JP6137169B2 - 新規抗ヒトil−23受容体抗体 - Google Patents
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Description
(1)以下の1)〜4)のいずれかから選択される、抗ヒトIL−23R抗体。
1)配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号18に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトIL−23R抗体;
2)配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号6に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトIL−23R抗体;
3)配列番号14に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号6に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトIL−23R抗体;並びに
4)配列番号14に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号18に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトIL−23R抗体。
(2)配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号18に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、上記(1)に記載の抗ヒトIL−23R抗体。
(3)配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号6に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、上記(1)に記載の抗ヒトIL−23R抗体。
(4)配列番号14に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号6に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、上記(1)に記載の抗ヒトIL−23R抗体。
(5)配列番号14に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号18に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、上記(1)に記載の抗ヒトIL−23R抗体。
(6)前記抗体の重鎖定常領域がヒトIgγ1定常領域である、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の抗ヒトIL−23R抗体。
(7)前記抗体の軽鎖定常領域がヒトIgκ定常領域である、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の抗ヒトIL−23R抗体。
(8)前記抗体の重鎖定常領域がヒトIgγ1定常領域であり、前記抗体の軽鎖定常領域がヒトIgκ定常領域である、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の抗ヒトIL−23R抗体。
(9)配列番号12に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号20に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記(2)に記載の抗ヒトIL−23R抗体。
(10)配列番号12に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記(3)に記載の抗ヒトIL−23R抗体。
(11)配列番号16に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記(4)に記載の抗ヒトIL−23R抗体。
(12)配列番号16に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号20に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記(5)に記載の抗ヒトIL−23R抗体。
(13)上記(1)〜(12)のいずれかに記載の抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
(14)上記(1)〜(12)のいずれかに記載の抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
(15)上記(13)及び/又は(14)に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
(16)上記(15)に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
(17)以下の(a)及び(b)からなる群より選択される、上記(16)の宿主細胞。
(a)上記(1)〜(12)のいずれかの抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;及び
(b)上記(1)〜(12)のいずれかの抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
(18)上記(16)又は(17)に記載の宿主細胞を培養し、抗ヒトIL−23R抗体を発現させる工程を包含する、上記(1)〜(12)のいずれかに記載の抗ヒトIL−23R抗体を生産する方法。
(19)上記(1)〜(12)のいずれかに記載の抗ヒトIL−23R抗体を含む、眼科疾患、炎症性腸疾患、又は乾癬の治療剤。
(20)上記(1)〜(12)のいずれかに記載の抗ヒトIL−23R抗体の治療有効量を投与する工程を包含する、眼科疾患、炎症性腸疾患、又は乾癬を予防又は処置するための方法。
(21)眼科疾患、炎症性腸疾患、又は乾癬の予防又は処置に使用するための、上記(1)〜(12)のいずれかに記載の抗ヒトIL−23R抗体。
本発明者らは、抗ヒトIL−23R抗体の作製において相当の創意検討を重ねた結果、従来の抗ヒトIL−23R抗体と比較して活性及び/又は種交差性において優れた抗ヒトIL−23R抗体を作製することに成功した。
1)配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号18に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトIL−23R抗体。
2)配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号6に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトIL−23R抗体。
3)配列番号14に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号6に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトIL−23R抗体。
4)配列番号14に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号18に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトIL−23R抗体。
本発明者らは、抗IL−23R抗体を作製するための抗原及びスクリーニング系材料として使用するために、ヒトIL−23R配列の細胞外部分配列(非特許文献1、配列番号21の24番目から353番目のアミノ酸)とマウスイムノグロブリンFc領域との融合タンパク質(ヒトIL−23R−マウスFc融合タンパク質)を作製した。具体的には、PCR法によりプライマーED14−1(配列番号22)とED14−2(配列番号23)を用いてヒトIL−23Rの細胞外部分配列を増幅し、マウスFc融合タンパク質発現用ベクターであるpFUSE−mIgG2A−Fc2(InvivoGen社)のEcoRI及びBglIIサイトに挿入し、マウスFc融合IL−23R発現ベクターとした。ここで、PCR法によって増幅された遺伝子内にはプライマーED14−1配列内及びヒトIL−23R遺伝子配列内の2か所のEcoRIサイトがあるが、部分消化及びアガロースゲル切出しによって、ヒトIL−23R遺伝子配列内のEcoRIサイトが切断されていない遺伝子断片を得て、これを当該発現ベクターに挿入した。作製したベクターを、遺伝子導入試薬である293フェクチン(Invitrogen社)を用いてFreeStyle 293細胞(Invitrogen社)へ遺伝子導入し、この細胞をFreeStyle 293 Expression medium(Invitrogen社)を用いた無血清培養系で培養後、ヒトIL−23R−マウスFc融合タンパク質を含む培養上清を取得した。取得した培養上清からHiTrapAカラム(GEヘルスケアジャパン社)及び蛋白精製装置であるAKTAシステム(GEヘルスケアジャパン社)を用いてタンパク質を精製し、以下の実験に使用した。また、同様の方法においてサルIL−23R配列の細胞外部分配列を用いて、サルIL−23R−マウスFc融合タンパク質を取得した。
本発明者らは、抗IL−23R抗体の結合性試験及び抗体取得のための細胞抗原として使用するために、全長ヒトIL−23R発現細胞を取得した。PCR法によりプライマーAA26−Fw(配列番号24)及びプライマーAA10−4(配列番号25)を用いてヒトIL−23R遺伝子全長(非特許文献1、配列番号21の全長)を増幅し、この遺伝子断片をクローニングベクターであるpCR2.1−TOPOベクター(Invitrogen社)へ挿入した。配列確認後、この遺伝子断片を哺乳類細胞発現用ベクターであるpcDNA3.1ベクター(Invitrogen社)に組み換えた。このベクターをLipofectamine 2000(Invitrogen社)を用いてヒト樹立培養細胞である293細胞へ遺伝子導入した。この細胞をG418含有RPMI1640培地にて選択培養した後、限界希釈法にてモノクローン化した。その後、蛍光色素標識抗ヒトIL−23R抗体(R&Dシステムズ社)を用いたフローサイトメトリー測定により高い蛋白発現を示すクローンを選別することでヒトIL−23R発現細胞を取得した。
本発明者らは、抗ヒトIL−23R抗体を取得するため、ベロシミューンマウスに、免疫反応を惹起するアジュバントと共に、実施例1及び2でそれぞれ取得したヒトIL−23R−Fc融合タンパク質又はヒトIL−23R発現細胞を免疫した。マウスを数回免疫し、血中抗体価の上昇を確認し、最終免疫を行った。定法に従い、免疫したマウスの脾臓やリンパ節等を摘出しリンパ球を収集し、これをマウスミエローマ細胞SP2/0と細胞融合することでハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの限界希釈サンプルを作製し、モノクローン化を行った。各クローンについて、拡大培養を行った後に無血清培地であるCDハイブリドーマメディウム(Invitrogen社)に培地変更し、約5日間培養した。得られた培養上清からプロテインGスピンカラム(Pro−Chem社)を用いて抗体を精製した。
本発明者らは、抗体の抗原特異的結合活性を測定するために、抗原ELISAを使用した。ヒト又はサルIL−23R−Fc融合タンパク質を、ヌンクマキシソープ白色384プレート(Maxisorp 384 plate;Nunc社)に500ng/mLの濃度で固相化した。ブロッキング剤(Blocking One;ナカライテスク社)を添加し室温にて1時間静置した後、洗浄液(TPBS:0.05% Tween−20含有リン酸バッファー生理食塩水(PBS))で2回洗浄し、精製抗体サンプルを、適宜希釈系列を作製して添加した。室温にて1時間インキュベートした後、TPBSにて4回洗浄し、希釈液(Blocking OneをPBSで2倍希釈したもの)で2000倍に希釈したホースラディッシュぺルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスIg抗体(HRP−rabbit anti−mouse Ig antibody;DAKO社)を添加した。室温にて1時間インキュベートした後、洗浄液で4回洗浄した。化学発光検出試薬であるBM−Chemiluminescence ELISA Substrate(POD)(ロシュダイアグノスティック社)を40μL加えて、その化学発光量をEnVisionカウンター(パーキンエルマー社)で測定した。各抗体についてデュプリケートで試験を行い、EC50を曲線当てはめにより分析した。本試験では、比較抗体として、ヒト化抗ヒトIL−23R抗体hum20D7(特許文献1)のFc領域をマウスFc領域で置換した融合抗体(以下、hum20D7−mFcと称する)を用いた。なお、ここでhum20D7をマウスFc領域との融合抗体としたのは、本評価系では二次抗体として抗マウスIg抗体を用いるためであり、抗マウスIg抗体がマウスFc領域を認識することにより活性測定が可能となる。
表1:抗ヒトIL−23R抗体のヒトIL−23Rに対する結合活性
前述のアッセイによって同定された抗体25−3について、本発明者らはハイブリドーマから抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子をクローニングした。各ハイブリドーマからRNAを抽出し、cDNA増幅キット(SMARTer RACE cDNA Amplification kit;Clontech社)を用いて、cDNAを作製した。次いで、PCRを用いて、重鎖及び軽鎖の可変領域を伸長及び増幅した。このPCR産物を直接シークエンサー(ABI PRISM 3100;Applied Biosystems社)で配列解析を行った。また、PCR産物をpCR3.1−TOPO(Invitrogen社)等のPCR産物サブクローニング用ベクターへ組み換えた後、遺伝子配列を解析して配列決定を行った。
前述の抗体は、可変領域がヒト由来であり、定常領域がマウス由来の抗体である。そこで、本発明者らは、GSベクター(Lonza Biologics社)を用いて、重鎖及び軽鎖の両遺伝子を含む発現ベクターを構築し、完全ヒト型抗体を作製した。具体的には、抗体の重鎖可変領域遺伝子の5’側にシグナル配列を、そして3’側にヒトIgγ1の定常領域遺伝子(Man Sung Coら,(1992) J Immunol.Vol.148(4):1149−1154)をそれぞれ繋げ、この重鎖遺伝子をGSベクターpEE6.4に挿入した。また、抗体の軽鎖可変領域遺伝子の5’側にシグナル配列を、そして3’側にヒトκ鎖の定常領域遺伝子(Man Sung Coら,前出)をそれぞれ繋げ、この軽鎖遺伝子をGSベクターpEE12.4に挿入した。
さらに、本発明者らは、前述の完全ヒト型25−3について、その重鎖可変領域及び/又は軽鎖可変領域にアミノ酸変異を導入して、4種の該抗体の改変体(各々、完全ヒト型25−3−1、完全ヒト型25−3−2、完全ヒト型25−3−3、完全ヒト型25−3−4と称する)を作製した。
各抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子がそれぞれ挿入された前述のGSベクターを用いて、恒常的発現の方法で抗体発現を行った。恒常的発現は、各抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子がそれぞれ挿入された前述のGSベクターをNotIとPvuIで制限酵素切断し、Ligation−Convenience Kit(NIPPONGENE社)又はLigation−high(TOYOBO社)を用いてライゲーションを行い、重鎖と軽鎖の両遺伝子が挿入されたGSベクターを構築した。この発現ベクターは、完全長の重鎖及び軽鎖とグルタミン合成酵素(Glutamine synthetase)をコードしており、CHO−K1SV細胞にトランスフェクションにより抗体を発現させた。培養上清をプロテインA又はプロテインGカラム(GEヘルスケアジャパン社)で精製し、各完全ヒト型抗体の精製抗体を得た。
本発明者らは、前記実施例で作製した完全ヒト型抗体の抗原特異的結合活性を測定するために、抗原ELISAを使用した。ヒト又はサルIL−23R−Fc融合タンパク質を、ヌンクマキシソープ白色384プレート(Maxisorp 384 plate;Nunc社)に500ng/mLの濃度で固相化した。ブロッキング剤(Blocking One;ナカライテスク社)を添加し室温にて1時間静置した後、洗浄液(TPBS:0.05% Tween−20含有リン酸バッファー生理食塩水(PBS))で2回洗浄し、精製抗体サンプルを、適宜希釈系列を作製して添加した。室温にて1時間インキュベートした後、TPBSにて4回洗浄し、二次抗体として希釈液(Blocking OneをPBSで2倍希釈したもの)で2000倍に希釈したホースラディッシュぺルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体(anti−human IgG antibody;DAKO社)を添加した。室温にて1時間インキュベートした後、洗浄液で4回洗浄した。化学発光検出試薬であるBM−Chemiluminescence ELISA Substrate(POD)(ロシュダイアグノスティック社)を40μL加えて、その化学発光量をEnVisionカウンター(パーキンエルマー社)で測定した。各抗体についてデュプリケートで試験を行い、EC50を曲線当てはめにより分析した。
表3:完全ヒト型抗ヒトIL−23R抗体のヒトIL−23Rに対する結合活性
本発明者らは、完全ヒト型抗体の抗原特異的中和活性を測定するために、IL−23に反応して増殖応答を示すKit225細胞(非特許文献1)を用いて細胞増殖阻害活性検討を行った。このアッセイでは、IL−2存在下で継代培養を行ったKit225細胞を、10%FBS及び1%ペニシリン・ストレプトマイシンを含有するRPMI1640培地で3回洗浄してIL−2を取り除いた後に、同培地で75000個/mLとなるように細胞懸濁液を調製し、100μL/ウェルで96ウェルプレートに分注した。精製抗体サンプルについて、2000ng/mLをトップに上記の培地で4倍希釈系列を作製した後、細胞へ添加し、プレートミキサーで撹拌した。ヒトIL−23(Humanzyme社)を最終濃度2ng/mLで添加し、撹拌後、37℃、5%CO2下で5日間インキュベートした。抗体サンプルのかわりに上記の培地のみを添加した群をコントロール群として設定し、IL−23添加群を100%コントロール、IL−23非添加群を0%コントロールとした。その後、細胞増殖数測定試薬CellTiter−Glo(Promega社)を用いて定量し、曲線当てはめによりそのIC50値を解析した。
Claims (23)
- 以下の(1)〜(4)のいずれかから選択される、抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメントであって、該フラグメントは一本鎖可変領域フラグメント、Fab、Fab’、又はF(ab’) 2 である、抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメント。
(1)配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号18に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメント;
(2)配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号6に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメント;
(3)配列番号14に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号6に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメント;並びに
(4)配列番号14に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号18に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメント。 - 配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号18に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメント。
- 配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号6に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメント。
- 配列番号14に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号6に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメント。
- 配列番号14に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号18に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメント。
- 前記抗体又は抗体フラグメントの重鎖定常領域がヒトIgγ1定常領域である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメント。
- 前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖定常領域がヒトIgκ定常領域である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメント。
- 前記抗体又は抗体フラグメントの重鎖定常領域がヒトIgγ1定常領域であり、前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖定常領域がヒトIgκ定常領域である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメント。
- 他のペプチド又はタンパク質と融合した、又は、修飾剤と結合した、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメント。
- 配列番号12に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号20に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項2に記載の抗ヒトIL−23R抗体。
- 配列番号12に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項3に記載の抗ヒトIL−23R抗体。
- 配列番号16に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項4に記載の抗ヒトIL−23R抗体。
- 配列番号16に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号20に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項5に記載の抗ヒトIL−23R抗体。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体又は抗体フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体又は抗体フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチド、及び、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体又は抗体フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 以下の(a)及び(b)からなる群より選択される、宿主細胞。
(a)請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体又は抗体フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又は抗体フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;及び
(b)請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体又は抗体フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又は抗体フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 - 以下の(a)及び(b)からなる群より選択される、宿主細胞。
(a)請求項10〜13のいずれか1項に記載の抗体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;及び
(b)請求項10〜13のいずれか1項に記載の抗体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターとで形質転換された宿主細胞。 - 請求項16に記載の宿主細胞を培養し、抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメントを生産する方法。
- 請求項17に記載の宿主細胞を培養し、抗ヒトIL−23R抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトIL−23R抗体を生産する方法。
- 請求項18に記載の方法で生産された抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメントであって、該フラグメントは一本鎖可変領域フラグメント、Fab、Fab’、又はF(ab’) 2 である、抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメント。
- 請求項19に記載の方法で生産された抗ヒトIL−23R抗体。
- 他のペプチド及びタンパク質と融合した、又は、修飾剤と結合した、請求項20又は21に記載の抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメント。
- 請求項1〜13及び20〜22のいずれか1項に記載の抗ヒトIL−23R抗体又は抗ヒトIL−23R抗体フラグメント及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
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