CN101189265A

CN101189265A - 抗il2抗体

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Publication number: CN101189265A
Application number: CNA2006800197422A
Authority: CN
Inventors: 帕特里克·鲍尔勒; 约翰·拉姆斯登; 斯蒂芬·弗兰兹; 托拜厄姆·劳姆; 乔格·沃尔克兰德
Original assignee: Micromet GmbH
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH
Priority date: 2005-06-01
Filing date: 2006-05-31
Publication date: 2008-05-28
Anticipated expiration: 2026-05-31
Also published as: AU2006254333A1; US20080317746A1; NO20076568L; BRPI0610912A2; CA2609234A1; WO2006128690A1; MX2007014565A; AU2006254333B2; RU2007143996A; CA2609234C; US7964707B2; KR20080032046A; KR101340559B1; JP5414271B2; EP1888644A1; JP2008542321A; CN101189265B; RU2425054C2; NZ563213A; IL187316A0

Abstract

本发明涉及特异结合人白细胞介素－2(IL2)的人源化单克隆抗体或其片段，其中所述人源化单克隆抗体通过在所述人IL2与人IL2－受体结合之前、之中、和/或之后结合所述人IL2来中和人IL2的活性，而且其中所述人源化单克隆抗体的轻链可变区在其第二框架区中的氨基酸位置第42－46位上包含连续的氨基酸序列KAPKA。

Description

抗IL2抗体

本发明涉及特异结合人细胞因子IL2的抗体及其片段。本发明还涉及编码该抗体及其片段的多核苷酸、包含该抗体及其片段的药物组合物和涉及该抗体及其片段的医学用途。

人IL2是有133个氨基酸的蛋白质(15.4kDa)，其不与其他任何因子带有显著的序列同源性。IL2作为153个氨基酸的前体蛋白合成，前20个氨基末端氨基酸作为疏水分泌信号序列。该蛋白质包含对生物活性至关重要的单个二硫键(连接位置Cys58/105)。

IL2的生物活性由膜受体介导，所述膜受体几乎专门在活化的T细胞上表达，而不在静息T细胞上表达。完整的IL2受体由3个I型穿膜蛋白亚基构成：α、β和γ；较低亲和性的功能性受体可以仅由β和γ受体蛋白组成。静息的B细胞和静息的单核白细胞很少表达该受体。IL2受体(尤其是α亚基)的表达由许多因子调节，例如有IL5、IL6和L2R/p55诱导因子。

小鼠和人IL2都能使同种物种T细胞高效增殖。人IL2对小鼠细胞也有作用，但反之不然。IL2是所有T淋巴细胞亚群的生长因子。它对于T细胞来说，是抗原非特异性的增殖因子，其能诱导静息的细胞中的细胞周期进程并由此使T淋巴细胞克隆扩增。IL2也促进活化的B细胞的增殖和分化。与T细胞的增殖一样，该活性也需要存在其他因子，例如IL4。

由于其对T细胞和B细胞的效应，IL2成为免疫应答的核心调节剂。药物的临床功效很好地说明了IL2对适应性免疫应答的起始和扩增的核心重要性，所述药物最常用于抑制不希望产生的免疫应答，如移植排斥。免疫抑制药物环孢霉素A和FK506(他克莫司)通过阻断经由T细胞受体的信号递送来抑制IL2产生，而雷帕霉素(西罗莫司)抑制经由IL2受体的信号递送。环孢霉素A和雷帕霉素协同作用，通过防止IL2驱动的T细胞克隆扩增来限制免疫应答。可是，所有这些化合物都靶向细胞内信号递送途径，其不但专门干扰IL2，而且干扰其它因子。这意味着这些药物的临床应用会由于它们有限的靶位专一性而带来不希望产生的副作用的相当大风险。

IL2活性的抗体抑制剂的许多例子也是现有已知的，例如商品化的抗体daclizumab(Zenapax

，Protein Design Lab，Inc.)。可是，IL2活性的已知抗体抑制剂通过结合IL2受体而不是抗原本身来发挥它们的生物学效能。考虑到IL2活性抑制剂的重要的临床应用，本发明的目的是提供IL2活性的另外的特异性抑制剂。

因此，本发明的一个方面提供了特异结合人白细胞介素-2(IL2)的人源化单克隆抗体或其片段，其中所述人源化单克隆抗体通过在所述人IL2与人IL2-受体结合之前、之中、和/或之后结合所述人IL2来中和人IL2的活性，而且其中所述人源化单克隆抗体的轻链可变区在其第二框架区中包含连续的氨基酸序列KAPKA，优选其在氨基酸位置第42-46位上。

本文所用的术语“人源化单克隆抗体”、或“人源化抗体”、或“人源化免疫球蛋白”、或其语法上相关的变型可互换使用，指包含源自一种或多种非人免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，所述分子另外还包含至少一个部分，如源自一种或多种人免疫球蛋白或其生殖系序列的轻或重链可变结构域的至少一个框架区。本文所用的“人源化抗体”包括人源化轻链可变结构域免疫球蛋白和人源化重链可变结构域免疫球蛋白。人源化抗体可包括部分或完全源自一种或多种人基因序列(包括合成类似物)的恒定区。预计人源化抗体像提供CDR的供体抗体那样结合相同的靶抗原。通常除了CDR，人源化抗体或免疫球蛋白的所有节段或部分都与天然产生的或共有的人免疫球蛋白序列的相应节段或部分基本上一致或基本上同源。

所述人源化单克隆抗体的轻链可变区(VL)在其第二框架区中包含连续的氨基酸序列KAPKA，优选其位于氨基酸位置第42-46位。该优选序列的编号，即位置第42-46位，指如“VBase”数据库(

MRC蛋白质工程中心)所示的编号，其可在互联网地址http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk处获得。为了清楚起见，人生殖系VL的框架区序列(作为V-κ和V-λ序列)和VH区的框架区的序列比对包括在本申请中，这些序列也出现在Vbase中(分别参见图7、8和9，尤其是图8a和9a，中对人生殖系V-κ和V-λ序列中的第二轻链框架区的编号)。

尽管本文提供氨基酸序列KAPKA(即Lys-Ala-Pro-Lys-Ala)的优选编号(即氨基酸位置第42-46位)以方便地与上文引用的文献对应，应当理解的是在该部分序列内的氨基酸同一性，而不是其本身中的和其本身的序列编号，决定了本发明人源化单克隆抗体的活性。如所属领域技术人员所知道的，存在有多种对人生殖系抗体序列编号的规则，上文所引用的文献(VBase)仅是这些中的一种。因此，包括在某些人生殖系轻链可变区的第二框架区内的部分氨基酸序列KAPKA可根据以上引文中特别指出的规则之外的编号规则来分派其他编号。在这种情况下，部分氨基酸序列KAPKA将带有优选的氨基酸位置第42-46位之外的编号方式，而在这种其他的标号规则下对应优选的氨基酸位置第42-46位的序列将可能是除了KAPKA之外的氨基酸序列。在这种情况下，如所属领域技术人员会理解的，带有“正确”序列(KAPKA)但编号有差异(优选的氨基酸位置第42-46位之外的)的部分氨基酸序列应当被认为是本发明的实质特征，而其他其编号是“正确”的(优选是氨基酸位置第42-46位)，但其同一性不是KAPKA的部分氨基酸序列不是本发明的实质特征。

令人惊讶的观察结果是，在第二轻链框架区中缺少共有序列KAPKA的抗体或其片段，尤其是在该序列串中缺少末端丙氨酸残基的，能特异结合IL2，但不能中和其活性。当包含在人源化单克隆抗体的轻和重可变链中的CDR区如SEQ ID No.1-3(分别针对轻链可变区CDR 1-3)、和SEQ ID No.4-6(分别针对重链可变区CDR 1-3)所示时，尤其是这样的。不受理论所限，本发明人将丧失中和活性归结于共有序列KAPKA的脱漏，尤其归结于该序列串中的末端丙氨酸残基被除了丙氨酸之外的其他氨基酸所替代，从而使之不稳定和/或产生对中和产生有害效应、而不影响结合活性的构象重排。

本文中所用的术语“特异结合”或语法相关表述，如“特异的结合”、“特异地结合”、“特异结合物”等，指人单克隆抗体或其片段从多种作为潜在结合配偶体的不同抗原汇聚物中区分出人IL2和任何其他不同于人IL2的潜在抗原、仅结合或仅显著结合人IL2的能力。在本发明的范围内，“显著”结合人IL2，是指在从作为潜在结合配偶体的能同样接触的多种不同抗原的汇聚物中，以比任何其他不同于人IL2的抗原至少10倍、优选50倍、最优选100倍或更高的频率(在动力学意义上)地结合人IL2的时候。如本领域技术人员所理解的，这些动力学测量可在Biacore设备上进行。

本发明所述的人源化抗体或其片段是单克隆的。本文中所用的术语“单克隆的”应被理解为具有其现有技术中所述的典型含义，即识别所结合抗原上的单个表位的抗体。这与多克隆抗体相反，多克隆抗体代表一组结合相同抗原的不同抗体，而且结合在该抗原不同表位上。因为该原因，单分子抗原可同时被多个特异针对该抗原的多克隆抗体分子结合，但是它仅被单个特定特异针对该抗原的具体单克隆抗体分子结合；被单个单克隆抗体分子结合后，结合的表位被封闭，由此不再为其他相同单克隆抗体分子所结合。抗体的单克隆性质使其尤其适于用作治疗剂，这是因为该抗体将作为单一、均一的分子种类而存在，其可以被很好地表征并重复制备并纯化。可高精度地预测出这些因素产生的产物的生物活性，如果要使该分子被管理部门批准可以向哺乳动物(尤其是人)给药治疗，则这是非常重要的考量因素。

本文中所用的“中和”、“中和物”、“在中和”和其语法上相关的变体指部分或完全减弱IL2的一种或多种生物学效应。该部分或完全减弱IL2的一种或多种生物学效应可由修饰、阻断和/或消除IL2介导的信号传导造成，例如在细胞内信号传递、细胞增殖或释放可溶性物质、上或下调细胞内基因活性(例如能导致除了IL2之外的配体的表面受体表达的那些)中所显示的。所属领域技术人员能理解的是，存在多种模式来确定试剂(例如所论及的抗体或其片段)是否能被划分为中和物。这一般可通过如下进行的标准体外测试来实现：在第一个增殖实验中，细胞系(其增殖程度已知取决于IL2的活性)和一系列含各种浓度的IL2的样品一起孵育，孵育后测定细胞系的增殖程度。通过这种测量，确定出能使细胞半最大增殖的IL2浓度。然后进行第二个增殖实验，其在一系列与第一个增殖实验中所用的相同数量的细胞样品的每一种中、利用以上确定的IL2浓度、以及此次是各种浓度的怀疑是IL2中和物的抗体或其片段。然后测量细胞增殖，以确定足以导致半最大生长抑制的抗体或其片段的浓度。如果得到的生长抑制对抗体(或其片段)浓度图是S形的，则在一定程度上导致了抗体依赖性生长抑制，即以某种程度中和了IL2活性。在这种情况下，抗体或其片段可被认为是本发明范围内的“中和物”。其增殖程度已知取决于IL2的活性的细胞系的一个例子是CTLL-2细胞系，其可通过商业途径从LGC Promochem处获得。合适细胞系的其他例子是NK92(DSMZ)。

令人惊讶地，本发明的人源化单克隆抗体通过在所述人IL2与人IL2-受体结合之前、之中和/或之后结合所述人IL2来中和人IL2的活性。该中和模式是高度意想不到的。通常，通过防止配体-受体复合物形成来导致抗体介导的对配体生物活性的中和(所述生物活性依赖于所述配体与受体的结合)。根据该中和的典型场景，中和性抗体在配体-受体交界面的位置上结合配体或受体。以这种方式，抗体的存在在空间上和/或静电上防止了配体-受体复合物的形成：不形成配体-受体复合物，则通常由配体与其受体结合而造成的生物活性不受影响。

对根据本发明所述的人源化单克隆抗体所观察到的中和模式与该经典场景有很大区别，在于丧失正常由IL2造成的生物活性不取决于防止IL2和其受体间的复合物形成。这是指无论是否IL2已经与IL2受体结合，IL2的生物活性都会丧失，这暗示本发明人源化单克隆抗体所识别的表位不位于与IL2受体相互作用的IL2部分上。由此，用本发明的人源化单克隆抗体通过几种模式可实现IL2中和。

根据第一种模式，在形成IL2和其受体间的复合物之前，抗体结合溶液中的IL2，由此IL2介导的信号转换不在IL2与其受体结合的事件中发生。

根据第二种模式，在IL2和其受体形成复合物的同时，抗体结合IL2。在本文中，同时形成受体-IL2-抗体三重复合物也不造成任何、或至少任何显著的信号转换。

根据第三种模式，IL2已经与其受体形成复合物，而当IL2以与含IL2受体的细胞表面上的受体形成复合物的形式存在时，抗体结合IL2。在该第三种场景中，一旦抗体结合，在IL2被抗体结合之前任何已经发生的IL2介导的信号转换就会丧失。

该非经典中和，即由本发明人源化单克隆抗体所导致的中和，相当令人惊讶，并有几种治疗优势。

首先，由于本发明人源化单克隆抗体识别不直接参与接触IL2受体的IL2表位，因此治疗性抗体和IL2受体之间不会有竞争。这带来了以下效应，即可以将比抗体和IL2受体间存在相同表位的结合竞争的情况下所需浓度更低浓度的治疗性抗体给药于患者。这有效地增加了本发明的人源化单克隆抗体的治疗功效，因为给药浓度(相对于经典中和模式所需的给药浓度)降低而不丧失生物学效应。给药较低量的治疗剂不但从患者耐受性的角度来说是高度希望的，而且从经济的角度来说也是，因为特定疗法的成本负担下降了，或从另一个角度，更大量的患者将受益于给定量的治疗性抗体。

其次，如上所提示的，本发明的人源化单克隆抗体结合和中和已经在与其受体形成的复合物中的IL2的生物活性的能力具有很大优势，即已经控制的IL2介导的信号转换可以被关闭，而无需IL2先要从其受体结合配偶体上解离下来。这带来了终极效应，即本发明的人源化单克隆抗体所需的中和生物活性能比其它“经典”抗体中和剂可能在体内更快地实现，所述其它“经典”抗体中和剂在显现任何治疗效应前首先必须与IL2受体竞争IL2上的结合表位。该作用的速度尤其在急性局面(如器官移植的免疫排斥，此为抗IL2疗法的已知领域)中尤其有益。

该上述非典型中和模式的第三个优势涉及IL2受体位于T细胞表面上的事实。T细胞本身产生IL2并也通过增殖来加强它们自身增殖从而对IL2应答。在某些急性炎症应答中，如移植手术后的组织排斥，不仅希望减少由存在的T细胞造成的炎症应答的强度，而且希望减少产生免疫应答的T细胞的数量。本发明的人源化单克隆抗体能尤其有效地实现该目的。如上所解释的，已经与T细胞表面上其受体结合的IL2的生物活性会丧失。可是，丧失后，本发明的人源化单克隆抗体通常将会仍旧结合IL2(IL2本身与IL2受体结合)一段时间，由此靶向T细胞来通过抗体依赖性细胞的细胞毒性(“ADCC”)而对其摧毁。在ADCC中，用免疫球蛋白包被的靶细胞会被带有识别包被靶T细胞的免疫球蛋白Fc部分的Fc受体的效应器细胞杀死。在多数情况下，参与ADCC中的效应器细胞是自然杀伤(“NK”)细胞，其在它们的表面上带有诸如Fc受体Fc-γ-RIII。以这种方式，仅有被免疫球蛋白包被的细胞被杀死，因此细胞杀伤的特异性直接与抗体结合特异性相关。在本发明的上下文中，通过在与其受体形成的复合物中的IL2已经用本发明的人源化单克隆抗体修饰的T细胞成为以上意义的靶T细胞，其然后被诸如NK细胞所裂解。该效应迅速并有效地减轻了由带有IL2受体的细胞(如T细胞)造成的免疫应答。

根据本发明的一个具体实施方式，包含在人单克隆抗体或其片段中的第一、第三和/或第四轻链框架区之至少一个对应于人生殖系序列的那个/那些区域。

根据本发明的另一个具体实施方式，本发明人源化单克隆抗体或其片段的轻链可变区在其CDR1区中包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。根据本发明的另一个具体实施方式，本发明人源化单克隆抗体或其片段的轻链可变区在其CDR2区中包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。根据本发明的另一个具体实施方式，本发明人源化单克隆抗体或其片段的轻链可变区在其CDR3区中包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

根据本发明的另一个具体实施方式，本发明人源化单克隆抗体或其片段的轻链可变区在其CDR1区中进一步包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，在其CDR2区中包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列并在其CDR3区中包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

根据本发明的另一个具体实施方式，重链可变区在其CDR1区中包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。根据本发明的另一个具体实施方式，重链可变区在其CDR2区中包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。根据本发明的另一个具体实施方式，重链可变区在其CDR3区中包含如SEQ IDNO：6所示的氨基酸序列。

根据本发明的另一个具体实施方式，重链可变区在其CDR1区中包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，在其CDR2区中包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列并在其CDR3区中包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

根据本发明的另一个具体实施方式，本发明人源化单克隆抗体或其片段的轻链可变区在其CDR1区中进一步包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，在其CDR2区中包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列并在其CDR3区中包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，而且重链可变区在其CDR1区中包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，在其CDR2区中包含如SEQID NO：5所示的氨基酸序列并在其CDR3区中包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。已经发现这些CDR区尤其有益于以上述方式结合并中和IL2的生物学效应。

根据本发明的另一个具体实施方式，第一轻链框架区的氨基酸序列、第二轻链框架区的剩余氨基酸序列、和第三轻链框架区的氨基酸序列对应于基因座O12、O2、O18、O8、A30、L1、L15、L4、L18、L5、L19、L8、L23、L9、L11或L12上的人生殖系亚群VKI的那些中的任何氨基酸序列；或基因座1a上的人生殖系亚群VL1的；或基因座2c、2e、2a2或2b2上的人生殖系亚群VL2的那些中的任何氨基酸序列。在该具体实施方式中，“第二轻链框架区的剩余氨基酸序列”指第二轻链框架区中除了序列KAPKA之外的那些氨基酸。然后利用VBase数据库的编号方式，“第二轻链框架区的剩余氨基酸序列”指包含在第二轻链框架区位置第35-41和47-49位上的氨基酸，而无论该轻链框架区是V-κ还是V-λ框架区(对于与V-κ和V-λ框架区相关的人生殖系序列，分别参见图7a和8a)。优选在该具体实施方式中，进一步掺入第四轻链框架区，其序列对应于人生殖系序列JK4中发现的，尤其是FGGGTKVEIK。其他适于用作第四轻链框架区的氨基酸序列包括但不限于FGQGTKVEIK、FGQGTKLEIK、FGPGTKVDIK、FGQGTRLEIK、FGTGTKVTVL、FGGGTKLTVL和FGGGTQLTVL。

根据另一个具体实施方式，包括在人单克隆抗体或其片段中的第一、第二和/或第三重链框架区之至少一个对应于人生殖系序列的那个/那些区域。

根据另一个具体实施方式，第一重链框架区的氨基酸序列、第二重链框架区的氨基酸序列和第三重链框架区的氨基酸序列对应于人生殖系亚群VH3的那些中的任何氨基酸序列，尤其是在基因座3-07上的，其中第一重链框架区的氨基酸序列是EVQLVESGGGLVQPGGSLR LSCAASGFTFS，第二重链框架区的氨基酸序列是WVRQAPGKGLEWVA而且第三重链框架区的氨基酸序列是RFTISRDNAKNS LYLQMNSLRAEDTAVYYCAR。例如与以上所引用的生殖系基因座3-07内的3个框架序列组合在一起时，第四重链框架区的氨基酸序列可以有益地选自以下序列之一：WGQGTLVTVSS，WGRGTLVTVSS，WGQGTMVTVSS，WGQGTLVTVSS，WGQGTLVTVSS和WGQGTTVTVSS。

在优选的具体实施方式中，人源化单克隆抗体或其片段包含含如SEQID NO.7所示氨基酸序列的轻链可变区和含如SEQ ID NO.8所示氨基酸序列的重链可变区。尤其优选的是人源化单克隆抗体，其包含含如SEQ IDNO.9所示氨基酸序列的轻链和含如SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的重链。以下，包含SEQ ID NO.9和10和/或SEQ ID NO.7和8的人源化抗IL2IgG1抗体将被称为“抗IL2”。

人源化单克隆抗体可以是IgG抗体形式的，尤其是IgG1或IgG4抗体。现有公知的是，IgG不仅包含负责高度区分抗原识别和结合的可变抗体区，而且包含通常存在于内源产生的抗体中的重和轻抗体多肽链的恒定区，并且在一些情况下，甚至在一个或多个位点上带有碳水化合物修饰，该糖基化通常在IgG的Fc部分上。这些Fc部分已知能引发各种体内效应器功能，如ADCC和补体依赖性细胞毒性(“CDC”)。ADCC的机理如上文所述。在CDC中，2个同样的免疫球蛋白结合靶细胞表面上的两个同样抗原(例如在本文中的T细胞上的IL2)，由此它们各自的Fc部分相互接近。该场景能吸引补体蛋白，补体蛋白中例如有C1q、C3、C4和C9，后者能在靶T细胞中产生小孔。通过这种穿孔能杀死靶细胞。与此同时，靶T细胞也在它/它们的表面的其他位置上产生修饰。该修饰吸引效应器细胞，然后由其以与上述ADCC机制内容中相似的方式来杀死靶T细胞(例如参见Gelderman等(2004)，Trends Immunology 25，158-64)。

有益的是，IgG抗体是IgG1抗体或IgG4抗体，这些形式是优选的，这是因为它们的体内作用机制被特别好地理解并表征了。对于IgG1抗体，尤其是这样的。

根据本发明的另一个具体实施方式，人源化单克隆抗体的片段可以是scFv、单结构域抗体、Fv、双抗体、串联的双抗体、Fab、Fab’或aF(ab)2。这些形式通常可被分成两个亚型，即由单多肽链组成的那些，和包含至少2条多肽链的那些。前一亚型的成员包括scFv(包含一个VH区和一个VL区，它们通过多肽接头连接成单多肽链)；和单结构域抗体(包含特异结合人IL2的单个抗体可变结构域)。后一亚型的成员包括Fv(包含一个VH区和一个VL区，形成分开的多肽链，它们非共价地相互连接)；双抗体(包含2条非共价连接的多肽链，其中每一条包含2个抗体可变区(通常每条多肽链有一个VH和一个VL)，并排列使得一条多肽链上的VH与各个其他多肽链上的VL非共价相连，而反之亦然，从而产生了二价抗体分子)；串联的双抗体(双特异性单链Fv抗体，其包含不同特异性的4个共价相连的免疫球蛋白可变(VH和VL)区，形成上述双抗体两倍大的同二聚体)；Fab(以一条多肽链包含完整的抗体轻链，完整抗体轻链包含了VL区和完整的轻链恒定区，而且作为另一条多肽链包含一部分抗体重链，其包含完整的VH区和部分重链恒定区，所述2条多肽链通过链内二硫键而在分子间相连)；Fab’(如同以上Fab，除了在抗体重链上带有额外的还原的二硫键)；和F(ab)2(包含2个Fab’分子，每个Fab’分子与另一个Fab’分子通过链内二硫键相连)。一般而言，上文所述类型的抗体片段给设计带来了很大的灵活性，例如，设计需要在特定紧急情况下临时治疗给药的抗体的药物动力学性质。例如，可期望减小给药的抗体大小，从而在治疗已知很少有血管分布的组织(例如，关节)时增加组织穿透程度。在某些情况下，也可期望增加治疗性抗体被清除出身体的速率，所述速率一般通过减少给药的抗体大小来加速。

根据本发明的另一个具体实施方式，人源化单克隆抗体可以呈现为单价单特异性的或多价单或多特异性的，尤其是二价单或双特异性的形式。一般而言，多价单特异性的，尤其是二价单特异性的抗体，可给它带来治疗优势，即亲合效应可增强该抗体起到的中和作用，亲合效应即相同抗体与多个分子的相同抗原(本文中的人IL2)结合。本发明的抗体的几种单价单特异性形式如上所述(例如，scFv、Fv、或单结构域抗体)。多价多特异性的，尤其是本发明的人源化单克隆抗人IL2抗体的二价双特异性形式，可包括完整的IgG，其中一个结合臂结合人IL2，而其另一个结合臂结合不同于人IL2的另一抗原。其他多价多特异性(尤其是二价双特异性)形式有利的为人源化的单链双特异性抗体，即重组人源化抗体构建体，其包含2个上述scFv实体，通过所述2个scFv实体间现有已知的短的多肽间隔区连成一个连续的多肽链。在本文中，双特异性单链抗体中所包括的双特异性单链抗体的一个scFv部分将特异结合如上所提及的人IL2，而该双特异性单链抗体的另一个scFv部分将结合另一个确定具有治疗益处的抗原。

根据另一个具体实施方式，人源化单克隆抗体或其片段可以是衍生化的，例如用有机聚合物，例如用一个或多个聚乙二醇(“PEG”)分子。现有已知的是，这种衍生化有益于调节抗体或其片段的药效学性质。

scFv是尤其优选的(单价单特异性)抗体片段，尤其是包含如SEQ IDNO.11或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的scFv。

本发明的另一方面提供了人单克隆抗体或其片段，其包含与如SEQ IDNO：1-12之任一所示的氨基酸有至少70％同源性、优选至少80、90、或更高的至少95％同源性的氨基酸序列。同源性可通过标准序列比对程序来确定，如Vector NTI (InforMax^TM，Maryland，美国)。该程序在一个氨基酸一个氨基酸的基础上比较排列的序列，并设置各种水平的比较严谨度(如相同氨基酸、保守氨基酸替换等)。作为本文中所用的术语，如果它们属于相同的主要组别，则所论及的2个氨基酸被认为是互相“保守的替换”。作为非限制性举例，2个属于非极性氨基酸组的不同氨基酸被认为是互相“保守的替换”，即使这2个氨基酸不相同，而非极性氨基酸和碱性氨基酸不被认为是互相“保守的替换”。Alberts，Johnson，Lewis，Raff，Roberts和Walter的“Molecular Biology ofthe Cell”(第4版(2002))的第3.1节把氨基酸分成四个主要的组：酸性、非极性、不带电荷的极性和碱性。该分组方式可用于在本发明中确定特定氨基酸是否是另一个所论及的氨基酸的“保守替换”。

本发明的另一方面提供了多核苷酸分子。该多核苷酸包含编码如SEQID NO：1-12之任一所示氨基酸序列的核苷酸序列或与所述核苷酸序列显示出有至少60％、优选至少65、70、75、80、85、90、或95％同源性的核苷酸序列。在本文中，同源性可通过序列比对比较包含编码SEQ ID NO：1-12之任一氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸与具有所论及核苷酸序列(“测试序列”)的多核苷酸来确定，而且如果测试序列中的核苷酸与编码SEQ IDNO：1-12之任一的相应氨基酸序列的核苷酸序列中的相应核苷酸是相同的，或如果测试序列中的一个或多个核苷酸与编码SEQ ID NO：1-12之任一的氨基酸序列的核苷酸之间的差别形成了核苷酸三联体，其翻译后导致与SEQ ID NO：1-12之任一的相应氨基酸序列中的相应氨基酸相同(由于简并三联体)或保守替换的氨基酸，则其中测试序列中的核苷酸被认为是同源的。在本文中，术语“保守的替换”与上述的一样理解。

本发明的另一方面提供了药物组合物，其包含人源化单克隆抗体或其片段或多核苷酸分子，所述多核苷酸分子具有编码如SEQ ID NO：1-12之任一所示氨基酸序列、或编码包含与SEQ ID NO：1-12之任一有至少70％同源性的氨基酸序列的氨基酸序列的核苷酸序列，其中“同源性”与上文解释的一样理解。

根据本发明，术语“药物组合物”涉及向哺乳动物患者(优选人患者)给药的组合物。在优选的具体实施方式中，药物组合物包含用于非肠道注射或输注的组合物。该非肠道注射或输注可利用再吸收过程的优势，所述再吸收过程的形式如皮内、皮下、肌肉内和/或腹膜内注射或输注。可选的是，该非肠道注射或输注可避开再吸收过程，并为心脏内、动脉内、静脉内、腰内和/或膜内注射或输注的形式。在另一个优选的具体实施方式中，药物组合物包含用于通过皮肤给药的组合物。通过皮肤给药的一个例子是表皮给药，其中药物组合物以如溶液、混悬液、乳剂、泡沫剂、油膏、药膏、糊剂和/或贴到皮肤上的贴片的形式给药。可选的是，可通过一种或多种粘膜来实现药物组合物的给药。例如，给药可以是颊的、舌的或舌下的，即通过口和/或舌的粘膜的，并且应用形式可以如片剂、锭剂、糖衣片(即糖衣药丸)和/或漱口溶液。可选的是，给药可以是肠道的，即通过胃和/或肠道粘膜的，并且应用形式可以如片剂、糖衣片(即糖衣药丸)、胶囊、溶液、混悬液和/或乳剂。可选的是，给药可以是直肠的，并且应用形式可以如栓剂、直肠胶囊和/或药膏或油膏。可选的是，给药可以是鼻内的，并且应用形式可以如滴剂、药膏或油膏和/或喷剂。可选的是，给药可以是肺部的，即通过支气管和/或肺泡的，并且应用形式可以如气雾剂和/或吸入剂。可选的是，给药可以是结膜的，并且应用形式可以如滴眼液、眼药膏和/或洗眼液。可选的是，给药可以是通过泌尿生殖器道粘膜实现的，如可以是阴道内的或尿道内的，并且应用形式可以如栓剂、药膏和/或药笔剂。应当理解，以上给药的可选形式并不互相排斥，而且可以用它们的任意数量的组合来构成有效治疗方案。

本发明的药物组合物可进一步包括药学上可接受的载体。合适的药物载体的例子是现有公知的，包括磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂(如油/水乳剂)、各类润湿剂、无菌溶液等。包含这些载体的组合物可通过公知的常规方法来配制。这些药物组合物可以合适的剂量向受试者给药。剂量方案可由参与的医生和临床因素来确定。如现有医学技术所公知的，对于任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者的身材、身体表面积、年龄、给药的特定化合物、性别、给药时间和途径、综合健康情况、以及同时给药的其他药物。如，非肠道给药的制剂包括无菌水或非水溶液、混悬液、乳剂和脂质体。非水溶剂的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、和可注射的有机脂(如油酸乙酯)。含水载体包括水、醇/含水溶液、乳剂或混悬液，包括盐水和缓冲介质。适于一般非肠道给药的载体包括氯化钠溶液、Ringer氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化Ringer氏、或不挥发性油。适于静脉内或动脉内给药的载体包括流体和营养物补充剂、电解液补充剂(如基于Ringer氏葡萄糖的那些)等。也可含有防腐剂和其他添加剂，例如，抗微生物、抗氧化、鳌合剂、惰性气体等。另外，本发明的药物组合物可包含蛋白质载体，像诸如，血清白蛋白或免疫球蛋白，优选是人源的。关注的是，除了(如本发明所述的)人源化单克隆抗体或其片段，本发明的药物组合物还可包含其他生物活性剂，这取决于药物组合物所需的用途。该试剂可以是作用于胃肠系统的药物、作为细胞抑制剂的药物、防止多尿酸血症的药物、抑制免疫反应的药物(如皮质类固醇)、调节炎症反应的药物、作用于循环系统的药物和/或诸如细胞因子的现有已知的试剂。

本发明的另一方面提供了如上文所述的人源化单克隆抗体或其片段或如上文所述的多核苷酸分子在制备用于治疗哺乳动物(优选是人)的炎性疾病的药物中的用途，任选还包含一种或多种抗炎剂。炎性疾病最好是选自由类风湿性关节炎(RA)、哮喘、多发性硬化(MS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、特发性肺纤维变性(IPF)、炎性肠病(IBD)、色素层炎、黄斑变性、结肠炎、牛皮癣、沃勒变性、抗磷脂综合症(APS)、急性冠状动脉综合症、再狭窄、动脉粥样硬化、复发性多软骨炎(RP)、急性或慢性肝炎、失败的整形外科植入、肾小球肾炎、狼疮、自身免疫疾病、急性胰腺炎或强直性脊柱炎(AS)所组成的组。

本发明的另一方面提供了如上文所述的人源化单克隆抗体或其片段或如上文所述的多核苷酸分子在制备用于治疗哺乳动物(优选是人)的肿瘤性疾病或其他具有延迟细胞凋亡、增强细胞存活或增殖的病况的药物中的用途，任选还包含一种或多种抗癌剂。肿瘤性疾病优选是癌，所述癌优选是白血病、多发性骨髓瘤、胃癌或皮肤癌。

本发明的另一方面提供了治疗炎性疾病的方法，其中将如上文所述的人源化单克隆抗体或其片段或如上文所述的多核苷酸分子(任选与一种或多种其他抗炎试剂一起)以足以防止和/或改善所述炎性疾病的量和时间来给药于哺乳动物，优选给药于人受试者。炎性疾病最好是选自由类风湿性关节炎(RA)、哮喘、多发性硬化(MS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、特发性肺纤维变性(IPF)、炎性肠病(IBD)、色素层炎、黄斑变性、结肠炎、牛皮癣、沃勒变性、抗磷脂综合症(APS)、急性冠状动脉综合症、再狭窄、动脉粥样硬化、复发性多软骨炎(RP)、急性或慢性肝炎、失败的整形外科植入、肾小球肾炎、狼疮、自身免疫疾病、急性胰腺炎或强直性脊柱炎(AS)所组成的组。

本发明的另一方面提供了治疗肿瘤性疾病的方法，其中将如上文所述的人源化单克隆抗体或其片段或如上文所述的多核苷酸分子(任选与一种或多种其他抗癌症试剂一起)以足以防止和/或改善所述肿瘤性疾病或其他具有延迟细胞凋亡、增强细胞存活或增殖的病症的量和时间来给药于哺乳动物，优选给药于人受试者。肿瘤性疾病优选是癌，所述癌优选是白血病、多发性骨髓瘤、胃癌或皮肤癌。

本发明现在将通过非限制性的附图和实施例来描述。附图的总体情况如下：

图1人源化VL区后保留的抗原结合性

图2人源化VL区后丧失的中和活性

图3 VL区内人/小鼠框架交换不影响IL2的结合

图4整合了人第二轻链框架后丧失的中和活性

图5 VL区的位置第42-46位的氨基酸变化(第二轻链框架内)不影响抗原结合

图6第二轻链框架第46位上的亮氨酸至丙氨酸的突变导致重新获得中和活性

图7a第一和第二轻链框架区(V-κ)的人生殖系氨基酸序列。省略了CDR区；剩余框架区余下编号公开于网上的“Vbase”数据库(参见以上网址)。

图7b第三轻链框架区(V-κ)的人生殖系氨基酸序列。省略了CDR区；剩余框架区余下编号公开于网上的“Vbase”数据库(参见以上网址)。

图8a第一和第二轻链框架区(V-λ)的人生殖系氨基酸序列。省略了CDR区；剩余框架区余下编号公开于网上的“Vbase”数据库(参见以上网址)。

图8b第三轻链框架区(V-κ)的人生殖系氨基酸序列。省略了CDR区；剩余框架区余下编号公开于网上的“Vbase”数据库(参见以上网址)。

图9a第一和第二重链框架区的人生殖系氨基酸序列。省略了CDR区；剩余框架区余下编号公开于网上的“Vbase”数据库(参见以上网址)。

图9b第三重链框架区的人生殖系氨基酸序列。省略了CDR区；剩余框架区余下编号公开于网上的“Vbase”数据库(参见以上网址)。

图10人源化抗IL2抗体“抗IL2”结合自然杀伤淋巴瘤细胞系NKL的特异性

图11抗IL2消除了在CTLL-2细胞上IL2依赖性的IL2依赖性的CD124细胞表面表达的上调

图12抗IL2特异阻断IL2受体的IL2信号传导下游

图13CD25表达水平有差异地影响抗IL2和Daclizumab的功效

图14显示抗I12和Daclizumab对原代人NK细胞的IL2依赖性增殖的影响的结果

图15显示抗I12和Daclizumab对NK细胞的IL2依赖性的IFN-γ释放的影响的结果

实施例1：人IL2(“hIL2”)抗原的获得

下述实施例1a、1b和1c中的实验方法的目的在于提供源自不同来源的重组IL2抗原材料：在原核细胞、真核细胞中表达的抗原和作为经认证的治疗剂可通过商业渠道获得的重组蛋白抗原。

实施例1a：从大肠杆菌重组表达

利用标准PCR和分子生物学技术，将成熟的hIL2(即，编码氨基酸残基APTSSS...IISTLT的)作为单开放阅读框(“ORF”)而克隆入原核表达载体pBAD(Invitrogen)。将3个编码甲硫氨酸的核苷酸加到5’端，在3’端，将一段核苷酸序列插在终止密码子之前，使得六组氨酸的标签融合到蛋白质的C末端。

根据厂商提供的说明书，将该构建体用于转化感受态大肠杆菌(BL21(DE3)株，Stratagene)。细菌在标准LB培养基上生长至OD(600nm)密度＝0.5，然后加入L-阿拉伯糖至浓度为0.2％w/v，从而引发表达5h。以10,000g离心15分钟来收获大肠杆菌。然后根据厂商说明书，用BugBuster试剂和规程(Novagen)来制备不可溶性级分(包涵体)。

包涵体溶于6M盐酸胍(“GuHCl”)中，然后用含2M GuHCl(pH＝8.0)/1mM氧化型谷胱甘肽/10mM还原型谷胱甘肽的缓冲液稀释至0.1mg/ml，并于20℃孵育16h。孵育后，缓慢加入冰醋酸并剧烈搅拌从而将pH调节至6.0。最后，用3个连续的层析法来获得高纯度的和均一的hIL2his蛋白质制品：固定化金属亲和层析(IMAC)、反相HPLC、离子交换层析。在细胞增殖实验(见下)中来验证纯化的蛋白质的功能性。

实施例1b：从哺乳动物细胞中重组表达

利用标准PCR和分子生物学技术，将成熟的hIL2(即，编码氨基酸残基APTSSS...IISTLT的)克隆入真核表达载体pEFdhfr(Mack M.等(1995)PNAS 92，7021-5)中。编码人IgG的前导肽的核苷酸序列加入到5’端，使能进行有效加工和分泌，在3’端插入核苷酸序列于终止密码子之前，以将六组氨酸标签融合到蛋白质的C末端。

293细胞(DSMZ，订购码ACC305)以25-35％平板表面覆盖率接种并培养24h。然后根据厂商说明书，利用“Transfast”试剂(Promega)来用pEFdhfr-hIL2表达载体转染细胞。再培养60h后，收集细胞上清液，并用IMAC法并接着用离子交换层析纯化hIL2-his蛋白质。在细胞增殖实验中来验证纯化的蛋白质的功能性。

实施例1c：购买Proleukin

Proleukin(经配制的重组hIL2，表达于大肠杆菌)从Chiron处购买。通过以上方法，得到3种不同来源的全功能性的重组hIL2抗原。

实施例2：产生人源化单克隆抗hIL2抗体

希望产生具有特别好的作用模式、特异靶向人hIL2并能中和其生物活性的人源化单克隆抗体(“mAb”)。一般而言，靶向分泌型可溶蛋白(如细胞因子hIL2)的中和mAb识别表位，所述表位至少部分与相应细胞因子受体成分所识别的表位重叠。因此，mAb直接与受体竞争结合细胞因子。该作用机制暗示了可有效实现中和。MAb必须以最高的剂量来应用以竞争过细胞因子受体。

实施例2a：起点--＞可商用的单克隆抗hIL2抗体作为蛋白质

为了能理解不同的抗hIL2 mAb能如上所述中和的程度，免疫小鼠来产生抗hIL2mAb，然后收集脾细胞并进行杂交瘤融合，这都根据标准规程来实现。另外，购买可商用的抗hIL2mAb。在3个测试中，用可用的mAb库来比较不同抗体的特征：通过ELISA测试与可溶抗原的结合，通过FACS测试与细胞表面相关抗原的结合，和通过细胞增殖试验测试中和hIL2生物活性的能力。

ELISA试验如下进行：

在20℃进行所有的孵育。用抗生物素蛋白链菌素包被的96孔ELISA板(Nunc)吸附PEG-生物素化的Proleukin，每孔为0.1μg溶于100μl PBS-TB(磷酸缓冲盐液，pH＝7.4，0.05％v/v Tween-20，1％w/v BSA)，进行30分钟。然后每孔用200μl PBS-T(磷酸缓冲盐液，pH＝7.4，0.05％v/vTween-20)洗板3次。加入不同的mAb样品，每孔100μl，并孵育样品1小时。然后每孔用200μl PBS-T洗板3次。所用的检测抗体是山羊抗人IgG HRP缀合的mAb，(Jackson Immunoresearch)，用PBS-TB以1∶1000稀释，每孔100μl，孵育1小时。然后每孔用200μl PBS-T洗板3次。通过与HRP底物：100μl 2，2′-连氮基-二[3-乙基-苯噻唑啉-6-磺酸](“ABTS”)底物缓冲液(Roche Diagnostics，ABTS片)孵育来最终定量抗体与抗原的结合，并孵育平板5至10分钟，直至显现出绿色染料。在96孔板读数仪上于405nm处测量染色情况。

FACS试验如下进行：

为了在细胞培养条件下使生长最优化，人自然杀伤淋巴瘤细胞系NKL依赖于在培养基(基本Iscove培养基(Biochrom AG；10％v/v胎牛血清(Biochrom AG)；100μg/ml青霉素/链霉素(Biochrom AG))中存在约5ng/mlhIL2。在试验准备过程中通过在无hIL2培养基上培养24小时来使每ml 1×10⁶个NKL细胞耗尽hIL2。临实验前用无hIL2培养基洗细胞。于4℃进行所有如下孵育30分钟；为了洗涤，PBS-F缓冲液(磷酸缓冲盐液，3％v/v胎牛血清)也于4℃使用。首先，溶于200μl培养基的2×10⁵个NKL细胞与1μg重组人hIL2孵育或在相同条件下不与hIL2一起孵育。然后洗细胞3次，每次用2ml PBS-F。然后于4℃将2×10⁵个细胞与不同的溶于200μl培养基的1μg小鼠抗hIL2 mAb孵育30分钟。再如上所述来洗细胞3次，最后与用200μl PBS-F以1∶1000稀释的FITC缀合的山羊抗小鼠IgG检测mAb(Jackson Immunoresearch)孵育。再洗3次后，在FACS器上分析其表面带有hIL2的细胞相对于普通细胞的细胞荧光。

增殖试验如下进行：

为了在细胞培养条件下使生长最优化，鼠CTL细胞系CTLL-2(LGCPromochem)依赖于在培养基(基本Iscove培养基(Biochrom AG；10％v/v胎牛血清(Biochrom AG)；100μg/ml青霉素/链霉素(Biochrom AG)；0.5mM 2-巯基乙醇(Gibco))中存在约5 ng/ml hIL2；。小鼠和人hIL2都能很好地维持CTLL-2细胞的生存和增殖。在试验准备过程中通过在无hIL2的培养基上培养12小时来使每ml 1×10⁶个CTLL-2细胞耗尽hIL2。

临实验前，用无hIL2的培养基洗细胞。用96孔组织培养板进行增殖实验并评估不同mAb对hIL2生物活性的抑制。每孔最终使用200μl测试体积，该体积包括：5×10⁴个CTLL-2细胞，2ng/ml hIL2(能达到大约半最大增殖)和浓度为5000ng/ml、1000ng/ml、200ng/ml和40ng/ml的不同抗hIL2mAb。所有样品重复制备3次。各混合物于37℃在存在5％二氧化碳的潮湿箱中孵育48小时。然后根据厂商推荐的方式，利用AlamarBlue荧光染料读出器(Biosource International)和96孔荧光板读出仪检测存活的细胞。

发现mAb202(可通过商业途径得自R&D Systems)(i)结合可溶抗原，(ii)结合细胞表面相关抗原，和(iii)有效中和hIL2生物活性。在测试的抗体中，在所有3个测试中仅有mAb 202得分，因此根据以上所定义的特征，它被认为是有前途的候选物，并因此被选为进行接下来的实验的起点。

实施例2b：测序确定抗hIL2抗体的一级序列：鉴定重链可变区(“VH”) 和轻链可变区(“VL”)序列

由于缺少可用的mAb202杂交瘤克隆，测序mAb以鉴定VH和VL氨基酸序列。为此，制备mAb202的Fab片段。使这些片段进行蛋白酶水解消化，用在线HPLC进行肽分离。然后，通过MS/MS质谱分析各个肽的氨基酸组成和序列。该方法鉴定了VH和VL蛋白质序列。

实施例2c：对保留的功能性的控制：测序的VH/VL区与已知的小鼠恒定区的融合

需要对上述mAb202蛋白质测序所得的测序结果进行功能确认。因此，合成编码被测序的VH的基因并克隆入能提供小鼠IgG1恒定区的表达载体。同样，合成编码被测序的VL的基因并克隆入能提供小鼠Cκ结构域的表达载体。这两个表达载体将理想地允许重建原来的mAb202，然后如上来重新测试其功能性。两个载体在293细胞中共表达后，在细胞上清液中检测抗IL2 mAb，比较那些在原来mAb202中观察到的特征。蛋白质测序后重构的mAb所观察到的活性(通过ELISA以及利用CTLL-2细胞系的增殖测试中)与亲本mAb202活性之间的一致性可用作确认由该抗体的VH和VL区所确定的序列正确的证明。

实施例2d：重链的人源化

人源化的目的是完全保留抗体的结合特异性和生物活性并使mAb中存在的非人序列成分最小化。后者的目的在于使抗体在向人受试者给药时比亲本抗体(非人源的)更不可能引发免疫应答。首先，产生嵌和重链的表达载体，其含原小鼠VH以及人IgG1同种型的C1、C2和C3结构域。表达嵌和重链后，当与嵌和轻链(见下)组合在一起时，可重新产生原小鼠mAb的特征(见下)。接下来的合理步骤是人源化VH区。为了避免特异性改变，保留CDR序列不变。因此，基于原小鼠VH，搜索最密切相关的人VH框架序列。在所有人VH框架中，发现人框架1-3/3-07/J6与原来的鼠框架有最高程度的同源性。发现人框架1-3/3-07/J6与相应小鼠VH框架有16个氨基酸残基的差异。以下比对显示了原来的小鼠和人1-3/3-07/J6 VH框架的直接比较；原CDR序列被下划线了，而两个序列的相同氨基酸用星号表示。

VH_小鼠 DVRLVESGGGLVKPGGSLKLSCAAYGFTFSSYTLAWVRQTPEKRLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRG

1-3/3-07/J6 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTLAWVRQAPGKGLEWVAAIDSSSYTYSPDTVRG

* ********* ***** ***** ************** * * *********************

VH_小鼠 RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTRDSNWDALDYWGQGTSVIVSS

1-3/3-07/J6 RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSNWDALDYWGQGTTVTVSS

*********** ***** ** **** *** *************** * ***

含原小鼠VH或人源化VH的构建体在下文将分别被称为cHC(嵌和重链(chimeric heavey chain)，其含小鼠VH和人C1、C2、C3)和hHC(含VH的人源化重链(humanized heavy chain)，其含人VH框架内的小鼠CDR区和人C1、C2、C3)。为了人源化重链的重组蛋白表达，编码人源化VH以及人IgG1同种型的C1、C2和C3结构域的开放阅读框被克隆入合适的载体(Raum T等(2001)Cancer Immunol Immunother.50，141-50)。

实施例2e：轻链的人源化

进行人源化的方法与上述重链的相似。简而言之，产生嵌和轻链的表达载体，其含原小鼠VL以及人Ck结构域，并在与嵌和重链(见上)共表达后测试。然后在第二步，基于原小鼠VL，搜索最密切相关的人VL框架序列。保留所有3个CDR。人VL框架O12/Jk4显示出是最密切相关的序列。小鼠VL和人O12/Jk4的VL框架中有总共22个氨基酸残基不同。以下比对显示了原来的小鼠和人O12/Jk4框架的直接比较；原CDR序列被下划线了，而两个序列的相同氨基酸用星号表示。

VL小鼠 DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVGWYQQKPGQSPKALIYSASFRYS

O12/Jk4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVGWYQQKPGKAPKLLIYSASFRYS

** **** * ****** ******************** ** **********

VL小鼠 GVPDRFTGSGSGTDFSLTISNVKSEDLAEYFCQQYYTYPYTFGGGTKLEIK

O12/Jk4 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGGGTKVEIK

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含原小鼠VL或人源化VL的构建体在下文将分别被称为cLC(嵌和轻链(chimeric light chain)，其含小鼠VL和人Cκ)和hLC(含VL的人源化轻链(humanized light chain)，其含人VL框架内的小鼠CDR区和人Cκ)。为了人源化轻链的重组蛋白表达，编码人源化VL以及人Ck结构域的开放阅读框被克隆入合适的载体(Raum T等(2001)Cancer Immunol Immunother.50，141-50)。

实施例2e.1：改变作为整个框架区的人和小鼠序列；通过增殖试验评估结合和中和性

进行了重和轻链的成功的人源化之后，测试得到的人源化mAb的特征，与嵌和mAb(即含完整的鼠可变结构域的抗体分子)比较。因为嵌和mAb显示出与原mAb有可比性的对IL2生物活性的中和性，所以它被用作这些实验的参照。编码重和轻链的表达载体对被用来瞬时共转染293细胞(所用的规程与实施例1b所述的转染过程一致，不同之处在于细胞用两个质粒同时转染)。

在293细胞中表达后，通过抗hIgG ELISA来检验可比量的不同型mAb，其如下进行：

用96孔ELISA板(Nunc)于4℃孵育以1∶2,000的稀释度溶于PBS的抗hIgG mAb(Abcam LTD)12小时，每孔100μl。用200μl PBS-T缓冲液洗每个孔3次，然后向每个孔注入从293细胞收获的100μl纯上清液和用培养基连续稀释的上清液，并于20℃孵育1小时。然后，用200μl PBS-T缓冲液洗每个孔3次。向孔加入1∶1,000稀释度的溶于PBS-TB的山羊抗人IgG HRP缀合的mAb(Jackson Immunoresearch)，每孔100μl，于20℃孵育1小时。然后，每孔用200μl PBS-T洗板3次。通过与HRP底物：100μlABTS底物缓冲液(Roche Diagnostics，ABTS片)孵育来最终定量抗体与hIgG的结合性，并孵育板5至10分钟直至显现出绿色染料。在96孔板读数仪上测量405nm处的染色情况。仅用含有相当量的mAb的上清液来进行所有的以下实验。通过ELISA(见上)来测试抗原与各种mAb的结合。

分别通过ELISA和CTLL-2增殖测试来分析与产生的mAb在可溶抗原结合性和对IL2生物活性的中和性上的特征(更详细的实验规程参见以上实施例2a)。在ELISA实验中，增加的吸收单位指示了mAb与hIL2抗原结合的增加量。在CTLL-2增殖测试中，增加的荧光单位指示了有代谢活性的(＝活)细胞的增加数量。通过抗hIgG ELISA，控制所有含不同型mAb的细胞上清液(“SN”)中mAb浓度一致，然后将它们进行以下实验。代表性的实验结果如图1所示。在本文中，hLC+hHC (hLC＝人源化轻链，hHC＝人源化重链)和cLC+hHC(cLC＝嵌和轻链)的组合都显示出相当的与hIL2抗原的结合性。CTLL-2测试的结果(图2)显示，hLH+hHC不会造成任何可检测的对hIL2生物活性的中和，这是因为检测到的荧光与对照SN并无不同。相反，cLH+hHC降低了活细胞数，其证据是mAb浓度依赖性荧光降低。在该测试中应用两个独立的cLC或hHC链，没有对hIL2依赖性细胞存活产生影响(数据未显示)。图2所示的有代表性的实验中的每个数据点代表重复样品的平均结果。所述测试结果在表1中有概括说明：

表1

轻链	重链	抗原结合性	中和性
轻链	重链	抗原结合性	中和性	hLC	HHC	+	-
cLC	HHC	+	+	hLC	HHC	+	-

这些结果证明了，尽管与可溶抗原的结合似乎并不是不同的，但是只要hLC一与人源化重链变体使用，就能使中和性丧失。结论是VL的人源化损害了mAb的一些功能。

为了确定何处(即框架区内的何处)导入了该损害，在不同节段(segment)内进行cLC VL框架的人源化，同一时刻仅将一个框架(即框架区1、框架区2或框架区3)从小鼠改变为人的，而不是同时改变3个框架。给出命名缩写并在下文使用，以指明这些人源化变体。根据该命名法，用3个大写字母产生三连词来命名最初3个框架区1、2和3中的每一个，其中三连词的第一位表明框架区1的性质，三连词的第二位表明框架区2的性质，而且三连词的第三位表明框架区3的性质。例如，“HMM”将表示鼠源的VL中的人框架区1，而“MHM”表示仅有框架区2是人的，而框架区1和3是鼠源的。

根据它们的效应来分析不同人/鼠杂交体VL结构域的特征。然后，分别通过ELISA和CTLL-2增殖试验来分析hIL2抗原的结合性和对IL2生物活性的中和(更详细的实验规程参见以上实施例2a)。在ELISA实验中，增加的吸收单位指示了mAb与hIL2抗原结合的增加量。在CTLL-2增殖测试中，增加的荧光单位指示了有代谢活性的(＝活)细胞的增加数量。利用抗hIgG ELISA，将所有含不同型mAb的细胞上清液(“SN”)控制为统一mAb浓度，然后将它们进行以下实验。代表性的实验结果如图3所示。在本文中，可以看到所有人/鼠杂交体VL在与hHC组合在一起时显示出相当的与hIL2抗原的结合性。CTLL-2试验的结果(图4)显示，只有VL框架2是鼠的，才能观察到对hIL2生物活性的中和；MHM+hHC相对于对照SN不改变活细胞数。在图4所示的有代表性的实验中的每个数据点代表了重复样品的平均值。所述试验的结果在表2中概括说明：

表2：

轻链	重链	抗原结合性	中和性
轻链	重链	抗原结合性	中和性	HMM	HHC	+	+
MHM	HHC	+	-	HMM	HHC	+	+
MHM	HHC	+	-	MMH	HHC	+	+
HMH	HHC	+	+	MMH	HHC	+	+

这些实验相当清晰地表明，VL的框架2决定了mAb是否能中和IL2生物活性。更详细的小鼠和人框架2序列的比较揭示了这些序列有3个氨基酸的差异。特别地，小鼠框架2包含部分氨基酸序列QSPKA，而相应人序列是KAPKL(为了清楚起见，人和小鼠物种间的氨基酸差异用下划线划出)。

实施例2e.2：改变框架2内的人和任意小鼠序列；通过增殖试验和靶基因诱导试验评估结合性和中和性

为了确定是所有3个氨基酸改变还是仅有一些改变在提供中和性mAb方面起决定作用，进行另一组实验。为此，源于小鼠的氨基酸残基QS或A被重新导入hLC。

通过ELISA和CTLL-2增殖试验分别分析得到的mAb在可溶抗原结合性和对IL2生物活性的中和上的特征(更详细的实验规程参见以上实施例2a)。在ELISA实验中，增加的吸收单位指示了mAb与hIL2抗原结合的增加量。在CTLL-2增殖测试中，增加的荧光单位指示了有代谢活性的(＝活)细胞的增加数量。通过抗hIgG ELISA，将所有含不同mAb的细胞SN控制为统一mAb浓度，然后将它们进行以下实验。图5显示了有代表性的实验结果。从此可清楚地见到，QSPKL+hHC和KAPKA+hHC型都显示出与hIL2抗原相当的结合性。CTLL-2试验(图6)表明，QSKPL+hHC不会造成任何可检测到的对hIL2生物活性的中和，这是因为检测到的荧光与对照SN并无不同。相反，KAPKA+hHC减少了活细胞数，其证据为mAb浓度依赖性荧光降低。图6所示的有代表性的实验中的每个数据点代表重复样品的平均值。所述试验的结果在表3中概括说明。

表3：

轻链	重链	抗原结合性	中和性
轻链	重链	抗原结合性	中和性	hLC	HHC	+	-
hLC_QSPKL	HHC	+	-	hLC	HHC	+	-
hLC_QSPKL	HHC	+	-	hLC_KAPKA	HHC	+	+

这表明，如果mAb能中和IL2生物活性，则以下位于VL框架2中的单个氨基酸残基作如下限定：源于小鼠框架2的在该位置中的丙氨酸残基能中和，而源于人框架2的亮氨酸残基不能。

实施例3：确定中和模式

以下，术语“抗IL2”表示人源化抗IL2抗体，其包含含如SEQ IDNO：9所示氨基酸序列的轻链(本身包含带有如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的VL区)和含如SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的重链(本身包含带有如SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的VL区)。如以上实施例2e.2所解释的，抗IL2的VL包含氨基酸序列“KAPKA”。

希望更好地理解抗IL2中和hIL2的模式。为此，进行实验以研究hIL2和hIL2受体成份与抗IL2结合的性质。

由于NKL细胞需要IL2才能存活，推测这些细胞能表达IL2的功能性受体。根据以上详述的过程来进行FACS实验。简而言之，细胞与抗hIL2mAb和物种特异性的第二检测抗体的混合物(“预混物”)一起孵育。第二抗体与荧光标记缀合。利用FACS在存在和缺失hIL2的情况下监测细胞荧光。进行以下实验场景来解答是否需要某些孵育次序来得到所观察效果的问题。

在第一个场景中，预混物与或不与hIL2一起孵育30分钟，然后加入NKL细胞。以hIL2依赖性的方式观察到细胞荧光。在第二个场景中，NKL细胞与或不与hIL2一起孵育30分钟，然后加入预混物。然后，以hIL2依赖性的方式观察到细胞荧光。

这些实验证实了hIL2在与抗IL2结合时，仍旧能结合其受体，并进一步证实了hIL2在与其受体连接时仍旧能与抗IL2相互作用。

这些结果证实了，如上产生的抗IL2所结合的hIL2表位是独特的，至少部分与hIL2受体结合的hIL2表位不同。该中和模式是值得注意的，这是因为它暗示了中和hIL2是通过结合该分子可溶的或受体结合的形式来实现的。然后按时间顺序来看，这是指hIL2和抗IL2间的结合事件在hIL2和hIL2-受体间的复合物形成之前或之后发生；在任一种情况下，都能导致hIL2生物活性的中和。因而通过外推，可以推测，在两个相关结合事件-形成hIL2和hIL2-受体间的复合物和hIL2和抗IL2间的复合物-同时发生的情况中，也能导致中和。

应当注意，该观察到的抗IL2的中和模式与其他已知中和模式形成极大反差，其他已知中和模式中被中和性抗配体抗体和配体受体结合的表位是同一和相同的；在该常规的场景下，不可能有配体、配体-受体和中和性抗配体抗体间的三重复合物存在。在该常规中和模式中，差异表达的配体必须被中和性抗配体抗体结合，而配体仍旧是可溶形式的，由此不能形成配体和配体-受体间复合物。

实施例4：抗IL2与人自然杀伤淋巴瘤细胞系NKL的IL2依赖性结合

在该实施例中，研究了抗IL2与细胞表面相关的hIL2的结合特异性。抗IL2亲本Ab(mAb202)显示出严格IL2依赖性的与NKL细胞的细胞表面的结合。因此抗IL2的该特定特征必须要被确证。

实验前先使NKL细胞耗尽hIL2 24h。抗IL2或人IgG1同种型对照抗体在缺失或存在2倍摩尔量过量的hIL2的情况下于20℃孵育60分钟。然后将各混合物加入NKL细胞(每样品10⁵个细胞)中并进一步在冰上孵育30分钟。然后，全面洗细胞并加入荧光标记的山羊抗人IgG检测抗体，然后在冰上孵育30分钟。然后再洗细胞，接着进行FACS分析以研究细胞相关的荧光。

如预期的，在缺失hIL2的情况下，用抗IL2或对照抗体，没有显著的细胞相关的荧光被检测到(图10，左图)。在存在hIL2的情况下，用对照抗体，细胞相关的荧光没有变化(图10，右图，阴影峰)。相反与hIL2和抗IL2一起孵育会造成荧光大幅度增长(图10，右图，黑边的峰)，这显示抗IL2与细胞表面有IL2依赖性结合。因此，识别细胞表面相关的hIL2的能力在抗IL2中被保留了。该实验提供了证据表明，抗IL2不仅能识别溶液中的hIL2，而且能识别与其受体成份之一或几个相连的hIL2。因此，hIL2能以非排他性的方式与抗IL2和IL2受体成份相连。

实施例5：抗IL2消除了CTLL-2细胞上IL2依赖性的CD124细胞表面表达的上调

用hIL2刺激后，CTLL-2细胞增殖并上调了CD124(IL-4Rα)的细胞表面的表达(Puri，R.K.，等(1990).Immunology 70，492)。因而通过IL2刺激，CTLL-2细胞获得了对经由IL-4的伴随性刺激的增加了的灵敏度。因此，抗IL2不仅限制IL2介导的增殖，而且能影响CD124表达。

为了检验该假设，在实验前将CTLL-2细胞在缺失hIL2的情况下培养12h，然后在存在或缺失滴定确定的抗IL2浓度的情况下用0.5ng/ml hIL2刺激5h。通过FACS分析，用荧光标记的CD124特异性抗体评估CD124表达水平。用检测到的平均荧光密度相对于不同的抗IL2浓度作图(图11，带黑线的空心方块)；在缺失抗IL2(图11，实心菱形)或缺失IL2(图11，实心三角)的情况下记录的平均荧光值作为对照。如图11所证实的，抗IL2以剂量依赖性方式降低了CD124表达；该试验计算得到的IC50约为3.3×10^-10M。这些数据暗示，抗IL2不仅影响CTLL-2细胞的增殖，而且影响其他IL2依赖性细胞应答，如CD124表达。

实施例6：抗IL2特异阻断IL2R的IL2信号转换下游

进行该实验以进一步排除抗IL2介导其对hIL2依赖性细胞应答的影响部分是通过某些细胞毒性机制的可能性，并确认抗IL2作用的机制高度特异于hIL2驱动的信号传递，但不影响相关的途径。在IL2介导的信号传递途径的最快速的细胞事件中的是转录因子STAT3的酪氨酸磷酸化(Leonard，W.J.2000.IL2 Family Cytokines and their Receptors)。其他细胞因子(如IL-6)引发了也涉及STAT3的部分重叠的细胞信号传递途径，(Hemmann，U.，等(1996).J Biol Chem 271，12999；Stahl，N.，等(1995).Science 267，1349)。

因此，测试抗IL2对IL2-和IL6驱动的STAT3酪氨酸磷酸化的影响。外周血淋巴细胞分离自新鲜供体血中，以2×10⁶个细胞/ml来孵育，预先用凝集素刺激48h，然后在刺激前在培养基中静息24h。然后在没有mAb或存在抗IL2或同种型对照单克隆抗体的情况下，用饱和浓度的IL2或IL6/sIL6R刺激细胞15分钟。用SDS-PAGE分离细胞质提取物之后，通过免疫印迹，利用STAT3酪氨酸磷酸化特异性抗体检查STAT3的磷酸化状态(图12，上一排)。为了控制相当的上样量，还进行总STAT3蛋白质印迹(图12，下一排)。标准蛋白质的电泳迁移率示于图12中每一排的左侧。

在缺失抗IL2的情况下，IL2和IL-6的刺激都极大地增强了STAT3的酪氨酸磷酸化(图12，相对于泳道1的泳道2和3，或相对于泳道1的泳道6和7)。因此在IL2刺激后，抗IL2特异影响STAT3的酪氨酸磷酸化，但在IL6刺激后不影响(图12，相对于泳道5的泳道4)。这些数据证实了，抗IL2高度特异地干扰hIL2的生物功能，而不影响其他因子调节的途径，抗IL2也没有显著的细胞毒性效应。

实施例7：抗IL2和Daclizumab的功效有差异地受CD25表达水平影响

在增殖试验中利用IL2依赖性细胞系NKL，并行比较Daclizumab(人源化抗CD25 mAb)与抗IL2和同种型对照抗体的抑制活性(图13)。

为了研究通过抗IL2或Daclizumab的CD25细胞表面表达水平对IL2诱导的细胞增殖的影响，NKL细胞进行FACS分选，选出低或高水平表达CD25的，在该实验中并行研究这两种细胞群。用于FACS分选的抗CD25mAb不干扰IL2或Daclizumab与CD25的结合(数据未显示)。分选后通过FACS可能立即区别出CD25^低和CD25^高群，在5天的实验进程中，合并两种群，使CD25表达水平与在分选前的相当。这暗示了，在该试验获得的结果在最初阶段清楚地分开了CD25^低对CD25^高群，但在该实验以后阶段不能。因此，比较CD25^低和CD25^高群时观察到的抗IL2或Daclizumab造成的增殖抑制的差异是有限的，这归因于不稳定的CD25表达水平；还有清楚的趋势表明，从这些数据中可推导出不同CD25依赖程度的Daclizumab和抗IL2功效。在准备实验中通过在无hIL2培养基中培养使NKL细胞饥饿16小时。每孔使用200μl的最终试验体积，其包括：1×10⁴个NKL细胞，2ng/ml hIL2(以允许半最大增殖)，和滴定确定浓度的不同单克隆抗体。所有样品都重复制备。各混合物都孵育120小时，然后用荧光染料使活细胞能被看到。

在该试验中，与Daclizumab相比，抗IL2一般能更有效地中和IL2介导的增殖。如所预测的，抗IL2的功效不受CD25表达水平影响：在CD25^低和CD25^高NKL细胞中，用抗IL2得到的曲线基本上重合。相反，用Daclizumab得到的曲线在CD25^低中与CD25^高NKL细胞相比显示出清楚的差异。同种型对照Ab没有效果(图13)。总之，该实验提供了体外证据表明，Daclizumab的功效是依赖于CD25水平的，而抗IL2不是。

实施例8：抗IL2或Daclizumab对原代人NK细胞的IL2依赖性增殖的影响

不仅是原代T细胞，而且有原代NK细胞，都能应答IL2刺激以增殖。因此在进一步的实验中，研究新分离的人NK细胞的IL2诱导的增殖的抑制性。

自供体血负分离(negative isolation)而得到细胞并与hIL2(5.5ng/ml)在存在或缺失滴定确定的抗IL2或Daclizumab情况下孵育。对照抗体仅以最高浓度应用；另一对照在缺失IL2和抗体的情况下与细胞一起进行孵育。用荧光染料在一周孵育期的末尾定量活细胞。在该实验中，抗IL2基本能降低IL2驱动的原代人NK细胞的增殖。当高抗IL2浓度时，增殖基本限于在缺失IL2的情况下观察到的水平，这表明抗IL2影响在该试验中存在的所有有IL2应答的NK细胞。相反，Daclizumab仅显示出效应幅度大为降低，这提示了该抗体的存在仅影响部分NK细胞(图14)。为了进一步研究该发现，在用IL2和抗体进行的一周孵育期中监测CD25表达水平：来自供体的总NK细胞仅有约11％显示获得CD25表达，在第3天最大，并在第7天掉至2％。同样，从所有供体中新分离的NK细胞没有可检测到的CD25表达，而且所有分析的个体的NK细胞中找到了相似的CD25表达水平和动力学情况(数据未显示)。这解释了为什么Daclizumab仅能抑制部分NK细胞的增殖(图14)。抗IL2也显示能不依赖CD25表达水平并能阻断所有NK细胞的增殖，其IC50值约为3×10^-10M。这些结果提供了强有力的指标，即抗IL2能通过中等亲和性IL2受体CD122/CD132来干扰IL2介导的信号，不依赖于CD25，而Daclizumab却不能。

实施例9：抗IL2或Daclizumab对NK细胞IFN-γ的IL2依赖性释放的影响

除了增殖，原代NK细胞对细胞因子刺激的典型和迅速的应答是释放IFN-γ。在进一步实验中测量依赖于抗IL2和Daclizumab的后者的释放。

在该试验中，新分离的人NK细胞用含hIL2(5.5ng/ml)、hIL12(5ng/ml)和hIL18(5ng/ml)的混合物来刺激，刺激这些细胞有效产生并释放IFN-γ。比较滴定测定的抗IL2、Daclizumab和同种型对照抗体在孵育最初的48h内对IFN-γ释放的影响。抗IL2和Daclizumab都能以剂量依赖性方式减少IFN-γ的表达，而对照抗体没有效果(图15)。抗IL2是更有效的IFN-γ释放抑制剂，相对于Daclizumab的约1.1×10^-9M，其得到的IC50约为1.3×10^-10M(图15)。与前面实施例所述实验相反，该实验设置中的所有NK细胞都能进行CD25表达(数据未显示)，这解释了与NK细胞增殖相比，Daclizumab对IFN-γ有更深的影响。

表4概括说明了抗IL2和Daclizumab的平衡结合常数(K_D)，以及，用实施例8和9所述的两种Ab进行的并行比较实验中得到的IC50值。

表4：

特征	单位	抗IL2	Daclizumab
特征	单位	抗IL2	Daclizumab	结合亲和性	平衡解离常数(K_D)	6.8±6.1×10^-10M(BiaCore)2.5±1.6×10^-9M(细胞表面)	3.0×10^-9M^#
人原代NK细胞的增殖	IC50	1.0±0.6×10^-10M	1.4±0.4×10^-9M*	结合亲和性	平衡解离常数(K_D)	6.8±6.1×10^-10M(BiaCore)2.5±1.6×10^-9M(细胞表面)	3.0×10^-9M^#
人原代NK细胞的增殖	IC50	1.0±0.6×10^-10M	1.4±0.4×10^-9M*	人NK细胞的IFN-γ产量	IC50	1.3±1.0×10^-10M	1.1±0.8×10^-9M

^#根据Junghans，R.P.，等(1990).Cancer Res 50，1495.

^*基于总NK细胞群的～10％，其表达CD25

序列表

<110>米克罗麦特股份公司(Micromet AG)

<120>抗IL2抗体

<130>MIC-026 PCT

<140>

<141>2006-05-31

<150>EP 05 011 845.4

<151>2005-06-01

<160>12

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>CDR-L1

<400>1

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Gly

1 5 10

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

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<400>2

Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Ser

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

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Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

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<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

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<223>CDR-H1

<400>4

Ser Tyr Thr Leu Ala

1 5

<210>5

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<213>人工序列

<220>

<223>CDR-H2

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Ala Ile Asp Ser Ser Ser Tyr Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Val Arg Gly

1 5 10 15

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<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>CDR-H3

<400>6

Asp Ser AsR Trp Asp Ala Leu Asp Tyr

1 5

<210>7

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210>8

<211>117

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Leu Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asp Ser Ser Ser Tyr Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Val Arg

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Ser Asn Trp Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210>9

<211>214

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>LC

<400>9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

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Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210>10

<211>447

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>HC

<400>10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Leu Ala Trp ValArg Gln Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asp Ser Ser Ser Tyr Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Val Arg

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Ser Asn Trp Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210>11

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>scFv VL-VH

<400>11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

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Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

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Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Leu Ala Trp Val Arg

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>scFv VH-VL

<400>12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

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Thr Leu Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Val Gly Thr Asn Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

165 170 175

Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser

180 185 190

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

195 200 205

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr

210 215 220

Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230 235

Claims

1.特异结合人白细胞介素-2(IL2)的人源化单克隆抗体或其片段，

●其中所述人源化单克隆抗体通过在所述人IL2与人IL2-受体结合之前、过程中、和/或之后结合所述人IL2来中和人IL2的活性，而且

●其中所述人源化单克隆抗体的轻链可变区在其第二框架区中包含连续的氨基酸序列KAPKA。

2.权利要求1的人源化单克隆抗体或其片段，其中连续的氨基酸序列KAPKA位于第二框架区的氨基酸位置第42-46位上。

3.权利要求1或2的人源化单克隆抗体或其片段，其中第一、第三和/或第四轻链框架区之至少一个对应于那个/那些区域的人生殖系序列。

4.前述权利要求之任一项的人源化单克隆抗体或其片段，其中轻链可变区在其CDR1区还包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，在其CDR2区还包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列而且在其CDR3区还包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；而且其中重链可变区在其CDR1区包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，在其CDR2区包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列而且在其CDR3区包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

5.前述权利要求之任一项的人源化单克隆抗体或其片段，其中第一、第三和/或第四轻链框架区之至少一个对应于那个/那些区域的人生殖系序列。

6.前述权利要求之任一项的人源化单克隆抗体或其片段，其中第一轻链框架区的氨基酸序列、第二轻链框架区的剩余氨基酸序列(即包括氨基酸位置第35-41和47-49位)、和第三轻链框架区的氨基酸序列对应于基因座O12、O2、O18、O8、A30、L1、L15、L4、L18、L5、L19、L8、L23、L9、L11或L12上的人生殖系亚群VKI的那些中任何氨基酸序列；或基因座1a上的人生殖系亚群VL1的；或基因座2c、2e、2a2或2b2上的人生殖系亚群VL2的那些中的任何氨基酸序列。

7.前述权利要求之任一项的人源化单克隆抗体或其片段，其中第一重链框架区的氨基酸序列、第二重链框架区的氨基酸序列、和第三重链框架区的氨基酸序列分别对应于人生殖系亚群VH3的那些中任何氨基酸序列。

8.权利要求7的人源化单克隆抗体或其片段，其中第一重链框架区的氨基酸序列、第二重链框架区的氨基酸序列、和第三重链框架区的氨基酸序列与人生殖系亚群VH3的基因座3-07中的一样。

9.权利要求6至8之任一项的人源化单克隆抗体或其片段，其中第四轻链框架区的氨基酸序列对应于人JK4的氨基酸序列(FGGGTKVEIK)。

10.前述权利要求之任一项的人源化单克隆抗体或其片段，其中所述人源化单克隆抗体包含含如SEQ ID NO.7所示氨基酸序列的轻链可变区和含如SEQ ID NO.8所示氨基酸序列的重链可变区。

11.前述权利要求之任一项的人源化单克隆抗体，其中所述人源化单克隆抗体包含含如SEQ ID NO.9所示氨基酸序列的轻链和含如SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的重链。

12.前述权利要求之任一项所述的人源化单克隆抗体，其中所述抗体是IgG。

13.权利要求12所述的人源化单克隆抗体，其中所述IgG是IgG1或IgG4。

14.权利要求1至10之任一项所述的所述人源化单克隆抗体的片段，其中所述片段是scFv、单结构域抗体、Fv、双抗体、串联的双抗体、Fab、Fab’或F(ab)2。

15.权利要求14所述的所述人源化单克隆抗体的片段，其中所述片段是scFv，尤其其中所述scFv在其轻链可变区中包含如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列和在其重链可变区中包含如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

16.权利要求15所述的所述人源化单克隆抗体的片段，其中所述scFv包含如SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。

17.前述权利要求之任一项的人源化单克隆抗体或其片段，所述人源化单克隆抗体或其片段包含分别与如SEQ ID NO：1-12之任一所示的氨基酸序列有至少70％同源性、优选至少80、90、或更好的至少95％同源性的氨基酸序列。

18.多核苷酸分子，其包含编码如SEQ ID NO.1-12之任一所示氨基酸序列的核苷酸序列、或显示出与所述核苷酸序列有至少60％、优选65、70、75、80、85、90、或95％同源性的核苷酸序列，

其中同源性可通过序列比对将包含编码SEQ ID NO：1-12之任一氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸分子与具有所论及的核苷酸序列的多核苷酸分子进行比较而确定，

其中，如果所述序列中的核苷酸与编码SEQ ID NO：1-12之任一的相应氨基酸序列的核苷酸序列中的相应核苷酸一致，或者如果所论及的序列中的一个或多个核苷酸相对于编码SEQ ID NO：1-12之任一氨基酸序列的核苷酸序列中一个或多个相应核苷酸有差别，使核苷酸三联体在被翻译后产生与SEQ ID NO：1-12之任一的相应氨基酸序列中相应氨基酸相同(由于简并三联体而造成)或保守替代，则所论及的序列中的核苷酸被认为是同源的。

19.药物组合物，其包含权利要求1-17之任一项所述的人源化单克隆抗体或其片段或权利要求18所述的多核苷酸分子。

20.权利要求19的药物组合物，其中所述药物组合物进一步包含一种或多种抗炎症或抗癌药物。

21.权利要求1至17之任一项所述的人源化单克隆抗体或其片段或权利要求18所述的多核苷酸分子在制备用于治疗哺乳动物，优选人的炎性疾病的药物中的用途，所述药物中任选包含一种或多种其他抗炎剂。

22.权利要求21的用途，其中所述炎性疾病选自由类风湿性关节炎(RA)、哮喘、多发性硬化(MS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、特发性肺纤维变性(IPF)、炎性肠病(IBD)、色素层炎、黄斑变性、结肠炎、牛皮癣、沃勒变性、抗磷脂综合症(APS)、急性冠状动脉综合症、再狭窄、动脉粥样硬化、复发性多软骨炎(RP)、急性或慢性肝炎、失败的整形外科植入、肾小球肾炎、狼疮、自身免疫疾病、急性胰腺炎或强直性脊柱炎(AS)组成的组。

23.权利要求1-17任一项所述的人单克隆抗体或其片段或权利要求18所述的多核苷酸分子在制备用于治疗哺乳动物，优选人的肿瘤性疾病或其他具有延迟细胞凋亡、增强细胞存活或增殖的病症的药物中的用途，所述药物任选包含一种或多种其他抗癌剂。

24.权利要求23的用途，其中所述肿瘤性疾病是癌。

25.权利要求24的用途，其中所述癌是白血病、多发性骨髓瘤、胃癌或皮肤癌。

26.治疗炎性疾病的方法，其中将权利要求1-17任一项所述的人源化单克隆抗体或其片段或权利要求18的多核苷酸分子以足以防止和/或改善所述炎性疾病的量和时间(任选与一种或多种其他抗炎试剂一起)来给药于哺乳动物，优选给药于人受试者。

27.权利要求26的方法，其中所述炎性疾病选自由类风湿性关节炎(RA)、哮喘、多发性硬化(MS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、特发性肺纤维变性(IPF)、炎性肠病(IBD)、色素层炎、黄斑变性、结肠炎、牛皮癣、沃勒变性、抗磷脂综合症(APS)、急性冠状动脉综合症、再狭窄、动脉粥样硬化、复发性多软骨炎(RP)、急性或慢性肝炎、失败的整形外科植入、肾小球肾炎、狼疮、自身免疫疾病、急性胰腺炎或强直性脊柱炎(AS)组成的组。

28.治疗肿瘤性疾病的方法，其中将上文所述的人源化单克隆抗体或其片段或上文所述的多核苷酸分子以足以防止和/或改善所述肿瘤性疾病或其他具有延迟细胞凋亡、增强细胞存活或增殖的病症的量和时间(任选与一种或多种其他抗癌试剂一起)来给药于哺乳动物，优选给药于人受试者。

29.权利要求28的方法，其中所述肿瘤性疾病是癌。

30.权利要求29的方法，其中所述癌是白血病、多发性骨髓瘤、胃癌或皮肤癌。