CN116234564A - 抗Nectin-4抗体、包含所述抗体的缀合物及其应用 - Google Patents

抗Nectin-4抗体、包含所述抗体的缀合物及其应用 Download PDF

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Abstract

提供了抗Nectin‑4抗体或其抗原结合片段、包含其的抗体缀合物以及其在制备药物中的用途，特别是在制备用于治疗和/或预防癌症的药物中的用途。

Description

抗Nectin-4抗体、包含所述抗体的缀合物及其应用
本申请要求2020年9月16日提交的题为“抗Nectin-4抗体、包含所述抗体的缀合物及其应用”的第202010972365.6号中国申请的优先权以及2020年12月31日提交的题为“抗Nectin-4抗体、包含所述抗体的缀合物及其应用”的第202011624826.7号中国申请的优先权，这些申请的全文整体援引加入本文。
技术领域
本发明属于生物医药领域。具体地，本发明涉及抗Nectin-4抗体与包含其的缀合物及其应用，特别是在治疗和/或预防Nectin-4相关疾病中的应用。
背景技术
Nectin-4属于Nectin家族蛋白，又称PVRL，属于免疫球蛋白超家族(Immunoglobulin Superfamily)，主要功能是介导钙离子非依赖型细胞粘着连接(Adhesion Junction)。Nectin家族成员包括Nectin-1、Nectin-2、Nectin-3及Nectin-4，大小约510-550个氨基酸，属于I型跨膜蛋白，结构上包含由三个Ig-like结构域形成的胞外段加上一个跨膜区和一个胞内尾部区域。三个Ig-like结构域含1个IgV和两个IgC，而其胞内区的C-端都具有一个由Glu/Ala-X-Tyr-Val组成的保守区域，用于结合Afadin蛋白的PDZ结构域。Nectin-4不具有该蛋白序列，但仍能与Afadin蛋白在胞内结合。
Nectin-4可以通过抑制失巢凋亡、激活PI3K-AKT信号通路来促进肿瘤细胞的存活和增殖。研究表明Nectin-4在胃癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌和食管癌中有表达，并且在非小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌和胰腺癌中有较强的表达。Nectin-4在肿瘤中的高表达与病人预后差密切相关。因此，Nectin-4可作为肿瘤药物开发的理想靶点。
目前靶向Nectin-4的ADC药物Enfortumab Vedotin(参见例如WO2012/047724)治疗尿路上皮癌适应症已经上市。Enfortumab Vedotin是抗Nectin-4全人源抗体偶联VC-MMAE药物，DAR值是4。临床III期数据表明整体患者中4个人达到完全缓解(CR)，41个人达到部分缓解(PR)，客观缓解率(ORR)为41％；OS中位数达到13.6个月，持续反应时间中位数为5.75个月，无进展生存期(PFS)中位数为5.4个月。曾经接受过免疫检查点抑制剂治疗组89例病人中ORR为40％；未接受过免疫检查点抑制剂治疗组 23例病人中ORR为44％；肝转移组33例病人中ORR为39％。Enfortumab Vedotin具有优异的抗肿瘤疗效。
Nectin-4在胎盘中表达，在部分正常组织中有弱到中度表达，如皮肤、食管、乳腺、膀胱。Enfortumab Vedotin在临床上毒副作用主要表现为疲劳(54％)；≥3级副作用为贫血(8％)、低钠血症(7％)、尿路感染(7％)、高血糖症(6％)；4例患者出现与药物相关的严重副作用，包括呼吸衰竭、尿路梗阻、糖尿病酮症酸中毒和多器官衰竭等。由此表明Enfortumab Vedotin药物的毒副问题偏大。
发明内容
在一总的方面，本发明提供了特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(1a)如下三个根据Chothia编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:3所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:4所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:5所示序列或其变体的CDR-H3；和/或如下三个根据Chothia编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:6所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:7所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；或者
(1b)如下三个根据Abm编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:9所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:10所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:5所示序列或其变体的CDR-H3；和/或如下三个根据Abm编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:6所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:7所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；或者
(1c)如下三个根据Kabat编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:11所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:12所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:5所示序列或其变体的CDR-H3；和/或如下三个根据Kabat编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:6所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:7所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；
或
如下三个根据Kabat编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:11所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:63所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:5所示序列或其变体的CDR-H3；和/或如下三个根据Kabat编号系 统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:6所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:7所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；
或者
(1d)如下三个根据IMGT编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:13所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:14所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:15所示序列或其变体的CDR-H3；和/或如下三个根据IMGT编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:16所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:17所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；或者
(2a)如下三个根据Chothia编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:21所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:22所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3；和/或如下三个根据Chothia编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；
或
如下三个根据Chothia编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:18所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:22所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3；和/或如下三个根据Chothia编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；
或者
(2b)如下三个根据Abm编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:27所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:28所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3；和/或如下三个根据Abm编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；
或
如下三个根据Abm编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:36所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:28所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3；和/或如下三个根据Abm编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；
或者
(2c)如下三个根据Kabat编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:29所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:30所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3；和/或如下三个根据Kabat编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；
或
如下三个根据Kabat编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:44所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:30所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3；和/或如下三个根据Kabat编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；
或者
(2d)如下三个根据IMGT编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:31所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:32所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:33所示序列或其变体的CDR-H3；和/或如下三个根据IMGT编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:34所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:35所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；
或
如下三个根据IMGT编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:54所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:32所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:33所示序列或其变体的CDR-H3；和/或如下三个根据IMGT编号系统定义的轻链CDR：包含SEQ ID NO:34所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:35所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；
或者
(3a)如下三个根据Chothia编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:39所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:40所示序列或其变体的CDR-H2， 包含SEQ ID NO:41所示序列或其变体的CDR-H3；和/或如下三个根据Chothia编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:42所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:43所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；或者
(3b)如下三个根据Abm编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:45所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:46所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:41所示序列或其变体的CDR-H3；和/或如下三个根据Abm编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:42所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:43所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；或者
(3c)如下三个根据Kabat编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:47所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:48所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:41所示序列或其变体的CDR-H3；和/或如下三个根据Kabat编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:42所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:43所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；
或
如下三个根据Kabat编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:47所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:64所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:41所示序列或其变体的CDR-H3；和/或如下三个根据Kabat编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:42所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:43所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；
或者
(3d)如下三个根据IMGT编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:49所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:50所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:51所示序列或其变体的CDR-H3；和/或如下三个根据IMGT编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:52所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:53所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；
其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述置换是保守置换。
在优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合片段还包含衍生自人或鼠免疫球蛋白的框架区。
在一方面，本发明提供一种抗体缀合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及至少一种治疗剂。
在又一方面，本发明提供一种嵌合抗原受体(CAR)以及表达所述CAR的免疫效应细胞。
在又一方面，本发明还涉及一种融合蛋白，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段，以及另外的生物活性多肽。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段、抗体缀合物、免疫效应细胞、多特异性抗体或融合蛋白，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在又一总的方面，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段、抗体缀合物、免疫效应细胞、多特异性抗体、融合蛋白或药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
本发明还涉及本发明的抗体或其抗原结合片段、抗体缀合物、免疫效应细胞、多特异性抗体、融合蛋白或药物组合物在治疗和/或预防癌症中的用途。
在另一总的方面，本发明还提供了一种治疗有需要的受试者中癌症的方法，所述癌症与Nectin-4相关。所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段、抗体缀合物、免疫效应细胞、多特异性抗体、融合蛋白或药物组合物。
优选地，所述癌症选自胃癌、肝癌、肝细胞癌、膀胱癌、尿路上皮癌、尿道癌、肾盂癌、输尿管癌、肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、乳腺导管癌、三阴性乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、结肠癌、直肠癌和食管癌。
具体实施方式
定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所用，“至少一个(种)”或“一个(种)或多个(种)”可以表示1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个(种)或更多个(种)。
表述“包含”或与其同义的类似表述“包括”、“含有”和“具有”等是开放性的，不排除 额外的未列举的元素、步骤或成分。表述“由…组成”排除未指明的任何元素、步骤或成分。表述“基本上由…组成”指范围限制在指定的元素、步骤或成分，加上任选存在的不会实质上影响所要求保护的主题的基本和新的特征的元素、步骤或成分。应当理解，表述“包含”涵盖表述“基本上由…组成”和“由…组成”。
术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。
如本文所用，“多肽”是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸形成的聚合物。“蛋白”可以由一条或多条多肽以共价或非共价方式形成。除非另有说明，否则术语“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用。
如本文所用，“抗体”指免疫球蛋白或其片段，其通过至少一个抗原结合位点特异性结合抗原表位。在本文中，抗体的定义涵盖抗原结合片段。因此，术语“抗体”包括多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单域抗体以及抗原结合片段。抗体可以是合成的(例如通过化学偶联或生物偶联产生的)、酶促处理得到的或重组产生的。本文所提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如，IgG2a和IgG2b)。在一实施方案中，本发明的抗体为鼠源单克隆抗体。在又一实施方案中，本发明的抗体为人源化单克隆抗体。
如本文所用，“传统抗体”或“全长抗体”通常包含四条多肽：两条重链(HC)和两条轻链(LC)。每条轻链从N末端到C末端包含“轻链可变区(VL)”和“轻链恒定区(CL)”。每条重链从N末端到C末端包含“重链可变区(VH)”以及“重链恒定区(CH)”。重链恒定区从N末端到C末端可以包含CH1、CH2和CH3。在某些免疫球蛋白类型(例如IgM和IgE)中，重链恒定区还可以包含CH4。“Fc”片段指包含CH2和CH3的片段，其提供与Fc受体结合的位点。“铰链区”指抗体中连接免疫球蛋白Fab和Fc片段的部分。在有些情况下，铰链区指T细胞受体中连接恒定区和跨膜结构域的部分。在本文中，当对于嵌合抗原受体使用时，铰链区还可以指任何功能等同物。本领域技术人员可以根据已知的算法和软件判断VH、VL、CL、CH1、CH2、CH3和铰链区在抗体中的位置，可以应用的算法和软件的描述可以参见例如William R.Strohl,Lila M.Strohl,(2012),Antibody structure–function relationships,In Woodhead Publishing Series in Biomedicine,Therapeutic Antibody Engineering,Woodhead Publishing,pp.37-56。
通常，VL和VH各自可以包含三个高度可变的“互补决定区(CDR)”和四个相对保守的“框架区(FR)”，并且从N末端到C末端以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的次序连接。在本文中，轻链可变区的CDR(CDRL)可以称为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，重链可变区的CDR(CDRH)可以称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。通常认为包含一 对VH和VL的六个CDR决定抗原结合位点的结合特异性，但在某些情况下，包含少于六个CDR(例如三、四或五个)的其他片段(例如单域抗体，又称为纳米抗体)同样具有结合抗原的能力。本领域技术人员可以使用本领域熟知的方法识别CDR，例如使用Kabat、Abm或Chothia编号法。在本文中，对于同一个可变区可以使用多个CDR编号系统，例如Chothia、Abm、Kabat和IMGT。本领域技术人员应当理解，尽管由不同编号系统定义的CDR可能会不同，但是同一编号系统对应的CDR代表能够结合抗原表位的有效抗原结合位点。有关CDR编号系统的描述可以参见例如， Kabat编号系统：Kabat,E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242； Chothia编号系统：Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917； IMGT编号系统：Lefranc,M.-P.,2011(6),IMGT,the International ImMunoGeneTics Information System Cold Spring Harb Protoc.； Abm编号系 统：Martin,A.C.R.and J.Allen(2007)“Bioinformatics tools for antibody engineering,”in S.Dübel(ed.),Handbook of Therapeutic Antibodies.Weinheim:Wiley-VCH Verlag,pp.95–118。
在本文中，术语“框架区”和“构架区”可以互换使用。如本文中所使用的，术语“框架区”、“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
通常认为，由一个VH和一个VL通过非共价作用构成的“Fv”片段为包含抗原结合位点的最小的抗原结合片段。但是只包含重链可变区的单域抗体(VHH，又称sdAb或纳米抗体)也可以有抗原结合能力。可以通过肽接头将VH和VL连接来获得“单链Fv(scFv)”。通过向Fv或scFv中引入二硫键可以分别获得“二硫键稳定的Fv(dsFv)”或“单链二硫键稳定的Fv(scdsFv或dsscFv)”。在一些实施方案中，例如本发明的抗体缀合物、多特异性抗体或CAR中的抗原结合片段优选使用scFv或scdsFv。
如本文所用，“Fab”包含一个完整的抗体轻链(VL-CL)和抗体重链可变区和一个重链恒定区(VH-CH1，也称为Fd)。用肽接头将“Fab”中的CL和CH1连接可以获得单链“Fab(scFab)”。“F(ab') 2”基本上包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段。“Fab'”为F(ab') 2的一半，其可以通过还原F(ab') 2铰链区的二硫键获得。
抗体或抗原结合片段可以是“单价”、“二价”、“三价”或“四价”或更多价，是指其具有多个抗原结合位点(例如1、2、3或4个或者更多个)。
当抗体或抗原结合片段所结合的抗原为两种或更多种(例如2、3、4、5或6种)时，其又可以称为“多特异性抗体”，例如双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体，其分别表示能够结合2、3或4种抗原的多特异性抗体。
如本文所用，“双抗体(diabody)”指这样的抗体，其包含两个scFv，具有两个抗原结合位点(二价)，其中每个scFv中的VH和VL之间通过短肽接头(大约5-10个氨基酸残 基)连接，使得VH和VL链间配对(即第一scFv的VH和第二scFv的VL配对，第一scFv的VL和第二scFv的VH配对)形成抗原结合位点。双抗体可以是双特异性抗体。
如本文所用，抗体的“抗原结合片段”指全长抗体的部分，其少于全长，但是至少包含全长抗体的部分可变区(例如包含一个或多个CDR和/或一个或多个抗原结合位点)，并因此保留全长抗体的至少部分特异性结合抗原的能力。抗原结合片段可以例如包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物、合成产生的衍生物、重组产生的衍生物。抗原结合片段的实例包括但不限于Fv、scFv、dsFv、scdsFv、Fab、scFab、Fab'、F(ab') 2、双抗体、Fd和Fd'片段以及其他片段(例如包含修饰的片段)。抗原结合片段可以包含多条肽链，例如通过二硫键和/或通过肽接头连接和/或非共价作用构成。
如本文使用，术语“单克隆抗体”是指一群高度均质的抗体，其中所包含的抗体分子之间除了可能少量存在的可能天然发生的突变之外是基本相同的。单克隆抗体通常特异性结合单一的抗原表位。可用于本发明中的单克隆抗体可以通过本领域已知的任何方法制备，例如从转基因动物中产生(例如转基因小鼠)、由永生化的B细胞(例如B细胞杂交瘤)产生，或者使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备，或者从噬菌体抗体文库中分离。本发明的抗体或抗原结合片段为单克隆抗体。在一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段为人源化单克隆抗体。
“嵌合抗体”指这样的抗体，其中的一部分(例如CDR、FR、可变区、恒定区或其组合)与衍生自特定物种的抗体中相应序列相同或同源，剩余的部分与衍生自另一物种的抗体中相应序列相同或同源。在本文中，“嵌合抗体”还涵盖包含属于不同抗体类型或亚类的部分的抗体。在一具体实施方案中，所述嵌合抗体具有鼠源抗体可变区和人源抗体恒定区。
如本文所用，“人源化抗体”指含有非人源抗体和人源抗体序列的抗体。因此，人源化抗体是含有衍生自非人免疫球蛋白最小序列的嵌合抗体。非人抗体可以是来源于任何非人物种的抗体或其中包含非人物种来源的部分的抗体(例如嵌合抗体)。非人物种例如可以包括小鼠、大鼠、兔、羊驼或非人灵长类动物。由非人抗体获得人源化抗体的技术是本领域技术人员熟知的。人源化抗体可以由非人抗体(例如鼠源抗体或嵌合抗体)产生，例如，将非人抗体(例如鼠源抗体)的CDR序列移植到人抗体框架区中。在某些情况下，为了保持人源化抗体的抗原结合能力和/或稳定性，可以在人抗体框架区中保留非人抗体(例如鼠源抗体)框架序列的关键氨基酸残基，即进行“回复突变”(参见，例如Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81(21):6851-6855；Neuberger et al.(1984)Nature 312:604-608)。
如本文所用，氨基酸序列的“百分比(％)序列同一性”、“序列同一性”具有本领域公认的定义，其指通过序列比对(例如通过人工检视或可公知的算法)确定的两个多肽序列之 间相同的百分比。可以使用本领域技术人员已知的方法确定，例如使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、Clustal Omega、FASTA软件。
“亲和力”或“结合亲和力”用来衡量抗体和抗原之间通过非共价作用相互结合的强度。“亲和力”的大小通常可以报告为平衡解离常数K D或EC 50。K D可以通过测量平衡缔合常数(ka)和平衡解离常数(kd)来计算：K D＝kd/ka。可以用本领域已知的常规技术测定亲和力，例如生物膜干涉技术(可以采用例如Octet Fortebio检测系统)、放射免疫法、表面等离子共振法、酶联免疫测定或流式细胞术等。
在本文中，抗体和抗原“特异性结合”是指抗体和抗原之间以较高的亲和力相互结合。通常，特异性结合的两个抗体和抗原之间的K D值为至少约10 -6到至少约10 -9M或更低，例如至少约10 -6、至少约10 -7、至少约10 -8、至少约10 -9M或更低。
在本文中，“源自”或“衍生自”参考氨基酸序列的氨基酸序列与所述参考氨基酸序列部分或者全部相同或同源。例如，衍生自人免疫球蛋白的重链恒定区的氨基酸序列与其所源自的人免疫球蛋白重链恒定区的野生型序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
在本文中，多肽或氨基酸序列的“变体”与其所源自的多肽或氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸突变或修饰。氨基酸突变包括氨基酸的置换、缺失或添加。本领域技术人员应当理解多肽或蛋白中非必需区中的氨基酸可以用合适的保守氨基酸置换，并且一般不改变其生物活性(参见，例如Watson et al.,Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。合适的保守置换是本领域技术人员熟知的。在下表中列出一些常见的氨基酸残基保守置换的非限制性实例。在某些情况下，氨基酸置换是非保守置换。本领域即是人员应当理解，可以对抗体或抗体片段进行氨基酸突变或修饰来改变其性能，例如改变抗体糖基化修饰的类型，改变形成链间二硫键的能力，或者为抗体缀合物的制备提供活性基团。包含这类氨基酸突变或修饰的抗体或其抗原结合片段也涵盖在本发明的抗体或其抗原结合片段的范围之内。
原始残基 示例性的保守置换 优选的置换
Ala(A) Val，Leu，Ile Val
Arg(R) Lys，Gln，Asn Lys
Asn(N) Gln，His，Asp，Lys，Arg Gln
Asp(D) Glu，Asn Glu
Cys(C) Ser，Ala Ser
Gln(Q) Asn，Glu Asn
Glu(E) Asp，Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn，Gln，Lys，Arg Arg
Ile(I) Leu，Val，Met，Ala，Phe Leu
Leu(L) Ile，Val，Met，Ala，Phe Ile
Lys(K) Arg，Gln，Asn Arg
Met(M) Leu，Phe，Ile Leu
Phe(F) Trp，Leu，Val，Ile，Ala，Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val，Ser Ser
Trp(W) Tyr，Phe Tyr
Tyr(Y) Trp，Phe，Thr，Ser Phe
Val(V) Ile，Leu，Met，Phe，Ala Leu
在本文中，术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，通常可以包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
如本文所用，“分离的”是指物质(例如核酸分子或多肽)与其存在的来源或环境是分离的，即基本上不包含其他任何成分。
在本文中，“载体”是用于将外源核酸导入宿主细胞的媒介，当载体转化入适当的宿主细胞时，外源核酸得以扩增或表达。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。如本文所用，载体的定义涵盖质粒、线性化质粒、病毒载体、粘粒、噬菌体载体、噬菌粒、人工染色体(例如，酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体)等。
如本文所用，“表达载体”指能够表达DNA的载体，所述DNA与能够影响DNA表达的调控序列(如启动子、核糖体结合位点)可操作地连接。调控序列可以包含启动子和终止子序列，并且任选地可以包含复制起点、选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体可以是质粒、噬菌体载体、重组病毒或其他载体，当引入适当的宿主细胞时，导致克隆DNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并且包含在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入宿主细胞基因组的表达载体。
如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、保持、复制或扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达核酸或载体所编码的多肽。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。
如本文所用，术语“治疗”指对疾病/症状的改善，例如使疾病/症状减轻或消失、防止或减缓疾病/症状的发生、进展和/或恶化。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。
“有效量”是指这样的剂量，其足以使疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。“有效量”指防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或症状所需的量。例如，对于肿瘤的治疗，相对于未接受治疗的对象，“有效量”的本发明的抗体或其抗原结合片段、抗体缀合物、免疫效应细胞或药物组合物优选地将肿瘤细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10％，优选 至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％。抑制肿瘤生长的效力可以利用本领域常规的肿瘤动物模型评估，例如自发性肿瘤、诱发性肿瘤、移植性肿瘤动物模型。或者，也可以利用本领域公知的体外检测方法检查抑制细胞生长的能力。有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段、抗体缀合物、免疫效应细胞或药物组合物能够减小肿瘤大小，或以其他方式缓解对象的症状(如预防和/或治疗转移或复发)。本领域技术人员可以根据例如对象的年龄、身体状况、性别、症状的严重程度、特定组合物或给药途径等因素来确定有效量。有效量可以在一次或多次施用中给予。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂、表面活性剂、佐剂、离子强度增强剂、稀释剂、维持渗透压的试剂、延迟吸收的试剂、防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水、水性缓冲液(如缓冲盐水)、醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞、2-苯氧乙醇、对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠、明胶、SPGA、糖类(如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、乳糖、葡聚糖、或葡萄糖)、氨基酸(如谷氨酸、甘氨酸)、蛋白质(如干燥乳清、白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。
如本文所用，哺乳动物的实例包括但不限于人、非人灵长类动物、大鼠、小鼠、牛、马、猪、羊、狗、猫等。在本文中，术语“对象”是指哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象是癌症患者、怀疑患有癌症或处于患癌风险中的人或者动物。在本文中，术语“对象”和“受试者”可以互换使用。
抗Nectin-4抗体或其抗原结合片段
在一总的方面，本发明提供了抗Nectin-4抗体或其抗原结合片段，其特异性识别并结合Nectin-4。
Nectin-4可以为包含人Nectin-4或非人Nectin-4全长或部分氨基酸序列的蛋白。优选地，所述Nectin-4为人Nectin-4。人Nectin-4可以例如具有Uniprot识别号(ID)： Q96NY8-1所示的氨基酸序列。非人Nectin-4可以例如是哺乳动物Nectin-4，例如非人灵长类动物食蟹猴Nectin-4，其可以具有例如Uniprot识别号(ID)：L0N6D9所示的氨基酸序列。非人Nectin-4还可以例如是大鼠Nectin-4，其可以具有例如Uniprot识别号(ID)：D3ZET1所示的氨基酸序列。非人Nectin-4还可以例如是小鼠Nectin-4，其可以具有例如Uniprot识别号(ID)：Q8R007所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合Nectin-4的IgV结构域。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合人Nectin-4的IgV结构域。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合Nectin-4并阻断其与Nectin-1的相互作用。
在一些实施方案中，所述抗Nectin-4抗体包含重链可变区(VH)，其包含3个重链CDRs(CDRH)：CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3选自表1中的CDRH组。
表1抗Nectin-4抗体的重链CDR
Figure PCTCN2021116651-APPB-000001
Figure PCTCN2021116651-APPB-000002
在一些实施方案中，所述抗Nectin-4抗体包含轻链可变区(VL)，其包含3个轻链CDR(CDRL)：CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3选自表2中的CDRL组。
表2抗Nectin-4抗体的轻链CDR
Figure PCTCN2021116651-APPB-000003
互补决定区(CDR)
在一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Chothia编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:3所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:4所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:5所示序列或其变体的CDR-H3。在另一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Chothia编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:6所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:7所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3。
在一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含 如下三个根据Abm编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:9所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:10所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:5所示序列或其变体的CDR-H3。在另一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Abm编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:6所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:7所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3。
在一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Kabat编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:11所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:12或63所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:5所示序列或其变体的CDR-H3。在另一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Kabat编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:6所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:7所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3。
在一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据IMGT编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:13所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:14所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:15所示序列或其变体的CDR-H3。在另一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据IMGT编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:16所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:17所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3。
在一具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：
(a)如下六个根据Chothia编号系统定义的重链和轻链的CDRs：包含SEQ ID NO:3所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:4所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:5所示序列或其变体的CDR-H3，包含SEQ ID NO:6所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:7所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；或
(b)如下六个根据Abm编号系统定义的重链和轻链的CDRs：包含SEQ ID NO:9所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:10所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:5所示序列或其变体的CDR-H3，包含SEQ ID NO:6所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:7所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；或
(c)如下六个根据Kabat编号系统定义的重链和轻链的CDRs：包含SEQ ID NO:11所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:12或63所示序列或其变体的 CDR-H2，包含SEQ ID NO:5所示序列或其变体的CDR-H3，包含SEQ ID NO:6所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:7所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；或
(d)如下六个根据IMGT编号系统定义的重链和轻链的CDRs：包含SEQ ID NO:13所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:14所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:15所示序列或其变体的CDR-H3，包含SEQ ID NO:16所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:17所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3。
在一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Chothia编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:21所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:22所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3。在另一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Chothia编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3。
在一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Abm编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:27所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:28所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3。在另一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Abm编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3。
在一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Kabat编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:29所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:30所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3。在另一些具体实施方案中所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Kabat编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3。
在一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据IMGT编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:31所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:32所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:33所示序列或其变体的CDR-H3。在另一些具体实施方案中，所述特异性结合 Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据IMGT编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:34所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:35所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3。
在一具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：
(a)如下六个根据Chothia编号系统定义的重链和轻链的CDRs：包含SEQ ID NO:21所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:22所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3，包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；或
(b)如下六个根据Abm编号系统定义的重链和轻链的CDRs：包含SEQ ID NO:27所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:28所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3，包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；或
(c)如下六个根据Kabat编号系统定义的重链和轻链的CDRs：包含SEQ ID NO:29所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:30所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3，包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；或
(d)如下六个根据IMGT编号系统定义的重链和轻链的CDRs：包含SEQ ID NO:31所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:32所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:33所示序列或其变体的CDR-H3，包含SEQ ID NO:34所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:35所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3。
在一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Chothia编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:18所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:22所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3。在另一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Chothia编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3
在一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Abm编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:36所示序列或其变 体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:28所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3。在另一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Abm编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3。
在一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Kabat编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:44所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:30所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3。在另一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Kabat编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3。
在一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据IMGT编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:54所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:32所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:33所示序列或其变体的CDR-H3。在另一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段还包含如下三个根据IMGT编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:34所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:35所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3。
在一具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：
(a)如下六个根据Chothia编号系统定义的重链和轻链的CDRs：包含SEQ ID NO:18所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:22所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3，包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；或
(b)如下六个根据Abm编号系统定义的重链和轻链的CDRs：包含SEQ ID NO:36所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:28所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3，包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；或
(c)如下六个根据Kabat编号系统定义的重链和轻链的CDRs：包含SEQ ID NO:44所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:30所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3，包含SEQ ID NO:24所示序列 或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；或
(d)如下六个根据IMGT编号系统定义的重链和轻链的CDRs：包含SEQ ID NO:54所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:32所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:33所示序列或其变体的CDR-H3，包含SEQ ID NO:34所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:35所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3。
在一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Chothia编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:39所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:40所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:41所示序列或其变体的CDR-H3。在另一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Chothia编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:42所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:43所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3。
在一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Abm编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:45所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:46所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:41所示序列或其变体的CDR-H3。在另一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Abm编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:42所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:43所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3。
在一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Kabat编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:47所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:48或64所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:41所示序列或其变体的CDR-H3。在另一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据Kabat编号系统定义的轻链CDRs：包含SEQ ID NO:42所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:43所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3。
在一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据IMGT编号系统定义的重链CDRs：包含SEQ ID NO:49所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:50所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:51所示序列或其变体的CDR-H3。在另一些具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含如下三个根据IMGT编号系统定义的轻链 CDRs：包含SEQ ID NO:52所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:53所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3。
在一具体实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：
(a)如下六个根据Chothia编号系统定义的重链和轻链的CDRs：包含SEQ ID NO:39所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:40所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:41所示序列或其变体的CDR-H3，包含SEQ ID NO:42所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:43所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；或
(b)如下六个根据Abm编号系统定义的重链和轻链的CDRs：包含SEQ ID NO:45所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:46所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:41所示序列或其变体的CDR-H3，包含SEQ ID NO:42所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:43所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；或
(c)如下六个根据Kabat编号系统定义的重链和轻链的CDRs：包含SEQ ID NO:47所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:48或64所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:41所示序列或其变体的CDR-H3，包含SEQ ID NO:42所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:43所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；或
(d)如下六个根据IMGT编号系统定义的重链和轻链的CDRs：包含SEQ ID NO:49所示序列或其变体的CDR-H1，包含SEQ ID NO:50所示序列或其变体的CDR-H2，包含SEQ ID NO:51所示序列或其变体的CDR-H3，包含SEQ ID NO:52所示序列或其变体的CDR-L1，包含SEQ ID NO:53所示序列或其变体的CDR-L2，包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3。
在如上所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段实施方案中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。
框架区(FR)
在一些实施方案中，所述VH还包含重链框架区(FR)。在另一些实施方案中，所述VL还包含轻链框架区(FR)。所述重链框架区和/或轻链框架区可以各自独立地衍生自任何物种免疫球蛋白的框架区。优选地，所述重链框架区和轻链框架区各自独 立地衍生自人或鼠免疫球蛋白的重链框架区和轻链框架区。在一实施方案中，所述重链框架区和轻链框架区各自独立地包含衍生自鼠免疫球蛋白的重链框架区和轻链框架区、人免疫球蛋白的重链框架区和轻链框架区或其组合的氨基酸序列。在一实施方案中，所述重链框架区和轻链框架区各自独立地包含衍生自人胚系抗体的重链框架区和轻链框架区的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含衍生自人免疫球蛋白的重链框架区，和/或所述抗体或其抗原结合片段的VL包含衍生自人免疫球蛋白的轻链框架区。因此，在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段是人源化的。在此类实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链框架区和/或轻链框架区可以包含一个或多个非人源(例如，鼠源)氨基酸残基，例如所述重链框架区和/或轻链框架区可以包含一或多个氨基酸回复突变，在这些回复突变中有相应的鼠源氨基酸残基。
在一优选实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:1所示序列或其变体的VH。在又一优选实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:2所示序列或其变体的VL。
在一优选实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:1所示序列或其变体的VH，和具有如SEQ ID NO:2所示序列或其变体的VL。
在一优选实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:55所示序列或其变体的VH。在又一优选实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:56所示序列或其变体的VL。
在一优选实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:55所示序列或其变体的VH，和具有如SEQ ID NO:56所示序列或其变体的VL。
在又一优选实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:19所示序列或其变体的VH。在又一优选实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:20所示序列或其变体的VL。
在又一优选实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:19所示序列或其变体的VH，和具有如SEQ ID NO:20所示序列或其变体的VL。
在又一优选实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含： 具有如SEQ ID NO:57所示序列或其变体的VH。在又一优选实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:58所示序列或其变体的VL。
在又一优选实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:57所示序列或其变体的VH，和具有如SEQ ID NO:58所示序列或其变体的VL。
在另一优选实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:37所示序列或其变体的VH。在又一优选实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:38所示序列或其变体的VL。
在另一优选实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:37所示序列或其变体的VH，和具有如SEQ ID NO:38所示序列或其变体的VL。
在另一优选实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:59所示序列或其变体的VH。在又一优选实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:60所示序列或其变体的VL。
在另一优选实施方案中，所述特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:59所示序列或其变体的VH，和具有如SEQ ID NO:60所示序列或其变体的VL。
在具体的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1)具有如SEQ ID NO:1所示序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:2所示序列或其变体的VL；或者
(2)具有如SEQ ID NO:19所示序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:20所示序列或其变体的VL；或者
(3)具有如SEQ ID NO:37所示序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:38所示序列或其变体的VL；或者
(4)具有如SEQ ID NO:55所示序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:56所示序列或其变体的VL；或者
(5)具有如SEQ ID NO:57所示序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:58所示序列或其变体的VL；或者
(6)具有如SEQ ID NO:59所示序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:60所示序列或其变体的VL。
在如上所述的实施方案中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。或者，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)。优选地，所述置换是保守置换。
恒定区
在一些实施方案中，所述抗Nectin-4抗体进一步包含重链恒定区。在另一实施方案中，所述抗Nectin-4抗体进一步包含轻链恒定区。重链恒定区和轻链恒定区可以各自独立地衍生自任何物种的免疫球蛋白的重链恒定区和轻链恒定区。在优选的实施方案中，重链恒定区和轻链恒定区各自独立地衍生自鼠免疫球蛋白的重链恒定区或其变体和轻链恒定区或其变体。在更优选的实施方案中，重链恒定区和轻链恒定区各自独立地衍生自人免疫球蛋白的重链恒定区或其变体和轻链恒定区或其变体。所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)。
所述重链恒定区可以包含选自至少一部分铰链区、CH1、CH2、CH3或其组合的氨基酸序列。在一实施方案中，所述重链恒定区包含CH1。在一实施方案中，所述重链恒定区包含CH1-铰链区-CH2。在一实施方案中，所述重链恒定区包含CH1-铰链区-CH2-CH3。在一些实施方案中，重链恒定区还包含CH4。重链恒定区可以衍生自任何亚型(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的免疫球蛋白的重链恒定区或其组合。优选地，重链恒定区衍生自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)重链恒定区。在一优选实施方案中，所述重链恒定区衍生自人IgG1重链恒定区。
所述轻链恒定区可以衍生自λ(Lambda)轻链或κ(Kappa)轻链恒定区。在一优选实施方案中，所述轻链恒定区为人κ轻链恒定区。
在一具体实施方案中，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:61的序列或其变体。在一具体实施方案中，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:62的序列或其变体。在这些实施方案中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。或者，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)。
在一具体实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中：
(a)所述重链包含：具有SEQ ID NO:1所示序列或其变体的VH和具有SEQ ID NO:61所示序列或其变体的重链恒定区，所述轻链包含：具有SEQ ID NO:2所示序列或其变体的VL和具有SEQ ID NO:62所示序列或其变体的轻链恒定区；或者(b)所述重链包含：具有SEQ ID NO:19所示序列或其变体的VH和具有SEQ ID NO:61所示序列或其变体的重链恒定区，所述轻链包含：具有SEQ ID NO:20所示序列或其变体的VL和具有SEQ ID NO:62所示序列或其变体的轻链恒定区；或者(c)所述重链包含：具有SEQ ID NO:37所示序列或其变体的VH和具有SEQ ID NO:61所示序列或其变体的重链恒定区，所述轻链包含：具有SEQ ID NO:38所示序列或其变体的VL和具有SEQ ID NO:62所示序列或其变体的轻链恒定区；或者(d)所述重链包含：具有SEQ ID NO:55所示序列或其变体的VH和具有SEQ ID NO:61所示序列或其变体的重链恒定区，所述轻链包含：具有SEQ ID NO:56所示序列或其变体的VL和具有SEQ ID NO:62所示序列或其变体的轻链恒定区；或者(e)所述重链包含：具有SEQ ID NO:57所示序列或其变体的VH和具有SEQ ID NO:61所示序列或其变体的重链恒定区，所述轻链包含：具有SEQ ID NO:58所示序列或其变体的VL和具有SEQ ID NO:62所示序列或其变体的轻链恒定区；或者(f)所述重链包含：具有SEQ ID NO:59所示序列或其变体的VH和具有SEQ ID NO:61所示序列或其变体的重链恒定区，所述轻链包含：具有SEQ ID NO:60所示序列或其变体的VL和具有SEQ ID NO:62所示序列或其变体的轻链恒定区。
在一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段选自scFv、Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv片段、二硫键稳定的Fv(dsFv)、双抗体、双特异性抗体和多特异性抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
鼠源抗体
在一实施方案中，本发明的抗Nectin-4抗体为鼠源抗体，其包含VH和VL，所述VH包含以上所述的重链CDR和重链框架区，所述VL包含以上所述的轻链CDR和轻链框架区，其中所述重链框架区和轻链框架区各自独立地包含衍生自鼠免疫球蛋白框架区的氨基酸序列。在一实施方案中，本发明的抗Nectin-4抗体是从小鼠杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。
在一具体实施方案中，鼠源抗体包含VH，其包含表1中组a所述的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3以及重链框架区，所述重链框架区包含衍生自鼠免疫球蛋白框架区的氨基酸序列。在一优选实施方案中，鼠源抗体包含具有如SEQ ID NO:1所示序列 或其变体的VH。在又一具体实施方案中，鼠源抗体还包含VL，其包含表2中组a所述的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3以及轻链框架区，所述轻链框架区包含衍生自鼠免疫球蛋白框架区的氨基酸序列。在一优选实施方案中，鼠源抗体包含具有如SEQ ID NO:2所示序列或其变体的VL。
在另一具体实施方案中，鼠源抗体包含VH，其包含表1中组b所述的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3以及重链框架区，所述重链框架区包含衍生自鼠免疫球蛋白框架区的氨基酸序列。在一优选实施方案中，鼠源抗体包含具有如SEQ ID NO:19所示序列或其变体的VH。在又一具体实施方案中，鼠源抗体还包含VL，其包含表2中组b所述的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3以及轻链框架区，所述轻链框架区包含衍生自鼠免疫球蛋白框架区的氨基酸序列。在一优选实施方案中，鼠源抗体包含具有如SEQ ID NO:20所示序列或其变体的VL。
在又一具体实施方案中，鼠源抗体包含VH，其包含表1中组c所述的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3以及重链框架区，所述重链框架区包含衍生自鼠免疫球蛋白框架区的氨基酸序列。在一优选实施方案中，鼠源抗体包含具有如SEQ ID NO:37所示序列或其变体的VH。在又一具体实施方案中，鼠源抗体还包含VL，其包含表2中组c所述的CDRL1、CDR-L2、CDR-L3以及轻链框架区，所述轻链框架区包含衍生自鼠免疫球蛋白框架区的氨基酸序列。在一优选实施方案中，鼠源抗体包含具有如SEQ ID NO:38所示序列或其变体的VL。
在如上所述的实施方案中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。或者，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)。优选地，所述置换是保守置换。
在一具体实施方案中，鼠源抗体包含具有如SEQ ID NO:1所示序列的VH以及具有如SEQ ID NO:2所示序列的VL。
在另一具体实施方案中，鼠源抗体包含具有如SEQ ID NO:19所示序列的VH以及具有如SEQ ID NO:20所示序列的VL。
在又一具体实施方案中，鼠源抗体包含具有如SEQ ID NO:37所示序列的VH以及具有如SEQ ID NO:38所示序列的VL。
嵌合抗体
在一实施方案中，本发明的抗Nectin-4抗体为嵌合抗体。在一些实施方案中，所述嵌合抗体包含以上所述鼠源抗体的重链CDR和/或轻链CDR。在一些实施方案中， 所述嵌合抗体包含以上所述鼠源抗体的重链可变区和/或轻链可变区。在一些实施方案中，所述嵌合抗体包含以上所述鼠源抗体的重链可变区和轻链可变区，以及重链恒定区和/或轻链恒定区，所述重链恒定区衍生自非鼠源免疫球蛋白的重链恒定区，和/或所述轻链恒定区衍生自非鼠源免疫球蛋白的轻链恒定区。在一优选实施方案中，所述重链恒定区衍生人免疫球蛋白的重链恒定区，和/或所述轻链恒定区衍生自人免疫球蛋白的轻链恒定区。在一优选实施方案中，所述重链恒定区衍生自人免疫球蛋白的重链恒定区，所述轻链恒定区衍生自人免疫球蛋白的轻链恒定区。
在一些实施方案中，嵌合抗体包含表1中组a所述鼠源抗体的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3。在一些实施方案中，嵌合抗体还包含表2中组a所述鼠源抗体的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3。
在一具体实施方案中，嵌合抗体包含具有如SEQ ID NO:1所示序列或其变体的VH。在一具体实施方案中，嵌合抗体还包含具有如SEQ ID NO:2所示序列或其变体的VL。
在另一具体实施方案中，嵌合抗体包含具有如SEQ ID NO:19所示序列或其变体的VH。在一具体实施方案中，嵌合抗体还包含具有如SEQ ID NO:20所示序列或其变体的VL。
在又一具体实施方案中，嵌合抗体包含具有如SEQ ID NO:37所示序列或其变体的VH。在一具体实施方案中，嵌合抗体还包含具有如SEQ ID NO:38所示序列或其变体的VL。
在如上所述的实施方案中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。或者，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)。优选地，所述置换是保守置换。
在一些实施方案中，如上所述的嵌合抗体还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。在一优选实施方案中，所述重链恒定区衍生自人免疫球蛋白的重链恒定区，所述轻链恒定区衍生自人免疫球蛋白的轻链恒定区。在一实施方案中，所述重链恒定区衍生自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。在一实施方案中，所述重链恒定区衍生自人IgG1重链恒定区。在一实施方案中，所述轻链恒定区衍生自人λ或κ轻链恒定区。在一实施方案中，所述轻链恒定区衍生自人κ轻链恒定区。在一具体实施方案中，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列或其变体。在一具体实施方案中，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或其变体。在这些实施方案中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、 至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。或者，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)。
在一具体实施方案中，嵌合抗体包含重链和轻链，所述重链包含：具有如SEQ ID NO:1所示序列的VH和具有如SEQ ID NO:61所示序列的重链恒定区，所述轻链包含：具有如SEQ ID NO:2所示序列的VL和具有如SEQ ID NO:62所示序列的轻链恒定区。
在另一具体实施方案中，嵌合抗体包含重链和轻链，所述重链包含：具有如SEQ ID NO:19所示序列的VH和具有如SEQ ID NO:61所示序列的重链恒定区，所述轻链包含：具有如SEQ ID NO:20所示序列的VL和具有如SEQ ID NO:62所示序列的轻链恒定区。
在又一具体实施方案中，嵌合抗体包含重链和轻链，所述重链包含：具有如SEQ ID NO:37所示序列的VH和具有如SEQ ID NO:61所示序列的重链恒定区，所述轻链包含：具有如SEQ ID NO:38所示序列的VL和具有如SEQ ID NO:62所示序列的轻链恒定区。
人源化抗体
在一实施方案中，本发明的抗Nectin-4抗体为人源化抗体，其包含VH和VL，所述VH包含以上所述的重链CDR和重链框架区，所述VL包含以上所述的轻链CDR和轻链框架区，其中所述重链框架区和轻链框架区各自独立地包含衍生自人免疫球蛋白重链框架区和轻链框架区的氨基酸序列。在此类实施方案中，所述重链框架区和/或轻链框架区可以包含一个或多个非人源(例如，鼠源)氨基酸残基，例如所述重链框架区和/或轻链框架区可以包含一或多个氨基酸回复突变，在这些回复突变中有相应的鼠源氨基酸残基。人源化抗体可以由非人抗体(例如鼠源抗体或嵌合抗体)产生。在一实施方案中，人源化抗体如本发明实施例所述由本发明的抗Nectin-4鼠源抗体制备。
在一具体实施方案中，人源化抗体包含如上所述鼠源抗体的CDR-H1或其变体、CDR-H2或其变体、CDR-H3或其变体。在一具体实施方案中，人源化抗体还包含如上所述鼠源抗体的CDR-L1或其变体、CDR-L2或其变体、CDR-L3或其变体。
在一具体实施方案中，人源化抗体包含VH，其包含如上所述鼠源抗体的CDR-H1或其变体、CDR-H2或其变体、CDR-H3或其变体，以及重链框架区，所述重链框架区包含衍生自人免疫球蛋白重链框架区的氨基酸序列。在又一具体实施方案中，人源化抗体还包含VL，其包含如上所述鼠源抗体的CDR-L1或其变体、CDR-L2或其变体、 CDR-L3或其变体以及轻链框架区，所述轻链框架区包含衍生自人免疫球蛋白轻链框架区的氨基酸序列。
在一具体实施方案中，人源化抗体包含VH，根据Chothia编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:3所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:4所示的CDR-H2、如SEQ ID NO:5所示的CDR-H3，以及重链框架区，所述重链框架区包含衍生自人免疫球蛋白重链框架区的氨基酸序列。在又一具体实施方案中，人源化抗体还包含VL，根据Chothia编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:6所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:7所示的CDR-L2、如SEQ ID NO:8所示的CDR-L3以及轻链框架区，所述轻链框架区包含衍生自人免疫球蛋白轻链框架区的氨基酸序列。
在一具体实施方案中，人源化抗体包含VH，根据Abm编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:9所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:10所示的CDR-H2、如SEQ ID NO:5所示的CDR-H3，以及重链框架区，所述重链框架区包含衍生自人免疫球蛋白重链框架区的氨基酸序列。在又一具体实施方案中，人源化抗体还包含VL，根据Abm编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:6所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:7所示的CDR-L2、如SEQ ID NO:8所示的CDR-L3以及轻链框架区，所述轻链框架区包含衍生自人免疫球蛋白轻链框架区的氨基酸序列。
在一具体实施方案中，人源化抗体包含VH，根据Kabat编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:11所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:12或63所示的CDR-H2、如SEQ ID NO:5所示的CDR-H3，以及重链框架区，所述重链框架区包含衍生自人免疫球蛋白重链框架区的氨基酸序列。在又一具体实施方案中，人源化抗体还包含VL，根据Kabat编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:6所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:7所示的CDR-L2、如SEQ ID NO:8所示的CDR-L3以及轻链框架区，所述轻链框架区包含衍生自人免疫球蛋白轻链框架区的氨基酸序列。
在一具体实施方案中，人源化抗体包含VH，根据IMGT编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:13所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:14所示的CDR-H2、如SEQ ID NO:15所示的CDR-H3，以及重链框架区，所述重链框架区包含衍生自人免疫球蛋白重链框架区的氨基酸序列。在又一具体实施方案中，人源化抗体还包含VL，根据IMGT编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:16所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:17所示的CDR-L2、如SEQ ID NO:8所示的CDR-L3以及轻链框架区，所述轻链框架区包含衍生自人免疫球蛋白轻链框架区的氨基酸序列。
在一具体实施方案中，人源化抗体包含具有如SEQ ID NO:56所示序列或其变体的VL。在一实施方案中，人源化抗体包含具有如SEQ ID NO:55所示序列或其变体的VH。
在一具体实施方案中，人源化抗体包含VH，根据Chothia编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:21或18所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:22所示的CDR-H2、如SEQ ID NO:23所示的CDR-H3，以及重链框架区，所述重链框架区包含衍生自人免疫球蛋白重链框架区的氨基酸序列。在又一具体实施方案中，人源化抗体还包含VL，根据Chothia编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:24所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:25所示的CDR-L2、如SEQ ID NO:26所示的CDR-L3以及轻链框架区，所述轻链框架区包含衍生自人免疫球蛋白轻链框架区的氨基酸序列。
在一具体实施方案中，人源化抗体包含VH，根据Abm编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:27或36所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:28所示的CDR-H2、如SEQ ID NO:23所示的CDR-H3，以及重链框架区，所述重链框架区包含衍生自人免疫球蛋白重链框架区的氨基酸序列。在又一具体实施方案中，人源化抗体还包含VL，根据Abm编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:24所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:25所示的CDR-L2、如SEQ ID NO:26所示的CDR-L3以及轻链框架区，所述轻链框架区包含衍生自人免疫球蛋白轻链框架区的氨基酸序列。
在一具体实施方案中，人源化抗体包含VH，根据Kabat编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:29或44所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:30所示的CDR-H2、如SEQ ID NO:23所示的CDR-H3，以及重链框架区，所述重链框架区包含衍生自人免疫球蛋白重链框架区的氨基酸序列。在又一具体实施方案中，人源化抗体还包含VL，根据Kabat编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:24所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:25所示的CDR-L2、如SEQ ID NO:26所示的CDR-L3以及轻链框架区，所述轻链框架区包含衍生自人免疫球蛋白轻链框架区的氨基酸序列。
在一具体实施方案中，人源化抗体包含VH，根据IMGT编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:31或54所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:32所示的CDR-H2、如SEQ ID NO:33所示的CDR-H3，以及重链框架区，所述重链框架区包含衍生自人免疫球蛋白重链框架区的氨基酸序列。在又一具体实施方案中，人源化抗体还包含VL，根据IMGT编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:34所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:35所示的CDR-L2、如SEQ ID NO:26所示的CDR-L3以及轻链框架区，所述轻链框架区包含衍生自人免疫球蛋白轻链框架区的氨基酸序列。
在一具体实施方案中，人源化抗体包含具有如SEQ ID NO:58所示序列或其变体的VL。在一实施方案中，人源化抗体包含具有如SEQ ID NO:57所示序列或其变体的VH。
在一具体实施方案中，人源化抗体包含VH，根据Chothia编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:39所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:40所示的CDR-H2、如SEQ ID NO: 41所示的CDR-H3，以及重链框架区，所述重链框架区包含衍生自人免疫球蛋白重链框架区的氨基酸序列。在又一具体实施方案中，人源化抗体还包含VL，根据Chothia编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:42所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:43所示的CDR-L2、如SEQ ID NO:8所示的CDR-L3以及轻链框架区，所述轻链框架区包含衍生自人免疫球蛋白轻链框架区的氨基酸序列。
在一具体实施方案中，人源化抗体包含VH，根据Abm编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:45所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:46所示的CDR-H2、如SEQ ID NO:41所示的CDR-H3，以及重链框架区，所述重链框架区包含衍生自人免疫球蛋白重链框架区的氨基酸序列。在又一具体实施方案中，人源化抗体还包含VL，根据Abm编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:42所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:43所示的CDR-L2、如SEQ ID NO:8所示的CDR-L3以及轻链框架区，所述轻链框架区包含衍生自人免疫球蛋白轻链框架区的氨基酸序列。
在一具体实施方案中，人源化抗体包含VH，根据Kabat编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:47所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:48或64所示的CDR-H2、如SEQ ID NO:41所示的CDR-H3，以及重链框架区，所述重链框架区包含衍生自人免疫球蛋白重链框架区的氨基酸序列。在又一具体实施方案中，人源化抗体还包含VL，根据Kabat编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:42所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:43所示的CDR-L2、如SEQ ID NO:8所示的CDR-L3以及轻链框架区，所述轻链框架区包含衍生自人免疫球蛋白轻链框架区的氨基酸序列。
在一具体实施方案中，人源化抗体包含VH，根据IMGT编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:49所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:50所示的CDR-H2、如SEQ ID NO:51所示的CDR-H3，以及重链框架区，所述重链框架区包含衍生自人免疫球蛋白重链框架区的氨基酸序列。在又一具体实施方案中，人源化抗体还包含VL，根据IMGT编号系统定义，其包含如SEQ ID NO:52所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:53所示的CDR-L2、如SEQ ID NO:8所示的CDR-L3以及轻链框架区，所述轻链框架区包含衍生自人免疫球蛋白轻链框架区的氨基酸序列。
在一实施方案中，人源化抗体包含具有如SEQ ID NO:60所示序列或其变体的VL。在一实施方案中，人源化抗体包含具有如SEQ ID NO:59所示序列或其变体的VH。
在如上所述的实施方案中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。或者，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个， 3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)。优选地，所述置换是保守置换。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含下述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中，所述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)与前述人源化抗体中所述的重链可变区和/或轻链可变区相比，至少一个CDR和/或框架区含有氨基酸突变，所述氨基酸突变为一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)。优选地，所述置换为保守置换。
在一些实施方案中，抗Nectin-4人源化抗体还包含重链恒定区。在一实施方案中，所述重链恒定区衍生自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。在一实施方案中，所述重链恒定区衍生自人IgG1重链恒定区。在一实施方案中，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列或其变体。
在一些实施方案中，抗Nectin-4人源化抗体还包含轻链恒定区。在一实施方案中，所述轻链恒定区衍生自人λ或κ轻链恒定区。在一实施方案中，所述轻链恒定区衍生自人κ轻链恒定区。在一实施方案中，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或其变体。
在如上所述的实施方案中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。或者，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)。
在一具体实施方案中，人源化抗体包含重链和轻链，所述重链包含：具有SEQ ID NO:55所示序列的VH和具有SEQ ID NO:61所示序列的重链恒定区，所述轻链包含：具有SEQ ID NO:56所示序列的VL和具有SEQ ID NO:62所示序列的轻链恒定区。
在一具体实施方案中，人源化抗体包含重链和轻链，所述重链包含：具有SEQ ID NO:57所示序列的VH和具有SEQ ID NO:61所示序列的重链恒定区，所述轻链包含：具有SEQ ID NO:58所示序列的VL和具有SEQ ID NO:62所示序列的轻链恒定区。
在一具体实施方案中，人源化抗体包含重链和轻链，所述重链包含：具有SEQ ID NO:59所示序列的VH和具有SEQ ID NO:61所示序列的重链恒定区，所述轻链包含：具有SEQ ID NO:60所示序列的VL和具有SEQ ID NO:62所示序列的轻链恒定区。
可以使用本领域已知的方法制备和生产本发明的抗Nectin-4抗体或其抗原结合片段。这类方法可以包括例如，从噬菌体展示文库、酵母展示文库、永生化的B细胞(例如， 小鼠B细胞杂交瘤细胞或EBV永生化的B细胞)制备和分离抗体或抗原结合片段。还可以用免疫动物的方法，例如用抗原或编码抗原的DNA免疫动物(例如小鼠)，从免疫后的动物分离表达抗体的B细胞。优选地，将表达抗体的B细胞永生化，例如制备成杂交瘤或EBV永生化的B细胞。还可以用编码本发明的抗体或其抗原结合片段的核酸分子或表达载体转化宿主细胞，然后从宿主细胞中表达本发明的抗Nectin-4或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明的抗Nectin-4抗体由免疫后的动物中获得，例如由用人Nectin-4蛋白免疫的小鼠中获得。
多特异性抗体
在一方面，本发明提供了一种多特异性抗体，其包含本发明的抗Nectin-4抗体或其抗原结合片段以及至少一种其他抗体或其抗原结合片段或者抗体类似物，使得所述多特异性抗体能够结合Nectin-4以及至少一种其他抗原。
在一实施方案中，所述多特异性抗体为双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。在一实施方案中，多特异性抗体为双特异性双抗体，其包含第一scFv(或scdsFv)和第二scFv(或scdsFv)，其中第一scFv(或scdsFv)包含通过短肽接头连接的本发明的VH和其他抗体的VL，第二scFv(或scdsFv)包含通过短肽接头连接的本发明的VL和所述其他抗体的VH，所述其他抗体结合Nectin-4以外的抗原，所述短肽接头包含5-10个氨基酸残基。
在一实施方案中，其他抗原为细胞表面蛋白、受体或受体亚基。细胞表面蛋白可以例如是免疫细胞受体。免疫细胞可以例如是免疫效应细胞，例如自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、细胞毒性T(CTL)细胞。在一优选实施方案中，双特异性抗体可以同时结合Nectin-4和PD-1。
多特异性抗体为多价抗体，例如可以为二价、三价、四价或更多价。
在一优选实施方案中，多特异性抗体包含的抗原结合片段选自scFv、dsFv、scdsFv、Fab、scFab、Fab'、F(ab') 2。
多特异性抗体还可以包含抗体重链恒定区和/或轻链恒定区。重链恒定区可以包含选自至少一部分铰链区、CH1、CH2、CH3或其组合的氨基酸序列。优选地，所述重链恒定区具有CH1。
利用感兴趣的抗体或抗体片段构建多特异性抗体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如国际专利申请公布号WO 93/08829；Suresh et al.,(1986)Methods in Enzymology,121:210；Traunecker et al.,(1991)EMBO,10:3655-3659)。
可以利用本领域已知的各种技术产生和分离多特异性抗体。例如，可以用重组DNA技术获得编码多特异性抗体的核酸分子，任选地将所述核酸分子克隆入表达载体，然后 用所述核酸分子或表达载体转化宿主细胞，在合适的条件下培养转化的宿主细胞以允许所述核酸或表达载体表达，最后从宿主细胞或培养基中分离和纯化多特异性抗体。
融合蛋白
在又一方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段，以及另外的生物活性多肽。
在优选的实施方案中，所述另外的生物活性多肽是具有治疗活性、结合活性或酶活性的多肽或蛋白。生物活性多肽的非限制性实例可以包括但不限于：蛋白毒素(例如白喉毒素、蓖麻毒素)、酶(例如脲酶、辣根过氧化物酶)、细胞因子。
核酸、载体和宿主细胞
在另一方面，本发明提供了一种核酸分子，其包含编码本发明的抗Nectin-4抗体或抗原结合片段的多核苷酸序列。可以利用本领域已知的方法获得所述核酸，例如，分离自噬菌体展示文库、酵母展示文库、免疫动物、永生化的细胞(例如，小鼠B细胞杂交瘤细胞、EBV介导的永生化B细胞)或者化学合成。本发明的核酸分子可以针对用于表达的宿主细胞进行密码子优化。所述核酸分子可以是分离的。
在又一方面，本发明还提供了包含所述核酸分子的载体。在一实施方案中，本发明的核酸分子制备为重组核酸。在一实施方案中，将本发明的核酸分子克隆入表达载体中。表达载体可以进一步包含额外的多核苷酸序列，例如调控序列和抗生素抗性基因。可使用本领域众所周知的技术制备包含本发明的核酸的所述重组核酸，例如化学合成、DNA重组技术(例如聚合酶链式反应(PCR)技术)等(参见Sambrook,J.,E.F.Fritsch,and T.Maniatis.(1989).Molecular cloning:a laboratory manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)。表达载体还可以包含编码多肽或蛋白的多核苷酸序列，所述多肽或蛋白可促进所表达抗体或抗原结合片段的检测和/或分离。这类多肽或蛋白可以包括但不限于亲和标签(例如生物素、聚组氨酸标签(His 6)或谷胱甘肽S-转移酶(GSH)标签)、包含蛋白酶切割位点的多肽和报告蛋白(例如荧光蛋白)。本发明的核酸分子可以存在于一种或多种载体中。在一些实施方案中，所述表达载体为DNA质粒，例如用于在细菌、酵母或哺乳动物细胞中表达的DNA质粒。在另一些实施方案中，所述表达载体为病毒载体。在其他实施方案中，表达载体为噬菌体载体或噬菌粒载体。
本发明还提供了一种宿主细胞，其包含至少一个如上所述的核酸或载体。在优选的实施方案中，本文的宿主细胞用于表达本发明的抗Nectin-4抗体或其抗原结合片段。宿主细胞的实例包括但不限于原核细胞(例如细菌，例如大肠杆菌)、真核细胞(例如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞)。
细菌(例如，大肠杆菌BL21(DE3))对于表达较小的抗原结合片段，例如Fv，scFv，Fab和Fab'片段特别有利。在一些实施方案中，将编码重链可变区和轻链可变区的核酸分子克隆到单个载体中并导入BL21(DE3)。适合于抗体表达的哺乳动物宿主细胞包括但不限于骨髓瘤细胞、HeLa细胞、HEK细胞(例如HEK 293细胞)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和其他适于表达抗体的哺乳动物细胞。
本发明还提供了一种在宿主细胞中产生本发明的抗Nectin-4抗体或抗原结合片段的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(Ⅰ)用至少一种本文所述的核酸或表达载体转化宿主细胞，
(Ⅱ)在合适的条件下培养转化的宿主细胞以允许所述核酸或表达载体表达，和
(Ⅲ)从宿主细胞或培养基中分离和纯化本发明的抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，使用单一的载体，其包含编码重链和轻链的多核苷酸序列。在一些实施方案中，使用两种载体，其中一种载体编码抗体的轻链，而另一种编码抗体的重链。在一些实施方案中，宿主细胞还包含伴侣质粒，其可以帮助提高抗体或抗体片段的溶解性、稳定性和/或折叠。从宿主细胞中分离和纯化抗体的技术是本领域技术人员所熟知的。
抗体缀合物
本发明还提供了一种抗体缀合物，其包含与至少一种治疗剂缀合的本发明的抗体或其抗原结合片段。抗体药物缀合物(ADC)是一种典型的抗体缀合物，其中所述治疗剂可以例如为细胞毒性剂。
在一些优选的实施方案中，本发明的抗体缀合物能够靶向Nectin-4阳性的靶细胞并追踪或杀死靶细胞。在一些更优选的实施方案中，本发明的抗体缀合物选择性地杀死Nectin-4阳性癌细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞选自胃癌细胞、乳腺癌细胞、膀胱癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、头颈癌细胞和卵巢癌细胞。
治疗剂可以选自细胞毒性剂、治疗性抗体(例如与另外的抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段)、放射性同位素、寡核苷酸及其类似物(例如干扰RNA)、生物活性肽、蛋白毒素(例如白喉毒素、蓖麻毒素)和酶(例如脲酶)。细胞毒性剂是指抑制或降低细胞的活性、功能和/或杀死细胞的物质。细胞毒性剂的实例可以包括但不限于：类美登素(maytansinoid)(例如美登素(maytansine)、奥利斯他汀类(例如MMAF、MMAE、MMAD)、多司他汀(duostatin)、念珠藻环肽(cryptophycin)、长春花生物碱类(例如长春碱、长春新碱)、秋水仙碱类、海兔毒素类、紫杉烷、紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、烯二炔类抗生素、细胞松弛素类、喜树碱类、蒽环类抗生素(例如道诺霉素(daunorubicin)、二羟基蒽二酮(dihydroxyanthracindione)、多柔比星(doxorubicin))、细胞毒性抗生素(例如丝裂霉素 (mitomycin)、放线菌素(actinomycin)、倍癌霉素(duocarmycin)(例如CC-1065)、金霉素(auromycin)、多霉素(duomycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、内孢霉素(endomycin)、酚霉素(phenomycin))、阿霉素、柔红霉素、卡奇霉素、顺铂(cisplatin)、溴化乙锭(ethidiumbromide)、博来霉素、丝裂霉素、光辉霉素、普拉地内酯、鬼臼毒素、依托泊苷(etoposide)、米托蒽醌、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他滨、巯嘌呤、喷司他丁、氟达拉滨、克拉屈滨、奈拉滨、卡莫司汀、洛莫司汀、甲氨蝶呤、苯丙氨酸氮芥、替尼泊苷(tenoposide)、糖皮质激素等。
放射性同位素可以选自例如 212Bi、 213Bi、 131I、 125I、 111In、 177Lu、 186Re、 188Re、 153Sm、 90Y。用放射性同位素标记的抗体又可称为放射免疫缀合物。
在一实施方案中，治疗剂为具有抗肿瘤生物活性的分子。具有抗肿瘤生物活性的分子包括但不限于细胞毒性剂、化疗剂、放射性同位素、免疫检查点抑制剂、靶向肿瘤特异性抗原的抗体和其他抗肿瘤药物。在优选一实施方案中，治疗剂为细胞毒性剂。在又一优选实施方案中，治疗剂为放射性同位素。
在一具体实施方案中，治疗剂为
Figure PCTCN2021116651-APPB-000004
Figure PCTCN2021116651-APPB-000005
可以利用本领域已知的任何技术将治疗剂与本发明的抗体或抗原结合片段通过接头缀合。所述接头可以包含用于共价缀合的活性基团，例如胺、羟胺、马来酰亚胺基、羧基、苯基、硫醇、巯基或羟基。接头可为可切割的或不可切割的。可切割的接头例如酶可切割的接头(例如，包含蛋白酶切割位点的肽)、pH敏感的接头(例如，腙类接头)或可还原的接头(例如，二硫键)。
在一实施方案中，接头包含选自胺、羟胺、马来酰亚胺基、羧基、苯基、硫醇、巯基和羟基的活性基团。在一实施方案中，接头为化学键。在一实施方案中，接头包含氨基酸或2-10个氨基酸组成的肽。氨基酸可以是天然或非天然氨基酸。
在一优选实施方案中，接头选自Val、Cit、Phe、Lys、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、
Figure PCTCN2021116651-APPB-000006
Figure PCTCN2021116651-APPB-000007
Figure PCTCN2021116651-APPB-000008
其中1和2中的一个表示接头与本发明的抗体或其抗原结合片段连接的位置，另一个表示接头与治疗剂连接的位置。
在一些实施方案中，在与本发明的抗体或抗原结合片段缀合之前，先将治疗剂和接头缀合形成中间体。在一些实施方案中，中间体通过与本发明的抗体或抗原结合片段上的巯基形成硫醚键而连接。这类中间体的结构和制备方法以及使用其制备抗体缀合物的方法描述于例如国际专利申请公布号WO2019/114666，其相关内容整体援引加入本文。
在一实施方案中，所述抗体缀合物具有式(Ⅰ)所示结构，
A-(L-D) γ
(Ⅰ)；
其中，A为本发明的抗体或其抗原结合片段；
L为接头；优选地，L包含氨基酸或2-10个氨基酸组成的肽；进一步优选地，L选自Val、Cit、Phe、Lys、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、
Figure PCTCN2021116651-APPB-000009
Figure PCTCN2021116651-APPB-000010
Figure PCTCN2021116651-APPB-000011
其中1和2中的一个表示L与A连接的位置，另一个表示L与D连接的位置；
D为治疗剂；优选地，D选自细胞毒性剂、治疗性抗体、放射性同位素、寡核苷酸及其类似物、生物活性肽、蛋白毒素和酶；更优选地，D为具有抗肿瘤生物活性的 分子；进一步优选地，D为
Figure PCTCN2021116651-APPB-000012
Figure PCTCN2021116651-APPB-000013
γ表示连接至A的(L-D)部分的数量，其为1-10的整数。
在一具体实施方案中，(L-D)部分具有式(1)的结构，其通过与本发明的抗体或其抗原结合片段与具有式(1)结构的化合物上的巯基形成硫醚键而连接,
Figure PCTCN2021116651-APPB-000014
且本发明的抗体缀合物具有式(2)的结构：
Figure PCTCN2021116651-APPB-000015
其中A为本发明的抗体或抗原结合片段，γ指通过与A的巯基形成硫醚键而连接至A的(L-D)部分的数量，其为1-10的整数。在一具体实施方案中，A为本发明的抗人Nectin-4人源化单克隆抗体。
在又一方面，本发明提供一种组合物，其含有本发明的抗体缀合物。在一实施方案中，所述组合物中治疗剂与本发明的抗Nectin-4抗体或其抗原结合片段的摩尔比(DAR值)为1-10之间的小数或整数，例如1-8之间的小数或整数，例如1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.79、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、6.95、7.0、7.03、7.1、7.12、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。
CAR和表达CAR的免疫效应细胞
本发明的抗体或其抗原结合片段可用于构建嵌合抗原受体(CAR)。因此，在另一方面，本发明还提供一种嵌合抗原受体(CAR)。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体(CAR)”是一种人工受体，其特异性识别并结合靶标(例如癌细胞表面上表达的抗原)，例如通过包含特异性结合癌细胞表面上的抗原的抗原结合片段，并且可以赋予在表面表达CAR的细胞(例如免疫效应细胞)靶标特异性。优选地，CAR对靶标的识别导致表达CAR的免疫效应细胞的活化和/或扩增。
在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包含本发明的特异性结合Nectin-4抗体或其抗原结合片段(例如，scFv)、跨膜结构域、以及一个或多个细胞内T细胞信号结构域。在此类实施方案中，本发明还提供核酸分子，所述核酸分子可以包含编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述编码嵌合抗原受体的核苷酸序列进一步包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段(例如ScFv)的核苷酸序列。在某些实施方案中，本发明的核酸分子编码包含本发明抗体的抗原结合片段(例如ScFv)的嵌合抗原受体。所述核酸分子可以是分离的。
在又一方面，本发明还提供一种免疫效应细胞，其经基因修饰从而在表面表达本发明的CAR。优选地，免疫效应细胞选自T淋巴细胞(例如细胞毒性T细胞(CTL))、 自然杀伤细胞(NK)和自然杀伤T细胞(NKT)。免疫效应细胞靶向Nectin-4阳性的病变细胞(例如，Nectin-4阳性的癌细胞)，并被激活以启动效应功能，例如，引起Nectin-4阳性的癌细胞的死亡。
在又一方面，本发明还涉及编码所述CAR的核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体和表达所述CAR的免疫细胞(例如CTL)。
药物组合物
本发明还提供药物组合物，其包含本发明的抗体或抗原结合片段、抗体缀合物、组合物、表达CAR的免疫效应细胞、多特异性抗体或融合蛋白，以及药学上可接受的载体和/赋形剂。
本文提供的药物组合物可以为多种剂型，包括但不限于固体、半固体、液体、粉末或冻干形式。
取决于剂型的不同，药学上可接受的载体和/或赋形剂可以包括但不限于：稀释剂、粘合剂和胶粘剂、润滑剂、崩解剂、防腐剂、媒介物、分散剂、助流剂、甜味剂、包衣、结构形成赋形剂、防腐剂、抗氧化剂(如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚、柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等)、增溶剂、胶凝剂、软化剂、溶剂(例如，水、酒精、乙酸和糖浆)、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和乙酸盐缓冲剂)、表面活性剂(例如非离子表面活性剂，例如聚山梨酯80、聚山梨酯20、泊洛沙姆或聚乙二醇)、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂(例如海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖)、吸收延迟剂、螯合剂和乳化剂。
优选地，所述药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。对于包含抗体或其抗原结合片段或者抗体缀合物的组合物而言，优选的剂型通常可以为例如注射液、冻干粉。对于包含抗体或其抗原结合片段或者抗体缀合物的组合物而言，合适的载体和/或赋形剂可以选自缓冲剂(例如柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、组氨酸盐缓冲液)、等渗剂(例如海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖)、非离子表面活性剂(例如聚山梨酯80、聚山梨酯20、泊洛沙姆)或其组合。
药物组合物一般是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。通过将活性物质(例如本发明的抗体或抗体缀合物)以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的载体和/或赋形剂中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性物质掺入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体和/或赋形剂中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备 方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。
可通过本领域已知的任何方法，例如通过全身或局部施用，将本文提供的药物组合物给药于对象。给药途径包括但不限于肠胃外(例如，静脉内、腹膜内、皮内、肌肉内、皮下或腔内)、局部、硬膜外或粘膜(例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部)。本领域技术人员应当理解，确切的给药剂量将取决于各种因素，例如药物组合物的代谢动力学性质、治疗的持续时间、特定化合物的排泄速率、治疗目的、给药途径和受试者的状况，例如患者的年龄、健康状况、体重、性别、饮食、病史，以及医学领域公知的其他因素。给药方法可以为例如注射或输注。
作为一般性指导，本发明的抗体缀合物的给药剂量范围可以为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至20mg/kg受试者体重。例如，给药剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重，10mg/kg体重或20mg/kg体重，或在1-20mg/kg范围内。示例性的治疗方案需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、每3-6个月一次、或起始给药间隔略短后期给药间隔加长。给药方式可以是静脉滴注。
Nectin-4相关疾病
本本发明的抗体或其抗原结合片段、抗体缀合物、免疫效应细胞、多特异性抗体、融合蛋白或药物组合物，或由其所制备的药物可以用于治疗和/或预防疾病。所述疾病与Nectin-4相关。优选地，所述疾病与Nectin-4异常表达相关。术语“异常表达”指与正常状态的样品(或标准样品，例如未患有与Nectin-4异常表达相关疾病的对象的样品)相比，样品中蛋白表达水平过高或过低。
优选地，所述疾病以Nectin-4高表达为特征。例如，患有或怀疑患有疾病(例如膀胱癌)的对象的组织(例如膀胱)中高表达Nectin-4，而未患有所述疾病的对象的所述组织中不表达或低表达Nectin-4。
优选地，所述疾病为癌症。优选地，所述癌症选自胃癌、肝癌、肝细胞癌、膀胱癌、尿路上皮癌、尿道癌、肾盂癌、输尿管癌、肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、乳腺导管癌、三阴性乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、结肠癌、直肠癌和食管癌。
癌症治疗可以通过例如但不限于从肿瘤退化程度、肿瘤重量或大小的变化、进展时间、存活时间、无进展存活、总体应答率、应答持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性等方面评估。
诊断和治疗用途
本发明的抗Nectin-4抗体或其抗原结合片段或抗体缀合物可用于诊断目的，以检测、诊断或监测与Nectin-4相关的疾病和/或病症。例如，本发明提供的抗Nectin-4抗体或其抗原结合片段或抗体缀合物可以用于原位、体内、离体和体外诊断测定或成像测定。
在一些实施方案中，为检测对象中Nectin-4的表达水平和/或追踪表达Nectin-4的细胞，可以将本发明的抗体或抗原结合片段与至少一种标记缀合来获得标记的抗体。这类标记的抗体也包含在本发明的抗体或抗原结合片段的范围内。优选地，所述标记选自酶(例如辣根过氧化物酶)、荧光染料、放射性同位素、生物素和胶体金。将标记与抗体缀合的技术是本领域技术人员熟知的。
在一方面，本发明提供了检测样品中Nectin-4的存在或确定其表达水平的方法，其包括：
(a)使用本发明的抗体或抗原结合片段或者标记的抗体与样品接触；
(b)检测所述抗体或抗原结合片段与所述样品中Nectin-4之间免疫复合物的形成或确定所述免疫复合物的量，以检测样品中Nectin-4的存在或确定样品中Nectin-4的表达水平。
本发明还提供诊断对象中与Nectin-4相关的疾病的方法，其包括：
(a)获得对象的样品；
(b)使用本发明的抗体或抗原结合片段或者标记的抗体检测所述样品中Nectin-4表达水平；
(c)将Nectin-4的表达水平与参考蛋白的表达水平进行比较，其中Nectin-4表达水平与参考蛋白表达水平相比增加或降低表示Nectin-4异常表达。
所述参考蛋白可以是标准样品中的Nectin-4，所述标准样品可以例如是未患有与Nectin-4异常表达相关疾病的对象的样品。所述样品可以是任何形式，例如细胞、组织、体液。以上检测可以利用本领域已知的技术来进行，这类技术包括但不限于蛋白质免疫印记、流式细胞术、免疫组织化学测定(IHC)、ELISA测定。
本发明还涉及本发明的抗体或其抗原结合片段、抗体缀合物、免疫效应细胞、多特异性抗体、融合蛋白或药物组合物在治疗和/或预防疾病中的用途。
本发明还涉及本发明的抗体或其抗原结合片段、抗体缀合物、免疫效应细胞、多特异性抗体、融合蛋白或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防疾病。在一实施方案中，所述疾病为本文所述的癌症。
本发明的抗体或其抗原结合片段、抗体缀合物、免疫效应细胞、多特异性抗体、融合蛋白或药物组合物可以与至少一种或多种本文所述的治疗剂联合施用。联合施用的方式没有限制。例如，可以将上述治疗剂全部在一次施用或分开施用。当分开施用时(采用互相不同的施用方案的情况下)，它们可以连续施用而不中断或以预定的 间隔施用。
治疗方法
本发明还提供了一种治疗有需要的受试者中疾病的方法，所述疾病与Nectin-4相关。在一实施方案中，所述疾病为本文所述的癌症。
所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段、抗体缀合物、组合物、免疫效应细胞、多特异性抗体、融合蛋白或药物组合物。
在某些实施方案中，本发明的方法还包括施用选自以下的治疗方案：手术、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗、激素治疗、血管生成抑制和姑息治疗。
在某些实施方案中，本发明的方法还包括进一步施用选自以下的一种或多种治疗剂：化疗剂、放射性同位素、免疫检查点抑制剂、靶向其他抗原的抗体和其他抗肿瘤药物。化疗剂可以包括例如：抗代谢药、烷化剂、细胞毒性剂、拓扑异构酶抑制剂、微管抑制剂。其他抗肿瘤药物可以包括例如：血管生成抑制因子、脱乙酰化酶(HDAC)抑制因子、Hedgehog信号通路阻滞剂、mTOR抑制剂、p53/mdm2抑制剂、PARP抑制剂、蛋白酶体抑制剂(例如bortezomib、carfilzomib、ixazomib、Marizomib、Oprozomib)以及酪氨酸激酶抑制剂(例如BTK抑制剂)。化疗剂的实例包括但不限于：环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、白消安、氮芥、苯丁酸氮芥、环己硝脲、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、顺铂(DDP)、卡铂(CBP)、奥沙利铂(OXA)、甲氨蝶呤(MTX)、6-巯基嘌呤(6-MP)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷、吉西他滨、长春碱、长春新碱、长春地辛、喜树碱、伊立替康、拓扑替康、卢比替康、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇、紫杉烷、多西他赛、紫杉醇脂质体、放线菌素D、伊达比星、多柔比星、表柔比星、丝裂霉素、博来霉素、阿霉素、表阿霉素。免疫检查点抑制剂包括但不限于特异性结合PD-1、PD-L1、CTLA4、LAG-3、TIM-3或VISTA的抗体或其抗原结合片段。放射性同位素可以包括例如 212Bi、 213Bi、 131I、 125I、 111In、 177Lu、 186Re、 188Re、 153Sm、 90Y。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、抗体缀合物、免疫效应细胞、多特异性抗体、融合蛋白或药物组合物与化疗剂联合使用。在一实施方案中，化疗剂选自顺铂、奥沙利铂、吉西他滨、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶及其组合。在另一些实施方案中，本发明的抗体缀合物与免疫检查点抑制剂联合使用。在一实施方案中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-L1抗体或其抗原结合片段、抗PD-1抗体或其抗原结合片段及其组合。在又一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、抗体缀合物、免疫效应细胞、多特异性抗体、融合蛋白或药物组合物与放射性同位素联合使用。
试剂盒
本发明还提供试剂盒，其包含本发明的抗体或抗原结合片段、抗体缀合物、标记的抗体、多特异性抗体、融合蛋白、药物组合物或免疫效应细胞，以及使用说明。试剂盒还可以包含合适的容器。在某些实施方案中，试剂盒还包含给药的装置。通常，试剂盒还包括标签，其用于表明试剂盒内容物的预期用途和/或使用方法。术语“标签”包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式随试剂盒提供的任何书面的或记录的材料。
有益效果
在一具体方面，本发明提供了抗Nectin-4抗体或其抗原结合片段，特别是抗Nectin-4人源化单克隆抗体。本发明的抗体对Nectin-4具有高亲和力：实施例中使用多种方法检测本发明的抗体对Nectin-4的结合亲和力，例如ELISA、生物膜干涉技术和流式细胞术，结果表明本发明的抗Nectin-4抗体对体外纯化的Nectin-4和细胞表面Nectin-4都有较高的亲和力。出人意料地，人源化单克隆抗体31HZ、56HZ及74HZ与人Nectin-4、食蟹猴Nectin-4的动态亲和力均优于现有技术Enfortumab，表明在体内结合活性方面，本发明的抗体对Nectin-4具有更高的亲和力；抗体31HZ、56HZ及74HZ更高的内吞活性也证实了这一点。而且，本发明的抗体对Nectin-4具有高特异性：31HZ、56HZ、74HZ均特异性识别人Nectin-4，不识别Nectin-1、Nectin-2、Nectin-3。另外，本发明的抗体阻断Nectin-4与Nectin-1的结合，并且31HZ、56HZ及74HZ对Nectin-4的竞争结合能力与Enfortumab相当。
在另一具体方面，本发明还提供了抗Nectin-4抗体缀合物，其可以靶向Nectin-4阳性细胞。本发明的抗体缀合物能够高亲和性、高特异性地靶向Nectin-4阳性细胞，这对于治疗癌症或体内诊断非常有利，因为高亲和力和特异性可以降低脱靶毒性效应，减少副作用。实施例也证实了这一点，本发明的ADC对内源表达人Nectin-4的多种肿瘤细胞系，例如人乳腺导管癌细胞、人胃癌细胞、人乳腺癌细胞，均有较强的杀伤活性。更进一步地，在小鼠非小细胞肺癌移植瘤模型中，本发明的ADC表现出显著的肿瘤抑制活性，并且具有良好的安全性。
附图说明
图1A显示了A549-Nectin-4稳定细胞系流式检测结果。
图1B显示了T24-Nectin-4稳定细胞系流式检测结果。
图2显示了抗人Nectin-4鼠源抗体的亲和力检测结果。
图3A显示了抗人Nectin-4人源化单克隆抗体31HZ与人Nectin-4蛋白亲和力ELISA检测结果。
图3B显示了抗人Nectin-4人源化单克隆抗体74HZ与人Nectin-4蛋白亲和力ELISA检测结果。
图3C显示了抗人Nectin-4人源化单克隆抗体56HZ与人Nectin-4蛋白亲和力ELISA检测结果。
图3D显示了抗人Nectin-4人源化单克隆抗体31HZ与食蟹猴Nectin-4蛋白亲和力ELISA检测结果。
图3E显示了抗人Nectin-4人源化单克隆抗体74HZ与食蟹猴Nectin-4蛋白亲和力ELISA检测结果。
图3F显示了抗人Nectin-4人源化单克隆抗体56HZ与食蟹猴Nectin-4蛋白亲和力ELISA检测结果。
图4A显示了抗人Nectin-4人源化单克隆抗体31HZ、74HZ与T47D细胞亲和力流式检测结果。
图4B显示了抗人Nectin-4人源化单克隆抗体56HZ与NCI-N87细胞亲和力流式检测结果。
图5A显示了抗人Nectin-4人源化单克隆抗体31HZ、74HZ在T47D细胞上内吞活性检测结果。
图5B显示了抗人Nectin-4人源化单克隆抗体31HZ、74HZ在MDA-MB-468细胞上内吞活性检测结果。
图5C显示了抗人Nectin-4人源化单克隆抗体31HZ、74HZ在A549-Nectin-4细胞上内吞活性检测结果。
图5D显示了抗人Nectin-4人源化单克隆抗体56HZ在T24-Nectin-4细胞上内吞活性检测结果。
图6A显示了抗人Nectin-4人源化单克隆抗体31HZ、74HZ识别人Nectin-4结构域检测结果。
图6B显示了抗人Nectin-4人源化单克隆抗体56HZ识别人Nectin-4结构域检测结果。
图7A显示了抗人Nectin-4人源化单克隆抗体31HZ、74HZ竞争活性检测结果。
图7B显示了抗人Nectin-4人源化单克隆抗体56HZ竞争活性检测结果。
图8A显示了抗人Nectin-4人源化单克隆抗体31HZ特异性检测结果。
图8B显示了抗人Nectin-4人源化单克隆抗体74HZ特异性检测结果。
图8C显示了抗人Nectin-4人源化单克隆抗体56HZ特异性检测结果。
图9A显示了抗人Nectin-4 ADC 31HZ-TL001、74HZ-TL001对A549-Nectin-4细胞的杀伤结果。
图9B显示了抗人Nectin-4 ADC 31HZ-TL001、74HZ-TL001对A549细胞的杀伤结果。
图9C显示了抗人Nectin-4 ADC 31HZ-TL001、56HZ-TL001对T24-Nectin-4细胞的杀伤结果。
图9D显示了抗人Nectin-4 ADC 31HZ-TL001、56HZ-TL001对T24细胞的杀伤结果。
图10A显示了抗人Nectin-4 ADC 31HZ-TL001、74HZ-TL001对T47D细胞的杀伤结果。
图10B显示了抗人Nectin-4 ADC 31HZ-TL001、74HZ-TL001对MDA-MB-468细胞的杀伤结果。
图10C显示了抗人Nectin-4 ADC 31HZ-TL001、56HZ-TL001对NCI-N87细胞的杀伤结果。
图11显示了NOD/SCID小鼠皮下NCI-H322M细胞移植瘤模型中各组小鼠肿瘤体积随时间的变化情况。
图12显示了NOD/SCID小鼠皮下NCI-H322M细胞移植瘤模型中各组小鼠体重随时间的变化情况。
图13显示了NOD/SCID小鼠皮下
Figure PCTCN2021116651-APPB-000016
胃癌BL9200 PDX模型中各组小鼠肿瘤体积随时间的变化情况。
图14显示了NOD/SCID小鼠皮下
Figure PCTCN2021116651-APPB-000017
胃癌BL9200 PDX模型中各组小鼠体重随时间的变化情况。
实施例
以下实施例旨在仅对本发明进行举例说明，因此并不应被视为以任何方式限制本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书进行。
实施例1抗人Nectin-4人源化单克隆抗体的制备
1.1人Nectin-4过表达细胞系构建
为验证人Nectin-4抗体的特异性及功能，将人Nectin-4(Uniprot ID：Q96NY8-1)的完整编码序列(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)克隆到慢病毒载体pLVX-IRES-puro上，并通过文献所述(Mohammadi Z et al.,Mol Biotechnol.2015 Sep；57(9):793-800)慢病毒包装系统制备病毒，获得病毒后分别感染A549非小细胞肺癌细胞(ATCC)与T24人膀胱移行细胞癌细胞(ATCC)，通过嘌呤霉素筛选及单克隆挑选， 获得过表达人Nectin-4的单克隆的A549-Nectin-4稳定细胞系及T24-Nectin-4稳定细胞系。
1.2人Nectin-4过表达细胞系检测
A549-Nectin-4及T24-Nectin-4稳定细胞系采用流式细胞术(流式细胞仪：Beckman，CytoFlex；检测抗体Enfortumab，序列来自于国际专利申请公布号：WO2012/047724)进行鉴定，确定细胞正确表达人Nectin-4。如图1A及1B所示，流式结果显示A549-Nectin-4、T24-Nectin-4均获得阳性率高(接近100％)，表明A549-Nectin-4和T24-Nectin-4为均一性良好的稳定细胞系，可用于后续实验。
1.3抗人Nectin-4鼠源单克隆抗体的制备
采用蛋白免疫的方式免疫野生型小鼠，获得抗人Nectin-4鼠源单克隆抗体。用完全弗氏佐剂(CFA)乳化人Nectin-4蛋白(义翘神州，Cat:19771-H08H)免疫Babl/c和C57小鼠5-6周龄各2只，具体为：50μg进行皮下初免，之后采用弗氏不完全佐剂(IFA)乳化Nectin-4蛋白，每2周25μg进行腹腔加强免疫，3次加强以后，采用内源表达Nectin-4的肿瘤细胞T47D 5×10 6细胞(一种人乳腺管癌细胞)进行腹腔最后加强，3-5天后取脾脏细胞进行杂交瘤融合。采用标准的融合流程用PEG融合的方式将小鼠脾脏细胞和Sp2/0(ATCC，Cat#CRL-1581)小鼠骨髓瘤细胞系进行融合，之后采取HAT加压筛选，10-14天后进行ELISA筛选，获得结合Nectin-4蛋白的阳性克隆约200个。通过流式细胞仪进一步筛选，获得3个能够识别T47D肿瘤细胞的阳性杂交瘤克隆进行亚克隆，最后通过有限稀释法进行亚克隆分选以获得单克隆，它们的编号分别为：31#、56#以及74#。
1.4抗人Nectin-4鼠源抗体的亲和力检测
通过ELISA方法检测候选分子与人Nectin-4亲和力。将杂交瘤单克隆31#、56#以及74#无血清培养，获得3-10mL上清，然后通过Protein A(MabSelect SuRe,GE)进行纯化获得鼠源抗体。
采用ELISA对从杂交瘤细胞株31#、56#以及74#的培养上清中分离纯化的鼠源单克隆抗体进行亲和力的测定。用碳酸盐(CBS)缓冲液将人Nectin-4(义翘神州，Cat:19771-H08H)稀释至1μg/mL，以100μL/孔的体积加于96孔板中，4℃放置16-20h。将96孔板中CBS缓冲液吸掉，用PBST(pH 7.4，PBS含0.05％吐温20)缓冲液洗板1次后，加入200μL/孔含有2％PBST的脱脂奶粉(封闭液)，室温孵育1h封闭。移去封闭液，用PBST缓冲液洗板3次后，将待测抗Nectin-4鼠源抗体用PBST/2％脱脂奶粉稀释至适合浓度，然后加入至100μL/孔，室温孵育1.5h。移去反应体系，用PBST洗板3次后，50μL/孔加入用PBST/1％脱脂奶粉稀释(稀释比例1:5000)的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(购自The Jackson Laboratory)，室温孵育1h。PBST洗 板3次后，加入100μL/孔TMB，室温孵育显色5-10min。加入50μL/孔0.2M硫酸终止显色。酶标仪在双波长450/620nm处检测吸光值(O.D.)。
检测结果如图2与表3所示，3个抗人Nectin-4鼠源抗体均能高亲和力结合人Nectin-4蛋白，EC 50在30至70pM之间。
表3抗人Nectin-4亲和力检测
克隆编号 EC 50(pM)
31# 54.95
56# 36.33
74# 69.39
1.5抗Nectin-4鼠源单抗的可变区扩增
杂交瘤细胞培养到8000-10000个左右，细胞裂解并采用cDNA反转录试剂盒(Thermo Fisher Sci.Cat#18080-200)合成第一链cDNA。采用引物从cDNA中PCR方式扩增VH和VK基因，PCR产物通过DNA纯化试剂盒(Qiagen,Cat#28104)纯化，并连接到PUC57载体上。每一个连接反应大概挑取5个克隆进行测序。序列通过Vector NTI 11.5(Thermo Fisher Sci.)和Sequencer 5.4.6(Genecodes)进行分析。再通过IMGT以及abYsis获得抗人Nectin-4鼠源抗体可变区序列以及CDR序列如下表4所示。
表4抗人Nectin-4鼠源抗体可变区及CDR氨基酸序列
Figure PCTCN2021116651-APPB-000018
注：VH、VL、CDR-H1、CDRH2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3列中的数字表示各自对应的SEQ ID NO，例如抗体31#的VH对应SEQ ID NO:1，VL对应SEQ ID NO:2。
1.6抗人Nectin-4鼠源抗体的人源化
采用CDR移植抗体人源化改造方法对鼠源抗体31#、56#、74#进行人源化改造。简言之，人源化改造涉及以下步骤：把鼠源单克隆抗体的氨基酸序列与人胚系抗体 氨基酸序列进行比对，找出同源性高、理化性质较优的序列，作为人胚系框架序列；分析考察HLA-DR亲和性，选出亲和力低的人胚系框架序列；再将鼠源抗体的六个CDR分别移植到选定的重链及轻链框架序列上。
进一步利用计算机模拟技术，应用分子对接分析可变区及其周边的框架氨基酸序列，考察其空间立体结合方式。通过计算静电力、范德华力、亲疏水性和熵值，分析该鼠源抗体氨基酸序列中可与Nectin-4蛋白作用以及维护空间构架的关键氨基酸，并在移植后的抗体中，保留这些鼠源的氨基酸。也即，对上述人源化模板的FR区氨基酸残基进行了一系列的回复突变，以使人源化抗体尽可能保留鼠源抗体的抗原结合能力。
根据以上方法，以鼠源抗体31#、56#、74#的CDR为基础构建人源化抗体，分别命名为31HZ、56HZ以及74HZ；其中，各抗体的重链恒定区均为人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:61)，各抗体的轻链恒定区均为人Kappa轻链恒定区(SEQ ID NO:62)。构建的人源化抗体31HZ、56HZ以及74HZ的轻链CDR氨基酸序列分别和31#、56#、74#的轻链CDR一致。构建的人源化抗体31HZ、56HZ以及74HZ的重链CDR氨基酸序列如5.1所示：
表5.1抗人Nectin-4人源化抗体的重链CDR氨基酸序列
Figure PCTCN2021116651-APPB-000019
进一步人源化抗体31HZ、56HZ以及74HZ三个抗体的可变区及恒定区氨基酸序列如表5.2所示：
表5.2抗人Nectin-4人源化抗体可变区及恒定区氨基酸序列
Figure PCTCN2021116651-APPB-000020
1.7抗人Nectin-4人源化抗体的制备
将上述抗人Nectin-4人源化抗体的重链和轻链氨基酸序列通过密码子优化合成连接入质粒ptt5(委托南京金斯瑞生物科技有限公司)。重链和轻链对应的质粒同时转染到CHO-E细胞中，将上清通过protein A(MabSelect SuRe,GE)进行纯化后获得抗人Nectin-4人源化抗体。
实施例2抗人Nectin-4人源化单克隆抗体亲和力检测
2.1抗人Nectin-4人源化单克隆抗体与不同种属Nectin-4蛋白亲和力检测
采用ELISA法检测抗人Nectin-4人源化单克隆抗体与不同种属Nectin-4蛋白亲和力。具体步骤如下：用CBS包被液(称取0.32g Na 2CO 3、0.59g NaHCO 3，去离子水溶解，定容至200mL)稀释人Nectin-4或食蟹猴Nectin-4抗原至1μg/mL，100μL每孔包被至酶标板中，4℃过夜；第二天弃去孔中液体，用300μL PBS清洗一次；加入100μL PBS(含2％BSA，购自BOVOGEN，货号BSAS 1.0)，37℃封闭2小时；用PBS(含2％BSA)稀释31HZ、56HZ、74HZ及Enfortumab抗体(1500ng/mL起始，3倍稀释，11个浓度点)，取100μL加入对应的孔中，37℃孵育2小时；300μL PBST清洗3次；用PBS(含2％BSA)按1:10000比例稀释HRP标记的羊抗人二抗(购自Jackson，109-035-00)，取100μL加入对应的孔中，37℃孵育1小时；300μL PBST清洗5次；加入100μL TMB显色液(购自湖州英创，TMB-S-004)至对应的孔中，室温显色5-20分钟；加入50μL 2N H 2SO 4终止，酶标仪(购自MD，SpectraMax M2)OD450nm读数并导入Graphpad Prism进行曲线拟合。
实验结果如图3A-3F及表6所示，31HZ与人Nectin-4蛋白、食蟹猴Nectin-4蛋白亲和力优于Enfortumab；56HZ、74HZ与人Nectin-4蛋白、食蟹猴Nectin-4蛋白亲和力与Enfortumab基本相当。
表6抗人Nectin-4人源化单克隆抗体与不同种属Nectin-4蛋白亲和力检测
Figure PCTCN2021116651-APPB-000021
2.2抗人Nectin-4人源化单克隆抗体与不同种属Nectin-4蛋白动态亲和力检测
使用Octet Fortebio
Figure PCTCN2021116651-APPB-000022
测定抗人Nectin-4人源化单克隆抗体的动态亲和力。主要测定步骤为：首先将抗人Nectin-4人源化单克隆抗体(浓度为5μg/mL)固定到ProA传感器上，然后与人或食蟹猴Nectin-4(梯度稀释到400nM、200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、0nM)进行结合反应，充分反应后的固相结合物在PBST缓冲液中进行解离反应。实验结束后在Data Analysis 11.0软件打开，选用1:1模式，整体拟合(global fitting)，对结果进行分析，获得抗体与抗原的亲和力常数。
实验结果如表7所示，31HZ、56HZ及74HZ与人Nectin-4蛋白、食蟹猴Nectin-4蛋白动态亲和力均优于Enfortumab。
表7抗人Nectin-4人源化单克隆抗体与不同种属Nectin-4蛋白动态亲和力检测
Figure PCTCN2021116651-APPB-000023
2.3抗人Nectin-4人源化单克隆抗体与肿瘤细胞膜表面人Nectin-4亲和力检测
采用T47D细胞检测31HZ、74HZ与细胞膜表面人Nectin-4亲和力。具体步骤如下：消化T47D细胞，离心重悬，PBS洗两次；用PBS(含1％BSA)重悬细胞，按3×10 5细胞/孔铺细胞至96孔尖底板中，每孔50μl体积；在每个孔中分别加入50μL待检抗体，终浓度15μg/mL起始，4倍梯度稀释，共10个浓度点；以Human IgG作为阴性对照；混匀，4℃避光反应1小时；PBS洗3次，加入FITC标记的抗人Fc二抗(品牌：BioLegend，货号：409322)，4℃避光孵育0.5小时；PBS洗3次，流式 上机(流式细胞仪品牌：Beckman，型号：Cytoflex)检测。
用相同方法检测56HZ与NCI-N87细胞(一种人胃癌细胞,ATCC)膜表面人Nectin-4亲和力，抗体按3.33μg/mL起始，3倍稀释，10个浓度点。
实验结果如图4A、4B及表8所示，31HZ、56HZ与细胞膜表面Nectin-4亲和力与Enfortumab相当。
表8抗人Nectin-4人源化单克隆抗体与肿瘤细胞膜表面人Nectin-4亲和力检测
Figure PCTCN2021116651-APPB-000024
注：/：未检测。
实施例3抗人Nectin-4人源化单克隆抗体内吞活性检测
采用流式细胞术检测抗人Nectin-4人源化单克隆抗体内吞活性。具体步骤如下：取T47D、MDA-MB-468(一种人乳腺癌细胞，ATCC)或A549-Nectin-4细胞，胰酶消化计数，用PBS(含1％BSA)重悬细胞，调整细胞密度至3×10 6/mL；取100μL重悬后细胞，加入终浓度为10μg/mL的待检测抗体31HZ,56HZ，74HZ，以同型Human IgG作为阴性对照，冰上孵育1小时；孵育完成后用预冷PBS洗3次，用细胞培养基重悬细胞并将细胞分为两部分，一部分放置在37℃细胞培养箱中孵育1、2、4小时(内吞组)，另一部分继续在冰上孵育1、2、4小时(亲和力组)；孵育结束后，预冷PBS洗3次，用50μL PBS(含1％BSA)重悬细胞，加入抗人荧光二抗(BioLegend)，4℃孵育半小时；孵育结束后，预冷PBS洗3次，然后通过流式细胞仪(Beckman)检测细胞上的荧光信号(表示为平均荧光强度(MFI))并按公式：内吞比例(％)＝[1-(MFI 37℃抗体组-MFI 37℃对照组)/(MFI 冰上抗体组–MFI 冰上对照组)]×100％计算出抗体在内吞率。
用相同方法检测56HZ在T24-Nectin-4细胞上的内吞活性。
实验结果如图5A-5D所示，31HZ、56HZ及74HZ内吞活性优于Enfortumab。实施例4抗人Nectin-4人源化单克隆抗体结合人Nectin-4结构域检测
人Nectin-4含有1个IgV结构域及2个IgC结构域。为检测抗人Nectin-4人源化 单克隆抗体结合的结构域，构建了过表达Nectin-4IgV结构域的A549稳定细胞系A549-Nectin-4-IgV，以及过表达Nectin-4的2个IgC结构域的A549稳定细胞系A549-Nectin-4-IgCC，并通过流式法检测待检抗体结合的结构域，具体步骤如下：消化A549-Nectin-4-IgV及A549-Nectin-4-IgCC细胞，离心重悬，PBS洗两次；用PBS(含1％BSA)重悬细胞，按300000细胞/孔铺细胞至96孔尖底板中，每孔50μl体积；在每个孔中分别加入50μL终浓度为40μg/mL待检抗体，并以Human IgG作为阴性对照；混匀，4℃避光反应1小时；PBS洗3次，加入FITC标记的抗人Fc二抗(品牌：BioLegend，货号：409322)，4℃避光孵育0.5小时；PBS洗3次，流式上机(流式细胞仪品牌：Beckman，型号：Cytoflex)检测。
实验结果如图6A、6B所示，31HZ、56HZ、74HZ及Enfortumab均只结合人Nectin-4的IgV结构域，不结合IgC结构域。
实施例5抗人Nectin-4人源化单克隆抗体竞争活性检测
人Nectin-4通过IgV结构域与另一个Nectin-4分子或Nectin-1分子连接。因31HZ、56HZ及74HZ均结合Nectin-4的IgV结构域，通过竞争ELISA法检测三者的竞争活性，具体步骤如下：用CBS包被液稀释Nectin-4蛋白至2μg/mL，100μL每孔，37℃孵育两小时；300μL PBST清洗一次，加入PBS(2％BSA)，100μL每孔，37℃孵育2小时；用PBS(2％BSA)稀释生物素标记的Nectin-1-hFc至20μg/mL；用PBS(2％BSA)稀释待检测抗体，31HZ、74HZ按照3.73μg/mL起始，3倍稀释，9个浓度点；56HZ按照1.25μg/mL起始，2倍稀释，10个浓度点；将上述两种稀释好的溶液等体积混匀后，100μL/孔加入至对应孔中，室温孵育2小时；300μL PBST清洗三次；用PBS(2％BSA)按1:10000比例稀释HRP-streptavidin，100μL/孔加入至对应孔中，室温度孵育1小时；300μL PBST清洗五次；加入100μL TMB对应的孔中，室温显色10分钟；加入50μL 2N H 2SO 4终止，酶标仪450nm读数。
实验结果如图7A、7B所示，31HZ、56HZ及74HZ均能够竞争抑制人Nectin-4与人Nectin-1的结合，其竞争IC 50值分别为27.62ng/mL、26.90ng/mL、27.22ng/mL，与Enfortumab(27.11ng/mL)相当。
实施例6抗人Nectin-4人源化单克隆抗体特异性检测
Nectin家族成员包括Nectin-1、Nectin-2、Nectin-3及Nectin-4，成员之间序列同源性为25％左右，但结构和功能比较类似。为检测本文中的抗人Nectin-4人源化单克隆抗体是否只识别Nectin-4，不识别Nectin-1、Nectin-2、Nectin-3，采用ELISA法检测待检抗体的特异性。具体步骤如下：用CBS包被液稀释人Nectin-1、Nectin-2、 Nectin-3及Nectin-4抗原至1μg/mL，100μL每孔包被至酶标板中，4℃过夜；第二天弃去孔中液体，用300μL PBS清洗一次；加入100μL PBS(含2％BSA)，37℃封闭2小时；用PBS(含2％BSA)稀释31HZ、56HZ、74HZ及Enfortumab抗体，取100μL加入对应的孔中，37℃孵育2小时；300μL PBST清洗3次；用PBS(含2％BSA)按1:10000比例稀释HRP标记的羊抗人二抗，取100μL加入对应的孔中，37℃孵育1小时；300μL PBST清洗5次；加入100μL TMB显色液至对应的孔中，室温显色5-20分钟；加入50μL 2N H 2SO 4终止，酶标仪OD450nm读数并导入Graphpad Prism进行曲线拟合。
实验结果如图8A、8B、8C所示，31HZ、56HZ、74HZ均特异性识别人Nectin-4，不识别Nectin-1、Nectin-2、Nectin-3。
实施例7抗人Nectin-4 ADC的制备
采用TL001与抗人Nectin-4人源化单克隆抗体进行偶联，制备抗人Nectin-4 ADC，TL001具有式(1)的结构：
Figure PCTCN2021116651-APPB-000025
TL001的制备方法请参见WO2019/114666中的描述，其相关内容整体援引加入本文。
抗人Nectin-4抗体缀合物(抗人Nectin-4 ADC)制备方法如下：
(1)偶联：取抗人Nectin-4人源化单克隆抗体30mg，用稀释液(20mM PB+105mM NaCl，pH 7.7)稀释，加入终浓度为5mM的依地酸钠溶液，混匀；加入TCEP溶液(与抗体摩尔比4.4:1)，混匀，室温放置30分钟；向上述溶液体系加入溶解于二甲基亚砜中的TL001(与抗体摩尔比9:1)，混匀，室温静置2小时，得到偶联后样品，分别命名为31HZ-TL001、56HZ-TL001、74HZ-TL001及Enfortumab-TL001。对抗人Nectin-4 ADC进行缓冲液置换后分装保存在4℃。
(2)检测：
对抗人Nectin-4 ADC进行LC-MS分子量分析，条件如下：
色谱测定条件：
液相色谱柱：Thermo MAbPac RP 3.0×100mm；
流动相A：0.1％FA/98％H2O/2％ACN；
流动相B：0.1％FA/2％H2O/98％ACN；
流速：0.25mL/min；样品室温度：8℃；柱温：60℃；进样量：1μL；
时间(min) 2 20 22 25 26 30
流动相A(％) 75 60 5 5 75 75
流动相B(％) 25 40 95 95 25 25
切换阀：0-3min to waste，3-22min to MS，22-30min to waste
质谱测定条件：
质谱型号：AB Sciex Triple TOF 5600+；
参数：GS1 35；GS2 35；CUR 30；TEM 350；ISVF 5500；DP 200；CE 10；m/z 600-4000；Time bins to sum 40。
偶联后的抗人31HZ-TL001的轻链、重链理论分子量及实测分子量(重链以主要糖型G0F计算)见下表：
Figure PCTCN2021116651-APPB-000026
31HZ-TL001轻链偶联0～1个毒素(LC、DAR1比例分别为0.1％、99.9％)、重链偶联0～4个毒素(HC、DAR1、DAR2、DAR3、DAR4比例分别为0.0％、2.0％、10.2％、86.1％、1.8％)，由此计算抗体与毒素的偶联比(DAR)为7.75，计算公式：DAR＝轻链DAR1×2+重链(DAR1×1+DAR2×2+DAR3×3+DAR4×4)×2。
用同样的方法检测56HZ-TL001、74HZ-TL001、Enfortumab-TL001的DAR值分别为7.71、7.98及8.01：
根据如上质谱的分析结果，可以确定抗人Nectin-4 ADC的结构为：
Figure PCTCN2021116651-APPB-000027
其中A为抗人Nectin-4人源化单克隆抗体；γ指通过与A的巯基形成硫醚键而连接至A的TL001的数量，为1-10的整数。
将VC-MMAE与Enfortumab偶联制备Enfortumab-VC-MMAE，制备和检测方法如上所述，抗体与VC-MMAE摩尔比为1:5。最终获得该批次Enfortumab-VC-MMAE的DAR值为：5.09。
实施例8抗人Nectin-4 ADC对高表达人Nectin-4肿瘤细胞系的杀伤活性检测
选取A549-Nectin-4稳定细胞系检测31HZ-TL001、74HZ-TL001、Enfortumab-TL001对人Nectin-4高表达细胞系的杀伤活性。具体实验步骤如下：消化A549-Nectin-4细胞，离心收集细胞，用DMEM+4％FBS培养基重悬细胞至100000/mL，100μL/孔铺细胞至96孔板中；用DMEM基础培养基梯度稀释ADC分子，按照终浓度150μg/mL起始，4倍稀释，11个浓度点，加入对应孔中，每孔100μL，最终血清浓度为2％；37℃、5％CO 2培养箱中培养72小时；加入CCK8(Rhinogen)，20μL/孔，37℃、5％CO 2培养箱中孵育0.5-2.5小时，每半小时用酶标仪(MD)450nm读数并导入Graphpad Prism进行曲线拟合。
实验结果如图9A、9B所示，31HZ-TL001、74HZ-TL001及Enfortumab-TL001均能够有效杀伤A549-Nectin-4细胞，其EC 50值分别为1390ng/mL、1364ng/mL及2049ng/mL，表明31HZ-TL001、74HZ-TL001对高表达人Nectin-4肿瘤细胞系的杀伤活性优于Enfortumab-TL001；同时，31HZ-TL001、74HZ-TL001及Enfortumab-TL001对未过表达人Nectin-4的A549细胞杀伤活性EC 50值分别为5982ng/mL、6251ng/mL及5604ng/mL。整体从对A549-Nectin-4细胞和A549细胞的杀伤活性来看，31HZ-TL001、74HZ-TL001和Enfortumab-TL001具有Nectin-4靶点特异性的杀伤作用。
用上文所述相同的实验方法检测31HZ-TL001、56HZ-TL001对人Nectin-4高表达细胞系T24-Nectin-4的杀伤活性。实验结果如图9C、9D所示，31HZ-TL001、56HZ-TL001均能够有效杀伤T24-Nectin-4细胞，其EC 50值分别为1277ng/mL、1568ng/mL，表明两者杀伤活性基本相当；31HZ-TL001、56HZ-TL001对未过表达人Nectin-4的T24细胞杀伤活性EC 50值分别为2884ng/mL、3665ng/mL，杀伤活性明显弱于对T24-Nectin-4细胞的杀伤，表明两者的杀伤作用是Nectin-4特异性的。
实施例9抗人Nectin-4 ADC对内源表达人Nectin-4肿瘤细胞系的杀伤活性检测
选取T47D肿瘤细胞系检测31HZ-TL001、74HZ-TL001、Enfortumab-TL001对内源表达人Nectin-4肿瘤细胞系的杀伤活性。具体实验步骤如下：消化T47D细胞，离心收集细胞，用1640+4％FBS培养基重悬细胞至100000/mL，100μL/孔铺细胞至96孔板中；用1640基础培养基梯度稀释ADC分子，按照终浓度150μg/mL起始，4倍稀释，11个浓度点，加入对应孔中，每孔100μL，最终血清浓度为2％；37℃、5％CO 2 培养箱中培养72小时；加入CCK8(Rhinogen)，20μL/孔，37℃、5％CO 2培养箱中孵育0.5-2.5小时，每半小时用酶标仪(MD)450nm读数并导入Graphpad Prism进行曲线拟合。
实验结果如图10A所示，31HZ-TL001、74HZ-TL001及Enfortumab-TL001均能够有效杀伤T47D细胞，其EC 50值分别为206.1ng/mL、611.3ng/mL及229.2ng/mL，表明31HZ-TL001对T47D细胞的杀伤活性与Enfortumab-TL001相当。
用上文所述相同的实验方法检测31HZ-TL001、74HZ-TL001及Enfortumab-TL001对内源表达人Nectin-4肿瘤细胞系MDA-MB-468的杀伤活性。实验结果如图10B所示，31HZ-TL001、74HZ-TL001及Enfortumab-TL001均能够有效杀伤MDA-MB-468细胞，其EC 50值分别为1030ng/mL、2277ng/mL及1190ng/mL，表明31HZ-TL001对MDA-MB-468细胞的杀伤活性与Enfortumab-TL001相当。
用上文所述相同的实验方法检测31HZ-TL001、56HZ-TL001对内源表达人Nectin-4肿瘤细胞系NCI-N87的杀伤活性。实验结果如图10C所示，31HZ-TL001、56HZ-TL001均能够有效杀伤NCI-N87细胞，其EC 50值分别为9376ng/mL、10935ng/mL，表明两者杀伤活性基本相当。
综上所述，31HZ-TL001、56HZ-TL001对内源表达人Nectin-4肿瘤细胞系的杀伤活性与Enfortumab-TL001基本相当。
实施例10抗人Nectin-4 ADC体内CDX模型药效检测
通过人非小细胞肺癌细胞系NCI-H322M构建CDX模型评价ADC分子的抗肿瘤作用。具体步骤如下：用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养液，在37℃，5％CO 2的条件下培养NCI-H322M细胞。收集指数生长期细胞，PBS重悬，按照1×10 7/只的细胞量(悬浮于0.1mL PBS)，皮下接种于雌性NOD/SCID小鼠(百奥赛图江苏基因生物技术有限公司)，建立皮下移植瘤模型。待肿瘤平均体积达到70～100mm 3时，根据瘤体积随机分组，每组5只。分组当天记为第0天(Day 0)，组别为媒介物(生理盐水)(阴性对照)组、31HZ-TL001组(3mg/kg和10mg/kg)、56HZ-TL001组(3mg/kg和10mg/kg)、Enfortumab-TL001组(10mg/kg)及Enfortumab-VC-MMAE组(10mg/kg)。所有样品均为尾静脉注射，每周给药2次，共给药6次。
给药后每周2次用游标卡尺测量肿瘤直径，并按如下计算公式计算肿瘤体积：V＝0.5a×b 2，其中a和b分别表示肿瘤的长径和短径。每天观察记录动物死亡情况。
采用以下公式计算肿瘤生长抑制率TGI(％)，用于评价抑瘤疗效：
TGI(％)＝[1-(V T末-V T始)/(V C末-V C始)]*100％
其中V T末：处理组实验结束时肿瘤体积均值；
V T始：处理组给药开始时肿瘤体积均值；
V C末：阴性对照组实验结束时肿瘤体积均值；
V C始：阴性对照组给药开始时肿瘤体积均值。
实验结果如表9及图11、12所示，31HZ-TL001、56HZ-TL001、Enfortumab-TL001及Enfortumab-VC-MMAE对NCI-H322M移植瘤模型的肿瘤生长有显著的抑制作用，且呈剂量依赖性。6次给药后(第21天)，与阴性对照组相比，在10mg/kg剂量水平下，31HZ-TL001、56HZ-TL001、Enfortumab-TL001和Enfortumab-VC-MMAE的TGI分别为155.79％、163.56％、156.31％和173.79％。所有治疗组小鼠在观察期内均无明显的体重下降，表明动物对ADC药物的耐受性良好。
表9 NCI-H322M+NOD/SCID小鼠CDX模型
Figure PCTCN2021116651-APPB-000028
注：TGI：肿瘤生长抑制率；PR：肿瘤部分消退；CR：肿瘤全部消退。P值为与媒介物组比较结果。
上述结果表明，从31HZ-TL001、56HZ-TL001在3mg/kg和10mg/kg剂量水平下的TGI来看，31HZ-TL001和56HZ-TL001均能剂量依赖性地有效抑制肿瘤生长。在10mg/kg剂量水平下，31HZ-TL001和56HZ-TL001均能使组中5只小鼠产生肿瘤部分消退，并且与Enfortumab-TL001及Enfortumab-VC-MMAE药效基本相当。此外，荷瘤小鼠对31HZ-TL001、56HZ-TL001具有良好的耐受性。
实施例11抗人Nectin-4 ADC体内PDX模型药效检测
从
Figure PCTCN2021116651-APPB-000029
膀胱癌异种移植模型BL9200(中美冠科生物技术(太仓)有限公司，高表达Nectin-4的膀胱癌肿瘤，来源于一名63岁男性患者)荷瘤小鼠收取肿瘤组织，切 成直径为3×3×3mm的瘤块接种于NOD/SCID小鼠(江苏集萃药康生物科技有限公司)右前肩胛处皮下。当荷瘤鼠平均肿瘤体积到达约150-250mm 3时，根据肿瘤大小随机分组，每组7只，分组当天定义为第0天(Day 0)。组别为4组：Human IgG1同型对照抗体(阴性对照)组(IgG1 3mg/kg)、Human IgG1-TL001(简称IgG1-TL001，3mg/kg；制备方法参见实施例7)、56HZ-TL001 1mg/kg组和3mg/kg组。所有样品均为尾静脉注射，每周2次，共给药6次。给药后观察并定期测量小鼠肿瘤体积及体重，测量和计算方法如实施例10所述。
实验结果如表10及图13、14所示，6次给药后(第20天)，与阴性对照组Human IgG1(hIgG1)3mg/kg相比，56HZ-TL001 3mg/kg对肿瘤生长的抑制TGI为105.55％(p<0.05)，且该组有4只小鼠肿瘤部分消退；56HZ-TL001 3mg/kg对肿瘤的生长抑制作用显著优于相同剂量的同型对照ADC(hIgG1-TL001 3mg/kg)(p<0.001)。hIgG1组1只小鼠死亡，其余组别无动物死亡，且活动正常。给药期间各组小鼠体重均有轻微下降，其中IgG1组的体重由于未得到有效治疗而下降程度最大，表明荷瘤鼠对ADC药物的耐受性良好。
上述结果表明，56HZ-TL001对BL9200膀胱癌PDX移植瘤模型的肿瘤生长具有显著的抑制作用。此外，荷瘤鼠对56HZ-TL001耐受性良好。
表10
Figure PCTCN2021116651-APPB-000030
膀胱癌+NOD/SCID小鼠PDX模型
Figure PCTCN2021116651-APPB-000031
注：TGI：肿瘤生长抑制率；PR：肿瘤部分消退；CR：肿瘤全部消退；/：不适用。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
Figure PCTCN2021116651-APPB-000032
Figure PCTCN2021116651-APPB-000033
Figure PCTCN2021116651-APPB-000034
Figure PCTCN2021116651-APPB-000035
Figure PCTCN2021116651-APPB-000036

Claims (30)

  1. 特异性结合Nectin-4的抗体或其抗原结合片段，其包含：
    (1a)
    如下三个根据Chothia编号系统定义的重链CDRs：
    包含SEQ ID NO:3所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:4所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:5所示序列或其变体的CDR-H3；和/或
    如下三个根据Chothia编号系统定义的轻链CDRs：
    包含SEQ ID NO:6所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:7所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；
    或者
    (1b)
    如下三个根据Abm编号系统定义的重链CDRs：
    包含SEQ ID NO:9所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:10所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:5所示序列或其变体的CDR-H3；和/或
    如下三个根据Abm编号系统定义的轻链CDRs：
    包含SEQ ID NO:6所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:7所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；
    或者
    (1c)
    如下三个根据Kabat编号系统定义的重链CDRs：
    包含SEQ ID NO:11所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:12或63所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:5所示序列或其变体的CDR-H3；和/或
    如下三个根据Kabat编号系统定义的轻链CDRs：
    包含SEQ ID NO:6所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:7所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；
    或者
    (1d)
    如下三个根据IMGT编号系统定义的重链CDRs：
    包含SEQ ID NO:13所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:14所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:15所示序列或其变体的CDR-H3；和/或
    如下三个根据IMGT编号系统定义的轻链CDRs：
    包含SEQ ID NO:16所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:17所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；
    或者
    (2a)
    如下三个根据Chothia编号系统定义的重链CDRs：
    包含SEQ ID NO:21或18所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:22所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3；和/或
    如下三个根据Chothia编号系统定义的轻链CDRs：
    包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；
    或者
    (2b)
    如下三个根据Abm编号系统定义的重链CDRs：
    包含SEQ ID NO:27或36所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:28所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3；和/或
    如下三个根据Abm编号系统定义的轻链CDRs：
    包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；
    或者
    (2c)
    如下三个根据Kabat编号系统定义的重链CDRs：
    包含SEQ ID NO:29或44所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:30所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3；和/或
    如下三个根据Kabat编号系统定义的轻链CDRs：
    包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；
    或者
    (2d)
    如下三个根据IMGT编号系统定义的重链CDRs：
    包含SEQ ID NO:31或54所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:32所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:33所示序列或其变体的CDR-H3；和/或
    如下三个根据IMGT编号系统定义的轻链CDRs：
    包含SEQ ID NO:34所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:35所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；
    或者
    (3a)
    如下三个根据Chothia编号系统定义的重链CDRs：
    包含SEQ ID NO:39所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:40所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:41所示序列或其变体的CDR-H3；和/或
    如下三个根据Chothia编号系统定义的轻链CDRs：
    包含SEQ ID NO:42所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:43所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；
    或者
    (3b)
    如下三个根据Abm编号系统定义的重链CDRs：
    包含SEQ ID NO:45所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:46所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:41所示序列或其变体的CDR-H3；和/或
    如下三个根据Abm编号系统定义的轻链CDRs：
    包含SEQ ID NO:42所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:43所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；
    或者
    (3c)
    如下三个根据Kabat编号系统定义的重链CDRs：
    包含SEQ ID NO:47所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:48或64所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:41所示序列或其变体的CDR-H3；和/或
    如下三个根据Kabat编号系统定义的轻链CDRs：
    包含SEQ ID NO:42所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:43所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；
    或者
    (3d)
    如下三个根据IMGT编号系统定义的重链CDRs：
    包含SEQ ID NO:49所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:50所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:51所示序列或其变体的CDR-H3；和/或
    如下三个根据IMGT编号系统定义的轻链CDRs：
    包含SEQ ID NO:52所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:53所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；
    其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述置换是保守置换；
    优选地，所述抗体或抗原结合片段还包含衍生自人或鼠免疫球蛋白的框架区；
    优选地，所述抗体或抗原结合片段结合人Nectin-4。
  2. 权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含：
    (a)如下六个根据Chothia编号系统定义的重链和轻链的CDRs：
    包含SEQ ID NO:3所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:4所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:5所示序列或其变体的CDR-H3，
    包含SEQ ID NO:6所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:7所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；或者
    (b)如下六个根据Abm编号系统定义的重链和轻链的CDRs：
    包含SEQ ID NO:9所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:10所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:5所示序列或其变体的CDR-H3，
    包含SEQ ID NO:6所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:7所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；或者
    (c)如下六个根据Kabat编号系统定义的重链和轻链的CDRs：
    包含SEQ ID NO:11所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:12或63所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:5所示序列或其变体的CDR-H3，
    包含SEQ ID NO:6所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:7所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；或者
    (d)如下六个根据IMGT编号系统定义的重链和轻链的CDRs：
    包含SEQ ID NO:13所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:14所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:15所示序列或其变体的CDR-H3，
    包含SEQ ID NO:16所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:17所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；
    其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述置换是保守置换。
  3. 权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含：
    (a)如下六个根据Chothia编号系统定义的重链和轻链的CDRs：
    包含SEQ ID NO:21或18所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:22所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3，
    包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；或者
    (b)如下六个根据Abm编号系统定义的重链和轻链的CDRs：
    包含SEQ ID NO:27或36所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:28所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3，
    包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；或者
    (c)如下六个根据Kabat编号系统定义的重链和轻链的CDRs：
    包含SEQ ID NO:29或44所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:30所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:23所示序列或其变体的CDR-H3，
    包含SEQ ID NO:24所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:25所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；或者
    (d)如下六个根据IMGT编号系统定义的重链和轻链的CDRs：
    包含SEQ ID NO:31或54所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:32所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:33所示序列或其变体的CDR-H3，
    包含SEQ ID NO:34所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:35所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:26所示序列或其变体的CDR-L3；
    其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述置换是保守置换。
  4. 权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含：
    (a)如下六个根据Chothia编号系统定义的重链和轻链的CDRs：
    包含SEQ ID NO:39所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:40所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:41所示序列或其变体的CDR-H3，
    包含SEQ ID NO:42所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:43所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:8或其变体的CDR-L3；或者
    (b)如下六个根据Abm编号系统定义的重链和轻链的CDRs：
    包含SEQ ID NO:45所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:46所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:41所示序列或其变体的CDR-H3，
    包含SEQ ID NO:42所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:43所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；或者
    (c)如下六个根据Kabat编号系统定义的重链和轻链的CDRs：
    包含SEQ ID NO:47所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:48或64所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:41所示序列或其变体的CDR-H3，
    包含SEQ ID NO:42所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:43所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；或者
    (d)如下六个根据IMGT编号系统定义的重链和轻链的CDRs：
    包含SEQ ID NO:49所示序列或其变体的CDR-H1，
    包含SEQ ID NO:50所示序列或其变体的CDR-H2，
    包含SEQ ID NO:51所示序列或其变体的CDR-H3，
    包含SEQ ID NO:52所示序列或其变体的CDR-L1，
    包含SEQ ID NO:53所示序列或其变体的CDR-L2，
    包含SEQ ID NO:8所示序列或其变体的CDR-L3；
    其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述置换是保守置换。
  5. 权利要求1-4任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含：
    具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:55所示序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:56所示序列或其变体的VL；或
    具有如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:57所示序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:58所示序列或其变体的VL；或
    具有如SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:59所示序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:60所示序列或其变体的VL；
    其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、 至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述置换是保守置换。
  6. 权利要求1-5中任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含：
    (1)具有如SEQ ID NO:1所示序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:2所示序列或其变体的VL；或者
    (2)具有如SEQ ID NO:19所示序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:20所示序列或其变体的VL；或者
    (3)具有如SEQ ID NO:37所示序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:38所示序列或其变体的VL；或者
    (4)具有如SEQ ID NO:55所示序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:56所示序列或其变体的VL；或者
    (5)具有如SEQ ID NO:57所示序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:58所示序列或其变体的VL；或者
    (6)具有如SEQ ID NO:59所示序列或其变体的VH和/或具有如SEQ ID NO:60所示序列或其变体的VL；
    其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述置换是保守置换。
  7. 权利要求1-6中任一项的抗体或其抗原结合片段，其为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
  8. 权利要求1-7中任一项的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含：
    人免疫球蛋白的重链恒定区或其变体，以及轻链恒定区或其变体，其中所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；
    优选地，所述重链恒定区为IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区；所述轻链恒定区选自κ或λ轻链恒定区；
    更优选地，所述重链恒定区为IgG1重链恒定区；
    最优选地，所述重链恒定区具有如SEQ ID NO:61所示的序列；所述轻链恒定 区为κ轻链恒定区；和/或所述轻链恒定区具有如SEQ ID NO:62所示的序列。
  9. 权利要求1-8中任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中：
    (a)所述重链包含：具有SEQ ID NO:1所示序列的VH和具有SEQ ID NO:61所示序列的重链恒定区，所述轻链包含：具有SEQ ID NO:2所示序列的VL和具有SEQ ID NO:62所示序列的轻链恒定区；或者
    (b)所述重链包含：具有SEQ ID NO:19所示序列的VH和具有SEQ ID NO:61所示序列的重链恒定区，所述轻链包含：具有SEQ ID NO:20所示序列的VL和具有SEQ ID NO:62所示序列的轻链恒定区；或者
    (c)所述重链包含：具有SEQ ID NO:37所示序列的VH和具有SEQ ID NO:61所示序列的重链恒定区，所述轻链包含：具有SEQ ID NO:38所示序列的VL和具有SEQ ID NO:62所示序列的轻链恒定区；或者
    (d)所述重链包含：具有SEQ ID NO:55所示序列的VH和具有SEQ ID NO:61所示序列的重链恒定区，所述轻链包含：具有SEQ ID NO:56所示序列的VL和具有SEQ ID NO:62所示序列的轻链恒定区；或者
    (e)所述重链包含：具有SEQ ID NO:57所示序列的VH和具有SEQ ID NO:61所示序列的重链恒定区，所述轻链包含：具有SEQ ID NO:58所示序列的VL和具有SEQ ID NO:62所示序列的轻链恒定区；或者
    (f)所述重链包含：具有SEQ ID NO:59所示序列的VH和具有SEQ ID NO:61所示序列的重链恒定区，所述轻链包含：具有SEQ ID NO:60所示序列的VL和具有SEQ ID NO:62所示序列的轻链恒定区。
  10. 权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段，其选自scFv、Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv片段、二硫键稳定的Fv(dsFv)、双抗体、双特异性抗体和多特异性抗体。
  11. 权利要求1-10中任一项的抗体或其抗原结合片段，其结合Nectin-4的IgV结构域。
  12. 权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合片段，其与至少一种标记缀合；优选地，所述标记选自酶、荧光染料、放射性同位素、生物素和胶体金。
  13. 一种抗体缀合物，其包含权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合片段以及至少一种治疗剂。
  14. 权利要求13的抗体缀合物，其中所述治疗剂为细胞毒性剂。
  15. 权利要求13或14的抗体缀合物，其具有式(Ⅰ)所示结构，
    A-(L-D) γ
    (Ⅰ)；
    其中，A为如权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合片段；
    L包含氨基酸或2-10个氨基酸组成的肽；进一步优选地，L选自Val、Cit、Phe、Lys、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、
    Figure PCTCN2021116651-APPB-100001
    Figure PCTCN2021116651-APPB-100002
    Figure PCTCN2021116651-APPB-100003
    其中1和2中的一个表示L与A连接的位置，另一个表示L与D连接的位置；
    D选自细胞毒性剂、治疗性抗体、放射性同位素、寡核苷酸及其类似物、生物活性肽、蛋白毒素和酶；优选地，D为具有抗肿瘤生物活性的分子；
    进一步优选地，D为
    Figure PCTCN2021116651-APPB-100004
    Figure PCTCN2021116651-APPB-100005
    γ为1-10的整数。
  16. 权利要求15的抗体缀合物，其中(L-D)部分具有式(1)的结构，其通过与A上的巯基形成硫醚键而连接，
    Figure PCTCN2021116651-APPB-100006
    所述抗体缀合物具有式(2)的结构：
    Figure PCTCN2021116651-APPB-100007
    其中γ为1～10的整数，A为权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合片段。
  17. 权利要求13的抗体缀合物，其中所述治疗剂为放射性同位素；
    优选地，所述放射性同位素选自 212Bi、 213Bi、 131I、 125I、 111In、 177Lu、 186Re、 188Re、 153Sm、 90Y。
  18. 一种组合物，其含有权利要求13-17中任一项的抗体缀合物，其中组合物中治疗剂与所述抗体或其抗原结合片段的摩尔比(DAR值)为1-10之间的小数或整数(例如 1-8之间的小数或整数，例如1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.79、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、6.95、7.0、7.03、7.1、7.12、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0)。
  19. 一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合片段，跨膜结构域、以及一个或多个细胞内T细胞信号结构域。
  20. 一种免疫效应细胞，其在表面表达权利要求19所述的CAR；优选地，所述免疫效应细胞选自细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞。
  21. 一种核酸分子，其编码权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合片段。
  22. 一种表达载体，其包含权利要求21的核酸分子。
  23. 一种宿主细胞，其包含权利要求21的核酸分子或权利要求24的表达载体；
    优选地，所述宿主细胞为真核细胞；更优选为哺乳动物细胞；最优选为中国仓鼠卵巢细胞；或者
    优选地，所述宿主细胞为原核细胞；更优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。
  24. 一种多特异性抗体，其包含权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合片段以及至少一种其他抗体或其抗原结合片段或者抗体类似物，使得所述多特异性抗体能够结合Nectin-4以及至少一种其他抗原；优选地，所述多特异性抗体为双特异性抗体或三特异性抗体或四特异性抗体。
  25. 一种融合蛋白，其包含权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合片段，以及另外的生物活性多肽；
    优选地，所述另外的生物活性多肽是具有治疗活性、结合活性或酶活性的多肽或蛋白。
  26. 一种药物组合物，其包含权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合片段、权利要求13-17中任一项的抗体缀合物、权利要求18的组合物、权利要求20的免疫效应细胞、权利要求24的多特异性抗体或权利要求25的融合蛋白，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
  27. 权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合片段、权利要求13-17中任一项的抗体缀合物、权利要求18的组合物、权利要求20的免疫效应细胞、权利要求24的多特异性抗体、权利要求25的融合蛋白或权利要求26的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症；优选地，所述癌症选自胃癌、肝癌、肝细胞癌、膀胱癌、尿路上皮癌、尿道癌、肾盂癌、输尿管癌、肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、乳腺导管癌、三阴性乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、结肠癌、直肠癌和食管癌。
  28. 权利要求27的用途，其中所述药物与选自以下的一种或多种治疗剂联合使用：抗肿瘤药物、化疗剂、放射性同位素、免疫检查点抑制剂。
  29. 权利要求27的用途，其中所述药物与选自以下的一种或多种治疗方案联合使用：手术、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗、激素治疗、血管生成抑制和姑息治疗。
  30. 一种检测样品中Nectin-4的存在或确定其表达水平的方法，其包括：
    (a)使所述样品与权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合片段接触，和
    (b)检测所述抗体或抗原结合片段与所述样品中Nectin-4之间免疫复合物的形成或确定所述免疫复合物的量，以检测样品中Nectin-4的存在或确定样品中Nectin-4的表达水平。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117982672A (zh) * 2022-07-14 2024-05-07 百奥泰生物制药股份有限公司 抗Nectin-4抗体药物偶联物及应用
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
EA201790850A1 (ru) 2010-09-29 2017-11-30 Эдженсис, Инк. Конъюгаты антитело-лекарственное средство (adc), связывающиеся с белками 191p4d12
CN106729743B (zh) 2015-11-23 2021-09-21 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 抗ErbB2抗体-药物偶联物及其组合物、制备方法和应用
CN110392697A (zh) * 2017-03-02 2019-10-29 国家医疗保健研究所 对nectin-4具有特异性的抗体及其用途
KR20200024788A (ko) * 2017-06-05 2020-03-09 어젠시스 인코포레이티드 넥틴-4 결합 단백질 및 이의 사용 방법
JP7446993B2 (ja) 2017-12-15 2024-03-11 シチュアン ケルン－バイオテック バイオファーマシューティカル カンパニー リミテッド 生物活性分子コンジュゲート、その調製法及び使用
KR20210009308A (ko) 2018-05-09 2021-01-26 이슘 리서치 디벨롭먼트 컴퍼니 오브 더 히브루 유니버시티 오브 예루살렘 엘티디. 인간 넥틴4에 특이적인 항체
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