JPWO2020090892A1 - 抗ヒトFn14抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]
配列番号2のアミノ酸番号31から35までのアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2のアミノ酸番号50から65までのアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号2のアミノ酸番号98から114までのアミノ酸配列からなるCDR3とを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号4のアミノ酸番号24から40までのアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号4のアミノ酸番号56から62までのアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号4のアミノ酸番号95から103までのアミノ酸配列からなるCDR3とを含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント。
[2]
以下の(1)及び(2)から選択される、[1]に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント:
(1)配列番号2のアミノ酸番号1から125までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号4のアミノ酸番号1から114までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント;並びに
(2)上記(1)の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメント。
[3]
配列番号2のアミノ酸番号1から125までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号4のアミノ酸番号1から114までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、[2]に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント。
[4]
翻訳後修飾が、重鎖可変領域N末端のピログルタミル化及び/又は重鎖C末端のリジン欠失である、[2]に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント。
[5]
配列番号2のアミノ酸番号1から125までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号2のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域、及び、配列番号4のアミノ酸番号1から114までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、[2]に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント。
[6]
以下の(3)及び(4)から選択される、[2]に記載の抗ヒトFn14抗体:
(3)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトFn14抗体;並びに
(4)上記(3)の抗体の翻訳後修飾により生じた抗体である、抗ヒトFn14抗体。
[7]
配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、[6]に記載の抗ヒトFn14抗体。
[8]
翻訳後修飾が、重鎖N末端のピログルタミル化及び/又は重鎖C末端のリジン欠失である、[6]に記載の抗ヒトFn14抗体。
[9]
配列番号2のアミノ酸番号1から454までのアミノ酸配列からなる重鎖であって、配列番号2のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖、及び、配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、[8]に記載の抗ヒトFn14抗体。
[10]
一本鎖可変領域フラグメント、Fab、Fab’、又はF(ab’)2である、[1]〜[5]のいずれかに記載の抗原結合フラグメント。
[11]
[3]に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
[12]
[3]に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
[13]
[11]及び/又は[12]に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
[14]
以下の(a)〜(d)からなる群より選択される、宿主細胞:
(a)[3]に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)[3]に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞;
(c)[3]に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
(d)[3]に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
[15]
以下の(e)〜(h)からなる群より選択される、宿主細胞:
(e)[7]に記載の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(f)[7]に記載の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞;
(g)[7]に記載の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
(h)[7]に記載の抗ヒトFn14抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
[16]
以下の(A)〜(C)からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含する抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法:
(A)[3]に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(B)[3]に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞;並びに
(C)[3]に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
[17]
以下の(D)〜(F)からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトFn14抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトFn14抗体を生産する方法:
(D)[7]に記載の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(E)[7]に記載の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞;並びに
(F)[7]に記載の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗ヒトFn14抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
[18]
[16]に記載の方法で生産された抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント。
[19]
[17]に記載の方法で生産された抗ヒトFn14抗体。
[20]
[1]〜[10]、[18]、及び[19]のいずれかに記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント、並びに薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
[21]
[3]に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント、[5]に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
[22]
[7]に記載の抗ヒトFn14抗体、[9]に記載の抗ヒトFn14抗体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
[23]
がん悪液質の予防又は治療用医薬組成物である、[20]〜[22]のいずれかに記載の医薬組成物。
[24]
[1]〜[10]、[18]、及び[19]のいずれかに記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与する工程を包含する、がん悪液質を予防又は治療する方法。
[25]
がん悪液質の予防又は治療に使用するための、[1]〜[10]、[18]、及び[19]のいずれかに記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント。
[26]
がん悪液質の予防又は治療用医薬組成物の製造における、[1]〜[10]、[18]、及び[19]のいずれかに記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
[27]
[1]〜[10]、[18]、及び[19]のいずれかに記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む、がん又はがん悪液質の予防又は治療用医薬組成物であって、かつ抗がん剤と併用されるものである、医薬組成物。
[28]
抗がん剤を含む、がん又はがん悪液質の予防又は治療用医薬組成物であって、[1]〜[10]、[18]、及び[19]のいずれかに記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントと併用されるものである、医薬組成物。
本発明の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントには、以下の特徴を有する抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントが含まれる。
配列番号2のアミノ酸番号31から35までのアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2のアミノ酸番号50から65までのアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号2のアミノ酸番号98から114までのアミノ酸配列からなるCDR3とを含む重鎖可変領域、並びに配列番号4のアミノ酸番号24から40までのアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号4のアミノ酸番号56から62までのアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号4のアミノ酸番号95から103までのアミノ酸配列からなるCDR3とを含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント。
本発明のポリヌクレオチドには、本発明の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、本発明の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
本発明の発現ベクターには、本発明の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び/又は本発明の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
本発明の形質転換された宿主細胞としては、本発明の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、本発明の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞が挙げられる。
(a)本発明の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)本発明の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞;
(c)本発明の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
(d)本発明の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
(e)本発明の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(f)本発明の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞;
(g)本発明の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
(h)本発明の抗ヒトFn14抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
本発明の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法には、以下の(A)〜(C)からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法が含まれる。
(A)本発明の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(B)本発明の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞;並びに
(C)本発明の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
(D)本発明の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(E)本発明の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞;並びに
(F)本発明の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
本発明の医薬組成物には、本発明の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与、及び筋肉内投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。
配列番号2のアミノ酸番号1から125までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号4のアミノ酸番号1から114までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント、並びに、該抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメントである、抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物。
(5)配列番号2のアミノ酸番号1から454までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトFn14抗体。
(6)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖であって、配列番号2のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトFn14抗体。
(7)配列番号2のアミノ酸番号1から454までのアミノ酸配列からなる重鎖であって、配列番号2のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトFn14抗体。
(8)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトFn14抗体。
本発明者らは、抗Fn14抗体を取得するための抗原及びスクリーニング試験に用いる材料として使用するため、ヒトFn14−ヒトFc融合タンパク質及びマウスFn14−マウスFc融合タンパク質を作製した。ヒトFn14−ヒトFc融合タンパク質は、ヒトFn14配列の細胞外部分配列(NCBIアクセッション番号:NP_057723.1の1番目から79番目のアミノ酸)のC末端と、ヒトFc領域(NCBIアクセッション番号:P01857.1の106番目から330番目のアミノ酸)のN末端をペプチドリンカー(配列番号9)で連結した融合タンパク質である。また、マウスFn14−マウスFc融合タンパク質は、マウスFn14配列の細胞外部分配列(NCBIアクセッション番号:AAF07882.1の1番目から75番目のアミノ酸)のC末端と、マウスFc領域のN末端を連結した融合タンパク質であり、具体的にはマウスFn14配列の細胞外部分配列をコードする遺伝子をpFUSE−mIgG2B−Fc1(InvivoGen社、pfuse−mg2bfc1)のhEF1−HTLVプロモーター領域とmIgG2B−Fc領域の間のマルチクローニングサイトに制限酵素EcoRIとEcoRVを用いて組み込み、発現させた融合タンパク質である。GSベクターpEE12.4(Lonza社)に前述の融合タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターをそれぞれ作製し、CHO−K1SV細胞(Lonza社)にそれぞれ導入した。当該CHO−K1SV細胞の培養上清から、定法に従い、ヒトFn14−ヒトFc融合タンパク質及びマウスFn14−マウスFc融合タンパク質をそれぞれ精製した。
ヒトモノクローナル抗体開発技術「ベロシミューン」(VelocImmune antibody technology:Regeneron社(米国特許6596541号))マウスを用いて抗体を作製した。ベロシミューン技術により得られた抗体は、ヒト抗体の可変領域とマウス抗体の定常領域を有する抗体(キメラ抗体とも称する)である。ベロシミューンマウスに、免疫反応を惹起するアジュバントと共に、実施例1で作製したヒトFn14−ヒトFc融合タンパク質からFabRICATOR(Sigma社、77661)を用いてヒトFc領域を切断・除去したヒトFn14タンパク質を免疫した。定法に従い、免疫したマウスのリンパ節から採取したリンパ球を、マウス由来ミエローマ細胞SP2/0−Ag14(ATCC:CRL−1581)と細胞融合することでハイブリドーマを作製し、モノクローン化した。ヒトFn14に結合し、かつ、Tweak刺激によるNFkBの活性化(以下、後記実施例において、「Tweak誘導NFkB活性化」と称する)を抑制する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、培養上清から抗体を精製した。
実施例2で見出した抗体のヒトFn14に対するアゴニスト作用を評価するために、Tweak非存在下での抗体のNFkB活性化に対する作用を、レポーターアッセイで評価した。具体的には、NFkB転写応答配列が組み込まれたルシフェラーゼレポーターベクターpGL4.32(Promega社、E8491)を安定的に導入したHEK293細胞(ATCC、CRL−1573)(以下、NFkB/HEK293細胞と称する)を作製し、評価に用いた。
実施例3で選別した抗体を産生するハイブリドーマから、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子をクローニングし、配列決定した。抗体の配列決定後、重鎖可変領域遺伝子の5’側にシグナル配列(Wittle N et al.、Protein Engineering.1987、Vol.1 No.6、p.499−505)をコードする遺伝子を、そして3’側にL234A及びL235Aのアミノ酸変異を有するヒトIgγ1定常領域遺伝子(配列番号1の塩基番号376番目から1365番目までの塩基配列からなる)をそれぞれ繋げ、この重鎖遺伝子をGSベクターpEE6.4(Lonza社)に挿入した。また軽鎖可変領域遺伝子の5’側にはシグナル配列(Wittle N et al.、Protein Engineering.1987、Vol.1 No.6、p.499−505)をコードする遺伝子を、そして3’側にヒトκ鎖の定常領域遺伝子(配列番号3の塩基番号343番目から660番目までの塩基配列からなる)をそれぞれ繋げ、この軽鎖遺伝子をGSベクターpEE12.4に挿入した。これらのGSベクターをNotI−HFとPvuI−HFで制限酵素切断し、DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(TaKaRa社、6023)を用いてライゲーションを行い、重鎖と軽鎖の両遺伝子が挿入されたGSベクターを構築した。このベクターをトランスフェクトしたCHO−K1SV細胞の培養上清から、定法に従い抗体を精製して4−1の完全ヒト型抗体を取得し、4−1hと命名した。
精製した4−1hのアミノ酸修飾分析をした結果、精製抗体の大部分において、重鎖N末端のピログルタミル化及びC末端のリジン欠失が生じていた。
実施例4で取得した4−1h及び4−1mの、Fn14タンパク質に対する結合活性を評価した。実施例1で取得したヒトFn14−ヒトFc融合タンパク質及びマウスFn14−マウスFc融合タンパク質をリン酸バッファー生理食塩水(PBS)にて1μg/mLに希釈し、マキシソープ384ウェル透明プレート(Nunc社、464718)に1ウェルあたり15μL添加し、一晩4℃でインキュベートすることで、固相化した。翌日固相液を除き、0.05%Tween−20含有トリス緩衝生理食塩水(TBS−T)で洗浄した。20%のBlocking One(ナカライテスク社、03953−95)を含むPBSを1ウェルあたり50μL添加し、室温で1時間静置した後、TBS−Tで洗浄した。実施例4で取得した4−1h又は4−1mを、5%Blocking Oneを含むTBS−T(以下、希釈液と称する)を用いて、最高濃度30μg/mLから12段階、4倍公比の希釈により、希釈系列を作製し、1ウェルあたり20μL添加した。室温で1時間インキュベートした後、TBS−Tで洗浄した。2次抗体として、4−1hには希釈液で5000倍希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ヒトカッパー軽鎖抗体(SouthernBiotech社、2060−05)を、4−1mには希釈液で4000倍希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウスカッパー軽鎖抗体(SouthernBiotech社、1050−05)を、1ウェルあたり20μL添加した。室温で1時間インキュベートした後、TBS−Tで洗浄し、TMB Microwell Peroxidase Substrate(Kirkegaard&Perry Laboratories社、50−76−03)を添加して4−1h評価時は3分間、4−1m評価時は5分間静置した後、2M硫酸を加えて反応を停止させ、450nmの吸光度をSpectraMax Paradigm(Molecular Devices社)で測定した。デュプリケートで試験を行い、EC50値を4−パラメーターロジスティック曲線当てはめにより算出した。
表1:4−1h及び4−1mのヒト及びマウスFn14に対する結合活性
実施例4で取得した4−1hのFn14に対するアンタゴニスト活性を評価するために、Tweak誘導NFkB活性化阻害作用をレポーターアッセイで評価した。
実施例4で取得した4−1hの機能的活性をin vitro IL−8産生アッセイで評価した。A375細胞(ATCC、CRL−1619)を10%ウシ胎児血清含有DMEMで5x104cells/mLに懸濁し、96ウェル平底プレート(IWAKI、3860−096)に1ウェルあたり100μL播種した。37℃、5%CO2で一晩培養後、PBSで洗浄した。実施例4で取得した4−1hについて、最終濃度1ng/mLから100μg/mLまでの10倍希釈系列を前記培地で作製し、細胞に添加した。最終濃度5ng/mLのTweak存在下(アンタゴニスト活性評価)又は非存在下(アゴニスト活性評価)、37℃、5%CO2で一晩培養後、培養上清を回収し、培養上清中のIL−8濃度をHuman IL−8/CXCL8 Quantikine ELISA kit(R&D社、D8000C)を用いて測定した。アンタゴニスト活性及びアゴニスト活性評価における最終容量は、それぞれ65μL/ウェル及び100μL/ウェルで実験した。本試験では、比較抗体として、CRCBT−06−002を用い、各抗体についてデュプリケートで実験した。
表3:4−1h及びCRCBT−06−002のTweak刺激によるIL−8産生に対する阻害活性
マウス結腸癌細胞株C26(COLON 26)を担癌したマウスは、悪液質の特徴である体重減少及び筋量の低下を示す、代表的ながん悪液質モデルの一つである(Aulino P et al.、BMC Cancer.2010、Vol.10 363、p.1−15)(Bonetto A et al.、J Vis Exp.2016、Nov.30 117、p.1−21)。
実施例9と同様にC26担癌マウスを作製した。C26担癌マウスの体重が減少に転じるタイミングから各群5匹で投与を開始した。具体的には、細胞注入後22日目から70日目までは1週間に3回、その後71、76、78、83及び85日目に、PBSによって希釈した4−1mを0.3mg/kg(投与容量10mL/kg)で皮下投与した。対照群には実施例9と同一のアイソタイプコントロール抗体を、4−1mと同様の方法で投与した。ゲムシタビン投与群は、PBSによって希釈したゲムシタビン(商品名:ジェムザール、イーライリリー・アンド・カンパニー)を10mg/kg(投与容量10mL/kg)で皮下投与した。ゲムシタビン併用4−1m投与群は、4−1mとゲムシタビンの両方を同日に投与した。腫瘍の長径及び短径を、ノギス(アズワン、VC01−150)を用いて継時的に測定し、以下の式に従って腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積=長径(mm)×短径(mm)×短径(mm)/2
マウスの生存率をカプラン・マイヤー生存率曲線で図6に示す。群間の生存曲線における違いを比較する場合はログランク検定を行い、p<0.05の場合を有意とした。生存期間中央値は対照群、4−1m投与群及びゲムシタビン投与群でそれぞれ41日、57日及び55日であった。ゲムシタビン併用4−1m投与群の生存期間中央値は83日であり、4−1m単独又はゲムシタビン単独投与群の生存曲線に対し有意差が認められた。
一方、抗体単独及びゲムシタビン併用のどちらの場合においても、4−1m投与による腫瘍体積への影響は認められなかった(図7)。
以上の結果から、4−1mは腫瘍サイズに影響を及ぼさずに生存期間を延長し、ゲムシタビンのような抗がん剤と併用することで、生存率の向上により有効である可能性が示された。
Claims (28)
- 配列番号2のアミノ酸番号31から35までのアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2のアミノ酸番号50から65までのアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号2のアミノ酸番号98から114までのアミノ酸配列からなるCDR3とを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号4のアミノ酸番号24から40までのアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号4のアミノ酸番号56から62までのアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号4のアミノ酸番号95から103までのアミノ酸配列からなるCDR3とを含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 以下の(1)及び(2)から選択される、請求項1に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント:
(1)配列番号2のアミノ酸番号1から125までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号4のアミノ酸番号1から114までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント;並びに
(2)上記(1)の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 配列番号2のアミノ酸番号1から125までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号4のアミノ酸番号1から114までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、請求項2に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 翻訳後修飾が、重鎖可変領域N末端のピログルタミル化及び/又は重鎖C末端のリジン欠失である、請求項2に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 配列番号2のアミノ酸番号1から125までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号2のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域、及び、配列番号4のアミノ酸番号1から114までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、請求項2に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 以下の(3)及び(4)から選択される、請求項2に記載の抗ヒトFn14抗体:
(3)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトFn14抗体;並びに
(4)上記(3)の抗体の翻訳後修飾により生じた抗体である、抗ヒトFn14抗体。 - 配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項6に記載の抗ヒトFn14抗体。
- 翻訳後修飾が、重鎖N末端のピログルタミル化及び/又は重鎖C末端のリジン欠失である、請求項6に記載の抗ヒトFn14抗体。
- 配列番号2のアミノ酸番号1から454までのアミノ酸配列からなる重鎖であって、配列番号2のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖、及び、配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項8に記載の抗ヒトFn14抗体。
- 一本鎖可変領域フラグメント、Fab、Fab’、又はF(ab’)2である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗原結合フラグメント。
- 請求項3に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項3に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項11及び/又は請求項12に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 以下の(a)〜(d)からなる群より選択される、宿主細胞:
(a)請求項3に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)請求項3に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞;
(c)請求項3に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
(d)請求項3に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 - 以下の(e)〜(h)からなる群より選択される、宿主細胞:
(e)請求項7に記載の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(f)請求項7に記載の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞;
(g)請求項7に記載の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
(h)請求項7に記載の抗ヒトFn14抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 - 以下の(A)〜(C)からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含する抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法:
(A)請求項3に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(B)請求項3に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞;並びに
(C)請求項3に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 - 以下の(D)〜(F)からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトFn14抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトFn14抗体を生産する方法:
(D)請求項7に記載の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(E)請求項7に記載の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞;並びに
(F)請求項7に記載の抗ヒトFn14抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗ヒトFn14抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 - 請求項16に記載の方法で生産された抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 請求項17に記載の方法で生産された抗ヒトFn14抗体。
- 請求項1〜10、18、及び19のいずれか1項に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント、並びに薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
- 請求項3に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項5に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
- 請求項7に記載の抗ヒトFn14抗体、請求項9に記載の抗ヒトFn14抗体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
- がん悪液質の予防又は治療用医薬組成物である、請求項20〜22のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜10、18、及び19のいずれか1項に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与する工程を包含する、がん悪液質を予防又は治療する方法。
- がん悪液質の予防又は治療に使用するための、請求項1〜10、18、及び19のいずれか1項に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメント。
- がん悪液質の予防又は治療用医薬組成物の製造における、請求項1〜10、18、及び19のいずれか1項に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
- 請求項1〜10、18、及び19のいずれか1項に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む、がん又はがん悪液質の予防又は治療用医薬組成物であって、かつ抗がん剤と併用されるものである、医薬組成物。
- 抗がん剤を含む、がん又はがん悪液質の予防又は治療用医薬組成物であって、請求項1〜10、18、及び19のいずれか1項に記載の抗ヒトFn14抗体又はその抗原結合フラグメントと併用されるものである、医薬組成物。
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