TW201702263A - 抗－ｃｄ２０－／抗－ｂａｆｆ雙特異性抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供結合CD20及TNF家族之B細胞活化因子(BAFF)且特徵在於對CD20及BAFF二者具有高親和力及強同時中和性質之雙特異性抗體。本發明之雙特異性抗體可用於治療自體免疫疾病，其包括全身性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎及原發性薛格連氏症候群(primary Sjögren's Syndrome)。

Description

抗-CD20-/抗-BAFF雙特異性抗體
本發明係醫藥領域，具體而言針對CD20及TNF家族之B細胞活化因子(BAFF)之雙特異性抗體之新領域。本發明之雙特異性抗體預期可用於治療一或多種具有B細胞失調之自體免疫疾病，例如全身性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡性腎炎(LN)、原發性薛格連氏症候群(primary Sjögren's Syndrome,pSS)及/或格雷氏病(Grave’s Disease,GD)。
SLE、LN及pSS係以產生自身抗體為特徵之全身性自體免疫疾病。據估計，30-60%患有SLE之患者在其疾病過程期間之某一階段發展腎損害(組織學參考指示進展為LN)。LN係複雜的、多因素自體免疫疾病，其若不控制可導致腎衰竭。pSS之特徵在於外分泌腺(例如，唾液腺及淚腺)之慢性發炎且可影響呼吸道、血管、神經、肝及/或腎功能。目前沒有批准用於pSS之疾病修飾治療(disease-modifying treatment)。同樣地，對目前可用SLE及LN治療之反應緩慢且通常並不完全(其中僅大約25-50%患者達到緩解)。
CD20係在早期前驅B細胞發育期間由B細胞表現之B-淋巴球限制性分化抗原。多個研究表明CD20用作B細胞活化(B細胞分化為漿細胞所需之步驟)之調節劑。由於分化之B細胞係適應性免疫之關鍵，故已開發B細胞清除療法(B cell depletion therapy,BCDT)作為多種自體免疫疾病(包括SLE及LN)之治療。CD20在B細胞分化中所起之作用增加CD20作為用於BCDT之靶標的吸引力。然而，儘管已作出許多努力， 但至今仍沒有靶向CD20之BCDT經批准用於治療SLE、LN或pSS。
BAFF係刺激B細胞存活、增殖及分化之細胞介素。已在模擬SLE、LN及pSS之自體免疫疾病之鼠類模型中報告BAFF之過表現。多個研究表明，與自體免疫疾病相關聯之BAFF過表現起到自刪除路徑「挽救」自體反應性B細胞之作用。然而，已證明抗BAFF抗體療法僅中等有效。
因此，業內仍需要用於治療SLE、LN及pSS之替代療法。較佳地，該等治療將能夠在大量對目前可用選項無反應或自其受益不足之患者中展示效能。一種此替代療法可包括共投與兩種不同的生物產物(例如，抗體)。共投與需要注射兩種單獨產物或單次注射兩種不同抗體之共調配物。儘管兩次注射允許劑量量及時間之靈活性，但其就順從性、疼痛及成本而言對於患者不方便。另外，尋找容許兩種不同抗體之化學及物理穩定性之共調配物條件通常極具挑戰或不太可能。因此，業內仍需要用於治療SLE、LN及pSS之替代療法，且較佳該等替代療法將包含雙特異性抗體。
WO199509917揭示以重組方式產生具有雙重特異性之雙特異性、四價抗體之方法，其藉由產生融合至具有不同特異性之完整抗體(Ab)之單鏈可變片段(scFv)多肽來實施。美國專利第8,153,125號揭示針對人類CD20之抗體。美國專利第7,317,089號揭示針對人類BAFF之可溶及膜結合形式二者之抗體。然而，當遵循WO199509917中之教示產生包含美國專利第8,153,125號之CD20抗體及美國專利第7,317,089號之BAFF抗體之起始雙特異性抗體時，本發明者觀察到與化學及物理穩定性相關之顯著問題。起始雙特異性抗體中需要許多修飾以充分克服該等問題。此項技術中既未建議此需要亦未建議實際改變。此外，若干改變並非慣例或源自普通常規知識。同樣地，單一抗體自身不具有該等問題，此表明在雙特異性抗體之情況下該等胺基酸結構域 周圍之局部環境有所不同。因此，需要利用中和CD20及BAFF二者之雙特異性抗體之藥理學介入。
本發明提供雙特異性抗體，其具有四個多肽鏈，即兩個第一多肽鏈及兩個第二多肽鏈，其中第一多肽鏈中之每一者包含經由多肽鏈接體(L1)在mAb IgG重鏈(HC)之N-末端處獨立鏈接至單鏈可變片段(scFv)，且第二多肽鏈之每一者包含mAb輕鏈(LC)。根據本發明之雙特異性抗體，每一HC包含具有重鏈互補決定區(HCDR)1-3之重鏈可變區(HCVR1)且每一LC包含具有輕鏈互補決定區(LCDR)1-3之輕鏈可變區(LCVR1)。另外，根據本發明之雙特異性抗體，每一scFv包含具有LCDR 4-6之輕鏈可變區(LCVR2)及具有HCDR 4-6之重鏈可變區(HCVR2)。同樣，根據本發明之雙特異性抗體，LCVR2在其C-末端鏈接至L1且在其N-末端鏈接至多肽鏈接體(L2)，該多肽鏈接體L2鏈接至HCVR2之C-末端。
根據本發明雙特異性抗體之具體實施例，HCDR1之胺基酸序列係由SEQ ID NO：9給出，HCDR2之胺基酸序列係由SEQ ID NO：10給出，HCDR3之胺基酸序列係由SEQ ID NO：11給出，LCDR1之胺基酸序列係由SEQ ID NO：15給出，LCDR2之胺基酸序列係由SEQ ID NO：16給出，LCDR3之胺基酸序列係由SEQ ID NO：17給出，HCDR4之胺基酸序列係由SEQ ID NO：12給出，HCDR5之胺基酸序列係由SEQ ID NO：13給出，HCDR6之胺基酸序列係由SEQ ID NO：14給出，LCDR4之胺基酸序列係由SEQ ID NO：18給出，LCDR5之胺基酸序列係由SEQ ID NO：19給出，且LCDR6之胺基酸序列係由SEQ ID NO：20給出。
根據具體實施例，HC包含mAb IgG1同型。在一些實施例中，本發明之雙特異性抗體在每一HC之恆定區中包括一或多個增強效應物功能之修飾。甚至更具體實施例包括在殘基601處之胺基酸麩胺酸及 在殘基608處之麩醯胺酸(殘基編號係基於表1之例示性雙特異性抗體的第一多肽)。
根據其他具體實施例，每一LC包含mAb κ輕鏈。在一些該等實施例中，LCVR1之胺基酸序列係由SEQ ID NO：7給出，且LCVR2之胺基酸序列係由SEQ ID NO：8給出。根據其他具體實施例，HCVR1之胺基酸序列係由SEQ ID NO：5給出且HCVR2之胺基酸序列係由SEQ ID NO：6給出。根據甚至其他實施例，L1之胺基酸序列係由SEQ ID NO：21給出且L2之胺基酸序列係由SEQ ID NO：22給出。在本發明雙特異性抗體之甚至更具體實施例中，第一多肽中之每一者之胺基酸序列係由SEQ ID NO：1給出且第二多肽中之每一者之胺基酸序列係由SEQ ID NO：2給出。
本發明亦係關於核酸分子及編碼本發明之雙特異性抗體之表現載體。在實施例中，本發明提供包含編碼第一多肽之聚核苷酸序列的DNA分子，其中第一多肽之胺基酸序列係SEQ ID NO：1。在實施例中，本發明亦提供包含編碼第二多肽之聚核苷酸序列之DNA分子，其中第二多肽之胺基酸序列係SEQ ID NO：2。在另一實施例中，本發明提供DNA分子，其包含編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之第一多肽之聚核苷酸序列且包含編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之第二多肽之聚核苷酸序列。在具體實施例中，編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之第一多肽之聚核苷酸序列係由SEQ ID NO：3給出且編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之第二多肽之聚核苷酸序列係由SEQ ID NO：4給出。
本發明亦提供利用DNA分子轉化之哺乳動物細胞，該細胞能夠表現本發明之包含第一多肽及第二多肽之雙特異性抗體。另外，本發明提供產生第一多肽及第二多肽之雙特異性抗體之方法，其包含在使得表現本發明之雙特異性抗體之條件下培養該哺乳動物細胞。本發明 亦提供藉由該方法產生之雙特異性抗體。
本發明亦提供治療具有B細胞失調之自體免疫疾病(例如SLE、LN、pSS或GD)之方法，其包含向需要其之患者投與有效量之本發明雙特異性抗體。
本發明亦提供本發明之雙特異性抗體，其用於療法中。更具體而言，本發明提供本發明之雙特異性抗體，其用於治療SLE、LN、pSS或GD。
本發明亦提供醫藥組合物，其包含本發明雙特異性抗體及一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。本發明之醫藥組合物可用於治療SLE、LN、pSS或GD，其中此一治療包含向需要其之患者投與本發明之醫藥組合物。
在實施例中，本發明亦提供本發明之雙特異性抗體在製造用於治療SLE、LN、pSS或GD之藥劑中之用途。
如本文所提及，術語「雙特異性抗體」係指包含四個抗原結合位點之工程化多肽。四個抗原結合位點中之兩個結合CD20且另外兩個抗原結合位點結合BAFF。本發明之雙特異性抗體能夠單獨或同時結合CD20及BAFF，並在活體外及/或活體內中和至少一種人類CD20生物活性及至少一種人類BAFF生物活性。本發明之雙特異性抗體在活體外在BAFF之存在或不存在下亦係CD20之強效抑制劑。
此外，本文中所提及之雙特異性抗體包含四個多肽鏈，即兩個第一多肽及兩個第二多肽。第一多肽中之每一者經工程化以包含在mAb重鏈(HC)之N-末端藉由多肽鏈接體(L1)鏈接之單鏈可變片段(scFv)。第二多肽中之每一者經工程化以包含mAb輕鏈(LC)並與第一多肽中之一者、特定而言在第一多肽之HC內形成鏈間二硫鍵。第一多肽中之每一者經工程化以與另一第一多肽、特定而言在第一多肽中之每一者之HC之間形成鏈間二硫鍵。第一多肽中之每一者進一步經 工程化以特定而言在每一各別第一多肽之scFv內形成鏈內二硫鍵。
如本文所提及，第一多肽之「單鏈可變片段」(scFv)係指包含經由多肽鏈接體(L2)鏈接之重鏈可變區(HCVR2)及輕鏈可變區(LCVR2)之多肽鏈。另外，如本文所提及(且如以下示意圖中所代表)，每一scFv之LCVR2：a.)藉由多肽鏈接體(L1)在其C-末端處鏈接至HC(第一多肽)之N-末端；且b.)經由第二多肽鏈接體(L2)在其N-末端處鏈接至同一scFv之HCVR2之C-末端。
根據本發明之雙特異性抗體，將第一多肽中之每一者之HC歸類為γ，其定義同型(例如，IgG)。同型可進一步分成亞類(例如，IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)。在特定實施例中，本發明之雙特異性抗體係IgG1。每一HC之C-末端界定主要負責效應物功能之恆定區(CH)。在具體實施例中，本發明之雙特異性抗體在每一HC之CH中具有一或多個增強效應物功能之修飾。在更具體之實施例中，本發明之雙特異性抗體係IgG1且在兩個HC之CH中具有增強效應物功能之修飾。在甚至更具體實施例中，該等修飾包括在兩個HC之CH中在殘基601處之胺基酸麩胺酸及在殘基608處之麩醯胺酸(殘基編號係基於表1中例示性雙特異性抗體之第一多肽)。第一多肽中之每一者之每一HC之N-末端部分包括可變區(HCVR1)。
另外，根據本發明之雙特異性抗體，將包含第二多肽之每一mAb輕鏈(LC)歸類為κ或λ且特徵在於具體恆定區，如此項技術中已知。在具體實施例中，本發明之雙特異性抗體包含κ LC。每一LC之C-末端部分界定輕鏈恆定區，而第二多肽中之每一者之每一LC之N-末端部分包括輕鏈可變區(LCVR1)。
每一HC及LC分別之HCVR1及LCVR1及每一scFv之HCVR2及LCVR2可進一步細分為稱為互補決定區(CDR)之高變區，其點綴有更保守、稱為框架區(FR)之區域。較佳地，本發明雙特異性抗體之框架區具有人類起源或實質上人類起源。本發明雙特異性抗體之每一HCVR1、HCVR2、LCVR1及LCVR2由三個CDR及四個FR構成，其自胺基末端至羧基末端按下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。此處，每一HCVR1之3個CDR稱為「HCDR1、HCDR2及HCDR3」；每一HCVR2之3個CDR稱為「HCDR4、HCDR5及HCDR6」；每一LCVR1之3個CDR稱為「LCDR1、LCDR2及LCDR3」；且每一LCVR2之3個CDR稱為「LCDR4、LCDR5及LCDR6」。CDR含有大多數與抗原形成特定相互作用之殘基。本發明雙特異性抗體結合具體抗原之功能性能力在很大程度上受該六個CDR之影響。
「抗原-結合部分」、「抗原-結合位點」及「抗原-結合區」在本文中可互換使用，其係指本發明之雙特異性抗體之含有與抗原相互作用且賦予針對各別抗原之雙特異性抗體特異性及親和性之胺基酸殘基之部分。根據本發明之雙特異性抗體，抗原-結合位點係藉由HCVR1/LCVR1對(藉由鏈間二硫鍵鍵結之LC及HC)及scFv HCVR2/LCVR2對形成。另外，根據本發明之雙特異性抗體，藉由每一HCVR1/LCVR1對形成之抗原-結合位點係相同的(例如，包含針對相同抗原之特異性及親和性)，且藉由每一scFv HCVR2/LCVR2對形成 之抗原-結合位點係相同的(例如，包含針對相同抗原之特異性及親和性)。然而，根據本發明之雙特異性抗體，藉由每一HCVR1/LCVR1對形成之抗原-結合位點不同於藉由每一scFv HCVR2/LCVR2對形成之抗原-結合位點(例如，包含針對不同抗原之特異性及親和性)。
「親代抗體」或「親本抗體」在本文中可互換使用，其係由用於藉助(例如)胺基酸取代及結構改變製備雙特異性抗體之mAb(例如，HC及LC二者)及scFv中之一者之胺基酸序列編碼的抗體。親代抗體可為鼠類、嵌合、人類化或人類抗體。構築本發明雙特異性抗體之初始嘗試包括其中親本BAFF抗體(例如闡述於美國專利第7,317,089號中者)經工程化以包含呈各種組態及定向之scFv部分、及親本CD20抗體(例如闡述於美國專利第8,153,125號中者)經工程化以包含雙特異性抗體之scFV以及mAb部分二者之構築體。
術語「Kabat編號」或「Kabat標記」在本文中可互換使用。業內公認之該等術語係指對比抗體之重鏈及輕鏈可變區中之其他胺基酸殘基更具可變性(即，高變性)之胺基酸殘基進行編號的系統(Kabat等人，Ann.NY Acad.Sci.190：382-93(1971)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國衛生及公共服務部(Department of Health and Human Services),NIH出版號91-3242(1991))。
術語「North編號」或「North標記」在本文中可互換使用。業內公認之該等術語係指對比抗體之重鏈及輕鏈可變區中之其他胺基酸殘基更具可變性(即，高變性)之胺基酸殘基進行編號的系統且至少部分地基於具有大量晶體結構之親和傳播聚類(affinity propagation clustering)，如(North等人，A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations,Journal of Molecular Biology,406：228-256(2011)中所述。
在本發明之例示性雙特異性抗體中，各個區及鏈接體之關係例 示於表1中(胺基酸之編號應用線性編號；胺基酸至可變結構域之指派係基於在www.imgt.org可獲得之International Immunogenetics Information System®；胺基酸至CDR結構域之指派係基於熟知之Kabat及North編號慣例且反映於表1之最後)：
表1中之本發明例示性雙特異性抗體包含兩個具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之第一多肽及兩個具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之第二多肽。根據表1中所呈現之本發明例示性雙特異性抗體，第一多肽中之每一者與第二多肽中之每一者在SEQ ID NO：1之半胱胺酸殘基489與SEQ ID NO：2之半胱胺酸殘基213之間形成鏈間二硫鍵；與另一第一多肽形成至少兩個鏈間二硫鍵，第一鏈間二硫鍵係在第一多肽之半胱胺酸殘基495(SEQ ID NO：1)與另一第一多肽之半胱胺酸殘基495(SEQ ID NO：1)之間形成，第二鏈間二硫鍵係在第一多肽之半胱胺酸殘基498(SEQ ID NO：1)與另一第一多肽之半胱胺酸殘基498(SEQ ID NO：1)之間形成；及在第一多肽中之每一者之scFv中在每一各別第一多肽之半胱胺酸殘基44(SEQ ID NO：1)與半胱胺酸殘基243(SEQ ID NO：1)之間形成之鏈內二硫鍵。此外，表1之例示性雙特異性抗體在兩個第一多肽之SEQ ID NO：1的天冬醯胺殘基566處糖基化。
雙特異性抗體工程化
在構築本發明雙特異性抗體時遇到與化學及物理穩定性相關之重大問題。所遇到之問題包括差的表現、形成剪接變體、差的純化回收、低熱穩定性、所表現雙特異性抗體之聚集、scFv之錯誤摺疊、LC剪切、低結合親和力及低靶標中和活性、差的溶解性及快速活體內清除。
舉例而言，構築本發明之雙特異性抗體之初始嘗試包括其中親本CD20抗體(闡述於美國專利第8,153,125號中)包含mAb抗體部分且親本BAFF抗體(例如闡述於美國專利第7,317,089號中)包含雙特異性抗體之scFv部分之構築體。初始構築體包括以各個組態偶聯至mAb部分之scFv部分，分別包括在HC及LC二者之胺基-末端或羧基末端。另外，初始構築體包括在HCVR2及LCVR2之配置中變化之scFv部分(例如，mAb部分(C或N末端)-鏈接體1-LCVR2或HCVR2-鏈接體2-LCVR2或HCVR2中之另一者)。此外，親本BAFF抗體構築體包括重鏈種系框架VH4-59及VH4-34及輕鏈種系框架L6之組合。親本CD20抗體構築體亦包括重鏈種系框架VH5-51及輕鏈種系框架A27之組合。親本CD20抗體構築體亦包括具有IgG1亞類之HC以及在每一HC(IgG1亞類)之恆定區(CH)內之修飾二者，例如如美國專利第8,153,125號中所闡述。將初始構築體選殖於人類IgG1-Fc哺乳動物表現載體中並於HEK293F細胞中表現。然而，初始產生之雙特異性構築體(如上述)展現一或多個上述之化學及/或物理問題。
因此進行結構修飾以解決與試圖構築本發明雙特異性抗體相關之化學及物理穩定性問題。舉例而言，相對於親本BAFF抗體之修飾係在HCDR4、HCDR5、LCDR4、LCDR5及LCDR6中工程化。另外，經構築HCVR2及LCVR2係工程化成下式之BAFF scFv格式：HCVR2-L2-LCVR2-L1-(N-末端)HC(CD20)。使HCVR2(G44C)與LCVR2(G243C)問之用於穩定BAFF scFv之二硫鍵工程化(胺基酸殘基編號係 基於表1之例示性雙特異性抗體)。另外，重鏈種系框架相對於親本BAFF抗體自HC4-59變為HC4-34。本發明雙特異性抗體之mAb部分亦經工程化以解決化學及物理穩定性問題(上文所述)，包括CD20之結合親和力及中和。舉例而言，相對於親本CD20抗體之修飾係在HC之LCDR3及CH中(特定而言HC IgG1主鏈之CH2區)進行工程化。
此外，計算雙特異性抗體之靜電表面電荷並鑑別並破壞帶電荷補丁。已實施廣泛的穩定性研究並相對於各別親本抗體針對熱穩定性及物理及化學穩定性質以及BAFF及CD20結合及中和性質對所構築雙特異性抗體進行篩選。
將編碼工程化BAFF scFv構築體及CD20 mAb構築體(包含以本文所述之方式廣泛化學及物理修飾及定向)之核酸序列工程化於IgG1表現載體中用於藉由哺乳動物細胞(例如CHO及HEK293)表現。在本發明雙特異性抗體之初始表現之後，鑑別剪接變體位點。藉助將經工程化之沉默修飾引入核酸序列來消除剪接變體問題，將該核酸序列重新工程化於IgG1表現載體中用於藉由哺乳動物細胞(例如CHO及HEK293)表現。將本發明之經表現雙特異性抗體針對化學及物理穩定性質以及功能性質(包括BAFF及CD20結合親和力以及中和性質)廣泛地進行篩選。
雙特異性抗體經工程化以包括具有經修飾IgG1亞類(相對於天然IgG1：I601E、A608Q)及CDR修飾(相對於親本CD20抗體：在N93H處之LCDR3)之CD20 mAb、以及具有七個CDR修飾(相對於親本BAFF抗體：在Y32H、Y99A、Y100R、Y107L、F110Y及Y112H處之HCVR、在W237H處之LCVR)及經修飾HC框架(相對於親本BAFF抗體：VH4-34→VH4-39)之BAFF scFv，當其如本文所述定向時，將其鑑別為改良初始構築體中所展示之表現、物理穩定性、化學穩定性、熱穩定性及親和性及中和問題(上文所述)(胺基酸殘基編號係基於表1之例示性 雙特異性抗體)。另外，該等工程化修飾使得在食蟹猴中之清除率得到改良。上述修飾中之任一者均非此項技術中建議之慣例或普通常規知識且在個別親本抗體之初始表徵中並未鑑別出對該等修飾之需要。
雙特異性抗體表現
能夠引導可操作地連接至其之基因之表現的表現載體已為此項技術熟知。表現載體可編碼促進多肽自宿主細胞分泌之信號肽。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽。第一多肽鏈及第二多肽鏈可在一個載體中自其可操作連接之不同啟動子獨立地表現，或者，第一及第二多肽鏈可在兩個載體中(一者表現第一多肽鏈且一者表現第二多肽鏈)自其可操作連接之不同啟動子獨立地表現。
宿主細胞包括經一或多種表現本發明之第一多肽鏈、第二多肽鏈或第一及第二第二多肽鏈二者之表現載體穩定或瞬時轉染、轉化、轉導或感染之細胞。產生本發明雙特異性抗體之宿主細胞系之產生及分離可使用此項技術中已知之標準技術完成。哺乳動物細胞較佳係用於表現雙特異性抗體之宿主細胞。具體的哺乳動物細胞係CHO及HEK 293。較佳地，雙特異性抗體分泌於培養宿主細胞之培養基中，雙特異性抗體可藉由習用技術自其回收或純化。舉例而言，可將培養基施加至Protein A或G管柱並使用習用方法自其溶析。另外，可溶性聚集體及多聚體可藉由常用技術(包括粒徑排阻、疏水相互作用、離子交換或羥磷灰石層析)有效地移除。產物可立即於(例如)-70℃冷凍，或可凍乾。
此項技術中熟知抗體之哺乳動物表現導致糖基化。通常，糖基化出現於抗體之Fc區中之高度保守之N-糖基化位點處。N-聚糖通常附接至天冬醯胺。舉例而言，表1中所呈現例示性雙特異性抗體之HC在SEQ ID NO：1之天冬醯胺殘基566處糖基化。
治療應用
如本文所用之「治療(treatment,treating)」意欲指所有其中可減緩、中斷、阻止、控制或終止本文所述病症之進展之過程，但並不一定指示完全消除所有病症症狀。治療包括投與本發明雙特異性抗體用於治療可能因CD20陽性B細胞及/或BAFF之含量降低或CD20陽性B細胞及/或BAFF之生物活性降低而受益之患者之疾病或病況，且包括：(a)抑制疾病之進一步進展，即，阻止其發展；及(b)減輕疾病，即，使疾病或病症消退或緩和其症狀或併發症。本發明之雙特異性抗體預期用以治療具有B細胞失調之自體免疫疾病，包括SLE、LN、pSS及/或GD。
術語「患者」、「受試者」及「個體」在本文中可互換使用，係指人類。在某些實施例中，患者進一步特徵在於患有可因CD20陽性B細胞及BAFF二者之含量降低或生物活性降低而受益之疾病、病症或病況(例如，自體免疫病症)。在另一實施例中，患者進一步特徵在於處於發展出可因CD20陽性B細胞及BAFF二者之含量降低或生物活性降低降低而受益之疾病、病症或病況之風險下。
醫藥組合物
本發明之雙特異性抗體可納入適於投與患者之醫藥組合物中。本發明之雙特異性抗體可單獨或與醫藥上可接受之載劑及/或稀釋劑一起以單一或多個劑量投與患者。該等醫藥組合物設計為適合用於所選投藥模式，且若適當，使用醫藥上可接受之稀釋劑、載劑及/或賦形劑，例如分散劑、緩衝劑、表面活性劑、防腐劑、增溶劑、等滲劑、穩定劑及諸如此類。該等組合物可根據揭示於(例如)Remington, The Science and Practice of Pharmacy，第19版，Gennaro編輯，Mack Publishing Co.,Easton,PA 1995(其提供熟悉此項技術者通常已知之調配技術概略)中之習用技術進行設計。適用於醫藥組合物之載劑包括當於本發明之雙特異性抗體組合時保留分子之活性且與患者之免疫 系統不反應之任何材料。本發明之醫藥組合物包含雙特異性抗體及一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
包含本發明雙特異性抗體之醫藥組合物可使用標準投與技術投與處於本文所述疾病或病症之風險或展現該等疾病或病症之患者。
本發明之醫藥組合物含有有效量之本發明雙特異性抗體。有效量係指所需(以劑量及持續時期及投與方式)以達成期望治療結果之量。雙特異性抗體之有效量可根據下述因素而有所變化：例如疾病狀態、個體之年齡、性別及體重、以及抗體或抗體部分於該個體內引發期望反應之能力。有效量亦為雙特異性抗體之治療有益效應勝過其任何毒性或有害效應之量。
實例
除非另外說明，否則貫穿實例提及之例示性工程化雙特異性抗體係指上表1所呈現之本發明例示性雙特異性抗體。
雙特異性抗體表現及純化
例示性雙特異性抗體係基本上如下表現及純化。使用含有SEQ ID NO：3(編碼SEQ ID NO：1之例示性第一多肽鏈)及SEQ ID NO：4(編碼SEQ ID NO：2之例示性第二多肽鏈)之DNA之麩醯胺酸合成酶(GS)表現載體藉由電穿孔用於轉染中國倉鼠細胞株(CHO，GS敲除純系1D3)。表現載體編碼SV早期(猿猴病毒40E)啟動子及GS基因。GS之表現允許生物化學合成麩醯胺酸(一種CHO細胞所需之胺基酸)。轉染後，細胞利用50μM L-甲硫胺酸磺醯亞胺(MSX)經歷批量選擇。利用MSX對GS之抑制以增加選擇之嚴格性。可針對表現內源性含量GS之CHO野生型細胞選擇表現載體cDNA整合於宿主細胞基因體之轉錄活性區中之細胞。將經轉染彙集物以低密度平鋪以允許穩定表現細胞之接近選殖性(close-to-clonal)生長。篩選主要孔(masterwell)之雙特異性抗體表現並然後於用於生產之無血清懸浮培養中按比例擴大。將例示 性雙特異性抗體分泌於其中之澄清培養基施加於利用相容緩衝液(例如，磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4))平衡之Protein A親和管柱。將管柱洗滌以去除非特異性結合組份。藉由(例如)pH梯度(例如，0.1M磷酸鈉緩衝液pH 6.8至0.1M檸檬酸鈉緩衝液pH 2.5)溶析結合之雙特異性抗體並利用Tris,pH 8緩衝液進行中和。藉由(例如)SDS-PAGE或分析型粒徑排阻檢測雙特異性抗體流份，並然後彙集。可溶性聚集體及多聚體可藉由常用技術(包括粒徑排阻、疏水相互作用、離子交換或羥磷灰石層析)有效移除。使用常用技術將雙特異性抗體濃縮及/或無菌過濾。該等例示性雙特異性抗體在該等層析步驟後之純度大於98%(單體)。該等雙特異性抗體可立即於-70℃冷凍或於4℃儲存數月。
雙特異性抗體對CD20之結合親和力
例示性雙特異性抗體對人類CD20之結合親和力及化學計量係使用MSD SI6000儀器(Meso Scale Discovery,Rockville,MD)藉由基於Meso Scale Discovery之溶液平衡滴定方法(MSD-SET)量測。將多陣列96孔分析板(Meso Scale Discovery,p/n.L15XA-3)用0.5μg/mL存於PBS中之山羊抗人類Fc捕獲抗體(Jackson ImmunoResearch,p/n.109-005-098)塗覆並於4℃培育過夜。培育之後，將板用PBS洗滌並然後使用3% Blocker A溶液(Meso Scale Discovery,p/n.R93AA-1)於室溫封阻60分鐘。然後將板再次用PBS洗滌。
以500pM或25pM中之一者一式雙份製備例示性雙特異性抗體樣品。藉由離心(500 x G，於10℃ 4分鐘)使經固定WIL2-S細胞(表現CD20之人類B-淋巴瘤細胞，ATCC CRL-8885)沈澱，丟棄上清液並將沈澱物以400百萬個細胞/mL之濃度重新懸浮於3% Blocker A溶液中。將細胞於V-底部96孔板中利用3% Blocker A溶液連續稀釋(使用3倍稀釋)降至7000個細胞/mL(對於每一雙特異性抗體濃度重複，產生總共11個細胞濃度)。亦產生空白(無細胞/mL)樣品以包括在滴定曲線中(針 對每一重複產生第12個濃度)。
將例示性雙特異性抗體(於3% Blocker A溶液中稀釋至1nM或50pM)與每一重複之11個不同細胞濃度中之每一者及空白以1：1比率混合(例示性雙特異性抗體之最終濃度為500nM或25pM；WIL2-S細胞之最終濃度為約200百萬個細胞/mL至約3500個細胞/mL)。將混合物在板振盪器上於37℃培育過夜且然後藉由離心(500 x G，於10℃ 4分鐘)沈澱。離心後，將50μL添加於預先塗覆有山羊抗人類Fc捕獲抗體之MSD多陣列96孔分析板之孔並於板振盪器上於室溫培育60分鐘。然後將板用PBS洗滌。之後，將存於1% Blocker A溶液中之25μL 1μg/mL磺基-TAG偶聯之抗人類/NHP κ輕鏈二級抗體(Meso Scale Discovery,p/n.D20TF-6)添加至各孔。然後將板在板振盪器上於室溫培育60分鐘且然後用PBS洗滌三次。將1X讀取緩衝液T(Meso Scale Discovery,p/n.R92TC-1)添加至各孔並將板在MSDSI6000板讀取器(Meso Scale Discovery,Rockville MD)上讀取。將數據輸出至KinExA Pro軟體(Sapidyne Instruments,Inc.,Boise ID)並將結果擬合至「Affinity,Standard Constant Partner(Calculate TCM)」模型以測定KD。
以上分析亦在飽和量之人類BAFF之存在下實施，其中例示性雙特異性抗體之濃度(與11個不同細胞濃度混合之後)保持於100pM或2nM中之一者且人類BAFF係以10倍莫耳過量(分別為1nM及20nM三聚物濃度)添加。
實質上如本文所述測定之例示性雙特異性抗體對人類CD20之結合親和力(在不存在飽和人類BAFF之情形下)(N=3)為KD=239±68pM(平均值±SD)。實質上如本文所述測定之例示性雙特異性抗體對人類CD20之結合親和力(在飽和人類BAFF之存在下)(N=3)為KD=305±133pM(平均值±SD)。該等結果表明，本發明之例示性雙特異性抗體在飽和濃度之重組人類BAFF之存在或不存在下均與人類CD20產生結 合反應(依賴於雙特異性抗體之濃度)。
雙特異性抗體對BAFF之結合親和力
例示性雙特異性抗體對人類BAFF之結合親和力及化學計量係使用純化重組人類可溶性BAFF(自HEK293細胞表現)藉由MSD-SET量測。純化重組BAFF係使用EZ-Link磺基-NHS-LC生物素試劑(Thermo Scientific,p/n.21335)生物素化。活體外Biacore分析(數據未顯示)表明未處理及生物素化重組BAFF展現類似結合性質。
將多陣列96孔分析板(Meso Scale Discovery,p/n.L15XA-3)用3.5μg/mL雙特異性抗體塗覆並於4℃培育過夜。培育之後，將板用PBS洗滌三次，然後使用3% Blocker A溶液於室溫封阻45分鐘。然後將板再次用PBS洗滌。
將例示性雙特異性抗體以224pM之濃度開始在V-底部96孔板中連續稀釋(使用2倍稀釋)，產生12個不同雙特異性抗體濃度。將7pM生物素化重組BAFF與例示性雙特異性抗體之每一稀釋液混合且然後於37℃下培育36-48小時(以達到平衡)。將平衡樣品添加至預先塗覆有例示性雙特異性抗體之MSD多陣列96孔分析板之孔中；將樣品混合2.5分鐘，且然後用PBS洗滌三次。之後，將存於1% Blocker A溶液中之25μL 1μg/mL磺基-TAG標記之鏈黴抗生物素蛋白檢測試劑(Meso Scale Discovery,p/n.R32AD-5)添加至各孔。然後將板在板振盪器上於室溫培育3分鐘且然後用PBS洗滌。將1X讀取緩衝液T(Meso Scale Discovery,p/n.R92TC-1)添加至各孔並將板在MSDSI6000板讀取器(Meso Scale Discovery,Rockville MD)上讀取。所得結合信號反映溶液中自由抗原之量。將數據輸出至KinExA Pro軟體並將結果擬合至「Standard,Affinity」結合模型以測定KD。
實質上如本文所述測定之例示性雙特異性抗體對重組人類BAFF之結合親和力(N=3)為KD=0.3±0.4pM(平均值±SD)。該等結果表 明，本發明之例示性雙特異性抗體與人類BAFF產生結合反應(依賴於雙特異性抗體之濃度)。
CD20及BAFF之同時結合
使用流式細胞術以測定例示性雙特異性抗體是否同時結合CD20及BAFF。例示性雙特異性抗體及對照人類IgG1抗體各自利用AlexaFlour488(Life Technologies,p/n.A10468)根據製造商說明書進行螢光標記。重組人類BAFF經生物素化並自5000ng連續稀釋(使用5倍稀釋)至0.32ng。
JY細胞株係於細胞表面上表現CD20之艾司坦-巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus)永生化人類B細胞類淋巴母細胞系(ATCC 77442)。將JY細胞與生物素化BAFF之每一稀釋液及以下中之一者一起於4℃培育30分鐘：a.)1μg經標記之例示性雙特異性抗體；或b.)1μg經標記之對照IgG1抗體。培育之後，將細胞用FACS緩衝液(2%胎牛血清存於PBS中)洗滌兩次並重新懸浮於FACS緩衝液中用於分析。經由流式細胞術(Beckman Coulter FC500)同時檢測CD20及BAFF結合二者。於FL-1(FITC)通道中檢測CD20結合且於FL-2(PE)通道中檢測BAFF結合。FACS數據係藉由FCS Express 4(De Novo軟體)分析。結果呈現於表2中。
表2之結果表明，本發明之例示性雙特異性抗體能夠結合細胞表面上之人類CD20及可溶性BAFF，甚至在BAFF之飽和濃度下。
活體外可溶性及膜結合之BAFF誘導之T1165.17細胞增殖之中和
T1165.17細胞係自T1165鼠類漿細胞瘤(源自BALB/c AnPt小鼠之腹水腫瘤)亞選殖之BAFF反應性鼠類細胞株。研究已顯示T1165.17細胞需要低含量之IL-1β，但在短期增殖分析中已顯示其他細胞介素能夠代替IL-1β。
將可溶性人類BAFF(5ng/mL)或膜結合之人類BAFF(18.1ng/mL)一式三份添加至96孔板。將以下中之一者：a.)例示性雙特異性抗體；b.)親本BAFF抗體(例如美國專利第7,317,089號中所闡述者)；及c.)陰性對照抗體(IgG1同型抗體)以以下濃度中之每一者添加至含有可溶性BAFF或膜結合之BAFF之孔：1.667、0.556、0.185、0.062、0.021、0.007及0.002(nM)。將T1165.17細胞用無血清RPMI 1640培養基洗滌三次，然後重新懸浮於含有RPMI 1640、10% FBS、1mM丙酮酸鈉、5×10-5M 2-巰基乙醇及抗生素/抗黴菌劑(Gibco,p/n.15240)之分析培養基中。將T1165.17細胞以5000個細胞/孔之濃度添加至各孔並將板於5% CO2中於37℃培育44小時。培育之後，將MTS Viability Substrate(Promega,p/n.G3580)添加至各孔並將板再培育1小時，然後在微板讀取器(Molecular Devises)上實施490nm之吸光度量測。測試係一式三份實施。
表3a及3b中提供之結果表明，本發明之例示性雙特異性抗體能夠完全中和(可溶性及膜結合之)BAFF誘導之T1165.17細胞增殖。此中和經改良超過陽性對照抗體(親本BAFF抗體)。陰性對照IgG1抗體並未展示抑制可溶性或膜結合之BAFF誘導之T1165.17細胞增殖。
補體依賴性細胞毒性(CDC)活性之活體外分析
將例示性雙特異性抗體及親本CD20抗體(例如美國專利第8,153,125號中所闡述者)各自分別自10μg/mL連續稀釋(使用2倍稀釋)至0.01μg/mL。為評價飽和量之BAFF當結合至例示性雙特異性抗體之scFv部分時是否影響例示性雙特異性抗體之CDC活性，使每一稀釋液在存在及不存在飽和量(100ng/mL)之可溶性人類BAFF三聚物之情 況下重複。將例示性雙特異性抗體及親本CD20抗體二者之每一稀釋液(有及沒有可溶性人類BAFF三聚物)添加至以40,000個細胞/孔之濃度平鋪於96孔板上之WILS-2 B淋巴瘤細胞(其表現跨膜CD20)並將板於37℃培育30分鐘。之後，將以1：15稀釋之純化人類血清補體(Quidel,p/n.A133)添加至各孔並將板於37℃培育2小時。培育之後，將阿爾瑪藍(Alamar Blue)(Biosource,p/n.DAL1100)添加至各孔並將板於37℃培育過夜。使用Molecular Devices Spectra Max Gemini EM讀取器在540nm激發及590nm發射下記錄相對螢光單位(反映每一孔活細胞之數量)。將所收集數據模型化至4-參數擬合S形劑量反應曲線以計算EC50值。所得EC50值呈現於表4中。
表4中所提供之結果表明，本發明之例示性雙特異性抗體在存在或不存在飽和量之可溶性人類BAFF下均具有CDC活性，以濃度依賴性方式使每一孔之活WIL2-S細胞之群體減少。例示性雙特異性抗體之所觀察CDC活性與親本CD20抗體相當。本發明之雙特異性抗體甚至在BAFF同時接合時亦展示有效CDC活性。
抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性之活體外分析
使用WIL2-S B淋巴瘤細胞(其表現人類CD20)及經反轉錄病毒載 體轉導以共表現NFAT-螢光素酶報告基因、γ鏈及FcγIIIa(F158)受體或FcγIIIa(V158)受體中之任一者之人類Jurkat T細胞(ATCC #TIB-152)來分析本發明雙特異性抗體之ADCC活性。將WIL2-S細胞以40,000個細胞/孔之濃度與例示性雙特異性抗體或親本CD20抗體(例如美國專利第8,153,125號中所闡述者)(二者均已自150ng/mL連續稀釋(使用3倍稀釋)至0.07ng/mL)於37℃培育1小時。培育(於37℃ 1小時)之後，將經轉染之Jurkat T細胞以200,000個細胞/孔之濃度添加至孔並將板於37℃培育3小時。
藉由向各孔添加100μl Steady Glo螢光素酶受質(Promega,p/n.E2520)並混合15分鐘生成螢光素酶報導基因信號。使用SPECTRAmax LMaxII(Molecular Devices)量測指示FcγIIIa受體接合增加(解釋為ADCC活性增加)之報導基因發光信號並模型化至4參數擬合S形劑量反應曲線以計算EC50值。所得EC50值呈現於下表5中。
表5中所提供之結果表明，本發明之例示性雙特異性抗體以濃度依賴性方式接合FcγIIIa受體。例示性雙特異性抗體之所觀察ADCC活性與親本CD20抗體相當。本發明之例示性雙特異性抗體展示有效ADCC活性。
為評價BAFF當結合至本發明雙特異性抗體之scFv部分時是否影 響本發明雙特異性抗體之FcγIIIa受體接合(及ADCC)活性，在存在及不存在1/3連續稀釋濃度之可溶性人類BAFF三聚物(自100ng/mL之起始濃度)之情況下重複(一式兩份)上述實驗。親本CD20抗體係在不存在可溶性人類BAFF下且在可溶性人類BAFF之此最高起始濃度(100ng/mL)下測試。使用經轉導以共表現NFAT-螢光素酶報告基因及FcγIIIa(V158)受體(如上文所述)之Jurkat T細胞。所得EC50數據呈現於下表6中。
表6中所提供之結果表明，本發明之例示性雙特異性抗體甚至在BAFF之存下亦接合FcγIIIa受體。如表6中所示，本發明之例示性雙特 異性抗體在BAFF之飽和條件下經歷FcγIIIa受體接合之稍微下降。例示性雙特異性抗體之所觀察ADCC活性在BAFF之飽和條件下與親本CD20抗體相比稍微下降。本發明之例示性雙特異性抗體在BAFF之同時接合期間展示有效ADCC活性。
BAFF中和之活體內分析
人類BAFF活體內中和係使用表現人類可溶性BAFF之轉基因FVB小鼠(FVB/N-TgN(LP40)16989)進行評價。人類BAFF轉基因(Tg)小鼠皮下注射3.3奈莫耳：a.)例示性雙特異性抗體(N=5)；b.)親本BAFF抗體(N=5)；c.)人類IgG4陰性對照抗體(N=5)；d.)親本CD20抗體(N=5)；或e.)未經處理(天然小鼠，N=5)。8天之後，將小鼠處死並收集血漿及脾。每一抗體之暴露係藉由特定針對人類IgG之血漿ELISA證實。
製備脾細胞之單一細胞懸浮液並在紅血球溶解之後測定白血球總數。使用細胞表面標記B220及流式細胞術測定B淋巴球之相對百分比，藉此能夠藉由B220陽性細胞之百分比乘以脾臟中白血球之總數計算每一脾臟B細胞之總數。結果呈現於下表7中。
表7中所提供之結果反映與天然、陰性對照及親本CD20抗體處理之轉基因小鼠相比，經單一皮下注射例示性雙特異性抗體處理之人類BAFF Tg小鼠之脾臟中B細胞之總數下降。B細胞之此下降相當於利用 親本BAFF抗體所觀察到者。本發明之例示性雙特異性抗體展示BAFF之有效活體內中和。
活體內效能模型
本發明之例示性雙特異性抗體並不結合鼠類CD20且對鼠類BAFF之結合性大幅減少(與人類BAFF相比，對鼠類BAFF之結合減少為約1/250)。另外，不能產生代用鼠類雙特異性抗體。因此，分開使用鼠類抗體(一種針對鼠類CD20且一種針對鼠類BAFF)在齧齒類動物模型中測試雙重靶向CD20及BAFF之治療潛能。
在宿主小鼠(雌性C57BL/6xDBA/2 F1小鼠，Charles River Laboratories)中經由自供體小鼠(7至8週齡雌性DBA/2小鼠，Charles River Laboratories)轉移14×106個CD4+脾細胞誘導狼瘡樣自體免疫性。將來自供體小鼠之CD4+脾細胞依Via CS及Shearer GM,Ann.NY Acad.Sci.,532：44-50(1988)所述，轉移至宿主小鼠之尾靜脈中。在轉移時，供體CD4+脾細胞為宿主B細胞提供同源幫助，此使得宿主B細胞(包括自體反應性宿主B細胞)增殖/擴增。
為在正進行免疫反應之情形中研究B細胞耗盡，將CD4+脾細胞自供體小鼠轉移至宿主小鼠。轉移後7天，經由ELISA測試宿主小鼠之抗dsDNA自體抗體(如下文所述)以證實引發疾病。在轉移後第7天，宿主小鼠亦根據以下四個治療組中之一者經皮下治療：(a)65μg鼠類CD20抗體+65μg mIgG1同型對照抗體(N=4)；(b)65μg鼠類BAFF抗體+65μg mIgG1同型對照抗體(N=4)；(c)65μg鼠類CD20抗體+65μg BAFF抗體(N=4)；或(d)130μg mIgG1同型對照抗體(N=4)。
宿主小鼠在抗體治療後7天處死並如上文所述藉由流式細胞術測定血液、淋巴結及脾中之B220+細胞值(與經過治療之轉基因BAFF小鼠之脾B細胞含量相關)。結果呈現於下表8中。
表8中所提供之結果表明，經單一皮下注射鼠類CD20抗體及鼠類BAFF抗體治療之宿主小鼠之血液、淋巴結及脾中B細胞之總數顯著下降超過陰性對照治療之小鼠。經鼠類CD20抗體及鼠類BAFF抗體治療之宿主小鼠中B細胞之含量降至低於未經治療小鼠及僅經鼠類CD20抗體或鼠類BAFF抗體中之一者單獨治療之小鼠者之含量。
在7週研究中，將CD4+脾細胞自供體小鼠轉移至宿主小鼠，且在脾細胞轉移之當天，宿主小鼠根據以下四個治療組中之一者經皮下治療：(a)65μg鼠類CD20抗體+65μg mIgG1同型對照抗體(N=10)；(b)65μg鼠類BAFF抗體+65μg mIgG1同型對照抗體(N=10)；(c)65μg鼠類CD20抗體+65μg鼠類BAFF抗體(N=10)；或(d)130μg mIgG1同型對照抗體(N=10)。
在治療後7週將宿主小鼠處死並如下文詳細闡述量測抗dsDNA自體抗體存在及尿液白蛋白/肌酸酐值。
藉由ELISA測定宿主小鼠血漿樣品中抗dsDNA自體抗體之存在。將Greiner 96孔微量滴定板(Bellco Glass,p/n.655 061)用存於Dulbecco 之磷酸鹽緩衝鹽水(D-PBS，無Mg，無Ca)中之10μg/mL Trevigen(R&D Systems,p/n.9600-5D)小牛胸腺DNA塗覆並於4℃培育過夜。培育之後，將板利用含有2%牛血清白蛋白(BSA)之D-PBS於室溫(RT)封阻1小時，然後用存於PBS中之0.05% Tween 20洗滌。
在處死當天收集宿主小鼠之血漿且血漿樣品利用存於PBS中之0.05% Tween 20加2% BSA稀釋至1：100之起始稀釋液。對於每一所收集血漿樣品，自該起始1：100血漿稀釋液製備6個4倍連續稀釋液。將經稀釋血漿樣品添加至板之個別孔並將板於室溫培育2小時，用存於PBS中之0.05% Tween 20洗滌，且然後與利用存於PBS中之0.05% Tween 20加2% BSA稀釋至1：2000稀釋液之山羊抗小鼠IgG(H及L)-HRP(Jackson ImmunoResearch,p/n.115-035-166)一起培育90分鐘。之後，將TMB受質(Thermo Scientific,p/n.34021)添加至各孔。利用0.5M H2SO4終止顯色。使用分光光度計在A450(SpectraMax,Molecular Devices)讀取比色信號並使用GraphPad Prism分析所收集數據用於測定抗DNA效價(EC50)值。抗dsDNA效價值呈現於表9中。
表9中所提供之結果表明當利用鼠類CD20抗體及鼠類BAFF抗體二者治療時，抗DNA效價顯著低於利用CD20抗體單獨或BAFF抗體單獨治療之效價。
白蛋白/肌酸酐比率係用於評價涉及SLE進展之腎損害之可用度量。白蛋白/肌酸酐比率值係藉由根據以下方程式個別地量測宿主小鼠尿液中之白蛋白(μg/mL)及肌酸酐(mg/dL)值來測定：[(尿液白蛋白 (μg/mL)/尿液肌酸酐(mg/dL))×100=白蛋白肌酸酐比率(μg/mg)]。利用Cobas CREA Plus分析(Roche,p/n.11775685)根據製造商說明書量測尿液肌酸酐含量。
藉由夾心ELISA測定尿液白蛋白含量。將微量滴定板(Greiner Bio-One,p/n.655061)用60μl兔抗小鼠白蛋白抗體(Acris Antibodies,p/n.AP09221PU-N)以0.75μg/mL之濃度(稀釋於PBS中)塗覆，然後用洗滌緩衝液(20mM Tris、0.15M NaCl、0.1% Tween 20,pH 7.4)洗滌並使用封阻緩衝液(酪蛋白於PBS中，Pierce Protein Biology Products,p/n.37528)封阻。藉由利用封阻緩衝液(Pierce,p/n.37528)進行1：2000稀釋及1：80,000稀釋製備尿液樣品。藉由使用1：2稀釋之封阻緩衝液(Pierce,p/n.37528)將200ng/mL濃度之小鼠白蛋白(Innovative Research,p/n.IMSA)連續稀釋降至0.78ng/mL生成標準曲線。將標準曲線連續稀釋液(50μL)及樣品稀釋液(50μL)一式雙份添加至板之個別孔並於室溫培育1.5小時。之後，將板用洗滌緩衝液洗滌，且然後與50μL山羊抗小鼠白蛋白-HRP(Bethyl,p/n.A90-234P)之1：3000稀釋液一起於室溫培育1小時。將板用洗滌緩衝液洗滌，且然後藉由向各孔添加50μl OPD受質(Sigma,p/n.P-6912)顯影。藉由添加100μL 1N HCl終止比色反應。使用板讀取器(SpectraMax,Molecular Devices)於490nm量測比色信號並使用SoftMax 3.1.2軟體及4參數擬合分析所收集數據以反算樣品濃度。白蛋白肌酸酐比率值呈現於表10中。
表10中所提供之結果表明與利用鼠類CD20抗體單獨或鼠類BAFF抗體單獨治療之小鼠相反，利用鼠類CD20抗體及鼠類BAFF抗體二者治療之小鼠的白蛋白肌酸酐比率顯著降低。
食蟹猴中之藥物動力學評價
食蟹猴之胺基酸序列與人類CD20之胺基酸序列共享96.6%一致性。使用食蟹猴全血之流式細胞術以證實例示性抗體結合至食蟹猴CD20。
將自食蟹猴收集之全血(50μL)與以下中之任一者於室溫培育30分鐘：(a)例示性雙特異性抗體(1.5μg)(經AlexaFluor647標記)及陽性對照抗體(1.5μg)(FITC標記之CD40抗體，其與食蟹猴具有反應性且來自BioLegend,p/n.334306)；或(b)人類IgG1同型陰性對照抗體(1.5μg)(經AlexaFluor647標記)及陽性對照抗體(1.5μg)(FITC標記之CD40抗體，其與食蟹猴具有反應性且來自BioLegend,p/n.334306)。培育之後，藉由根據製造商說明書添加FACS溶解溶液(Becton Dickinson & Co.,p/n.349202)使紅血球溶解。將細胞用FACS緩衝液(含2%胎牛血清之PBS)洗滌三次，然後重新懸浮於FACS緩衝液中，然後使用Beckman Coulter FC500進行流式細胞術。CD20結合係在FL-4(647)通道中檢測且CD40結合係在FL-1(FITC)通道中檢測。結果呈現於下表11中。
表11中所提供之結果表明本發明之例示性雙特異性抗體結合B細胞之食蟹猴CD20，而人類IgG1陰性對照抗體不能結合食蟹猴B細胞。該等結果支持食蟹猴用於本發明雙特異性抗體之活體內測試。
為評價例示性雙特異性抗體之血清藥物動力學，雄性食蟹猴經靜脈內(N=2)或經皮下(N=2)投與13.3mg/kg例示性雙特異性抗體。例示性雙特異性抗體係於PBS溶液(pH 7.4)中準備。由於物理及化學不穩定性(本文所述)阻止表現及回收，故不可能利用包含親本CD20抗體及親本BAFF之雙特異性抗體進行藥物動力學研究。
投與之前，自每一食蟹猴收集約1.5mL血液。投與之後，在投與後1、6、12、24、48、72、96、168、240、336、432、504、600及672小時自股靜脈經靜脈內將血液樣品(約1.5mL)收集於試管血清分離試管(例如，不含抗凝劑)中。在各別時間點收集之後，將樣品處理成血清。
例示性雙特異性抗體之清除係利用塗覆於ELISA板(Thermo ScientificTM Immulon® 4HBX)上之AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人類IgG(F(ab’)2片段特異性)(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,p/n.109-006-097)藉由總人類IgG ELISA分析血清樣品來測定。將來自各別時間點之血清樣品(100μL)添加至ELISA板之個別孔並於25℃培養60min。培育之後，將100μL(50,000倍稀釋)小鼠抗人類IgG Fc-HRP(Southern Biotech,p/n.9040-05)添加至ELISA板之孔以檢測例示性雙特異性抗體。經由洗滌去除未結合酶並將100μL TMB微孔過氧化酶受質系統(KPL,p/n.50-76-00)添加至ELISA板之個別孔。藉由添加100μL TMB終止溶液(KPL,p/n.50-85-05)終止顯色並於450nm量測孔之光學密度，其中波長校正設定為630nm。
亦生成已知量之例示性雙特異性抗體於100%食蟹猴血清(BioreclamationIVT,p/n.CYNSRM)中之標準曲線用於測定清除值。 將於100%食蟹猴血清中之例示性雙特異性抗體以20倍連續稀釋稀釋於封阻劑於PBS中之酪蛋白(Thermo ScientificTM BlockerTM,p/n.37528)中。例示性雙特異性抗體之標準曲線範圍係78.1-5000ng/mL(其中量化之上限及下限分別為1900ng/mL及120ng/mL)。
使用自時間零(投與抗體)至投與後192小時之免疫反應性對時間輪廓計算例示性雙特異性抗體之清除值並使用Phoenix軟體(WinNonLin 6.3,Connect 1.3)經由無分室分析測定。靜脈內投與之例示性雙特異性抗體展示0.83mL/hr/kg之平均清除率及58小時之平均半衰期。當皮下投與時，例示性雙特異性抗體展示1.22mL/hr/kg之平均清除率、72小時之平均半衰期及69%之生物利用度。結果表明，例示性雙特異性抗體具有足夠半衰期、清除率及生物利用度以支持皮下投藥。
例示性雙特異性抗體在食蟹猴循環中之穩定性係基於BAFF抗原捕獲值(在上述時間點時收集之血清樣品)對總人類IgG ELISA值(如上文所述計算)之比率測定。BAFF抗原捕獲係利用塗覆於ELISA板(Thermo ScientificTM Immulon® 4HBX)上之BAFF抗原(Eli Lilly and Company)。將來自上文所述每一各別時間點之血清樣品(100μL)添加至ELISA板之個別孔並於25℃培育60min。培育之後，將100μL(10,000倍稀釋)小鼠抗人類IgG Fc-HRP(Southern Biotech,p/n.9040-05)添加至ELISA板之孔用於檢測例示性雙特異性抗體。經由洗滌去除未結合酶，並將100μL TMB微孔過氧化酶受質系統(KPL,p/n.50-76-00)添加至ELISA板之個別孔。藉由添加100μL TMB終止溶液(KPL,p/n.50-85-05)終止顯色並於450nm量測孔之光學密度，其中波長校正設定為630nm。
使用Phoenix(WinNonLin 6.3,Connect 1.3)經由無分室分析測定BAFF抗原捕獲及總人類IgG ELISA二者之曲線下面積(AUC)。平均曲 線下面積百分比(AUC%)值係計算為(AUC0-tlast,BAFF抗原捕獲分析/AUC0-tlast，總人類IgG分析)*100%。基於BAFF結合，例示性雙特異性抗體展示約95%至101%之AUC%。結果反映例示性雙特異性抗體在鏈接體L1及L2處具有足夠穩定性。
雙特異性抗體物理及化學性質分析
由於差的雙特異性抗體表現、LC剪切、scFv之錯誤摺疊、差的純化回收、雙特異性抗體降解/剪切、差的熱穩定性及低親和力(相對於親本抗體)，不可能利用包含親本CD20抗體及親本BAFF之雙特異性抗體進行初步研究。然而，利用本發明例示性雙特異性抗體之初步研究意外的展示有益性質，包括表現雙特異性抗體及意外有益之化學及物理穩定性及溶解性。如由本文所提供之數據所展示，本發明雙特異性抗體展現低HMW聚集、良好溶解性、於溶液中之良好黏度、增加之物理穩定性(包括低降解含量及高光穩定性)、低肽鍵裂解及高及低濃度之冷凍解凍穩定性，同時對CD20(如藉由本文所述之FACS分析所量測)及BAFF(如藉由本文所述之ELISA分析所量測)二者維持良好親和力並維持BAFF之中和活性以及ADCC活性(二者皆如本文所述分析)。
物理及化學穩定性分析
對於物理及化學穩定性分析，將表1之例示性雙特異性抗體調配於10mM乙酸鹽(pH 5.0)、0.02% Tween-80中。將例示性雙特異性抗體樣品濃縮至1mg/mL、50mg/mL及100mg/mL(使用Amicon U.C.過濾器，Millipore,p/n.UFC903024)。
藉由將樣品在4℃、25℃及40℃中之一者下培育4週之時期評價濃縮至1mg/mL之樣品的樣品穩定性。濃縮至50mg/mL及100mg/mL之樣品係在4℃及25℃中之一者下在150mM NaCl存在及不存在下培育4週之時期。
各別培育時期之後，使用TSK G3000SW(Tosoh Bioscience,p/n.08541)管柱利用粒徑篩析層析(SEC)分析樣品之高分子量百分比(HMW%)。使用50mM磷酸鈉+350mM NaCl,pH 7.0作為移動相，以0.5mL/min運行35min。將10μL(10μg)體積之1mg/mL抗體樣品注入管柱中並於214nm下量測檢測。對於高黏度樣品，將1μL體積(50μg或100μg)注入管柱中並於280nm下量測檢測。使用ChemStation分析層析圖並使用在單峰之前所溶析峰之AUC對總AUC之比率計算%高分子量(HMW)。結果概述於表12中。
表12中所提供之結果表明，如本文所述經調配之本發明例示性雙特異性抗體達成高蛋白質濃度且在4週25℃降解研究之後高分子量內容物顯示小於1.4%變化。
亦根據製造商說明書使用Beckman-PA800 plus系統利用毛細管等電聚焦(cIEF)分析來分析濃縮至1mg/mL之樣品的樣品降解。對於在4℃培育之樣品而言，經量測樣品降解百分比為0%；對於在25℃培育之樣品而言，樣品降解經量測為1.3%。
亦根據製造商說明書使用Thermo Scientific Ion Trap LC-MS系統利用液體層析-質譜(LC-MS)分析來分析濃縮至1mg/mL並於40℃下儲 存之樣品用於鑑別肽鍵裂解。雙特異性抗體之區均未展示高於2%之肽鍵裂解且鉸鏈區(第一多肽鏈，例示性雙特異性抗體之SEQ ID NO：1)僅展示約1%之肽鍵裂解。
溶解度分析
在4℃、-5℃及-10℃下1週培育時期之後在每一溫度下分析例示性雙特異性抗體之溶解度。溶解度係利用濃縮至100mg/mL與150mg/mL之間(使用Amicon U.C.過濾器，Millipore，目錄編號UFC903024)並調配於10mM乙酸鹽(pH 5.0)中之雙特異性抗體試樣來評價。例示性雙特異性抗體展現至少148mg/mL之溶解度，在治療性雙特異性抗體之可接受值內。例示性雙特異性抗體在高濃度下亦僅展示HMW內容物含量之0.49%變化，且在培育時期之後沒有相分離。
於室溫下分析例示性雙特異性抗體之黏度。評價濃縮至100mg/mL並調配於10mM乙酸鹽(pH 5.0)中之雙特異性抗體之黏度。例示性雙特異性抗體在100mg/mL下展現4.9cp(治療性雙特異性抗體之接受值)之黏度。
光穩定性分析
利用濃縮於50mg/mL並調配於以下中任一者之雙特異性抗體評價例示性雙特異性抗體之光穩定性分析：(a)10mM乙酸鹽(pH 5.0)、0.02% Tween-80；或(b)10mM檸檬酸鹽(pH 6.0)、0.02% Tween-80、150mM NaCl。將樣品暴露240,000勒克司(lux)小時可見光加40瓦特-hr/m2 UV光。對照(「黑暗」)樣品未暴露於光。然後使用TSKgel Super G3000SW管柱於粒徑篩析層析(SEC)上分析樣品。結果概述於表13中。
表13中所提供之結果表明，以高濃度調配於10mM乙酸鹽(pH 5.0)、0.02% Tween-80中之本發明例示性雙特異性抗體具有與其他治療性雙特異性抗體相當之光穩定性。
高及低濃度冷凍/解凍分析
在根據表14實施之三個冷凍/解凍循環之後評價本發明例示性雙特異性抗體之冷凍解凍分析：
利用濃縮於1mg/mL並調配於10mM乙酸鹽，pH 5.0(有及沒有0.02% Tween-80)中之雙特異性抗體評價例示性雙特異性抗體之低濃度冷凍/解凍分析。實施三個冷凍/解凍循環(表14中表示之單一循環)並使用HIAC粒子計數器(Pacific Scientific,p/n.9703)評價每一樣品之粒子生長。兩種調配物(有及沒有0.02% Tween-80)之粒子計數均小於或等於100。具有0.02% Tween-80之調配物與未經受冷凍/解凍循環之對照樣品相比未展示粒子計數之差異，此表明本發明之例示性雙特異性抗體在低濃度條件下在多個冷凍/解凍循環之後穩定。
利用濃縮於50mg/mL並調配於以下中之任一者之雙特異性抗體 評價例示性雙特異性抗體之高濃度冷凍/解凍分析：(a)10mM乙酸鹽(pH 5.0)、0.02% Tween-80；或(b)10mM檸檬酸鹽(pH 6.0)、0.02% Tween-80，有及沒有150mM NaCl。實施三個冷凍/解凍循環(表14中表示之單一循環)並使用HIAC粒子計數器評價每一樣品之粒子生長。結果提供於表15中：
表15中所提供之結果表明，在高濃度並調配於10mM乙酸鹽(pH 5.0)、0.02% Tween-80中之本發明例示性雙特異性抗體在多個冷凍/解凍循環之後穩定。
序列
表1之例示性雙特異性抗體之第一多肽(SEQ ID NO：1)
表1之例示性雙特異性抗體之第二多肽(SEQ ID NO：2)
編碼表1之例示性雙特異性抗體之第一多肽之DNA序列(SEQ ID NO：3)
編碼表1之例示性雙特異性抗體之第二多肽之DNA序列(SEQ ID NO：4)
表1之例示性雙特異性抗體之HCVR1(SEQ ID NO：5)
表1之例示性雙特異性抗體之HCVR2(SEQ ID NO：6)
表1之例示性雙特異性抗體之LCVR1(SEQ ID NO：7)
表1之例示性雙特異性抗體之LCVR2(SEQ ID NO：8)
表1之例示性雙特異性抗體之HCDR1(SEQ ID NO：9)
KGSGRTFTSYNMH
表1之例示性雙特異性抗體之HCDR2(SEQ ID NO：10)
AIYPLTGDTSYNQKSKL
表1之例示性雙特異性抗體之HCDR3(SEQ ID NO：11)
ARSTYVGGDWQFDV
表1之例示性雙特異性抗體之HCDR4(SEQ ID NO：12)
TVSGGSFSGHYWS
表1之例示性雙特異性抗體之HCDR5(SEQ ID NO：13)
EINHSGSTNYNPSLKS
表1之例示性雙特異性抗體之HCDR6(SEQ ID NO：14)
ARGARDILTGYLYYYDH
表1之例示性雙特異性抗體之LCDR1(SEQ ID NO：15)
RASSSVPYIH
表1之例示性雙特異性抗體之LCDR2(SEQ ID NO：16)
YATSALAS
表1之例示性雙特異性抗體之LCDR3(SEQ ID NO：17)
QQWLSHPPT
表1之例示性雙特異性抗體之LCDR4(SEQ ID NO：18)
RASQSVSRYLA
表1之例示性雙特異性抗體之LCDR5(SEQ ID NO：19)
YDASNRAT
表1之例示性雙特異性抗體之LCDR6(SEQ ID NO：20)
QQRSNHPRT
表1之例示性雙特異性抗體之多肽鏈接體1(SEQ ID NO：21)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
表1之例示性雙特異性抗體之多肽鏈接體2(SEQ ID NO：22)
GGGGSGGGGSGGGGS
<110> 美國禮來大藥廠
<120> 抗-CD20-/抗-BAFF雙特異性抗體
<130> X20443
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<160> 22
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<211> 715
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表1之例示性雙特異性抗體之第一多肽
<400> 1
<210> 2
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表1之例示性雙特異性抗體之第二多肽
<400> 2
<210> 3
<211> 2145
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼表1之例示性雙特異性抗體之第一多肽之DNA序列
<400> 3
<210> 4
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼表1之例示性雙特異性抗體之第二多肽之DNA序列
<400> 4
<210> 5
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表1之例示性雙特異性抗體之HCVR1
<400> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 表1之例示性雙特異性抗體之HCVR2
<400> 6
<210> 7
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表1之例示性雙特異性抗體之LCVR1
<400> 7
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表1之例示性雙特異性抗體之LCVR2
<400> 8
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 表1之例示性雙特異性抗體之HCDR1
<400> 9
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表1之例示性雙特異性抗體之HCDR2
<400> 10
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表1之例示性雙特異性抗體之HCDR3
<400> 11
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表1之例示性雙特異性抗體之HCDR4
<400> 12
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表1之例示性雙特異性抗體之HCDR5
<400> 13
<210> 14
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表1之例示性雙特異性抗體之HCDR6
<400> 14
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表1之例示性雙特異性抗體之LCDR1
<400> 15
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表1之例示性雙特異性抗體之LCDR2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表1之例示性雙特異性抗體之LCDR3
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表1之例示性雙特異性抗體之LCDR4
<400> 18
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 表1之例示性雙特異性抗體之LCDR5
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<210> 20
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 表1之例示性雙特異性抗體之LCDR6
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<210> 21
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 表1之例示性雙特異性抗體之多肽鏈接體1
<400> 21
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表1之例示性雙特異性抗體之多肽鏈接體2
<400> 22

Claims (17)

  1. 一種雙特異性抗體，其包含兩個第一多肽鏈及兩個第二多肽鏈，其中以下各項之每一者a.)該第一多肽鏈包含單鏈可變片段(scFv)及mAb IgG重鏈(HC)，該HC具有包含重鏈CDR(HCDR)1-3之重鏈可變區(HCVR1)，其中HCDR1之胺基酸序列係SEQ ID NO：9，HCDR2之胺基酸序列係SEQ ID NO：10，HCDR3之胺基酸序列係SEQ ID NO：11；且該scFv具有重鏈可變區(HCVR2)及輕鏈可變區(LCVR2)，HCVR2包含HCDR 4-6且LCVR2包含LCDR 4-6，其中HCDR4之胺基酸序列係SEQ ID NO：12，HCDR5之胺基酸序列係SEQ ID NO：13，HCDR6之胺基酸序列係SEQ ID NO：14，LCDR4之胺基酸序列係SEQ ID NO：18，LCDR5之胺基酸序列係SEQ ID NO：19，且LCDR6之胺基酸序列係SEQ ID NO：20；及b.)該第二多肽包含含有輕鏈CDR(LCDR)1-3之mAb輕鏈(LC)，其中LCDR1之胺基酸序列係SEQ ID NO：15，LCDR2之胺基酸序列係SEQ ID NO：16，LCDR3之胺基酸序列係SEQ ID NO：17，其中每一scFv經由共價附接至HC之N-末端及LCVR2之C-末端之多肽鏈接體(L1)獨立鏈接至該HC，且LCVR2經由共價附接至LCVR2之N-末端及HCVR2之C-末端之第二多肽鏈接體(L2)鏈接至相同scFv之HCVR2。
  2. 如請求項1之雙特異性抗體，其中HCVR1之胺基酸序列係SEQ ID NO：5，LCVR1之胺基酸序列係SEQ ID NO：7，HCVR2之胺基酸序列係SEQ ID NO：6，且LCVR2之胺基酸序列係SEQ ID NO：8。
  3. 如請求項1及2中任一項之雙特異性抗體，其中L1之胺基酸序列 係SEQ ID NO：21且L2之胺基酸序列係SEQ ID NO：22。
  4. 一種雙特異性抗體，其包含兩個第一多肽鏈及兩個第二多肽鏈，其中該等第一多肽中之每一者之胺基酸序列係SEQ ID NO：1且該等第二多肽中之每一者之胺基酸序列係SEQ ID NO：2。
  5. 一種DNA分子，其包含編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之多肽鏈之聚核苷酸序列。
  6. 一種DNA分子，其包含編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之多肽鏈之聚核苷酸序列。
  7. 一種DNA分子，其包含編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之多肽鏈之聚核苷酸序列且包含編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之多肽鏈之聚核苷酸序列。
  8. 一種哺乳動物細胞，其包含如請求項5之DNA分子及如請求項6之DNA分子，該細胞能夠表現具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之多肽鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之多肽鏈。
  9. 如請求項8之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞係CHO。
  10. 一種哺乳動物細胞，其包含如請求項7之DNA分子，該細胞能夠表現具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之多肽鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之多肽鏈。
  11. 如請求項10之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞係CHO。
  12. 一種用於產生雙特異性抗體之方法，該雙特異性抗體包含胺基酸序列係SEQ ID NO：1之多肽及胺基酸序列係SEQ ID NO：2之多肽，該方法包含在使得該雙特異性抗體表現之條件下培養如請求項8或10之哺乳動物細胞，及回收該經表現雙特異性抗體。
  13. 一種雙特異性抗體，其藉由如請求項12之方法產生。
  14. 如請求項1、2、4及13中任一項之雙特異性抗體，其用於療法中。
  15. 如請求項1、2、4及13中任一項之雙特異性抗體，其用於治療全身性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎或原發性薛格連氏症候群(primary Sjögren's Syndrome)。
  16. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至4及13中任一項之雙特異性抗體及一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  17. 一種如請求項1至4及13中任一項之雙特異性抗體之用途，其用於製造用於治療全身性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎或原發性薛格連氏症候群之藥劑。
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