TW201536806A - 新穎抗人類ｔｓｌｐ受體抗體 - Google Patents

新穎抗人類ｔｓｌｐ受體抗體 Download PDF

Info

Publication number
TW201536806A
TW201536806A TW103127264A TW103127264A TW201536806A TW 201536806 A TW201536806 A TW 201536806A TW 103127264 A TW103127264 A TW 103127264A TW 103127264 A TW103127264 A TW 103127264A TW 201536806 A TW201536806 A TW 201536806A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antibody
tslp receptor
human tslp
human
receptor antibody
Prior art date
Application number
TW103127264A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI635097B (zh
Inventor
Hiromu Sato
Daisuke Yamajuku
Kazunori Arai
Mako Ogino
Original Assignee
Astellas Pharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Astellas Pharma Inc filed Critical Astellas Pharma Inc
Publication of TW201536806A publication Critical patent/TW201536806A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI635097B publication Critical patent/TWI635097B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本發明係提供一種抗人類TSLP受體抗體，其係可與人類TSLP受體具特異性地結合，且以人類TSLP受體為介而阻礙人類TSLP之作用。 本發明團隊針對抗人類TSLP受體抗體進行檢討，提供含有由序列編號1之胺基酸編號1至118之胺基酸序列所構成之重鏈可變區，以及由序列編號3之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區之抗人類TSLP受體抗體。明確得知前述抗人類TSLP受體抗體，係可阻礙因TSLP所誘發之TARC mRNA之表現以及MDC蛋白質之產生，進而抑制於猴蛔蟲抗原致敏模型中的過敏反應，遂完成本發明。

Description

新穎抗人類TSLP受體抗體
本發明係有關新穎的抗人類TSLP受體抗體。
胸腺基質淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin；TSLP)係回應發炎促使的刺激所產生之來自上皮細胞之細胞激素。TSLP主要係介由活化樹突細胞以及肥大細胞來促進過敏性發炎反應。樹突細胞係表現紅血球生成素受體家族成員之一的TSLP受體與IL-7受體α鏈，TSLP係以TSLP受體及IL-7受體α鏈所形成的蛋白二聚體作為受體進行結合，活化樹突細胞。因TSLP而被活化的樹突細胞，表現胸腺和活性調節趨化素(thymus and activation regulated chemokine；TARC(CCL17))、巨嗜細胞衍生趨化素(macrophage-derived chemokine；MDC(CCL22))等發炎性的趨化素(Nat.Immunol.,2002,Vol.7,p.673-680)。已知TARC以及MDC係Th2趨化素，誘使Th2細胞至發炎部位(Int.Immunol.,1999,Vol.11,p.81-88)。另外，因TSLP而被活化的樹突細胞，會強力誘導 初始T細胞分化為Th2細胞，而該Th2細胞會產生IL-4、IL-5、IL-13以及TNFα，並引起發炎反應(Nat.Immunol.,2002,Vol.7,p.673-680)。
目前已報告該介由TSLP受體之因TSLP而活化樹突細胞之機轉，與氣喘等過敏性發炎疾病、全身性硬皮症之病狀形成有關。
與氣喘的關連，目前已有報告指出，於TSLP會於肺部特異性的表現亢進之基因轉殖小鼠模型中，伴隨肺部的Th2趨化素量與IgE量之增加，引發呼吸道的發炎反應，並發展至氣喘般病狀(Nat.Immunol.,2005,Vol.6,p.1047-1053)。另外，於TSLP受體基因剔除小鼠以及經投予抗TSLP受體抗體之氣喘病狀模型中，Th2趨化素與血液中IgE的產生被抑制的同時，確認了呼吸功能的改善效果(J.Exp.Med.,2005,Vol.202,p.829-839，以及Clin.Immunol.,2008,Vol.129,p.202-210)。另外，亦有報告指出，在氣喘患者中，與疾病的重症度有關連，在氣喘患者的呼吸道中TSLP與TARC及MDC的表現被增大(J.Immunol.,2005,Vol.174,p.8183-8190，以及J.Immunol.,2008,Vol.181,p.2790-2798)。
與全身性硬皮症的關聯，已有報告指出，全身性硬皮症患者的皮膚TSLP表現過剩(Arthritis Rheum.,2013,Vol.65,p.1335-1346)，且於使用TSLP受體基因剔除小鼠之博來黴素誘發硬皮症模型中，皮膚上局部發炎位置的IL-13以及IL-17的表現幾乎完全被抑制，病理解析中亦 發現膠原蛋白所佔比例為有意義的改善(Ann.Rheum.Dis.,2013,Vol.72,p.2018-23)。
因此，期待若可開發對於人類TSLP受體可特異性地結合，阻礙介由人類TSLP受體之人類TSLP之作用的單株抗體，可有效適用於人類TSLP以及人類TSLP受體與病狀形成有關之各種疾病之預防以及治療。
至今已研究了解之人類TSLP受體的抗體，已報告有小鼠單株抗體之13H5以及其人類抗體之hu13H5(專利文件1)、小鼠單株抗體之1D6.C9，其嵌合抗體之NV115-3B-IgG1以及NV115-3B-IgG4(專利文件2)、完全人類型抗體之NV164-1以及NV163-1(專利文件3)、倉鼠來源之人類化單株抗體之TSLPR-012_141(專利文件4)。
目前已確認13H5於TSLP刺激引起的TSLP受體安定表現的Ba/F3細胞增殖分析系中之中和活性，但尚未確認hu13H5之中和活性(專利文件1)。另外，基於專利文件2~4之記載，該等文件中記載的抗體中，已知TSLPR-012_141係其中具有最高中和活性(專利文件2~4)。正對TSLPR-012_141以各種中和活性試驗進行評價。例如於TSLP刺激引起的TSLP受體安定表現的Ba/F3細胞增殖分析系、TSLP刺激之來自人類末梢血液的樹突細胞之TARC、MDC以及IL-8產生分析系、以及TSLP刺激之來自人類末梢血液的樹突細胞與初始T細胞共同培養系中之Th2趨化素產生分析系等，已確認了TSLPR-012_141顯示有中和活性(專利文件4)。然而，為了使 用為抗體藥物，希望為能有具更高中和活性之抗體。
訂定抗體藥物的有效投予量的主要原因，可舉出抗體所具有的對於抗原的結合活性與中和活性，以及於體內存在的抗原量，由於使結合活性與中和活性提高係聯繫著降低投藥量，結果亦與患者於經濟上的負擔以及降低醫療成本相連結，可說是極為有益的改良。
因此之故，為了利用於各種疾病的預防及治療，必須取得較先前的抗人類TSLP受體抗體具有更優異活性之抗人類TSLP受體抗體。
先前技術文件 專利文件
專利文件1：國際公開第2009/100324號公報
專利文件2：國際公開第2007/112146號公報
專利文件3：國際公開第2008/155365號公報
專利文件4：國際公開第2012/007495號公報
本發明之課題係提供一種可與人類TSLP受體具特異性地結合，且以人類TSLP受體為介而阻礙人類TSLP作用之抗人類TSLP受體抗體。
本發明團隊對於製作抗人類TSLP受體抗體，累積了 相當程度的創意檢討後，提供含有由序列編號1之胺基酸編號1至118之胺基酸序列所構成之重鏈可變區，以及由序列編號3之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區之抗人類TSLP受體抗體。明確得知前述之抗人類TSLP受體抗體，係阻礙因TSLP所誘發之TARC mRNA之表現以及MDC蛋白質之產生(實施例5以及6)，進而抑制於猴蛔蟲抗原致敏模型中的過敏反應(實施例7)，完成本發明。
亦即，本發明係作為醫學上或產業上的有用的物質或方法，並包含下述之發明者。
(1)一種抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，其係包含由序列編號1之胺基酸編號1至118之胺基酸序列所構成之重鏈可變區，以及由序列編號3之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區。
(2)如(1)之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，其中前述抗體之重鏈不變區係人類Igγ1不變區。
(3)如(1)之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，其中前述抗體之輕鏈不變區係人類Igκ不變區。
(4)如(1)之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，其中前述抗體之重鏈不變區係人類Igγ1不變區，前述抗體之輕鏈不變區係人類Igκ不變區。
(5)如(1)~(4)之抗原結合片段，前述抗原結合片段係單鏈可變區片段、Fab、Fab’或F(ab’)2。
(6)如(1)之抗人類TSLP受體抗體，其係包含由 序列編號1所示胺基酸序列構成之重鏈，以及由序列編號3所示胺基酸序列構成之輕鏈。
(7)如(1)之抗人類TSLP受體抗體，其係包含由序列編號1之胺基酸編號1至447之胺基酸編號構成之重鏈，以及由序列編號3所示胺基酸序列構成之輕鏈。
(8)一種多核苷酸，其係含有編碼如(1)之抗體之重鏈可變區之鹼基序列。
(9)一種多核苷酸，其係含有編碼如(1)之抗體之輕鏈可變區之鹼基序列。
(10)一種表現載體，其係含有如(8)及/或(9)之多核苷酸。
(11)一種宿主細胞，其係選自下述(a)~(d)所成群之細胞，且經以如(10)之表現載體進行轉形作用之宿主細胞；(a)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼如(1)之抗人類TSLP受體抗體之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸，與含有編碼該抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用；(b)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼如(1)之抗人類TSLP受體抗體之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，與含有編碼該抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用；(c)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼如(1)之抗人類TSLP受體抗體之重鏈可變區之鹼基序列之多核 苷酸之表現載體，進行轉形作用；以及(d)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼如(1)之抗人類TSLP受體抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用。
(12)一種宿主細胞，其係選自下述(a)~(d)所成群之細胞，且經以如(10)之表現載體進行轉形作用之宿主細胞；(a)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼如(6)之抗人類TSLP受體抗體之重鏈之鹼基序列之多核苷酸，與含有編碼該抗體之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用；(b)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼如(6)之抗人類TSLP受體抗體之重鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，與包含含有編碼該抗體之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用；(c)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼如(6)之抗人類TSLP受體抗體之重鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用；以及(d)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼如(6)之抗人類TSLP受體抗體之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用。
(13)一種生產抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段之方法，其係包含培養如(11)之宿主細胞，使抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段表現之步驟。
(14)一種生產抗人類TSLP受體抗體之方法，其係包含培養如(12)之宿主細胞，使抗人類TSLP受體抗體表現之步驟。
(15)一種抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，其係利用如(13)之方法進行生產。
(16)一種抗人類TSLP受體抗體，其係利用如(14)之方法進行生產。
(17)一種醫藥組成物，其係包含(1)~(7)、(15)或(16)中任一項之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段以及藥學上容許之賦形劑。
(18)如(17)之醫藥組成物，其係氣喘之預防或治療用醫藥組成物。
(19)一種預防或治療氣喘之方法，其係包含以(1)~(7)、(15)或(16)中任一項之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段之治療有效量進行投藥之步驟。
(20)一種使用，其係為了氣喘之預防或治療，使用如(1)~(7)、(15)或(16)中任一項之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段。
(21)一種使用，其係於製造氣喘之預防或治療用醫藥組成物時，使用如(1)~(7)、(15)或(16)中任一項之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段。
上述(1)~(7)、(15)及(16)所記載之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段中，係包含與其他的胜 肽以及蛋白質的融合體，以及經使與修飾劑結合的修飾體。
本發明之抗人類TSLP受體抗體，係與人類TSLP受體結合，且對於以人類TSLP受體為介之人類TSLP之作用具有中和活性，可使用為氣喘等發炎性炎症疾病，與全身性硬皮症等之預防或治療劑。
〔圖1〕顯示於完全人類型T7-27的猴蛔蟲抗原致敏模型中，減少蛔蟲抗原特異性的IgE濃度之作用。縱軸係表示Vehicle群之一個體於Day 22時，使血漿中蛔蟲抗原特異性的IgE濃度為2000U/mL時，各檢體的相對的血漿中蛔蟲抗原特異性的IgE濃度。表示Vehicle群以及抗體投予群Day 1(投予懸濁於氫氧化鋁凝膠之蛔蟲抗原液之前)的IgE濃度、Vehicle群Day 22的IgE濃度、以及抗體投予群Day 22的IgE濃度。
〔圖2〕顯示於完全人類型T7-27的猴蛔蟲抗原致敏模型中，減少蛔蟲抗原特異性的皮膚反應之作用。圖係表示Day 22時，投予磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)以及100μg/mL之蛔蟲抗原溶液時之結果。縱軸係蛔蟲抗原液投予後出現皮膚反應的直徑，減去PBS投予後出現皮膚反應的直徑之值(delta cm)。
〔圖3〕顯示於抗TSLP受體抗體之小鼠氣喘模型中，抑制呼吸道反應亢進反應之作用。縱軸係使用為呼吸功能指標之PenH之值(★★p<0.01、★p<0.05、##p<0.01、#p<0.05)。
〔圖4〕顯示於抗TSLP受體抗體之小鼠氣喘模型中，抑制嗜酸性球之浸潤作用。縱軸係表示BALF細胞懸濁液中的嗜酸性球數(★★p<0.01)。
〔圖5〕顯示於抗TSLP受體抗體之小鼠氣喘模型中，阻礙TARC mRNA表現之作用。縱軸係表示TARC mRNA之表現量。
以下，詳細敘述本發明。
抗體係存在有IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE等五類(class)，抗體分子的基本構造係各類共通，由分子量為5萬~7萬的重鏈與2萬~3萬的輕鏈所構成。重鏈一般係由約含有440個胺基酸的聚胜肽鏈構成，每一類具有其特徵性的構造，對應於IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，分別稱為Igγ、Igμ、Igα、Igδ、Igε。進而，IgG存在有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等次類，分別對應的重鏈稱為Igγ1、Igγ2、Igγ3、Igγ4。輕鏈一般係由約含有220個胺基酸的聚胜肽鏈構成，已知有L型與K型此2種，分別稱為Igλ、Igκ。抗體基本構造之胜肽構成，係分別以相同的2條重鏈與2條輕鏈，以雙硫鍵結(S-S鍵結)以及非共價 鍵而結合，分子量為15萬~19萬。2種輕鏈可與任一種重鏈配成對。各抗體分子總是由相同的2條輕鏈與相同的2條重鏈構成在一起。
鏈內的S-S鍵結，於重鏈中有4個(Igμ、Igε中有5個)，輕鏈中有2個，胺基酸每100~110個殘基形成一個環(loop)，該立體構造於各環間均類似，稱為構造單位或區域(domain)。位於重鏈、輕鏈之胺基酸末端(N端)的區域，即使是來自同種動物同一類(次類)的檢體，其胺基酸序列未必相同，稱為可變區，各區域分別稱為重鏈可變區(VH)以及輕鏈可變區(VL)。可變區羧基末端(C端)的胺基酸序列，各類或次類幾乎均相同而被稱為不變區(各區域分別表示為CH1、CH2、CH3或CL)。
抗體的抗原決定部位係由VH以及VL構成，結合的特異性係由該部位之胺基酸序列決定。另一方面，與補體及各種細胞間的結合的所謂生物學活性，係反映在各類Ig(免疫球蛋白)的不變區構造上之差異。目前已知輕鏈與重鏈可變區的可變性，幾乎被局限在重鏈及輕鏈上均存在有的3個很小的超可變區，該等區域被稱為抗體互補決定區(CDR；自N端側開始分別為CDR1、CDR2、CDR3)。可變區剩下的部份被稱為骨架區(FR)，相對較為固定。
含有抗體VH以及VL的各種抗原結合片段亦具有抗原結合活性，該等具有代表性的抗原結合片段，可舉出單鏈可變區片段(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2。Fab係由輕 鏈、以及包含VH、CH1區域及部分的樞紐區(hinge region)之重鏈片段所構成，係一價的抗體片段。Fab’係由輕鏈、以及包含VH、CH1區域及部分的樞紐區之重鏈片段所構成，係一價的抗體片段，該部分的樞紐區係包含由構成重鏈間S-S鍵結之半胱胺酸殘基。F(ab’)2片段係2個Fab’片段於樞紐區中重鏈間以S-S鍵結進行結合之二價抗體片段。scFv係由以連接肽(linker)而連結的VH以及VL所構成，係一價的抗體片段。
<本發明之抗人類TSLP受體抗體>
本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，係具有下述特徵之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段。係一種含有由序列編號1之胺基酸編號1至118之胺基酸序列所構成之重鏈可變區，以及由序列編號3之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段。
本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，較佳係具有上述特徵，並進而包含重鏈不變區以及輕鏈不變區。不變區可為選自任一種次類的不變區(例如重鏈不變區為Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4之不變區，輕鏈不變區為Igλ或Igκ的不變區)，重鏈不變區以人類Igγ1不變區為佳，輕鏈不變區以人類Igκ不變區為佳。
人類Igγ1不變區可舉出例如由序列編號1之胺基酸編號119至448之胺基酸序列所構成之人類Igγ1不變 區。
人類Igκ不變區可舉出例如由序列編號3之胺基酸編號109至214之胺基酸序列所構成之人類Igκ不變區。
本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，係以包含上述重鏈可變區以及輕鏈可變區，且重鏈不變區係人類Igγ1不變區，輕鏈不變區係人類Igκ不變區之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段為更佳。
其中一實施方式中，本發明之抗原結合片段係scFv、Fab、Fab’或F(ab’)2。
相關業者可使用該領域中周知之方法，製作抗體或其抗原結合片段與其他胜肽及蛋白質之融合體，亦可製作使與修飾劑結合之修飾體。本發明之抗體或其抗原結合片段，亦包含該等融合體與修飾體型態之抗體或其抗原結合片段。例如，含有由序列編號1之胺基酸編號1至118之胺基酸序列所構成之重鏈可變區，以及由序列編號3之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，亦包含該抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段與其他胜肽及蛋白質之融合體，及使與修飾劑結合之修飾體。使用於融合之其他胜肽與蛋白質，若不會使抗體或其抗原結合片段的結合活性降低者，則無特別限制，可舉出例如人類血清白蛋白、各種標誌胜肽、人工螺旋模組(helix motif)胜肽、麥芽糖結合蛋白、麩胺基硫轉移酶、各種毒素、其他多量體等可促進作用之胜肽或蛋白質等。使用於修飾之修試劑，若 不會使抗體或其抗原結合片段的結合活性降低者，則無特別限制，可舉出例如聚乙二醇、糖鏈、磷脂質、脂質體、低分子化合物等。
於一實施方式中，本發明之抗人類TSLP受體抗體，係具有下述特徵之抗人類TSLP受體抗體。
一種抗人類TSLP受體抗體，其係含有由序列編號1之胺基酸序列所構成之重鏈，以及由序列編號3之胺基酸序列所構成之輕鏈。
使抗體於細胞中表現時，已知抗體於轉譯後會受進行修飾。轉譯後修飾之例可舉出重鏈C端的離胺酸因羧基胜肽酶而被切斷，重鏈及輕鏈N端的麩醯胺酸或麩胺酸因焦麩胺酸化而朝向焦麩胺酸之修飾等，已知各種抗體，有重鏈C端離胺酸之缺失，與重鏈N端的麩醯胺酸進行朝向焦麩胺酸之修飾(Journal of Pharmaceutical Sciences,2008,Vol.97,p.2426)。另外，於該領域中亦已得知該等轉譯後修飾並未對抗體活性造成影響(Analytical Biochemistry,2006,Vol.348,p.24-39)。
本發明之抗體係不僅具有完全長度的重鏈之抗體，亦包含C端具有離胺酸缺失之重鏈之抗體，及重鏈N端的麩醯胺酸或麩胺酸因焦麩胺酸化而朝向焦麩胺酸之修飾之抗體等，於細胞內表現時亦包含經轉譯後修飾之抗體。另外本發明之抗原結合片段中，抗原結合片段的N端的麩醯胺酸或麩胺酸因焦麩胺酸化而朝向焦麩胺酸之修飾之抗原結合片段等，於細胞內表現時亦包含經轉譯後修飾之抗原 結合片段。
例如，本發明之抗人類TSLP受體抗體，亦包含下述記載之抗人類TSLP受體抗體。
一種抗人類TSLP受體抗體，其係含有由序列編號1之胺基酸編號1的麩胺酸經焦麩胺酸修飾以及/或序列編號1之胺基酸編號448的離胺酸為缺失之胺基酸序列所構成之重鏈，以及由序列編號3之胺基酸序列所構成之輕鏈。
本發明亦包含具有下述特徵之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段。
一種抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，係包含由序列編號1之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所構成之CDR1，由序列編號1之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所構成之CDR2，以及由序列編號1之胺基酸編號99至107之胺基酸序列所構成之CDR3之重鏈可變區，以及，包含由序列編號3之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所構成之CDR1，由序列編號3之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所構成之CDR2，以及由序列編號1之胺基酸編號89至97之胺基酸序列所構成之CDR3之輕鏈可變區。
本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，係與人類TSLP受體結合。抗體或抗原結合片段是否與人類TSLP受體結合，係可使用周知的結合活性測定方法進行確認。測定結合活性之方法可舉出例如Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)及表面電漿子共振(SPR)等方法。使用ELISA時，例示之方法中係將人類TSLP受體與經使與人類Fc融合之蛋白質(人類TSLP受體-人類Fc融合蛋白質(係依據序列編號5之鹼基序列編碼而成))固定於ELISA盤中，再加入檢測抗體使其進行反應。反應後，加入經利用辣根過氧化酶(HRP)等酵素標誌之抗IgG抗體等二次抗體使其反應，洗淨後，使用檢測其活性之試藥(例如以HRP標誌時，為BM-Chemiluminescence ELISA Substrate(POD)(羅氏醫療診斷設備公司))等進行活性測定，可確認檢測抗體是否與人類TSLP受體結合。使用SPR時，例如可使用Biacore(註冊商標)2000(日本GE健康管理公司)。例示之方法係將檢測抗體固定於檢測晶片的表面，於流路中添加人類TSLP受體與經使與小鼠Fc融合之蛋白質(人類TSLP受體-小鼠Fc融合蛋白質(係依據序列編號6之鹼基序列編碼而成)。藉由分析抗體與人類TSLP受體之結合速度定數(ka)、解離速度定數(kd)以及解離定數(KD)，可確認檢測抗體是否與人類TSLP受體結合。
另外，本發明之抗體或其抗原結合片段，亦包含結合有來自其他動物的TSLP受體(例如猴TSLP受體)之抗體或其抗原結合片段，可使用同樣的方法針對該等受體測定結合活性。
本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，較佳係與人類TSLP受體結合，且具有對於人類TSLP受 體之中和活性。對人類TSLP受體之中和活性係意指藉由與人類TSLP受體結合，介由人類TSLP之對於人類TSLP受體之結合，所帶來的阻礙任何的生物活性之活性，可利用介由人類TSLP受體之1個或複數個人類TSLP的生物活性為指標而進行評價。該等中和活性可舉出例如使用人類末梢血液單核球細胞(PBMC)之阻礙TSLP誘發TARC mRNA表現活性，與阻礙TSLP誘發MDC蛋白質產生活性。活性的具體評價方法，係可使用如後述實施例5以及6記載之方法。
為了更詳細評價本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段之效果，亦可使用in vivo實驗。例如可使用後述實施例7記載之方法，使用猴蛔蟲抗原致敏模型之抗過敏反應試驗等，評價抗人類TSLP受體抗體之in vivo之藥效。
本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，以本說明書所揭示之，以本發明之抗人類TSLP受體抗體的重鏈可變區以及輕鏈可變區之序列資訊為基礎，使用相關領域中周知之方法，相關業者可簡易地進行製作。本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，並無特別限制，可依循後述之<生產本發明之抗人類TSLP受體抗體之方法>所記載之方法製造。
本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，可依據需要進而純化後，再依據常法加以製劑化，可使用於氣喘等過敏性發炎疾病與全身性硬皮症等，人類TSLP 以及人類TSLP受體與其病狀形成有關之疾病之預防或治療。
<本發明之多核苷酸>
本發明之多核苷酸中，係包含含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸，以及，含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸。
其中一個實施方式中，含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸，係包含編碼序列編號1之胺基酸編號1至118之胺基酸序列所構成之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸。
包含編碼序列編號1之胺基酸編號1至118之胺基酸序列所示之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸，可舉出例如含有序列編號2之鹼基編號1至354之鹼基序列之多核苷酸。
較佳之實施型態中，含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸，係包含編碼由序列編號1所示之胺基酸序列構成之重鏈之鹼基序列之多核苷酸。
包含編碼由序列編號1所示之胺基酸序列構成之重鏈之鹼基序列之多核苷酸，可舉出例如含有序列編號2所示之鹼基序列之多核苷酸。
其中一個實施方式中，含有編碼本發明之抗人類 TSLP受體抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸，係包含編碼序列編號3之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸。
包含編碼序列編號3之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所示之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸，可舉出例如含有序列編號4之鹼基編號1至324之鹼基序列之多核苷酸。
較佳之實施型態中，含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸，係包含編碼由序列編號3所示之胺基酸序列構成之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸。
包含編碼由序列編號3所示之胺基酸序列構成之重鏈之鹼基序列之多核苷酸，可舉出例如含有序列編號4所示之鹼基序列之多核苷酸。
本發明之多核苷酸，係可依據該鹼基序列，使用相關領域周知之方法，藉由該業者可容易地製作。例如，本發明之多核苷酸，係可利用該領域中周知之基因合成方法進行合成。該等基因合成方法，可舉出WO90/07861記載之抗體基因之合成方法等相關業者周知之各種方法。
<本發明之表現載體、本發明之經轉形作用的宿主細胞、生產本發明之抗人類TSLP受體抗體之方法、以及利用該方法所生產之抗人類TSLP受體抗體>
本發明之表現載體中，係包含含有編碼本發明之抗人 類TSLP受體抗體之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸以及/或含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體。
較佳之本發明之表現載體，可舉出含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之重鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體、含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體、或含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之重鏈之鹼基序列之多核苷酸與含有編碼該抗體之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體。
為了表現本發明之多核苷酸所使用之表現載體，可於真核細胞(例如動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母)以及/或原核細胞(例如大腸菌)之各種宿主細胞內，表現含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸，以及/或含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸，只要是能夠藉由該等細胞編碼生產的多胜肽，並無特別的限制。該等表現載體可舉出例如質體載體、病毒載體(例如腺病毒、輪狀病毒)等，較佳可使用pEE6.4與pEE12.4(Lonza公司)。另外，亦可於AG-γ1與AG-κ(例如參照WO94/20632)等預先具有人類Ig不變區基因之表現載體，導入可變區基因片段後表現抗體基因。
本發明之表現載體，可包含可與本發明之多核苷酸功能連結之啟動子。為了使本發明之多核苷酸於動物細胞中表現之啟動子，可舉出例如CMV、RSV、SV40等來自病 毒之啟動子、肌動蛋白啟動子、EF(elongation factor，延伸因子)1α啟動子、熱誘導啟動子等。為了於細菌(例如大腸屬細菌)中表現的啟動子，可舉出例如trp啟動子、lac啟動子、λPL啟動子、tac啟動子等。為了於酵母中表現的啟動子，可舉出例如GAL1啟動子、GAL10啟動子、PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子等。
本發明之經轉形作用的宿主細胞，係選自下述(a)~(d)所成群之細胞，且經以本發明之表現載體進行轉形作用之宿主細胞。
(a)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸，與含有編碼該抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用；(b)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，與含有編碼該抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用；(c)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用；以及(d)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用。
另一個實施型態中，本發明之經轉形作用的宿主細胞，係選自下述(a)~(d)所成群之細胞，且經以本發明之表現載體進行轉形作用之宿主細胞。
(a)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之重鏈之鹼基序列之多核苷酸，與含有編碼該抗體之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用；(b)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之重鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，與含有編碼該抗體之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用；(c)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之重鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用；以及(d)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用。
宿主細胞使用動物細胞、昆蟲細胞或酵母時，本發明之表現載體係包含起始密碼子以及終止密碼子。此時，本發明之表現載體，亦可含有增強子序列、編碼本發明之抗體或其重鏈可變區或輕鏈可變區之基因之5’端與3’端之非轉譯區、分泌訊息序列、剪接點、多聚腺苷酸化點、或可複製單位等。使用大腸菌作為宿主細胞時，本發明之表現載體可獲得包含起始密碼、終止密碼、端區域以及可複 製單位。此時，本發明之表現載體，因應目的亦可含有一般使用之篩選標誌(例如耐四環素類基因、耐安比西林基因、耐卡那黴素基因、耐新黴素基因、二氫葉酸還原酶基因)。
較佳之本發明之經轉形作用的宿主細胞，可舉出經以含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之重鏈之鹼基序列之多核苷酸，與含有編碼該抗體之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸的表現載體，進行轉形作用的宿主細胞，以及經以含有編碼本發明之抗人類TSLP受體抗體之重鏈之鹼基序列之多核苷酸的表現載體，與含有編碼該抗體之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸的表現載體，進行轉形作用的宿主細胞。
進行轉形作用之宿主細胞，若為適合欲使用之表現載體，且以該表現載體進行轉形作用後，可使抗體表現者，則無特別限制。例如，於本發明之技術領域中一般常使用之天然細胞或以人工方式建立之細胞等各種細胞(例如動物細胞(例如CHO-KISV細胞)、昆蟲細胞(例如Sf9)、細菌(大腸菌屬細菌等)、酵母(酵母菌屬、畢赤酵母菌屬等)等)，較佳係可使用CHO-KISV細胞、CHO-DG44細胞、293細胞、NS0細胞等培養細胞。
並未特別限制宿主細胞進行轉形作用之方法，例如可使用磷酸鈣法、電穿孔法等。
生產本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段之方法，係包含培養本發明之經轉形作用之宿主細胞， 再使抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段表現之步驟，此生產抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段之方法。
本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，亦包含以生產本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段之方法，所生產之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段。
生產本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段之方法，若為包含培養本發明之經轉形作用之宿主細胞，再使抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段表現之步驟，則無特別限制。使用於該方法中之較佳之宿主細胞，係可舉出前述之較佳之本發明之經轉形作用的宿主細胞。
經轉形作用之宿主細胞之培養係可利用周知之方法進行。可適當選擇培養條件例如溫度、培養基之pH以及培養時間。宿主細胞為動物細胞時，培養基可使用例如含有約5~20%牛胎兒血清之MEM培養基(Science,1959,Vol.130,No.3373,p.432-7)、DMEM培養基(Virology,1959,Vol.8,p.396)、RPMI1640培養基(J.Am.Med.Assoc.,1967,Vol.199,p.519)、199培養基(Exp.Biol.Med.,1950,Vol.73,p.1-8)等。培養基的pH以約6~8為佳，進行培養時可因應需要進行通氣與攪拌，一般於約30~40℃下進行約15~72小時。宿主細胞為昆蟲細胞時，培養基可使用例如含牛胎兒血清之Grace’s培養基( Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1985,Vol.82,p.8404)等。培養基的pH以約5~8為佳，進行培養時可因應需要進行通氣與攪拌，一般於約20~40℃下進行約15~100小時。宿主細胞為大腸菌或酵母時，培養基較適當可為例如含有營養源之液體培養基。營養培養基係以含有經轉形作用之宿主細胞於生長時所必須的碳源、無機氮源或有機氮源為佳。碳源可舉出例如葡萄糖、葡聚糖、可溶性澱粉、蔗糖等，無機氮源或有機氮源可舉出例如銨鹽類、硝酸鹽類、胺基酸、玉米漿、蛋白腖、酪蛋白、肉類萃取物、黃豆渣、馬鈴薯萃取液等。依據需要亦可含有其他的營養素(例如無機鹽(例如氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂)、維他命類等)、抗生素(例如四環素、新黴素、安比西林、卡那黴素等)。培養基的pH以約5~8為佳。宿主細胞為大腸菌時，較佳之培養基可使用例如LB培養基、M9培養基(Mol.Col.,Cold Spring Harbor Laboratory,Vol.3,A2.2)等。培養時可因應需要進行通氣與攪拌，一般於約14~43℃下進行約3~24小時。宿主細胞為酵母時，培養基可使用例如Burkholder最小培養基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1980,Vol.77,p.4505)等。培養時可因應需要進行通氣與攪拌，一般於約20~35℃下進行約14~144小時。藉由如上述之培養，可使本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段表現。
生產本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段之方法，除使抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段 表現之步驟外，可再進而包含自該經轉形作用之宿主細胞，回收抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，較佳為分離或純化之步驟。分離或純化方法可舉出例如鹽析、溶媒沈澱法等利用溶解度之方法、透析、極限過濾、凝膠過濾等利用分子量之差的方法、離子交換管柱層析法、氫氧基磷灰石管柱層析法等利用電荷之方法、親和性管柱層析法等利用具特異性的親和性之方法、逆相高速液體管柱層析法等利用輸水性之差的方法、等電點電泳等利用等電點之差的方法等。較佳係將培養上清液中所蓄積之抗體，利用各種管柱層析法，例如使用蛋白質A管柱或蛋白質G管柱之管柱層析法進行純化。
<本發明之醫藥組成物>
本發明之醫藥組成物中，係包含含有本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，以及醫藥上容許之賦形劑之醫藥組成物。本發明之醫藥組成物係可以相關領域中常用之賦形劑，亦即，使用藥劑用賦形劑與藥劑用担體等，利用一般使用之方法而進行調製。該等醫藥組成物之劑型之例，可舉出例如注射劑、點滴用劑等非經口劑，並可藉由靜脈內投藥、皮下投藥等進行投藥。進行製劑化時，可於藥學上許可的範圍內使用因應該等劑型之賦形劑、担體、添加劑等。
本發明之醫藥組成物係包含複數種的本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段。例如含有重鏈C端離 胺酸缺失之抗體、N端經進行轉譯後修飾之抗體或其抗原結合片段、含有重鏈C端離胺酸缺失且N端經進行轉譯後修飾之抗體、以及/或重鏈C端具有離胺酸且N端未經進行轉譯後修飾之抗體之醫藥組成物亦包含於本發明中。
例如，含有本發明之抗人類TSLP受體抗體之本發明之醫藥組成物中，亦包含含有下述(1)~(4)中2種以上之抗人類TSLP受體抗體之醫藥組成物。
(1)包含由序列編號1之胺基酸編號1至447之胺基酸序列所構成之重鏈，以及序列編號3所示之胺基酸序列所構成之輕鏈之抗人類TSLP受體抗體。
(2)包含序列編號1所示胺基酸序列構成之，胺基酸編號1之麩胺酸經以焦麩胺酸修飾後之重鏈，以及序列編號3所示之胺基酸序列所構成之輕鏈之抗人類TSLP受體抗體。
(3)包含由序列編號1之胺基酸編號1至447之胺基酸序列所構成之，胺基酸編號1之麩胺酸經以焦麩胺酸修飾後之重鏈，以及序列編號3所示之胺基酸序列所構成之輕鏈之抗人類TSLP受體抗體。
(4)包含由序列編號1之胺基酸序列所構成之重鏈，以及序列編號3所示之胺基酸序列所構成之輕鏈之抗人類TSLP受體抗體。
進行製劑化時，本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段之添加量，依患者症狀的程度與年齡、使用 製劑之劑型、或抗體結合力價等而異，例如可使用約0.001mg/kg~100mg/kg。
本發明之醫藥組成物，可適用於人類TSLP以及人類TSLP受體係與病狀形成有關之疾病，例如作為氣喘的預防或治療用醫藥組成物。
本發明係包含本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段以及藥學上許可的賦形劑，並包含氣喘的預防或治療用醫藥組成物。另外，本發明係包含將本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段之治療有效量進行投藥之步驟，並包含氣喘的預防或治療用醫藥組成物。另外，本發明係包含為了使用於氣喘的預防或治療之本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段。以及，本發明係於製造氣喘的預防或治療用醫藥組成物時，包含使用本發明之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段。
〔實施例〕
已記述本發明之全部，為了更增進理解於此提供可為參照之特定的實施例，但該等例子係以例示為目的者，並非限定本發明者。
針對使用市售試劑組或試藥等之部分，若無特別說明時，係依照附件之實驗步驟進行實驗。另外，將濃度mol/L簡單以M來表示。例如1M之氫氧化鈉水溶液係意指1mol/L之氫氧化鈉水溶液。
(實施例1：取得TSLP受體-Fc融合蛋白質)
為使用於抗體結合活性之評價，取得了使人類TSLP受體與人類Fc融合之蛋白質(人類TSLP受體-人類Fc融合蛋白質)、使人類TSLP受體與小鼠Fc融合之蛋白質(人類TSLP受體-小鼠Fc融合蛋白質)、以及使猴TSLP受體與人類Fc融合之蛋白質(猴TSLP受體-人類Fc融合蛋白質)。將人類TSLP受體-人類Fc融合基因(序列編號5)、人類TSLP受體-小鼠Fc融合基因(序列編號6)、以及猴TSLP受體-人類Fc融合基因(序列編號7)，分別以哺乳動物表現用載體之GS載體(Lonza公司)pEE12.4進行基因重組。將製作完成之載體，使用基因導入試藥之293 fectin(Life technologies公司)，對FreeStyle 293細胞(Life technologies公司)導入基因，再使用FreeStyle 293 Expression medium(Life technologies公司)之無血清培養系培養該細胞1周後，分別取得含有人類TSLP受體與人類Fc融合蛋白質、人類TSLP受體與小鼠Fc融合蛋白質或猴TSLP受體與人類Fc融合蛋白質之培養上清液。自取得之上清液使用純化蛋白質管柱蛋白質G管柱(日本GE健康管理公司)，純化各TSLP受體-Fc融合蛋白質。
(實施例2：取得TSLP變異體-Flag蛋白質)
為使用於抗體中和活性之評價，取得了使人類TSLP變異體Flag標誌結合之蛋白質(人類TSLP變異體-Flag 蛋白質)、以及使猴TSLP變異體與Flag標誌結合之蛋白質(猴TSLP變異體-Flag蛋白質)。將人類或猴TSLP變異體-Flag基因(序列編號8或9(為了防止因被furin蛋白酶切斷而喪失活性，分別編碼經於切斷部位插入變異之人類或猴野生型TSLP之胺基酸序列))分別以，GS載體pEE12.4進行基因重組。將製作完成之載體，使用基因導入試藥之293 fectin，對FreeStyle 293細胞導入基因，再使用FreeStyle 293 Expression medium之無血清培養系培養該細胞1周後，分別取得含有人類TSLP變異體-Flag蛋白質或猴TSLP變異體-Flag蛋白質之培養上清液。自取得之上清液使用抗FLAG M2抗體親和性凝膠(Sigma公司)，純化各TSLP變異體-Flag蛋白質。
(實施例3：製作完全人類型抗TSLP受體抗體)
對進行人類單株抗體開發技術「VelocImmune」(VelocImmune antibody technology：Regeneron公司(美國專利6596541號))所使用之小鼠，與誘發免疫反應之佐劑(adjuvant)一同加入人類TSLP受體-Fc(R&D公司)，以及人類TSLP受體表現Ba/F3細胞(藉由將編碼人類TSLP受體基因(序列編號10)以及人類IL-7受體α鏈基因(序列編號11)之載體，導入小鼠Ba/F3細胞(理化學研究所：RCB0805)而製作)使小鼠致敏。依據常用方法，收集經致敏之自小鼠脾臟與淋巴結取出之淋巴球，再藉由使其與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0(ATCC CRL- 1581)進行細胞融合而製作為融合瘤(hybridoma)。再對融合瘤進行單株化，使用無血清培養基之CD融合瘤培養基(Life technologies公司)進行培養。自所得之培養上清液，使用抗體純化試劑組Protein G Purification kit(Proteus公司)純化抗體。
為評價抗體的結合活性，分別使用實施例1所製作之人類TSLP受體-人類Fc融合蛋白質以及猴TSLP受體-人類Fc融合蛋白質，進行ELISA檢測。另外，為評價抗體之中和活性，將因實施例2所製作之猴TSLP變異體-Flag蛋白質之刺激，阻礙TSLP受體表現Ba/F3細胞之細胞增殖試驗，以及，將因實施例2所製作之猴TSLP變異體-Flag蛋白質之刺激，阻礙猴全血之MDC蛋白質產生試驗。
自上述試驗，經命名為T7-27之抗體(嵌合抗體)，明確得知對人類以及猴TSLP受體具有結合活性以及中和活性。自生產T7-27之融合瘤中，選殖(cloning)編碼抗體的重鏈與輕鏈之基因，並確定其序列。
前述之抗體可變區係來自人類，不變區係來自小鼠之抗體。因此，使用GS載體，構築含有重鏈以及輕鏈的兩基因之表現載體，製作完全人類型抗體。具體而言，分別連結編碼T7-27抗體的重鏈可變區基因的5’端的訊息序列(Nigel Whittle等人，Protein Engineering,1987；1(6)：499-505)的基因，以及3’端的人類Igγ1的不變區基因(由序列編號2之鹼基編號355至1344之鹼基序 列所構成)，再將該重鏈基因插入GS載體pEE6.4中。另外，分別連結編碼輕鏈可變區基因的5’端的訊息序列(Nigel Whittle等人，同前)的基因，以及3’端的人類Igκ的不變區基因(由序列編號4之鹼基編號325至642之鹼基序列所構成)，再將該輕鏈基因插入GS載體pEE12.4中。
分別將編碼所製作之T7-27完全人類型抗體(完全人類型T7-27)之重鏈之鹼基序列，揭示於序列編號2，再依據該序列編碼之胺基酸序列揭示於序列編號1，以及編碼該抗體之輕鏈之鹼基序列揭示於序列編號4，再依據該序列編碼之胺基酸序列揭示於序列編號3。完全人類型T7-27之重鏈可變區，係由序列編號1之胺基酸編號1至118之胺基酸序列所構成，重鏈的CDR1、CDR2、CDR3係分別由序列編號1之胺基酸編號31至35、50至66、99至107之胺基酸序列所構成。完全人類型T7-27之輕鏈可變區，係由序列編號3之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成，輕鏈的CDR1、CDR2、CDR3係分別由序列編號3之胺基酸編號24至34、50至56、89至97之胺基酸序列所構成。
使用經分別插入抗體的重鏈與輕鏈基因之前述GS載體，以短暫性表現以及持續性表現此2種方法進行抗體表現。有關短暫性表現，係對經以FreeStyle 293 Expression medium之約100萬個/mL的FreeStyle 293細胞，將前述之重鏈以及輕鏈兩個表現載體，使用293 fectin進行轉 染(transfection)，並進行培養7天。或者，對約1000萬個CHO-K1SV細胞(Lonza公司)，將前述之重鏈以及輕鏈兩個表現載體，使用電穿孔法進行轉染，並於CD-CHO medium(Life technologies公司)中培養7天。自培養上清液使用蛋白質A管柱或蛋白質G管柱(日本GE健康管理公司)進行純化，獲得完全人類型抗體之純化抗體。有關持續性表現，係將經分別插入抗體的重鏈與輕鏈基因之前述GS載體，於NotI與PvuI位置以限制酵素切斷，再使用接合(ligation)用試劑組Ligation-Convenience Kit(NIPPON GENE公司)，或接合試藥Ligation-high(TOYOBO公司)進行接合作用，構築成經插入重鏈與輕鏈兩基因之GS載體。該表現載體，可編碼完全長度之重鏈與輕鏈，載藉由轉染CHO-K1SV細胞而使抗體表現。對培養上清液利用蛋白質A管柱或蛋白質G管柱(日本GE健康管理公司)進行純化，獲得完全人類型抗體之純化抗體。分析經純化之完全人類型T7-27之胺基酸修飾後，發現於大部分的純化抗體中，重鏈C端有離胺酸之缺失。
(實施例4：利用SPR解析之結合活性評價)
為詳細測定完全人類型T7-27之結合活性，進行了SPR解析。本實驗例中，比較抗體係使用抗人類TSLP受體抗體TSLPR-012_141(專利文件4)。
SPR解析係使用Biacore(登記商標)2000(日本GE健康管理公司)進行解析。檢測晶片CM5的表面上係使 用Human Antibody Capture Kit與Amine Coupling Kit(日本GE健康管理公司)，並使各抗人類TSLP受體抗體固相化。將實施例1中取得之人類TSLP受體-小鼠Fc融合蛋白質，使用HBS-EP溶液(日本GE健康管理公司)進行系列稀釋，並以流速為50μL/min，添加100μL於流路中。利用該測定系，使用數據解析軟體(BIA Evaluation)，計算人類TSLP受體-小鼠Fc融合蛋白質與抗人類TSLP受體之結合速度定數(ka)、解離速度定數(kd)以及解離定數(KD)(表1)。
其結果，可明確得知完全人類型T7-27與TSLPR-012_141相比，具有強約3倍之結合活性。
(實施例5：評價經使用人類PBMC之TSLP誘發之阻礙TARC mRNA表現)
為評價完全人類型T7-27之中和活性，評價於人類末梢血中單核細胞(PBMC)之TSLP誘發之阻礙TARC mRNA表現。由於人類PBMC中亦含有表現TSLP受體之樹突細胞，而可使用於抗人類TSLP受體抗體之評價。比 較抗體係使用TSLPR-012_141。自後述之試驗例1之結果，由於可發現因抗TSLP受體抗體引起氣喘模型之病狀改善與阻礙血中TARC mRNA之表現有相關性，暗示本評價系係對於病狀具有效性之評價系。
取人類PBMC(AllCells公司)於96孔盤(Gleiner公司)，以每孔為20萬個細胞之量，使用160μL之RPMI1640培養基(Life technologies公司)進行細胞播種。以RPMI1640培養基，製作實施例2所製作之人類TSLP變異體-Flag蛋白質之系列稀釋(最終濃度為0.1ng/mL至100ng/mL之範圍共計7個濃度之系列稀釋)，並添加20μL至培養液中。於設定為37℃之CO2培養箱中進行孵育24小時之後，以RPMI1640培養基調製使各抗人類TSLP受體抗體之最終濃度成為0.3μg/mL，再添加20μL至培養液中，進而進行孵育72小時。控制組檢體係分別準備取代人類TSLP變異體-Flag蛋白質，而添加RPMI1640培養基至培養盤孔中、取代抗體而以RPMI1640培養基添加至培養盤孔中。去除200μL之培養上清液之後，使用RNA純化用試劑組RNeasy 96 kit(Qiagen公司)，以30μL的水萃取出total RNA。其次再使用逆轉錄用試劑組High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Life technologies公司)，進行10μL RNA之逆轉錄反應。接著，使用TARC的TaqMan探針(probe)(Ccl17，Hs00171074，Life technologies公司)、βactin的TaqMan探針(Actb，Hs99999903，Life technologies公司)、 Express qPCR SuperMix(A10313，Life technologies公司)，以及2μL的cDNA，利用TaqMan PCR法測定TARC mRNA之表現量。針對各抗體進行重複2次的試驗，並以比較CT法解析測定結果，並計算TARC mRNA之表現量。再自該表現量計算各TSLP濃度之抗體的阻礙率。將取代人類TSLP變異體-Flag蛋白質，而添加RPMI1640培養基之培養盤孔中的阻礙率設定為100%，且將添加了30以及100ng/mL之人類TSLP變異體-Flag蛋白質之孔的平均值，設定為阻礙率為0%。解析計算出之阻礙率，並藉由對照三參數對數式曲線，計算出0.3μg/mL的抗體可阻礙50%時之TSLP濃度(表2)。本TSLP濃度愈高，意味著受測抗體對於TSLP之中和活性愈強。
其結果，可明確得知完全人類型T7-27與TSLPR-012_141相比，人類TSLP所誘發之阻礙TARC mRNA表現活性高12倍。
(實施例6：經使用人類PBMC之TSLP誘發之阻礙MDC蛋白質產生)
為評價完全人類型T7-27之中和活性，評價於人類 PBMC之TSLP誘發之阻礙MDC蛋白質產生。比較抗體係使用TSLPR-012_141。
人類PBMC係藉由以與人類血液等量之PBS稀釋後，於其上方層積等量的Ficoll-Paque PLUS(日本GE健康管理公司)，於室溫下以400×g，離心處理30分鐘而調製。將人類PBMC使用96孔盤(Gleiner公司)，以每孔為約30萬個細胞之量，使用100μL之RPMI1640培養基(Life technologies公司)進行細胞播種。以RPMI1640培養基將實施例2製作之人類TSLP變異體-Flag蛋白質調製為最終濃度為5ng/mL，添加10μL至培養液中。於設定為37℃之CO2培養箱中進行孵育24小時之後，再將以RPMI1640培養基製作之各抗人類TSLP受體抗體之系列稀釋(最終濃度為0.1ng/mL至10μg/mL之範圍共計5個濃度之系列稀釋)，再添加10μL至培養液中，進而進行孵育5天。控制組檢體係分別準備取代人類TSLP變異體-Flag蛋白質，而添加RPMI1640培養基至培養盤孔中、取代抗體而以RPMI1640培養基添加至培養盤孔中。其後，採取培養上清液，利用經以PBS(Life technologies公司)稀釋20倍之上清液，對MDC之產生量，使用Human CCL22/MDC Quantikine ELISA Kit(R&D公司)進行評價。針對各抗體進行重複2次的試驗，計算於各抗體濃度之阻礙率。將取代人類TSLP變異體-Flag蛋白質，而添加RPMI1640培養基之培養盤孔中的阻礙率設定為100%，將取代抗體而添加RPMI1640培養基之培養盤孔 中的阻礙率設定為0%。並藉由對照三參數對數式曲線，計算出可阻礙50%時之抗體濃度並作為IC50(表3)。
其結果，可明確得知完全人類型T7-27與TSLPR-012_141相比，人類TSLP所誘發之阻礙MDC蛋白質產生活性約高9倍。
(實施例7：猴蛔蟲抗原致敏模型中之完全人類型T7-27的評價)
藉由蛔蟲抗原使猴致敏，誘導蛔蟲抗原特異性之IgE，引起過敏反應之皮膚反應。
對雄性食蟹獼猴於Day1、Day8以及Day15時藉由使用懸濁於氫氧化鋁凝膠(以下稱作Alum)之蛔蟲抗原液(0.5mg/mL DNP-Ascaris(LSL公司)，以50mg/mL Alum濃度懸濁於PBS之抗原液。以下稱作蛔蟲抗原-Alum液)，對腹腔內投予量為3.6mL/kg，對肌肉投予為0.4mL/kg，使猴子致敏。並分別設定處置群為Normal群(未處置)、Vehicle群(溶媒(20mM之檸檬酸鈉緩衝液/120mM之NaCl(pH6.0))於致敏前1天經靜脈投予群)以及抗體投予群(10mg/kg的完全人類型 T7-27(以溶媒稀釋)於致敏前1天經靜脈投予群)。Normal群n=2，Vehicle群以及抗體投予群n=3。
且Alum係以下述方法製作。
將硫酸鋁(14~18水和物)(Wako公司)溶解於超純水中調製為1M之溶液，使其通過0.22μm的過濾器後，添加1M之氫氧化鈉(Nakaraitesuku公司)至白色沈澱不再產生為止。去除上清液，以超純水洗淨5次後，再以PBS(Wako公司)洗淨3次。將洗淨後之白色沈澱，於冰浴下藉由均質機(KINEMATICA公司，CH-6010)更加粉碎化。其次，使用離心機(日立公司，himac CR21)以2000rpm，5分鐘，4℃進行離心後，去除上清液，再以PBS洗淨2次。將所得之沉澱物懸濁於PBS中獲得Alum。
測定血漿中蛔蟲抗原特異性的IgE濃度
對上述食蟹獼猴於Day1(投予蛔蟲抗原-Alum液之前)、Day8、Day15以及Day22進行經時性的採血，離心(1800×g，4℃，10分鐘)後，回收血漿。使用下述方法測定血漿中蛔蟲抗原特異性IgE之產生量。
以PBS調製使DNP-Ascaris之濃度成為100μg/mL，再添加100μL於Nunc-ImmunoTMMicroWellTM96孔固體盤(Nunc公司)於室溫進行固相化一晚。添加200μL固定劑(Blocking One：Nakaraitesuku公司)，靜置於室溫30分鐘後，去除其溶液。其次，再分別添加100μL之回收血 漿以及檢量線用檢體。檢量線用檢體係使用Vehicle群之1個體於Day 22時使血漿中IgE濃度濃度為2000U/mL，再以稀釋溶液(含5%Blocking One之PBS)調製之稀釋系列(2000U/mL~16U/mL)。靜置於室溫1小時後，以T-PBS(含0.05%之Tween-20之PBS)洗淨5次，再添加100μL之利用稀釋溶液進行10000倍稀釋後之HRP標誌人類IgE檢測抗體(A80-108P：Bethyl公司)。再度靜置於室溫1小時後，以T-PBS洗淨5次。最後，使用過氧化酶發色試劑組(ML-1120T：SUMILON公司)進行測定。吸光度係使用SpectraMax(分子裝置公司)進行測定。Day1以及Day22之結果示於圖1。
皮膚測試
於Day22，對Vehicle群以及抗體投予群之各個體分別以100μL之PBS、1、10以及100μg/mL之蛔蟲抗原溶液(將DNP-Ascaris懸濁於PBS之溶液)，於同一個體經剃毛後的2個部位(每隻猴子合計有8個部位)進行投予。Normal群則對各個體分別以100μL之PBS以及100μg/mL之蛔蟲抗原溶液，於同一個體經剃毛後的4個部位(每隻猴子合計有8個部位)進行投予。使皮膚致敏20分鐘後，使用游標測微計以測定直徑觀察皮膚反應。針對各個體，將投予蛔蟲抗原溶液後之皮膚反應的直徑，減去投予PBS之皮膚反應的直徑的值作為delta cm。投予100μg/mL之蛔蟲抗原溶液時之結果示於圖2。且，投予 1以及10μg/mL之蛔蟲抗原溶液時，並未引起可評價受驗抗體充分的皮膚反應。
求得各群之平均值以及標準誤差，將血漿中蛔蟲抗原特異性的IgE測定時，Day1之值(投予蛔蟲抗原-Alum液前之值)設定為100%，Day22之Vehicle群設定為0%，並求出抑制率。
如圖1所示，完全人類型T7-27與Vehicle群相比，於猴蛔蟲抗原致敏模型中，可使蛔蟲抗原特異性的IgE濃度減少(抑制97%)。
如圖2所示，完全人類型T7-27與Vehicle群相比，於猴蛔蟲抗原致敏模型中，投予100μg/mL之蛔蟲抗原溶液時，可使蛔蟲抗原特異性的皮膚反應減少。
自該等結果，可明確得知完全人類型T7-27，於猴蛔蟲抗原致敏模型中，可以抑制因蛔蟲抗原特異性之IgE所引起之過敏反應。
(試驗例1：小鼠塵蟎抗原致敏氣喘模型中抗TSLP受體抗體之評價)
已知小鼠塵蟎抗原致敏模型係氣喘模型，其病狀可舉出呼吸道出現反應性的亢進以及嗜酸性白血球對支氣管肺泡之浸潤等。
對NC/Nga小鼠(Charles River公司)於Day0(初次致敏時)以及Day5，利用腹腔內投予使用塵蟎抗原(Dp)(LSL公司)為100μg Dp/0.5mL生理食鹽水/小 鼠之用量，實施致敏。Day12以及Day19，再使用塵蟎抗原為100μg Dp/50μL生理食鹽水/小鼠之用量，利用點鼻投予引發呼吸道炎症。對抗體投予群，分別於Day-1、Day2、Day5、day8、Day11、Day14以及Day18(抗體投予日)每日一次，將各用量(0.1、1、10mg/kg)經以PBS(WAKO公司)溶解之抗小鼠TSLP受體抗體(WAKO公司)進行皮下投予。設計陽性對照群為迪皮質醇(dexamethasone)投予群(Dex群)。對Dex群自Day12至Day19每天一次，以3mg/kg之用量對腹腔內投予經以PBS溶解之迪皮質醇。設定之處置群係如下所述。
〔處置群〕
Normal群(n=10)：無處置
Saline群(n=6)：於Day0以及Day5，使用塵蟎抗原進行腹腔內投予，Day12以及Day19使用生理食鹽水進行點鼻投予，於抗體投予日則以PBS進行皮下投予。
PBS群(n=10)：於Day0以及Day5使用塵蟎抗原進行腹腔內投予，Day12以及Day19使用塵蟎抗原進行點鼻投予，於抗體投予日則以PBS進行皮下投予。
抗體投予群(0.1、1、10mg/kg)(各用量n=10)：於Day0以及Day5使用塵蟎抗原進行腹腔內投予， Day12以及Day19使用塵蟎抗原進行點鼻投予，於抗體投予日則以各用量之抗體進行皮下投予。
Dex群(n=10)：於Day0以及Day5使用塵蟎抗原進行腹腔內投予，Day12以及Day19使用塵蟎抗原進行點鼻投予，Day12至Day19則以迪皮質醇進行腹腔內投予。
於Day20將小鼠置入專用的無拘束箱中。利用箱子附設之呼吸氣流計的轉換器連結接呼吸功能解析裝置BioSystem XA(Buxco公司)，利用轉換器檢測相對於大氣壓力，箱內壓之變化。為了調查呼吸道反應性，使用超音波噴霧器，使經溶解於生理食鹽水之乙醯-β-甲基膽鹼(Sigma公司)依序(0.25、0.5、1、2、4mg/mL)提高濃度同時使小鼠吸入暴露。將使用箱內壓之變化機械地算出之PenH，作為呼吸功能的指標，並將測定結果示於圖3。
其次，自小鼠腹部大靜脈採血後，將小鼠放血使其安樂死。對小鼠插入氣管內套管(cannula)，以含有0.1%牛胎兒血清(BioWest公司)之PBS溶液進行支氣管肺泡洗淨，並回收支氣管肺泡洗淨液(BALF)。將BALF離心，去除上清液後，將沉渣懸濁於500μL之生理食鹽水，調製為BALF細胞懸濁液。使用多項目自動血球分析裝置XT-2000i(SYSMEX公司)，測定BALF細胞懸濁液中的嗜酸性白血球數。測定結果示於圖4。
將上述取得之血液，以RPMI1640培養基(Life technologies公司)稀釋10倍後於培養盤(IWAKI公司)上進行細胞播種(1mL/孔)。使用PBS使小鼠TSLP(R&D公司)之最終濃度成為0或10ng/mL而進行稀釋，再添加100μL至培養盤。於設定為37℃之5%CO2培養箱中進行孵育24小時之後，使用RNeasy 96 kit(Qiagen公司)，以30μL的水萃取出total RNA。其次再使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Life technologies公司)，進行10μL RNA之逆轉錄反應。接著，使用TARC的TaqMan探針(probe)(Ccl17，Mm01244826 g1，Life technologies公司)、βactin的TaqMan探針(Actb，Mm00607939 s1，Life technologies公司)、Express qPCR SuperMix(A10313，Life technologies公司)，以及2μL的cDNA，利用TaqMan PCR法測定TARC mRNA之表現量。以比較CT法解析測定結果，並計算表現量。添加10ng/mL之TSLP時之結果示於圖5。
求出各群之平均值以及標準誤差。針對PBS群、Normal群、Saline群以及Dex群各群間之關連性檢定，使用Student-t檢定。針對PBS群與抗體投予群間的關連性檢定，使用Dunnett多重比較。任一情況時均以p<0.05時為有意義之差。
如圖3所示，抗體投予群與PBS群相比，發現於該小鼠氣喘模型中，以1mg/mL之乙醯-β-甲基膽鹼所誘發的呼吸道反應性亢進之抑制作用。明確得知抗TSLP受體抗體於氣喘模型中之改善呼吸功能。
如圖4所示，抗體投予群與PBS群相比，發現對支氣管肺泡嗜酸性球之浸潤具抑制作用。
如圖5所示，抗體投予群與PBS群相比，發現對TARC mRNA之表現具阻礙作用。
自圖3以及圖4之結果，確認了抗TSLP受體抗體，可改善氣喘模型之病狀。進而，與圖5之結果合併，發現因抗TSLP受體抗體之病狀改善與阻礙TARC mRNA之表現具有相關性，明確得知可將TARC mRNA之表現之阻礙效果作為評價病狀改善效果之指標。
〔產業上之可利用性〕
本發明之抗人類TSLP受體抗體，係可適用於人類TSLP以及人類TSLP受體與病狀形成有關之各種疾病之預防或治療。另外，本發明之多胜肽、表現載體、宿主細胞以及生產方法，係可適用於生產前述抗人類TSLP受體抗體。
〔序列表之非關鍵詞文字〕
以下序列表中之數字<223>係記載「Artificial Sequence」之說明。具體而言，序列表之序列編號2以及4所示之鹼基序列，分別為完全人類型T7-27之重鏈以及輕鏈之鹼基序列，序列編號1以及3所示之胺基酸序列，分別為依據序列編號2以及4編碼之重鏈以及輕鏈之胺基酸序列。序列表之序列編號5、6、7、8以及9所示之鹼 基序列分別為編碼人類TSLP受體-人類Fc融合蛋白質、人類TSLP受體-小鼠Fc融合蛋白質、猴TSLP受體-人類Fc融合蛋白質、人類TSLP變異體-Flag蛋白質以及猴TSLP變異體-Flag蛋白質之鹼基序列。
<110> Astellas Pharma Inc.
<120> 新穎抗人類TSLP受體抗體
<130> A14014TW
<150> JP2013-165676
<151> 2013-08-09
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人類TSLP受體抗體之重鏈
<400> 1
<210> 2
<211> 1347
<213> 人工序列
<212> DNA
<220>
<223> 抗人類TSLP受體抗體之重鏈基因
<400> 2
<210> 3
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人類TSLP受體抗體之輕鏈
<400> 3
<210> 4
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人類TSLP受體抗體之輕鏈基因
<400> 4
<210> 5
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類TSLP受體-人類Fc之基因
<400> 5
<210> 6
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類TSLP抗體-小鼠Fc基因
<400> 6
<210> 7
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹獼猴TSLP受體-人類Fc之基因
<400> 7
<210> 8
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類TSLP變異體-Flag之基因
<400> 8
<210> 9
<211> 498
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹獼猴TSLP變異體-Flag基因
<400> 9
<210> 10
<211> 1116
<212> DNA
<213> 人類
<400> 10
<210> 11
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人類
<400> 11

Claims (21)

  1. 一種抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，其係包含由序列編號1之胺基酸編號1至118之胺基酸序列所構成之重鏈可變區，以及由序列編號3之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區。
  2. 如請求項1之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，其中前述抗體之重鏈不變區係人類Igγ1不變區。
  3. 如請求項1之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，其中前述抗體之輕鏈不變區係人類Igκ不變區。
  4. 如請求項1之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，其中前述抗體之重鏈不變區係人類Igγ1不變區，前述抗體之輕鏈不變區係人類Igκ不變區。
  5. 如請求項1之抗原結合片段，前述抗原結合片段係單鏈可變區片段、Fab、Fab’或F(ab’)2。
  6. 如請求項1之抗人類TSLP受體抗體，其係包含由序列編號1所示胺基酸序列構成之重鏈，以及由序列編號3所示胺基酸序列構成之輕鏈。
  7. 如請求項1之抗人類TSLP受體抗體，其係包含由序列編號1之胺基酸編號1至447之胺基酸編號構成之重鏈，以及由序列編號3所示胺基酸序列構成之輕鏈。
  8. 一種多核苷酸，其係含有編碼如請求項1之抗體之重鏈可變區之鹼基序列。
  9. 一種多核苷酸，其係含有編碼如請求項1之抗體之輕鏈可變區之鹼基序列。
  10. 一種表現載體，其係含有如請求項8及/或9之多核苷酸。
  11. 一種宿主細胞，其係選自下述(a)~(d)所成群之細胞，且經以如請求項10之表現載體進行轉形作用；(a)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼如請求項1之抗人類TSLP受體抗體之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸，與含有編碼該抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用；(b)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼如請求項1之抗人類TSLP受體抗體之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，與含有編碼該抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用；(c)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼如請求項1之抗人類TSLP受體抗體之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用；以及(d)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼如請求項1之抗人類TSLP受體抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用。
  12. 一種宿主細胞，其係選自下述(a)~(d)所成群之細胞，且經以如請求項10之表現載體進行轉形作用；(a)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼如請求項6之抗人類TSLP受體抗體之重鏈之鹼基序列之多核苷 酸，與含有編碼該抗體之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用；(b)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼如請求項6之抗人類TSLP受體抗體之重鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，與包含含有編碼該抗體之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用；(c)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼如請求項6之抗人類TSLP受體抗體之重鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用；以及(d)一種宿主細胞，其係經以包含含有編碼如請求項6之抗人類TSLP受體抗體之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體，進行轉形作用。
  13. 一種生產抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段之方法，其係包含培養如請求項11之宿主細胞，使抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段表現之步驟。
  14. 一種生產抗人類TSLP受體抗體之方法，其係包含培養如請求項12之宿主細胞，使抗人類TSLP受體抗體表現之步驟。
  15. 一種抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段，其係利用如請求項13之方法進行生產。
  16. 一種抗人類TSLP受體抗體，其係利用如請求項14之方法進行生產。
  17. 一種醫藥組成物，其係包含請求項1~7、15或16中任一項之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段以 及藥學上容許之賦形劑。
  18. 如請求項17之醫藥組成物，其係氣喘之預防或治療用醫藥組成物。
  19. 一種預防或治療氣喘之方法，其係包含以請求項1~7、15或16中任一項之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段之治療有效量進行投藥之步驟。
  20. 一種使用，其係為了氣喘之預防或治療，使用如請求項1~7、15或16中任一項之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段。
  21. 一種使用，其係於製造氣喘之預防或治療用醫藥組成物時，使用如請求項1~7、15或16中任一項之抗人類TSLP受體抗體或其抗原結合片段。
TW103127264A 2013-08-09 2014-08-08 新穎抗人類ｔｓｌｐ受體抗體 TWI635097B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013-165676 2013-08-09
JP2013165676 2013-08-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201536806A true TW201536806A (zh) 2015-10-01
TWI635097B TWI635097B (zh) 2018-09-11

Family

ID=52461517

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW103127264A TWI635097B (zh) 2013-08-09 2014-08-08 新穎抗人類ｔｓｌｐ受體抗體

Country Status (29)

Country Link
US (2) US9328171B2 (zh)
EP (1) EP3031913B1 (zh)
JP (1) JP6380394B2 (zh)
KR (1) KR102260680B1 (zh)
AR (1) AR097293A1 (zh)
AU (1) AU2014303356B2 (zh)
BR (1) BR112016002743B1 (zh)
CA (1) CA2920484C (zh)
CY (1) CY1121678T1 (zh)
DK (1) DK3031913T3 (zh)
ES (1) ES2730978T3 (zh)
HK (1) HK1223123A1 (zh)
HR (1) HRP20190752T1 (zh)
HU (1) HUE043111T2 (zh)
IL (1) IL243851B (zh)
LT (1) LT3031913T (zh)
MX (1) MX369208B (zh)
MY (1) MY177098A (zh)
PH (1) PH12016500237A1 (zh)
PL (1) PL3031913T3 (zh)
PT (1) PT3031913T (zh)
RS (1) RS58696B1 (zh)
RU (1) RU2689528C2 (zh)
SG (1) SG11201600935SA (zh)
SI (1) SI3031913T1 (zh)
TR (1) TR201906969T4 (zh)
TW (1) TWI635097B (zh)
UA (1) UA119328C2 (zh)
WO (1) WO2015020193A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI787161B (zh) * 2015-12-18 2022-12-21 日商安斯泰來製藥股份有限公司 含有抗人類ｔｓｌｐ受體抗體之醫藥組成物

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114853888B (zh) * 2021-02-05 2023-11-03 上海洛启生物医药技术有限公司 抗tslp纳米抗体及其应用
CN113069543B (zh) * 2021-06-07 2021-08-06 迈威(上海)生物科技股份有限公司 包含抗胸腺基质淋巴细胞生成素的单克隆抗体的液体组合物
WO2023028612A2 (en) * 2021-08-27 2023-03-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-tslpr (crlf2) antibodies
CN114028562B (zh) * 2021-11-01 2022-05-24 江苏荃信生物医药股份有限公司 包含抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(tslp)单克隆抗体的液体制剂
CN116217725B (zh) * 2021-12-02 2023-09-22 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种抗tslp单克隆抗体的纯化方法
CN117209604B (zh) * 2021-12-02 2024-03-22 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种抗tslp的单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
ATE256751T1 (de) 1993-03-11 2004-01-15 Chemo Sero Therapeut Res Inst Monoklonaler anti-hiv antikörper
AU2001270266B2 (en) * 2000-06-28 2004-10-21 Amgen Inc. Thymic stromal lymphopoietin receptor molecules and uses thereof
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20050249712A1 (en) * 2004-03-23 2005-11-10 The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health & Human Services Methods for use of TSLP and agonists and antagonists thereof
KR101383472B1 (ko) * 2006-01-13 2014-04-08 아이알엠 엘엘씨 알레르기 질병 치료를 위한 흉선 간질 림포포이에틴수용체에 대한 항체
UA108064C2 (uk) * 2006-12-14 2015-03-25 Вектор експресії, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує ізольований тимусний стромальний лімфопоетичний білок (tslp) або його антигенний фрагмент
WO2008155365A1 (en) 2007-06-20 2008-12-24 Irm Llc Methods and compositions for treating allergic diseases
US8475793B2 (en) 2008-02-07 2013-07-02 Merck Sharp & Dohme Corp. Engineered anti-TSLPR antibodies
WO2012007495A1 (en) 2010-07-15 2012-01-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies specifically binding to human tslpr and methods of use
US20120020960A1 (en) * 2010-07-26 2012-01-26 Baylor Research Institute Thymic Stromal Lymphopoietin (TSLP) and OX40 Ligand in Cancer
US9732151B2 (en) * 2011-11-03 2017-08-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Biomarkers for TSLP treatment

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI787161B (zh) * 2015-12-18 2022-12-21 日商安斯泰來製藥股份有限公司 含有抗人類ｔｓｌｐ受體抗體之醫藥組成物

Also Published As

Publication number Publication date
PL3031913T3 (pl) 2019-08-30
RU2016107814A (ru) 2017-09-14
CA2920484A1 (en) 2015-02-12
ES2730978T3 (es) 2019-11-13
JPWO2015020193A1 (ja) 2017-03-02
MX369208B (es) 2019-10-31
US20160046720A1 (en) 2016-02-18
MX2016001796A (es) 2016-04-15
BR112016002743B1 (pt) 2020-12-08
KR102260680B1 (ko) 2021-06-07
JP6380394B2 (ja) 2018-08-29
SG11201600935SA (en) 2016-03-30
HRP20190752T1 (hr) 2019-06-14
TR201906969T4 (tr) 2019-06-21
PH12016500237B1 (en) 2016-05-02
TWI635097B (zh) 2018-09-11
EP3031913A1 (en) 2016-06-15
PT3031913T (pt) 2019-05-31
WO2015020193A1 (ja) 2015-02-12
BR112016002743A2 (pt) 2017-11-21
US9328171B2 (en) 2016-05-03
CA2920484C (en) 2021-03-30
IL243851B (en) 2019-11-28
UA119328C2 (uk) 2019-06-10
IL243851A0 (en) 2016-04-21
EP3031913B1 (en) 2019-04-17
MY177098A (en) 2020-09-05
AU2014303356A1 (en) 2016-02-18
RU2689528C2 (ru) 2019-05-28
EP3031913A4 (en) 2017-03-22
KR20160035080A (ko) 2016-03-30
RU2016107814A3 (zh) 2018-06-28
SI3031913T1 (sl) 2019-06-28
AR097293A1 (es) 2016-03-02
US20160208005A1 (en) 2016-07-21
CY1121678T1 (el) 2020-07-31
HK1223123A1 (zh) 2017-07-21
AU2014303356A2 (en) 2017-02-02
DK3031913T3 (da) 2019-05-20
HUE043111T2 (hu) 2019-08-28
US9908941B2 (en) 2018-03-06
PH12016500237A1 (en) 2016-05-02
RS58696B1 (sr) 2019-06-28
LT3031913T (lt) 2019-05-27
AU2014303356B2 (en) 2020-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI635097B (zh) 新穎抗人類ｔｓｌｐ受體抗體
WO2019091436A1 (zh) 4-1bb抗体及其制备方法和应用
CN105829534B (zh) 抗人bdca-2抗体
US20220363781A1 (en) Anti-tslp antibody and uses thereof
JP6627761B2 (ja) 新規抗ヒトＩｇβ抗体
KR20220131970A (ko) 항-st2 항체 및 그의 적용
TW201600528A (zh) 交聯B淋巴球之CD23但不致敏肥大細胞的人源化抗-IgE抗體
CN113501878A (zh) 针对人tslp的多种抗体及其用途
WO2021213245A1 (zh) 抗体或其抗原结合片段、其制备方法及医药用途
JP7415939B2 (ja) 抗ヒトＦｎ１４抗体
EP2821416B1 (en) Novel anti-human il-23 receptor antibody
WO2021215469A1 (ja) 抗ヒトＦｎ１４抗体と免疫チェックポイント阻害剤を併用することにより、がんを予防又は治療する医薬組成物及び方法
CN106062193B (zh) 与人tlr2及人tlr4结合的双特异性抗体
JP7084057B2 (ja) 新規抗ｐａｄ２抗体
JP6529602B2 (ja) 抗ｃｄ２０／抗ｂａｆｆ二重特異性抗体