KR20230069111A - 항-넥틴-4 항체, 그를 포함하는 접합체 및 그의 응용 - Google Patents

항-넥틴-4 항체, 그를 포함하는 접합체 및 그의 응용 Download PDF

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Abstract

항-넥틴-4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 그를 포함하는 항체 접합체, 및 약제의 제조, 특히 암의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조에서의 그의 용도가 제공된다.

Description

항-넥틴-4 항체, 그를 포함하는 접합체 및 그의 응용
본 출원은 2020년 9월 16일에 제출되고, 발명의 명칭이 "항-넥틴-4 항체, 그를 포함하는 접합체 및 그의 응용"인 중국 출원 번호 제202010972365.6호 및 2020년 12월 31일에 제출되고, 발명의 명칭이 "항-넥틴-4 항체, 그를 포함하는 접합체 및 그의 응용"인 제202011624826.7호에 기초한 우선권을 주장하고, 이들 출원의 전체 내용은 참조에 의해 본원에 포함된다.
본 발명은 생물의학 분야에 속한다. 구체적으로, 본 발명은 항-넥틴-4 항체 및 그를 포함하는 접합체, 및, 그의 적용, 구체적으로, 넥틴-4 관련 질환의 치료 및/또는 예방에서의 그의 적용에 관한 것이다.
면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 PVRL로도 알려진 넥틴(Nectin) 패밀리 단백질에 속하는 넥틴-4는 주로 칼슘 이온 비의존성 세포 접착 연접(adhesion junction)을 매개하는 기능을 하다. 넥틴 패밀리는 넥틴-1, 넥틴-2, 넥틴-3 및 넥틴-4의 구성원을 포함하고, 약 510-550개의 아미노산 크기를 가지며, I형 막관통 단백질에 속하고, 그 구조는 3개의 Ig-유사 도메인에 의해 형성된 세포외 세그먼트(extracellular segment), 막관통 영역 및 세포내 꼬리 영역(intracellular tail region)을 포함한다. 3개의 Ig-유사 도메인은 1개의 IgV 도메인과 2개의 IgC 도메인을 포함하고, 세포내 도메인의 C-말단은 Afadin 단백질의 PDZ 도메인에 결합하기 위해 이용되는, Glu/Ala-X-Tyr-Val로 구성된 보존적 영역을 갖는다. 넥틴-4는 이 단백질 서열을 갖지 않으나, 세포 내에서 Afadin 단백질에 결합할 수 있다.
넥틴-4는 아노이키스(anoikis)를 억제하고 PI3K-AKT 신호 전달 경로를 활성화하여 종양 세포의 생존과 증식을 촉진할 수 있다. 연구에 따르면 넥틴-4는 위암, 간세포암, 비소세포폐암, 방광암, 유방암, 췌장암, 난소암, 두경부암, 및 식도암에서 발현되고, 비소세포폐암, 방광암, 유방암 및 췌장암에서 강하게 발현된다. 종양에서 넥틴-4의 높은 발현은 환자의 나쁜 예후와 밀접하게 관련된다. 따라서, 넥틴-4는 종양 치료제 개발을 위한 이상적인 표적으로 이용될 수 있다.
현재, 넥틴-4를 표적으로 하는 ADC 약물 엔포르투맙 베도틴(Enfortumab Vedotin)(예를 들어, WO2012/047724 참조)은 요로상피세포 암종의 치료에 이미 이용 가능하다. 엔포르투맙 베도틴은 DAR 값이 4인 항-넥틴-4 완전 인간 항체 접합 VC-MMAE 약물이다. 3상 임상 데이터에 따르면, 4명의 환자가 완전 관해(CR)를 달성했고, 41명의 환자가 부분 반응(PR)을 달성했으며, 객관적 반응률(objective response rate; ORR)은 41%이고, OS 중앙값은 13.6개월에 도달했으며, 반응 지속 기간 중앙값(median duration of response)은 5.75개월이고, 무진행 생존 기간(progression-free survival: PFS) 중앙값은 5.4개월이었다. ORR은 체크포인트 억제제 치료군의 환자 89명에서 40%, 체크포인트 억제제 무경험군(checkpoint inhibitor-naive group)의 환자 23명에서 44%, 간 전이군의 환자 33명에서 39%였다. 엔포르투맙 베도틴은 우수한 항종양 효능을 갖는다.
넥틴-4는 태반에서 발현되었고, 피부, 식도, 유방, 및 방광과 같은 일부 정상 조직에서는 약하게 내지 중간 정도로 발현되었다. 엔포르투맙 베도틴의 주요한 임상적 독성 및 부작용은 피로(54%)였고, 3등급 이상 부작용은 빈혈(8%), 저나트륨혈증(7%), 요로 감염(7%), 고혈당(6%)이었으며, 4명의 환자는 호흡 부전, 요로 폐쇄, 당뇨병성 케톤산증 및 다발성 장기 부전을 포함한 심각한 약물 관련 부작용을 보였다. 이는 엔포르투맙 베도틴의 독성 및 부작용이 너무 심각하다는 것을 나타낸다.
하나의 일반적인 양태에서, 본 발명은 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서,
(1a) Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 3에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 4에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 5에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는 Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 6에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 7에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(1b) Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 9에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 10에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 5에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는 Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 6에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 7에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(1c) Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 11에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 12에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 5에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는 Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 6에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 7에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 11에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 63에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 5에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는 Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 6에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 7에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3;
(1d) IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 13에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 14에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 15에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 16에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 17에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(2a) Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 21에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 22에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는 Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 다음 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3;
또는
Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 18에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 22에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는 Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 다음 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(2b) Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 27에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 28에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는 Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3;
또는
Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 36에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 28에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는 Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(2c) Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 29에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 30에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는 Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3;
또는
Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 44에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 30에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는 Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(2d) IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 31에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 32에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 33에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 34에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 35에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 54에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 32에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 33에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 34에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 35에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(3a) Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 39에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 40에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 41에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는 Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 42에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 43에 기재된 서열을 포함하는 CDR-L2 또는 그의 변이체, 서열번호 8에 기재된 서열을 포함하는 CDR-L3 또는 그의 변이체; 또는
(3b) Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 45에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 46에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 41에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는 Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 42에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 43에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(3c) Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 47에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 48에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 41에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는 Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 42에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 43에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3;
또는
Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 47에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 64에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 41에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는 Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 42에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 43에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(3d) IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 49에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 50에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 51에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 52에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 53에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열을 포함하는 CDR-L3또는 그의 변이체;를 포함하고,
상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖고; 바람직하게는, 상기 치환은 보존적 치환인 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 또는 마우스(murine) 면역글로불린으로부터 유래된 프레임워크 영역을 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 적어도 하나의 치료제를 포함하는 항체 접합체(antibody conjugate)를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR) 및 CAR을 발현하는 면역 이펙터(effector) 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 추가적인 생물학적 활성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항체 접합체, 면역 이펙터 세포, 다중특이성 항체, 또는 융합 단백질, 및 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항체 접합체, 면역 이펙터 세포, 다중특이성 항체, 융합 단백질 또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 암의 치료 및/또는 예방에서 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항체 접합체, 면역 이펙터 세포, 다중특이성 항체, 융합 단백질 또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 또한 필요로 하는 개체에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 암은 넥틴-4와 연관된 것인 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항체 접합체, 면역 이펙터 세포, 다중특이성 항체, 융합 단백질 또는 약학적 조성물의 치료 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 상기 암은 위암, 간암, 간세포 암종, 방광암, 요로상피암, 요도암, 신우암, 요관암, 폐암, 비소세포폐암, 유방암, 유관암(breast ductal cancer), 삼중음성 유방암, 췌장암, 난소암, 두경부암, 결장암, 직장암 및 식도암으로부터 선택된다.
본 발명을 수행하기 위한 특정 모델
정의
본 발명에서, 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 과학 및 기술 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 또한, 본원에서 사용되는 단백질 및 핵산 화학, 분자생물학, 세포 및 조직 배양, 미생물학, 면역학 관련 용어 및 실험 절차는 해당 분야에서 널리 사용되는 용어 및 일상적인 절차이다. 한편, 본 발명의 이해를 돕기 위해, 관련 용어에 대한 정의 및 설명이 하기에 제공된다.
본원에서 사용된, "적어도 하나(종(kind))" 또는 "하나(종) 이상(종)"은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20(종) 또는 그 이상(종)을 의미할 수 있다.
표현 "포함하는(comprising)" 또는 그 등가물 "포괄하는(including)", "함유하는(containing)" 및 "갖는(having)" 등은 개방형이며 추가적인 기재되지 않은 요소, 단계 또는 구성성분을 배제하지 않는다. 표현 "구성된(consistin of)"은 특정되지 않은 요소, 단계 또는 구성성분을 배제한다. 표현 "필수적으로 구성된(consisting essentially of)"은 범위가 청구된 대상의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 선택적인 요소, 단계 또는 구성성분의 추가를 포함한, 특정된 요소, 단계, 또는 구성성분으로 한정된다는 것을 의미한다. 표현 "포함하는"은 표현 "필수적으로 구성된" 및 "구성된"을 포함하는 것으로 이해되어야한다.
용어 "선택적(optional)" 또는 "선택적으로(optionally)"는 후속으로 기재된 이벤트 또는 상황이 발생할 수도 있고 발생하지 않을 수도 있으며, 그 기재는 해당 이벤트 또는 상황의 발생 및 해당 이벤트 또는 상황의 비발생을 모두 포함한다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된, "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산으로 형성된 중합체를 의미한다. "단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드와 공유결합에 의해 또는 비-공유 결합에 의해 형성될 수 있다. 달리 표시되지 않으면, 용어 "폴리펩티드"와 "단백질"은 본원에서 호환적으로 사용된다.
본원에서 사용된, "항체"는 하나 이상의 항원 결합 부위를 통해 항원성 에피토프에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 또는 그의 단편을 의미한다. 본원에서, 항체의 정의는 항원 결합 단편을 포함한다. 따라서, 용어 "항체"는 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 인간 항체, 비-인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일 도메인 항체 및 항원-결합 단편을 포함한다. 항체는 합성(예를 들어, 화학적으로 또는 생물학적으로 커플링에 의해 생성됨)이거나, 효소적으로 처리되거나 재조합적으로 생산될 수 있다. 본원에서 제공되는 항체는 임의의 면역글로불린 타입(예를 들면, IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 및 IgY), 임의의 클래스(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2), 또는 서브클래스(예: IgG2a 및 IgG2b)를 포함하다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 마우스 단일클론 항체이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 인간화 단일클론 항체이다.
본원에서 사용된, "전통적인(traditional) 항체" 또는 "전장(full-length) 항체"는 전형적으로 4개의 폴리펩티드: 2개의 중쇄(HC) 및 2개의 경쇄(LC)를 포함한다. 각각의 경쇄는 N-말단에서 C-말단까지 "경쇄 가변 영역(VL)" 및 "경쇄 불변 영역(CL)"을 포함한다. 각각의 중쇄는 N-말단에서 C-말단까지 "중쇄 가변 영역(VH)" 및 "중쇄 불변 영역(CH)"을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 N-말단에서 C-말단까지 CH1, CH2 및 CH3을 포함할 수 있다. 특정 면역글로불린 타입(예를 들면, IgM 및 IgE)에서, 중쇄 불변 영역은 CH4를 추가로 포함할 수 있다. "Fc" 단편은 Fc 수용체에 대한 결합 부위를 제공하는 CH2 및 CH3을 포함하는 단편을 의미한다. "힌지 영역(hinge region)"은 면역글로불린의 Fab와 Fc 단편을 연결하는 항체의 부분을 의미한다. 일부 경우에, 힌지 영역은 불변 영역과 막관통 도메인을 연결하는 T 세포 수용체의 일부를 의미하다. 본원에서, 키메라 항원 수용체와 관련하여 사용될 때, 힌지 영역은 또한 임의의 기능적 등가물을 의미할 수 있다. 당업자는 공지된 알고리즘 및 소프트웨어에 따라 항체에서 VH, VL, CL, CH1, CH2, CH3 및 힌지 영역의 위치를 판단할 수 있고, 적용 가능한 알고리즘 및 소프트웨어에 대한 설명은 예를 들어, William R. Strohl, Lila M. Strohl, (2012), Antibody structure-function relationships, In Woodhead Publishing Series in Biomedicine, Therapeutic Antibody Engineering, Woodhead Publishing, pp. 37-56에서 볼 수 있다.
일반적으로, VL 및 VH는 각각 3개의 고도로 가변적인 "상보성 결정 영역(CDR)" 및 4개의 상대적으로 보존적인(conservative) "프레임워크 영역(FR)"을 포함할 수 있고, 이들은 N-말단부터 C-말단까지 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 서열로 연결된다. 본원에서, 경쇄 가변영역 CDR(CDRL)은 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3으로 지칭될 수 있고, 중쇄 가변영역 CDR(CDRH)은 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3로 명명될 수 있다. 일반적으로, VH 및 VL의 한 쌍을 포함하는 6개의 CDR이 항원 결합 부위의 결합 특이성을 결정할 수 있는 것으로 간주되나. 일부 경우에, 6개 미만 (예를 들면, 3개, 4개 또는 5개)의 CDR을 포함하는 기타 단편(예를 들면, 단일 도메인 항체, 나노바디(nanobody)로도 알려짐)이 또한 항원-결합 능력을 갖는다. 당업자는 당해 분야에 잘 알려진 방법, 예를 들어 Kabat, Abm 또는 Chothia 넘버링 방법을 이용하여 CDR을 식별할 수 있다. 이러한 맥락에서, 동일한 가변 영역에 대해 복수의 CDR 넘버링 시스템, 예를 들면, Chothia, Abm, Kabat 및 IMGT이 이용될 수 있다. 상이한 넘버링 시스템에 의해 정의된 CDR이 상이할 수 있지만, 동일한 넘버링 시스템에서 식별된 CDR은 항원 에피토프에 결합할 수 있는 효율적인 항원 결합 부위를 나타낸다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. CDR 넘버링 시스템에 대한 설명은 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템의 경우, Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Chothia 넘버링 시스템의 경우, Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; 또는 IMGT 넘버링 시스템의 경우, Lefranc, M.-P., 2011(6), IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System Cold Spring Harb Protoc.; Abm 넘버링 시스템의 경우, Martin, A.C.R. and J. Allen (2007) "Bioinformatics tools for antibody engineering," in S. Dubel (ed.), Handbook of Therapeutic Antibodies. Weinheim: Wiley-VCH Verlag, pp. 95-118에서 볼 수 있다.
본원에서, 용어 "프레임워크 영역" 및 "프레임워크"는 호환적으로 사용된다. 본원에서 사용된, 용어 "프레임워크 영역", "프레임워크" 또는 "FR"의 잔기는 앞저 정의된 CDR 잔기 이외의 항체의 가변 영역에 있는 아미노산 잔기를 의미한다.
일반적으로 비-공유결합(non-covalent) 상호작용을 통한 하나의 VH와 하나의 VL로 구성된 "Fv" 단편이 항원 결합 부위를 포함하는 가장 작은 항원 결합 단편인 것으로 간주된다. 그러나, 중쇄의 가변 영역만을 포함하는 단일 도메인 항체(VHH, sdAb 또는 나노바디로도 알려짐)도 항원 결합 능력을 가질 수 있다. "단쇄 Fv(scFv)"는 펩티드 링커를 통해 VH와 VL을 연결하는 것에 의해 얻을 수 있다. "이황화 안정화 Fv(disulfide stabilized Fv: dsFv)" 또는 "단쇄 이황화 안정화 Fv(scdsFv 또는 dsscFv)"는 각각 Fv 또는 scFv에 이황화 결합을 도입함으로써 얻을 수 있다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 본 발명의 CAR에서 항체 접합체, 다중특이성 항체 또는 항원 결합 단편은 바람직하게는 scFv 또는 scdsFv를 사용한다.
본원에서 사용된, "Fab"는 하나의 완전한 항체 경쇄(VL-CL) 및 항체 중쇄 가변 영역 및 하나의 중쇄 불변 영역(VH-CH1, Fd로도 공지됨)을 포함한다. 단쇄(single chain) "Fab(scFab)"은 "Fab"에서 CL과 CH1을 펩티드 링커로 연결함으로써 얻을 수 있다. "F(ab')2"는 본질적으로 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함한다. "Fab'"는 F(ab')2의 힌지 영역에서 이황화 결합을 환원시켜 얻을 수 있는 F(ab')2의 절반이다.
항체 또는 항원 결합 단편은 "1가", "2가", "3가" 또는 "4가" 이상일 수 있으며, 이는 이들이 복수(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개 이상)의 항원 결합 부위를 갖는다는 것을 의미한다.
항체 또는 항원 결합 단편이 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 항원에 결합하는 경우, 이는 또한 "다중특이성 항체", 예를 들어 이중특이성 항체, 삼중특이성 또는 사중특이성 항체로 지칭될 수 있고, 각각 2, 3 또는 4개의 항원에 결합할 수 있는 다중특이성 항체를 나타낸다.
본원에서 사용된, "디아바디(diabody)"는 2개의 항원 결합 부위(2가)를 갖는 2개의 scFv를 포함하는 항체를 의미하며, 각 scFv의 VH 및 VL은 짧은 펩티드 링커(대략 5-10개 아미노산 잔기)에 의해 연결되어, VH 및 VL 사슬이 쌍을 이루어 (즉, 제1 scFv의 VH와 제2 scFv의 VL이 쌍을 이루고, 제1 scFv의 VL과 제2 scFv의 VH가 쌍을 이룸) 항원-결합 부위를 형성한다. 디아바디는 이중특이성 항체일 수 있다.
본원에서 사용된, 항체의 "항원-결합 단편"은 전장 항체의 일부를 의미하며, 전장보다 짧지만 전장 항체의 가변 영역의 적어도 일부를 포함(예를 들어, 하나 이상의 CDR 및/또는 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함)하고, 따라서, 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 능력의 적어도 일부를 보유한다. 항원 결합 단편은, 예를 들어 전장 항체의 효소 처리에 의해 생산된 항체 유도체, 합성적으로 생산된 유도체, 또는 재조합에 의해 생산된 유도체를 포함할 수 있다. 항원 결합 단편의 예는 Fv, scFv, dsFv, scdsFv, Fab, scFab, Fab', F(ab')2, 디아바디, Fd 및 Fd' 단편 및 기타 단편(예: 변형을 포함하는 단편)을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 항원-결합 단편은 예를 들어 이황화 결합 및/또는 펩티드 링커 및/또는 비-공유 상호작용을 통한 연결에 의해 형성된 다중 펩티드 사슬을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "단일클론 항체"는 고도로 균질한 항체의 집단으로서, 그에 포함된 항체 분자들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생 돌연변이를 제외하고는 실질적으로 동일한 것인 집단을 의미한다. 단일클론 항체는 일반적으로 단일 에피토프에 특이적으로 결합하다. 본 발명에서 유용한 단일클론 항체는 형질전환(transgenic) 동물(예를 들어, 형질전환 마우스)로부터의 생산, 불멸화 B 세포(예를 들어, B 세포 하이브리도마)로부터의 생산, 또는 재조합 DNA 방법을 이용한 박테리아, 진핵 또는 식물 세포로부터의 생산, 또는 파아지 항체 라이브러리로부터 분리에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 단일클론 항체이다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간화 단일클론 항체이다.
"키메라 항체"는 일부(예를 들어, CDR, FR, 가변 영역, 불변 영역, 또는 이들의 조합)가 특정 종으로부터 유래된 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동이고, 나머지 부분은 다른 종에서 유래된 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동인 것인 항체를 의미한다. 본원에서 사용된, "키메라 항체"는 또한 상이한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 부분을 포함하는 항체를 포함한다. 특정 구체예에서, 키메라 항체는 마우스 항체 가변 영역 및 인간 항체 불변 영역을 갖는다.
본원에서 사용된, "인간화 항체"는 비-인간(non-human) 항체 및 인간 항체 서열을 포함하는 항체를 의미한다. 따라서, 인간화 항체는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 비-인간 항체는 임의의 비-인간 종으로부터 유래된 항체 또는 비-인간 종으로부터 유래된 부분을 포함하는 항체(예를 들어, 키메라 항체)일 수 있다. 비-인간 종은 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼, 알파카 또는 인간을 제외한 영장류를 포함할 수 있다. 비-인간 항체로부터 인간화 항체를 얻는 기법이 당업자에게 잘 알려져 있다. 인간화 항체는, 예를 들어 비-인간 항체(예를 들어, 마우스 항체)의 CDR 서열을 인간 항체 프레임워크 영역에 이식함으로써 비-인간 항체(예를 들어, 마우스 항체 또는 키메라 항체)로부터 생산될 수 있다. 일부 경우에, 인간화 항체의 항원 결합 능력 및/또는 안정성을 유지하기 위해, 비-인간 항체(예를 들어, 마우스 항체)의 프레임워크 서열의 주요 아미노산 잔기가 인간 항체의 프레임워크 영역에 유지될 수 있고, 즉, "역돌연변이(back mutation)"가 수행된다(예를 들어, Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81(21): 6851-6855; Neuberger et al. (1984) Nature 312: 604-608 참조).
본원에서 사용된, 아미노산 서열의 "퍼센트(%) 서열 동일성", "서열 동일성"은 당업계에서 널리-인정되는 정의를 가지며, 서열 정렬(예를 들어, 수동 검사 또는 잘 알려진 알고리즘)에 의해 결정된 2개의 폴리펩티드 서열간 퍼센트 동일성을 의미한다. 이는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, Clustal Omega, FASTA 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 결정될 수 있다.
"친화도(affinity)" 또는 "결합 친화도"는 비-공유 상호작용에 의한 항체와 항원 간 결합의 강도를 측정하기 위해 이용된다. "친화도"의 크기는 일반적으로 평형 해리 상수 KD 또는 EC50으로 보고될 수 있다. KD는 평형 결합 상수 (ka) 및 평형 해리 상수(kd)를 측정하여 계산할 수 있다: KD = kd/ka. 친화도는 바이오필름 간섭계(biofilm interferometry)(예를 들어, Octet Fortebio 검출 시스템이 사용될 수 있음), 방사선면역분석(radioimmunoassay), 표면 플라즈몬 공명, ELISA(enzyme-linked immunoassay) 또는 유세포분석 등과 같은, 당업계에 공지된 통상적인 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에서 사용된, 항체와 항원 사이의 "특이적 결합"은 높은 친화도에 의한 항체와 항원 간의 결합을 의미한다. 일반적으로, 항체와 특이적으로 결합된 항원 사이의 KD 값은 적어도 약 10-6 내지 적어도 약 10-9 M 이하, 예를 들어, 적어도 약 10-6, 적어도 약 10-7, 적어도 약 10-8, 적어도 약 10-9 M 이하이다.
본원에서 사용된, 기준(reference) 아미노산 서열 "로부터" 또는 "로부터 유래된" 아미노산 서열은 기준 아미노산 서열과 부분적으로 또는 완전히 동일하거나 상동이다. 예를 들어, 인간 면역글로불린으로부터 유래된 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 그것이 유래된 야생형 인간 면역글로불린의 중쇄 불변 영역의 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
본원에서 사용된, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열의 "변이체(variant)"는 그것이 유래된 폴리펩티드 또는 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 변형을 갖는다. 아미노산 돌연변이는 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 당업자는 폴리펩티드 또는 단백질의 비필수 영역에 있는 아미노산이 일반적으로 생물학적 활성을 변화시키지 않는 적절한 보존적 아미노산으로 치환될 수 있음을 이해할 것이다(예를 들어, Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p. 224 참조). 적절한 보존적 치환은 당업자에게 잘 알려져 있다. 아미노산 잔기의 일부 일반적인 보존적 치환의 비제한적 예가 하기 표에 열거된다. 특정 경우에, 아미노산 치환은 비보존적 치환이다. 당업자는 항체 또는 항체 단편의 특성을 변경하기 위해, 예를 들어, 항체 글리코실화 변형의 타입을 변경하거나, 사슬간 이황화 결합을 형성하는 능력을 변경하거나, 또는 활성 그룹을 항체 접합체에 제공하기 위해 항체 또는 항체 단편에 아미노산 돌연변이 또는 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러한 아미노산 돌연변이 또는 변형을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 또한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 범위 내에 포함된다.
Figure pct00001
본원에서 사용된, 용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "핵산 분자"는 2개 이상의 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 올리고머 또는 중합체를 의미하며, 일반적으로 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된, "단리된(isolated)"은 물질(예를 들어, 핵산 분자 또는 폴리펩티드)이 그것이 존재하는 소스(source) 또는 환경으로부터 분리된다는 것, 즉, 임의의 다른 성분이 실질적으로 없다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된, "벡터"는 외인성 핵산을 숙주 세포 내로 도입하기 위해 사용되는 비히클이며, 벡터가 적절한 숙주 세포로 형질전환될 때, 외인성 핵산이 증폭되거나 발현된다. 벡터는 일반적으로 에피솜으로 유지되지만 유전자 또는 그의 일부를 게놈의 염색체에 통합하도록 설계될 수 있다. 본원에서 사용된, 벡터의 정의는 플라스미드, 선형화된 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드, 파아지 벡터, 파지미드(phagemid), 인공 염색체(예를 들어, 효모 인공 염색체 및 포유동물 인공 염색체) 등을 포함한다.
본원에서 사용된, "발현 벡터"는 DNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 상기 DNA가 DNA 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 리보솜 결합 부위)에 작동가능하게 연결되어 있는 것인 벡터를 의미한다. 조절 서열은 프로모터 및 터미네이터 서열을 포함할 수 있고, 선택적으로 복제원점, 선택 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 플라스미드, 파아지 벡터, 재조합 바이러스, 또는 적절한 숙주 세포 내로 도입될 때, 클로닝된 DNA의 발현을 가져오는 기타 벡터일 수 있다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며 진핵 및/또는 원핵 세포에서 복제가능한 발현 벡터 뿐만 아니라 에피솜으로 유지되는 발현 벡터, 또는 숙주 세포 게놈에 통합되는 발현 벡터를 포함한다.
본원에서 사용된, "숙주 세포"는 벡터를 수용, 유지, 복제 또는 증폭하기 위해 사용되는 세포이다. 숙주 세포는 또한 벡터 또는 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 숙주 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포일 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "치료"는 질병/증상의 개선, 예를 들어 질병/증상을 감소 또는 제거하고, 질병/증상의 발생, 진행 및/또는 악화를 예방 또는 지연시키는 것을 의미한다. 따라서, 치료는 예방, 치료 및/또는 치유를 포함한다.
"유효량"은 질병의 증상의 중증도를 감소시키거나, 질병의 무증상 기간의 빈도 및 지속기간을 증가시키거나, 질병의 고통으로 인한 손상 또는 장애를 예방하기에 충분한 용량을 의미한다. "유효량"은 질병 또는 증상을 예방, 치유, 개선, 지연 또는 부분적으로 지연시키는 데 필요한 양을 의미한다. 예를 들어, 종양의 치료를 위해, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항체 접합체, 면역 이펙터 세포, 또는 약학적 조성물의 "유효량"은 미처리 개체 대비, 바람직하게는 종양 세포 성장 또는 종양 성장을 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 약 20%, 보다 바람직하게는 적어도 약 30%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 바람직하게는 적어도 약 50%, 보다 바람직하게는 적어도 약 60%, 보다 바람직하게는 적어도 약 70%, 더 바람직하게는 약 80% 이상 억제한다. 종양 성장 억제의 효능은 자연(spontaneous) 종양, 유도 종양 및 이식된 종양에 대한 동물 모델과 같은 당업계의 통상적인 종양 동물 모델을 사용하여 평가할 수 있다. 대안적으로, 세포 성장을 억제하는 능력은 또한 당업계에 잘 알려진 인 비트로 분석을 이용하여 조사될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항체 접합체, 면역 이펙터 세포, 또는 약학적 조성물의 유효량은 개체에서 종양 크기를 감소시킬 수 있거나, 또는 달리 증상을 완화할 수 있다(예를 들어, 전이 또는 재발의 예방 및/또는 치료). 당업자는 개체의 연령, 신체 상태, 성별, 증상의 중증도, 특정 조성 또는 투여 경로 등과 같은 인자에 기초하여 유효량을 결정할 수 있다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제"는 개체 및 활성 성분과 약리학적 및/또는 생리학적으로 양립가능한 담체 및/또는 부형제를 나타내며, 이는 당업계에 널리 공지되어 있고(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995 참조), pH 조정제, 계면활성제, 아쥬반트, 이온 강도 증강제(ionic strength enhancing agent), 희석제, 삼투압 유지제, 흡수 지연제, 보존제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, pH 조정제는 인산염 완충액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 계면활성제는 양이온성, 음이온성 또는 비이온성 계면활성제, 예를 들면, Tween-80을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이온 강도 증강제는 염화나트륨을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보존제는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등과 같은 다양한 항세균제 및 항진균제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 삼투압 유지제는 당(sugar), NaCl 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 흡수 지연제는 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 희석제는 물, 수성 완충액(예: 완충 식염수), 알코올 및 폴리올(예: 글리세롤) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보존제는 티메로살, 2-페녹시에탄올, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등과 같은 다양한 항세균제 및 항진균제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 안정화제는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가지며, 약물 중 활성 성분의 원하는 활성을 안정화시킬 수 있고, 소듐 글루타메이트, 젤라틴, SPGA, 당(예: 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로오스, 락토오스, 글루칸 또는 글루코오스), 아미노산(예: 글루탐산, 글리신), 단백질(예: 건조 유청, 알부민 또는 카세인) 또는 이들의 분해 생성물(예: 락트알부민 가수분해물) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용된, 포유동물의 예는 인간, 비-인간 영장류, 랫트, 마우스, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본원에서 사용된, 용어 "개체(subject)"는 인간과 같은 포유동물을 의미한다. 일부 구체예에서, 개체는 인간이다. 일부 구체예에서, 개체는 암 환자, 암에 걸린 것으로 의심되거나 암을 발병할 위험이 있는 인간 또는 동물이다. 본원에서, 용어 "대상(object)"과 "개체(subject)"는 호환적으로 사용된다.
항-넥틴-4 항체 또는 그의 항원 결합 단편
하나의 일반적인 양태에서, 본 발명은 넥틴-4를 특이적으로 인식하고 그에 결합하는 항-넥틴-4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
넥틴-4는 인간 넥틴-4 또는 비-인간 넥틴-4의 전체 또는 부분 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 바람직하게는, 넥틴-4는 인간 넥틴-4이다. 인간 Nectin-4는 예를 들어 Uniprot 식별 번호(ID): Q96NY8-1에 의해 표시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 비-인간 넥틴-4는 예를 들어 포유동물 넥틴-4, 예를 들면, 비-인간 영장류 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이 넥틴-4일 수 있고, 이는 Uniprot 식별 번호(ID): L0N6D9로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 비-인간 넥틴-4는 또한 예를 들어 Uniprot 식별 번호(ID): D3ZET1로 표시된 아미노산 서열을 가질 수 있는 랫트 넥틴-4일 수 있다. 비-인간 넥틴-4는 또한, 예를 들어, Uniprot 식별 번호(ID): Q8R007로 표시된 아미노산 서열을 가질 수 있는 마우스 넥틴-4일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 넥틴-4의 IgV 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 넥틴-4의 IgV 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 넥틴-4에 특이적으로 결합하고 그의 넥틴-1과의 상호작용을 차단할 수 있다.
일부 구체예에서, 항-넥틴-4 항체는 3개의 중쇄 CDR(CDRH): CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3은 표 1의 CDRH 그룹에서 선택된다.
표 1: 항-넥틴-4 항체의 중쇄 CDR
넘버링 시스템 그룹 CDR-H1
(서열번호) 		CDR-H2
(서열번호) 		CDR-H3
(서열번호)
Chothia a/e GYTFTDY (3) HPSDSE (4) WDFRIYYAMDY (5)
b GYSITSDY (21) SFSGR (22) GNYDGFDY (23)
c GYFNSITSDY (18) SFSGR (22) GNYDGFDY (23)
d/f GYTFINY (39) HPSDSA (40) WGNFYTVNAWYYFDY (41)
Abm a/e GYTFTDYWMN (9) MIHPSDSETR (10) WDFRIYYAMDY (5)
b GYSITSDYDWH (27) YISFSGRTY (28) GNYDGFDY (23)
c GYFNSITSDYDWH (36) YISFSGRTY (28) GNYDGFDY (23)
d/f GYTFINYWMN (45) MIHPSDSATR (46) WGNFYTVNAWYYFDY (41)
Kabat a DYWMN (11) MIHPSDSETRLNQKFKD (12) WDFRIYYAMDY (5)
b SDYDWH (29) YISFSGRTYYNPSLKS (30) GNYDGFDY (23)
c ITSDYDWH (44) YISFSGRTYYNPSLKS (30) GNYDGFDY (23)
d NYWMN (47) MIHPSDSATRLNQKFKD (48) WGNFYTVNAWYYFDY (41)
e DYWMN (11) MIHPSDSETRLNQKFQG (63) WDFRIYYAMDY (5)
f NYWMN (47) MIHPSDSATRLNQSFQG (64) WGNFYTVNAWYYFDY (41)
IMGT a/e GYTFTDYW (13) IHPSDSET (14) ARWDFRIYYAMDY (15)
b GYSITSDYD (31) ISFSGRT (32) ARGNYDGFDY (33)
c GYFNSITSDYD (54) ISFSGRT (32) ARGNYDGFDY (33)
d/f GYTFINYW (49) IHPSDSAT (50) ARWGNFYTVNAWYYFDY (51)
일부 구체예에서, 항-넥틴-4 항체는 3개의 경쇄 CDR(CDRL): CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3은 표 2의 CDRL 그룹에서 선택된다.
표 2: 항-넥틴-4 항체의 경쇄 CDR
넘버링 시스템 그룹 CDR-L1
(서열번호) 		CDR-L2
(서열번호) 		CDR-L3
(서열번호 )
Chothia a/e KSSQSLLNTNSQKNYLA (6) FASTRES (7) QQHYSTPLT (8)
b/c RASQNIGTSIH (24) FASESIS (25) QQSKSWPTYT (26)
d/f KSSQTLLNSNTQKNYLA (42) FASTRES (43) QQHYSTPLT (8)
Abm a/e KSSQSLLNTNSQKNYLA (6) FASTRES (7) QQHYSTPLT (8)
b/c RASQNIGTSIH (24) FASESIS (25) QQSKSWPTYT (26)
d/f KSSQTLLNSNTQKNYLA (42) FASTRES (43) QQHYSTPLT (8)
Kabat a/e KSSQSLLNTNSQKNYLA (6) FASTRES (7) QQHYSTPLT (8)
b/c RASQNIGTSIH (24) FASESIS (25) QQSKSWPTYT (26)
d/f KSSQTLLNSNTQKNYLA (42) FASTRES (43) QQHYSTPLT (8)
IMGT a/e QSLLNTNSQKNY (16) FAS (17) QQHYSTPLT (8)
b/c QNIGTS (34) FAS (35) QQSKSWPTYT (26)
d/f QTLLNSNTQKNY (52) FAS (53) QQHYSTPLT (8)
상보성 결정 영역(CDR)
일부 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 3에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 4에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 5에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3. 다른 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 6에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 7에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
일부 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 9에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 10에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 5에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3. 다른 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 6에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 7에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
일부 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 11에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 12 또는 63에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 5에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3. 다른 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 6에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 7에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
일부 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 13에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 14에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 15에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3. 다른 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 16에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 17에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(a) Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 6개의 중쇄 및 경쇄의 CDR: 서열번호 3에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 4에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 5에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3, 서열번호 6에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 7에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(b) Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 6개의 중쇄 및 경쇄의 CDR: 서열번호 9에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 10에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 5에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3, 서열번호 6에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 7에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(c) Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 6개의 중쇄 및 경쇄의 CDR: 서열번호 11에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 12 또는 63에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 5에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3, 서열번호 6에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 7에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(d) IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 6개의 중쇄 및 경쇄의 CDR: 서열번호 13에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 14에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 15에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3, 서열번호 16에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 17에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
일부 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 21에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 22에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3. 다른 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
일부 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 27에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 28에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3. 다른 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
일부 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 29에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 30에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3. 다른 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
일부 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 31에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 32에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 33에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3. 다른 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 34에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 35에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 6개의 중쇄 및 경쇄의 CDR: 서열번호 21에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 22에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3, 서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(b) Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 6개의 중쇄 및 경쇄의 CDR: 서열번호 27에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 28에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3, 서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(c) Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 6개의 중쇄 및 경쇄의 CDR: 서열번호 29에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 30에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3, 서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(d) IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 6개의 중쇄 및 경쇄의 CDR: 서열번호 31에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 32에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 33에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3, 서열번호 34에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 35에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
일부 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 18에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 22에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3. 다른 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
일부 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 36에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 28에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3. 다른 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
일부 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 44에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 30에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3. 다른 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
일부 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 54에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 32에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 33에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3. 다른 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR을 더 포함한다: 서열번호 34에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 35에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 6개의 중쇄 및 경쇄의 CDR: 서열번호 18에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 22에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3, 서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(b) Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 6개의 중쇄 및 경쇄의 CDR: 서열번호 36에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 28에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3, 서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(c) Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 6개의 중쇄 및 경쇄의 CDR: 서열번호 44에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 30에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3, 서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(d) IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 6개의 중쇄 및 경쇄의 CDR: 서열번호 54에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 32에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 33에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3, 서열번호 34에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 35에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
일부 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 39에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 40에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 41에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3. 다른 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 42에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 43에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
일부 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 45에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 46에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 41에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3. 다른 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 42에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 43에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
일부 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 47에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 48 또는 64에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 41에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3. 다른 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 42에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 43에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
일부 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 49에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 50에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 51에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3. 다른 특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함한다: 서열번호 52에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 53에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
특정 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 6개의 중쇄 및 경쇄의 CDR: 서열번호 39에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 40에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 41에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3, 서열번호 42에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 43에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(b) Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 6개의 중쇄 및 경쇄의 CDR: 서열번호 45에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 46에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 41에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3, 서열번호 42에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 43에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(c) Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 6개의 중쇄 및 경쇄의 CDR: 서열번호 47에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 48 또는 64에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 41에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3, 서열번호 42에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 43에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
(d) IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 6개의 중쇄 및 경쇄의 CDR: 서열번호 49에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 50에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2, 서열번호 51에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3, 서열번호 52에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 53에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3.
전술된 바와 같은 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 일부 구체예에서, 상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 그것이 유래된 서열 대비 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖고; 바람직하게는, 상기 치환은 보존적 치환이다.
프레임워크 영역( FR )
일부 구체예에서, VH는 중쇄 프레임워크 영역(FR)을 더 포함한다. 다른 구체예에서, VL은 경쇄 프레임워크 영역(FR)을 더 포함한다. 중쇄 프레임워크 영역 및/또는 경쇄 프레임워크 영역은 각각 독립적으로 임의의 종의 면역글로불린의 프레임워크 영역으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 중쇄 프레임워크 영역 및 경쇄 프레임워크 영역은 각각 독립적으로 인간 또는 마우스 면역글로불린의 중쇄 프레임워크 영역 및 경쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된다. 일 구체예에서, 중쇄 프레임워크 영역 및 경쇄 프레임워크 영역은 각각 독립적으로 마우스 면역글로불린의 중쇄 프레임워크 영역 및 경쇄 프레임워크 영역, 인간 면역글로불린의 중쇄 프레임워크 영역 및 경쇄 프레임워크 영역, 또는 이들의 조합으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 중쇄 프레임워크 영역 및 경쇄 프레임워크 영역은 각각 독립적으로 인간 생식계열 항체(human germline antibody)의 중쇄 프레임워크 영역 및 경쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 VH는 인간 면역글로불린으로부터 유래된 중쇄 프레임워크 영역을 포함하고 및/또는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 VL은 인간 면역글로불린에서 유래된 경쇄 프레임워크 영역을 포함한다. 따라서, 특정 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간화된다. 그러한 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 프레임워크 영역 및/또는 경쇄 프레임워크 영역은 하나 이상의 비-인간(예를 들어, 마우스) 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 예를 들면, 중쇄 프레임워크 영역 및/또는 경쇄 프레임워크 영역은 하나 이상의 아미노산 역돌연변이(backmutation)를 포함할 수 있고, 이러한 역돌연변이에 상응하는 마우스 아미노산 잔기가 있다.
바람직한 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호 1에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH를 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 2에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호 1에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH, 및 서열번호 2에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 55에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH를 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호 56에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호 55에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH, 및 서열번호 56에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 19에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH를 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 20에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 19에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH, 및 서열번호 20에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 57에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH를 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 58에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호 57에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH, 및 서열번호 58에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 37에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH를 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 38에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 37에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH, 및 서열번호 38에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 59에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH를 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 60에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 59에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH, 및 서열번호 60에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
(1) 서열번호 1에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH 및/또는 서열번호 2에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL; 또는
(2) 서열번호 19에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH 및/또는 서열번호 20에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL; 또는
(3) 서열번호 37에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH 및/또는 서열번호 38에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL; 또는
(4) 서열번호 55에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH 및/또는 서열번호 56에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL; 또는
(5) 서열번호 57에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH 및/또는 서열번호 58에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL; 또는
(6) 서열번호 59에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH 및/또는 서열번호 60에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL.
전술된 바와 같은 구체예에서, 상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 대안적으로, 상기 변이체는 그것이 유래된 서열 대비 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖고; 바람직하게는, 상기 치환은 보존적 치환이다.
불변 영역
일부 구체예에서, 항-넥틴-4 항체는 중쇄 불변 영역을 더 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항-넥틴-4 항체는 경쇄 불변 영역을 더 포함한다. 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역은 각각 독립적으로 임의의 종의 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역으로부터 유래될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역은 각각 독립적으로 마우스 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 또는 그의 변이체 및 경쇄 불변 영역 또는 그의 변이체로부터 유래된다. 보다 바람직한 구체예에서, 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역은 각각 독립적으로 인간 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 또는 그의 변이체 및 경쇄 불변 영역 또는 그의 변이체로부터 유래된다. 상기 변이체는 그것이 유래된 야생형 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어, 최대 20개, 최대 15개, 최대 10개 또는 최대 5개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가; 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는다.
중쇄 불변 영역은 힌지 영역, CH1, CH2, CH3, 또는 이들의 조합의 적어도 일부로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 중쇄 불변 영역은 CH1을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 중쇄 불변 영역은 CH1-힌지 영역-CH2를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 중쇄 불변 영역은 CH1-힌지 영역-CH2-CH3을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 중쇄 불변 영역은 CH4를 추가로 포함한다. 상기 중쇄 불변 영역은 임의의 서브타입(예: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM), 임의의 클래스(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2), 또는 임의의 서브클래스(예: IgG2a 및 IgG2b), 또는 이들의 조합의 중쇄 불변 영역으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 중쇄 불변 영역으로부터 유래된다. 바람직한 구체예에서, 상기 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역으로부터 유래된다.
경쇄 불변 영역은 λ(람다) 경쇄 또는 κ(카파) 경쇄 불변 영역으로부터 유래될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 경쇄 불변 영역은 인간 κ 경쇄 불변 영역이다.
특정 구체예에서, 상기 중쇄 불변 영역은 서열번호 61에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 경쇄 불변 영역은 서열번호 62에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 이러한 구체예에서, 상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 대안적으로, 상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 최대 20개의 아미노산의 보존적 치환(예를 들어, 최대 15, 최대 10, 또는 최대 5개의 아미노산의 보존적 치환; 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산의 보존적 치환)을 갖는다.
특정 구체예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고:
(a) 상기 중쇄는 서열번호 1에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH, 및 서열번호 61에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 및 경쇄는 서열번호 2에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL 및 서열번호 62에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하거나; 또는
(b) 상기 중쇄는 서열번호 19에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH, 및 서열번호 61에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 및 상기 경쇄는 서열번호 20에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL, 및 서열번호 62에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하거나; 또는
(c) 상기 중쇄는 서열번호 37에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH, 및 서열번호 61에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 및 상기 경쇄는 서열번호 38에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL, 및 서열번호 62에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하거나; 또는
(d) 상기 중쇄는 서열번호 55에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH, 및 서열번호 61에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 및 상기 경쇄는 서열번호 56에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL, 및 서열번호 62에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하거나; 또는
(e) 상기 중쇄는 서열번호 57에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH, 및 서열번호 61에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 및 상기 경쇄는 서열번호 58에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL 및 서열번호 62에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하거나; 또는
(f) 상기 중쇄는 서열번호 59에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH, 및 서열번호 61에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 및 상기 경쇄는 서열번호 60에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL, 및 서열번호 62에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 갖는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 이황화 안정화된 Fv(dsFv), 디아바디, 이중특이성 항체 및 다중특이성 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마우스 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체이다.
마우스 항체
일 구체예에서, 본 발명의 항-넥틴-4 항체는 VH 및 VL을 포함하는 마우스 항체이고, 상기 VH는 전술된 바와 같은 중쇄 CDR 및 중쇄 프레임워크 영역을 포함하고, 상기 VL은 전술된 바와 같은 경쇄 CDR 및 경쇄 프레임워크 영역을 포함하며, 상기 중쇄 프레임워크 영역 및 상기 경쇄 프레임워크 영역은 각각 독립적으로 마우스 면역글로불린 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 항-넥틴-4 항체는 마우스 하이브리도마 세포로부터 생산된 단일클론 항체이다.
특정 구체예에서, 상기 마우스 항체는 표 1의 그룹 a에 기재된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 및 중쇄 프레임워크 영역을 포함하는 VH를 포함하고, 상기 중쇄 프레임워크 영역은 마우스 면역글로불린 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 마우스 항체는 서열번호 1에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH를 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 마우스 항체는 표 2의 그룹 a에 기재된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 경쇄 프레임워크 영역을 포함하는 VL을 추가로 포함하고, 상기 경쇄 프레임워크 영역은 마우스 면역글로불린 프레임워크 영역에서 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 마우스 항체는 서열번호 2에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 상기 마우스 항체는 표 1의 그룹 b에 기재된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 및 중쇄 프레임워크 영역을 포함하는 VH를 포함하고, 상기 중쇄 프레임워크 영역은 마우스 면역글로불린 프레임워크 영역에서 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 마우스 항체는 서열번호 19에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH를 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 마우스 항체는 표 2의 그룹 b에 기재된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 경쇄 프레임워크 영역을 포함하는 VL을 추가로 포함하고, 상기 경쇄 프레임워크 영역은 마우스 면역글로불린 프레임워크 영역에서 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 마우스 항체는 서열번호 20에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 상기 마우스 항체는 표 1의 그룹 c에 기재된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 및 중쇄 프레임워크 영역을 포함하는 VH를 포함하고, 상기 중쇄 프레임워크 영역은 마우스 면역글로불린 프레임워크 영역에서 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 마우스 항체는 서열번호 37에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH를 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 마우스 항체는 표 2의 그룹 c에 기재된 바와 같은 CDRL1, CDR-L2, CDR-L3 및 경쇄 프레임워크 영역을 포함하는 VL을 추가로 포함하고, 상기 경쇄 프레임워크 영역은 마우스 면역글로불린 프레임워크 영역에서 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 마우스 항체는 서열번호 38에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
전술된 구체예에서, 상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 대안적으로, 상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는다. 바람직하게는, 상기 치환은 보존적 치환이다.
특정 구체예에서, 상기 마우스 항체는 서열번호 1에 기재된 서열을 갖는 VH 및 서열번호 2에 기재된 서열을 갖는 VL을 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 상기 마우스 항체는 서열번호 19에 기재된 서열을 갖는 VH 및 서열번호 20에 기재된 서열을 갖는 VL을 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 상기 마우스 항체는 서열번호 37에 기재된 서열을 갖는 VH 및 서열번호 38에 기재된 서열을 갖는 VL을 포함한다.
키메라 항체
일 구체예에서, 본 발명의 항-넥틴-4 항체는 키메라 항체이다. 일부 구체예에서, 상기 키메라 항체는 전술된 바와 같은 마우스 항체의 중쇄 CDR 및/또는 경쇄 CDR을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 키메라 항체는 전술된 바와 같은 마우스 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 키메라 항체는 전술된 바와 같은 마우스 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 및 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함하며, 상기 중쇄 불변 영역은 비-마우스(non-murine) 면역글로불린의 중쇄 불변 영역으로부터 유래되고, 및/또는 상기 경쇄 불변 영역은 비-마우스 면역글로불린의 경쇄 불변 영역으로부터 유래된다. 바람직한 구체예에서, 상기 중쇄 불변 영역은 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역으로부터 유래되고 및/또는 상기 경쇄 불변 영역은 인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역으로부터 유래된다. 바람직한 구체예에서, 상기 중쇄 불변 영역은 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역으로부터 유래되고, 상기 경쇄 불변 영역은 인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역으로부터 유래된다.
일부 구체예에서, 키메라 항체는 표 1의 그룹 a에 기재된 바와 같은 마우스 항체의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 키메라 항체는 표 2의 그룹 a에 기재된 바와 같은 마우스 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3을 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 키메라 항체는 서열번호 1에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 키메라 항체는 서열번호 2에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 더 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 상기 키메라 항체는 서열번호 19에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 키메라 항체는 서열번호 20에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 추가로 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 상기 키메라 항체는 서열번호 37에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 키메라 항체는 서열번호 38에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 추가로 포함한다.
전술된 구체예에서, 상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 대안적으로, 상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는다. 바람직하게는, 상기 치환은 보존적 치환이다.
일부 구체예에서, 전술된 바와 같은 키메라 항체는 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 중쇄 불변 영역은 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역으로부터 유래되고 상기 경쇄 불변 영역은 인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역으로부터 유래된다. 일 구체예에서, 상기 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 영역으로부터 유래된다. 일 구체예에서, 상기 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역으로부터 유래된다. 일 구체예에서, 상기 경쇄 불변 영역은 인간 λ 또는 κ 경쇄 불변 영역으로부터 유래된다. 일 구체예에서, 상기 경쇄 불변 영역은 인간 κ 경쇄 불변 영역으로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 상기 중쇄 불변 영역은 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 경쇄 불변 영역은 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 이러한 구체예에서, 상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 대안적으로, 상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여, 최대 20개의 아미노산의 보존적 치환(예를 들어, 최대 15개, 최대 10개, 또는 최대 5개의 아미노산의 보존적 치환; 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산의 보존적 치환)을 갖는다.
특정 구체예에서, 상기 키메라 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 서열번호 1에 기재된 서열을 갖는 VH 및 서열번호 61에 기재된 서열을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 2에 기재된 서열을 갖는 VL 및 서열번호 62에 기재된 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 상기 키메라 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 서열번호 19에 기재된 서열을 갖는 VH 및 서열번호 61에 기재된 서열을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 20에 기재된 서열을 갖는 VL 및 서열번호 62에 기재된 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
또 다른 구체적인 구체예에서, 상기 키메라 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 서열번호 37에 기재된 서열을 갖는 VH 및 서열번호 61에 기재된 서열을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 38에 기재된 서열을 갖는 VL 및 서열번호 62에 기재된 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
인간화 항체
일 구체예에서, 본 발명의 항-넥틴-4 항체는 VH 및 VL을 포함하는 인간화 항체이고, 상기 VH는 전술된 중쇄 CDR 및 중쇄 프레임워크 영역을 포함하고, 상기 VL은 전술된 경쇄 CDR 및 경쇄 프레임워크 영역을 포함하며, 상기 중쇄 프레임워크 영역 및 상기 경쇄 프레임워크 영역은 각각 독립적으로 인간 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역 및 경쇄 프레임워크 영역에서 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 구체예에서, 상기 중쇄 프레임워크 영역 및/또는 상기 경쇄 프레임워크 영역은 하나 이상의 비-인간(예를 들어, 마우스) 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 예를 들어, 상기 중쇄 프레임워크 영역 및/또는 상기 경쇄 프레임워크 영역은 하나 이상의 아미노산 역 돌연변이를 포함할 수 있고, 이러한 역 돌연변이에는 상응하는 마우스 아미노산 잔기가 있다. 인간화 항체는 비-인간 항체(예를 들어, 마우스 또는 키메라 항체)로부터 생성될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 인간화 항체는 본 발명의 실시예에 기재된 바와 같이 본 발명의 항-넥틴-4 마우스 항체로부터 제조된다.
특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 전술된 바와 같은 마우스 항체의 CDR-H1 또는 그의 변이체, CDR-H2 또는 그의 변이체, CDR-H3 또는 그의 변이체를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 전술된 바와 같은 마우스 항체의 CDR-L1 또는 그의 변이체, CDR-L2 또는 그의 변이체, CDR-L3 또는 그의 변이체를 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 전술된 바와 같은 마우스 항체의 CDR-H1 또는 그의 변이체, CDR-H2 또는 그의 변이체, CDR-H3 또는 그의 변이체를 포함하는 VH, 및 중쇄 프레임워크를 포함하고, 상기 중쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 전술된 바와 같은 마우스 항체의 CDR-L1 또는 그의 변이체, CDR-L2 또는 그의 변이체, CDR-L3 또는 그의 변이체를 포함하는 VL, 및 경질 사슬 프레임워크 영역을 포함하고, 상기 경쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 3에 기재된 CDR-H1, 서열번호 4에 기재된 CDR-H2, 서열번호 5에 기재된 CDR-H3을 포함하는, Chothia 넘버링 시스템에 의해 정의된 VH, 및 중쇄 프레임워크 영역을 포함하고, 상기 중쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 6에 기재된 CDR-L1, 서열번호 7에 기재된 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 CDR-L3을 포함하는, Chothia 넘버링 시스템에 의해 정의된 VL, 및 경쇄 프레임워크 영역을 추가로 포함하고, 상기 경쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 9에 기재된 CDR-H1, 서열번호 10에 기재된 CDR-H2, 서열번호 5에 기재된 CDR-H3을 포함하는, Abm 넘버링 시스템에 의해 정의된 VH, 및 중쇄 프레임워크 영역을 포함하고, 상기 중쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 6에 기재된 CDR-L1, 서열번호 7에 기재된 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 CDR-L3을 포함하는, Abm 넘버링 시스템에 의해 정의된 VL, 및 경쇄 프레임워크 영역을 추가로 포함하고, 상기 경쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 11에 기재된 CDR-H1, 서열번호 12 또는 63에 기재된 CDR-H2, 서열번호 5에 기재된 CDR-H3을 포함하는, Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 VH, 및 중쇄 프레임워크 영역을 포함하고, 상기 중쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 6에 기재된 CDR-L1, 서열번호 7에 기재된 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 CDR-L3을 포함하는, Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 VL, 및 경쇄 프레임워크 영역을 추가로 포함하고, 상기 경쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 13에 기재된 CDR-H1, 서열번호 14에 기재된 CDR-H2, 서열번호 15에 기재된 CDR-H3을 포함하는, IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 VH, 및 중쇄 프레임워크 영역을 포함하고, 상기 중쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 16에 기재된 CDR-L1, 서열번호 17에 기재된 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 CDR-L3을 포함하는, IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 VL, 및 경쇄 프레임워크 영역을 추가로 포함하고, 상기 경쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 56에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 55에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH를 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 21 또는 18에 기재된 CDR-H1, 서열번호 22에 기재된 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 CDR-H3을 포함하는, Chothia 넘버링 시스템에 의해 정의된 VH, 및 중쇄 프레임워크 영역을 포함하고, 상기 중쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 24에 기재된 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 CDR-L3을 포함하는, Chothia 넘버링 시스템에 의해 정의된 VL, 및 경쇄 프레임워크 영역을 추가로 포함하고, 상기 경쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 27 또는 36에 기재된 CDR-H1, 서열번호 28에 기재된 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 CDR-H3을 포함하는, Abm 넘버링 시스템에 의해 정의된 VH, 및 중쇄 프레임워크 영역을 포함하고, 상기 중쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 24에 기재된 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 CDR-L3을 포함하는, Abm 넘버링 시스템에 의해 정의된 VL, 및 경쇄 프레임워크 영역을 추가로 포함하고, 상기 경쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 29 또는 44에 기재된 CDR-H1, 서열번호 30에 기재된 CDR-H2, 서열번호 23에 기재된 CDR-H3을 포함하는, Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 VH, 및 중쇄 프레임워크 영역을 포함하고, 상기 중쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 24에 기재된 CDR-L1, 서열번호 25에 기재된 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 CDR-L3을 포함하는, Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 VL, 및 경쇄 프레임워크 영역을 추가로 포함하고, 상기 경쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 31 또는 54에 기재된 CDR-H1, 서열번호 32에 기재된 CDR-H2, 서열번호 33에 기재된 CDR-H3을 포함하는, IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 VH, 및 중쇄 프레임워크 영역을 포함하고, 상기 중쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 34에 기재된 CDR-L1, 서열번호 35에 기재된 CDR-L2, 서열번호 26에 기재된 CDR-L3을 포함하는, IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 VL, 및 경쇄 프레임워크 영역을 추가로 포함하고, 상기 경쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 58에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 57에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH를 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 39에 기재된 CDR-H1, 서열번호 40에 기재된 CDR-H2, 서열번호 41에 기재된 CDR-H3을 포함하는, Chothia 넘버링 시스템에 의해 정의된 VH, 및 중쇄 프레임워크 영역을 포함하고, 상기 중쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 42에 기재된 CDR-L1, 서열번호 43에 기재된 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 CDR-L3을 포함하는, Chothia 넘버링 시스템에 의해 정의된 VL, 및 경쇄 프레임워크 영역을 추가로 포함하고, 상기 경쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 45에 기재된 CDR-H1, 서열번호 46에 기재된 CDR-H2, 서열번호 41에 기재된 CDR-H3을 포함하는, Abm 넘버링 시스템에 의해 정의된 VH, 및 중쇄 프레임워크 영역을 포함하고, 상기 중쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 42에 기재된 CDR-L1, 서열번호 43에 기재된 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 CDR-L3을 포함하는, Abm 넘버링 시스템에 의해 정의된 VL, 및 경쇄 프레임워크 영역을 추가로 포함하고, 상기 경쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 47에 기재된 CDR-H1, 서열번호 48 또는 64에 기재된 CDR-H2, 서열번호 41에 기재된 CDR-H3을 포함하는, Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 VH, 및 중쇄 프레임워크 영역을 포함하고, 상기 중쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 42에 기재된 CDR-L1, 서열번호 43에 기재된 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 CDR-L3을 포함하는, Kabat 넘버링 시스템에 의해 정의된 VL, 및 경쇄 프레임워크 영역을 추가로 포함하고, 상기 경쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 49에 기재된 CDR-H1, 서열번호 50에 기재된 CDR-H2, 서열번호 51에 기재된 CDR-H3을 포함하는, IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 VH, 및 중쇄 프레임워크 영역을 포함하고, 상기 중쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 중쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 52에 기재된 CDR-L1, 서열번호 53에 기재된 CDR-L2, 서열번호 8에 기재된 CDR-L3을 포함하는, IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된 VL, 및 경쇄 프레임워크 영역을 추가로 포함하고, 상기 경쇄 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 경쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 60에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 인간화 항체는 서열번호 59에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH를 포함한다.
전술된 구체예에서, 상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 대안적으로, 상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는다. 바람직하게는, 상기 치환은 보존적 치환이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및/또는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 전술된 인간화 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역 대비, 적어도 하나의 CDR 및/또는 프레임워크 영역은 아미노산 돌연변이를 포함하고, 상기 아미노산 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가, 또는 이들의 임의의 조합(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가, 또는 이들의 임의의 조합)이다. 바람직하게는, 상기 치환은 보존적 치환이다.
일부 구체예에서, 상기 항-넥틴-4 인간화 항체는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 상기 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 영역으로부터 유래된다. 일 구체예에서, 상기 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역으로부터 유래된다. 일 구체예에서, 상기 중쇄 불변 영역은 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 항-넥틴-4 인간화 항체는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 상기 경쇄 불변 영역은 인간 λ 또는 κ 경쇄 불변 영역으로부터 유래된다. 일 구체예에서, 상기 경쇄 불변 영역은 인간 κ 경쇄 불변 영역으로부터 유래된다. 일 구체예에서, 상기 경쇄 불변 영역은 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함한다.
전술된 구체예에서, 상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 대안적으로, 상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 20개 이하의 아미노산의 보존적 치환 (예를 들면, 15개 이하, 10개 이하, 또는 5개 이하의 아미노산의 보존적 치환; 예를 들면, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 보존적 치환)을 갖는다.
특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 서열번호 55에 기재된 서열을 갖는 VH 및 서열번호 61에 기재된 서열을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 56에 기재된 서열을 갖는 VL 및 서열번호 62에 기재된 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 서열번호 57에 기재된 서열을 갖는 VH 및 서열번호 61에 기재된 서열을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 58에 기재된 서열을 갖는 VL 및 서열번호 62에 기재된 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 인간화 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 서열번호 59에 기재된 서열을 갖는 VH 및 서열번호 61에 기재된 서열을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 60에 기재된 서열을 갖는 VL 및 서열번호 62에 기재된 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명의 항-넥틴-4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조 및 생산될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면, 파아지 디스플레이 라이브러리, 효모 디스플레이 라이브러리, 불멸화 B 세포(예를 들어, 마우스 B 세포 하이브리도마 세포 또는 EBV 불멸화 B 세포)로부터 항체 또는 항원-결합 단편을 제조하고 단리하는 것을 포함할 수 있다. 동물을 면역화시키는 방법, 예를 들어 동물(예를 들어, 마우스)을 항원 또는 상기 항원을 코딩하는 DNA로 면역화시키는 방법이 또한 이용될 수 있고, 항체-발현 B 세포는 면역화된 동물로부터 단리될 수 있다. 바람직하게는, 항체-발현 B 세포는 불멸화되고, 예를 들어 하이브리도마 또는 EBV 불멸화 B 세포로서 제조된다. 숙주 세포는 또한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산 분자 또는 발현 벡터로 형질전환될 수 있고, 그 후, 본 발명의 항-넥틴-4 또는 그의 항원-결합 단편이 상기 숙주 세포로부터 발현된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항-넥틴-4 항체는 면역화된 동물, 예를 들어 인간 넥틴-4 단백질로 면역화된 마우스로부터 수득된다.
다중특이성 항체
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-넥틴-4 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 적어도 하나의 다른 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체 유사체(antibody analog)를 포함하는 다중특이성 항체로서, 상기 다중특이성 항체는 넥틴-4 및 하나 이상의 다른 항원에 결합할 수 있는 것인 다중특이성 항체를 제공한다.
일 구체예에서, 다중특이성 항체는 이중특이성 항체, 삼중특이성 항체 또는 사중특이성 항체이다. 일 구체예에서, 상기 다중특이성 항체는 제1 scFv(또는 scdsFv) 및 제2 scFv(또는 scdsFv)를 포함하는 이중특이성 디아바디이고, 상기 제1 scFv(또는 scdsFv)는 짧은 펩티드 링커에 의해 연결된 본 발명의 VH 및 다른 항체의 VL을 포함하고, 제2 scFv(또는 scdsFv)는 더 짧은 펩티드 링커에 의해 연결된 본 발명의 VL 및 상기 다른 항체의 VH를 포함하며, 상기 다른 항체는 넥틴-4가 아닌 다른 항원에 결합하고, 상기 짧은 펩티드 링커는 5-10개의 아미노산 잔기를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 다른 항원은 세포 표면 단백질, 수용체 또는 수용체 서브유닛이다. 상기 세포 표면 단백질은 예를 들어 면역 세포 수용체일 수 있다. 면역 세포는 예를 들어 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 세포독성 T(CTL) 세포와 같은 면역 이펙터 세포일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 이중특이성 항체는 넥틴-4 및 PD-1에 결합할 수 있다.
다중특이성 항체는 예를 들어 2가, 3가, 4가 또는 그 이상일 수 있는 다가 항체이다.
바람직한 구체예에서, 상기 다중특이성 항체는 scFv, dsFv, scdsFv, Fab, scFab, Fab', F(ab')2로 이루어진 군으로부터 선택된 항원-결합 단편을 포함한다.
상기 다중특이성 항체는 또한 항체 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 상기 중쇄 불변 영역은 힌지 영역, CH1, CH2, CH3, 또는 이들의 조합의 적어도 일부로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 중쇄 불변 영역은 CH1을 갖는다.
목적 항체 또는 항체 단편을 사용하여 다중특이성 항체를 구축하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 93/08829; Suresh et al., (1986) Methods in Enzymology, 121: 210; Traunecker et al., (1991) EMBO, 10: 3655-3659 참조).
다중특이성 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산 및 단리될 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술을 이용하여 다중특이성 항체를 코딩하는 핵산 분자를 얻을 수 있으며, 선택적으로 상기 핵산 분자를 발현 벡터 내로 클로닝하고, 그 후, 숙주 세포를 상기 핵산 분자 또는 발현 벡터로 형질전환시키고, 형질전환된 숙주 세포를 상기 핵산 또는 발현 벡터의 발현을 가능하게 하는 적절한 조건에서 배양하고, 최종적으로 상기 숙주 세포 또는 그의 배양 배지로부터 다중특이성 항체를 단리 및 정제한다.
융합 단백질
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 추가적인 생물학적 활성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 상기 추가적인 생물학적 활성 폴리펩티드는 치료 활성, 결합 활성 또는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질이다. 생물학적 활성 폴리펩티드의 비한정적 예는 단백질 독소(예: 디프테리아 독소, 리신), 효소(예: 우레아제, 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)), 사이토카인을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
핵산, 벡터 및 숙주 세포
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-넥틴-4 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 상기 핵산은 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여, 예를 들어 파아지 디스플레이 라이브러리, 효모 디스플레이 라이브러리, 면역화된 동물, 불멸화 세포(예를 들어, 마우스 B 세포 하이브리도마 세포, EBV-매개 불멸화 B 세포)로부터의 단리 또는 화학 합성에 의해 수득될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 발현에 사용되는 숙주 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 상기 핵산 분자는 분리될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 재조합 핵산으로서 제조된다. 일 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 발현 벡터 내로 클로닝된다. 상기 발현 벡터는 조절 서열 및 항생제 내성 유전자와 같은 추가적인 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 핵산은 화학적 합성, 재조합 DNA 기술(예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술) 등과 같은 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 제조할 수 있다(Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 참조). 상기 발현 벡터는 또한 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 상기 폴리펩티드 또는 단백질은 발현된 항체 또는 항원-결합 단편의 검출 및/또는 단리를 촉진할 수 있다. 이러한 폴리펩티드 또는 단백질은 친화성 태그(affinity tag)(예: 비오틴, 폴리히스티딘 태그(His6) 또는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GSH) 태그), 프로테아제 절단 부위를 포함하는 폴리펩티드, 및 리포터 단백질(예: 형광성 단백질)을 포함할 수 있으나 그에 한정되지 않는다. 본 발명의 핵산 분자는 하나 이상의 벡터에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 발현 벡터는 DNA 플라스미드, 예를 들어 박테리아, 효모 또는 포유동물 세포에서의 발현을 위한 DNA 플라스미드이다. 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 파아지 벡터 또는 파아지미드(phagemid) 벡터이다.
본 발명은 또한 전술된 바와 같은 적어도 하나의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본원의 숙주 세포는 본 발명의 항-넥틴-4 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현시키기 위해 사용된다. 숙주 세포의 예는 원핵 세포(예를 들어, 박테리아, 예를 들어, E. coli), 진핵 세포(예를 들어, 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
박테리아(예: E. coli BL21(DE3))는 Fv, scFv, Fab 및 Fab' 단편과 같은 더 작은 항원 결합 단편을 발현하는 데 특히 유리하다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자가 단일 벡터 내로 클로닝되고 BL21(DE3) 내로 도입된다. 항체 발현에 적합한 포유동물 숙주 세포는 골수종 세포, HeLa 세포, HEK 세포(예를 들어, HEK 293 세포), CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포, 및 항체 발현에 적합한 기타 포유동물 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 본 발명의 항-넥틴-4 항체 또는 항원 결합 단편을 생산하는 방법을 제공한다:
(I) 본원에 기재된 적어도 하나의 핵산 또는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계,
(II) 핵산 또는 발현 벡터의 발현을 허용하기에 적합한 조건 하에 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
(III) 상기 숙주 세포 또는 그의 배양 배지로부터 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 단리 및 정제하는 단계.
일부 구체예에서, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 벡터가 사용된다. 일부 구체예에서, 2개의 벡터가 사용되고, 하나는 항체 경쇄를 코딩하고 다른 하나는 항체 중쇄를 코딩한다. 일부 구체예에서, 상기 숙주 세포는 항체 또는 항체 단편의 용해도, 안정성 및/또는 폴딩을 증가시키는 것을 도울 수 있는 파트너 플라스미드를 추가로 포함한다. 숙주 세포로부터 항체를 단리하고 정제하는 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다.
항체 접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 치료제에 접합된 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체 접합체를 제공한다. 항체 약물 접합체(ADC)는 항체 접합체의 전형적인 타입이며, 상기 치료제는 예를 들어 세포독성제일 수 있다.
일부 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체 접합체는 넥틴-4 양성 표적 세포를 표적화하고 표적 세포를 추적하거나 사멸시킬 수 있다. 일부 보다 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체 접합체는 넥틴-4 양성 암세포를 선택적으로 사멸시킨다. 일부 구체예에서, 상기 암세포는 위암 세포, 유방암 세포, 방광암 세포, 폐암 세포, 간암 세포, 결장암 세포, 직장암 세포, 두경부암 세포, 및 난소암 세포로부터 선택된다.
치료제는 세포독성제, 치료 항체(예를 들어, 추가적인 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편), 방사성 동위원소, 올리고뉴클레오티드 및 그의 유사체(예를 들어, 간섭 RNA), 생물학적 활성 펩티드, 단백질 독소(예: 디프테리아 독소, 리신) 및 효소(예: 우레아제)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 세포독성제는 세포의 활성 또는 기능을 억제 또는 감소시키고/시키거나 세포를 죽이는 물질을 의미한다. 세포독성제의 예는 메이탄시노이드(예: 메이탄신), 아우리스타틴(auristatin)(예: MMAF, MMAE, MMAD), 듀오스타틴, 크립토피신(cryptophycin), 빈카 알칼로이드(예: 빈블라스틴, 빈크리스틴), 콜히친, 돌라스타틴, 탁산, 파클리탁셀, 도세탁셀, 카바지탁셀, 엔디인 항생제(enediynes antibiotics), 시토칼라신(cytochalasins), 캄프토테신, 안트라사이클린(예: 다우노루비신, 디히드록시안트라신디온, 독소루비신), 세포독성 항생제(예: 미토마이신, 액티노마이신, 듀오카르마이신 (예: CC-1065), 아우로마이신, 듀오마이신, 칼리케아미신, 엔도마이신, 페노마이신), 독소루비신, 다우노루비신, 칼리케아미신, 시스플라틴, 에티디움 브로마이드, 블레오마이신, 미토마이신, 미트라마이신, 플라디에놀리드, 포도필로톡신, 에토포사이드, 미톡산트론, 5-플루오로우라실, 시타라빈, 겜시타빈, 머캅토퓨린, 펜토스타틴, 플루다라빈, 클라드리빈, 넬라라빈, 카르무수틴, 로무스틴, 메토트렉세이트, 멜팔란, 테니포사이드, 글루코코르티코이드 등을 포함할 수 있으나, 그에 한정되지 않는다.
방사성 동위원소는 예를 들어, 212Bi, 213Bi, 131I, 125I, 111In, 177Lu, 186Re, 188Re, 153Sm, 90Y로부터 선택될 수 있다. 방사성 동위원소 표지된 항체는 또한 방사성 면역접합체(radio immunoconjugate)로 지칭될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 치료제는 항종양 생물학적 활성을 갖는 분자이다. 항종양 생물학적 활성을 갖는 분자는 세포독성제, 화학요법제, 방사성 동위원소, 면역 체크포인트 억제제, 종양 특이적 항원을 표적으로 하는 항체, 및 기타 항종양 약물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 구체예에서, 상기 치료제는 세포독성제이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 치료제는 방사성 동위원소이다.
특정 구체예에서, 상기 치료제는
Figure pct00002
,
Figure pct00003
,
Figure pct00004
또는
Figure pct00005
이다.
상기 치료제는 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용하여 링커를 통해 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편에 접합될 수 있다. 링커는 아민, 히드록실아민, 말레이미드, 카르복실, 페닐, 티올, 설프히드릴, 또는 히드록실기와 같은 공유 접합(covalent conjugation)을 위한 반응기를 포함할 수 있다. 링커는 절단 가능하거나 절단 불가능할 수 있다. 절단 가능한 링커는 예를 들어, 효소적으로 절단 가능한 링커(예를 들어, 프로테아제 절단 부위를 포함하는 펩티드), pH 민감성 링커(예를 들어, 히드라존(hydrazone)-타입 링커), 또는 환원성 링커(예를 들어, 이황화 결합)이다.
일 구체예에서, 링커는 아민, 히드록실아민, 말레이미드, 카르복실, 페닐, 티올, 설프히드릴, 및 히드록실 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응성 기를 포함한다. 일 구체예에서, 링커는 화학 결합이다. 일 구체예에서, 링커는 아미노산 또는 2-10개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 포함한다. 상기 아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 링커는 Val, Cit, Phe, Lys, D-Val, Leu, Gly, Ala, Asn,
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
로 구성된 군으로부터 선택되고, 식 중에서, 위치 1 및 위치 2 중 하나는 링커가 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 부착된 위치를 나타내고, 나머지 하나는 상기 링커가 상기 치료제에 연결된 위치를 나타낸다.
일부 구체예에서, 상기 치료제 및 상기 링커는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편의 접합 전에 접합되어 중간체를 형성한다. 일부 구체예에서, 상기 중간체는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편 상의 설프히드릴기와 티오에테르 결합을 형성함으로써 연결된다. 이러한 중간체의 구조 및 제조 방법 및 이를 사용하여 항체 접합체를 제조하는 방법이 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO2019/114666에 기술되고, 그 관련 내용은 그 전체가 참조에 의해 본원에 포함된다.
일 구체예에서, 상기 항체 접합체는 식 (I)의 구조를 가지며,
A-(L-D)γ
식 (I);
식 중에서, A는 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 나타내고;
L은 링커이고, L은 아미노산, 또는 2-10개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 포함하며; 바람직하게는 L은 Val, Cit, Phe, Lys, D-Val, Leu, Gly, Ala, Asn,
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
로부터 선택되고,
식 중에서, 위치 1 및 위치 2 중 하나는 L과 A가 연결된 위치를 나타내고, 나머지 하나는 L과 D가 연결된 위치를 나타내며,
D는 치료제이고; 바람직하게는 D는 세포 독성제, 치료 항체, 방사성 동위원소, 올리고뉴클레오티드 및 그의 유사체, 생물학적 활성 펩티드, 단백질 독소 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되고; 보다 바람직하게는, D는 항종양 생물학적 활성 분자이고;
더욱 바람직하게는, D는
Figure pct00012
,
Figure pct00013
,
Figure pct00014
, 또는
Figure pct00015
이고,
γ는 A에 연결된 (L-D) 모이어티의 개수를 나타내고, 1 내지 10의 정수이다.
특정한 구체예에서, 상기 (L-D) 모이어티는 하기 식 (1) 구조를 갖고, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 설프히드릴기와 식 (1)의 화합물 간에 티오에테르 결합을 형성하는 것에 의해 연결되며,
Figure pct00016
식 (1),
본 발명의 항체 접합체는 하기 식 (2)의 구조를 가지며:
Figure pct00017
식 (2),
식 중에서, A는 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편이고, γ는 A의 설프히드릴기와 티오에테르 결합을 형성하는 것에 의해 A에 연결된 (L-D) 모이어티의 갯수를 나타내고, 1 내지 10의 정수이다. 특정한 구체예에서, A는 본 발명의 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 접합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 조성물 중 본 발명의 항-넥틴-4 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 대한 치료제의 몰비 (DAR 값)는 1 내지 10의 소수(decimal) 또는 정수, 예를 들면, 1과 8 사이의 소수 또는 정수, 예를 들면, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.79, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 6.95, 7.0, 7.03, 7.1, 7.12, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8.0이다.
CAR 및 CAR-발현 면역 이펙터 세포
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 키메라 항원 수용체(CAR)를 작제하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다.
본원에서 사용된, 용어 "키메라 항원 수용체(CAR)"는, 예를 들어 암세포의 표면에 있는 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편에 의해, 표적(예를 들어, 암 세포의 표면 상에 발현된 항원)을 특이적으로 인식하고 그에 결합하고, 표면에 CAR를 발현하는 세포 (예: 면역 이펙터 세포)에 표적 특이성을 부여할 수 있는 인공 수용체이다. 바람직하게는, CAR에 의한 표적의 인식은 CAR-발현 면역 이펙터 세포의 활성화 및/또는 확장을 초래한다.
일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체는 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, scFv), 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 T 세포 신호 도메인(signal domain)을 포함한다. 이러한 구체예에서, 본 발명은 또한 핵산 분자를 제공하며, 상기 핵산 분자는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 상기 키메라 항원 수용체의 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편(예를 들어, ScFv)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 항체의 항원-결합 단편(예를 들어, ScFv)을 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩한다. 상기 핵산 분자는 단리될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 표면에 본 발명의 CAR를 발현하도록 유전적으로 변형된 면역 이펙터 세포를 제공한다. 바람직하게는, 상기 면역 이펙터 세포는 T 림프구(예를 들어, 세포독성 T 세포(CTL)), 자연 살해 세포(NK) 및 자연 살해 T 세포(NKT)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 면역 이펙터 세포는 넥틴-4-양성 질병 세포(Nectin-4-positive diseased cell)(예: 넥틴-4-양성 암세포)를 표적으로 하고 이펙터 기능을 개시하도록 활성화되어, 예를 들어 넥틴-4-양성 암세포의 사멸을 유발하다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 CAR을 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터, 및 CAR를 발현하는 면역 세포(예를 들어, CTL)에 관한 것이다.
약학적 조성물
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편, 항체 접합체, 조성물, CAR-발현 면역 이펙터 세포, 다중특이성 항체 또는 융합 단백질, 및 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본원에서 제공되는 약학적 조성물은 고체, 반고체, 액체, 분말 또는 동결건조 형태를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 투여 형태(dosage form)일 수 있다.
투여 형태에 따라, 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제는 희석제, 결합제 및 접착제, 윤활제, 붕해제, 보존제, 비히클, 분산제, 유동 촉진제(flow promoting agent), 감미제, 코팅제, 구조- 형성 부형제, 보존제, 항산화제(예: 아스코르브산, 시스테인 염산염, 소듐 비술페이트, 소듐 메타비술피트, 소듐 술피트, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔(BHA), 부틸화 히드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, α-토코페롤, 시트르산, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등), 가용화제, 겔화제, 연화제, 용매(예: 물, 알코올, 아세트산 및 시럽), 완충제(예: 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제 및 아세테이트 완충제), 계면활성제(예: 비이온성 계면활성제, 예를 들면, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 또는 폴리에틸렌 글리콜), 항세균제, 항진균제, 등장화제(예: 트레할로오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 락토오스, 글루코오스), 흡수 지연제, 킬레이트제 및 유화제를 포함할 수 있으나, 그에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 약학적 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 상피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입)에 적합하다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항체 접합체를 포함하는 조성물의 경우, 바람직한 투여 형태는 일반적으로 예를 들어 주사 용액, 동결건조된 분말일 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항체 접합체를 포함하는 조성물의 경우, 적합한 담체 및/또는 부형제는 완충제(예: 시트레이트 완충제, 아세테이트 완충제, 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제, 히스티딘 염 완충제), 등장화제(예: 트레할로오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 락토오스, 글루코오스), 비이온성 계면활성제(예: 폴리소르베이트 80, 폴리 소르베이트 20, 폴록사머) 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
약학적 조성물은 일반적으로 제조 및 저장 조건 하에서 무균이고 안정하다. 활성 물질(예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체 접합체)을 적합한 용매에 원하는 양으로 혼합하고, 필요에 따라 앞서 열거된 담체 및/또는 부형제 중 하나 또는 조합을 첨가한 후 멸균 정밀여과(sterile microfiltration)하여, 멸균 주사 용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 물질을 기본 분산 매질 (basic dispersion medium) 및 앞서 열거된 필요한 기타 성분들을 포함하는 멸균 담체 및/또는 부형제에 혼입(incorporate)시키는 것에 의해 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 사전에 멸균 여과된 그의 용액을 진공 건조 및 동결 건조(동결 건조(lyophilization))하여 임의의 원하는 추가 성분과 조합된 활성 성분의 분말을 수득하는 것을 포함한다.
본원에서 제공되는 약학적 조성물은 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 전신 또는 국소 투여에 의해 개체에게 투여될 수 있다. 투여 경로는 비경구(예: 정맥내, 복강내, 피내, 근육내, 피하 또는 강내), 국소, 경막외 또는 점막(예: 비강, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소) 투여를 포함하나, 그에 한정되지 않는다. 투여되는 정확한 용량은 약학적 조성물의 대사 특성, 치료 기간, 특정 화합물의 배설 속도, 치료의 목적, 투여 경로, 및 환자의 연령, 건강, 체중, 성별, 식이 요법, 병력 및 의학 분야에서 잘 알려진 기타 요인과 같은 개체의 조건과 같은 다양한 인자에 따라 달라질 것이라는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 투여 방법은 예를 들어, 주사 또는 주입일 수 있다.
일반적인 가이드로서, 본 발명의 항체 접합체는 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 보다 전형적으로 0.01 내지 20 mg/kg 개체의 체중의 투여량 범위로 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여 용량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중, 10 mg/kg 체중 또는 20 mg/kg 체중일 수 있거나, 또는 1 내지 20 mg/kg 체중의 범위일 수 있다. 예시적인 요구되는 치료 요법(regimen)은 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 매월 1회, 3개월마다 1회, 3-6개월마다 1회, 또는 약간 단축된 초기 투여 간격 및 연장된 후기 투여 간격일 수 있다. 투여 방식은 정맥내 점적(intravenous drip)일 수 있다.
넥틴-4 관련 질환
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항체 접합체, 면역 이펙터 세포, 다중특이성 항체, 융합 단백질 또는 약학적 조성물, 또는 그로부터 제조된 약제는 질환의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다. 상기 질환은 넥틴-4와 연관된다. 바람직하게는, 상기 질환은 넥틴-4의 비정상적 발현과 연관된다. 용어 "비정상적 발현(abnormal expression)"은 정상 상태의 시료(또는, 표준 시료, 예를 들어, Nectin-4의 비정상적 발현과 연관된 질환을 앓지 않는 개체로부터의 시료) 대비, 시료 중 너무 높거나 또는 너무 낮은 단백질의 발현을 의미한다.
바람직하게는, 상기 질환은 넥틴-4의 높은 발현을 특징으로 한다. 예를 들어, 넥틴-4는 질병(예: 방광암)을 갖거나, 갖는 것으로 의심되는 개체의 조직(예: 방광)에서 높게 발현되고, 넥틴-4는 상기 질환을 갖지 않는 개체의 조직에서는 발현되지 않거나 낮은 수준으로 발현된다.
바람직하게는, 상기 질환은 암이다. 바람직하게는, 암은 위암, 간암, 간세포 암종, 방광암, 요로상피암, 요도암, 신우암, 요도암, 폐암, 비소세포폐암, 유방암, 유관암, 삼중음성 유방암, 췌장암, 난소암, 두경부암, 결장암, 직장암 및 식도암으로 이루어진 군에서 선택된다.
암 치료는 예를 들어, 종양 퇴행의 정도, 종양 중량 또는 크기의 변화, 진행 시간, 생존 시간, 무진행 생존 기간(progression-free survival), 전체 반응률(overall response rate), 반응 기간, 삶의 질, 단백질 발현 및/또는 활성 등에 의해 평가될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
진단 및 치료를 위한 용도
본 발명의 항-넥틴-4 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체 접합체는 넥틴-4와 관련된 질환 및/또는 질병을 검출, 진단 또는 모니터링하기 위한 진단 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공된 항-넥틴-4 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체 접합체는 인 시투(in situ), 인 비보(in vivo), 엑스 비보(ex vivo), 및 인 비트로 진단 분석 또는 이미징 분석에서 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 개체에서 넥틴-4의 발현 수준을 검출하고 및/또는 넥틴-4 발현 세포를 추적하기 위해, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 표지된 항체를 수득하기 위해 하나 이상의 표지에 접합될 수 있다. 그러한 표지된 항체도 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편의 범위 내에 포함된다. 바람직하게는, 표지는 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 형광 염료, 방사성 동위원소, 비오틴 및 콜로이드성 금으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 표지를 항체에 접합시키는 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다.
일 양태에서, 본 발명은 시료에서 넥틴-4의 존재를 검출하거나 또는 그의 발현 수준을 결정하는 방법으로서,
(a) 상기 시료를 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편 또는 표지된 항체와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시료에서 넥틴-4의 존재를 검출하거나 그의 발현을 결정하기 위해, 상기 시료에서 상기 항체 또는 항원-결합 단편과 넥틴-4의 면역 복합체(immune complex)의 형성을 검출하거나 그의 양을 결정하는 단계;를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 개체에서 넥틴-4와 관련된 질환을 진단하는 방법으로서,
(a) 개체의 시료를 수득하는 단계;
(b) 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편 또는 표지된 항체를 이용하여 상기 시료에서 넥틴-4의 발현 수준을 검출하는 단계;
(c) 넥틴-4의 발현 수준을 기준 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계로서, 상기 기준 단백질의 발현 수준 대비 넥틴-4의 발현 수준의 증가 또는 감소는 넥틴--4의 비정상적 발현을 나타내는 것인 단계;를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
상기 기준 단백질은 표준 시료의 넥틴-4일 수 있고, 표준 시료는 예를 들어 넥틴-4의 비정상적 발현과 연관된 질환을 앓지 않는 개체로부터의 시료일 수 있다. 상기 시료는 세포, 조직, 체액과 같은 임의의 형태일 수 있다. 상기 검출은 웨스턴 블롯팅, 유세포 분석, 면역조직화학적 분석(IHC), ELISA 분석을 포함하나 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 질환의 치료 및/또는 예방에서 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항체 접합체, 면역 이펙터 세포, 다중특이성 항체, 융합 단백질 또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 약제의 제조에서 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항체 접합체, 면역 이펙터 세포, 다중특이성 항체, 융합 단백질 또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것으로, 상기 약제는 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 사용되는 것인 용도에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 질환은 본원에 기재된 바와 같은 암이다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항체 접합체, 면역 효과기 세포, 다중특이성 항체, 융합 단백질 또는 약학적 조성물은 본원에 기재된 치료제 중 적어도 하나와 조합하여 투여될 수 있다. 병용 투여의 방식은 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 치료제는 모두 동시에, 또는 별도로 투여될 수 있다. 별도로 투여되는 경우(서로 다른 투여 요법의 경우), 그들은 중단 없이 연속적으로 또는 소정의 간격으로 투여될 수 있다.
치료 방법
본 발명은 또한 필요로 하는 개체에서 넥틴-4와 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 질환은 본원에 기재된 바와 같은 암이다.
상기 방법은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항체 접합체, 조성물, 면역 이펙터 세포, 다중특이성 항체, 융합 단백질 또는 약학적 조성물의 치료 유효량을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 수술, 방사선요법, 화학요법, 표적 요법, 면역요법, 호르몬 요법, 혈관신생 억제, 및 완화 치료(palliative care)로 구성된 군으로부터 선택된 치료 요법을 투여하는 것을 더 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 화학요법제, 방사성 동위원소, 면역 체크포인트 억제제, 다른 항원을 표적으로 하는 항체, 및 기타 항종양 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치료제를 투여하는 것을 더 포함한다. 화학요법제는 예를 들어 항대사물질, 알킬화제, 세포독성제, 토포이소머라아제 억제제, 미세소관 억제제(microtubule inhibitor)를 포함할 수 있다. 다른 항종양 약물은 예를 들어 혈관신생 억제제, 데아세틸라아제(HDAC) 억제제, 헤지호그 신호전달 경로 차단제(Hedgehog signaling pathway blockers), mTOR 억제제, p53/mdm2 억제제, PARP 억제제, 프로테아좀 억제제(예: 보르테조밉, 카르필조밉, 익사조밉, 마리조밉, 오프로조밉) 및 티로신 키나아제 억제제(예: BTK 억제제)를 포함할 수 있다. 화학요법제의 예는 시클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란, 부술판, 클로르메틴, 클로람부실, 로무스틴, 카르무스틴(BCNU), CCNU, 시스플라틴(DDP), 카르보플라틴(CBP), 옥살리플라틴(OXA), 메토트렉세이트(MTX), 6-메르캅토퓨린(6-MP), 5-플루오로우라실(5-FU), 시타라빈, 젬시타빈, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 캄프토테신, 이리노테칸, 토포테칸, 루비테칸, 에토포시드, 테니포시드, 파클리탁셀, 탁산, 도세탁셀, 파클리탁셀 리포솜, 악티노마이신 D, 이다루비신, 독소루비신, 에피루비신, 미토마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 에피루비신을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 면역 체크포인트 억제제는 PD-1, PD-L1, CTLA4, LAG-3, TIM-3 또는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 방사성 동위원소는 예를 들어, 212Bi, 213Bi, 131I, 125I, 111In, 177Lu, 186Re, 188Re, 153Sm, 90Y를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 항체 접합체, 면역 이펙터 세포, 다중특이성 항체, 융합 단백질 또는 약학적 조성물은 화학요법제와 조합하여 사용된다. 일 구체예에서, 상기 화학요법제는 시스플라틴, 옥살리플라틴, 젬시타빈, 시클로포스파미드, 5-플루오로우라실, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체 접합체는 면역 체크포인트 억제제와 조합하여 사용된다. 일 구체예에서, 상기 면역 체크포인트 억제제는 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 항체 접합체, 면역 이펙터 세포, 다중특이성 항체, 융합 단백질 또는 약학적 조성물은 방사성 동위원소와 조합하여 사용된다.
키트
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 항체 접합체, 표지된 항체, 다중특이성 항체, 융합 단백질, 약학적 조성물 또는 면역 이펙터 세포, 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 또한 적절한 용기를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 키트는 투여를 위한 장치를 추가로 포함한다. 전형적으로, 상기 키트는 또한 키트 내의 내용물의 의도된 용도 및/또는 사용 방법을 나타내기 위해 사용되는 라벨을 포함한다. 용어 "라벨(label)"은 키트에 또는 키트와 함께 또는 달리 키트와 함께 제공되는 모든 서면 또는 기록 자료를 포함하도록 의도된다.
유용한 효과
특정 양태에서, 본 발명은 항-넥틴-4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 특히 항-넥틴-4 인간화 단일클론 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 넥틴-4에 대한 높은 친화도를 갖는다: 실시예에서, 넥틴-4에 대한 본 발명의 항체의 결합 친화도를 검출하기 위해 ELISA, 바이오필름 간섭(biofilm interference) 기술 및 유세포 분석과 같은 다양한 방법이 사용되고, 결과는 본 발명의 항-넥틴-4 항체가 인 비트로 정제된 넥틴-4 및 세포 표면 넥틴-4 모두에 대해 높은 친화도를 갖는다는 것을 보여준다. 놀랍게도, 인간화 단일클론 항체 31HZ, 56HZ 및 74HZ의 인간 넥틴-4 및 시노몰구스 원숭이 넥틴-4에 대한 동적 친화도는 모두 선행 기술의 엔포르투맙보다 우수하여 본 발명의 항체가 넥틴-4에 대한 친화도가 더 높다는 것을 나타내고, 이는 항체 31HZ, 56HZ 및 74HZ의 더 높은 세포내 이입 활성(endocytic activity)에 의해 확인된다. 또한, 본 발명의 항체는 넥틴-4에 대해 높은 특이성을 갖는다: 31HZ, 56HZ, 74HZ는 모두 인간 넥틴-4를 특이적으로 인식하나, 넥틴-1, 넥틴-2, 및넥틴-3은 인식하지 못한다. 또한, 본 발명의 항체는 넥틴-4가 넥틴-1에 결합하는 것을 차단하며, 넥틴-4에 대한 31HZ, 56HZ 및 74HZ의 경쟁적 결합 능력은 엔포르투맙에 필적한다.
또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 또한 넥틴-4 양성 세포를 표적으로 할 수 있는 항-넥틴-4 항체 접합체를 제공한다. 본 발명의 항체 접합체는 넥틴-4 양성 세포를 높은 친화도 및 특이성으로 표적화할 수 있으며, 이는 높은 친화도 및 특이성이 오프 타겟(off-target) 독성 효과를 감소시키고, 부작용을 줄일 수 있기 때문에, 암의 치료 또는 인 비보 진단에 매우 유리하다. 실시예도 이 점을 확인한다. 본 발명의 ADC는 인간 넥틴-4를 내생적으로 발현하는 인간 유관암 세포, 인간 위암 세포 및 인간 유방암 세포와 같은 다양한 종양 세포주에 대해 강력한 사멸 활성을 갖는다. 또한, 마우스 비소세포폐암 이종이식 모델에서, 본 발명의 ADC는 상당한 종양 억제 활성을 나타내고 우수한 안전성을 갖는다.
도 1a는 A549-넥틴-4 안정 세포주(A549-Nectin-4 stable cell line)의 유세포 분석 결과를 보여준다.
도 1b는 T24-넥틴-4 안정 세포주의 유세포 분석 결과를 보여준다.
도 2는 항-인간 넥틴-4 마우스 항체의 친화도 검출 결과를 보여준다.
도 3a는 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체 31HZ와 인간 넥틴-4 단백질 간의 친화도에 대한 ELISA 검출 결과를 보여준다.
도 3b는 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체 74HZ와 인간 넥틴-4 단백질 간의 친화도에 대한 ELISA 검출 결과를 보여준다.
도 3c는 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체 56HZ와 인간 넥틴-4 단백질 간의 친화도에 대한 ELISA 검출 결과를 보여준다.
도 3d는 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체 31HZ와 시노몰구스 원숭이 넥틴-4 단백질 간의 친화도에 대한 ELISA 검출 결과를 보여준다.
도 3e는 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체 74HZ와 시노몰구스 원숭이 넥틴-4 단백질 간의 친화도에 대한 ELISA 검출 결과를 보여준다.
도 3f는 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체 56HZ와 시노몰구스 원숭이 넥틴-4 단백질 간의 친화도에 대한 ELISA 검출 결과를 보여준다.
도 4a는 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체 31HZ 및 74HZ의 T47D 세포에 대한 친화도에 대한 유세포 분석 결과를 보여준다.
도 4b는 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체 56HZ의 NCI-N87 세포에 대한 친화도에 대한 유세포 분석 결과를 보여준다.
도 5a는 T47D 세포에 대한 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체 31HZ 및 74HZ의 세포내 이입 활성을 검출한 결과를 보여준다.
도 5b는 MDA-MB-468 세포에 대한 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체 31HZ 및 74HZ의 세포내 이입 활성을 검출한 결과를 보여준다.
도 5c는 A549-넥틴-4 세포에 대한 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체 31HZ 및 74HZ의 세포내 이입 활성을 검출한 결과를 보여준다.
도 5d는 T24-넥틴-4 세포에 대한 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체 56HZ의 세포내 이입 활성을 검출한 결과를 보여준다.
도 6a는 인간 넥틴-4 도메인을 인식하는 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체 31HZ 및 74HZ의 검출 결과를 보여준다.
도 6b는 인간 넥틴-4 도메인을 인식하는 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체 56HZ의 검출 결과를 보여준다.
도 7a는 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체 31HZ 및 74HZ의 경쟁 활성의 검출 결과를 보여준다.
도 7b는 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체 56HZ의 경쟁 활성의 검출 결과를 보여준다.
도 8a는 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체 31HZ의 특이성의 검출 결과를 보여준다.
도 8b는 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체 74HZ의 특이성의 검출 결과를 보여준다.
도 8c는 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체 56HZ의 특이성의 검출 결과를 보여준다.
도 9a는 A549-넥틴-4 세포를 사멸시키는 항-인간 넥틴-4 ADC 31HZ-TL001 및 74HZ-TL001의 결과를 보여준다.
도 9b는 A549 세포를 사멸시키는 항-인간 넥틴-4 ADC 31HZ-TL001 및 74HZ-TL001의 결과를 보여준다.
도 9c는 T24-넥틴-4 세포를 사멸시키는 항-인간 넥틴-4 ADC 31HZ-TL001 및 56HZ-TL001의 결과를 보여준다.
도 9d는 T24 세포를 사멸시키는 항-인간 넥틴-4 ADC 31HZ-TL001 및 56HZ-TL001의 결과를 보여준다.
도 10a는 T47D 세포를 사멸시키는 항-인간 넥틴-4 ADC 31HZ-TL001 및 74HZ-TL001의 결과를 보여준다.
도 10b는 MDA-MB-468 세포를 사멸시키는 항-인간 넥틴-4 ADC 31HZ-TL001 및 74HZ-TL001의 결과를 보여준다.
도 10c는 NCI-N87 세포를 사멸시키는 항-인간 넥틴-4 ADC 31HZ-TL001 및 56HZ-TL001의 결과를 보여준다.
도 11은 NOD/SCID 마우스의 피하 NCI-H322M 세포 이종이식 종양 모델에서 시간 경과에 따른 마우스의 각 그룹의 종양 부피의 변화를 보여준다.
도 12는 NOD/SCID 마우스의 피하 NCI-H322M 세포 이종이식 종양 모델에서 시간 경과에 따른 마우스의 각 그룹의 체중의 변화를 보여준다.
도 13은 NOD/SCID 마우스의 피하 HuPrime® 위암 BL9200 PDX 모델에서 시간 경과에 따른 마우스의 각 그룹의 종양 부피의 변화를 보여준다.
도 14는 NOD/SCID 마우스의 피하 HuPrime® 위암 BL9200 PDX 모델에서 시간 경과에 따른 마우스의 각 그룹의 체중의 변화를 보여준다.
하기 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 따라서 어떠한 방식으로도 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 하기 실시예에서, 구체적인 조건이 없는 실험 방법은 통상적인 방법 및 조건에 따라, 또는 제품 설명서에 따라 수행하였다.
실시예 1: 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체의 제조
1.1 인간 넥틴-4 과발현 세포주의 구축
인간 넥틴-4 항체의 특이성과 기능을 검증하기 위해, 인간 넥틴-4(Uniprot ID: Q96NY8-1)의 완전한 코딩 서열(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd.에서 합성함)을 렌티바이러스 벡터 pLVX-IRES-puro에 클로닝하고, 문헌(Mohammadi Z et al., Mol Biotechnol. 2015 Sep; 57(9): 793-800)에 기재된 렌티바이러스 패키징 시스템에 의해 바이러스를 제조하고, 수득된 바이러스를 이용하여 A549 비소세포폐암세포(ATCC) 및 T24 인간 방광 이행세포 암종 세포(ATCC)를 각각 감염시키고, 퓨로마이신 스크리닝과 단일클론 선택을 통해, 인간 넥틴-4를 과발현하는 단일클론 A549-넥틴-4 안정 세포주(stable cell line) 및 T24-넥틴-4 안정 세포주를 수득했다.
1.2 인간 넥틴-4 과발현 세포주의 검출
유세포 분석법(유세포 분석기: Beckman, CytoFlex; 검출 항체 국제 특허 출원 공개 번호: WO2012/047724에 표시된 서열을 갖는, 엔포르투맙(Enfortumab))에 의해 A549-넥틴-4 및 T24-넥틴-4 안정 세포주를 식별했고, 유세포 분석법상기 세포들이 인간 넥틴-4를 올바르게 발현했다는 것을 확인했다. 도 1a 및 1b에서 볼 수 있듯이, 유세포 분석 결과는 A549-넥틴-4 및 T24-넥틴-4가 모두 높은 양성률(100%에 가까움)을 갖는다는 것을 보여주어, A549-넥틴-4 및 T24-넥틴-4가 모두 후속 실험에서 사용될 수 있는 충분히 균질한(well-homogenous) 안정한 세포주라는 것을 나타냈다.
1.3 항-인간 넥틴-4 마우스 단일클론 항체의 제조
야생형 마우스를 단백질 면역화에 의해 면역화하여 항-인간 넥틴-4 마우스 단일클론 항체를 얻었다. 완전 프로인트 아주반트(CFA)로 에멀젼화된 인간 넥틴-4 단백질(Sino Biological, Cat: 19771-H08H)을 사용하여 각각 5-6주령의 2마리의 Balb/c 및 2마리의 C57 마우스를 면역화시켰다. 구체적으로, 50㎍의 단백질을 사용하여 피하 1차 면역화를 수행하고, 그 후, 25㎍의 불완전 프로인트 애쥬번트(IFA)로 에멀젼화된 넥틴-4 단백질을 사용하여 2주마다 복강내 추가 면역을 수행하고, 3회의 부스터 후에, 5x106 개의 넥틴-4-내생적 발현 종양 세포 T47D(인간 유관암 세포의 일종)를 사용하여 최종 복강내 부스터를 수행하고, 3-5일 후에 비장 세포를 채취하여 하이브리도마 융합을 수행하였다. 마우스 비장 세포를 표준 융합 절차(standard fusion procedure)를 이용하여 PEG에 의해 Sp2/0(ATCC, Cat# CRL-1581) 마우스 골수종 세포주와 융합시키고, HAT를 사용하여 가압 스크리닝(pressurization screening)을 수행하고, 10-14일 후에 ELISA 스크리닝을 수행하여, 넥틴-4 단백질에 결합하는 약 200개의 양성 클론을 수득했다. 유세포 분석에 의한 추가 스크리닝을 통해, T47D 종양 세포를 인식할 수 있는 3개의 양성 하이브리도마 클론을 서브클로닝을 위해 수득하고, 최종적으로, 제한 희석법(limiting dilution method)으로 서브클론 분류(subclonal sorting)를 수행하여 단일클론을 수득했으며, 그들의 번호는 각각 31#, 56#, 74#이었다.
1.4 항-인간 넥틴-4 마우스 항체의 친화도 검출
인간 넥틴-4에 대한 후보 분자의 친화도를 ELISA 방법으로 검출하였다. 하이브리도마 단일클론 31#, 56# 및 74#를 무혈청 배양하여 3-10mL의 상층액을 수득하고, Protein A(MabSelect SuRe, GE)로 정제하여 마우스 항체를 얻었다.
하이브리도마 세포주 31#, 56# 및 74#의 배양 상층액으로부터 단리되고 정제된 마우스 단일클론 항체의 친화도를 ELISA에 의해 결정하였다. Human Nectin-4(Sino Biological, Cat: 19771-H08H)를 탄산염(CBS) 완충액으로 1㎍/mL까지 희석하고, 96-웰 플레이트에 100㎕/웰의 부피로 첨가하고, 16-20시간 동안 4℃에 두었다. 96-웰 플레이트의 CBS 완충액을 피펫팅에 의해 버리고, 플레이트를 PBST(pH 7.4, 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS) 완충액으로 1회 세척하고, 2% 탈지 분유(skim milk powder)를 포함하는 PBST(블로킹(blocking) 용액)를 200㎕/웰로 첨가하고, 블로킹을 위해 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 블로킹 용액을 제거하고 플레이트를 PBST 완충액으로 3회 세척하였다. 테스트할 항-넥틴-4 마우스 항체를 PBST/2% 탈지분유로 적정 농도로 희석한 후 100 ㎕/웰의 부피로 플레이트에 첨가하고 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 시스템(reaction system)을 제거하고, 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, PBST/1% 탈지분유로 희석한(희석비 1:5000) HRP 표지 염소 항-마우스 IgG 2차 항체(Jackson Laboratory에서 구입) 50㎕/웰을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 PBST로 3회 세척한 후, 100㎕/웰의 TMB를 첨가하고, 발색을 위해 실온에서 5-10분 동안 인큐베이션시켰다. 50㎕/웰의 0.2M 황산을 첨가하여 발색을 중단시켰다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 광학 밀도(OD)를 이중 파장 450/620 nm에서 검출했다.
검출 결과가 도 2 및 표 3에 표시되었다. 모든 3종의 항-인간 넥틴-4 마우스 항체는 30 내지 70pM 범위의 EC50으로 인간 넥틴-4 단백질에 높은 친화도로 결합할 수 있었다.
표 3: 항-인간 넥틴-4 친화도 검출
클론 No. EC50 (pM)
31# 54.95
56# 36.33
74# 69.39
1.5 항-넥틴-4 마우스 단일클론 항체의 가변 영역 증폭
하이브리도마 세포를 약 8,000-10,000개의 세포까지 배양한 후, 세포를 용해시키고, cDNA 역전사 키트(Thermo Fisher Sci. Cat# 18080-200)를 사용하여 제1 가닥 cDNA를 합성했다. 프라이머를 사용하여 VH 및 VK 유전자를 cDNA로부터 PCR에 의해 증폭시키고, PCR 산물을 DNA 정제 키트(Qiagen, Cat#28104)로 정제하고, PUC57 벡터에 라이게이션시켰다. 각각의 라이게이션 반응에 대해 약 5개의 클론을 선택하고 시퀀싱했다. 벡터 NTI 11.5(Thermo Fisher Sci.) 및 시퀀서 5.4.6(Genecodes)에 의해 서열을 분석했다. 항-인간 넥틴-4 마우스 항체의 가변 영역 서열 및 CDR 서열은 IMGT 및 abYsis를 통해 수득하였고, 하기 표 4에 표시했다.
표 4: 항-인간 넥틴-4 마우스 항체의 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열
클론 No. VH VL 넘버링 시스템 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3
31# 1 2 Chothia 3 4 5 6 7 8
Abm 9 10 5 6 7 8
Kabat 11 12 5 6 7 8
IMGT 13 14 15 16 17 8
56# 19 20 Chothia 21 22 23 24 25 26
Abm 27 28 23 24 25 26
Kabat 29 30 23 24 25 26
IMGT 31 32 33 34 35 26
74# 37 38 Chothia 39 40 41 42 43 8
Abm 45 46 41 42 43 8
Kabat 47 48 41 42 43 8
IMGT 49 50 51 52 53 8
비교(note): VH, VL, CDR-H1, CDRH2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 열의 숫자는 그들의 해당하는 서열번호를 나타내고, 예를 들어 항체 31#의 경우, 그의 VH는 서열번호 1에 해당하고, 그의 VL은 서열번호 2에 해당한다.
1.6 항-인간 넥틴-4 마우스 항체의 인간화
마우스 항체 31#, 56#, 및 74#를 CDR-그라프팅(grafting)에 의해 인간화시켰다. 요약하면, 인간화는 하기 단계를 포함했다: 마우스 단일클론 항체의 아미노산 서열을 인간 생식계열 항체의 아미노산 서열과 정렬하여 높은 상동성과 더 나은 물리화학적 특성을 갖는 서열을 인간 생식계열 프레임워크 서열로 찾고; HLA-DR 친화도를 분석 및 조사하고, 낮은 친화도를 갖는 인간 생식계열 프레임워크 서열을 선택하고, 그 후, 마우스 항체의 6개의 CDR을 각각 선택된 중쇄 및 경쇄 프레임워크 서열에 이식하였다.
또한, 컴퓨터 시뮬레이션 기술을 이용하고, 분자 도킹(molecular docking)을 이용하여 가변 영역 및 그의 주변 영역의 프레임워크 아미노산 서열을 분석하고, 이들의 공간적 3차원 결합 방식을 조사하였다. 정전기력, 반 데르 발스 힘, 친수성 및 소수성, 엔트로피 값을 계산하여, 넥틴-4 단백질과 상호 작용하고 공간적 프레임워크를 유지할 수 있는 마우스 항체 아미노산 서열의 주요 아미노산을 분석하고 이러한 마우스 아미노산을 이식된 항체에 유지시켰다. 즉, 인간화 항체에서 마우스 항체의 항원 결합능을 최대한 유지하기 위해, 인간화 주형(humanized template)의 FR 영역의 아미노산 잔기에 일련의 역-돌연변이(back-mutation)를 수행하였다.
전술된 방법에 따라, 마우스 항체 31#, 56# 및 74#의 CDR을 기반으로 인간화 항체를 구축하고, 각각 31HZ, 56HZ 및 74HZ로 명명하였고; 이때, 각 항체의 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역(서열 번호: 61)이었고, 각 항체의 경쇄 불변 영역은 인간 κ 경쇄 불변 영역(서열 번호: 62)이었다. 제작된 인간화 항체 31HZ, 56HZ 및 74HZ의 경쇄 CDR 아미노산 서열은 각각 31#, 56# 및 74#의 경쇄 CDR과 동일했다. 제작된 인간화 항체 31HZ, 56HZ 및 74HZ의 중쇄 CDR의 아미노산 서열이 표 5.1에 표시되었다:
표 5.1: 항-인간 넥틴-4 인간화 항체의 중쇄 CDR의 아미노산 서열
CDRH 그룹 넘버링 시스템 CDR-H1
(서열번호 ) 		CDR-H2
(서열번호 ) 		CDR -H3
(서열번호 )
56HZCDRH-a Chothia GYFNSITSDY (18) SFSGR (22) GNYDGFDY (23)
56HZCDRH-b Abm GYFNSITSDYDWH (36) YISFSGRTY (28)
56HZCDRH-c Kabat ITSDYDWH (44) YISFSGRTYYNPSLKS (30)
56HZ CDRH-d IMGT GYFNSITSDYD (54) ISFSGRT (32) ARGNYDGFDY (33)
31HZ CDRH-a Chothia GYTFTDY (3) HPSDSE (4) WDFRIYYAMDY (5)
31HZ CDRH-b Abm GYTFTDYWMN (9) MIHPSDSETR (10)
31HZ CDRH-c Kabat DYWMN (11) MIHPSDSETRLNQKFQG (63)
31HZ CDRH-d IMGT GYTFTDYW (13) IHPSDSET (14) ARWDFRIYYAMDY (15)
74HZ CDRH-a Chothia GYTFINY (39) HPSDSA (40) WGNFYTVNAWYYFDY (41)
74HZ CDRH-b Abm GYTFINYWMN (45) MIHPSDSATR (46)
74HZ CDRH-c Kabat NYWMN (47) MIHPSDSATRLNQSFQG(64)
74HZ CDRH-d IMGT GYTFINYW (49) IHPSDSAT (50) ARWGNFYTVNAWYYFDY (51)
또한, 인간화 항체 31HZ, 56HZ 및 74HZ의 가변 및 불변 영역의 아미노산 서열이 표 5.2에 표시되었다:
표 5.2: 항-인간 넥틴-4 인간화 항체의 가변 및 불변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00018
1.7 항-인간 넥틴-4 인간화 항체의 제조
전술된 항-인간 넥틴-4 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 코돈 최적화에 의해 합성하고 플라스미드 ptt5에 라이게이션시켰다(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd.에 위탁). 중쇄 및 경쇄에 상응하는 플라스미드를 동시에 CHO-E 세포에 형질감염시키고, 상층액을 Protein A(MabSelect SuRe, GE)로 정제하여 항-인간 넥틴-4 인간화 항체를 수득했다.
실시예 2: 항-인간 넥틴 -4 인간화 단일클론 항체의 친화도 검출
2.1 상이한 종의 넥틴-4 단백질에 대한 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체의 친화도 검출
상이한 종의 넥틴-4 단백질에 대한 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체의 친화도를 ELISA에 의해 검출하였다. 구체적인 단계는 하기와 같았다: 인간 넥틴-4 또는 시노몰구스 원숭이 넥틴-4 항원을 CBS 코팅 용액(0.32g Na2CO3 및 0.59g NaHCO3를 칭량하고, 탈이온수에 용해시키고 200 mL로 만듬)으로 1 ㎍/mL까지 희석하고, ELISA 플레이트에 웰당 100㎕로 코팅하고 4℃에서 밤새 방치하였다; 다음 날, 웰의 액체를 버리고 300㎕의 PBS로 1회 세척하고; 100㎕의 PBS(2% BSA 함유, BOVOGEN으로부터 구입, Cat. No. BSAS 1.0)를 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 블로킹시켰다; 31HZ, 56HZ, 74HZ 및 엔포르투맙 항체를 PBS(2% BSA 함유)로 희석하고(1500ng/mL에서 시작, 3배 희석, 11개 농도 포인트), 100㎕를 취하여 상응하는 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시키고; 300㎕의 PBST로 3회 세척하고; HRP 표지 염소 항-인간 2차 항체(Jackson 구매, 109-035-00)를 PBS(2% BSA 함유)로 1:10000으로 희석하고, 100㎕를 취하여 상응하는 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키고; 300㎕의 PBST로 5회 세척하고; TMB 발색 용액(InnoReagents에서 구입, TMB-S-004) 100㎕를 해당 웰에 첨가하고, 실온에서 5-20분 동안 발색을 수행하였다; 중지를 위해 50 ㎕의 2 N H2SO4를 첨가하고, OD450 nm 판독값을 마이크로플레이트 판독기(MD, SpectraMax M2에서 구입)에서 수집하고 곡선 맞춤(curve fitting)을 위해 Graphpad Prism으로 불러왔다.
실험 결과가 도 3a 내지 3f 및 표 6에 표시되며, 인간 넥틴-4 단백질 및 시노몰구스 원숭이 넥틴-4 단백질에 대한 31HZ의 친화도가 엔포르투맙의 친화도보다 더 우수했고; 인간 넥틴-4 단백질 및 시노몰구스 원숭이 넥틴-4 단백질에 대한 56HZ 및 74HZ의 친화도는 기본적으로 엔포르투맙의 친화도와 유사하다는 것을 나타냈다.
표 6: 상이한 종의 넥틴-4 단백질에 대한 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체의 친화도 검출
항체 명칭 EC50 (ng/mL)
인간 넥틴-4 단백질 시노몰구스 원숭이 넥틴-4 단백질
31HZ 3.60 4.45
56HZ 9.48 9.85
74HZ 8.34 6.73
엔포르투맙 7.10±2.00 (n=3) 6.00±0.66 (n=3)
2.2 상이한 종의 넥틴-4 단백질에 대한 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체의 동적 친화도의 검출
항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체의 동적 친화도(dynamic affinity)는 Octet Fortebio®를 사용하여 검출하였다. 주요 단계는 하기를 포함했다: 먼저 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체(농도 5㎍/mL)를 ProA 센서에 고정화하고, 인간 또는 시노몰구스 원숭이 넥틴-4(400nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 0 nM로 점진적으로 희석됨)와 결합 반응에 적용하고, 완전 반응을 통해 수득된 고상의 고정된(anchored) 산물을 PBST 완충액에서 해리 반응에 적용시켰다. 실험의 종료 후, Data Analysis 11.0 소프트웨어를 이용하여 1:1 모드로 결과를 분석하여 글로벌 피팅(global fitting)을 수행하고, 그에 의해 항원에 대한 항체의 친화도 상수를 구하였다.
실험 결과를 표 7에 표시했다. 인간 넥틴-4 단백질과 시노몰구스 원숭이 넥틴-4 단백질에 대한 31HZ, 56HZ 및 74HZ의 동적 친화도는 엔포르투맙의 동적 친화도보다 우수했다.
표 7: 상이한 종의 넥틴-4 단백질에 대한 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체의 동적 친화도 검출
항체 명칭 KD (x 10-9 M)
인간 넥틴-4 단백질 시노몰구스 원숭이 넥틴-4 단백질
31HZ 22.50 14.50
56HZ 19.60 18.40
74HZ 12.10 9.540
엔포르투맙 28.30±2.90 (n=2) 33.60±3.50 (n=2)
2.3 종양 세포 막 표면에서 인간 넥틴-4에 대한 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체의 친화도 검출
T47D 세포를 이용하여 세포막 표면의 인간 넥틴-4에 대한 31HZ 및 74HZ의 친화도를 검출하였다. 구체적인 단계는 하기와 같았다: T47D 세포를 분해시키고(digest), 원심분리에 의해 재현탁시키고, PBS로 2회 세척했다; 세포를 PBS(1% BSA 함유)에 재현탁시키고, 웰당 50㎕의 부피로 3×105개 세포/웰로 96-웰 팁-바닥 플레이트(96-well tip-bottom plate)에 도말(spread)했다; 최종 농도 15㎍/mL에서 시작하여, 4배 구배 희석으로 총 10개 농도로, 테스트할 항체 50㎕를 각 웰에 첨가하고;인간 IgG를 음성 대조군으로 이용했다; 잘 혼합한 후, 결과적으로 수득된 혼합물을 암소에서 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다; PBS로 3회 세척하고, FITC-표지 항-인간 Fc 2차 항체(브랜드: BioLegend, 제품 번호: 409322)를 첨가하고, 암소에서 4℃에서 0.5시간 동안 인큐베이션하였다; PBS로 3회 세척하고 유세포 분석기(flow cytometer)(유세포 분석기 브랜드: Beckman, 모델: Cytoflex)를 이용하여 검출을 수행하였다.
동일한 방법을 이용하여, NCI-N87 세포(인간 위암 세포의 일종, ATCC) 막 표면에서 인간 넥틴-4에 대한 56HZ의 친화도를 검출했다. 항체는 3.33㎍/mL에서 시작하여, 3배 희석물로 총 10개 농도였다.
실험 결과가 도 4a, 4b 및 표 8에 표시되며, 세포 막 표면의 넥틴-4에 대한 31HZ 및 56HZ의 친화도가 엔포르투맙의 친화도와 유사하다는 것을 나타냈다.
표 8: 종양 세포 막 표면에서 인간 넥틴-4에 대한 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체의 친화도 검출
항체 명칭 EC50 (ng/mL)
T47D NCI-N87
31HZ 12.29 /
56HZ / 16.39
74HZ 22.28 /
엔포르투맙 10.11 22.07
비고: /: 미 검출(not detected).
실시예 3: 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론항체의 세포내 이입 활성 검출
항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체의 세포내 이입 활성(endocytic activity)을 유세포 분석에 의해 검출하였다. 구체적인 단계는 하기와 같았다: T47D, MDA-MB-468(인간 유방암 세포의 일종, ATCC) 또는 A549-넥틴-4 세포를 트립신으로 분해하고 계수하고, 세포를 PBS(1% BSA 함유)에 재현탁시키고, 세포 밀도를 3 x 106/mL로 조정하고; 테스트할 31HZ, 56HZ 또는 74HZ 항체를 100 ㎕의 재현탁된 세포에 최종 농도 10 ㎍/mL로 첨가하고, 이소형 인간 IgG를 음성 대조군으로 사용하고, 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다; 인큐베이션 후 미리 냉각시킨 PBS로 3회 세척한 후, 세포를 세포 배양 배지에 재현탁시키고, 두 부분으로 나누고, 한 부분은 37℃ 세포 인큐베이터에 넣고, 1시간, 2시간, 및 4시간 동안 인큐베이션시키고(세포내 이입(endocytosis) 그룹), 나머지 부분은 얼음에서 1시간, 2시간, 및 4시간 동안 인큐베이션시키고(친화도 그룹); 인큐베이션 후 미리 냉각시킨 PBS로 3회 세척하고, 세포를 50 ㎕ PBS(1% BSA 함유)로 재현탁시키고, 항-인간 형광 2차 항체(BioLegend)를 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다; 인큐베이션 후, 미리 냉각시킨 PBS로 3회 세척하고, 세포 상의 형광 신호(MFI (Mean Fluorescent Intensity)로 표시)를 유세포 분석기(Beckman)로 검출하고, 항체 세포내 이입율 (endocytosis rate)을 하기 식에 따라 계산했다:
세포내 이입율 (%) = [1 - (MFI37℃에서의 항체 그룹 - MFI37℃에서의 대조군)/(MFI얼음에서의 항체 그룹 - MFI얼음에서의 대조군)] × 100%.
동일한 방법으로 T24-넥틴-4 세포에 대한 56HZ의 세포내 이입 활성을 검출하였다.
실험 결과가 도 5a 내지 5d에 표시되며, 이는 31HZ, 56HZ 및 74HZ의 세포내 이입 활성이 엔포르투맙의 활성보다 우수하다는 것을 나타냈다.
실시예 4: 인간 넥틴-4에 대한 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체의 결합 도메인의 검출
인간 넥틴-4는 1개의 IgV 도메인과 2개의 IgC 도메인을 포함하다. 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체의 결합 도메인을 결정하기 위해, 넥틴-4 IgV 도메인을 과발현하는 A549 안정 세포주, A549-넥틴-4-IgV 및 넥틴-4의 2개의 IgC 도메인을 과발현하는 A549 안정 세포주, A549-넥틴-4-IgCC를 구축하고, 테스트 대상 항체의 결합 도메인을 유세포 분석으로 검출하였다. 구체적인 단계는 하기와 같았다: A549-넥틴-4-IgV 및 A549-넥틴-4-IgCC 세포를 분해하고, 원심분리에 의해 재현탁시키고, PBS로 2회 세척하였다; 세포를 PBS(1% BSA 함유)로 재현탁시키고, 300,000개 세포/웰로 96-웰 팁-바닥 플레이트에 웰당 50㎕를 도말했다; 40㎍/mL의 최종 농도에서 테스트 대상 항체 50㎕를 각 웰에 첨가하고, 인간 IgG를 음성 대조군으로 이용하였다; 잘 혼합한 후, 결과적으로 수득된 혼합물을 암소에서 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다; PBS로 3회 세척하고, FITC-표지 항-인간 Fc 2차 항체(브랜드: BioLegend, 제품 번호: 409322)를 첨가하고, 암소에서 4℃에서 0.5시간 동안 인큐베이션시켰다; PBS로 3회 세척하고 유세포 분석기(유세포 분석기 브랜드: Beckman, 모델: Cytoflex)를 이용하여 검출을 수행하였다.
실험 결과가 도 6a 및 도 6b에 표시되며, 이는 31HZ, 56HZ, 74HZ 및 엔포르투맙이 인간 넥틴-4의 IgV 도메인에만 결합하고, IgC 도메인에는 결합하지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 5: 항-인간 넥틴-4 인간화 단클론항체의 경쟁 활성의 검출
인간 넥틴-4는 IgV 도메인을 통해 다른 넥틴-4 분자 또는 넥틴-1 분자에 연결된다. 31HZ, 56HZ, 및 74HZ는 모두 넥틴-4의 IgV 도메인에 결합하기 때문에, 3개의 항체의 경쟁 활성(competitive activity)을 경쟁적 ELISA에 의해 검출하였다. 구체적인 단계는 하기와 같았다: 넥틴-4 단백질을 CBS 코팅 용액, 웰당 100㎕로 2㎍/mL로 희석하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다; 300㎕ PBST로 1회 세척을 수행하고, 그 후, PBS(2% BSA)를 웰당 100㎕ 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션을 수행했다; 비오틴-표지 넥틴-1-hFc를 PBS(2% BSA)로 20㎍/mL로 희석했다; 검출 대상 항체를 PBS(2% BSA)로 희석했고, 이때, 31HZ 및 74HZ의 희석은 3.73㎍/mL에서 시작하여, 3배 희석으로 9개 농도로, 56HZ의 희석은 1.25㎍/mL에서 시작하여, 2배 희석으로 10개의 농도로 준비했다; 전술된 2개의 희석물을 동일한 부피로 잘 혼합하고, 해당 웰에 100 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션을 수행했다; 세척은 300 ㎕ PBST로 3회 수행했다; HRP-스트렙타비딘을 PBS(2% BSA)로 1:10000의 비율로 희석하고, 해당 웰에 100㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다; 300 ㎕의 PBST로 세척을 5회 수행했다; 해당 웰에 100㎕의 TMB를 첨가하고, 실온에서 10분 동안 발색을 수행하고, 50㎕의 2N H2SO4 50㎕를 첨가하여 종결시키고, 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 450nm에서 판독값을 수집했다.
실험 결과가 도 7a 및 7b에 표시되며, 31HZ, 56HZ 및 74HZ가 인간 넥틴-4의 인간 넥틴-1으로의 결합을 경쟁적으로 억제할 수 있고, 이들의 경쟁 IC50 값은 각각 27.62 ng/mL, 26.90 ng/mL, 및 27.22 ng/mL이고, 엔포르투맙 (27.11 ng/mL)에 필적했다는 것을 나타냈다.
실시예 6: 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체의 특이성 검출
넥틴 패밀리는 넥틴-1, 넥틴-2, 넥틴-3 및 넥틴-4의 구성원을 포함하며, 구성원은 약 25%의 서열 동일성을 공유하나, 유사한 구조와 기능을 갖는다. 본 발명의 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체가 넥틴-4만 인식하고 넥틴-1, 넥틴-2, 및 네틴-3은 인식하지 못하는지 여부를 확인하기 위하여, 테스트 대상 항체의 특이성을 ELISA로 검출했다. 구체적인 단계는 하기와 같았다: 인간 넥틴-1, 넥틴-2, 넥틴-3 및 넥틴-4 항원을 CBS 코팅 용액으로 1 ㎍/mL로 희석하고, ELISA 플레이트에 웰당 100 ㎕로 코팅하고, 4℃에서, 밤새 방치하였다; 다음 날, 웰 내의 액체를 버리고, 300 ㎕의 PBS로 1회 세척을 수행하였다; 100㎕의 PBS(2% BSA 함유)를 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 블로킹을 수행하였다; 31HZ, 56HZ, 74HZ 및 엔포르투맙 항체를 PBS(2% BSA 함유)로 희석하고, 100 ㎕를 취하여 해당 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다; 300㎕의 PBST로 세척을 3회 수행하였다; HRP-표지 염소 항-인간 2차 항체를 PBS(2% BSA 함유)로 1:10000의 비율로 희석하고, 100 ㎕을 취하여 해당 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션을 수행하였다; 300 ㎕의 PBST로 세척을 5회 수행하였다; 100 ㎕의 TMB 발색 용액을 해당 웰에 첨가하고, 실온에서 5-20분 동안 발색을 수행하였다; 정지를 위해 50㎕의 2N H2SO4를 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 OD450 nm에서 판독값을 수집하고, 곡선 피팅을 위해 데이터를 Graphpad Prism으로 불러들였다.
실험 결과가 도 8a, 8b, 및 8c에 표시되며, 이는 31HZ, 56HZ 및 74HZ가 모두 인간 넥틴-4를 특이적으로 인식하나, 넥틴-1, 넥틴-2 및 넥틴-3을 인식하지 못한다는 것을 보여주었다.
실시예 7: 항-인간 넥틴-4 ADC의 제조
TL001을 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체와 커플링시켜 항-인간 넥틴-4 ADC를 제조했고, TL001의 구조는 하기 식 (1)로 표시된다:
Figure pct00019
식 (1)
TL001의 제조 방법은 WO2019/114666을 참조할 수 있으며, 그의 관련 내용은 참조에 의해 그 전체가 본원에 포함된다.
항-인간 넥틴-4 항체 접합체(항-인간 넥틴-4 ADC)의 제조 방법은 하기와 같았다:
(1) 커플링(coupling): 30 mg의 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체를 취하여 희석제(20 mM PB+105 mM NaCl, pH 7.7)로 희석하고 최종 농도 5mM의 소듐 에데테이트(sodium edetate) 용액을 첨가하고, 잘 혼합했다; TCEP 용액(TCEP 대 항체의 몰비는 4.4:1임)을 첨가하고, 잘 혼합하고, 실온에서 30분 동안 정치시켰다; 전술된 용액계(solution system)에 디메틸설폭시드에 용해시킨 TL001(TL001 대 항체의 몰비는 9:1임)을 첨가하고, 잘 혼합하고, 실온에서 2시간 동안 정치시켜 커플링된 시료를 수득하고, 각각 31HZ-TL001, 56HZ-TL001, 74HZ-TL001 및 엔포르투맙-TL001로 명명했다. 항-인간 넥틴-4 ADC에 완충액 교환을 적용한 후, 4℃에서 분취액(aliquot)으로 보관하였다.
(2) 검출:
항-인간 넥틴-4 ADC의 분자량을 하기 조건에서 LC-MS로 분석하였다:
크로마토그래피 조건:
액체 크로마토그래피 컬럼: Thermo MAbPac RP 3.0 x 100 mm;
이동상 A: 0.1% FA/98% H2O/2% ACN;
이동상 B: 0.1% FA/2% H2O/98% ACN;
유속: 0.25 mL/분; 샘플 챔버 온도: 8℃; 컬럼 온도: 60℃; 샘플 크기: 1 ㎕
Figure pct00020
스위칭 밸브: 0-3분 내지 폐기(waste), 3-22분 내지 MS, 22-30분 내지 폐기
질량 분석 조건:
질량 분석기 모델: AB Sciex Triple TOF 5600+;
파라미터: GS1 35; GS2 35; CUR 30; TEM 350; ISVF 5500; DP 200; CE 10; m/z 600-4000; Time bins to sum 40.
커플링된 항-인간 31HZ-TL001의 경쇄 및 중쇄(중쇄는 주요 당사슬 (main glyform) G0F에 의해 계산됨)의 이론적 분자량 및 측정된 분자량이 하기 표에 표시되었다:
Figure pct00021
31HZ-TL001의 경쇄는 0 내지 1개의 독소와 커플링되었고(LC 및 DAR1의 비율은 각각 0.1% 및 99.9%), 중쇄는 0 내지 4개의 독소와 커플링되었으며 (HC, DAR1, DAR2, DAR3 및 DAR4의 비율은 각각 0.0%, 2.0%, 10.2%, 86.1%, 1.8%), 따라서, 항체에 대한 독소의 약물-항체 비율(DAR)은 계산 공식에 따라 7.75로 계산되었다: DAR = 경쇄 DAR1 × 2 + 중쇄(DAR1 × 1 + DAR2 × 2 + DAR3 × 3 + DAR4 × 4) × 2.
동일한 방법을 이용하여, 56HZ-TL001, 74HZ-TL001 및 엔포르투맙-TL001의 검출된 DAR 값은 각각 7.71, 7.98 및 8.01이었다.
전술된 질량 분광의 분석 결과에 따르면, 항-인간 넥틴-4 ADC의 구조는 하기와 같이 결정되어야 하다:
Figure pct00022
식 중에서, A는 항-인간 넥틴-4 인간화 단일클론 항체를 나타내고; γ는 A의 티올기와 티오에테르 결합을 형성하여 A에 연결된 TL001의 갯수를 나타내며, 1 내지 10의 정수이다.
엔포르투맙-VC-MMAE는 VC-MMAE와 엔포르투맙을 커플링하여 제조하였다. 제조 및 검출 방법은 전술한 바와 같으며, 항체 대 VC-MMAE의 몰비는 1:5였다. 엔포르투맙-VC-MMAE의 이 배치(batch)의 DAR 값은 5.09 이었다.
실시예 8: 인간 넥틴-4의 고발현을 갖는 종양 세포주에 대한 항-인간 넥틴-4 ADC의 사멸 활성 검출
인간 넥틴-4의 높은 발현을 갖는 세포주에 대한 31HZ-TL001, 74HZ-TL001 및 엔포르투맙-TL001의 사멸 활성을 검출하기 위해 A549-넥틴-4 안정 세포주를 선택하였다. 구체적인 실험 단계는 하기와 같았다: A549-넥틴-4 세포를 분해하고, 세포를 원심분리에 의해 수집하고, DMEM+4% FBS 배지를 이용하여 100,000/mL로 재현탁시키고, 100 ㎕/웰로 96-웰에 도말하였다; ADC 분자를 DMEM 기본 배지를 이용하여, 구배에 의해 150 ㎍/mL의 최종 농도로부터 시작하여, 4배 희석으로 11개의 농도로 희석하고, 해당 웰에 웰당 100 ㎕로 첨가하였고, 최종 혈청 농도는 2% 이었다; 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 72시간 동안 인큐베이션을 수행하였다; CCK8(Rhinogen)을 20㎕/웰로 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 0.5-2.5시간 동안 인큐베이션시키고, 마이크로플레이트 판독기(MD)에서 30분 마다 OD450 nm 판독값을 수집하고, 곡선 피팅을 위해 Graphpad Prism으로 불러들였다.
실험 결과가 도 9a 및 9b에 표시되며, 이는 31HZ-TL001, 74HZ-TL001 및 엔포르투맙-TL001이 모두 각각 1390 ng/mL, 1364 ng/mL 및 2049 ng/mL의 EC50 값으로 A549-넥틴-4 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있다는 것을 나타내며, 인간 넥틴-4의 고발현을 갖는 종양 세포주에 대한 31HZ-TL001 및 74HZ-TL001의 사멸 활성이 엔포르투맙-TL001보다 우수하고; 반면에, 인간 넥틴-4를 과발현하지 않는 A549 세포에 대한 31HZ-TL001, 74HZ-TL001 및 엔포르투맙-TL001의 사멸 활성 EC50 값은 각각 5982 ng/mL, 6251 ng/mL 및 5604 ng/mL이라는 것을 보여주었다. 전반적으로, A549-넥틴-4 세포 및 A549 세포에 대한 사멸 활성의 측면에서, 31HZ-TL001, 74HZ-TL001 및 엔포르투맙-TL001은 넥틴-4 특이적이다.
인간 넥틴-4의 높은 발현을 갖는 T24-넥틴-4 세포주에 대한 31HZ-TL001 및 56HZ-TL001의 사멸 활성을 전술된 동일한 실험 방법으로 검출하였다. 실험 결과는 도 9c 및 9d에 표시되며, 이는 31HZ-TL001 및 56HZ-TL001이 모두 T24-넥틴-4 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있고 이들의 EC50 값은 각각 1277 ng/mL 및 1568 ng/mL이라는 것을 보여주고, 상기 2개의 ADC의 사멸 활성이 실질적으로 동등하고; 인간 넥틴-4를 과발현하지 않은 T24 세포에 대한 31HZ-TL001 및 56HZ-TL001의 사멸 활성 EC50 값은 각각 2884 ng/mL 및 3665 ng/mL이며, 이러한 사멸 활성은 T24-넥틴-4의 사멸 활성보다 훨씬 더 낮다는 것을 보여주고, 둘 모두의 사멸 효과가 넥틴-4 특이적이었다는 것을 나타냈다.
실시예 9: 인간 넥틴-4를 내생적으로 발현하는 종양 세포주에 대한 항-인간 넥틴-4 ADC의 사멸 활성 검출
인간 넥틴-4를 내생적으로 발현하는 종양 세포주에 대한 31HZ-TL001, 74HZ-TL001 및 엔포르투맙-TL001의 사멸 활성을 검출하기 위해 T47D 종양 세포주를 선택하였다. 구체적인 실험 단계는 하기와 같았다: T47D 세포를 분해하고, 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 1640+4% FBS 배지를 이용하여 100,000/mL로 재현탁시키고, 100 ㎕/웰로 96-웰에 도말하였다; ADC 분자를 1640 기본 배지를 이용하여, 구배에 의해 150 ㎍/mL의 최종 농도로부터 시작하여, 4배 희석으로 11개의 농도로 희석하고, 해당 웰에 웰당 100 ㎕로 첨가하였고, 최종 혈청 농도는 2% 이었다; 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 72시간 동안 인큐베이션을 수행하였다; CCK8(Rhinogen)을 20㎕/웰로 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 0.5-2.5시간 동안 인큐베이션시키고, 마이크로플레이트 판독기(MD)에서 30분 마다 OD450 nm 판독값을 수집하고, 곡선 피팅을 위해 Graphpad Prism으로 불러들였다.
실험 결과가 도 10a에 표시되며, 이는 31HZ-TL001, 74HZ-TL001 및 엔포르투맙-TL001이 각각 206.1 ng/mL, 611.3 ng/mL 및 229.2 ng/mL의 EC50 값으로 T47D 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있다는 것을 나타내고, T47D 세포에 대한 31HZ-TL001의 사멸 활성이 엔포르투맙-TL001의 사멸 활성과 유사하다는 것을 보여주었다.
인간 넥틴-4를 내생적으로 발현하는 종양 세포주 MDA-MB-468에 대한 31HZ-TL001, 74HZ-TL001 및 엔포르투맙-TL001의 사멸 활성을 전술된 것과 동일한 실험 방법으로 검출하였다. 실험 결과가 도 10b에 표시되며, 이는 31HZ-TL001, 74HZ-TL001 및 엔포르투맙-TL001이 MDA-MB-468 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있고, 이들의 EC50 값은 각각 1030 ng/mL, 2277 ng/mL 및 1190 ng/mL라는 것을 보여주어, MDA-MB-468 세포에 대한 31HZ-TL001의 사멸 활성이 엔포르투맙-TL001의 사멸 활성과 유사하다는 것을 나타냈다.
인간 넥틴-4를 내생적으로 발현하는 종양 세포주 NCI-N87에 대한 31HZ-TL001 및 56HZ-TL001의 사멸 활성을 전술된 것과 동일한 실험 방법으로 검출하였다. 실험 결과가 도 10c에 표시되며, 이는 31HZ-TL001 및 56HZ-TL001이 모두 NCI-N87 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있고, 이들의 EC50 값은 각각 9376 ng/mL 및 10935 ng/mL라는 것을 보여주어, 이 둘의 사멸 활성이 실질적으로 동등하다는 것을 나타냈다.
결론적으로, 인간 넥틴-4를 내생적으로 발현하는 종양 세포주에 대한 31HZ-TL001 및 56HZ-TL001의 사멸 활성은 엔포르투맙-TL001의 사멸 활성과 실질적으로 동등했다.
실시예 10: CDX 모델에서 항-인간 넥틴-4 ADC의 생체내 약역학
ADC 분자의 항종양 효과는 인간 비소세포폐암 세포주 NCI-H322M의 CDX 모델을 구축하여 평가하였다. 구체적인 단계는 하기와 같았다: NCI-H322M 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 10% 우태아혈청(FBS)을 함유하는 RPMI1640 배지로 배양하였다. 지수 성장기의 세포를 수집하고, PBS에 재현탁하고, 암컷 NOD/SCID 마우스(Biocytogen Jiangsu Gene Biotechnology Co., Ltd.)에 1x107/마우스(0.1mL의 PBS에 현탁됨)로 피하접종하여 피하 이종이식 종양 모델을 확립했다. 평균 종양 부피가 70-100 mm3에 도달했을 때, 마우스를 종양 부피에 따라 무작위로, 각 그룹당 5마리의 마우스로 그룹화하였다. 그룹화를 수행한 날을 0일차(Day 0)로 기록했고, 그룹은 비히클 그룹(정상 식염수)(음성 대조군), 31HZ-TL001 그룹(3 mg/kg 및 10 mg/kg), 56HZ-TL001 그룹(3 mg/kg 및 10 mg/kg), 엔포르투맙-TL001 그룹(10 mg/kg) 및 엔포르투맙-VC-MMAE 그룹(10 mg/kg)을 포함했다. 모든 시료는 총 6회 용량으로 주 2회 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다.
종양 직경은 투여 후 주 2회 버니어 캘리퍼스로 측정하였고, 종양 부피는 하기 식에 따라 계산하였다: V = 0.5a × b2, 식 중에서, a 및 b는 각각 종양의 장경 및 단경을 나타낸다. 동물의 사망을 매일 관찰하고 기록했다.
하기 식을 이용하여 종양 성장 억제율 TGI(%)을 계산하였고, 이를 종양 억제 효능을 평가하기 위해 이용했다:
TGI(%) = [1 - (VT-종료 - VT-개시)/(VC-종료 - VC-개시)] * 100%
여기서
VT-종료: 실험의 종료시 처리 그룹의 평균 종양 부피;
VT-개시: 투여의 개시시 처리 그룹의 평균 종양 부피;
VC-종료: 실험의 종료시 음성 대조군의 평균 종양 부피;
VC-개시: 투여의 개시시 음성 대조군의 평균 종양 부피.
실험 결과가 표 9와 도 11 및 12에 표시되며, 이는 31HZ-TL001, 56HZ-TL001, 엔포르투맙-TL001 및 엔포르투맙-VC-MMAE가 NCI-H322M 이종이식 종양 모델에서 용량-의존적 방식으로 종양 성장에 유의한 억제 효과가 있다는 것을 보여주었다. 6회 투여 후 (21일차), 10 mg/kg 용량 수준에서, 음성 대조군과 비교하여 31HZ-TL001, 56HZ-TL001, 엔포르투맙-TL001 및 엔포르투맙-VC-MMAE의 TGI 값은 각각 155.79%, 163.56%, 156.31% 및 173.79%이었다. 관찰 기간 동안 모든 처리 그룹에서 유의한 체중 감소는 없었으며, 이는 ADC에 대한 동물의 내약성이 우수함을 나타낸다.
표 9: NCI-H322M + NOD/SCID 마우스 CDX 모델
Figure pct00023
참고: TGI: 종양 성장 억제율; PR: 종양의 부분 퇴행(partial regression); CR: 종양의 완전한 퇴행(complete regression). P 값은 비히글 그룹과 비교한 결과이다.
전술된 결과는 3 mg/kg 및 10 mg/kg의 용량 수준에서 31HZ-TL001 및 56HZ-TL001의 TGI 값을 고려할 때 31HZ-TL001 및 56HZ-TL001이 모두 용량 의존적 방식 종양 성장을 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 보여주었다. 10 mg/kg의 용량 수준에서, 31HZ-TL001 및 56HZ-TL001이 모두 그룹에서 5마리 마우스 모두의 종양을 부분적으로 퇴행시킬 수 있었고, 효능은 기본적으로 엔포르투맙-TL001 및 엔포르투맙-VC-MMAE와 동등했다. 또한, 31HZ-TL001 및 56HZ-TL001은 종양-보유 마우스에 의해 충분히 내약되었다(well-tolerated).
실시예 11: PDX 모델에서 항-인간 넥틴-4 ADC의 인 비보 약역학
HuPrime® 방광암 이종이식 모델 BL9200(Crown Bioscience (Taicang) Co., Ltd., 63세 남성 환자에서 유래한 넥틴-4의 고발현을 가짐) 종양-보유(tumor-bearing) 마우스로부터 종양 조직을 채취하고, 직경 3×3×3 mm의 조각으로 절단하고, NOD/SCID 마우스(Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd.)의 오른쪽 앞 견갑골에 피하로 접종하였다. 종양-보유 마우스의 평균 종양 부피가 약 150-250 mm3에 도달했을 때, 마우스를 종양 크기에 따라 각 그룹당 7마리의 마우스로, 무작위로 그룹으로 나누고, 그룹화를 수행한 날을 0일차(Day 0)로 정의하였다. 4개의 그룹이었다: 인간 IgG1 이소형 대조군 항체 그룹(IgG1 3 mg/kg, 음성 대조군), 인간 IgG1-TL001 그룹(IgG1-TL001로 약칭함, 3 mg/kg; 제조 방법은 실시예 7 참조), 56HZ-TL001의 1 mg/kg 그룹 및 3 mg/kg 그룹. 모든 시료는 총 6회 용량에 대해 주 2회 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 투여 후, 마우스의 종양 부피 및 체중을 관찰하고 주기적으로 측정하였으며, 측정 및 계산 방법은 실시예 10에 기재된 바와 같았다.
실험 결과가 표 10과 도 13 및 14에 표시되었다. 6회 투여 후(20일차), 3 mg/kg 인간 IgG1(hIgG1) 음성 대조군과 비교하여, 3 mg/kg의 56HZ-TL001은 종양 성장에 대해 105.55%(P < 0.05)의 억제 TGI를 보였고, 이 그룹의 4마리의 마우스에서 종양의 부분적 퇴행이 관찰되었다. 3mg/kg의 56HZ-TL001은 동일한 용량에서 이소형 대조군 ADC(3mg/kg의 hIgG1-TL001)보다 종양 성장에 대해 유의하게 개선된 억제 효과를 나타냈다(P < 0.001). hIgG1 그룹에서 1마리의 마우스가 사망하였고, 정상적인 활동을 하는 다른 그룹에서는 사망이 관찰되지 않았다. 투여 기간 동안 각 그룹에서 마우스의 체중은 약간 감소하고, 그 중 IgG1 그룹의 체중이 효과적인 치료 부족으로 가장 많이 감소하여, 종양-보유 마우스가 ADC에 대한 내약성이 양호하다는 것을 나타냈다.
전술된 결과는 56HZ-TL001이 BL9200 방광암 PDX 이종이식 모델의 종양 성장에 유의한 억제 효과를 나타낸다는 것을 보여주었다. 또한, 종양-보유 마우스는 56HZ-TL001에 충분히 내약했다.
표 10: HuPrime® 방광암 + NOD/SCID 마우스 PDX 모델
Figure pct00024
참고: TGI: 종양 성장 억제율; PR: 종양의 부분 퇴행; CR: 종양의 완전한 퇴행; /: 해당 없음(not applicable).
본 발명의 특정 구체예가 상세히 설명되었으나, 당업자는 개시된 모든 교시에 비추어 세부사항에 대해 다양한 수정 및 변형이 이루어질 수 있으며, 이러한 변경은 모두 본 발명의 범위 내에 속한다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위 및 그 등가물에 의해 주어진다.
서열 목록
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Figure pct00028
<110> SICHUAN KELUN-BIOTECH BIOPHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Anti-Nectin-4 antibody, conjugate including same, and application thereof <130> IEC220337PCT <150> CN202010972365.6 <151> 2020-09-16 <150> CN202011624826.7 <151> 2020-12-31 <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 31#VH <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Asp Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Leu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asp Phe Arg Ile Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 31#VL <400> 2 Asp Val Val Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Thr 20 25 30 Asn Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Thr Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chothia 31#/31HZ CDR-H1 <400> 3 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chothia 31# /31HZ CDR-H2 <400> 4 His Pro Ser Asp Ser Glu 1 5 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chothia/Abm/ Kabat 31# /31HZ CDR-H3 <400> 5 Trp Asp Phe Arg Ile Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chothia/Abm/ Kabat 31# /31HZ CDR-L1 <400> 6 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Thr Asn Ser Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chothia/Abm/ Kabat 31# /31HZ CDR-L2 <400> 7 Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chothia/Abm/ Kabat/IMGT 31#/31HZ/74#/74HZ CDR-L3 <400> 8 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Abm 31#/31HZ CDR-H1 <400> 9 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Trp Met Asn 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Abm 31# /31HZ CDR-H2 <400> 10 Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg 1 5 10 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kabat 31# /31HZ CDR-H1 <400> 11 Asp Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kabat 31# CDR-H2 <400> 12 Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 13 <211> 8 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Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Asp Trp His Trp Ile Arg His Phe Pro Gly Asn Met Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr His Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Phe 65 70 75 80 Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 56#VL <400> 20 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln His Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Phe Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Thr 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chothia 56# CDR-H1 <400> 21 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr 1 5 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chothia 56#/56HZ CDR-H2 <400> 22 Ser Phe Ser Gly Arg 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chothia/Abm/ Kabat 56# /56HZ CDR-H3 <400> 23 Gly Asn Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chothia/Abm/ Kabat 56# /56HZ CDR-L1 <400> 24 Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser Ile His 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chothia/Abm/ Kabat 56# /56HZ CDR-L2 <400> 25 Phe Ala Ser Glu Ser Ile Ser 1 5 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chothia/Abm/ Kabat/IMGT 56#/56HZ CDR-L3 <400> 26 Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Thr Tyr Thr 1 5 10 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Abm 56# CDR-H1 <400> 27 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Asp Trp His 1 5 10 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Abm 56# /56HZ CDR-H2 <400> 28 Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Arg Thr Tyr 1 5 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kabat 56# CDR-H1 <400> 29 Ser Asp Tyr Asp Trp His 1 5 <210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kabat 56#/56HZ CDR-H2 <400> 30 Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IMGT 56# CDR-H1 <400> 31 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Asp 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IMGT 56#/56HZ CDR-H2 <400> 32 Ile Ser Phe Ser Gly Arg Thr 1 5 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IMGT 56# /56HZ CDR-H3 <400> 33 Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IMGT 56# /56HZ CDR-L1 <400> 34 Gln Asn Ile Gly Thr Ser 1 5 <210> 35 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IMGT 56#/56HZ CDR-L2 <400> 35 Phe Ala Ser 1 <210> 36 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Abm 56HZ CDR-H1 <400> 36 Gly Tyr Phe Asn Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Asp Trp His 1 5 10 <210> 37 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 74#VH <400> 37 Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Ala Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Asn Phe Tyr Thr Val Asn Ala Trp Tyr Tyr Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly His Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 38 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 74#VL <400> 38 Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Thr Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Asn Thr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chothia 74#/74HZ CDR-H1 <400> 39 Gly Tyr Thr Phe Ile Asn Tyr 1 5 <210> 40 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chothia 74#/74HZ CDR-H2 <400> 40 His Pro Ser Asp Ser Ala 1 5 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chothia/Abm/ Kabat 74#/74HZ CDR-H3 <400> 41 Trp Gly Asn Phe Tyr Thr Val Asn Ala Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chothia/Abm/ Kabat 74#/74HZ CDR-L1 <400> 42 Lys Ser Ser Gln Thr Leu Leu Asn Ser Asn Thr Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chothia/Abm/ Kabat 74#/74HZ CDR-L2 <400> 43 Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kabat 56HZ CDR-H1 <400> 44 Ile Thr Ser Asp Tyr Asp Trp His 1 5 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Abm 74#/74HZ CDR-H1 <400> 45 Gly Tyr Thr Phe Ile Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 10 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Abm 74#/74HZ CDR-H2 <400> 46 Met Ile His Pro Ser Asp Ser Ala Thr Arg 1 5 10 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kabat 74# /74HZ CDR-H1 <400> 47 Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 48 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kabat 74# CDR-H2 <400> 48 Met Ile His Pro Ser Asp Ser Ala Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 49 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IMGT 74#/74HZ CDR-H1 <400> 49 Gly Tyr Thr Phe Ile Asn Tyr Trp 1 5 <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IMGT 74#/74HZ CDR-H2 <400> 50 Ile His Pro Ser Asp Ser Ala Thr 1 5 <210> 51 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IMGT 74#/74HZ CDR-H3 <400> 51 Ala Arg Trp Gly Asn Phe Tyr Thr Val Asn Ala Trp Tyr Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IMGT 74#/74HZ CDR-L1 <400> 52 Gln Thr Leu Leu Asn Ser Asn Thr Gln Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 53 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IMGT 74#/74HZ CDR-L2 <400> 53 Phe Ala Ser 1 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IMGT 56HZ CDR-H1 <400> 54 Gly Tyr Phe Asn Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Asp 1 5 10 <210> 55 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 31HZ VH <400> 55 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asp Phe Arg Ile Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 56 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 31HZ VL <400> 56 Asp Val Val Ile Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Thr 20 25 30 Asn Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 57 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 56HZ VH <400> 57 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Phe Asn Ser Ile Thr 20 25 30 Ser Asp Tyr Asp Trp His Trp Ile Arg His His Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser His Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 70 75 80 Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 58 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 56HZ VL <400> 58 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Phe Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Thr 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 59 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 74HZ VH <400> 59 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Ala Thr Arg Leu Asn Gln Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Asn Phe Tyr Thr Val Asn Ala Trp Tyr Tyr Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 60 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 74HZ VL <400> 60 Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Thr Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Asn Thr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 61 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 heavy chain constant region <400> 61 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 62 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kappa light chain constant region <400> 62 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 63 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kabat 31HZ CDR-H2 <400> 63 Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kabat 74HZ CDR-H2 <400> 64 Met Ile His Pro Ser Asp Ser Ala Thr Arg Leu Asn Gln Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly

Claims (30)

  1. 넥틴-4(Nectin-4)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서,
    (1a)
    Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR:
    서열번호 3에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 4에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 5에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
    Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR:
    서열번호 6에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 7에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (1b)
    Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR:
    서열번호 9에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 10에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 5에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
    Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR:
    서열번호 6에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 7에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (1c)
    Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR:
    서열번호 11에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 12 또는 63에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 5에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
    Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR:
    서열번호 6에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 7에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (1d)
    IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR:
    서열번호 13에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 14에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 15에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
    IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR:
    서열번호 16에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 17에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (2a)
    Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR:
    서열번호 21 또는 18에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 22에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
    Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR:
    서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (2b)
    Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR:
    서열번호 27 또는 36에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 28에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
    Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR:
    서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (2c)
    Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR:
    서열번호 29 또는 44에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 30에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
    Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR:
    서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (2d)
    IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR:
    서열번호 31 또는 54에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 32에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 33에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
    IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR:
    서열번호 34에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 35에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (3a)
    Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR:
    서열번호 39에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 40에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 41에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
    Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR:
    서열번호 42에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 43에 기재된 서열을 포함하는 CDR-L2 또는 그의 변이체,
    서열번호 8에 기재된 서열을 포함하는 CDR-L3 또는 그의 변이체; 또는
    (3b)
    Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR:
    서열번호 45에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 46에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 41에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
    Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR:
    서열번호 42에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 43에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (3c)
    Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR:
    서열번호 47에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 48 또는 64에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 41에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
    Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR:
    서열번호 42에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 43에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (3d)
    IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 중쇄 CDR:
    서열번호 49에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 50에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 51에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
    IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 하기 3개의 경쇄 CDR:
    서열번호 52에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 53에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 8에 기재된 서열을 포함하는 CDR-L3 또는 그의 변이체;를 포함하고,
    상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖고; 바람직하게는, 상기 치환은 보존적 치환이고;
    바람직하게는, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 또는 마우스 면역글로불린으로부터 유래된 프레임워크 영역을 더 포함하고;
    바람직하게는, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 넥틴-4에 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 청구항 1에 있어서,
    (a) Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 중쇄 및 경쇄에 대한 하기 6개의 CDR:
    서열번호 3에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 4에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 5에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3,
    서열번호 6에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 7에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (b) Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 중쇄 및 경쇄에 대한 하기 6개의 CDR:
    서열번호 9에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 10에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 5에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3,
    서열번호 6에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 7에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (c) Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 중쇄 및 경쇄에 대한 하기 6개의 CDR:
    서열번호 11에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 12 또는 63에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 5에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3,
    서열번호 6에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 7에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (d) IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 중쇄 및 경쇄에 대한 하기 6개의 CDR:
    서열번호 13에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 14에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 15에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3,
    서열번호 16에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 17에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3;를 포함하고,
    상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖고; 바람직하게는, 상기 치환은 보존적 치환인 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 청구항 1에 있어서,
    (a) Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 중쇄 및 경쇄에 대한 하기 6개의 CDR:
    서열번호 21 또는 18에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 22에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3,
    서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (b) Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 중쇄 및 경쇄에 대한 하기 6개의 CDR:
    서열번호 27 또는 36에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 28에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3,
    서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (c) Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 중쇄 및 경쇄에 대한 하기 6개의 CDR:
    서열번호 29 또는 44에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 30에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 23에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3,
    서열번호 24에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 25에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (d) IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 중쇄 및 경쇄에 대한 하기 6개의 CDR:
    서열번호 31 또는 54에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 32에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 33에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3,
    서열번호 34에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 35에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 26에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3;를 포함하고,
    상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖고; 바람직하게는, 치환은 보존적 치환인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 청구항 1에 있어서,
    (a) Chothia 넘버링 시스템에 따라 정의된 중쇄 및 경쇄에 대한 하기 6개의 CDR:
    서열번호 39에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 40에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 41에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3,
    서열번호 42에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 43에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (b) Abm 넘버링 시스템에 따라 정의된 중쇄 및 경쇄에 대한 하기 6개의 CDR:
    서열번호 45에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 46에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 41에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3,
    서열번호 42에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 43에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (c) Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의된 중쇄 및 경쇄에 대한 하기 6개의 CDR:
    서열번호 47에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 48 또는 64에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 41에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3,
    서열번호 42에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 43에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 또는
    (d) IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 중쇄 및 경쇄에 대한 하기 6개의 CDR:
    서열번호 49에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 50에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 51에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-H3,
    서열번호 52에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 53에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L2,
    서열번호 8에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 CDR-L3;를 포함하고,
    상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖고; 바람직하게는, 치환은 보존적 치환인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 1 또는 서열번호 55에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH 및/또는 서열번호 2 또는 서열번호 56에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL; 또는
    서열번호 19 또는 서열번호 57에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH 및/또는 서열번호 20 또는 서열번호 58에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL; 또는
    서열번호 37 또는 서열번호 59에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH 및/또는 서열번호 38 또는 서열번호 60에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL;를 포함하고,
    상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 그것이 유래된 서열과 비교하여, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖고; 바람직하게는, 상기 치환은 보존적 치환인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서,
    (1) 서열번호 1에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH 및/또는 서열번호 2에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL; 또는
    (2) 서열번호 19에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH 및/또는 서열번호 20에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL; 또는
    (3) 서열번호 37에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH 및/또는 서열번호 38에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL; 또는
    (4) 서열번호 55에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH 및/또는 서열번호 56에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL; 또는
    (5) 서열번호 57에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH 및/또는 서열번호 58에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL; 또는
    (6) 서열번호 59에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VH 및/또는 서열번호 60에 기재된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 VL;를 포함하고,
    상기 변이체는 그것이 유래된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 그것이 유래된 서열과 비교하여, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖고; 바람직하게는, 상기 치환은 보존적 치환인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 마우스 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 또는 그의 변이체, 및 경쇄 불변 영역 또는 그의 변이체를 더 포함하고,
    상기 변이체는 그것이 유래된 야생형 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어, 20개 이하, 15개 이하, 10개 이하, 또는 5개 이하의 아미노산의 치환, 결실, 또는 부가; 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖고;
    바람직하게는, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 영역과 같은 IgG 중쇄 불변 영역이고; 상기 경쇄 불변 영역은 κ 또는 λ 경쇄 불변 영역으로부터 선택되고;
    보다 바람직하게는, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 중쇄 불변 영역이고;
    가장 바람직하게는, 상기 중쇄 불변 영역은 서열번호 61에 기재된 서열을 갖고; 상기 경쇄 불변 영역은 κ 경쇄 불변 영역이고; 및/또는 상기 경쇄 불변 영역은 서열번호 62에 기재된 서열을 갖는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하고,
    (a) 상기 중쇄는 서열번호 1에 기재된 서열을 갖는 VH 및 서열번호 61에 기재된 서열을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 2에 기재된 서열을 갖는 VL, 및 서열번호 62에 기재된 서열을 갖는 경쇄 불변영역을 포함하거나; 또는
    (b) 상기 중쇄는 서열번호 19에 기재된 서열을 갖는 VH, 및 서열번호 61에 기재된 서열을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 20에 기재된 서열을 갖는 VL, 및 서열번호 62에 기재된 서열을 갖는 경쇄 불변영역을 포함하거나; 또는
    (c) 상기 중쇄는 서열번호 37에 기재된 서열을 갖는 VH, 및 서열번호 61에 기재된 서열을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 38에 기재된 서열을 갖는 VL, 및 서열번호 62에 기재된 서열을 갖는 경쇄 불변영역을 포함하거나; 또는
    (d) 상기 중쇄는 서열번호 55에 기재된 서열을 갖는 VH, 및 서열번호 61에 기재된 서열을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 56에 기재된 서열을 갖는 VL, 및 서열번호 62에 기재된 서열을 갖는 경쇄 불변영역을 포함하거나; 또는
    (e) 상기 중쇄는 서열번호 57에 기재된 서열을 갖는 VH, 및 서열번호 61에 기재된 서열을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 58에 기재된 서열을 갖는 VL, 및 서열번호 62에 기재된 서열을 갖는 경쇄 불변영역을 포함하거나; 또는
    (f) 상기 중쇄는 서열번호 59에 기재된 서열을 갖는 VH, 및 서열번호 61에 기재된 서열을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 60에 기재된 서열을 갖는 VL, 및 서열번호 62에 기재된 서열을 갖는 경쇄 불변영역을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, dsFv(disulfide-stabilized Fv), 디아바디, 이중특이성 항체 및 다중특이성 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 넥틴-4의 IgV 도메인에 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 표지에 접합되고, 바람직하게는, 상기 표지는 효소, 형광 염료, 방사성 동위원소, 비오틴 및 콜로이드 금(colloidal gold)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  13. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 하나 이상의 치료제를 포함하는 항체 접합체.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 치료제는 세포 독성제인 것인 항체 접합체.
  15. 청구항 13 또는 14에 있어서, 하기 식 I로 표시되는 구조를 갖고,
    A-(L-D)γ
    (I);
    식 중에서, A는 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 나타내고;
    L은 아미노산, 또는 2-10개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 나타내며;
    더욱 바람직하게는, L은 Val, Cit, Phe, Lys, D-Val, Leu, Gly, Ala, Asn,
    Figure pct00029

    Figure pct00030

    Figure pct00031
    로부터 선택되고,
    식 중에서, 위치 1 및 위치 2 중 하나는 L과 A가 연결된 위치를 나타내고, 나머지 하나는 L과 D가 연결된 위치를 나타내며,
    D는 세포 독성제, 치료 항체, 방사성 동위원소, 올리고뉴클레오티드 및 그의 유사체, 생물학적 활성 펩티드, 단백질 독소 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되고; 바람직하게는, D는 항종양 생물학적 활성을 갖는 분자이고;
    더욱 바람직하게는, D는
    Figure pct00032
    ,
    Figure pct00033
    ,
    Figure pct00034
    , 또는
    Figure pct00035
    이고,
    γ는 1 내지 10의 정수인 것인 항체 접합체.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 (L-D) 모이어티는 A의 설프히드릴기와 티오에테르 결합을 형성하여 연결된 하기 식(1)의 구조를 갖고,
    Figure pct00036

    식 (1),
    상기 항체 접합체는 하기 식 (2)의 구조를 가지며:
    Figure pct00037

    식 (2),
    γ는 1 내지 10의 정수이고, A는 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 나타내는 것인 항체 접합체.
  17. 청구항 13에 있어서, 상기 치료제는 방사성 동위원소이고,
    바람직하게는, 상기 방사성 동위원소는 212Bi, 213Bi, 131I, 125I, 111In, 177Lu, 186Re, 188Re, 153Sm, 90Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체 접합체.
  18. 청구항 13 내지 17 중 어느 한 항에 따른 항체 접합체를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물 중 치료제 대 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 몰비(DAR 값)는 1 내지 10의 소수 또는 정수(예를 들면, 1과 8 사이의 소수 또는 정수, 예를 들면, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.79, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 6.95, 7.0, 7.03, 7.1, 7.12, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8.0)인 것인 항체 접합체.
  19. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR).
  20. 표면에 청구항 19에 따른 CAR을 발현하는 면역 이펙터(effector) 세포로서, 바람직하게는, 면역 이펙터 세포는 세포독성 T 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 자연 살해 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역 이펙터 세포.
  21. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자.
  22. 청구항 21에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  23. 청구항 21에 따른 핵산 분자 또는 청구항 24에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포로서,
    바람직하게는, 상기 숙주 세포는 진핵 세포이고, 보다 바람직하게는 포유동물 세포, 가장 바람직하게는 CHO(Chinese hamster ovary) 세포이거나, 또는
    바람직하게는, 상기 숙주 세포는 원핵 세포이고, 보다 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 대장균인 것인 숙주 세포.
  24. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 적어도 하나의 다른 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체 유사체를 포함하는, 다중특이성 항체로서, 상기 다중특이성 항체는 넥틴-4 및 하나 이상의 다른 항원에 결합할 수 있고, 바람직하게는 상기 다중특이성 항체는 이중특이성 또는 삼중특이성 또는 사중특이성 항체인 것인 다중특이성 항체.
  25. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 추가적인 생물학적 활성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질로서,
    바람직하게는, 상기 추가적인 생물학적 활성 폴리펩티드는 치료 활성, 결합 활성 또는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질인 것인 융합 단백질.
  26. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 청구항 13 내지 17 중 어느 한 항에 따른 항체 접합체, 청구항 18에 따른 조성물, 청구항 20에 따른 면역 이펙터 세포, 청구항 24에 따른 다중특이성 항체, 또는 청구항 25에 따른 융합 단백질, 및 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  27. 약제의 제조에서 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 청구항 13 내지 17 중 어느 한 항에 따른 항체 접합체, 청구항 18에 따른 조성물, 청구항 20에 따른 면역 이펙터 세포, 청구항 24에 따른 다중특이성 항체, 청구항 25에 따른 융합 단백질 또는 청구항 26에 따른 약학적 조성물의 용도로서, 상기 약제는 암의 치료를 위해 사용되고, 바람직하게는, 상기 암은 위암, 간암, 간 세포 암종, 방광암, 요로상피암, 요도암, 신우암, 요관암, 폐암, 비소세포폐암, 유방암, 유관암(breast ductal cancer), 삼중음성 유방암, 췌장암, 난소암, 두경부암, 결장암, 직장암 및 식도암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 약제는 항종양제, 화학요법제, 방사성 동위원소, 면역 체크포인트 억제제로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 치료제와 조합하여 사용되는 것인 용도.
  29. 청구항 27에 있어서, 상기 약제는 수술, 방사선 요법, 화학 요법, 표적 요법, 면역 요법, 호르몬 요법, 혈관신생 억제 및 완화 치료로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치료 요법과 조합하여 사용되는 것인 용도.
  30. 시료에서 넥틴-4의 존재를 검출하거나 넥틴-4의 발현 수준을 결정하는 방법으로서,
    (a) 상기 시료를 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계, 및
    (b) 상기 시료에서 넥틴-4의 존재를 검출하거나 넥틴-4의 발현 수준을 결정하기 위해 상기 시료에서 상기 항체 또는 항원-결합 단편과 넥틴-4의 면역 복합체의 형성을 검출하거나 상기 복합체의 양을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
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