tioactividad de IL2 fue analizada por ELISA y un ensayo de proliferación de CTLL-2 respectivamente (ver ejemplo 2a anterior para los protocolos experimentales detallados) . En el experimento de ELISA, unidades de absorbancia cada vez mayores serán indicadores de cantidades incrementadas del enlace del mAb al antígeno hIL2. En el ensayo de proliferación de CTLL-2, unidades de fluorescencia cada vez mayores serán indicadoras de un número incrementado de célulae metabólicamente activas (= vivas) . Todos los sobrenadantes celulares ("SN") que contenían las diferentes versiones del mAb fueron controladas para concentraciones uniformes de mAb por una ELISA anti-hlgG antes de que se sometieiran a los siguientes experimentos. Los resultados de un experimento representativo son mostrados en la figura 1. Aquí, ambas combinaciones de hLC + hHC (hLC = cadena ligera humani?;ada, hHC = cadena pesada humanizada) y cLC + hHC (cLC = cadena ligera quimérica) muestran enlace comparable al antígeno hIL2. Los resultados del ensayo de CTLL-2 (figura 2) muestran que hLH + hHC no conducen a ninguna neutralización detectable de la bioactividad de hIL2 debido a que la fluorescencia detectada no es diferente de la SN control. En contraste, Clh + hHC reduce el número de células vivas como es evidente por una reducción en la fluorescencia dependí-ente de la concentración del mAb. La aplicación de las cadenas individuales cLC o hHC en este ensayo no tuvo impacto sobre la supervivencia celular dependiente de hIL2 ammoacidos Específicamente, la estructura 2 de ratón comprende la secuencia parcial de aminoácidos OSPKA, mientras que la secuencia humana correspondiente es KAPKL (aminoácidos que difieren entre la especie humana y de ratón han sido subrayados para claridad) Ejemplo] 2e.2: Permutación de las secuencias humana y de ratón (µentro de la estructura 2; evaluación del enlace neutralización por un ensayo de proliferación y un ensayo de inducción del gen objetivo Para determinar si los tres cambios de aminoácidos o únicamente algunos son decisivos en términos de la provisión de un mAb neutralizador, un grupo adicional de experimentos fue realizado. Para este fin, los residuos QS o A de aminoácidos derivados de ratón fueron re-introducidos dentro del hLC. Las características de los mAbs resultantes con respecto al enlace del antígeno soluble y la neutralización del bifactividad de IL2 fueron analizadas mediante ELISA y un ensayo de proliferación de CTLL-2 respectivamente (ver Ejemplo 2a anterior para los protocolos experimentales detallados) . En el experimento de ELISA, unidades de absorbencia cada vez mayores son indicadoras de cantidades carda ?ez mayores del enlace del mAb al antígeno hIL2. En el ensayo de proliferación de CTLL-2, las unidades de fluorescencia cada vez mayores son indicadoras de un número Esto muestra que un residuo de aminoácido simple localizado en la estructura 2 de VL defina si el mAb neutraliza la bioactividad de IL2 : el residuo de alanina en esta posición, derivado de la estructura 2 del ratón, permite la neutralización, el residuo de leucina, derivado de la estructura 2 humana, no lo hace. E emplo 3: Determinación del modo de neutralización En lo subsiguiente, el término "anti-IL2" denota un anticuerpo humanizado anti-IL2 que comprende una cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No.: 9 (la misma comprendiendo una región VL con una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No.: 7 ) y una cadena pesada que comprende una secuenqia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No.: 10 (la misma que comprende la región VL con una secuencia de aminoác idos como se describe en la SEQ ID No. : 8) . La VL del anti-IL2 comprende la secuencia de aminoácidos "KAPKA" como se explica anteriormente en el ejemplo 2e.2 Se deseó comprender mejor el modo de neutralización de hlL2 por anti-lL2. Para este fin, fueron realizados los experimentos para estudiar la naturaleza de enlace de hIL2, por una parte, a los componentes del receptor de hIL2, y por otra p rte, al anti-lL2. Ya que las células NKL requieren IL2 para la supervivencia, se puede inferir que estas células expresan un enlazado por el receptor de hIL2 Este modo de neutralización es notorio ya que implica que la neutralización de hIL2 puede ser logrado por el enlace de esta mólécula ya sea en su forma soluble o en su forma enlazada al receptor. Visto cronológicamente, entonces, estos significa que el evento de enlace entre hIL2 y anti-IL2 puede tiener lugar ya sea antes o después de la formación del complejo entre hIL2 y el receptor de hIL2 ; en todo caso, la neutralización de la bioactividad de hIL2 es efectuada. Mediante extrapolación se puede asumir por lo tanto que la neutralización es también efectuada en el caso en que los elementos de enlace relevantes - la formación del complejo entre hIL2 y el receptor de hIL2 y el complejo entre hIL2 y anti-IL2 - ocurren simultáneamente. Se debe notar que tal modo de neutralización como es obssrvado para anti-IL2 permanece en agudo contraste a otros modos conocidos de neutralización en los cuales el epitopq enlazado por un anticuerpo neutralización anti-ligando y el receptor del ligando, son uno y el mismo; en tal escenario convencional, no es posible que el complejo ternario entre el ligando, ligando y un receptor y el anticuerpo anti-ligando neutralizador existan. Expresado de una panera diferente, en tal modo convencional de neutralización, el ligando debe ser enlazado por el anticuerpo neutralizador anti-ligando, mientras que el ligando está todavía en forma soluble, y de modo que la formación de un complejo entre el ligando y el ligando y un receptqr está excluido. Ejemplcj 4: Enlace dependiente de IL2 del antígeno anti-IL2 a 1a línea celular de linfoma asesina natural, humana NKL En este ejemplo, se estudió la especificidad del enlace de anti-IL2 a hlL2 asociada a la superficie celular. El anticuerpo progenitor anti-IL2 (mAb202) mostró estrictamente enlace dependiente de IL2 a la superficie celular de las células NKL. Esta característica particular tuvo qi.e ser por lo tanto confirmada para IL2. Las células NKL fueron privadas de hIL2 por 24 horas antes del experimento. Anti-IL2 o un anticuerpo control del isotipo igGl humano fueron incubados en ausencia o presencia de un exceso dos veces molar de hIL2 a 20 eC por 60 minutos. Las mezclas respectivas fueron luego agregadas a las células NKL (105 células por muestra) y posteriormente incubadas por 30 minutos sobre hielo. Subsecuentemente, las células: fueron lavadas extensamente y se agregó un anticuerpo de detección de cabra anti-IgG humana, marcado con fluorescencia, seguido por la incubación por 30 minutos sobre hielo. Nuevamente, las células fueron lavadas y luego sometidas a análisis de FACS para evitar la fluorescencia asociada a las células. Como se esperaba, en ausencia de hlL2 , no fue detectable ninguna fluorescencia significativa asociada a las células. Ya sea con el anti-IL2 o el anticuerpo control (figura 10, gráfica izquierda). En presencia de hIL2 , la fluorescencia asociada a las células con el anticuerpo control permaneció sin cambio (figura 10, gráfica derecha, pico sombreado) . En contraste, la incubación con hlL2 e IL2 dio como resultado un incremento sustancial en la fluoreecencia (figura 10, gráfica derecha, pico delineado en negro) , indicador del enlace específico dependiente de IL2 de anti-II?2 a la superficie celular. De este modo, la habilidad para reconocer hIL2 asociado a la superficie celular fue conservada en anti-IL2. Este experimento proporcionó evidencia de que anti-IL2 no solamente reconoce hIL2 en solución, sino que también reconoce hIL2 que está asociado con uro o varios de sus componentes del receptor. En consecuencia, hlL2 puede asociarse con anti-IL2 y el o los componentes del receptor de IL2 de una manera no exclusiva. Ejempl?» 5: Anti-IL2 abroga lea suprarregulación dependiente de IL2, de la expresión de la superficie celular de CD124 sobre células CTLL-2 Después de la estimulación con hIL2, las células CTLL-2 proliferan y suprarregulan la expresión de la superf cié celular de CD124 (IL-4R alfa) (Puri, R.K., et al. (1990) Immunology 70, 492). En consecuencia, las células CTLL-2 adquieren sensibilidad incrementada a la estimulación concomí tante a través de IL4 vía el estímulo con IL2. Por lo tanto, anti-lL2 puede no solamente limitar la proliferación mediada por IL2 sin también afectar la expresión de CD124. Para probar esta hipótesis, las células CTLL-2 fueron cultivadas en ausencia de hIL2 por 12 horas antes del experimento , y luego estimuladas con 0.5 ng/ml de hIL2 por 5 horas én presencia o ausencia de concentraciones tituladas y anti-Ilj2 Los niveles de expresión de CD124 fueron evaluados mediante análisis de FACS utilizando un anticuerpo específico de CD12 4, marcado con fluorescencia. Las intensidades de flúores cencía medias detectadas, fueron trazadas gráficamente versus las diferentes concentraciones de anti-IL2 ( f igur a 11, cuadros abiertos con línea negra) ; valore s de fluorescencia media registrados en ausenc ia de anti-IL2 (figura 11, diamante relleno) o en au encia de IL2 (figura 11, triángulo relleno) fueron incluidos como controles. Como es evidente a partir de la figura 11, anti-IL2 redujo la expresión de CD 24 de una manera dependiente de la dosis; la IC50 computada a partir de este ensayo fue aproxi madamente 3.3 x 10 -10 M Estos datos implican que a r.ti-IL2 no solamente afecta la proliferación de las células CTLL-2 sino también otras respuestas célulares dependientes de IL2- tales como la exprés ion de CD124.
Ejemplol 6: Anti-IL2 bloquea específicamente la transdulcción de la señal de IL2 en dirección 3 ' de la IL2R Este experimento fue realizado para excluir adicio?almente la posibilidad de que anti-lL2 medie sus efectos sobre las respuestas celulares independientes de hlL2 en parte por algún mecanismo citotóxico, y para confirmar que el mecanismo de acción de anti-IL2 es altamente específico para les señales impulsadas por hIL2 pero no afecta las vías relacionadas. Entre los eventos celulares más rápidos de las señalee celulares mediadas por IL2 está la fosforilación y la tirosi?a del factor de transcripción STAT3 (Leonard, W.J. 2000 IL2 Family Cytokines and their Receptors) . Otras citocir.as, tales como IL-6, disparan parcialmente las vías de señalización celulares traslapadas, las cuales también involucran STAT3 (Hemmann, U. , et al., (1996). J Biol Chem 271, 12;999; Stahl, N. , et al. (1995). Science 267, 1349; Por lo tanto, anti-IL2 fue probado con respecto a sus efectos sobre la fosforilación de tirosina de STAT3 impulsada por IL2 y por IL6. Los linfocitos de sangre periférica fueron aislados de sangre fresca de donador, incubados a 2 x 106 células/ml preestimuladas 48 horas con lectina, y luego se dejaron descansar en medio por 24 horas antes de la estimulación. Las células fueron luego estimuladas con concentraciones de saturación de IL2 o IL-6/sIL6Ra sin el mAb o en presencia de anti-IL2, o un anticuerpo monoclonal control isotipo por 15 minutos, Después de la separación de los extractos citoplásmicos por SDS--PAGE, el estado de fosforilación de STAT3 fue investigado por transferencia inmune utilizando el anticuerpo específico de la fosforilación de la tirosina de STAT3 (figura 12, panel superior) . Para controlar la carga comparable, fue también realizaldc una transferencia para la proteína STAT3 total (figura 12, panel inferior). La movilidad de electroforética de las proteínas estándares es indicada a la izquierda de cada panel en la figura 12. La estimulación con IL2 e IL-6 aumentó en gran medida la fosforilación de tirosina celular STAT3 en ausencia de anti -IL2 (figura 12, bandas 2 y 3, versus 1, o bandas 6 y 7, versus 1) . Anti-IL2 afecta por lo tanto específicamente la fosforilación de la tirosina de STAT3 después de la estimulación con IL2, pero no después de la estimulación con IL-6 ( igura 12, bandas 4 versus 5). Estos datos demuestran que an Í-IL2 es altamente específicamente por interferencia con la biología de hlL2 y no afecta las vías reguladas por otros f actores, ni tampoco anti-IL2 posee efectos citotóxicos evidentes . Ejemplc 7 : La eficacia del anti-IL2 y daclizumab es afectada de manera diferente por los niveles de expresión de CD25 La actividad inhibitoria de daclizumab, un mAb debido a los niveles de expresión de CD25 no estables; todavía, una tendencia clara que indica la dependencia a CD25 diferenlcial de la eficacia de daclizumab y anti-IL2, puede ser deducida de estos datos. Las células NKL fueron privadas de alimento por 16 horas en la preparación del experimento mediante cultivo del medio libre de hIL2. Por pozo, se aplicó un volumen de ensayo final de 200 µl que incluyó: 1 x 104 celulas NKL, 2 ng/ml de hIL2 (para permitir la proliferacion media máxima) y los diferentes anticuerpos monoclonales a concentraciones tituladas. Todas las muestras fueron preparadas por duplicado. La incubación de las muestras respectivas tuvo lugar por 120 horas, luego las células viables fueron visualizadas utilizando un colorante flúorescente. En general, anti-lL2 fue más eficiente en la neutralización de la proliferación mediada por IL2 comparando a daclizumab en este ensayo. Como se anticipaba, la eficacia del ant i-IL2 no fue afectada por los niveles de expresión de CD25: én las células NKL con CD25baja y CD25alta las curvas obtenidas con el anti-IL2 corrieron esencialmente sobre la parte uperior uno de la otra. En contraste, las curvas obtenidas por daclizumab muestran una clara diferencia en CD25baja comparada a las células NKL con CD25alta El Ab control isotipo no tuvo efecto (figura 13). En resumen, este experimento proporcionó evidencia in vitro de que la eficacia del dabl Jzu ab pero no del anti-IL2 es dependiente de los niveles de CD25. Ejemplo; 8 : Impacto del anti-IL2 o daclizumab sobre la proliferación de células NK humanas primarias dependiente de IL2 No solamente las células T primarias, sino también las cédulas NK primarias pueden proliferar en respuesta a la estimulación con IL2. De este modo, en un experimento posterior, se estudió la inhibición de la proliferación de células NK humanas recién aisladas, inducida por IL2. Las células fueron obtenidas mediante aislamiento negati?o de sangre de donador e incubadas con hIL2 (5.5 ng/ml ; en presencia o ausencia de anti-IL2 titulado o daclizumab. Se aplicó un anticuerpo control únicamente a la concentración más alta; otro control más fue realizado con las cédulas en ausencia de IL2 y anticuerpo. Las células viables fueron cuantificadas utilizando un colorante fluorescente al final del periodo de incubación de una semana. Anti-IL2 redujo sustancialmente la proliferación impulsada por IL2 de células NK humanas primarias, en este experimento. Con las concentraciones de anti-IL2 alta, la proliferación es esencialmente limitada a los niveles observados en ausencia de IL2 indicador de anti-IL2 que afecta todas las células NK que responden a IL2 presentes en este e: sayo. En contraste, daclizumab únicamente mostró efecto de amplitud muy reducida, sugiriendo que únicamente una fracción de las células NK fue afectada por la presencia de este anticuerpo (Figura 14) Para investigar adicio?almente este hallazgo, fueron monitorizados los niveles de expresión de CD25 durante la incubación de una semana con IL2 y anticuerpos: únicamente aproximadamente 11% de las células NK totales provenientes del donador mostraron exprésión adquirida de CD25 con un máximo en el día 3 y una caída ál 2% en el día 7. Consistentemente, las células NK recién aisladas provenientes de todos los donadores estuvieron desprovistas de expresión detectable de CD25 y niveles similares y la cinética de la expresión de CD25 fueron encontrados con las células NK provenientes de todos los donadores analizados (datos no mostrados) . Esto explicó por que: daclizumab pudo inhibir la proliferación únicamente de una fracción de las células NK (Figura 14) . Anti-IL2 nuevamente mostró independencia de los niveles de expresión de CD25 y bloqueo la proliferación de todas las células NK con un valor de IC50 de aproximadamente 3 x 10 -10 M. Estos resultados proporcionan una fuerte indicación de que ant?-l lL2 pero no el daclizumab es capaz de interferir con las señales mediadas por IL2 a través del receptor de IL2 de afinidad intermedia, CD122/CD132, independiente de CD25.
Ejemplq 9 Impacto de anti-IL2 o de daclizumab sobre la liberaqión de IFN-gamma dependiente de IL2 por células NK Además de la proliferación, una respuesta típica y rápida de las células NK primarias a la estimulación con citocir.a es la liberación de IFN-gamma. La liberación de este ultimo fue medida en un experimento adicional, dependiente de anti-112 y de daclizumab. En este ensayo, células NK humanas recién aisladas fueron estimuladas con un cóctel que comprendía hlL2 (5.5 ng/ml), hILl2 (5 ng/ml) y hILl8 (5 ng/ml), disparando la produc ión eficiente y liberación de IFN-gama por estas células Los efectos de anti-IL2 titulado , daclizumab y un anticuerpo control isotipo sobre la liberación de IFN-gamma dentro de las primeras 48 horas de incubación, fueron comparadas . Anti-IL2 y daclizumab reduj eron la expresión de iFN-gairma de una manera dependiente de la dosis , mientras que el anticuerpo control no tuvo efecto ( Figura 15 ) . Anti-IL2 fue un inhibidor más potente de la liberación de IFN-gamma , calificando con una IC50 de aproximadamente 1 . 3 x 10"10 M, en comparación a aproximadamente 1 . 1 x 10"9 M para la daclizumab (Figura 15 ) . En contraste al experimento descrito en el ej emplo previo , todas las células NK en este procedimiento experimental adquirieron la expresión de CD25 (datos no mostrados) , explicando el efecto más profundo del daclizumab sobre IFN-gamma en comparación a la proliferación de las células NK.
La tabla 4 resume la constante de enlace en el equil ibrio (KD) para anti-IL2 y daclizumab. Además, los valores de IC50 obtenidos en los experimentos comparativos lado p<f)r lado con ambos anticuerpos son como se describen anteriármente en los Ejemplos 8 y 9.
Tabla 4 Características Unidad Anti-I 2 Dacliz?mab Afinidad de Constante de 6.8 ± 6.1 x 3.0 x 10~9 M# enlace disociación 10 -10 M en el (Biacore) equilibrio 2.5 ± 1.6 x (KD) 10" M (Superficie Celular) Proli feración IC50 1.0 ± 0.6 x 1.4 ± 0.4 x de la$ células 10"10 M 10"y " NK primarias humanas Producción de IC50 1.3 ± 1.0 x 1.1 ± 0.8 x IFN-gtamma por 10"10 M 10~9 M las c slulas NK humanas d acuerdo a Junghans, R.P., et al. (1990) . Cáncer Res

Claims (30)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un anticuerpo monoclonal humanizado o un fragmento del mismo que se enlaza específicamente a la interleucina 2 humana (IL2), caracterizado porque el anticuerpo monoclonal humanizado neutraliza la actividad de IL2 humana al enlazarse a la IL2 humana antes de, durante y ío subsecuente al enlace de la IL2 humana al receptor de IL2 humana, y en donde la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humanizado comprende en su segunda región estructural la secuencia de aminoácidos contigua KAPKA.
2. El anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos contigua KAPKA está localizada en las posiciones de los aminoácidos 42-46 qe la segunda región estructural.
3. El anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento del mismo de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porgue al menos una de la primera, tercera y/o quarta regiones estructurales de cadena ligera cor:responden a la secuencia de línea germinal humana para esa o esas regiones .
4. El anticuerpo monoclonal humanizado o fragmer.to del mismo de conformidad con cualquiera de las reivinc.icaciones precedentes, caracterizado porque la región variabl e de cadena ligera comprende además en su región CDRl una seóuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No . : 1 , en su región CDR2, una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No.: 2, y en su región CDR3 una secuenctia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No.: 3 ; y e:? donde la región variable de cadena pesada comprende en su región CDRl una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No. : 4, en su región CDR2 una secuencia de aminoaáccidos como se describe en la SEQ ID No. : 5 y en su región CDR3 una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No . : 6.
5. El anticuerpo monoclonal humanizado o fragmertito del mismo de conformidad con cualquiera de las reivincjlicaciones precedentes, caracterizado porque al menos una de la primera, tercera y/o cuarta regiones estructurales de cadena ligera corresponden a la secuencia de línea germinal humana para esa o esas regiones .
6. El anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las secuencias de aminoácidos de la primera región estructural de cadena ligera, las secuencias de aminoácidos remanentes de la segunda región estructural de cadena ligera (por ejemplo, en las posiciones de aminoácidos 35-41 y 47-49 inclusive) y la secuenqia de aminoácidos de la tercera región estructural de cadena ligera corresponden a cualquiera de aquellas de su grupo ?e línea germinal VKl en los locus 012, 02, 018, 08, A30, Ll, L15, L4, L18, L5 , L19, L8 , L23, L9 , Lll ó L12, o del subgrupo de línea germinal humana VLl en el locus la; o cualquiera de aquellos del subgrupo de línea terminal humana VL2 en los locus 2c, 2e, 2a2 ó 2b2.
7. El anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la secuenda de aminoácidos de la primera región estructural de cadena pesada, la secuencia de aminoácidos de la segunda región estructural de cadena pesada, y la secuencia de aminoácidos de la tercera región estructural de cadena pesada corresponden independientemente a una de aquellas del subgrupo VH3 de línea germinal humana.
8. El anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 7 , caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de la primera región estructural de cadena pesada, la secuencia de aminoácidos de la segunda región estructural de cadena pesada, y la secuencia de aminoácidos de la tercera región estructjural de cadena pesada están en un locus 3-07 del subgruóo VH3 de línea germinal humana.
9. El anticuerpo monoclonal humanizado o fragmer to del mismo de conformidad con cualquiera de las reivinc.icaciones 6 a 8, caracterizado porque la secuencia de aminoác idos de la cuarta región estructural de cadena ligera cor responde a aquélla de la JK4 humana (FGGGTKVEIK) .
10. El anticuerpo monoclonal humanizado o fragm er.to del mismo de conformidad con cualquiera de las reivi ncLiicaciones precedentes, caracterizado porque el anti cuerpo monoclonal humanizado comprende una región variabl e de cadena ligera que comprende una secuencia de ammoaq:idos como se describe en la SEQ ID No. : 7, y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de ammoacidos como se describe en la SEQ ID No. : 8.
11. El anticuerpo monoclonal humanizado o fragmerito del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal humanizado comprende una cadena ligera que i L?Cluye una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No . : 9 y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No.: 10
12. El anticuerpo monoclonal humanizado fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo es una IgG.
13. El anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 12, carácterizado porque la IgG es una IgGl ó IgG4.
14. El fragmento del anticuerpo monoclonal humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindlicaciones 1 a 10, caracterizado porque el fragmento es un scFlv, un anticuerpo de dominio simple, un Fv, un diacuerpo , un diacuerpo en tándem, un Fab, un Fab' o un F(ab)2
15. El fragmento del anticuerpo monoclonal humanizado de conformidad con la reivindicación 14, carácterizado porque el fragmento es un scFv, en particular en donqe el scFv comprende en su región variable de cadena ligera una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No. : 7 y en su región variable de cadena pesada una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID No. : 8.
16. El fragmento del anticuerpo monoclonal humanizado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el scFv comprende una secuencia de ammoacidos como se describe en la SEQ ID No. : 11 o en la SEQ ID No. 12.
17. El anticuerpo monoclonal humanizado o el fragme to del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal humanizado o el fragmento del mismo que comprende una secuencia de aminoácidos posee al menos 70% de homología, preferentemente al menos 80, 90 ó todavía mejor al menos 95% de homología, a la secuencia de aminoácidos respectiva como se describe en cualquiera de las SEQ ID Nos . : 1-12.
18. Una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualquiera de las SEQ ID Nos.: 1-12 o una secuencia de nucleótidos que muestra al menos 60%, preferentemente 65, 70, 75, 80, 85, 90 ó 95% de homoloría con la secuencia nucleotídica, caracterizada porque la homología puede ser determinada por la comparación de una molécula polinusleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos de conformidad con las; SEQ ID Nos.: 1-12, con una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos en cuestión por alineación de secuencia, en donde un nucleótido en la secuencia en cuestión es considerado homólogo si éste es ya sea idéntico al nucleótjido correspondiente en la secuencia de nucleótidos que codifiqa para una secuencia de aminoácidos correspondiente de conformidad con cualguiera de las SEQ ID Nos.: 1-12, o si una o más desviaciones de nucleótido en la secuencia en cuestión de uno o más nucleótidos correspondientes en la secuencia de nucleótidos que codifican para una secuencia de aminoácidos de con íormidad con cualquiera de las SEQ ID Nos.: 1-12, da como resultado un triplete de nucleótidos el cual, cuando es traducido, da como resultado un aminoácido que es ya idéntico a (debido a un triplete degenerado) o una sustitución conservadora del aminoácido correspondiente en la secuencia de aminoácido correspondiente de conformidad con cualquiera de las SEQ ID Nos.: 1-12.
19. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 o una molécula polinucleotídica de conformidad con la reivindicación 18.
20. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la composición farmacéutica comprende además uno o más medicamentos antiinflamatorios o anti-cancerosos
21. El uso de un anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o de una molécula polinucleotídica de conformidad con la reivindicación 18, en la fabricación de un medicamento, que comprende opcionalmente uno o más agentes anti-inflamatorios adicionales, para el tratamiento de enfermedades inflamatorias en mamíferos, preferentemente humanos .
22. El uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde las enfermedades inflamatorias son elegidas del grupo que consiste en artritis reumatoide (RA) , asma, esclerosis múltiple (MS) , enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , síndrome de insuficiencia respiratoria aguda (ARDS), fibrosis pulmonar idiopática (IPF) , enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), uveitis, degeneración macular ', colitis, psoriasis, degeneración Waleriana, síndrome antifoe folípido (APS), síndrome coronario agudo, restenosis, ateroee clerosis, policondritis de recidiva (RP) , hepatitis aguda o crónica, implantes ortopédicos fallidos, glomerúlonefritis, lupus, enfermedades autoinmunes, pancreatitis aguda o espondilitis anquilosante (AS) .
23. El uso de un anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 o de una molécula polinucleotídica de conformidad con la reivindicación 18, en donde la fabricación de un medicamento, que comprende opcionalmente uno o más agentes; anti-cancerosos adicionales, para el tratamiento de una enfermedad tumoral u otra condición con apoptosis celular retardada, supervivencia celular incrementada o proliferación celularl incrementada en mamíferos, preferentemente humanos.
24. El uso de conformidad con la reivindicación 23, en donde la enfermedad tumoral es un cáncer.
25. El uso de conformidad con la reivindicación 24, enj donde el cáncer es leucemia, mieloma múltiple, carcinoma gástrico o carcinoma de piel.
26. Un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal humaniz :ado o el fragmento del mismo de conformidad con cualqui.era de las reivindicaciones 1-17 o una molécula polinucleotídica de conformidad con la reivindicación 18, es administrada (opcionalmente junto con uno o más agentes anti-inflamatorios adicionales) a un mamífero, preferentemente a un sujeto humano en una cantidad suficiente y por un tiempo suficiente para prevenir y/o mejorar la enfermedad inf1amatoria .
27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque las enfermedades inflamatorias son elegidas del grupo que consiste en artritis reumatoide (RA) , asma, esclerosis múltiple (MS) , enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , síndrome de insuficiencia respiratoria aguda (ARDS) , fibrosis pulmonar idiopática (IPF) , enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) , uveitis, degeneración macular, colitis, psoriasis, degeneración Waleriana, síndrome antifosfolípido (APS) , síndrome coronario agudo, restenosis, ateroesclerosis, policondritis de recidiva (RP) , hepatitis aguda o crónica, implantes ortopédicos fallidos, glomerulonefritis, lupus, enfermedades autoinmunes, pancreatitis aguda o espondilitis anquilosante (AS)
28. Un método de tratamiento de una enfermedad tumoral, caracterizado porque un anticuerpo monoclonal humanizado o el fragmento del mismo como se describe anteriormente en la presente o una molécula polinucleotídica como se; describe anteriormente es administrado (opcionalmente junto con uno o más agentes anti-cancerosos adicionales) a un mamífero, preferentemente a un sujeto humano en una cantidad suficiente por un tiempo suficiente para prevenir y/o mejorar la enfermedad tumoral u otra condición con apoptosis celular retardada, supervivencia o proliferación celulares increm ntadas.
29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la enfermedad tumoral es un cáncer.
30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el cáncer es leucemia, mieloma múltiple, carcinoma gástrico o carcinoma de piel.
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