JP6627761B2 - 新規抗ヒトＩｇβ抗体 - Google Patents

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Description

本発明は、医薬組成物の有効成分として有用な抗ヒトＩｇβ抗体に関する。
Ｂ細胞受容体（Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＢＣＲ）は、Ｉｇα（ＣＤ７９Ａ）とＩｇβ（ＣＤ７９Ｂ）のヘテロ二量体と会合した膜結合型免疫グロブリン分子（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ；ｍＩｇ）から構成される。抗原は、ｍＩｇに結合し、受容体を凝集させ、Ｉｇα／ＩｇβサブユニットはＢ細胞内にシグナルを伝達する（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．４１，ｐ．５９９−６１３，２００４）。
ＩｇＧ抗体に対するＦｃ受容体であるＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）のタンパク質ファミリーには、免疫活性的な機能を有するＦｃγＲＩａ（ＣＤ６４Ａ）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２Ａ）、及びＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６Ａ）と、免疫抑制的な機能を有するＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２Ｂ）が報告されている。Ｂ細胞上のＢＣＲとＦｃγＲＩＩｂとがＩｇＧ免疫複合体を介して架橋されると、Ｂ細胞の活性化が抑制され、Ｂ細胞の増殖や抗体産生が抑制されることが報告されている（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１０，ｐ．３２８−３４３，２０１０、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．８，ｐ．３４−４７，２００８、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２，ｐ．５８０−５９２，２００２）。
このようなＦｃγＲＩＩｂを介したＢ細胞活性化の制御は、関節リウマチや全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患に深く関与することが報告されている。
関節リウマチとの関連としては、ＦｃγＲＩＩｂノックアウトマウスにおいて、液性免疫が適切に制御されず（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３７９，ｐ．３４６−３４９，１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６３，ｐ．６１８−６２２，１９９９）、コラーゲン誘導関節炎に対する感受性が増加することが報告されている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１８９，ｐ．１８７−１９４，１９９９）。また、関節リウマチ患者のメモリーＢ細胞におけるＦｃγＲＩＩｂの発現低下が確認されている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１９０，ｐ．６０１５−６０２２，２０１３）。
全身性エリテマトーデスとの関連としては、ＦｃγＲＩＩｂがＢ細胞特異的に発現亢進するトランスジェニックマウスにおいて、全身性エリテマトーデス様病態の発症が有意に抑制されることが報告されている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．２０５，ｐ．８８３−８９５，２００８）。ＦｃγＲＩＩｂのノックアウトマウスにおいて、自己反応性のＢ細胞やプラズマ細胞が出現し、全身性エリテマトーデス様病態を自然発症することが確認されている（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．１３，ｐ．２７７−２８５，２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．２０７，ｐ．２７６７−２７７８，２０１０）。また、全身性エリテマトーデス患者のメモリーＢ細胞におけるＦｃγＲＩＩｂの発現低下（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．２０３，ｐ．２１５７−２１６４，２００６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１７８，ｐ．３２７２−３２８０，２００７）や、ＦｃγＲＩＩｂの細胞膜貫通領域における遺伝子多型と全身性エリテマトーデスの発症頻度との関連性（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，Ｖｏｌ．４６，ｐ．１２４２−１２５４，２００２）が報告されている。
また、ＦｃγＲＩＩｂを介したＢ細胞活性化の制御による抗体産生の抑制は、自己抗体が病態に関連する自己免疫疾患の治療に有効である。
特発性血小板減少性紫斑病は、自己の血小板に対する自己抗体が原因で血小板破壊が生じる自己免疫疾患である（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．，Ｖｏｌ．１３，ｐ．５７７−５８３，２０１４）。抗血小板抗体を投与された動物は血小板減少が惹起され（Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，Ｖｏｌ．１６７，ｐ．１１０−１２０，２０１４）、自己抗体を減少させることが特発性血小板減少性紫斑病の治療に有効であること（Ｔｈｅｒ．Ａｐｈｅｒ．Ｄｉａｌ．Ｖｏｌ．１６，ｐ．３１１−３２０，２０１２、Ｌｕｐｕｓ，Ｖｏｌ．２２，ｐ．６６４−６７４，２０１３）が報告されている。
従って、ＢＣＲとＦｃγＲＩＩｂを架橋し、ＦｃγＲＩＩｂの免疫抑制機能を増強するモノクローナル抗体を開発することができれば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス及び特発性血小板減少性紫斑病等の自己免疫疾患の予防及び治療に有用であることが期待される。
ＢＣＲとＦｃγＲＩＩｂを架橋する抗体としては、ＩｇβとＦｃγＲＩＩｂに対する二重特異的抗体であるＤＡＲＴ（特許文献１、非特許文献１）、及びＢＣＲ複合体の一部であるＣＤ１９に結合する可変領域とＦｃγＲＩＩｂに対する親和性が増強されたＦｃ領域を有するａｎｔｉ−ＣＤ１９ Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（特許文献２、非特許文献２及び３）が報告されている。その中でも、ａｎｔｉ−ＣＤ１９ Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆが詳細に検討されており、ＢＣＲを刺激したＢ細胞の活性化に対する抑制作用、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を移植したマウスにおけるヒト血中抗体価濃度の低下作用が確認されている（特許文献２、非特許文献２及び３）。
国際公開第２０１２／０１８６８７号 国際公開第２００８／１５０４９４号
「アースライティス アンド リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ）」、（米国）、２０１０；６２（７）：１９３３−１９４３ 「モレキュラー イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、（米国）、２００８；４５（１５）：３９２６−３９３３ 「ザ ジャーナル オブ イムノロジー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、（米国）、２０１１；１８６（７）：４２２３−４２３３
本発明の課題は、ＢＣＲとＦｃγＲＩＩｂを架橋する、従来の抗体よりも増強された免疫抑制機能を有する抗ヒトＩｇβ抗体を提供することにある。
本発明者らは、抗ヒトＩｇβ抗体の作製において相当の創意検討を重ねた結果、配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９８から１０８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４のアミノ酸番号２４から３８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５４から６０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９３から１０１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、該抗体の重鎖定常領域がＳ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である、抗ヒトＩｇβ抗体を複数作製し（実施例１〜３）、これらの抗体が、ヒトＢ細胞上のヒトＩｇβに結合し（実施例４及び５）、抗ＩｇＭ抗体誘発性のヒトＢ細胞の活性化を阻害すること（実施例６）を見出した。これらの結果、前記抗ヒトＩｇβ抗体を提供し、本発明を完成した。さらには、上記抗体が、ヒトＰＢＭＣ移入ＮＯＧマウスモデルにおいて、血漿中ヒト抗体価を抑制すること（実施例７）、及びサルＴＴｘ抗原感作モデルにおいて、血漿中の総抗体価に影響を与えることなく、抗原特異的抗体を抑制すること（実施例８）を見出した。
すなわち、本発明は、医学上又は産業上有用な物質又は方法として以下の発明を含むものである。
（１）抗ヒトＩｇβ抗体であって、配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９８から１０８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４のアミノ酸番号２４から３８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５４から６０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９３から１０１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
（２）ヒト化抗体である、（１）に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
（３）以下の１）〜４）からなる群より選択される、（１）に記載の抗ヒトＩｇβ抗体：
１）配列番号６のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号８のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、抗ヒトＩｇβ抗体；
２）配列番号２のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、抗ヒトＩｇβ抗体；
３）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１２のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、抗ヒトＩｇβ抗体；並びに
４）上記１）〜３）のいずれかの抗ヒトＩｇβ抗体の翻訳後修飾により生じた抗ヒトＩｇβ抗体。
（４）配列番号６のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号８のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、（３）に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
（５）配列番号２のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、（３）に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
（６）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１２のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、（３）に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
（７）（４）〜（６）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の翻訳後修飾により生じた抗ヒトＩｇβ抗体。
（８）翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失である、（３）又は（７）に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
（９）ヒトＩｇκ定常領域である軽鎖定常領域を含む、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
（１０）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、（１）に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
（１１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、（１）に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
（１２）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、（１）に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
（１３）（１０）〜（１２）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の翻訳後修飾により生じた抗ヒトＩｇβ抗体。
（１４）翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失である、（１３）に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
（１５）アミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号６のアミノ酸番号１から４４８までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、（１３）に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
（１６）配列番号２のアミノ酸番号１から４４８までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、（１３）に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
（１７）配列番号１０のアミノ酸番号１から４４８までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、（１３）に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
（１８）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
（１９）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
（２０）（１８）及び／又は（１９）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（２１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、（２０）に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞：
（ａ）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（２２）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、（２０）に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞：
（ａ）（１０）〜（１３）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）（１０）〜（１３）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）（１０）〜（１３）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）（１０）〜（１３）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（２３）以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＩｇβ抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＩｇβ抗体を生産する方法：
（ａ）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（２４）以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＩｇβ抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＩｇβ抗体を生産する方法：
（ａ）（１０）〜（１３）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）（１０）〜（１３）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）（１０）〜（１３）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（２５）（２３）に記載の方法で生産された抗ヒトＩｇβ抗体。
（２６）（２４）に記載の方法で生産された抗ヒトＩｇβ抗体。
（２７）（１）〜（１７）、（２５）及び（２６）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
（２８）（１０）に記載の抗ヒトＩｇβ抗体、（１５）に記載の抗ヒトＩｇβ抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
（２９）自己免疫疾患の予防又は治療用の医薬組成物である、（２７）又は（２８）に記載の医薬組成物。
（３０）自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ又は特発性血小板減少性紫斑病 である、（２９）に記載の医薬組成物。
（３１）（１）〜（１７）、（２５）及び（２６）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の治療有効量を投与する工程を包含する、自己免疫疾患を予防又は治療する方法。
（３２）自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ又は特発性血小板減少性紫斑病である、（３１）に記載の方法。
（３３）自己免疫疾患の予防又は治療に使用するための、（１）〜（１７）、（２５）及び（２６）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
（３４）自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ又は特発性血小板減少性紫斑病である、（３３）に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
（３５）自己免疫疾患の予防又は治療用医薬組成物の製造における、（１）〜（１７）、（２５）及び（２６）のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の使用。
（３６）自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ又は特発性血小板減少性紫斑病である、（３５）に記載の使用。
本発明の抗ヒトＩｇβ抗体は、Ｂ細胞の活性化を阻害することによって、優れた免疫抑制作用を有するものであり、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ又は特発性血小板減少性紫斑病等の自己免疫疾患の予防又は治療剤として使用できる。
ヒトＢ細胞における抗ＩｇＭ抗体誘発細胞増殖に対するヒト化抗Ｉｇβ抗体の阻害効果を示す。縦軸はＢ細胞の増殖率、横軸は添加した抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。
ヒトＰＢＭＣをＮＯＧマウスに移入することによって惹起される血漿中ヒトＩｇＭ抗体価の上昇に対するヒト化抗Ｉｇβ抗体の阻害作用を示す。縦軸は血漿中ヒトＩｇＭ抗体価（μｇ／ｍＬ）、横軸はヒトＰＢＭＣをＮＯＧマウスに移入してからの時間（日）を示す。
ヒトＰＢＭＣをＮＯＧマウスに移入することによって惹起される血漿中ヒトＩｇＥ抗体価の上昇に対するヒト化抗Ｉｇβ抗体の阻害作用を示す。縦軸は血漿中ヒトＩｇＥ抗体価（ｎｇ／ｍＬ）、横軸はヒトＰＢＭＣをＮＯＧマウスに移入してからの時間（日）を示す。
沈降破傷風トキソイドをサルに免疫することによって惹起される血漿中の抗沈降破傷風トキソイド抗体価の上昇に対するヒト化抗Ｉｇβ抗体の阻害作用を示す。縦軸は血漿中抗沈降破傷風トキソイド抗体価（Ｕ／ｍＬ）、横軸は沈降破傷風トキソイドをサルに免疫してからの時間（日）を示す。
沈降破傷風トキソイドを免疫したサルにおけるヒト化抗Ｉｇβ抗体の血漿中総ＩｇＭ抗体価に対する作用を示す。縦軸は血漿中総ＩｇＭ抗体価（Ｕ／ｍＬ）、横軸は沈降破傷風トキソイドをサルに免疫してからの時間（日）を示す。
沈降破傷風トキソイドを免疫したサルにおけるヒト化抗Ｉｇβ抗体の血漿中総ＩｇＡ抗体価に対する作用を示す。縦軸は血漿中総ＩｇＡ抗体価（Ｕ／ｍＬ）、横軸は沈降破傷風トキソイドをサルに免疫してからの時間（日）を示す。
沈降破傷風トキソイドを免疫したサルにおけるヒト化抗Ｉｇβ抗体の血漿中総ＩｇＧ抗体価に対する作用を示す。縦軸は血漿中総ＩｇＧ抗体価（Ｕ／ｍＬ）、横軸は沈降破傷風トキソイドをサルに免疫してからの時間（日）を示す。
以下に、本発明について詳述する。
抗体にはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥの５つのクラスが存在する。抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２万〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してＩｇγ、Ｉｇμ、Ｉｇα、Ｉｇδ、Ｉｇεとよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のサブクラスが存在し、それぞれに対応する重鎖はＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３、Ｉｇγ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれＩｇλ、Ｉｇκとよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ、ε鎖には五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位又はドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにアミノ末端（Ｎ末端）に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域とよばれている。可変領域よりカルボキシ末端（Ｃ末端）側のアミノ酸配列は、各クラス又はサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれている。
抗体の抗原結合部位は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域によって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇの定常領域の構造の差を反映している。軽鎖と重鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ；それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と呼んでいる。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、比較的一定である。
＜本発明の抗ヒトＩｇβ抗体＞
本発明の抗ヒトＩｇβ抗体には、以下の特徴を有する抗ヒトＩｇβ抗体が含まれる。
抗ヒトＩｇβ抗体であって、配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９８から１０８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４のアミノ酸番号２４から３８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５４から６０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９３から１０１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体は、ヒト化抗体である。本明細書において「ヒト化抗体」とは、マウス抗体由来のＣＤＲとヒト抗体由来の他の抗体部分を含む形態の抗体を意味する。ヒト化抗体の作製方法は当該分野で公知であり、例えば、米国特許５２２５５３９号、同６１８０３７０号等を参照して作製することができる。
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体は、以下の１）〜３）のいずれかに記載の抗ヒトＩｇβ抗体である：
１）配列番号２のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、抗ヒトＩｇβ抗体；
２）配列番号６のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号８のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、抗ヒトＩｇβ抗体；並びに
３）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１２のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
本明細書中で使用される抗体の定常領域におけるアミノ酸変異導入に関する残基番号については、ＥＵインデックス（Ｋａｂａｔら，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）に従う。Ｓ２３９Ｄとは、ヒトＩｇγ１定常領域におけるＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従うアミノ酸２３９位のセリンのアスパラギン酸での置換である。Ｈ２６８Ｄとは、ヒトＩｇγ１定常領域におけるＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従うアミノ酸２６８位のヒスチジンのアスパラギン酸での置換である。Ｌ３２８Ｗとは、ヒトＩｇγ１定常領域におけるＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従うアミノ酸３２８位のロイシンのトリプトファンでの置換である。Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域としては、例えば、配列番号２のアミノ酸番号１２０から４４９までのアミノ酸配列からなるヒトＩｇγ１定常領域が挙げられる。
本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の軽鎖定常領域としては、Ｉｇλ又はＩｇκのいずれの定常領域も選択可能であり得るが、ヒトＩｇκ定常領域が好ましい。ヒトＩｇκ定常領域としては、例えば、配列番号４のアミノ酸番号１１３から２１８までのアミノ酸配列からなるヒトＩｇκ定常領域が挙げられる。
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体は、以下のｉ）〜ｉｉｉ）のいずれかから選択される抗ヒトＩｇβ抗体である：
ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体；
ｉｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体；並びに
ｉｉｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
抗体を細胞内で発現させる場合、抗体が翻訳後に修飾を受けることが知られている。翻訳後修飾の例としては、重鎖Ｃ末端のリジンのカルボキシペプチダーゼによる切断、重鎖及び軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾、グリコシル化、酸化、脱アミド化、糖化等が挙げられ、種々の抗体において、このような翻訳後修飾が生じることが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．９７，ｐ．２４２６−２４４７，２００８）。
本発明の抗ヒトＩｇβ抗体には、翻訳後修飾を受けた抗ヒトＩｇβ抗体も含まれる。翻訳後修飾を受けた本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の例としては、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失を受けた抗ヒトＩｇβ抗体が挙げられる。このようなＮ末端のピログルタミル化又はＣ末端リジン欠失による翻訳後修飾が抗体の活性に影響を及ぼすものではないことは当該分野で知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３４８，ｐ．２４−３９，２００６）。
例えば、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体には、以下の１）〜３）に記載の抗ヒトＩｇβ抗体も含まれる：
１）アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾され及び／又はアミノ酸番号４４９のリジンを欠く配列番号２のアミノ酸配列からなる重鎖、並びに配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
２）アミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾され及び／又はアミノ酸番号４４９のリジンを欠く配列番号６のアミノ酸配列からなる重鎖、並びに配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
３）アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾され及び／又はアミノ酸番号４４９のリジンを欠く配列番号１０のアミノ酸配列からなる重鎖、並びに配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体は、以下のｉ）〜ｉｉｉ）のいずれかから選択される抗ヒトＩｇβ抗体である：
ｉ）配列番号２のアミノ酸番号１から４４８までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
ｉｉ）アミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号６のアミノ酸番号１から４４８までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体；並びに
ｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸番号１から４４８までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
当業者であれば、本発明に基づいて、抗体と他のペプチドや蛋白質との融合体を作製することや、修飾剤を結合させた修飾体を作製することも可能であり、これらの形態の抗体も本発明の抗体に含まれる。融合に用いられる他のペプチドや蛋白質は、抗体の結合活性を低下させないものである限り特に限定されず、例えば、ヒト血清アルブミン、各種タグペプチド、人工ヘリックスモチーフペプチド、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、各種毒素、その他多量体化を促進しうるペプチド又は蛋白質等が挙げられる。修飾に用いられる修飾剤は、抗体の結合活性を低下させないものである限り特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、糖鎖、リン脂質、リポソーム、低分子化合物等が挙げられる。
本明細書における「抗ヒトＩｇβ抗体」とは、ヒトＩｇβに結合する抗体を意味する。ヒトＩｇβに結合するか否かは、公知の結合活性測定方法を用いて確認することができる。結合活性を測定する方法としては、例えば、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）等の方法が挙げられる。ＥＬＩＳＡを用いる場合は、例えば、ヒトＩｇβ−Ｆｌａｇ蛋白質（例えば、配列番号１３の塩基配列にコードされる）をＥＬＩＳＡプレートに固相化し、これに対して被験抗体を添加して反応させた後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素で標識した抗ＩｇＧ抗体等の二次抗体を反応させる。反応後、洗浄した後、その活性を検出する試薬（例えば、ＨＲＰ標識の場合、ＢＭ−Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰＯＤ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社））等を用いた活性測定により、二次抗体の結合を同定することで、被験抗体がヒトＩｇβに結合するか否かを確認することができる。具体的な評価方法としては、後記実施例４に記載されるような方法を用いることができる。
本発明の抗ヒトＩｇβ抗体には、ヒトＩｇβに結合する抗体であれば、ヒトＩｇβへの結合に加え、他の動物由来のＩｇβ（例えば、サルＩｇβ）にも結合する抗体も含まれる。
本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の活性を評価する方法として、ヒトＢ細胞に対する結合活性や、ＢＣＲ刺激によるヒトＢ細胞の活性化を阻害する活性を評価してもよい。このような活性の評価方法としては、後記実施例５及び６に記載されるような方法を用いることができる。好ましくは、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体は、ヒトＩｇβに結合し、ＢＣＲ刺激によるヒトＢ細胞の活性化を阻害する活性を有する。
本発明の抗ヒトＩｇβ抗体は、本明細書に開示される、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。本発明の抗ヒトＩｇβ抗体は、特に限定されるものではないが、例えば、後述の＜本発明の抗ヒトＩｇβ抗体を生産する方法及び該方法により生産された抗ヒトＩｇβ抗体＞に記載の方法に従い製造することができる。
本発明の抗ヒトＩｇβ抗体は、必要によりさらに精製された後、定法に従って製剤化され、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、バセドウ病、視神経脊髄炎、自己免疫性溶血性貧血、天疱瘡、抗リン脂質抗体症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、シェーグレン症候群、橋本病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎及び慢性疲労症候群等の自己免疫疾患の予防又は治療に用いることができる。
＜本発明のポリヌクレオチド＞
本発明のポリヌクレオチドには、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１又は１５に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号５に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号９に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号７に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドは、その塩基配列に基づき、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、ＷＯ９０／０７８６１に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。
＜本発明の発現ベクター＞
本発明の発現ベクターには、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターが含まれる。
本発明のポリヌクレオチドを発現させるために用いる発現ベクターとしては、真核細胞（例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母）及び／又は原核細胞（例えば、大腸菌）の各種の宿主細胞中で本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び／又は本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現し、これらによりコードされるポリペプチドを産生できるものである限り、特に制限されるものではない。このような発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等が挙げられ、好ましくは、ｐＥＥ６．４やｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）を使用することができる。
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。動物細胞で本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０などのウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。細菌（例えば、エシェリキア属菌）で本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。酵母で本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが挙げられる。
宿主細胞として、動物細胞、昆虫細胞又は酵母を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン及び終止コドンを含み得る。この場合、エンハンサー配列、本発明の抗体又はその重鎖若しくは軽鎖をコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、或いは複製可能単位などを含んでいてもよい。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域、及び複製可能単位を含み得る。本発明の発現ベクターは、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。
＜本発明の形質転換された宿主細胞＞
本発明の形質転換された宿主細胞には、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
（ａ）本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
好ましい本発明の形質転換された宿主細胞としては、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞が挙げられる。
形質転換する宿主細胞としては、使用する発現ベクターに適合し、該発現ベクターで形質転換されて、抗体を発現することができるものである限り、特に限定されるものではない。形質転換する宿主細胞としては、例えば、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞又は人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、細菌（エシェリキア属菌など）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）など）が挙げられ、好ましくは、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、２９３細胞、ＮＳ０細胞等の培養細胞を使用することができる。
宿主細胞を形質転換する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等を用いることができる。
＜本発明の抗ヒトＩｇβ抗体を生産する方法及び該方法により生産された抗ヒトＩｇβ抗体＞
本発明の抗ヒトＩｇβ抗体を生産する方法には、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＩｇβ抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＩｇβ抗体を生産する方法が含まれる。
（ａ）本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
本発明の抗ヒトＩｇβ抗体を生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＩｇβ抗体を発現させる工程を包含している限り、特に限定されるものではない。該方法で使用される好ましい宿主細胞としては、前述の好ましい本発明の形質転換された宿主細胞が挙げられる。
形質転換された宿主細胞の培養は公知の方法により行うことができる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ及び培養時間は、適宜選択される。宿主細胞が動物細胞の場合、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１３０，ｐ．４３２−４３７，１９５９）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，ｐ．３９６，１９５９）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１９９，ｐ．５１９，１９６７）、１９９培地（Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．７３，ｐ．１−８，１９５０）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行われる。宿主細胞が昆虫細胞の場合、培地としては、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８２，ｐ．８４０４，１９８５）等を用いることができる。培地のｐＨは約５〜８であるのが好ましく、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０〜４０℃で約１５〜１００時間行われる。宿主細胞が大腸菌又は酵母である場合、培地としては、例えば、栄養源を含有する液体培地が適当である。栄養培地は、形質転換された宿主細胞の生育に必要な炭素源、無機窒素源、又は有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖等が、無機窒素源又は有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液等が挙げられる。所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類）、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン）等を含んでいてもよい。培地のｐＨは約５〜８であるのが好ましい。宿主細胞が大腸菌の場合、好ましい培地としては、例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｏｌ．Ｃｌｏ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｖｏｌ．３，Ａ２．２）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約１４〜４３℃で約３〜２４時間行われる。宿主細胞が酵母の場合、培地としては、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．４５０５，１９８０）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行われる。上述のような培養により、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体を発現させることができる。
本発明の抗ヒトＩｇβ抗体を生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＩｇβ抗体を発現させる工程に加えて、さらには、該形質転換された宿主細胞から抗ヒトＩｇβ抗体を回収、好ましくは単離又は精製する工程を含むことができる。単離又は精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。好ましくは、培養上清中に蓄積された抗体は、各種クロマトグラフィー、例えば、プロテインＡカラム又はプロテインＧカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製することができる。
本発明の抗ヒトＩｇβ抗体には、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体を生産する方法で生産された抗ヒトＩｇβ抗体も含まれる。
＜本発明の医薬組成物＞
本発明の医薬組成物には、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。
本発明の医薬組成物は、複数種の本発明の抗ヒトＩｇβ抗体を含み得る。例えば、翻訳後修飾を受けていない抗体及び翻訳後修飾により生じた抗体を含有する医薬組成物も本発明に含まれる。
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、以下の（１）〜（３）からなる群より選択される抗ヒトＩｇβ抗体、及び、該抗ヒトＩｇβ抗体の翻訳後修飾により生じた抗ヒトＩｇβ抗体を含有する。
（１）配列番号６のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号８のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、抗ヒトＩｇβ抗体；
（２）配列番号２のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、抗ヒトＩｇβ抗体；並びに
（３）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１２のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
本発明の医薬組成物には、重鎖Ｃ末端リジンの欠失抗体、Ｎ末端翻訳後修飾を受けた抗体、重鎖Ｃ末端リジンを欠失しＮ末端翻訳後修飾を受けた抗体、及び／又は重鎖Ｃ末端リジンを有しＮ末端翻訳後修飾を受けていない抗体を含有する医薬組成物も含まれる。
１つの実施形態において、抗ヒトＩｇβ抗体を含有する本発明の医薬組成物には、以下の（１）〜（４）のうち２種以上の抗ヒトＩｇβ抗体を含有する医薬組成物も含まれる。
（１）配列番号２のアミノ酸番号１から４４８までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
（２）アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された配列番号２のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
（３）アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された配列番号２のアミノ酸番号１から４４８までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
（４）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
１つの実施形態において、抗ヒトＩｇβ抗体を含有する本発明の医薬組成物には、以下の（１）〜（４）のうち２種以上の抗ヒトＩｇβ抗体を含有する医薬組成物も含まれる。
（１）配列番号６のアミノ酸番号１から４４８までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
（２）アミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号６のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
（３）アミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号６のアミノ酸番号１から４４８までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
（４）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
１つの実施形態において、抗ヒトＩｇβ抗体を含有する本発明の医薬組成物には、以下の（１）〜（４）のうち２種以上の抗ヒトＩｇβ抗体を含有する医薬組成物も含まれる。
（１）配列番号１０のアミノ酸番号１から４４８までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
（２）アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された配列番号１０のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
（３）アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された配列番号１０のアミノ酸番号１から４４８までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
（４）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
さらに１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、以下に記載の医薬組成物である：
配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＩｇβ抗体、アミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号６のアミノ酸番号１から４４８までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＩｇβ抗体、並びに、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
製剤化における本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、或いは抗体の結合力価等により異なるが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いることができる。
本発明の医薬組成物は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、バセドウ病、視神経脊髄炎、自己免疫性溶血性貧血、天疱瘡、抗リン脂質抗体症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、シェーグレン症候群、橋本病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎及び慢性疲労症候群等の自己免疫疾患の治療剤として用いることができる。
本発明には、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体を含む、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ又は突発性血小板減少性紫斑病の予防又は治療用医薬組成物が含まれる。また、本発明には、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の治療有効量を投与する工程を包含する、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ又は突発性血小板減少性紫斑病を治療又は予防する方法が含まれる。また、本発明には、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ又は突発性血小板減少性紫斑病の予防又は治療に使用するための、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体が含まれる。また、本発明には、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ又は突発性血小板減少性紫斑病の予防又は治療用医薬組成物の製造における、本発明の抗ヒトＩｇβ抗体の使用が含まれる。
本発明についてさらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
市販のキット又は試薬等を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。
（実施例１：ヒト及びサルＩｇβ−Ｆｌａｇ蛋白質の取得）
ヒトＩｇβにＦｌａｇタグを結合させた蛋白質（ヒトＩｇβ−Ｆｌａｇ蛋白質）及びサルＩｇβにＦｌａｇタグを結合させた蛋白質（サルＩｇβ−Ｆｌａｇ蛋白質）を取得した。ヒトＩｇβ−Ｆｌａｇ遺伝子（配列番号１３）をＧＳベクターｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）に組み換えた。サルＩｇβ−Ｆｌａｇ遺伝子（配列番号１４）をＧＳベクターｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）に組み換えた。作製した各ベクターを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）へ遺伝子導入した。各細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた無血清培養系で１週間培養後、ヒトＩｇβ−Ｆｌａｇ蛋白質又はサルＩｇβ−Ｆｌａｇ蛋白質を含む培養上清をそれぞれ取得した。取得した培養上清から抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体アフィニティーゲル（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）を用いて蛋白質を精製し、以下の実験に使用した。
（実施例２：抗ヒトＩｇβ抗体の取得）
抗ヒトＩｇβ抗体を取得するため、Ｃ３Ｈ/ＨｅＪＪｍｓＳｌｃ−ｌｐｒ/ｌｐｒマウス（日本エスエルシー）に、免疫反応を惹起するアジュバントと共に、実施例１で取得したヒトＩｇβ−Ｆｌａｇ蛋白質及びサルＩｇβ−Ｆｌａｇ蛋白質を免疫した。マウスを数回免疫し、最終免疫を行った。定法に従い、免疫したマウスの脾臓やリンパ節を摘出しリンパ球を収集し、これをマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１）と細胞融合することでハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの限界希釈サンプルを作製し、モノクローン化を行った。各クローンについて、拡大培養を行った後に無血清培地であるＨｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に培地を変更し、３〜５日間培養した。得られた培養上清から抗体精製キットＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｒｏｔｅｕｓ社）を用いて抗体を精製した。
各クローンから得られた抗体について、ヒト及びサルＩｇβ−Ｆｌａｇ蛋白質に対する結合活性、並びにヒト及びサルＢ細胞に対する結合活性を評価した。その結果、ＣＬ６＿４０と命名した抗体が、ヒト及びサルＩｇβ−Ｆｌａｇ蛋白質の両方に結合し、ヒト及びサルＢ細胞の両方に対する高い結合活性を有することが見い出された。ＣＬ６＿４０について、ハイブリドーマから抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子をクローニングし、配列決定を行った。
（実施例３：ヒト化抗体の作製）
ＣＬ６＿４０の軽鎖及び重鎖のＣＤＲを他のヒト抗体へ移植して、複数のヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子を作製した。ＧＳベクター（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）を用いて、各ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の両遺伝子を含む発現ベクターを構築した。具体的には、各ヒト化抗体の重鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列（Ｎ．Ｗｈｉｔｔｌｅら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ．１，ｐ．４９９−５０５，１９８７）をコードする遺伝子を、そして３’側にＳ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１の定常領域遺伝子（配列番号１の塩基番号３５８から１３５０までの塩基配列からなる）をそれぞれ繋げ、この重鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ６．４に挿入した。また、これらの各ヒト化抗体の軽鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列（Ｎ．Ｗｈｉｔｔｌｅら、前出）をコードする遺伝子を、そして３’側にヒトκ鎖の定常領域遺伝子（配列番号３の塩基番号３３７から６５７までの塩基配列からなる）をそれぞれ繋げ、この軽鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ１２．４に挿入した。
作製したヒト化抗体ＣＬ６＿４０ｍ１２＿ＤＤＷの重鎖の塩基配列を配列番号１及び配列番号１５に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に、該抗体の軽鎖の塩基配列を配列番号３に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。配列番号２に示される重鎖の可変領域は、配列番号２のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなり、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２のアミノ酸番号３１から３５、５０から６５、９８から１０８までのアミノ酸配列からなる。配列番号４に示される軽鎖の可変領域は、配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなり、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４のアミノ酸番号２４から３８、５４から６０、９３から１０１までのアミノ酸配列からなる。
作製したヒト化抗体ＣＬ６＿４０ｍ１４＿ＤＤＷの重鎖の塩基配列を配列番号５に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号６に、該抗体の軽鎖の塩基配列を配列番号７に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号８にそれぞれ示す。配列番号６に示される重鎖の可変領域は、配列番号６のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなり、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６のアミノ酸番号３１から３５、５０から６５、９８から１０８までのアミノ酸配列からなる。配列番号８に示される軽鎖の可変領域は、配列番号８のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなり、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号８のアミノ酸番号２４から３８、５４から６０、９３から１０１までのアミノ酸配列からなる。
作製したヒト化抗体ＣＬ６＿４０ｍ１６＿ＤＤＷの重鎖の塩基配列を配列番号９に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１０に、該抗体の軽鎖の塩基配列を配列番号１１に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１２にそれぞれ示す。配列番号１０に示される重鎖の可変領域は、配列番号１０のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなり、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５、５０から６５、９８から１０８までのアミノ酸配列からなる。配列番号１２に示される軽鎖の可変領域は、配列番号１２のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなり、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１２のアミノ酸番号２４から３８、５４から６０、９３から１０１までのアミノ酸配列からなる。
配列番号６及び１０に示される各重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、配列番号２に示される重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同じであり、配列番号８及び１２に示される各軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、配列番号４に示される軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と同じである。
各ヒト化抗体を作製するため、各抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子がそれぞれ挿入された前述のＧＳベクターをＮｏｔＩとＰｖｕＩで制限酵素切断し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ＮＩＰＰＯＮＧＥＮＥ社）を用いてライゲーションを行い、重鎖と軽鎖の両遺伝子が挿入されたＤｏｕｂｌｅ−Ｇｅｎｅベクターを構築した。Ｅｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で約３００万個／ｍＬに培養されたＥｘｐｉ２９３細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に対し、Ｄｏｕｂｌｅ−ＧｅｎｅベクターをＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてトランスフェクトし、５日間培養した。その培養上清からプロテインＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｊａｐａｎ社）を用いて、各ヒト化抗体の精製抗体を得た。恒常的発現については、前述のＤｏｕｂｌｅ−ＧｅｎｅベクターをＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）へトランスフェクションすることにより抗体を発現させた。その培養上清からＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｊａｐａｎ社）を用いて、各ヒト化抗体の精製抗体を得た。精製した各ヒト化抗体のアミノ酸修飾を分析した結果、精製抗体の大部分において、ＣＬ６＿４０ｍ１２＿ＤＤＷでは、重鎖Ｃ末端のリジンの欠失が、ＣＬ６＿４０ｍ１４＿ＤＤＷでは、重鎖Ｎ末端のピログルタミン変換及び重鎖Ｃ末端のリジン欠失が、ＣＬ６＿４０ｍ１６＿ＤＤＷでは、重鎖Ｃ末端のリジン欠失が、それぞれ生じていた。
（実施例４：抗原に対するＥＬＩＳＡアッセイ）
ヒト化抗体の抗原結合活性を測定するために、抗原ＥＬＩＳＡを使用した。実施例１で取得したヒトＩｇβ−Ｆｌａｇ蛋白質を、５０００ｎｇ／ｍＬの濃度になるようにトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ；Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）で調製し、ヌンクマキシソープ白色３８４プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ ３８４ ｐｌａｔｅ；Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり１５μＬ添加して室温で１時間固相化した。ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ；Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）で２回洗浄後、ブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ；ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社）を１２０μＬ添加し、室温にて１時間静置した後、その溶液を除去した。ブロッキング剤とＴＢＳを等量ずつ加えた希釈溶液を使って、実施例３で取得した各ヒト化抗体の希釈系列（最終濃度が０．４６ｎｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬの８段階）を作製し、１５μＬ添加した。室温にて１時間静置した後、ＴＢＳ−Ｔ洗浄液にて３回洗浄し、希釈溶液で３０００倍に希釈したホースラディッシュぺルオキシダーゼ標識ラビット抗ヒトＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社）を２０μＬ添加した。室温にて１時間静置した後、ＴＢＳ−Ｔ洗浄液で３回洗浄した。化学発光検出試薬であるＢＭ−Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰＯＤ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を３０μＬ加えて、その化学発光量をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定した。同様の方法で、実施例１で取得したサルＩｇβ−Ｆｌａｇ蛋白質を用いた抗原ＥＬＩＳＡアッセイも実施した。被験抗体の各濃度における結合活性を算出するにあたり、被験抗体非添加のウェルの測定値を０％とし、被験抗体の最大活性の収束値を１００％と設定した。算出された結合活性を解析し、曲線当てはめにより被験抗体のＥＣ５０値を算出した。
その結果、ＣＬ６＿４０ｍ１２＿ＤＤＷのヒト及びサルＩｇβ−Ｆｌａｇ蛋白質に対するＥＣ５０値は、それぞれ１２８ｎｇ／ｍＬ及び１８３ｎｇ／ｍＬであった。ＣＬ６＿４０ｍ１４＿ＤＤＷのヒト及びサルＩｇβ−Ｆｌａｇ蛋白質に対するＥＣ５０値は、それぞれ１００ｎｇ／ｍＬ及び１０６ｎｇ／ｍＬであった。ＣＬ６＿４０ｍ１６＿ＤＤＷのヒト及びサルＩｇβ−Ｆｌａｇ蛋白質に対するＥＣ５０値は、それぞれ１３２ｎｇ／ｍＬ及び１１８ｎｇ／ｍＬであった。各ヒト化抗体はいずれも、ヒト及びサルＩｇβ−Ｆｌａｇ蛋白質の両方に対する高い結合活性を有することが確認できた。
（実施例５：ヒト及びサルＰＢＭＣに対するＦＡＣＳ解析）
ヒト及びサルＢ細胞に対するヒト化抗体の結合活性を評価するために、ヒト及びサルＰＢＭＣを用いて、それらのＰＢＭＣ中に含まれるＢ細胞を対象として、Ｂ細胞マーカーであるＣＤ２０を指標にＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）解析を行った。サルＰＢＭＣは、サル血液を等量のＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）にて希釈後、等量のＦｉｃｏｌｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｊａｐａｎ社）の上に積層し、室温、１５００ｒｐｍ、３０分間遠心処理することによって調製した。ヒトＰＢＭＣ（ＡｌｌＣｅｌｌｓ社）又はサルＰＢＭＣを、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社）に１ウェルあたり２０万個で、３０μＬのＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に懸濁して播種した。Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒを使って、実施例３で取得した各ヒト化抗体の希釈系列（最終濃度が０．０３μｇ／ｍＬから３０μｇ／ｍＬの４段階）を作製し、３０μＬ添加した。氷上で３０分間静置した後、Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒにて３回洗浄し、Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで２００倍希釈したフィコエリトリン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγフラグメント（ＪＡＣＫＳＯＮ社）と８倍希釈したアロフィコシアニン標識マウス抗ＣＤ２０抗体（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を含む溶液を４０μＬ添加した。氷上で３０分間静置した後、Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒにて２回洗浄後、ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）にて蛍光強度を測定し、平均蛍光強度（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ；ＭＦＩ）を算出した。解析にはＦｌｏｗＪｏ（ＴＯＭＹ ＤＩＧＩＴＡＬ ＢＩＯＬＯＧＹ社）を使用した。
その結果、各ヒト化抗体はいずれも、ヒト及びサルＢ細胞の両方に対する高い結合活性を有することが確認できた。
（実施例６：ヒトＢ細胞における抗ＩｇＭ抗体誘発細胞増殖活性評価）
ＢＣＲ刺激によるヒトＢ細胞の活性化に対するヒト化抗体の阻害効果を評価するために、ヒトＢ細胞における抗ＩｇＭ抗体誘発細胞増殖活性を評価した。抗ＩｇＭ抗体は、ＢＣＲを凝集させることで、Ｂ細胞の活性化をもたらす。ＢＣＲ及びＦｃγＲＩＩｂの双方に結合する抗体は、ＢＣＲにＦｃγＲＩＩｂを動員し、それによってＢ細胞の増殖を阻害することができる。本実施例では、比較抗体として、ａｎｔｉ−ＣＤ１９ Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（特許文献２）を用いた。コントロール抗体として、生体内に存在しない抗原であるＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に対するヒトＩｇＧ１抗体（ａｎｔｉ−ＫＬＨ Ａｂ）を用いた（国際公開第２０１３／０９４７２３号）。ヒトＢ細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ社）を、９６ウェルプレート（Ｉｗａｋｉ社）に１ウェルあたり約３万個で、６０μＬのＲＰＭＩ培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）で播種した。ＲＰＭＩ培地を使って、実施例３で取得した各ヒト化抗体、ａｎｔｉ−ＣＤ１９ Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、又はａｎｔｉ−ＫＬＨ Ａｂの希釈系列（最終濃度が０．３μｇ／ｍＬから３０μｇ／ｍＬの３段階）を作製し２０μＬ添加した。ＲＰＭＩ培地で最終濃度が５μｇ／ｍＬになるように調製した抗ＩｇＭ抗体（ＪＡＣＫＳＯＮ社）を２０μＬ添加し、４日間ＣＯ2インキュベータにてインキュベートした。その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、細胞増殖解析を行った。また、本実施例において、陰性対照として被験抗体非添加／抗ＩｇＭ抗体非添加群、陽性対照として被験抗体非添加／抗ＩｇＭ抗体添加群を調製して試験した。各被験抗体について、デュプリケートで試験を行った。
ヒトＢ細胞の増殖率の結果を図１に示す。被験抗体非添加／抗ＩｇＭ抗体非添加群を陰性対照（増殖率０％）、被験抗体非添加／抗ＩｇＭ抗体添加群を陽性対照（増殖率１００％）として、被験抗体投与群の増殖率を算出した。当該増殖率の値が小さいほど被験抗体のＢＣＲに対する抑制活性が強いことを意味する。
図１に示すように、ａｎｔｉ−ＣＤ１９ Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆの３０μｇ／ｍＬにおける増殖率は、５２．３％であるのに対して、ＣＬ６＿４０ｍ１２＿ＤＤＷ、ＣＬ６＿４０ｍ１４＿ＤＤＷ及びＣＬ６＿４０ｍ１６＿ＤＤＷの３０μｇ／ｍＬにおける増殖率は、それぞれ２．８％、２０．２％及び２３．２％であった。したがって、前述のヒト化抗体はいずれも、ａｎｔｉ−ＣＤ１９ Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆと比較して、ヒトＢ細胞における抗ＩｇＭ抗体誘発細胞増殖に対して強い阻害活性を有していることが明らかとなった。
（実施例７：ヒトＰＢＭＣ移入ＮＯＧマウスモデルにおける薬効評価）
ヒト化抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗体産生に対する有効性を確認する目的として、ヒトＰＢＭＣをＮＯＧマウスに移入することによって惹起されるヒト抗体価の上昇に対する各種抗体の治療投与における作用を評価した。本モデルでは、異物（マウス）認識により激しく活性化されたヒトＢ細胞が、マウス体内でプラズマ（ブラスト）細胞まで分化すると考えられ、ヒトＢ系列細胞の活性化に対する被験薬の薬理作用を評価するには適したモデルであると考えられる。
ヒトＰＢＭＣ（ＡｌｌＣｅｌｌｓ社）をＰＢＳ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）にて１０００万個／ｍＬに縣濁し、１１週齢の雄性ＮＯＧマウス（インビボサイエンス社）に０．２５ｍＬ（２５０万個）を尾静脈内投与した。Ｄａｙ３４（ＰＢＭＣ移入後３４日）に体重測定及び採血を実施した。血漿中ヒトＩｇＭ及びＩｇＥ抗体価をＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）にて測定した。血漿中ヒトＩｇＭ、ＩｇＥ抗体価及び体重のデータをもとに群分けを実施した。
本実施例では、比較抗体として、ａｎｔｉ−ＣＤ１９ Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆを用いた。コントロール抗体として、ａｎｔｉ−ＫＬＨ Ａｂを用いた。Ｄａｙ３５及び４２に被験抗体を１０ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇでマウスに皮下投与した。Ｄａｙ４２及びＤａｙ４９に採血を実施し、血漿中ヒトＩｇＭ及びＩｇＥ抗体価をＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）にて測定した。実験は４−５匹／群で実施した。実験結果は平均値±標準誤差で示した。ａｎｔｉ−ＫＬＨ Ａｂ群と各種被験抗体群との有意差検定は対応のないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用い、ｐ値が０．０５未満の場合に統計的有意とみなした。以上の検定はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン ５．０４）を用いて行った。
血漿中ヒトＩｇＭ抗体価に対する被験抗体の作用を図２に示す。ａｎｔｉ−ＫＬＨ Ａｂと比較して、ＣＬ６＿４０ｍ１２＿ＤＤＷ及びＣＬ６＿４０ｍ１４＿ＤＤＷは、血漿中ヒトＩｇＭ抗体価を有意に低下させた。血漿中ヒトＩｇＭ抗体価に対するＣＬ６＿４０ｍ１２＿ＤＤＷ及びＣＬ６＿４０ｍ１４＿ＤＤＷの低下作用の発現は非常に早く、投与開始後１週（Ｄａｙ４２）から認められた。一方、ａｎｔｉ−ＣＤ１９ Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆは、投与開始後２週（Ｄａｙ４９）においてのみ血漿中ヒトＩｇＭ抗体価に対する有意な低下作用を示した。
次に、血漿中ヒトＩｇＥ抗体価に対する被験抗体の作用を図３に示す。ａｎｔｉ−ＫＬＨ Ａｂと比較して、ＣＬ６＿４０ｍ１２＿ＤＤＷ及びＣＬ６＿４０ｍ１４＿ＤＤＷは、血漿中ヒトＩｇＥ抗体価を急速かつ有意に低下させた。一方、ａｎｔｉ−ＣＤ１９ Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆは、血漿中ヒトＩｇＥ抗体価を低下させなかった。
図２と図３に示すように、前述のＣＬ６＿４０ｍ１２＿ＤＤＷ及びＣＬ６＿４０ｍ１４＿ＤＤＷはいずれも、ａｎｔｉ−ＣＤ１９ Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆと比較して、ヒト抗体価の上昇に対して強い阻害活性を有していることが明らかとなった。
（実施例８：サルＴＴｘ抗原感作モデルにおける薬効評価）
サルに沈降破傷風トキソイド（ＴＴｘ）抗原を１回感作させることによりＴＴｘ抗原特異的なＩｇＧが産生される。本モデルでは、血漿中のＴＴｘ抗原特異的ＩｇＧに加えて、血漿中の総抗体価も評価ができる。したがって、本モデルは、自己免疫疾患の治療にあたり、有効性に加えて、安全性の評価も可能となる。
雄性カニクイザル（生産地：中国、３歳以上）を用い、ゾラゼパム塩酸塩２‐５ｍｇ／ｋｇ（０．０５ ｍＬ／ｋｇ；ＵＳＰ社）及びチレタミン塩酸塩２．５‐５ｍｇ／ｋｇ（０．２５ｍＬ／ｋｇ；ＵＳＰ社）の混合麻酔下にてＴＴｘを感作した（感作日をＤaｙ０とする）。ＴＴｘの感作は破傷風トキソイド（ＴＴｘ、１０ Ｌｆ／ｍＬ、デンカ生研社）を大腿部筋肉内に０．６ｍＬ／サル、背部の皮内に０．６ｍＬ／サル（１２箇所に各５０μＬ）注入することにより行った。処置群として、Ｖｅｈｉｃｌｅ群（溶媒（２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液／１２０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）；ＫＯＨＪＩＮ ＢＩＯ社）、１ｍＬ／ｋｇ、ｎ＝３）及び抗体投与群（１０ｍｇ／１ｍＬ／ｋｇ、ヒト化抗体ＣＬ６＿４０ｍ１４＿ＤＤＷ（溶媒で希釈）、ｎ＝３）を用いた。投与のタイミングはＴＴｘ感作１４日後とし、覚醒下において静脈より１ｍＬ／ｋｇの投与容量にて行った。
上記カニクイザルにＣＬ６＿４０ｍ１４＿ＤＤＷを投与してから４時間後、７２時間後、１６８時間後及び３３６時間後と経時的に採血し、遠心後、血漿を回収した。血漿中薬物濃度はＧｙｒｏｌａｂTM ｘＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｇｙｒｏｓ ＡＢ社）を用いて測定した。Ｍｅｔｈｏｄ及びディスクは２００−３Ｗ−００１−Ａ及びＢｉｏａｆｆｙ ２００ ｃｏｍｐａｃｔ ｄｉｓｃｓ（Ｇｙｒｏｓ ＡＢ社）を使用した。また、固相化抗原と検出抗体にはｂｉｏｔｉｎラベル化したＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＣＤ７９Ｂ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ社）及びａｌｅｘａラベル化したＧｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社）を使用した。表１に示すように、ＣＬ６＿４０ｍ１４＿ＤＤＷの血漿中薬物濃度は、本モデルの評価期間中、維持していた。
表１：サルにおけるヒト化抗Ｉｇβ抗体の血漿中薬物濃度推移
Figure 0006627761
上記カニクイザルよりＤａｙ１３（沈降破傷風トキソイドを免疫して１３日後）、Ｄａｙ１４、Ｄａｙ１７、Ｄａｙ２１及びＤａｙ２８と経時的に採血し、遠心後、血漿を回収した。回収した血漿中の抗沈降破傷風トキソイド抗体価（ａｎｔｉ―ＴＴｘ ＩｇＧ）を測定するために、抗原ＥＬＩＳＡを使用した。沈降破傷風トキソイド（デンカ生研社）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）で２０倍希釈し、ヌンクマキシソープ９６プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ ｐｌａｔｅ；Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり１００μＬ添加して４℃で一晩固相化した。ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で４回洗浄後、ブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋｅｒ Ｃａｓｅｉｎ ｉｎ ＰＢＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を２００μＬ添加し、室温にて２時間静置した後、その溶液を除去した。次に、回収した血漿及び検量線用サンプルをそれぞれ１００μＬ添加した。検量線サンプルは沈降破傷風トキソイドを免疫したカニクイザルから２１日後及び２３日後に採取した血漿を混合したものを１００Ｕ／ｍＬとして、ブロッキング剤を希釈溶液に使って調製した希釈系列（０．４８８ｍＵ／ｍＬ〜５００ｍＵ／ｍＬ）を用いた。室温にて２時間静置した後、ＰＢＳ−Ｔ洗浄液にて４回洗浄し、ブロッキング剤で３０００倍に希釈したホースラディッシュぺルオキシダーゼ標識ヤギ抗サルＩｇＧ抗体（ノルディック社）を１００μＬ添加した。室温にて１時間静置した後、ＰＢＳ−Ｔ洗浄液で４回洗浄した。その後、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＫＰＬ社）を用いて測定した。吸光度はＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（モレキュラーデバイス社）で測定した。
血漿中抗沈降破傷風トキソイド抗体価に対する被験抗体の作用を図４に示す。ＣＬ６＿４０ｍ１４＿ＤＤＷはＶｅｈｉｃｌｅ群と比較して、血漿中抗沈降破傷風トキソイド抗体価（ａｎｔｉ―ＴＴｘ ＩｇＧ）を低下させた。
上記カニクイザルより回収したＤａｙ１４、Ｄａｙ１７、Ｄａｙ２１及びＤａｙ２８の血漿中の総抗体価（ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ）は以下の方法を用いて測定した。ウサギ抗サルＩｇＭポリクローナル抗体（ＣＯＶＡＮＣＥ社）、ヤギ抗ヒトＩｇＡポリクローナル抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）でそれぞれ１００倍、５００倍、１０００倍に希釈し、ヌンクマキシソープ９６プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ ｐｌａｔｅ；Ｎｕｎｃ社）に１００μＬ添加して４℃で一晩固相化した。ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で４回洗浄後、ブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋｅｒ Ｃａｓｅｉｎ ｉｎ ＰＢＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を２００μＬ添加し、室温にて１時間静置した後、ＰＢＳ−Ｔ洗浄液にて４回洗浄した。ブロッキング剤を希釈溶液に使って、検量線用サンプル及び採取したサル血漿の希釈系列を作製し、１００μＬ添加した。検量線用サンプルには、正常カニクイザルから調製した血漿を希釈して使用した。室温にて２時間静置し、ＰＢＳ−Ｔ洗浄液にて４回洗浄した後、ホースラディッシュぺルオキシダーゼ標識抗サルＩｇＭ抗体（ＫＰＬ社）、ホースラディッシュぺルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＡ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ホースラディッシュぺルオキシダーゼ標識抗サルＩｇＧ抗体（ＫＰＬ社）をブロッキング剤でそれぞれ１０００倍、５０００倍、３０００倍に希釈し、１００μＬ添加した。室温にて２時間静置した後、ＰＢＳ−Ｔ洗浄液で４回洗浄した。その後、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＫＰＬ社）を用いて測定した。吸光度はＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（モレキュラーデバイス社）で測定した。
血漿中の総抗体価（ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ）に対する被験抗体の作用をそれぞれ図５、６及び７に示す。ＣＬ６＿４０ｍ１４＿ＤＤＷはＶｅｈｉｃｌｅ群と比較して、血漿中の総抗体価（ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ）に影響を与えなかった。
これらの結果から、ＣＬ６＿４０ｍ１４＿ＤＤＷは血漿中の総抗体価に影響を与えることなく、抗原特異的抗体を抑制することが明らかとなった。自己免疫疾患の治療にあたり、有効性に加えて、安全性でも優れたプロファイルを有していることが明らかとなった。
本発明の抗ヒトＩｇβ抗体は、自己免疫疾患の予防又は治療に有用である。また、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換された宿主細胞、及び抗体を生産する方法は、前記抗ヒトＩｇβ抗体を産生するのに有用である。
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号１及び３で示される塩基配列は、それぞれＣＬ６＿４０ｍ１２＿ＤＤＷの重鎖及び軽鎖の塩基配列であり、配列表の配列番号２及び４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び３によりコードされる重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列である。配列表の配列番号５及び７で示される塩基配列は、それぞれＣＬ６＿４０ｍ１４＿ＤＤＷの重鎖及び軽鎖の塩基配列であり、配列表の配列番号６及び８で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５及び７によりコードされる重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列である。配列表の配列番号９及び１１で示される塩基配列は、それぞれＣＬ６＿４０ｍ１６＿ＤＤＷの重鎖及び軽鎖の塩基配列であり、配列表の配列番号１０及び１２で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号９及び１１によりコードされる重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列である。配列表の配列番号１３に示される塩基配列は、ヒトＩｇβ−Ｆｌａｇ遺伝子の塩基配列であり、配列表の配列番号１４に示される塩基配列は、サルＩｇβ−Ｆｌａｇ遺伝子の塩基配列である。配列表の配列番号１５で示される塩基配列は、ＣＬ６＿４０ｍ１２＿ＤＤＷの重鎖の塩基配列である。

Claims (28)

  1. 抗ヒトＩｇβ抗体であって、配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９８から１０８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４のアミノ酸番号２４から３８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５４から６０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９３から１０１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、抗ヒトＩｇβ抗体。
  2. ヒト化抗体である、請求項１に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
  3. 以下の（１）〜（４）からなる群より選択される、請求項１に記載の抗ヒトＩｇβ抗体：
    （１）配列番号６のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号８のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、抗ヒトＩｇβ抗体；
    （２）配列番号２のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、抗ヒトＩｇβ抗体；
    （３）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１２のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、抗ヒトＩｇβ抗体；並びに
    （４）上記（１）〜（３）のいずれかの抗ヒトＩｇβ抗体の翻訳後修飾により生じた抗ヒトＩｇβ抗体。
  4. 配列番号６のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号８のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、請求項３に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
  5. 配列番号２のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、請求項３に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
  6. 配列番号１０のアミノ酸番号１から１１９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１２のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、Ｓ２３９Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、及びＬ３２８Ｗのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、請求項３に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
  7. 請求項４〜６のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の翻訳後修飾により生じた抗ヒトＩｇβ抗体。
  8. 翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失である、請求項３又は７に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
  9. ヒトＩｇκ定常領域である軽鎖定常領域を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
  10. 配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
  11. 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
  12. 配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
  13. 請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の翻訳後修飾により生じた抗ヒトＩｇβ抗体。
  14. 翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失である、請求項１３に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
  15. アミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号６のアミノ酸番号１から４４８までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１３に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
  16. 配列番号２のアミノ酸番号１から４４８までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１３に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
  17. 配列番号１０のアミノ酸番号１から４４８までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１３に記載の抗ヒトＩｇβ抗体。
  18. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
  19. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
  20. 請求項１８及び／又は１９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  21. 以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、請求項２０に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞：
    （ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
    （ｂ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
    （ｃ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
    （ｄ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
  22. 以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、請求項２０に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞：
    （ａ）請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
    （ｂ）請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
    （ｃ）請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
    （ｄ）請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
  23. 以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＩｇβ抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＩｇβ抗体を生産する方法：
    （ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
    （ｂ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
    （ｃ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
  24. 以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＩｇβ抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＩｇβ抗体を生産する方法：
    （ａ）請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
    （ｂ）請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
    （ｃ）請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
  25. 請求項２３に記載の方法で生産された抗ヒトＩｇβ抗体。
  26. 請求項２４に記載の方法で生産された抗ヒトＩｇβ抗体。
  27. 請求項１〜１７、２５及び２６のいずれか１項に記載の抗ヒトＩｇβ抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
  28. 請求項１０に記載の抗ヒトＩｇβ抗体、及び／又は、請求項１５に記載の抗ヒトＩｇβ抗体、並びに、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
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