JPWO2015020193A1 - 新規抗ヒトｔｓｌｐ受容体抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】 ヒトＴＳＬＰ受容体に特異的に結合し、ヒトＴＳＬＰ受容体を介するヒトＴＳＬＰの作用を阻害する抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体を提供する。【解決手段】 本発明者らは、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体について検討し、配列番号１のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号３のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体を提供した。前記抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体が、ＴＳＬＰによって誘発されるＴＡＲＣ ｍＲＮＡの発現及びＭＤＣ蛋白質の産生を阻害し、さらにはサルアスカリス抗原感作モデルにおいてアレルギー反応を抑制することを明らかにし、本発明を完成した。【選択図】 なし

Description

本発明は、新規な抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体に関する。

胸腺間質性リンパ球性新生因子（ｔｈｙｍｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＴＳＬＰ）は、炎症促進性刺激に応答して産生される、上皮細胞由来のサイトカインである。主に、ＴＳＬＰは、樹状細胞及びマスト細胞に対する活性化を介して、アレルギー性炎症反応を促進する。樹状細胞は、ヘマトポエチン受容体ファミリーのメンバーであるＴＳＬＰ受容体とＩＬ−７受容体α鎖を発現し、ＴＳＬＰは、ＴＳＬＰ受容体とＩＬ−７受容体α鎖からなるヘテロダイマーを受容体として結合し、樹状細胞を活性化する。ＴＳＬＰによって活性化された樹状細胞は、胸腺及び活性化制御ケモカイン（ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ；ＴＡＲＣ（ＣＣＬ１７））、マクロファージ由来ケモカイン（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ；ＭＤＣ（ＣＣＬ２２））等の炎症性ケモカインを発現する（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００２、Ｖｏｌ．７、ｐ．６７３−６８０）。ＴＡＲＣ及びＭＤＣは、Ｔｈ２ケモカインであり、炎症部位にＴｈ２細胞を誘引することが知られている（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、Ｖｏｌ．１１、ｐ．８１−８８）。また、ＴＳＬＰによって活性化された樹状細胞は、ナイーブＴ細胞をＴｈ２型へ強力に分化誘導させ、このＴｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＴＮＦαを産生し、炎症反応を惹起させる（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００２、Ｖｏｌ．７、ｐ．６７３−６８０）。

このようなＴＳＬＰ受容体を介するＴＳＬＰによる樹状細胞の活性化は、喘息等のアレルギー性炎症疾患や、全身性強皮症の病態形成に関与することが報告されている。

喘息との関連としては、ＴＳＬＰが肺特異的に発現亢進するトランスジェニックマウスにおいて、肺中のＴｈ２サイトカイン量とＩｇＥ量の増加に伴って、気道での炎症反応が惹起され、喘息様病態に至ることが報告されている（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００５、Ｖｏｌ．６、ｐ．１０４７−１０５３）。また、ＴＳＬＰ受容体のノックアウトマウスや抗ＴＳＬＰ受容体抗体が投与された喘息病態モデルにおいて、Ｔｈ２サイトカインや血中ＩｇＥの産生が抑制されると共に、呼吸機能の改善効果が確認されている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００５、Ｖｏｌ．２０２、ｐ．８２９−８３９、及びＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００８、Ｖｏｌ．１２９、ｐ．２０２−２１０）。また、喘息患者において、疾患の重症度と相関して、ＴＳＬＰ並びにＴＡＲＣ及びＭＤＣの発現が喘息気道において増大されることが報告されている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００５、Ｖｏｌ．１７４、ｐ．８１８３−８１９０、及びＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００８、Ｖｏｌ．１８１、ｐ．２７９０−２７９８）。

全身性強皮症との関連としては、全身性強皮症患者の皮膚においてＴＳＬＰが過剰発現していること（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．、２０１３、Ｖｏｌ．６５、ｐ．１３３５−１３４６）、ＴＳＬＰ受容体のノックアウトマウスを用いたブレオマイシン誘発強皮症モデル試験において、皮膚の炎症局所においてＩＬ−１３及びＩＬ−１７の発現がほぼ完全に抑制され、病理像においてもコラーゲンの占める割合が有意に改善されることが報告されている（Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．、２０１３、Ｖｏｌ．７２、ｐ．２０１８−２３）。

従って、ヒトＴＳＬＰ受容体に特異的に結合し、ヒトＴＳＬＰ受容体を介するヒトＴＳＬＰの作用を阻害するモノクローナル抗体を開発することができれば、ヒトＴＳＬＰ及びヒトＴＳＬＰ受容体が病態形成に関与する各種疾患の予防及び治療に有用であることが期待される。

現在までに研究が進められてきたヒトＴＳＬＰ受容体に対する抗体としては、マウスモノクローナル抗体である１３Ｈ５及びそのヒト化抗体であるｈｕ１３Ｈ５（特許文献１）、マウスモノクローナル抗体である１Ｄ６．Ｃ９、そのキメラ抗体であるＮＶ１１５−３Ｂ−ＩｇＧ１及びＮＶ１１５−３Ｂ−ＩｇＧ４（特許文献２）、完全ヒト型抗体であるＮＶ１６４−１及びＮＶ１６３−１（特許文献３）、ハムスター由来のヒト化モノクローナル抗体であるＴＳＬＰＲ−０１２＿１４１（特許文献４）が報告されている。

１３Ｈ５は、ＴＳＬＰ刺激によるヒトＴＳＬＰ受容体安定発現Ｂａ／Ｆ３細胞の増殖アッセイ系において中和活性が確認されているが、ｈｕ１３Ｈ５の中和活性は確認されていない（特許文献１）。また、特許文献２〜４の記載に基づいて、これらの文献に記載の抗体のうち、ＴＳＬＰＲ−０１２＿１４１が最も中和活性が高いと理解される（特許文献２〜４）。ＴＳＬＰＲ−０１２＿１４１については種々の中和活性試験で評価されている。例えば、ＴＳＬＰ刺激によるヒトＴＳＬＰ受容体安定発現Ｂａ／Ｆ３細胞の増殖アッセイ系、ＴＳＬＰ刺激ヒト末梢血由来樹状細胞のＴＡＲＣ、ＭＤＣ及びＩＬ−８産生アッセイ系、並びに、ＴＳＬＰ刺激ヒト末梢血由来樹状細胞及びナイーブＴ細胞共培養系におけるＴｈ２サイトカイン産生アッセイ系等において、ＴＳＬＰＲ−０１２＿１４１が中和活性を示すことが確認されている（特許文献４）。しかし、抗体医薬として使用するためにより高い中和活性を有する抗体が望ましい。

抗体医薬の有効投与量を規定する主な要因としては、抗体が有する抗原に対する結合活性や中和活性、体内に存在する抗原の量が挙げられるが、結合活性や中和活性を向上させることは投与量の低減に繋がり、結果として患者の経済的な負担や医療コストの低減にも繋がる極めて有益な改良であるといえる。

こうしたことから、従来の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体よりも活性において優れた抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体を取得することが、各種疾患の予防及び治療に利用するためには必要である。

国際公開第２００９／１００３２４号 国際公開第２００７／１１２１４６号 国際公開第２００８／１５５３６５号 国際公開第２０１２／００７４９５号

本発明の課題は、ヒトＴＳＬＰ受容体に特異的に結合し、ヒトＴＳＬＰ受容体を介するヒトＴＳＬＰの作用を阻害する抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体を提供することにある。

本発明者らは、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の作製において相当の創意検討を重ねた結果、配列番号１のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号３のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体を提供した。前記抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体が、ＴＳＬＰによって誘発されるＴＡＲＣ ｍＲＮＡの発現及びＭＤＣ蛋白質の産生を阻害し（実施例５及び６）、さらにはサルアスカリス抗原感作モデルにおいてアレルギー反応を抑制する（実施例７）ことを明らかにし、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、医学上又は産業上有用な物質又は方法として以下の発明を含むものである。
（１）配列番号１のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号３のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメント。
（２）前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域である、上記（１）に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメント。
（３）前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκ定常領域である、上記（１）に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメント。
（４）前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域であり、前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκ定常領域である、上記（１）に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメント。
（５）上記抗原結合フラグメントが一本鎖可変領域フラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）₂である、上記（１）〜（４）に記載の抗原結合フラグメント。
（６）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記（１）に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体。
（７）配列番号１のアミノ酸番号１から４４７までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記（１）に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体。
（８）上記（１）に記載の抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
（９）上記（１）に記載の抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
（１０）上記（８）及び／又は（９）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（１１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、上記（１０）に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（ａ）上記（１）に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）上記（１）に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）上記（１）に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）上記（１）に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（１２）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、上記（１０）に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（ａ）上記（６）に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）上記（６）に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）上記（６）に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）上記（６）に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（１３）上記（１１）に記載の宿主細胞を培養し、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法。
（１４）上記（１２）に記載の宿主細胞を培養し、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体を生産する方法。
（１５）上記（１３）に記載の方法で生産された抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１６）上記（１４）に記載の方法で生産された抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体。
（１７）上記（１）〜（７）、（１５）、及び（１６）のいずれかに記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
（１８）喘息の予防又は治療用医薬組成物である、上記（１７）に記載の医薬組成物。
（１９）上記（１）〜（７）、（１５）、及び（１６）のいずれかに記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与する工程を包含する、喘息を予防又は治療する方法。
（２０）喘息の予防又は治療に使用するための、上記（１）〜（７）、（１５）、及び（１６）のいずれかに記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメント。
（２１）喘息の予防又は治療用医薬組成物の製造における、上記（１）〜（７）、（１５）、及び（１６）のいずれかに記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
上記（１）〜（７）、（１５）、及び（１６）に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントには、他のペプチド及び蛋白質との融合体や、修飾剤を結合させた修飾体も含まれる。

本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体は、ヒトＴＳＬＰ受容体に結合し、ヒトＴＳＬＰ受容体を介するヒトＴＳＬＰの作用に対する中和活性を有するものであり、喘息等のアレルギー性炎症疾患や、全身性強皮症等の予防又は治療剤として使用できる。

完全ヒト型Ｔ７−２７のサルアスカリス抗原感作モデルにおけるアスカリス抗原特異的ＩｇＥ濃度の減少作用を示す。縦軸は、Ｖｅｈｉｃｌｅ群の１個体のＤａｙ２２における血漿中アスカリス抗原特異的ＩｇＥ濃度を２０００Ｕ／ｍＬとしたときの、各サンプルの相対的な血漿中アスカリス抗原特異的ＩｇＥ濃度を示す。Ｖｅｈｉｃｌｅ群及び抗体投与群のＤａｙ１（水酸化アルミニウムゲルで懸濁したアスカリス抗原液を投与する前）のＩｇＥ濃度、Ｖｅｈｉｃｌｅ群のＤａｙ２２のＩｇＥ濃度、並びに抗体投与群のＤａｙ２２のＩｇＥ濃度を示す。 完全ヒト型Ｔ７−２７のサルアスカリス抗原感作モデルにおけるアスカリス抗原特異的皮膚反応の減少作用を示す。Ｄａｙ２２にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び１００μｇ/ｍＬのアスカリス抗原溶液を投与したときの結果を示す。縦軸は、アスカリス抗原溶液投与後の皮膚反応の直径からＰＢＳ投与後の皮膚反応の直径を引いた値（ｄｅｌｔａ ｃｍ）を示す。 抗ＴＳＬＰ受容体抗体のマウス喘息モデルにおける気道反応性亢進反応の抑制作用を示す。縦軸は、呼吸機能の指標として用いたＰｅｎＨの値を示す（^★★ｐ＜０．０１、^★ｐ＜０．０５、^♯♯ｐ＜０．０１、^♯ｐ＜０．０５）。 抗ＴＳＬＰ受容体抗体のマウス喘息モデルにおける好酸球の浸潤抑制作用を示す。縦軸は、ＢＡＬＦ細胞懸濁液中の好酸球数を示す（^★★ｐ＜０．０１）。 抗ＴＳＬＰ受容体抗体のマウス喘息モデルにおけるＴＡＲＣ ｍＲＮＡの発現阻害作用を示す。縦軸は、ＴＡＲＣ ｍＲＮＡの発現量を示す。

以下に、本発明について詳述する。

抗体にはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥの５つのクラスが存在し、抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２万〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してＩｇγ、Ｉｇμ、Ｉｇα、Ｉｇδ、Ｉｇεとよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のサブクラスが存在し、それぞれに対応する重鎖はＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３、Ｉｇγ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれＩｇλ、Ｉｇκとよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。

鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（Ｉｇμ、Ｉｇεには五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位又はドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにアミノ末端（Ｎ末端）側に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域（Ｖ_H）及び軽鎖可変領域（Ｖ_L）とよばれている。可変領域よりカルボキシ末端（Ｃ末端）側のアミノ酸配列は、各クラス又はサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれている（各ドメインは、それぞれ、Ｃ_H１、Ｃ_H２、Ｃ_H３又はＣ_Lと表される）。

抗体の抗原決定部位はＶ_H及びＶ_Lによって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇの定常領域の構造の差を反映している。軽鎖と重鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ；それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）とよんでいる。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、比較的一定である。

抗体のＶ_H及びＶ_Lを含む各種抗原結合フラグメントも抗原結合活性を有し、このような代表的な抗原結合フラグメントとして、一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂が挙げられる。Ｆａｂは、軽鎖と、ＶＨ、Ｃ_H１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される、一価の抗体フラグメントである。Ｆａｂ'は、軽鎖と、ＶＨ、Ｃ_H１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される、一価の抗体フラグメントであり、このヒンジ領域の部分には重鎖間Ｓ−Ｓ結合を構成していたシステイン残基が含まれる。Ｆ（ａｂ'）₂フラグメントは、２つのＦａｂ'フラグメントがヒンジ領域中の重鎖間Ｓ−Ｓ結合で結合した二価の抗体フラグメントである。ｓｃＦｖは、リンカーで連結されたＶ_HとＶ_Lから構成される、一価の抗体フラグメントである。

＜本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体＞
本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下の特徴を有する抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントである。
配列番号１のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号３のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメント。

好ましくは、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその結合フラグメントは、上記特徴を有し、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含む。定常領域としては、どのようなサブクラスの定常領域（例えば、重鎖定常領域としてＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３又はＩｇγ４の定常領域、軽鎖定常領域としてＩｇλ又はＩｇκの定常領域）も選択可能であり得るが、重鎖定常領域としてヒトＩｇγ１定常領域が好ましく、軽鎖定常領域としては、ヒトＩｇκ定常領域が好ましい。

ヒトＩｇγ１定常領域としては、例えば、配列番号１のアミノ酸番号１１９から４４８までのアミノ酸配列からなるヒトＩｇγ１定常領域が挙げられる。

ヒトＩｇκ定常領域としては、例えば、配列番号３のアミノ酸番号１０９から２１４までのアミノ酸配列からなるヒトＩｇκ定常領域が挙げられる。

本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントとしては、上記の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域であり、軽鎖定常領域がヒトＩｇκ定常領域である、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントがより好ましい。

１つの実施形態において、本発明の抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）₂である。

当業者であれば、当該分野で公知の方法を用いて、抗体又はその抗原結合フラグメントと他のペプチドや蛋白質との融合体を作製することや、修飾剤を結合させた修飾体を作製することも可能である。本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントには、このような融合体や修飾体の形態の抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。例えば、配列番号１のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号３のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントには、該抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその結合フラグメントと他のペプチドや蛋白質との融合体や、修飾剤を結合させた修飾体も含まれる。融合に用いられる他のペプチドや蛋白質は、抗体又はその抗原結合フラグメントの結合活性を低下させないものである限り特に限定されず、例えば、ヒト血清アルブミン、各種タグペプチド、人工ヘリックスモチーフペプチド、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、各種毒素、その他多量体化を促進しうるペプチド又は蛋白質等が挙げられる。修飾に用いられる修飾剤は、抗体又はその抗原結合フラグメントの結合活性を低下させないものである限り特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、糖鎖、リン脂質、リポソーム、低分子化合物等が挙げられる。

１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体は、以下の特徴を有する抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体である。
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体。

抗体を細胞で発現させる場合、抗体が翻訳後に修飾を受けることが知られている。翻訳後修飾の例としては、重鎖Ｃ末端のリジンのカルボキシペプチダーゼによる切断、重鎖及び軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾等が挙げられ、種々の抗体において、重鎖Ｃ末端のリジンが欠失することや重鎖Ｎ末端のグルタミンの大部分がピログルタミン酸への修飾を受けることが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００８、Ｖｏｌ．９７、ｐ．２４２６）。また、このような翻訳後修飾が抗体の活性に影響を及ぼすものではないことも当該分野で知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６、Ｖｏｌ．３４８、ｐ．２４−３９）。

本発明の抗体には、完全長の重鎖を有する抗体だけではなく、Ｃ末端のリジンを欠く重鎖を有する抗体、重鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸がピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を受けた抗体など、細胞内での発現に際して翻訳後修飾を受けた抗体も含まれる。また、本発明の抗原結合フラグメントには、抗原結合フラグメントのＮ末端のグルタミン又はグルタミン酸がピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を受けた抗原結合フラグメントなど、細胞内での発現に際して翻訳後修飾を受けた抗原結合フラグメントも含まれる。

例えば、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体には、以下に記載される抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体も含まれる。
配列番号１のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾され及び／又は配列番号１のアミノ酸番号４４８のリジンを欠くアミノ酸配列からなる重鎖、並びに配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体。

本発明には、以下の特徴を有する抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。
配列番号１のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１のアミノ酸番号９９から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号３のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３のアミノ酸番号８９から９７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメント。

本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＴＳＬＰ受容体に結合する。抗体又は抗原結合フラグメントがヒトＴＳＬＰ受容体に結合するか否かは、公知の結合活性測定方法を用いて確認することができる。結合活性を測定する方法としては、例えば、Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）や表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）等の方法が挙げられる。ＥＬＩＳＡを用いる場合は、例示的な方法において、ヒトＴＳＬＰ受容体とヒトＦｃを融合させた蛋白質（ヒトＴＳＬＰ受容体−ヒトＦｃ融合蛋白質（配列番号５の塩基配列によってコードされる））をＥＬＩＳＡプレートに固相化し、これに対して被験抗体を添加して反応させる。反応後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素で標識した抗ＩｇＧ抗体等の二次抗体を反応させ、洗浄した後、その活性を検出する試薬（例えば、ＨＲＰ標識の場合、ＢＭ−Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰＯＤ）（ロシュダイアグノスティック社））等を用いた活性測定によって、被験抗体がヒトＴＳＬＰ受容体に結合するか否かを確認することができる。ＳＰＲを用いる場合は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いることができる。例示的な方法において、被験抗体をセンサーチップの表面に固相化し、ヒトＴＳＬＰ受容体とマウスＦｃを融合させた蛋白質（ヒトＴＳＬＰ受容体−マウスＦｃ融合蛋白質（配列番号６の塩基配列によってコードされる））を流路に添加させる。抗体とヒトＴＳＬＰ受容体との結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、及び解離定数（ＫＤ）を解析することによって、被験抗体がヒトＴＳＬＰ受容体に結合するか否かを確認することができる。

また、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントには、他の動物由来のＴＳＬＰ受容体（例えば、サルＴＳＬＰ受容体）にも結合する抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれ、同様の方法を用いてこれらの受容体に対する結合活性を測定することができる。

好ましくは、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＴＳＬＰ受容体に結合し、ヒトＴＳＬＰ受容体に対する中和活性を有する。ヒトＴＳＬＰ受容体に対する中和活性とは、ヒトＴＳＬＰ受容体への結合により、ヒトＴＳＬＰのヒトＴＳＬＰ受容体への結合を介してもたらされる任意の生物活性を阻害する活性を意味し、ヒトＴＳＬＰ受容体を介するヒトＴＳＬＰの１つ又は複数の生物活性を指標に評価することができる。このような中和活性としては、例えば、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いたＴＳＬＰ誘発ＴＡＲＣ ｍＲＮＡ発現阻害活性やＴＳＬＰ誘発ＭＤＣ蛋白質産生阻害活性が挙げられ、活性の具体的な評価方法としては、後記実施例５及び６に記載されるような方法を用いることができる。

本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントの効果をより詳細に評価するために、ｉｎ ｖｉｖｏでの試験を用いることもできる。例えば、後記実施例７に記載のように、サルアスカリス抗原感作モデルを用いる抗アレルギー反応試験等を用いて、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの薬効を評価することができる。

本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントは、本明細書に開示される、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントは、特に限定されるものではないが、例えば、後述の＜本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体を生産する方法＞に記載の方法に従い製造することができる。

本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントは、必要によりさらに精製された後、常法に従って製剤化され、喘息等のアレルギー性炎症疾患や全身性強皮症等の、ヒトＴＳＬＰ及びヒトＴＳＬＰ受容体が病態形成に関与する疾患の予防又は治療に用いることができる。

＜本発明のポリヌクレオチド＞
本発明のポリヌクレオチドには、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。

１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。

配列番号１のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列に示される重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２の塩基番号１から３５４までの塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。

好ましい実施形態において、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。

配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。

１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号３のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。

配列番号３のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号４の塩基番号１から３２４までの塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。

好ましい実施形態において、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。

配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。

本発明のポリヌクレオチドは、その塩基配列に基づき、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、ＷＯ９０／０７８６１に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が挙げられる。

＜本発明の発現ベクター、本発明の形質転換された宿主細胞、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体を生産する方法、及び該方法により生産された抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体＞
本発明の発現ベクターには、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び／又は本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。

好ましい本発明の発現ベクターとしては、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、又は本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターが挙げられる。

本発明のポリヌクレオチドを発現させるために用いる発現ベクターとしては、真核細胞（例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母）及び／又は原核細胞（例えば、大腸菌）の各種の宿主細胞中で本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び／又は本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現し、これらによりコードされるポリペプチドを産生できるものである限り、特に制限されるものではない。このような発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等が挙げられ、好ましくは、ｐＥＥ６．４やｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ社）を使用することができる。また、ＡＧ−γ１やＡＧ−κ（例えば、ＷＯ９４／２０６３２を参照）等の予めヒトＩｇ定常領域遺伝子を有する発現ベクターに可変領域遺伝子断片を導入して抗体遺伝子を発現することもできる。

本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。動物細胞で本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０などのウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。細菌（例えば、エシェリキア属菌）で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。また、酵母で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが挙げられる。

本発明の形質転換された宿主細胞には、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
（ａ）本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。

１つの実施形態において、本発明の形質転換された宿主細胞は、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。
（ａ）本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。

宿主細胞として動物細胞、昆虫細胞、又は酵母を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン及び終止コドンを含み得る。この場合、本発明の発現ベクターは、エンハンサー配列、本発明の抗体又はその重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域をコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、あるいは複製可能単位などを含んでいてもよい。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域、及び複製可能単位を含み得る。この場合、本発明の発現ベクターは、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。

好ましい本発明の形質転換された宿主細胞としては、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞が挙げられる。

形質転換する宿主細胞としては、使用する発現ベクターに適合し、該発現ベクターで形質転換されて、抗体を発現することができるものである限り、特に限定されるものではない。形質転換する宿主細胞としては、例えば、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞又は人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、細菌（エシェリキア属菌など）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）など）が挙げられ、好ましくは、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、２９３細胞、ＮＳ０細胞等の培養細胞を使用することができる。

宿主細胞を形質転換する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等を用いることができる。

本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法には、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法が含まれる。

本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントには、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法で生産された抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。

本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含している限り、特に限定されるものではない。該方法で使用される好ましい宿主細胞としては、前述の好ましい本発明の形質転換された宿主細胞が挙げられる。

形質転換された宿主細胞の培養は公知の方法により行うことができる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ、及び培養時間は、適宜選択される。宿主細胞が動物細胞の場合、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９５９、Ｖｏｌ．１３０、Ｎｏ．３３７３、ｐ．４３２−７）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９５９、Ｖｏｌ．８、ｐ．３９６）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．、１９６７、Ｖｏｌ．１９９、ｐ．５１９）、１９９培地（Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１９５０、Ｖｏｌ．７３、ｐ．１−８）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行われる。宿主細胞が昆虫細胞の場合、培地としては、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８５、Ｖｏｌ．８２、ｐ．８４０４）等を用いることができる。培地のｐＨは約５〜８であるのが好ましく、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０〜４０℃で約１５〜１００時間行われる。宿主細胞が大腸菌又は酵母である場合、培地としては、例えば、栄養源を含有する液体培地が適当である。栄養培地は、形質転換された宿主細胞の生育に必要な炭素源、無機窒素源又は有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源又は有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが挙げられる。所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類など）、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）を含んでいてもよい。培地のｐＨは約５〜８であるのが好ましい。宿主細胞が大腸菌の場合、好ましい培地としては、例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｏｌ．Ｃｌｏ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｖｏｌ．３、Ａ２．２）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約１４〜４３℃で約３〜２４時間行われる。宿主細胞が酵母の場合、培地としては、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８０、Ｖｏｌ．７７、ｐ．４５０５）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行われる。上述のような培養により、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させることができる。

本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程に加えて、さらには、該形質転換された宿主細胞から抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントを回収、好ましくは単離又は精製する工程を含むことができる。単離又は精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。好ましくは、培養上清中に蓄積された抗体は、各種クロマトグラフィー、例えば、プロテインＡカラム又はプロテインＧカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製することができる。

＜本発明の医薬組成物＞
本発明の医薬組成物には、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。

本発明の医薬組成物は、複数種の本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントを含み得る。例えば、重鎖Ｃ末端リジンの欠失抗体、Ｎ末端翻訳後修飾を受けた抗体又はその抗原結合フラグメント、重鎖Ｃ末端リジンを欠失しＮ末端翻訳後修飾を受けた抗体、及び／又は重鎖Ｃ末端リジンを有しＮ末端翻訳後修飾を受けていない抗体を含有する医薬組成物も本発明に含まれる。

例えば、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体を含有する本発明の医薬組成物には、以下の（１）〜（４）のうち２種以上の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体を含有する医薬組成物も含まれる。
（１）配列番号１のアミノ酸番号１から４４７までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体。
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体。
（３）配列番号１のアミノ酸番号１から４４７までのアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体。
（４）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体。

製剤化における本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントの添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、又は抗体の結合力価等により異なるが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いることができる。

本発明の医薬組成物は、ヒトＴＳＬＰ及びヒトＴＳＬＰ受容体が病態形成に関与する疾患、例えば、喘息の予防又は治療用医薬組成物として用いることができる。

本発明には、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される賦形剤を含む、喘息の予防又は治療用医薬組成物が含まれる。また、本発明には、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与する工程を包含する、喘息を予防又は治療する方法が含まれる。また、本発明には、喘息の予防又は治療に使用するための、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントが含まれる。また、本発明には、喘息の予防又は治療用医薬組成物の製造における、本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントの使用が含まれる。

本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。

市販のキット又は試薬等を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。また、便宜上、濃度ｍｏｌ／ＬをＭとして表わす。例えば、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液は１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液であることを意味する。

（実施例１：ＴＳＬＰ受容体−Ｆｃ融合蛋白質の取得）
抗体の結合活性の評価に用いるために、ヒトＴＳＬＰ受容体とヒトＦｃを融合させた蛋白質（ヒトＴＳＬＰ受容体−ヒトＦｃ融合蛋白質）、ヒトＴＳＬＰ受容体とマウスＦｃを融合させた蛋白質（ヒトＴＳＬＰ受容体−マウスＦｃ融合蛋白質）及びサルＴＳＬＰ受容体とヒトＦｃを融合させた蛋白質（サルＴＳＬＰ受容体−ヒトＦｃ融合蛋白質）を取得した。ヒトＴＳＬＰ受容体−ヒトＦｃ融合遺伝子（配列番号５）、ヒトＴＳＬＰ受容体−マウスＦｃ融合遺伝子（配列番号６）及びサルＴＳＬＰ受容体−ヒトＦｃ融合遺伝子（配列番号７）を哺乳細胞発現用ベクターＧＳベクター（Ｌｏｎｚａ社）ｐＥＥ１２．４にそれぞれ組み換えた。作製したベクターを、遺伝子導入試薬２９３フェクチン（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３細胞（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）へ遺伝子導入し、この細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた無血清培養系で1週間培養後、ヒトＴＳＬＰ受容体−ヒトＦｃ融合蛋白質、ヒトＴＳＬＰ受容体−マウスＦｃ融合蛋白質又はサルＴＳＬＰ受容体−ヒトＦｃ融合蛋白質を含む培養上清をそれぞれ取得した。取得した培養上清から蛋白質精製カラムプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いて各ＴＳＬＰ受容体−Ｆｃ融合蛋白質を精製した。

（実施例２：ＴＳＬＰ変異体−Ｆｌａｇ蛋白質の取得）
抗体の中和活性の評価に用いるために、ヒトＴＳＬＰ変異体にＦｌａｇタグを結合させた蛋白質（ヒトＴＳＬＰ変異体−Ｆｌａｇ蛋白質）及びサルＴＳＬＰ変異体にＦｌａｇタグを結合させた蛋白質（サルＴＳＬＰ変異体−Ｆｌａｇ蛋白質）を取得した。ヒト又はサルＴＳＬＰ変異体−Ｆｌａｇ遺伝子（配列番号８又は９（フューリンプロテアーゼにより切断されて活性が失われるのを防ぐために、その切断部位に変異を挿入したヒト又はサル野生型ＴＳＬＰのアミノ酸配列をそれぞれコードする））をＧＳベクターｐＥＥ１２．４にそれぞれ組み換えた。作製したベクターを、２９３フェクチンを用いてＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３細胞へ遺伝子導入し、この細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍを用いた無血清培養系で1週間培養後、ヒトＴＳＬＰ変異体−Ｆｌａｇ蛋白質又はサルＴＳＬＰ変異体−Ｆｌａｇ蛋白質を含む培養上清をそれぞれ取得した。取得した培養上清から抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、各ＴＳＬＰ変異体−Ｆｌａｇ蛋白質を精製した。

（実施例３：完全ヒト型抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の作製）
ヒトモノクローナル抗体開発技術「ベロシミューン」（ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ社（米国特許６５９６５４１号））マウスに、免疫反応を惹起するアジュバントと共に、ヒトＴＳＬＰ受容体−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ社）及びヒトＴＳＬＰ受容体発現Ｂａ／Ｆ３細胞（ヒトＴＳＬＰ受容体遺伝子（配列番号１０）及びヒトＩＬ−７受容体α鎖遺伝子（配列番号１１）をコードするベクターをマウスＢａ／Ｆ３細胞（理化学研究所：ＲＣＢ０８０５）へ導入することで作製）を免疫した。常法に従い、免疫したマウスの脾臓やリンパ節を摘出しリンパ球を収集し、これをマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１）と細胞融合することでハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマのモノクローン化を行い、無血清培地であるＣＤハイブリドーマメディウム（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で培養した。得られた培養上清から抗体精製キットＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｒｏｔｅｕｓ社）を用いて抗体を精製した。

抗体の結合活性を評価するために、実施例１で作製したヒトＴＳＬＰ受容体−ヒトＦｃ融合蛋白質及びサルＴＳＬＰ受容体−ヒトＦｃ融合蛋白質を用いたＥＬＩＳＡをそれぞれ行った。また、抗体の中和活性を評価するために、実施例２で作製したサルＴＳＬＰ変異体−Ｆｌａｇ蛋白質刺激によるヒトＴＳＬＰ受容体発現Ｂａ／Ｆ３細胞の細胞増殖阻害アッセイ、及び、実施例２で作製したサルＴＳＬＰ変異体−Ｆｌａｇ蛋白質刺激によるサル全血のＭＤＣ蛋白質産生阻害アッセイを行った。

以上の試験から、Ｔ７−２７と命名した抗体（キメラ抗体）が、ヒト及びサルＴＳＬＰ受容体に対する結合活性及び中和活性を有することが明らかとなった。Ｔ７−２７を産生するハイブリドーマから抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子をクローニングし、配列決定を行った。

前述の抗体は、可変領域がヒト由来であり、定常領域がマウス由来の抗体である。そこで、ＧＳベクターを用いて、重鎖及び軽鎖の両遺伝子を含む発現ベクターを構築し、完全ヒト型抗体を作製した。具体的には、Ｔ７−２７の抗体の重鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列（Ｎｉｇｅｌ Ｗｈｉｔｔｌｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９８７；１（６）：４９９−５０５．）をコードする遺伝子を、そして３’側にヒトＩｇγ１の定常領域遺伝子（配列番号２の塩基番号３５５から１３４４までの塩基配列からなる）をそれぞれ繋げ、この重鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ６．４に挿入した。また、抗体の軽鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列（Ｎｉｇｅｌ Ｗｈｉｔｔｌｅら、前出）をコードする遺伝子を、そして３’側にヒトＩｇκの定常領域遺伝子（配列番号４の塩基番号３２５から６４２までの塩基配列からなる）をそれぞれ繋げ、この軽鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ１２．４に挿入した。

作製したＴ７−２７の完全ヒト型抗体（完全ヒト型Ｔ７−２７）の重鎖をコードする塩基配列を配列番号２に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１に、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を配列番号４に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号３にそれぞれ示す。完全ヒト型Ｔ７−２７の重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなり、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１のアミノ酸番号３１から３５、５０から６６、９９から１０７までのアミノ酸配列からなる。完全ヒト型Ｔ７−２７の軽鎖可変領域は、配列番号３のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなり、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３のアミノ酸番号２４から３４、５０から５６、８９から９７までのアミノ酸配列からなる。

抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子がそれぞれ挿入された前述のＧＳベクターを用いて、一過性発現及び恒常的発現の２種類の方法で抗体発現を行った。一過性発現については、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍで約１００万個／ｍＬに培養されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３細胞に対し、前述の重鎖及び軽鎖の両発現ベクターを２９３フェクチンを用いてトランスフェクトし、７日間培養した。もしくは、約１０００万個のＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ社）に対して、前述の重鎖及び軽鎖の両発現ベクターをエレクトロポレーション法を用いてトランスフェクトし、ＣＤ−ＣＨＯ ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で７日間培養した。培養上清をプロテインＡカラム又はプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いて精製し、完全ヒト型抗体の精製抗体を得た。恒常的発現については、抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子がそれぞれ挿入された前述のＧＳベクターをＮｏｔＩとＰｖｕＩで制限酵素切断し、ライゲーション用キットＬｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ＮＩＰＰＯＮＧＥＮＥ社）又はライゲーション試薬Ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてライゲーションを行い、重鎖と軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクターを構築した。この発現ベクターは、完全長の重鎖及び軽鎖をコードしており、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞にトランスフェクションにより抗体を発現させた。培養上清をプロテインＡカラム又はプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケアジャパン社）で精製し、完全ヒト型抗体の精製抗体を得た。精製した完全ヒト型Ｔ７−２７のアミノ酸修飾を分析した結果、精製抗体の大部分において、重鎖Ｃ末端のリジンの欠失が生じていた。

（実施例４：ＳＰＲ解析による結合活性評価）
完全ヒト型Ｔ７−２７の結合活性を詳細に測定するために、ＳＰＲ解析を行った。本実施例では、比較抗体として、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体 ＴＳＬＰＲ−０１２＿１４１（特許文献４）を用いた。

ＳＰＲ解析においては、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いて解析を行った。センサーチップＣＭ５の表面にＨｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ ＫｉｔとＡｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いて、各抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体を固相化した。実施例１で取得したヒトＴＳＬＰ受容体−マウスＦｃ融合蛋白質を、ＨＢＳ−ＥＰ溶液（ＧＥヘルスケアジャパン社）で段階希釈し、流速５０μＬ／ｍｉｎにて、１００μＬを流路に添加した。この測定系により、ヒトＴＳＬＰ受容体−マウスＦｃ融合蛋白質と抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体との結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、及び解離定数（ＫＤ）を、データ解析ソフトウェア（ＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）を用いて計算した（表１）。
表１：ＳＰＲ解析によるヒトＴＳＬＰ受容体に対する結合活性

この結果、完全ヒト型Ｔ７−２７は、ＴＳＬＰＲ−０１２＿１４１と比較して、約３倍強い結合活性を有することが明らかとなった。

（実施例５：ヒトＰＢＭＣを用いたＴＳＬＰ誘発ＴＡＲＣ ｍＲＮＡ発現阻害評価）
完全ヒト型Ｔ７−２７の中和活性を評価するために、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＴＳＬＰ誘発のＴＡＲＣ ｍＲＮＡ発現阻害を評価した。ヒトＰＢＭＣには、ＴＳＬＰ受容体を発現している樹状細胞も含まれるため、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の評価に用いることができる。比較抗体として、ＴＳＬＰＲ−０１２＿１４１を用いた。後述の試験例１の結果から、抗ＴＳＬＰ受容体抗体による喘息モデルの病態改善と血中ＴＡＲＣ ｍＲＮＡの発現阻害に相関が認められたことから、本評価系は病態への有効性を示唆する評価系である。

ヒトＰＢＭＣ（ＡｌｌＣｅｌｌｓ社）を９６ウェルプレート（Ｇｌｅｉｎｅｒ社）に１ウェルあたり２０万個を、１６０μＬのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で播種した。実施例２で作製したヒトＴＳＬＰ変異体−Ｆｌａｇ蛋白質の希釈系列（最終濃度が０．１ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬまでの範囲で７段階）をＲＰＭＩ１６４０培地で作製して培養液中に２０μＬ添加した。３７℃に設定したＣＯ₂インキュベータにて２４時間インキュベートした後、各抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体を最終濃度が０．３μｇ／ｍＬになるようにＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、培養液中に２０μＬ添加して、さらに７２時間インキュベートした。コントロールサンプルとして、ヒトＴＳＬＰ変異体−Ｆｌａｇ蛋白質の代わりにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェル、抗体の代わりにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェルをそれぞれ準備した。培養上清２００μＬを除去後、ＲＮＡ精製用キットＲＮｅａｓｙ ９６ ｋｉｔ（キアゲン社）を使用してトータルＲＮＡを３０μＬの水で抽出した。次に逆転写用キットＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して、１０μＬのＲＮＡを逆転写反応した。次に、ＴＡＲＣのＴａｑＭａｎプローブ （Ｃｃｌ１７、Ｈｓ００１７１０７４、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、βアクチンのＴａｑＭａｎプローブ（Ａｃｔｂ、Ｈｓ９９９９９９０３、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｅｘｐｒｅｓｓ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ａ１０３１３、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及び２μＬのｃＤＮＡを使って、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法にてＴＡＲＣ ｍＲＮＡの発現量を測定した。各抗体についてデュプリケートで試験を行い、測定結果を比較ＣＴ法にて解析し、ＴＡＲＣ ｍＲＮＡの発現量を計算した。そこから、各ＴＳＬＰ濃度における抗体の阻害率を計算した。ヒトＴＳＬＰ変異体−Ｆｌａｇ蛋白質の代わりにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェルの阻害率を１００％として設定し、ヒトＴＳＬＰ変異体−Ｆｌａｇ蛋白質を３０及び１００ｎｇ／ｍｌを添加したウェルの平均値を阻害率０％として設定した。算出された阻害率を解析し、３パラメータロジスティック曲線当てはめにより、０．３μｇ／ｍＬの抗体が５０％阻害できるＴＳＬＰ濃度を算出した（表２）。本ＴＳＬＰ濃度が高いほど、被験抗体のＴＳＬＰに対する中和活性が強いことを意味する。
表２：ヒトＰＢＭＣを用いたＴＳＬＰ誘発ＴＡＲＣ ｍＲＮＡ発現阻害活性

この結果、完全ヒト型Ｔ７−２７は、ＴＳＬＰＲ−０１２＿１４１と比較して、ヒトＴＳＬＰ誘発ＴＡＲＣ ｍＲＮＡ発現阻害活性が１２倍高いことが明らかとなった。

（実施例６：ヒトＰＢＭＣを用いたＴＳＬＰ誘発ＭＤＣ蛋白質産生阻害評価）
完全ヒト型Ｔ７−２７の中和活性を評価するために、ヒトＰＢＭＣにおけるＴＳＬＰ誘発のＭＤＣ蛋白質産生阻害を評価した。比較抗体として、ＴＳＬＰＲ−０１２＿１４１を用いた。

ヒトＰＢＭＣは、ヒト血液を等量のＰＢＳにて希釈後、等量のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥヘルスケアジャパン社）の上に積層し、室温、４００×ｇ、３０分間遠心処理することによって調製した。ヒトＰＢＭＣを９６ウェルプレート（Ｇｌｅｉｎｅｒ社）に１ウェルあたり約３０万個を、１００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で播種した。実施例２で作製したヒトＴＳＬＰ変異体−Ｆｌａｇ蛋白質を最終濃度が５ｎｇ／ｍＬになるようにＲＰＭＩ１６４０培地で調製し培養液中に１０μＬ添加した。３７℃に設定したＣＯ₂インキュベータにて２４時間インキュベートした後、各抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の希釈系列（最終濃度が０．１ｎｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬまでの範囲で５段階）をＲＰＭＩ１６４０培地で作製して培養液中に１０μＬ添加し、さらに５日間インキュベートした。コントロールサンプルとして、ヒトＴＳＬＰ変異体−Ｆｌａｇ蛋白質の代わりにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェル、抗体の代わりにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェルをそれぞれ準備した。その後、培養上清を採取し、ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で２０倍希釈した上清を利用して、ＭＤＣの産生量をＨｕｍａｎ ＣＣＬ２２／ＭＤＣ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ社）を使用して評価した。各抗体について、デュプリケートで試験を行い、各抗体濃度における阻害率を計算した。ヒトＴＳＬＰ変異体−Ｆｌａｇ蛋白質の代わりにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェルの阻害率を１００％として設定し、抗体の代わりにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェルの阻害率を０％として設定した。３パラメータロジスティック曲線当てはめにより、５０％阻害できる抗体濃度をＩＣ５０として算出した（表３）。
表３：ヒトＰＢＭＣを用いたＴＳＬＰ誘発ＭＤＣ蛋白質産生阻害評価

この結果、完全ヒト型Ｔ７−２７は、ＴＳＬＰＲ−０１２＿１４１と比較して、ＴＳＬＰ誘発ＭＤＣ蛋白質産生阻害活性が約９倍高いことが明らかとなった。

（実施例７：サルアスカリス抗原感作モデルにおける完全ヒト型Ｔ７−２７の評価）
サルをアスカリス抗原で感作させることで、アスカリス抗原特異的ＩｇＥが誘導され、アレルギー反応として皮膚反応が惹起される。
雄性カニクイザルにＤａｙ１、Ｄａｙ８及びＤａｙ１５に水酸化アルミニウムゲル（以下、Ａｌｕｍと称する）で懸濁したアスカリス抗原液（０．５ｍｇ／ｍＬ ＤＮＰ−Ａｓｃａｒｉｓ（ＬＳＬ社）、５０ｍｇ／ｍＬ Ａｌｕｍの濃度でＰＢＳに懸濁した抗原液。以下、アスカリス抗原−Ａｌｕｍ液と称する。）を、腹腔内に３．６ｍＬ／ｋｇ、筋肉内に０．４ｍＬ／ｋｇを投与することで感作した。なお、処置群として、Ｎｏｒｍａｌ群（無処置群。ｎ＝２）、Ｖｅｈｉｃｌｅ群（溶媒（２０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液／１２０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０））を感作１日前に静脈内投与した群。ｎ＝３）及び抗体投与群（１０ｍｇ／ｋｇの完全ヒト型Ｔ７−２７（溶媒で希釈）を感作１日前に静脈内投与した群。ｎ＝３）をそれぞれ設定した。
なお、Ａｌｕｍは、以下の方法で作製した。
硫酸アルミニウム（１４〜１８水和物）（Ｗａｋｏ社）を超純水に溶解して１Ｍの溶液を調製し、０．２２μｍのフィルターに通した後、１Ｍ 水酸化ナトリウム（ナカライテスク社）を白色沈殿が生じなくなるまで添加した。上清を除去し、超純水で５回洗浄後、さらにＰＢＳ（ＷＡＫＯ社）で３回洗浄した。洗浄した白色沈殿を、氷冷下においてホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社、ＣＨ−６０１０）により細かく砕いた。次に、遠心機（日立社、ｈｉｍａｃ ＣＲ２１）で２０００ｒｐｍ、５分、４℃にて遠心後、上清を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。得られた沈殿物をＰＢＳに懸濁してＡｌｕｍを得た。

血漿中アスカリス抗原特異的ＩｇＥの測定
上記カニクイザルよりＤａｙ１（アスカリス抗原−Ａｌｕｍ液を投与する前）、Ｄａｙ８、Ｄａｙ１５及びＤａｙ２２と継時的に採血し、遠心（１８００×ｇ、４℃、１０分）後、血漿を回収した。血漿中のアスカリス抗原特異的ＩｇＥの産生量は以下の方法を用いて測定した。
ＤＮＰ−Ａｓｃａｒｉｓを１００μｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳで調製し、Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ^TM ＭｉｃｒｏＷｅｌｌ^TM ９６ウェルソリッドプレート（Ｎｕｎｃ社）に１００μＬ添加して室温で一晩固相化した。ブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ：ナカライテスク社）を２００μＬ添加し、室温で３０分静置した後、その溶液を除去した。次に、回収した血漿及び検量線用サンプルをそれぞれ１００μＬ添加した。検量線用サンプルには、Ｖｅｈｉｃｌｅ群の１個体のＤａｙ２２における血漿中アスカリス抗原特異的ＩｇＥ濃度を２０００Ｕ／ｍＬとし、希釈溶液（５％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ含有ＰＢＳ）により調製した希釈系列（２０００Ｕ／ｍＬ〜１６Ｕ／ｍＬ）を用いた。室温にて１時間静置した後、Ｔ−ＰＢＳ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）にて５回洗浄し、希釈溶液で１００００倍に希釈したＨＲＰ標識ヒトＩｇＥ検出抗体（Ａ８０−１０８Ｐ：Ｂｅｔｈｙｌ社）を１００μＬ添加した。再び室温にて１時間静置した後、Ｔ−ＰＢＳで５回洗浄した。最後にペルオキシダーゼ発色キット（ＭＬ−１１２０Ｔ：ＳＵＭＩＬＯＮ社）を用いて測定した。吸光度はＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（モレキュラーデバイス社）で測定した。Ｄａｙ１及びＤａｙ２２の結果を、図１に示す。

スキンテスト
Ｄａｙ２２に、Ｖｅｈｉｃｌｅ群及び抗体投与群の各個体の皮内にＰＢＳ並びに１、１０及び１００μｇ／ｍＬ アスカリス抗原溶液（ＤＮＰ−ＡｓｃａｒｉｓをＰＢＳで懸濁した溶液）を、それぞれ１００μＬ、同一個体の剃毛した腹部各２か所（１匹あたり合計８カ所）に投与した。Ｎｏｒｍａｌ群には、各個体の皮内にＰＢＳ及び１００μｇ／ｍＬ アスカリス抗原溶液を、それぞれ１００μＬ、同一個体の剃毛した腹部各４か所（１匹あたり合計８カ所）に投与した。皮膚感作２０分後に、ノギスを用いて直径を測定することで皮膚反応を観察した。それぞれの個体において、アスカリス抗原溶液投与後の皮膚反応の直径からＰＢＳ投与後の皮膚反応の直径を引いた値をｄｅｌｔａ ｃｍとした。１００μｇ／ｍＬ アスカリス抗原溶液投与時の結果を、図２に示す。なお、１及び１０μｇ／ｍＬ アスカリス抗原溶液を投与した場合、被験抗体を評価するのに十分な皮膚反応は惹起されなかった。

各群の平均値及び標準誤差を求め、血漿中アスカリス抗原特異的ＩｇＥの測定においては、Ｄａｙ１の値（アスカリス抗原−Ａｌｕｍ液を投与する前の値）を１００％、Ｄａｙ２２のＶｅｈｉｃｌｅ群を０％として抑制率を求めた。

図１に示すように、完全ヒト型Ｔ７−２７はＶｅｈｉｃｌｅ群と比較して、サルアスカリス抗原感作モデルにおいて、アスカリス抗原特異的ＩｇＥ濃度を減少させた（９７％抑制）。

図２に示すように、完全ヒト型Ｔ７−２７はＶｅｈｉｃｌｅ群と比較して、サルアスカリス抗原感作モデルにおいて、１００μｇ／ｍＬ アスカリス抗原溶液投与時のアスカリス抗原特異的皮膚反応を減少させた。

これらの結果から、完全ヒト型Ｔ７−２７は、サルアスカリス抗原感作モデルにおいて、アスカリス抗原特異的ＩｇＥにより惹起されるアレルギー反応を抑制させることが明らかとなった。

（試験例１：マウスダニ抗原感作喘息モデルにおける抗ＴＳＬＰ受容体抗体の評価）
マウスダニ抗原感作モデルは喘息モデルとして知られており、その病態としては、気道反応性の亢進及び気管支肺胞への好酸球の浸潤等が挙げられる。
ＮＣ／Ｎｇａ マウス（チャールスリバー社）に、Ｄａｙ０（初回感作時）及びＤａｙ５に、ダニ抗原（Ｄｐ）（ＬＳＬ社）を１００μｇ Ｄｐ／０．５ｍＬ生理食塩液／マウスの用量で腹腔内投与することで感作を実施した。Ｄａｙ１２及びＤａｙ１９に、ダニ抗原を１００μｇ Ｄｐ／５０μＬ生理食塩液／マウスの用量で点鼻投与することで気道炎症を惹起した。抗体投与群には、Ｄａｙ−１、Ｄａｙ２、Ｄａｙ５、Ｄａｙ８、Ｄａｙ１１、Ｄａｙ１４、及びＤａｙ１８（抗体投与日）に１日１回、各用量（０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇ）でＰＢＳ（ＷＡＫＯ社）に溶解した抗マウスＴＳＬＰ受容体抗体（ＷＡＫＯ社）を皮下投与した。陽性対照群としてデキサメタゾン投与群（Ｄｅｘ群）を設けた。Ｄｅｘ群には、Ｄａｙ１２からＤａｙ１９まで１日１回、３ｍｇ／ｋｇの用量でＰＢＳに溶解したデキサメタゾンを腹腔内投与した。設定した処置群は以下のとおりである。
［処置群］
Ｎｏｒｍａｌ群（ｎ＝１０）：
無処置
Ｓａｌｉｎｅ群（ｎ＝６）：
Ｄａｙ０及びＤａｙ５にダニ抗原を腹腔内投与、Ｄａｙ１２及びＤａｙ１９に生理食塩液を点鼻投与、抗体投与日にＰＢＳを皮下投与
ＰＢＳ群（ｎ＝１０）：
Ｄａｙ０及びＤａｙ５にダニ抗原を腹腔内投与、Ｄａｙ１２及びＤａｙ１９にダニ抗原を点鼻投与、抗体投与日にＰＢＳを皮下投与
抗体投与群（０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇ）（各用量につきｎ＝１０）：
Ｄａｙ０及びＤａｙ５にダニ抗原を腹腔内投与、Ｄａｙ１２及びＤａｙ１９にダニ抗原を点鼻投与、抗体投与日に各用量の抗体を皮下投与
Ｄｅｘ群（ｎ＝１０）：
Ｄａｙ０及びＤａｙ５にダニ抗原を腹腔内投与、Ｄａｙ１２及びＤａｙ１９にダニ抗原を点鼻投与、Ｄａｙ１２からＤａｙ１９にデキサメタゾンを腹腔内投与

Ｄａｙ２０にマウスを専用の無拘束チャンバー内に入れた。チャンバーに取り付けた、呼吸気流計を利用したトランスデューサーを呼吸機能解析装置ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ ＸＡ（Ｂｕｘｃｏ社）に接続し、大気圧に対するチャンバー内圧の変化をトランスデューサーで検出した。気道反応性を調べるために、超音波ネブライザーを用いて、生理食塩液に溶解したアセチル−β―メチルコリンクロリド（Ｓｉｇｍａ社）（０．２５、０．５、１、２、４ｍｇ／ｍＬ）を順に濃度を上げながら吸入曝露した。チャンバー内圧の変化を用いて機械的に算出されるＰｅｎＨを、呼吸機能の指標として使用した。測定結果を図３に示す。

次に、マウスの腹部大静脈より血液採取後、マウスを放血により安楽死させた。気管内にカニューレを挿管し、０．１％ウシ胎児血清（ＢｉｏＷｅｓｔ社）含有ＰＢＳ溶液で気管支肺胞洗浄を行い、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を回収した。ＢＡＬＦを遠心し、上清を除去した後、沈渣を生理食塩液５００μＬで懸濁し、ＢＡＬＦ細胞懸濁液を調製した。ＢＡＬＦ細胞懸濁液中の好酸球数を、多項目自動血球分析装置ＸＴ−２０００ｉ（ＳＹＳＭＥＸ社）を用いて測定した。測定結果を図４に示す。

上記で取得した血液を、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で１０倍希釈しプレート（ＩＷＡＫＩ社）に播種した（１ｍＬ／ウェル）。マウスＴＳＬＰ（Ｒ＆Ｄ社）を終濃度で０又は１０ｎｇ/ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、１００μＬ添加した。３７℃、５％ＣＯ₂下で、２４時間培養した後、ＲＮｅａｓｙ ９６ ｋｉｔ（キアゲン社）を使用してトータルＲＮＡを３０μＬの水で抽出した。次にＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して、１０μＬのＲＮＡを逆転写反応した。次に、ＴＡＲＣのＴａｑＭａｎプローブ （Ｃｃｌ１７、Ｍｍ０１２４４８２６ ｇ１、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、βアクチンのＴａｑＭａｎプローブ（Ａｃｔｂ、Ｍｍ００６０７９３９ ｓ１、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｅｘｐｒｅｓｓ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ａ１０３１３、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及び２μＬのｃＤＮＡを使って、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法にてＴＡＲＣ ｍＲＮＡの発現量を測定した。測定結果を比較ＣＴ法にて解析し、発現量を計算した。１０ｎｇ/ｍＬ ＴＳＬＰ添加時の結果を図５に示す。

各群の平均値及び標準誤差を求めた。ＰＢＳ群とＮｏｒｍａｌ群、Ｓａｌｉｎｅ群及びＤｅｘ群それぞれの群の間の有意差検定には、Ｓｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定を用いた。ＰＢＳ群と抗体投与群の間の有意差検定には、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較を用いた。いずれの場合にも、ｐ＜０．０５の場合を有意差ありとした。

図３に示すように、抗体投与群ではＰＢＳ群と比較して、このマウス喘息モデルにおいて、１ｍｇ/ｍＬのアセチル−β―メチルコリンクロリドで誘発される気道反応性亢進抑制作用が認められた。抗ＴＳＬＰ受容体抗体は、喘息モデルにおいて呼吸機能を改善することが明らかとなった。

図４に示すように、抗体投与群ではＰＢＳ群と比較して、気管支肺胞への好酸球の浸潤抑制作用が認められた。

図５に示すように、抗体投与群ではＰＢＳ群と比較して、ＴＡＲＣ ｍＲＮＡの発現阻害作用が認められた。

図３及び図４の結果から抗ＴＳＬＰ受容体抗体は、喘息モデルの病態を改善することが確認された。さらに、図５の結果と合わせて、抗ＴＳＬＰ受容体抗体による病態の改善とＴＡＲＣ ｍＲＮＡの発現阻害に相関が認められ、ＴＡＲＣ ｍＲＮＡの発現阻害効果を指標に、病態改善効果を評価できることが明らかになった。

本発明の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体は、ヒトＴＳＬＰ及びヒトＴＳＬＰ受容体が病態形成に関与する各種疾患の予防又は治療に有用である。また、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞及び生産する方法は、前記抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体を産生するのに有用である。

以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号２及び４で示される塩基配列は、それぞれ完全ヒト型Ｔ７−２７の重鎖及び軽鎖の塩基配列であり、配列番号１及び３で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２及び４によりコードされる重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列である。配列表の配列番号５、６、７、８及び９で示される塩基配列は、それぞれヒトＴＳＬＰ受容体−ヒトＦｃ融合蛋白質、ヒトＴＳＬＰ受容体−マウスＦｃ融合蛋白質、サルＴＳＬＰ受容体−ヒトＦｃ融合蛋白質、ヒトＴＳＬＰ変異体−Ｆｌａｇ蛋白質及びサルＴＳＬＰ変異体−Ｆｌａｇ蛋白質をコードする塩基配列である。

Claims (21)

1. 配列番号１のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号３のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメント。
2. 前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域である、請求項１に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメント。
3. 前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκ定常領域である、請求項１に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメント。
4. 前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域であり、前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκ定常領域である、請求項１に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメント。
5. 上記抗原結合フラグメントが一本鎖可変領域フラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）₂である、請求項１に記載の抗原結合フラグメント。
6. 配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体。
7. 配列番号１のアミノ酸番号１から４４７までのアミノ酸番号からなる重鎖、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体。
8. 請求項１に記載の抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
9. 請求項１に記載の抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
10. 請求項８及び／又は９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
11. 以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、請求項１０に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
    （ａ）請求項１に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
    （ｂ）請求項１に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
    （ｃ）請求項１に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
    （ｄ）請求項１に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
12. 以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、請求項１０に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
    （ａ）請求項６に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
    （ｂ）請求項６に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
    （ｃ）請求項６に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
    （ｄ）請求項６に記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
13. 請求項１１に記載の宿主細胞を培養し、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法。
14. 請求項１２に記載の宿主細胞を培養し、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体を生産する方法。
15. 請求項１３に記載の方法で生産された抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメント。
16. 請求項１４に記載の方法で生産された抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体。
17. 請求項１〜７、１５、及び１６のいずれかに記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
18. 喘息の予防又は治療用医薬組成物である、請求項１７に記載の医薬組成物。
19. 請求項１〜７、１５、及び１６のいずれかに記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与する工程を包含する、喘息を予防又は治療する方法。
20. 喘息の予防又は治療に使用するための、請求項１〜７、１５、及び１６のいずれかに記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメント。
21. 喘息の予防又は治療用医薬組成物の製造における、請求項１〜７、１５、及び１６のいずれかに記載の抗ヒトＴＳＬＰ受容体抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。

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