CN101945667A - 利妥昔单抗不应性类风湿性关节炎患者的疗法 - Google Patents

Abstract

公开了治疗利妥昔单抗不应性类风湿性关节炎(RA)患者的方法，包括以有效治疗RA的量对患者施用除利妥昔单抗以外的抗CD20抗体。

Description

利妥昔单抗不应性类风湿性关节炎患者的疗法

相关申请的交叉引用

依据37CFR§1.53(b)提交的此非临时申请依据35USC§119(e)要求2007年12月21日提交的美国临时申请流水号61/016,281的权益，通过述及完整收录。

发明领域

本发明关注用于治疗利妥昔单抗(rituximab)不应性类风湿性关节炎(RA)患者的方法。

发明背景

淋巴细胞是在造血过程中在骨髓中生成的许多类型白血球(白细胞)之一。有两种主要的淋巴细胞群：B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)。

B细胞在骨髓内成熟，然后离开骨髓并在其细胞表面上表达抗原结合抗体。当幼稚B细胞初次遭遇其膜结合抗体对之特异性的抗原时，该细胞开始快速分裂且其后代分化成记忆B细胞和称作“浆细胞”的效应细胞。记忆B细胞具有较长的寿命并继续表达与最初的亲本细胞具有相同特异性的膜结合抗体。浆细胞不生成膜结合抗体，但改为生成可分泌形式的抗体。分泌型抗体是体液免疫的主要效应分子。

B细胞相关病症包括自身免疫性疾病。内科医师和科学家已经鉴定了超过70种临床上独特的自身免疫性疾病，包括RA、多发性硬化(MS)、血管炎、免疫介导的糖尿病、和狼疮诸如系统性红斑狼疮(SLE)。这些疾病的慢性本质导致巨大的社会和财政负担。

靶向B细胞表面抗原的细胞毒剂是B细胞相关癌症疗法的重要焦点。此类B细胞表面抗原(包括CD19、CD20、CD22、和CD52)代表了淋巴瘤治疗的潜在治疗剂的靶物。

CD20抗原(也称作人B淋巴细胞限制分化抗原，Bp35，或者B1)是位于前B淋巴细胞和成熟B淋巴细胞上、具有约35kD分子量的四次跨膜、糖基化整合膜蛋白。该抗原还在超过90％的B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)上表达，但在造血干细胞、原B细胞(pro-B cell)、正常浆细胞或其它正常组织上没有找到。CD20调节细胞周期起始和分化的激活过程中的早期步骤，并可能发挥钙离子通道的功能在活化的B细胞中发生磷酸化，CD20出现在前B细胞阶段的B淋巴细胞表面上，而且能在成熟和记忆B细胞上找到，但在浆细胞上找不到。CD20具有钙通道活性，而且可能在B细胞发育中发挥作用。不清楚外周CD20⁺B细胞体外溶解和利妥昔单抗体内活性之间的关系。利妥昔单抗在体外展现出抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。还在淋巴瘤细胞和细胞系中及在某些小鼠异种移植物模型中观察到利妥昔单抗的有力补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。数种抗CD20抗体，包括利妥昔单抗，显示出在通过二抗或通过其它手段交联时能在体外诱导凋亡。

倘若CD20在B细胞淋巴瘤中表达，那么该抗原可充当此类淋巴瘤“靶向”的候选者。本质上，这样的靶向可概括如下：对患者施用对B细胞的CD20表面抗原特异性的抗体。这些抗CD20抗体特异性结合正常B细胞和恶性B细胞二者的CD20抗原(在表面上)；抗体与CD20表面抗原结合可导致赘生性B细胞的破坏和消减。另外，可以将具有破坏肿瘤潜力的化学药剂或放射性标记物与抗CD20抗体偶联，使得该药剂特异性“投递”至赘生性B细胞。不考虑方法，首要目标是破坏肿瘤；具体方法可根据所利用的具体抗CD20抗体来决定，如此，靶向CD20抗原的可用方法可以有相当大的变化。

利妥昔单抗(

)抗体是针对CD20抗原的遗传工程嵌合鼠/人单克隆抗体。利妥昔单抗就是US 5,736,137(Anderson et al.)中称作“C2B8”的抗体。利妥昔单抗指明用于治疗患有复发性或顽固性低级或滤泡性CD20阳性B细胞NHL的患者。作用机制的体外研究表明利妥昔单抗结合人补体并通过CDC溶解淋巴样B细胞系。此外，它在ADCC测定法中具有显著活性。利妥昔单抗显示出在氚化胸苷掺入测定法中具有抗增殖效应且直接诱导凋亡，而其它抗CD19和抗CD20抗体不行。利妥昔单抗使耐药性人B细胞淋巴瘤细胞系对多柔比星和其它毒素的细胞毒性效应敏感。体内临床前研究显示了利妥昔单抗从猕猴的外周血、淋巴结、和骨髓消减B细胞。

美国在1997年11月批准将利妥昔单抗用于治疗患有复发性或顽固性低级或滤泡性CD20⁺B细胞NHL的患者，每周一次，一剂375mg/m²，共四剂。2001年4月，美国又批准了利妥昔单抗用于治疗低级NHL：复治(每周一次，共四剂)和额外的剂量给药方案(每周一次，共八剂)。批准后，患者已经暴露于利妥昔单抗，或是作为单一疗法或是联合免疫抑制剂或化疗药物。还已经作为维持疗法用利妥昔单抗治疗患者，可长达两年。利妥昔单抗已经用于治疗恶性和非恶性浆细胞病症。

还在多种非恶性自身免疫性病症中研究了利妥昔单抗。所述病症包括RA、狼疮、免疫性血小板减少性紫癜、纯红细胞再生障碍、自身免疫性贫血、冷凝集素病、重度胰岛素耐受B型综合征、混合性冷球蛋白血症、重症肌无力、韦格纳氏肉芽肿病、顽固性寻常型天疱疮、皮肌炎、斯耶格伦氏综合征、活动性II型混合性冷球蛋白血症、寻常型天疱疮、自身免疫性神经病、瘤外视性眼阵挛-肌阵挛综合征、及复发-缓和型多发性硬化(RRMS)。

在RA患者中进行了II期研究(WA16291)，提供了有关利妥昔单抗的安全性和疗效的48周跟踪数据。将患者随机平分为四个治疗组：甲氨蝶呤、仅用利妥昔单抗、利妥昔单抗加甲氨蝶呤、及利妥昔单抗加环磷酰胺。利妥昔单抗的治疗方案为第1天和第15天静脉内施用1克。大多数RA患者对利妥昔单抗输注有很好的耐受，其中36％在其首次输注期间发生至少一例不良事件(与30％接受安慰剂的患者相比)。总之，认为大多数不良事件在严重程度方面是轻度到中度的，而且所有治疗组之间很均衡。在48周中四个组发生了共19例重度不良事件，其中利妥昔单抗/环磷酰胺组稍多一些。所有组之间的感染发生率很均衡。该RA患者群中重度感染的平均比率为每100名患者-年有4.66例，低于基于社会的流行病学研究中所报告的RA患者中需要入院治疗的感染比率(每100名患者-年为9.57例)。

DANCER IIb期试验评估利妥昔单抗和甲氨蝶呤在缓解病情的抗风湿药(DMARD)耐受性RA患者中的功效，其中利妥昔单抗在第1天和第15天以500mg或1000mg的剂量给予。两种利妥昔单抗剂量的ACR响应在6个月时在统计学上优于安慰剂。没有看到两种利妥昔单抗剂量之间的差异，而且口服皮质类固醇的功效分析揭示了对ACR响应没有显著影响。

REFLEX 3期试验评估利妥昔单抗和甲氨蝶呤在抗TNF-α疗法响应不足的RA患者中的功效，其中利妥昔单抗以1000mg的剂量给予。在试验条件下用利妥昔单抗处理的患者展现出活动性疾病的体征和症状的改善，在六个月里有显著的受益。

所报导的利妥昔单抗在少数神经学病症患者中的安全谱，包括自身免疫性神经病、视性眼阵挛-肌阵挛综合征、和RRMS，与在肿瘤学或RA中所报导的类似。在正在RRMS患者中进行的利妥昔单抗联合干扰素-β或醋酸格拉默(glatiramer acetate)的研究者发起的试验(IST)中，十名接受治疗的患者中有一人在首次利妥昔单抗输注后发生中度发烧和打寒战，之后入院彻夜观察，而其余九名患者完成了四次输注的方案，没有报告任何不良事件。

对具有顽固性ANCA相关血管炎(AAV)的患者给予利妥昔单抗以及免疫抑制性药物诸如静脉内环磷酰胺、霉酚酸酯、硫唑嘌呤、或来氟米特，有明显的功效。与静脉内环磷酰胺一起，对具有顽固性系统性血管炎的患者以4剂每剂375mg/m²给予利妥昔单抗。9名具有AAV的患者用2剂或4剂每周一次的500mg利妥昔单抗成功治疗。在11名具有顽固性AAV的患者中，利妥昔单抗治疗或复治(4剂，每周一次，375mg/m²/剂)通过B细胞消减诱导了消退。

其它抗CD20抗体包括例如⁹⁰Y标记的2B8鼠源抗体，称作“Y2B8”(

)(Biogen-Idec，Inc.)(例如US 5,736,137，Anderson et al.；ATCC保藏物HB11388)；鼠源IgG2a“B1”或“Tositumomab”，任选用131I标记以产生“131I-B 1”或“碘I131 tositumomab”抗体(BEXXAR^TM)(Corixa；CoulterPharmaceutical，Inc.)(例如US 5,595,721，Kaminski et al.)；鼠源单克隆抗体“1F5”(例如Press et al.Blood，69(2)：584-591(1987))及其变体，包括“框架修补”或人源化1F5(例如WO 2003/002607，Leung；ATCC保藏物HB-96450)；鼠源和嵌合2H7抗体(例如US 5,677,180，Robinson et al.)；人源化2H7抗体，诸如rhuMAb2H7和其它型式(Genentech，Inc.)(例如WO 2004/056312，Adams et al.，及下文记录的其它参考文献)；靶向CD20的人抗体，称作2F2、HUMAX-CD20^TM、或ofatumumab(GlaxoSmithKline；GenMab A/S)(例如Glennie和van de Winkel，Drug Discovery Today，8：503-510(2003)；Cragg et al.，Blood，101：1045-1052(2003)；及US 2004/0167319，Teeling et al.)；针对CD20的人单克隆抗体(GenMab A/S/Medarex，Inc.)(例如WO 2004/035607和WO2005/103081，Teeling et al.)；有复杂的N-糖苷连接的糖链连接至Fc区的针对CD20的抗体(Kyowa Hakko)(例如US 2004/0093621，Shitara et al.)；结合CD20细胞外表位的嵌合化或人源化单克隆抗体(Biomedics Inc.)(例如WO2006/106959，Numazaki et al.)；结合CD20的单克隆抗体和片段(例如WO2005/000901，Tedder et al.)，诸如HB20-3、HB20-4、HB20-25、和MB20-11；结合CD20的小的、模块式的免疫药物(SMIP)(Wyeth，Trubion Pharmaceuticals，Inc.)，包括TRU-015(例如US 2005/0186216；US 2005/0202534；US2005/0202028；US 2005/136049；及US 2005/0202023，Ledbetter et al.，及US2007/0059306，Grosmaire et al.)；CD20结合抗体，包括AME系列的抗体(EliLilly和Co.，Applied Molecular Evolution，Inc.)，诸如AME 33(例如US2005/0025764，Watkins et al.)和AME 133和AME 133v抗体(例如US2005/0136044，Watkins和Pancook)(还可参见例如WO 2004/103404和US2006/0251652，Watkins et al.)及具有Fc突变的抗CD20抗体(例如WO2005/070963，Allan et al.)；CD20结合分子，诸如那些列于WO 2005/016969和US 2005/0069545，Carr et al.)的；WO 2005/014618(Chang et al.)所列双特异性抗体；人源化LL2及相似抗体(Immunomedics，Inc.)(例如US 7,151,164和US2005/0106108，Hansen)；A20抗体(Immunomedics，Inc.)，诸如嵌合A20(cA20)或人源化A20抗体(hA20，IMMUN-106TM，veltuzumab)(例如US2003/0219433，Hansen et al.)；针对CD20的完全人的抗体(Amgen/AstraZeneca)(例如WO 2006/130458，Gazit et al.)；针对CD20的抗体(Avestha GengraineTechnologies Pvt Ltd.)(例如WO 2006/126069，Morawala)；针对CD20的嵌合或人源化B-Ly1抗体(Roche/GlycArt Biotechnology AG)，诸如GA 101(例如WO2005/044859；US 2005/0123546；US 2004/0072290；及US 2003/0175884，Umana et al.)；及单克隆抗体L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2，可从国际白细胞分类研究组(International Leukocyte Typing Workshop)获得(例如Valentine et al.，Leukocyte Typing III，McMichael编，p.440，Oxford UniversityPress，1987)。此列表提供代表性抗CD20抗体，但不是穷举的。

尽管利妥昔单抗有效治疗B细胞淋巴瘤，但是已有报告，约50％的复发性/顽固性CD20+滤泡性淋巴瘤患者不响应利妥昔单抗的初始治疗(先天耐药性)(McLaughlin et al.，J Clin Oncol.，16：2825-2833(1998))；而且接近60％的在先利妥昔单抗响应患者会不再受益于利妥昔单抗治疗(获得耐药性)(Daviset al.，J Clin Oncol.，18：3135-3143(2000))。不清楚这些形式的利妥昔单抗耐药性是由于恶性B细胞的适应特性还是由于宿主的免疫效应器机制受损。

Bello和Sotomayor，Hematology，1：233-242(2007)讨论并回顾关于肿瘤和宿主相关机制的文献来解释利妥昔单抗耐药性。在建议治疗策略以克服抗CD20疗法的这些障碍时，他们提出更新一代的单克隆抗体，包括AME 133v、GA101、ofatumumab、和veltuzumab，它们的开发得到了抗CD20单克隆抗体疗法的广泛使用的激励。

描述对利妥昔单抗不应的淋巴瘤(例如B细胞淋巴瘤和无痛性NHL)的其它文献包括US 2005/0025764(Watkins et al.)；US 2005/0202023(Ledbetteret al.)；US 2006/0246004(Lowman)；US 6,455,043；US2003/0026804；US2003/0206903(后三项Grillo-Lopez)；US 2004/0192900(Kunz et al.)；WO2006/094192(Goldenberg et al.)；US 2007/0059306和WO 2007/14278(Grosmaire et al.)；及WO 2007/14238(Bruge)。Fleischmann R.et al.“Safety和Efficacy in Rheumatoid Arthritis(RA)Patients(Pts)Treated With Rituximabwho develop Human Anti-Chimeric Antibodies(HACA)”(ACR Late BreakerAbstract 2007)报告了少数形成高滴度抗利妥昔单抗抗体(HACA)的RA患者，所述HACA似乎干扰B细胞消减。

存在对在那些对利妥昔单抗处理有抗性、不应、或以其它方式不响应的患者中治疗RA和关节损伤的有效手段的需要。

发明概述

因而，本发明提供用于治疗对利妥昔单抗不响应的RA和关节损伤患者的手段。本发明如要求保护的那样。

一方面，本发明提供了治疗对利妥昔单抗不响应的类风湿性关节炎(RA)患者的方法，包括以有效治疗RA的量对患者施用抗CD20抗体，其中该抗CD20抗体是(1)包含SEQ ID NO：2中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：4中或SEQ ID NO：5中重链可变区氨基酸序列的ofatumumab；(2)包含SEQ IDNO：7中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：8中或SEQ ID NO：9中重链可变区氨基酸序列的veltuzumab；(3)包含SEQ ID NO：11的免疫药物；(4)包含SEQID NO：13中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：15中重链可变区氨基酸序列、或包含SEQ ID NO：17中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：18中重链可变区氨基酸序列、或包含SEQ ID NO：19的CD20结合抗体；或(5)其Fc区中有等分无岩藻糖基化碳水化合物且包含SEQ ID NO：21中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：23中重链可变区氨基酸序列的人源化II型抗CD20IgG1抗体。

另一方面，本发明提供了治疗对利妥昔单抗不响应的类风湿性关节炎(RA)患者的方法，包括以有效治疗RA的量对患者施用抗CD20抗体，其中该抗CD20抗体是(1)具有SEQ ID NO：2和4的轻链和重链可变区、或SEQ IDNO：2和5的轻链和重链可变区的ofatumumab；(2)具有SEQ ID NO：7和8的轻链和重链可变区、或SEQ ID NO：7和9的轻链和重链可变区的veltuzumab；(3)具有SEQ ID NO：11的免疫药物；(4)具有SEQ ID NO：13和15的轻链和重链可变区、或具有SEQ ID NO：17和18的轻链和重链可变区、或具有SEQ ID NO：19的CD20结合抗体；或(5)其Fc区中有等分无岩藻糖基化碳水化合物且具有SEQ ID NO：21和23的轻链和重链可变区的人源化II型抗CD20 IgG1抗体

又一方面，本发明涉及抗CD20抗体在制备用于治疗对利妥昔单抗不响应的类风湿性关节炎患者的药物组合物中的用途，该抗CD20抗体是(1)包含SEQ ID NO：2中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：4中或SEQ ID NO：5中重链可变区氨基酸序列的ofatumumab；(2)包含SEQ ID NO：7中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：8中或SEQ ID NO：9中重链可变区氨基酸序列的veltuzumab；(3)包含SEQ ID NO：11的免疫药物；(4)包含SEQ ID NO：13中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：15中重链可变区氨基酸序列、或包含SEQID NO：17中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：18中重链可变区氨基酸序列、或包含SEQ ID NO：19的CD20结合抗体；或(5)其Fc区中有等分无岩藻糖基化碳水化合物且包含SEQ ID NO：21中轻链可变区氨基酸序列和SEQ IDNO：23中重链可变区氨基酸序列的人源化II型抗CD20IgG1抗体。

在一个实施方案中，所述抗CD20抗体是ofatumumab。最优选的是，所述ofatumumab包含SEQ ID NO：4中重链可变区氨基酸序列。或者，它包含SEQID NO：5中重链可变区氨基酸序列。

在另一个实施方案中，所述抗CD20抗体是veltuzumab。在一个具体的方面，所述veltuzumab包含SEQ ID NO：8中重链可变区氨基酸序列。在另一个具体的方面，所述veltuzumab包含SEQ ID NO：9中重链可变区氨基酸序列。

在又一个实施方案中，所述抗CD20抗体是免疫药物(即TRU-015)。

在还有一个实施方案中，所述抗CD20抗体是包含SEQ ID NO：13和15或包含SEQ ID NO：17和18或包含SEQ ID NO：19的CD20结合抗体。一方面，所述CD20结合抗体包含SEQ ID NO：13中轻链可变区氨基酸序列和SEQ IDNO：15中重链可变区氨基酸序列。另一方面，所述CD20结合抗体包含SEQID NO：17中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：18中重链可变区氨基酸序列。又一方面，所述CD20结合抗体包含SEQ ID NO：19。

在第五个总的实施方案中，所述抗CD20抗体是人源化II型抗CD20IgG1抗体。

在一个优选的方面，所述抗CD20抗体未偶联细胞毒剂。

在其它优选的方面，所述抗CD20抗体静脉内或皮下施用。在一个具体的方面，它皮下施用。

在另一个优选的实施方案中，有效量的抗CD20抗体导致通过评估触痛的或肿胀的关节数目、进行患者的整体临床评估、评估红细胞沉降率、评估C-反应性蛋白质水平的量、或使用疾病活动综合测量确定的临床改善。

抗CD20抗体以基于体重的剂量或固定的剂量施用，这取决于例如临床参数。优选固定的剂量。在固定剂量给药的一个优选方面，抗CD20抗体以介于约50和4000mg之间、更优选介于约75和3000mg之间、更优选介于约100和2000mg之间、更优选介于约100和1000mg之间、仍更优选介于约150和1000mg之间、仍更优选介于约200和1000mg之间的剂量施用，而且最优选的是，剂量是约200、300、400、500、600、700、800、900、1000mg、或2000mg。

在另一个优选的实施方案中，抗体以约1个月的一段时间内1-4剂的频率施用。在另一个优选的方面，抗体以2-3剂施用。在还有一些方面，抗体在约2-3周的一段时间内施用。

另一方面，所述方法进一步包括与所述抗体一起施用有效量的一种或多种第二药物，其中所述抗体是第一药物。所述第二药物是一种药物或一种以上的药物。所述第二药物优选是免疫抑制剂、DMARD、与第一药物不同的针对CD20的抗体、疼痛控制剂、整联蛋白拮抗剂、非类固醇抗炎药(NSAID)、细胞因子拮抗剂、二膦酸盐、或其组合。

一方面，所述第二药物是DMARD，优选选自下组：金诺芬、氯喹、D-青霉胺、可注射金、口服金、羟氯喹、柳氮磺吡啶、硫代苹果金酸钠和甲氨蝶呤(MTX)。

另一方面，所述第二药物是NSAID，优选选自下组：芬布芬、萘普生、双氯芬酸、依托度酸、吲哚美辛、阿司匹林、和布洛芬。

又一方面，所述第二药物是选自下组的免疫抑制剂：依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗、来氟米特、阿那白滞素、硫唑嘌呤、和环磷酰胺。

还有一方面，所述第二药物选自下组：抗α4、依那西普、英夫利昔单抗、依那西普、阿达木单抗、kinaret、efalizumab、骨保护素(OPG)、NFκB配体的抗受体活化物(抗RANKL)、NFκB-Fc的抗受体活化物(RANK-Fc)、帕米膦酸盐、阿伦膦酸盐、actonel、唑来膦酸盐、利妥昔单抗、2H7抗体、氯膦酸盐、MTX、azulfidine、羟氯喹、多西环素、来氟米特、柳氮磺吡啶(SSZ)、泼尼松龙、白介素-1受体拮抗剂、泼尼松、和甲泼尼龙。

在还有一方面，所述第二药物选自下组：英夫利昔单抗、MTX、英夫利昔单抗与MTX的组合、依那西普、皮质类固醇、环孢菌素A、硫唑嘌呤、金诺芬、羟氯喹(HCQ)、泼尼松龙与MTX和SSZ组合、MTX与SSZ和HCQ的组合、环磷酰胺与硫唑嘌呤和HCQ的组合、和阿达木单抗与MTX的组合。更优选的是，所述皮质类固醇是泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、氢化可的松、或地塞米松。

最优选的第二药物是MTX。MTX优选经口或胃肠外施用。

在本文中方法的另一个优选方面，患者展现出对一种或多种抗肿瘤坏死因子-α抑制剂响应不足。在此类方法中，所述抗CD20抗体优选作为单剂或双剂施用，更优选每剂介于约200mg和1000mg之间。仍更优选的是，剂量是在治疗开始时在第1天和第15天约200mg×2、约300mg×2、约500mg×2、约700mg×2、或约1000mg×2，优选静脉内或皮下。

在另一个优选的实施方案中，所述RA是早期RA或初期RA。

在另一个方面，所述方法进一步包括通过给患者施用有效量的抗CD20抗体来复治患者。优选的是，所述复治在第一次施用所述抗体后至少约24周开始。在另一个实施方案中，开始另一次复治，优选在第二次施用所述抗CD20抗体后至少约24周。

优选的是，关节损伤在复治后减轻和/或在复治前在患者中观察到临床改善。优选的是，所述临床改善是通过评估触痛的或肿胀的关节数目、进行患者的整体临床评估、评估红细胞沉降率、评估C-反应性蛋白质水平的量、或使用疾病活动综合测量确定的。

另一方面，本发明提供了用于治疗对利妥昔单抗不响应的受试者中的关节损伤的方法，包括对受试者施用抗CD20抗体，该抗CD20抗体是(1)包含SEQ ID NO：2中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：4中或SEQ ID NO：5中重链可变区氨基酸序列的ofatumumab；(2)包含SEQ ID NO：7中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：8中或SEQ ID NO：9中重链可变区氨基酸序列的veltuzumab；(3)包含SEQ ID NO：11的免疫药物；(4)包含SEQ ID NO：13中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：15中重链可变区氨基酸序列、或包含SEQID NO：17中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：18中重链可变区氨基酸序列、或包含SEQ ID NO：19的CD20结合抗体；或(5)其Fc区中有等分无岩藻糖基化碳水化合物且包含SEQ ID NO：21中轻链可变区氨基酸序列和SEQ IDNO：23中重链可变区氨基酸序列的人源化II型抗CD20 IgG1抗体，其中该抗CD20抗体的施用量有效实现关节损伤减轻。

另一方面，本发明涉及抗CD20抗体在制备用于治疗对利妥昔单抗不响应的受试者中的关节损伤的药物组合物中的用途，该抗CD20抗体是(1)包含SEQ ID NO：2中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：4中或SEQ ID NO：5中重链可变区氨基酸序列的ofatumumab；(2)包含SEQ ID NO：7中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：8中或SEQ ID NO：9中重链可变区氨基酸序列的veltuzumab；(3)包含SEQ ID NO：11的免疫药物；(4)包含SEQ ID NO：13中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：15中重链可变区氨基酸序列、或包含SEQID NO：17中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：18中重链可变区氨基酸序列、或包含SEQ ID NO：19的CD20结合抗体；或(5)其Fc区中有等分无岩藻糖基化碳水化合物且包含SEQ ID NO：21中轻链可变区氨基酸序列和SEQ IDNO：23中重链可变区氨基酸序列的人源化II型抗CD20 IgG1抗体。

在此方法中，优选的是，使用放射照相测试来确定关节损伤减轻的程度。此测试优选在施用抗CD20抗体后至少约1个月时，更优选在施用所述抗体后至少约2个月时进行。

在一些具体的方面，所述抗CD20抗体是ofatumumab、或veltuzumab、或免疫药物、或包含SEQ ID NO：13和15或包含SEQ ID NO：17和18或包含SEQID NO：19的CD20结合抗体、或人源化II型抗CD20 IgG1抗体。

更优选的是，所述ofatumumab包含SEQ ID NO：4中重链可变区氨基酸序列。或者，它包含SEQ ID NO：5中重链可变区氨基酸序列。在一个具体的方面，所述veltuzumab包含SEQ ID NO：8中重链可变区氨基酸序列。在另一个具体的方面，所述veltuzumab包含SEQ ID NO：9中重链可变区氨基酸序列。一方面，所述CD20结合抗体包含SEQ ID NO：13中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：15中重链可变区氨基酸序列。另一方面，所述CD20结合抗体包含SEQ ID NO：17中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：18中重链可变区氨基酸序列。又一方面，所述CD20结合抗体包含SEQ ID NO：19。

优选的是，所述关节损伤治疗方法进一步包括与所述抗CD20抗体一起施用有效量的一种或多种第二药物，其中所述抗CD20抗体是第一药物。所述第二药物可以是一种以上的药物。所述第二药物优选是免疫抑制剂、DMARD、与第一药物不同的针对CD20的抗体、整联蛋白拮抗剂、NSAID、细胞因子拮抗剂、二膦酸盐、或其组合。

在还有一个实施方案中，本发明提供了为抗CD20抗体或其药学可接受组合物做广告的方法，包括给目标受众宣传抗CD20抗体或其药物组合物用于治疗对利妥昔单抗不响应的类风湿性关节炎患者的用途，该抗CD20抗体是(1)包含SEQ ID NO：2中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：4中或SEQ IDNO：5中重链可变区氨基酸序列的ofatumumab；(2)包含SEQ ID NO：7中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：8中或SEQ ID NO：9中重链可变区氨基酸序列的veltuzumab；(3)包含SEQ ID NO：11的免疫药物；(4)包含SEQ ID NO：13中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：15中重链可变区氨基酸序列、或包含SEQID NO：17中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：18中重链可变区氨基酸序列、或包含SEQ ID NO：19的CD20结合抗体；或(5)其Fc区中有等分无岩藻糖基化碳水化合物且包含SEQ ID NO：21中轻链可变区氨基酸序列和SEQ IDNO：23中重链可变区氨基酸序列的人源化II型抗CD20 IgG1抗体。

本文中的发明还涵盖监测对利妥昔单抗不响应的具有RA或关节烧伤的受试者中的骨或软组织关节损伤治疗的方法，包括给受试者施用有效量的本文中抗CD20抗体之一，并且距该次施用至少大约三个月、优选大约24周之后通过成像技术诸如MRI或放射照相术测量骨或软组织关节损伤相对于所述给药之前的基线是否减轻，其中治疗后受试者中对比于基线的减轻指示该抗CD20抗体正在对关节损伤产生效果。优选的是，在施用抗CD20抗体之后再次测量对比于基线的减轻程度。

又一方面，本发明提供了确定是否要继续给对利妥昔单抗不响应的具有骨或软组织关节损伤的受试者施用本文中的抗CD20抗体的方法，包括使用成像技术诸如放射照相术和/或MRI测量第一次施用抗CD20抗体之后受试者中关节损伤的减轻，使用成像技术诸如放射照相术和/或MRI测量第二次施用抗CD20抗体之后受试者中关节损伤的减轻，比较第一次和第二次时受试者中的成像发现，如果第二次的得分比第一次少，那么继续施用抗CD20抗体。

发明详述

I.定义

“B细胞”指在骨髓中成熟的淋巴细胞，包括幼稚B细胞、记忆B细胞、或效应B细胞(浆细胞)。本文中的B细胞指正常的或非恶性的B细胞。

“B细胞恶性肿瘤”指涉及B细胞的恶性肿瘤。例子包括何杰金氏(Hodgkin)病，包括淋巴细胞为主型的何杰金氏病(LPHD)；NHL；滤泡中心细胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；毛细胞白血病；类浆细胞淋巴细胞性淋巴瘤；套细胞淋巴瘤；AIDS或HIV相关淋巴瘤；多发性骨髓瘤；中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；移植后淋巴增生性病症(PTLD)；瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症(淋巴浆细胞性淋巴瘤)；粘膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤；和边缘区淋巴瘤/白血病。

“CD20”抗原或“CD20”是在超过90％来自外周血或淋巴器官的B细胞表面上找到的约35kDa非糖基化磷蛋白。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞二者上，但在干细胞上不表达。CD20在文献中的其它名称包括“B淋巴细胞限制抗原”和“Bp35”。CD20抗原记载于例如Clark et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.(USA)82：1766(1985)。优选的CD20抗原是人CD20。

术语“抗体”在本文中以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。

“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在有些实施方案中，将抗体纯化至(1)根据例如Lowry法的测定，抗体重量超过95％，而在有些实施方案中，重量超过99％，(2)足以通过使用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。

“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有可变域(V_H)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有可变域(V_L)，而另一端是恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。

如本文中所使用的，术语“抗CD20抗体”指(1)ofatumumab(HUMAX-CD20^TM)，一种与利妥昔单抗结合不同CD20表位的IgG1κ人单抗；(2)veltuzumab(IMMUN-106^TM或hA20)，一种具有鼠起源的互补决定区(CDR)和与epratuzumab(一种人源化抗CD22 IgG1抗体)同样的90％人框架区的人源化工程抗体；(3)一种具有SEQ ID NO：11(也称作TRU-015)的小的、模块式的免疫药物(SMIP)(本文中称作免疫药物)；(4)一种CD20结合分子，其是包含SEQ ID NO：13和15(Lilly AME 33)或包含SEQ ID NO：17和18(LillyAME 133)或包含SEQ ID NO：19(Lilly AME 133v，也称作LY2469298，其以升高的亲和力结合FcγRIIIa(CD16))的抗体；和(5)一种人源化II型抗CD20抗体，其属于同种型IgG1，具有糖基工程化的Fc部分(Fc区中的等分无岩藻糖基化碳水化合物)和经修饰的肘铰链，称作GA101。所有这些抗体在下文(包括其全长或可变区序列)及给出定义的文献进一步描述。

抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变域可以称为“VH”。轻链的可变域可以称为“VL”。这些结构域一般是抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。

术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区(HVR)的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如ADCC中抗体的参与。

根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，一般性描述于例如Abbas et al.，Cellular和Mol.Immunology，4th ed.(W.B.Saunders，Co.，2000)。抗体可以是抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价关联而形成的更大融合分子的一部分。

术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体而非如下文所定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗体。

“裸抗体(裸露的抗体)”为本发明目的指未偶联细胞毒性模块或放射性标记物的抗体。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)₂片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。

“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连接，使得轻链和重链在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，每个可变域的三个HVR相互作用而在V_H-V_L二聚体表面上限定了抗原结合位点。六个HVR一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。

Fab片段包含重链和轻链可变域，而且还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)₂抗体片段最初是作为在Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在V_H与V_L结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见Pluckthün，于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，1994，第269-315页。

术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在同一条多肽链(V_H-V_L)中包含相连的重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三抗体(Triabody)和四抗体(tetrabody)也记载于Hudson et al.，Nat.Med.9：129-134(2003)。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的突变，例如天然存在的突变。如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是分立的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。

修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler和Milstein，Nature，256：495-497(1975)；Hongo et al.，Hybridoma，14(3)：253-260(1995)，Harlow etal.，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988)；Hammerling et al.，于：Monoclonal Antibodies和T-Cell Hybridomas，563-681(Elsevier，N.Y.，1981))、重组DNA法(参见例如US 4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Sidhu et al.，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee et al.，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；Lee et al.，J.Immunol.Methods284(1-2)：119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann et al.，Year in Immuno.7：33(1993)；US 5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Markset al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-813(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnol.14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.14：826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。

单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(例如US 4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851-6855(1984))。嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如用感兴趣抗原免疫猕猴而生成的抗体。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的HVR残基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的HVR残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的FR残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。为了进一步改进抗体的性能可进行这些修饰。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见例如Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还可参见例如Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy，Asthma&Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle和Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)；及US 6,982,321和7,087,409。

“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581(1991))。还可用于制备人单克隆抗体的是以下文献中记载的方法：Cole et al.，Monoclonal Antibodies和Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner et al.，J.Immunol.147(1)：86-95(1991)。还可参见van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.，5：368-374(2001)。可通过给已经修饰以应答抗原性刺激而生成人抗体但其内源基因组已经失能的转基因动物例如经过免疫的异种小鼠(xenomice)施用抗原来制备人抗体(参见例如US 6,075,181和6,150,584，关于XENOMOUSE^TM技术)。还可参见例如Li et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)，关于经人B-细胞杂交瘤技术生成的人抗体。

术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al.Immunity 13：37-45(2000)及Johnson和Wu于：Methods in Molecular Biology 248：1-25(Lo，ed.，Human Press，Totowa，NJ，2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al.，Nature363：446-448(1993)；及Sheriff et al.，Nature Struct.Biol.3：733-736(1996)。

本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。作为Kabat互补决定区(CDR)的HVR是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat et al.，见上文)。Chothia改为指结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。

HVR可包括如下“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些延伸的HVR定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等，见上文编号的。

“框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的HVR残基外的那些残基。

表述“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变体指Kabat et al.，见上文中的抗体编辑用于重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。

“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个HVR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在一个实施方案，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。例如，Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了HVR和/或框架残基的随机诱变：例如Barbas et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al.，Gene 169：147-155(1995)；Yelton et al.，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al.，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。

“生长抑制性”抗体指那些阻止或降低表达抗体所结合之抗原的细胞增殖的抗体。例如，抗体可以在体外和/或在体内阻止或降低B细胞增殖。

“诱导凋亡”的抗体指那些根据标准凋亡测定法的测定，诱导(例如B细胞的)程序性细胞死亡的抗体，所述测定法诸如膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网膨胀、细胞破裂、和/或膜囊(称作凋亡小体)形成。

抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。

术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C-端区域，包括天然序列Fc区和变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447，依照EU编号系统)可以消除，例如在生产或纯化抗体的过程中，或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程改造。因而，完整抗体组合物可以包括所有K447残基都被消除的抗体群、无一K447残基被消除的抗体群、或者混合了有K447残基的抗体和没有K447残基的抗体的抗体群。

除非本文另有说明，免疫球蛋白重链的残基编号方式是如Kabat et al.，见上文中的EU索引的编号方式。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号方式。

“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合结构域(例如抗体可变域)联合，而且可以使用多种测定法来评估，例如本文定义中所公开的。

“天然序列Fc区”包含与在自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区；及其天然存在变体。

“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰(优选一处或多处氨基酸替代)而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。优选的是，变异Fc区与天然序列Fc区相比或与亲本多肽的Fc区相比具有至少一处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代。变异Fc区在本文中优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约80％的同源性，最优选与它们具有至少约90％的同源性，更优选与它们具有至少约95％的同源性。

“含Fc区的抗体”指包含Fc区的抗体。Fc区的C-末端赖氨酸(依照EU编号系统的残基447)可以消除，例如在纯化抗体的过程中或者通过重组改造编码抗体的核酸。因此，依照本发明包含具有Fc区的抗体的组合物可包含具有K447的抗体、消除了所有K447的抗体、或具有与没有K447残基的抗体的混合物。

“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。在有些实施方案中，FcR是天然人FcR。在有些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括属于FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括那些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见例如

Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见例如Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel et al.，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-341(1995)。

术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))并调节免疫球蛋白的体内稳态。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie 1997，Hinton 2004)。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie和Ward.，Immunology Today 18(12)：592-598(1997)；Ghetie etal.，Nature Biotechnology，15(7)：637-640(1997)；Hinton et al.，J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216(2004)；及WO 2004/92219(Hinton et al.))。

可测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染人细胞系中，或者在施用了具有变异Fc区的多肽的灵长类动物中。WO 00/42072(Presta)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。还可参见例如Shields et al.，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。

“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。在某些实施方案中，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如NK细胞、嗜中性细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞即NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如US5,500,362，5,821,337或6,737,056中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括PBMC和NK细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所披露的。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合抗体(适宜亚类的)起始的，该抗体已结合至其关联抗原。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所记载的。具有更改的Fc区氨基酸序列(具有变异Fc区的多肽)及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于例如US 6,194,551和WO 1999/51642。还可参见例如Idusogie et al.，J.Immunol.164：4178-4184(2000)。

“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快速地结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的、示例性和例示性的、用于测量结合亲和力的实施方案。

在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述使用Fab型式的目的抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的：通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chen，et al.，J Mol Biol 293：865-881(1999))。为了确定测定条件，用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(DYNEX Technologies，Inc.)过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附平板中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与连续稀释的目的Fab混合(例如与Presta et al.，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将目的Fab保温过夜；不过，保温可持续更长时间(例如约65个小时)以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板以进行室温保温(例如1小时)。然后除去溶液，并用含0.1％Tween-20^TM表面活性剂的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20^TM；Packard)，然后在TOPCOUNT^TM伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。

依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用-2000或

-3000仪器(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl每分钟的流速注入至获得约十个RU的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％TWEEN 20^TM表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(

Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen et al.，J Mol Biol 293：865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M^-1s^-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(astop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCO^TM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。

依照本发明的“结合速率”(on-rate，rate of association，association rate)或“k_on”也可如上所述使用

-2000或

-3000系统(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)来测定。

短语“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文时表示两个数值(例如，一个涉及本发明的抗体而另一个涉及参照/比较抗体)之间足够高的相似程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。作为参照/比较值的函数，所述两个数值之间的差异例如小于约50％，小于约40％，小于约30％，小于约20％，和/或小于约10％。

短语“实质性降低”或“实质性不同”在用于本文时表示两个数值(通常一个与某分子有关而另一个与参照/比较分子有关)之间足够高的差异程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有统计学显著性。作为参照/比较分子该数值的函数，所述两个数值之间的差异例如大于约10％，大于约20％，大于约30％，大于约40％，和/或大于约50％。

术语“利妥昔单抗”或

在本文中指针对CD20抗原的遗传工程嵌合鼠/人单克隆抗体，在US 5,736,137中称为“C2B8”，包括其保持结合CD20能力的片段。

纯粹为了本发明的目的，除非另有说明，“2H7”或“2H7抗体”指具有下文所提供的和/或US 2006/0034835和WO 2004/056312(both Lowman et al.)；US2006/0188495(Barron et al.)；和US 2006/0246004(Adams et al.)中所记载的序列的人源化抗CD20抗体。简言之，以一系列定点诱变步骤进行鼠抗人CD20抗体，2H7(本文中也称作m2H7，m代表鼠)的人源化。鼠2H7抗体可变区序列和具有小鼠V和人C的嵌合2H7已经记载于例如US 5,846,818和6,204,023。通过比较鼠2H7可变域的氨基酸序列(披露于US 5,846,818)与已知抗体的序列(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)，鉴定了2H7的CDR残基。基于序列高变性(Kabat et al.，supra)定义了轻链和重链的CDR。用合成的寡核苷酸，使用定点诱变(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：488-492(1985))将鼠2H7的所有六个CDR引入质粒pVX4上所包含的、与共有序列V_κI、V_HIII(V_L卡帕亚组I，V_H亚组III)对应的完整人Fab框架(参见WO 2004/056312中的图2)。通过定点诱变在噬菌粒pVX4中对V区(CDR和/或FR)进行进一步的修饰。构建用于表达全长IgG的质粒。通过将嵌合2H7Fab以及人源化Fab 2-6型的V_L和V_H结构域亚克隆入先前为哺乳动物细胞表达而描述的pRK载体中(Gorman et al.，DNA Prot.Eng.Tech.，2：3-10(1990))。

以下2H7抗体包括在本文中的定义内：

(1)一种人源化抗体，其包含VL序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAP

SNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGT

KVEIKR(SEQ ID NO：24)；

和VH序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV

GAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA

RVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：25)。

(2)一种人源化抗体，其包含VL序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPS

NLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTK

VEIKR(SEQ ID NO：26)；

和VH序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV

GAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR

VVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：27)。

(3)一种人源化抗体，其包含VL序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPS

NLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTK

VEIKR(SEQ ID NO：26)；

和VH序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV

GAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR

VVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：28)。

(4)一种人源化抗体，其包含具有序列SEQ ID NO：29的全长轻(L)链和具有序列SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、或SEQ ID NO：38之一的全长重(H)链，其中所述序列显示于下文。

(5)一种人源化抗体，其包含具有序列SEQ ID NO：32的全长轻(L)链和具有序列SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、或SEQ IDNO：37之一的全长重(H)链，其中所述序列显示于下文。

SEQ ID NO：29：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAP

SNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGT

KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN

ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS

SPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO：30：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV

GAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA

RVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA

LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS

LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL

FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP

REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK

GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN

YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK

SLSLSPG

SEQ ID NO：31：

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RVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA

LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS

LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL

FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP

REEQYNATYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAK

GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN

YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK

SLSLSPG

SEQ ID NO：32：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPS

NLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTK

VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS

PVTKSFNRGEC

SEQ ID NO：33：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV

GAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR

VVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL

GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL

GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF

PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR

EEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKG

QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY

KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS

LSLSPG

SEQ ID NO：34：

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GAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR

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GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL

GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF

PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR

EEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEATISKAKGQ

PREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK

TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL

SLSPG

SEQ ID NO：35：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV

GAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR

VVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL

GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL

GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF

PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR

EEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKG

QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY

KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS

LSLSPG

SEQ ID NO：36：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV

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VVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL

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GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF

PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR

EEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKG

QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY

KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHWHYTQKS

LSLSPG

SEQ ID NO：37：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV

GAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR

VVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAAL

GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL

GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF

PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR

EEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKG

QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY

KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS

LSLSPG

SEQ ID NO：38：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV

GAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA

RVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA

LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS

LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL

FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP

REEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAK

GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN

YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK

SLSLSPG

鼠抗人CD20抗体m2H7包含可变区序列：

VL序列：

QIVLSQSPAI LSASPGEKVT MTCRASSSVS YMHWYQQKPG

SSPKPWIYAP SNLASGVPARFSGSGSGTSY SLTISRVEAE

DAATYYCQQWSFNPPTFGAG TKLELK(SEQ ID NO：39)

VH序列：

QAYLQQSGAELVRPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWI

GAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAR

VVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVS(SEQ ID NO：40)

在包含Fc区的抗CD20抗体中，Fc区的C端赖氨酸(依照EU编号系统的残基447)可被消除，例如在抗体纯化过程中或通过编码抗体多肽的核酸的重组工程改造。例如，hA20可包含包括K447残基的或消除了所有K447残基的Fc区，或者是Fc区有K447残基的抗体与Fc区无K447残基的抗体的混合物。

在某些实施方案中，本文中有用的抗CD20抗体进一步包含IgG Fc中的氨基酸改变且展现升高的对人FcRn的结合亲和力，比具有野生型IgG Fc的抗体升高至少约60倍、优选至少约70倍、更优选至少约80倍、甚至更优选至少约100倍、仍更优选至少约125倍、和最优选至少约150倍至约170倍。

IgG中的N-糖基化位点位于CH2结构域中的Asn297。为了在本文中的疗法中使用，本发明包括本文中具有Fc区的任何符合条件的抗CD20抗体的组合物，其中该组合物中约80-100％(和优选约90-99％)的抗体包含缺乏附着至糖蛋白Fc区的岩藻糖或具有降低的岩藻糖含量的成熟核心碳水化合物结构。

为了治疗目的，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人，家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛等。优选的是，哺乳动物指人。

表述“有效量”指药物有效治疗RA或关节损伤的量。这会包括根据例如放射照相术或其它检查的测定有效实现与施用该量之前的基线相比RA或关节损伤减轻的量。有效量的第二药物不仅可以有助于与本文中的抗CD20抗体一起治疗RA或关节损伤，而且还可以有助于治疗不良效应，包括副作用或症状或伴随RA或关节损伤的其它疾患，包括伴随的或潜在的疾病或病症。

如本文中所使用的，“类风湿性关节炎”或“RA”指一种已承认的疾病状态，其可以依照关于RA分类的2000修正的美国类风湿协会标准或任何相似标准来诊断。该术语不仅包括活跃的和早期的RA，而且包括初期的RA，如下文中所定义的。RA的生理学指标包括对称性关节肿胀，这在RA中是特征性的尽管不是不变的。手的近端指间(PIP)关节以及掌指(MCP)、腕、肘、膝、踝和跖趾(MTP)关节的纺锤形肿胀常常患病，而且肿胀是容易检测的。被动运动时的疼痛是关节炎症的最灵敏测试，而且炎症和结构变形常常限制患病关节的活动范围。典型的可见变化包括MCP关节处指的尺骨偏斜、MCP和PIP关节的伸展过度或屈曲过度、肘的屈曲挛缩、及腕骨和趾的半脱位。在对利妥昔单抗有抗性之外，RA受试者可能对DMARD有抗性，即DMARD在治疗症状方面无效或不是完全有效，或者，可以由于毒性或疗效不足已经发生对于先前的或当前的使用TNF-α抑制剂诸如依那西普、英夫利昔单抗和/或阿达木单抗的治疗响应不足的受试者(例如，依那西普3个月、25毫克、每周两次或者英夫利昔单抗以3mg/kg输液至少4次)。

患有“活跃的类风湿性关节炎”的患者指患有活跃的且非潜伏的RA症状的患者。患有“早期的活跃的类风湿性关节炎”的受试者指那些活跃的RA依照关于RA分类的修正的1987ACR标准确诊至少8周但不长于4年的受试者。

患有“早期的类风湿性关节炎”的受试者指那些RA依照关于RA分类的修正的1987ACR标准确诊至少8周但不长于4年的受试者。RA包括例如幼发型(juvenile-onset)RA、幼年型特发性关节炎(juvenile idiopathic arthritis)(JIA)、或幼年型(juvenile RA)(JRA)。

患有“初期的RA”的患者患有未完全达到确诊RA的ACR标准的早期多关节炎。他们包括如下的具有阳性抗环状瓜氨酸化肽(抗CCP)抗体的患者，所述患者呈现多关节炎，但是尚未确诊RA，而且处于发展形成真正的ACR标准RA的高风险(95％概率)。

“关节损伤”以最广义使用，指一个或多个关节的任何部分的损伤或者部分或完全的破坏，包括结缔组织和软骨，其中损伤包括任何原因的结构和/或功能的损伤，而且可能引起或不引起关节疼痛/关节痛。它包括，但不限于，与炎性以及非炎性关节病有关的或由其引起的关节损伤。此损伤可以是由任何疾患引起的，诸如自身免疫病，尤其是关节炎，且最尤其是RA。例示性的此类疾患包括急性和慢性关节炎、RA包括幼发型RA、JIA、或JRA、和阶段诸如类风湿性滑膜炎、痛风或痛风性关节炎、急性免疫学关节炎、慢性炎性关节炎、退化性关节炎、II型胶原诱发的关节炎、感染性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、银屑病关节炎、斯提耳氏病、脊椎关节炎、骨关节炎、慢性渐进性关节炎(arthritis chronica progrediente)、变形性关节炎(arthritis deformans)、慢性原发性多关节炎(polyarthritis chronicaprimaria)、反应性关节炎、绝经期关节炎、雌激素衰竭性关节炎、和强直性脊柱炎/类风湿性脊椎炎)、RA以外的风湿性自身免疫病、和RA继发的重大系统性累及疾病(包括但不限于血管炎、肺纤维化或费耳提氏综合征(Felty’ssyndrome))。为本文目的，关节指(脊椎动物，诸如动物)骨骼各组件与包围和支持它的各部分之间的接触点，包括但不限于例如髋、脊柱的椎骨之间的关节、脊柱与骨盆之间的关节(骶髂关节)、腱和韧带附着于骨处的关节、肋骨与脊柱之间的关节、肩、膝、足、肘、手、指、踝和趾，尤其是手和足中的关节。

本文中的“自身免疫病”指源于且针对个体自身组织或器官的疾病或紊乱或其共分离(co-segregate)或表现或由其导致的状况。在许多这些自身免疫性和炎性病症中，可以存在许多临床和实验室标志，包括但不限于：高丙种球蛋白血症、高水平自身抗体、组织中抗原-抗体复合物沉积、得益于皮质类固醇或免疫抑制治疗、及受侵害组织中的淋巴样细胞集合体。不限于关于B细胞介导的自身免疫性疾病的任何一种理论，认为B细胞通过众多机制途径在人自身免疫病中展现了致病性效果，包括自身抗体的生成、免疫复合物的形成、树突细胞和T细胞的激活、细胞因子的合成、直接的趋化因子释放、及提供巢(nidus)供异位新淋巴生成。这些途径中的每一个可以不同程度地参与自身免疫病的病理。

本文中的“自身免疫病”可以为器官特异性疾病(即免疫应答特异性针对一种器官系统，诸如内分泌系统、造血系统、皮肤、心肺系统、胃肠和肝系统、肾系统、甲状腺、耳、神经肌肉系统、中枢神经系统等)或可以影响多器官系统的系统性疾病(例如SLE、RA、多肌炎等)。优选的此类疾病包括自身免疫性风湿病学病症(诸如例如RA、斯耶格伦氏综合征(syndrome)、硬皮病、狼疮(诸如SLE和狼疮肾炎)、多肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征、和银屑病关节炎)、自身免疫性胃肠和肝病症(诸如例如炎性肠病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(Crohn′s disease))、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、和乳糜泻)、血管炎(诸如例如ANCA阴性血管炎和AAV，包括丘施二氏血管炎(Churg-Strauss vasculitis)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener′sgranulomatosis)、和微观多脉管炎)、自身免疫性神经病学病症(诸如例如MS、视性眼阵挛肌阵挛综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、阿耳茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、和自身免疫性多神经病)、肾病症(诸如例如肾小球肾炎、古德帕斯丘氏综合征(Goodpasture’ssyndrome)、和贝格尔氏病(Berger’s disease))、自身免疫性皮肤病学病症(诸如例如银屑病、荨麻疹、hives、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮、和皮肤红斑狼疮)、血液学病症(诸如例如血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、输血后紫癜、和自身免疫性溶血性贫血)、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自身免疫性听觉疾病(诸如例如内耳病和听力损失)、贝切特氏病(Behcet′sdisease)、雷诺氏综合征(Raynaud′s syndrome)、器官移植、和自身免疫性内分泌病症(诸如例如糖尿病相关自身免疫病诸如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、阿狄森氏病(Addison’s disease)、和自身免疫性甲状腺病(例如格雷夫斯氏病(Graves’disease)和甲状腺炎))。更优选的此类疾病包括例如RA、溃疡性结肠炎、AAV、狼疮、MS、斯耶格伦氏综合征、格雷夫斯氏病、IDDM、恶性贫血、甲状腺炎、和肾小球肾炎。

对受试者的“治疗”在本文中指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。那些需要治疗的受试者包括那些已经患有RA或关节损伤的受试者以及需要预防RA或关节损伤或RA或关节损伤进展的受试者。因此，受试者可以是已经诊断为具有RA或关节损伤或者可以是倾向于或易感于RA或关节损伤，或者可以是具有RA或关节损伤，其有可能在不进行治疗的情况中进展。若RA或关节损伤得到缓解或治愈，或者RA或关节损伤(包括其体征和症状)和结构损伤的进展停止或者与给药之前受试者的状况相比减缓，则该治疗是成功的。

成功的治疗还包括完全或部分防止RA或关节损伤的发生/发展。为本文目的，减缓或减轻RA或关节损伤或RA或关节损伤进展等同于阻滞、降低、或逆转RA或关节损伤。该方法中的RA治疗功效可通过例如使用RA患者中的ACR和/或欧洲风湿病防治联合会(EULAR)临床响应参数，或通过评估患者中RA程度的分子决定子(molecule determinant)来测定。

临床医师可使用本领域已知的数种方法之任一来测量本文中抗CD20抗体的特定剂量方案的功效。例如，可使用x-射线技术来测定患者中关节破坏和损伤的程度，而且可使用ACR20、ACR50、和ACR70标度来确定对该疗法的相对有效响应。可调整剂量方案来提供最佳的期望响应(例如治疗效应)。例如，可施用一剂，可以在一段时间里施用多个分剂，或者可以根据治疗情况的紧急事件成比例地降低或提高剂量。

患者对本文中抗CD20抗体治疗的“有效响应”(effective response)或患者对本文中抗CD20抗体治疗的“响应性”(responsiveness)及类似用语指源自用抗CD20抗体进行的治疗或作为该治疗的结果而给予不响应利妥昔单抗的患者的临床或治疗益处。此类益处包括细胞或生物学应答、完全响应、部分响应、稳定的病情(没有进展或复发)、或源自用本文中抗CD20抗体进行的治疗或作为该治疗的结果的患者响应及较晚时候复发。例如，有效响应可以是患者中更高的ACR50。

“受试者”在本文中指任何单一人类受试者，包括适于接受治疗的患者，他正经受或者已经经受RA或关节损伤的一种或多种体征、症状、或其它指标，无论例如是新近确诊的或者以前确诊的且现在正经受对利妥昔单抗处理不响应诸如复发。意图包括作为受试者的是参与临床研究试验的任何受试者。受试者可以是在开始本文中的治疗时未用过所用第二药物的，即该受试者在“基线”(即在本文中治疗方法中施用第一剂抗CD20抗体之一之前的一个设定点，诸如开始治疗之前筛选受试者的日子)时可以没有用例如免疫抑制剂诸如甲氨蝶呤(MTX)治疗过。这样的“未接触(药物)”受试者一般认为是用所述第二药物进行治疗的候选人。

“临床改善”指防止RA或关节损伤的进一步进展或者指RA或关节损伤因治疗所致的任何改善，其根据各种测试(包括放射照相术检查)来确定。如此，临床改善可以是例如通过评估触痛的或肿胀的关节数目、银屑病评估严重性指数、受试者综合临床评估、评估红细胞沉降率、或评估C-反应蛋白水平的量而确定的。

为本文目的，如果他/她没有RA或活跃的关节损伤的症状，诸如那些可通过本文所披露的方法来检测的，而且根据基线时的或治疗期间某一时间点的评估RA或关节损伤没有进展，那么该受试者处于“消退”中。那些没有处在消退中的受试者包括例如那些经受RA或关节损伤恶化或进展的受试者。经受症状的重现，包括活跃的RA或关节损伤的此类受试者指那些“不响应”或具有“复发”的受试者。

当涉及受试者或患者对利妥昔单抗(或如本文所列他们对其没有响应的其它药物)的反应时，表述“对...没有响应”描述那些在施用利妥昔单抗(或此类其它药物)后不展示出任何的或足够的RA治疗迹象，或展现出对利妥昔单抗(或其它药物)的临床不可接受的高度毒性，或在第一次施用利妥昔单抗(或其它药物)后不维持治疗迹象的受试者或患者，其中此语境中所使用的词语“治疗”如本文中所定义的。短语“没有响应”包括对那些对先前施用的利妥昔单抗(或其它药物)耐药和/或不应的受试者的描述，而且包括受试者或患者在接受给予他或她的利妥昔单抗(或其它药物)的同时疾病有进展的情况和受试者或患者在完成涉及他或她不再有响应的利妥昔单抗(或其它药物)的治疗方案后12个月内(更优选6个月内)疾病有进展的情况。

如此，对利妥昔单抗(或其它药物)“没有响应”包括在先前的或当前的治疗后继续患有活动性疾病的受试者。例如，患者可以在用他们没有响应的利妥昔单抗(或其它药物)治疗约1-3个月后具有活跃的疾病活动。此类响应性可以由治疗所讨论病症的本领域技术人员临床医师来评估。描述语“不响应”还指对第一轮利妥昔单抗(或其它药物)有响应但对复治方案中第二轮或更晚疗程的此类药物不响应的响应者。它包括响应第一临床终点但不响应次级终点的后继不响应者。它包括那些消减了B细胞但不响应例如利妥昔单抗处理的患者，以及没有消减B细胞的患者。它还包括例如在第24周或在更晚的时间显示ACR响应改善少于约20％的患者。

就对药物没有响应而言，因先前的或当前的一种或多种药物(诸如TNF-α抑制剂)的治疗而经历“临床上不可接受的高水平毒性”的受试者经历一种或多种与该药物有关的、有经验的临床医师认为是重大的负面副作用或不良事件，诸如例如免疫反应(包括形成自身抗体和人抗嵌合抗体(HACA)，如通过文献中的标准测试来测定，诸如例如对血清的酶联免疫吸附测定法(Prometheus Laboratories，San Diego，CA)，参见例如Baert et al.，N Engl J Med，348：601-608(2003))、严重感染、充血性心力衰竭、脱髓鞘(引起MS)、显著的超敏感性、神经病理性事件、高度的自身免疫、癌症(诸如子宫内膜癌、NHL、结核病、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、黑素瘤)、等。

RA或关节损伤的“症状”指受试者经受的结构、功能、或感觉中的任何病态现象或偏离正常的现象，其指示RA或关节损伤，诸如那些上面所列的，包括关节触痛或关节肿胀。

“改良Sharp总分(total modifled Sharp score)”指使用Genant，Am.J.Med.，30：35-47(1983)改良的依照Sharp的方法评估放射照片得到的分值。主要评估为来自筛选的Sharp-Genant总分的变化。Sharp-Genant得分综合了手和足的侵蚀得分和关节腔变窄得分。关节损伤是在这些测试中测量的，其通过均值变化小于基线(患者在第一次施用抗CD20抗体之前进行筛选或检验的时间)时的得分来评分。

术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素或其片段。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)()；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、calicheamicin、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如MTX和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；

雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)，例如紫杉醇(paclitaxel)(

Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和多西他塞(doxetaxel)(

-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素(mitomycin)C；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；(卡培他滨(capecitabine))；伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DFMO)；视黄酸(retinoic acid)；esperamicins；卡培他滨(capecitabine)；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。

术语“免疫抑制剂”在本文中用于辅助疗法时指起抑制或掩盖本文中所治疗哺乳动物的免疫系统作用的物质。这将包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩盖MHC抗原的物质。此类药剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶类(见US 4,665,077)；NSAID；更昔洛韦(ganciclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮质激素类诸如皮质醇(cortisol)或醛甾酮(aldosterone)、抗炎剂类诸如环加氧酶抑制剂、5-脂加氧酶抑制剂或白三烯受体拮抗剂；嘌呤拮抗剂类，诸如硫唑嘌呤(azathioprine)或霉酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil，MMF)；烷化剂类，诸如环磷酰胺(cyclophosphamide)、溴隐亭(bromocryptine)、达那唑(danazol)、氨苯砜(dapsone)、戊二醛(它掩盖MHC抗原，如US 4,120,649中所记载的)；MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢霉素A；类固醇类，诸如皮质类固醇或糖皮质类固醇或糖皮质激素类似物，例如泼尼松(prednisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)包括SOLU-

甲泼尼龙琥珀酸钠、和地塞米松(dexamethasone)；二氢叶酸还原酶抑制剂类，诸如MTX(口服或皮下)；抗疟剂类，诸如氯喹(chloroquine)和羟氯喹(hydroxycloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；来氟米特(leflunomide)；细胞因子拮抗剂诸如细胞因子抗体或细胞因子受体抗体，包括抗干扰素-α、-β或-γ抗体，抗TNF-α抗体(英夫利昔单抗(infliximab)(

)或阿达木单抗(adalimumab))，抗TNF-α免疫粘附素(依那西普(etanercept))，抗TNF-β抗体，抗白介素-2(IL-2)抗体和抗IL-2受体抗体，和抗IL-6受体抗体和拮抗剂(诸如ACTEMRA^TM(tocilizumab))；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛(pan)T抗体，优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；包含LFA-3结合域的可溶性肽(WO 1990/08187)；链激酶；转化生长因子-β(TGF-β)；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T细胞受体(Cohen et al.，US5,114,721)；T细胞受体片段(Offner et al.，Science 251：430-432(1991)；WO90/11294；Ianeway，Nature，341：482(1989)；WO 91/01133)；BAFF拮抗剂，诸如抗BAFF抗体和抗BR3抗体和zTNF4拮抗剂(综述参见Mackay和Mackay，Trends Immunol.23：113-5(2002))；干扰T辅助细胞信号的生物制剂，诸如抗CD40受体或抗CD40配体(CD154)，包括CD40-CD40配体的阻断性抗体(例如Durie et al.，Science，261：1328-30(1993)；Mohan et al.，J.Immunol.，154：1470-80(1995))和CTLA4-Ig(Finck et al.，Science，265：1225-7(1994))；及T细胞受体抗体(EP 340,109)，诸如T10B9。本文中的有些免疫抑制剂还是DMARD，诸如MTX。本文中优选的免疫抑制剂的例子包括环磷酰胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤、来氟米特、MMF、或MTX。

术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-1b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15，包括

rIL-2；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物，包括通过人工合成产生的小分子实体，及其药剂学可接受的衍生物和盐。“细胞因子拮抗剂”指通过任何机制抑制或拮抗此类细胞因子的分子，包括例如细胞因子的抗体、细胞因子受体的抗体、和免疫粘附素。

术语“整联蛋白”指容许细胞结合和应答胞外基质且涉及多种细胞功能诸如伤口愈合、细胞分化、肿瘤细胞归巢、和凋亡的受体蛋白质。它们是牵涉细胞-胞外基质和细胞-细胞相互作用的细胞粘附受体大家族的一部分。功能性整联蛋白由非共价结合的两个跨膜糖蛋白亚基组成，称为α和β。α亚基彼此都享有一定同源性，β亚基也是如此。所述受体总是包含一条α链和一条β链。例子包括α6β1、α3β1、α7β1、α4链(诸如α4β1)、β7链(诸如α4β7和/或αEβ7的β7整联蛋白亚基)、LFA-1等。在用于本文时，术语“整联蛋白”包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列整联蛋白的生物学活性等效物，包括通过人工合成产生的小分子实体，及其药剂学可接受的衍生物和盐。

“整联蛋白拮抗剂”指通过任何机制来抑制或拮抗此类整联蛋白的分子，包括例如针对整联蛋白的抗体。本文中“整联蛋白拮抗剂或抗体”的例子包括LFA-1抗体，诸如可以从Genentech购买的efalizumab(

)，或其它CD11/11a和CD18抗体，或α4整联蛋白抗体，诸如可以从Biogen-IDEC购买的natalizumab(

)，或二氮杂环苯丙氨酸衍生物(WO 2003/89410)、苯丙氨酸衍生物(WO 2003/70709、WO 2002/28830、WO 2002/16329和WO2003/53926)、苯基丙酸衍生物(WO 2003/10135)、烯胺衍生物(WO2001/79173)、丙酸衍生物(WO 2000/37444)、链烷酸衍生物(WO 2000/32575)、取代苯基衍生物(US 6,677,339和6,348,463)、芳香胺衍生物(US 6,369,229)、ADAM解联蛋白结构域多肽(US 2002/0042368)、αvβ3整联蛋白的抗体(EP633945)、抗β7抗体诸如rhuMAb β7(US 2006/0093601)和MLN-02(MillenniumPharmaceuticals)、抗α4抗体诸如

(Biogen-IDEC-)、T0047(GSK/Tanabe)、CDP-323(口服)(UCB)、氮桥二环氨基酸衍生物(WO2002/02556)、等。

为本发明目的，“肿瘤坏死因子α”或“TNF-α”指包含如Pennica et al.，Nature 312：721(1984)或Aggarwal et al.，JBC 260：2345(1985)中所记载的氨基酸序列的人TNF-α分子。“TNF-α抑制剂”在本文中指在一定程度上抑制TNF-α的生物学功能的药剂，一般通过结合TNF-α并中和其活性。本文中明确涵盖的TNF-α抑制剂的例子有依那西普(etanercept)(

)、英夫利昔单抗(infliximab)(

)和阿达木单抗(adalimumab)(HUMIRA^TM)。

“缓解病情的抗风湿药”或“DMARD”的例子包括羟氯喹(hydroxycloroquine)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、MTX、来氟米特(leflunomide)、依那西普(etanercept)、英夫利昔单抗(infliximab)(加口服和皮下MTX)、硫唑嘌呤(azathioprine)、D-青霉胺、金盐(口服)、金盐(肌肉内)、米诺环素(minocycline)、环孢霉素(cyclosporine)包括环孢霉素A和表面环孢霉素、葡萄球菌蛋白A(Goodyear和Silverman，J.Exp.Med.197(9)：1125-39(2003))，包括其盐和衍生物，等。本文中优选的DMARD是MTX。

“非类固醇抗炎药”或“NSAID”的例子包括阿司匹林(aspirin)、乙酰水杨酸(acetylsalicylic acid)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)、COX-2抑制剂诸如塞来考昔(celecoxib)(

4-(5-(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺和伐地考昔(valdecoxib)(

)、及美洛昔康(meloxicam)(

)，包括其盐和衍生物，等。优选的是，它们是阿司匹林、萘普生、布洛芬、吲哚美辛或托美丁。

“皮质类固醇”指具有类固醇的一般化学结构，模拟或提升天然存在皮质类固醇的效果的数种合成的或天然存在的物质中的任一种。合成的皮质类固醇的例子包括泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)(包括甲泼尼龙(methylprednisolone)，诸如SOLU-

甲泼尼龙琥珀酸钠)、地塞米松(dexamethasone)或地塞米松曲安西龙(dexamethasone triamcinolone)、氢化可的松(hydrocortisone)和倍他米松(betamethasone)。本文中优选的皮质类固醇是泼尼松、甲泼尼龙、氢化可的松或地塞米松。

“药物”指用以治疗RA或关节损伤或者RA或关节损伤的体征或症状或副作用的活性药剂。

术语“药物配制剂”指其形式容许药物的生物学活性是有效的，且不含对会施用该配制剂的受试者产生不可接受的毒性的别的成分的无菌制备物。

“无菌”配制剂是无菌的或不含所有活的微生物及其孢子。

“包装插页”用于指通常包括在治疗用产品或药物的商业包装中的说明书，它们包含有关涉及此类治疗用产品或药物应用的适应征、用法、剂量、施用、禁忌症、与该包装产品联合的其它治疗用产品和/或警告等的信息。

“试剂盒”指包含至少一种用于治疗RA或关节损伤的药物的任何制品(例如包装或容器)。所述制品优选以用于实施本发明方法的单位来宣传、分发、或销售。

“目标受众(target audience)”指接受如通过推销或做广告(尤其为了特定用途、治疗、或适应症)进行的特定药物宣传或意图进行的特定药物宣传的人群或机构，诸如患者个体，患者群体，报纸、医学文献、和杂志读者，电视或因特网观众，无线电或因特网听众，内科医生，药品公司，等。

在本文中使用时，词语“标记物”指直接地或间接地偶联或融合至诸如核酸探针或抗体等试剂且便于检测与其偶联或融合的试剂的化合物或组合物。标记物可以是自身就可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。该术语意图涵盖通过将可检测物质偶联(即物理连接)至探针或抗体进行的对探针或抗体的直接标记，以及通过与直接标记的另一试剂的反应性而进行的对探针或抗体的间接标记。间接标记的例子包括用荧光标记的二抗检测一抗，和用生物素末端标记DNA探针使得它能用荧光标记的链霉亲合素来检测。

II.实施本发明的方式

本文中的受试者或患者先前已经施用利妥昔单抗来治疗RA，而且对该利妥昔单抗治疗没有响应。

在一个实施方案中，本发明提供了用选自特定组的除利妥昔单抗以外的抗CD20抗体治疗此类不响应的RA患者的方法。该组包括：

(1)ofatumumab(具有下文给出的一个轻链可变区和两个备选重链可变区的序列)，

(2)veltuzumab(具有下文给出的一个轻链和两个重链可变区之一的序列)，

(3)小的、模块式的免疫药物(SMIP)(也称作免疫药物或TRU-015)(具有下文给出的序列)，

(4)三种CD20结合抗体之一(也称作AME 33、AME 133、和AME 133v)(具有下文为前两种抗体给出的轻链和重链可变区序列及为第三种抗体给出的完整序列)，和

(5)其Fc区中有等分无岩藻糖基化碳水化合物的人源化II型抗CD20IgG1抗体(也称作GA101)(具有下文给出的轻链和重链可变区序列)。

另一方面，本发明提供了治疗对利妥昔单抗不响应的受试者中的关节损伤的方法，包括对受试者施用上述抗CD20抗体之一，其中抗CD20抗体的施用量有效实现关节损伤减轻。

在此类方法中任选的是，施用后至少约1个月、优选至少约2个月、和更优选至少约52周，对受试者测试关节损伤的减轻。例如，给予受试者测量关节损伤与施用前基线相比的减轻情况(其指示受试者得到了成功治疗)的成像测试(诸如放射照相测试)，该测试优选测量总改良Sharp得分。

在另一个优选的实施方案中，关节损伤是由关节炎引起的，优选RA，且更优选早期或初期RA。优选的是，在此方法中，关于约52周评估，以有效量施用第二药物，其中所述抗CD20抗体是第一药物。一方面，所述第二药物是一种以上的药物。另一方面，所述第二药物是上文所列之一，包括免疫抑制剂、DMARD、除第一药物以外的针对CD20的不同抗体、整联蛋白拮抗剂、NSAID、细胞因子拮抗剂、二膦酸盐、或其组合，最优选MTX。

又一方面，本文中的治疗方法包括通过以有效治疗RA或实现与在先施用抗CD20抗体的效果相比关节损伤的持续的或保持的减轻的量给患者或受试者提供抗CD20抗体的另外施用来复治患者或受试者。优选的是，所述复治在第一次施用所述抗体后至少约24周开始。在另一个优选的实施方案中，开始一次或多次另外的复治，更优选在第二次施用所述抗体后至少约24周。在此实施方案的一个方面，在第一次复治后对受试者另外施用所述抗CD20抗体，即使受试者在在先施用后的RA测试或另一种成像测试时没有临床改善。然而，在一个优选的方面，RA或关节损伤在第二次或后续复治后与复治后第一次评估(诸如成像评估)后的RA或关节损伤程度相比已经减轻。

III.抗CD20抗体的描述

Ofatumumab(HUMAX-CD20 ^TM )

编码ofatumumab轻链可变区的多核苷酸具有如下序列：

ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT

GGCTCCCAGA TACCACCGGA GAAATTGTGT TGACACAGTC

TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC

CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACTTAG

CCTGGTACCA ACAGAAACCT GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT

CATCTATGAT GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC

AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGGACAGAC TTCACTCTCA

CCATCAGCAG CCTAGAGCCT GAAGATTTTG CAGTTTATTA

CTGTCAGCAG CGTAGCAACT GGCCGATCAC CTTCGGCCAA

GGGACACGAC TGGAGATTAAAC(SEQ ID NO：1)

代表ofatumumab轻链可变区的多肽具有如下序列：

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro Asp Thr

Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu

Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala

Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn

Trp Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys(SEQ ID NO：2)

编码ofatumumab第一(且优选的)重链可变区的多核苷酸具有如下序列：

ATGGAGTTGG GACTGAGCTG GATTTTCCTT TTGGCTATTT

TAAAAGGTGT CCAGTGTGAA GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG

GGGAGGCTTG GTACAGCCTG GCAGGTCCCT GAGACTCTCC

TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTTAATGAT TATGCCATGC

ACTGGGTCCG GCAAGCTCCA GGGAAGGGCC TGGAGTGGGT

CTCAACTATT AGTTGGAATA GTGGTTCCAT AGGCTATGCG

GACTCTGTGA AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAACG

CCAAGAAGTC CCTGTATCTG CAAATGAACA GTCTGAGAGC

TGAGGACACG GCCTTGTATT ACTGTGCAAA AGATATACAG

TACGGCAACT ACTACTACGG TATGGACGTC TGGGGCCAAG

GGACCACGGT CACCGTCTCC TCAG(SEQ ID NO：3)

代表ofatumumab第一(且优选的)重链可变区的多肽具有如下序列：

Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly Val Gln Cys

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile

Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser(SEQ ID NO：4)

代表ofatumumab第二重链可变区的多肽具有如下序列：

Met Phe Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly Val Gln Cys

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile

Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr

Cys Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser(SEQ ID NO：5)

还可参见US 2004/0167319 SEQ ID NO：1-4所列ofatumumab(HuMax-CD20^TM(2F2))可变区序列，通过述及将其公开内容收入本文。具体而言，第一重链可变区序列(如本文中所定义的)为该专利申请的SEQ IDNO：1和2(分别为核苷酸和氨基酸)，而轻链可变区序列为SEQ ID NO：3和4(分别为核苷酸和氨基酸)。第二重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列还描绘于US 2004/0167319的图53，其中标示了它们的CDR区。

Veltuzumab：

下文显示了代表veltuzumab(1)所有可变区的信号肽、(2)轻链可变区、和(3)两个备选重链可变区的多肽的序列：

轻链和重链可变区的信号序列：

M G W S C I I L F L V A T A T G V H S(SEQ ID NO：6)

轻链可变区：

D I Q L T Q S P S S L S A S V G D R V T M T C

W F Q Q

K P G K A P K P W I YG V P V R F S G S G S G T D Y T F T I SS L Q P E D I A T Y Y C

F G G G T K L E I K(SEQ IDNO：7)

(标有下划线的部分依序分别为CDR1、CDR2、和CDR3)

重链可变区1：

Q V Q L Q Q S G A E V K K P G S S V K V S C K A S G Y T F T

W

V K Q A P G Q G L E W I G

K A T L T A

D E S T N T A Y M E L S S L R S E D T A F Y Y C A R

W G Q G T T V T V S(SEQ ID NO：8)

(标有下划线的部分依序分别为CDR1、CDR2、和CDR3)

重链可变区2：

Q V Q L Q Q S G A E V K K P G S S V K V S C K A S G Y T F S

W

V R Q A P G Q G L E W M G

R A T I T A

D E S T N T A Y M E L S S L R S E D T A F Y F C A R

W G Q G T T V T V S(SEQ ID NO：9)

(标有下划线的部分依序分别为CDR1、CDR2、和CDR3)

还可参见US 2003/0219433图5A、5B、和5C，通过述及将其公开内容明确收入本文。

免疫药物(TRU-015)：

编码多肽TRU-015的多核苷酸具有如下序列：

AAGCTTGCCG CCATGGATTT TCAAGTGCAG ATTTTCAGCT

TCCTGCTAAT CAGTGCTTCA GTCATAATGT CCAGAGGACA

AATTGTTCTC TCCCAGTCTC CAGCAATCCT GTCTGCATCT

CCAGGGGAGA AGGTCACAAT GACTTGCAGG GCCAGCTCAA

GTGTAAGTTA CATGCACTGG TACCAGCAGA AGCCAGGATC

CTCCCCCAAA CCCTGGATTT ATGCCCCATC CAACCTGGCT

TCTGGAGTCC CTGCTCGCTT CAGTGGCAGT GGGTCTGGGA

CCTCTTACTC TCTCACAATC AGCAGAGTGG AGGCTGAAGA

TGCTGCCACT TATTACTGCC AGCAGTGGAG TTTTAACCCA

CCCACGTTCG GTGCTGGGAC CAAGCTGGAG CTGAAAGATG

GCGGTGGCTC GGGCGGTGGT GGATCTGGAG GAGGTGGGAG

CTCTCAGGCT TATCTACAGC AGTCTGGGGC TGAGTCGGTG

AGGCCTGGGG CCTCAGTGAA GATGTCCTGC AAGGCTTCTG

GCTACACATT TACCAGTTAC AATATGCACT GGGTAAAGCA

GACACCTAGA CAGGGCCTGG AATGGATTGG AGCTATTTAT

CCAGGAAATG GTGATACTTC CTACAATCAG AAGTTCAAGG

GCAAGGCCAC ACTGACTGTA GACAAATCCT CCAGCACAGC

CTACATGCAG CTCAGCAGCC TGACATCTGA AGACTCTGCG

GTCTATTTCT GTGCAAGAGT GGTGTACTAT AGTAACTCTT

ACTGGTACTT CGATGTCTGG GGCACAGGGA CCACGGTCAC

CGTCTCTGAT CAGGAGCCCA AATCTTGTGA CAAAACTCAC

ACATCTCCAC CGTGCTCAGC ACCTGAACTC CTGGGTGGAC

CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC CCAAAACCCA AGGACACCCT

CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACATG CGTGGTGGTG

GACGTGAGCC ACGAAGACCC TGAGGTCAAG TTCAACTGGT

ACGTGGACGG CGTGGAGGTG CATAATGCCA AGACAAAGCC

GCGGGAGGAG CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC

GTCCTCACCG TCCTGCACCA GGACTGGCTG AATGGCAAGG

AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGCCC TCCCAGCCCC

CATCGAGAAA ACCATCTCCA AAGCCAAAGG GCAGCCCCGA

GAACCACAGG TGTACACCCT GCCCCCATCC CGGGATGAGC

TGACCAAGAA CCAGGTCAGC CTGACCTGCC TGGTCAAAGG

CTTCTATCCA AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT

GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC

TGGACTCCGA CGGCTCCTTC TTCCTCTACA GCAAGCTCAC

CGTGGACAAG AGCAGGTGGC AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA

TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC CACTACACGC

AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT CCGGGTAAAT GATCTAGA(SEQ IDNO：10)

多肽TRU-015具有如下序列：

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser Val Ile Met Ser

Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys

Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln

Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val

Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val

Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Ser Val

Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu GluTrp Ile Gly Ala

Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr

Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser

Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr

Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser

Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu val Lys Phe Asn

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys(SEQ ID NO：11)

TRU-015的核苷酸和氨基酸序列还可参见US 2007/0059306SEQ IDNO：3和4，通过述及将其公开内容明确收入本文。

CD20结合抗体：

AME 33：

编码AME 33抗体轻链可变区的多核苷酸具有如下序列：

GAAATTGTGT TGACGCAGTC TCCAGGCACC CTGTCTTTGT

CTCCAGGGGA AAGAGCCACC CTCTCCTGCA GGGCCAGCTC

AAGTGTACCG TACATCCACT GGTACCAGCA GAAACCTGGC

CAGGCTCCCA GGCTCCTCAT CTATGCCACA TCCGCTCTGG

CTTCTGGCAT CCCAGACAGG TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG

GACAGACTTC ACTCTCACCA TCAGCAGACT GGAGCCTGAA

GATTTTGCAG TGTATTACTG TCAGCAGTGG CTGAGTAACC

CACCCACTTT TGGCCAGGGG ACCAAGCTGG AGATCAAA(SEQ IDNO：12)

代表AME 33抗体轻链可变区的多肽具有如下序列：

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala

Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ala Leu Ala Ser Gly Ile Pro

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu

Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Leu Ser Asn Pro Pro Thr

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys(SEQ ID NO：13)

编码AME33抗体重链可变区的多核苷酸具有如下序列：

GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGAGCAGAG GTGAAAAAGC

CCGGGGAGTC TCTGAAGATC TCCTGTAAGG GTTCTGGCCG

TACATTTACC AGTTACAATA TGCACTGGGT GCGCCAGATG

CCCGGGAAAG GCCTGGAGTG GATGGGGGCT ATTTATCCCT

TGACGGGTGA TACTTCCTAC AATCAGAAGT CGAAACTCCA

GGTCACCATC TCAGCCGACA AGTCCATCAG CACCGCCTAC

CTGCAGTGGA GCAGCCTGAA GGCCTCGGAC ACCGCCATGT

ATTACTGTGC GAGATCGACT TACGTGGGCG GTGACTGGCA

GTTCGATGTC TGGGGCAAGG GGACCACGGT CACCGTCTCC TCA(SEQID NO：14)

代表AME 33抗体重链可变区的多肽具有如下序列：

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys

Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg

Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Asp

Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ser Lys Leu Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser

Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

Ala Arg Ser Thr Tyr Val Gly Gly Asp Trp Gln Phe Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr

Thr Val Thr Val Ser Ser(SEQ ID NO：15)

AME33轻链和重链可变区核苷酸和氨基酸序列还可参见US2005/0025764和US 2006/0251652图2-3以及SEQ ID NO：59-62，通过述及将其公开内容明确收入本文。

AME 133：

编码AME 133抗体轻链可变区的多核苷酸具有如下序列：

GAA ATT GTG TTG ACG CAG TCT CCA GGC ACC CTG TCT TTG TCT

CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT

GTA CCG TAC ATC CAC TGG TAC CAG CAG AAA CCT GGC CAG GCT

CCC AGG CTC CTC ATC TAT GCC ACA TCC GCT CTG GCT TCT GGC ATC

CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACT

CTC ACC ATC AGC AGA CTG GAG CCT GAA GAT TTT GCA GTG TAT

TAC TGT CAG CAG TGG CTG AGT AAC CCA CCC ACT TTT GGC CAG

GGG ACC AAG CTG GAG ATC AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA TCT

GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA

ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA

GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG

GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC

AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA

GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT

CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA

GAG TGT TAG(SEQ ID NO：16)

代表AME 133抗体轻链可变区的多肽具有如下序列：

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala

Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

GlV Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ala Leu Ala Ser Gly Ile Pro

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu

Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Leu Ser Asn Pro Pro Thr

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly

Glu Cys(SEQ ID NO：17)

代表AME 133抗体重链可变区的多肽具有如下序列：

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys

Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg

Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Asp

Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ser Lys Leu Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser

Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

Ala Arg Ser Thr Tyr Val Gly Gly Asp Trp Gln Phe Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr

Thr Val Thr Val Ser Ser(SEQ ID NO：18)

还可参见US 2005/0136044SEQ ID NO：197和198所列AME 133轻链可变区核苷酸和氨基酸序列，通过述及将其公开内容明确收入本文。

AME 133v：

代表AME 133v(一种将AME 133Fab区融合至经修饰BChE变体L530而制备的融合蛋白)的多肽具有如下序列：

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys

Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg

Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Asp

Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ser Lys Leu Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser

Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

Ala Arg Ser Thr Tyr Val Gly Gly Asp Trp Gln Phe Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

Phe Pro Ala

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

Lys Leu Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met Asn

Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro Tyr Ala Gln Pro

Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile

Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro

Gly Phe Phe Gly Ser Glu Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys

Leu Tyr Leu Asn Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp

Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr Asp Gly Lys

Phe

Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu

Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe

Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn

Pro Lys Ser Val Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His

Leu Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser Gly Ser

Ala Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg Asn Arg Thr Leu Asn

Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu

Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly

Thr Asn Leu Ser Val Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met

Pro Asp Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly Val

Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Ala Tyr Gly Ala Pro Gly Phe Ser Lys Asp

Asn Asn SerIle Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu Gly Leu Lys Ile

Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp

Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly

Asp Tyr Asn Phe Ile Cys Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly

Asn Asn Ala Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu

Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu Pro Leu Glu

Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser Arg Ser Ile Val Lys Arg

Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser

Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr

Arg Ile Met Thr Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro

Lys Val(SEQ ID NO：19)

还可参见US 2005/0136044SEQ ID NO：202和图19，通过述及将其公开内容明确收入本文。

具有糖工程改造Fc区的人源化II型抗CD20 IgG1抗体：

编码人源化II型抗CD20IgG1抗体(GA101)轻链可变区的多核苷酸具有如下序列：

GATATCGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCC CTGCCCGTCA

CCCCTGGAGA GCCCGCCAGC ATTAGCTGCA GGTCTAGCAA

GAGCCTCTTG CACAGCAATG GCATCACTTA TTTGTATTGG

TACCTGCAAA AGCCAGGGCA GTCTCCACAG CTCCTGATTT

ATCAAATGTC CAACCTTGTC TCTGGCGTCC CTGACCGGTT

CTCCGGATCC GGGTCAGGCA CTGATTTCAC ACTGAAAATC

AGCAGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGAGTT TATTACTGCG

CTCAGAATCT AGAACTTCCT TACACCTTCG GCGGAGGGAC

CAAGGTGGAG ATCAAACGTA CGGTG(SEQ ID NO：20)

代表人源化II型抗CD20IgG1抗体(GA101)轻链可变区的多肽具有如下序列：

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala

Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr

Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn

Leu Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val

(SEQ ID NO：21)

编码人源化II型抗CD20IgG1抗体(GA101)重链可变区的多核苷酸具有如下序列：

CAGGTGCAAT TGGTGCAGTC TGGCGCTGAA GTTAAGAAGC

CTGGGAGTTC AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCCGGATA

CGCCTTCAGC TATTCTTGGA TGAACTGGGT GCGGCAGGCC

CCTGGACAAG GGCTCGAGTG GATGGGACGG ATCTTTCCCG

GCGATGGGGA TACTGACTAC AATGGGAAAT TCAAGGGCAG

AGTCACAATT ACCGCCGACA AATCCACTAG CACAGCCTAT

ATGGAGCTGA GCAGCCTGAG ATCTGAGGAC ACGGCCGTGT

ATTACTGTGC AAGAAATGTC TTTGATGGTT ACTGGCTTGT

TTACTGGGGC CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCCTCA(SEQ ID NO：22)

代表人源化II型抗CD20IgG1抗体(GA101)重链可变区的多肽具有如下序列：

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys

Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser Trp Met Asn Trp Val Arg

Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp

Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr

Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

Cys Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

Val Thr Val Ser Ser(SEQ ID NO：23)

还可参见US 2005/0123546，通过述及将其公开内容明确收入本文，关于BHH2-KV1-GE(GA101)，它是通过将来自鼠B-ly1的CDR序列嫁接到具有完全人的IgG1-κ种系序列的框架区上而人源化的。US 2005/0123546图7列举了B-ly1的预测CDR区的一个选集。GA101的BHH2成分(重链可变区)的序列在表2和3中呈现为SEQ ID NO：31(核苷酸)和32(氨基酸)。KV1成分(轻链可变区)在表2和3中呈现为SEQ ID NO：75(核苷酸)和76(氨基酸)。表观重链和轻链可变区信号序列也在这些表中列举为SEQ ID NO：73(重链可变区，核苷酸)、74(重链可变区，氨基酸)、77(轻链可变区，核苷酸)、和76(轻链可变区，氨基酸)。

BHH2-KV1-GE(GA101)的总体序列信息预测为：

轻链可变区(总体)：

-SEQ ID NO：75和76，分别为核苷酸和氨基酸

轻链可变区(预测)CDR1：

-SEQ ID NO：8和18，分别为核苷酸和氨基酸

轻链可变区(预测)CDR2：

-SEQ ID NO：9和19，分别为核苷酸和氨基酸

轻链可变区(预测)CDR3：

-SEQ ID NO：10和20，分别为核苷酸和氨基酸

重链可变区(总体)：

-SEQ ID NO：31和32，分别为核苷酸和氨基酸

重链可变区(预测)CDR1：

-SEQ ID NO：5-7和15-17之任一，分别为核苷酸和氨基酸

重链可变区(预测)CDR2：

-SEQ ID NO：21-23和25-27之任一，分别为核苷酸和氨基酸

重链可变区(预测)CDR3：

-SEQ ID NO：24和28，分别为核苷酸和氨基酸

抗CD20抗体的汇总及其具体实施方案：

如此，总而言之，可在本文中治疗方法中使用的抗CD20抗体是(1)包含SEQ ID NO：2中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：4中或SEQ ID NO：5中重链可变区氨基酸序列的ofatumumab；(2)包含SEQ ID NO：7中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：8中或SEQ ID NO：9中重链可变区氨基酸序列的veltuzumab；(3)包含SEQ ID NO：11的免疫药物；(4)包含SEQ ID NO：13中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：15中重链可变区氨基酸序列、或包含SEQID NO：17中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：18中重链可变区氨基酸序列、或包含SEQ ID NO：19的CD20结合抗体；或(5)其Fc区中有等分无岩藻糖基化碳水化合物且包含SEQ ID NO：21中轻链可变区氨基酸序列和SEQ IDNO：23中重链可变区氨基酸序列的人源化II型抗CD20 IgG1抗体。

在一个实施方案中，所述抗CD20抗体是ofatumumab。最优选的是，所述ofatumumab包含SEQ ID NO：4中重链可变区氨基酸序列。然而，在另一个实施方案中，它包含SEQ ID NO：5中重链可变区氨基酸序列。

在另一个实施方案中，所述抗CD20抗体是veltuzumab。在一个具体的方面，所述veltuzumab包含SEQ ID NO：8中重链可变区氨基酸序列。在另一个具体的方面，所述veltuzumab包含SEQ ID NO：9中重链可变区氨基酸序列。

在又一个实施方案中，所述抗CD20抗体是免疫药物(等同于TRU-015)。

在还有一个实施方案中，所述抗CD20抗体是包含SEQ ID NO：13和15或包含SEQ ID NO：17和18、或包含SEQ ID NO：19的CD20结合抗体。一方面，所述CD20结合抗体包含SEQ ID NO：13中轻链可变区氨基酸序列和SEQ IDNO：15中重链可变区氨基酸序列(AME 33)。另一方面，所述CD20结合抗体包含SEQ ID NO：17中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：18中重链可变区氨基酸序列(AME 133)。又一方面，所述CD20结合抗体包含SEQ ID NO：19(AME 133v)。

在第五个总的实施方案中，所述抗CD20抗体是人源化II型抗CD20IgG1抗体。

这些可用于治疗患者或受试者的抗CD20抗体可使用任何合适方法来生产，包括下文和本文实施例中描述的那些。

IV.抗CD20抗体的生成

本文中的抗CD20抗体一般是如下制造的。

Ofatumumab(HUMAX-CD20 ^TM )

Ofatumumab(2F2)可例如依照US 2004/0167319中记载的规程来制备，通过述及将其公开内容明确收入本文。本文中为ofatumumab给出的第一重链可变区序列描绘于SEQ ID NO：1和2(分别为核苷酸和氨基酸)，而本文中为ofatumumab给出的轻链可变区序列描绘于此专利申请的SEQ ID NO：3和4(分别为核苷酸和氨基酸)。第二重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列及它们指派的CDR区也描绘于US 2004/0167319的图53。

US 2004/0167319的实施例1-3披露了2F2的制备的细节。具体而言，使用表达人抗体基因的HCo7和KM小鼠来制备完全人的针对CD20的单克隆抗体。

在KM小鼠品系中，内源小鼠κ轻链基因已经遭到纯合破坏，如Chen et al.，EMBO J.，12：811-820(1993)中所记载的，而且内源小鼠重链基因已经遭到纯合破坏，如WO 2001/09187实施例1中所记载的。此小鼠品系携带人κ轻链转基因KCo5，如Fishwild et al.，Nature Biotechnology，14：845-851(1996)中所记载的。此小鼠品系还携带由染色体14片段hCF(SC20)构成的人重链转染色体，如WO 2002/43478中所记载的。

HCo7小鼠具有在它们的内源轻链(κ)基因中的JKD破坏(如Chen et al.，见上文中所记载的)、在它们的内源重链基因中的CMD破坏(如WO 2001/14424实施例1中所记载的)、KCo5人κ轻链转基因(如Fishwild et al.，见上文中所记载的)、和HCo7人重链转基因(如U.S.5,770,429中所记载的)。

用人CD20转染的NS/0细胞免疫HCo7和KM小鼠。对于第一次免疫接种，每只小鼠，将150μl PBS中的1×10⁷个细胞与完全弗氏佐剂1∶1混合，并腹膜内(i.p.)注射。后续i.p.免疫接种使用不含佐剂的相似量的细胞进行。融合前3和2天，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中悬浮的0.5×10⁷个细胞静脉内强化接种小鼠。

使用人CD20转染的NS/0细胞以及CD20阴性亲本NS/0细胞，使用FACS分析通过流式细胞术监测小鼠血清中针对人CD20的抗体的存在。

基于标准方案，自HCo7和KM小鼠分离小鼠脾细胞，并用PEG融合至小鼠骨髓瘤细胞系。然后对所得杂交瘤通过ELISA筛选人IgGκ生成并通过FACS分析使用人CD20转染的NS/0和SKBR3细胞筛选CD20特异性。用50％PEG(Sigma)将来自免疫接种小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液融合至四分之一数目的SP2/0不分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)。将细胞以大于1×10⁵/孔分配入平底微量滴定板，接着在含有10％胎牛血清、10％P388D1(ATCC，CRL TIB-63)条件培养基、3-5％DMEM中origin(IGEN)(Mediatech，CRL 10013，含高葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠)加5mM HEPES、0.055mM2-巯基乙醇、50mg/ml庆大霉素和1×HAT(Sigma，CRL P-7185)的选择性培养基中温育约2周。1-2周后，在用HT替换HAT的培养基中培养细胞。然后通过流式细胞术对各个孔筛选人抗CD20单克隆IgG抗体。一旦发生广泛的杂交瘤生长，通常在10-14天后监测培养基。将分泌抗体的杂交瘤再次铺板，再次筛选，并且，如果仍然对人IgG呈阳性，那么通过有限稀释来亚克隆抗CD20单克隆抗体。然后在体外在组织培养基中培养稳定的亚克隆以生成小量的抗体供表征用。自每个保留亲本细胞反应性(根据FACS)的杂交瘤选择一个克隆。为每个克隆生成5-10瓶细胞库，并保存在液氮中。

通过实施同种型ELISA来测定抗体的同种型。用50μl/孔1μg/ml PBS中的小鼠抗人κ轻链包被微量滴定板的孔，于4℃温育过夜。用5％鸡血清封闭后，将板与上清液和纯化的同种型对照反应。然后将板于环境温度温育1-2小时。然后将孔与人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4特异性辣根过氧化物酶偶联的探针反应。如上所述将板显色并分析。

杂交瘤细胞系之一生成所表达的2F2，一种人单克隆IgG1，κ抗体，其具有US 2004/0167319的核苷酸序列SEQ ID NO：1和3及氨基酸序列SEQ IDNO：2和4。

然后在聚合酶链式反应(PCR)中使用引物和寡核苷酸对V_L和V_H区测序，如US 2004/0167319中所披露的。

在琼脂糖凝胶上分析PCR产物后，用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen，Westburg，Leusden，Netherlands)纯化产物。依照制造商的方案(1999年，第6版)将V_H和V_L区各2份独立扩增的PCR产物克隆入pGEMT载体系统II(Promega)。

转化至大肠杆菌JM109后，使用T7和SP6引物通过菌落PCR筛选各个菌落，30个于55℃的退火循环。使用QIAPREP SPIN MINIPREP^TM试剂盒(Qiagen)纯化来自菌落的质粒DNA。通过NcoI/NotI(NE Biolabs，Westburg，Leusden，Netherlands)消化并在琼脂糖凝胶上分析，进一步分析VH和VL区。

克隆入pGEMT载体系统II后对V区测序。测序是在Baseclear(Leiden，Netherlands)进行的。通过比对Vbase(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/intro.htm).http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok.php？menu＝901中的种系V基因序列来分析序列。

使用如下引物使用PCR自标准克隆载体pGem-5Zf(Promega)扩增2F2抗体重链和轻链可变区，该引物包括最佳的Kozak序列和合适的限制性位点以在GS恒定区载体pCONγ1f和PCONκ(Lonza)中克隆片段。

扩增后，将片段纯化并用限制酶消化，用于在两种载体中克隆和连接。将重链可变区片段用HindIII和BsiWI消化，并连接入pCONγ1f载体，该载体已经用HindIII和BsiWI消化，并用碱性磷酸酶去磷酸化。将轻链可变区片段用HindIII和ApaI消化，并连接入PCONκ载体，该载体已经用HindIII和ApaI消化，并用碱性磷酸酶去磷酸化。通过菌落PCR检查转化的大肠杆菌菌落，并培养重链(HC)和轻链(LC)构建物各2个阳性菌落用于分离质粒。对这4个克隆的分离的质粒测序以验证序列。发现两个HC克隆和一个LC克隆具有正确的序列。

组合这两个HC和一个LC构建物以给出两种LC-HC组合并瞬时共转染入CHO-K1细胞以对构建物检查2F2抗体的正确生成。在此表达实验中所有组合都达到了正常生成水平，并且选择HC和LC构建物各一个克隆用于构建双基因载体。

通过将来自重链载体pCONγ1f/重链可变区的完整表达盒连接入轻链载体pCONκ/轻链可变区，使用标准克隆规程在双基因克隆载体(称作pCONγ1f/κ2F2)中组合HC和LC构建物。

再次在CHO-K1细胞中的瞬时转染中在功能上测试此构建物，并且显示正常的表达水平。对pCONγ1f/κ2F2质粒的可变区测序以再次验证正确的序列。

通过用在对表达重要的区以外切割的独特限制酶PvuI消化pCONγ1f/κ2F2，制备线性质粒用于稳定转染。通过琼脂糖凝胶电泳证实了完全的线性化，并将DNA纯化和保存于-20℃直至使用。

使用上述线性DNA质粒通过用质粒DNA电穿孔实施了6次NS/0宿主细胞转染。转染后，将细胞分配入96孔板并温育。添加S选择性培养基(含有10％经透析的胎牛血清(dFCS)和10μM GS抑制剂L-甲硫氨酸砜亚胺但缺少谷氨酰胺)，并监测板以确定何时未转染细胞死亡而剩下转染细胞的斑点。关于GS载体系统的详情，参见WO 1987/04462。将转染板温育大约3周以容许集落形成。用显微镜检查所得集落以验证集落的大小适合测定法(覆盖大于60％的孔底)且每个孔中只存在一个集落。通过IgGκ-ELISA对来自436个转染子的细胞上清液筛选装配好的抗体。

使用此数据，选择111个转染子用于接下来的操作和进一步在静态培养中评估。将选定细胞系的培养物扩增并适应含低血清的培养基(含有牛血清清蛋白(BSA)和添加的1％dFCS)，并在静态培养中进行进一步的生产力评估(ELISA和百分比汇合的测量)。选择排名最高的65个细胞系用于接下来的操作。在含低血清的培养基中的分批摇瓶悬浮培养(含有BSA和添加的1％dFCS)中进行选定细胞系的初步生产力评估。基于收获抗体浓度(根据ELISA)和可接受的生长特征，选择30个细胞系用于使用分批摇瓶悬浮培养的无血清培养基中的进一步评估。

在无血清培养基中在一式两份补料-分批摇瓶悬浮培养中进一步评估生成最高抗体浓度的10个细胞系。通过蛋白A高效液相层析(HPLC)依照公知的标准方法测定收获时的产物浓度。

IMMU-106(hA20或Veltuzumab)

US 2003/0219433图5披露了hA20轻链V基因hA20Vk(图5A)及重链V基因hA20VH1(图5B)和hA20VH2(图5C)的核苷酸序列，以及VKpBR2(图5A)和VHpBS2(图5B和5C)分阶段载体(staging vectors)的临近侧翼序列。不翻译的核苷酸序列以小写字母显示。用于亚克隆的限制性位点有下划线并标示。分泌信号肽序列有双下划线。氨基酸序列在相应的核苷酸序列下面以单字母代码给出。Kabat编号方案用于氨基酸残基。以字母编号的氨基酸残基代表依照Kabat的插入残基，而且具有与前一个残基相同的编号。

用于构建veltuzumab的方法记载于例如US 2003/0219433，通过述及将其公开内容明确收入本文。在一种特别的制备方法中，例如，如下构建和制备抗体：

每条可变链任选分两部分构建：5′一半和3′一半，分别称作“A”和“B”。每个一半任选通过使用Taq聚合酶用两条短的侧翼引物PCR扩增单链合成寡核苷酸模板来生成。可以首先将扩增片段克隆入pCR4TA克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)并进行DNA测序。模板和引物对见US2003/0219433。

全长Vκ轻链的装配可通过用适宜的5′和3′酶限制酶消化每种片段并连接入先前用PvuII和BclI(经BclI消化的末端与BglII的相容)消化的VKpBR2载体来实现。所得连接产物含有连接至PvuII位点的A片段、连接至BclI位点的B片段、及在BstBI位点处连接到一起的A和B片段。VKpBR2是VKpBR(Leunget al.，Hybridoma，13：469(1994))的一种改良分阶段载体，其中在翻译起始密码子上游14个碱基处引入了XbaI限制性位点。通过DNA测序证实正确的可读框后，作为XbaI-BamHI片段自VKpBR2取出完整的链，并连接入pdHL2表达载体。只含有Vκ序列的载体称作hA20VκpdHL2。载体pdHL2含有在IgH增强子和MTI启动子控制下的人IgG1 C1、C2、C3、和铰链区及人κ链Ck二者的表达盒，以及受弱SV40启动子控制的小鼠dhfr基因(作为转染子选择和转基因共扩增的标志物)(Gillies et al.，J.Immunol.Methods，125：191(1989)和Losman et al.，Cancer，80：2660(1997))。通过替换pdHL2的Vκ和VH区段，可表达不同的嵌合或人源化抗体。

为了构建重链，适宜的寡核苷酸用它们各自的引物对进行PCR扩增。对两种类型的VH进行与为Vκ进行的相同的构建方法，有下述修改：A片段的5′端限制性位点是PstI，而B片段的3′端限制性位点是BstEII。这些片段在共同的NciI位点处连接入VHpBS2载体时连接到一起，产生全长VH序列(见US2003/0219433图1B和2C)，并通过DNA测序验证。VHpBS2是VHpBS(Leung etal.，Hybridoma，13：469(1994))的一种改良分阶段载体，其中在翻译起始密码子上游16个碱基处引入了XhoI限制性位点。将装配好的VH基因作为XhoI-BamHI限制性片段亚克隆入含有Vκ序列的表达载体，hA20VκpdHL2。因为pdHL2的重链区缺少BamHI限制性位点，所以此连接需要使用HNB接头(其序列见US 2003/0219433)来提供可变链的BamHI位点和pdHL2载体中存在的HindIII位点之间的桥。

hA20抗体的转染和表达任选如下进行。大约30μg hA20的表达载体通过SalI消化来线性化并通过电穿孔(450V和25μF)转染入Sp2/0-Ag14细胞。将转染细胞分配入96孔板2天，然后通过以终浓度0.025μM添加MTX入培养基中来选择药物抗性。预期2-3周里孔中出现MTX抗性集落。通过ELISA测定法对来自选择中幸存的集落的上清液筛选人抗体分泌。

简言之，将100μl上清液添加入用山羊抗人IgG(GAH-IgG)，F(ab′)2片段特异性抗体预包被的微量滴定板的孔中，并于室温温育1小时。通过用清洗缓冲液(含有0.05％POLYSORBATE 20^TM表面活性剂的PBS)清洗3次来除去未结合的蛋白质。将辣根过氧化物酶(HRP)偶联的GAH-IgG，Fc片段特异性抗体添加至孔。温育1小时后，清洗板。通过添加含有4mM邻-苯二胺二盐酸化物(OPD)和0.04％H₂O₂的底物溶液后读取A490nm来揭示结合的HRP偶联的抗体。扩增阳性细胞克隆，并在蛋白A柱上通过亲和层析自细胞培养物上清液纯化hA20抗体。

免疫药物

CD20特异性SMIP一般性地记载于US 2003/133939、2003/0118592、和2005/0136049，通过述及将其公开内容明确收入本文。一种例示性的CD20特异性SMIP(TRU-015)的生成记载于例如US 2007/0059306(通过述及将其公开内容收入本文)和下文。

TRU-015是一种结合CD20抗原的重组(鼠/人)单链蛋白。结合域基于公众可得的人抗CD20抗体序列。结合域经改良CSS铰链区与人IgG1的效应器域、CH2和CH3域连接。TRU-015在溶液作为二聚体存在，而且二聚体具有大约106,000道尔顿的理论分子量。编码TRU-015的核苷酸序列和TRU-015的氨基酸序列分别列于上文所列SEQ ID NO：10和11。

关于SEQ ID NO：11中所列氨基酸序列，TRU-015包含2e12前导肽克隆序列(氨基酸1-23)；具有可变区中第11位残基赖氨酸变成丝氨酸(VHL11S)的氨基酸替代(反映在第34位)的2H7鼠抗人CD20轻链可变区；以第129位残基开始的接头(该接头在末端具有额外的丝氨酸以掺入用于盒改组的SacI限制性位点)；缺少重链区末端处丝氨酸残基的2H7鼠抗人CD20重链可变区；包括包含(CSS)序列的改良铰链区的人IgG1 Fc域；和野生型CH2和CH3域。

TRU-015可以使用适宜的培养基在生物反应器中培养，然后使用一系列层析和过滤步骤来纯化，包括，例如采用减少病毒的滤器的步骤。然后可以将材料浓缩并与合适的赋形剂一起配制，诸如例如磷酸钠(例如20mM)和蔗糖(例如240mM)，处于适宜的生理学可接受pH，例如pH 6-7，更优选6.0。然后可以将组合物过滤，之后以例如10mg/mL的浓度装入管形瓶，诸如玻璃管形瓶。每个玻璃管形瓶可装有例如5mL TRU-015(50mg/管形瓶)。

CD20结合抗体

CD20结合抗体AME 33是如例如US 2005/0025764和US 2006/0251652所述制备的，通过述及将其公开内容明确收入本文。AME 33重链和轻链可变区的多核苷酸和氨基酸序列在这两件申请中都呈现为图2-3(SEQ IDNO：59-62)。AME 33轻链和重链可变区的氨基酸序列在上文中分别列为SEQID NO：13和15。

US 2005/0025764实施例1详细记载了AME 33的制备，包括列出了每个可变域的CDR区。CD20结合分子AME 33的轻链和重链可变区可以与轻链和重链恒定区组合及表达成Fab或完整抗体(例如IgG)。例如，US 2005/0025764图10和11显示了AME 33的完整轻链和重链，其包括轻链和重链恒定区，在图10A和11A标有下划线。或者，AME 33可含有那两幅图中显示的重链恒定区，除了Fc区中的氨基酸替代。具体而言，该专利申请图11中显示的重链恒定区可含有D280H突变或K290S突变(图11A以粗体显示了第280和290位，没有突变)。图11B显示了粗体和下划线的“GAC”。

具体而言，图10A显示了AME 33完整轻链氨基酸序列如下，其中恒定区标有下划线：

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVPYIHWYQQKPGQAPRLLIYATSA

LASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQWLSNPPTFGQGTKLE

IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ

SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV

TKSFNRGEC(SEQ ID NO：41)

图11A显示了AME 33完整重链氨基酸序列如下，其中恒定区标有下划线：

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGRTFTSYNMHWVRQMPGKGLEWM

GAIYPLTGDTSYNQKSKLQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAR

STYVGGDWQFDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG

CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG

TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP

KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE

QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP

REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT

TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS

LSPGK(SEQ ID NO：42)

CD20结合抗体AME 133是如例如US 2005/0136044所述制备的，通过述及将其公开内容明确收入本文，包括实施例VII。AME 133轻链可变区的多核苷酸和氨基酸序列分别列于US 2005/0136044中的SEQ ID NO：197和198。AME 133轻链可变区的氨基酸序列在上文中列为SEQ ID NO：17。AME 133重链可变区的氨基酸序列在上文中列为SEQ ID NO：18。

CD20结合抗体AME 133v(LY2469298)如例如US 2005/0136044所述制备，通过述及将其公开内容明确收入本文。此抗体的生成记载于例如第24页第175段。它是自AME 133Fab区融合至改良BChE变体L530制备的融合蛋白。AME 133v的多核苷酸和氨基酸序列显示于US 2005/0136044图19，而多肽序列是US 2005/0136044的SEQ ID NO：202和本文中的SEQ ID NO：19。

关于AME 133和AME 133v，通过文库筛选鉴定出掺入有优化的变体残基的抗体-酶融合蛋白，并且通过靶向CD20验证了在使用CPT-11的ADEPT中使用优化的BChE的可行性。CD20是对于测试在ADEPT中使用优化的BChE的可行性是一种有用的靶抗原，因为该抗原在人B淋巴瘤系上丰富表达(3.2×10⁵个分子/细胞)且在抗体结合后不经历显著的内在化。AME133是一种人源化抗CD20，具有完全人的种系框架区，是在Applied MolecularEvolution使用定向进化策略生成的，而且单价Fab以极高的亲和力(1×10^-9M)结合CD20。一种例示性的模型融合蛋白(抗CD20-BChE.4-1)(SEQ ID NO：202)由融合于CH1重链域的C端、改良BChE变体L530的N端的AME133 Fab构成。BChE变体在氨基酸530处截短以消除其正常装配成四聚体。单体型式的酶展现与天然存在的四聚体形式的每个亚基等同的活性，没有由于变构效应损失活性，如Blong et al.，Biochem.J.，327(Pt 3)：747-57(1997)所述。

对于AME 133v，使不贴壁的HEK 293细胞适应无血清低蛋白质培养基(UltraCULTURE，BioWhittaker)中的悬浮培养，并用融合蛋白AME 133v瞬时转染，产生2-4mg/L的产量。使用SEPHAROSE Q^TM介质上的阴离子层析接着苯基SEPHAROSE^TM介质上的疏水相互作用层析步骤开发了两步纯化规程。这得到纯度＞90％的产物，通过SDS-PAGE检测到一个主要的污染物条带。

本领域已知的许多规程可用于表达本文中的CD20结合分子。例如，这三种CD20结合分子可以使用单载体或双载体系统在哺乳动物或其它(包括细菌、真菌和植物)表达系统中表达成Fab或IgG。对于单载体中的表达，在一个表达盒内制备或克隆重链和轻链二者，该表达盒含有表达必需的所有调控元件。使用双载体的表达使用两个在分开的质粒中的表达盒。一般将单一的质粒或组合的质粒转染入宿主细胞系诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或视网膜细胞系PerC6，选择，然后扩增和培养以表达Fab或IgG蛋白，如本领域技术人员知道的。

细菌表达系统优选用于生成Fab。一个例子是在M13病毒表达系统中插入和表达Fab。如此表达的Fab被分泌入细菌的周质空间，而且可以通过多种方法自其释放，包括本领域知道的低渗休克和冻融规程。还任选使用蛋白酶诸如木瓜蛋白酶通过蛋白水解切割自完整IgG生成Fab。可以自切割产物的Fc部分纯化切割产物的Fab部分。

可以使用本领域知道的多种测序和特异性吸附技术来纯化Fab和抗体(参见例如Harlow et al.，见上文)。例如，可以使用蛋白A亲和层析接着MONOS^TM阳离子交换层析通过特异性结合容易地自细胞上清液纯化抗体。

具有糖工程改造的Fc区的人源化II型抗CD20IgG1抗体

分子GA101是一种人源化II型抗CD20IgG1抗体。它是通过将来自鼠单克隆抗体B-ly1的CDR序列嫁接到具有完全人的IgG1-κ种系序列的框架区上而人源化的。还有，此抗体的Fc区-碳水化合物是使用如WO 2004/065540中所述GLYCOMAB^TM技术糖工程改造的(通过述及将其公开内容收入本文)，产生等分无岩藻糖基化Fc区-碳水化合物。GA101是BHH2-KV1-GE，其制备记载于例如US 2005/0123546，通过述及将其公开内容明确收入本文。尤其参见其实施例2。

BHH2构件(重链可变区)的序列在US 2005/0123546表2和3中呈现为SEQ ID NO：31(核苷酸)和32(氨基酸)。KV1构件(轻链可变区)在表2和3中呈现为SEQ ID NO：75(核苷酸)和76(氨基酸)。该分子还含有人IgG1恒定区。

为了生成GA101，如下实施高同源性抗体受体框架搜索，即将小鼠B-Ly1蛋白质序列与一个人种系序列集合比对并选择显示最高序列同一性的人序列。选择来自VBase数据库的序列VH1__10作为重链框架受体序列，且选择VK__2__40序列作为轻链的框架受体。向这两种受体框架上嫁接小鼠重链和轻链可变域的三个CDR。因为框架4区不是种系V基因可变区的一部分，所以个别地进行该位置的比对。为重链选择JH4区，而为轻链选择JK4区。设计的免疫球蛋白结构域的分子建模揭示了CDR以外潜在需要鼠氨基酸残基代替人氨基酸残基的一个部位。重新将鼠氨基酸残基引入人框架中会生成所谓的回复突变。例如，Kabat第27位处的人受体氨基酸残基回复突变成酪氨酸残基。设计人源化抗体变体，或是包括或是省略回复突变。人源化抗体轻链不需要任何回复突变。设计蛋白质序列后，如下详述合成编码这些蛋白质的DNA序列。

为了避免在人受体框架的至关重要氨基酸残基位置处(对于保留好的抗原结合亲和力或抗体功能而言至关重要的)引入回复突变，调查了完整框架区1(FR1)或者框架区1(FR1)和2(FR2)一起是否能用在天然人种系序列中那些重要的位置处早就具有供体残基的人抗体序列或其功能等同物替换。为此目的，将小鼠Bly1序列的VH框架1和2个别地与人种系序列比对。在这里，对于选择受体框架，最高序列同一性是不重要的而且不使用，取而代之，数个至关重要残基的匹配是更为重要的。那些至关重要残基包含残基24、71、和94(Kabat编号方式)，还有那些位于位置27、28、和30(Kabat编号方式)处的残基，它们位于Kabat的CDR1定义之外，但是常常涉及抗原结合。选择IMGT序列VH 315作为合适的一种。设计蛋白质序列之后，如下详述合成编码这些蛋白质的DNA序列。使用这种办法，对轻链或重链都不会得到回复突变，以保留较好水平的抗原结合。

设计人源化抗体V区的氨基酸序列后，生成DNA序列。各框架区的DNA序列数据可见于人种系序列的数据库。CDR区的DNA序列取自相应的鼠cDNA数据。凭借这些序列，实质上装配好了完整DNA序列。具有此DNA序列数据，通过引入沉默突变，在实际序列中引入诊断性限制性位点，创建限制性内切核酸酶的识别位点。为了获得实际的DNA链，实施基因合成，其中自感兴趣基因设计寡核苷酸，使得一系列寡核苷酸衍生自编码链，而另一系列来自非编码链。每种寡核苷酸的3′和5′端(除了行中的第一个和最后一个)总是显示自相对链衍生的两种引物的互补序列。在将这些寡核苷酸放入适合于任何热稳定聚合酶的反应缓冲液并添加Mg²⁺、dNTP和DNA聚合酶时，每种寡核苷酸自其3′端延伸。然后，一种引物新形成的3′端与相对链的下一种引物退火，并在适合于模板依赖性DNA链延长的条件下进一步延伸其序列。将最终的产物克隆入常规载体，用于在大肠杆菌中繁殖。

使用标准分子生物学技术，在上述可变区序列的上游添加人重链和轻链前导序列(用于分泌)，然后分别在人IgG1κ重链和轻链恒定区序列上游连接这些。将所得完整抗体重链和轻链DNA序列亚克隆入哺乳动物表达载体(轻链一种，重链一种)，在MPSV启动子的控制下且在合成polyA位点上游，每种载体携带EBV OriP序列。如下生成抗体，即用哺乳动物抗体重链和轻链表达载体共转染HEK293-EBNA，转染后5-7天收获条件化培养基，并通过蛋白A亲和层析接着阳离子交换层析和最终的大小排阻层析步骤来纯化分泌的抗体以分离纯的单体IgG1抗体。在25mM磷酸钾、125mM氯化钠、100mM甘氨酸溶液pH 6.7中配制抗体。通过与GnT-III糖基转移酶表达载体一起，或与GnT-III表达载体加Golgi甘露糖苷酶II表达载体一起共转染抗体表达载体，生成人源化抗体变体的糖工程改造变体。通过MALDI/TOF-MS来分析附着至抗体Fc区的寡糖。

为了在溶液中自抗体释放寡糖，将40-50μg抗体与2.5mU PNGaseF(Glyko，US.A.)在2mM TRIS缓冲液pH 7.0中以终体积25微升混合，并将混合物于37℃温育3小时。

在添加乙酸至终浓度150mM后，将含有释放的寡糖的酶促消化物于室温再温育3小时，随后流经装填在micro-bio-spin层析柱(BioRad，Switzerland)中的0.6ml阳离子交换树脂(AG50 W-X8树脂，氢形式，100-200目，BioRad，Switzerland)以除去阳离子和蛋白质。将1μl所得样品应用于不锈钢靶盘，并在盘上与1μl sDHB基质混合。sDHB基质是通过在1ml乙醇/10mM氯化钠水溶液1∶1(v/v)中溶解2mg 2，5-二羟基苯甲酸加0.1mg 5-甲氧基水杨酸制备的。将样品风干，施加0.2μl乙醇，并最终让样品再次在空气下重结晶。

用于获得质谱的MALDI-TOF质谱仪是Voyager Elite(PerspectiveBiosystems)。以线性配置运转仪器，加速20kV和延迟80ns。将使用寡糖标准品的外部校准用于离子的质量指派。将来自200次激光射击的光谱求和以获得最终的光谱。

使用基于流式细胞术的测定法对纯化的单体人源化抗体变体测试对RajiB细胞淋巴瘤靶细胞上人CD20的结合。

施加富集CD16和CD56阳性细胞(MACS系统，Miltenyi Biotec GmbH，Bergisch Gladbach/Germany)的负选择，自新鲜分离的外周血单个核细胞(PBMC)分离人NK细胞。通过CD56表达测定的纯度介于88-95％之间。在不含钙和镁离子的PBS中于37℃温育新鲜分离的NK细胞(3×10⁵细胞/ml)20分钟以除去NK细胞结合的IgG。将细胞以10⁶个细胞/孔与PBS，0.1％BSA中不同浓度的抗CD20抗体(0、0.1、0.3、1、3、10μg/ml)一起温育。数次清洗后，通过与1∶200 FITC偶联的F(ab′)₂山羊抗人，F(ab′)₂特异性IgG(JacksonImmunoResearch，West Grove，Pa./USA)和抗人CD56-PE(BD Biosciences，Allschwil/Switzerland)一起温育来检测抗体结合。以10μg/ml的浓度添加抗FcγRIIIA 3G8F(ab′)₂片段(Ancell，Bayport，Minn./USA)以竞争抗体糖变体的结合(3μg/ml)。在FACSCALIBUR^TM仪器(BD Biosciences，Allschwil/Switzerland)上为CD56阳性细胞测定关于结合的抗体变体的荧光强度。通过电穿孔(280V，950μF，0.4cm)用编码FcγRIIIA-Val158α-链和γ-链的表达载体转染CHO细胞。通过添加6μg/ml嘌呤霉素来选择转染子，并对10⁶个细胞使用10μl FITC偶联的抗FcγRIII 3G8单克隆抗体(BD Biosciences，Allschwil/Switzerland)通过FACS分析稳定克隆。与NK细胞结合类似地实施IgG1对表达FcγRIIIA-Va 1158的CHO细胞的结合。

人源化B-Ly1抗体的重要特性在于它是II型抗CD20抗体，如Cragg andGlennie，Blood，103(7)：2738-2743(2004)中所定义的。因此，使用Polyak andDeans，Blood，99(9)：3256-3262(2002)中为此目的描述的测定法，它在结合至CD20后不诱导任何显著的对非离子去污剂自CD20+人序列提取CD20的抗性。依照US 2005/0123546，人源化B-Ly1抗体诱导比C2B8抗体(另一种与利妥昔单抗具有相同序列的抗CD20抗体(参见US 2003/0003097，Reff))要少的对非离子去污剂提取CD20的抗性。如对II型抗CD20抗体所预期的，人源化B-Ly1不具有任何显著的补体介导的溶胞活性。人源化B-Ly1抗体在同型聚集测定法中很有效力。在此测定法中，将CD20阳性人细胞Daudi细胞在哺乳动物细胞培养箱中在5％CO₂气氛中在细胞培养基中于37℃温育生长达24小时，抗体浓度为1μg/ml和平行的浓度为5μg/ml。聚集物据报告比那些通过添加C2B8对照抗体诱导的要大。另外，而且与II型抗CD20抗体一致，在使用C2B8嵌合IgG1抗体的相同条件下，相对于对照，人源化B-Ly1抗体据报告在CD20阳性人细胞与其一起温育时诱导更高水平的凋亡。

人源化抗体的糖工程改造抗体通过在哺乳动物细胞中与抗体基因一起共表达GnTIII糖基转移酶来生成。这导致附着至抗体Fc区的非岩藻糖基化寡糖(包括等分无岩藻糖基化寡糖)的分数升高，如WO 2004/065540(图17-19)中所记载的。相对于非糖工程改造的抗体和相对于C2B8抗体，糖工程改造抗体具有显著更高水平的对人FcγRIII受体的结合和ADCC活性。人源化B-Ly1抗体在全血测定法中诱导人B细胞消减方面也比对照C2B8抗体更有效力。这对于非糖工程改造的B-Ly1抗体和对于它的糖工程改造型式都是如此。糖工程改造的抗体在全血测定法中消减B细胞方面比C2B8对照抗CD20抗体效力高大约1000倍。

c恒定区

将仅仅通过可变区序列鉴定的本文中抗CD20抗体的轻链和重链可变区与记载此类抗体且通过述及收入本文的上述专利申请任一中披露的恒定区组合。典型的是，恒定区由轻链和重链恒定区组成，而且抗体是具有Fc的完整抗体。这些序列优选连接至前导序列，例如US 2005/0025764中文中给出的前导。根据具体的抗体，可采用任何人恒定区同种异型链。例如，AME 33可含有US 2005/0025764图10和11显示的轻链和重链恒定区(本文中SEQ IDNO：41和42中有下划线的残基)，除了Fc区中的氨基酸替代。具体而言，US2005/0025764图11显示的重链恒定区可含有D280H突变或K290S突变(图11A以粗体显示了第280和290位，没有突变)。US 2005/0025764图11B显示了粗体和下划线的“GAC”。此“GAC”可变成“CAT”以编码D280H突变。

V.药物配制剂

依照本发明使用的抗体的治疗用配制剂通过将具有期望纯度的抗体与任选的药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，以冻干配制剂或水溶液的形式制备供贮存。关于配制剂的一般信息参见例如Gilman et al.，(编)(1990)，The Pharmacological Bases of Therapeutics，第8版，Pergamon Press；A.Gennaro(编)，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，(1990)，MackPublishing Co.，Eastori，Pennsylvania；Avis et al.，(编)(1993)PharmaceuticalDosage Forms：Parenteral Medications Dekker，New York；Lieberman et al.，(编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets Dekker，New York；及Liebermanet al.，(编)(1990)，Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems Dekker，New York，Kenneth A.Walters(编)(2002)Dermatological和TransdermalFormulations(Drugs和Pharmaceutical Sciences)，Vol.119，Marcel Dekker。

可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

例示性的抗CD20抗体配制剂记载于上文引用的、记载本文中抗体的专利申请中，包括本文中背景部分中引用的那些，通过述及将它们所有的公开内容明确收入本文。

适于皮下施用的冻干配制剂记载于例如US 6,267,958(Andya et al.)。此类冻干配制剂可以用合适的稀释剂重建至高蛋白质浓度，重建的配制剂可皮下施用于本文中待治疗的哺乳动物。

还涵盖抗体的结晶形式。参见例如US 2002/0136719A1(Shenoy et al.)。

本文中的配制剂还可含有超过一种活性化合物(上文定义的第二治疗药物)，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。此类治疗药物的类型和有效量取决于例如配制剂中存在的抗CD20抗体的量和类型，以及受试者的临床参数。本文中记录了优选的此类第二治疗药物。

活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如《Remington’sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编(1980)。

本文中可应用的持续释放制剂的例子包括含有所述抗CD20抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(US 3,773,919)、L-谷氨酸与L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTJ^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。

用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。

VI.用抗体治疗

可以以任何剂量来施用本文中的抗CD20抗体，只要它有效治疗患者。根据诸如所采用的具体抗CD20抗体、关于所采用的抗CD20抗体的文献中发表的在先临床经验、患者的特征和临床史、RA和关节损伤的类型和严重性、正在给予的其它药物、和预测的任何副作用等因素，具有本领域普通技术的内科医师能容易地确定所需要的药物组合物的有效量和开出这样的处方。例如，内科医师可以以多剂抗CD20抗体开始，其在药物组合物中以低于实现期望的治疗效果所需要的水平的水平使用，并逐渐提高剂量，直至实现期望的效果。抗CD20抗体的给定剂量或治疗方案的功效可通过例如使用标准RA功效度量评估患者中的体征和症状和/或评估对结构损伤或放射照相进展的抑制来测定。

剂量可以根据体重决定或者是固定剂量，优选固定剂量，不管体重。按体重计的剂量的一个例子是375mg/m²，每周一次，共4剂。作为一般提议，胃肠外施用的抗体的每剂有效量会在约20mg至约5000mg的范围里，通过一个或多个剂量来实现，这可以换算成按体重计的剂量。优选的是，总剂量介于约50和4000mg之间，优选约75和3000mg之间，更优选约100和2000mg之间，更优选约100和1000mg之间，更优选约150和1000mg之间，更优选约200和1000mg之间，包括约200、300、400、500、600、700、800、900、1000mg、和2000mg的剂量。这些剂量可以作为单剂或作为多剂(例如2-4剂)给予。此类剂量可通过例如输注来进行。更优选的是，作为单剂或作为两剂以介于约200和1000mg之间的剂量施用本文中的抗CD20抗体(优选所述剂量是输注)。在一个更优选的实施方案中，以约200mg×1或2剂、300mg×1或2剂、400mg×1或2剂、500mg×1或2剂、600mg×1或2剂、700mg×1或2剂、800mg×1或2剂、900mg×1或2剂、或1000mg×1或2剂施用抗CD20抗体。如果以2剂施用，那么在一个实施方案中在治疗开始时，在第1天和第15天给予药物，优选静脉内。

优选的是，如果以多剂形式给予，剂量给药的频率是约一个月的一段时间内约2-4剂、或约2-3周的一段时间内施用约2-3剂。

然而，如上面指出的，对于抗体的这些建议量要加以诸多治疗上的考量。在选择合适剂量和进度安排中，关键的因素是所得的结果，如上文提示的。例如，为治疗正在发作的和急性的RA或关节损伤，开始可能需要相对较高的剂量。为得到最有效的结果，尽可能接近RA或关节损伤的首次体征、诊断、表现或出现，或者在RA或关节损伤的消退过程中施用抗体。

在本文中的所有方法中，RA优选是早期或初期RA。本文中的受试者或患者可以是类风湿因子(RF)或抗CCP阳性或阴性的。这些自身抗体是强相关的，但是可代表RA的不同临床子集。优选的是，受试者或患者是这两种所述自身抗体之一或二者阳性的，最优选二者阳性的。

在本文所列所有创造性方法中，抗CD20抗体可以是未偶联的，诸如裸抗体，或者可以为了进一步的效力(例如为了延长半衰期)而偶联另一分子。

在本文中所有方法的另一个实施方案中，本文中的抗CD20抗体是施用于受试者以治疗RA或关节损伤的唯一药物。

在一个备选的方面，可以与本文中的抗体一起施用第二药物，如上所述。联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药物配制剂的共施用，以及任一次序的序贯施用，其中优选有一段时间两种(或多种)活性剂(药物)同时发挥其生物学活性。

第二药物包括例如免疫抑制剂、除第一药物以外的针对CD20的抗体(即所述抗CD20抗体是第一药物)、细胞因子拮抗剂诸如细胞因子拮抗剂、整联蛋白拮抗剂(例如抗体)、皮质类固醇、或其任何组合。此类第二药物的类型取决于多种因素，包括RA和/或关节损伤的类型、RA和/或关节损伤的严重性、受试者的状况和年龄、所采用的第一药物的类型和剂量、等等。

此类额外药物的例子包括免疫抑制剂(例如米托蒽醌(

)、MTX、环磷酰胺、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、来氟米特、和硫唑嘌呤)，静脉内免疫球蛋白(γ球蛋白)，淋巴细胞消减疗法(例如米托蒽醌、环磷酰胺、CAMPATH^TM抗体、抗CD4、克拉屈滨(cladribine)、利妥昔单抗、2H7抗体、有至少两个结构域的多肽构建体(包含受到自身反应性B细胞的Ig受体特异性识别的脱免疫(de-immunized)、自身反应性抗原或其片段)(WO 2003/68822)、全身照射、骨髓移植)，整联蛋白拮抗剂或抗体(例如LFA-1抗体诸如可以从Genentech购买的efalizumab/

或α4整联蛋白抗体诸如可以从Biogen购买的natalizumab/或上文所述其它抗体)，治疗RA和/或关节损伤继发的或相关的症状的药剂诸如本文中所记载的那些，类固醇诸如皮质类固醇(例如泼尼松龙、甲泼尼龙诸如SOLU-MEDROL^TM注射用甲泼尼龙琥珀酸钠、泼尼松诸如低剂量泼尼松、地塞米松、或糖皮质激素，例如经由关节注射，包括系统性皮质类固醇疗法)，非淋巴细胞消减免疫抑制疗法(例如MMF或环孢霉素)，TNF-α抑制剂诸如TNF-α的抗体，DMARD，NSAID，血浆去除术或血浆交换，甲氧苄啶-磺胺甲

唑(BACTRIM^TM，SEPTRA^TM)，霉酚酸酯，H2-阻断剂或质子泵抑制剂(在利用潜在溃疡原性的免疫抑制疗法期间)，左旋甲状腺素，环孢菌素A(例如

)，促生长素抑制素类似物，DMARD或NSAID，细胞因子拮抗剂诸如抗体，抗代谢物，免疫抑制剂，康复性手术，放射碘，甲状腺切除术，抗IL-6受体拮抗剂/抗体(例如ACTEMRA^TM(tocilizumab))，或其它B细胞拮抗剂诸如BR3-Fc、TACI-Ig、抗BR3抗体、抗CD40受体或抗CD40配体(CD154)、阻断CD40-CD40配体的药剂、依帕珠单抗(epratuzumab)(抗CD22抗体)、lumiliximab(抗CD23抗体)、或除利妥昔单抗或本文中所使用的抗CD20抗体诸如2H7抗体以外的针对人CD20的抗体。

优选的此类药物包括γ球蛋白、整联蛋白拮抗剂、抗CD4、克拉屈滨、甲氧苄啶-磺胺甲

唑、H2阻断剂、质子泵抑制剂、环孢霉素、TNF-α抑制剂、DMARD、NSAID(用于治疗例如肌肉骨胳的症状)、左旋甲状腺素、细胞因子拮抗剂(包括细胞因子受体拮抗剂)、抗代谢物、免疫抑制剂诸如MTX或皮质类固醇、二碳磷酸盐化合物(bisphosphonate)、和B细胞表面标志物的另一种拮抗剂诸如例如针对CD20的小分子、CD22抗体、BR3抗体、lumiliximab(抗CD23抗体)、BR3-Fc、或TACI-Ig。

更优选的此类药物是免疫抑制剂诸如MTX或皮质类固醇、DMARD、除第一药物以外的针对CD20的不同抗体、整联蛋白拮抗剂、NSAID、细胞因子拮抗剂、二碳磷酸盐化合物、或其组合。

在一个特别优选的实施方案中，第二药物是DMARD，其优选选自金诺芬、氯喹、D-青霉胺、可注射的金、口服的金、羟氯喹、柳氮磺吡啶、myocrisin和MTX。

在另一个此类实施方案中，第二药物是NSAID，其优选选自芬布芬、萘普生、双氯芬酸、依托度酸和吲哚美辛、阿司匹林和布洛芬。

在又一个此类实施方案中，第二药物是免疫抑制剂，其优选选自依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗、来氟米特、阿那白滞素、硫唑嘌呤、MTX、和环磷酰胺。

在其它优选的实施方案中，第二药物选自抗α4，依那西普、英夫利昔单抗、依那西普、阿达木单抗、kinaret、efalizumab、OPG、RANK-Fc、抗RANKL、帕米膦酸盐、阿伦膦酸盐、actonel、唑来膦酸盐、利妥昔单抗、2H7抗体、氯膦酸盐、MTX、azulfidine、羟氯喹、多西环素、来氟米特、SSZ、泼尼松龙、白介素-1受体拮抗剂、泼尼松、和甲泼尼龙。

在进一步优选的实施方案中，第二药物选自MTX、英夫利昔单抗、英夫利昔单抗与MTX的组合、依那西普、皮质类固醇、环孢菌素A、硫唑嘌呤、金诺芬、羟氯喹(HCQ)、泼尼松龙与MTX和SSZ的组合、MTX与SSZ和HCQ的组合、环磷酰胺与硫唑嘌呤和HCQ的组合、阿达木单抗与MTX的组合。如果第二药物是皮质类固醇，优选的是，它是泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、氢化可的松、或地塞米松。并且，优选的是，皮质类固醇的施用量低于不给用所述抗CD20抗体治疗的受试者施用皮质类固醇时的用量。最优选的是，第二药物是MTX。

所有这些第二药物可以彼此组合或者单独与第一药物一起使用，因此表述“第二药物”在用于本文时不意味着它是第一药物以外的唯一药物。如此，第二药物不必是一种药物，而是可以包含超过一种上述药物。

本文所列的这些第二药物通常以与上文所用相同的剂量和施用途径或者迄今所用剂量的大约1-99％使用。如果确实使用此类第二药物，那么优选它们以低于不存在第一药物时的量使用，尤其是在第一药物的初始服药之后的后续给药中，以便消除或降低由此引起的副作用。

对于本文所述复治方法，其中第二药物以有效量与抗体暴露(exposure)一起施用，它可以与任何暴露一起施用，例如，只与一次暴露或者与超过一次暴露一起施用。在一个实施方案中，第二药物与初始暴露一起施用。在另一个实施方案中，第二药物与初始和第二暴露一起施用。在又一个实施方案中，第二药物与所有暴露一起施用。优选的是，在初始暴露(诸如类固醇的)之后，降低或清除此类第二药物的量以减少受试者对具有副作用的药剂诸如泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、和环磷酰胺的暴露。

第二药物的联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药用配制剂的共施用(同时施用)，以及任一次序的序贯施用，其中优选有一段时间两种(或多种)活性剂(药物)同时发挥其生物学活性。

本文中的抗CD20抗体以任何合适手段施用，包括胃肠外、表面、腹膜内、肺内、鼻内和/或损伤内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内(i.v.)、动脉内、腹膜内或皮下(s.c.)施用。还涵盖鞘内施用(参见例如US 2002/0009444，Grillo-Lopez，关于抗CD20抗体的鞘内投递)。另外，还可合适地通过脉冲输注来施用抗CD20抗体，例如用剂量逐渐减少的抗CD20抗体。优选的是，通过i.v.或s.c.来给予剂量给药。是i.v.还是s.c.施用会取决于许多因素，包括所采用的抗CD20抗体的类型、患者的临床史、具体的剂量给药和进度安排、等。在一些情况中，可能优选通过s.c.而非i.v.施用来给予抗体。

如果提供多次抗CD20抗体暴露，那么每次暴露可以使用相同的或不同的施用手段来提供。在一个实施方案中，每次暴露通过静脉内施用。在另一个实施方案中，每次暴露通过皮下施用给予。在又一个实施方案中，所述暴露通过静脉内和皮下施用二者给予。

在一个实施方案中，以缓慢的i.v.输注而非i.v.推注(i.v.push)或快速注射(bolus)来施用抗CD20抗体。例如，在抗CD20抗体的任何输注之前约30分钟施用类固醇诸如泼尼松龙或甲泼尼龙(例如静脉内约80-120毫克，更具体静脉内约100毫克)。所述抗CD20抗体是通过例如专用线路输注的。

对于多剂抗CD20抗体暴露的初始剂，或者对于所述暴露只包括一剂的单剂，此类输注优选以约50毫克/小时的速率开始。这可逐步提高，例如，每约30分钟速率提高约50毫克/小时直至约400毫克/小时的最大值。然而，如果受试者正发生输注相关反应，那么输注速率优选降低至例如当前速率的一半，例如从100毫克/小时降低至50毫克/小时。优选的是，抗CD20抗体此类剂(例如约1000毫克总剂量)的输注用约255分钟(4小时15分钟)完成。优选的是，受试者在开始输注前大约30至60分钟通过口接受醋氨酚/对乙酰氨基酚(例如约1克)和盐酸苯海拉明(diphenhydramine HCl)(例如约50毫克或相似药剂的等效剂量)的预防性处理。

如果给予超过一次的抗CD20抗体输注(剂)以完成整个暴露，那么优选在此输注实施方案中以高于初始输注的速率开始第二或随后的抗CD20抗体输注，例如约100毫克/小时。此速率可以逐步提高，例如每约30分钟速率提高约100毫克/小时直至约400毫克/小时的最大值。发生输注相关反应的受试者优选将输注速率降低至该速率的一半，例如从100毫克/小时降低至50毫克/小时。优选的是，此类第二剂或随后剂的抗CD20抗体(例如约1000毫克总剂量)的输注用约195分钟(3小时15分钟)完成。

除了通过上文所述传统路径将本文中的抗CD20抗体之一施用于患者，本发明涵盖通过基因疗法进行的施用。编码抗体的核酸的此类施用涵盖在表述“施用有效量的抗体”中。可参见例如WO 1996/07321，其关注使用基因疗法来产生胞内抗体。

主要有两种方法使核酸(任选包含在载体中)进入患者的细胞，即体内(in vivo)和回体(ex vivo)。对于体内投递，通常在需要抗体的部位将核酸直接注射入患者。对于回体治疗，采集患者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并将经过修饰的细胞直接施用于患者，或是例如装入多孔膜再植入患者(参见例如US 4,892,538和5,283,187)。有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移至目的宿主的体外培养的细胞还是体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移入哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。

目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(例如，可用于脂质介导的基因转移的脂质有DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行转染。在有些情况中希望与对靶细胞特异性的药剂一起提供核酸来源，诸如对靶细胞上的细胞表面膜蛋白特异性的抗体、针对靶细胞上受体的配体等。若采用脂质体，则可以使用与胞吞作用有关的细胞表面膜蛋白结合的蛋白质靶向和/或促进摄取，例如对特定细胞类型有向性的衣壳蛋白或其片段、针对在循环中经历内在化的蛋白质的抗体、和靶向胞内定位并延长胞内半衰期的蛋白质。受体介导的胞吞作用的技术记载于例如Wu et al.，J.Biol.Chem.，262：4429-4432(1987)和Wagneret al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：3410-3414(1990)。基因标记和基因治疗方案记载于例如Anderson et al.，Science，256：808-813(1992)和WO 1993/25673。

一旦鉴定出对抗CD20抗体治疗最有响应的患者群，用本文中的抗体单独地或与其它药物联合地进行处理导致对RA或关节损伤(包括其体征或症状)的改善。例如，此类治疗可导致ACR测量相对于只用第二药物(例如免疫抑制剂，诸如MTX)治疗的患者的改善，和/或可导致通过ACR测定得出的客观响应(部分的或完全的，优选完全的)。此外，用本文中的抗体与至少一种第二药物的组合进行的治疗优选导致对患者产生累加的、更优选协同的(或大于累加的)治疗受益。优选的是，在此组合方法中，第二药物的至少一次施用与本文中的抗体的至少一次施用之间的时间安排是大约一个月或更短、更优选大约两周或更短。

就本文中的方法而言，如上所述确定治疗的成功。临床改善优选是通过评估触痛的或肿胀的关节数目、进行患者的整体临床评估、评估红细胞沉降率、评估C-反应性蛋白质水平的量、或使用疾病活动(疾病响应)综合测量诸如DAS-28、ACR-20、-50、或-70得分而确定的。

对于本文中的治疗方法，在施用步骤之后包括检验受试者对治疗的响应的任选步骤，用于确定该响应水平对于治疗RA或关节损伤是否有效。例如，任选包括检验给药之后的成像(放射照相术和/或MRI)得分并与给药以前获得的基线成像结果比较的步骤，用于通过测量是否发生变化和变化了多少来确定治疗是否有效。此检验可以在给药之后以多种有安排的或未安排的时间间隔重复，用于确定任何部分或完全消退的维持。

或者，本文中的方法包括在给药前检验受试者的步骤，用于了解是否存在RA或关节损伤的一种或多种生物标志物或症状，如上文所列。在另一种方法中，可以包括在给受试者施用抗体之前检查受试者病历的步骤，如上文所详述的，例如用于排除感染或恶性肿瘤作为受试者疾患的主要原因，例如主要原因的情况。优选的是，关节损伤是原发性的(例如首要疾病)，而且不是继发性的，诸如感染或恶性肿瘤继发的，不管是实体瘤或液体瘤。

在本文中所有方法的又一个实施方案中，受试者以前从未施用一种或多种除利妥昔单抗以外的药物诸如抗TNF-α抑制剂例如抗TNF-α或抗TNF-α受体抑制剂(用于治疗RA)或者免疫抑制剂(用于治疗RA或关节损伤)，和/或以前从未用除利妥昔单抗以外的针对B细胞表面标志的拮抗剂治疗过(例如以前从未用2H7抗体或CD22或BR3抗体治疗过)。

在此方面的一个具体实施方案中，受试者以前从未用以下药剂治疗过：整联蛋白拮抗剂诸如抗α4整联蛋白抗体或共刺激调控物、免疫抑制剂、细胞因子拮抗剂、抗炎剂诸如NSAID、MTX以外的DMARD，除了硫唑嘌呤和/或来氟米特、细胞消减疗法，包括调查中的药剂(例如CAMPATH、抗CD4、抗CD5、抗CD3、抗CD19、抗CD11a、抗CD22、或BLys/BAFF)、活的/减毒的疫苗(在基线前28天内)、或皮质类固醇诸如关节内的或胃肠外的糖皮质激素(在基线前4周内)。

更优选的是，所述受试者先前从未用免疫抑制剂、细胞因子拮抗剂、整联蛋白拮抗剂、皮质类固醇、镇痛药、DMARD、或NSAID治疗过。仍更优选的是，所述受试者从未用免疫抑制剂、细胞因子拮抗剂、整联蛋白拮抗剂、皮质类固醇、DMARD、或NSAID治疗过。最优选的是，在本发明的所有方法中，在施用第一剂抗CD20抗体之前，所述受试者先前从未用免疫抑制剂治疗过。

或者，在利妥昔单抗之外所述受试者或患者先前曾经还施用其它药物，而且在一个实施方案中，所述受试者或患者对用于治疗RA或关节损伤的此类药物没有响应。受试者对其可没有响应的此类药物(除利妥昔单抗以外)包括例如化疗剂、免疫抑制剂、细胞因子拮抗剂、整联蛋白拮抗剂、皮质类固醇、镇痛药、或除针对CD20的抗体以外的B细胞表面标志拮抗剂。优选的是，此类针对B细胞表面标志的拮抗剂不是抗体或免疫粘附素，而且是例如小分子抑制剂、或反义寡核苷酸、或拮抗性肽。更具体的说，受试者对其可没有响应的药物包括免疫抑制剂诸如MTX、DMARD、或TNF-α抑制剂。

在上文鉴定的方法的特别优选的实施方案中，受试者展现出对一种或多种抗TNF-α抑制剂响应不足，和/或与抗CD20抗体一起对受试者施用MTX。

在另一个实施方案中，受试者或患者对除利妥昔单抗以外的、用于RA或关节损伤的疗法有响应。

在另一个优选的方面，在基线或开始治疗之前给受试者施用MTX。更优选的是，MTX是以大约10-25毫克/周的剂量施用的。并且，优选的是，在基线之前施用MTX至少大约12周，仍更优选的是，在基线之前的最后4周施用稳定剂量的MTX。在其它实施方案中，MTX是口服或胃肠外施用的。

在还有一个方面，除了对利妥昔单抗不响应，在接受上述任何方法的治疗之前，包括在本文中抗CD20抗体的初始暴露或后续暴露之后，受试者可能已经具有RA或关节损伤复发或者遭受器官损伤诸如肾损伤。然而，优选的是，用除利妥昔单抗以外的任何药物，受试者没有RA或关节损伤复发，更优选的是，至少在初始治疗之前还没有这样的复发。

在又一个实施方案中，受试者没有恶性肿瘤，包括B细胞恶性肿瘤、实体瘤、血液学恶性肿瘤、或原位癌(除了已经切除并痊愈的皮肤的基细胞和鳞状细胞癌)。

在还有一个实施方案中，受试者没有RA以外的风湿性自身免疫病，或者RA继发的重大系统性病症(包括但不限于血管炎、肺纤维化或费耳提氏综合征)。在另一个实施方案中，受试者没有RA功能性状态ACR分类所定义的功能性IV级。在又一个实施方案中，受试者没有RA以外的炎性关节病(包括但不限于痛风、反应性关节炎、银屑病关节炎、血清阴性的脊椎关节病、莱姆病)、或其它系统性自身免疫性病症(包括但不限于SLE、炎性肠病、硬皮病、炎性肌病、混合性结缔组织病、或任何重叠综合征)。在另一个实施方案中，受试者在16岁以前没有JIA、JRA、和/或RA。在另一个实施方案中，受试者没有重大的和/或不受控制的心或肺病(包括梗阻性肺病)、或重大的伴发病，包括但不限于神经系统、肾、肝、内分泌或胃肠病症，也没有原发性或继发性免疫缺陷(历史或当前活动性的)，包括HIV感染的已知历史。在另一个方面，受试者没有可影响任何疗效评估的任何神经学的(先天性的或获得性的)、血管的或系统性的病症，特别是关节痛和肿胀(例如帕金森氏病、大脑性瘫痪、糖尿病性神经病)。在又一个实施方案中，受试者没有MS。在又一个实施方案中，受试者没有狼疮或斯耶格伦氏综合征。在又一个实施方案中，受试者没有RA以外的自身免疫病。在本发明的又一个方面，受试者中的任何关节损伤与自身免疫病或RA以外的自身免疫病无关，或者与发生自身免疫病或RA以外的自身免疫病的风险无关。

在另一个实施方案中，受试者确实有继发性斯耶格伦氏综合征或继发性限制性皮肤血管炎，但是没有它们的原发性形式。

VII.制品

本文中提供了包含可用于治疗RA或关节损伤的材料的制品。所述制品包括容器和容器上或伴随容器的标签或包装插页。在此方面，包装插页在容器上或伴随容器。合适的容器包括例如瓶(bottles)、管形瓶(vials)、注射器(syringes)、等。所述容器可以用多种材料诸如玻璃或塑料制成。所述容器容纳或装有有效治疗RA或关节损伤的抗CD20抗体，并可以具有无菌出入口(例如该容器可以是具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中的至少一种活性剂是抗CD20抗体。标签或包装插页指明该组合物用于治疗适于治疗的受试者中的关节损伤或RA，及关于所提供抗体和任何其它药物的给药量和间隔的具体指示。

所述制品可以进一步包括第二容器，该容器装有药学可接受的稀释缓冲剂，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液、和右旋糖溶液。制品还可包括从商业和使用者观点看有需要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、和注射器。

本发明的试剂盒和制品还包括信息，例如以包装插页或标签的形式，指示所述组合物用于治疗RA或关节损伤，其中患者对利妥昔单抗治疗不响应。所述插页或标记物可采取任何形式，诸如纸或电子介质，例如磁记录介质(例如软盘)或CD-ROM。所述标签或插页还可包括关于所述试剂盒或制品中药物组合物和剂量形式的其它信息。

一般而言，此类信息帮助患者和医师高效且安全地使用所包装的药物组合物和剂量形式。例如，所述插页中可提供关于抗体的下列信息：药动学、药效学、临床研究、功效参数、适应症和用法、禁忌症、警告、预防、不良反应、过剂量、正确剂量和施用、如何补给、正确贮存条件、参考文献和专利信息。

本发明的一个具体实施方案是一种制品，包括包装在一起的药物组合物和标签，所述药物组合物包含本文中的抗CD20抗体之一和药学可接受载体，所述标签陈述了所述药物组合物指示用于治疗对利妥昔单抗治疗不响应的RA患者。相同的标签可应用于治疗关节损伤患者。

在一个优选的实施方案中，本文中的制品进一步包括装有第二药物的容器，其中抗体是第一药物，且该制品进一步在包装插页上包含用有效量的第二药物治疗患者的说明书。第二药物可以是任何上文列出的那些药物，例示性的第二药物就是上文列出的那些，包括免疫抑制剂、皮质类固醇、DMARD、除第一药物以外的其它针对CD20的抗体、整联蛋白拮抗剂、NSAID、细胞因子拮抗剂、二膦酸盐、或其组合，更优选DMARD、NSAID、细胞因子拮抗剂、整联蛋白拮抗剂、或免疫抑制剂。最优选的是，所述第二药物是MTX。

在另一个方面，本发明提供了制造本文中抗CD20抗体或其药物组合物的方法，包括在包装中组合抗体或药物组合物与标签，所述标签陈述了所述抗CD20抗体或药物组合物指示用于治疗对利妥昔单抗不响应的RA或关节损伤患者。

VIII.做广告的方法

本文中的发明还涵盖一种用于为本文中的抗CD20抗体之一的药学可接受组合物做广告的方法，其包括给目标受众宣传有效量的所述组合物用于治疗患有RA或关节损伤的患者的用途，所述患者对利妥昔单抗不响应。

做广告为经由非个人媒体进行的、通常付费的通讯，其中发起人受到鉴别且信息受到控制。为本文目的的做广告包括宣传(publicity)、公共关系(public relations)、产品布置(product placement)、赞助(sponsorship)、保险(underwriting)、和促销(sales promotion)。该术语还包括出现在任何印刷传播媒体中的商业信息公告，其设计用于引起大众的兴趣以劝说、通知、宣传、激发、或以其它方式改变行为，向购买、支持、或认可本文中发明的有利方式发展。

本文中治疗方法的广告和宣传可通过任何手段实现。用于传递这些信息的广告媒体的例子包括电视、电台、电影、杂志、报纸、因特网、和告示板，包括商业性的，即出现在广播媒体中的信息。广告还包括那些在食品货车座位上、机场通道墙壁上、和公共汽车侧面上的广告、或电话等候信息或店内PA系统中听到的广告、或可放置视觉或听觉通讯的任何地方的广告。宣传或做广告手段的更特定的例子包括电视、电台、电影、因特网(诸如网络传播和网络研讨会(webinar))、意图到达同步用户的交互式计算机网络、固定的或电子的告示板和其它公共标牌、海报、传统的或电子的文献(诸如杂志和报纸)、其它媒体渠道、讲座或个体接触，例如通过电子邮件、电话、即时信息、邮寄、快递、大众(mass)、或载体邮件(carrier mail)、亲自访问等进行。

所使用的做广告的类型会取决于许多因素，例如待传达的目标受众的性质，例如医院、保险公司、诊所、医生、护士、和患者，以及成本考虑和管理药物和诊断剂做广告的相关管辖权法律和条例。可根据由服务相互作用和/或其它数据(诸如用户人口统计状况和地理学定位)限定的用户表征使做广告个性化或用户化。

本领域已知的许多备选实验方法可以在本发明的实施中成功替代本文中具体记载的实验方法，如例如与本发明有关的技术领域中可得到的手册、教科书和网站中记载的(例如，Using Antibodies，A Laboratory Manual，Harlow，E.和Lane，D.，编(Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1999)；Roeet.al.，DNA Isolation和Sequencing(Essential Techniques Series)(John Wiley&Sons，1996)；Methods in Enzymology：Chimeric Genes和Proteins，Abelson et al.，编(Academic Press，2000)；Molecular Cloning：a Laboratory Manual，第3版，Sambrook和MacCallum著，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，2001)；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel et al.，编(John Wiley&Sons，1987)及定期更新版；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis etal.，编，1994)；Current Protocols in Protein Science，Coligan，编(John Wiley&Sons，2003)；及Methods in Enzymology：Guide to Protein Purification，Vol.182，Deutscher，编(Academic Press，Inc.，1990))。

以下非限制性实施例例示了本发明的进一步详情。通过述及明确将本说明书中所有引文的公开内容收入本文。

实施例

实施例1：利妥昔单抗不应性RA的治疗

具有活动性RA、对利妥昔单抗响应不足的患者用另一种抗CD20抗体来治疗，其中此抗CD20抗体是ofatumumab、veltuzumab、具有SEQ ID NO：11的免疫药物(即TRU-015)、CD20结合抗体(即AME 33、AME 133、或AME133v)、或GA101。

依照此实施例的疗法的候选人包括那些由于毒性或效能不足，对先前的或当前的利妥昔单抗处理经历过响应不足的。在此先前的或当前的处理中，给予患者1或2剂利妥昔单抗，每剂1g；如果是2剂，相隔2周给予。

患者可在筛选和随机化时有肿胀关节计数(swollen joint count，SJC)＞8(关节计数66)及触痛关节计数(tender joint count，TJC)＞8(关节计数68)；或是C反应性蛋白质(C-reactive protein，CRP)＞1.5mg/dl(15mg/L)或是红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)＞28mm/h；和/或根据中央阅读部位的测定(可考虑手、腕或足的任何关节，除了手的远端指间关节(distalinterphalangeal joint，DIP))，有至少一个关节有可归于RA的明确侵蚀的放射照相术证据。

使用选自下组的剂量用ofatumumab、veltuzumab、TRU-015、AME 33、AME 133、AME 133v、或GA101处理患者：100mg×1-4、200mg×1-4、300×1-4、400mg×1-4、500mg×1-4、600mg×1-4、700mg×1-4、800mg×1-4、900mg×1-4、1000mg×1-4、或2000mg×1-4。在一个月的时间内相隔1或2周给予多剂。

患者还可接受伴随的MTX(10-25mg/周，口服(p.o.)或胃肠外)以及皮质类固醇方案，其包括抗CD20抗体输注前30分钟甲泼尼龙100mg i.v.及泼尼松第2-7天60mg p.o.、第8-14天30mg p.o.、到第16天回到基线剂量。患者还可接受叶酸(5mg/周)，或是作为单剂或是作为多个日分剂(divided daily doses)来给予。患者任选在整个治疗期继续接受任何背景皮质类固醇(＜10mg/d泼尼松或等同物)。患者还可接受利妥昔单抗(例如利妥昔单抗1g×1-2剂(如果是2剂，隔周))及抗CD20抗体。

主要终点(primary endpoint)是使用Cochran-Mantel-Haenszel(CMH)测验(其用于比较组差异，关于RF和区域进行了调整)，在第24周具有ACR20响应的患者的比例。

潜在的次要终点(secondary endpoint)包括：

1.第24周时具有ACR50和70响应的患者的比例。这些可以如关于主要终点所规定的那样来分析。

2.从筛选到第24周的疾病活动得分(disease activity score，DAS)的变化。这些可以使用ANOVA模型来评估，其中基线DAS、RF、和治疗作为该模型中的项。

3.第24周时的分类DAS响应者(EULAR响应)。这些可以使用为RF进行了调整的CMH测验来评估。

4.自筛选起的ACR核心集(core set)(SJC、TJC、患者的和医师的整体评估、健康评估问卷(HAQ)、疼痛、CRP、和ESR)变化。可以为这些参数报告描述性统计。

5.自筛选起的SF-36变化。可以为8个领域得分(domain score)及精神和躯体分量得分(mental and physical component score)报告描述性统计。另外，精神和躯体分量得分可进行进一步分类和分析。

6.改良Sharp放射照相得分、侵蚀得分、和关节腔变窄得分的变化。在适当时，这些可以使用连续的或分类的方法学来分析。

探索性的终点和分析：

在适当时，使用二元或连续重复测量模型评估到第8周、第12周、第16周、第20周、第24周和之后的ACR(20/50/70和ACR n)和DAS响应变化。在第24周和之后评估探索性放射照相分析，包括没有侵蚀进展的患者的比例。

描述性分析其它探索性终点(例如完全临床响应和无疾病时期)，作为延长的观察期的一部分。用描述性统计分析相对于FACIT-F疲劳筛选的变化。

依据本文所述任何一项或多项终点，如上文详述用ofatumumab、veltuzumab、TRU-015、AME 33、AME 133、AME 133v、或GA101处理的如上所述对利妥昔单抗疗法响应不足的RA患者展现有益的临床响应。

Claims (71)

1.一种治疗对利妥昔单抗不响应的类风湿性关节炎(RA)患者的方法，包括以有效治疗RA的量对患者施用抗CD20抗体，其中该抗CD20抗体是(1)包含SEQ ID NO：2中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：4中或SEQ IDNO：5中重链可变区氨基酸序列的ofatumumab；(2)包含SEQ ID NO：7中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：8中或SEQ ID NO：9中重链可变区氨基酸序列的veltuzumab；(3)包含SEQ ID NO：11的免疫药物；(4)包含SEQID NO：13中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：15中重链可变区氨基酸序列、或包含SEQ ID NO：17中轻链可变区氨基酸序列和SEQ IDNO：18中重链可变区氨基酸序列、或包含SEQ ID NO：19的CD20结合抗体；或(5)其Fc区中有等分无岩藻糖基化碳水化合物且包含SEQ IDNO：21中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：23中重链可变区氨基酸序列的人源化II型抗CD20IgG1抗体。

2.权利要求1的方法，其中所述抗CD20抗体是ofatumumab。

3.权利要求2的方法，其中所述ofatumumab包含SEQ ID NO：4中重链可变区氨基酸序列。

4.权利要求2的方法，其中所述ofatumumab包含SEQ ID NO：5中重链可变区氨基酸序列。

5.权利要求1的方法，其中所述抗CD20抗体是veltuzumab。

6.权利要求5的方法，其中所述veltuzumab包含SEQ ID NO：8中重链可变区氨基酸序列。

7.权利要求5的方法，其中所述veltuzumab包含SEQ ID NO：9中重链可变区氨基酸序列。

8.权利要求1的方法，其中所述抗CD20抗体是免疫药物。

9.权利要求1的方法，其中所述抗CD20抗体是CD20结合抗体。

10.权利要求9的方法，其中所述CD20结合抗体包含SEQ ID NO：13中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：15中重链可变区氨基酸序列。

11.权利要求9的方法，其中所述CD20结合抗体包含SEQ ID NO：17中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：18中重链可变区氨基酸序列。

12.权利要求9的方法，其中所述CD20结合抗体包含SEQ ID NO：19。

13.权利要求1的方法，其中所述抗CD20抗体是人源化II型抗CD20IgG1抗体。

14.权利要求1的方法，其中所述抗CD20抗体未偶联细胞毒剂。

15.权利要求1的方法，其中所述抗CD20抗体静脉内施用。

16.权利要求1的方法，其中所述抗CD20抗体皮下施用。

17.权利要求1的方法，其中所述有效量的抗CD20抗体导致通过评估触痛的或肿胀的关节数目、进行患者的整体临床评估、评估红细胞沉降率、评估C-反应性蛋白质水平的量、或使用疾病活动综合测量确定的临床改善。

18.权利要求1的方法，其中所述抗CD20抗体以介于约50和4000mg之间的剂量施用。

19.权利要求18的方法，其中所述剂量介于约75和3000mg之间。

20.权利要求18的方法，其中所述剂量介于约100和2000mg之间。

21.权利要求18的方法，其中所述剂量介于约100和1000mg之间。

22.权利要求18的方法，其中所述剂量介于约150和1000mg之间。

23.权利要求18的方法，其中所述剂量介于约200和1000mg之间。

24.权利要求18的方法，其中所述剂量是约200、300、400、500、600、700、800、900、1000mg、或2000mg。

25.权利要求1的方法，其中所述抗CD20抗体以约1个月的一段时间内1-4剂的频率施用。

26.权利要求1的方法，其中所述抗CD20抗体以2-3剂施用。

27.权利要求1的方法，其中所述抗CD20抗体在约2-3周的一段时间内施用。

28.权利要求1的方法，进一步包括与所述抗CD20抗体一起施用有效量的一种或多种第二药物，其中所述抗CD20抗体是第一药物。

29.权利要求28的方法，其中所述第二药物是一种以上的药物。

30.权利要求27的方法，其中所述第二药物是免疫抑制剂、缓解病情的抗风湿药(DMARD)、与第一药物不同的针对CD20的抗体、疼痛控制剂、整联蛋白拮抗剂、非类固醇抗炎药(NSAID)、细胞因子拮抗剂、二膦酸盐、或其组合。

31.权利要求30的方法，其中所述第二药物是DMARD。

32.权利要求31的方法，其中所述DMARD选自下组：金诺芬、氯喹、D-青霉胺、可注射金、口服金、羟氯喹、柳氮磺吡啶、硫代苹果金酸钠和甲氨蝶呤。

33.权利要求30的方法，其中所述第二药物是NSAID。

34.权利要求33的方法，其中所述NSAID选自下组：芬布芬、萘普生、双氯芬酸、依托度酸、吲哚美辛、阿司匹林、和布洛芬。

35.权利要求30的方法，其中所述免疫抑制剂选自下组：依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗、来氟米特、阿那白滞素、硫唑嘌呤、和环磷酰胺。

36.权利要求30的方法，其中所述第二药物选自下组：抗α4、依那西普、英夫利昔单抗、依那西普、阿达木单抗、kinaret、efalizumab、骨保护素(OPG)、NFκB配体的抗受体活化物(抗RANKL)、NFκB-Fc的抗受体活化物(RANK-Fc)、帕米膦酸盐、阿伦膦酸盐、actonel、唑来膦酸盐、氯膦酸盐、甲氨蝶呤、azulfidine、羟氯喹、多西环素、来氟米特、柳氮磺吡啶(SSZ)、泼尼松龙、利妥昔单抗、2H7抗体、白介素-1受体拮抗剂、泼尼松、和甲泼尼龙。

37.权利要求30的方法，其中所述第二药物选自下组：英夫利昔单抗、甲氨蝶呤(MTX)、英夫利昔单抗与MTX的组合、依那西普、皮质类固醇、环孢菌素A、硫唑嘌呤、金诺芬、羟氯喹(HCQ)、泼尼松龙与MTX和SSZ组合、MTX与SSZ和HCQ的组合、环磷酰胺与硫唑嘌呤和HCQ的组合、和阿达木单抗与MTX的组合。

38.权利要求37的方法，其中所述皮质类固醇是泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、氢化可的松、或地塞米松。

39.权利要求37的方法，其中所述第二药物是MTX。

40.权利要求39的方法，其中所述MTX经口或胃肠外施用。

41.权利要求1的方法，其中所述患者展现出对一种或多种抗肿瘤坏死因子-α抑制剂响应不足。

42.权利要求41的方法，其中所述抗体作为单剂或双剂施用，每剂介于约200mg和1000mg之间。

43.权利要求42的方法，其中所述抗体在治疗开始时在第1天和第15天以约200mg×2、约300mg×2、约500mg×2、约700mg×2、或约1000mg×2的剂量施用。

44.权利要求1的方法，其中所述RA是早期RA或初期RA。

45.权利要求1的方法，进一步包括通过给患者施用有效量的所述抗体来复治患者。

46.权利要求45的方法，其中所述复治在第一次施用所述抗体后至少约24周开始。

47.权利要求45的方法，其中开始另一次复治。

48.权利要求47的方法，其中所述另一次复治在第二次施用所述抗CD20抗体后至少约24周开始。

49.权利要求45的方法，其中关节损伤在复治后减轻。

50.权利要求45的方法，其中在复治前在患者中观察到临床改善。

51.权利要求50的方法，其中所述临床改善是通过评估触痛的或肿胀的关节数目、进行患者的整体临床评估、评估红细胞沉降率、评估C-反应性蛋白质水平的量、或使用疾病活动综合测量确定的。

52.一种用于治疗对利妥昔单抗不响应的受试者中的关节损伤的方法，包括对受试者施用抗CD20抗体，该抗CD20抗体是(1)包含SEQ ID NO：2中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：4中或SEQ ID NO：5中重链可变区氨基酸序列的ofatumumab；(2)包含SEQ ID NO：7中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：8中或SEQ ID NO：9中重链可变区氨基酸序列的veltuzumab；(3)包含SEQ ID NO：11的免疫药物；(4)包含SEQ ID NO：13中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：15中重链可变区氨基酸序列、或包含SEQ ID NO：17中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：18中重链可变区氨基酸序列、或包含SEQ ID NO：19的CD20结合抗体；或(5)其Fc区中有等分无岩藻糖基化碳水化合物且包含SEQ ID NO：21中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：23中重链可变区氨基酸序列的人源化II型抗CD20 IgG1抗体，其中该抗CD20抗体的施用量有效实现关节损伤减轻。

53.权利要求52的方法，其中使用放射照相测试来确定关节损伤减轻的程度。

54.权利要求53的方法，其中所述测试在施用所述抗体后至少约1个月时进行。

55.权利要求54的方法，其中所述测试在施用所述抗体后至少约2个月时进行。

56.权利要求52的方法，其中所述抗CD20抗体是ofatumumab。

57.权利要求56的方法，其中所述ofatumumab包含SEQ ID NO：4中重链可变区氨基酸序列。

58.权利要求56的方法，其中所述ofatumumab包含SEQ ID NO：5中重链可变区氨基酸序列。

59.权利要求52的方法，其中所述抗CD20抗体是veltuzumab。

60.权利要求59的方法，其中所述veltuzumab包含SEQ ID NO：8中重链可变区氨基酸序列。

61.权利要求59的方法，其中所述veltuzumab包含SEQ ID NO：9中重链可变区氨基酸序列。

62.权利要求52的方法，其中所述抗CD20抗体是免疫药物。

63.权利要求52的方法，其中所述抗CD20抗体是CD20结合抗体。

64.权利要求63的方法，其中所述CD20结合抗体包含SEQ ID NO：13中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：15中重链可变区氨基酸序列。

65.权利要求63的方法，其中所述CD20结合抗体包含SEQ ID NO：17中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：18中重链可变区氨基酸序列。

66.权利要求63的方法，其中所述CD20结合抗体包含SEQ ID NO：19。

67.权利要求52的方法，其中所述抗CD20抗体是人源化II型抗CD20 IgG1抗体。

68.权利要求52的方法，进一步包括与所述抗CD20抗体一起施用有效量的一种或多种第二药物，其中所述抗CD20抗体是第一药物。

69.权利要求68的方法，其中所述第二药物是一种以上的药物。

70.权利要求67的方法，其中所述第二药物是免疫抑制剂、缓解病情的抗风湿药(DMARD)、与第一药物不同的针对CD20的抗体、整联蛋白拮抗剂、非类固醇抗炎药(NSAID)、细胞因子拮抗剂、二膦酸盐、或其组合。

71.一种为抗CD20抗体或其药学可接受组合物做广告的方法，包括给目标受众宣传抗CD20抗体或其药物组合物用于治疗对利妥昔单抗不响应的类风湿性关节炎患者的用途，该抗CD20抗体是(1)包含SEQ ID NO：2中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：4中或SEQ ID NO：5中重链可变区氨基酸序列的ofatumumab；(2)包含SEQ ID NO：7中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：8中或SEQ ID NO：9中重链可变区氨基酸序列的veltuzumab；(3)包含SEQ ID NO：11的免疫药物；(4)包含SEQ ID NO：13中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：15中重链可变区氨基酸序列、或包含SEQ ID NO：17中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：18中重链可变区氨基酸序列、或包含SEQ ID NO：19的CD20结合抗体；或(5)其Fc区中有等分无岩藻糖基化碳水化合物且包含SEQ ID NO：21中轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：23中重链可变区氨基酸序列的人源化II型抗CD20IgG1抗体。