BR112019025513A2

BR112019025513A2 - Proteínas de ligação à nectina-4 e métodos de uso das mesmas

Info

Publication number: BR112019025513A2
Application number: BR112019025513-3A
Authority: BR
Inventors: Jane Meyrick Morrison Karen; Karen Jane Meyrick Morrison; Donate Fernando; Fernando Donate; Yang Peng; Peng Yang
Original assignee: Agensys, Inc.
Priority date: 2017-06-05
Filing date: 2018-06-04
Publication date: 2020-06-23
Also published as: CN111675761B; EP3635013A1; CN111675761A; WO2018226578A1; RU2019144030A3; WO2018226578A8; JP7168590B2; CN111051345A; RU2019144030A; TW201902922A; EP3635013A4; CA3065514A1; JP2020522261A; MX2019014318A; KR20200024788A; US11292837B2; US20200231670A1

Abstract

São fornecidos aqui composições, métodos e usos que envolvem anticorpos que se ligam especificamente à Nectina-4. Também são fornecidos aqui métodos para a avaliação da expressão da Nectina-4 em uma amostra ou um paciente e métodos para avaliação da capacidade de resposta de um câncer a um agente terapêutico anticâncer.

Description

“PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO À NECTINA-4 E MÉTODOS DE USO DAS MESMAS”

1. CAMPO

[001] São fornecidos aqui composições, métodos e usos que envolvem anticorpos que se ligam especificamente à Nectina-4 humana e detectam o nível de expressão da Nectina-4.

2. REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS DE PATENTES

RELACIONADOS

[002] Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente U.S. Provisório No. 62/515.454, depositado em 5 de junho de 2017, cujo conteúdo inteiro é incorporado aqui como referência.

3. REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA

ELETRONICAMENTE

[003] Este pedido de patente incorpora como referência uma Forma que Pode ser Lida por Computador (CRF) de uma Listagem de Sequências no formato de texto ASCII submetida com este pedido de patente, intitulada 14369-208- 228_SEQ_LISTING.txt, que foi criada em 31 de maio de 2018 e tem 37.280 bytes de tamanho.

4. ANTECEDENTES

[004] A Nectina-4, também conhecida como a proteína 4 relacionada ao receptor de poliovírus (PVRL4), é uma proteína transmembrana do tipo de passagem única de aproximadamente 52 kDa de tamanho que pertence à família das Nectinas de moléculas de adesão celular. As Nectinas medeiam a adesão célula-célula indepentende de Ca2+ nas junções aderentes tanto através da interação homofílica na qual uma Nectina-4 interage com outra Nectina-4 quanto das interações heterofílicas nas quais a Nectina-4 interage com outra proteína da família das Nectinas tal como Nectina- 1, Nectina-2 ou Nectina-3. (Miyoshi J et al., 2007, Am

J Nephrol 27:590-604; Takai et al., 2003, Cancer Sci 94:655-667; Reymond N. et al., 2001, Journal of Biological Chemistry, 276:43205-15). O domínio extracelular da Nectina-4 tem três subdomínios similares aos da Ig denominados V, C1 e C2. Foi mostrado que o domínio C1 na Nectina-2 é responsável pelas interações homofílicas, enquanto que os domínios V da maioria das moléculas de Nectina contribuem para as interações heterofílicas e para a adesão célula-célula. (Miyoshi J et al., 2007, Am J Nephrol 27:590-604; Takai et al., 2003, Cancer Sci 94:655-667; Reymond N. et al., 2001, Journal of Biological Chemistry, 276:43205-15).

[005] As Nectinas são expressas em vários tecidos, incluindo, por exemplo, células hematopoiéticas, neuronais, endoteliais e epiteliais. (Mendelsohn C et al., 1989, Cell 56:855-865; Lopez M et al., 1995, Gene (Amst.) 155:261-265; Lopez M et al., 1998, Blood 92:4602-4611; Reymond N et al., 2000, Gene (Amst.) 255:347-355; Cocchi F. et al., 1998, Journal of Virology, 72:9992–10002; Takahashi K. et al., 1999, Journal of Cell Biology 145:539–549; Miyoshi J et al., 2007, Am J Nephrol 27:590– 604; Takai et al., 2003, Cancer Sci 94:655–667).

[006] Além de mediar as adesões célula-célula através das interações homofílicas ou das interações heterofílicas com outras proteínas da família das Nectinas, as Nectinas podem recrutar outras moléculas de adesão celular tais como caderinas ou outros receptores de superfície celular tal como o receptor da prolactina. Através do recrutamento de outros receptores de superfície celular, as Nectinas também servem como um correceptor estimulador e assim têm uma função de sinalização. Por exemplo, na glândula mamária de camundongos, a Nectina-4 interage com o receptor da prolactina através de seus domínios extracelular e transmembrana e se liga e sequestra o supressor-de-citocinassinalização-1 (SOCS- 1), que normalmente inibe a atividade de quinase da Janus Kinase-2 (JAK2), aumentando assim a ativação e a sinalização da JAK2 induzida pela prolactina.

(Maruoka et al., 2017, Journal of Biological Chemistry, doi: 10.1074/jbc.M116.769091,

jbc.M116.769091, Epub Ahead of Print; Kitayama et al., 2016, Journal of Biological Chemistry 291:5817-5831). As Nectinas também cooperam com as caderinas para induzir e então suprimir rapidamente a atividade de Rac1 durante a adesão célula- célula inicial. (Khameeka et al., 2011, PLoS ONE 6: e17841).

[007] Há uma falta de sucesso nos anticorpos anti-Nectina-4 desenvolvidos até agora para detectar e avaliar especificamente a expressão da Nectina-4 em várias amostras biológicas. Assim, há a necessidade de identificar um anticorpo anti- Nectina-4 que possa detectar e avaliar especificamente a expressão da Nectina-4 em amostras biológicas.

5. SUMÁRIO

[008] A presente divulgação fornece proteínas que se ligam à Nectina-4 (por exemplo, Nectina-4 humana, SEQ ID NO:43), incluindo proteínas de ligação tais como anticorpos que se ligam à Nectina-4. Tais proteínas de ligação, que incluem anticorpos, podem ser ligar a um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de Nectina-4 e/ou um epítopo da Nectina-4.

[009] A presente divulgação fornece ainda, em certas modalidades, proteínas de ligação, incluindo anticorpos ou fragmentos dos mesmos, que se ligam especificamente a uma célula que expressa Nectina-4.

[010] Também são fornecidos aqui polinucleotídeos e vetores que compreendem sequências que codificam tais anticorpos, células (por exemplo, células hospedeiras) que compreendem tais polinucleotídeos ou vetores e composições, reagentes e kits que compreendem tais anticorpos. Em outro aspecto, são fornecidos aqui métodos para modulação da atividade da Nectina-4 (por exemplo, ativação da sinalização da Nectina-4) ou níveis de expressão da Nectina-4, métodos de diagnóstico e usos de tais anticorpos anti-Nectina-4.

[011] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo anti-Nectina-4) compreende seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs) ou menos de seis CDRs. Em outras modalidades, uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo anti-Nectina-4) compreende uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs selecionadas da região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, VH CDR2, VH CDR3, região variável de cadeia leve (VL) CDR1, VL CDR2 e/ou VL CDR3. Em certas modalidades, uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo anti-Nectina-4) compreende uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs selecionadas de VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 e/ou VL CDR3 de um anticorpo monoclonal nomeado M22-321b41.1 que é descrito aqui ou um variante humanizado do mesmo. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo anti-Nectina-4) compreende ainda uma região scaffold ou uma região de framework (FR), incluindo uma VH FR1, VH FR2, VH FR3, VH FR4, VL FR1, VL FR2, VL FR3 e/ou VL FR4 de uma sequência de aminoácidos de imunoglobulina humana ou uma variante da mesma.

[012] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 do anticorpo M22-321b41.1 como apresentado na Tabela 1.

[013] Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 do anticorpo M22-321b41.1 como apresentado na Tabela 1.

[014] Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma VL que compreende VL FR1, VL FR2, VL FR3 e VL FR4 do anticorpo M22- 321b41.1 como apresentado na Tabela 2; e (b) uma VH que compreende VH FR1, VH FR2, VH FR3 e VH FR4 do anticorpo M22- 321b41.1 como apresentado na Tabela 2.

[015] Em certas modalidades, a VL CDR1, a VL CDR2 e a VL CDR3 do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendem as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS:7, 10 e 12, respectivamente e a VH CDR1, a VH CDR2 e a VH CDR3 do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendem as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS:15, 19 e 23, respectivamente.

[016] Em outra modalidade, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos compreende uma ou mais modificações conservativas da mesma.

[017] Em certas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos compreende uma ou mais modificações conservativas da mesma.

[018] Em certas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3; e (b) uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4.

[019] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região Fc de IgG1 humana. Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma região Fc de IgG1 humana mutante.

[020] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ainda uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33.

[021] Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ainda uma região Fc de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:35.

[022] Ainda em outra modalidade, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ainda uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33; e uma região Fc de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:35.

[023] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5.

[024] Em certas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 31-346 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 31-150 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em certas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 1-150 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1.

[025] Em uma modalidade, o epítopo da Nectina-4 humana é distinto do sítio de ligação do ligante da Nectina-4.

[026] Em um aspecto, é fornecido aqui um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 humana, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente a uma célula que expressa Nectina-4.

[027] Em uma modalidade, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 humana é utilizado para avaliar a expressão da Nectina-4 em uma amostra de tecido de um indivíduo suspeito de ter câncer, compreendendo: (a) o contato da dita amostra de tecido com o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; (b) detecção da ligação do dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo à dita amostra de tecido; e (c) a determinação da expressão da Nectina-4 na amostra de tecido, em que o nível de expressão da Nectina-4 na amostra de tecido é comparado com um nível de expressão de referência da Nectina-4.

[028] Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado, humano ou quimérico. Em outra modalidade, o anticorpo humanizado é um anticorpo desimunizado ou um anticorpo humano compósito. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Em modalidades específicas, o anticorpo é um anticorpo humanizado que se liga especificamente à Nectina-4 humana.

[029] Em certas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um Fab, um Fab’, um F(ab’)2, um Fv, um scFv, um dsFv, um diabody, um triabody ou um tetrabody. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo multiespecífico formado de fragmentos de anticorpo.

[030] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é conjugado a um agente. Em uma modalidade, o agente é um radioisótopo, um quelante de metal, uma enzima, um composto fluorescente, um composto bioluminescente ou um composto quimioluminescente.

[031] Também é fornecida aqui uma composição que compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo fornecido aqui. Em certas modalidades, a composição compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.

[032] Também é fornecido aqui um polinucleotídeo que compreende sequências de nucleotídeos que codificam uma VH, uma VL ou tanto uma VH quanto uma VL de um anticorpo fornecido aqui.

[033] A presente divulgação fornece ainda, em certas modalidades, um polinucleotídeo que compreende sequências de nucleotídeos que codificam uma cadeia pesada, uma cadeia leve ou tanto uma cadeia pesada quanto uma cadeia leve de um anticorpo fornecido aqui.

[034] Em certas modalidades, o polinucleotídeo está ligado de forma operacional a um promotor.

[035] Também é fornecida aqui uma população de polinucleotídeos que compreende: (a) um primeiro polinucleotídeo que compreende sequências de nucleotídeos que codificam uma VH ou uma cadeia pesada de um anticorpo fornecido aqui e (b) um segundo polinucleotídeo que compreende sequências de nucleotídeos que codificam uma VL ou uma cadeia leve de um anticorpo fornecido aqui. Em certas modalidades, o primeiro polinucleotídeo está ligado de forma operacional a um primeiro promotor e o segundo polinucleotídeo está ligado de forma operacional a um segundo promotor.

[036] Também é fornecido aqui um vetor que compreende um polinucleotídeo fornecido aqui.

[037] A presente divulgação fornece ainda, em certas modalidades, uma população de vetores que compreende: (a) um primeiro vetor que compreende sequências de nucleotídeos que codificam uma VH ou uma cadeia pesada de um anticorpo fornecido aqui e (b) um segundo vetor que compreende sequências de nucleotídeos que codificam uma VL ou uma cadeia leve de um anticorpo fornecido aqui.

[038] A presente divulgação fornece adicionalmente, em certas modalidades, uma população de vetores que compreende: (a) um primeiro vetor que compreende sequências de nucleotídeos que codificam uma VH ou uma cadeia pesada de um anticorpo fornecido aqui ligado de forma operacional a um primeiro promotor e (b) um segundo vetor que compreende sequências de nucleotídeos que codificam uma VL ou uma cadeia leve de um anticorpo fornecido aqui ligado de forma operacional a um segundo promotor.

[039] A presente divulgação fornece, em certas modalidades, uma célula que compreende um polinucleotídeo ou uma população de polinucleotídeos fornecida aqui.

[040] A presente divulgação fornece ainda, em certas modalidades, uma célula que compreende um vetor ou uma população de vetores fornecida aqui.

[041] A presente divulgação fornece adicionalmente, em certas modalidades, uma célula isolada que produz um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo fornecido aqui.

[042] Também é fornecida aqui uma população de células que compreende: (a) uma primeira célula hospedeira que compreende um polinucleotídeo que compreende sequências de nucleotídeos que codificam uma VH ou uma cadeia pesada de um anticorpo fornecido aqui e (b) uma segunda célula hospedeira que compreende um polinucleotídeo que compreende sequências de nucleotídeos que codificam uma VL ou uma cadeia leve de um anticorpo fornecido aqui.

[043] Também é fornecida aqui uma população de células que compreende: (a) uma primeira célula hospedeira que compreende um polinucleotídeo que compreende sequências de nucleotídeos que codificam uma VH ou uma cadeia pesada de um anticorpo fornecido aqui ligado de forma operacional a um primeiro promotor e (b) uma segunda célula hospedeira que compreende um polinucleotídeo que compreende sequências de nucleotídeos que codificam um VL ou uma cadeia leve de um anticorpo fornecido aqui ligado de forma operacional a um segundo promotor.

[044] Também é fornecido aqui um kit que compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo fornecido aqui.

[045] Também é fornecido aqui um método de produção de um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um epítopo da Nectina-4 humana. Em certas modalidades, o método compreende a cultura de uma célula fornecida aqui para expressar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em outras modalidades, o método compreende a expressão de um polinucleotídeo fornecido aqui. Em uma modalidade, o epítopo da Nectina-4 humana é distinto do sítio de ligação do ligante da Nectina-4.

6. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[046] A FIG.1 representa o resultado de um experimento que mostra que todas as células cancerosas foram coradas positivamente em um ensaio de coloração por IHC do xenoenxerto de AG-B1 positivo para mRNA da Nectina-4 com 2,5 μg/mL de M22-321b41.1.

[047] A FIG.2 representa o resultado de um experimento que mostra que todas as células cancerosas foram coradas positivamente em um ensaio de coloração por IHC do xenoenxerto de AG-B1 positivo para mRNA da Nectina-4 com 2,5 μg/mL de M22-244b3.1.1.1.

[048] A FIG.3 representa o resultado de um experimento que mostra que todas as células não foram coradas em um ensaio de coloração por IHC do xenoenxerto de AG-K24 Negativo para mRNA da Nectina-4 com 2,5 μg/mL de M22- 321b41.1.

[049] A FIG.4 representa o resultado de um experimento que mostra que muitas células foram coradas positivamente em um ensaio de coloração por IHC de xenoenxerto de AG-K24 Negativo para mRNA da Nectina-4 com 2,5 μg/mL de M22- 244b3.1.1.1.

[050] A FIG.5 representa o resultado de um experimento que mostra que todas as células não foram coradas em um ensaio de coloração por IHC de xenoenxerto de MDA-MB-231-MFP-XCL Negativo para mRNA da Nectina-4 com 2,5 μg/mL de M22-321b41.1.

[051] A FIG.6 representa o resultado de um experimento que mostra que muitas células foram coradas positivamente em um ensaio de coloração por IHC de xenoenxerto de MDA-MB-231-MFP-XCL Negativo para mRNA da Nectina-4 com 2,5 μg/mL de M22-244b3.1.1.1.

[052] A FIG.7 representa o resultado de um experimento que mostra que todas as células não foram coradas em um ensaio de coloração por IHC do xenoenxerto de AG-B1 positivo para mRNA da Nectina-4 com 2,5 μg/mL de anticorpo IgG2a de Controle Negativo.

[053] A FIG.8 representa o resultado de um experimento que mostra que todas as células cancerosas foram coradas positivamente em um ensaio de coloração por IHC de xenoenxerto AG-L16 Positivo para mRNA da Nectina-4 com 2,5 μg/mL de M22-321b41.1.

[054] A FIG.9 representa o resultado de um experimento que mostra que a maioria das células cancerosas foi corada positivamente em um ensaio de coloração por IHC de xenoenxerto de AG-B11 Positivo para mRNA da Nectina-4 com 2,5 μg/mL de M22-321b41.1.

[055] A FIG.10 representa o resultado de um experimento que mostra forte coloração da Nectina-4 em um ensaio de coloração por IHC de carcinoma urotelial com M22-321b41.1.

[056] A FIG.11 representa o resultado de um experimento que mostra heterogeneidade da coloração da Nectina-4 em um ensaio de coloração por IHC de carcinoma de mama com M22-321b41.1.

[057] A FIG.12A representa os resultados de um experimento de Western blotting que mostra a detecção específica da banda de Nectina-4 apenas naquelas células e xenoenxertos que expressam Nectina-4.

[058] A FIG.12B representa os resultados de um experimento de FACS de controle que mostra que as células Rat1(E)-Nectin-4 que blotted positivamente com M22-321b41.1 na FIG.12A expressavam altos níveis de Nectina-4; e as outras células Rat1(E) que blotted negativamente com M22-321b41.1 na FIG.12A expressavam altos níveis de Nectina-1, Nectina-2 e Nectina-3, indicando que M22- 321b41.1 é específico para a Nectina-4.

[059] A FIG.13 representa os resultados de um experimento de Western blotting que mostra que o anticorpo M22-321b41.1 reconheceu uma banda de proteína contendo o fragmento/domínio V (resíduos de aminoácidos 1-150) da Nectina-4. No painel superior, o anticorpo M22-321b41.1 foi testado em um ensaio de Western contra lisados de células expressando comprimento completo do tipo selvagem (wt), fragmento/domínio V (V), fragmento/domínio V e C1 (V/C1), fragmento/domínio C1 e C2, fragmento/domínio C2 e controle negativo (neo). No painel inferior, o blotting de GAPDH foi utilizado como um controle de carregamento.

7. DESCRIÇÃO DETALHADA

[060] São fornecidas aqui proteínas de ligação, tais como anticorpos que se ligam à Nectina-4, incluindo a Nectina-4 humana. Em uma modalidade, os anticorpos para Nectina-4 se ligam à Nectina-4 humana. Em algumas modalidades, a ligação dos anticorpos para Nectina-4 à Nectina-4 é testada in vitro. Em outras modalidades, a ligação dos anticorpos para Nectina-4 à Nectina-4 é testada ex vivo.

Em certas modalidades, os testes incluem ensaios de imunohistoquímica (IHC), ensaios de separação de células ativadas por fluorescência (FACS), ELISA, immunoblotting (por exemplo, Western blotting, dot blotting ou in-cell Western blotting) e outros ensaios imunológicos.

[061] Em modalidades específicas, as proteínas de ligação, tais como anticorpos que se ligam à Nectina-4, fornecidas aqui compartilham a característica comum de competir uma com as outras pela ligação da Nectina-4. Esta inibição competitiva pode indicar que cada anticorpo se liga à mesma região da Nectina-4 (por exemplo, os mesmos epítopos), thereby asserting efeitos similares. Em certas modalidades, os anticorpos anti-Nectina-4 fornecidos aqui incluem anticorpos humanizados anti-Nectina-4, tais como aqueles derivados ou com base no anticorpo

M22-321b41.1. Em outras modalidades, os anticorpos anti-Nectina-4 fornecidos aqui competem pela ligação com um anticorpo derivado ou com base no M22-321b41.1.

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Nectina-4 têm sequências de CDR que são descritas na Tabela 1. Em certas modalidades, os anticorpos anti-Nectina-4 se ligam a um domínio específico da Nectina-4 humana (por exemplo, resíduos 31-346, 1-150 ou 31-150 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1). Além disso, tal ligação pode ser enormemente atribuída a resíduos de aminoácidos particulares dentro da região, que compreendem o epítopo reconhecido pelos os anticorpos anti-Nectina-4 descritos aqui. Considerados juntos, os resultados descritos aqui demonstram que os efeitos observados para um anticorpo anti- Nectina-4 que é derivado ou com base no M22-321b41.1, incluindo um anticorpo que tem uma ou mais CDRs descritas na Tabela 1, podem ser extrapolados para outros anticorpos anti-Nectina-4 descritos aqui que têm a mesma especificidade ao epítopo ou similar (por exemplo, as mesmas CDRs ou similares).

[062] Em algumas modalidades da presente divulgação, as proteínas de ligação tais como anticorpos anti-Nectina-4 podem compreender regiões variáveis de imunoglobulina que compreendem uma ou mais CDRs que são descritas na Tabela 1. Nestas proteínas de ligação (por exemplo, anticorpos anti-Nectina-4), as CDRs podem ser unidas com uma ou mais regiões scaffold ou regiões framework (FRs) tais como as descritas na Tabela 2, que orientam a(s) CDR(s) de forma que as propriedades apropriadas de ligação ao antígeno da(s) CDR(s) sejam obtidas. Tais proteínas de ligação, que incluem os anticorpos anti-Nectina-4 que são descritos aqui, podem se ligar à Nectina-4 em vários ensaios.

7.1 Técnicas Gerais

[063] As técnicas e os procedimentos descritos ou referidos aqui incluem aqueles que são geralmente bem entendidos e/ou comumente empregados utilizando metodologia convencional pelos peritos na técnica, tal como, por exemplo,

as metodologias amplamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3d ed.2001); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 2003); Terapêutico Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed.2009); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Albitar ed.2010); e Antibody Engineering Vols 1 and 2 (Kontermann e Dübel eds., 2d ed.2010).

7.2 Terminologia

[064] A não ser que seja descrito o contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado que é comumente entendido por um perito comum na técnica. Com a finalidade de interpretação deste relatório descritivo, a descrição a seguir dos termos se aplicará e, sempre que apropriado, os termos utilizados no singular também incluirão o plural e vice versa. Todas as patentes, os pedidos de patentes, os pedidos de patentes publicados e outras publicações são incorporados aqui como referência em sua totalidade. No caso de qualquer descrição dos termos apresentados entrar em conflito com qualquer documento incorporado aqui como referência, a descrição do termo apresentado abaixo deve ser o controle.

[065] Os termos “Nectina-4”, “polipeptídeo da Nectina-4” ou “proteína da Nectina-4” abrangem um polipeptídeo (“polipeptídeo” e “proteína” são utilizados aqui de forma intercambiável), incluindo qualquer polipeptídeo nativo, de qualquer fonte de invertebrado, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo, ser humanos e macacos cynomolgus (cynos)), cachorros e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a não ser que seja indicado o contrário. Em certas modalidades, os termos incluem “polipeptídeos relacionados da Nectina-4”, incluindo suas variantes de SNP.

O termo “Nectina-4” também abrange a Nectina-4 não processada “de comprimento completo” bem como qualquer forma da Nectina-4 que resulta do processamento na célula. Em algumas modalidades, a Nectina-4 tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. GenBank™ accession number NM_030916 (mRNA), NG_028109

(DNA genômica), Gene ID 81607 (gene), NP_112178 (sequências de aminoácidos precursoras) fornece outros exemplos de sequências de ácido nucleico ou de aminoácidos da Nectina-4 humana. Um exemplo de sequência de aminoácidos da Nectina-4 humana é fornecido abaixo:

MPLSLGAEMWGPEAWLLLLLLLASFTGRCPAGELETSDVVTVVLGQDAKLP CFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPR NPL DGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPLPSLNPGPALEEGQG LTL AASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTC VVS HPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPP PSYNWTRL DGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGK QVD LVSASVVVVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLH S

HHTDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTE LLSPG SGRAEEEEDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV (SEQ ID NO:1)

[066] GenBank™ accession number NM_030916 fornece um exemplo da sequência de ácido nucleico da Nectina-4 humana: atgcccctgtccctgggagccgagatgtgggggcctgaggcctggctgctgctgctgctactgctggcatc atttacaggc cggtgccccgcgggtgagctggagacctcagacgtggtaactgtggtgctgggccaggacgcaaaactgccctgctt ctaccgagggga ctccggcgagcaagtggggcaagtggcatgggctcgggtggacgcgggcgaaggcgcccaggaactagcgcta ctgcactccaaata cgggcttcatgtgagcccggcttacgagggccgcgtggagcagccgccgcccccacgcaaccccctggacggctc agtgctcctgcgc aacgcagtgcaggcggatgagggcgagtacgagtgccgggtcagcaccttccccgccggcagcttccaggcgcg gctgcggctccga gtgctggtgcctcccctgccctcactgaatcctggtccagcactagaagagggccagggcctgaccctggcagcctc ctgcacagctgag ggcagcccagcccccagcgtgacctgggacacggaggtcaaaggcacaacgtccagccgttccttcaagcactcc cgctctgctgccgt cacctcagagttccacttggtgcctagccgcagcatgaatgggcagccactgacttgtgtggtgtcccatcctggcctgc tccaggaccaaa ggatcacccacatcctccacgtgtccttccttgctgaggcctctgtgaggggccttgaagaccaaaatctgtggcacatt ggcagagaagga gctatgctcaagtgcctgagtgaagggcagccccctccctcatacaactggacacggctggatgggcctctgcccagt ggggtacgagtg gatggggacactttgggctttcccccactgaccactgagcacagcggcatctacgtctgccatgtcagcaatgagttct cctcaagggattct caggtcactgtggatgttcttgacccccaggaagactctgggaagcaggtggacctagtgtcagcctcggtggtggtg gtgggtgtgatcg ccgcactcttgttctgccttctggtggtggtggtggtgctcatgtcccgataccatcggcgcaaggcccagcagatgacc cagaaatatgag gaggagctgaccctgaccagggagaactccatccggaggctgcattcccatcacacggaccccaggagccagcc ggaggagagtgta gggctgagagccgagggccaccctgatagtctcaaggacaacagtagctgctctgtgatgagtgaagagcccgag ggccgcagttactc cacgctgaccacggtgagggagatagaaacacagactgaactgctgtctccaggctctgggcgggccgaggagg aggaagatcaggat gaaggcatcaaacaggccatgaaccattttgttcaggagaatgggaccctacgggccaagcccacgggcaatggc atctacatcaatggg cggggacacctggtctga (SEQ ID NO:36)

[067] GenBank™ accession number AF472510, NM_027893, XM_203738, NM_001122680 fornece exemplos de sequências de ácido nucleico e de aminoácidos da Nectina-4 de camundongo; GenBank™ accession number XM_005541220 e XM_005541223 fornece exemplos de sequências de ácido nucleico e de aminoácidos da Nectina-4 de macaco

[068] “Polipeptídeos relacionados da Nectina-4” incluem variantes alélicas (por exemplo, variantes de SNP); variantes de splice; fragmentos; derivados; variantes de substituição, deleção e inserção; polipeptídeos de fusão; e homólogos interespécies, que podem manter a atividade da Nectina-4. Como os peritos na arte considerarão, um anticorpo anti-Nectina-4 fornecido aqui pode se ligar a um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4, um antígeno da Nectina-4 e/ou um epítopo da Nectina-4. Um “epítopo” pode ser parte de um antígeno de Nectina-4 maior, que pode ser parte de um fragmento maior de um polipeptídeo da Nectina-4, que, por sua vez, pode ser parte de um polipeptídeo maior da Nectina-4. A Nectina-4 pode existir em uma forma nativa ou desnaturada.

Os polipeptídeos da Nectina-4 descritos aqui podem ser isolados de uma variedade de fontes, tais como de tipos de tecidos humanos ou de outra fonte ou preparados através de métodos recombinantes ou de síntese. Ortólogos do polipeptídeo da Nectina-4 também são bem conhecidos na técnica.

[069] Um “ligante da Nectina-4” refere-se a uma molécula que se liga ou interage de outra maneira com a Nectina-4. A Nectina-4 pode ter interações homofílicas com outra molécula de Nectina-4 e interações heterofílicas com outras proteínas da família da Nectina, tais como a Nectina-1, a Nectina-2 e a Nectina-3. A Nectina-4 também pode interagir com outras moléculas de adesão de superfície tais como caderinas e outros receptores de superfície celular, tais como receptores da prolactina. A Nectina-4 também pode interagir com partículas virais e proteínas virais sobre partículas virais, por exemplo, vírus do sarampo e poliovírus. Portanto, os ligantes da Nectina-4 podem incluir Nectina-1, Nectina-2, Nectina-3 ou Nectina-4 ou os fragmentos de qualquer uma das proteínas da família da Nectina. Os ligantes da Nectina-4 também podem incluir domínios ou a molécula de comprimento completo dos outros receptores de superfície celular tais como as caderinas ou seus fragmentos ou os receptores da prolactina ou seus fragmentos. Os ligantes da Nectina-4 podem incluir ainda partículas virais, proteínas do capsídeo viral, proteínas da superfície viral e fragmentos de qualquer uma das proteínas virais que podem se ligar à Nectina-4. Exemplos não limitantes de ligante da Nectina-4 além dos ligantes que ocorrem naturalmente descritos aqui ou conhecidos por um perito na técnica incluem ligantes gerados artificialmente, por exemplo, ligantes identificados através da separação de uma biblioteca de peptídeos em relação àqueles que podem se ligar à Nectina-4.

[070] Os termos “atividade da Nectina-4” e “sinalização da Nectina” significam um efeito biológico ou uma resposta biológica induzida pela ligação do ligante da Nectina-4 à Nectina-4, por exemplo, in vivo ou in vitro. Os termos referem- se também ao efeito ou à resposta similar induzida por moléculas que podem imitar a função de um ligante da Nectina-4. Tais miméticos de ligantes da Nectina-4 induzem uma resposta biológica ou efeitos biológicos que resultariam de outra maneira da ligação do ligante da Nectina-4.

[071] O termo “proteína de ligação” refere-se a uma proteína que compreendem uma porção (por exemplo, uma ou mais regiões de ligação tais como CDRs) que se liga à Nectina-4 e, opcionalmente, uma porção scaffold ou framework (por exemplo, uma ou mais regiões de scaffold ou framework) que permite que a porção de ligação adote uma conformação que promove a ligação da proteína de ligação a um polipeptídeo, um fragmento ou um epítopo da Nectina-4. Exemplos destas proteínas de ligação incluem anticorpos, tal como um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo recombinante, um anticorpo de cadeia única, um diabody, um triabody, um tetrabody, um fragmento Fab, um fragmento F(ab’)2, um anticorpo IgD, um anticorpo IgE, um anticorpo IgM, um anticorpo IgG1, um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3 ou um anticorpo IgG4 e seus fragmentos. A proteína de ligação pode compreender, por exemplo, um scaffold de proteína alternativo ou um scaffold artificial com CDRs enxertadas ou derivados de CDR. Tais scaffolds incluem, mas não são limitados a, scaffolds derivados de anticorpo que compreendem mutações introduzidas, por exemplo, para estabilizar a estrutura tridimensional da proteína de ligação bem como scaffolds totalmente sintéticos que compreendem, por exemplo, um polímero biocompatível. Ver, por exemplo, Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 53(1):121-29; e Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog.20:639-54. Em adição, miméticos peptídicos de anticorpo (“PAMs”) podem ser utilizados, bem como scaffolds baseados em miméticos de anticorpo que utilizam componentes da fibronectina como um scaffold. No contexto da presente divulgação, diz-se que uma proteína de ligação se liga especificamente ou se liga seletivamente à Nectina-4.

[072] O termo “anticorpo”, “imunoglobulina” ou “Ig” é utilizado de forma intercambiável aqui e é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente, por exemplo, anticorpos monoclonais anti-Nectina-4 individuais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo ou intactos), composições com anticorpo anti-Nectina-4 com especificidade poliepitópica ou monoepitópica, anticorpos policlonais ou monovalentes, anticorpos multivalentes, formados de pelo menos dois anticorpos intactos, anticorpos anti-Nectina-4 de cadeia única e fragmentos de anticorpos anti-Nectina-4, que são descritos abaixo. Um anticorpo pode ser humano, humanizado, quimérico e/ou de afinidade maturada, bem como um anticorpo de outras espécies, por exemplo, camundongo e coelho etc. É pretendido que o termo

“anticorpo” inclua um produto polipeptídico de células B dentro da classe de imunoglobulina de polipeptídeos que é capaz de se ligar a um antígeno molecular específico e seja composto de dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, em que cada par tem uma cadeia pesada (aproximadamente 50-70 kDa) e uma cadeia leve (aproximadamente 25 kDa), cada porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de aproximadamente 100 a aproximadamente 130 ou mais aminoácidos e cada porção carbóxi-terminal de cada cadeia inclui uma região constante. Ver, por exemplo, Antibody Engineering (Borrebaeck ed., 2d ed.1995); e Kuby, Immunology (3d ed.1997). Em modalidades específicas, o antígeno molecular específico pode ser ligado por um anticorpo fornecido aqui, incluindo um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de Nectina-4 ou um epítopo da Nectina-4.

Os anticorpos incluem ainda, mas não são limitados a, anticorpos sintéticos, anticorpos produzidos de forma recombinante, anticorpos camelizados, intrabodies, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) e fragmentos funcionais (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno tais como fragmentos de ligação à Nectina-4) de qualquer um dos anteriores, que se refere a uma porção de um polipeptídeo de cadeia pesada ou leve do anticorpo que mantém parte ou toda a atividade de ligação do anticorpo do qual o fragmento foi derivado. Exemplos não limitantes de fragmentos funcionais (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno tais como fragmentos de ligação à Nectina-4) incluem Fvs de cadeia única (scFv), fragmentos Fab, fragmentos F(ab’), fragmentos F(ab)2, fragmentos F(ab’)2, Fvs ligados com dissulfeto (dsFv), fragmentos Fd, fragmentos Fv, diabody, triabody, tetrabody e minibody. Em particular, os anticorpos fornecidos aqui incluem moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, por exemplo, domínios de ligação ao antígeno ou moléculas que contêm um sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno da Nectina-4 (por exemplo, uma ou mais CDRs de um anticorpo anti-Nectina-4). Tais fragmentos de anticorpo podem ser encontrados, por exemplo, em Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1989); Mol. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers ed., 1995); Huston et al., 1993, Cell Biophysics 22:189-224; Plückthun e Skerra, 1989, Meth.

Enzymol.178:497-515; e Day, Advanced Immunochemistry (2d ed.1990). Os anticorpos fornecidos aqui podem ser de qualquer classe (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) ou qualquer subclasse (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) de molécula de imunoglobulina.

[073] Um “antígeno” é um antígeno predeterminado ao qual um anticorpo pode se ligar de forma seletiva. Um antígeno alvo pode ser um polipeptídeo, um carboidrato, um ácido nucleico, um lipídeo, um hapteno ou outro composto que ocorre naturalmente ou sintético. Em algumas modalidades, o antígeno alvo é um polipeptídeo.

[074] Os termos “fragmento de ligação ao antígeno”, “domínio de ligação ao antígeno”, “região de ligação ao antígeno” e termos similares referem-se à porção de um anticorpo, que compreende os resíduos de aminoácidos que interagem com um antígeno e confere sobre o agente de ligação sua especificidade e afinidade pelo antígeno (por exemplo, as CDRs).

[075] Os termos “se liga” ou “ligação” referem-se a uma interação entre moléculas incluindo, por exemplo, a formação de um complexo. As interações podem ser, por exemplo, interações não covalentes incluindo pontes de hidrogênio, ligações iônicas, interações hidrofóbicas e/ou interações de van der Waals. Um complexo também pode incluir a ligação de duas ou mais moléculas mantidas juntas por ligações covalentes ou não covalentes, interações ou forças. A força das interações não covalentes totais entre um único sítio de ligação ao antígeno sobre um anticorpo e um único epítopo de uma molécula alvo, tal como a Nectina-4, é a afinidade do anticorpo ou do fragmento funcional por aquele epítopo. A relação da taxa de dissociação (koff) para a taxa de associação (kon) de um anticorpo a um antígeno monovalente (koff/kon) é a constante de dissociação KD, que é inversamente relacionada à afinidade. Quanto menor o valor de KD, maior a afinidade do anticorpo.

O valor de KD varia para complexos diferentes de anticorpo e antígeno e depende tanto da kon quanto da koff. A constante de dissociação KD para um anticorpo fornecido aqui pode ser determinada utilizando qualquer método fornecido aqui ou qualquer outro método bem conhecido pelos peritos na técnica. A afinidade em um sítio de ligação nem sempre reflete a verdadeira força da interação entre um anticorpo e um antígeno. Quando antígenos complexos que contêm vários determinantes antigênicos repetidos, tal como uma Nectina-4 polivalente, entram em contato com anticorpos que contêm vários sítios de ligação, a interação do anticorpo com o antígeno em um sítio aumentará a probabilidade de uma reação em um segundo sítio. A força de tais várias interações entre um anticorpo multivalente e um antígeno é chamada de avidez. A avidez de um anticorpo pode ser uma medida de sua capacidade de ligação melhor do que a afinidade de seus sítios de ligação individuais. Por exemplo, uma avidez alta pode compensar uma afinidade baixa que é algumas vezes observada para anticorpos IgM pentaméricos, que podem ter uma afinidade menor que a de IgG, mas a avidez alta de IgM, resultante de sua multivalência, possibilita que se ligue ao antígeno eficientemente.

[076] Os termos “anticorpos que se ligam especificamente à Nectina-4”, “anticorpos que se ligam especificamente a um epítopo da Nectina-4” e termos análogos também são utilizados aqui de forma intercambiável e referem-se a anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídeo da Nectina-4, tal como um antígeno ou um fragmento ou um epítopo da Nectina-4 (por exemplo, a Nectina- 4 humana tal como um polipeptídeo, um antígeno ou um epítopo da Nectina-4 humana). Um anticorpo que se liga especificamente à Nectina-4 (por exemplo, Nectina-4 humana) pode se ligar ao domínio extracelular ou ao peptídeo derivado do domínio extracelular da Nectina-4. Um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno da Nectina-4 (por exemplo, Nectina-4 humana) pode reagir de forma cruzada com antígenos relacionados (por exemplo, Nectina-4 de cyno). Em certas modalidades, um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno da Nectina-4 não reage de forma cruzada com outros antígenos tais como, mas não limitados à Nectina-1, à Nectina-2 e/ou à Nectina-3. Um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno da Nectina-4 pode ser identificado, por exemplo, por ensaios imunológicos, Biacore® ou outras técnicas conhecidas pelos peritos na técnica.

[077] Um anticorpo que “se liga a um antígeno de interesse” (por exemplo, um antígeno alvo tal como a Nectina-4) é um que se liga ao antígeno com afinidade suficiente de forma que o anticorpo seja útil como um agente no direcionamento ou na detecção de uma célula ou um tecido que expressa o antígeno e não reage significativamente de forma cruzada com outras proteínas. Em tais modalidades, a extensão da ligação do anticorpo a uma proteína “que não é alvo” será menor que aproximadamente 10% da ligação do anticorpo a sua proteína alvo particular, por exemplo, que é determinada através da análise de separação de células ativadas por fluorescência (FACS) ou RIA. Em relação à ligação de um anticorpo a uma molécula alvo, o termo “ligação específica”, “se liga de forma específica a” ou “é específico para” um polipeptídeo particular ou um epítopo sobre um alvo polipeptídico particular significa a ligação que é de forma mensurável diferente de uma interação não específica. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, através da determinação da ligação de uma molécula comparada à ligação de uma molécula de controle, que geralmente é uma molécula de estrutura similar que não tem atividade de ligação. Por exemplo, a ligação específica pode ser determinada através de competição com uma molécula de controle que é similar ao alvo, por exemplo, um excesso de alvo não marcado. Neste caso, a ligação específica é indicada se a ligação do alvo marcado a uma sonda for inibida de forma competitiva pelo excesso de alvo não marcado. O termo “anticorpo anti-Nectina-4” ou “um anticorpo que se liga à Nectina-4” inclui um anticorpo que é capaz de se ligar à Nectina-4 com afinidade suficiente de forma que o anticorpo seja útil, por exemplo, como um agente de diagnóstico no direcionamento para a Nectina-4. O termo “ligação específica”, “se liga de forma específica a” ou “é específico para” um polipeptídeo ou um epítopo particular sobre um alvo polipeptídico particular como utilizado aqui se refere à ligação na qual uma molécula se liga a um polipeptídeo ou um epítopo particular sobre um polipeptídeo particular sem se ligar substancialmente a qualquer outro polipeptídeo ou epítopo polipeptídico. É fornecido aqui um anticorpo anti-Nectina-4 que se liga especificamente à Nectina-4. Também é fornecido aqui um anticorpo anti-Nectina-4 que se liga especificamente à Nectina-4 em relação à Nectina-1, à Nectina-2 e/ou à Nectina-3.

[078] Um anticorpo se liga especificamente a um antígeno da Nectina-4 quando se liga a um antígeno da Nectina-4 com maior afinidade que a qualquer antígeno de reação cruzada o que é determinado utilizando técnicas experimentais, tais como ensaios radioimunológicos (RIA) e ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISAs). Tipicamente uma reação específica ou seletiva será pelo menos duas vezes o sinal de fundo ou ruído e pode ser mais de 10 vezes o sinal de fundo.

Ver, por exemplo, Fundamental Immunology 332-36 (Paul ed., 2d ed.1989) para uma discussão em relação à especificidade do anticorpo. Alternativamente, a especificidade de um anticorpo pode ser determinada qualitativamente, por exemplo, em um ensaio de IHC. Em tal ensaio de IHC, um anticorpo se liga especificamente a um antígeno da Nectina-4 ou tem especificidade por um antígeno da Nectina-4 quando o anticorpo se liga, por exemplo, é corado de forma imunohistoquímica, a células que expressam Nectina-4, mas não substancialmente não se liga, por exemplo, não é substancialmente corado, às células que não expressam Nectina-4.

Como um exemplo, um anticorpo substancialmente não se liga, por exemplo, não é substancialmente corado, a uma célula no IHC quando o anticorpo se liga, por exemplo, é corado de forma imunohistoquímica, a uma célula em um nível substancialmente similar ao nível de ligação observado com um controle de isotipo de imunoglobulina.

[079] Os termos “anticorpo totalmente humano” ou “anticorpo humano” são utilizados aqui de forma intercambiável e referem-se a um anticorpo que compreende uma região variável humana e, por exemplo, uma região constante humana. Em modalidades específicas, os termos referem-se a um anticorpo que compreende uma região variável e uma região constante de origem humana.

Anticorpos anti-Nectina-4 “totalmente humanos”, em certas modalidades, também podem abranger anticorpos que se ligam a polipeptídeos da Nectina-4 e são codificados por sequências de ácido nucleico que são variantes somáticas que ocorrem naturalmente da sequência de ácido nucleico de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Em uma modalidade específica, os anticorpos anti- Nectina-4 fornecidos aqui são anticorpos totalmente humanos. O termo “anticorpo totalmente humano” inclui anticorpos que têm regiões variáveis e constantes que correspondem às sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana que são descritas por Kabat et al. (Ver Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242). Exemplos de métodos de produção de anticorpos totalmente humanos são fornecidos, por exemplo, nos Exemplos descritos aqui, mas qualquer método conhecido na técnica pode ser utilizado.

[080] A expressão “anticorpo humano recombinante” inclui anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos expressos utilizando um vetor de expressão recombinante transfectados para dentro de uma célula hospedeira, anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatória recombinante, anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo ou um bovino) que é transgênico e/ou transcromossômico em relação aos genes de imunoglobulinas humanas (ver, por exemplo, Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287- 6295) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem splicing de sequências de genes de imunoglobulinas humanas em outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes podem ter regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana (Ver Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242). Em certas modalidades, entretanto, tais anticorpos humanos recombinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências de Ig humanas é utilizado, mutagênese somática in vivo) e assim as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL do anticorpo recombinantes são sequências que, embora derivadas e relacionadas às sequências de VH e VL da linhagem germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linhagem germinativa de anticorpos humanos in vivo.

[081] O termo “compete” quando utilizado no contexto de anticorpos anti- Nectina-4 (por exemplo, anticorpos e proteínas de ligação que se ligam à Nectina-4 e competem pelo mesmo epítopo ou sítio de ligação sobre um alvo) significa competição que é determinada por um ensaio no qual o seu anticorpo (ou fragmento de ligação) em estudo previne ou inibe a ligação específica de uma molécula de referência (por exemplo, um ligante de referência ou uma proteína de ligação ao antígeno de referência, tal como um anticorpo de referência) a um antígeno comum (por exemplo, Nectina-4 ou um fragmento da mesma). Inúmeros tipos de ensaios de ligação competitiva podem ser utilizados para determinar se um anticorpo de teste compete com um anticorpo de referência para ligação à Nectina-4 (por exemplo, Nectina-4 humana). Exemplos de ensaios que podem ser empregados incluem RIA direto ou indireto em fase sólida, ensaio imunológico enzimático direto ou indireto em fase sólida (EIA), ensaio de competição em sanduíche (ver, por exemplo, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-53), EIA com biotina-avidina direto em fase sólida (ver, por exemplo, Kirkland et al., 1986, J. Immunol.137:3614-19), ensaio com marcação direto em fase sólida, ensaio em sanduíche com marcação direto em fase sólida (ver, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)), RIA com marcação direto em fase sólida utilizando marcação com I-125 (ver, por exemplo, Morel et al., 1988, Mol. Immunol. 25:7-15) e RIA com marcação direto (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol.32:77-82). Tipicamente, tal ensaio envolve o uso de um antígeno purificado (por exemplo, Nectina-4 tal como Nectina-4 humana) ligado a uma superfície sólida ou a células que carregam uma proteína de ligação ao antígeno de teste não marcada (por exemplo, anticorpo anti-Nectina-4 de teste) ou uma proteína de ligação ao antígeno de referência marcada (por exemplo, anticorpo anti-Nectina-4 de referência). Outros exemplos de ensaios de ligação competitiva que podem ser utilizados incluem ensaios de ELISA, FACS, de adesão celular (por exemplo, que são descritos em Humphries et al. Methods Mol Biol.

2009;522:203-10), ensaios de ressonância de plasmon de superfície (SPR) ou outros ensaios de ligação competitiva conhecidos por um perito na técnica. A inibição competitiva pode ser medida através da determinação da quantidade de marcação ligada à superfície sólida ou às células na presença da proteína de ligação ao antígeno de teste. Geralmente a proteína de ligação ao antígeno de teste está presente em excesso. Os anticorpos identificados pelo ensaio de competição (anticorpos de competição) incluem anticorpos ligação ao mesmo epítopo que o do anticorpo de referência e/ou anticorpos que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente próximo ao epítopo ligado pela referência para que ocorra impedimento estérico dos anticorpos. Detalhes adicionais em relação aos métodos para determinação de ligação competitiva são descritos aqui. Geralmente, quando uma proteína do anticorpo de competição está presente em excesso, esta inibirá a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum em pelo menos 30%, por exemplo, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ou 75%. Em alguns casos, a ligação é inibida em pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais.

[082] Como utilizado aqui, o termo “em combinação” no contexto da administração de outras terapias refere-se ao uso de mais de uma terapia. O uso do termo “em combinação” não restringe a ordem na qual as terapias são administradas a um indivíduo com uma infecção. Uma primeira terapia pode ser administrada antes (por exemplo, 1 minuto, 45 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas), concorrentemente ou após (por exemplo, 1 minuto, 45 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas) a administração de uma segunda terapia a um indivíduo que teve, tem ou é suscetível a uma doença mediada pela Nectina-4. Qualquer terapia adicional pode ser administrada em qualquer ordem com as outras terapias adicionais. Em certas modalidades, os anticorpos fornecidos aqui podem ser administrados em combinação com uma ou mais terapias (por exemplo, terapias que não são os anticorpos fornecidos aqui que são atualmente administradas para prevenir, tratar, controlar e/ou melhorar uma doença mediada pela Nectina-4.

Exemplos não limitantes de terapias que podem ser administradas em combinação com um anticorpo fornecido aqui incluem agentes analgésicos, agentes anestésicos, antibióticos ou agentes imunomoduladores ou qualquer outro agente listado na U.S. Pharmacopoeia e/ou na Physician’s Desk Reference.

[083] Um anticorpo “isolado” é substancialmente livre de material celular ou outras proteínas contaminantes de uma fonte de célula ou tecido e/ou outros componentes contaminantes da qual o anticorpo é derivado ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros reagentes químicos quando sintetizado quimicamente. A expressão “substancialmente livre de material celular” inclui preparações de um anticorpo nas quais o anticorpo está separado de componentes celulares das células das quais é isolado ou produzido de forma recombinante.

Assim, um anticorpo que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de anticorpo que têm menos que aproximadamente 30%, 25%, 20%, 15%,10%, 5% ou 1% (em peso seco) de proteína heteróloga (também referida aqui como “proteína contaminante”). Em certas modalidades, quando o anticorpo é produzido de forma recombinante, este é substancialmente livre de meio de cultura, por exemplo, o meio de cultura representa menos que aproximadamente 20%, 15%, 10%, 5% ou 1% do volume da preparação de proteína. Em certas modalidades, quando o anticorpo é produzido através de síntese química, este é substancialmente livre de precursores químicos ou outros reagentes químicos, por exemplo, está separado de precursores químicos ou outros reagentes químicos que estão envolvidos na síntese da proteína. Consequentemente tais preparações do anticorpo têm menos que aproximadamente 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco) de precursores químicos ou compostos que não são o anticorpo de interesse.

Os componentes contaminantes também podem incluir, mas não são limitados a, materiais que iriam interferir nos usos terapêuticos para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteicos ou não proteicos. Em certas modalidades, o anticorpo será purificado (1) até mais que 95% em peso do anticorpo como determinado pelo método de Lowry (Lowry et al., 1951, J. Bio. Chem.193: 265- 75), tal como 96%, 97%, 98% ou 99%, (2) até um grau suficiente para a obtenção de pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna através do uso de um spinning cup sequenator ou (3) até a homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando azul de Coomassie ou coloração com prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Ordinariamente, entretanto, o anticorpo isolado será preparado em pelo menos uma etapa de purificação. Em modalidades específicas, os anticorpos fornecidos aqui são isolados.

[084] Uma unidade de anticorpo de 4 cadeias é uma glicoproteína heterotetramérica composta de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. No caso de IgGs, a unidade de 4 cadeias tem geralmente aproximadamente 150.000 daltons. Cada cadeia L é ligada a uma cadeia H por uma ligação bissulfeto covalente, enquanto que as duas cadeias H são ligadas uma a outra por uma ou mais ligações dissulfeto dependendo do isotipo da cadeia H. Cada cadeia H e L também tem pontes dissulfeto intercadeias espaçadas regularmente.

Cada cadeia H tem no terminal N, um domínio variável (VH) seguido por três domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias α e γ e quatro domínios CH para os isotipos μ e ε. Cada cadeia L tem no terminal N, um domínio variável (VL) seguido por um domínio constante (CL) em sua outra extremidade. O VL é alinhado com o VH e o CL é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). Acredita-se que resíduos de aminoácidos particulares formam uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada. O pareamento de VH e VL juntos forma um único sítio de ligação ao antígeno. Para a estrutura e as propriedades de classes diferentes de anticorpos, ver, por exemplo, Basic and Clinical Immunology 71 (Stites et al. eds., 8th ed.1994).

[085] O termo “região variável”, “domínio variável”, “região V” ou “domínio V” refere-se a uma porção das cadeias leves ou pesadas de um anticorpo que fica geralmente localizada no amino-terminal da cadeia leve ou pesada e tem um comprimento de aproximadamente 120 a 130 aminoácidos na cadeia pesada e aproximadamente 100 a 110 aminoácidos na cadeia leve e é utilizada na ligação e na especificidade de cada anticorpo particular por seu antígeno particular.

A região variável da cadeia pesada pode ser referida como “VH”. A região variável da cadeia leve pode ser referida como “VL”. O termo “variável” refere-se ao fato de que certos segmentos das regiões variáveis diferem extensivamente em sequência entre os anticorpos.

A região V medeia a ligação do antígeno e define a especificidade de um anticorpo particular por seu antígeno particular.

Entretanto, a variabilidade não é igualmente distribuída ao longo da extensão de 110 aminoácidos das regiões variáveis.

Ao invés disso, as regiões V consistem de extensões menos variáveis (por exemplo, relativamente invariáveis) chamadas de regiões framework (FRs) de aproximadamente 15-30 aminoácidos separadas por regiões mais curtas de maior variabilidade (por exemplo, variabilidade extrema) chamadas de “regiões hipervariáveis” que têm cada uma aproximadamente 9-12 aminoácidos de comprimento.

As regiões variáveis de cadeias pesadas e leves compreendem cada uma quatro FRs, adotando largely uma configuração de folha β, conectadas por três regiões hipervariáveis, que formam loops de conexão e em alguns casos fazem parte da estrutura de folha β.

As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em grande proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno dos anticorpos (ver, por exemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological

Interest (5th ed.1991)). As regiões constantes não estão envolvidas diretamente na ligação um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tal como a participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)

e citotoxicidade dependente do complemento (CDC). As regiões variáveis diferem extensivamente em sequência entre anticorpos diferentes.

Em modalidades específicas, a região variável é uma região variável humana.

[086] O termo “resíduo de região variável de numeração como em Kabat” ou “posição de aminoácido de numeração como em Kabat” e variações do mesmo referem-se ao sistema de numeração usado para a região variável de cadeias pesadas ou a região variável de cadeias leves da compilação de anticorpos em Kabat et al., supra. Utilizando esse sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear real pode conter menos ou aminoácidos adicionais que correspondem a um encurtamento de ou uma inserção em, uma FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada podem incluir um único inserto de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 e três resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c etc. de acordo com Kabat) após o resíduo 82. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada para um anticorpo dado por meio de alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada em Kabat “padrão”. O sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando se referindo a um resíduo no domínio variável (aproximadamente resíduos 1 a 107 da cadeia leve e resíduos 1 a 113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., supra).

O “sistema de numeração de EU” ou “índice de EU” é geralmente usado quando se referindo a um resíduo emu ma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, o índice de EU reported em Kabat et al., supra). O “índice de EU como em Kabat” refere-se à numeração de resíduo do anticorpo de EU IgG 1 humano. Outros sistemas de numeração foram descritos, por exemplo, por AbM, Chothia, Contact, IMGT e AHon e são bem entendidos por um indivíduo de habilidade comum na técnica.

[087] Um anticorpo “intacto” é um que compreende um sítio de ligação ao antígeno bem como uma CL e pelo menos regiões de cadeia pesada constantes, CH1, CH2 e CH3. As regiões constantes podem incluir regiões constantes humanas ou sequências de aminoácidos variantes das mesmas. Em certas modalidades, um anticorpo intacto tem uma ou mais funções efetoras.

[088] “Fragmentos de anticorpo” compreendem uma porção de um anticorpo intacto, tal como a região de ligação a antígeno ou variável do anticorpo intacto.

Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, sem limitação, fragmentos de Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv; diacorpos e di-diacorpos (ver, por exemplo, Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci.90:6.444 a 6.448; Lu et al., 2005, J. Biol. Chem. 280:19.665 a

19.672; Hudson et al., 2003, Nat. Med.9:129 a 134; o document n° WO 93/11161; e as Patentes nos U.S. 5.837.242 e 6.492.123); moléculas de anticorpo de cadeia única (ver, por exemplo, as Patentes nos U.S. 4.946.778; 5.260.203; 5.482.858; e

5.476.786); anticorpos de domínio variável duplos (ver, por exemplo, Patente n° U.S.

7.612.181); anticorpos de domínio variável únicos (sdAbs) (ver, por exemplo, Woolven et al., 1999, Immunogenetics 50: 98 a 101; e Streltsov et al., 2004, Proc Natl Acad Sci EUA.101:12.444 a 12.449); e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo.

[089] Um “fragmento funcional”,“fragmento de ligação” ou “fragmento de ligação ao antígeno” de um anticorpo terapêutico exibirá pelo menos uma se não algumas ou todas dentre as funções biológicas atribuídas ao anticorpo intacto, a função que compreende pelo menos ligação ao antígeno alvo (por exemplo, um fragmento de ligação Nectina-4 ou fragmento que se liga a Nectina-4).

[090] O termo “proteína de fusão”, como utilizado aqui, se refere a um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de um anticorpo e uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ou uma proteína heteróloga (por exemplo, um polipeptídeo ou uma proteína não normalmente uma parte do anticorpo (por exemplo, um anticorpo de ligação a antígeno não anti-Nectina-4). O termo “fusão”, quando usado em relação a Nectina-4 ou a um anticorpo anti-Nectina-4, refere-se à ligação de um peptídeo ou um polipeptídeo ou fragmento, variante e/ou derivado do mesmo, com um peptídeo ou polipeptídeo heterólogo. Em certas modalidades, a proteína de fusão mantém a atividade biológica da Nectina-4 ou do anticorpo anti-Nectina-4. Em certas modalidades, a proteína de fusão compreende uma região VH, região VL, CDR de VH (uma, duas ou três CDRs de VH) e/ou CDR de VL (uma, duas ou três CDRs de VL) de anticorpo Nectina-4, em que a proteína de fusão se liga a um epítopo da Nectina-4, um fragmento de Nectina-4 e/ou um polipeptídeo da Nectina-4.

[091] O termo “cadeia pesada”, quando usasdo em referência a um anticorpo refere-se a uma cadeia de polipeptídeo de aproximadamente 50 a 70 kDa, em que a porção amino terminal inclui uma região variável de aproximadamente 120 a 130 ou mais aminoácidos e uma porção carbóxi terminal inclui uma região constante. A região constante pode ser uma dentre cinco tipos distintos, (por exemplo, isótipos) referidos a como alpha (α), delta (δ), épsilon (ε), gama (γ) e mu (µ), com base na sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada. As cadeias pesadas distintas são diferentes em tamanho: α, δ e γ contêm aproximadamente 450 aminoácidos, enquanto µ e ε contêm aproximadamente 550 aminoácidos. Quando combinados com uma cadeia leve, esses tipos distintos de cadeias pesadas dão origem a cinco classes bem conhecidas (por exemplo, isótipos) de anticorpos, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluindo quatro subclasses de IgG, a saber IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Uma cadeia pesada pode ser uma cadeia pesada humana.

[092] O termo “cadeia leve”, quando usado em referência a um anticorpo, refere-se a um cadeia de polipeptídeo de aproximadamente 25 kDa, em que a porção amino terminal inclui uma região variável de aproximadamente 100 a aproximadamente 110 ou mais aminoácidos e uma porção carbóxi terminal inclui uma região constante. O comprimento aproximado de uma cadeia leve é 211 a 217 aminoácidos. Esses são dois tipos distintos, referidos como kappa (κ) ou lambda (λ), com base na sequência de aminoácidos do domínios constantes. Sequências de aminoácidos de cadeia leve são bem conhecidos na técnica. Uma cadeia leve pode ser uma cadeia leve humana.

[093] O termo “hospedeiro”, como utilizado aqui, refere-se a um animal, tal como um mamífero (por exemplo, um humano).

[094] O termo “célula hospedeira”, como utilizado aqui, refere-se a uma célula de sujeito particular que pode ser transfectada com uma molécula de ácido nucleico e a progenitura ou progenitura potencial de tal célula. A progenitura de tal célula pode não ser idêntica à célula-mãe transfectada com a molécula de ácido nucleico devido a mutações ou influências ambientais que podem ocorrer em gerações ou integrações sucessoras da molécula de ácido nucleico no genoma de célula hospedeira.

[095] O termo “anticorpo monoclonal”, como utilizado aqui, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homgêneos, por exemplo, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por mutações de ocorrência natural possíveis que podem estar presents em quantidades menores e cada anticorpo monoclonal reconhecerá tipicamente um epítopo único no antígeno. Em modalidades específicas, um “anticorpo monoclonal”, como utilizado aqui, é um anticorpo produzido por um único hibridoma ou outra célula, em que o anticorpo se liga a apenas um epítopo da Nectina-4, como determinado, por exemplo, por meio de ELISA ou outro ensaio de ligação a antígeno ou ligação competitiva cpnhecido na técnica. O termo “monoclonal” não é limitado a qualquer método particular para fazer o anticorpo. Por exemplo, os anticorpos monoclonais úteis na presente divulgação podem ser preparados pela metodologia de hibridoma descrita primeiro por Kohler et al., 1975, Nature 256:495 ou podem ser feitos utilizando métodos de DNA recombinante em células animais ou de planta bacterianas ou eucarióticas (ver, por exemplo, Patente n° U.S. 4.816.567). Os “anticorpos monoclonais” também podem ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpo de fago, utilizando as técnicas descritas em Clackson et al., 1991, Nature 352:624 a 628 e Marks et al., 1991, J. Mol. Biol.222:581 a 597, por exemplo. Outros métodos para a preparação de linhagens celulares clonais e de anticorpos monoclonais expressos pelas mesmas são bem conhecidos na técnica.

Ver, por exemplo, Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 5ª ed.2002). Exemplos de métodos de produção de anticorpos monoclonais são fornecidos nos Exemplos no presente documento.

[096] O termo “nativo”, quando usado em conexão com materiais biológicos, tais como moléculas de ácido nucleico, polipeptídeos, células hospedeiras e similares, refere-se a aqueles que são encontrados na natureza e não são manipulados, modificados e/ou mudados (por exemplo, isolados, purificados, selecionados) por um ser humano.

[097] Os anticorpos fornecidos aqui podem incluir anticorpos “quiméricos”, nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou que pertence a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da cadeia (ou cadeias) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou que pertence a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que os mesmos exibam a atividade biológica desejada (ver a Patente n° U.S. 4.816.567; e Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 81:6.851 A 6.855).

[098] Formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são anticorpos quiméricos que incluem imunoglobulinas humanas (por exemplo, anticorpo recipiente), nas quais os resíduos de CDR nativos são substituídos por resíduos da CDR correspondente de uma espécie não humana (por exemplo, anticorpo doador), tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que tem a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, um ou mais resíduos de região FR da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar adicionalmente o desempenho de anticorpo. Uma cadeia pesada ou leve de anticorpo humanizado pode compreender substancialmente todas ou pelo menos uma ou mais das regiões variáveis, nas quais todas ou substancialmente todas dentre as CDRs correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas dentre as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. Em certas modalidades, o anticorpo humanizado compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, ver, Jones et al., 1986, Nature 321:522 a 525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323 a 329; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol.2:593 a 596; Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:4.285 a 4.289; as Patentes nos U.S. 6.800.738;

6.719.971; 6.639.055; 6.407.213; e 6.054.297.

[099] Um “anticorpo humano” é um que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um humano e/ou foi produzida utilizando qualquer uma dentre as técnicas para produzir anticorpos humanos como revelado no presente documento. Essa definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação a antígeno não humanos. Anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando diversas técnicas conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de exibição de fago (Hoogenboom e Winter, 1991, J. Mol. Biol.227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581) e bibliotecas de exibição de leveduras (Chao et al., 2006, Nature Protocols 1: 755 a 768). Também estão disponíveis métodos para a preparação de anticorpos monoclonais humanos descritos em Cole et al., Monoclonal antibodies and Cancer Therapy 77 (1985); Boerner et al., 1991, J.

Immunol. 147(1):86 a 95; e van Dijk e van de Winkel, 2001, Curr. Opin. Pharmacol.5: 368 a 374. Anticorpos humanos podem ser preparados administrando-se o antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta a desafio antigênico, mas cujos loci endógenos foram desabilitados, por exemplo, camundongos (ver, por exemplo, Jakobovits, 1995, Curr. Opin.

Biotechnol.6(5):561 a 566; Brüggemann e Taussing, 1997, Curr. Opin.

Biotechnol.8(4):455 a 458; e as Patentes nos U.S. 6.075.181 e 6.150.584 em relação à tecnologia XENOCAMUNDONGOTM). Ver também, por exemplo, Li et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 103:3.557 a 3.562 em relação a anticorpos humanos gerados por meio de uma tecnologia de hibridoma de célula B humana.

[0100] Uma “CDR” refere-se uma dentre três regiões hipervariáveis (H1, H2 ou H3) dentro da estrutura de não região da estrutura de camada β de VH de imunoglobulina (Ig ou anticorpo) ou uma dentre três regiões hipervariáveis (L1, L2 ou L3) dentro da estrutura de não região da estrutura de camada β de VL de anticorpo.

Consequentemente, CDRs são sequências de região variável intercaladas dentro das sequências de estrutura de região. As regiões CDR são bem conhecidas pelos peritos na técnica e foram definidas por, por exemplo, Kabat, como as regiões de maior hipervariabilidade dentro dos domínios variáveis (V) de anticorpo (Kabat et al., 1997, J. Biol. Chem.252:6.609 a 6.616; Kabat, 1978, Adv. Prot. Chem.32:1 a 75). As sequências de região CDR também foram definidas estruturalmente por Chothia como aqueles resíduos que não são parte da estrutura de camada β conservada e, desse modo, têm capacidade para adotar conformações diferentes (Chothia e Lesk, 1987, J. Mol. Biol.196:901 a 917). Ambas as terminologias são bem reconhecidas na técnica. As sequências de região CDR também foram definidas por AbM, Contact e IMGT. As posições de CDRs dentro da região variável de anticorpo canônica foram determinadas por comparação de diversas estruturas (Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol.

Biol. 273:927 a 948; Morea et al., 2000, Methods 20:267 a 79). Devido ao fato de que o número de resíduos dentro da região hipervariável varia em anticorpos diferentes, resíduos adicionais relativos às posições canônicas são convencionalmente numeradas com a, b, c e assim por diante próximo ao número de resíduo no esquema de numeração de região variável canônico (Al-Lazikani et al., supra). Tal nomenclatura é, similarmente, bem conhecida pelos peritos na técnica.

[0101] O termo “região hipervariável”,“HVR” ou “HV”, quando usado no presente documento, refere-se às regiões de um anticorpo região variável que são hipervariáveis em sequência e/ou forma laços estruturalmente definidos. Geralmente, anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis, três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). Diversas delineações de região hipervariável estão em uso e são abrangidas no presente documento. As Regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de Kabat são baseadas na variabilidade de sequência e são as mais comumente usadas (ver, por exemplo, Kabat et al., supra). Chothia se refere, em vez disso, ao local dos laços estruturais (ver, por exemplo, Chothia e Lesk, 1987, J. Mol. Biol.196:901 a 917). O fim do laço de CDR-H1 de Chothia, quando numerado utilizando a convenção de numeração de Kabat varia entre H32 e H34 dependendo do comprimento do laço (isto é porque o esquema de numeração de Kabat coloca as inserções em H35A e H35B; se nem 35A nem 35B estiver presente, o laço termina em 32; se apenas 35A estiver presente, o laço termina em 33; se tanto 35A quanto 35B estiverem presentes, o laço termina em 34). As regiões hipervariáveis de AbM representam um compromisso entre as CDRs de Kabat e laços estruturais de Chothia e são usadas pelo software de modelação de anticorpo AbM de Oxford Molecular (ver, por exemplo, Antibody Engineering Vol.2 (Kontermann e Dübel eds., 2d ed.2010)). As regiões hipervariáveis de “contacto” são baseadas em uma análise das estruturas cristalinas complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma dentre essas regiões hipervariáveis ou CDRs são apontadas abaixo.

[0102] Recentemente, um sistema de numeração universal foi desenvolvido e amplamente adotado, ImMunoGeneTics (IMGT) Information System® (Lafranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27(1):55 a 77). IMGT é um sistema de informações integrado que se especializa em imunoglobulinas (IG), receptores de célula T (TCR) e complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de ser humano e outros vertebrados. No presente documento, as CDRs são referidas em termos tanto da sequência de aminoácidos quanto do local dentro da cadeia leve ou pesada. Como o “local” das CDRs dentro de uma estrutura do domínio variável de imunoglobulina é conservado entre espécies e se apresentam em estruturas chamadas laços, utilizando-se sistemas de numeração que alinham sequências de domínio variável de acordo com características estruturais, resíduos de CDR e estrutura são prontamente identificados. Essas informações podem ser usadas em enxerto e substituição de resíduos de CDR de imunoglobulinas de uma espécie em uma estrutura aceitante a partir de, tipicamente, um anticorpo humano. Um sistema de numeração adicional (AHon) foi desenvolvido por Honegger e Plückthun, 2001, J.

Mol. Biol.309: 657 a 670.

[0103] Correspondência entre o sistema de numeração, incluindo, por exemplo, o sistema de numeração de Kabat e o sistema de numeração de IMGT único, é bem conhecida pelo perito na técnica (ver, por exemplo, Kabat, supra; Chothia e Lesk, supra; Martin, supra; Lefranc et al., supra). IMGT Kabat AbM Chothia Contact VH CDR1 27 a 38 31 a 35 26 a 35 26 a 32 30 a 35 VH CDR2 56 a 65 50 a 65 50 a 58 53 a 55 47 a 58 VH CDR3 105 a 117 95 a 102 95 a 102 96 a 101 93 a 101 VL CDR1 27 a 38 24 a 34 24 a 34 26 a 32 30 a 36 VL CDR2 56 a 65 50 a 56 50 a 56 50 a 52 46 a 55 VL CDR3 105 a 117 89 a 97 89 a 97 91 a 96 89 a 96

[0104] Regiões hipervariáveis podem compreender “regiões hipervariáveis estendidas” como a seguir: 24 a 36 ou 24 a 34 (L1), 46 a 56 ou 50 a 56 (L2) e 89 a 97 ou 89 a 96 (L3) na VL e 26 a 35 ou 26 a 35A (H1), 50 a 65 ou 49 a 65 (H2) e 93 a 102, 94 a 102 ou 95 a 102 (H3) na VH. Como utilizado aqui, os termos “HVR” e “CDR” são utilizados de forma intercambiável.

[0105] O termo “região constante” ou “domínio constante” refere-se a uma porção carbóxi terminal da luz e cadeia pesada que não está diretamente envolvida na ligação do anticorpo ao antígeno, mas exibe diversas funções efetoras, tais como interação com o Fc receptor. O termo refere-se à porção de uma molécula de imunoglobulina que tem uma sequência de aminoácidos mais conservada em relação à outra porção da imunoglobulina, a região variável, a qual contém o sítio de ligação a antígeno. A região constante pode conter as regiões de CH1, CH2 e CH3 da cadeia pesada e a região de CL da cadeia leve.

[0106] O termo “estrutura” ou “FR” refere-se àqueles resíduos de região variável que flanqueiam como CDRs. Resíduos de FR estão presentes, por exemplo, em anticorpos, diacorpos, anticorpos lineares e anticorpos biespecíficos de domínio quimérico, humanizado, humano. Os resíduos de FR são aqueles resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos de região hipervariável ou dos resíduos de CDR.

[0107] Um anticorpo de “afinidade maturada” é um com uma ou mais alterações (por exemplo, variações de sequência de aminoácidos, incluindo mudanças, adições e/ou deleções) em uma ou mais HVRs do mesmo, o que resulta em um aperfeiçoamento na afinidade do anticorpo com antígeno, em comparação com um anticorpo mãe que não tem essa alteração (ou alterações). Anticorpos com afinidade maturada pode tem afinidadades nanomolares ou até mesmo picomolares com o antígeno alvo. Anticorpos com afinidade maturada are produced por procedimentos conhecidos na técnica. For revisão, ver Hudson e Souriau, 2003,

Nature Medicine 9:129 a 134; Hoogenboom, 2005, Nature Biotechnol.23:1.105 a

1.116; Quiroz e Sinclair, 2010, Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51.

[0108] “Afinidade de ligação” geralmente refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um sítio de ligação único de uma molécula (por exemplo, uma proteína de ligação, tal como um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A não ser que seja indicado o contrário, como utilizado aqui, “afinidade de ligação” refere-se a afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula de ligação X com seu parceiro de ligação Y pode ser geralmente representada por uma constante de dissociação (KD).

Afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos aqui. Anticorpos de baixa afinidade geralmente ligam antígeno lentamente e tendem a dissociar prontamente, enquanto anticorpos de alta afinidade geralmente ligam antígeno mais rápido e tendem a permanecer ligados por mais tempo. Uma variedade de métodos para medir a afinidade de ligação é conhecida na técnica, em que qualquer um pode ser usado para os propósitos da presente divulgação. Modalidades ilustrativas específicas incluem as seguintes. Em uma modalidade, a “KD” ou o “valor de KD” pode ser medido por meio de ensaios conhecidos na técnica, por exemplo, por meio de um ensaio de ligação. A KD pode ser medida em um RIA, por exemplo, realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno (Chen et al., 1999, J. Mol Biol 293:865 a 881). A KD ou o valor de KD também pode ser medida utilizando-se ensaios de ressonância de plasmon de superfície por Biacore®, utilizando, por exemplo, um Biacore®TM-2000 ou um Biacore®TM-3000 ou por meio de interferometria de bio-camada utilizando, por exemplo, o sistema Octet®QK384. Uma “constante de associação” ou “média de associação” ou “taxa de associação” ou “kon” também pode ser determinada com as mesmas técicas de ressonância de plasmon de superfície ou interferometria de bio-

camada descritas acima utilizando, por exemplo, um sistema Biacore®TM-2000 ou um sistema Biacore®TM-3000 ou o sistema Octet®QK384.

[0109] Uma expressão “substancialmente similar” ou “substancialmente o mesmo” denota um grau suficientemente alto de similaridade entre dois valores ou sinais numéricos (por exemplo, sinais de manchamento de IHC) a partir de duas imagens (por exemplo, uma associada a um anticorpo da presente divulgação e a outra associada a um anticorpo de referência) de forma que um perito na técnica considere a diferença entre os dois valores ou as duas imagens como tendo significado biológico pequeno ou inexistente dentro do contexto da característica biológica medida pelos valores (por exemplo, valores de KD). Por exemplo, a diferença entre os dois valores pode ser menos que aproximadamente 50%, menos que aproximadamente 40%, menos que aproximadamente 30%, menos que aproximadamente 20%, menos que aproximadamente 10% ou menos que aproximadamente 5%, como uma função do valor para o anticorpo de referência.

[0110] A expressão “substancialmente aumentado”, “substancialmente reduzido” ou “substancialmente diferente”, como utilizado aqui, denota um grau suficientemente alto de diferença entre dois valores ou sinais numéricos (por exemplo, sinais de manchamento de IHC) a partir de duas imagens (por exemplo, uma associada a um anticorpo da presente divulgação e a outra associada a um anticorpo de referência) de forma que um perito na técnica considere a diferença entre os dois valores ou as duas imagens como tendo significado estatístico dentro do contexto da característica biológica medida pelos valores. Por exemplo, a diferença entre os ditos dois valores pode ser maior que aproximadamente 10%, maior que aproximadamente 20%, maior que aproximadamente 30%, maior que aproximadamente 40% ou maior que aproximadamente 50%, como uma função do valor para o anticorpo de referência.

[0111] “Funções efetoras” do anticorpo referem-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região de Fc (por exemplo, uma região de Fc de sequência nativa ou uma região de Fc de sequência de aminoácidos variante) de um anticorpo e variam com o isótipo de anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação de C1q; CDC; ligação de Fc receptor; ADCC; fagocitose; e ativação de célula B.

[0112] O termo “quantidade eficiente”, como utilizado aqui, se refere à quantidade de um anticorpo ou uma composição farmacêutica fornecida aqui que é suficiente para resultar no resultado desejado.

[0113] O termo “região de Fc” no presente documento é usado para definir uma região de terminal C de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo, por exemplo, regiões de Fc de sequência nativa, regiões de Fc recombinante e regiões de Fc variantes. Embora as fronteiras da região de Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região de Fc de cadeia pesada de IgG humana é normalmente definida para estender de um resíduo de aminoácido até a posição Cys226 ou de Pro230 até o terminal carboxila do mesmo. A lisina de terminal C (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração de EU) da região de Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo ou modificando-se geneticamente de modo recombinante o ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada do anticorpo. Consequentemente, uma composição de anticorpos intactos pode compreender populações de anticorpo com todos os resíduos K447 removidos, populações de anticorpo com nenhum resíduo K447 removido e populações de anticorpo que têm uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447.

[0114] Uma “região de Fc funcional” possui uma “função efetora” de uma região de Fc de sequência nativa. “Funções efetoras” exemplificativas incluem ligação de C1q; CDC; ligação de Fc receptor; ADCC; fagocitose; etc. Tais funções efetoras geralmente exigem que a região de Fc seja combinada com uma região de ligação ou um domínio de ligação (por exemplo, uma região ou domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas utilizando diversos ensaios, como revelado.

[0115] A “região de Fc de sequência nativa” compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza e não manipulada, modificada e/ou mudada (por exemplo, isolada, purificada, selecionada, incluindo ou combinando com outras sequências, tais como sequências de região variável) por um humano. Regiões de Fc de IgG1 humana de sequência nativa incluem uma região de Fc de IgG1 humana de sequência nativa (alotipos A e não A); região de Fc de IgG2 humana de sequência nativa; região de Fc de IgG3 humana de sequência nativa; e região de Fc de IgG4 humana de sequência nativa, bem como variantes de ocorrência natural das mesmas. Por exemplo, uma sequência de aminoácidos de região de Fc de IgG1 humana nativa é fornecida abaixo (SEQ ID NO:35).

[0116] Uma “região de Fc variante” compreende uma sequência de aminoácidos que é diferente daquela de uma região de Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, substituição, adição ou deleção). Em certas modalidades, a região de Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido em comparação com uma região de Fc de sequência nativa ou a região de Fc de um polipeptídeo mãe, por exemplo, de aproximadamente uma a aproximadamente dez substituições de aminoácido ou de aproximadamente uma a aproximadamente cinco substituições de aminoácido em uma região de Fc de sequência nativa ou na região de Fc de um polipeptídeo mãe. A região de Fc variante no presente documento pode ter pelo menos aproximadamente 80% de homologia com uma região de Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo mãe ou pelo menos aproximadamente

90% de homologia com o mesmo, por exemplo, pelo menos aproximadamente 95% de homologia com o mesmo.

[0117] O termo “variante”, quando usado em relação a Nectina-4 ou a um anticorpo anti-Nectina-4, pode se referir a um peptídeo ou um polipeptídeo que compreendem um ou mais (tal como , por exemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 25, aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 ou aproximadamente 1 a aproximadamente 5) substituições, deleções e/ou adições de sequência de aminoácidos em comparação com uma sequência nativa ou não modificada. Por exemplo, uma variante de Nectina-4 pode resultar de uma ou mais (tal como, por exemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 25, aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 ou aproximadamente 1 a aproximadamente 5) mudanças a uma sequência de aminoácidos de uma Nectina-4 nativa. Além disso, a título de exemplo, uma variante de um anticorpo anti-Nectina-4 pode resultar de uma ou mais (tal como, por exemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 25, aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 ou aproximadamente 1 a aproximadamente 5) mudanças a uma sequência de aminoácidos de um anticorpo anti-Nectina-4 nativo ou anteriormente não modificado.

Variantes pode ser de ocorrência natural, tal como variantes alélicas ou de splice ou podem ser artificialmente construídas. Variantes de polipeptídeo podem ser preparadas a partir das moléculas de ácido nucleico correspondentes que codificam as variantes. Em modalidades específicas, a variante de Nectina-4 ou a variante de anticorpo anti-Nectina-4 mantém pelo menos ligação específica a Nectina-4 em comparação com um anticorpo de referência. Em certas modalidades, a variante é codificada por uma variante de polimorfismo de nucleotídeo (SNP) única de uma molécula de ácido nucleico que codifica regiões ou sub-regiões de VH ou VL de anticorpo Nectina-4 ou anticorpo anti-Nectina-4, tal como uma ou mais CDRs.

[0118] O termo “vetor” refere-se a uma substância que é usada para portar ou incluir uma sequência de ácido nucleico, incluindo, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-Nectina-4 como é descrito aqui, a fim de introduzir uma sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira.

Vetores aplicáveis para uso incluem, por exemplo, vetores de expressão, plasmídeos, vetores de fago, vetores virais, epissomas e cromossomos artificiais, os quais podem incluir sequências ou marcadores de seleção operáveis para integração estável em um cromossomo de célula hospedeira. Adicionalmente, os vetores podem incluir um ou mais genes marcadores selecionáveis e sequências de controle de expressão controlada. Genes marcadores selecionáveis que podem estar incluídos, por exemplo, fornecem resistência a antibióticos ou toxinas, deficiências auxotróficas complementares ou suprem nutrientes críticos que não estão nos meios de cultura. Sequências de controle de expressão podem incluir promotores constitutivos e induzíveis, aprimoradores de transcrição, terminadores de transcrição e similares, os quais são bem conhecidos na técnica. Quando duas ou mais moléculas de ácido nucleico devem ser co-expressas (por exemplo, um anticorpo tanto de cadeia pesada quanto de cadeia leve ou um anticorpo VH e VL), ambas as moléculas de ácido nucleico podem ser inseridas, por exemplo, em um vetor de expressão único ou em vetores de expressão separados. Para vetor de expressão único, os ácidos nucleicos de codificação podem ser operacionalmente ligados a uma sequência de controle de expressão comum ou ligados a sequências de controle de expressão diferentes, tais como um promotor induzível e um promotor constitutivo. A introdução de moléculas de ácido nucleico em uma célula hospedeira pode ser confirmada utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, por exemplo, análise de ácido nucleico, tais como amplificação por Northern blots ou reação de cadeia de polímeroase (PCR) de mRNA, immunoblotting para expressão de produtos genéticos ou outros métodos analíticos adequados para testar a expressão de uma sequência de ácido nucleico introduzida ou seu produto genético correspondente. É entendido pelos peritos na técnica que as moléculas de ácido nucleico são expressas em uma quantidade suficiente para produzir um produto desejado (por exemplo, um anticorpo anti-Nectina-4, como é descrito aqui) e é adicionalmente entendido que níveis de expressão podem ser otimizados para obter expressão suficiente utilizando métodos bem conhecidos na técnica.

[0119] Um polipeptídeo da Nectina-4 “domínio extracelular” ou “ECD” refere- se a uma forma do polipeptídeo da Nectina-4 que é essencialmente livre da transmembrana e domínios citoplásmicos. Por exemplo, um polipeptídeo da Nectina- 4 ECD pode ter menos que 1% de tal transmembrana e/ou domínios citoplásmicos e pode ter menos que 0,5% de tais domínios.

[0120] O termo “identidade” refere-se a uma relação entre as sequências de duas ou mais moléculas de polipeptídeo ou duas ou mais moléculas de ácido nucleico, como determinado por alinhar e comparar as sequências. “Porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos (%)” em relação a uma sequência de polipeptídeo de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticas aos resíduos de aminoácidos na sequência de polipeptídeo de referência, após alinhar as sequências e introduzir vãos, se necessário, para alcançar a porcentagem de identidade de sequência máxima e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para propósitos de determinar a porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcançado de diversas formas que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, utilizando software de computador publicamente disponível, tal como software BLAST, BLAST- 2, ALIGN ou MEGALIGN (DNAStar, Inc.). Os peritos na técnica podem determinar parâmetros apropriados para alinhar sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar alinhamento máximo sobre o comprimento completo das sequências que estão sendo comparadas.

[0121] Uma “modificação” de um resíduo/posição de aminoácido refere-se a uma alteração de uma sequência de aminoácidos primária em comparação com uma sequência de aminoácidos inicial, em que os resultados de mudança a partir de uma alteração de sequência que envolve o dito resíduo/posição de aminoácido. Por exemplo, modificações típicas incluem substituição do resíduo com outro aminoácido (por exemplo, uma substituição conservadora ou não conservadora), inserção de um ou mais (por exemplo, geralmente menos de 5, 4 ou 3) aminoácidos adjacentes ao dito resíduo/posição e/ou deleção do dito resíduo/posição.

[0122] Um “epítopo” é o sítio na superfície de um antígeno molécula ao qual uma molécula de anticorpo única se liga, tal como uma região localizada na superfície de um antígeno, tal como um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4, que tem capacidade para ser ligado a uma ou mais regiões de ligação a antígeno de um anticorpo e que tem atividade antigênica ou imunogênica em um animal, tal como um mamífero (por exemplo, um humano), que tem capacidade para elicitar uma resposta imunológica. Um epítopo que tem atividade imunogênica é uma porção de um polipeptídeo que elicita uma resposta de anticorpo em um animal. Um epítopo que tem atividade antigênica é uma porção de um polipeptídeo à qual um anticorpo se liga como determinado por qualquer método bem conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, por meio de um ensaio imunológico. Epítopos antigênicos não precisam ser necessariamente imunogênicos.

Epítopos consistem normalmente em agrupamentos superficiais quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm características tridimensionais específicas bem como características de carga específicas. Epítopos de anticorpo podem ser epítopos lineares ou epítopos conformacionais. Epítopos lineares são formados por uma sequência contínua de aminoácidos em uma proteína. Epítopos conformacionais são formados por aminoácidos que são descontínuos na sequência proteica, mas que são reunidos mediante dobramento da proteína em sua estrutura tridimensional. Epítopos induzidos são formados quando a estrutura tridimensional da proteína está em uma conformação alterada, tal como ativação ou ligação seguinte de outra proteína ou ligante. Em certas modalidades, um epítopo da Nectina-4 é uma características superficial tridimensional de um polipeptídeo da Nectina-4. Em outras modalidades, um epítopo da Nectina-4 é uma característica linear de um polipeptídeo da Nectina-4.

Geralmente, um antígeno tem diversos ou muitos epítopos diferentes e pode reagir com muitos anticorpos diferentes.

[0123] Um anticorpo liga “um epítopo”, “essencialmente o mesmo epítopo” ou “o mesmo epítopo” como um anticorpo de referência, quando os dois anticorpos reconhecem epítopos idênticos, sobrepostos ou adjacentes e, um espaço tridimensional. Os métodos mais amplamente usados e rápidos para determinar se dois anticorpos se ligam a epítopos idênticos, sobrepostos ou adjacentes em um espaço tridimensional são ensaios de competição, que podem ser configurados em diversos formatos diferentes, por exemplo, utilizando qualquer antígeno identificado ou anticorpo identificado. Em alguns ensaios, o antígeno é imobilizado em uma placa de 96 cavidades ou expresso em uma superfície celular e a capacidade de anticorpos não identificados para bloquear uma ligação de anticorpos identificados é medida utilizando identificações fluorescentes radioativas ou enzimáticas.

[0124] “Mapeamento de epítopo” é o processo para identificar os sítios de ligação ou epítopos, de anticorpos em seus antígenos alvos. “Escaneamento de epítopo” é o processo para agrupar anticorpos com base nos epítopos que os mesmos reconhecem. Mais particularmente, escaneamento de epítopo compreende métodos e sistemas para discriminar as propriedades de reconhecimento de epítopo de anticorpos diferentes, utilizando ensaios de competição em combinação com processos computacionais para agregação de anticorpos com base em suas propriedades de reconhecimento de epítopo e identificação de anticorpos que têm especificidades de ligação distintas.

[0125] “Carreadores”, como utilizado aqui, incluem carreadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis que são não tóxicos a uma célula ou um mamífero que é exposto aos mesmos nas dosagens e concentrações empregadas. Normalmente, o carreador fisiologicamente aceitável é uma solução tamponada de pH aquoso. Exemplos de carreadores fisiologicamente aceitáveis incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de peso molecular baixo (por exemplo, menos de aproximadamente 10 resíduos de aminoácidos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; álcoois de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contraíons de formação de sal, tais como sódio; e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN™, polietilenoglicol (PEG) e PLURONICS™. O termo “carreador” também pode se referir a um diluente, adjuvante (por exemplo, adjuvante, excipiente ou veículo de Freund (completo ou incompleto)). Tais carreadores, incluindo carreadores farmacêuticos, podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Água é um exemplo de carreador quando uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) é administrada intravenosamente. Soluções salinas e soluções de dextrose e glicerol aquosas também podem ser empregada como carreadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes adequados (por exemplo, excipientes farmacêuticos) incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e similares. A composição, se desejado, também pode conter quantidades menores de agentes molhantes ou emulsificantes ou agentes de tamponamento de pH. Composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsão, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação sustentada e similares. Composições orais, incluindo formulações, podem incluir carreadores padrões, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio etc. Exemplos de carreadores farmacêuticos adequados são descritos em Remington e Gennaro, Remington’s Pharmaceutical Sciences (18ª ed.1990). Composições, incluindo compostos farmacêuticos, podem conter um anticorpo anti-Nectina-4, por exemplo, em forma isolada ou purificada, em conjunto com uma quantidade adequada de carreadores.

[0126] O termo “farmaceuticamente aceitável”, como utilizado aqui, significa sendo aprovado por uma agência regulatória do Governo Federal ou um governo do estado ou listada na Farmacopeia dos Estados Unidos, Farmacopeia Europeia ou outra Farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e mais particularmente em humanos.

[0127] “Anticorpos policlonais”, como utilizado aqui, referem-se a uma população de anticorpo gerada em uma resposta imunogênica a uma proteína que tem muitos epítopos e, desse modo, inclui uma variedade de anticorpos diferentes direcionada aos mesmos epítopos ou a epítopos diferentes dentro da proteína.

Métodos para produzir anticorpos policlonais são conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 5ª ed.2002)).

[0128] Um “ácido nucleico isolado” é um ácido nucleico, por exemplo, um RNA, DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos, que é substancialmente separado de outras sequências de DNA genômicas, bem como proteínas ou complexos, tais como ribossomos e polímeroases, as quais acompanham naturalmente uma sequência nativa. Uma molécula de ácido nucleico “isolada” é uma que é separada de outras moléculas de ácido nucleico que estão presentes na fonte natural da molécula de ácido nucleico. Além disso, uma molécula de ácido nucleico “isolada”, tal como uma molécula de cDNA, pode ser substancialmente livre de outro material celular ou meio de cultura quando produzida por meio de técnicas recombinantes ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros reagentes químicos quando quimicamente sintetizada. Em uma modalidade específica, uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam um anticorpo, como é descrito aqui, são isoladas ou purificadas. O termo abrange sequências de ácido nucleico que foram removidas de seu ambiente de ocorrência natural e inclui isolados de DNA recombinantes ou clonados e análogos quimicamente sintetizados ou análogos biologicamente sintetizados por meio de sistemas heterólogos. Uma molécula substancialmente pura podem incluir formas isoladas da molécula.

[0129] “Polinucleotídeo” ou “ácido nucleico”, como usado de modo intercambiável no presente documento, refere-se a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento e inclui DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases e/ou seus análogos ou qualquer substrato que possa ser incorporado em um polímero por meio de polimerase de DNA ou RNA ou por meio de uma reação sintética. um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos.“Oligonucleotídeo”, como utilizado aqui, refere-se a polinucleotídeos curtos, geralmente de filamento único e sintéticos que têm geralmente, mas não necessariamente, menos de aproximadamente 200 nucleotídeos de comprimento. Os termos “oligonucleotídeo” e “polinucleotídeo” não são mutuamente exclusivos. A descrição acima para polinucleotídeos é igual e completamente aplicável a oligonucleotídeos. uma célula que produz um anticorpo anti-Nectina-4 da presente divulgação podem incluir uma célula de hibridoma mãe, bem como células hospedeiras bacterianas e eucarióticas nas quais ácidos nucleicos que codificam os anticorpos foram introduzidos. Células hospedeiras adequadas são reveladas abaixo.

[0130] A não ser que seja especificado o contrário, a extremidade esquerda de qualquer sequência de polinucleotídeos de filamento único revelada no presente documento é a extremidade 5’; a direção esquerda de sequências de polinucleotídeos de filamento duplo é denominada como a direção 5’. A direção de adição de 5’ a 3’ de transcritos de RNA nascentes é denominada como a direção de transcrição; regiões de sequência no filamento de DNA que tem a mesma sequência que o transcrito de RNA que são 5’ à extremidade 5’ do transcrito de RNA são denominadas como “sequências a montante”; regiões de sequência no filamento de DNA que têm a mesma sequência que o transcrito de RNA que são 3’ à extremidade 3’ do transcrito de RNA são denominadas como “sequências a jusante”.

[0131] O termo “anticorpo recombinante” refere-se a um anticorpo que é preparado, expresso, criado ou isolado por meios recombinantes. Anticorpos recombinantes podem ser anticorpos expressos utilizando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira, anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo recombinante e combinatória, anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo ou uma vaca) que é transgênico e/ou transcromossômico para genes de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, Taylor et al., 1992, Nucl. Acids Res.20:6.287 a 6.295) ou anticorpos preparados, expressos,

criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem splicing de sequências genéticas de imunoglobulina para outras sequências de DNA. Tais anticorpos recombinantes podem ter regiões variáveis e constantes, incluindo aqueles derivados a partir de sequências de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana (Ver Kabat et al., supra). Em certas modalidades, entretanto, tais anticorpos recombinantes podem ser submetidos a mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências de Ig humanas é usado, mutagênese somática in vitro), desse modo as sequências de aminoácidos das regiões de VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas a sequências de VH e VL de linha genética humana , podem não existir naturalmente dentro do repertório de linha genética de anticorpo humano in vivo.

[0132] Os termos “indivíduo” e “paciente” podem ser usados de modo intercambiável. Como utilizado aqui, em certas modalidades, um indivíduo é um mamífero, tal como um não primata (por exemplo, vaca, porco, cavalo, gato, cão, rato etc.) ou um primata (por exemplo, macaco e humano). Em modalidades específicas, o indivíduo é um humano. Em uma modalidade, o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um humano, diagnosticado com uma afecção ou distúrbio fornecido aqui. Em outra modalidade, o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um humano, com risco de desenvolver uma afecção ou um distúrbio fornecido aqui.

[0133] “Substancialmente todo” refere-se a pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 65%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99% ou aproximadamente 100%.

[0134] O termo “sonda detectável” refere-se a uma composição que fornece um sinal detectável. O termo inclui, sem limitação, qualquer fluoróforo, cromóforo, radio-identificação, enzima, anticorpo ou fragmento de anticorpo e similares, que forneça um sinal detectável por meio de sua atividade.

[0135] O termo “agente detectável” refere-se a uma substância que pode ser usada para assegurar a existência ou presença de uma molécula desejada, tal como um anticorpo anti-Nectina-4, como é descrito aqui, em uma amostra ou um indivíduo.

Um agente detectável pode ser uma substância que tem capacidade para ser visualizada ou uma substância que tem capacidade, de outro modo, de ser determinada e/ou medida (por exemplo, por meio de quantificação).

[0136] O termo “agente de diagnóstico” refere-se a uma substância administrada a um indivíduo que auxilia no diagnóstico de uma doença, um distúrbio ou afecções. Tais substâncias podem ser usadas para revelar, apontar e/ou definir a localização de um processo que causa a doença. Em certas modalidades, um agente de diagnóstico inclui o anticorpo anti-Nectina-4 ou um fragmento do mesmo, como é descrito aqui, que quanto sozinho ou conjugado a uma substância e administrado a um indivíduo ou colocado em contato com uma amostra de um indivíduo, auxilia no diagnóstico de uma doença mediada pela Nectina-4.

[0137] O termo “ácido nucleico de codificação” ou equivalentes gramaticais do mesmo, como é usado em referência a molécula de ácido nucleico, refere-se a uma molécula de ácido nucleico em seu estado nativo ou quando manipulada por meio de métodos bem conhecidos pelos peritos na técnica que podem ser transcritos para produzir mRNA, que é, então, traduzido em um polipeptídeo e/ou um fragmento do mesmo. O filamento antissentido é o complemento de tal molécula de ácido nucleico e a sequência de codificação pode ser deduzida a partir da mesma.

[0138] O termo “excipiente” refere-se a uma substância inerte que é comumente usada como um diluente, veículo, conservante, ligante ou agente estabilizante e inclui, mas sem limitação, proteínas (por exemplo, albumina de soro etc.), aminoácidos (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, arginina, glicina, histidina etc.), ácidos graxos e fosfolipídios (por exemplo, sulfonatos de alquila, caprilato etc.), tensoativos (por exemplo, SDS, polissorbato, tensoativo não iônico etc.), sacarídeos (por exemplo, sacarose, maltose, trealose etc.) e polióis (por exemplo, manitol, sorbitol etc.). Ver, também, Remington e Gennaro, Remington’s Pharmaceutical Sciences (18ª ed.1990), que é incorporado aqui como referência em sua totalidade.

[0139] No contexto de um peptídeo ou um polipeptídeo, o termo “fragmento” como utilizado aqui se refere a um peptídeo ou um polipeptídeo que compreende menos que a sequência de aminoácidos de comprimento completo. Tal fragmento pode ocorrer, por exemplo, de um trucamento no terminal amino, um trucamento no terminal carbóxi e/ou uma deleção interna de resíduo(s) da sequência de aminoácidos. Os fragmentos podem, por exemplo, resultar do splicing alternativo do RNA ou da atividade de proteases in vivo. Em certas modalidades, os fragmentos de Nectina-4 ou os fragmentos de anticorpo anti-Nectina-4 incluem polipeptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos de pelo menos 5 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 10 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 15 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 20 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 25 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 30 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 40 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 50 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 60 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 70 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 80 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 90 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 100 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 125 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 150 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 175 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 200 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 225, pelo menos 250, pelo menos 275, pelo menos 300, pelo menos 325, pelo menos 350, pelo menos 375, pelo menos 400, pelo menos 425, pelo menos 450, pelo menos 475, pelo menos 500, pelo menos 525 ou pelo menos 550 resíduos de aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um anticorpo anti-Nectina-4. Em uma modalidade específica, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um anticorpo anti-Nectina-4 mantém pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3 ou mais funções do polipeptídeo ou do anticorpo.

[0140] Os termos “em torno de” e “aproximadamente” singificam dentro de 20%, dentro de 15%, dentro de 10%, dentro de 9%, dentro de 8%, dentro de 7%, dentro de 6%, dentro de 5%, dentro de 4%, dentro de 3%, dentro de 2%, dentro de 1% ou menos de certo valor ou faixa.

[0141] “Administrar” ou “administração” refere-se ao ato de injetar ou de outra maneira fornecer fisicamente uma substância que existe fora do corpo (por exemplo, um anticorpo anti-Nectina-4 que é descrito aqui) a um paciente, tal como através de fornecimento na mucosa, intradérmico, intravenoso, intramuscular e/ou qualquer outro método de fornecimento físico descrito aqui ou conhecido na técnica.

[0142] No contexto de um polipeptídeo, o termo “análogo” como utilizado aqui se refere a um polipeptídeo que possui uma função similar ou idêntica à de um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um anticorpo anti-Nectina-4, mas não compreende necessariamente uma sequência de aminoácidos similar ou idêntica de um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um anticorpo anti-Nectina-4 ou possui uma estrutura similar ou idêntica de um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um anticorpo anti-Nectina-4. Um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos similar refere-se a um polipeptídeo que satisfaz pelo menos um dos seguintes: (a) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%,

pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos

90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% idêntico à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um anticorpo anti-Nectina-4 descrito aqui; (b) um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos que se hibridiza sob condições rigorosas a uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um anticorpo anti-Nectina-4 (ou região VH ou VL do mesmo) descrito aqui pelo menos 5 resíduos de aminoácidos, pelo menos 10 resíduos de aminoácidos, pelo menos 15 resíduos de aminoácidos, pelo menos 20 resíduos de aminoácidos, pelo menos 25 resíduos de aminoácidos, pelo menos 30 resíduos de aminoácidos, pelo menos 40 resíduos de aminoácidos, pelo menos 50 resíduos de aminoácidos, pelo menos 60 amino resíduos, pelo menos 70 resíduos de aminoácidos, pelo menos 80 resíduos de aminoácidos, pelo menos 90 resíduos de aminoácidos, pelo menos 100 resíduos de aminoácidos, pelo menos 125 resíduos de aminoácidos ou pelo menos 150 resíduos de aminoácidos (ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2001); e

Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)); ou (c) um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 30%,

pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos

55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos

99% idêntico à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo da Nectina-4,

um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um anticorpo anti-Nectina-4 (ou região VH ou VL do mesmo) descrito aqui.

Um polipeptídeo com estrutura similar a de um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um anticorpo anti-Nectina-4 descrito aqui se refere a um polipeptídeo que tem uma estrutura secundária, terciária ou quaternária similar à de um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um anticorpo anti- Nectina-4 descrito aqui. A estrutura de um polipeptídeo pode ser determinada através dos métodos conhecidos pelos peritos na técnica, incluindo, mas não limitados a, cristalografia de raios-X, ressonância magnética nuclear e microscopia eletrônica cristalográfica.

[0143] No contexto de um polipeptídeo, o termo “derivado” como utilizado aqui se refere a um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um anticorpo que se liga a um polipeptídeo da Nectina-4 que foi alterado através da introdução de resíduo de aminoácido substituições, deleções ou adições. O termo “derivado” como utilizado aqui refere-se também a um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um anticorpo que se liga a um polipeptídeo da Nectina-4 que foi modificado quimicamente, por exemplo, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao polipeptídeo. Por exemplo, mas não com a finalidade de limitação, um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um anticorpo anti-Nectina-4 pode ser quimicamente modificado, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, clivagem química, formulação, síntese metabólica de tunicamicina, ligação a um ligante celular ou outra proteína etc. Os derivados são modificados de uma maneira que é diferente do peptídeo ou dos polipeptídeos que ocorrem naturalmente ou de partida, no tipo ou na localização das moléculas ligadas. Os derivados incluem ainda a deleção de um ou mais grupos químicos que estão naturalmente presentes no peptídeo ou no polipeptídeo. Ainda, um derivado de um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um anticorpo anti-Nectina-4 pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos. Um derivado de polipeptídeo possui uma função similar ou idêntica à de um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um anticorpo anti- Nectina-4 descrito aqui.

[0144] É pretendido que o termo “composição” abranja um produto que contém os ingredientes especificados (por exemplo, um anticorpo fornecido aqui), opcionalmente, nas quantidades especificadas.

[0145] Como utilizado aqui, os termos “prevenir”, “prevenindo” e “prevenção” referem-se à inibição total ou parcial do desenvolvimento, da recorrência, do início ou do espalhamento de uma doença mediada pela Nectina-4 e/ou sintoma relacionado à mesma, resultante da administração de uma terapia ou uma combinação de terapias fornecidas aqui (por exemplo, uma combinação de agentes profiláticos ou terapêuticos, tal como um anticorpo fornecido aqui).

[0146] Como utilizado aqui, o termo “agente profilático” refere-se a qualquer agente que possa inibir totalmente ou parcialmente o desenvolvimento, a recorrência, o início ou o espalhamento de uma doença mediada pela Nectina-4 e/ou sintoma relacionado à mesma em um indivíduo. Em certas modalidades, o termo “agente profilático” refere-se a um anticorpo fornecido aqui. Em certas outras modalidades, o termo “agente profilático” refere-se a um agente que não é um anticorpo fornecido aqui. Em algumas modalidades, um agente profilático é um agente que é conhecido por ser útil ou que foi ou que está sendo atualmente utilizado para prevenir uma doença mediada pela Nectina-4 e/ou um sintoma relacionado à mesma ou impedir o início, o desenvolvimento, a progressão e/ou a gravidade de uma doença mediada pela Nectina-4 e/ou um sintoma relacionado à mesma. Em modalidades específicas, o agente profilático é um anticorpo anti-Nectina-4 totalmente humano, tal como um anticorpo monoclonal anti-Nectina-4 totalmente humano.

[0147] Em certas modalidades, um “título de soro profilaticamente eficiente” é o título do soro em um indivíduo, tal como um ser humano, que inibe totalmente ou parcialmente o desenvolvimento, a recorrência, o início ou o espalhamento de uma doença mediada pela Nectina-4 e/ou um sintoma relacionado à mesma no dito indivíduo.

[0148] Uma “doença mediada pela Nectina-4” e um “distúrbio mediado pela Nectina-4” são utilizados aqui de forma intercambiável e referem-se a qualquer doença que é completamente ou parcialmente causada por, é o resultado de ou está correlacionada à Nectina-4. Em certas modalidades, a Nectina-4 é expressa de forma aberrante (por exemplo, altamente) na superfície de uma célula. Em algumas modalidades, a Nectina-4 pode ser regulada para mais de forma aberrante sem um tipo de célula particular. Em outras modalidades, a sinalização celular normal, aberrante ou excessiva é causada pela ligação da Nectina-4 a um ligante da Nectina-4. Em algumas modalidades, doença mediada pela Nectina-4 é uma doença na qual a Nectina-4 pode ser utilizada como um biomarcador em um indivíduo, por exemplo, um ser humano. Em algumas modalidades, doença mediada pela Nectina- 4 é uma doença na qual a expressão da Nectina-4 pode refletir progressão ou prognóstico de doença em um indivíduo, por exemplo, um ser humano. Em certas modalidades, o ligante da Nectina-4 é um receptor da Nectina-4, por exemplo, que é expresso na superfície de uma célula.

[0149] O termo “título no soro” como utilizado aqui se refere a um título no soro médio em uma população de pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30 ou pelo menos 40 indivíduos até aproximadamente 100, 1000 ou mais.

[0150] Como utilizado aqui, o termo “efeitos colaterais” abrange efeitos indesejados e adversos de uma terapia (por exemplo, um agente profilático ou terapêutico). Os efeitos indesejados não são necessariamente adversos. Um efeito adverso de uma terapia (por exemplo, um agente profilático ou terapêutico) poderia ser prejudicial ou desconfortável ou perigoso. Exemplos de efeitos colaterais incluem, diarreia, tosse, gastroenterite, respiração ofegante, náusea, vômito, anorexia, câimbras abdominais, febre, dor, perda de peso corporal, desidratação, alopecia, dispneia, insônia, vertigem, mucosite, efeitos nos nervos e nos músculos, fadiga, boca seca e perda de apetite, erupções na pele ou inchaços no local da administração, sintomas similares aos da gripe tais como febre, calafrios e fadiga, problemas no trato digestivo e reações alérgicas. Os efeitos indesejados adicionais sofridos pelos pacientes são inúmeros e são conhecidos na técnica. Muitos estão descritos na Physician’s Desk Referência (60th ed., 2006).

[0151] Como utilizado aqui, o termo “agente terapêutico” refere-se a qualquer agente que pode ser usado no tratamento, gerenciamento ou melhoramento de uma doença mediada pela Nectina-4 e/ou um sintoma relacionado à mesma. Em certas modalidades, o termo “agente terapêutico” refere-se a um anticorpo fornecido aqui. Em certas outras modalidades, o termo “agente terapêutico” refere-se a um agente diferente de um anticorpo fornecido aqui. Em algumas modalidades, um agente terapêutico é um agente que é conhecido por ser útil para ou ter sido útil ou está sendo atualmente usado para o tratamento, gerenciamento ou melhoramento de uma doença mediada pela Nectina-4 ou um ou mais sintomas relacionados à mesma.

[0152] A combinação de terapias (por exemplo, uso de agentes profiláticos ou terapêuticos) que é mais eficaz que os efeitos aditivos de quaisquer duas ou mais terapias únicas. Por exemplo, um efeito sinérgico de uma combinação de agentes profiláticos e/ou terapêuticos é mais eficaz que o agente único sozinho e/ou permite o uso de dosagens menores de um ou mais dentre os agentes e/ou administração menos frequente dos ditos agentes a um indivíduo com uma doença mediada pela Nectina-4. A habilidade para utilizar dosagens menores de terapias profiláticas ou terapêuticas e/ou administrar as ditas terapias menos frequentemente reduz a toxicidade associada a uma administração das ditas terapias a um indivíduo sem reduzir a eficácia das ditas terapias na prevenção, no gerenciamento, no tratamento ou no melhoramento de uma doença mediada pela Nectina-4. Em adição, um efeito sinérgico pode resultar em eficácia aperfeiçoada de terapias na prevenção ou no gerenciamento, tratamento ou melhoramento de uma doença mediada pela Nectina-

4. Finalmente, o efeito sinérgico de uma combinação de terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) pode evitar ou reduzir efeitos colaterais adversos ou indesejados associados ao uso de qualquer terapia única.

[0153] Em certas modalidades, um “título no soro terapeuticamente eficaz” é o título no soro em um indivíduo, tal como um humano, que reduz a gravidade, a duração e/ou os sintomas associados a uma doença mediada pela Nectina-4 no dito indivíduo.

[0154] Como utilizado aqui, o termo “terapia” refere-se a qualquer protocolo, método e/ou agente que pode ser usado na prevenção, no gerenciamento, tratamento e/ou melhoramento de uma doença mediada pela Nectina-4. Em certas modalidades, os termos “terapias” e “terapia” referem-se a uma terapia biológica, terapia de suporte e/ou outras terapias úteis na prevenção, no gerenciamento, tratamento e/ou melhoramento de uma doença mediada pela Nectina-4 conhecida por um perito na técnica, tal como pessoal médico.

[0155] Como utilizado aqui, os termos “tratar”, “tratamento” e “que trata” referem-se à redução ou ao melhoramento da progressão, gravidade e/ou duração de uma doença mediada pela Nectina-4 resultante de uma administração de uma ou mais terapias (incluindo, mas sem limitação, uma administração de um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos, tal como um anticorpo fornecido aqui).

[0156] Como utilizado aqui, os termos “gerenciar”, “que gerencia” e “gerenciamento” referem-se aos efeitos benéficos que um indivíduo deriva de uma terapia (por exemplo, um agente profilático ou terapêutico), que não resulta em uma cura de uma afecção associada a Nectina-4. Em certas modalidades, um indivíduo é administrado uma ou mais terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos, tais como um anticorpo descrito aqui) para “gerenciar” uma afecção ou um distúrbio descrito aqui, um ou mais sintomas dos mesmos, a fim de impedir a progressão ou pioramento da afecção ou do distúrbio.

[0157] Como utilizado aqui, os termos “prevenir”, “que previne” e “prevenção” referem-se à inibição total ou parcial do desenvolvimento, da recorrência, do início ou do espalhamento de uma doença mediada pela Nectina-4 e/ou de um sintoma relacionado à mesma, resultante de uma administração de uma terapia ou combinação de terapias fornecida aqui (por exemplo, uma combinação de agentes profiláticos ou terapêuticos, tais como um anticorpo da invenção).

[0158] Como utilizado aqui, “administrar” ou “administração” refere-se ao ato de injetar ou entregar fisicamente de outro modo uma substância (por exemplo, um anticorpo anti-Nectina-4 fornecido aqui ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) a um indivíduo ou um paciente (por exemplo, humano), tal como por meio de entrega mucosal, topical, intradérmica, parenteral, intravenosa, subcutânea, intramuscular e/ou qualquer outro método de entrega física descrito aqui ou conhecido na técnica.

[0159] Como utilizado aqui, os termos “quantidade eficiente” ou “quantidade terapeuticamente eficiente” referem-se a uma quantidade de uma terapia (por exemplo, um anticorpo ou uma composição farmacêutica fornecida aqui) que é suficiente para reduzir e/ou melhorar a gravidade e/ou duração de uma dada afecção, distúrbio ou doença e/ou um sintoma relacionado à mesma. Esses termos também abrangem uma quantidade necessária para a redução, diminuição ou melhoramento do avanço ou progressão de uma dada doença, redução, diminuição ou melhoramento da recorrência, do desenvolvimento ou do início de uma dada doença e/ou para aperfeiçoar ou aprimorar o efeito (ou efeitos) profilático ou terapêutico de outra terapia (por exemplo, uma terapia diferente de um anticorpo anti-Nectina-4 fornecido aqui). Em algumas modalidades, “quantidade eficiente”, como utilizado aqui, refere-se também à quantidade de um anticorpo descrito aqui para alcançar um resultado especificado.

[0160] Os termos “estabilidade” e “estável”, como utilizados aqui, no contexto de uma formulação líquida que compreende um anticorpo que se liga de forma imunoespecífica a um antígeno da Nectina-4 referem-se à resistência do anticorpo na formulação para dobramento, , degradação ou fragmentação térmica e química sob dadas condições de manufatura, preparação, transporte e armazenamento. As formulações “estáveis” fornecidas aqui retêm atividade biológica igual ou maior que 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 99,5% sob dadas condições de manufatura, preparação, transporte e armazenamento. A estabilidade do anticorpo pode ser avaliada por graus de agregação, degradação ou fragmentação através dos métodos conhecidos pelos peritos na técnica, incluindo, mas não limitados a Eletroforese de Gel Capilar reduzido (rCGE), Eletroforese de Gel de Poliacrilamida de Sulfato de Dodecil Sódio (SDS-PAGE) e HPSEC, em comparação com um anticorpo de referência. A estabilidade geral de uma formulação que compreende um anticorpo que se liga de forma imunoespecífica a um antígeno da Nectina-4 pode ser avaliada por meio de diversos ensaios imunológicos incluindo, por exemplo, ELISA e ensaio radio-imunológico utilizando o epítopo específico de Nectina-4. Em algumas formulações exemplificativas, o anticorpo anti-Nectina-4 pode ser estável por dois meses, quatro meses, seis meses, oito meses, dez meses, um ano, dezoito meses, dois anos, três anos ou mais.

[0161] O termo “substancialmente livre de tensoativo”, como utilizado aqui, se refere a uma formulação de um anticorpo que se liga de forma imunoespecífica a um antígeno da Nectina-4, em que a dita formulação contém menos que 0,0005%,

menos que 0,0003% ou menos que 0,0001% de tensoativos e/ou menos que 0,0005%, menos que 0,0003% ou menos que 0,0001% de tensoativos.

[0162] O termo “substancialmente livre de sal”, como utilizado aqui, se refere a uma formulação de um anticorpo que se liga de forma imunoespecífica a um antígeno da Nectina-4, em que a dita formulação contém menos que 0,0005%, menos que 0,0003% ou menos que 0,0001% de sais inorgânicos.

[0163] O termo “sal inorgânico”, como utilizado aqui, se refere a quaisquer compostos que não contêm carbono que resulta da substituição de parte ou todo o hidrogênio ácido ou um ácido por um metal ou um grupo que atua como um metal e são normalmente usados como um composto de ajuste de tonicidade em composições e preparações farmacêuticas de materiais biológicos. Os sais inorgânicos mais comuns são NaCl, KCl, NaH2PO4 etc.

[0164] O termo “tensoativo”, como utilizado aqui, se refere a substâncias orgânicas que têm estruturas anfipáticas; a saber, as mesmas são compostas por grupos de tendências de solubilidade opostas, tipicamente uma cadeia de hidrocarbonetos solúveis em óleo e um grupo iônico solúvel em água. Tensoativos podem ser classificados, dependendo da carga da porção química ativa em superfície, em tensoativos aniônicos, catiônicos e não iônicos. Tensoativos são normalmente usados como agentes molhantes, emulsificantes, solubilizantes e dispersantes para diversas composições e preparações farmacêuticas de materiais biológicos.

8. Composições e Métodos de Produção das Mesmas

[0165] São fornecidos aqui anticorpos que se ligam de forma imunoespecífica a um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um epítopo da Nectina-4. Também são fornecidos ácidos nucleicos isolados que codificam anticorpos que se ligam de forma imunoespecífica a um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um epítopo da Nectina-4. São adicionalmente fornecidos vetores e células hospedeiras que compreendem ácidos nucleicos que codificam anticorpos que se ligam de forma imunoespecífica a um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um epítopo da Nectina-4. Também são fornecidos métodos de produção de anticorpos que se ligam de forma imunoespecífica a um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um epítopo da Nectina-4.

[0166] Em certas modalidades, os anticorpos fornecidos aqui se ligam à Nectina-4 humana e/ou de cyno. Em uma modalidade, os anticorpos para Nectina-4 se ligam à Nectina-4 humana. Em uma modalidade, os anticorpos para Nectina-4 se ligam à Nectina-4 de cyno. Em uma modalidade, os anticorpos para Nectina-4 se ligam tanto à Nectina-4 humana quanto à Nectina-4 de cyno. Em outras modalidades, os anticorpos fornecidos aqui não se ligam à Nectina-4 de roedor.

[0167] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Nectina-4 se ligam ao domínio extracelular (ECD) da Nectina-4. Em certas modalidades, os anticorpos anti- Nectina-4 se ligam a um epítopo no ECD da Nectina-4, que é distinto do sítio de ligação do ligante da Nectina-4.

[0168] Também são fornecidos anticorpos que bloqueiam competitivamente um anticorpo anti-Nectina-4 fornecido aqui da ligação a um polipeptídeo da Nectina-

4.

[0169] Também são fornecidos anticorpos que competem pela ligação a um polipeptídeo da Nectina-4 com um anticorpo anti-Nectina-4 fornecido aqui.

[0170] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Nectina-4 não bloqueiam a ligação do ligante da Nectina-4 a um polipeptídeo da Nectina-4.

[0171] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Nectina-4 não competem com o ligante da Nectina-4 pela ligação a um polipeptídeo da Nectina-4.

[0172] Em certas modalidades, a ligação do ligante de Nectina-4 à Nectina-4 não é inibida pelo anticorpo.

[0173] Os anticorpos anti-Nectina-4 fornecidos aqui também podem ser conjugados ou fundidos de forma recombinante, por exemplo, a um agente de diagnóstico, um agente detectável e/ou um agente. São adicionalmente fornecidas composições que compreendem um anticorpo anti-Nectina-4.

[0174] Também são fornecidas aqui moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam uma cadeia pesada, uma cadeia leve de imunoglobulina, uma região VH, uma região VL, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 e/ou VL CDR3 de anticorpos anti-Nectina-4 que se ligam a um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4, um peptídeo da Nectina-4 ou um epítopo da Nectina-4.

[0175] São adicionalmente fornecidos vetores e células hospedeiras que compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos anti-Nectina-4 que se ligam a um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4, um peptídeo da Nectina-4 ou um epítopo da Nectina-4. Também são fornecidos métodos de produção de anticorpos que se ligam a um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4, um peptídeo da Nectina- 4 ou um epítopo da Nectina-4.

[0176] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece anticorpos anti- Nectina-4 que podem encontrar uso aqui como agentes de diagnóstico. Os exemplos de anticorpos incluem anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, humanos e heteroconjugados, bem como suas variantes que têm afinidade aprimorada ou outras propriedades.

9. Anticorpos Anti-Nectina-4

[0177] Os anticorpos fornecidos aqui, mas não são limitados a, anticorpos sintéticos, anticorpos monoclonais, anticorpos produzidos de forma recombinante,

anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, intrabodies, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos camelizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’), Fvs ligados com dissulfeto (sdFv), anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) e fragmentos que se ligam aos epítopos de qualquer um dos anteriores.

[0178] Em particular, os anticorpos fornecidos aqui incluem moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação ao antígeno que se liga de forma imunoespecífica a um antígeno da Nectina-4. As moléculas de imunoglobulina fornecidas aqui podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, um anticorpo fornecido aqui é um anticorpo IgG, tal como um anticorpo IgG1.

[0179] Variantes e derivados de anticorpos incluem fragmentos de anticorpo que mantêm a capacidade de se ligar especificamente a um epítopo. Os exemplos de fragmentos incluem fragmentos Fab (um fragmento de anticorpo que contém o domínio de ligação ao antígeno e compreende uma cadeia leve e parte de uma cadeia pesada ligadas em ponte por uma ligação dissulfeto); Fab' (um fragmento de anticorpo que contém um único domínio anti ligação que compreende um Fab e uma porção adicional da cadeia pesada através da região de dobradiça); F(ab')2 (duas moléculas de Fab' ligadas por ligações dissulfeto intercadeia nas regiões de dobradiça das cadeias pesadas; as moléculas de Fab’ podem ser direcionadas para os mesmos ou epítopos diferentes); uma cadeia de Fab de cadeia única que compreende uma região variável, também conhecida como, um sFv (a região variável que determina a ligação ao antígeno de uma cadeia leve e uma pesada individuais de um anticorpo ligadas uma a outra por uma cadeia de 10-25 aminoácidos); um Fv com ligação dissulfeto ou dsFv (a região variável que determina a ligação ao antígeno de uma cadeia leve e uma pesada individuais de um anticorpo ligadas uma a outra por uma ligação dissulfeto); uma VH camelizada (a região variável que determina a ligação ao antígeno de uma cadeia pesada individual de um anticorpo na qual alguns aminoácidos na interface de VH são encontrados na cadeia pesada de anticorpos de camelo que ocorrem naturalmente); um diabody (um sFv dimerizado formado quando o domínio VH de um primeiro sFv se une com o domínio VL de um segundo sFv e o domínio VL do primeiro sFv se une com o domínio VH do segundo sFv; as duas regiões de ligação ao antígeno do diabody podem ser direcionadas para os mesmos epítopos ou diferentes); e um triabody (um sFv trimerizado, formado de uma maneira similar à de um diabody, mas no qual três domínios de ligação ao antígeno são criados em um único complexo; os três domínios de ligação ao antígeno podem ser direcionados para os mesmos epítopos ou diferentes). Os derivados de anticorpos também incluem uma ou mais sequências de CDR de um sítio de combinação de anticorpo. As sequências de CDR podem ser ligadas umas às outras em um scaffold quando duas ou mais sequências de CDR estiverem presentes. Em certas modalidades, um anticorpo fornecido aqui compreende um Fv de cadeia única (“scFv”). Os scFvs são fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios VH e VL de um anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipeptídeo do scFv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que possibilita que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação ao antígeno. Para uma revisão dos scFvs ver Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp.269- 315 (1994).

[0180] Os anticorpos fornecidos aqui podem ser de qualquer origem animal incluindo aves e mamíferos (por exemplo, ser humano, camundongo, jumento, ovino, coelho, caprino, porquinho da Índia, camelo, equino ou frango). Em certas modalidades, os anticorpos fornecidos aqui são anticorpos humanos ou humanizados monoclonais. Como utilizado aqui, anticorpos “humanos” incluem anticorpos que têm a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulinas humanas ou de camundongos que expressam anticorpos partindo de genes humanos.

[0181] Em certas modalidades, os anticorpos são anticorpos totalmente humanos, tais como anticorpos totalmente humanos que se ligam de forma imunoespecífica a um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4 ou um epítopo da Nectina-4. Tais anticorpos totalmente humanos seriam vantajosos em relação aos completamente de camundongo (ou anticorpos inteiros ou parciais de outras espécies não humanas), anticorpos humanizados ou anticorpos quiméricos para minimizar o desenvolvimento de efeitos colaterais indesejados ou desnecessários, tais como respostas imunológicas direcionadas para anticorpos que não são totalmente humanos (por exemplo, anticorpos anti-Nectina-4 derivados de outra espécie) quando administrados ao indivíduo.

[0182] Em uma modalidade, o anticorpo fornecido aqui pode incluir um anticorpo biespecífico ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que tem dois anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, dos quais cada um é direcionado para um epítopo diferente sobre a Nectina-4.

[0183] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos aqui são monoespecíficos para certo epítopo de um polipeptídeo da Nectina-4 e não se ligam de forma imunoespecífica a outros epítopos.

[0184] Em algumas modalidades, são fornecidos aqui anticorpos que se ligam à Nectina-4, incluindo um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4, um peptídeo da Nectina-4 ou um epítopo da Nectina-4.

Em uma modalidade, um anticorpo fornecido aqui se liga à Nectina-4 humana. Em outra modalidade, um anticorpo fornecido aqui se liga à Nectina-4 de cyno. Em outra modalidade, um anticorpo fornecido aqui se liga à Nectina-4 humana e Nectina-4 de cyno. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Nectina-4 não bloqueiam a ligação do ligante da Nectina-4 a um polipeptídeo da Nectina-4. Em outras modalidades, os anticorpos anti-Nectina-4 são anticorpos humanizados (por exemplo, que compreendem regiões constantes humanas) que se ligam à Nectina-4, incluindo um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4, um peptídeo da Nectina-4 ou um epítopo da Nectina-4.

[0185] Em uma modalidade, os anticorpos das composições que compreendem os anticorpos e os métodos de utilização dos anticorpos fornecidos aqui incluem um anticorpo M22-321b41.1. Também são fornecidos aqui hibridomas que produzem o anticorpo M22-321b41.1. Em algumas modalidades, o anticorpo M22-321b41.1 é produzido partindo da linhagem de células de hibridoma M22- 321b41.1. Em algumas modalidades, o anticorpo M22-321b41.1 tem isotipo IgG2a/kappa de camundongo.

[0186] M22-321b41.1 é uma linhagem de células de hibridoma de origem de camundongo. A linhagem de células de hibridoma M22-321b41.1 foi depositada em 13 de junho de 2017 (ATCC Accession Nos. PTA-124245).

[0187] Em certas modalidades, o anticorpo anti-Nectina-4 compreende uma região VH, uma região VL, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 e/ou VL CDR3 do anticorpo monoclonal de camundongo descrito aqui, tal como uma sequência de aminoácidos representada na Tabela 1. Consequentemente, em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou seu fragmento funcional fornecido aqui compreende uma, duas e/ou três CDRs de cadeia pesada e/ou uma, duas e/ou três CDRs de cadeia leve do anticorpo anti-Nectina-4 M22-321b41.1.

Tabela 1: Sequências de CDR do Anticorpo M22-321b411 Exemplificativo Kabat Chothia Contact

VL VL RSSKSLLHSNGITYLY RSSKSLLHSNGIT RSSKSLLHSNGI ITYLYWY CD CDR (SEQ ID NP:7) YLY (SEQ ID NO:7) TYLY (SEQ ID (SEQ ID NO:8) R 1 NO:7)

Seq VL LLIYHMSLAS (SEQ ID HMSNLAS (SEQ ID HMSNLAS (SEQ LLIYHMSNLA . CDR NO:9) NO:10) ID NO:10) (SEQ ID 2 NO:11) VL AQNLELPFT (SEQ ID AQNLELPFT (SEQ AQNLELPFT AQNLELPFT CDR NO:12) ID NO:12) (SEQ ID NO:12) (SEQ ID 3 NO:13-) VH VH GYTFTTYWMQ (SEQ TYWMQ (SEQ ID GYTFTTY (SEQ TTYWMQ CD CDR ID NO:14) NO:15) ID O:16) (SEQ ID R 1 NO:17) Seq VH WIGSIYPGDGDTRYT SIYPGDGDTRYTQ YPGDGD (SEQ WIGSIYPGDG . CDR QKFKG (SEQ ID KFKG (SEQ ID ID NO:20) DTR (SEQ ID 2 NO:18) NO:19) NO:21) VH AREYYGLDY (SEQ ID EYYGLDY (SEQ ID EYYGLDY (SEQ AREYYGLD CDR NO:22) NO:23) ID NO:23) (SEQ ID 3 NO:24) Sequência de VL:

DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYHMSNLASGVPD

RFTSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPFTFGGGTKLETKRADAAPTVSIPFPPSSE QLTSG (SEQ ID NO: 3) Sequência de VH:

QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYIFTTYWMQVKQRPGQGLEWIGSIYPGDGDTRYTQK

FKGKATLTADKSSSTAYIQLSTLASEDSAVYYCAREYYGLDYWGQGTTVSSAKTTAPSVYPLAPC GDTTG (SEQ ID NO: 4)

[0188] Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido aqui compreende ou consiste de seis CDRs, por exemplo, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 e/ou VL CDR3 identificadas nas Tabelas 1. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido aqui pode compreender menos de seis CDRs. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ou consiste de uma, duas, três, quatro ou cinco CDRs selecionadas do grupo que consiste de VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 e/ou VL CDR3 identificadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ou consiste de uma, duas, três, quatro ou cinco CDRs selecionadas do grupo que consiste de VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 e/ou VL CDR3 do anticorpo monoclonal M22-321b41.1.

[0189] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos aqui compreendem uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) VH CDRs listadas na Tabela 1. Em outras modalidades, os anticorpos fornecidos aqui compreendem uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) VL CDRs listadas na Tabela 1. Ainda em outras modalidades, os anticorpos fornecidos aqui compreendem uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) VH CDRs listadas na Tabela 1 e uma ou mais VL CDRs listadas na Tabela 1. Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia VH CDR1

(SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH CDR1 (SEQ

ID NO:14). Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO:19), Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH

CDR2 (SEQ ID NO:21) e Exemplary VH CDR2 (SEQ ID NO:18). Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID

NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e

Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma VH CDR1 e/ou uma VH CDR2 e/ou uma VH CDR3 selecionada independentemente de qualquer uma da(s) sequência(s) de aminoácidos de VH

CDR1, VH CDR2, VH CDR3 que é(são) representada(s) na Tabela 1. Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID

NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e

Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7). Em outra modalidade, os anticorpos compreendem uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2

(SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID

NO:9). Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat

VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12). Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma VL CDR1 e/ou uma VL CDR2 e/ou uma VL CDR3 selecionada independentemente de qualquer uma das sequências de aminoácidos de VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3 que são representadas na Tabela 1.

[0190] Em certas modalidades, os anticorpos fornecidos aqui compreendem uma região VH que compreende: (1) uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14); (2) uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO:19), Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e Exemplary VH CDR2 (SEQ ID NO:18); e (3) uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); e uma região VL que compreende: (1) uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7); (2) uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9); e (3) uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12).

[0191] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos aqui compreendem uma região VH que compreende: (1) uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14); (2) uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO:19), Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e Exemplary VH CDR2 (SEQ ID NO:18); e (3) uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22).

[0192] Em outras modalidades, os anticorpos fornecidos aqui compreendem uma região VL que compreende: (1) uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7); (2) uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9); e (3) uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12).

[0193] Também são fornecidos aqui anticorpos que compreendem uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) VH CDRs e uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) VL CDRs listadas na Tabela 1. Em particular, é fornecido aqui um anticorpo que compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14); e uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia

VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1

(SEQ ID NO:7). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat

VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1

(SEQ ID NO:17) e Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14); e uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL

CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ

ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia

VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH

CDR1 (SEQ ID NO:14); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia

VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL

CDR3 (SEQ ID NO:12). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH

CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO:19), Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO:20),

Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e Exemplary VH CDR2 (SEQ ID NO:18); e uma

VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7),

Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH

CDR2 (SEQ ID NO:19), Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ

ID NO:21) e Exemplary VH CDR2 (SEQ ID NO:18); e uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL

CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO:19), Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e Exemplary VH CDR2 (SEQ ID NO:18); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); e uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); e uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9).

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ

ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia

VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH

CDR1 (SEQ ID NO:14); uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO:19), Chothia

VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e Exemplary VH

CDR2 (SEQ ID NO:18); e uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1

VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1

(SEQ ID NO:17) e Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14); uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH

CDR2 (SEQ ID NO:19), Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ

CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ

VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH

VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e Exemplary VH

CDR2 (SEQ ID NO:18); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia

VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL

CDR3 (SEQ ID NO:12). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH

Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e Exemplary VH CDR2 (SEQ ID NO:18); uma VH

CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23),

Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); e uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7),

CDR2 (SEQ ID NO:19), Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ

ID NO:21) e Exemplary VH CDR2 (SEQ ID NO:18); uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH

CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ

ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); e uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL

CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ

ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO:19), Chothia VH CDR2

(SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e Exemplary VH CDR2 (SEQ

ID NO:18); uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3

(SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14); uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); e uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14); uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); e uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9).

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14); uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH

CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ

ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL

CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ

VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14); uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia

VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1

(SEQ ID NO:7); e uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia

VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL

CDR2 (SEQ ID NO:9). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de

Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH

CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14); uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat

VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ

ID NO:8) e Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL

CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ

ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia

VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH

CDR1 (SEQ ID NO:14); uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia

VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL

CDR2 (SEQ ID NO:9); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia

VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL

CDR3 (SEQ ID NO:12). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH

Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e Exemplary VH CDR2 (SEQ ID NO:18);, uma

Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7); e uma VL

CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO:10),

Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH

CDR2 (SEQ ID NO:19), Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ

ID NO:21) e Exemplary VH CDR2 (SEQ ID NO:18); uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL

CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID

NO:8) e Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL

CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ

ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO:19), Chothia VH CDR2

(SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e Exemplary VH CDR2 (SEQ

ID NO:18); uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ

ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID

NO:9); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID

NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH

CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ

ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL

CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID

NO:8) e Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7); e uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL

CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ

ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia

VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH

CDR3 (SEQ ID NO:22); uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia

VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1

(SEQ ID NO:7); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia

VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL

CDR3 (SEQ ID NO:12). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH

Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); uma VL

Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9); e uma VL

CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12),

Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID

NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e

Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14); uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR2 (SEQ ID

NO:19), Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e

Exemplary VH CDR2 (SEQ ID NO:18); uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID

NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e

Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); e uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID

NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e

Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID

NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14);

uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO:19), Chothia VH CDR2 (SEQ ID

NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e Exemplary VH CDR2 (SEQ ID NO:18);

uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID

NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22);

e uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID

NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH

CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ

ID NO:17) e Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14); uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH

CDR2 (SEQ ID NO:19), Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ

CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ

CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ

VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH

VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e Exemplary VH

CDR2 (SEQ ID NO:18); uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia

VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1

VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL

CDR2 (SEQ ID NO:9). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH

CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO:16),

Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14); uma VH

Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e Exemplary VH CDR2 (SEQ ID NO:18); uma VL

CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7),

Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7); e uma VL

Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID

NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e

Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14);, uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR2 (SEQ ID

NO:19), Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e

Exemplary VH CDR2 (SEQ ID NO:18); uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14); uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7); e uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9).

Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14); uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID

CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ

ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia

VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH

CDR1 (SEQ ID NO:14); uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH

CDR3 (SEQ ID NO:22); uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia

VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL

VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL

CDR3 (SEQ ID NO:12). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH

Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e Exemplary VH CDR2 (SEQ ID NO:18); uma VH

Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); uma VL

Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7); e uma VL

Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR2 (SEQ ID

NO:19), Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e

NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24), and

Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID

NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e

Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID

NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e

Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO:19), Chothia VH CDR2

(SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e Exemplary VH CDR2 (SEQ

(SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ

ID NO:22);a VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID

NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID

NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12).

Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH

CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ

CDR2 (SEQ ID NO:19), Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ

CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL

CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID

CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ

ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia

VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH

VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e Exemplary VH

CDR2 (SEQ ID NO:18); uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia

VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH

VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1

VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL

CDR3 (SEQ ID NO:12). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH

Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14); uma VH

Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e Exemplary VH CDR2 (SEQ ID NO:18); uma VH

Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); uma VL

Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9); e uma VL

NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e

NO:19), Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e

Exemplary VH CDR2 (SEQ ID NO:18); uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7); uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14); uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7); uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12).

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO:19), Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ

ID NO:21) e Exemplary VH CDR2 (SEQ ID NO:18); uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7); uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO:15), Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO:16), Contact VH CDR1 (SEQ ID NO:17) e Exemplary VH CDR1 (SEQ ID NO:14); uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7); uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12).

Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH

CDR2 (SEQ ID NO:19), Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO:20), Contact VH CDR2 (SEQ ID NO:21) e Exemplary VH CDR2 (SEQ ID NO:18); uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7); uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO:23), Contact VH CDR3 (SEQ ID NO:24) e Exemplary VH CDR3 (SEQ ID NO:22); uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO:7), Contact VL CDR1 (SEQ ID NO:8) e Exemplary VL CDR1 (SEQ ID NO:7); uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO:10), Contact VL CDR2 (SEQ ID NO:11) e Exemplary VL CDR2 (SEQ ID NO:9); e uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de um grupo que consiste de Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO:12), Contact VL CDR3 (SEQ ID NO:13) e Exemplary VL CDR3 (SEQ ID NO:12).

Em outra modalidade, o anticorpo compreende qualquer combinação das mesmas das VH CDRs e das VL CDRs listadas na Tabela 1.

[0194] As regiões framework descritas aqui são determinadas com base nos limites do sistema de numeração de CDR. Em outras palavras, se as CDRs forem determinadas, por exemplo, por Kabat, IMGT ou Chothia, então as regiões framework são os resíduos de aminoácidos que circundam as CDRs na região variável no formato, do terminal N para o terminal C: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FR4. Por exemplo, FR1 é definida como os resíduos de aminoácidos N- terminais até os resíduos de aminoácidos da CDR1 que são definidos, por exemplo, pelo sistema de numeração de Kabat, pelo sistema de numeração IMGT ou pelo sistema de numeração de Chothia, FR2 é definida como os resíduos de aminoácidos entre os resíduos de aminoácidos de CDR1 e CDR2 que são definidos, por exemplo, pelo sistema de numeração de Kabat, pelo sistema de numeração de IMGT ou pelo sistema de numeração de Chothia, FR3 é definida como os resíduos de aminoácidos entre os resíduos de aminoácidos de CDR2 e CDR3 que são definidos, por exemplo, pelo sistema de numeração de Kabat, pelo sistema de numeração de IMGT ou pelo sistema de numeração de Chothia e FR4 é definida como os resíduos de aminoácidos C-terminais até os resíduos de aminoácidos CDR3 que são definidos, por exemplo, pelo sistema de numeração de Kabat, pelo sistema de numeração de IMGT ou pelo sistema de numeração de Chothia.

[0195] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou seu fragmento funcional fornecido aqui compreende ainda uma, duas, três e/ou quatro FRs de cadeia pesada e/ou uma, duas, três e/ou quatro FRs de cadeia leve do anticorpo M22-321b41.1 como mostrado na Tabela 2.

Tabela 2. Sequências de Aminoácidos de VL e VH FRs de M22-321b41.1 Antic FR1 FR2 FR3 FR4 orpo

VL DIVMTQAAFSNPVTLG WYLQKPG GVPDRFTSSGSGTDFT FGGGT TSASISC (SEQ ID QSPQLLTY LRISRVEAEDVGVYYC KLETKR NO:25) (SEQ ID (SEQ ID NO:27) (SEQ ID NO:26) NO:28)

VH QVQLQQSGAELARPG WVKQRPG KATLTADKSSSTAYIQLS WGQGT ASVKLSCKASGYTFT QGLEWTG TLASEDSAVYCAR (SEQ TLTVSS (SEQ ID NO:29) (SEQ ID ID NO:31) (SEQ ID NO:30) NO:32)

[0196] Em certas modalidades, o anticorpo isolado ou seu fragmento funcional fornecido aqui compreende ainda uma, duas, três e/ou quatro FRs de cadeia pesada do anticorpo M22-321b41.1 que são mostradas na Tabela 2. Em algumas modalidades, a(s) FR(s) de cadeia pesada do anticorpo é(são) do anticorpo M22-321b41.1.

[0197] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou seu fragmento funcional fornecido aqui compreende ainda uma, duas, três e/ou quatro FRs de cadeia leve do anticorpo M22-321b41.1 que são mostradas na Tabela 2. Em algumas modalidades, a(s) FR(s) de cadeia leve do anticorpo é(são) do anticorpo M22-321b41.1.

[0198] Em certas modalidades, um anticorpo ou um fragmento do mesmo descrito aqui compreende uma região VH que compreende: (1) uma VH FR1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29; (2) uma VH FR2 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30; (3) uma VH FR3 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31; e/ou (4) uma VH FR4 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32. Em modalidades específicas, o anticorpo compreende a região VH que compreende todas as quatro das VH FR1, VH FR2, VH FR3 e VH FR4 referidas anteriormente.

[0199] Consequentemente, em uma modalidade, o anticorpo humanizado compreende uma região VH que inclui uma VH FR1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29. Em algumas modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma região VH que inclui uma VH FR2 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado compreende uma região VH que inclui uma VH FR3 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31. Em outras modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma região VH que inclui uma VH FR4 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32.

[0200] Em algumas modalidades, a região VL compreende: (1) uma VL FR1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25; (2) uma VL FR2 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26; (3) uma VL FR3 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27; e/ou (4) uma VL FR4 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28.

[0201] Consequentemente, em algumas modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma região VL que inclui uma VL FR1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25. Em certas modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma região VL que inclui uma VL FR2 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado compreende uma região VL que inclui uma VL FR3 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27. Ainda em outras modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma região VL que inclui uma VL FR4 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28.

[0202] Em algumas modalidades, um anticorpo ou um fragmento do mesmo compreende uma região VH e uma região VL, em que a região VH compreende: (1) uma VH FR1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29; (2) uma VH FR2 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30; (3) uma VH FR3 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31; e/ou (4) uma VH FR4 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32; e em que a região VL compreende: (1) uma VL FR1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25; (2) uma VL FR2 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26; (3) uma VL FR3 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27; e/ou (4) uma VL FR4 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28.

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região VH que compreende todas as quatro das VH FR1, VH FR2, VH FR3 e VH FR4 referidas acima. Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma região VL que compreende todas as quatro das VL FR1, VL FR2, VL FR3 e VL FR4 referidas acima. Ainda em outras modalidades, o anticorpo compreende uma região VH que compreende todas as quatro das VH FR1, VH FR2, VH FR3 e VH FR4 referidas acima e uma região VL que compreende todas as quatro das VL FR1, VL FR2, VL FR3 e VL FR4 referidas acima.

[0203] Também são fornecidos aqui anticorpos que compreendem uma ou mais (por exemplo, uma, duas, três ou quatro) VH FRs e uma ou mais (por exemplo, uma, duas, três ou quatro) VL FRs listadas na Tabela 2. Em particular, é fornecido aqui um anticorpo que compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29) e uma VL FR1 (SEQ ID NO:25). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30) e uma VL FR1 (SEQ ID NO:25). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26).

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31) e uma VL FR1 (SEQ ID NO:25).

Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR1 (SEQ ID NO:25). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30) e uma VL FR1 (SEQ ID NO:25). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26).

Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31) e uma VL FR1 (SEQ ID NO:25). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25)

e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma

VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR3 (SEQ ID

NO:27). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID

NO:30), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR2

(SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL

FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL

FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25)

e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR4 (SEQ ID

NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID

NO:31), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR2

(SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL

FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR4

(SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma

VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25)

e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma

VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID

NO:27). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31) e uma VL FR1 (SEQ ID NO:25). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR1 (SEQ ID NO:25). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR1 (SEQ ID NO:25). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR1 (SEQ ID NO:25). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO: 27). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outra modalidade,

o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID

NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3

(SEQ ID NO:31), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma

VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID

NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID

NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4

(SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL

FR2 (SEQ ID NO:26). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH

FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma

VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID

NO:25) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL

FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32),

uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade,

o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR4 (SEQ ID

NO:32), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3

(SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma

VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR3 (SEQ ID

NO:27). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID

NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR4

(SEQ ID NO:28). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2

(SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma

VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH

FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma

VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR3 (SEQ ID

NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL

FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32),

uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outra modalidade,

o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID

NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4

(SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma

VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID

NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID

NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4

(SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ

ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL

FR2 (SEQ ID NO:26). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR3

(SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma

VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH

FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID

NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1

(SEQ ID NO:25), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR1 (SEQ ID NO:25). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH

FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27).

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27).

Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27).

Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27).

Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27).

Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27).

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR3 (SEQ ID

NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL

FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR2 (SEQ ID NO:26). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2

(SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4

(SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28).

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR3 (SEQ ID NO:27). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID

NO:28). Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma VH FR1 (SEQ ID NO:29), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH FR2 (SEQ ID NO:30), uma VH FR3 (SEQ ID NO:31), uma VH FR4 (SEQ ID NO:32), uma VL FR1 (SEQ ID NO:25), uma VL FR2 (SEQ ID NO:26), uma VL FR3 (SEQ ID NO:27) e uma VL FR4 (SEQ ID NO:28). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende qualquer combinação das VH FRs (SEQ ID NOS:29-32) e das VL FRs (SEQ ID NOS:25-28) listadas na Tabela 2.

[0204] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos aqui compreendem uma região VH ou domínio VH. Em outras modalidades, os anticorpos fornecidos aqui compreendem uma região VL ou domínio VL. Em certas modalidades, os anticorpos fornecidos aqui têm uma combinação de (i) um domínio VH ou região VH; e/ou (ii) um domínio VL ou região VL. Ainda em outras modalidades, os anticorpos fornecidos aqui têm uma combinação de (i) um domínio VH ou região VH; e/ou (ii) um domínio VL ou região VL selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOS:3 e 4 que são apresentadas na Tabela 1.

[0205] Em certas modalidades, os anticorpos fornecidos aqui compreendem uma região VH que compreende: (1) uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15; (2) uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19; e (3) uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; e uma região VL selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NO:3 que é apresentada na Tabela 1.

[0206] Em outras modalidades, os anticorpos fornecidos aqui compreendem uma região VH selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NO:4 que é apresentada na Tabela 1; e uma região VL que compreende: (1) uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7; (2) uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10; e (3) uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12.

[0207] Também são fornecidas aqui moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam uma cadeia pesada, uma cadeia leve, uma região VH, uma região VL, uma VH CDR1, uma VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR1, uma VL CDR2 e/ou uma VL CDR3 de imunoglobulina dos anticorpos anti-Nectina-4 que se ligam a um polipeptídeo da Nectina-4, um fragmento de um polipeptídeo da Nectina-4, um peptídeo da Nectina-4 ou um epítopo da Nectina-4. Os exemplos de sequências de ácido nucleico para a região VL, a cadeia leve, a região VH e a cadeia pesada do anticorpo M22-321b41.1 são mostrados nas Tabelas 3-4.

Tabela 3. Sequências de Ácido Nucleico de VL Anticorpo Sequências de nucleotídeo

Sequência GATATTGTGATGACCGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGG de DNA AACATCAGCTTCCATTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCTACATAGTA para região ATGGCATCACTTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCAGCTCTC de VL AGCTCTGATTTATCATATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAG M22- GTTCACTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCA 321b41.1 GAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGTGTTTATTACTGCGCTCAAAATCTA

GAACTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAACAAAAC GGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAG

CAGTTAACATCTGGA (SEQ ID NO:37) Sequência GATATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCACCTGGAA de DNA CATCACTCCATCCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTTCCTACATAGTAATGG para CATCATTATTGTATTGGTATTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCT cadeia leve CCTGATTATCAATGTAATGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCACTAGC M22- AGTGGGTCAGGAATGATTACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTG 321b41.1 AGGATGTGGGTGTATTACTGCGCTCAAAATCTAGAACTCCGTCACGTT

GGAGGGGGGACAGCTGGAAACAAAACGGGGCTGATGCTGCACCAA CGACATCTTCCCACATCAGTGAGCAGTAACATCTGGAGGTGCCTCAG CGTGTGCTCTTGAACAACTTCTACCCAAAGACATCAATGTCAAGTGG AAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGA CTGATCAGGACAGCAAAGAAGCATACAGCATGAGCAGCACCCTCAC GTGACCAAGGACGAGTATGAACGACAAACAGCATACCTGTGAGGCC ACACAGACATCAACTCACATTGTCAAGACCTTCAACAGGAATGAGTG

T (SEQ ID NO:39) Tabela 4. Sequências de Ácido Nucleico de VH Anticorp Sequências de nucleotídeo o

Sequên CAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGGCGAGCTGGCAAGACTGGGGTCAG cia de TGAAATTGTCCTGCAAGGCTCTGGCTATACCTTACTACTACTGGATGCAGT

DNA GGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGATGGATTGGGTCTATATCT para GGAGATGGTGATACTAGGTACACTCAGAAGTTCAAGGGCAAGGACATGA região CTGCAGATAAATCCTCCAGCACAGCCTACATTCAACTCAGCACCTTGGCA de VL TCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGAATACTACGGTCTTGA M22- CTACTGGGGCCAAGGCACACTCTCACAGTCTCCTCAGCAAAACAAAGCA 321b41. TCGGTCTATCACTGGCCTGTGTGTGGAGATAAATGGC 1 (SEQ ID NO:38) Sequên CAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGCAAGACCTGGGGCT cia de TCAGTGAAATTGTCCTGCAAGGCTCTGGCTATACCTACTACCTACTGGATG

DNA CAGTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGTCTA para TTTATCCTGGAGATGGTGATACTAGGTACACTCAGAAGTTCAAGGGCAAG cadeia GCCACATTGACTGCAGATAAATCCTCCAGCACAGCCTACATTCAACTCAG pesada CACCTTGGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGAATACT M22- AGTCTGACTACTGGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCA 321b41. AAACAACAGCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCTGTGTGTGGAGATACAAC 1 TGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGGTTATTTCTGAGCCA

GTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCTGTCCAGTGGTGTGCACACCTT CCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCACACCCTCAGCAGCTCAGTGACTG TAACCTCGAGCACCTGGCCAGCCAGTCCATCACCTGCAATGTGGCCCAG AGGGCCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAA CCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATG TACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTG AGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGG AAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACT CTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGT GGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCA TCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGT ATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTC TGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGG ACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCC TGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAG AAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGG GTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAA A

(SEQ ID NO:40)

[0208] Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido aqui tem uma sequência de aminoácidos de VH e uma de VL do anticorpo M22-321b41.1. Em algumas modalidades, um anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos de VH da SEQ ID NO:4 e uma sequência de aminoácidos de VL da SEQ ID NO:3.

[0209] Em certas modalidades, um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito aqui, que se liga especificamente a um polipeptídeo da Nectina-4 (por exemplo, um ECD da Nectina-4, por exemplo, Nectina-4 humana), compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a cadeia leve compreende uma região constante que tem uma sequência de aminoácidos de:

GASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSST LTLTKDEY ERHNSYTCEATHKTSTSPIVKTFNRNEC (SEQ ID NO:33).

[0210] Em certas modalidades, um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito aqui, que se liga especificamente a um polipeptídeo da

Nectina-4 (por exemplo, um ECD da Nectina-4, por exemplo, Nectina-4 humana), compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada compreende uma região constante que tem uma sequência de aminoácidos de:

SSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTS STWPSQSIT CNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSP IVTC VVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSG KEF KCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPED IY

VEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLH NH HTTKSFSRTPGK (SEQ ID NO:34).

[0211] Em outras modalidades, um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito aqui, que se liga especificamente a um polipeptídeo da Nectina-4 (por exemplo, um ECD da Nectina-4, por exemplo, Nectina-4 humana), compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada compreende uma região Fc de IgG1 humana que tem uma sequência de aminoácidos de:

PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSE DDPDVQISW FVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIE RTI SKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYK

NT EPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK (SEQ ID NO:35).

[0212] Em algumas modalidades, um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito aqui, que se liga especificamente a um polipeptídeo da Nectina-4 (por exemplo, um ECD da Nectina-4, por exemplo, Nectina-4 humana), compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada não compreende uma região Fc de IgG1 humana que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:35.

[0213] Ainda em outra modalidade, um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito aqui, que se liga especificamente a um polipeptídeo da Nectina-4 (por exemplo, um ECD da Nectina-4, por exemplo, Nectina-4 humana), compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a cadeia leve compreende uma região constante que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33; e a cadeia pesada compreende uma região Fc que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:35.

[0214] Em certas modalidades, um anticorpo descrito aqui, que se liga especificamente a um polipeptídeo da Nectina-4 (por exemplo, um ECD da Nectina- 4, por exemplo, Nectina-4 humana), compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos como a seguir:

[0215] DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQ

SPQLLIYHMSNLA SGVPDRFTSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPFTFGGGTKLETKRADA APT

VSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKD STYS MSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKTFNRNEC (SEQ ID NO:5).

[0216] Em algumas modalidades, um anticorpo descrito aqui, que se liga especificamente a um polipeptídeo da Nectina-4 (por exemplo, um ECD da Nectina- 4, por exemplo, Nectina-4 humana), compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos como a seguir:

QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTYWMQWVKQRPGQGLEWIG SIYPGDGD TRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYIQLSTLASEDSAVYYCAREYYGLDYWGQGTTLTV SSA KTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQ SDL YTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLG GPSV FIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNS TLR VVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEE MTK

KQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKN W VERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK (SEQ ID NO:6).

[0217] Em uma modalidade particular, um anticorpo descrito aqui, que se liga especificamente a um polipeptídeo da Nectina-4 (por exemplo, um ECD da Nectina- 4, por exemplo, Nectina-4 humana), compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que (i) a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5; e (ii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6.

[0218] Ainda em outro aspecto, são fornecidos anticorpos que competem com um dos anticorpos exemplificados ou fragmentos funcionais para ligação à Nectina-4. Tais anticorpos também podem se ligar ao mesmo epítopo que um dos anticorpos exemplificados aqui ou a um epítopo sobreposto. É esperado que os anticorpos e os fragmentos que competem ou se ligam ao mesmo epítopo que o dos anticorpos exemplificados exibam propriedades funcionais similares. As proteínas e os fragmentos de ligação ao antígeno exemplificados incluem aqueles com as regiões VH e VL e as CDRs fornecidas aqui, incluindo aquelas na Tabela 1. Assim, como um exemplo específico, os anticorpos que são fornecidos incluem aqueles que competem com um anticorpo que compreende: (a) 1, 2, 3, 4, 5 ou todas as 6 das CDRs listadas para um anticorpo listado na Tabela 1; (b) uma VH e uma VL selecionadas das regiões VH e VL listadas para um anticorpo listado na Tabela 1; ou (c) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas que compreendem uma VH e uma VL que são especificadas para um anticorpo listado na Tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo é o anticorpo M22-321b41.1.

[0219] Em certas modalidades, um anticorpo descrito aqui ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende sequências de aminoácidos com certa porcentagem de identidade relativa ao anticorpo M22-321b41.1.

[0220] A determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências (por exemplo, sequências de aminoácidos ou sequências de ácido nucleico) pode ser realizada utilizando um algoritmo matemático. Um exemplo não limitante preferido de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A.87:2264 2268, modificado como em Karlin e Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad.

Sci. U.S.A.90:58735877. Tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol.215:403. As pesquisas de nucleotídeos em BLAST podem ser realizadas com os parâmetros do programa de nucleotídeos NBLAST ajustados, por exemplo, para escore=100, tamanho de palavra=12 para a obtenção de sequências de nucleotídeos homólogas às moléculas de ácido nucleico descritas aqui. As pesquisas de proteínas em BLAST podem ser realizadas com os parâmetros do programa XBLAST ajustados, por exemplo, para escore 50, tamanho de palavra=3 para a obtenção de sequências de aminoácidos homólogas a de uma molécula de proteína descrita aqui. Para alinhamentos com gaps (espaços) com a finalidade de comparação, o Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res.25:33893402. Alternativamente, o PSI BLAST pode ser utilizado para realizar uma pesquisa repetida que detecta relações distantes entre as moléculas (Id.). Quando são utilizados os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI Blast, os parâmetros pré-definidos dos respectivos programas (por exemplo, de XBLAST e NBLAST) podem ser utilizados (ver, por exemplo, National Center for Biotechnology Information (NCBI) na worldwide web, ncbi.nlm.nih.gov). Outro exemplo não limitante preferido de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, 1988, CABIOS 4:1117. Tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) que faz parte do pacote de software de alinhamento de sequências GCG. Quando é utilizado o programa ALIGN para comparação de sequências de aminoácidos, uma tabela de peso dos resíduos PAM120, uma penalidade de comprimento de gap (espaço) de 12 e uma penalidade de gap (espaço) de 4 podem ser utilizadas.

[0221] A porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser determinada utilizando técnicas similares àquelas descrita anteriormente, com ou sem permitir gaps. No cálculo da porcentagem de identidade, tipicamente são contadas somente as combinações exatas.

[0222] Em certas modalidades, um anticorpo descrito aqui ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um domínio VL que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, em que o anticorpo se liga de forma imunoespecífica à Nectina-4. Em certas modalidades, um anticorpo descrito aqui ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um domínio VL que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, em que o anticorpo se liga de forma imunoespecífica à Nectina-4 e em que o anticorpo compreende CDRs (por exemplo, VL CDRs 1-3) que são idênticas às CDRs (por exemplo, VL CDRs 1-3) do anticorpo M22-321b41.1.

[0223] Em certas modalidades, um anticorpo descrito aqui ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um domínio VL que compreendem regiões framework de VL que têm pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos das regiões framework da SEQ ID NO:3, em que o anticorpo se liga de forma imunoespecífica à Nectina-4. Em uma modalidade particular, o anticorpo compreende VL CDRs que são idênticas às VL CDRs do anticorpo M22-321b41.1.

[0224] Em certas modalidades, um anticorpo descrito aqui ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um domínio VH que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, em que o anticorpo se liga de forma imunoespecífica à Nectina-4. Em certas modalidades, um anticorpo descrito aqui ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um domínio VH que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, em que o anticorpo se liga de forma imunoespecífica à Nectina-4 e em que o anticorpo compreende CDRs (por exemplo, VH CDRs 1-3) que são idênticas às CDRs (por exemplo, VH CDRs 1-3) do anticorpo M22-321b41.1.

[0225] Em certas modalidades, um anticorpo descrito aqui ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um domínio VH que compreendem regiões framework de VH que têm pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos

90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos das regiões framework da SEQ ID NO:4, em que o anticorpo se liga de forma imunoespecífica à Nectina-4. Em modalidades específicas, tal anticorpo compreende CDRs (por exemplo, VH CDRs 1-3) idênticas às CDRs (por exemplo, VH CDRs 1-3) do anticorpo M22-321b41.1.

[0226] Em certas modalidades, um anticorpo descrito aqui ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende (i) um domínio VL que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3 e (ii) um domínio VH que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, respectivamente, em que o anticorpo se liga de forma imunoespecífica à Nectina-4. Em modalidades específicas, tal anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende CDRs (por exemplo, VL CDRs 1-3 e/ou VH CDRs 1-3) idênticas às CDRs (por exemplo, VL CDRs 1-3 e/ou VH CDRs 1-3) do anticorpo M22-321b41.1.

[0227] Em outro aspecto, anticorpos ou fragmentos que se ligam ao antígeno dos mesmos fornecidos aqui se ligam a uma região, incluindo um epítopo, da Nectina-4 humana. Por exemplo, em algumas modalidades, um anticorpo fornecido aqui se liga a uma região da Nectina-4 humana (SEQ ID NO:1) que compreende os resíduos de aminoácidos 31-346 (SEQ ID NO:2), uma região da Nectina-4 humana (SEQ ID NO:1) que compreende os resíduos de aminoácidos 1-150 (SEQ ID NO:45) ou uma região da Nectina-4 humana (SEQ ID NO:1) que compreende os resíduos de aminoácidos 31-150 (SEQ ID NO:46) da Nectina-4 humana. Ainda em outro aspecto, os anticorpos fornecidos aqui se ligam a um epítopo específico da Nectina- 4 humana. A sequência de aminoácidos dos resíduos de aminoácidos 31-346 da Nectina-4 humana (SEQ ID NO:1) é:

AGELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQEL ALLHSKYG LHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRL RVL VPPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSA AVTS EFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGR EG

AMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEF SSRD SQVTVDVLDPQEDSGKQVDLV (SEQ ID NO:2). A sequência de aminoácidos dos resíduos de aminoácidos 1-150 da Nectina-4 humana (SEQ ID NO:1) é:

MPLSLGAEMWGPEAWLLLLLLLASFTGRCPAGELETSDVVTVVLGQDAKLP CFYRGDS

GEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVL LR NAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPL (SEQ ID NO:45). A sequência de aminoácidos dos resíduos de aminoácidos 31-150 da Nectina-4 humana (SEQ ID NO:1) é:

AGELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQEL ALLHSKYG

LHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRL RVL VPPL (SEQ ID NO:46)

[0228] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos aqui se ligam a um epítopo da Nectina-4 que é um aspecto de superfície tridimensional de um polipeptídeo da Nectina-4 (por exemplo, em uma forma multimérica de um polipeptídeo da Nectina-4). Uma região de um polipeptídeo da Nectina-4 que contribui para um epítopo pode ser de aminoácidos contíguos do polipeptídeo ou o epítopo pode se unir partindo de duas ou mais regiões não contíguas do polipeptídeo. Um epítopo da Nectina-4 pode estar presente (a) na forma multimérica (“um epítopo multimérico da Nectina-4”) da Nectina-4, (b) na forma monomérica (“um epítopo monomérico da Nectina-4”) da Nectina-4, (c) tanto na forma multimérica quanto monomérica da Nectina-4, (d) na forma multimérica, mas não na forma monomérica da Nectina-4 ou (e) na forma monomérica, mas não na forma multimérica da Nectina-4. Por exemplo, em algumas modalidades, o epítopo está presente ou disponível apenas para ligação na forma multimérica (nativa), mas não está presente ou disponível para ligação na forma monomérica (desnaturada) por um anticorpo anti-Nectina-4. Em outras modalidades, o epítopo da Nectina-4 é um aspecto linear do polipeptídeo da Nectina-4 (por exemplo, em uma forma multimérica ou uma forma monomérica do polipeptídeo da Nectina-4). Os anticorpos fornecidos aqui podem se ligar de forma imunoespecífica a (a) um epítopo da forma monomérica da Nectina-4, (b) um epítopo da forma multimérica of Nectina-4, (c) um epítopo da forma monomérica, mas não da forma multimérica da Nectina-4, (d) um epítopo da forma multimérica, mas não da forma monomérica da Nectina-4 ou (e) tanto da forma monomérica quanto da forma multimérica da Nectina-4.

[0229] Também são fornecidos aqui anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo ou um sobreposto da Nectina-4 (por exemplo, um epítopo localizado em um ECD da Nectina-4 humana) que o do anticorpo M22-321b41.1 descrito aqui, por exemplo, anticorpos que competem (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) pela ligação à Nectina-4 (por exemplo, um ECD da Nectina-4 humana) com o anticorpo M22-321b41.1 descrito aqui ou que inibem de forma competitiva (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) o anticorpo M22-321b41.1 descrito aqui da ligação a Nectina-4 (por exemplo, um epítopo localizado sobre o ECD da Nectina-4 humana).

[0230] Em um aspecto específico, também são fornecidos aqui anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo ou a um sobreposto da Nectina-4 (por exemplo, um epítopo localizado em um ECD da Nectina-4 humana) que o do anticorpo M22- 321b41.1.

[0231] Os anticorpos que se ligam aos mesmos ou epítopos sobrepostos da Nectina-4 (por exemplo, um epítopo localizado em um ECD da Nectina-4 humana) podem ser identificados utilizando técnicas rotineiras tais como as utilizadas nos exemplos apresentados aqui. Um ensaio imunológico, por exemplo, utilizado para demonstrar a capacidade de um anticorpo de bloquear a ligação de outro anticorpo a um antígeno alvo, isto é, um ensaio de ligação competitiva. Os ensaios de ligação competitiva também podem ser utilizados para determinar se dois anticorpos têm especificidade de ligação similar por um epítopo. A ligação competitiva pode ser determinada em um ensaio no qual a imunoglobulina em teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum, tal como a Nectina-

4. São conhecidos vários tipos de ensaios de ligação competitiva, por exemplo: ensaio radioimunológico (RIA) direto ou indireto em fase sólida, ensaio imunológico enzimático (EIA) direto ou indireto em fase sólida, ensaio de competição em sanduíche (ver Stahli et al., (1983) Methods in Enzymology 9:242); EIA com biotina- avidina direto em fase sólida (ver Kirkland et al., (1986) J. Immunol.137:3614); ensaio com marcação direto em fase sólida, ensaio em sanduíche com marcação direto em fase sólida (ver Harlow e Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA com marcação direto em fase sólida utilizando marcação com I-125 (ver Morel et al., (1988) Mol. Immunol.25(1):7); EIA biotina- avidina direto em fase sólida (Cheung et al., (1990) Virology 176:546); e RIA com marcação direto. (Moldenhauer et al., (1990) Scand J. Immunol.32:77). Tipicamente, este ensaio envolve o uso de antígeno purificado (por exemplo, Nectina-4, tal como um ECD da Nectina-4 humana) ligado a uma superfície sólida ou células que carregam qualquer uma de uma imunoglobulina de teste não marcada e uma imunoglobulina de referência marcada. A inibição competitiva pode ser medida através da determinação da quantidade de marcação ligada à superfície sólida ou às células na presença da imunoglobulina de teste. Geralmente a imunoglobulina de teste está presente em excesso. Geralmente, quando um anticorpo de competição está presente em excesso, este inibirá a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum em pelo menos 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% ou mais. Um ensaio de ligação competitiva pode ser configurado em um grande número de formatos diferentes utilizando antígeno marcado ou anticorpo marcado. Em uma versão comum deste ensaio, o antígeno é imobilizado sobre uma placa de 96 poços. A capacidade dos anticorpos não marcados de bloquear a ligação de anticorpos marcados ao antígeno é então medida utilizando marcações radioativas ou enzimáticas. Para mais detalhes ver, por exemplo, Wagener et al., J.

Immunol., 1983, 130:2308-2315; Wagener et al., J. Immunol. Methods, 1984, 68:269- 274; Kuroki et al., Cancer Res., 1990, 50:4872-4879; Kuroki et al., Immunol. Invest., 1992, 21:523-538; Kuroki et al., Hybridoma, 1992, 11:391-407 e utilizando Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane editors (Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, N.Y., 1999), pp.386-389.

[0232] Em certos aspectos, os ensaios de ligação competitiva podem ser utilizados para determinar se a ligação de um anticorpo é inibida de forma competitiva, por exemplo, de uma maneira dependente da dose, por outro anticorpo, sinalizando dessa maneira que os anticorpos se ligam essencialmente ao mesmo epítopo ou a epítopos sobrepostos, por exemplo, epítopos estericamente sobrepostos. Tais ensaios de ligação competitiva podem incluir, por exemplo, ensaios de ELISA com competição, que podem ser configurados em todos os números de formatos diferentes, utilizando antígeno marcado ou anticorpo marcado.

Em uma modalidade particular, um anticorpo pode ser testado em ensaios de ligação competitiva com o anticorpo M22-321b41.1 descrito aqui ou um anticorpo quimérico ou Fab do mesmo ou um anticorpo que compreende VH CDRs e VL CDRs do anticorpo M22-321b41.1.

[0233] Em aspectos específicos, é fornecido aqui um anticorpo que bloqueia de forma competitiva (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) a ligação de anticorpos que compreendem as sequências de aminoácidos descritas aqui para ligação específica a um polipeptídeo da Nectina-4 (por exemplo, um ECD da Nectina-4, por exemplo, Nectina-4 humana), que é determinado utilizando ensaios conhecidos por um perito na técnica ou descritos aqui (por exemplo, ensaios competitivos de ELISA). Em aspectos específicos, é fornecido aqui um anticorpo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) pela ligação específica a um polipeptídeo da Nectina-4 (por exemplo, um ECD da Nectina-4, por exemplo, Nectina-4 humana), com um anticorpo que compreende as sequências de aminoácidos descritas aqui (por exemplo, sequências de aminoácidos de VL e/ou VH do anticorpo M22-321b41.1), que é determinado utilizando ensaios conhecidos por um perito na técnica ou descritos aqui (por exemplo, ensaios competitivos de ELISA).

[0234] Em aspectos específicos, é fornecido aqui um anticorpo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) pela ligação específica a um polipeptídeo da Nectina-4 (por exemplo, um ECD da Nectina-4, por exemplo, Nectina-4 humana), com o anticorpo M22-321b41.1.

[0235] Em aspectos específicos, é fornecido aqui um anticorpo que compete (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) pela ligação específica a um polipeptídeo da Nectina-4 (por exemplo, um ECD da Nectina-4, por exemplo, Nectina-4 humana), com um anticorpo que compreende uma região de cadeia VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3 e uma região de cadeia VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4.

[0236] Em um aspecto específico, também são fornecidos aqui anticorpos (i) que competem (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) para ligação específica a um epítopo de um polipeptídeo da Nectina-4 (por exemplo, um epítopo de um ECD da Nectina-4 humana), com qualquer anticorpo M22-321b41.1 e (ii) que são capazes de se ligar especificamente à Nectina-4 em um ensaio de IHC.

[0237] Em uma modalidade específica, um anticorpo descrito aqui é um que é bloqueado de forma competitiva (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) por um anticorpo que se liga especificamente à Nectina-4 e compreende uma região de cadeia VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3 e uma região de cadeia VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, em relação à ligação específica a um polipeptídeo da Nectina-4 (por exemplo, um ECD da Nectina-4, por exemplo, Nectina-4 humana).

[0238] Em um aspecto específico, também são fornecidos aqui anticorpos (i) que bloqueiam competitivamente (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) o anticorpo M22-321b41.1 em relação à ligação específica a um epítopo de um polipeptídeo da Nectina-4 (por exemplo, um epítopo de um ECD da Nectina-4 humana) e (ii) que são capazes de se ligar especificamente à Nectina-4 em um ensaio de IHC.

[0239] Em aspectos específicos, é fornecido aqui um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga de forma imunoespecífica ao mesmo epítopo que o do anticorpo M22-321b41.1 que compreende as sequências de aminoácidos descritas aqui para ligação específica a um polipeptídeo da Nectina-4 (por exemplo, um ECD da Nectina-4, por exemplo, Nectina-4 humana).

Os ensaios conhecidos por um perito na técnica ou descritos aqui (por exemplo, ensaios de ELISA) podem ser utilizados para determinar se dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo.

[0240] Em uma modalidade específica, um anticorpo descrito aqui ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga de forma imunoespecífica ao mesmo epítopo que o do anticorpo M22-321b41.1 que se liga especificamente à Nectina-4 e compreende uma região de cadeia VL que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3 e uma região de cadeia VH que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4.

[0241] Em um aspecto específico, também são fornecidos aqui anticorpos (i) que se ligam de forma imunoespecífica ao mesmo epítopo de um polipeptídeo da Nectina-4 (por exemplo, um epítopo de um ECD da Nectina-4 humana) que o do anticorpo M22-321b41.1; e (ii) que são capazes de se ligar especificamente à Nectina-4 em um ensaio de IHC.

[0242] Em certas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 31-346 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 31-75 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 75-125 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 100-150 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 125-175 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 150-200 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 175-225 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 200-250 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 225-275 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 250-300 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 275-325 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 300-346 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1.

[0243] Em certas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 1-150 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 31-150 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 1-10 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 5-15 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 10-20 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 15-25 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 20-30 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 25-35 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 30-40 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 35-45 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 40-50 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1.

Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 45-55 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 50-60 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 65-75 dentro de uma sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 70-80 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo,

quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 75-85 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 80-90 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 85-95 dentro de uma sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 90-100 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo,

quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 95-105 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à

Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 100-110 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 105-115 dentro de uma sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 110-120 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 115-125 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 120-130 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 125-135 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 130-140 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 135-145 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, quando ligado à Nectina-4, se liga a pelo menos um dos resíduos 140-150 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1.

[0244] Também é considerada qualquer combinação de dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais dos sítios de ligação à Nectina-4 com os aminoácidos referidos acima.

[0245] Em certas modalidades, os anticorpos se ligam especificamente a um epítopo de um ECD da Nectina-4 humana que é distinto do sítio de ligação do ligante da Nectina-4. Em certas modalidades, a ligação do ligante da Nectina-4 à Nectina-4 não é inibida pelo anticorpo.

[0246] Em um aspecto, são fornecidos aqui anticorpos que se ligam especificamente à Nectina-4. Em certas modalidades, são fornecidos aqui anticorpos que se ligam especificamente a um ECD da Nectina-4 humana.

[0247] Em certas modalidades, os anticorpos que se ligam especificamente à Nectina-4 se ligam a um ECD da Nectina-4 humana ou um epítopo de um ECD da Nectina-4 humana dos mesmos. Em certas modalidades, os anticorpos se ligam especificamente a um epítopo de um ECD da Nectina-4 humana que é distinto do sítio de ligação do ligante da Nectina-4.

[0248] A atividade da Nectina-4 pode se referir a qualquer atividade da Nectina-4 tais como aquelas conhecidas ou descritas na técnica. Exemplos não limitantes de atividade da Nectina-4 incluem: dimerização do receptor da Nectina-4, heterodimerização do receptor da Nectina-4 com outros receptores, fosforilação do receptor da Nectina-4, sinalização a jusante do receptor da Nectina-4, proliferação celular tal como o aumento induzido pelo ligante da Nectina-4 da proliferação celular (por exemplo, proliferação de células cancerosas) ou sobrevivência celular (por exemplo, células cancerosas), antiapoptose induzida pelo ligante da Nectina-4. A atividade da Nectina-4 ou a função de Nectina-4 são utilizadas aqui de forma intercambiável. Em certos aspectos, a atividade da Nectina-4 é induzida pela ligação do ligante da Nectina-4 ao receptor da Nectina-4. Em certas modalidades, pode ocorrer um aumento na atividade ou na sinalização da Nectina-4, na ausência do ligante da Nectina-4 que se liga ao receptor da Nectina-4, devido à alta expressão (ou superexpressão) de receptores da Nectina-4. A expressão alta ou a superexpressão da Nectina-4 em uma célula refere-se a um nível de expressão que é pelo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400% ou 500% maior que o nível de expressão de uma célula de referência conhecida por ter expressão da Nectina-4 ou atividade da Nectina-4 normal ou maior que o nível de expressão médio da Nectina-4 em uma população de células ou amostras conhecidas por terem expressão da Nectina-4 ou atividade da Nectina-4 normal. Os níveis de expressão da Nectina-4 podem ser avaliados por métodos descritos aqui ou conhecidos por um perito na técnica (por exemplo, Western blotting, ELISA ou IHC).

10. Anticorpos Policlonais

[0249] Os anticorpos da presente divulgação podem compreender anticorpos policlonais. Métodos para preparar anticorpos policlonais são conhecidos pelo perito na técnica. Anticorpos policlonais podem ser cultivados em um mamífero, por exemplo, por meio de uma ou mais injeções de um agente imunizante e, se desejado, um adjuvante. Tipicamente, o agente imunizante e/ou adjuvante será injetado no mamífero por meio de múltiplas injeções subcutâneas ou intraperitoneais. O agente imunizante pode incluir um polipeptídeo da Nectina-4 ou uma proteína de fusão do mesmo. Pode ser útil conjugar o agente imunizante para uma proteína conhecida por ser imunogênica no mamífero que está sendo imunizado ou para imunizar o mamífero com a proteína e um ou mais adjuvantes. Exemplos de tais proteínas imunogênicas incluem, mas não são limitados a, hemocianina do molusco keyhole limpet, albumina de soro, tiroglobulina bovina e inibidor de tripsina de soja.

Exemplos de adjuvantes que podem ser empregados incluem Ribi, CpG, Poli 1C, adjuvante de Freund completo e adjuvante MPL-TDM (Lipídio A de monofosforila, dicorinomicolato de trealose sintético). O protocolo de imunização pode ser selecionado por um perito na técnica sem experimentação indevida. O mamífero pode, então, ser sangrado e o soro ensaiado para titulaçãoo de anticorpo de Nectina-4. Se desejado, o mamífero pode ser impulsionado até que o título no anticorpo aumente ou estabilize. Adicional ou alternativamente, linfócitos podem ser obtidos a partir do animal imunizado para fusão e preparação de anticorpos monoclonais a partir dos hibridomas que são descritos abaixo.

11. Anticorpos monoclonais

[0250] Os anticorpos da presente divulgação podem ser alternativamente anticorpos monoclonais. Anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando o método de hibridoma descritos primeiramente por Kohler et al., 1975, Nature 256:495 a 497 ou podem ser produzidos por meio de métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, a Patente n° U.S. 4.816.567).

[0251] No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado, como descrito acima, para elicitar linfócitos que produzem ou têm capacidade para produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína usada para imunização.

[0252] Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro. Após imunização, linfócitos são isolados e, então, fundidos com uma linhagem celular de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal antibodies: Principles and Practice 59 a 103 (1986)).

[0253] As células de hibridoma preparadas desse modo são semeadas e cultivadas em um meio de cultura adequado que, em certas modalidades, contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células mãe de mieloma não fundidas (também denominadas como parceiro de fusão). Por exemplo, se as células mãe de mieloma não tiverem a enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura seletivo para os hibridomas incluirão tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio de HAT), o que impede o crescimento de células deficientes de HGPRT.

[0254] Células de mieloma de parceiro de fusão exemplificativas são aquelas que se fundem eficientemente, suportam produção de alto nível estável de anticorpo pelas células de produção de anticorpo selecionado e são sensíveis a um meio seletivo que seleciona contra as células mãe não fundidas. Linhagens celulares de mieloma exemplificativas são linhagens de mieloma de murino, tais como SP-2 e derivados, por exemplo, células X63- Ag8-653 disponíveis a partir da Coleção de Cultura do Tipo Americano American Type Culture Collection (Manassas, VA) e aquelas derivadas de tumores de camundongo MOPC-21 e MPC-11 disponíveis a partir Salk Institute Cell Distribution Center (San Diego, CA). Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma camundongo-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, 1984, Immunol.133:3.001 a 3.005; e Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51 a 63 (1987)).

[0255] O meio de cultura em que células de hibridoma estão sendo cultivadas é testado para produção de anticorpos monoclonais direcionada contra o antígeno. Uma especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por meio de imunoprecipitação ou por meio de um ensaio de ligação in vitro, tal como RIA ou ELISA. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise de Scatchard descrita em Munson et al., 1980, Anal. Biochem.107:220 a 239.

[0256] Uma vez que as células de hibridoma que produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejada são identificadas, os clones podem ser subclonados limitando-se os procedimentos de diluição e o crescimento por meio de métodos padrões (Goding, supra). Meios de cultura adequados para esse propósito incluem, por exemplo, meio de DMEM ou RPMI-1640. Em adição, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores ascites em um animal, por exemplo, por meio de injeção i.p. das células em camundongos.

[0257] Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido ou soro de ascites por meio de procedimentos de purificação de anticorpo convencionais, tais como, por exemplo, cromatografia de afinidade (por exemplo, utilizando proteína A ou proteína G- Sepharose) ou cromatografia de troca iônica, cromatografia de hidroxilapatite, eletroforese gel, diálise etc.

[0258] DNA que codifica os anticorpos monoclonais é prontamente isolado e sequenciado utilizando procedures convencionais (por exemplo, utilizando-se sondas de oligonucleotídeo que têm capacidade para ligação especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murino). As células de hibridoma podem servir como uma fonte de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, os quais são, então, transfectados em células hospedeiras, tais como células de E. coli, células de COS de símios, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem de outro modo proteína de anticorpo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Artigos de revisão sobre expressão recombinante em bactérias de DNA que codifica o anticorpo incluem Skerra et al., 1993, Curr. Opinion in Immunol.5:256 a 262 e Plückthun, 1992, Immunol. Revs.130:151 a 188.

[0259] Em algumas modalidades, um anticorpo que se liga um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos de um domínio VH e/ou uma sequência de aminoácidos de um domínio VL codificada por uma sequência de nucleotídeos que hibridiza para (1) o complemento de uma sequência de nucleotídeos que codifica qualquer um dentre o domínio VH e/ou domínio VL descrito aqui sob condições rigorosas (por exemplo, hibridização para DNA ligado a filtro em cloreto de sódio/citrato de sódio a 6X (SSC) a aproximadamente 45 °C seguido por uma ou mais lavagens em SSC a 0,2X/SDS a 0,1% a aproximadamente 50 a 65 °C), sob condições altamente rigorosas (por exemplo, hibridização para ácido nucleico ligado a filtro em SSC a 6X a aproximadamente 45 °C seguido por uma ou mais lavagens em SSC a 0,1X/SDS a 0,2% a aproximadamente 68 °C) ou sob outras condições de hibridização rigorosas que são bem conhecidas pelos peritos na técnica. Ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology Vol. I,

6.3.1-6.3.6 e 2.10.3 (Ausubel et al. eds., 1989).

[0260] Em algumas modalidades, um anticorpo que liga um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos de uma CDR de VH ou uma sequência de aminoácidos de uma CDR de VL codificada por uma sequência de nucleotídeos que hibridiza para o complemento de uma sequência de nucleotídeos que codifica qualquer uma das CDRs de VH e/ou CDRs de VL representadas na Tabela 1 sob condições rigorosas (por exemplo, hibridização para DNA ligado a filtro em SSC a 6X a aproximadamente 45 °C seguido por uma ou mais lavagens em SSC a 0,2X/SDS a 0,1% a aproximadamente 50 a 65 °C) sob condições altamente rigorosas (por exemplo, hibridização para ácido nucleico ligado a filtro em SSC a 6X a aproximadamente 45 °C seguido por uma ou mais lavagens em SSC a 0,1X/SDS a 0,2% a aproximadamente 68 °C) ou sob outras condições de hibridização rigorosas que são conhecidas pelos peritos na técnica (ver, por exemplo, Ausubel et al., supra).

[0261] Em uma modalidade adicional, anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpo podem ser isolados das bibliotecas de fago de anticorpo geradas utilizando a técnica, como descrito em, por exemplo, Anticorpo Phage Display: Methods and Protocols (O’Brien e Aitken eds., 2002). Em métodos de exibição de fago, domínios de anticorpo funcionais são exibidos na superfície de partículas de fago que portam as sequências de polinucleotídeos que codificam os mesmos.

Exemplos de métodos de exibição de fago que podem ser usados para produzir os anticorpos descritos aqui incluem aqueles revelados em Brinkman et al., 1995, J.

Immunol. Methods 182:41 a 50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177 a 186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol.24:952 a 958; Persic et al., 1997, Gene 187:9 a 18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191 a 280; Pedido PCT n° PCT/GB91/O1134; Publicações Internacionais nos WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401 e WO97/13844; e Patentes nos U.S. 5.698.426, 5.223.409, 5.403.484, 5.580.717,

5.427.908, 5.750.753, 5.821.047, 5.571.698, 5.427.908, 5.516.637, 5.780.225,

5.658.727, 5.733.743 e 5.969.108.

[0262] Em princípio, clones de anticorpo sintéticos são selecionados triando- se bibliotecas de fago que contêm fagos que exibem diversos fragmentos de região variável (Fv) de anticorpo fundida em proteína de revestimento de fago. Tais bibliotecas de fago são triadas contra o antígeno desejado. Clones que expressam fragmentos Fv que têm capacidade para se ligar ao antígeno desejado são adsorvidos ao antígeno e, desse modo, separados dos clones de não ligação na biblioteca. Os clones de ligação são, então, eluídos a partir do antígeno e podem ser adicionalmente enriquecidos por meio de ciclos adicionais de adsorção/eluição de antígeno.

[0263] Domínios variáveis podem ser funcionalmente exibidos em fago, como fragmentos Fv de cadeia único (scFv), em que VH e VL são ligadas de modo covalente através de um peptídeo curto e flexível ou como fragmentos Fab, em que os mesmos são, cada um, fundidos a um domínio constante e interagem de modo não covalente, como descrito, por exemplo, em Winter et al., 1994, Ann. Rev.

Immunol.12:433 a 455.

[0264] Repertórios de genes de VH e VL podem ser separadamente clonados por meio de PCR e aleatoriamente recombinados em bibliotecas de fago, as quais podem, então, ser pesquisadas por clones de ligação a antígeno, como descrito, em Winter et al., supra. Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos de alta afinidade ao imunogene sem a exigência de hibridomas de construção.

[0265] Alternativamente, o repertório não exposto pode ser clonado para fornecer uma única fonte de anticorpos humanos a uma ampla faixa de antígenos não próprios e também próprios sem qualquer imunização, como descrito por Griffiths et al., 1993, EMBO J 12:725 a 734. Finalmente, bibliotecas não expostas também podem ser produzidas sinteticamente clonando-se os segmentos de gene V não rearrumados de células-tronco e utilizando iniciadores de PCR que contêm sequência aleatório para codificar as regiões de CDR3 altamente variáveis e para alcançar a rearrumação in vitro, como descrito, por exemplo, por Hoogenboom e Winter, 1992, J. Mol. Biol.227:381 a 388.

[0266] A triagem das bibliotecas pode ser alcançada por meio de diversas técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, Nectina-4 (por exemplo, um polipeptídeo, fragmento ou epítopo da Nectina-4) pode ser usada para revestir as cavidades de placas de adsorção, expressas em células hospedeiras afixadas a placas de adsorção ou usadas em classificação de célula, conjugando uma biotina para captura com grânulos revestidos com estreptavidina ou usadas em qualquer outro método para virar bibliotecas de exibição. A seleção de anticorpos com cinética de dissociação lenta (por exemplo, boas afinidades de ligação) pode ser promovida por meio do uso de lavagens longas e exibição de fago monovalente, como descrito em Bass et al., 1990, Proteins 8:309 a 314 e documento n° WO 92/09690, e por meio do uso de uma densidade de revestimento baixa de antígeno, como descrito em Marks et al., 1992, Biotechnol.10:779 a 783.

[0267] Anticorpos anti-Nectina-4 podem ser obtidos projetando-se um procedure de triagem de antígeno adequado para selecionar o clone de fago de interesse seguido por construção de um clone de anticorpo anti-Nectina-4 clone de comprimento completo utilizando sequências de VH e/ou VL (por exemplo, as sequências de Fv) ou diversas sequências de CDR a partir de sequências de VH e VL, a partir do clone de fago de interesse e sequências de região constante adequada (por exemplo, Fc), como descrito em Kabat et al., supra.

[0268] Anticorpos descritos aqui também podem, por exemplo, incluir anticorpos quiméricos. Um anticorpo quimérico é uma molécula em que porções diferentes do anticorpo são derivadas de moléculas de imunoglobulina diferentes.

Por exemplo, um anticorpo quimérico podem conter uma região variável de um anticorpo monoclonal de camundongo ou rato fundido a uma região constante de um anticorpo humano. Métodos para produzir anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Morrison, 1985, Science 229:1.202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191 a 202; e Patentes nos U.S. 5.807.715, 4.816.567, 4.816.397 e 6.331.415.

[0269] Anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno produzidos utilizando técnicas tais como aquelas descritas aqui podem ser isolados utilizando técnicas bem conhecidas padrões. Por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser adequadamente separados de, por exemplo, meio de cultura, fluido de ascites, soro, lisato celular, material de reação de síntese ou similares por meio de procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais, tais como, por exemplo, proteína A-Sepharose, cromatografia de hidroxilapatite, eletroforese gel, diálise ou cromatografia de afinidade. Como utilizado aqui, um anticorpo “isolado” ou “purificado” é substancialmente livre de material celular ou outra proteínas a partir de uma fonte de célula ou tecido a partir da qual o anticorpo é derivado ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros reagentes químicos quando quimicamente sintetizada.

12. Fragmentos de anticorpo

[0270] A presente divulgação fornece anticorpos e fragmentos de anticorpo que se ligam à Nectina-4. Em determinadas circunstâncias existem vantagens de utilizar fragmentos de anticorpo, em vez de anticorpos completos. O tamanho menor dos fragmentos permite liberação rápida e pode levar a acesso aperfeiçoado a células, tecidos ou órgãos. Para uma revisão de determinados fragmentos de anticorpo, ver Hudson et al., 2003, Nature Med.9:129 a 134.

[0271] Diversas técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, esses fragmentos foram derivados por meio de digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto et al., 1992, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107 a 117; e Brennan et al., 1985, Science 229:81 a 83). Entretanto, esses fragmentos podem ser produzidos agora diretamente por meio de células hospedeiras recombinantes. fragmentos Fab, Fv e scFv de anticorpo podem ser todos expressos em e secretados a partir de células E.

coli ou de levedura, permitindo, desse modo, a produção fácil de quantidades grandes desses fragmentos. Fragmentos de anticorpo podem ser isolados das bibliotecas de fago de anticorpo discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab’-SH podem ser diretamente recuperados a partir de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163 a 167). De acordo com outra abordagem, os fragmentos F(ab’)2 podem ser isolados diretamente de cultura de célula hospedeira recombinante. Os fragmentos Fab e F(ab’)2 com vida útil in vivo aumentada que compreendem resíduos de epítopo de ligação receptores selvagens são descritos, por exemplo, na Patente n° U.S. 5.869.046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão evidentes ao perito. Em certas modalidades, um anticorpo é um fragmento Fv de cadeia única (scFv) (ver, por exemplo, documento n° WO 93/16185; Patentes nos U.S. 5.571.894 e 5.587.458). Fv e scFv têm sítios de combinação intactos que não têm regiões constantes; assim, os mesmos podem ser adequados para ligação não específica reduzida durante uso in vivo. As proteínas de fusão scFv podem ser construídas para render fusão de uma proteína efetora em qualquer terminal amino ou carbóxi de um scFv (Ver, por exemplo, Borrebaeck ed., supra). O fragmento de anticorpo também pode ser um “anticorpo linear”, por exemplo, como descrito nas referências citadas acima.

[0272] Estruturas de ligação derivadas de anticorpo menor são os domínios variáveis separados (domínios V) também são denominados anticorpos de domínio variável únicos (sdAbs). Determinados tipos de organismos, os camelídeos e peixes cartiloginosos, têm domínios similares a V únicos de alta afinidade montados em uma estrutura de domínio equivalente a Fc como parte de seu sistema imunológico.

(Woolven et al., 1999, Immunogenetics 50: 98 a 101; e Streltsov et al., 2004, Proc Natl Acad Sci EUA.101:12.444 a 12.449). Os domínios similares a V (chamados VhH em camelídeos e V-NAR em tubarões) exibem tipicamente laços de superfície longos, os quais permitem penetração de cavidades de antígenos alvos. Os mesmos também estabilizam VHs de domínio isolado mascarando-se fragmentos de superfície hidrofóbicos.

[0273] Esses domínios de VhH e V-NAR foram usados para modificar geneticamente sdAbs. Variantes de domínio V humano foram projetadas utilizando seleção de bibliotecas de fago e outras abordagens que resultaram em domínios derivados de VL e VH de alta ligação estáveis.

[0274] Anticorpos fornecidos aqui incluem, mas não são limitados a, moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, por exemplo, moléculas que contêm um sítio de ligação ao antígeno que se ligam a um epítopo da Nectina-4. As moléculas de imunoglobulina fornecidas aqui podem ser de qualquer classe (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) ou qualquer subclasse (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) de molécula de imunoglobulina.

[0275] Variantes e derivados de anticorpos incluem fragmento de anticorpos funcionais que mantêm a habilidade para se ligar a um epítopo da Nectina-4.

Fragmentos funcionais exemplificativos incluem fragmentos Fab (por exemplo, um fragmento de anticorpo que contém o domínio de ligação ao antígeno e compreende uma cadeia leve e parte de uma cadeia pesada ligadas em ponte por uma ligação dissulfeto); Fab’ (por exemplo, um fragmento de anticorpo que contém um domínio de ligação ao antígeno único que compreendem um Fab e uma porção adicional da cadeia pesada através da região de dobradiça); F(ab’)2 (por exemplo, duas moléculas de Fab’ unidas por ligações de dissulfeto entre cadeias nas regiões de dobradiça das cadeias pesadas; as moléculas de Fab’ podem ser direcionadas em direção aos mesmos epítopos ou a epítopos diferentes); uma cadeia única que compreende uma região variável, também conhecida como, scFv (por exemplo, a região variável que determina uma ligação ao antígeno de uma cadeia leve e uma pesada individuais de um anticorpo ligadas uma a outra por uma cadeia de 10 a 25 aminoácidos); um Fv com ligação dissulfeto ou dsFv (por exemplo, a região variável que determina a ligação ao antígeno de uma cadeia leve e uma pesada individuais de um anticorpo ligadas uma a outra por uma ligação dissulfeto); uma VH camelizada (por exemplo, a região variável que determina a ligação ao antígeno de uma cadeia pesada individual de um anticorpo na qual alguns aminoácidos na interface de VH são encontrados na cadeia pesada de anticorpos de camelo que ocorrem naturalmente).

13. Anticorpos humanizados

[0276] Anticorpos descritos aqui podem, por exemplo, incluir anticorpos humanizados, por exemplo, anticorpos desumanizados ou humanos compósitos.

[0277] Um anticorpo humanizado pode compreender sequências de região constante humanas. Em certas modalidades, um anticorpo humanizado pode ser selecionado a partir de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE e qualquer isótipo, incluindo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Em certas modalidades, um anticorpo humanizado pode compreender sequências constantes de cadeia leve de kapa ou lambda.

[0278] Anticorpos humanizados podem ser produzidos utilizando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo, mas não limitados a, enxerto de CDR (Patente Europeia n° EP 239.400; Publicação internacional n° WO 91/09967; e Patentes nos U.S. 5.225.539, 5.530.101 e 5.585.089), folheamento ou ressurgimento (Patentes Europeias nos EP 592.106 e EP 519.596; Padlan, 1991,

Molecular Immunology 28(4/5):489 a 498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805 a 814; e Roguska et al., 1994, PNAS 91:969 a 973), embaralhamento de cadeia (Patentes nos U.S. 5.565.332) e técnica, como revelado, por exemplo, na Patente n° U.S. 6.407.213, Patente n° U.S. 5.766.886, documento n° WO 9317105, Tan et al., J. Immunol.169:111.925 (2002), Caldas et al., Protein Eng.13(5):353 a 360 (2000), Morea et al., Methods 20(3):26.779 (2000), Baca et al., J. Biol.

Chem.272(16):10.678 a 10.684 (1997), Roguska et al., Protein Eng.9(10):895.904 (1996), Couto et al., Cancer Res.55 (23 Supp):5.973s a 5.977s (1995), Couto et al., Cancer Res.55(8):1.717 a 1.722 (1995), Sandhu JS, Gene 150(2):409 a 410 (1994) e Pedersen et al., J. Mol. Biol.235(3):959 a 973 (1994). Ver também a Publicação de Patente n° U.S. US 2005/0042664 A1 (24 de fevereiro de 2005), cada uma das quais está incorporada a título de referência no presente documento em sua totalidade.

[0279] Em algumas modalidades, anticorpos fornecidos aqui podem ser anticorpos humanizados que ligam Nectina-4, incluindo Nectina-4 humana. Por exemplo, anticorpos humanizados da presente divulgação podem compreender uma ou mais CDRs que são mostradas na Tabela 1. Diversos métodos para humanizar anticorpos não humanos são conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo humanizado pode ter um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos no mesmo a partir de uma fonte que é não humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são normalmente denominados como resíduos “importados”, que são tipicamente tomados de um domínio variável “importado”. Humanização pode ser realizada, por exemplo, seguindo o método de Jones et al., 1986, Nature 321:522 a 525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323 a 327; e Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1.534 a 1.536), substituindo-se sequências de região hipervariável para as sequências correspondentes de um anticorpo humano.

[0280] Em alguns casos, os anticorpos humanizados são construídos por meio de enxerto de CDR, em que as sequências de aminoácidos dos seis CDRs do anticorpo não humano mãe (por exemplo, roedor) são enxertados em uma estrutura de anticorpo humano. Por exemplo, Padlan et al. determinaram que apenas aproximadamente um terço dos resíduos nas CDRs realmente entram em contato o antígeno e denominou esses os “resíduos de determinação de especificidade” ou SDRs (Padlan et al., 1995, FASEB J.9:133 a 139). Na técnica de enxerto de SDR, apenas os resíduos de SDR são enxertados na estrutura de anticorpo humano (ver, por exemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods 36:25 a 34).

[0281] A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leve quanto pesado, a serem usados na produção dos anticorpos humanizados pode ser importante para reduzir antigenicidade. Por exemplo, de acordo com o método chamado “de melhor ajuste”, a sequência do domínio variável de um anticorpo não humano (por exemplo, de roedor) é triada contra toda a biblioteca de sequências de domínio variável humano conhecidas. A sequência humana que está mais próxima àquela do roedor pode ser selecionada como a estrutura humana para o anticorpo humanizado (Sims et al., 1993, J. Immunol.151:2.296 a 2.308; e Chothia et al., 1987, J. Mol.

Biol.196:901 a 917). Outro método usa uma estrutura particular derivada da sequência de consenso de todos anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser usada para diversos anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:4.285 a 4.289; e Presta et al., 1993, J. Immunol. 151:2.623 a 2.632). Em alguns casos, a estrutura é derivada a partir da sequência de consensos das subclasses humanas mais abundantes, subgrupo I VL6 (VL6I), e subgrupo III VH (VHIII). Em outro método, genes de linha genética humanos são usados como a fonte das regiões de estrutura.

[0282] Em um paradigma alternativo baseado na comparação de CDRs, chamada super-humanização, homologia de FR é irrelevante. O método consiste na comparação da sequência não humana com o repertório genético de linha genética humana funcional. Esses genes que codificam as mesmas estruturas ou estruturas canônicas proximamente relacionadas às sequências de murino são, então, selecionadas. Após, dentro dos genes que compartilham as estruturas canônicas com o anticorpo não humano, aqueles com a maior homologia dentro das CDRs são escolhidos como doadores de FR. Finalmente, as CDRs não humanas são enxertadas nessas FRs (ver, por exemplo, Tan et al., 2002, J. Immunol.169:1.119 a

1.125).

[0283] É geralmente adicional desejável que anticorpos sejam humanizados com retenção de sua afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar esse objetivo, de acordo com um método, anticorpos humanizados são preparados por meio de um processo de análise das sequências mães e diversos produtos humanizados conceituais utilizando modelos tridimensionais das sequências mães e humanizadas. Modelos de imunoglobulina tridimensionais estão comumente disponíveis e são familiares aos peritos na técnica.

Programas de computador estão disponíveis, os quais ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. Essas incluem, por exemplo, WAM (Whitelegg e Rees, 2000, Protein Eng.13:819 a 824), Modeller (Sali e Blundell, 1993, J. Mol.

Biol.234:779 a 815) e Swiss PDB Viewer (Guex e Peitsch, 1997, Electrophoresis 18:2.714 a 2.723). A inspeção dessas exibições permite análise de similaridade de papel dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, por exemplo, a análise de resíduos que influenciam a habilidade da imunoglobulina candidata para ligar seu antígeno. Dessa forma, resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências recebedoras e importadas de forma que a característica de anticorpo desejada, tal como afinidade aumentada para o antígeno (ou antígenos) alvo, seja alcançada. Em geral, os resíduos de região hipervariável são diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência de ligação do antígeno.

[0284] Outro método para humanização de anticorpo é baseado em uma métrica de humanidade de anticorpo denominada Human String Content (HSC).

Esse método compara a sequência de camundongo com o repertório de genes de linha genética humana e as diferenças são classificadas como HSC. A sequência- alvo é, então, humanizada maximizando-se seu HSC em vez de utilizando uma medição de identidade global para gerar múltiplas variantes humanizadas diversas (Lazar et al., 2007, Mol. Immunol.44:1.986 a 1.998).

[0285] Além dos métodos descritos acima, métodos empíricos podem ser usados para gerar e selecionar anticorpos humanizados. Esses métodos incluem aqueles que são baseados na geração de bibliotecas grandes de variantes humanizadas e seleção dos melhores clones utilizando tecnologias de enriquecimento ou técnicas de triagem de alto rendimento. Variantes de anticorpo podem ser isoladas de bibliotecas de exibição de fago, ribossomo e leveduras, bem como por meio de triagem de colônia bacteriana (ver, por exemplo, Hoogenboom, 2005, Nat. Biotechnol.23:1.105 a 1.116; Dufner et al., 2006, Trends Biotechnol.24:523 a 529; Feldhaus et al., 2003, Nat. Biotechnol.21:163 a 170; e Schlapschy et al., 2004, Protein Eng. Des. Sel.17:847 a 860).

[0286] Na abordagem de biblioteca de FR, uma coleção de variantes de resíduo são introduzidas em posições específicas no FR seguido por triagem da biblioteca para selecionar o FR que suporta melhor a CDR enxertada. Os resíduos a serem substituídos podem incluir alguns ou todos os resíduos “Vernier” identificados como potenciais contribuidores para a estrutura de CDR (ver, por exemplo, Foote e Winter, 1992, J. Mol. Biol.224:487 a 499) ou a partir do conjunto mais limitado de resíduos alvo identificados por Baca et al. (1997, J. Biol. Chem.272:10.678 a 10.684).

[0287] Em embaralhamento de FR, FRs inteiros são combinados com as CDRs não humanas em vez de criar bibliotecas combinatórias de variantes de resíduo selecionados (ver, por exemplo, Dall’Acqua et al., 2005, Methods 36:43 a 60).

As bibliotecas podem ser triadas para ligação em um processo de duas etapas, humanizando primeiro VL, seguido por VH. Alternativamente, um processo de embaralhamento de FR de uma etapa pode ser usado. Mostrou-se que tal processo é mais eficiente do que a triagem de duas etapas, uma vez que os anticorpos resultantes exibiram propriedades bioquímicas e fisicoquímicas aperfeiçoadas incluindo expressão aperfeiçoada, afinidade aumentada e estabilidade térmica (ver, por exemplo, Damschroder et al., 2007, Mol. Immunol.44:3.049 a 3.060).

[0288] O método de “humaneering” é baseado em identificação experimental de determinantes de especificidade mínima essenciais (MSDs) e é baseado em substituição sequencial de fragmentos não humanos em bibliotecas de FRs humanos e avaliação de ligação. O mesmo começa com regiões da CDR3 de cadeias de VH e VL não humanas e substitui progressivamente outras regiões do anticorpo não humano nos FRs humanos, incluindo a CDR1 e CDR2 tanto de VH quanto de VL. Essa metodologia resulta tipicamente em retenção de epítopo e identificação de anticorpos a partir de múltiplas subclasses com CDRs de segmento V humanas distintas. A humaneering permite o isolamento de anticorpos que são 91 a 96% homólogos a anticorpos de gene de linha genética humana (ver, por exemplo, Alfenito, Cambridge Healthtech Institute’s Third Annual PEGS, The Protein Engineering Summit, 2007).

[0289] O método de “modificação genética humana” envolve alterar um anticorpo ou fragmento de anticorpo não humano, tal como um camundongo ou anticorpo quimérico ou fragmento de anticorpo, fazendo-se mudanças específicas à sequência de aminoácidos do anticorpo a fim de produzir um anticorpo modificado com imunogenicidade reduzida em um humano que, mesmo assim, mantém as propriedades de ligação desejáveis dos anticorpos não humanos originais.

Geralmente, a técnica envolve classificar resíduos de aminoácidos de um anticorpo não humano (por exemplo, camundongo) como resíduos “risco baixo”, “risco moderado” ou “alto risco”. A classificação é realizada utilizando um cálculo de risco/recompensa global que avalia os benefícios previstos de produção de substituição particular (por exemplo, par imunogenicidade em humanos) contra o risco de que a substituição afetará o dobramento de anticorpo resultante. O resíduo de aminoácido humano particular a ser substituído em uma dada posição (por exemplo, risco baixo ou moderado) de uma sequência de anticorpo não humano (por exemplo, camundongo) pode ser selecionado alinhando-se uma sequência de aminoácidos a partir das regiões variáveis do anticorpo não humano com a região correspondente de uma sequência de anticorpo humano específica ou de consenso.

Os resíduos de aminoácidos em posições de risco baixo ou moderado na sequência não humana podem ser substituídos pelos resíduos correspondentes na sequência de anticorpo humano de acordo com o alinhamento. Técnicas para produzir proteínas modificadas geneticamente humanas são descritas em maiores detalhes em Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7:805 a 814; Patentes nos U.S.

5.766.886; 5.770.196; 5.821.123; e 5.869.619; e Publicação n° PCT WO 93/11794.

[0290] Um compósito de anticorpo humano pode ser gerado utilizando, por exemplo, tecnologia de Composite Human Antibody™ (Antitope Ltd., Cambridge, Reino Unido). Para gerar anticorpos humanos de compósito, sequências de região variável são projetadas a partir de fragmentos de múltiplas sequências de anticorpo humano de região variável de uma forma que evite epítopos de célula T, minimizando, desse modo, a imunogenicidade do anticorpo resultante. Tais anticorpos podem compreender sequências de região constante humanas, por exemplo, regiões de cadeia leve e/ou regiões de cadeia pesada humanas constantes.

[0291] Um anticorpo desimunizado é um anticorpo em que epítopos de célula T foram removidos. Métodos para produzir anticorpos desimunizados foram descritos. Ver, por exemplo, Jones et al., Methods Mol Biol.2009;525:405 a 423, xiv e De Groot et al., Cell. Immunol.244:148 a 153(2006)). Anticorpos desimunizados compreendem regiões variáveis e regiões constantes humanas sem epítopo de célula T. Rapidamente, VH e VL de um anticorpo são clonadas e epítopos de célula T são subsequentemente identificados testando-se peptídeos sobrepostos derivados a partir da VH e VL do anticorpo em um ensaio de T proliferação de células T.

Epítopos de célula T são identificados por meio de métodos in silico para identificar ligação de peptídeo a MHC de classe II humana. Mutações são introduzidas na VH e VL para revogar a ligação a MHC de classe II humana. VH e VL mutacionadas são, então, utilizadas para gerar o anticorpo desimunizado.

14. Anticorpos humanos

[0292] Em modalidades específicas, o anticorpo é um anticorpo anti-humano totalmente humano. Anticorpos totalmente humanos podem ser produzidos por meio de qualquer método conhecido na técnica. Anticorpos humanos anti-Nectina-4 podem ser construídos combinando-se sequências de domínio variável de clone de Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição de fago derivado de humano com sequência (ou sequências) de domínio constante conhecida.

[0293] Alternativamente, anticorpos monoclonais humanos anti-Nectina-4 da presente divulgação podem ser produzidos por meio do método de hibridoma.

Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma de camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos foi descrita, por exemplo, por Kozbor, 1984, J. Immunol.133:3.001 a 3.005; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51 a 63 (1987); e Boerner et al., 1991, J.

Immunol.147:86 a 95.

[0294] Também é possível produzir animal transgênicos (por exemplo, camundongos) que têm capacidade, mediante imunização, para produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Camundongos transgênicos que expressam repertórios de anticorpo humano foram usados para gerar anticorpos monoclonais de sequência humana de alta afinidade contra uma ampla variedade de alvos de fármaco potenciais (ver, por exemplo, Jakobovits, A., 1995, Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):561 a 566; Brüggemann e Taussing, 1997, Curr. Opin. Biotechnol.8(4):455 a 458; Patentes nos U.S. 6.075.181 e 6.150.584; e Lonberg et al., 2005, Nature Biotechnol.23:1.117 a

1.125).

[0295] Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado por meio de imortalização de linfócitos B humanos que produzem um anticorpo direcionado contra um antígeno alvo (por exemplo, tais linfócitos B podem ser recuperados de um indivíduo individual ou podem ter sido imunizados in vitro) (ver, por exemplo, Cole et al., Monclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985); Boerner et al., 1991, J.

Immunol. 147(1):86 a 95; e Patente n° U.S. 5.750.373).

[0296] O embaralhamento genético também pode ser usado para derivar anticorpos humanos de anticorpos não humanos, por exemplo, roedor, em que o anticorpo humano tem afinidades e especificidades similares ao anticorpo não humano inicial. De acordo com esse método, que também é chamado “impressão de epítopo” ou “seleção guiada”, a região variável de cadeia pesada ou leve de um fragmento de anticorpo não humano obtido por meio de técnicas de exibição de fago, como é descrito aqui, é substituída com um repertório de genes de domínio de V humanos, criando uma população de quimeras de scFv ou Fab de cadeia não humana/cadeia humana. A seleção com antígeno resulta em isolamento de um scFv ou Fab de cadeia não humana/cadeia humana quimérica, em que a cadeia humana restaura o sítio de ligação a antígeno destruído mediante remoção da cadeia não humana correspondente no clone de exibição de fago primário (por exemplo, o epítopo guia (imprime) a escolha do parceiro de cadeia humana). Quando o processo é repetido a fim de substituir a cadeia não humana restante, um anticorpo humano é obtido (ver, por exemplo, documento n° PCT WO 93/06213; e Osbourn et al., 2005, Methods 36:61 a 68). Diferente de humanização tradicional de anticorpos não humanos por meio de enxerto de CDR, essa técnica fornece completamente anticorpos humanos, os quais não têm resíduos de FR ou CDR de origem não humana. Exemplos de seleção guiada para humanizar anticorpos de camundongo em direção a antígenos de superfície celular incluem a proteína de ligação a folato presente em células cancerosas de ovário (ver, por exemplo, Figini et al., 1998, Cancer Res.58:991 a 996) e CD147, que é altamente expressa em carcinoma hepatocelular (ver, por exemplo, Bao et al., 2005, Cancer Biol. Ther.4:1.374 a 1.380).

[0297] Uma desvantagem potencial da abordagem de seleção guiada é que o embaralhamento de uma cadeia de anticorpo enquanto se mantém a outra constante poderia resultar em desvio de epítopo. A fim de manter o epítopo reconhecido pelo anticorpo não humano, a retenção de CDR pode ser aplicada (ver, por exemplo, Klimka et al., 2000, Br. J. Cancer.83:252 a 260; e Beiboer et al., 2000, J. Mol. Biol. 296:833 a 849). Nesse método, a CDR de VH3 não humana é comumente retida uma vez que essa CDR pode estar no centro do sítio de ligação a antígeno e pode ser a região mais importante do anticorpo para reconhecimento de antígeno. Em alguns casos, entretanto, CDR de VH3 e CDR de VL3, bem como CDR de VH2, CDR de VL2 e CDR de VL1 do anticorpo não humano podem ser retidas.

15. Anticorpos Multivalentes

[0298] Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado) mais rápido que um anticorpo bivalente por uma célula que expressa um antígeno ao qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos da presente divulgação podem ser anticorpos multivalentes (os quais são diferentes da classe IgM) com três ou mais sítios de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpos tetravalentes), os quais podem ser mais prontamente produzidos por meio de expressão recombinante de ácido nucleico que codifica a cadeias de polipeptídeos do anticorpo.

O anticorpo multivalente pode compreender um domínio de dimerização e três ou mais sítios de ligação a antígeno.

Em certas modalidades, o domínio de dimerização compreende

(ou consiste em) uma região Fc ou uma região de dobradiça.

Nesse cenário, o anticorpo compreenderá uma região Fc e três ou mais sítios de ligação a antígeno em terminal amino à região de Fc.

Em certas modalidades, um anticorpo multivalente compreende (ou consiste em) três a aproximadamente oito sítios de ligação a antígeno.

Em tal modalidade, um anticorpo multivalente compreende (ou consiste em) quatro sítios de ligação a antígeno.

O anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeia de polipeptídeo (por exemplo, duas cadeias de polipeptídeos), em que a cadeia (ou cadeias) de polipeptídeo compreendem dois ou mais domínios variáveis.

Por exemplo, a cadeia (ou cadeias) de polipeptídeo pode compreender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável,

VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia de polipeptídeo de uma região Fc, X1 e X2 representam um aminoácido ou polipeptídeo e n é 0 ou 1. Por exemplo, a cadeia (ou cadeias) de polipeptídeo pode compreender: cadeia de região de Fc de VH-CH1 ligante com VH-CH1 flexível; ou cadeia de região de Fc de VH-

CH1-VH-CH1. O anticorpo multivalente no presente documento pode compreender adicionalmente pelo menos dois (por exemplo, quatro) polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve.

O anticorpo multivalente no presente documento pode, por exemplo, compreender de aproximadamente dois a aproximadamente oito polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve.

Os polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve contemplados aqui compreendem uma cadeia leve domínio variável e, opcionalmente, compreendem adicionalmente um domínio de CL.

16. Modificação genética de Fc

[0299] Pode ser desejável modificar um anticorpo anti-Nectina-4 fornecido aqui por meio de modificação genética de Fc. Em certas modalidades, a modificação à região de Fc do anticorpo resulta na diminuição ou eliminação de uma função efetora do anticorpo. Em certas modalidades, a função efetora é ADCC, ADCP e/ou CDC. Em algumas modalidades, a função efetora é ADCC. Em outras modalidades, a função efetora é ADCP. Em outras modalidades, a função efetora é CDC. Em uma modalidade, a função efetora é ADCC e ADCP. Em uma modalidade, a função efetora é ADCC e CDC. Em uma modalidade, a função efetora é ADCP e CDC. Em uma modalidade, a função efetora é ADCC, ADCP e CDC. Isso pode ser alcançado introduzindo-se uma ou mais substituições de aminoácido em uma região Fc do anticorpo.

[0300] Para aumentar a vida útil de soro do anticorpo, um indivíduo pode incorporar um epítopo de ligação receptor selvagem no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo), por exemplo, como descrito na Patente n° U.S. 5.739.277.

O termo “epítopo de ligação receptor selvagem” refere-se a um epítopo da região de Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável por aumentar a vida útil do soro in vivo da molécula de IgG.

17. Agentes de Ligação Alternativos

[0301] A presente divulgação abrange agentes de ligação a não imunoglobulina que se ligam especificamente ao mesmo epítopo como um anticorpo anti-Nectina-4 revelado no presente documento. Em algumas modalidades, um agente de ligação a não imunoglobulina é identificado como um agente que desloca ou é deslocado por um anticorpo anti-Nectina-4 da presente divulgação em um ensaio de ligação competitiva. Esses agentes de ligação alternativos podem incluir, por exemplo, qualquer uma das estruturas de proteína geneticamente modificadas conhecidas na técnica. Tais estruturas podem compreender uma ou mais CDRs que são mostradas na Tabela 1. Tais estruturas incluem, por exemplo, anticalinas, as quais são baseadas na estrutura lipocalina, uma estrutura de proteína caracterizada por um barril beta rígido que suporta quatro laços hipervariáveis que formam o sítio de ligação ligante. Especificidades de ligação inovadoras podem ser geneticamente modificadas por meio de mutagênese aleatória direcionada nas regiões de laço, em combinação com exibição e seleção guiada funcional (ver, por exemplo, Skerra, 2008, FEBS J.275:2.677 a 2.683). Outras estruturas adequadas podem incluir, por exemplo, adnectinas ou monocorpos, com base no décimo domínio extracelular de fibronectina III humana (ver, por exemplo, Koide e Koide, 2007, Methods Mol. Biol.352: 95 a 109); aficorpos, com base no domínio Z de proteína A de estafilococos (ver, por exemplo, Nygren et al., 2008, FEBS J. 275:2.668 a 2.676); DARPins, com base em proteínas de repetição umkyrin (ver, por exemplo, Stumpp et al., 2008, Drug. Discov. Today 13:695 a 701); finômeros, com base no domínio de SH3 da quinase de proteína Fyn humana (ver, por exemplo, Grabulovski et al., 2007, J. Biol.

Chem.282:3.196 a 3.204); afitinas, com base em Sac7d a partir de Sulfolobus acidolarius (ver, por exemplo, Krehenbrink et al., 2008, J. Mol. Biol.383:1.058 a

1.068); afilinas, com base em y-B-cristalina humana (ver, por exemplo, Ebersbach et al., 2007, J. Mol. Biol. 372:172 a 185); avímeros, com base no um domínio de proteínas receptoras de membrana (ver, por exemplo, Silverman et al., 2005, Biotechnol.23:1.556 a 1.561); peptídeos de nó ricos em cisteína (ver, por exemplo, Kolmar, 2008, FEBS J.275:2.684 a 2.690); e inibidores de tipo Kunitz geneticamente modificados (ver, por exemplo, Nixon e Wood, 2006, Curr. Opin. Drug. Discov.

Dev.9:261 a 268). Para uma revisão, ver, por exemplo, Gebauer e Skerra, 2009, Curr.

Opin. Chem. Biol.13:245 a 255.

18. Triagem para Anticorpos Específicos para Nectina-4

[0302] Técnicas para gerar anticorpos foram descritas acima. Anticorpos podem ser adicionalmente triados ou selecionados para determinadas características biológicas, tais como sua especificidade de ligação para Nectina-4, como desejado. Triagem para anticorpos específicos para um antígeno alvo envolve dois aspectos. Primeiro, triar os anticorpos para identificar aqueles que não se ligam a ou têm baixa ligação a uma amostra que não contém Nectina-4. Esse aspecto da triagem identifica anticorpos que reconhecem especificamente e ligam Nectina-4, mas não reconhecem substancialmente ou ligam moléculas diferentes de Nectina-4.

Segundo, triar os anticorpos para identificar aqueles que se ligam fortemente ou com alta afinidade a uma amostra que inclui Nectina-4. Esse aspecto da triagem identifica anticorpos que têm alta afinidade a Nectina-4 e podem dar sinais de detecção fortes em diversos ensaios que são descritos abaixo. A triagem para anticorpos em ambos os aspectos pode ser alcançada utilizando um ensaio imunológico adicionalmente descrito abaixo.

[0303] Em certas modalidades, os anticorpos são inicialmente triados utilizando um ELISA em que placas de micro-titulação são revestidas com proteína Nectina-4 ou fragmento da mesma. Os clones de anticorpos que não se ligam ou se ligam de modo fraco a Nectina-4 imobilizada são eliminados. Em algumas modalidades, anticorpos que ligam Nectina-4 podem ser adicionalmente triados para reatividade em um ensaio imunológico, por exemplo, ensaio baseado em ELISA ou ensaio de western blotting, a outras isoformas de Nectina, por exemplo, utilizando placas de micro-titulação revestidas com Nectina-1, Nectina-2 ou Nectina-3. Clones de anticorpos que são reativos a outra isoforma de Nectina são eliminados e clones de anticorpos que são reativos apenas a Nectina-4 podem ser selecionados para triagem adicional.

[0304] Os anticorpos anti-Nectina-4 podem ser adicionalmente triados para sua ligação para controlar negativos que não expressam ou expressam nível baixo de Nectina-4. Para tais triagens, a ligação entre os diversos clones dos anticorpos e os controles negativos pode ser determinada em um ensaio imunológico, por exemplo, ensaio de IHC, ensaio ELISA ou ensaios de immunoblotting. Clones de anticorpos que são reativos a quaisquer controles negativos são eliminados.

Controles negativos diferentes (por exemplo, tecidos ou linhagens celulares negativos diferentes para expressão da Nectina-4) podem conter um conjunto de moléculas, portanto múltiplos controles negativos podem ser usados para assegurar que os anticorpos candidatos anti-Nectina-4 sejam selecionados contra um conjunto diverso de moléculas de não Nectina-4.

[0305] Os anticorpos anti-Nectina-4 podem ser adicionalmente triados para ligação a controles positivos que são conhecidos por expressar Nectina-4. Para tais triagens, a ligação entre os diversos clones dos anticorpos e os controles positivos pode ser determinada em um ensaio imunológico, por exemplo, ensaio de IHC, ensaio ELISA ou ensaios de immunoblotting. Clones de anticorpos que têm ligação forte aos controles positivos são selecionados. Um anticorpo anti-Nectina-4 que se ligam fortemente a um controle positivo e de modo fraco a um controle negativo pode ser selecionado como um anticorpo específico para Nectina-4. A diferença entre uma quantidade de um anticorpo anti-Nectina-4 ligado aos controles positivos e negativos é a ligação específica daquele anticorpo anti-Nectina-4 a Nectina-4.

Ligação específica pode ser usada como um dos critérios para selecionar anticorpos anti-Nectina-4 específicos. Um anticorpo específico fornece alta ligação específica em um ensaio imunológico descrito em detalhes abaixo.

[0306] Em algumas modalidades, a especificidade do anticorpo anti-Nectina- 4 pode ser determinada correlacionando-se ou comparando-se a ligação de anticorpo anti-Nectina-4 com referências negativas e positivas com os níveis de expressão conhecidos da Nectina-4 nessas referências que foram determinadas determinada por outros meios. A expressão de referência da Nectina-4 pode ser um controle de Nectina-4 positivo ou um controle de Nectina-4 negativo, que são descritos abaixo. A ligação de um anticorpo específico anti-Nectina-4 a uma amostra ou uma referência pode ser correlacionada com ou ser proporcional à expressão da Nectina-4 na amostra ou na referência. Isto é, um anticorpo específico anti-Nectina-4 se liga fortemente a uma amostra ou uma referência que expressa alto nível de Nectina-4, se liga moderadamente àquela que expressa nível intermediário, se liga de modo fraco àquela que expressa baixo nível e se liga minimamente (por exemplo, se liga aproximadamente no mesmo nível que um anticorpo de isótipo de controle se ligaria) àquela que não expressa Nectina-4. A expressão conhecida da Nectina-4 nos controles negativos ou positivos pode ser determinada independentemente por meio de um ensaio de qPCR descrito em detalhes abaixo. A expressão conhecida da Nectina-4 também pode ser independentemente determinada utilizando quaisquer ensaios imunológicos descritos abaixo com um anticorpo anti-Nectina-4 que foi anteriormente determinado para ser específico para Nectina-4. Ensaios imunológicos adequados para confirmar a expressão da Nectina-4 nos controles negativos e positivos incluem, a título de exemplo e sem qualquer limitação, um ensaio de IHC, um ensaio de immunoblotting, um ensaio de FACS ou um ELISA, como descrito em detalhes abaixo. Em algumas modalidades, o nível de mRNUm de Nectina-4 pode não ser zero no controle negativo devido a ruído de fundo dos ensaios ou devido ao nível baixo biologicamente não significativo de Nectina-4 restante, que são descritos abaixo.

[0307] O controle de Nectina-4 negativo pode ser apropriadamente considerado negativo para Nectina-4, por exemplo, quando o nível de mRNUm de Nectina-4 em um ensaio de qPCR é substancialmente similar ao nível de mRNA detectado com um conjunto de iniciadores não específicos ou quando o nível de mRNUm de Nectina-4 é biologicamente não significativo à luz do nível de mRNUm de Nectina-4 em um controle de Nectina-4 positivo. De modo similar, a Nectina-4 detectada por meio de ensaios imunológicos utilizando outro anticorpo específico de Nectina-4 em um controle negativo pode não ser zero devido a ruído de fundo dos ensaios ou devido ao nível baixo biologicamente não significativo de Nectina-4 restante. O ruído de fundo pode ser causado por interações não específicas entre os reagentes de ensaio diferentes dos anticorpos anti-Nectina-4 e das amostras. O controle de Nectina-4 negativo pode ser apropriadamente considerado negativo para Nectina-4, por exemplo, quando o nível de Nectina-4 no controle negativo detectado pelo anticorpo específico de Nectina-4 é substancialmente similar ao nível de detecção de um anticorpo de isótipo de controle no mesmo ensaio. Em alguns ensaios, o ruído de fundo pode explicar uma porcentagem substancial do sinal detectado no controle positivo.

[0308] Adicionalmente, controles positivos e negativos foram identificados e publicados na literatura por peritos na técnica, incluindo tecidos, células (incluindo, por exemplo, linhagens celulares) e amostras patológicas positivos e/ou negativos.

Tal literatura pode ser prontamente identificad pesquisando-se bancos de dados, tais como Pubmed (por exemplo, utilizando termos de busca, tais como Nectina-4, expressão, positivo, negativo e/ou distribuição) e analisando os resultados de busca.

[0309] Consequentemente, uma quantidade relativa do anticorpo específico de Nectina-4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ligada a um controle negativo célula sem expressão da Nectina-4 pode ser

[0310] aproximadamente 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, 0,05%, 0,03%, 0,01%, 0,001% ou menos de uma quantidade do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ligada ao controle positivo de expressão de Nectina-4.

[0311] Em algumas modalidades do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo fornecido aqui, a expressão negativa ou positiva da Nectina-4 nas células de controle é independentemente determinada por um ensaio de qPCR, um ensaio de IHC com um segundo anticorpo, um ensaio de immunoblotting com um segundo anticorpo, um ensaio de FACS com um segundo anticorpo ou um ELISA com um segundo anticorpo.

[0312] Em algumas modalidades do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo fornecido aqui, uma quantidade do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ligadas às células é determinada por um ensaio de IHC, um ensaio de immunoblotting, um ensaio de FACS ou um ELISA.

19. Variantes de anticorpo

[0313] Em algumas modalidades, a modificação (ou modificações) de sequência de aminoácidos dos anticorpos que se ligam à Nectina-4 ou descritos aqui é contemplada. Por exemplo, pode ser desejável para aperfeiçoar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo, incluindo, mas não limitados à especificidade, termoestabilidade, nível de expressão, funções efetoras, glicosilação, imunogenicidade reduzida ou solubilidade. Assim, além dos anticorpos anti-Nectina-4 descritos aqui, é contemplado que variantes de anticorpo anti- Nectina-4 podem ser preparadas. Por exemplo, variantes de anticorpo anti-Nectina-4 podem ser preparadas introduzindo-se mudanças de nucleotídeo apropriadas no DNA de codificação e/ou por meio de síntese do anticorpo ou polipeptídeo desejado.

Os peritos na técnica que apreciam que mudanças de aminoácido podem alterar processos pós-translacionais do anticorpo anti-Nectina-4, tal como mudar o número ou a posição de sítios de glicosilação ou alterar as características de ancoramento de membrana.

[0314] Em algumas modalidades, uma glutamina no primeiro resíduo pode ser substituída com piroglutamato em qualquer um dos anticorpos fornecidos aqui que compreende um polipeptídeo que tem uma primeira glutamina em sua sequência também é fornecida. Tal substituição ocorre naturalmente em afecções fisiológicas ou in vitro ou ex vivo em um tampão com um pH aproximadamente 7. Tal substituição pode ser realizada submetendo-se o anticorpo que compreende um polipeptídeo que tem uma primeira glutamina a uma afecção em que a ciclização da primeira glutamina glutaminila para formar piroglutamato é favorecida, por exemplo, em uma solução de baixo teor de ácido, tal como acetato e trifluoroacetato.

[0315] Em algumas modalidades, anticorpos fornecidos aqui são quimicamente modificados, por exemplo, por meio da fixação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo. Os anticorpos derivados podem incluir anticorpos que foram quimicamente modificados, por exemplo, por meio de glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por meio de grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína etc. Qualquer uma dentre as diversas modificações químicas pode ser executada por meio de técnicas conhecidas, incluindo, mas sem limitação, clivagem química, acetilação, formulação, síntese metabólica de tunicamicina etc, específicas.

Adicionalmente, o anticorpo pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.

[0316] Variações podem ser uma substituição, deleção ou inserção de um ou mais códons que codificam o anticorpo ou polipeptídeo que resulta em uma alteração na sequência de aminoácidos em comparação com a sequência nativa anticorpo ou polipeptídeo. Substituições de aminoácido podem ser o resultado de substituir um aminoácido com outro aminoácido que tem propriedades estruturais e/ou químicas similares, tais como a substituição de uma leucina com uma serina, por exemplo, substituições de aminoácido conservadoras. Técnicas padrões conhecidas pelos peritos na técnica podem ser usadas para introduzir mutações na sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula fornecida aqui, incluindo, por exemplo, mutagênese direcionada a sítio e mutagênese mediada por PCR que resulta em substituições de aminoácido. Inserções ou deleções podem estar opcionalmente na faixa de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. Em certas modalidades, a substituição, deleção ou inserção inclui menos de 25 substituições de aminoácido, menos de 20 substituições de aminoácido, menos de 15 substituições de aminoácido, menos de 10 substituições de aminoácido, menos de 5 substituições de aminoácido, menos de 4 substituições de aminoácido, menos de 3 substituições de aminoácido ou menos de 2 substituições de aminoácido em relação à molécula original. Em uma modalidade específica, a substituição é uma substituição de aminoácido conservadora feita em um ou mais resíduos de aminoácidos não essenciais previstos. A variação permitida pode ser determinada fazendo-se inserções, deleções ou substituições sistematicamente de aminoácidos na sequência e testando-se as variantes resultantes para atividade exibida pela sequência nativa de comprimento completo ou madura.

[0317] Inserções sequência de aminoácidos incluem fusões de terminal amino e/ou carboxila na faixa de comprimento de um resíduo a polipeptídeos que contêm cem ou mais resíduos, bem como inserções intrasequências de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila de terminal N. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para terapia de pró-fármaco de enzima direcionada a anticorpo) ou um polipeptídeo que aumenta a vida útil de soro do anticorpo.

[0318] Uma “substituição de aminoácido conservadora” é uma em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral com uma carga similar. Famílias de resíduos de aminoácidos que têm cadeias laterais com cargas similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais ramificadas em beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

Alternativamente, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou de parte da sequência de codificação, tal como por meio de mutagênese de saturação e os mutantes resultantes podem ser triados para atividade biológica para identificar mutantes que mantêm atividade. Após mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa e a atividade da proteína pode ser determinada.

[0319] Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são alcançadas selecionando-se substituições que são significativamente diferentes em seu efeito sobre a manutenção (a) de uma estrutura da coluna de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma folha ou conformação hélica, (b) da carga ou da hidrofobia da molécula no sítio alvo ou (c) do volume da cadeia lateral.

Alternativamente, substituições conservadoras (por exemplo, dentro de um grupo aminoácido com propriedades similares e/ou cadeias laterais) podem ser feitas, a fim de manter ou não mudar significativamente as propriedades. Aminoácidos podem ser agrupados de acordo com similaridades nas propriedades de seus cadeias laterais (ver, por exemplo, Lehninger, Biochemistry 73 a 75 (2d ed.1975)): (1) não polar: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) polar não carregada: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) ácida: Asp (D), Glu (E); e (4) básica: Lys (K), Arg (R), His(H).

[0320] Alternativamente, os resíduos que ocorrem naturalmente podem ser divididos em grupos com base nas propriedades das cadeias laterais comuns: (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

[0321] As substituições não conservativas acarretam na troca de um membro de uma destas classes por um de outra classe. Estes resíduos substituídos também podem ser introduzidos nos sítios de substituição conservativa ou, no restante dos sítios (não conservados). Consequentemente, em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 35%, pelo menos

40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%,

pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de um anticorpo monoclonal de camundongo descrito aqui.

Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da

Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 35% idêntica à sequência de aminoácidos de um anticorpo monoclonal de camundongo descrito aqui.

Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 40% idêntica à sequência de aminoácidos de um anticorpo monoclonal de camundongo descrito aqui.

Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 45% idêntica à sequência de aminoácidos de um anticorpo monoclonal de camundongo descrito aqui.

Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50%

idêntica à sequência de aminoácidos de um anticorpo monoclonal de camundongo descrito aqui.

Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 55% idêntica à sequência de aminoácidos de um anticorpo monoclonal de camundongo descrito aqui.

Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica à sequência de aminoácidos de um anticorpo monoclonal de camundongo descrito aqui.

Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 65%

Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos de um anticorpo monoclonal de camundongo descrito aqui.

Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75% idêntica à sequência de aminoácidos de um anticorpo monoclonal de camundongo descrito aqui.

Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%

Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos de um anticorpo monoclonal de camundongo descrito aqui.

Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de um anticorpo monoclonal de camundongo descrito aqui.

Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%

Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de um anticorpo monoclonal de camundongo descrito aqui.

[0322] Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos representada nas Tabelas 1-2.

Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 35% idêntica a uma sequência de aminoácidos representada nas Tabelas 1-2. Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 40% idêntica a uma sequência de aminoácidos representada nas Tabelas 1-2. Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 45% idêntica a uma sequência de aminoácidos representada nas Tabelas 1-2. Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica a uma sequência de aminoácidos representada nas Tabelas 1-2. Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 55% idêntica a uma sequência de aminoácidos representada nas Tabelas 1-2. Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica a uma sequência de aminoácidos representada nas Tabelas 1-2. Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 65% idêntica a uma sequência de aminoácidos representada nas Tabelas 1-2. Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica a uma sequência de aminoácidos representada nas Tabelas 1-2. Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75% idêntica a uma sequência de aminoácidos representada nas Tabelas 1-2. Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos representada nas Tabelas 1-2. Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica a uma sequência de aminoácidos representada nas Tabelas 1-2. Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de aminoácidos representada nas Tabelas 1-2. Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos representada nas Tabelas 1-2. Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos representada nas Tabelas 1-2.

[0323] Ainda em outra modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos da VH CDR e/ou da VL CDR que é pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos da VH CDR representada na Tabela 1 e/ou uma sequência de aminoácidos da VL CDR representada na Tabela 1. Ainda em outra modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos da VH CDR e/ou da VL CDR que é pelo menos 35% idêntica a uma sequência de aminoácidos da VH CDR representada na Tabela 1 e/ou uma sequência de aminoácidos da VL CDR representada na Tabela 1. Ainda em outra modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos da VH CDR e/ou da VL CDR que é pelo menos 40% idêntica a uma sequência de aminoácidos da VH CDR representada na Tabela 1 e/ou uma sequência de aminoácidos da VL CDR representada na Tabela 1. Ainda em outra modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos da VH CDR e/ou da VL CDR que é pelo menos 45% idêntica a uma sequência de aminoácidos da VH

CDR representada na Tabela 1 e/ou uma sequência de aminoácidos da VL CDR representada na Tabela 1. Ainda em outra modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos da VH CDR e/ou da VL CDR que é pelo menos 50%

idêntica a uma sequência de aminoácidos da VH CDR representada na Tabela 1 e/ou uma sequência de aminoácidos da VL CDR representada na Tabela 1. Ainda em outra modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos da VH CDR e/ou da VL CDR que é pelo menos 55% idêntica a uma sequência de aminoácidos da VH

CDR representada na Tabela 1 e/ou uma sequência de aminoácidos da VL CDR representada na Tabela 1. Ainda em outra modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos da VH CDR e/ou da VL CDR que é pelo menos 60%

idêntica a uma sequência de aminoácidos da VH CDR representada na Tabela 1 e/ou uma sequência de aminoácidos da VL CDR representada na Tabela 1. Ainda em outra modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos da VH CDR e/ou da VL CDR que é pelo menos 65% idêntica a uma sequência de aminoácidos da VH

CDR representada na Tabela 1 e/ou uma sequência de aminoácidos da VL CDR representada na Tabela 1. Ainda em outra modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos da VH CDR e/ou da VL CDR que é pelo menos 70% idêntica a uma sequência de aminoácidos da VH CDR representada na Tabela 1 e/ou uma sequência de aminoácidos da VL CDR representada na Tabela 1. Ainda em outra modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos da VH CDR e/ou da VL CDR que é pelo menos 75% idêntica a uma sequência de aminoácidos da VH

CDR representada na Tabela 1 e/ou uma sequência de aminoácidos da VL CDR representada na Tabela 1. Ainda em outra modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos da VH CDR e/ou da VL CDR que é pelo menos 80%

idêntica a uma sequência de aminoácidos da VH CDR representada na Tabela 1 e/ou uma sequência de aminoácidos da VL CDR representada na Tabela 1. Ainda em outra modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos da VH CDR e/ou da VL CDR que é pelo menos 85% idêntica a uma sequência de aminoácidos da VH

CDR representada na Tabela 1 e/ou uma sequência de aminoácidos da VL CDR representada na Tabela 1. Ainda em outra modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos da VH CDR e/ou da VL CDR que é pelo menos 90%

idêntica a uma sequência de aminoácidos da VH CDR representada na Tabela 1 e/ou uma sequência de aminoácidos da VL CDR representada na Tabela 1. Ainda em outra modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos da VH CDR e/ou da VL CDR que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos da VH CDR representada na Tabela 1 e/ou uma sequência de aminoácidos da VL CDR representada na Tabela 1. Ainda em outra modalidade, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um epítopo da Nectina-4 compreende uma sequência de aminoácidos da VH CDR e/ou da VL CDR que é pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos da VH CDR representada na Tabela 1 e/ou uma sequência de aminoácidos da VL CDR representada na Tabela 1.

[0324] As variações podem ser feitas com o uso de métodos conhecidos na técnica, como mutagênese mediada por oligonucleotídeo (direcionada ao local), varredura de alanina e mutagênese por PCR. A mutagênese direcionada ao local (consultar, por exemplo, Carter, 1986, Biochem J.237:1 a 7; e Zoller et al., 1982, Nucl. Acids Res.10:6487 a 500), mutagênese por cassete (consultar, por exemplo, Wells et al., 1985, Gene 34:315 a 23) ou outras técnicas conhecidas podem ser realizadas no DNA clonado para produzir o anticorpo anti-Nectina-4 de DNA variante.

[0325] Qualquer resíduo de cisteína não envolvida na manutenção da conformação apropriada do anticorpo anti-Nectina-4 pode ser substituído também, por exemplo, por um outro aminoácido, como alanina ou serina para aprimorar a estabilidade oxidativa da molécula e para impedir a reticulação aberrante. Por outro lado, a ligação (ou ligações de cisteína pode ser adicionada ao anticorpo anti- Nectina-4 para aprimorar sua estabilidade (por exemplo, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo, como um fragmento Fv).

[0326] Em algumas modalidades, uma molécula de anticorpo anti-Nectina-4 da presente revelação é um anticorpo “desimunizado”. Um anticorpo anti-Nectina-4

“desimunizado” é um anticorpo derivado de um anticorpo anti-Nectina-4 humanizado ou quimérico, que tem uma ou mais alterações na sua sequência de aminoácidos que resulta em uma redução de imunogenicidade do anticorpo em comparação ao respectivo anticorpo não desimunizado original. Um dos procedimentos para gerar tais anticorpo mutantes envolve a identificação e remoção de epítopos de células T da molécula de anticorpo. Em uma primeira etapa, a imunogenicidade da molécula de anticorpo pode ser determinada por vários métodos, por exemplo, por determinação in vitro de epítopos de células T ou previsão in silico de tais epítopos conforme conhecido na técnica. Uma vez que os resíduos críticos para a função de epítopo de célula T foram identificados, mutações podem ser feitas para remover a imunogenicidade e reter a atividade de anticorpo. Para revisão, consultar, por exemplo, Jones et al., 2009, Methods in Molecular Biology 525:405 a 23. 20.

Maturação de Afinidade in vitro

[0327] Em algumas modalidades, as variantes de anticorpo que têm uma propriedade aprimorada, como afinidade, estabilidade ou nível de expressão, quando em comparação a um anticorpo parental podem ser preparados por maturação de afinidade in vitro. Como o protótipo natural, a maturação de afinidade in vitro tem como base os princípios de mutação e seleção. As bibliotecas de anticorpos são exibidas como fragmentos de domínio Fab, scFv ou V na superfície de um organismo (por exemplo, célula de fago, de bactérias, de levedura ou mamífera) ou em associação (por exemplo, covalente ou não covalentemente) com seu mRNA ou DNA de codificação. A seleção de afinidade dos anticorpos exibidos permite o isolamento de organismos ou complexos que carregam as informações genéticas que codificam os anticorpos. Duas ou três etapas de mutação e seleção que utilizam métodos de exibição, como exibição de fago resulta, em geral, em fragmentos de anticorpo com afinidades na faixa nanomolar baixa. Os anticorpos com afinidade maturada podem ter afinidades nanomolares ou até mesmo picomolares para o antígeno alvo.

[0328] A exibição de bacteriófago é um método de espalhamento amplo para exibição e seleção de anticorpos. Os anticorpos são exibidos na superfície de Fd ou M13 bacteriófagos como fusões para a proteína de revestimento de bacteriófago. A seleção envolve a exposição ao antígeno para permitir que anticorpos exibidos por fago vinculem seus alvos, um processo chamado de “panning”. O fago ligado ao antígeno é recuperado e usado para infectar bactérias para produzir fago para etapas adicionais de seleção. Para revisão, consultar, por exemplo, Hoogenboom, 2002, Methods. Mol. Biol.178:1 a 37; e Bradbury e Marks, 2004, J. Immunol.

Methods 2016;290:29 a 49.

[0329] Em um sistema de exibição de levedura (consultar, por exemplo, Boder et al., 1997, Nat. Biotech.15:553 a 57; e Chao et al., 2006, Nat. Protocols 1:755 a 68), o anticorpo pode ser exibido como fusões variáveis de cadeia única(scFv) nas quais as cadeias pesadas e leves são conectadas por um conector flexível. A scFv é fundida à subunidade de adesão da proteína de aglutinina de levedura Aga2p, que se fixa à parede celular de levedura através de ligações de dissulfeto à Aga1p. A exibição de uma proteína através de Aga2p projeta a proteína para longe de uma superfície celular, minimizando interações potenciais com outras moléculas na parede celular de levedura. A separação magnética e a citometria de fluxo são usadas para examinar a biblioteca para selecionar anticorpos com afinidade ou estabilidade aprimorada. A ligação a um antígeno de interesse solúvel é determinada por etiquetagem de levedura com antígeno biotinilado e um reagente secundário, como conjugado de estreptavidina a um fluoróforo. As variações na expressão de superfície do anticorpo podem ser medidas através de etiquetagem de imunofluorescência da marca de hemaglutinina ou epítopo c-Myc que flanqueia a scFv. A expressão foi mostrada para correlacionar com a estabilidade da proteína exibida e, assim, os anticorpos podem ser selecionados para estabilidade aprimorada assim como afinidade aprimorada (consultar, por exemplo, Shusta et al., 1999, J. Mol. Biol.292:949 a 56). Uma vantagem adicional da exibição de levedura é que as proteínas exibidas são dobradas no retículo endoplasmático das células de levedura eucarióticas, aproveitando a vantagem das chaperonas de retículo endoplasmático e do maquinário de controle de qualidade. Uma vez que a maturação é concluída, a afinidade de anticorpo de poder ser “titulada” convenientemente enquanto exibido na superfície da levedura, que elimina a necessidade de expressão e purificação de cada clone. Uma limitação teórica de exibição de superfície de levedura é o tamanho de biblioteca funcional potencialmente menor que a biblioteca de outros métodos de exibição; entretanto, uma abordagem recente usa o sistema de correspondência de células de levedura para criar diversidade combinatória estimada para ser 1014 no tamanho (consultar, por exemplo, Publicação de Patente US 2003/0186374; e Blaise et al., 2004, Gene 342:211 a 18).

[0330] Na exibição de ribossomo, os complexos de mRNA-ribossomo- anticorpo (ARM) são gerados para seleção em um sistema sem célula. A codificação de biblioteca de DNA para uma biblioteca particular de anticorpos é, em geral, fundida para uma sequência espaçadora que é desprovida de um códon de parada.

Essa sequência espaçadora, quando traduzida, ainda é fixa ao peptidil-tRNA e ocupa o túnel ribossômico e, assim, permite que a proteína de interesse se sobressaia do ribossomo e dobra. O complexo resultante de mRNA, ribossomo e proteína podem se ligar a um ligante ligado à superfície, permitindo isolamento simultâneo do anticorpo e do seu mRNA de codificação através da captura de afinidade com o ligante. Então, o mRNA ligado ao ribossomo é transcrito de volta para o cDNA, que pode, então se submeter à mutagênese e ser usado na próxima etapa de seleção (consultar, por exemplo, Fukuda et al., 2006, Nucleic Acids Res.

34:e127 Na exibição de mRNA, uma ligação covalente entre o anticorpo e o mRNA é estabelecida com o uso de puromicina como molécula adaptadora (Wilson et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 98:3750 a 55).

[0331] À medida que esses métodos são realizados em sua totalidade in vitro, os mesmos fornecem duas vantagens principais sobre outras tecnologias de seleção. Primeiramente, a diversidade da biblioteca não é limitada pela eficiência de transformação de células bacterianas, mas apenas pelo número de ribossomos e moléculas de mRNA diferentes presentes no tudo de teste. Em segundo lugar, as mutações aleatórias podem ser introduzidas facilmente após cada etapa de seleção, por exemplo, por polimerases não corrigidas, já que nenhuma biblioteca deve ser transformada após qualquer etapa de diversificação.

[0332] Em um sistema de exibição de célula mamífera (consultar, por exemplo, Bowers et al., 2011, Proc Natl Acad Sci EUA.108:20455 a 60), uma biblioteca completamente humana de IgGs é construída com base em segmentos de gene V de sequência de linha genética unida a regiões pré-recombinadas de D(J).

As regiões V de comprimento total para a cadeia pesada e a cadeia leve são montadas com regiões constantes de cadeia pesada e cadeia leve humana e transfectadas em uma linha celular mamífera (por exemplo, HEK293). A biblioteca transfectada é expandida e submetida a várias etapas de seleção negativa contra esferas magnéticas acopladas a estreptavidina (SA), seguida por uma etapa de seleção positiva contra esferas magnéticas acopladas a SA revestidas com proteína alvo biotinilada, fragmento de peptídeo ou epítopo. As células positivamente selecionadas são expandidas e, então, classificadas por etapas de FACS para isolar clones de célula única que exibem anticorpos que se ligam especificamente à proteína alvo, fragmento de peptídeo ou epítopo. Os pares de cadeia pesada e cadeia leve desses clones de célula única são transfectados com AID para maturação adicional. Várias etapas de exibição de célula mamífera, acoplada à hipermutação somática acionada por AID, geram anticorpos de alta especificidade e alta afinidade.

[0333] A diversidade pode ser introduzida como CDRs ou todos os genes V das bibliotecas de anticorpo de uma maneira desejada ou através de introdução aleatória. A primeira abordagem inclui direcionar sequencialmente todas as CDRs de um anticorpo através de um nível alto ou baixo de mutagênese ou direcionar pontos quentes isolados de hipermutações somáticas (consultar, por exemplo, Ho et al., 2005, J. Biol. Chem.280:607 a 17) ou resíduos suspeitos de afetar afinidade na base experimental ou por razões estruturais. A diversidade pode ser introduzida também por substituição de regiões que são naturalmente diversas através de embaralhamento de DNA ou técnicas similares (consultar, por exemplo, Lu et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:43496 a 507; Patente nº US 5.565.332 e nº US 6.989.250).

As técnicas alternativas direcionam ciclos hipervariáveis que se estendem em resíduos de região de quadro (consultar, por exemplo, Bond et al., 2005, J. Mol.

Biol.348:699 a 709) empregam deleções e inserções de ciclos em CDRs ou usam diversificação com base na hibridização (consultar, por exemplo, Publicação de Patente nº US.2004/0005709). Os métodos adicionais para gerar diversidade em CDRs são revelados, por exemplo, na Patente nº US 7 985.840 Os métodos adicionais que podem ser usados para gerar bibliotecas de anticorpo e/ou maturação de afinidade de anticorpo são revelados, por exemplo, nas Patentes nº US 8.685.897 e nº US 8.603.930 e nas Publicações nº US 2014/0170705, nº US 2014/0094392, nº US 2012/0028301, nº US 2011/0183855 e nº US 2009/0075378, cada uma das quais são incorporadas a título de referência no presente documento.

[0334] O exame das bibliotecas pode ser realizado por várias técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a Nectina-4 pode ser imobilizada em suportes sólidos, colunas, pinos ou membranas/outros filtros de celulose/poli(fluoreto de vinilideno), expressados em células hospedeiras afixadas a placas de adsorção ou usados na classificação de célula ou conjugados com uma biotina para captura com esferas revestidas com estreptavidina ou usados em qualquer outro método para panning de bibliotecas de exibição.

[0335] Para revisão de maturação de afinidade de métodos in vitro, consultar, por exemplo, Hoogenboom, 2005, Nature Biotechnology 23:1105 a 16; Quiroz e Sinclair, 2010, Revista Ingeneria Biomedia 4:39 a 51; e referências dos mesmos.

21. Modificações de Anticorpos anti-Nectina-4

[0336] As modificações covalentes de anticorpos anti-Nectina-4 são incluídas no escopo da presente revelação. As modificações covalentes incluem reagir os resíduos alvo de aminoácidos de um anticorpo anti-Nectina-4 com um agente de derivação orgânico que tem capacidade de reagir com cadeias laterais selecionadas ou com resíduos terminais de N- ou C- do anticorpo anti-Nectina-4.

Outras modificações incluem desamidação de resíduos de glutaminil e asparaginil para resíduos de glutamil e aspartil correspondentes, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxilas de resíduos de seril ou treonil, metilação dos grupos α-amino de cadeias laterais de lisina, arginina e histidina(consultar, por exemplo, Creighton, Proteins: Structure e Molecular Properties 79-86 (1983)), acetilação de amina N-terminal e amidação de qualquer grupo carboxila C-terminal.

[0337] Outros tipos de modificação covalente do anticorpo anti-Nectina-4 incluídos no escopo desta presente revelação incluem alterar o padrão de glicosilação nativa do anticorpo ou polipeptídeo (consultar, por exemplo, Beck et al., 2008, Curr. Pharm. Biotechnol.9:482 a 501; e Walsh, 2010, Drug Discov. Today 15:773-80) e ligar o anticorpo a um dentre uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol ou polioxialquilenos na maneira apresentada por exemplo, nas Patentes nº US

4.640.835; nº US 4.496.689; nº US 4.301.144; nº US 4.670.417; nº US 4.791.192; ou nº US 4.179.337.

[0338] Um anticorpo anti-Nectina-4 da presente revelação pode ser modificado também para formar moléculas quiméricas que compreendem um anticorpo anti-Nectina-4 fundido em um outro polipeptídeo ou sequência de aminoácidos heterólogo, por exemplo, uma etiqueta de epítopo (consultar, por exemplo, Terpe, 2003, Appl. Microbiol. Biotechnol.60:523 a 33) ou a região Fc de uma molécula de IgG (consultar, por exemplo, Aruffo, Anticorpo Fusion Proteins 221 a 42 (Chamow e Ashkenazi eds., 1999)).

[0339] Também são fornecidos no presente documento proteínas de fusão que compreendem um anticorpo fornecido no presente documento que se liga a um antígeno da Nectina-4 e um polipeptídeo heterólogo. Em algumas modalidades, o

[0340] polipeptídeo heterólogo no qual o anticorpo é fundido é útil para direcionar o anticorpo para células que têm Nectina-4 expressada na superfície celular.

[0341] Também são fornecidos no presente documento painéis de anticorpos que se ligam a um antígeno da Nectina-4. Em modalidades específicas, os painéis de anticorpos têm taxas de associação diferentes, taxas de associação diferentes, afinidades diferentes para um antígeno da Nectina-4 e/ou especificidades diferentes para um antígeno da Nectina-4. Em algumas modalidades, os painéis compreendem ou consistem em aproximadamente 10, aproximadamente 25, aproximadamente 50, aproximadamente 75, aproximadamente 100, aproximadamente 125, aproximadamente 150, aproximadamente 175, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 350, aproximadamente 400, aproximadamente 450, aproximadamente 500, aproximadamente 550, aproximadamente 600, aproximadamente 650, aproximadamente 700, aproximadamente 750, aproximadamente 800,

aproximadamente 850, aproximadamente 900, aproximadamente 950 ou aproximadamente 1000 anticorpos ou mais. Os painéis de anticorpos podem ser usados, por exemplo, em placas de 96 poços ou de 384 poços para ensaios, como ELISAs. 22. Preparação de Anticorpos anti-Nectina-4

[0342] Os anticorpos anti-Nectina-4 podem ser produzidos por cultura de células transformadas ou transfectadas com um vetor que contém anticorpo anti- Nectina-4 que codifica ácidos nucleicos.

[0343] As sequências de polinucleotídeo que codificam componentes de polipeptídeo do anticorpo da presente revelação podem ser obtidas com o uso de técnicas recombinantes padrão. As sequências de polinucleotídeo desejadas podem ser isoladas e sequenciada a partir de anticorpo que produz células, como células de hibridoma. Alternativamente, os polinucleotídeos podem ser sintetizados com o uso de técnicas de sintetizador de nucleotídeo ou de PCR. Uma vez obtidas, as sequências que codificam os polipeptídeos são inseridas em um vetor recombinante capaz de replicar e expressar polinucleotídeos heterólogos em células hospedeiras.

Muitos vetores que estão disponíveis e são conhecidos na técnica podem ser usados com o propósito da presente revelação. A seleção de um vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho dos ácidos nucleicos a serem inseridos no vetor e da célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. As células hospedeiras adequadas para expressar anticorpos da presente revelação incluem procarióticas, como Archaebacteria e Eubacteria, incluindo organismos Gram- negativos ou Gram-positivos, micróbios eucarióticos, como fungos filamentosos ou levedura, células invertebradas, como células de inseto ou de planta e células vertebradas, como linhas de célula hospedeira mamífera. As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão descritos acima e cultivadas em meio nutricional convencional modificado conforme apropriado para induzir os promotores, selecionando transformantes ou amplificando os genes que codificam as sequências desejadas. Os anticorpos produzidos pelas células hospedeiras são purificados com o uso de métodos de purificação de proteína padrão conforme conhecido na técnica.

[0344] Os métodos para produção de anticorpo incluindo construção, expressão e purificação de vetor são descritos adicionalmente em Plückthun et al., Anticorpo Engineering: Producing anticorpos in Escherichia coli: From PCR to fermentation 203 a 52 (McCafferty et al. eds., 1996); Kwong e Rader, E. coli Expression e Purification of Fragments Fab de Antibody, in Current Protocols in Protein Science (2009); Tachibana e Takekoshi, Production of Anticorpo Fragments Fab in Escherischia coli, in Anticorpo Expression e Production (Al-Rubeai ed., 2011); e Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed., 2009).

[0345] Obviamente, contempla-se que métodos alternativos, que são bem conhecidos na técnica, podem ser empregados para preparar anticorpos anti- Nectina-4. Por exemplo, a sequência de aminoácidos apropriada ou porções da mesma pode ser produzida por síntese de peptídeo direta com o uso de técnicas de fase sólida (consultar, por exemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1969); e Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc.85:2149 a 54). A síntese de proteína in vitro pode ser realizada com o uso de técnicas atuais ou por automação. Várias porções do anticorpo anti-Nectina-4 podem ser sintetizadas quimicamente de modo separado e combinadas com o uso de métodos químicos e enzimáticos para produzir o anticorpo anti-Nectina-4 desejado. Alternativamente, os anticorpos podem ser purificados a partir de células ou fluidos corporais, como leite, de um animal transgênico manipulado para expressar o anticorpo conforme revelado, por exemplo, nas Patentes nº US 5.545.807 e nº US 5.827.690.

23. Imunoconjugados

[0346] A presente revelação fornece ainda conjugados que compreendem qualquer um dos anticorpos anti-Nectina-4 da presente revelação ligados covalentemente por um conector sintético a um ou mais agentes sem anticorpo.

[0347] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos no presente documento são conjugados ou fundidos de modo recombinante, por exemplo, para uma molécula de diagnóstico ou detectável. Os anticorpos conjugados ou fundidos de modo recombinante podem ser úteis, por exemplo, para monitorar ou gerar um prognóstico do início, desenvolvimento, progressão e/ou gravidade de uma doença mediada pela Nectina-4.

[0348] Tal diagnóstico e detecção podem ser realizados, por exemplo, por acoplamento do anticorpo a substâncias detectáveis incluindo, mas não se limitam a, várias enzimas, como, mas não se limitam, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou acetilcolinesterase; grupos prostéticos, como, mas não se limitam a, estreptavidina/biotina ou avidina/biotina; materiais fluorescentes, como, mas não se limita a, umbelliferona, fluoresceina, isocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloreto de dansila ou ficoeritrina; materiais luminescentes, como, mas não se limitam a, luminol; materiais bioluminescentes, como, mas não se limitam a, luciferase, luciferina ou aequorina; material quimioluminescente, como, mas não se limitam a, um acrinídio co0m base no composto ou em um HALOTAG; materiais radioativos, como, mas não se limitam a, iodo (131I, 125I, 123I e 121I,), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (115In, 113In, 112In e 111In), tecnécio (99Tc), tálio (201Ti), gálio (68Ga e 67Ga), paládio (103Pd), molibidênio (99Mo), xenônio (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn ou 117Sn; metais emissores de pósitrons com o uso de tomografias de emissão; e íons metálicos paramagnéticos não radioativos.

[0349] Também são fornecidos no presente documento os anticorpos que são fundidos de modo recombinante ou conjugados quimicamente (conjugações covalentes ou não covalentes) para um proteína ou polipeptídeo heterólogo (ou fragmento do mesmo, por exemplo, para um polipeptídeo de aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90 ou aproximadamente 100 aminoácidos) para gerar proteínas de fusão, assim como usos dos mesmos. Em particular, são fornecidas proteínas de fusão que compreendem um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo fornecido no presente documento (por exemplo, um fragmento Fab, fragmento Fc, fragmento Fv, fragmento F(ab)2, um domínio de VH, uma CDR de VH, um domínio de VL ou uma CDR de VL) e a proteína, o polipeptídeo ou o peptídeo heterólogo. Em uma modalidade, a proteína, o polipeptídeo ou o peptídeo heterólogo que o anticorpo é fundido para ser útil para direcionar o anticorpo para um tipo de célula particular, como uma célula que expressa Nectina-4. Por exemplo, um anticorpo que se liga a um receptor de superfície celular expressado por um tipo de célula particular pode ser fundido ou conjugado com um anticorpo modificado fornecido no presente documento.

[0350] Além disso, os anticorpos fornecidos no presente documento podem ser fundidos para um marcador ou sequências de “etiqueta”, como um peptídeo, para facilitar a purificação. Em modalidades específicas, o marcador ou a sequência de aminoácidos de etiqueta é um peptídeo de hexa-histidina, como a etiqueta fornecida em um vetor pQE (consultar, por exemplo, QIAGEN, Inc.), dentre outros, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis. Por exemplo, conforme descrito em Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:821 a 24, a hexa-histidina fornece purificação conveniente da proteína de fusão. Outras etiquetas de peptídeo úteis para purificação incluem, mas não se limitam a, a etiqueta de hemaglutinina

(“HA”), que correspondem a um epítopo derivado da proteína de hemaglutinina influenza (Wilson et al., 1984, Cell 37:767 a 78), o peptídeo de ligação de estreptavidina/avidina e a etiqueta de “SINALIZADORA”.

[0351] Métodos para fundir ou conjugar partes (incluindo polipeptídeos) com anticorpos são conhecidos (consultar, por exemplo, Arnon et al., Monoclonals Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy, in Monoclonals Antibodies e Cancer Therapy 243-56 (Reisfeld et al. eds., 1985); Hellstrom et al., Antibodies for Drug Delivery, in Controlled Drug Delivery 623-53 (Robinson et al. eds., 2ª ed.1987); Thorpe, Antibodies Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review, in Monoclonals Antibodies: Biological e Clinical Applications 475-506 (Pinchera et al. eds., 1985); Analysis, Results e Future Prospective of the Terapêutico Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy, in Monoclonals Antibodies for Cancer Detectamion e Therapy 303-16 (Baldwin et al. eds., 1985); Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev.62:119-58; Patentes nº US 5.336.603; nº US

5.622,929; nº US 5.359,046; nº US 5.349,053; nº US 5.447.851; nº US 5.723.125; nº US 5.783.181; nº US 5.908.626; nº US 5.844.095; e nº US 5.112.946; nº US EP

307.434; nº US 367.166; nº US EP 394.827; publicações de PCT WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631 e WO 99/04813; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 88: 10535 a 39; Traunecker et al., 1988, Nature, 331:84- 86; Zheng et al., 1995, J. Immunol.154:5590 a 600; e Vil et al., 1992, Proc. Natl.

Acad. Sci. EUA 89:11337 a 41).

[0352] As proteínas de fusão podem ser geradas, por exemplo, através das técnicas de embaralhamento de gene, embaralhamento de motivos, embaralhamento de exão e/ou embaralhamento de códon (chamado coletivamente de “embaralhamento de DNA”). O embaralhamento de DNA pode ser empregado para alterar as atividades de anticorpos anti-Nectina-4 conforme fornecido no presente documento, incluindo, por exemplo, anticorpos com altas afinidades baixas taxas de dissociação (consultar, por exemplo, Patentes nº US 5.605.793; nº US

5.811.238; nº US 5.830.721; nº US 5.834.252; e nº US 5.837.458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol.8:724 a 33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol.16(2):76 a 82; Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol.287:265-76; e Lorenzo e Blasco, 1998, Biotécnicas24(2):308 a 13). Os anticorpos ou os anticorpos codificados podem ser alterados ao serem submetidos à mutagênese aleatória por PCR propenso ao erro, a inserção de nucleotídeo aleatória ou outros métodos antes da recombinação. Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo fornecido no presente documento pode ser recombinado com um ou mais componentes, motivos, seções, partes, domínios, fragmentos etc. de uma ou mais moléculas heterólogas.

[0353] Um anticorpo fornecido no presente documento pode ser conjugado também com um segundo anticorpo para formar um anticorpo heteroconjugado conforme descrito, por exemplo, na Patente nº US 4 676.980

[0354] Os anticorpos que se ligam à Nectina-4 conforme fornecido no presente documento podem ser fixos a suportes sólidos, que são particularmente úteis para ensaios imunológicos ou purificação do antígeno alvo. Tais suportes sólidos incluem, mas não se limitam a, vidro, celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, cloreto de polivinila ou polipropileno.

[0355] O conector pode ser “conector clivável” que facilita a liberação do agente conjugado na célula, mas conectores não cliváveis são contemplados também no presente documento. Os conectores para uso nos conjugados da presente revelação incluem, sem limitação, conectores lábeis a ácido (por exemplo, conectores de hidrazona), conetores que contém dissulfeto, conectores sensíveis a peptidase (por exemplo, conectores de peptídeo que compreendem aminoácidos, por exemplo, valina e/ou citrulina, como citrulina-valina ou fenilalanina-lisina), conectores fotolábeis, conectores de dimetila (consultar, por exemplo, Chari et al., 1992, Cancer Res.52:127 a 31; e Patente nº US 5.208.020), conectores de tioéter ou conectores hidrofílicos projetados para evitar resistência mediada por transportador de múltiplos fármacos (consultar, por exemplo, Kovtun et al., 2010, Cancer Res.

70:2528 a 37).

[0356] Os conjugados do anticorpo e agente podem ser feitos com o uso de uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncional, como BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB e SVSB (benzoato de succimidila (4-vinilsulfona)). A presente revelação contempla adicionalmente que os conjugados de anticorpos e agentes podem ser preparados com o uso de quaisquer métodos adequados conforme revelado na técnica (consultar, por exemplo, Bioconjugate Techniques (Hermanson ed., 2ª ed.

2008)).

[0357] As estratégias de conjugação convencional para anticorpos e agentes tiveram como base químicas de conjugação aleatória que envolvem o grupo ε-amino de resíduos Lys ou o grupo tiol de resíduos Cys, que resultam em conjugados heterólogos. As técnicas recentemente desenvolvidas permitem conjugação específica de local com anticorpos, resultando em carga homogênea e evitando subpopulações de conjugado com ligação de antígeno ou farmacocinétios alterados.

Esses incluem a manipulação de “tiomabs” que compreendem substituições de cisteína em posições nas cadeias pesadas e leves que fornecem grupos de tiol reativos e não rompem a dobra e a montagem de imunoglobulina ou alteram ligação do antígeno (consultar, por exemplo, Junutula et al., 2008, J. Immunol. Meth.332 41a 52; e Junutula et al., 2008, Nature Biotechnol.26:925 a 32). Em outro método, selenocisteína é inserida de modo cotranslacional em uma sequência de anticorpo por recodificação do códon de parada UGA a partir da terminação a inserção de selenocisteína, permitindo a conjugação covalente específica de lugar no grupo nucleofílico de selenol de selenocisteína presença dos outros aminoácidos naturais

(consultar, por exemplo, Hofer et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 105:12451 a 56; e Hofer et al., 2009, Biochemistry 48(50):12047 a 57).

[0358] Em outras modalidades, são fornecidos no presente documento anticorpos conjugados ou fundidos de modo recombinante para uma fração terapêutica (ou uma ou mais frações terapêuticas). O anticorpo pode ser conjugado ou fundido de modo recombinante em uma fração terapêutica, como uma citotoxina, por exemplo, um agente citostático ou citocidal, um agente terapêutico ou um íon metálico radioativo, por exemplo, emissores alfas. Uma citotoxina ou um agente citotóxico inclui qualquer agente que é detrimental para células. As partes terapêutico incluem, mas não se limitam a, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina); agentes de alquilação (por exemplo, mecloretamina, tioepa cloramucila, melfalano, carmustina (BCNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cisdiclorodiamina platina (II) (DDP) e cisplatina); antraciclinas (por exemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) e doxorubicina); antibióticas (por exemplo, actinomicina d (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)); moléculas de Auristatina (por exemplo, auristatina PHE, briostatina 1 e solastatina 10; consultar Woyke et al., Antimicrob.

Agents Chemother. 46:3802 a 8 (2002), Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother.45:3580 a 4 (2001), Mohammad et al., Anticancer Drugs 12:735 a 40 (2001), Wall et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:76 a 80 (1999), Mohammad et al., Int. J. Oncol.15:367 a 72 (1999), todos os quais são incorporados a título de referência no presente documento); hormônios (por exemplo, glucocorticoides, progestinas, androgênios e estrogênios), inibidores de enzima de reparo de DNA (por exemplo, etoposídeo ou topotecano), inibidores de quinase (por exemplo, composto ST1571, mesilato de imatinibe (Kantarjian et al., Clin Cancer Res.8(7):2167 a 76 (2002)); agentes citotóxicos (por exemplo, paclitaxel, citocalasina

B, gramicidina D, brometo de etídeo, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, di-hidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos e esses compostos revelados nas Patentes nº US

6.245.759, nº US 6.399.633, nº US 6.383.790, nº US 6.335.156, nº US 6.271.242, nº US 6.242.196, nº US 6.218.410, nº US 6.218.372, nº US 6.057.300, nº US 6.034.053, nº US 5.985.877, nº US 5.958.769, nº US 5.925.376, nº US 5.922.844, nº US

5.911.995, nº US 5.872.223, nº US 5.863.904, nº US 5.840.745, nº US 5.728.868, nº US 5.648.239, nº US 5.587.459); inibidores de farnesil transferase (por exemplo, R115777, BMS-214662 e esses revelados, por exemplo, pelas Patentes nº US:

6.458.935, 6.451.812, 6.440.974, 6.436.960, 6.432.959, 6.420.387, 6.414.145,

6.410.541, 6.410.539, 6.403.581, 6.399.615, 6.387.905, 6.372.747, 6.369.034,

6.362.188, 6.342.765, 6.342.487, 6.300.501, 6.268.363, 6.265.422, 6.248.756,

6.239.140, 6.232.338, 6.228.865, 6.228.856, 6.225.322, 6.218.406, 6.211.193,

6.187.786, 6.169.096, 6.159.984, 6.143.766, 6.133.303, 6.127.366, 6.124.465,

6.124.295, 6.103.723, 6.093.737, 6.090.948, 6.080.870, 6.077.853, 6.071.935,

6.066.738, 6.063.930, 6.054.466, 6.051.582, 6.051.574 e 6.040.305); inibidores de topoisomerase (por exemplo, camptotecina; irinotecano; SN-38; topotecano; 9- aminocamptotecina; GG-211 (GI 147211); DX-8951f; IST-622; rubitecano; pirazoloacridina; XR-5000; saintopina; UCE6; UCE1022; TAN-1518A; TAN 1518B; KT6006; KT6528; ED-110; NB-506; ED-110; NB-506; e rebecamicina); bulgareina; aglutinantes de sulcos menores de DNA, como corante Hoescht 33342 e corante Hoechst 33258; nitidina; fagaronina; epiberberina; coralina; beta-lapacona; BC-4-1; bisfosfonatos (por exemplo, alendronato, cimadronte, clodronato, tiludronato, etidronato, ibandronato neridronato olpandronato risedronato piridronato pamidronato, zolendronato) inibidores de HMG-CoA reductase, (por exemplo,

lovastatina, simvastatina, atorvastatina, pravastatina, fluvastatina, estatina, cerivastatina, lescol, lupitor, rosuvastatina e atorvastatina); oligonucleotídeos antisenso (por exemplo, esses revelados nas Patentes nº US 6.277.832, nº US

5.998.596, nº US 5.885.834, nº US 5.734.033 e nº US 5.618.709); inibidores de adenosina deaminase (por exemplo, fosfato de Fludarabina e 2- Clorodeoxiadenosina); ibritumomabe tiuxetano (Zevalin®); tositumomabe (Bexxar®)) e sais, solvatos, clatratos e pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

[0359] Adicionalmente, um anticorpo fornecido no presente documento pode ser conjugado ou fundido de modo recombinante em uma fração terapêutica ou fração de fármaco que modifica uma determinada resposta biológica. As frações terapêuticas ou frações de fármaco não devem ser interpretadas como limitadas a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a fração de fármaco pode ser uma proteína, peptídeo ou polipeptídeo que possui uma atividade biológica desejada.

Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina, como abrina, ricina A, pseudomonas exotoxina, toxina de cólera ou toxina de difteria; uma proteína, como fator de necrose tumoral, interferon γ, interferon α, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento de derivado de plaquetas, ativador de plasminogênio de tecido, um agente apoptótico, por exemplo, TNF-γ, TNF-γ, AIM I (consultar, Publicação Internacional nº WO 97/33899), AIM II (consultar, Publicação Internacional nº WO 97/34911), Ligante Fas (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567 a 1574) e VEGF (consultar, Publicação Internacional nº WO 99/23105), um agente anti-antigiogênico, por exemplo, angiostatina, endostatina ou um componente da trajetória de coagulação (por exemplo, fator de tecido); ou, um modificador de resposta biológica, como, por exemplo, uma linfocina (por exemplo, interferon gama, interleucina-1 (“IL- 1”), interleucina-2 (“IL-2”), interleucina-5 (“IL-5”), interleucina-6 (“IL-6”), interleucina-7 (“IL-7”), interleucina 9 (“IL-9”), interleucina-10 (“IL-10”), interleucina-12 (“IL-12”), interleucina-15 (“IL-15”), interleucina-23 (“IL-23”), fator de estímulo de colônia de macrófago de granulócito (“GM-CSF”) e fator de estímulo de colônia de granulócito (“G-CSF” )) ou um fator de crescimento (por exemplo, hormônio de crescimento (“GH”)) ou um agente de coagulação (por exemplo, cálcio, vitamina K, fatores de tecido, como, mas não se limita a, fator de Hageman (factor XII), cininogênio de alto peso molecular (HMWK), pré-calicreina (PK), fatores de proteínas de coagulação II (protrombina), fator V, XIIa, VIII, XIIIa, XI, XIa, IX, IXa, X, fosfolipídeo e monômero de fibrina).

[0360] A fração ou fármaco terapêutico conjugado ou fundido de modo recombinante em um anticorpo fornecido no presente documento que se liga de forma imunoespecífica a um antígeno da Nectina-4 deve ser escolhido para alcançar o efeito profilático ou terapêutico desejado (ou efeitos profiláticos ou terapêuticos desejados). Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo modificado. Um médico ou equipe médica deve considerar o seguinte ao decidir em qual fração ou fármaco terapêutico conjugar ou fundir de modo recombinante em um anticorpo fornecido no presente documento: a natureza da doença, a gravidade da doença e a afecção do indivíduo.

[0361] Conforme usado no presente documento, o “conjugado de fármaco de anticorpo anti-Nectina-4” ou “ADC de anti-Nectina-4” se refere a um anticorpo anti- Nectina-4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conjugado ou fundido de modo recombinante em uma fração terapêutica (ou uma ou mais frações terapêuticas) ou um anticorpo anti-Nectina-4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conjugado ou fundido de modo recombinante em uma fração terapêutica ou fração de fármaco que modifica um determinada resposta biológica conforme descrito acima.

[0362] É fornecido no presente documento um ADC de anti-Nectina-4 incluindo um anticorpo anti-Nectina-4 que se liga especificamente à Nectina-4.

Também é fornecido no presente documento um ADC de anti-Nectina-4 incluindo anticorpo anti-Nectina-4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo fornecido no presente documento.

24. Métodos de utilização dos Anticorpos e Composições

[0363] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método de inibição (por exemplo, reduzindo a taxa de duplicação de números de células, diminuindo a taxa de aumento de números de célula ou bloqueando ou impedindo o aumento de número de célula) da proliferação de uma célula, que compreende entrar em contato com uma célula com uma quantidade eficaz de um ADC de anti- Nectina-4 fornecido no presente documento.

[0364] Em um aspecto, são fornecidos no presente documento métodos de inibição da proliferação de uma célula, que compreende entrar em contato com uma célula com um ADC de anti-Nectina-4 incluindo um anticorpo anti-Nectina-4 que se liga especificamente à Nectina-4 (por exemplo, um ECD da Nectina-4 humana ou um epítopo de um ECD da Nectina-4 humana) conforme fornecido no presente documento. Em certas modalidades, a célula entra em contato com uma quantidade eficaz de um ADC de anti-Nectina-4 conforme é descrito no presente documento.

Em algumas modalidades, o ADC de anti-Nectina-4 se liga a um ECD da Nectina-4 humana. Em algumas modalidades, o ADC de anti-Nectina-4 se liga a um epítopo de um ECD da Nectina-4 humana. Em certas modalidades, o ADC de anti-Nectina-4 se liga de forma específica a um epítopo de um ECD da Nectina-4 humana que é distinto do sítio de ligação do ligante da Nectina-4. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 10%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 15%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 20%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 25%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 30%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 35%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 40%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 45%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 50%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 55%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 60%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 65%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 70%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 75%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 80%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 85%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 90%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 95%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 98%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 99%. Em algumas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 100%. Em certas modalidades, a proliferação de uma célula é inibida em pelo menos aproximadamente 25% to aproximadamente 65%. Em modalidades específicas, a inibição da proliferação de uma célula é avaliada por métodos descritos no presente documento.

Em algumas modalidades, a inibição da proliferação de uma célula é avaliada por métodos conhecidos por um elemento versadona técnica.

Em certas modalidades, a inibição da proliferação de uma célula é relativa à inibição da proliferação de uma célula que não está em contato com um ADC de anti-Nectina-4. Em certas modalidades, a inibição da proliferação de uma célula é relativa à inibição da proliferação de uma célula que está em contato com um anticorpo não relacionado (por exemplo, um anticorpo que não se liga especificamente à Nectina-4), ADC do anticorpo não relacionado ou um anticorpo de anti-Nectina-4 não conjugado.

25. Composições farmacêuticas

[0365] Em um aspecto, a presente revelação fornece adicionalmente composições farmacêuticas que compreendem pelo menos um ADC de anti-Nectina- 4 da presente revelação. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende 1) um anticorpo anti-Nectina-4 e 2) um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0366] As composições farmacêuticas que compreendem um ADC de anti- Nectina-4 são preparadas para armazenamento por mistura do ADC de anti-Nectina- 4 que tem o grau de pureza desejado com carreadores, excipientes ou estabilizadores fisiologicamente aceitáveis opcionais (consultar, por exemplo, Remington, Remington’s Pharmaceutical Sciences (18ª ed.1980)) na forma de soluções aquosas ou liofilizadas ou em outras formas secas.

[0367] Os anticorpos da presente revelação podem ser formulados em qualquer forma adequada para entregar um tecido/célula alvo, por exemplo, como microcápsulas ou macroemulsões (Remington, supra; Park et al., 2005, Molecules 10:146 a 61; Malik et al., 2007, Curr. Drug. Deliv.4:141 a 51), como formulações com liberação sustentada (Putney e Burke, 1998, Nature Biotechnol.16:153 a 57) ou em lipossomos (Maclean et al., 1997, Int. J. Oncol.11:325 a 32; Kontermann, 2006, Curr.

Opin. Mol. Ther.8:39 a 56).

[0368] Um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento pode ser preso em microcápsula preparada, por exemplo, por técnica de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsula de gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de entrega de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou in macroemulsões. Tais técnicas são reveladas, por exemplo, em Remington, supra.

[0369] Várias composições e sistemas de entrega são conhecidos e podem ser usados com um ADC de anti-Nectina-4 que se liga a Nectina-4 conforme é descrito no presente documento, incluindo, mas não se limitam a, encapsulamento em lipossomos, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de uma expressão do ADC de anti-Nectina-4, endocitose mediada por receptor(consultar, por exemplo, Wu e Wu, 1987, J. Biol. Chem.262:4429-32), construção de um ácido nucleico como parte de m vetor retroviral ou outro vetor etc.

Em outra modalidade, uma composição pode ser fornecida como uma liberação controlada ou sistema de liberação sustentada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada para alcançar liberação controlada ou sustentada (consultar, por exemplo, Langer, supra; Sefton, 1987, Crit. Ref. Biomed. Eng.14:201 a 40; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507 a 16; e Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med.321:569 a 74). Em outra modalidade, os materiais poliméricos podem ser usados para alcançar liberação controlada ou sustentada de um agente profilático ou terapêutico (por exemplo, um ADC de anti-Nectina-4 conforme é descrito no presente documento) ou uma composição fornecida no presente documento (consultar, por exemplo, Medical Applications of Controlled Release (Langer e Wise eds., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design e Performance (Smolen e Ball eds., 1984); Ranger e Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem.23:61-126; Levy et al., 1985, Science 228:190 a 92; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351 a 56; Howard et al., 1989, J. Neurosurg.71:105 a 12; Patentes nº US 5.679.377; nº US

5.916.597; nº US 5.912.015; nº US 5.989.463; e nº US 5.128.326; Publicação de

PCT nº WO 99/15154 e nº WO 99/20253). Exemplos de polímeros usados em formulações de liberação sustentada incluem, mas não se limitam a, poli(2-hidroxi etil metacrilato), poli(metil metacrilato), poli(ácido acrílico), poli(acetato de etileno-co- vinil), poli(ácido metacrílico), poliglicolídeos (PLG), polianidridos, poli(N- vinilpirrolidona), poli(álcool vinílico), poliacrilamida, poli(etileno glicol), poliactidos (PLA), poli(lactido-co-glicolidos) (PLGA) e poliortoésteres. Em uma modalidade, o polímero usado em uma formulação de liberação sustentada é inerte, livre de impurezas lixiáveis, estável no armazenamento, estéril e biodegradável.

[0370] Ainda em outra modalidade, um sistema de liberação controlada ou sustentada pode ser colocado na proximidade de um tecido alvo particular, por exemplo, as passagens nasais ou pulmões, exigindo, assim, apenas uma fração da dose sistemática (consultar, por exemplo, Goodson, Medical Applications of Controlled Release Vol.2, 115 a 38 (1984)). Sistemas de liberação controlada são discutidos, por exemplo, por Langer, 1990, Science 249:1527 a 33. Qualquer técnica conhecida por um elemento versado na técnica pode ser usada para produzir formulações de liberação sustentada que compreendem um ou mais anticorpos que se ligam à Nectina-4 conforme é descrito no presente documento (consultar, por exemplo, Patente nº US 4.526.938, Publicação de PCT nº WO 91/05548 e nº WO 96/20698, Ning et al., 1996, Radiotherapy & Oncology 39:179 a 89; Song et al., 1995, PDA J. of Pharma. Sci. & Tech.50:372 a 97; Cleek et al., 1997, Pro. Int’l. Symp.

Control. Rel. Bioact. Mater.24:853 a 54; e Lam et al., 1997, Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759 a 60).

[0371] As formulações terapêuticas que contêm um ou mais anticorpos fornecidos no presente documento podem ser preparadas para armazenamento por mistura do ADC de anti-Nectina-4 que têm o grau desejado de pureza com carreadores, excipientes ou estabilizadores fisiologicamente aceitáveis opcionais (Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os carreadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos aos recipientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem soluções tampões, como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabeno, como metil ou propil paraben; catecol; resorcinol; ciclo- hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de aproximadamente 10 resíduos) ; proteínas, como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como polivinipirrolidona; aminoácidos. como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, como EDTA; açúcares, como sucrose, manitol, trehalose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de proteína de Zn); e/ou tensoativos não iônicos, como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

[0372] Os anticorpos fornecidos no presente documento também podem ser, por exemplo, formulados em lipossomos. Os lipossomos que contêm a molécula de interesse são preparados por métodos conhecidos na técnica, como descrito em Epstein et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 82:3688; Hwang et al. (1980) Proc.

Natl. Acad. Sci. EUA 77:4030; e Patentes nº US 4.485.045 e nº US 4.544.545. Os lipossomos com tempo de circulação melhorado são revelados na Patente nº US

5.013.556.

[0373] Os imunolipossomos particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase inversa com uma composição lipídica que contém fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Os lipossomos são extrudidos através de filtros de tamanho de poro predefinidos para gerar lipossomos com o diâmetro desejado. Os fragmentos Fab’ de um ADC de anti- Nectina-4 fornecidos no presente documento podem ser conjugados com os lipossomos conforme descrito em Martin et al. (1982) J. Biol. Chem.257:286 a 288 através de uma reação de intercâmbio de dissulfeto. Um agente quimioterapêutico (como Doxorubicina) está contido opcionalmente no lipossomo; Consultar Gabizon et al., (1989) J. National Cancer Inst.81(19):1484.

[0374] As formulações, como essas descritas no presente documento, podem conter também mais de um composto ativo conforme necessário para a indicação particular que é tratada. Em certas modalidades, as formulações compreendem um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento e um ou mais compostos ativos com atividades complementares que não afetam adversamente uma à outra. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido. Por exemplo, um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento pode ser combinado com um ou mais outros agentes terapêuticos. Tal terapia combinada pode ser administrada ao paciente em série ou simultaneamente ou em sequência.

[0375] Um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento pode ser preso em microcápsula preparada, por exemplo, por técnica de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsula de gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de entrega de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou in macroemulsões. Tais técnicas são reveladas em Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.

[0376] As formulações a serem usadas para administração in vivo podem ser estéreis. Isso é realizado prontamente por filtração através de, por exemplo, membranas de filtração estéreis.

[0377] As preparações de liberação sustentada podem ser preparadas também. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o ADC de anti-Nectina-4, cujas matrizes estão na forma de artigos conformados, por exemplo, filmes ou microcápsula. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) ou poli(álcool vinílico)), poliactidos (Patente nº US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e etil-L-glutamato, acetato de etileno vinila não degradável, copolímeros de ácido lático e ácido glicólico degradáveis, como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático ou ácido glicólico e acetato de leuprolide) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Embora os polímeros, como acetato de etileno vinila e ácido lático e ácido glicólico, possibilitem a liberação de moléculas por cerca de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos.

Quando os anticorpos encapsulados permanecem no corpo por um longo tempo, os mesmos desnaturar ou agregar como um resultado de exposição à umidade a 37 °C, resultando em uma perda de atividade biológica e em possíveis alterações na imunogenicidade. As estratégias racionais podem ser desenvolvidas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se for constatado que o mecanismo de agregação é a formação de ligação intermolecular S--S através de intercâmbio de tio-dissulfeto, a estabilização pode ser alcançada por modificação de resíduos de sulfi-hidrila, liofilização a partir de soluções ácidas, controlando o teor de umidade, usando aditivos apropriadas e desenvolvimento de composições de matriz de polímero específico.

[0378] As composições farmacêuticas fornecidas no presente documento contêm quantidades terapeuticamente eficientes de um ou mais anticorpos fornecidos no presente documento e opcionalmente um ou mais profiláticos de agentes terapêuticos em um carreador farmaceuticamente aceitável. Tais composições farmacêuticas são úteis na prevenção, no tratamento, no gerenciamento ou no melhoramento de uma doença mediada pela Nectina-4 ou um ou mais sintomas da mesma.

[0379] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis para administração dos compostos fornecidos no presente documento incluem quaisquer tais carreadores conhecidos por aqueles elementos versados na técnica que são adequados para o modo particular de administração.

[0380] Adicionalmente, os anticorpos fornecidos no presente documento podem ser formulados como ingrediente ativo farmaceuticamente isolado na composição ou podem ser combinados com outros ingredientes ativos (como um ou mais outros agentes profiláticos ou terapêuticos).

[0381] As composições podem conter um ou mais anticorpos fornecidos no presente documento. Em uma modalidade, os anticorpos são formulados em preparações farmaceuticamente adequadas, como soluções, suspensões, comprimidos, comprimidos dispersíveis, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação sustentada ou elixires, para administração oral ou em soluções ou suspensões estéreis para administração parenteral assim como preparação de adesivo transdérmico e inaladores de pó seco. Em uma modalidade, os anticorpos descritos acima são formulados em composições farmacêuticas com o uso de técnicas e procedimentos bem conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Ansel (1985) Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4ª Ed., p.126).

[0382] Nas composições, concentrações eficazes de um ou mais anticorpos ou derivados dos mesmos são misturados com um carreador farmaceuticamente adequado. As concentrações dos compostos nas composições são eficazes para entrega de uma quantidade, após a administração, que trata, previne ou melhora uma doença mediada pela Nectina-4 ou um sintoma da mesma.

[0383] Em uma modalidade, as composições são formuladas para administração de dosagem única. Para formular uma composição, a fração de peso do composto é dissolvida, suspensa, dispersada e, de outro modo, misturada em um carreador selecionado em uma concentração eficaz de modo que a afecção tratada seja aliviada, prevenida ou um ou mais sintomas sejam melhorados.

[0384] Um ADC de anti-Nectina-4 é fornecido no presente documento incluído no carreador farmaceuticamente aceitável em uma quantidade eficaz suficiente para exercer um efeito farmaceuticamente útil na ausência de efeitos colaterais indesejáveis no paciente tratado. A concentração terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente por teste dos compostos em sistemas in vitro e in vivo com o uso de métodos de rotina e, então, extrapolada a partir dos mesmos para dosagens para seres humanos.

[0385] A concentração de ADC de anti-Nectina-4 na composição farmacêutica dependerá, por exemplo, das características físico-químicas do ADC de anti-Nectina-4, da programação de dosagem e da quantidade administrada assim como outros fatores conhecidos por aqueles elementos de habilidade na técnica.

[0386] Em uma modalidade, uma dosagem terapeuticamente eficaz produz uma concentração sérica de ADC de anti-Nectina-4 de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 50 a 100 µg/ml. Em outra modalidade, as composições farmacêuticas fornecem uma dosagem de aproximadamente 0.001 mg a aproximadamente 2000 mg de ADC de anti-Nectina-4 por quilograma de peso corporal por dia. As formas de unidade de dosagem farmacêutica podem ser preparadas para fornecer de aproximadamente 0,01 mg, 0,1 mg ou 1 mg a aproximadamente 500 mg, 1000 mg ou 2000 mg e, em uma modalidade, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 500 mg do ADC de anti-Nectina-4 e/ou uma combinação de outros ingredientes essenciais opcionais por forma de unidade de dosagem.

[0387] O ADC de anti-Nectina-4 pode ser administrado uma vez ou pode ser dividido em diversas doses pequenas a serem administradas em intervalos de tempo.

Entende-se que a dosagem e duração precisas é uma função da doença a ser tratada e pode ser determinada empiricamente com o uso de protocolos de teste conhecidos ou por extrapolação a partir de dados de teste in vivo ou in vitro.

Observa-se que os valores de concentrações e dosagem podem variar também com a gravidade da afecção a ser aliviada. Entende-se adicionalmente que, para qualquer indivíduo particular, regimes de dosagem específica podem ser ajustados em time de acordo com a necessidade individual e do julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições e que as faixas de concentração apresentadas no presente documento são apenas exemplificativas e não se pretende que limite o escopo ou a prática das composições reivindicadas.

[0388] Após a mistura ou adição do ADC de anti-Nectina-4, a mistura resultante pode ser uma solução, suspensão, emulsão ou similares. A forma da mistura resultante depende de diversos fatores, incluindo o modo de administração pretendido e da solubilidade do composto no carreador ou veículo selecionado. A concentração eficaz é suficiente para melhorar os sintomas da doença, distúrbio ou afecção e pode ser determinada empiricamente.

[0389] As composições farmacêuticas são fornecidas para administração aos seres humanos e animais em formas de dosagem unitária, como comprimidos, cápsulas, pilulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões parenterais estéreis e soluções ou suspensões orais e emulsões de água e óleo que contêm quantidades adequadas dos compostos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Em uma modalidade, o ADC de anti-Nectina-4 é formulado e administrado em formas de dosagem unitária ou em forma de múltiplas dosagens. As formas de dosagem unitária conforme usado no presente documento se refere a unidades adequadas fisicamente distintas para indivíduos humanos e animais e embaladas individualmente conforme é conhecido na técnica. Cada dose unitária contém uma quantidade predeterminada do ADC de anti-Nectina-4 suficiente para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carreador, veículo ou diluente farmacêutico exigido. Exemplos de formas de dose unitária incluem ampolas e seringas e comprimidos ou cápsulas embalados individualmente. As formas de dose unitária podem ser administradas em frações ou múltiplos das mesmas. Uma forma de múltiplas doses é uma pluralidade de formas idênticas de dosagem unitária embaladas em um único recipiente a serem administradas na forma de dose unitária segregada. Exemplos de formas de múltiplas doses incluem frascos, garrafas de comprimidos ou cápsulas ou garrafas de pintas ou galões. Por conseguinte, a forma de múltiplas doses é um múltiplo de doses unitárias que não são segregadas na embalagem.

[0390] Em algumas modalidades, um ou mais anticorpos anti-Nectina-4 fornecidos no presente documento estão em uma formulação farmaceuticamente líquida. As composições administráveis farmaceuticamente líquidas podem, por exemplo, ser preparadas por dissolução, dispersão ou, de outro modo, mistura de um composto ativo conforme definido acima e adjuvantes farmaceuticamente opcionais em um carreador, como, por exemplo, água, solução salina, dextrose aquosa, glicerol, glicóis, etanol e similares, para formar, por meio disso, uma solução ou suspensão. Se desejado, a composição farmacêutica a ser administrada pode conter também quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas, como agentes de umectação, agentes de emulsificação, agentes de solubilização, agente tampão de pH e similares, por exemplo, acetato, citrato de sódio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitano, acetato de trietanolamina de sódio, oleato de trietanolamina e outros tais agentes.

[0391] Os métodos reais de preparação de tais formas de dosagem são conhecidos ou estarão evidentes para aqueles elementos versados nessa técnica; por exemplo, consultar Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.

[0392] As formas ou composições de dosagem que contêm ADC de anti- Nectina-4 na faixa de 0,005% a 100% com o equilíbrio constituído de carreador não tóxico podem ser preparadas. Os métodos para preparação dessas composições são conhecidos por aqueles elementos versados na técnica.

[0393] As formas de dosagem farmaceuticamente orais são sólidas, em gel ou líquidas. As formas de dosagem sólidas são comprimidos, cápsulas, grânulos e pós a granel. Os tipos de comprimidos orais incluem pastilhas e comprimidos compactados e mastigáveis e que podem ser com revestimento entérico, com revestimento de açúcar ou com revestimento de filme. As cápsulas podem ser cápsulas de gelatina duras ou macias, enquanto grânulos e pós podem ser fornecidos na forma não efervescente ou efervescente com a combinação de outros ingredientes conhecidos por aqueles elementos versados na técnica.

[0394] Em certas modalidades, as formulações são formas de dosagem sólidas. Em certas modalidades, as formulações são cápsulas ou comprimidos. Os comprimidos, as pilulas, as cápsulas, os trobiscos e similares podem conter um ou mais dos ingredientes a seguir ou compostos de uma natureza similar: um aglutinante; um lubrificante; um diluente; um deslizante; um agente de desintegração; um agente de coloração; um agente adoçante; um agente saborizante; um agente de umectação; um revestimento emético; e um revestimento de filme. Exemplos de aglutinantes incluem celulose microcristalina, goma traga- canta, solução de glucose, mucilagem de acácia, solução de gelatina, melado, polvinilpirrolidina, povidona, crospovidonas, sucrose e pasta de amido. Os lubrificantes incluem talco, amido, estearato de magnésio ou cálcio, licopódio e ácido esteárico. Os diluentes incluem, por exemplo, lactose, sucrose, amido, caulim, sal, manitol e fosfato de dicálcio. Os deslizantes incluem, mas não se limitam a, dióxido de silício coloidal. os agentes de desintegração incluem croscarmelose sódica, glicolato de amido de sódio, ácido algínico, amido de milho, amido de batata, bentonita, metilcelulose, ágar e carboximetilcelulose. Os agentes de coloração incluem, por exemplo, qualquer um dos corantes FD e C solúveis em água cerificados aprovados, misturas dos mesmos; e corantes FD e C insolúveis em água suspensos em hidrato de alumina. Os agentes adoçantes incluem sucrose, lactose, manitol e agentes adoçantes artificiais, como sacarina e qualquer número de sabores secos de aspersão. Os agentes saborizantes incluem sabores naturais extraídos de plantas, como frutas e misturas sintéticas de compostos que produzem uma sensação de prazer, como, mas não se limita a hortelã picante e salicilato de metila. Os agentes de umectação incluem monoestearato de propileno glicol, mono- oleato de sorbitano, monolaurato de dietileno glicol e éter laural de polioxipropileno.

Os revestimentos eméticos incluem ácidos graxos, gorduras, ceras, goma-laca, goma-laca amoniada e ftalatos de acetato de celulose. Os revestimentos de filme incluem hidroxietilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, polietileno glicol 4000 e ftalato de acetato de celulose.

[0395] Os anticorpos podem ser fornecidos em uma composição que protege os mesmos do ambiente ácido do estômago. Por exemplo, a composição pode ser formulada em um revestimento entérico que mantém sua integridade no estômago e libera o composto ativo no intestino. A composição pode ser formulada em combinação com um antiácido ou outro tal ingrediente.

[0396] Quando a forma de unidade de dosagem é uma cápsula, a mesma contém, além de material do tipo acima, um carreador líquido, como um óleo graxo.

Além disso, as formas de unidade de dosagem contêm vários outros materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem, por exemplo, revestimentos de açúcar e outros agentes entéricos. Os compostos podem ser administrados também como um componente de um elixir, uma suspensão, um xarope, uma pastilha, difusor, goma de mascar ou similares. Um xarope pode conter, além dos compostos ativos, sucrose como um agente adoçante e certos conservantes, corantes e colorações e sabores.

[0397] O ADC de anti-Nectina-4 pode ser misturado também com outros materiais ativos que não prejudicam a ação desejada ou com materiais que complementam a ação desejada, como antiácidos, bloqueadores de H2 e diuréticos. O ingrediente ativo é um ADC de anti-Nectina-4 ou derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo conforme é descrito no presente documento. Altas concentrações até aproximadamente 98% em peso do ingrediente ativo podem ser incluídas.

[0398] Em todas as modalidades, as formulações de comprimidos e cápsulas podem ser revestidas conforme conhecido por aqueles elementos versados na técnica a fim de modificar ou sustentar a dissolução do ingrediente ativo.

Assim, por exemplo, as mesmas podem ser revestidas com um revestimento digestível entericamente convencional, como fenilsalicilato, ceras e ftalato de acetato de celulose.

[0399] Em algumas modalidades, as formulações são formas de dosagem líquidas. As formas de dosagem líquidas incluem soluções, emulsões, suspensões, soluções e/ou suspensões reconstituídas a partir de grânulos não efervescentes e preparações efervescentes reconstituídas a partir de grânulos efervescentes. As soluções aquosas incluem, por exemplo, elixires e xaropes. As emulsões são óleo em água ou água em óleo.

[0400] Os elixires são preparações transparentes, adoçadas e hidroalcoólicas. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis usado em elixires incluem solventes. Os xaropes são soluções aquosas concentradas de um açúcar,

por exemplo, sucrose e pode conter um conservante. Uma emulsão é um sistema bifásico no qual um líquido é dispersado na forma de glóbulos pequenos por um outro líquido. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis usados em emulsões são não aquosos, emulsificando agentes e conservantes. As suspensões usam agentes e conservantes em suspensão farmaceuticamente aceitáveis. A substâncias farmaceuticamente aceitáveis usadas em grânulos não efervescentes para serem reconstituídas em uma forma de dosagem oral líquida, incluem agentes diluentes, adoçantes e de umectação. As substâncias farmaceuticamente aceitáveis usadas em grânulos efervescentes para serem reconstituídas em uma forma de dosagem oral líquida incluem ácidos orgânicos e uma fonte de dióxido de carbono. Os agentes de coloração e saborização são usados em todas as formas de dosagem acima.

[0401] Os solventes incluem glicerina, sorbitol, álcool etílico e xarope.

Exemplos de conservantes incluem glicerina, metil e propil parabeno, ácido benzoico, benzoato de sódio e álcool. Exemplos de líquidos não aquosos utilizados em emulsões incluem óleo mineral e óleo de semente de algodão. Exemplos de agentes de emulsificação incluem gelatina, acácia, tragacanto, bentonita e tensoativos, como mono-oleato de polioxietileno sorbitano. Os agentes de suspensão incluem carboximetilcelulose de sódio, pectina, tragacanto, Veegum e acácia. Os agentes adoçantes incluem sucrose, xaropes, glicerina e agentes adoçantes artificiais, como sacarina. Os agentes de umectação incluem monoestearato de propileno glicol, mono-oleato de sorbitano, monolaurato de dietileno glicol e éter laural de polioxietileno. Os ácidos orgânicos incluem ácido cítrico e tartárico. As fontes de dióxido de carbono incluem bicarbonato de sódio e carbonato de sódio. Os agentes de coloração incluem qualquer um dos corantes FD e C solúveis em água certificados e aprovados e misturas dos mesmos.

[0402] Os agentes de saborização incluem sabores naturais extraídos de plantas, tais frutas e misturas sintetizadas de compostos que produzem uma sensação de gosto de prazer.

[0403] Para uma forma de dosagem sólida, a solução ou suspensão em, por exemplo, carbonato de propileno, óleos vegetais ou triglicerídeos é, em uma modalidade, encapsulada em uma cápsula de gelatina. Tais soluções e a preparação e o encapsulamento da mesma são revelados na Patente n° US 4.328.245; n° US

4.409.239; e n° US 4.410.545. Para uma forma de dosagem líquida, a solução, por exemplo, em um polietileno glicol, pode ser diluída com uma quantidade suficiente de um carreador líquido farmaceuticamente aceitável, por exemplo, água, para ser medida facilmente para administração.

[0404] Alternativamente, as formulações orais líquidas e semi sólidas podem ser preparadas por dissolução ou dispersão do composto ativo ou al em óleos vegetais, glicóis, triglicerídeos, ésteres de propileno glicol (por exemplo, carbonato de propileno) e outros tais carreadores e por encapsulamento dessas soluções ou suspensões em invólucro de cápsula de gelatina. Outras formulações úteis incluem essas apresentadas nas Patentes n° US. RE28.819 e 4.358.603. Brevemente, tais formulações incluem, mas não se limitam a, essas que contém um composto fornecido no presente documento, um mono- ou poli-alquileno glicol dialquilatado, incluindo, mas não se limita a, 1,2-dimetoximetano, diglima, triglima, tetraglima, éter polietileno glicol-350-dimetílico, éter polietileno glicol-550-dimetílico, éter polietileno glicol-750-dimetílico em que 350, 550 e 750 referem-se ao peso molecular médio aproximado do polietileno glicol e um ou mais antioxidantes, como hidroxitolueno butilado (BHT), hidroxianisole butilado (BHA), galato de propila, vitamina E, hidroquinona, hidroxicumarinas, etanolamina, lecitina, cefalina, ácido ascórbico, ácido málico, sorbitol, ácido fosfórico, ácido tiodipropiônico e seu ésteres e ditiocarbamatos.

[0405] Outras formulações incluem, mas não se limitam a, soluções alcoólicas aquosas incluindo um acetal farmaceuticamente aceitável. Os álcoois usados nessas formulações são quaisquer solventes miscíveis em água farmaceuticamente aceitáveis que têm um ou mais grupos hidroxilas incluindo, mas não se limita a, propileno glicol e etanol. Os acetais incluem, mas não se limitam a, os acetais de di(alquila inferior) de aldeídos de alquila inferior, como acetal de acetaldeído de dietil.

[0406] Em uma modalidade, a administração parenteral que é caracterizada por injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa é contemplada também no presente documento. As administrações injetáveis podem ser preparadas de formas convencionais, como soluções líquidas ou suspensões, as formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção ou para emulsões. As administrações injetáveis, soluções e emulsões contêm também um ou mais excipientes. Os excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol ou etanol. Além disso, se desejado, as composições farmacêuticas a serem administradas podem conter também quantidade menores de substâncias auxiliares não tóxicas. como agentes de umectação ou de emulsificação, agentes tampão de pH, estabilizadores, melhoradores de solubilidade e outros tais agentes, como, por exemplo, acetato de sódio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina e ciclodextrinas.

[0407] Contempla-se também a implantação de um sistema de liberação lenta ou de liberação sustentada de modo que que um nível constante de dosagem seja mantido (consultar, por exemplo, Patente nº US 3.710.795) no presente documento. Brevemente, um composto fornecido no presente documento é dispersado em uma matriz interna sólida, por exemplo, polimetilmetacrilato, polibutilmetacrilato, cloreto de polivinila plastificado ou não plastificado, náilon plastificado, tereftalato de polietileno plastificado, borracha natural, poli-isopreno,

poli-isobutileno, poli-butadieno, polietileno, copolímeros de acetato de etileno vinila, borrachas de silicone, polidimetilsiloxanos, copolímeros de carbonato de silicone, polímeros hidrofílicos, como hidrogéis de ésteres de ácido acrílico e metacrílico, colágeno, álcool de polivinílicos reticulados e acetato de polivinila hidrolizado parcialmente reticulado, que é circundado por uma membrana polimérica externa, por exemplo, polietileno, polipropileno, copolímeros de etileno/propileno, copolímeros de etileno/etila, copolímeros de acetato de etileno/vinila, borrachas de silicone, polidimetil siloxanos, borracha de neopreno, polietileno clorado, cloreto de polivinila, copolímeros de cloreto de vinila com acetato de vinila, cloreto de vinilideno, etileno e propileno, ionômero de tereftalato de polietileno, borracha butílica borrachas de epicloro-hidrina, copolímero de etileno/álcool vinílico, terpolímero de etileno/acetato de vinila/álcool vinílico e copolímero de etileno/viniloxietanol, que é insolúvel em fluidos corporais. O ADC de anti-Nectina-4 se difunde através da membrana polimérica externa etapa de controle de taxa de liberação. A quantidade de ADC de anti-Nectina-4 contida em tais composições parenterais é altamente dependente da natureza específica das mesmas assim como da atividade do composto e das necessidades do indivíduo.

[0408] As preparações para administração parenteral incluem soluções estéreis prontas para injeção, produtos solúveis secos, como pós liofilizados, prontos para serem combinados com um solvente imediatamente antes do uso, incluindo comprimidos hipodérmicos, suspensões estéreis prontas para injeção, produtos insolúveis secos estéreis prontos para serem combinados com um veículo imediatamente antes do uso e emulsões estéreis. As soluções podem ser aquosas ou não aquosas.

[0409] Se administrados de modo intravenoso, os carreadores adequados incluem soluções salinas fisiológicas ou solução salina tampão de fosfato (PBS) e soluções que contêm agentes de espessamento e de solubilização, como glucose, polietileno glicol e polipropileno glicol e misturas dos mesmos.

[0410] os carreadores farmaceuticamente aceitáveis usados em preparações parenterais incluem veículos aquosos, veículos não aquosos, agentes antimicrobianos, agentes isotônicos, soluções tampões, antioxidantes, anestésicos locais, agentes de suspensão e de dispersão, agentes de emulsificação, agentes sequestrantes ou quelantes e outras substâncias farmaceuticamente aceitáveis.

[0411] Exemplos de veículos aquosos incluem Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringers, Injeção de Dextrose Isotônica, Injeção de Água Estéril, Dextrose e Injeção de Ringers Lactada. Os veículos parenterais não aquosos incluem óleos fixos de origem vegetal, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de gergelim e óleo de amendoim. Os agentes antimicrobianos em concentrações bacteriostáticas ou fungistáticas podem ser adicionados a preparações parenterais embaladas em recipientes com múltiplas doses que incluem fenóis ou cresóis, mercuriais, álcool benzílico, clorobutanol, ésteres de ácido metil e propil p- hidroxibenzoico, timerosal, cloreto de benzalcônio e cloreto de benzetônio. Os agentes isotônicos incluem cloreto de sódio e dextrose. As soluções tampões incluem fosfato e citrato. Os antioxidantes incluem bissulfato de sódio. Os anestésicos locais incluem cloridrato de procaína.

[0412] Os agentes de suspensão e dispersão incluem carboximetilcelulose de sódio, hidroxipropil metilcelulose e polivinilpirrolidona. Os agentes de emulsificação incluem Polisorbato 80 (TWEEN ^ 80). Um agente sequestrante ou quelante de íons metálicos inclui EDTA. Os carreadores farmacêuticos incluem álcool etílico, polietileno glicol e propileno glicol para veículos miscíveis em água; e hidróxido de sódio, ácido hidroclórico, ácido cítrico ou ácido lático para ajuste de pH.

[0413] A concentração do composto farmaceuticamente ativo é ajustada de modo que uma injeção forneça uma quantidade eficaz para produzir o efeito farmacológico desejado. A dose exata depende da idade, do peso e da afecção do paciente ou animal conforme é conhecido na técnica.

[0414] As preparações parenterais de dose unitária podem ser embaladas em uma ampola, um frasco ou uma seringa com uma agulha. Todas as preparações para administração parenteral podem ser estéreis conforme é conhecido e praticado na técnica.

[0415] Ilustrativamente, a infusão intravenosa ou intra-arterial de uma solução aquosa estéril que contém um composto ativo é um modo de administração eficaz. Uma outra modalidade consiste em uma solução aquosa estéril ou solução ou suspensão oleosa que contém um material ativo injetado conforme necessário para produzir o efeito farmacológico desejado.

[0416] As administrações injetáveis são projetadas para administração local e sistêmica. Em uma modalidade, uma dosagem terapeuticamente eficaz é formulada para conter uma concentração de pelo menos aproximadamente 0,1% p/p até aproximadamente 90% p/p ou mais, em certas modalidades, mais de 1% p/p do composto ativo para o tecido tratado (ou tecidos tratados).

[0417] O ADC de anti-Nectina-4 pode ser suspenso na forma micronizada ou outra forma adequada. A forma da mistura resultante depende de diversos fatores, incluindo o modo de administração pretendido e da solubilidade do composto no carreador ou veículo selecionado. A concentração eficaz é suficiente para melhorar os sintomas da afecção e pode ser determinada empiricamente.

[0418] Em outras modalidades, as formulações farmacêuticas são pós liofilizados que podem ser reconstituídos para administração como soluções, emulsões e outras misturas. As mesmas podem ser reconstituídas e formuladas como sólidos ou géis.

[0419] O pó liofilizado é preparado por dissolução de um ADC de anti- Nectina-4 fornecido no presente documento ou de um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo em um solvente adequado. Em algumas modalidades, o pó liofilizado é estéril. O solvente pode conter um excipiente que aprimora a estabilidade ou outro componente farmacológico do pó ou da solução reconstituída preparada a partir do pó. Os excipientes que podem ser usados incluem, mas não se limitam a, dextrose, sorbital, frutose, xarope de milho, xilitol, glicerina, glucose, sucrose ou outro agente adequado. O solvente pode conter também uma solução tampão, como citrato, fosfato de sódio ou potássio ou outras tais soluções tampão conhecidas por aqueles elementos com habilidade na técnica no pH aproximadamente neutro em uma modalidade.

[0420] A filtração estéril subsequente da solução seguida por liofilização sob condições padrões conhecidos por aqueles elementos com habilidade na técnica fornece a formulação desejada. Em uma modalidade, a solução resultante será particionada em frascos para liofilização. Cada frasco conterá uma única dosagem ou múltiplas dosagens do composto. O pó liofilizado pode ser armazenado sob condições apropriadas, como a aproximadamente 4 °C a temperatura ambiente.

[0421] A reconstituição desse pó liofilizado com água para injeção fornece uma formulação para uso na administração parenteral. Para reconstituição, o pó liofilizado é adicionado à água estéril ou a outro carreador adequado. A quantidade precisa depende do composto selecionado. Tal quantidade pode ser determinada empiricamente.

[0422] As misturas tópicas são preparadas conforme descrito para a administração local e sistêmica. A mistura resultante pode ser uma solução, suspensão, emulsões ou similares e pode ser formulada como cremes, géis, pomadas, emulsões, soluções, elixires, loções, suspensões, tintura, pastas, espumas, aerossóis, irrigações, aspersões, supositórios, bandagens, adesivos dérmicos ou quaisquer outras formulações adequadas para administração tópicas.

[0423] Os anticorpos fornecidos no presente documento podem ser formulados como aerossóis para aplicação tópica, como por inalação (consultar, por exemplo, Patente n° US 4.044.126, n° US 4.414.209 e n° US 4.364.923, que descrevem aerossóis para entrega de esteroide útil para tratamento de doenças inflamatórias, particularmente asma). Essas formulações para administração ao trato respiratório na forma de um aerossol ou solução para um nebulizador ou como um pó microfino para insuflações, isolado ou em combinação com um carreador inerte, como lactose. Em tal caso, em uma modalidade, as partículas da formulação terão diâmetros de menos de 50 mícrons, em uma modalidade, menos de 10 mícrons.

[0424] Os compostos podem ser formulados para aplicação local ou tópica, como aplicação tópica às membranas de pele e mucosas, como no olho, na forma de géis, cremes e loções e, para aplicação ao olho ou para aplicação intracisternal ou intraespinhal. Contempla-se que a administração tópica para entrega transdérmica e também que a administração aos olhos ou mucosa ou para terapias de inalação. As soluções nasais do composto ativo isolado ou em combinação outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem ser administradas também.

[0425] Essas soluções, particularmente essas soluções destinadas ao uso oftálmico, podem ser formuladas como soluções isotônicas a 0,01% a 10%, com pH aproximadamente 5 a 7, com sais apropriadas.

[0426] Contempla-se também que outras rotas de administração, como adesivos transdérmicos, incluindo dispositivos iontoforéticos e eletroforéticos e administração retal no presente documento.

[0427] Os adesivos transdérmicas incluindo dispositivos iontoforéticos e eletroforéticos são bem conhecidos por aqueles elementos com habilidade na técnica. Por exemplo, tais adesivos são revelados nas Patentes n° US 6.267.983, n° US 6.261.595, n° US 6.256.533, n° US 6.167.301, n° US 6.024.975, n° US 6.010.715, n° US 5.985.317, n° US 5.983.134, n° US 5.948.433 e n° US 5.860.957.

[0428] Por exemplo, as formas de dosagem farmacêutica para administração retal são supositórios retais, cápsulas e comprimidos para efeito sistêmico. Os supositórios retais são usados no presente documento significando que os corpos sólidos para inserção no reto que derretem ou amolecem em temperatura corporal que libera um ou mais ingredientes farmacologicamente ou terapeuticamente ativos.

As substâncias farmaceuticamente aceitáveis utilizadas nos supositórios retais são bases ou veículos e os agentes para aumentar o ponto de fusão. Exemplos de bases incluem manteiga de cacau (óleo de teobroma), gelatina de glicerina, carbowax (polioxietileno glicol) e misturas apropriadas de mono-, di- e triglicerídeos de ácidos graxos. As combinações das várias bases podem ser usadas. Os agentes para aumentar o ponto de fusão de supositórios incluem espermacete e cera. Os supositórios retais podem ser preparados pelo método compactado ou por moldagem. Em uma modalidade, o peso de um supositório retal é aproximadamente 2 a 3 gm.

[0429] Os comprimidos e as cápsulas para administração retal podem ser fabricados com o uso da mesma substância farmaceuticamente aceitável e pelos mesmos métodos que as formulações para administração oral.

[0430] Os anticorpos e outras composições fornecidos no presente documento podem ser formulados para serem direcionados para um tecido, receptor ou outra área particular do corpo do indivíduo a ser tratado. Muitos métodos de direcionamento são bem conhecidos por aqueles elementos com habilidade na técnica. Contempla-se que todos os métodos de direcionamento no presente documento nas composições instantâneas. Para exemplos não limitantes de métodos de direcionamento, consultar, por exemplo, as Patentes n° US 6.316.652, n° US 6.274.552, n° US 6.271.359, n° US 6.253.872, n° US 6.139.865, n° US

6.131.570, n° US 6.120.751, n° US 6.071.495,n° US 6.060.082, n° US 6.048.736, n° US 6.039.975, n° US 6.004.534, n° US 5.985.307, n° US 5.972.366, n° US 5.900.252,

n° US 5.840.674, n° US 5.759.542 e n° US 5.709.874. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Nectina-4 fornecidos no presente documento são direcionados (ou, de outro modo, administrados) para o cólon, como em um paciente que tem ou com risco de ter uma doença mediada pela Nectina-4.

[0431] Em uma modalidade, as suspensões lipossômicas, incluindo lipossomos direcionados ao tecido, como lipossomos direcionados ao tumor, podem ser também adequados como carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Essas podem ser preparadas de acordo com os métodos conhecidos por aqueles elementos versados na técnica. Por exemplo, as formulações de lipossomo podem ser preparadas conforme descrito na Patente nº US 4.522.811. Brevemente, os lipossomos, como vesículas multimelares (MLV’s), podem ser formados por secagem de fosfatidil-colina de ovo e fosfatidil-serina de cérebro (proporção molar de 7:3) no interior de um balão. Uma solução de um composto fornecida no presente documento em solução salina tampão de fosfato que é desprovida de cátions divalentes (PBS) é adicionada e o balão agitado até que o filme lipídico seja dispersado. As vesículas resultantes são lavadas para remover o composto não encapsulado, peletizadas por centrifugação e, então, ressuspensas em PBS.

26. Métodos de Administração e Dosagem

[0432] Em uma modalidade específica, é fornecida no presente documento uma composição para uso na prevenção, gerenciamento, tratamento e/ou melhoramento de uma doença mediada pela Nectina-4 que compreendem um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento. Em uma modalidade, é fornecida no presente documento uma composição para uso na prevenção de uma doença mediada pela Nectina-4, em que a composição compreende um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento. Em uma modalidade, é fornecida no presente documento uma composição para uso no gerenciamento de uma doença mediada pela Nectina-4, em que a composição compreende um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento. Em uma modalidade, é fornecida no presente documento uma composição para uso no tratamento de uma doença mediada pela Nectina-4, em que a composição compreende um ADC de anti- Nectina-4 fornecido no presente documento. Em uma modalidade, é fornecida no presente documento uma composição para uso no melhoramento de uma doença mediada pela Nectina-4, em que a composição compreende um ADC de anti- Nectina-4 fornecido no presente documento. Em certas modalidades, o indivíduo é um indivíduo com necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o indivíduo tem a Doença mediada pela Nectina-4. Em outras modalidades, o indivíduo tem risco de ter a Doença mediada pela Nectina-4. Em algumas modalidades, a administração resulta na prevenção, no gerenciamento, no tratamento ou no melhoramento da Doença mediada pela Nectina-4. Em uma modalidade, o ADC de anti-Nectina-4 é um ADC em que o anticorpo anti-Nectina-4 é o anticorpo M22- 321b41.1.

[0433] Em uma modalidade, é fornecida no presente documento uma composição para uso na prevenção, gerenciamento, tratamento e/ou melhoramento de um sintoma de uma doença mediada pela Nectina-4, em que a composição compreende um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento. Em uma modalidade, é fornecida no presente documento uma composição para uso na prevenção de um sintoma de uma doença mediada pela Nectina-4, em que a composição compreende uma ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento. Em uma modalidade, é fornecida no presente documento uma composição para uso no gerenciamento de um sintoma de uma doença mediada pela Nectina-4, em que a composição compreende um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento. Em uma modalidade, é fornecida no presente documento uma composição para uso no tratamento de um sintoma de uma doença mediada pela Nectina-4, em que a composição compreende um ADC de anti-

Nectina-4 fornecido no presente documento. Em uma modalidade, é fornecida no presente documento uma composição para uso no melhoramento de um sintoma de uma doença mediada pela Nectina-4, em que a composição compreende um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento. Em certas modalidades, o indivíduo é um indivíduo com necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o indivíduo tem a Doença mediada pela Nectina-4. Em outras modalidades, o indivíduo tem risco de ter a Doença mediada pela Nectina-4. Em algumas modalidades, a administração resulta na prevenção, no gerenciamento, no tratamento ou no melhoramento do sintoma da Doença mediada pela Nectina-4. Em uma modalidade, o anticorpo Nectina-4 é o anticorpo M22-321b41.1.

[0434] Em outra modalidade, é fornecido no presente documento um método de prevenção, gerenciamento, tratamento e/ou melhoria de uma doença mediada pela Nectina-4 em um indivíduo que compreende administrar uma quantidade eficaz de um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento. Em uma modalidade, é fornecido no presente documento um método de prevenção de uma doença mediada pela Nectina-4 em um indivíduo que compreende administrar uma quantidade eficaz de um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento.

Em uma modalidade, é fornecido no presente documento um método de gerenciamento de uma doença mediada pela Nectina-4 em um indivíduo que compreende administrar uma quantidade eficaz de um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento. Em uma modalidade, é fornecido no presente documento um método de tratamento de uma doença mediada pela Nectina-4 em um indivíduo, que compreende administrar uma quantidade eficaz de um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento. Em uma modalidade, é fornecido no presente documento um método de melhoria de uma doença mediada pela Nectina-4 em um indivíduo que compreende administrar uma quantidade eficaz de um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento. Em certas modalidades, o indivíduo é um indivíduo com necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o indivíduo tem a Doença mediada pela Nectina-4. Em outras modalidades, o indivíduo tem risco de ter a Doença mediada pela Nectina-4. Em algumas modalidades, a administração resulta na prevenção, no gerenciamento, no tratamento ou no melhoramento da Doença mediada pela Nectina-4. Em uma modalidade, o ADC de anti-Nectina-4 é um ADC em que o anticorpo anti-Nectina-4 é o anticorpo M22-321b41.1.

[0435] Em outra modalidade, é fornecido no presente documento um método de prevenção, gerenciamento, tratamento e/ou melhoramento de um sintoma de uma doença mediada pela Nectina-4 em um indivíduo que compreende administrar uma quantidade eficaz de um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento. Em uma modalidade, é fornecido no presente documento um método de prevenção de um sintoma de uma doença mediada pela Nectina-4 em um indivíduo que compreende administrar uma quantidade eficaz de um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento. Em uma modalidade, é fornecido no presente documento um método de gerenciamento de um sintoma de uma doença mediada pela Nectina-4 em um indivíduo que compreende administrar uma quantidade eficaz de um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento. Em uma modalidade, é fornecido no presente documento um método de tratamento de um sintoma de uma doença mediada pela Nectina-4 em um indivíduo que compreende administrar uma quantidade eficaz de um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento. Em uma modalidade, é fornecido no presente documento um método de melhoramento de uma doença mediada pela Nectina-4 em um indivíduo que compreende administrar uma quantidade eficaz de um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento. Em certas modalidades, o indivíduo é um indivíduo com necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o indivíduo tem a Doença mediada pela Nectina-4. Em outras modalidades, o indivíduo tem risco de ter a Doença mediada pela Nectina-4. Em algumas modalidades, a administração resulta na prevenção, no gerenciamento, no tratamento ou no melhoramento do sintoma da Doença mediada pela Nectina-4. Em uma modalidade, o ADC de anti- Nectina-4 é um ADC em que o anticorpo anti-Nectina-4 é o anticorpo M22-321b41.1.

[0436] Os anticorpos fornecidos no presente documento podem ser usados também, por exemplo, para purificar, detectar e direcionar antígenos de Nectina-4 em métodos de diagnóstico e terapêutica tanto in vitro quanto in vivo. Por exemplo, os anticorpos modificados têm uso em ensaio imunológicos para medir qualitativa e quantitativamente níveis de Nectina-4 em amostras biológicas. Consultar, por exemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed.1988) (incorporado em sua totalidade a título de referência no presente documento).

[0437] Também são fornecidos no presente documento métodos de prevenção, gerenciamento, tratamento e/ou melhoramento de uma doença mediada pela Nectina-4 por administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de um ADC de anti-Nectina-4 ou de composição farmacêutica que compreende um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento. Em um aspecto, um ADC de anti- Nectina-4 é purificado substancialmente (isto é, substancialmente sem substâncias que limitam seu efeito ou produz efeitos colaterias indesejados). Em certas modalidades, o anticorpo in ADC de anti-Nectina-4 é um anticorpo monoclonal totalmente humano, como um anticorpo monoclonal totalmente humanos. A terapia administrada a um indivíduo que pode ser um mamífero, como não primata (por exemplo, vacas, porcos, cavalos, gatos, cachorros, ratos, etc.) ou um primata (por exemplo, um macaco, como um macaco cinomologo ou um ser humano). Em uma modalidade, o indivíduo é um ser humano. Em outra modalidade, o indivíduo é um ser humano com uma doença mediada pela Nectina-4.

[0438] Vários sistemas de entrega são conhecidos e podem ser usados para administrar um agente profilático ou terapêutico (por exemplo, um ADC de anti-

Nectina-4 fornecido no presente documento), incluindo, mas não se limitam a,

encapsulamento em lipossomos, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de uma expressão do ADC de anti-Nectina-4, endocitose mediada por receptor(consultar, por exemplo, Wu e Wu, J.

Biol.

Chem.262:4429 a

4432 (1987)), a construção de um ácido nucleico como parte de um vetor retroviral ou outro vetor etc.

Os métodos de administração de um agente profilático ou terapêutico (por exemplo, um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento) ou de composição farmacêutica incluem, mas não se limitam a,

administração parenteral (por exemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal,

intravenosa e subcutânea), epidural e mucosal (por exemplo, intranasal e rotas orais). Em uma modalidade específica, um agente profilático ou terapêutico (por exemplo, um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento) ou uma composição farmacêutica é administrado de modo intranasal, de modo intravenoso ou de modo subcutâneo.

Os agentes ou composições profiláticos ou terapêuticos podem ser administrados por qualquer rota conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção de bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneo

(por exemplo, mucosa oral, mucosa intranasal, retal e mucosa intestinal, etc.) e podem ser administrados em conjunto com outros agentes biologicamente ativos.

A administração pode ser sistêmica ou local.

Além disso, a administração pulmonar pode ser empregada, por exemplo, por uso de um inalador ou nebulizador e de formulação com o agente de aerossolização.

Consultar, por exemplo, as Patentes n°

US 6.019.968, n° US 5.985.320, n° US 5.985.309, n° US 5.934.272, n° US 5.874.064,

n° US 5.855.913, n° US 5.290.540 e n° US 4.880.078; e as Publicações de PCT nº

WO 92/19244, nº WO 97/32572, nº WO 97/44013, nº WO 98/31346 e nº WO

99/66903, cada um dos quais é incorporada em sua totalidade a título de referência no presente documento.

[0439] Em uma modalidade específica, pode ser desejável administrar um agente ou composição profilático ou terapêutico ou uma composição farmacêutica fornecida localmente no presente documento para a área com necessidade de tratamento. Isso pode ser alcançado por, por exemplo, e não a título de limitação, infusão local, por administração tópica (por exemplo, por aspersão intranasal), por injeção ou por meio de um implante, em que o dito implante é de material poros, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, como membranas ou fibras sialásticas. Em algumas modalidades, ao administrar um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento, deve-se tomar cuidado com o uso de materiais nos quais o ADC de anti-Nectina-4 não absorve.

[0440] Em outra modalidade, um agente profilático ou terapêutico ou uma composição fornecida no presente documento pode ser entregue em uma vesícula, em particular um lipossomo (consultar Langer, 1990, Science 249:1527 a 1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease e Cancer, Lopez-Berestein e Fidler (eds.), Liss, Nova Iorque, pp.353 a 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp.317 a 327; consultar em geral ibid.).

[0441] Em outra modalidade, um agente profilático ou terapêutico ou uma composição fornecida no presente documento pode ser entregue em um sistema de liberação controlada ou de liberação sustentada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada para alcançar liberação controlada ou sustentada (consultar Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med.321:574). Em outra modalidade, os materiais poliméricos podem ser usados para alcançar liberação controlada ou sustentada de um agente profilático ou terapêutico (por exemplo, um ADC de anti- Nectina-4 conforme é descrito no presente documento) ou uma composição fornecida no presente documento (consultar, por exemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer e Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Flórida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design e Performance, Smolen e Ball (eds.), Wiley, Nova Iorque (1984); Ranger e Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev.

Macromol. Chem.23:61; consultar também Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol.25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg.71:105); Patente nº US 5.679.377; Patente nº US5.916.597; Patente nº US 5.912.015; Patente nº US 5.989.463; Patente nº US 5.128.326; Publicação de PCT nº WO 99/15154; e Publicação de PCT nº WO 99/20253.

[0442] Exemplos de polímeros usados em formulações de liberação sustentada incluem, mas não se limitam a, poli(2-hidroxi etil metacrilato), poli(metil metacrilato), poli(ácido acrílico), poli(acetato de etileno-co-vinil), poli(ácido metacrílico), poliglicolídeos (PLG), polianidridos, poli(N-vinilpirrolidona), poli(álcool vinílico), poliacrilamida, poli(etileno glicol), poliactidos (PLA), poli(lactido-co- glicolidos) (PLGA) e poliortoésteres. Em uma modalidade, o polímero usado em uma formulação de liberação sustentada é inerte, livre de impurezas lixiáveis, estável no armazenamento, estéril e biodegradável. Ainda em outra modalidade, um sistema de liberação controlada ou sustentada pode ser colocado na proximidade de um tecido alvo particular, isto é, por exemplo, as passagens nasais ou pulmões, exigindo, assim, apenas uma fração da dose sistemática (consultar, por exemplo, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp.115 a 138 (1984)). Os sistemas de liberação controlada são discutidos, por exemplo, por Langer, 1990, Science 249:1527 a 33. Qualquer técnica conhecida por um elemento versado na técnica pode ser usada para produzir formulações de liberação sustentada que compreendem um ou mais anticorpos fornecidos no presente documento. Consultar, por exemplo, a Patente nº US 4.526.938, a Publicação de PCT WO 91/05548, a Publicação de PCT WO 96/20698, Ning et al., 1996,“Intratumoral

Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenoenxerto using a Sustained- Release Gel”, Radiotherapy & Oncology 39:179 a 189, Song et al., 1995,“Anticorpo Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions”, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372 a 397, Cleek et al., 1997,“Biodegradable Polimeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application”, Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater.24:853 a 854 e Lam et al., 1997, “Microencapsulation of Recombinant Humanizedo Monoclonal Antibody for Local Delivery”, Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater.24:759 a 760, cada um dos quais é incorporada em sua totalidade a título de referência no presente documento.

[0443] Em uma modalidade específica, em que a composição fornecida no presente documento é um ácido nucleico que codifica um agente profilático ou terapêutico (por exemplo, um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento), o ácido nucleico pode ser administrado in vivo para promover expressão do seu agente profilático ou terapêutico codificado, por construção do mesmo como parte de um vetor de expressão de ácido nucleico apropriado e por administração do mesmo do modo que o mesmo se torne intracelular, por exemplo, por uso de um vetor retroviral (consultar a Patente nº US 4.980.286) ou por injeção direta ou por uso de bombardeio de micropartículas (por exemplo, uma pistola de genes; Biolistic, Dupont) ou de revestimento com lipídeos ou receptores de superfície celular ou de agentes de transfecção ou por administração do mesmo na ligação a um peptídeo do tipo homeobox que é conhecido por entrar no núcleo (consultar, por exemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 88:1864 a1868) etc. Alternativamente, um ácido nucleico pode ser introduzido de modo intracelular e incorporado no DNA de célula hospedeira para expressão por recombinação homóloga.

[0444] Em uma modalidade específica, uma composição fornecida no presente documento compreende um, duas ou mais anticorpos fornecidos no presente documento. Em outra modalidade, uma composição fornecida no presente documento compreende uma, duas ou mais anticorpos fornecidos no presente documento e um agente profilático ou terapêutico diferente de um ADC de anti- Nectina-4 fornecido no presente documento. Em uma modalidade, os agentes são conhecidos por serem úteis ou por terem sido usados ou por serem usados atualmente para a prevenção, gerenciamento, tratamento e/ou melhoramento de uma doença mediada pela Nectina-4. Além de agentes profiláticos ou terapêuticos, as composições fornecidas no presente documento podem compreendem também um carreador.

[0445] As composições fornecidas no presente documento incluem composições a granel úteis na fabricação de composições farmacêuticas (por exemplo, composições que são adequadas para administração a um indivíduo ou paciente) que podem ser usadas em uma preparação de formas de dosagem unitária.

[0446] Em uma modalidade, uma composição fornecida no presente documento é uma composição farmacêutica. Tais composições compreendem uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz de um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos (por exemplo, um anticorpo fornecido no presente documento ou outro agente profilático ou terapêutico) e um carreador farmaceuticamente aceitável.

As composições farmacêuticas podem ser formuladas para serem adequadas para a rota de administração a um indivíduo.

[0447] Em uma modalidade específica, o termo “carreador” se refere a um diluente, adjuvante (por exemplo, adjuvante de Freund (completo e incompleto)), excipiente ou veículo com o qual o elemento terapêutico é administrado. Tais carreadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como água e óleo, incluindo esses de petróleo, animal, vegetal ou de origem sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. A água é um exemplo de carreador quando a composição farmacêutica é administrada de modo intravenoso.

As soluções salinas e as soluções de dextrose e glicerol aquosas podem ser empregadas também como carreadores líquidos, particularmente, para soluções injetáveis. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glucose, lactose, sucrose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de sódio, talco, cloreto de sódio, leite em pó desnatado, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e similares. A composição, se desejado, pode conter também quantidades menores de agentes de umectação ou emulsificação ou agentes tampão de pH. Essas composições podem assumir a forma de soluções, suspensões, emulsão, comprimidos, pilulas, cápsulas, pós, formulações de liberação sustentada e similares. A formulação oral pode incluir carreadores padrão, como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc. Exemplos de carreadores farmacêuticos adequados são descritos em Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA. Tais composições conterão uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz do ADC de anti-Nectina-4, como na forma purificada, em conjunto com uma quantidade adequada de carreador com a finalidade de fornecer a forma para administração apropriada ao paciente. A formulação deve se adequar ao modo de administração.

[0448] Em uma modalidade, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa aos seres humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções em solução tampão aquosa isotônica estéril.

Quando necessário, a composição pode incluir também um agente de solubilização e um anestésico local, como lidocaína para amenizar a dor no local da injeção.

Entretanto, tais composições podem ser administradas por uma rota diferente da rota intravenosa.

[0449] Geralmente, os ingredientes de composições fornecidas no presente documento são supridos separadamente ou misturados em conjunto na forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó seco liofilizado ou um concentrado sem água em um recipiente vedado hermeticamente, como uma ampola ou sachê que indica a quantidade de agente ativo. Nos casos em que a composição deve ser administrada por infusão, a mesma pode ser dispensada com uma garrafa de infusão que contém água de nível farmacêutico estéril ou solução salina. Nos casos em que a composição é administrada por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser fornecida de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

[0450] Um anticorpo ou um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento pode ser embalado em um recipiente vedado hermeticamente, como uma ampola ou sachê que indica a quantidade de anticorpo ou ADC de anti-Nectina-

4. Em uma modalidade, o anticorpo ou ADC de anti-Nectina-4 é suprido como pó liofilizado esterilizado seco ou concentrado sem água em um recipiente vedado hermeticamente e pode ser reconstituído, por exemplo, com água ou solução salina para a concentração apropriada para administração a um indivíduo. Em certas modalidades, o anticorpo ou ADC de anti-Nectina-4 é suprido como pó liofilizado estéril seco em um recipiente vedado hermeticamente em uma dosagem unitária de pelo menos 0,1 mg, pelo menos 0,5 mg, pelo menos 1 mg, pelo menos 2 mg ou pelo menos 3 mg, como pelo menos 5 mg, pelo menos 10 mg, pelo menos 15 mg, pelo menos 25 mg, pelo menos 30 mg, pelo menos 35 mg, pelo menos 45 mg, pelo menos 50 mg, pelo menos 60 mg, pelo menos 75 mg, pelo menos 80 mg, pelo menos 85 mg, pelo menos 90 mg, pelo menos 95 mg ou pelo menos 100 mg. O ADC de anti-Nectina-4 liofilizado pode ser armazenado entre 2 e 8° C em seu recipiente original e o ADC de anti-Nectina-4 pode ser administrado por 12 horas, como por 6 horas, por 5 horas, por 3 horas ou por 1 hora após ser reconstituído. Em uma modalidade alternativo, um anticorpo ou um ADC de anti-Nectina-4 é suprido na forma líquida em um recipiente vedado hermeticamente que indica a quantidade e a concentração do anticorpo ou do ADC de anti-Nectina-4. Em certas modalidades, a forma líquida do anticorpo ou ADC de anti-Nectina-4 é suprida em um recipiente vedado hermeticamente de pelo menos 0,1 mg/ml, pelo menos 0,5 mg/ml ou pelo menos 1 mg/ml e, como pelo menos 5 mg/ml, pelo menos 10 mg/ml, pelo menos 15 mg/ml, pelo menos 25 mg/ml, pelo menos 30 mg/ml, pelo menos 40 mg/ml, pelo menos 50 mg/ml, pelo menos 60 mg/ml, pelo menos 70 mg/ml, pelo menos 80 mg/ml, pelo menos 90 mg/ml ou pelo menos 100 mg/ml.

[0451] As composições fornecidas no presente documento podem ser formuladas como formas neutras ou de sal. Os sais farmacêuticamente aceitáveis incluem esses sais formados com ânions, como esses derivados de ácidos hidroclóricos, fosfóricos, acéticos, oxálicos, tartáricos, etc. e esses formados com cátions, como esses cátions derivados de sódio, potássio, amônio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína etc.

[0452] A quantidade de um agente profilático ou terapêutico (por exemplo, um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento) ou uma composição fornecida no presente documento que será eficaz na prevenção, gerenciamento, tratamento e/ou melhoramento de uma doença mediada pela Nectina-4 pode ser determinada por técnicas clínicas padrão.

[0453] Consequentemente, uma dosagem de um ADC de anti-Nectina-4 ou uma composição que resulta em um título no soro de aproximadamente 0,1 μg/ml a aproximadamente 450 μg/ml e. em algumas modalidades, pelo menos 0,1 μg/ml, pelo menos 0,2 μg/ml, pelo menos 0,4 μg/ml, pelo menos 0,5 μg/ml, pelo menos 0,6 μg/ml, pelo menos 0,8 μg/ml, pelo menos 1 μg/ml, pelo menos 1,5 μg/ml, como pelo menos 2 μg/ml, pelo menos 5 μg/ml, pelo menos 10 μg/ml, pelo menos 15 μg/ml, pelo menos 20 μg/ml, pelo menos 25 μg/ml, pelo menos 30 μg/ml, pelo menos 35 μg/ml, pelo menos 40 μg/ml, pelo menos 50 μg/ml, pelo menos 75 μg/ml, pelo menos 100 μg/ml, pelo menos 125 μg/ml, pelo menos 150 μg/ml, pelo menos 200 μg/ml, pelo menos 250 μg/ml, pelo menos 300 μg/ml, pelo menos 350 μg/ml, pelo menos 400 μg/ml ou pelo menos 450 μg/ml pode ser administrado a um ser humano para a prevenção, gerenciamento, tratamento e/ou melhoramento de uma doença mediada pela Nectina-4. Além disso, os ensaios in vitro podem ser empregados opcionalmente para ajudar a identificar faixas de dosagem ideais. A dose precisa a ser empregada na formulação dependerá também da rota de administração e da gravidade de uma doença mediada pela Nectina-4 e deve ser decidida de acordo com o julgamento do profissional e com as circunstâncias de cada paciente.

[0454] As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de resposta à dose derivadas de sistemas de teste de modelo in vitro ou de animal.

[0455] Para os anticorpos fornecidos no presente documento, a dosagem administrada a um paciente é tipicamente 0,1 mg/kg a 100 mg/kg do peso corporal do paciente. Em algumas modalidades, a dosagem administrada ao paciente é aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 75 mg/kg do peso corporal do paciente. Em algumas modalidades, a dosagem administrada a m paciente é entre 1 mg/kg e 20 mg/kg do peso corporal do paciente, como 1 mg/kg a 5 mg/kg do peso corporal do paciente. Em geral, os anticorpos humanos têm uma meia-vida mais longa dentro do corpo humano que os anticorpos de outras espécies devido à resposta imunológica aos polipeptídeos estranhos. Assim, as dosagens mais baixas de anticorpos humanos e a administração menos frequentes são frequentemente possíveis. Adicionalmente, a dosagem e a frequência de administração dos anticorpos fornecidos no presente documento podem ser reduzidas por melhoramento de absorção e por penetração de tecido dos anticorpos por modificações, como, por exemplo, lipidação.

[0456] Em uma modalidade, aproximadamente 100 mg/kg ou menos, aproximadamente 75 mg/kg ou menos, aproximadamente 50 mg/kg ou menos, aproximadamente 25 mg/kg ou menos, aproximadamente 10 mg/kg ou menos, aproximadamente 5 mg/kg ou menos, aproximadamente 1 mg/kg ou menos, aproximadamente 0,5 mg/kg ou menos ou aproximadamente 0,1 mg/kg ou menos de um ADC de anti-Nectina-4 é administrado 5 vezes, 4 vezes, 3 vezes, 2 vezes ou 1 vez para gerenciar uma doença mediada pela Nectina-4. Em algumas modalidades, um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento é administrado aproximadamente 1 a 12 vezes, em que as doses podem ser administradas conforme necessário, por exemplo, semanal, bissemanal, mensal, bimestral, trimestralmente, etc., conforme determinado por um médico. Em algumas modalidades, uma dose inferior (por exemplo, 1 a 15 mg/kg) pode ser administrada mais frequentemente (por exemplo, 3 a 6 vezes). Em algumas modalidades, uma dose superior (por exemplo, 25 a 100 mg/kg) pode ser administrada menos frequentemente (por exemplo, 1 a 3 vezes). Entretanto, conforme estará evidente para aqueles elementos versados na técnica, outras quantidades de dosagens e programação são facilmente determináveis e dentro do escopo fornecido no presente documento.

[0457] Em uma modalidade específica, aproximadamente 100 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg ou menos, aproximadamente 50 mg/kg ou menos, aproximadamente 25 mg/kg ou menos, aproximadamente 10 mg/kg ou menos, aproximadamente 5 mg/kg ou menos, aproximadamente 1 mg/kg ou menos, aproximadamente 0,5 mg/kg ou menos, aproximadamente 0,1 mg/kg ou menos de um ADC de anti-Nectina-4 em uma formulação de liberação sustentada é administrada a um indivíduo, como um ser humano, para prevenir, gerenciar, tratar e/ou melhorar uma doença mediada pela Nectina-4. Em uma outra modalidade específica, aproximadamente 100 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg ou menos, aproximadamente 50 mg/kg ou menos, aproximadamente 25 mg/kg ou menos, aproximadamente 10 mg/kg ou menos, aproximadamente 5 mg/kg ou menos, aproximadamente 1 mg/kg ou menos, aproximadamente 0,5 mg/kg ou menos ou aproximadamente 0,1 mg/kg ou menos de bolus de um ADC de anti-Nectina-4 não em uma formulação de liberação sustentada é administrado a um indivíduo, como um ser humano, para prevenir, gerenciar, tratar e/ou melhorar uma doença mediada pela Nectina-4 e após um certo período de tempo, aproximadamente 100 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg ou menos, aproximadamente 50 mg/kg ou menos, aproximadamente 25 mg/kg ou menos, aproximadamente 10 mg/kg ou menos, aproximadamente 5 mg/kg ou menos, aproximadamente 1 mg/kg ou menos, aproximadamente 0,5 mg/kg ou menos ou aproximadamente 5 mg/kg ou menos de um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento em uma liberação sustentada é administrado ao dito indivíduo (por exemplo, de modo intranasal ou intramuscular) duas, três ou quatro vezes (como uma vez). De acordo com essa modalidade, um certo período de tempo pode ser 1 a 5 dias, uma semana, duas semanas ou um mês.

[0458] Em algumas modalidades, uma única dose de um ADC de anti- Nectina-4 fornecido no presente documento é administrada a um paciente para prevenir, gerenciar, tratar e/ou melhorar uma doença mediada pela Nectina-4 duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze vezes, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte, vinte e um, vinte e dois, vinte e três, vinte e quatro, vinte e cinco ou vinte e seis em intervalos bissemanais (por exemplo, aproximadamente 14 dias) ao longo de um ano, em que a dose é selecionada a partir do grupo que consiste em aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg,

aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 55 mg/kg, aproximadamente 60 mg/kg, aproximadamente 65 mg/kg, aproximadamente 70 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg, aproximadamente 80 mg/kg, aproximadamente 85 mg/kg, aproximadamente 90 mg/kg, aproximadamente 95 mg/kg, aproximadamente 100 mg/kg ou uma combinação dos mesmos (isto é, cada dose mensal pode ser idêntica ou não).

[0459] Em outra modalidade, uma única dose de um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento é administrada a um paciente para prevenir, gerenciar, tratar e/ou melhorar uma doença mediada pela Nectina-4 duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze vezes em intervalos aproximadamente mensais (por exemplo, aproximadamente 30 dias) ao longo de um ano, em que a dose é selecionada a partir do grupo que consiste em aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 55 mg/kg, aproximadamente 60 mg/kg, aproximadamente 65 mg/kg, aproximadamente 70 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg, aproximadamente 80 mg/kg, aproximadamente 85 mg/kg, aproximadamente 90 mg/kg, aproximadamente 95 mg/kg, aproximadamente 100 mg/kg ou uma combinação dos mesmos (isto é, cada dose mensal pode ser idêntica ou não).

[0460] Em uma modalidade, uma única dose de um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento é administrada a um paciente para prevenir,

gerenciar, tratar e/ou melhorar uma doença mediada pela Nectina-4 duas, três, quatro, cinco, seis vezes em intervalos aproximadamente bimestrais (por exemplo, aproximadamente 60 dias) ao longo de um ano, em que a dose é selecionada a partir do grupo que consiste em aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 55 mg/kg, aproximadamente 60 mg/kg, aproximadamente 65 mg/kg, aproximadamente 70 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg, aproximadamente 80 mg/kg, aproximadamente 85 mg/kg, aproximadamente 90 mg/kg, aproximadamente 95 mg/kg, aproximadamente 100 mg/kg ou uma combinação dos mesmos (isto é, cada dose mensal pode ser idêntica ou não).

[0461] Em algumas modalidades, uma única dose de um ADC de anti- Nectina-4 fornecido no presente documento é administrada a um paciente para prevenir, gerenciar, tratar e/ou melhorar uma doença mediada pela Nectina-4 duas, três, quatro vezes em intervalos aproximadamente trimestrais (por exemplo, aproximadamente 120 dias) ao longo de um ano em que a dose é selecionada a partir do grupo que consiste em aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 55 mg/kg, aproximadamente 60 mg/kg, aproximadamente 65 mg/kg, aproximadamente 70 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg, aproximadamente 80 mg/kg, aproximadamente 85 mg/kg, aproximadamente 90 mg/kg, aproximadamente 95 mg/kg, aproximadamente 100 mg/kg ou uma combinação dos mesmos (isto é, cada dose mensal pode ser idêntica ou não).

[0462] Em certas modalidades, a rota de administração de uma dose de um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento a um paciente é intranasal, intramuscular, intravenosa ou uma combinação das mesmas, mas outras rotas descritas no presente documento são também aceitáveis. Cada dose pode ser administrada ou não por uma rota de administração idêntica. Em algumas modalidades, um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento pode ser administrado através de múltiplas rotas de administração simultânea ou subsequentemente a outras doses do mesmo ADC de anti-Nectina-4 ou de um ADC de anti-Nectina-4 diferente fornecido no presente documento.

[0463] Em certas modalidades, os ADCs de anti-Nectina-4 fornecidos no presente documento são administrados profilática ou terapeuticamente a um indivíduo. Os ADCs de Anti-Nectina-4 fornecidos no presente documento podem ser administrados profilática ou terapeuticamente a um indivíduo com a finalidade de prevenir, atenuar ou melhorar uma doença mediada pela Nectina-4 ou sintoma da mesma.

27. Terapia de Gene

[0464] Em uma modalidade específica, os ácidos nucleicos que compreendem sequências que codificam anticorpos ou derivados funcionais dos mesmos são administrados a um indivíduo para uso em um método fornecido no presente documento, por exemplo, para prevenir, gerenciar, tratar e/ou melhorar uma doença mediada pela Nectina-4, distúrbio ou afecção por meio de terapia de gene. Tal terapia abrange essa realizada pela administração a um indivíduo de um ácido nucleico expressado ou expressível. Em uma modalidade, os ácidos nucleicos produzem seu anticorpo codificado que pode ser conjugado para fornecer um ADC de anti-Nectina-4 e o anticorpo ou ADC de anti-Nectina-4 medeia um efeito profilático ou terapêutico.

[0465] Qualquer um dos métodos para expressão de gene recombinante (ou terapia de gene) disponível na técnica pode ser usado. Exemplos de métodos são descritos abaixo e são fornecidos na seção Exemplos.

[0466] Para uma revisão geral dos métodos de terapia de gene, consultar Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488 a 505; Wu e Wu, 1991, Biotherapy 3:87 a 95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.32:573 a 596; Mulligan, 1993, Science 260:926 a 932; e Morgan e Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem.62:191 a 217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155 a 215.

[0467] Os métodos comumente conhecidos na técnica de tecnologia de DNA recombinante que podem ser usados são descritos em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); e Kriegler, Gene Transfer e Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).

[0468] Em uma modalidade específica, uma composição compreende ácidos nucleicos que codificam um anticorpo anti-Nectina-4 fornecido no presente documento, em que os ácidos nucleicos são parte de um vetor de expressão que expressa o anticorpo ou proteínas quiméricas ou cadeias pesadas ou leves ou as frações terapêuticas ou de fármaco do mesmo em uma célula hospedeira. Em particular, tais ácidos nucleicos têm promotores, como promotores heterólogos, ligados de forma operacional à região de codificação de anticorpo anti-Nectina-4, em que o promotor é induzível ou constitutivo, e, opcionalmente, específico de tecido.

Em uma outra modalidade particular, as moléculas de ácido nucleico são usadas nas quais o anticorpo anti-Nectina-4 que codifica sequências e quaisquer outras sequências desejadas são flanqueadas por regiões que promovem recombinação homóloga em um local desejado no genoma, fornecendo, assim, expressão intracromossômica do ADC de anti-Nectina-4 que codifica ácidos nucleicos (Koller e

Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:8932 a 8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435 a 438). Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- Nectina-4 expressada compreende um anticorpo de cadeia única; alternativamente, as sequências de ácido nucleico incluem sequências que codificam tanto as cadeias pesadas quanto as cadeias leves ou seus fragmentos no anticorpo anti-Nectina-4.

[0469] A entrega dos ácidos nucleicos para um indivíduo pode ser direta, no caso em que o indivíduo é exposto diretamente ao ácido nucleico ou a vetores que carregam ácido nucleico ou indireta, no caso em que as células são transformadas primeiramente com ácidos nucleicos in vitro, então, transplantadas para o indivíduo. Essas duas abordagens são conhecidas, respectivamente, como terapia de gene in vivo ou ex vivo.

[0470] Em uma modalidade específica, as sequências de ácido nucleico são administradas diretamente in vivo, em que as sequências são expressadas para produzir o produto codificado. Isso pode ser realizado por qualquer um dos inúmeros métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por construções das mesmas como parte de um vetor de expressão de ácido nucleico apropriado e por administração do vetor de modo que as sequências se tornem intracelulares, por exemplo, por infecção com o uso de vetores retrovirais defeituoso ou atenuados ou outros vetores virais (consultar Patente nº US 4.980.286) ou por injeção direta de DNA nu ou por uso de bombardeio de micropartículas (por exemplo, uma pistola de gene; Biolistic, Dupont) ou por revestimento com lipídeos ou receptores de superfície celular ou agentes de transfecção, por encapsulamento em lipossomos, micropartículas ou microcápsulas ou por administração das mesmas na ligação a um peptídeo que é conhecido por entrar no núcleo, por administração das mesmas na ligação a um ligante submetido à endocitose mediada por receptor (consultar, por exemplo, Wu e Wu, 1987, J. Biol. Chem.262:4429 a 4432) (que pode ser usado para direcionar especificamente tipos de célula para expressão dos receptores) etc. Em outra modalidade, os complexos de ligante de ácido nucleico podem ser formados nos quais o ligante compreende um peptídeo viral fusogênico para romper endossomos, permitindo que o ácido nucleico evite a degradação lisossômica. Ainda em outra modalidade, o ácido nucleico pode ser direcionado in vivo para absorção e expressão específicas de célula por direcionamento de um receptor específico (consultar, por exemplo, Publicações e PCT WO 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316; W093/14188, WO 93/20221). Alternativamente, o ácido nucleico pode ser introduzido de modo intracelular e incorporado na célula hospedeira DNA para expressão por recombinação homóloga (Koller e Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:8932 a 8935; e Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435 a 438).

[0471] Em uma modalidade específica, os vetores virais que contém sequências de ácido nucleico que codificam um anticorpo anti-Nectina-4 são usados.

Por exemplo, um vetor retroviral pode ser usado (consultar Miller et al., 1993, Meth.

Enzymol.217:581 a 599). Esses vetores retrovirais contêm os componentes necessários para o embalamento correto do genoma viral e a integração no DNA de célula hospedeira. As sequências de ácido nucleico que codificam o anticorpo anti- Nectina-4 a serem usadas na terapia de gene podem ser clonadas em um ou mais vetores, o que facilita a entrega do gene para um indivíduo. Os vetores retrovirais aproximadamente em mais detalhe podem ser encontrados em Boesen et al., 1994, Biotherapy 6:291 a 302, que descreve o uso de um vetor retroviral para entregar o gene mdr 1 para células tronco hematopoiéticas a fim de tornar as células tronco mais resistentes à quimioterapia. Outras referências que ilustram o uso de vetores retrovirais na terapia de gene são: Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest.93:644 a 651; Klein et al., 1994, Blood 83:1467 a 1473; Salmons e Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129 a 141; e Grossman e Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics e Devel.3:110 a 114.

[0472] Os adenovírus são outros vetores virais que podem ser usados na produção recombinante de anticorpos. Os adenovírus são veículos especialmente atrativos para entregar genes para o epitélio respiratório. Os adenovírus infectam naturalmente o epitélio respiratório onde causam uma doença moderada. Outros alvos para os sistemas de entrega com base no adenovírus são o fígado, o sistema nervoso central, as células endoteliais e o músculo. Os adenovírus têm a vantagem de ter capacidade de infectar células não divididas. Kozarsky e Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics e Development 3:499 a 503 apresentam uma revisão de terapia de gene com base no adenovírus. Bout et al., 1994, Human Gene Therapy 5:3-10 demonstraram o uso de vetores de adenovírus para transferir genes para o epitélio respiratório para macacos rhesus. Outros exemplos do uso de adenovírus na terapia de gene podem ser encontrados em Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431 a 434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143 a155; Mastrangeli et al., 1993, J. Clin.

Invest.91:225 a 234; Publicação de PCT W094/12649; e Wang et al., 1995, Gene Therapy 2:775 a 783. Em uma modalidade específica, os vetores de adenovírus são usados.

[0473] O vírus associado ao adeno (AAV) pode ser utilizado também (Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med.204:289 a 300; e Patente nº US 5.436.146).

Em uma modalidade específica, os vetores de AAV são usados para expressar um ADC de anti-Nectina-4 fornecido no presente documento. Em certas modalidades, o AAV compreende um ácido nucleico que codifica um domínio VH. Em certas modalidades, o AAV compreende um ácido nucleico que codifica um domínio VL. Em certas modalidades, o AAV compreende um ácido nucleico que codifica um domínio VH e um domínio VL. Em algumas modalidades dos métodos fornecidos no presente documento, um indivíduo é administrado um AAV que compreende um ácido nucleico que compreende um domínio VH e um AAV que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio VL. Em outras modalidades, um indivíduo é administrado um AAV que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio VH e um domínio VL. Em certas modalidades, os domínios VH e VL são super- expressados.

[0474] Uma outra abordagem para a terapia de gene envolve a transferência de um gene to células em cultura de tecido por tais métodos como eletroporação, lipofecção, transfecção mediada por fosfato de cálcio ou infecção viral. Geralmente, o método de transferência inclui a transferência de um marcador selecionável para as células. Então, as células são colocadas sob seleção para isolar essas células que foram absorvidas e são uma expressão do gene transferido. Então, essas células são entregues para um indivíduo.

[0475] Nessa modalidade, o ácido nucleico é introduzido em uma célula antes da administração in vivo da célula recombinante resultante. Tal introdução pode ser executada por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não se limitam à transfecção, eletroporação, microinjeção, infecção com um vetor viral ou bacteriófago que contém as sequências de ácido nucleico, fusão de célula, transferência de gene mediado por cromossomo, transferência de gene mediado por microcélula, fusão de esferoplasto, etc. Inúmeras técnicas são conhecidas na técnica para a introdução de genes estranhos nas células (consultar, por exemplo, Loeffler e Behr, 1993, Meth. Enzymol.217:599 a 618; Cohen et al., 1993, Meth.

Enzymol.217:618 a 644; Clin. Pharma. Ther.29:69 a 92 (1985)) e podem ser usadas de acordo com os métodos fornecidos no presente documento desde que as funções desenvolvimentalistas e fisiológicas necessárias das células receptoras naço sejam rompidas. A técnica deve fornecer a transferência estável do ácido nucleico para a célula de modo que o ácido nucleico seja expressível pela célula, como hereditário e expressível por sua progênia celular.

[0476] As células recombinantes resultantes podem ser entregues para um indivíduo por vários métodos conhecidos na técnica. As células sanguíneas recombinantes (por exemplo, células tronco ou progenitoras hematopoiéticas) podem ser administradas de modo intravenoso. A quantidade de células prevista para uso depende do efeito desejado, do estado do paciente, etc. e pode ser determinada por um elemento versado na técnica.

[0477] As células nas quais um ácido nucleico pode ser introduzido com propósitos de terapia de gene aborda qualquer tipo de célula desejada e disponível e incluem, mas não se limitam a células epiteliais, células endoteliais, queratinócitos, fibroblastos, células musculares, hepatócitos; células linfoides e mieloides, como linfócitos T, linfócitos B, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariócitos, granulócitos; várias células tronco ou progenitoras, em particular, células tronco ou progenitoras hematopoiéticaa, por exemplo, obtidas a partir da medula óssea, do sangue do cordão umbilical, sangue periférico, fígado fetal, etc.

[0478] Em uma modalidade específica, uma célula usada para terapia de gene é autóloga para o indivíduo.

[0479] Em uma modalidade na qual as células recombinantes são usadas na terapia de gene, as sequências de ácido nucleico que codificam um anticorpo anti- Nectina-4 são introduzidas nas células de modo que as mesmas são expressíveis pelas células ou por sua progênia e, então, as células recombinantes são administradas in vivo para efeito terapêutico. Em uma modalidade específica, as células tronco ou progenitores são usadas. Quaisquer células tronco e/ou progenitoras que podem ser isoladas e mantidas in vitro podem ser usadas potencialmente de acordo com essa modalidade dos métodos fornecidos no presente documento (consultar, por exemplo, Publicação de PCT WO 94/08598; Stemple e Anderson, 1992, Cell 71:973 a 985; Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio.

21A:229; e Pittelkow e Scott, 1986, Mayo Clinic Proc.61:771).

[0480] Em uma modalidade específica, a ácido nucleico a ser introduzido com propósitos de terapia de gene compreende um promotor induzível ligado de forma operacional à região de codificação de modo que a expressão do ácido nucleico seja controlável por controle da presença ou da ausência do indutor apropriado de transcrição.

28. Polinucleotídeos que Codificam um Anticorpo

[0481] Também são fornecidos polinucleotídeos que compreendem a sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo fornecido no presente documento que se liga de forma imunoespecífica a um epítopo da Nectina-4.

Também são fornecidos no presente documento polinucleotídeos que hibridizam sob condições de hibridização de alta, média e baixa severidade, por exemplo, conforme definido acima, para polinucleotídeos que codificam um anticorpo modificado fornecido no presente documento.

[0482] os polinucleotídeos podem ser obtidos e a sequência de nucleotídeos dos polinucleotídeos determinada por qualquer método conhecido na técnica. Uma vez que as sequências de aminoácidos de certos anticorpos Nectina-4 fornecidos no presente documento são conhecidos, as sequências de nucleotídeos que codificam esses anticorpos e versões modificadas desses anticorpos podem ser determinadas com o uso de métodos bem conhecidos na técnica, isto é, códons de nucleotídeo conhecidos para codificar aminoácidos particulares são montados de modo a gerar um ácido nucleico que codifica o anticorpo. Tal polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser montado a partir de oligonucleotídeos quimicamente sintetizados (por exemplo, conforme descrito em Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242), que envolve brevemente a síntese de oligonucleotídeos sobrepostos que contêm porções da sequência que codifica o anticorpo, fragmentos ou variantes do mesmo, recozimento e ligação desses oligonucleotídeos e, então, amplificação dos oligonucleotídeos ligados por PCR.

[0483] Alternativamente, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo fornecido no presente documento pode ser gerado a partir de ácido nucleico de uma fonte adequada (por exemplo, M22-321b41.1 hibridoma conforme fornecido no presente documento que tem um número de acesso ATCC nº PTA-124245, depositado em 13 de junho de 2017). Se um clone que contém um ácido nucleico que codifica um anticorpo particular não estiver disponível, mas a sequência da molécula de anticorpo for conhecida, um ácido nucleico que codifica a imunoglobulina pode ser sintetizado ou obtido quimicamente a partir de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de cDNA de anticorpo ou uma biblioteca de cDNA gerada a partir do ácido nucleico, como poli A+ RNA, isolado, qualquer tecido ou células que expressam o anticorpo, como células de hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo fornecido no presente documento) por amplificação de PCR com o uso de preparadores sintéticos hibridizáveis com as extremidades 3’ e 5’ da sequência ou por clonagem com o uso de uma sonda oligonucleotídica específica para a sequência de gene particular para identificar, por exemplo, um clone de cDNA de uma biblioteca de cDNA que codifica o anticorpo. Então, os ácidos nucleicos amplificados gerados por PCR podem ser clonados em vetores de clonagem replicáveis com o uso de qualquer método bem conhecido na técnica.

[0484] Em certas modalidades, as moléculas de ácido nucleico fornecidas no presente documento compreendem ou consistem em uma sequência de ácido nucleico como retratada em qualquer uma dentre SEQ ID NO:38 (que codifica um VH) e/ou SEQ ID NO:37 (que codifica um VL) ou qualquer combinação das mesmas (por exemplo, como uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo fornecido no presente documento, como um anticorpo de comprimento completo, cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo ou um anticorpo de cadeia única fornecido no presente documento).

[0485] Em certos aspectos, são fornecidos no presente documento polinucleotídeos que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo descrito no presente documento ou um fragmento do mesmo (por exemplo,

uma região de cadeia leve variável e/ou uma região cadeia pesada variável) que se liga de forma imunoespecífica a um antígeno da Nectina-4 e aos vetores, por exemplo, vetores que compreendem tais polinucleotídeos para expressão recombinante nas células hospedeiras (por exemplo, E. coli e células mamíferas).

Em certos aspectos, as células são fornecidas no presente documento (por exemplo, células hospedeiras). Também são fornecidos no presente documento métodos de produção de os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno descrito no presente documento.

[0486] Em certos aspectos, são fornecidos no presente documento os polinucleotídeos que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve ou cadeia pesada de um anticorpo descrito no presente documento. Em certas modalidades, são fornecidos no presente documento os polinucleotídeos que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve ou cadeia pesada de um anticorpo descrito no presente documento. Os polinucleotídeos podem compreender sequências de nucleotídeos que codificam uma cadeia leve que compreende as FRs e CDRs de VL de anticorpos descritos no presente documento (consultar, por exemplo, as Tabelas 1 a 2 respectivamente). Os polinucleotídeos podem compreender sequências de nucleotídeos que codificam uma cadeia pesada que compreendem as FRs e CDRs de VH de anticorpos descritos no presente documento (consultar, por exemplo, as Tabelas 1 a 2 respectivamente). Em modalidades específicas, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica uma região de cadeia VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:37. Em modalidades específicas, um polinucleotídeo descrito no presente documento codifica uma região de cadeia VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:38.

[0487] Em particular modalidades, são fornecido no presente documento os polinucleotídeos que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo anti- Nectina-4 que compreende três CDRs de cadeia VL, por exemplo, que contêm CDR1 de VL, CDR2 de VL e CDR3 de VL do anticorpo M22-321b41.1 (por exemplo, consultar a Tabela 1). Em modalidades específicas, são fornecidos no presente documento os polinucleotídeos que compreendem três CDRs de cadeia VH, por exemplo, que contêm CDR1 de VH, CDR2 de VH e CDR3 de VH do anticorpo M22-321b41.1 (por exemplo, consultar a Tabela 1).

[0488] Em modalidades particulares, são fornecidos no presente documento os polinucleotídeos que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo anti- Nectina-4 que compreendem uma região de cadeia VL, por exemplo, que contêm FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, que compreendem sequências de aminoácidos descritas no presente documento (por exemplo, consultar as Tabelas 1 a 2). Em modalidades específicas, são fornecidos no presente documento os polinucleotídeos que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo anti- Nectina-4 que compreende três CDRs de cadeia VL, por exemplo, que contêm FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 de VL, CDR2 de VL e CDR3 de VL do anticorpo M22-321b41.1 (por exemplo, consultar a Tabela 1 a 2).

[0489] Em certas modalidades, um polinucleotídeo descrito no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo fornecido no presente documento que compreende uma região de cadeia leve variável (VL) que compreende um aminoácido descrito no presente documento (por exemplo, consultar a Tabela 1), em que o anticorpo se liga de forma imunoespecífica a um polipeptídeo da Nectina-4.

[0490] Em certas modalidades, um polinucleotídeo descrito no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo fornecido no presente documento que compreende uma região de cadeia pesada variável (VH) que compreende um aminoácido descrito no presente documento (por exemplo, consultar a Tabela 1), em que o anticorpo se liga de forma imunoespecífica a um polipeptídeo da Nectina-4.

[0491] Em certos aspectos, um polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo descrito no presente documento que compreende uma região de cadeia VL que compreende uma ou mais FRs de VL que têm a sequência de aminoácidos descrito no presente documento (por exemplo, consultar a Tabela 2), em que o anticorpo se liga de forma imunoespecífica a um polipeptídeo da Nectina-4. Em certos aspectos, um polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo descrito no presente documento que compreendem uma região de cadeia VH que compreende uma ou mais FRs de VH que têm a sequência de aminoácidos descrito no presente documento (por exemplo, consultar a Tabela 2), em que o anticorpo se liga de forma imunoespecífica a um polipeptídeo da Nectina-4, por exemplo, à Nectina-4 humana polipeptídeo.

[0492] Em modalidades específicas, um polinucleotídeo fornecido no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo descrito no presente documento que compreende: regiões de estrutura (por exemplo, regiões de estrutura do domínio VL e domínio VH) que são regiões de estrutura humana, em que o anticorpo de forma imunoespecífica se liga um polipeptídeo da Nectina-4.

[0493] Em uma certa modalidade, um polinucleotídeo fornecido no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeos, conforme descrito na Tabela 3, que codifica um VH ou um VL, respectivamente, do anticorpo M22- 321b41.1 descrito no presente documento, que se liga de forma imunoespecífica a um polipeptídeo da Nectina-4.

Produção Recombinante de um Anticorpo

[0494] A expressão recombinante de um anticorpo fornecido no presente documento (por exemplo, um anticorpo de comprimento completo, cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo ou um anticorpo de cadeia única fornecido no presente documento) que se liga de forma imunoespecífica a um antígeno da Nectina-4 exige a construção de um vetor de expressão que contém um polinucleotídeo que codifica o anticorpo. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica uma molécula de anticorpo, cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou um fragmento do mesmo (como, mas não necessariamente, contendo o domínio de cadeia pesada e/ou leve variável) fornecido no presente documento foi obtido, o vetor para a produção da molécula de anticorpo pode ser produzido por tecnologia de DNA recombinante com o uso de técnicas bem conhecidas na técnica. Assim, os métodos para preparar uma proteína por uma expressão de um polinucleotídeo que contém uma sequência de codificação de anticorpo de nucleotídeos são descritos no presente documento. Os métodos que são bem conhecidos por aqueles elementos versados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão contendo sequências de codificação de anticorpo e sinais de controle transcricionais e transducionais apropriadas. Esses métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. Também são fornecidos vetores replicáveis que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo molécula fornecido no presente documento, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, um domínio de cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou um fragmento do mesmo ou uma CDR de cadeia pesada ou leve ligado de forma operacional a um promotor. Tais vetores podem incluir a sequência de nucleotídeos que codifica a região constante da molécula de anticorpo (consultar, por exemplo, Publicação Internacional nº WO 86/05807 e nº WO 89/01036; e Patente nº US

5.122.464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado em tal um vetor para expressão de toda a cadeia pesada, de toda a cadeia leve ou de ambas todas as cadeias pesadas e leves. O vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeira por técnicas convencionais e, então, as células transfectadas são cultivadas por técnicas convencionais para produzir um anticorpo fornecido no presente documento. Assim, também são fornecidas no presente documento as células hospedeiras que contêm um polinucleotídeo que codifica um anticorpo fornecido no presente documento ou seus fragmentos ou uma cadeia pesada ou leve do mesmo ou fragmento do mesmo ou um anticorpo de cadeia única fornecido no presente documento ligado de forma operacional a um promotor heterólogo. Em certas modalidades para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, os vetores que codificam tanto cadeias pesadas quanto cadeias leves podem ser coexpressados na célula hospedeira para expressão de toda a molécula de imunoglobulina conforme detalhado abaixo].

[0495] Uma variedade de sistemas de expressão vetor hospedeiro pode ser utilizada para expressar as moléculas de anticorpo fornecidas no presente documento (consultar, por exemplo, Patente nº US 5.807.715). Tais sistemas de expressão de vetor hospedeiro representam veículos pelos quais as sequências de codificação de interesse podem ser produzidas e, subsequentemente, purificadas, mas representam também células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de codificação de nucleotídeo apropriadas, expressar uma molécula de anticorpo fornecida no presente documento in situ.

Esses incluem, mas não se limitam micro-organismos, como bactérias (por exemplo, E. coli e B. subtilis) transformadas com vetores de DNA de bacteriófago recombinante, de DNA plasmídico ou de DNA cosmídico que contêm sequências de codificação de anticorpo; levedura (por exemplo, Saccharomyces Pichia) transformada com vetores de expressão de levedura recombinante que contém sequências de codificação de anticorpo; sistemas de célula de inseto infectadas com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, baculovírus) que contêm sequências de codificação de anticorpo; sistemas de célula de planta infectados com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus de mosaico de couve-flor, CaMV, vírus de mosaico de tabaco, TMV) ou transformados com vetores de expressão de plasmídeo (por exemplo, plasmídeo Ti) que contêm sequências de codificação de anticorpo; ou sistemas de célula mamífera (por exemplo, células COS, CHO, BHK, 293, NS0 e 3T3) que abrigam construtos de expressão recombinante que contêm promotores derivados do genoma de células mamíferas (por exemplo, promotor de metalotioneía) ou de vírus mamíferos (por exemplo, o promotor tardio de adenovírus; o promotor de vírus vaccinia 7,5 K). As células bacterianas, como Escherichia coli, ou células eucarióticas, especialmente para a expressão de toda a molécula de anticorpo recombinante, podem ser usadas para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, as células mamíferas, como células ovarianas de hamster chinês (CHO), em conjunto com um vetor, como o principal de promotor de gene intermediário precoce de citomegalovírus humano é um sistema de expressão eficaz para anticorpos (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; e Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2). Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos no presente documento são produzidos em células de CHO.

Em uma modalidade específica, a expressão de sequências de nucleotídeos que codificam anticorpos fornecidos no presente documento que se ligam de forma imunoespecífica a um antígeno da Nectina-4 é regulada por um promotor constitutivo, promotor induzível ou promotor específico de tecido.

[0496] Em sistemas bacterianos, diversos vetores de expressão podem ser selecionados vantajosamente dependendo do uso pretendido para a molécula de anticorpo que é expressada. Por exemplo, quando uma grande quantidade de tal anticorpo deve ser produzida, para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, os vetores que direcionam a expressão de altos níveis de produtos de proteína de fusão que são purificados prontamente podem ser desejáveis. Tais vetores incluem, mas não se limitam a, o vetor de expressão de E.

coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791), no qual a sequência de codificação de anticorpo pode ser ligada individualmente ao vetor na estrutura com a região de codificação de lac Z de modo que uma proteína de fusão seja produzida; aos vetores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res.13:3101 a 3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); e similares. Os vetores pGEX podem ser usados também para expressar polipeptídeos estranhos como proteínas de fusão com glutiona 5-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser purificadas facilmente a partir de células lisadas por adsorção e ligação a esferas de agarose de glutiona de matriz seguidas por eluição na presença de glutiona livre. Os vetores pGEX são projetados para incluir locais de clivagem de protease de trombina ou factor Xa de modo que o produto de gene alvo clonado possa ser liberado da fração de GST

[0497] Em um sistema de insetos, o vírus de poliedrosis nucleares Autographa californica (AcNPV) é usado como um vetor para expressar genes estranhos. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência de codificação de anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo, o gene de poliedrina) do vírus e colocada sob controle de um promotor AcNPV (por exemplo, o promotor de poliedrina).

[0498] Em células hospedeiras de mamíferos, uma diversidade de sistemas de expressão à base de vírus pode ser usada. em casos em que um adenovírus é usado como um vetor de expressão, a sequência de codificação de anticorpo de interesse pode ser ligada a um complexo de controle de transcrição/controle de adenovírus, por exemplo, a sequência principal promotora e tripartida anterior. Esse gene quimérico pode, então, ser inserido no genoma de adenovírus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção em uma região não essencial do genoma viral (por exemplo, região El ou E3) resultará em um vírus recombinante que é viável e tem a capacidade para ser uma expressão da molécula de anticorpo em hospedeiros infectados (por exemplo, ver Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 81:355-359). Sinais de iniciação específicos também podem ser exigidos para a tradução eficaz de sequência de codificação de anticorpos inseridas. Esses sinais incluem o códon de iniciação ATG e sequências adjacentes. Ademais, o códon de iniciação deve estar na fase com a estrutura de leitura da sequência de codificação desejada para garantir a tradução do inserto inteiro. Esses sinais de controle traduzíveis exógenos e códons de iniciação podem ser de uma variedade de origens, tanto natural quanto sintética. A eficácia da expressão pode ser melhorada pela inclusão de elementos melhoradores de transcrição, terminações de transcrição etc., adequados. (ver, por exemplo, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol.153:51-544).

[0499] Além disso, uma cepa de célula hospedeira pode ser escolhida, a qual modula a expressão das sequências inseridas ou modifica e processa o produto de gene da maneira específica desejada. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos de proteína podem ser importantes para a função da proteína. Células hospedeiras diferentes têm características e mecanismos específicos para o processamento pós-tradução e modificação de proteínas e produto de genes. Linhagens celulares ou sistemas hospedeiros adequados podem ser escolhidos para garantir a modificação e o processamento corretos da proteína estranha expressada. Para esse fim, células hospedeiras eucarióticas que possuem o maquinário celular para o processamento adequado da transcrição primária, glicosilação e fosforilação do produto de gene podem ser usadas. Tais células hospedeiras de mamíferos incluem, mas sem limitação, células CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O e T47D, NS0 (uma linhagem celular de mieloma murinho que não produz endogenamente quaisquer cadeias de imunoglobulina), CRL7O3O e

HsS78Bst. em algumas modalidades, anticorpos monoclonais anti-Nectina-4 totalmente humanos fornecidos no presente documento são produzidos em células de mamíferos, como Células CHO.

[0500] Para a produção de alto rendimento a longo prazo de proteínas recombinantes, a expressão estável pode ser usada. Por exemplo, linhagens celulares que expressam estavelmente a molécula de anticorpo podem ser geneticamente modificadas. em vez de usar vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado por elementos de controle de expressão adequados (por exemplo, promotor, melhorador, sequências, terminações de transcrição, sítios de poliadenilação etc.) e um marcador selecionável. Após a introdução do DNA estranho, pode-se permitir que células geneticamente modificadas podem ser cresçam por 1-2 dias em um meio enriquecido e, então, trocadas por um meio seletivo.

[0501] O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células se integrem estavelmente o plasmídeo em seus cromossomos e cresçam para formar foci que, por sua vez, pode ser clonado e expandido em linhagens celulares. Esse método pode ser vantajosamente usado para modificar geneticamente linhagens celulares que expressam uma molécula de anticorpo. Tais linhagens celulares geneticamente modificadas podem ser particularmente úteis na triagem e avaliação de composições que interagem direta ou indiretamente com a molécula de anticorpo.

[0502] Uma diversidade de sistemas de seleção pode ser usada, incluindo, porém sem limitação, os genes de timidina quinase do vírus herpes simplex (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), hipoxantinaguanina fosforibosiltransferase (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202) e adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17) pode ser empregados em células-tk, hgprt ou aprt,

respectivamente. Ademais, a resistência antimetabolita pode ser usada como a base da seleção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência a metotrexato (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O’Hare et al., 1981, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que confere resistência a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 (Wu e Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann.

Rev. Pharmacol. Toxicol.32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; e Morgan e Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem.62:191-217; Pode, 1993, TIB TECH 11(5):l55-215); e hygro, que confere resistência a higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). Métodos comumente conhecidos na técnica de tecnologia de DNA recombinante podem ser rotineiramente aplicados para selecionar o clone recombinante desejado e tais métodos são descritos, por exemplo, em Ausubel et al.

(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); e nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol.

Biol.150:1, que são incorporados a título de referência ao presente documento em suas totalidades.

[0503] Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados por amplificação de vetor (para uma revisão, ver Bebbington e Hentschel, The use of vectors com base em gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Volume 3 (Academic Press, New York, 1987)). Quando um marcador no sistema vetorial que expressa anticorpo for amplificável, o aumento no nível de inibidor presente na cultura da célula hospedeira aumentará o número de cópias do gene marcador. Visto que a região amplificada é associada ao gene de anticorpo, a produção do anticorpo também aumentará (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol.3:257).

[0504] A célula hospedeira pode ser cotransfectada com dois vetores de expressão fornecido no presente documento, em que o primeiro vetor codifica uma cadeia pesada derivada de polipeptídeo e o segundo vetor codifica uma cadeia leve derivada de polipeptídeo. Os dois vetores podem conter marcadores selecionável idênticos que permitem a expressão igual de polipeptídeos de cadeia pesada e leve.

Alternativamente, um vetor único pode ser usado, o qual codifica e tem a capacidade para expressa polipeptídeos tanto de cadeia pesada quando de cadeia leve. em tais situações, a cadeia leve deve ser substituída antes da cadeia pesada para evitar um excesso de cadeia pesada isenta de produtos tóxicos (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; e Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197-2199). As sequências de codificação para as cadeias pesadas e leves podem compreendem cDNA ou DNA genômico.

[0505] Uma vez que uma molécula de anticorpo fornecida no presente documento tenha sido produzida por expressão recombinante, a mesma pode ser purificada por qualquer método conhecido na técnica para purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, troca de íons, afinidade, particularmente por afinidade com o antígeno específico após Proteína A e cromatografia em coluna de dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Ainda, os anticorpos fornecidos no presente documento podem ser fusionados a sequências de polipeptídeo heterólogo descritas no presente documento ou de outro modo conhecido na técnica para facilitar a purificação. 29.

Ensaios e Métodos de Diagnóstico de Detecção

[0506] em um aspecto, anticorpos anti-Nectina-4 e fragmentos dos mesmos da presente divulgação são úteis para detectar a presença de Nectina-4 em uma amostra biológica. Tais anticorpos anti-Nectina-4 podem incluir aqueles que se ligam a Nectina-4 humana mas não induzem Atividade de sinalização de Nectina-4. O termo “detectar” ou “detecção”, como utilizado no presente documento, abfaixa detecção quantitativa ou qualitativa e se refere a usar leituras ou resultados de um ensaio para realizar uma determinação com relação à presença/ausência de Nectina-4 na amostra, o nível de expressão relativo de Nectina-4 na amostra (por exemplo, relativo a uma ou mais expressões de referência, relativo a outras amostras ou relativo a uma ou mais escalas de expressão) ou a concentração de Nectina-4 na amostra. A leitura detectada do ensaio pode ser dados numéricos, por exemplo, resultados de qPCR, resultados de ensaios imunológicos ou uma concentração proteica medida; a leitura detectada pode ser dados não numéricos, por exemplo, manchamento de células ou tecidos com anticorpos anti-Nectina-4 em imagens microscópicas ou manchamento de Nectina-4 em uma citometria de fluxo de imagem; ou a leitura detectada pode ser quaisquer dados experimentais que podem ser usados como um indicador para a expressão da Nectina-4, bem como para um perito na técnica, por exemplo, intensidade fluorescente, intensidade luminescente, leituras colorimétricas e espectroscopia de absorção/emissão. A leitura detectada nos ensaios é denominada no presente documento sinal do ensaio.

[0507] Como fornecido no presente documento, uma amostra biológica são amostras ou materiais que têm uma origem biológica. Amostras biológicas incluem amostra de fluido corporal, uma célula ou tecido. em algumas modalidades, a célula pode ser uma linhagem celular cultivada, células geneticamente modificadas, cultura in vitro ou ex vivo de células obtidas a partir de um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano ou células obtidas a partir de um indivíduo. em outras modalidades, as amostras de tecido podem incluir fluido corporal ou um tecido obtidas a partir de um indivíduo, incluindo um indivíduo humano. em algumas modalidades, as amostras de tecido incluem amostras de uma região de um indivíduo com suspeita de um a doença. Desse modo, amostras de tecido podem ser, porém sem limitação, tecidos, fluido corporal, frações de tecido e/ou células isoladas de um organismo, como um mamífero, em particular, um ser humano. em uma modalidade particular, as amostras de tecido são preparadas em seções que foram fixadas em formalina, embebidas em parafina (FFPE). As células, o fluido corporal e/ou o tecido podem ser obtidos a partir de um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano, por métodos bem conhecidos por um perito na técnica, por exemplo, biópsia (incluindo biópsia líquida), procedimentos cirúrgicos, esmerilhamento celular e flebotomia.

[0508] em um aspecto, a presente divulgação fornece um método para detectar a presença de Nectina-4 em uma amostra biológica. em determinadas modalidades, o método compreende colocar a amostra biológica em contato com um anticorpo anti-Nectina-4 sob condições permissivas para a ligação do anticorpo anti- Nectina-4 a Nectina-4 e detectar a ligação entre um anticorpo anti-Nectina-4 e Nectina-4.

[0509] Como é bem conhecido por um perito na técnica, a quantidade de um anticorpo ligada a um antígeno em uma amostra biológica está relacionada à quantidade do antígeno na amostra biológica. Portanto, a quantidade de ligação de um anticorpo anti-Nectina-4, como fornecido no presente documento, a Nectina-4 em uma amostra biológica pode ser usada para medir a quantidade ou o nível de expressão da Nectina-4 na amostra biológica. em algumas modalidades, a quantidade de Nectina-4 na amostra biológica é detectada na faixa de detecção linear do anticorpo anti-Nectina-4. A “faixa de detecção linear” se refere à faixa da quantidade ou concentração de um antígeno, dentro da qual a ligação de anticorpo se relaciona linearmente com a quantidade ou concentração do antígeno na amostra biológica. Tal faixa linear depende de fatores como a afinidade entre o anticorpo e o antígeno, a concentração do anticorpo usada para a ligação de anticorpo ao antígeno e a condição usada para a ligação de anticorpo ao antígeno.

[0510] A concentração do anticorpo usada para a ligação de anticorpo ao antígeno pode ser avaliada em experimentos de titulação. em uma modalidade de tais experimentos de titulação, a concentração de um anticorpo é diluída em série por um fator de duas vezes, três vezes, cinco vezes ou dez vezes e os anticorpos diluídos em série foram, cada um, ligados a amostras de controle com quantidade conhecida do antígeno correspondente. em uma modalidade, a concentração de anticorpo desejável é aquela em que a quantidade de anticorpo ligação diferencia da faixa de detecção linear mais ampla.

[0511] A expressão de Nectina-4 na amostra biológica se refere à quantidade de Nectina-4 na amostra biológica em um determinado período de tempo.

A expressão de Nectina-4 como medida reflete o acúmulo de Nectina-4 na amostra biológica ao longo de um período de tempo e pode incluir produtos de degradação ou modificação, como Nectina-4 de comprimento completo, fragmentos de Nectina-4 e naturalmente modificados, por exemplo, Nectina-4 glicosilada. Como as proteínas são traduzidas a partir de mRNAs, os níveis de mRNA na amostras biológicas podem ser usados como um indicador para a expressão de Nectina-4 na amostras biológicas.

[0512] São fornecidos no presente documento métodos para avaliação da expressão da Nectina-4 em uma amostra de tecido de um indivíduo suspeito de ter câncer, incluindo: (a) o contato da dita amostra de tecido com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma, como fornecido no presente documento; (b) detecção da ligação do dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo à dita amostra de tecido; (c) a determinação da expressão da Nectina-4 na amostra de tecido, em que o nível de expressão da Nectina-4 na amostra de tecido é comparado a um nível de expressão de referência da Nectina-4.

[0513] Também São fornecidos no presente documento métodos para avaliação da expressão da Nectina-4 em uma amostra de tecido de um indivíduo suspeito de ter câncer, incluindo: (a) realizar um ensaio de IHC na amostra de tecido com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como fornecido no presente documento; (b) determinar a expressão da Nectina-4 na amostra de tecido, em que o nível de expressão da Nectina-4 na amostra de tecido é comparado a um nível de expressão de referência da Nectina-4.

[0514] Também São fornecidos no presente documento métodos para avaliar a resposta de um paciente com câncer a um agente terapêutico anticâncer, em que o dito método tem como base a expressão da Nectina-4 em uma amostra de tecido do dito paciente, incluindo: (a) colocar a dita amostra de tecido em contato com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma, como fornecido no presente documento; (b) detectar a ligação do dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo à dita amostra de tecido; (c) a determinação da expressão da Nectina-4 na amostra de tecido, em que o nível de expressão da Nectina-4 na amostra de tecido é comparado a um nível de expressão de referência da Nectina-4; em que um nível de expressão da Nectina-4 aumentado comparado à referência é indicativo de capacidade de resposta à dita terapia anticâncer.

[0515] Também são fornecidos no presente documento métodos para avaliação da capacidade de resposta de um paciente com câncer a um agente terapêutico anticâncer, o dito método baseado na expressão da Nectina-4 em uma amostra de tecido do dito paciente, incluindo: (a) realizar um ensaio de IHC na amostra de tecido com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como fornecido no presente documento; (b) determinar a expressão da Nectina-4 na amostra de tecido, em que o nível de expressão da Nectina-4 na amostra de tecido é comparado a um nível de expressão de referência da Nectina-4, em que um nível de expressão da Nectina-4 aumentado na amostra de tecido comparado à referência é indicativo de capacidade de resposta à dita terapia anticâncer.

[0516] São fornecidos no presente documento métodos de tratamento de câncer em um indivíduo, incluindo (a) determinar o nível de expressão de Nectina-4 em uma amostra de tecido do indivíduo com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como fornecido no presente documento, em que o nível de expressão da Nectina-4 na amostra de tecido é superior a um nível de expressão de referência da Nectina-4; (b) administrar um agente terapêutico anticâncer ao indivíduo.

[0517] São fornecidos no presente documento métodos de tratamento de câncer em um indivíduo incluindo (a) colocar uma amostra de tecido do indivíduo em contato com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como fornecido no presente documento; (b) determinar o nível de expressão de Nectina-4 na amostra de tecido do indivíduo com anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como fornecido no presente documento, em que o nível de expressão da Nectina-4 na amostra de tecido é superior a um nível de expressão de referência da Nectina-4; (c) administrar um agente terapêutico anticâncer ao indivíduo.

[0518] São fornecidos no presente documento métodos de tratamento de câncer em um indivíduo incluindo (a) obter uma amostra de tecido do indivíduo ; (b) colocar a amostra de tecido do indivíduo em contato com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como fornecido no presente documento; (c) determinar o nível de expressão de Nectina-4 em uma amostra de tecido do indivíduo com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como fornecido no presente documento, em que o nível de expressão da Nectina-4 na amostra de tecido é superior a um nível de expressão de referência da Nectina-4; (d) administrar um agente terapêutico anticâncer ao indivíduo.

[0519] O indivíduo em qualquer método fornecido no presente documento pode ser um indivíduo humano e o indivíduo pode ter qualquer câncer para o qual uma determinação de expressão da Nectina-4 pode ser realizada e/ou para o qual a expressão da Nectina-4 pode fornecer diagnóstico, prognóstico ou valor preditivo.

Cânceres exemplificativos incluem leucemia linfoblástica aguda; linfoma linfoblástico agudo; leucemia linfócitica aguda; leucemia mielógica aguda; leucemia mieloide aguda (adulta/infantil); carcinoma adrenocortical; Cânceres relacionados a AIDS; Linfoma relacionado a AIDS; câncer de ânus; câncer de apêndice; astrocitomas; tumor teratoide/rabdoide atípico; carcinoma de células basal; câncer de duto biliar, extra-hepático (colangiocarcinoma); câncer de bexiga; osteossarcoma ósseo/histiocitoma fibroso maligno; câncer cerebral (adulto/infantil); tumor cerebral, astrocitoma cerebelar (adulto/infantil); tumor cerebral, astrocitoma cerebral/glioma maligno tumor cerebral; tumor cerebral, ependimoma; tumor cerebral, meduloblastoma; tumor cerebral, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais; tumor cerebral, glioma hipotalâmico e de trajetória visual; glioma de tronco encefálico; câncer de mama; adenomas/carcinoides bronquiais; tumor bronquial; linfoma de Burkitt; câncer infantil; tumor gastrointestinal carcinoide; tumor carcinoide; carcinoma de adulto, sítio primário desconhecido; carcinoma primário desconhecido; tumor embrionário de sistema nervoso central; linfoma de sistema nervoso central, primário; câncer de cervical; carcinoma adrenocortical infantil; cânceres infantis; astrocitoma cerebral infantil; cordoma, infantil; leucemia linfocitica crônica; leucemia mielógica crônica; leucemia mieloide crônica; transtortornos mieloproliferativos crônicos; câncer de cólon; câncer colorretal; craniofaringioma; linfoma de célula T cutâneo; tumor de célula redonda pequena desmoplástico; efisema; câncer endometrial; ependimoblastoma; ependimoma; câncer de esôfago; sarcoma de ewing na família Ewing de tumores; tumor de célula germinal extracranial; tumor de célula germinal extragonadal; extra-hepático câncer de duto biliar extra-hepático; câncer de vesícula biliar; câncer gástrico (de estômago); carcinoide gástrico; tumor carcinoide gastrointestinal; tumor estromal gastrointestinal;

tumor de célula germinal: tumor trofoblástico gestacional extracranial, extragonadal ou ovariano; tumor trofoblástico gestacional, sítio primário desconhecido; glioma;

glioma do tronco encefálico; glioma, trajetória visual infantile hipotalâmico; leucemia de célula capilar; câncer de cabeça e pescoço; câncer de coração; câncer hepatocelular (de fígado); linfoma de hodgkin; câncer hipofaringeal; glioma hipotalâmico e de trajetória visual; melanoma intraocular; carcinoma de célula de ilhota (pâncreas endócrino); Sarcoma de Kaposi; câncer de rim (câncer de célula renal); histiocitose de célula langerhans; câncer laringeal; câncer de cavidade oral e lábio; lipossarcoma; câncer de fígado (primário); câncer de pulmão; linfoma, sistema nervoso central primário; macroglobulinemia, Waldenström; câncer de mama masculina; histiocitoma fibroso maligno ósseo/osteossarcoma; meduloblastoma;

meduloepitelioma; melanoma; melanoma, intraocular (olho); câncer de célula merkel;

carcinoma de pele de célula merkel; mesotelioma; mesotelioma, maligno de adulto;

câncer de pescoço escamoso metastático com oculto primário; câncer de boca;

síndrome de neoplasia endócrina múltipla; mieloma múltiplo/neoplasma de célula plasmática; micose fungoide, síndromes mielodisplásticas; doenças mielodisplásticas/mieloproliferativas; leucemia mielógica, crônica; leucemia mieloide,

de aduto aguda; leucemia mieloide, infantil aguda; mieloma, múltiplo (câncer da medula espinhal); transtornos mieloproliferativos, crônicos; câncer de cavidade nasal e seio paranasal; carcinoma nasofaringeal; neuroblastoma, câncer de pulmão de célula não pequena; linfoma de não hodgkin; oligodendroglioma; câncer oral; câncer de cavidade oral; câncer orofaringeal; osteossarcoma/histiocitoma fibroso maligno ósseo; câncer de ovário; câncer eptelial ovariano (tumor estromal-eptelial de superfície); tumor de célula germinal ovariano; tumor ovariano de potencial maligno baixo; câncer pancreático; câncer pancreático de célula ilhota; papilomatose; câncer de seio paranasal e cavidade nasal; câncer de paratireoide; câncer de pênis; câncer paringeal; feocromocitoma; astrocitoma pineal; germinoma pineal; tumores parenquimais pineais de diferenciação intermediária; pineoblastoma e tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais; tumor pituário; adenoma pituário; neoplasia de célula plasmática/mieloma múltiplo; blastoma pleuropulmonar; linfoma de sistema nervoso central primário; câncer de próstata; câncer retal; carcinoma de célula renal (câncer de rim); pélvis renal e ureter, câncer de célula transicional; carcinoma de trato respiratório que envolve o gene NUT no cromossomo 15; retinoblastoma; rabdomiossarcoma, infantil; câncer de glândula salivar; sarcoma, Família Ewing de tumores; síndrome de Sézary; câncer de pele (melanoma); câncer de pele (não melanoma); câncer de pulmão de célula pequena; sarcoma de tecido mole de câncer de intestino pequeno; sarcoma de tecido mole, tumor de medula espinhal; carcinoma de célula escamosa; câncer de pescoço escamoso com oculto primário metastático; câncer de estômago (gástrico); tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial; Linfoma de célula T, cutâneo (Micose fungoide e síndrome de Sézary); câncer testicular; câncer de garganta; timoma; carcinoma de timoma e tímico; câncer de tireoide; câncer de tireoide, infantil; câncer de célula transicional da pélvis renal e ureter; câncer uretal; câncer uterino, endometrial; câncer urotelial, câncer de bexiga, câncer de um ureter, câncer de uma uretra e câncer de ovário, sarcoma uterino; câncer vaginal; câncer vulvar; Tumor de Wilms; e outros cânceres de origem epitelial nos quais Nectina-4 é expressa.

[0520] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos no presente documento, um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano com suspeita de ter câncer selecionado a partir de um grupo que consiste em câncer endometrial, câncer urotelial, câncer de bexiga, câncer de um ureter, câncer de uma uretra, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, câncer de próstata, câncer de pênis, câncer de ânus, cânceres da vulva, câncer de ovário e outros cânceres de origem epitelial no qual Nectina-4 é expressa.

[0521] Como usado no presente documento, o termo “responsividade” se refere à probabilidade de uma célula ou uma pessoa ou paciente ou um indivíduo responder ou ter uma reação ao tratamento com um agente terapêutico anticâncer.

A responsividade pode incluir a probabilidade de uma ampla faixa de reações ao agente terapêutico anticâncer, por exemplo, e sem qualquer limitação, proliferação ou crescimento diminuído de células cancerosas, morte celular de células cancerosas aumentada, redução no número de células cancerosas ou no tamanho do tumor, taxa reduzida de aumento do tamanho do tumor, progressão retardada dos estágios do câncer, regressão dos estágios do câncer ou do tamanho do tumor, redução na expressão de marcadores de câncer, metástase reduzida de câncer e/ou resultado de paciente aprimorado, como recuperação da massa corporal do paciente,

da taxa de sobrevivência do paciente em 6 meses , 1 ano, 2 anos, 3 anos ou 5 anos e/ou a duração de sobrevivência dos pacientes. em determinadas modalidades, a responsividade pode ser escalonada como insensibilidade (isto é, menos provável de responder), sensibilidade (provavelmente responderá) e/ou indeterminada. em determinadas modalidades, a célula ou o tecido ou pessoa ou paciente ou indivíduo tem mais probabilidade de responder a um agente terapêutico anticâncer quando a célula, o tecido, o paciente ou indivíduo mostra uma expressão significativa de

Nectina-4 em sua célula tumoral ou cancerosa. em determinadas modalidades, a responsividade aumenta com o nível aumentado de Nectina-4 nas células/tecidos tumorais ou cancerosos. em determinadas modalidades, a responsividade se correlaciona com ao nível de expressão da Nectina-4 nas células/tecidos tumorais ou cancerosos. em determinadas modalidades, a responsividade é linearmente proporcional ao nível de expressão da Nectina-4 nas células/tecidos tumorais ou cancerosos. em outras modalidades, a responsividade de uma célula, tecido,

paciente ou indivíduo a um agente terapêutico anticâncer pode ser 10%, 20%, 30%,

40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%,

500%, 750%, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes ou mais que as células negativas para expressão da Nectina-4.

[0522] Como usado no presente documento, “indicativo de responsividade” se refere a uma previsão de que a responsividade será maior em uma célula, tecido, pessoa ou indivíduo, que em outra célula, tecido, pessoa ou indivíduo. Tais previsões são realizadas com base em determinados critérios. em algumas modalidades, a previsão da responsividade é realizada com base n o nível de expressão da Nectina- 4 na célula, tecido, tumor, pessoa ou indivíduo. Como descrito acima, em determinadas modalidades, prevê-se que a célula ou o tecido ou a pessoa ou o paciente ou o indivíduo tem maior probabilidade de responder a um agente terapêutico anticâncer quando a célula, o tecido, o paciente ou o indivíduo exibem uma expressão significativa de Nectina-4 em sua célula tumoral ou cancerosa. em determinadas modalidades, prevê-se que a responsividade aumenta com o nível aumentado de Nectina-4 nas células/tecidos tumorais ou cancerosos. em determinadas modalidades, prevê-se que a responsividade se correlaciona a o nível de expressão da Nectina-4 nas células/tecidos tumorais ou cancerosos. em determinadas modalidades, prevê-se que a responsividade é linearmente proporcional ao nível de expressão da Nectina-4 nas células/tecidos tumorais ou cancerosos. em outras modalidades, a responsividade de uma célula, um tecido, um paciente ou um indivíduo a um agente terapêutico anticâncer é prevista como 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 750%, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes ou mais que as células negativas para expressão da Nectina-4.

[0523] O agente terapêutico anticâncer pode ser qualquer agente terapêutico anticâncer ou qualquer terapia anticâncer para a qual a expressão da Nectina-4 pode fornecer diagnóstico, prognóstico ou valor preditivo. em determinadas modalidades, o agente terapêutico é um direcionado a processos biológicos, por exemplo, uma trajetória de sinalização, uma trajetória metabólica ou uma trajetória de síntese/degradação de proteína, na qual Nectina-4 desempenha um papel. em determinadas modalidades, o agente terapêutico é um que é direcionado à atividade da Nectina-4, sinalização de Nectina-4 ou doenças mediadas por Nectina-4. em uma modalidade específica, o agente terapêutico é um anticorpo anti-Nectina-4 ou um conjugado de fármaco de anticorpo anti-Nectina-4.

[0524] Para uma determinação da expressão da Nectina-4 na amostra de tecido, o nível de expressão da Nectina-4 na amostra de tecido é comparada a um nível de expressão de referência da Nectina-4. O “nível de expressão de referência”, como usado no presente documento, se refere a um nível de expressão em uma amostra de referência que, quando comparado ao nível de expressão da Nectina-4 na amostra de teste, fornece informações relativas sobre a expressão da Nectina-4 na amostra de teste. O nível de expressão de referência pode ser um nível de expressão conhecido, por exemplo, expressão na amostra de referência em que a quantidade, concentração e/ou quantidade de mole de Nectina-4 é conhecida. Por exemplo, o nível de expressão de referência pode ser a expressão da Nectina-4 em uma linhagem celular em que as células foram transfectadas ou geneticamente modificadas de outro modo para expressar a quantidade conhecida de Nectina-4.

em algumas modalidades, o nível de expressão de referência pode ser a expressão da Nectina-4 em uma célula em que a expressão da Nectina-4 foi quantificada por métodos fornecidos no presente documento ou conhecidos por um perito na técnica, como ELISA, SDS-PAGE, imunoprecipitação quantitativa e/ou western blotting quantitativo. em outras modalidades, o nível de expressão de referência envolve mais que uma referência, como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 e mais referências. em uma modalidade, o nível de referência tem 4 referências: uma negativa para expressão da Nectina-4, uma com expressão fraca da Nectina-4, um com expressão moderada da Nectina-4 e um com expressão alta/forte da Nectina-4.

[0525] Alternativamente, um nível de expressão de referência pode ser um nível em que a concentração ou quantidade exata de Nectina-4 é desconhecida, mas o estado, atividade e/ou função da amostra de referência é conhecido. em algumas modalidades, os níveis de expressão de referência podem ser aqueles de uma célula não cancerosa do mesmo paciente que tem suspeita de ter câncer. em tais modalidades, comparando-se a expressão da Nectina-4 na amostra de teste com aquela na amostra de referência, a expressão da Nectina-4 na amostra de teste relativa (por exemplo, maior que, menor que ou substancialmente a mesma que) à expressão da Nectina-4 das células não cancerosas podem ser determinadas. em outras modalidades, os níveis de expressão de referência podem ser aqueles de uma célula cancerosa, em que comparando-se a expressão da Nectina-4 na amostra de teste com aquela na amostra de referência, a expressão da Nectina-4 na amostra de teste relativa (por exemplo, maior que, menor que ou substancialmente a mesma) à expressão da Nectina-4 das células cancerosas pode ser determinada.

em outras modalidades, os níveis de expressão de referência podem ser aqueles de uma célula de um segundo indivíduo, em que comparando-se a expressão da Nectina-4 na amostra de teste com aquela na amostra de referência, a expressão da Nectina-4 na amostra de teste relativa (por exemplo, maior que, menor que ou substancialmente a mesma) à expressão da Nectina-4 das células de um segundo indivíduo pode ser determinada. O segundo indivíduo pode ser um indivíduo humano normal que não tem câncer, um indivíduo humano que tem o mesmo tipo de câncer que o paciente com suspeita de câncer ou um indivíduo humano que tem um tipo diferente de câncer daquele do paciente com suspeita.

[0526] A amostra de referência e células de referência, como é descrito no presente documento, pode ser uma linhagem celular, uma cultura in vitro ou ex vivo de células obtidas a partir de paciente com suspeita de ter câncer, células obtidas a partir de paciente com suspeita de ter câncer, cultura in vitro ou ex vivo de células obtidas a partir de um segundo indivíduo, células obtidas a partir de um segundo indivíduo.

[0527] Portanto, em algumas modalidades dos métodos fornecidos no presente documento, o nível de expressão de referência da Nectina-4 pode ser o nível de expressão da Nectina-4 em células cancerosas, células não cancerosas do dito indivíduo ou células não cancerosas de um segundo indivíduo.

[0528] Como descrito acima, em algumas modalidades, a expressão da Nectina-4 em uma amostra pode ser determinada correlacionando-se ou comparando-se a ligação de anticorpo anti-Nectina-4 à amostra com a ligação de anticorpo anti-Nectina-4 às referências negativas e positivas, em que os níveis de expressão da Nectina-4 nas referências são conhecidos. A expressão de referência da Nectina-4 pode ser um controle de Nectina-4 positivo ou um controle de Nectina- 4 negativo. Como usado no presente documento, um “controle de Nectina-4 positivo” ou um “controle positivo” se refere a uma célula, um tecido, um tumor, um ser humano e/ou um indivíduo conhecido por expressar quantidade significativa de Nectina-4. Um “controle de Nectina-4 negativo” ou “controle negativo” se refere a células e/ou tecidos conhecidos por expressar nenhuma Nectina-4 ou nível baixo de Nectina-4, de modo que a Nectina-4 nas células ou nos tecidos não sejam biologicamente significativos. O nível de Nectina-4 é biologicamente insignificante quando (1) um perito na técnica considerar o nível de expressão da Nectina-4 baixo em vista de um produto de proteína de um gene de manutenção; (2) a presença ou ausência da quantidade baixa de Nectina-4 não faz uma diferença biológica a uma célula ou tecido; e (3) se essa quantidade insignificante de Nectina-4 for removida ou deletada das células ou dos tecidos, as células ou os tecidos continuarão a funcionar substancialmente da mesma forma que antes de tal remoção ou deleção. A expressão conhecida da Nectina-4 pode ser determinada independentemente por um ensaio de qPCR. A expressão conhecida da Nectina-4 também pode ser independentemente determinada com o uso de quaisquer ensaios imunológicos descritos abaixo com um anticorpo anti-Nectina-4 que foi determinado como específico para Nectina-4, (por exemplo, um anticorpo específico para Nectina-4 identificado nos métodos de triagem de especificidade descritos acima). Os ensaios imunológicos adequados incluem, a título de exemplo e sem qualquer limitação, um ensaio de IHC, um ensaio de immunoblotting, um ensaio FACS ensaio ou um ELISA.

em algumas modalidades, o nível de mRNA de Nectina-4 pode não ser zero no controle negativo devido ao ruído de fundo dos ensaios ou devido ao nível biologicamente insignificante baixo de Nectina-4 restante. O controle de Nectina-4 negativo pode ser adequadamente considerado como negativo para Nectina-4, por exemplo, quando o nível de mRNA de Nectina-4 em um ensaio de qPCR é substancialmente similar ao nível de mRNA detectado com um conjunto de iniciadores não específicos ou quando o nível de mRNA de Nectina-4 for biologicamente insignificante em vista do nível de mRNA de Nectina-4 em um controle de Nectina-4 positivo. De modo similar, a Nectina-4 detectada por ensaios imunológicos com o uso de outro Anticorpo específico para Nectina-4 em um controle negativo pode não ser zero devido ao ruído de fundo dos ensaios ou devido ao nível biologicamente insignificante baixo da Nectina-4 restante. O ruído de fundo pode ser causado por interações não específicas entre os reagentes de ensaio diferentes dos anticorpos anti-Nectina-4 e das amostras. O controle de Nectina-4 negativo pode ser adequadamente considerado como negativo para Nectina-4, por exemplo, quando o nível de Nectina-4 no controle negativo detectado pelo anticorpo anti-Nectina-4 for substancialmente similar ao nível de detecção a partir de um anticorpo de controle de isótopo no mesmo ensaio. em alguns ensaios, o ruído de fundo pode considerar uma porcentagensubstancial do sinal detectado a partir da expressão da Nectina-4.

[0529] Adicionalmente, os controles positivos e negativos foram identificados e publicados na literatura por elementos versados na técnica, incluindo amostras de tecidos, células (incluindo, por exemplo, linhagens celulares) e patológicas positivas e/ou negativas. Tal literatura pode ser prontamente identificada pesquisando-se nos bancos de dados, como Pubmed (por exemplo, com o uso de termos de busca, como Nectina-4, expressão, positivo, negativo e/ou distribuição) e analisando-se os resultados de busca.

[0530] Consequentemente, a quantidade relativa do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ligada a uma célula de controle negativo sem expressão da Nectina-4 pode ser de aproximadamente 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, 0,05%, 0,03%, 0,01%, 0,001% ou menos da quantidade do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ligada à célula da amostra que expressa a Nectina-4.

[0531] Portanto, em algumas modalidades dos métodos fornecidos no presente documento, o nível de expressão de referência da Nectina-4 é o nível de expressão da Nectina-4 em um controle negativo, em que a expressão da Nectina-4 no controle negativo é independentemente determinada por um ensaio de qPCR, um ensaio de IHC com um segundo anticorpo, um ensaio de immunoblotting com um segundo anticorpo, um ensaio FACS com um segundo anticorpo ou um ELISA com um segundo anticorpo.

[0532] em outras modalidades dos métodos fornecidos no presente documento, o nível de expressão de referência da Nectina-4 é o nível de expressão da Nectina-4 em uma célula de controle positivo que expressa Nectina-4, em que a expressão da Nectina-4 no controle positivo é independentemente determinada por um ensaio de qPCR, um ensaio de IHC com um segundo anticorpo, um ensaio de immunoblotting com um segundo anticorpo, um ensaio FACS com um segundo anticorpo ou um ELISA com um segundo anticorpo.

[0533] O nível de expressão da Nectina-4 na amostra pode ser diferente daquele em um controle positivo. A quantidade relativa da ligação de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo à amostra de tecido pode ser aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 750%, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes ou mais da quantidade da ligação de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo à célula de controle positivo que expressa Nectina-4.

[0534] Diversos protocolos de PCR ou qPCR diferentes são conhecidos na técnica e exemplificados abaixo no presente documento e podem ser diretamente aplicados ou adaptados para determinar o nível de mRNA de Nectina-4 na amostras ou controles, que pode ser usado como um indicador para os níveis de expressão de proteína de Nectina-4 na amostras ou controles. PCR quantitativo (qPCR) (também denominado PCR em tempo real) é aplicado e adaptado em algumas modalidades visto que fornece não apenas uma medida quantitativa, mas tambpem reduz o tempo e a contaminação. Como usado no presente documento, “PCR quantitativo (ou “qPCR”) se refere ao monitoramento direto do progresso de amplificação de PCR visto que ocorre sem a necessidade de amostragem repetida dos produtos de reação. em PCR quantitativo, os produtos de reação podem ser monitorados por meio de um mecanismo de sinalização (por exemplo, fluorescência) visto que os mesmos são gerados e são rastreados após o sinal subir acima de um nível de fundo, mas antes da reação chegar a um patamar. O número de ciclos exigido para obter um nível detectável ou “limiar” de fluorescência varia diretamente com a concentração de alvos amplificáveis no início do processo de PCR, permitindo uma medição de intensidade de sinal para fornecer uma medição de uma quantidade de ácido nucleico alvo na amostra em tempo real. Quando qPCR for aplicado para determinar o nível de expressão de mRNA, uma etapa extra de transcrição reversa de mRNA em DNA será realizada antes da análise de qPCR. Exemplos de Métodos de PCR podem ser encontrados na literatura (Wong et al., BioTechnics 39:75-85 (2005); D’haene et al., Methods 50:262–270 (2010)), que são incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Exemplos de Ensaios de PCR podem ser encontrados na Patente nº U.S. 6,927,024, que é incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Exemplos de Métodos de RT-PCR podem ser encontrados na Patente nº U.S.7.122.799, que são incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Um método de PCR de in situ PCR fluorescente é descrito na Patente nº U.S. 7.186.507, que é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0535] em uma modalidade específica, qPCR pode ser realizado para determinar ou medir os níveis de mRNA de Nectina-4 conforme o seguinte.

Brevemente, valores de Ct médio (limiar de ciclo) (ou denominado intercambiavelmente no presente documento Cq (ciclo quantitativo)) de reações de qPCR replicadas para Nectina-4 e um ou mais genes de manutenção são determinados. Valores de Ct médio para Nectina-4 podem ser, então, normalizados para os Valores de Ct dos genes de manutenção com o uso da seguinte fórmula exemplificativa: Nectina-4-ΔCt = (Ct médio de Nectina-4–Ct médio de gene de manutenção A). A Nectina-4-ΔCt relativa pode, então, ser usada para determinar o nível relativo de mRNA de Nectina-4, por exemplo, com o uso da fórmula de expressão de mRNA = 2–∆Ct. Para um resumo de valores de Ct e Cq, ver MIQE guideline (Bustin et al., The MIQE Guidelines: Minimum Informações for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments, Clinical Chemistry 55:4 (2009)).

[0536] Outros métodos comumente usados conhecidos na técnica para a quantificação de expressão de mRNA na amostra também podem ser usados, incluindo northern blotting e hibridização in situ (Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999)); ensaios de proteção de R (Hod, Biotécnicas 13:852- 854 (1992)); micromatrizes (Hoheisel et al., Nature Reviews Genetics 7:200- 210 (2006); Jaluria et al., Microbial Cell Fatories 6:4 (2007)); e reação de cadeia de polimerase (PCR) (Weis et al., Trends in Genetics 8:263-264 (1992)).

Alternativamente, os níveis de expressão de mRNA podem ser determinados por técnicas de sequenciamento. Os métodos representativos for análise de expressão genética com base em sequenciamento incluem Análise em Série de Expressão Genética (SAGE) e análise de expressão genética por sequenciamento de assinatura massivo paralelo (MPSS).

[0537] Como descrito anteriormente, as amostras de tecido podem ser, porém sem limitação, tecidos, fluido corporal, frações de tecido e/ou células isoladas de um organismo, como um mamífero, em particular, um ser humano. Portanto, as amostras de tecido podem ser obtidas a partir de uma variedade de órgãos de um indivíduo, incluindo um indivíduo humano. em algumas modalidades, amostras de tecido são obtidas a partir de órgãos com suspeita de ter um a doença, disfunção, tal como câncer. em outras modalidades, amostras de tecido são obtidas a partir de órgãos normais do paciente que está sendo testado ou a partir de um segundo indivíduo humano.

[0538] em determinadas modalidades dos métodos fornecidos no presente documento, o tecido inclui um tecido da bexiga, do ureter, da mama, do pulmão, do cólon, do reto, do ovário, da trompa de Falópio, do esôfago, do colo do útero, do endométrio uterino, da pele, da laringe, da medula óssea, glândula salivar, rim, próstata, cérebro, medula espinhal, placenta, adrenal, pâncreas, paratireoide, da hipófise, do testículo, da tireoide, do baço, das amígdalas, do timo, do coração, do estômago, do intestino delgado, do fígado, do músculo esquelético, do nervo periférico, do mesotélio ou do olho.

[0539] A ligação de anticorpos anti-Nectina-4 às amostras pode ser detectada por uma variedade de ensaios imunológicos conhecidos na técnica, incluindo uma abordagem de IHC, um ensaio de immunoblotting, um ensaio FACS e um ELISA.

[0540] Nectina-4 pode ser detectada por um anticorpo anti-Nectina-4 em uma variedade de abordagens de IHC. Mostrou-se que o manchamento de IHC de seções de tecido é um método confiável de avaliar ou detectar a presença de proteínas na amostra. As técnicas de IHC usam um anticorpo para sondar e visualizar antígenos in situ celulares, geralmente por métodos cromogênicos ou fluorescentes. Anticorpos ou anti-soros primários, como anti-soros policlonais e anticorpos monoclonais que são especificamente direcionados para Nectina-4, podem ser usados para detectar a expressão em um ensaio de IHC. em algumas modalidades, a amostra de tecido está em contato com o anticorpo primário para um alvo específico por um período de tempo suficiente para a ligação ao anticorpo-alvo ocorrer. Como discutido anteriormente em detalhes, os anticorpos podem ser detectados por etiquetas nos próprios anticorpos, por exemplo, etiquetas radioativas, etiquetas fluorescentes, etiquetas de hapteno, como biotina ou uma enzima, como peroxidase de rábano silvestre ou fosfatase alcalina. Alternativamente, o anticorpo primário não etiquetado é usado juntamente a um anticorpo secundário etiquetado, que compreende anti-soros, anti-soros policlonais ou um anticorpo monoclonal específicos para o anticorpo primário. Protocolos e kits de IHC são bem conhecidos na técnica e são comercialmente disponibilizados. Sistemas automatizados para preparação por deslizamento e processamento de IHC são comercialmente disponibilizados. O Automanchador Leica BOND e o sistema de Detecção de Refinamento Leica Bond são exemplos de sistema automatizado.

[0541] em algumas modalidades, um ensaio de IHC é realizado com um anticorpo primário não etiquetado juntamente a um anticorpo secundário etiquetado em um ensaio indireto. O ensaio indireto usa dois anticorpos para a detecção de proteínas-alvo, como Nectina-4 em uma amostra de tecido. Primeiro, um anticorpo primário não conjugado foi aplicado a o tecido (primeira camada), que reage com o antígeno-alvo na amostra de tecido. em seguida, uma anticorpo secundário etiquetado de enzima é aplicado, que especificamente reconhece o isótopo de anticorpo do anticorpo primário (segunda camada). O anticorpo secundário reage com o anticorpo primário, seguido por aplicação de substrato cromogênico. O anticorpo de segunda camada pode ser etiquetado com uma enzima, como uma peroxidase, que reage com o cromogênio 3, 3’-diaminobenzidina (DAB) para produzir precipitado marrom no sítio de reação. Esse método é sensível e versátil devido à amplificação de sinal potencial através de um sistema de amplificação de sinal.

[0542] em determinadas modalidades, para aumentar a sensibilidade da detecção, um sistema de amplificação de sinal pode ser usado. “Um sistema de amplificação de sinal”, como usado no presente documento, significa um sistema de reagentes e métodos que podem ser usados para aumentar o sinal a partir da detecção da ligação de anticorpo primário ou secundário. Um sistema de amplificação de sinal aumenta a sensibilidade da detecção de proteína-alvo, aumenta o sinal detectado e diminui o limiar inferior dos limites de detecção. Há diversos tipos de sistemas de amplificação de sinal, incluindo um sistema de etiquetagem de enzima e sistema de macroetiquetagem. Esses sistemas/abordagens não são mutuamente exclusivos e podem ser usados em combinação para efeito adicional.

[0543] Os sistemas de macroetiqueta ou macroetiquetagem são coleções de numeração de etiquetas em dezenas (por exemplo, ficobiliproteínas) a milhões (por exemplo, microesferas fluorescentes) afixadas ou incorporadas em uma estrutura comum. A estrutura pode ser acoplada a um reagente de afinidade específica alvo, como um anticorpo e as etiquetas incorporadas são, dessa forma, coletivamente associadas ao alvo mediante ligação. As etiquetas nas macroetiquetas podem ser qualquer uma das etiquetas descritas no presente documento, como fluoroforos, haptenos, enzimas e/ou radioisótopos. em uma modalidade do sistema de amplificação de sinal, um anticorpo secundário de polímero conjugado de cadeia etiquetada foi usado. A tecnologia de polímero usou uma molécula “espinhal” inerte etiquetada por enzima HRP de dextrano à qual 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50 ou mais moléculas de anticorpos secundários podem ser afixadas, tornando o sistema mais sensível

[0544] O sistema de amplificação de sinal com base em um sistema de etiquetagem de enzima usa a atividade catalítica de enzimas, como peroxidase de rábano silvestre (HRP) ou fosfatase alcalina para gerar etiquetagem de alta densidade de uma proteína-alvo ou sequência de ácido nucleico in situ. em uma modalidade, tiramida pode ser usada para aumentar o sinal de HRP. em tal sistema, HRP converte enzimaticamente o derivado de tiramida etiquetado em radicais de tiramida de vida curta altamente reativos. Os radicais de tiramida ativos etiquetados, então, se acoplam covalentemente a resíduos (principalmente ma porção química de fenol de resíduos de tirosina de proteína) na vizinhança do sítio de interação de anticorpo de HRP alvo, resultando na amplificação do número de etiquetas no sítio com perda relacionada a difusão mínima de localização de sinal. Consequentemente, o sinal pode ser amplificado 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 15, 20, 25, 30, 50, 75 ou 100 vezes. Como conhecido por um perito na técnica, as etiquetas na tiramida podem ser quaisquer etiquetas descritas no presente documento, incluindo fluoroforos, enzimas, haptenos, radioisótopos e/ou fotoforos. Outras reações com base em enzima também podem ser usadas para criar amplificação de sinal. Por exemplo, a amplificação de sinal de Fluorescência Etiquetada por Enzima (ELF) está disponível para fosfatase alcalina, em que a fosfatase alcalina cliva enzimaticamente um substrato fluorescente azul fracamente (fosfato ELF 97) e converte a mesma em um precipitado fluorescente verde amarelado luminoso que exibe uma alteração de Curso excepcionalmente grande e fotoestabilidade excelente. Tanto o sistema de amplificação de sinal à base de tiramida quanto amplificação de sinal de ELF são comercialmente disponibilizados, por exemplo, pela ThermoFisher Scientific (Waltham, MA USA 02451).

[0545] Desse modo, em algumas modalidades dos métodos fornecidos no presente documento, o nível de expressão da Nectina-4 é detectado com um sistema de amplificação de sinal.

[0546] em algumas modalidades, o espécime é, então, contra manchado para identificar elementos celulares e subcelulares.

[0547] em algumas modalidades, o nível de expressão da Nectina-4 também pode ser detectado com anticorpos descritos no presente document com o uso de um ensaio de immunoblotting. em algumas modalidades de um ensaio de immunoblotting as proteínas são frequentemente (mas não precisam ser) separadas por eletroforese e transferidas para as membranas (geralmente membrana de nitrocelulose ou PVDF). Similar aos ensaios de IHC, os primários ou anti-soros primários, como anti-soros policlonais e anticorpos monoclonais que são especificamente direcionados a Nectina-4, podem ser usados para detectar expressão de proteína. em algumas modalidades, a membrana está em contato com um anticorpo primário para um alvo específico por um período de tempo suficiente para a ligação de anticorpo ao antígeno ocorrer e os anticorpos ligados podem ser detectados por etiquetas diretas nos próprios anticorpos primários, por exemplo, com etiquetas radioativas, etiquetas fluorescentes, etiquetas de hapteno, como biotina ou enzimas, como peroxidase de rábano silvestre ou fosfatase alcalina. em outras modalidades, o anticorpo primário não etiquetado é usado em um ensaio indireto, como descrito acima, juntamente a um anticorpo secundário etiquetado específico para o anticorpo primário. Como descrito no presente documento, os anticorpos secundários podem ser etiquetados, por exemplo, com enzimas ou outras etiquetas detectáveis, como etiquetas fluorescentes, etiquetas luminescentes, etiquetas colorimétricas ou radioisótopos. Protocolos e kits de immunoblotting são bem conhecidos na técnica e são comercialmente disponibilizados. Os sistemas automatizados para immunoblotting, por exemplo, Sistemas iBind Western para Western blotting (ThermoFisher, Waltham, MA USA 02451), são comercialmente disponibilizados. Immunoblotting inclui, porém sem limitação, Western blot, Western blot em célula e dot blot. Dot blot é um procedimento simplificado no qual as amostras de proteína não são separadas por eletroforese, mas são observadas diretamente em uma membrana. Western blot em célula envolve cultivar células em placas de microtitulação, fixar/permeabilizar as células e a detecção subsequente com um anticorpo primário etiquetado principal ou anticorpo primário não etiquetado, seguido por anticorpo secundário etiquetado como descrito no presente documento.

[0548] em outras modalidades, os níveis de expressão de Nectina-4 também podem ser detectados com os anticorpos descritos no presente documento em um ensaio de citometria de fluxo, incluindo um ensaio de separação de célula ativada por fluorescência (FACS). Similar aos ensaios IHC ou immunoblotting, os anticorpos primários ou anti-soros, como anti-soros policlonais e anticorpos monoclonais que são especificamente direcionados a Nectina-4, podem ser usados para detectar a expressão de proteína em um ensaio FACS. em algumas modalidades, as células são manchadas com anticorpos primários contra proteína-alvo específica por um período de tempo suficiente para a ligação de anticorpo ao antígeno ocorrer e os anticorpos ligados podem ser detectados por etiquetas diretas nos anticorpos primários, por exemplo, etiquetas fluorescentes ou etiquetas de hapteno, como biotina nos anticorpos primários. em outras modalidades, o anticorpo primário não etiquetado é usado em um ensaio indireto, como descrito acima juntamente a um anticorpo secundário etiquetado de modo fluorescente específico para o anticorpo primário. FACS fornece um método para separar ou analisar uma mistura de células biológicas etiquetadas de modo fluorescente, uma célula de cada vez, com base nas características de dispersão de luz e fluorescentes específicas de cada célula. A citometria de fluxo, desse modo, detecta e relata a intensidade do anticorpo etiquetado por fluoricroma, que indica o nível de expressão da proteína-alvo.

Portanto, o nível de expressão de proteínas de superfície (como Nectina-4) pode ser detectado com o uso de anticorpos contra a proteína-alvo. Proteínas citoplásmicas não fluorescentes também podem ser observadas por manchamento de células permealizadas. Métodos para realizar machamento de FACS e análises são bem conhecidos por um perito na técnica e são descritos por Teresa S. Hawley e Robert G. Hawley in Flow Cytometry Protocols, Humana Press, 2011 (ISBN 1617379506, 9781617379505).

[0549] em outras modalidades, Os níveis de expressão de Nectina-4 também podem ser detectados com o uso de ensaios imunológicos, como um Ensaio Imunoenzimático (EIA) ou um ELISA. Tanto ensaio EIA quanto o ensaio ELISA são conhecidos na técnica, por exemplo, para testar uma ampla variedade de tecidos e amostras, incluindo sangue, plasma, soro ou medula espinhal. Uma ampla faixa de formatos de ensaio ELISA estão disponíveis, ver, por exemplo, as Patentes nº U.S.4.016.043, 4.424.279 e 4.018.653, que são incorporadas ao presente documento a título de referência em suas totalidades. Essas incluem tanto ensaios sítio único quanto de dois sítio ou “sanduíche” dos tipos não competitivos, bem como nos ensaios de ligação competitiva tradicionais. Esses ensaios também incluem ligação direta de um anticorpo etiquetado a uma proteína-alvo. Os ensaios sanduíche são comumente ensaios usados. Existe uma diversidade de variações da técnica de ensaio sanduíche. Por exemplo, em um ensaio de encaminhamento típico, um anticorpo não etiquetado é imobilizado em um substrato sólido e a amostra a ser testada é colocada em contato com a molécula de ligação. Após um período adequado de incubação, por um período de tempo suficiente para permitir a formação de um complexo de anticorpo-antígeno, um segundo anticorpo específico para o antígeno, etiquetado com uma molécula repórter tem a capacidade para produzir um sinal detectável é, então, adicionada e incubada, permitindo o tempo suficiente para a formação de outro complexo de anticorpo-antígeno-anticorpo etiquetado. Qualquer material não reagido é lavado e a presença do antígeno é determinada por observação de um sinal produzido pela molécula repórter. Os resultados podem ser qualitativos, por simples observação do sinal visual ou podem ser quantitativos por comparação com a amostra de controle que contém quantidades conhecidas de proteína-alvo.

[0550] em algumas modalidades dos ensaios EIA ou ELISA, uma enzima é conjugada ao segundo anticorpo. em outras modalidades, anticorpos secundários etiquetados de modo fluorescente podem ser usados no lugar do anticorpo secundário etiquetado de enzima para produzir um sinal detectável por um formato de ensaio ELISA. Quando ativado por iluminação com luz de um comprimento de onda particular, o anticorpo fluorocromo etiquetado adsorve a energia de luz, induzindo um estado de excitabilidade na molécula, seguido por emissão da luz em um cor características visualmente detectável com um microscópio luminoso. Como no EIA e ELISA, permite-se que o anticorpo etiquetado fluorescente se ligue ao primeiro complexo de proteína de anticorpo-alvo. Após lavar o reagente não ligado, o complexo terciário restante é, então, exposto à luz do comprimento de onda adequado, a fluorescência observada indica a presença da proteína-alvo de interesse. Técnicas de imunofluorescência e EIA são ambas muito bem estabelecidas na técnica e são reveladas no presente documento.

[0551] Para os ensaios imunológicos descritos no presente documento, qualquer uma dentre uma diversidade de etiquetas de enzima ou não etiquetas pode ser usada contanto que a etiqueta de atividade enzimática ou de não enzima, respectivamente, possa ser detectada. A enzima, portanto, produz um sinal detectável, que pode ser usado para detectar uma proteína-alvo. Os sinais detectáveis particularmente úteis são sinais cromogênicos ou fluorogênicos.

Consequentemente, enzimas particularmente úteis para o uso como uma etiqueta incluem aquelas para as quais um substrato cromogênico ou fluorogênico está disponível. Visto que substratos cromogênicos ou fluorogênicos podem ser convertidos por reação enzimática em um produto cromogênico ou fluorescente prontamente detectável, que pode ser prontamente detectado e/ou quantificado com o uso de microscópio ou espectroscópio. Tais enzimas são bem conhecidos pelos peritos na técnica, incluindo, porém sem limitação, uma peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, ^-galactosidase, glucose oxidase e similares (ver Hermanson, Bioconjugate Técnicas, Academic Press, San Diego (1996)). Outras enzimas que têm substratos cromogênicos ou fluorogênicos bem conhecidos incluem várias peptidases, em que substratos de peptídeo cromogênicos ou fluorogênicos podem ser usados para detectar reações de clivagem proteolítica. O uso de substratos cromogênicos e fluorogênicos também é bem conhecido em diagnósticos bacterianos, incluindo, porém sem limitação, o uso de ^- e ^- galactosidase, ^-glucuronidase,6-phospho- ^-D-galatosideo 6-fosfogalacto-hidrolase, ^-gluosidase, ^-glucosidase, amilase, neuraminidase, esterases, lipases e similares (Manafi et al., Microbiol. Rev.55:335-348 (1991)) e tais enzimas com substratos cromogênicos ou fluorogênicos bem conhecidos podem ser prontamente adaptadas para o uso nos métodos da presente invenção.

[0552] Vários substratos cromogênicos ou fluorogênicos para produzir sinais detectáveis são bem conhecidos pelos peritos na técnica e são comercialmente disponibilizados.

Substratos exemplificativos que podem ser usados para produzir um sinal detectável incluem, porém sem limitação, 3,3'-diaminobenzidina (DAB),

3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB), Cloronaftol (4-CN)(4-cloro-1-naftol), 2,2'-azino-

bis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS), dicloridrato de o-fenilenediamina

(OPD) e 3-amino-9-etilcarbazola (AEC) para peroxidase de rábano silvestre; 5-

bromo-4-cloro-3-indolil-1-fosfato (BCIP), azuç de nitrotetrazólio (NBT), Fast Red

(Fast Red TR/AS-MX) e Fosfato de p-Nitrofenila (PNPP) para fosfatase alcalina; 1-

Metil-3-indolil-β-D-galactopiranosideo e β-D-galactopiranosideo de 2-metóxi-4-(2- nitrovinil)fenil for ^-galactosidase; β-D-glucopiranosideo de 2-metóxi-4-(2- nitrovinil)fenila para ^-glucosidase; e similares.

Substratos fluorogênicos exemplificativos incluem, porém sem limitação, fosfato de 4-

(trifluorometil)umbeliferila para fosfatase alcalina; 4-Metilumbeliferil fosfato bis (2-

amino-2-metil-1,3-propanediol), 4-Metilumbeliferl fosfato bis (ciclo-hexilamônio) e 4-

Metilumbeliferil fosfato para fosfatase; QuantaBluTM e QuantaRedTM para peroxidase de rábano silvestre; β-D-galactopiranosídeo de 4-Metilumbeliferil,

Fluoresceína di(β-D-galactopiranosídeo) e di-(β-D-galactopiranosídeo) de naftofluoresceína para β-galactosidase; β-D-glucopiranosídeo de 3-acetilumbeliferila e 4-Metilumbeliferil-β-D-glucopiranosídeo para β-glucosidase; e 4-Metilumbeliferil-α-

D-galactopiranosídeo para α-galactosidase.

Enzimas e substratos exemplificativos para produzir um sinal detectável também são descritos, por exemplo, na publicação de patente nº US2012/0100540. Vários substratos de enzima detectáveis, incluindo substratos cromogênicos ou fluorogênicos, são bem conhecidos e comercialmente disponibilizados (Pierce, Rockford IL; Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX;

Invitrogen, Carlsbad CA; 42 Life Science; Biocare). Geralmente, os substratos são convertidos em produtos que formam precipitados que são depositados no sítio do ácido nucleico alvo.

Outros substratos exemplificativos incluem, porém sem limitação,

Verde HRP (42 Life Science), Betazoid DAB, Cardassian DAB, Romulin AEC,

Bajoran Purple, Vina Verde, Deep Space Black™, Warp Red™, Vulcan Fast Red e Ferangi Blue da Biocare (Concord CA; biocare.net/products/detection/cromogenics).

[0553] em algumas modalidades do ensaios imunológicos, uma etiqueta detectável pode ser diretamente acoplada ao anticorpo primário ou ao anticorpo secundário que detecta qual anticorpo primário não etiquetado pode ter. Etiquetas detectáveis exemplificativos são bem conhecidas pelos peritos na técnica, incluindo, porém sem limitação, etiquetas cromogênicas ou fluorescentes (ver Hermanson, Bioconjugate Technics, Academic Press, San Diego (1996)). Fluoroforos exemplificativos úteis como etiquetas incluem, porém sem limitação, derivados de rodamina, por exemplo, tetrametilrodamina, rodamina B, rodamina 6G, sulforodamina B, Texas Red (sulforodamina 101), rodamina 110 e derivados da mesma, como tetrametilrodamina-5-(ou 6), lissamina rodamina B e similares; 7- nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol (NBD); fluoresceína e derivados da mesma; naftalenos, como dansila (5-dimetilaminonaftaleno-1-sulfonila); derivados de coumarina, como ácido 7-amino-4-metilcoumarin-3-acético (AMCA), 7-dietilamino-3-[(4'- (iodoacetil)amino)fenil]-4-metilcoumarina (DCIA), corantes de flúor Alexa (Molecular Probes) e similares; 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPYTM) e derivados do mesmo (Molecular Probes; Eugene Oreg.); pirenos e pirenos sulfonados, como Cascade BlueTM e derivados do mesmo, incluindo ácido 8- metoxipireno-1,3,6-trissulfônico e similares; derivados de piridiloxazol e derivados de dapoxila (Molecular Probes); Amarelo Lúcifer (3,6-dissulfonato-4-amino-naftalimida) e derivados dos mesmos; Corantes fluorescentes de CyDyeTM (Amersham/GE Healthcare Life Sciences; Piscataway NJ) e similares. Cromoforos exemplificativos incluem, porém sem limitação, fenolftaleina, verde malaquita, nitroaromáticos, como nitrogenila, corantes diazo, dabsila (4-dimetilaminoazobenzeni-4'-sulfonila) e similares.

[0554] Métodos bem conhecidos por um perito na técnica como miscroscópio ou espectroscópio podem ser usados para visualizar sinais cromogênicos ou fluorescentes detectáveis associados aos anticorpos primários ou secundários ligados.

[0555] “Uma determinação da expressão da Nectina-4” se refere a colocar a expressão de Nectina-4 na amostra de teste biológica em um sistema referenciado (ou uma escala referenciada) de modo que uma pessoa familiar com o sistema referenciado possa conhecer a expressão de Nectina-4 relativa na amostra de teste com relação às outras amostras que forma posicionadas no sistema referenciado. Consequentemente, tal determinação envolve comparar a expressão de Nectina-4 na amostra de teste de tecido com um nível de expressão de referência da Nectina-4.

[0556] em algumas modalidades, o sistema referenciado pode ser um sistema quantitativo em que a concentração molar ou quantidade de mole real de Nectina-4 na amostra de teste é comparada à concentração molar ou quantidade de mole dos níveis de expressão de referência. em algumas modalidades, outras medições numéricas substitutas que são linearmente proporcionais à concentração molar ou quantidade de mole podem ser usadas. Exemplos dessas medições substitutas incluem mediação de intensidade de fluorescência de anticorpos ligados, medições de intensidade luminescente de anticorpos ligados, medições de radioatividade de anticorpos ligados e/ou medições colorimétricas ou cromogênicas de anticorpos ligados.

[0557] em outras modalidades, o sistema referenciado pode ser um sistema de categorização. Um sistema de categorização pode ter poucas categorias como 2 e tanto quanto 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 ou mais categorias. em uma modalidade, o sistema referenciado tem uma categoria positiva para amostras que são positivas para expressão da Nectina-4 (positiva) e uma categoria negativa para amostras que são negativas para expressão da Nectina-4 (negativa). em tal sistema de categorização, uma determinação da expressão da Nectina-4 na amostra de teste envolve comparar a expressão de Nectina-4 na amostra de teste com a expressão da Nectina-4 de uma amostra de referência positiva e/ou com uma referência negativa e colocar a amostra de teste na categoria positiva se a amostra de teste expressar Nectina-4 em um nível similar ou superior à referência positiva. em outra modalidade, o sistema de categorização tem 3 categorias, por exemplo, categorias de expressão negativa, média e alta. em outra modalidade, o sistema de categorização tem 4 categorias, por exemplo, categorias de expressão negativa, baixa/fraca, média/moderada e alta/forte. em alguns aspectos, uma determinação da expressão da Nectina-4 na amostra de teste envolve comparar a expressão de Nectina-4 na amostra de teste com uma ou mais referências de expressão da Nectina-4 de categorias conhecidas e colocar a amostra de teste em uma categoria de acordo com sua expressão relativa à(s) referência(s).

[0558] em algumas modalidades, o sistema referenciado pode ser um sistema de classificação. Um sistema de classificação pode ser similar a um sistema de categorização exceto pelo fato de que as categorias são substituídas por uma pontuação. Por exemplo, um sistema de 2 categorias de expressão negativa e positiva da Nectina-4 pode ser um sistema de classificação de 0 e 1, em que 0 significa negativo e 1 significa positivo. em outra modalidade, um sistema de 3 categorias pode ser um sistema de classificação de 0, 1 e 2, em que 0 é expressão negativa, 1 é baixa/fraca e 2 é expressão média/moderada e alta/forte. em outra modalidade, um sistema de 4 categorias pode ser um sistema de classificação de 0, 1, 2 e 3, em que 0 é expressão negativa, 1 é baixa/fraca, 2 é média/moderada e 3 é alta/forte. Similar ao sistema de categorização, uma determinação da expressão da Nectina-4 na amostra de teste no sistema de pontuação envolve comparar a expressão de Nectina-4 na amostra de teste com uma ou mais referências de expressão da Nectina-4 que tem uma pontuação conhecida e atribuir a amostra de teste uma pontuação de acordo com sua expressão relativa às referências. O sistema de pontuação, entretanto, pode ser pontuado com números descontínuos e distintos (por exemplo, um sistema de 0, 2, 4, 6, 8 e 10 ou um sistema de 1, 4, 6, 11, 13 e 19), números com frações (por exemplo, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, etc.), números negativos começando a partir de qualquer número (por exemplo, 1.000, 2.000, 3.000, etc.) e qualquer conjuntos de números que possa ser usado para rastrear a expressão relativa de proteína em amostras biológicas.

[0559] em algumas modalidades, o sistema referenciado pode ser porcentagens de células juntamente ao sistema de categorização ou de classificações. A combinação de porcentagem de células com um sistema de categorização ou de classificação fornece gradação mais precisa da amostras. em tal sistema combinado, cada célula da amostra biológica é atribuído ou substituído n o sistema de categorização ou de classificação e a porcentagem aproximada de células da amostra de teste em cada categoria ou pontuação é determinada. em um exemplo, as medições de porcentagens de células podem ser acoplados a um sistema de 2 categorias de expressão positiva e negativa da Nectina-4, em que a amostra não é medida como um inteiro, mas dividida na porcentagem de células que são positivas para a expressão da Nectina-4 e porcentagem de células que são negativas para a expressão da Nectina-4. Por exemplo, em um sistema de 2 categorias de expressão positiva e negativa da Nectina-4, a amostra de teste pode ser negativa para a expressão da Nectina-4 se for colocada em um sistema de 2 categorias, mas tem 10% de células positivas para a expressão da Nectina-4 e 90% de células negativas para a expressão da Nectina-4. em uma modalidade, o sistema referenciado inclui porcentagens de células juntamente a um sistema de 2 categorias ou 2 pontuações. em uma modalidade, o sistema referenciado inclui porcentagens de células juntamente a um sistema de 3 categorias ou 3 pontuações.

em uma modalidade, o sistema referenciado inclui porcentagens de células juntamente a um sistema de 4 categorias ou 4 pontuações. em uma modalidade, o sistema referenciado inclui porcentagens de células juntamente a um sistema de 5 categorias ou 5 pontuações. em uma modalidade, o sistema referenciado inclui porcentagens de células juntamente a um sistema de 6 categorias ou 6 pontuações.

em uma modalidade, o sistema referenciado inclui porcentagens de células juntamente a um sistema de 7 categorias ou 7 pontuações. em uma modalidade, o sistema referenciado inclui porcentagens de células juntamente a um sistema de 8 categorias ou 8 pontuações. em uma modalidade, o sistema referenciado inclui porcentagens de células juntamente a um sistema de 9 categorias ou 9 pontuações.

em uma modalidade, o sistema referenciado inclui porcentagens de células juntamente a um 10 categorias ou 10 pontuações. em uma modalidade, o sistema referenciado inclui porcentagens de células juntamente a qualquer sistema de categorização ou qualquer pontuação. em uma modalidade, o sistema referenciado inclui porcentagens de células juntamente a um sistema de 4 pontuações que compreendem 0 (negativo para Nectina-4), 1 (expressão baixa/fraca da Nectina-4), 2 (expressão média/moderada da Nectina-4) e 3 (expressão alta/forte da Nectina-4).

[0560] em alguns aspectos, o sistema referenciado pode ser uma proporção da expressão da Nectina-4 para a expressão de pelo menos uma proteína de referência. em algumas modalidades, a proporção pode ser uma proporção de medidas quantitativas de expressão da Nectina-4 e aquelas de uma proteína de referência, em que as medidas quantitativas incluem aquelas descritas, como concentração molar, quantidade de mole, medições de intensidade de fluorescência de anticorpos ligados, medições de intensidade luminescente de anticorpos ligados, medições de radioatividade de anticorpos ligados e/ou medições colorimétricas ou cromogênicas de anticorpos ligados. em outras modalidades, a proporção também pode ser uma proporção de pontuações atribuídas a expressão da Nectina-4 e da proteína referência, de acordo com qualquer sistema de pontuação fornecido no presente documento. Uma proteína de referência pode ser uma proteína de função celular comum, como actina, GAPDH, GDI ou qualquer proteína expressada por um gene de manutenção. Por exemplo, se uma amostra de teste tiver uma pontuação de 3 para expressão da Nectina-4 e pontuação de 1 para expressão de actina, a proporção pode ser determinada como 3.

[0561] em outros aspectos, o sistema de referência pode usar os resultados de uma função matemática com o uso de uma ou mais dentre a categorização, pontuação, proporção, porcentagem e medida quantitativa como informações de entrada. em algumas modalidades, a função matemática usa composição, adição, multiplicação ou combinação desses operadores para combinar as várias entradas para produzir resultados que fornecem informações mais detalhadas sobre a expressão da Nectina-4 na amostra e/ou gradação mais precisa na expressão da escala de Nectina-4. em uma modalidade, a função matemática calcula uma pontuação H com base na combinação de porcentagem e um sistema de 4 pontuações. Por exemplo, uma pontuação H foi calculado somando-se os produtos da porcentagem de células (0 a 100) em que cada uma tem a expressão da pontuação de Nectina-4 (0=negativa, 1=baixa/fraca, 2=moderada/média e 3=alta/forte). Por exemplo: um espécime com 10% de células com pontuação 3, 30% de células com pontuação 2, 20% de células com pontuação 1 e 40% de células com pontuação 0 teriam uma pontuação H de (3 × 10) + (2 × 30)+ (1 × 20) + (0 × 40) = 110.

[0562] Portanto, como fornecido no presente documento, o nível de expressão da Nectina-4 pode ser determinado com o uso de um sistema de categorização, um sistema de classificação, uma proporção da expressão da Nectina-4 para a expressão de pelo menos uma proteína de referência, porcentagem de células no dito sistema de categorização ou de classificação, uma medida quantitativa do sinal de coloração da Nectina-4 ou um resultado de uma função matemática com o uso de um ou mais dentre a dita categorização, pontuação, proporção, porcentagem e medida quantitativa como informações de entrada.

[0563] A maioria dos tecidos fixados em formalina exige uma etapa de recuperação de antígeno antes do manchamento imunoistoquímico. As pontes de metileno formadas durante a fixação de proteínas reticuladas e o mascaramento dos epítopos dos antígenos. Os métodos de recuperação de antígeno quebram essas pontes de metileno e expõem os epítopos, permitindo que os anticorpos se liguem.

em algumas modalidades, os antígenos são recuperados por um método de recuperação de epítopo induzido por calor (HIER) método. em outras modalidades, os antígenos são recuperados por um método de recuperação enzimática (por exemplo, digestão proteolítica). Para HIER, seções de tecido fixadas em formalina, embebidas em parafina (FFPE) podem ser aquecidas a 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C, 95 °C, 100 °C, 105 °C, 110 °C, 115 °C, 120 °C, 125 °C ou 130 °C. A seção de tecido FFPE pode ser aquecida a qualquer uma dessas temperaturas por 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 150, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540, 600, 660, 720, 780, 840, 900, 960, 1020, 1080, 1140, 1200, 1260, 1320, 1380 e 1440 minutos.

O procedimento de HIER em qualquer uma das temperaturas supracitadas e para qualquer uma das durações supracitadas pode ser realizado em uma solução que tem um pH de 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8, 8,2, 8,4, 8,6, 8,8, 9, 9,2, 9,4, 9,6, 9,8, 10, 10,2, 10,4, 10,6, 10,8, 11, 11,5 ou 12. em algumas modalidades, o HIER pode ser realizado em uma temperatura selecionada a partir de um grupo que consiste em 80 °C, 85 °C, 90 °C, 95 °C, 100 °C, 105 °C, 110 °C, 115 °C, para uma duração selecionada a partir de um grupo que consiste em 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 e a um pH selecionado a partir de um grupo que consiste em 8, 8,2, 8,4, 8,6, 8,8, 9, 9,2, 9,4, 9,6, 9,8, 10, 10,2, 10,4.

[0564] Assim, os métodos fornecidos no presente documento incluem adicionalmente uma etapa de recuperação do epítopo de Nectina-4 através da recuperação do epítopo induzida por calor (HIER).

[0565] anticorpos não marcados, anticorpos marcados e derivados e análogos dos mesmos, que, de forma imunoespecífica , se ligam a um antígeno da Nectina-4 que pode ser usado para fins de diagnóstico para detectar, diagnosticar ou monitorar uma doença mediada pela Nectina-4. Assim, são fornecidos no presente documento métodos para a detecção de uma doença mediada pela Nectina-4 que compreendem: (a) realizar ensaio da expressão de um antígeno da Nectina-4 em células ou uma amostra de tecido de um indivíduo com o uso de um ou mais anticorpos fornecidos no presente documento, que se ligam de forma imunoespecífica ao antígeno de Nectina-4; e (b) comparar o nível do antígeno de Nectina-4 com um nível de referência, por exemplo, níveis em amostras de tecido normais (por exemplo, amostras de tecido de um paciente que não tem uma doença mediada pela Nectina-4, amostras de tecido do mesmo paciente antes do início da doença início, células normais em uma amostra de tecidos do mesmo paciente ou amostras de tecido normais de um órgão normal do mesmo paciente), em que um aumento no nível ensaiado de antígeno de Nectina-4 comparado ao nível de controle do antígeno de Nectina-4 é indicativo de uma doença mediada pela Nectina-4.

[0566] Também é fornecido no presente documento um ensaio de diagnóstico para realizar diagnóstico de uma doença mediada pela Nectina-4 que compreendem: (a) realizar ensaio para o nível de um antígeno da Nectina-4 em células ou uma amostra de tecido de uma pessoa com o uso de um ou mais anticorpos fornecidos no presente documento, que se ligam de forma imunoespecífica a um antígeno da Nectina-4; e (b) comparar o nível do antígeno de Nectina-4 com um nível de referência, por exemplo, níveis em amostras de tecido normais, em que um aumento no nível de antígeno de Nectina-4 ensaiado comparado a um nível de referência do antígeno de Nectina-4 é indicativo de uma doença mediada pela Nectina-4. em determinadas modalidades, é fornecido aqui a método para tratar uma doença mediada pela Nectina-4 em um indivíduo, que compreendem: (a) realizar ensaio para o nível de um antígeno da Nectina-4 em células ou uma amostra de tecido do indivíduo com o uso de um ou mais anticorpos fornecidos no presente documento, que se ligam de forma imunoespecífica a um antígeno da Nectina-4; e (b) comparar o nível do antígeno de Nectina-4 com um nível de referência, por exemplo, níveis em amostras de tecido normais, em que um aumento no nível de antígeno de Nectina-4 ensaiado comparado a um nível de referência do antígeno de Nectina-4 é indicativo de uma doença mediada pela Nectina-4. em algumas modalidades, o método compreende ainda (c) administrar uma quantidade eficiente de um anticorpo fornecido aqui ao indivíduo identificado como tendo a doença mediada pela Nectina-4. Um diagnóstico mais definitivo de uma doença mediada pela Nectina-4 pode permitir que profissionais saudáveis empreguem medidas ou tratamento agressivo para impedir o desenvolvimento ou progressão adicional da doença mediada pela Nectina-4.

[0567] Anticorpos fornecidos no presente documento, podem ser usados para realizar ensaio dos níveis de antígeno de Nectina-4 em uma amostra biológica com o uso de métodos imunoistológicos clássicos, como descrito no presente documento ou como conhecido pelos peritos na técnica (por exemplo, ver Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol.101:976-985; e Jalkanen et al., 1987, J. Cell Biol.105:3087- 3096). Outros métodos à base de anticorpo úteis para detectar expressão de gene de proteína incluem ensaios imunológicos, como o ELISA e o ensaio radioimunológico (RIA). As etiquetas de ensaio de anticorpo adequadas são conhecidas na técnica e incluem etiquetas de enzima, como glucose oxidase; radioisótopos, como iodo (125I, 121I), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio

(121In) e tecnécio (99Tc); etiquetas luminescentes, como luminol; e etiquetas fluorescentes, como fluoresceína e rodamina e biotina.

[0568] Um aspecto fornecido no presente documento é a detecção e o diagnóstico de uma doença mediada pela Nectina-4 em um ser humano. Em uma modalidade, o diagnóstico compreende: a) administrar (por exemplo, parenteral, subcutânea ou intraperitonealmente) a um indivíduo uma quantidade eficiente de um anticorpo etiquetado que se liga de forma imunoespecífica a um antígeno da Nectina-4; b) aguardar por um intervalo de tempo após a administração para permitir que o anticorpo etiquetado se concentre em sítios no indivíduo em que o antígeno de Nectina-4 expressa (e para molécula etiquetada não ligada ser liberada para o nível de fundo); c) determinar o nível de fundo; e d) detectar o anticorpo etiquetado no indivíduo, de modo que a detecção de anticorpo etiquetado acima do nível de fundo indica que o indivíduo tem uma doença mediada pela Nectina-4. O nível de fundo pode ser determinado por vários métodos incluindo, comparar a quantidade de molécula etiquetada detectada para um valor padrão anteriormente determinado para um sistema particular.

[0569] Deve-se entender na técnica que o tamanho do indivíduo e do sistema de imageamento usado determinará a quantidade de porção química de imageamento necessária para produzir imagens de diagnóstico. No caso de uma porção química de radioisótopo, para um indivíduo humano, a quantidade de radioatividade injetada estará normalmente na faixa de aproximadamente 5 a 20 milicuries de 99Tc. O anticorpo etiquetado se acumulará, então, na localização de células que contêm a proteína específica. O imageamento de tumor in vivo é descrito em S.W. Burchiel et al.,“Immunopharmacokinetics of Radiomarked antibodies and Their Fragments”. (Capitulo 13 em Tumor Imaging: The Radiochemical Detectamion of Cancer, S.W. Burchiel e B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982).

[0570] Dependendo de diversas variáveis, incluindo o tipo de etiqueta usada e o modo de administração, o intervalo de tempo após a administração para permitir que o anticorpo etiquetado se concentre em sítios no indivíduo e para anticorpo etiquetado não ligado a ser liberado para o nível de fundo é de 6 a 48 horas ou 6 a 24 horas ou 6 a 12 horas. Em outra modalidade, o intervalo de tempo após a administração é de 5 a 20 dias ou 5 a 10 dias.

[0571] Em uma modalidade, o monitoramento de uma doença mediada pela Nectina-4 é realizado repetindo-se o método para diagnosticar uma doença mediada pela Nectina-4, por exemplo, um mês após o diagnóstico inicial, seis meses após o diagnóstico inicial, um ano após o diagnóstico inicial, etc.

[0572] A presença da molécula etiquetada pode ser detectada no indivíduo com o uso de métodos conhecidos na técnica para triagem in vivo. Esses métodos dependem do tipo de etiqueta usada. Peritos na técnica terão a capacidade para determinar o método adequado para detectar uma etiqueta particular. Métodos e dispositivos que podem ser usados nos métodos de diagnóstico fornecidos no presente documento incluem, porém sem limitação, tomografia computadorizada (CT), varredura de corpo inteiro, como tomografia de emissão de posição (PET), imageamento por ressonância magnética (MRI) e sonografia.

[0573] Em uma modalidade específica, a molécula é etiquetada com um radioisótopo e é detectado no paciente com o uso de um instrumento cirúrgico responsivo à radiação (Thurston et al., Patente nº U.S.5.441.050). Em outra modalidade, a molécula é etiquetada com um composto fluorescente e é detectada no paciente com o uso de um instrumento de varredura responsivo à fluorescência.

Em outra modalidade, a molécula é etiquetada com um metal emissor de pósitron e é detectado no paciente com o uso de tomografia por emissão de pósitron. Ainda em outra modalidade, a molécula é etiquetada com um etiqueta paramagnética e é detectada em um paciente com o uso de imageamento por ressonância magnética (MRI).

30. Kits

[0574] Também são fornecidos no presente documento, kits que compreendem um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-Nectina-4) fornecido no presente documento ou uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) do mesmo, empacotado em material de empacotamento adequado.

Um kit opcionalmente inclui uma etiqueta ou inserto de empacotamento, incluindo uma descrição dos componentes ou instruções para o uso in vitro, in vivo ou ex vivo, dos componentes nesse.

[0575] O termo “material de empacotamento” se refere a uma estrutura física que aloja os componentes do kit. O material de empacotamento pode manter os componentes estéreis e pode ser feito de material comumente usado para tais propósitos (por exemplo, papel, fibra corrugada, vidro, plástico, chapa, ampolas, frascos, tubos, etc.).

[0576] Kits fornecidos no presente documento podem incluir etiquetas ou insertos. Etiquetas ou insertos incluem “matéria impressa”, por exemplo, papel ou papelão, separado ou fixado a um componente, um kit ou material de empacotamento (por exemplo, uma caixa) ou afixado, por exemplo, a uma ampola, tubo ou frasco que contém um componente de kit. Etiquetas ou insertos podem adicionalmente incluir uma mídia legível por computador, como um disco (por exemplo, disco rígido, cartão ou disco de memória), disco óptico, como CD- ou DVD- ROM/RAM, DVD, MP3, fita magnética ou mídias de armazenamento elétricas, como RAM e ROM ou híbridos desses, como mídia de armazenamento magnético/óptico, mídia FLASH ou cartões do tipo memória. Etiquetas ou insertos podem incluir informações que identificam informações de fabricante, números de lote, localização e data de fabricante.

[0577] Kits fornecidos no presente documento podem, adicionalmente, incluir outros componentes. Cada componente do kit pode ser encerrado dentro de um recipiente individual e todos dentre os vários recipientes podem estar dentro de um único pacote. Os kits também pode ser projetados para armazenamento a frio. Um kit pode ser adicionalmente projetado para conter anticorpos fornecidos no presente documento, ou células que contêm ácidos nucleicos que codificam os anticorpos fornecidos no presente documento. As células no kit podem ser mantidas sob condições de armazenamento adequadas até estar prepardo para o uso. Os componentes adicionais podem incluir, a título de exemplo, uma amostra de referência positiva ou negativa (por exemplo, amostras de tecido de um paciente que tem uma doença mediada pela Nectina-4, amostras de tecido de um paciente que não tem uma doença mediada pela Nectina-4, amostras de tecido do mesmo paciente antes do início da doença, células normais em uma amostra de tecidos de um indivíduo com uma doença mediada por Nectina-4 ou amostras de tecido normais de um órgão normal do mesmo paciente), tampões, soluções de lavagem, um reagentes de detecção de anticorpo e/ou uma amplificação de sinal reagentes.

[0578] Também são fornecidos no presente documento, painéis de anticorpos que se ligam de forma imunoespecífica a um antígeno da Nectina-4. em modalidades específicas, são fornecidos no presente documento painéis de anticorpos que têm constantes de taxa de associação diferentes, constantes de taxa de dissociação diferentes, afinidades diferentes para antígeno de Nectina-4 e/ou especificidades diferentes para um antígeno da Nectina-4. Em determinadas modalidades, são fornecidos no presente documento painéis de aproximadamente 10, preferencialmente, aproximadamente 25, aproximadamente 50, aproximadamente 75, aproximadamente 100, aproximadamente 125, aproximadamente 150, aproximadamente 175, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 350,

aproximadamente 400, aproximadamente 450, aproximadamente 500, aproximadamente 550, aproximadamente 600, aproximadamente 650, aproximadamente 700, aproximadamente 750, aproximadamente 800, aproximadamente 850, aproximadamente 900, aproximadamente 950 ou aproximadamente 1.000 anticorpos ou mais. Os painéis de anticorpos podem ser usados, por exemplo, em placas com 96 cavidades ou 384 cavidades, como para ensaios como ELISAs.

[0579] Salvo se definido o contrário, todos os termos técnicos ou científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que comumente entendido por um perito comum na técnica ao qual essa invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento possam ser usados na prática ou teste da invenção, métodos e materiais adequados são descritos no presente documento.

[0580] Todos os pedidos, publicações, patentes e outras referências, citações de GenBank e citações de ATCC citadas no presente documento são incorporadas a título de referência em sua totalidade. No caso de conflito, o relatório descritivo, incluindo definições, irá reger.

[0581] Como usado no presente documento, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referentes plurais, salvo se o contexto indicar claramente o contrário. Assim, por exemplo, referência a “uma sequência de peptídeo” inclui uma pluralidade de tais sequências e assim por diante.

[0582] Como usado no presente documento, valores numéricos estão frequentemente presentes em um formato de faixa ao longo deste documento. O uso de um formato de faixa é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretado como uma limitação inflexível no escopo da invenção, salvo se o contexto indicar claramente o contrário. Consequentemente, o uso de uma faixa inclui expressamente todas as subfaixas possíveis, todos os valores numéricos individuais dentro de tal faixa e todos os valores numéricos ou faixas numéricas incluindo números inteiros dentro de tais faixas e frações do valores ou dos números inteiros dentro de faixas, salvo se o contexto indicar claramente o contrário. Essa intepretação se aplica independentemente da amplitude da faixa e em todos os contextos ao longo deste documento de patente. Assim, por exemplo, referência a uma faixa de 90 a 100% inclui 91 a 99%, 92 a 98%, 93 a 95%, 91 a 98%, 91 a 97%, 91 a 96%, 91 a 95%, 91 a 94%, 91 a 93% e assim por diante. A referência a uma faixa de 90 a 100% também inclui 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97% etc., bem como 91,1%, 91,2%, 91,3%, 91,4%, 91,5% etc., 92,1%, 92,2%, 92,3%, 92,4%, 92,5% etc. e assim por diante.

[0583] Além disso, referência a uma faixa de 1 a 3, 3 a 5, 5 a 10, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 60, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 100, 100 a 110, 110 a 120, 120 a 130, 130 a 140, 140 a 150, 150 a 160, 160 a 170, 170 a 180, 180 a 190, 190 a 200, 200 a 225, 225 a 250 inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 etc. Em um exemplo adicional, a referência a uma faixa de 25 a 250, 250 a 500, 500 a 1.000, 1.000 a 2,500, 2,500 a 5,000, 5,000 a 25,000, 25,000 a

50.000 inclui qualquer valor numérico ou faixa dentro de ou que abrange tais valores, por exemplo, 25, 26, 27, 28, 29…250, 251, 252, 253, 254…500, 501, 502, 503, 504… etc.

[0584] Como também usado no presente documento, uma série de faixas são reveladas ao longo deste documento. O uso de uma série de faixas inclui combinações das faixas superiores e inferiores para fornecer outra faixa. Essa interpretação se aplica independentemente da amplitude da faixa e em todos os contextos ao longo deste documento de patente. Assim, por exemplo, a referência a uma série de faixas como 5 a 10, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 75, 75 a 100, 100 a 150, inclui faixas como 5 a 20, 5 a 30, 5 a 40, 5 a 50, 5 a 75, 5 a 100, 5 a

150 e 10 a 30, 10 a 40, 10 a 50, 10 a 75, 10 a 100, 10 a 150 e 20 a 40, 20 a 50, 20 a 75, 20 a 100, 20 a 150 e assim por diante.

[0585] Para fins de concisão, determinadas abreviações são usadas no presente documento. Um exemplo é a abreviação com única letra para representar resíduos de aminoácidos. Os aminoácidos e suas três letras correspondentes e abreviações com única letra são as seguintes: alanina Ala (A) arginina Arg (R) asparagina Asn (N) ácido aspártico Asp (D) cisterina Cys (C) ácido glutâmico Glu (E) glutamina Gln (Q) glicina Gly (G) histidina His (H) isoleucina Ile (I) leucina Leu (L) lisina Lys (K) metionina Met (M) fenilalanina Phe (F) prolina Pro (P) serina Ser (S) treonina Thr (T) triptofano Trp (W) tirosina Tyr (Y) valina Val (V)

[0586] A invenção é geralmente revelada no presente documento com o uso de linguagem afirmativa para descrever as diversas modalidades. A invenção também inclui especificamente modalidades nas quais a matéria particular é excluída, completamente ou em parte, como substâncias ou materiais, etapas de método e condições, protocolos, procedimentos, ensaios ou análises. Assim, embora a invenção não seja geralmente expressa no presente documento em termos do que a invenção inclui, aspectos que não são expressamente incluídos na invenção são, não obstante, revelados no presente documento.

[0587] Uma diversidade de modalidades da invenção foi descrita. Não obstante, deve ser entendido que várias modificações podem ser realizadas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Consequentemente, os seguintes exemplos se destinam a ilustrar, porém sem limitação, o escopo da invenção descrita nas reivindicações.

EXEMPLOS

[0588] Os exemplos nessa seção são oferecidos a título de ilustração e não como limitação.

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE ANTÍGENO

[0589] Um fragmento de Nectina-4 humana, por exemplo, um fragmento incluindo sequência de aminoácidos 31-346 (SEQ ID NO:2) da Nectina-4 humana (SEQ ID NO:1) foi gerado e usado como o antígeno para campanhas de imunização subsequentes.

[0590] Nectina-4 6×HN-etiquetada (aa 31-346) foi produzida com o uso de vetores de expressão pET comercialmente disponibilizados. A expressão foi realizada em BL21 (DE3) E.coli de acordo com as instruções do fabricante e purificada com o uso de purificação à base de IMAC (cromatografia de afinidade de metal imobilizado).A Nectina 4 purificada (aa31-346) foi usada como imunogênio.

[0591] Uma Nectina 4 recombinante (aa (1-348) para triagem de anticorpo foi produzida em células 293FT com o uso de vetor de expressão pTag5/mychis modificado de acordo com instruções do fabricante. A proteína foi purificada com o uso de purificação à base de IMAC padrão.

EXEMPLO 2: GERAÇÃO DE ANTICORPOS

A. Geração e Produção de Gene

[0592] O anticorpo monoclonal M22-321b41.1 foi gerado por camundongo Balb/C de imunização com o fragmento recombinante bacterianamente produzida (31-346; SEQ ID NO:2) de domínio extracelular de proteína Nectina 4 humana com o uso de técnicas de hibridoma padrão descritas originalmente em Kohler e Milstein, Eur. J. Immunol.6, 511 (1976). A hibridoma M22-321b41 foi subclonada como M22- 321b41.1 que produz um anticorpo IgG2a kappa de camundongo que se liga especificamente ao domínio extracelular recombinante da proteína Nectina-4 humana por ELISA. Além disso, mostrou-se que o anticorpo M22-321b41.1 purificado de proteína A mancha especificamente os tecidos testados que expressam Nectina 4 por IHC.

[0593] As células de hibridoma M22-321b41.1 cresceram subsequencialmente, se expandiram e foram viavelmente congeladas por armazenamento a longo prazo em nitrogênio líquido.

B. Sequenciamento de Hibridoma

[0594] Os genes de cadeia pesada e leve e anticorpo de hibridoma M22- 321b41.1 foram sequenciados com o uso de RT-PCR.

EXEMPLO 3: TRIAGEM E SELEÇÃO DE ANTICORPOS

[0595] A. Ensaios de Triagem (ou Ensaios de Ligação)

[0596] A triagem ELISA primária foi realizada com fragmento de domínio extracelular de Nectina-4 (resíduos de aminoácidos 31-346) produzido como descrito acima.

[0597] A triagem ELISA secundária foi realizada com fragmento de domínio extracelular de Nectina-4 (resíduos de aminoácidos 31-346) produzido em E. coli,, fragmento de domínio extracelular de Nectina-4 (resíduos de aminoácidos 1-346) produzido em células 293FT, Nectina-4-tag5 e duas proteínas de controle (uma produzida com pET e uma produzida com tag5).

B. Seleção de Anticorpos

[0598] Os anticorpos foram selecionados inicialmente se os mesmos tiverem apresentado manchamento em células 3T3-Nectina-4 recombinantes e não tiverem manchamento nos controles. Subsequencialmente os anticorpos inicialmente controlados foram testados em um painel de tecidos de controle positivo e negativo com expressão de mRNA de Nectina-4 conhecida como determinada por pontuações de qPCR. Os anticorpos foram testados em várias concentrações e com vários protocolos de recuperação de antígeno. Os anticorpos foram selecionados se os mesmos produziram manchamento especifico nos tecidos de Nectina-4-mRNA positivo, não tiveram manchamento em tecidos de Nectina-4-mRNA negativo e foram melhores que os anticorpos de controle anti-Nectina-4 testados em termos de intensidade de manchamento, proporção de células manchadas e manchamento de fundo não específico.

[0599] EXEMPLO 4: Triagem quanto Anticorpos Específicos para Nectina-4

[0600] Os anticorpos gerados, como descrito acima, passaram por triagem para selecionar os anticorpos específicos para Nectina-4. A triagem foi realizada, por exemplo, com o uso de um ensaio de IHC. Brevemente, tecidos cancerosos de xenoenxerto humanos de várias origens, por exemplo, bexiga, seio, ovário, pâncreas, rim, pele, pulmão e cólon, foram primeiro testados em qPCR para determinar o nível de expressão da Nectina-4 nesses tecidos.

[0601] A análise de PCR quantitativo em tempo real (qPCR) foi empregada para determinar níveis de expressão de mRNA de Nectina-4. O ensaio de qPCR foi realizado com o uso de sistema de Detecção de PCR em Tempo Real Bio-Rad CFX384 com SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad) e 5 ng de equivalente de RNA de padrão cDNA. Os níveis de expressão de mRNA de Nectina-4 foram calculados como relativos aos níveis de expressão de GAPDH, um gene de manutenção, com o uso de um método Cq delta modificado com a seguinte fórmula: 10,000*2-

(CqNectina-4-CqGAPDH); a expressão relativa de Nectina-4 foi descrita em relação a unidades de GAPDH.

[0602] Iniciadores empregados na análise de qPCR de Nectina-4 incluem: 191P4D12.1 iniciador de encaminhamento: 5’- GGCTGGAGTTCAATGAGGTTTATTT -3’ (SEQ ID NO:41); e 191P4D12.2 iniciador reverso: 5’- TCCAGCAGATTTCAGACTAAGAAGA -3’ (SEQ ID NO:42). Iniciadores empregados na análise de qPCR de GAPDH incluem: GAPDH.1 iniciador de encaminhamento: 5’-AGAACATCATCCCTGCCTCTACTG -3’ (SEQ ID NO:43) ; e GAPDH.2 iniciador reverso: 5’- AAATGAGCTTGACAAAGTGGTCGT -3’ (SEQ ID NO:44).

[0603] cDNA modelo para qPCR foi sintetizado com o uso de Bio-Rad kit de síntese de cDNA iScript Advanced de RNA isolado das amostras de tecido ou linhagem celular com o uso de método de extração de RNA TRIzol seguido por limpeza de RNA e digestão de DNase I com o uso de kit de Limpeza Qiagen RNeasy.

[0604] Mostrou-se os tecidos de xenoenxerto humanos exemplificativos na Tabela 5. Os anticorpos anti-Nectina-4 gerados acima foram, então, usados em um ensaio de IHC para manchar os tecidos com níveis conhecidos de expressão da Nectina-4. Os ensaios de IHC foram realizados de modo similar, como descrito em detalhes no Exemplo 5 abaixo. O manchamento de IHC de Nectina-4 nos vários tecidos foi correlacionado a os níveis de mRNA de Nectina-4 nesses tecidos. Um anticorpo foi selecionado como um anticorpo específico para Nectina-4 quando o mesmo produziu sinal de manchamento de IHC que se correlacionou a os níveis de mRNA de Nectina-4, por exemplo, manchamento forte em tecidos com alto nível de mRNA de Nectina-4, sinal de manchamento de IHC moderado em tecidos com níveis intermediários de mRNA de Nectina-4, sinal de manchamento de IHC baixo em tecidos com mRNA de Nectina-4 baixo e no sinal de manchamento de IHC em tecidos uma expressão de nenhum mRNA de Nectina-4. No total, pelo menos 283 clones de anticorpo foram triados, resultando na identificação de anticorpo específico para Nectina-4 de M22-321b41.1 e M22-244b3.1.1.1

[0605] EXEMPLO 5: ENSAIOS FUNCIONAIS: MANCHAMENTO

IMUNOHISTOQUÍMICO DE TECIDOS DE XENOENXERTO

[0606] Anticorpos gerados, triados e purificados, por exemplo, como descrito no presente documento, foram adicionalmente avaliados quanto a sua habilidade para manchar especificamente tecidos de xenoenxerto humano que expressa Nectina-4 em um ensaio de IHC.

[0607] Por exemplo, dois anticorpos monoclonais anti-Nectina-4 de camundongo, M22-244b3.1.1.1 e M22-321b41.1 (isótopos IgG1 e IgG2a, respectivamente), foram testados em um ensaio de IHC. Os anticorpos M22- 244b3.1.1.1 anticorpo M22-321b41.1s foram fornecidos a 1,54 mg/ml e 1,3 mg/ml em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4. Como um controle negativo, um controle de isótopo IgG2a de camundongo comercial de mieloma murino (clone: UPC10, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) elevado a β-2,6-fructosan que não se liga à Nectina-4 humana ou outros antígenos de mamífero foram usados.

[0608] O manchamento de IHC foi realizado de acordo com os seguintes protocolos exemplificativos. Brevemente, uma técnica de IHC indireto foi usada para detectar Nectina-4 no ensaio de IHC. As amostras foram fixadas em formalina neutra tamponada a 10%, processadas e embebidas em cera de parafina e preparadas como seções de tecido de 4 μm. Após a desparafinação e re-hidratação, as seções foram tratadas quanto a recuperação de antígeno. Os epítopos de antígeno em Nectina-4 foram recuperados, por exemplo, aplicando-se calor às seções de tecido em um meio aquoso, comumente denominado procedimento de Recuperação de Epítopo Induzida por Calor (HIER). Por exemplo, os epítopos de antígeno em Nectina-4 foram recuperados aplicando-se Recuperação de Epítopo 2 (ER2, um tampão à base de EDTA a pH 8,9 a 9,1) na plataforma automatizada Leica por 20 minutos a 100 °C. As seções de tecido após a recuperação de antígeno foram, então, incubadas com anticorpos primários de camundongo M22-321b41.1, M22- 244b3.1.1.1 ou IgG2a (controle de anticorpo). As seções de tecido ligadas com anticorpos primários foram lavadas e detectadas com uma enzima etiquetada, por exemplo, etiquetada com peroxidase, anticorpo secundário. O anticorpo secundário ligado foi desenvolvido por cor, por exemplo, com o uso do sistema de Detecção de Polímero de Refinamento de Ligação Leica, que pode usar a reação entre peroxidase com o cromogênio 3,3’-diaminobenzidina (DAB) para produzir precipitado marrom no sítio de reação. As seções de tecido manchadas foram, então, triadas, imageadas e avaliadas com microscopia óptica, por exemplo, com o uso de um Aperio ScanScope CS (Aperio, Vista, CA).

[0609] Para avaliar o nível de expressão da Nectina-4 nas seções de tecido pelo nível de manchamento de anticorpo, as seções de tecido manchadas foram analisadas, avaliadas, categorizadas e registradas em categorias ou pontuações diferentes de acordo com a intensidade do manchamento de IHC e proporção de positividade de célula cancerosa. As categorias incluem forte (“3” ou intercambiavelmente com “3+”), moderada (“2” ou intercambiavelmente com “2+”) e fraca (“1” ou intercambiavelmente com como “1+”). A ausência de manchamento específico foi registrada como negativo (“0” ou intercambiavelmente com “-” ).

[0610] Tecidos cancerosos de xenoenxerto humano de várias origens, por exemplo, bexiga, seio, ovário, pâncreas, rim, pele, pulmão e cólon, com níveis conhecidos de expressão de mRNA de Nectina-4 foram testados. Os níveis de mRNA de Nectina-4 nesses tecidos de xenoenxerto humano exemplificativos foram primeiro avaliados com o uso de qPCR e mostrados na Tabela 5.

Tabela 5. Tecidos para Experimento de Titulação de Anticorpo Tecidos de ID de Camundongo Origem de MRNA de Nectina4 Xenoenxerto Tecido de (qPCR) Humano Xenoenxerto

AG-B1 61668 Carcinoma urotelial 681 papilar de bexiga AG-B11 68618 Carcinoma de célula 391 escamosa queratinizante invasivo de bexiga carcinoma AG-Br29 71838 Carcinoma ductal 76 infiltrante de seios AG-OV35 67431 Carcinoma seroso 45 de grau alto ovariano AG-Panc3 62103 Adenocarcinoma 12 invasivo moderadamente diferenciado pancreático AG-C6 61674 Adenocarcinoma 6 moderadamente diferenciado de cólon AG-K24 65766 Carcinoma de célula 0,4 renal AG-MellO 70845 Maligno 0

[0611] Para constatar a concentração de manchamento adequada para os anticorpos, os anticorpos M22-321b41.1 e M22-244b3.1.1.1 foram primeiro titulados a 2,5 μg/ml, 5,0 μg/ml e 7,5 μg/ml com o uso dos tecidos de xenoenxerto exemplificativos listados na Tabela 5 em um ensaio de coloração por IHC, como descrito acima. Os resultados foram mostrados na Tabela 6.

Tabela 6. Resumo de Resultados para a Titulação de M22-321b41.1 e M22- 244b3.1.1.1

M22-321b41.1 M22-244b3.1.1.1 Tecidos de ID de Conc.

Pontuação Conc. (pg/ml) Pontuação Xenoenxerto Camundongo (pg/ml) Humano MRNA de Nectina4 (qPCR) AG-B1 61668 681 2,5 3+ 2,5 3+ AG-B11 68618 391 2,5 3+ 2,5 2+ AG-Br29 71838 76 2,5 2+ 2,5 3+ AG-OV35 67431 45 2,5 3+ 2,5 2+ AG-Panc3 62103 12 2,5 3+ 2,5 3+

AG-C6 61674 6 2,5 1+ 2,5 + AG-K24 65766 0,4 2,5 - 2,5 2+ MDA-MB-231- 58624 0 2,5 2,5 1+ MFP-XCL

AG-MellO 70845 0 2,5 - 2,5 - AG-B1 61668 681 5 3+ 5 3+ AG-B11 68618 391 5 3+ 5 2+ AG-Br29 71838 76 5 2+ 5 3+ AG-OV35 67431 45 5 3+ 5 3+ AG-Panc3 62103 12 5 3+ 5 3+

AG-C6 61674 6 5 + 5 + AG-K24 65766 0,4 5 - 5 3+ 58624 0 5 + 5 1+ MDA-MB-231- MFP-XCL AG-MellO 70845 0 5 - 5 -

M22-321b41.1 M22-244b3.1.1.1 Tecidos de ID de MRNA de Conc.

Pontuação Conc. (pg/ml) Pontuação Xenoenxerto Camundongo Nectina4 (pg/ml) Humano (qPCR) AG-B1 61668 681 7,5 3+ 7,5 3+ AG-B11 68618 391 7,5 3+ 7,5 2+ AG-Br29 71838 76 7,5 2+ 7,5 3+ AG-OV35 67431 45 7,5 3+ 7,5 3+

AG-Panc3 62103 12 7,5 3+ 7,5 3+ AG-C6 61674 6 7,5 + 7,5 + AG-K24 65766 0,4 7,5 + 7,5 3+ 58624 0 7,5 + 7,5 1+ MDA-MB-231- MFP-XCL AG-MellO 70845 0 7,5 - 7,5 -

[0612] A concentração ideal para o manchamento de IHC de anticorpo anti- Nectina-4 foi determinado como a concentração na qual o manchamento de IHC de anticorpo anti-Nectina-4 foi observado nos tecidos que expressão mRNA de Nectina- 4, mas não nos tecidos Nectina-4 negativo. A 2,5 μg/ml, tanto M22-o anticorpo 321b41.1 quanto o anticorpo M22-244b3.1.1.1 exibiram manchamento positivo nos tecidos de xenoenxerto humano positivo para mRNA de Nectina-4 (FIG. 1 e FIG. 2) e mostraram o menor manchamento de fundo nos tecidos de controle negativo. A Tabela 6 e os resultados de manchamento detalhados na Tabela 7 indicaram que a concentração de 2,5 μg/ml foi um exemplo de concentração ideal para ambos os anticorpos.

Tabela 7. Resultados de Manchamento Detalhado para a Titulação de M22- 321b41.1 e M22-244b3.1.1.1 mRNA Conc. Número de de Anticorpo (μg/ml) Resultado de Xenoenxerto Camundongo Nectina4 Primário Manchamento AG-B1 61668 (qPCR) 681 M22-244b3.1.1.1 2,5 3+ AG-B11 68618 391 M22-244b3.1.1.1 2,5 2+ AG-Br29 71838 76 M22-244b3.1.1.1 2,5 3+ AG-OV35 67431 45 M22-244b3.1.1.1 2,5 2+ AG-Panc3 62103 12 M22-244b3.1.1.1 2,5 3+ AG-C6 61674 6 M22-244b3.1.1.1 2,5 + mRNA Conc. Número de de Anticorpo (μg/ml) Resultado de Xenoenxerto Camundongo Nectina4 Primário Manchamento AG-K24 65766 (qPCR) 0,4 M22-244b3.1.1.1 2,5 2+

AG-MellO 70845 0 M22-244b3.1.1.1 2,5 - MDA-MB-231- 58624 M22-244b3.1.1.1 2,5 + 0 MFP-XCL AG-B1 61668 681 M22-244b3.1.1.1 5,0 3+ AG-B11 68618 391 M22-244b3.1.1.1 5,0 2+ AG-Br29 71838 76 M22-244b3.1.1.1 5,0 3+ AG-OV35 67431 45 M22-244b3.1.1.1 5,0 3+ AG-Panc3 62103 12 M22-244b3.1.1.1 5,0 3+ AG-C6 61674 6 M22-244b3.1.1.1 5,0 + AG-K24 65766 0,4 M22-244b3.1.1.1 5,0 3+ AG-MellO 70845 0 M22-244b3.1.1.1 5,0 - MDA-MB-231- 58624 M22-244b3.1.1.1 5,0 + 0 MFP-XCL AG-B1 61668 681 M22-244b3.1.1.1 7,5 3+ AG-B11 68618 391 M22-244b3.1.1.1 7,5 2+ AG-Br29 71838 76 M22-244b3.1.1.1 7,5 3+ AG-OV35 67431 45 M22-244b3.1.1.1 7,5 3+ AG-Panc3 62103 12 M22-244b3.1.1.1 7,5 3+ AG-C6 61674 6 M22-244b3.1.1.1 7,5 + AG-K24 65766 0,4 M22-244b3.1.1.1 7,5 3+ AG-MellO 70845 0 M22-244b3.1.1.1 7,5 - MDA-MB-231- 58624 M22-244b3.1.1.1 7,5 + 0 MFP-XCL AG-B1 61668 681 M22-321b41.1 2,5 3+ AG-B11 68618 391 M22-321b41.1 2,5 3+ AG-Br29 71838 76 M22-321b41.1 2,5 2+ AG-OV35 67431 45 M22-321b41.1 2,5 3+ AG-Panc3 62103 12 M22-321b41.1 2,5 3+ AG-C6 61674 6 M22-321b41.1 2,5 + AG-K24 65766 0,4 M22-321b41.1 2,5 - AG-MellO 70845 0 M22-321b41.1 2,5 - MDA-MB-231- 58624 M22-321b41.1 2,5 - 0 MFP-XCL AG-B1 61668 681 M22-321b41.1 5,0 3+ AG-B11 68618 391 M22-321b41.1 5,0 3+ mRNA Conc.

Número de de Anticorpo (μg/ml) Resultado de Xenoenxerto Camundongo Nectina4 Primário Manchamento AG-Br29 71838 (qPCR) 76 M22-321b41.1 5,0 2+ AG-OV35 67431 45 M22-321b41.1 5,0 3+

AG-Panc3 62103 12 M22-321b41.1 5,0 3+ AG-C6 61674 6 M22-321b41.1 5,0 + AG-K24 65766 0,4 M22-321b41.1 5,0 - AG-MellO 70845 0 M22-321b41.1 5,0 - MDA-MB-231- 58624 M22-321b41.1 5,0 + 0 MFP-XCL AG-B1 61668 681 M22-321b41.1 7,5 3+ AG-B11 68618 391 M22-321b41.1 7,5 3+ AG-Br29 71838 76 M22-321b41.1 7,5 2+ AG-OV35 67431 45 M22-321b41.1 7,5 3+ AG-Panc3 62103 12 M22-321b41.1 7,5 3+ AG-C6 61674 6 M22-321b41.1 7,5 + AG-K24 65766 0,4 M22-321b41.1 7,5 + AG-MellO 70845 0 M22-321b41.1 7,5 - MDA-MB-231- 58624 M22-321b41.1 7,5 + 0 MFP-XCL

[0613] O anticorpo M22-321b41.1 a 2,5 μg/ml não gerou manchamento em tecidos de mRNA de Nectina-4-negativo AG-K24 e MDAMB-231-MFP-XCL (FIG. 3 e FIG. 5); enquanto que M22-244b3.1.1.1 não teve manchamento específico nas células cancerosas de xenoenxerto de mRNA de Nectina-4-negativo AG-K24 (FIG.

4) e MDAMB-231-MFP-XCL (FIG. 6). Não houve manchamento observado nas seções incubadas com o anticorpo de controle negativo IgG2a de camundongo (FIG.

7). Portanto, M22-321b41.1 manchou especificamente tecidos que expressam mRNA de Nectina-4 e não produziu manchamento ou produziu manchamento tão baixo quanto um controle de IgG de isótopo, para os tecidos que não expressam mRNA de Nectina-4.

[0614] A especificidade de M22-321b41.1 foi adicionalmente testada em um painel expandido de tecidos de controle positivo e negativo que são mostrados na Tabela 8. Os resultados mostraram que o anticorpo a 2,5 μg/ml foi específico para tecidos e células que expressam mRNA de Nectina-4, incluindo AG-B l, AG-UTS, AG-L16 (FIG. 8), AG-Br29, AG-Bl 1 (FIG. 9), AG-OV35, AG-Panc3, AG-C16, AG-C6, Ratl(E)-Nectina-4 e T47D. Os resultados também mostraram que o anticorpo foi negativo para tecidos e 231-MFPXCL (FIG 5), AG-Mel5, AG-K31, CALU-1, MDA-MB- 231, UG-K3, Rat1(E)-neo, Rat1(E)-Nectina-1, Rat1(E)-Nectina-2, Rat1(E)-Nectina-3, JMSU-1, Hep3B e ACHN. Essas constatações demonstraram que M22-321b41.1 foi específico para Nectina-4 em um ensaio de IHC, devido ao fato de que, para todos os tecidos e células testados aqui, M22-321b41.1 manchou positivamente os tecidos e células que expressaram mRNA de Nectina-4 e mancharam negativamente com aqueles que não expressaram. (Tabela 8 e Tabela 9).

Tabela 8: Resumo da expressão da Nectina-4 em um Painel expandido de FFPE Amostras com o uso de M22-321b41.1 a 2,5 μg/ml Amostra Número de ID mRNA de Nectina4 Pontuação (qPCR) (Manchamento de M22-32lb41.1) Rat 1(E) Neo C974 negativo - Rat 1(E) Nectinl C975 negativo - Rat 1(E) Nectin2 C976 negativo - Rat 1(E) Nectin3 C977 negativo - Rat 1(E) Nectin4 C978 positive 3 T47D C1035 positive 3 MDA-MB-231 C1033 negativo - JMSU-1 C979 negativo - Hep3B C951 negativo - ACHN C955 negativo - AG-B1 61668 681 3 AG-B11 68618 391 3 AG-B10 68687 374 3 AG-UT5 71078 188 2 AG-L16 62092 105 3 AG-Br29 71838 76 2 AG-OV35 67431 45 3 AG-Panc3 62103 12 3 AG-C16 66746 7 1

AG-C6 61674 6 1 AG-K24 65766 0,4 - AG-MellO 70845 0 - Amostra Número de ID mRNA de Nectina4 Pontuação (qPCR) (Manchamento de M22-32lb41.1) MDA-MB-231- 58624 0 MFP-XCL MDA-MB-231 58480 0 - AG-Mel5 57775 0 - AG-K31 600-B681 0 -

[0615] Tabela 9. M22-244b3.1.1.1 Resultados de Manchamento do Painel Expandido Número de MRNA de Anticorpo Conc Resultado de Xenoenxerto Camundongo Nectina4 Primário qt,m/ml:) Manchamento (qPCR) AG-BI 61668 681 M22- 2,5 321b41.1 AG-BII 68618 391 M22- 2,5 321b41.1 AG-Br29 71838 76 M22- 2,5 321b41.1 AG-OV35 67431 45 M22- 2,5 321b41.1 AG-Panc3 62103 12 M22- 2,5 321b41.1 AG-C6 61674 6 M22- 2,5 321b41.1 AG-K24 65766 0,4 M22- 2,5 321b41.1 AG-Me110 70845 0 M22- 2,5 321b41.1 58624 0 M22- 2,5 MFP-XCL 321b41.1

AG-BI 61668 681 M22- 5,0 321b41 1 AG-BII 68618 391 M22- 5,0 321b41.1 AG-Br29 71838 76 M22- 5,0 321b41.1 AG-OV35 67431 45 M22- 5,0 321b41.1 AG-Panc3 62103 12 M22- 5,0 321b41.1 AG-C6 61674 6 M22- 5,0 321b41.1 AG-K24 65766 0,4 M22- 5,0 321b41.1 AG-Me110 70845 0 M22- 5,0 321b41.1 NIDA-MB-231 58624 0 M22- 5,0 NFP-XCL 321b41.1 AG-BI 61668 681 M22- 7,5 321b41.1 AG-BII 68618 391 M22- 7,5 321b41.1 AG-Br29 71838 76 M22- 7,5 321b41.1 AG-OV35 67431 45 M22- 7,5 321b41.1 AG-Panc3 62103 12 M22- 7,5 321b41.1

Número de mRNA de Anticorpo Primário Conc Resultado de Xenoenxerto Camundongo Nectina4 (µm/ml) Manchamento (qPCR) AG-C6 61674 6 M22-321b41.1 7,5 + AG-K24 65766 0,4 M22-321b41.1 7,5 + AG-MellO 70845 0 M22-321b41.1 7,5 - MDA-MB-231- 58624 M22-321b41.1 7,5 + 0 MFP-XCL Ratl(E) Neo C974 negativo M22-321b41.1 2,5 - Ratl(E) Nectinl C975 negativo M22-321b41.1 2,5 - Ratl(E) Nectin2 C976 negativo M22-321b41.1 2,5 -

Ratl(E) Nectin3 C977 negativo M22-321b41.1 2,5 - Ratl(E) Nectin4 C978 negativo M22-321b41.1 2,5 3+ T47D C1035 negativo M22-321b41.1 2,5 3+ MDA-MB-231 C1O33 negativo M22-321b41.1 2,5 - JMSU-1 C979 negativo M22-321b41.1 2,5 - Hep3B C951 negativo M22-321b41.1 2,5 - ACHN C955 negativo M22-321b41.1 2,5 - AG-B1 61668 681 M22-321b41.1 2,5 3+ AG-B11 68618 391 M22-321b41.1 2,5 3+ AG-B10 68687 374 M22-321b41.1 2,5 3+ AG-UT5 71078 188 M22-321b41.1 2,5 2+ AG-L16 62092 105 M22-321b41.1 2,5 3+ AG-Br29 71838 76 M22-321b41.1 2,5 2+ AG-OV35 67431 45 M22-321b41.1 2,5 3+ AG-Panc3 62103 12 M22-321b41.1 2,5 3+ AG-C16 66746 7 M22-321b41.1 2,5 + AG-C6 61674 6 M22-321b41.1 2,5 + AG-K24 65766 0,4 M22-321b41.1 2,5 - AG-MellO 70845 0 M22-321b41.1 2,5 - MDA-MB-231- 58624 M22-321b41.1 2,5 - 0 MFP-XCL MDA-MB-231 58480 0 M22-321b41.1 2,5 - AG-Mel5 57775 0 M22-321b41.1 2,5 - AG-K31 M22-321b41.1 2,5 - 600- B681 0 CALU-1 72902 0 M22-321b41.1 2,5 - UG-K3 74323 0 M22-321b41.1 2,5 -

[0616] Os anticorpos anti-Nectina-4 gerados e triados, como descrito acima, foram adicionalmente comparados a outros anticorpos anti-Nectina-4 comerciais em um ensaio de IHC. Por exemplo, Anticorpo de Nectina-4/PVRL4 (denominado “anticorpo Novus PVRL4”) da Novus Biologicals (número de catálogo NBP1-82829), um anticorpo anti-Nectina-4 policlonal de coelho, foi obtido e testado quanto a sua habilidade para manchar especificamente Nectina-4 em um ensaio de IHC em vários tecidos de xenoenxerto nos quais os níveis de mRNA de Nectina-4 foram determinados por qPCR. Em experimentos em que o anticorpo Novus PVRL4 foi titulado a 2 μg/ml, 1,5 μg/ml, 1 μg/ml e 0,5 μg/ml, o anticorpo Novus PVRL4 produziu manchamento de Anticorpo Nectina-4 mais fraco que aquele produzido por Anticorpo M22-244b3.1.1.1.1 e produziu manchamento não específico em todas as concentrações em xeno MDA-MB-231 que não expressaram mRNA de Nectina-4, que são mostradas na Tabela 10. Desse modo, o anticorpo Novus PVRL4 foi não específico para Nectina-4.

Tabela 10: Resultados de Manchamento de anticorpo Novus PVRL4 em concentrações diferentes Tecido Nº de RNA Resultados de IHC camundongo MDA-MB- 231- 58624 0 Células positivas dispersadas mesmo a 0,5 ug/ml. MFP-XCL AG-B10P8 64069 286 Fragmento mod-forte a 2 pg/ml. Mais fraco em concentrações inferiores AG-Mell0P5 72088 0 Tumor negativo com fundo citoplásmico fraco a 1,5 ug/ml AG-OV20 P7 72260 67 Rendimento citoplásmico fraco com foci pequeno de células positivas moderadas AG-C18P9 67921 3 Fragmento fraco para negativo a 2 pg/ml. AG-C16P4 68679 50 Fragmento modesto-fraco, apical a 2pg/ml

[0617] O anticorpo Novus PVRL4 foi adicionalmente testado em um ensaio de IHC contra um painel mais amplo de tecidos no qual os níveis de mRNA de Nectina-4 foram determinados por qPCR. O manchamento citoplásmico de fundo foi observado na maioria dos xenoenxertos testados, independentemente d os níveis de mRNA de Nectina-4, que são mostrados na Tabela 11.

Tabela 11: Resultados de manchamento de anticorpo Novus PVRL4 em um painel mais amplo de tecidos de xenoenxerto Tecido Nº de RNA Novus PVRL4(NBP 1-82829) 2 pg/ml camundongo AG-B10P8 64069 286 Fragmento Membranoso Forte AG-Mell0P5 72088 0 Fundo negativo a fraco AG-OV20 P7 72260 67 Citoplásmico sujo AG-Br8 P3 59161 41 Membrana moderada-forte em uma metade

Tecido Nº de Novus PVRL4(NBP 1-82829) 2 pg/ml camundongo Tumor AG-K24 P3 64812 i Fundo negativo a fraco MDA-MB-231- 58624 0 Fundo fraco-moderado? MFP-XCL AG-K9P17 52376 0.1 Fundo positivo fraco? AG-OV23 P3 55635 2 Membrana/citoplasma de fragmento moderado AG-C18P9 67921 3 Fragmento positivo, fraco-moderado AG-C16P4 68679 50 Fragmento moderado AG-Brl2 P2 62109 1024 Rendimento de membrana forte

[0618] Visto que o anticorpo Novus PVRL4 é um anticorpo policlonal de coelho exaustivo com potencial de lote para lote variável, um anticorpo anti-Nectina- 4 policlonal de coelho diferente, PA5-30837 de ThermoFischer Scientific (como “anticorpo Thermo PVRL4”), foi obtido, testado e comparado em um ensaio de IHC em três tecidos de xenoenxerto diferentes no qual os níveis de mRNA de Nectina-4 foram determinados por qPCR. Os três tecidos de xenoenxerto testados incluídos AG-B1(+) PS26 com o npivel de mRNA de Nectina-4 a 478, AG-OV35P3 com nível de mRNA de Nectina-4 a 78 e AG-Mel5 P17 que não expressa nenhum mRNA de Nectina-4. O anticorpo Thermo PVRL4 produziu manchamento fraco/moderado de IHC em AG-B1 e manchamento negativo de IHC em AG-OV35.

[0619] Portanto, nem o anticorpo Novus PVRL4 nem o anticorpo Thermo PVRL4 foi específico para Nectina-4 em um ensaio de IHC como os anticorpos M22- 244b3.1.1.1.1 ou M22-321b41.1. gerados e triados no presente documento.

[0620] Dois outros anticorpos comerciais (um anticorpo anti-Nectina-4 MAB2659 monoclonal de camundongo e um anticorpo anti-Nectina-4 AF2659 policlonal de cabra), ambos da R&D Systems, também foram obtidos e testados em um ensaio de IHC em três tecidos de xenoenxerto diferentes nos quais os níveis de mRNA de Nectina-4 foram determinados por qPCR. Os três tecidos de xenoenxerto testados incluíram AG-B1(+) PS26 com nível de mRNA de Nectina-4 a 478, AG- OV35P3 com nível de mRNA de Nectina-4 a 78 e AG-Mel5 P17 com nenhum mRNA de Nectina-4. O anticorpo MAB2659 quando usado a 1 μg/ml ou 5 μg/ml produziu pontuação de sujeira/citoplásmica semelhante a manchamento na periferia do tumor em AG-B1 e AG-OV35. O anticorpo anti-Nectina-4 AF2659 policlonal de cabra produziu manchamento membranoso forte com manchamento estromal de fundo em AG-B1 e AG-OV35 a 5 μg/ml, mas manchamento fraco a 1 μg/ml. Portanto, o anticorpo AF2659 foi adicionalmente avaliado a 2,5 μg/ml nos outros tecidos. O anticorpo AF2659, entretanto, produziu manchamento de fundo em xenoenxertos MDA-MB-231 que não expressam mRNA de Nectina-4. Portanto, nem anticorpo MAB2659 nem o anticorpo AF2659 foram tão específicos quanto o anticorpo M22- 321b41.1 gerado e triado no presente documento.

[0621] EXEMPLO 6: ENSAIOS FUNCIONAIS: MACHAMENTO

IMUNOISTOQUÍMICO DE TECIDOS PRIMÁRIOS

[0622] Anticorpos, por exemplo, anti-Nectina-4 M22-321b41.1, gerados, triados, expressados e purificados, por exemplo, como descrito nos Exemplos no presente documento, foram adicionalmente avaliados para quanto a suas habilidades para manchar especificamente tecidos humanos primário que expressam Nectina-4 em um ensaio de IHC.

[0623] O ensaio de IHC foi realizado, por exemplo, com o uso de uma técnica de IHC indireta. O método de IHC indireto usou dois anticorpos parar a detecção de antígenos de tecido. Primeiro, um anticorpo primário não conjugado foi aplicado a o tecido (primeira camada), que reagiu com o antígeno de tecido. Em seguida, um anticorpo secundário etiquetado de enzima foi aplicado que foi direcionado contra o IgG das espécies animais nas quais o anticorpo primário foi elevado (segunda camada). O anticorpo secundário reagiu com o anticorpo primário, seguido por aplicação de substrato cromogênico. O anticorpo de segunda camada foi etiquetado com uma enzima peroxidase, que reagiu com o cromogênio 3,3’- diaminobenzidina (DAB) para produzir precipitado marrom no sítio de reação. Esse método é sensível e versátil devido à amplificação de sinal potencial através de diversas reações de anticorpo secundário com sítios antigênicos diferentes no anticorpo primário.

[0624] Como exemplo para aumentar adicionalmente a sensibilidade do teste, um anticorpo secundário de polímero conjugado de cadeia etiquetada foi usado. A tecnologia de polímero usou uma molécula “espinhal” inerte etiquetada com enzima de HRP de dextrano à qual até 10 moléculas de anticorpos secundários foram fixadas, tornando o sistema ainda mais sensível.

[0625] O espécime foi, então, contra manchado para identificar elementos celulares e subcelulares.

6.A. Procedimento de Manchamento

[0626] O ensaio de IHC foi realizado de acordo com o seguinte protocolo exemplificativo. Brevemente, as amostras de tecido foram fixadas, processadas e embebidas em cera de parafina e preparou as seções de tecido. As lâminas foram, então, incubadas em um forno a 60 ± 5 °C por 1 a 2 horas, removidas do forno e permitiu-se que as mesmas esfriassem a temperatura ambiente (TA) antes de prosseguir. Após a desparafinização e re-hidratação de rotina das amostras de tecido, a recuperação de antígeno foi realizada para reverter a reticulação de proteína que ocorreu após a fixação em formalina. A recuperação de antígeno foi obtida através de digestão proteolítica dos tecidos em soluções de protease ou através de aplicação de calor às seções de tecido em um meio aquoso, comumente denominado procedimento HIER. Para esse ensaio, a Recuperação de Epítopo 2 (ER2, um tampão à base de EDTA a pH 8,9 a 9,1) na plataforma automatizada Leica por 20 minutos a 100 °C foi usada.

[0627] O manchamento foi programado para ser executado em instrumentos de Ligação com o uso de Automanchadores de Ligação Leica a RT, salvo se especificado o contrário. Brevemente, as seguintes etapas foram programadas nos automanchadores de Ligação Leica como o protocolo de manchamento: (1) um procedimento de Recuperação de Epítopo 2 (ER2): 20 minutos a 100 °C (Solução de

Recuperação de Epítopo de Ligação 2 (Leica), nº de PeçaAR9640); (2) 3× Lavagem de Ligação: 0 min (Solução de Lavagem de Ligação (Leica), nº de Peça AR9590); (3)

Marcador: 15 minutos (manchamento com anticorpo anti-Nectina-4 M22-321b41 monoclonal de camundongo.1 ou controle negativo camundongo IgG2a (BD

Biosciences) nº de Peça 550339, no Diluente de Anticorpo Primário de Ligação

(Leica), nº de Peça AR9352); (4) 3× Lavagem de Ligação: 0 minutos (Solução de

Lavagem de Ligação (Leica), nº de Peça AR9590); (5) Após Primário: 8 minutos (anti camundongo IgG2a de coelho); (6) 3× Lavagem de Ligação: 2 minutos (Solução de

Lavagem de Ligação (Leica), nº de Peça AR9590); (7) Polímero: 8 minutos (Poli-

HRP-IgG Anti-coelho de Detecção de Refinamento de Polímero de Ligação (Leica),

nº de Peça DS9800); (8) 2× Lavagem de Ligação: 0 min, 2 min; (9) 1× água de DI: 0 minutos; (10) Bloco de Peróxido: 5 minutos (3 a 4% de peróxido de hidrogênio) e 3×

Lavagem de Ligação: 0 min; (11) 2× água de DI: 0 minutos; (12) refinamento de DAB misturado: 0 minutos (66 mM de Tetracloridrato de 3,3-Diaminobenzidina e ≤0,1% de

Peróxido de Hidrogênio da Detecção de Refinamento de Polímero de Ligação (Leica), nº de Peça DS9800); (13) refinamento de DAB misturado: 10 minutos (66 mM de Tetracloridrato de 3,3-Diaminobenzidina e ≤0.1% Hydrogen Peroxide from

Detecção de Refinamento de Polímero de Ligação (Leica), nº de Peça DS9800); (14)

3× água de DI: 0 minutos; (15) Hematoxilina: 15 minutos (<0,1% Hematoxilina de

Detecção de Refinamento de Polímero de Ligação (Leica), nº de Peça DS9800); (16)

1× água de DI: 0 minutos; (17) 1× Lavagem de Ligação: 0 minutos; (18) 1× água de

DI: 0 minutos.

Como indicado no procedimento, um IgG2a de camundongo de controle de reagente negativo da BD Biosciences foi usado para cada espécime testado para avaliar a presença de manchamento (de fundo) não específico.

A presença de manchamento de fundo também foi um critério para aceitação/rejeição de uma execução de ensaio particular.

6.B Amostras de tecido

[0628] Espécimes de controles positivos e negativos foram usados para validar e controlar todas as etapas da análise de IHC. Para esse ensaio, xenoenxertos de tumor humanos de camundongo com níveis variáveis de expressão da Nectina-4 foram usados como controles.

[0629] Espécimes de tecido humano fixados em formalina, embebidos em parafina foram obtidos como material restante da cirurgia ou autópsia das fontes aprovadas pelo Conselho de Revisão Institucional, por exemplo, repositórios governamentais (por exemplo, Cooperative Human Tissue Network), colaborações acadêmicas (por exemplo, UCLA, UC Irvine) e fontes comerciais, incluindo por exemplo, carcinoma de célula urotelial e transicional normal humana (BL802) e micromatriz de tecido normal (FDA999) (TMA), Biomax EUA. Amostras de tecido foram testadas quanto a expressão da Nectina-4 com o uso de protocolo descrito no Exemplo 6.A. Quatro xenoenxertos de tumor humanos de camundongo que incluem um negativo (X14-126), um fracamente positivo (X14-33), um moderadamente positivo (X14-139) e um fortemente positivo (X14-43) para expressão da Nectina-4, também foram testados.

[0630] 6.C Titulação de Concentração de Manchamento de Anticorpos anti- Nectina-4

[0631] O título de anticorpo primário ideal foi determinado realizando-se análise de titulação nas seções de tecido de xenoenxertos, por exemplo, com o uso do protocolo descrito nos Exemplos 4 e 5. A análise de titulação para espécimes embebidos em parafina foi realizada em um esforço para determinar a concentração ideal de anticorpo para os ensaios de IHC. A fim de realizar a análise de titulação, diluições seriais de 2 vezes que agrupam a concentração ideal (2,5 μg/ml) como determinado no Exemplo 5 foram preparadas e testadas com suas seções de tecido de controle negativo compatíveis.

[0632] O anticorpo anti-Nectina-4 M22-321b41.1 e seu anticorpo de controle negativo correspondente foram aplicados às seções de tecido de acordo com o protocolo de IHC adequado para espécimes embebidos em parafina, como declarado nos Exemplos 4 e 5. Os resultados foram avaliados e comparados pelos patologistas do estudo com o uso de microscopia óptica. Os patologistas do estudo determinaram que a titulação ideal (a concentração ideal de anticorpo) como a titulação mais baixa (a concentração mais baixa do anticorpo) que tendeu a intensidade de manchamento mais alta sem manchamento de fundo significativo.

Nesse Exemplo, como observado pela Tabela 12, uma concentração de anticorpo de 2,5 μg/ml foi selecionada e usada em ensaios de IHC subsequentes. Tabela 12: Determinar a concentração ideal de anticorpo para Anti-Nectina-4 M22-321b41.1. Nº de ID de Concentração Fundo % Intensidade Manchamento Sub Morfologia Comentários espécime execução de Anticorpo positiva de Estromal pg/ml Manchamento Alvo X14-126 0VE7 3,75 0 0 NA 0 NA A Pequeno Fragmento de tecido positivo observado, provavelmente um contaminante X14-126 0VE8 2,5 0 0 NA 0 NA A Mesmo que acima X14-126 0VE9 1.25 0 0 NA 0 NA A Mesmo que acima X14-33 0VDZ 3,75 0 25 1-3+ 0 M,C,Ap A X14-33 0VE0 2,5 0 25 1-3+ 0 M,C,Ap A X14-33 0VE1 1.25 0 25 1-3+ 0 M,C,Ap A X14-139 OVDS 3,75 0 90 1-3+ 0 M,C,Ap A X14-139 0VDT 2,5 0 90 1-3+ 0 M,C,Ap A X14-139 0VDU 1.25 0 80 1-3+ 0 M,C,Ap A X14-43 0VDK 3,75 0 100 3++ 1-3+ M,C A Dispersado

X14-43 0VDL 2,5 0 100 3++ 1-2+ M,C A X14-43 0VDM 1.25 0 100 3+ 1-2+ M,C A 2+F

6.D. Avaliação do manchamento de IHC de Nectina-4

[0633] A avaliação de manchamento de IHC foi realizada por patologistas certificados pelo conselho. A intensidade de manchamento foi avaliada e relatada como 0 (negativa), 1+ (fraca), 2+ (moderada) e 3+ (forte). A porcentagem aproximada de manchamento de células em cada nível de intensidade ou células positivamente manchadas geral foi avaliada e realtada a partir de 0 a 100%.

[0634] Para comparação de manchamento entre tecidos, os vários parâmetros de avaliação de manchamento de Nectina-4 foram diretamente comparados ou os resultados de manchamento de Nectina-4 foram adicionalmente processados, por exemplo, calculados como uma Pontuação H que considera tanto a intensidade de manchamento quanto a porcentagem de células manchadas em uma faixa específica de intensidades. Por exemplo, uma Pontuação H foi calculada somando-se os produtos da porcentagem de células manchadas em uma determinada intensidade de manchamento (0 a 100) e a intensidade de manchamento (0 a 3). Por exemplo: um espécime com 10% de células manchamento 3+, 30% de células manchamento 2+, 20% de células manchamento 1+ e 40% de células não manchadas seriam uma Pontuação H de (3 × 10) + (2 × 30)+ (1 × 20) + (0 × 40) = 110.

[0635] O Coeficiente de Variação (CV) foi usado para avaliar a variação ou precisão de intra-execuções na Pontuação H. A precisão de intra-execuções do desempenho do ensaio foi determinada a partir de cinco execuções separadas, com o uso de três espécimes de xenoenxerto positivos. Qualitativamente, a precisão de intra-execuções é considerada aceitável por geralmente um padrão de manchamento consistente de cada tecido testado em três execuções separadas. O CV foi calculado como a seguir:

CV = Desvio Padrão/Média× 100

[0636] Por exemplo, CV menor que ou igual a 35% foi considerado aceitável.

[0637] Como mostrado na Tabela 13 para a avaliação de precisão de intra- execuções, os padrões (combinações de 3+, 2+, 1+) de intensidade de manchamento foram consistentes para cada tecido ao longo das cinco réplicas.

Ademais, os CVs para todos os tecidos foram menores que 35%, que está dentro da faixa exemplificativa aceitável. Portanto, M22-321b41.1 forneceu precisão para detectar Nectina-4 no ensaio de IHC de Nectina-4.

Tabela 13. Precisão Intra-execução de Anti-Nectina-4 M22-321b41.1 em ensaios de IHC

INFORMAÇÕES DE ESPÉCIME GERAL MANCHAMENTO DE ARTIGO DE TESTE DE CÉLULAS DISTINTAS OUTRO nº de Adesão de Lâmina Data/Instrum Tecido Controle % e Localização Subcelular de Manchamento de Células II- % Comentário Demandaa ento de (Diagnóstico) Isotópico em Cada Intensidade Pontuaç De Manchament 3+% 3+Sub 2+% 2+ Sub 1+% 1+ Sub ão Nectina o Tecido 4 X14-43 0VH4 30 Junho de Xenoenxerto 0 95 M,C 5 M,C 0 NA 0 295 100 Tecido necrótico 2014 s excluído X14-43 0VH5 30 Junho de Xenoenxerto 0 95 M,C 5 M,C 0 NA 0 295 100 2014 s X14-43 0VH6 30 Junho de Xenoenxerto 0 98 M,C 2 M,C 0 NA 0 298 100 2014 s 326/362 X14-43 0VH7 30 Junho de Xenoenxerto 0 98 M,C 2 M,C 0 NA 0 298 100 2014 s X14-43 0VH8 30 Junho de Xenoenxerto 0 98 M,C 2 M,C 0 NA 0 298 100 2014 s Média 296,8 100,0 STDEV 1,6 0,0 cv 0,6 ,0 X14-139 OVHB 30 Junho de Xenoenxerto 0 40 M,C 45 M,C 10 M,C 5 220 95 2014 s X14-139 OVHC 30 Junho de Xenoenxerto 0 40 M,C 40 M,C 15 M,C 5 215 95 2014 s X14-139 OVHD 30 Junho de Xenoenxerto 0 40 M,C 35 M,C 20 M,C 5 210 95 2014 s X14-139 OVHE 30 Junho de Xenoenxerto 0 45 M,C 40 M,C 10 M,C 5 225 95 2014 s X14-139 OVHF 30 Junho de Xenoenxerto 0 45 M,C 40 M,C 10 M,C 5 225 95 2014 s Média 219,0 95,0 STDEV 6,5 0,0 CV 3,0 0,0

INFORMAÇÕES DE ESPÉCIME GERAL MANCHAMENTO DE ARTIGO DE TESTE DE CÉLULAS DISTINTAS OUTRO nº de Adesão de Lâmina Data/Instrum Tecido Controle % e Localização Subcelular de Manchamento de Células II- % Comentário Demandaa ento de (Diagnóstico) Isotópico em Cada Intensidade Pontuaç De Manchament 3+% 3+Sub 2+% 2+ Sub 1+% 1+ Sub 3+% ão Nectina Tecido X14-33 OVHI30 Junho de Xenoenxerto 0 10 M,C 15 M,C 5 M,C 70 65 30 2014 s X14-33 OVHJ 30 Junho de Xenoenxerto 0 10 M,C 10 M,C 10 M,C 70 60 30 2014 s X14-33 OVHK 30 Junho de Xenoenxerto 0 10 M,C 10 M,C 5 M,C 75 55 25 2014 s X14-33 OVHL 30 Junho de Xenoenxerto 0 8 M,C 12 M,C 5 M,C 75 53 25 2014 s X14-33 OVHM 30 Junho de Xenoenxerto 0 5 M,C 15 M,C 5 M,C 75 50 25

327/362 2014 s Média i 56,6 27,0 STDEV 1 i 5,9 2,7 cv 1 10,5 10,1 COMENTÁRIO/OBSERVAÇÃO ± = Resultados Equivocados GERAL: NA = Não aplicável Ca = Carcinoma NS = Não observado c/w = Consistente com

[0638] A reproducibilidade de intra-execuções do desempenho do ensaio foi determinada a partir de cinco execuções separadas, com o uso dos mesmos espécimes de xenoenxerto que para o ensaio de precisão.

[0639] Qualitativamente, precisão intra-execuções foi considerada aceitável por um padrão de manchamento geralmente consistente de ada tecido testado em cinco execuções separadas. Como mostrado na Tabela 14 para a reproducibilidade de intra-execuções, os padrões (combinações de 3+, 2+, 1+) de intensidade de manchamento foram consistentes para cada tecido durante as três réplicas. Ademais, os CVs para todos os tecidos foram menores que 35%, que estava dentro da faixa aceitável exemplificativa. Portanto, M22-321b41.1 forneceu reproducibilidade para detectar Nectina-4 no ensaio de IHC de Nectina-4.

Tabela 14: Reproducibildade Cruzada de Anti-Nectin04 M22-321b41.1 em Ensaios de IHC

INFORMAÇÕES GERAIS DE ESPÉCIME COLORAÇÃO DE ARTIGO TESTE DE CÉLULAS

DISTINTAS Aces Reprodutibilida Dados e Dados/Instrume Tecido Control % e Localização Subcelular de Coloração escor % Comentári so a de# Platafor nto de (Diagnóstic e de de Células em Cada Intensidade eH Nectina-4 os Quest ma de Coloração o) Isótipo 3+ 3+ 2+ 2+ 1+ 1+ 0% # Repetiçã % su % su % sub o b b

TECIDO X14- #1 26 Jun 2014 0VDL Xenoenxert 0 10 M, 0 NA 0 N 0 300 100 43 Ligação III os 0 C A X14- #2 30 Jun 2014 0VH4 Xenoenxert 0 95 M, 5 M, 0 N 0 295 100 43 Ligação III os C C A 329/362 X14- #3 30 Jun 2014 0VHQ Xenoenxert 0 95 M, 5 M, 0 N 0 295 100 43 Ligação Máx os C C A X14- #4 01 Jul 2014 0VJS Xenoenxert 0 10 M, 0 M, 0 N 0 300 100 43 Ligação Máx os 0 C C A X14- #5 01 Jul 2014 0VJQ Xenoenxert 0 98 M, 2 M, 0 N 0 298 100 43 Ligação III os C C A Meio 297, 100, 6 0 STDEV 2,5 0,0 CV 0,8 0,0 X14- #1 26 Jun 2014 0VDT Xenoenxert 0 40 M, 40 M, 15 M, 5 215 95 Coloração 139 Ligação III os C C C apical observad a X14- #2 30 Jun 2014 0VHB Xenoenxert 0 40 M, 45 M, 10 M, 5 220 95 139 Ligação III os C C C X14- #3 30 Jun 2014 0VHT Xenoenxert 0 45 M, 40 M, 10 M, 5 225 95 139 Ligação Máx os C C C X14- #4 01 Jul 2014 0VJX Xenoenxert 0 45 M, 45 M, 10 M, 0 235 100 139 Ligação Máx os C C C X14- #5 01 Jul 2014 0VJV Xenoenxert 0 45 M, 40 M, 15 M, 0 230 100 139 Ligação III os C C C

Meio 225, 97,0 0 STDEV 7,9 2,7 CV 3,5 2,8 X14- #1 26 Jun 2014 0VED Xenoenxert 0 8 M, 12 M, 10 C 70 58 30 Campo de 33 Ligação III os C C coloração apical X14- #2 30 Jun 2014 0VH1 Xenoenxert 0 10 M, 15 M, 5 M, 70 65 30 33 Ligação III os C C C X14- #3 30 Jun 2014 0VHW Xenoenxert 0 8 M, 12 M, 5 M, 75 53 25 33 Ligação Máx os C C C X14- #4 01 Jul 2014 0VK3 Xenoenxert 0 8 M, 10 M, 7 C 75 51 25 33 Ligação Máx os C C X14- #5 01 Jul 2014 0VK0 Xenoenxert 0 8 M, 12 M, 5 C 75 53 25

330/362 33 Ligação III os C C Meio 56,0 27,0 STDEV 5,7 2,7 CV 10,1 10,1 NOTAS/COMENTÁRIOS GERAIS ± = Resultados Ap = Coloração Apical H =Coloração SCC* = Equivocados Heteogênea Célula Escamos a Ca NA = Não B = Coloração de I = ICélulas L1 = Aplicável Camada Basal Inflamatórias LIgação 1 NS = Não Visto C = Coloração Ca = Carcinoma L2 = Citoplasmática Ligação 2 c/w = Consistente F = Positivo M = Coloração de N = Com focadamente Membrana Coloração Nuclear

[0640] Os parâmetros e resultados fornecidos por 6.A a 6.D são resumidos na seguinte tabela 15: Tabela 15: Parâmetros, Resultados Exemplificativos e Suas Faixas. Especificações de Desempenho Métodos e Resultados Precisões de Ensaio: 0,6%, 0,3%, 10,5% CVs de intra-execuções Exemplificativos Reproducibilidade de Ensaio: 0,8%, 3,5%, 10,1% CVs de intra-execuções Exemplificativos 0 = nenhum, 1 = fraco, Manchamento em Tecidos 2 = moderado, e 3 = manchamento forte Pontuação H (0-300); 0 a 3+, % de células Parâmetros, resultados e suas faixas manchadas ranges

6.E Sensibilidade e Especificidade do Manchamento de Nectina-4 IHC.

[0641] Um ensaio de IHC de Nectina-4 foi considerado sensível, por exemplo, se o mesmo manchou positivamente os tecidos que expressaram o antígeno de Nectina-4. Um ensaio de IHC de Nectina-4 foi considerado específico, por exemplo, se o manchamento diferencial foi observado ao longo de vários tipos de tecido e o manchamento de IHC de Nectina-4 se correlacionam com a expressão conhecida do antígeno de Nectina-4 nos tecidos manchados. Visto que as avaliações de especificidade e sensibilidade não foram mutuamente exclusivas, um ensaio frequentemente fornece informações tanto de sensibilidade quanto de especificidade.

[0642] A sensibilidade e a especificidade de ensaio de IHC de Nectina-4 com M22-321b41.1 foi determinada com um TMA de 60 cores únicas de carcinomas de bexiga e 20 tecidos uroteliais normais, 4 xenoenxertos de tumor humanos de camundongo e 13 seções de tecido inteiras de humano (WTS) de vários carcinomas incluindo bexiga, pulmão e seio. O resumo da sensibilidade e da especificidade do anticorpo M22-321b41.1 com reação ao manchamento de Nectina-4 em ensaios de

IHC foi listado na Tabela 16 e na Tabela 17 abaixo. Nesses e em alguns outros ensaios exemplificativos, as amostras de tecido foram fornecidas por seus resultados de Pontuação H em uma dentre as quatro categorias: alta (201 a 300), moderada (101 a 200), baixa (1 a 100), negativa (0).

Tabela 16. Resumo de Sensibilidade de Manchamento de Tecido Resumo de Sensibilidade de Manchamento de Tecido Tecidos Neoplásticos* Grau de ll de Pontuação Tier Localização Carcinomas de Tecido Inteiro M,C Bexiga: 6/8, Seio: 1/4, Pulmão: 2/4, Xenoenxertos: 2/4 Alta (201 a 300) Moderada (101 a 200) M,C Bexiga: 1/8, Seio: 2/4, Cólon: 2/3, Ovário: 1/1, Bexiga: 1/8, Pulmão: 1/4, Cólon: 1/3. Xenoenxertos: 1/4; Baixa (1 a 100) NA Seio: 1/4 Negativa NA Pulmão: 1/4, Cólon: 1/3, Xenoenxertos: 1/4 (<=0) Tabela 17. Resumo de Especificidade de Manchamento de Tecido Resumo de Especificidade de Manchamento de Tecido Grau de ll de Pontuação Localização Tecidos Normais* Tier M,C Esôfago: 1/3, Colo Uterino : 1/3, Pele : 2/3 Alta (201 a 300) Moderada (101 a 200) M,C Seio 1/3, Colo uterino 1/3, Laringe 1/3 Colo uterino 1/3, Seio 2/3, Medula Espinhal 1/3, Baixa (1 a 100) M,C Pulmão 1/3, Glândula salivar 3/3, Rim 1/3, Próstata Medula Espinhal 2/3, Pulmão 2/3, Esôfago 1/3, Rim 2/3, Próstata 1/3, Endométrio 1/3, Pele 1/3, Laringe Negativa 1/3

NA Os seguintes foram negativos em todas as réplicas: Cérebro (N), Cerebelo (N), Adrenal (N), Ovário, Pâncreas, Paratireoide, Hipófise, Testículos, Tireoide, Baço, Amigdala, Timo, Músculo Cardíaco, Estômago,

[0643] Em alguns ensaios exemplificativos para avaliar a especificidade e sensibilidade de M22-321b41.1, as Pontuações H para os 13 carcinomas de WTS, de manchamento com anticorpo X, que é conhecido por ser específico para Nectina- 4 ou o anticorpo anti-Nectina-4 M22-321b41.1 a 2,5 μg/ml respectivamente, foram comparados. A comparação, mostrada na Tabela 18 abaixo, indicou que o manchamento de IHC por M22-321b41.1 foi consistente com a expressão conhecida da Nectina-4 como mostrado pelo machamento de anticorpo X em grande maioria dos casos.

Tabela 18. Correlação entre M22-321b41.1 Manchamento de IHC e Manchamento de IHC de Anticorpo X Correlação Entre M22-321b41.1 e Anticorpo X M22-321b41.1 Anticorpo X Nº de Pontuação H Pontuação H Nº de Adesão Amostras 2,5,i(g/ml 2,5pg/ml 1 H882 300 280 2 H704 290 275 3 H716 230 200 4 H785 257 275 5 H878 180 100 6 H695 170 180 7 H734 140 135 8 H700 40 38 9 H737 45 120 10 H788 56 55 11 H838 90 125 12 H739 0 0 13 H774 0 0 14 X14-43 Alta 300 15 X14-139 Alta 215 16 X14-33 Baixa 58 17 X14-126 Negativa 0

[0644] Os resultados da Tabela 18 acima foram reclassificados em manchamento de Nectina-4 positivo e negativo para determinar a correlação de manchamento positivamente entre anticorpo X e o anticorpo anti-Nectina-4 M22- 321b41.1. um tecido foi considerado positivo se mostrou uma Pontuação H ≥150. As constatações gerais na Tabela 19 abaixo mostraram uma porcentagem de concordância de 89% entre anticorpo X e o anticorpo anti-Nectina-4 M22-321b41.1 para os tecidos positivamente manchados, uma taxa de concordância de 100% para os tecidos negativamente manchados e uma taxa de concordância geral de 94%.

Assim, há um alto grau de correlação entre manchamento de IHC de Nectina-4 com M22-321b41.1 e a expressão de Nectina-4 no tecido. Portanto, o ensaio de IHC de Nectina-4 com M22-321b41.1 é tanto sensível quanto específico.

Tabela 19. Anticorpo X de Nectina-4 Vs. M22-321b41.1 Quando o limite é uma Pontuação H ≥ 150 M22-321h41.1 Pos Neg Total Pos 8 0 8 Anticorpo X Neg 1 8 9 Total 9 8 17

[0645] A especificidade e a sensibilidade de M22-321b41.1 foram adicionalmente determinadas com o uso de um conjunto de amostras de tecido maior, incluindo um TMA de 60 cores únicas de carcinomas de bexiga e 20 tecidos uroteliais normais, 4 xenoenxertos de tumor humanos de camundongo e 13 seções de tecido inteiras de humano (WTS) de vários carcinomas, incluindo bexiga, pulmão e seio. Um total de 94 casos foram avaliados com uma detecção geral da Nectina-4 em 95% dos casos (82% em WTS e 98% na TMA) pelos ensaios de IHC com o anticorpo X. O manchamento de IHC representativo de Carcinomas com M22- 321b41.1 foi mostrado nas FIGS.10 e 11. A localização subcelular foi em maior parte membranosa e citoplásmica, com manchamento aplical que foi considerado membranoso.

Os resultados na Tabela 20 demostraram adicionalmente a sensibilidade e a especificidade dos ensaios de IHC de Nectina-4 com M22-

321b41.1, devido à porcentagem de manchamento positivo em espécimes de tumor com M22-321b41.1 ser consistente com a expressão conhecida de Nectina-4 em carcinomas como fornecido pelos ensaios de IHC com o anticorpo X.

Portanto, o ensaio de IHC de Nectina-4 com M22-321b41.1 foi tanto sensível quanto específico.

Tabela 20. Sensibilidade de Anticorpo M22-321 Anti-Nectina4.1 em Manchamento de IHC de Tecidos Diferentes.

Tabela 20-Parte I.

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DISTINTAS Linh Nº de Data de ID de Control % e Localização Subcelular Pontuaçã % de Norm Endotéli Muscul Fitroblast Estrom Célula Comentário a adesão execução/Tip Execuçã e de de Manchamento de Células oH Nectin al o o Liso o a s s o de Tecido o isotipo em Cadda Intensidade a inflam 3+ 3+su 2+ 2+ 1+ 1+- 0% 336/362 % b % sub % sub 1 X14-26 7/772014 0VRV 0 0 NA 1 0 0 NA 10 0 0 NA 0 NS 0 0 NS Xenoenxerto 0 0 s 2 X14-39 7/772014 0VRY 30 30 M,C 45 M, 20 M, 5 200 95 NA 0 NS 0 0 NS Xenoenxerto C C s

TECIDO 1 PTBL01172 23//2014 0V6I 0 40 M,C 45 M, 10 M, 5 220 95 NS 0 0 0 0 2+F A Bexiga Ca C C 2 PTBL00626 23//2014 0V6M 0 50 M,C 15 M, 15 M, 20 195 100 NS 0 2+ 0 0 2+ B Bexiga Ca C C 3 PTBL00696 23//2014 0V6Q 0 30 M,C 55 M, 10 M, 5 210 90 NS 0 1+ 0 0 a 1+ 2+ A Bexiga Ca C C 4 PTBL01177 23//2014 0V6T) 0 50 M,C 345 M, 5 C 0 240 90 NS 0 0 0 0 3+ A Bexiga Ca C

5 PTBL01228 23//2014 0V6W 0 80 M,C 10 M, 0 NA 10 260 100 NS 0 3+ 0 1+ 3+ A Bexiga Ca C 6 PTBL01247 23//2014 0V6Z 0 90 M,C 10 M, 0 NA 0 290 100 NS 0 1+ 0 1+ 3+ A Bexiga Ca C 7 PTBL01824 23//2014 0V72 0 70 M,C 20 M, 10 C 0 260 100 NS 0 0 1+ 2+ 2+ Pulmão C SCC* 8 H882 7/7/2014 0V81 0 80 M,C 20 M, 0 NA 0 280 100 3+ 0 2+ 0 0 2+F Urinário Bt. C 9 H704 7/7/2014 0V84 0 80 M,C 15 M, 5 C 0 275 100 3+ 0 NS 0 1 a 2+ 3+ Seio (DC) C 337/362 10 H716 7/7/2014 0V87 0 50 M,C 20 M, 10 C 20 200 80 2+ 0 NS 0 0 2+ Seio (DC) C 11 H785 7/7/2014 0V8A 0 80 M,C 15 M, 5 C 0 275 100 2+ 0 NS 0 1 a 2+ 2+ Pulmão C (scC) 12 H878 7/7/2014 0VSD 0 20 M,C 15 M, 10 C 55 100 45 NS 0 0 0 0 2+ Urinário Bt. C 13 H695 7/7/2014 0VSG 0 25 M,C 40 M, 25 C 10 180 90 2+ 0 NS 0 0 2+F Seio (DC) C 14 H734 7/7/2014 0VSI 0 5 M,C 45 M, 30 C 20 135 80 2+ 0 0 0 0 0 Cólon C 15 H700 7/7/2014 0VSM 0 10 M,C 3 M, 2 C 85 38 15 NS 0 0 0 0 0 Seio (DC) C 16 H737 7/7/2014 0VSQ 0 10 M 40 M, 10 C 40 120 60 0 0 0 0 0 2+F M = Apical Cólon C mensal

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Linh Nº de Data de ID de Control % e Localização Subcelular Pontuaçã % de Norm Endotel Muscul Fitroblast Estrom Célula Comentário a adesão execução/Tip Execuçã e de de Manchamento de Células oH Nectin al oi o Liso o a s s o de Tecido o isotipo em Cadda Intensidade a inflam 17 H788 7/7/2014 0VST 0 5 C 15 C 10 C 70 55 30 3+ 0 0 0 0 3+ Camda Pulmão Basal Negativa 18 H838 7/7/2014 0VSW 0 10 M,C 35 M, 25 M, 30 125 70 NS 0 0 0 0 3+ Ovário C C 19 H739 7/7/2014 0VSZ 0 0 NA 0 NA 0 NA 10 0 0 NS 0 0 0 0 0 Cólon 0 20 H774 7/7/2014 0VT2 0 0 NA 0 NA 0 NA 10 0 0 3+ 0 0 0 0 0 Pulmão 0

338/362 21 X14-43 26/06/2014 0VDL 0 100 M,C 0 NA 0 NA 0 300 100 NS 0 0 0 0 NS Xenoenxerto s 22 X14-139 26/06/2014 0VDT 0 40 M,C 40 M, 15 M, 5 215 95 NS 0 0 0 0 NS Xenoenxerto C C s 23 X14-33 26/06/2014 0VED 0 8 M,C 12 M, 10 M, 70 58 30 NS 0 0 0 0 NS Xenoenxerto C C s 24 X14-126 26/06/2014 0VE8 0 0 NA 0 NA 0 NA 10 0 0 NS 0 0 0 0 NS Xenoenxerto 0 s COMENTÁRIO/OBSERVAÇÃ NA = Não aplicável NC = Controle Negativo A = Apical N = Normal O GERAL: N = Não observado F = Focal C = Manchamento citoplásmico PC = Células de plasma

I.I= Invasivo/intraductal N = Nuclear IC = Células Inflamatórias TCC = Carcinoma de célula transiscional Ca = Carcinoma NAT = Tecido Normal Adjacente de Câncer SCC* Ca de célula escamosa

LLC = Carcinoma de PSC Ca = IDC = Carcinoma ductal infiltrante Célula Grande Cistadenocarcinoma seroso papilar Tabela 20-Parte II

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DISTINTAS Nº de ID de Localizaçã Grau e Control % e Localização Subcelular de Pontuaçã % de Norma Endotel Muscul Fitroblast Estrom Célula Comentário adesã execuçã o de TMA Diagnóstic e de Manchamento de Células em oH Nectin l oi o Liso o a s s o o o de isotipo Cadda Intensidade a inflam 339/362 Bexiga 3+ 3+su 2+ 2+ 1+ 1+- 0% % b % sub % sub BL802 0VK8 A1 TCC G1 0 85 M,C 15 M, 0 NA 0 285 100 NS 0 0 0 0 NS

C BL802 0VK8 A2 TCCG2 0 25 M,C 50 M, 15 M, 10 190 90 NS 0 0 0 0 3+ G1-G2 C C BL802 0VK8 A3 TCC G1 0 0 M,C 5 M, 10 M, 85 20 15 NS 0 0 0 0 2+

C C BL802 0VK8 A4 TCC G1- 0 15 M,C 40 M, 35 M, 10 160 90 NS 0 NS 0 1+ 2+ G2 C C

INFORMAÇÕES ESPÉCIME PADRÃO MANCHAMENTO DE ARTIGO MANCHAMENTO DE ARTIGO DE TESTE DE OUTROS TIPOS DE CÉLULAS DE TESTE DE CÉLULAS DISTINTAS

Nº de ID de Localizaçã Grau e Control % e Localização Subcelular de Pontuaçã % de Norma Endotel Muscul Fitroblast Estrom Célula Comentário adesã execuçã o de TMA Diagnóstic e de Manchamento de Células em oH Nectin l oi o Liso o a s s o o o de isotipo Cadda Intensidade a inflam Bexiga BL802 0VK8 A5 TCC G2 0 65 M,C 20 M, 10 M, 5 245 95 NS 0 0 0 0 NS

C C BL802 0VK8 A6 TCC G2- 0 25 M,C 55 M, 15 M, 5 200 95 NS 0 0 0 0 3+ G3 C C BL802 0VK8 A7 TCC G2 0 25 M,C 35 M, 25 M, 15 170 85 NS 0 NS 0 0 3+

C C BL802 0VK8 A8 TCC G2 0 30 M,C 45 M, 15 M, 10 195 90 NS 0 NS 0 0 3+

C C BL802 0VK8 A9 TCC G1 0 0 NA 5 M, 15 M, 80 25 20 NS 0 NS 0 0 NS 340/362

C C BL802 0VK8 A1O TCC G2 0 80 M,C 10 M, 10 M, 0 270 100 NS 0 NS 0 0 3+

C C BL802 0VK8 Bl TCC G2 0 95 M,C 5 M, 0 NA 0 295 100 NS 0 NS 0 0 3+

C BL802 0VK8 B2 TCC G2 0 5 M,C 45 M, 30 M, 20 135 80 NS 0 NS 0 0 0

C C BL802 0VK8 B3 TCC G2 0 60 M,C 20 M, 10 M, 10 230 90 NS 0 NS 0 0 3+

C C BL802 0VK8 B4 TCC G2 0 30 M,C 45 M, 15 M, 10 195 90 NS 0 NS 0 0 3+

C C BL802 0VK8 B5 TCC G3 0 70 M,C 15 M, 5 M, 10 245 90 NS 0 NS 0 0 3+

C C BL802 0VK8 B6 TCC G2 0 20 M,C 50 M, 20 M, 10 180 90 NS 0 NS 0 0 2+

C C BL802 0VK8 B7 TCC G3 0 30 M,C 10 M, 45 M, 15 155 85 NS 0 0 0 0 3+

C C

BL802 0VK8 B8 TCC G3 0 80 M,C 20 M, 0 NA 0 280 100 NS 0 NS 0 0 NS Núcleo C parcial BL802 0VK8 B9 TCC G1 0 20 M,C 40 M, 20 M, 20 160 80 NS 0 0 0 0 NS

C C BL802 0VK8 B10 TCC G2 0 20 M,C 30 M, 20 M, 30 140 700 NS 0 0 0 0 2+ (escaso) C C BL802 0VK8 C1 TCC G1 0 90 M,C 10 M, 0 NA 0 290 100 NS 0 NS 0 0 3+

C BL802 0VK8 C2 TCC G2 0 15 M,C 65 M, 15 M, 5 190 95 NS 0 NS 0 0 2+

C C BL802 0VK8 TCC G2 C3 0 600 M,C 20 M, 10 M, 10 230 90 NS 0 NS 0 0 3+ (escaso) C C G1

DISTINTAS 341/362 Nº de ID de Localizaçã Grau e Control % e Localização Subcelular de Pontuaçã % de Norma Endotel Muscul Fitroblast Estrom Célula Comentário adesã execuçã o de TMA Diagnóstic e de Manchamento de Células em oH Nectin l oi o Liso o a s s o o o de isotipo Cadda Intensidade a inflam Bexiga BL802 0VK8 C4 TCC G2- 0 40 C 10 C 0 NA 50 140 50 NS 0 NS 0 0 3+ G3 BL802 0VK8 C5 TCC G3 0 30 M,C 20 M, 20 M, 30 150 70 NS 0 NS 0 0 2+

C C BL802 0VK8 C6 TCC G2 0 0 M,C 40 M, 40 M, 20 120 80 NS 0 NS 0 0 3+

C C BL802 0VK8 C7 TCC G3 0 80 M,C 20 M, 0 NA 0 280 100 NS 0 NS 0 0 0

C BL802 0VK8 C8 TCC G3 0 2 M,C 2 M, 0 NA 96 10 4 NS 0 0 0 0 3+

C BL802 0VK8 C9 TCC G 0 65 M,C 20 M, 15 C 0 250 100 NS 0 0 0 0 3+ 3 C BL802 0VK8 C10 TCC G2 0 5 M,C 60 M, 10 M, 25 145 75 2+ 0 0 0 0 0

C C BL802 0VK8 D1 TCC G2 0 25 M,C 55 M, 20 C 0 205 100 NS 0 NS 0 0 3+

C

BL802 0VK8 D2 TCC G2 0 50 M,C 10 M, 10 C 30 180 70 NS 0 0 0 0 2+

C BL802 0VK8 D3 TCC G3 0 35 M,C 45 M, 15 C 5 210 95 NS 0 0 0 0 2+

C BL802 0VK8 D4 TCC G2 0 30 M,C 60 M, 10 C 0 220 100 NS 0 NS 0 0 2+

C BL802 0VK8 D5 TCC G3 0 40 C 50 C 5 C 5 225 95 NS 0 2+ 0 0 2+F Células M+ raras BL802 0VK8 D6 TCC G3 0 80 M,C 10 M, 5 C 5 265 95 NS 0 2+ 0 0 2+

C BL802 0VK8 D7 TCC G1- 0 55 C 40 C 3 C 2 248 98 NS 0 NS 0 0 2+ G2 342/362 BL802 0VK8 D8 TCC G2 0 25 M,C 45 M, 15 M, 15 180 85 NS 0 2+ 0 0 3+

C C BL802 0VK8 D9 TCC G2 0 0 NA 20 C 30 C 50 70 50 NS 0 NS 0 0 0 BL802 0VK8 D10 TCC G3 0 40 M,C 40 M, 20 C 0 220 100 NS 0 NS 0 0 2+ Tecido C adiposo de estroma BL802 0VK8 E1 TCC G2 0 90 M,C 10 M, 0 NA 0 290 100 NS 0 NS 0 0 2+

C BL802 0VK8 E2 TCC G2 0 70 C 15 C 10 C 5 250 95 NS 0 NS 0 0 3+

DISTINTAS Nº de ID de Localizaçã Grau e Control % e Localização Subcelular de Pontuaçã % de Norma Endotel Muscul Fitroblast Estrom Célula Comentário adesã execuçã o de TMA Diagnóstic e de Manchamento de Células em oH Nectin l oi o Liso o a s s o o o de isotipo Cadda Intensidade a inflam BL802 0VK8 E3 Bexiga TCC G2 0 25 M,C 50 C 20 C 5 195 95 NS 0 1+ 0 0 2+ BL802 0VK8 E4 TCC G2 0 100 M,C 0 NA 0 NA 0 300 100 NS 0 3+ 0 0 3+

BL802 0VK8 E5 TCC G2 0 70 M,C 10 M, 5 M, 15 235 85 NS 0 NS 0 0 2+

C C BL802 0VK8 E6 TCC G2 0 80 M,C 20 M, 0 NA 0 280 100 NS 0 NS 0 0 0

C BL802 0VK8 E7 TCC G3 0 65 M,C 20 M, 5 M, 10 240 90 NS 0 0 0 0 0

C C BL802 0VK8 E8 TCC G2 0 30 M,C 50 M, 15 C 5 205 95 NS 0 NS 0 0 0

C BL802 0VK8 E9 TCC G2 0 75 M,C 20 M, 5 C 0 270 100 NS 0 NS 0 0 0

C BL802 0VK8 E10 TCC G2 0 2 M,C 18 M, 30 M, 50 72 50 NS 0 NS 0 0 0

C C 343/362 BL802 0VK8 F1 TCC G2 0 100 C 0 NA 0 NA 0 300 100 NS 0 NS 0 0 0 BL802 0VK8 F2 TCC G2- 0 80 M,C 20 M, 0 NA 0 280 100 NS 0 NS 0 0 3+ G23 C BL802 0VK8 F3 TCC G3 0 10 C 85 C 3 C 2 203 98 NS 0 1+ 0 0 2+ BL802 0VK8 F4 TCC G3 0 50 C 30 C 18 C 2 228 98 NS 0 NS 0 0 2+ BL802 0VK8 F5 TCC G3 0 40 M,C 40 C 20 C 0 220 100 NS 0 NS 0 0 2+ BL802 0VK8 F6 TCC* 0 20 C 10 C 10 C 60 90 40 NS 0 NS 0 0 0 BL802 0VK8 F7 TCC G3 0 0 NA 0 NA 0 NA 10 0 0 NS 0 NS 0 0 0 0 BL802 0VK8 F8 AdenoCa 0 0 NA 3 NA 0 NA 97 6 3 NS 0 NS 0 0 0 G2 BL802 0VK8 F9 AdenoCa 0 0 NA 3 M, 2 M, 90 15 10 NS 0 0 0 0 0 (SM&BU) C C BL802 0VK8 F10 TCC 0 95 C 5 NA 0 NA 0 295 100 3+ 0 NS 0 0 2+

INFORMAÇÕES ESPÉCIME PADRÃO MANCHAMENTO DE ARTIGO DE TESTE MANCHAMENTO DE ARTIGO DE TESTE DE OUTROS TIPOS DE CÉLULAS

DE CÉLULAS DISTINTAS Nº de ID de Localiza Grau e Control % e Localização Subcelular de Pontua % de Endote Muscul Fitrobla Estro Células Comen Pontuação H adesão execuç ção de Diagnóstico de e de Manchamento de Células em Cadda ção H Nectin loi o Liso sto ma inflam tários ão TMA Bexiga isotipo Intensidade a 3+% 3+sub 2+% 2+ 1+% 1+- 0% BL802 0VK8 G1 NAT 0 0 NA 1 c 30 c 60 50 40 NA 0 0 0 0 0 10 BL802 0VK8 G2 NAT 0 40 M,C 30 M,C 10 c 20 190 80 NA 0 0 0 0 0 BL802 0VK8 G3 NAT 0 0 NA 0 NA 0 NA 100 0 0 NA 0 NS 0 0 0 BL802 0VK8 G4 NAT (SM & BV) 0 15 C 30 C 45 C 10 150 90 NA 0 0 0 0 0 344/362 BL802 0VK8 G5 NAT (inflamação 0 80 M,C 20 M,C 0 NA 0 280 100 NA 0 0 0 0 0 crônica de BL802 0VK8 G6 NAT (inflamação 0 25 M,C 15 M,C 40 C 20 145 80 NA 0 0 0 0 0 crônica de BL802 0VK8 G7 NAT 0 30 M,C 60 M,C 10 M,C 0 220 100 NA 0 0 0 0 0 BL802 0VK8 G8 NAT 0 20 M,C 20 M,C 30 M,C 30 130 70 NA 0 0 0 0 0 BL802 0VK8 G9 NAT 0 60 M,C 20 M,C 15 C 5 235 95 NA 0 0 0 0 0 BL802 0VK8 GIO NAT (tecido 0 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA Nenhum urotélio fibroso e vaso presente BL802 0VK8 Hl NAT (Escasso) 0 0 NA 15 M,C 15 C 70 45 30 NA 0 0 0 0 0 Calcificação Normal observada BL802 0VK8 H2 NAT (SM & BV) 0 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA Tecido rompitdo Normal BL802 0VK8 H3 NAT (Escasso) 0 0 NA 70 M,C 30 C 0 170 100 NA 0 0 0 0 0 Normal BL802 0VK8 H4 NAT (SM & BV) 0 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA Tecido rompido Normal BL802 0VK8 H5 NAT (SM & BV) 0 0 NA 80 M,C 15 M,C 5 175 95 NA 0 0 0 0 0 Normal BL802 0VK8 H6 NAT (Escasso) 0 0 NA 0 NA 10 C 90 10 10 NA 0 0 0 0 0 Urotélio escasso Normal

BL802 0VK8 H7 NAT Normal 0 0 NA 25 M,C 15 c 60 65 40 NA 0 0 0 0 0 Camda Basal Negativa BL802 0VK8 H8 NAT Normal 0 70 M,C 20 M,C 0 NA 10 250 90 NA 0 0 0 0 0 BL802 0VK8 H9 NAT Normal 0 0 NA 0 NA 40 C 60 40 40 NA 0 0 0 0 0

DE CÉLULAS DISTINTAS Nº de ID de Localiza Grau e Control % e Localização Subcelular de Pontua % de Normal Endotel Muscul Fitrobl Estrom Células Comentários adesão execuç ção de Diagnóstico de e de Manchamento de Células em Cadda ção H Nectin oi o Liso asto a inflam ão TMA Bexiga isotipo Intensidade a

TECIDO BL802 0VK8 H10 NAT Normal 0 0 NA 0 NA 30 M,C 70 30 30 NA 0 0 0 0 0 Urotélio escasso presente 345/362 COMENTÁRIO/OBSERVAÇÃO GERAL: NA = Não Aplicável Occ= Ocasional N= Normal F= Focalmente Positivo G = Grade NS = Não Observado Sc = Disperso C = Manchamento Citoplásmico TCC = Carcinoma de Célula Transicional Ca = Carcinoma BLA = Bexiga M = Manchamento de Membrana SM = Músculo Liso * = Inflamação crônica de tecido e vaso sanguíneo BV = Vaso Sanguíneo NAT = Adjacenete Normal a Tumor

[0646] A especificidade e a sensibilidade de M22-321b41.1 foram adicionalmente determinadas a partir de todos os 33 espécimes humanos normais contidos em triplicatas no FDA999d. Como mostrado na Tabela 21, o manchamento de IHC com o anticorpo anti-Nectina-4 M22-321b41.1 foi consistente com a expressão de Nectina-4 em células normais reportadas na literatura (Rabet et al.,

2016.) exceto pelo fato de que o seio normal mostrou imunorreatividade parcial e fraca a moderada. As hemácias manchadas por Nectina-4 em uma intensidade moderada a forte. O epitélio escamoso manchado fortemente enquanto a camada basal foi negativa.

Tabela 21. Especificidade de Anticorpo M22-321b41.1 Anti-Nectina4 em Manchamento de IHC de Tecidos Diferentes

INFORMAÇÕES DE ESPÉCIME GERAL MANCHAMENTO DE ARTIGO DE TESTE MANCHAMENTO DE ARTIGO DE TESTE DE

DE CÉLULAS DISTINTAS OUTROS TIPOS DE CÉLULAS Nº de ID de Localizaç Linhagem Localizaç Pontuaçã % de Endotel Muscul Fitroblast Estrom Célula Comentário adesão execuçã ão de cellular/Teci ão de oH Nectin oi o Liso o a s s o TMA do isotipo a inflam 3+ 3+SU 2+ 2+SU 1+ 1+SU 0% % B % B % B

TECIDO FDA999 0VK5 Al Cérebro (N) 0 i NA 0 1 i NA 10 0 0 0 NA NS 0 NS d 0 1 NA 0 0 347/362 FDA999 0VK5 A2 Cérebro (N) 0 0 NA 0 1 NA 0 NA 10 0 0 0 NA NS 0 NS d 1 0 FDA999 0VK5 A3 Cérebro (N) 0 0 NA 0 1 NA 0 NA 10 0 0 0 NA NS 0 NS d 0 FDA999 0VK5 A4 Cérebro (N) 0 0 NA 0 | NA 0 NA 10 0 0 0 NA NS 0 NS d 0 FDA999 0VK5 A5 Cérebro (N) 0 0 NA 0 | NA 0 NA 10 0 0 0 NA NS 0 NS d 0 FDA999 0VK5 A6 Cérebro (N) 0 0 NA 0 i NA 0 NA 10 0 0 0 NA NS 0 NS d 0 FDA999 0VK5 A7 Cerebelo 0 0 NA 0 1 NA 0 NA 10 0 0 0 NA NS 0 NS d (N) 1 0 FDA999 0VK5 A8 Cerebelo 0 0 NA 0 | NA 0 NA 10 0 0 0 NA NS 0 NS d (N) 0 FDA999 0VK5 A9 Cerebelo 0 0 NA 0 | NA 0 NA 10 0 0 0 NA NS 0 NS d (N) 1 0 FDA999 0VK5 Bl Adrenal (N) 0 0 NA 0 1 NA 0 NA 10 0 0 0 NA 0 0 NS d 1 0 FDA999 0VK5 B2 Adrenal (N) 0 0 NA 0 | NA 0 NA 10 0 0 0 NA 0 0 NS d 0

FDA999 0VK5 B3 Adrenal (N) 0 0 NA 0 1 NA 0 NA 10 0 0 0 NA 0 0 NS Pigmento d 1 0 endógeno presente FDA999 0VK5 B4 Ovário (N) 0 0 NA 0 | NA 0 NA 10 0 0 0 NA 0 0 NS d FDA999 0VK5 B5 Ovário (N) 0 0 NA 0 1 NA 0 NA 0 10 0 0 0 NA 0 0 NS d FDA999 0VK5 B6 Ovário (N) 0 0 NA 0 1 | NA 0 NA 0 10 0 0 0 NA 0 0 NS d FDA999 0VK5 B7 Pâncreas 0 0 NA 0 1 NA 0 NA 0 10 0 0 0 NA 0 0 NS d (N) 0 FDA999 0VK5 B8 Pâncreas 0 0 NA 0 1 NA 0 NA 10 0 0 0 NA 0 0 NS d (N) 0 FDA999 0VK5 B9 Pâncreas 0 0 NA 0 | NA 0 NA 10 0 0 0 NA 0 0 NS Células occ d (N) 0 2+ de artigo 348/362 de FDA999 0VK5 Cl Paratireoide 0 0 NA 0 1 NA 0 NA 10 0 0 0 NA 0 0 NS d (NAT) 1 0 FDA999 0VK5 C2 Paratireoide 0 0 NA 0 | NA 0 NA 10 0 0 0 NA 0 0 NS d (NAT) 0 FDA999 0VK5 C3 Paratireoide 0 0 NA 0 | NA 0 NA 10 0 0 0 NA 0 0 NS d (NAT) 1 J 1 0

INFORMAÇÕES DE ESPÉCIME GERAL MANCHAMENTO DE ARTIGO DE TESTE DE MANCHAMENTO DE ARTIGO DE TESTE DE OUTROS

CÉLULAS DISTINTAS TIPOS DE CÉLULAS Nº de adesão ID de Localização Linhagem Localização Pontuação % de Endotelio Musculo Fitroblasto Estroma Células cellular/Tecido 3+% 3+SUB 2+% 2+SUB 1+% 1+SUB 0% H Nectina Liso Cetls inflam

TECIDO FDA999d 0VK5 C4 Hipófise (N) 0 0 NA 0 1 NA 0 1 NA 100 0 0 0 NA 0 0 NS 0 1 I FDA999d 0VK5 C5 Hipófise (NAT) 0 NA 0 1 NA 0 | NA 100 0 0 0 NA 0 0 NS FDA999d 0VK5 C6 Hipófise (N) 0 0 NA 0 | NA 0 | NA 100 0 0 0 NA 0 0 NS RBC’s2+ FDA999d 0VK5 C7 Testículos (N) 0 0 NA 0 1 NA 0 1 NA 100 0 0 0 NA 0 0 NS 1 i

FDA999d 0VK5 C8 Testículos (N) 0 0 NA 0 | NA 0 | NA 100 0 0 0 NA 0 0 NS FDA999d 0VK5 C9 Testículos (N) 0 0 NA 0 1 NA 0 1 NA 100 0 0 0 NA 0 0 NS Células 1 interotical de OCC FDA999d 0VK5 DI Tireoide (N) 0 0 NA 0 1 NA 0 1 NA 100 0 0 0 NA 0 0 NS 2+

FDA999d 0VK5 D2 Tireoide (N) 0 0 NA 0 | NA 0 | NA 100 0 0 0 NA 0 0 NS FDA999d 0VK5 D3 Tireoide (N) 0 0 NA 0 1 NA 0 l NA 100 0 0 0 NA 0 0 NS Estroma 1 1 2+F colóide 2+ FDA999d 0VK5 D4 Seio (NAT) 0 0 NA 20 |M,C 30 1 50 70 50 0 NS 0 0-1 + 0 1C FDA999d 0VK5 D5 Seio (NAT) 0 0 NA 15 25 1c 60 55 40 0 NS 0 0 0 M,C i

349/362 FDA999d 0VK5 D6 Seio (NAT) 0 10 M 25 | M,C 25 | M,C 40 105 60 0 NS 0 0 0 FDA999d 0VK5 D7 Baço (N) 0 0 M 0 |M,C 0 | NA 100 0 0 0 NS 0 0 0 FDA999d 0VK5 D8 Baço (N) 0 0 NA 0 1 NA 0 1 NA 100 0 0 0 NS 0 1-2+ 0 1 1 FDA999d 0VK5 D9 Baço (N) 0 0 NA 0 | NA 0 | NA 100 0 0 0 NS 0 1-2+ 0 FDA999d 0VK5 El Amigdala (N) 0 0 NA 0 1 NA 0 1 NA 100 0 0 0 NA 0 0 0 RBC’s 3+ i 1 0 FDA999d 0VK5 E2 Amigdala (N) 0 NA 0 1 NA 0 1 NA 100 0 0 0 NS 0 0 0 FDA999d 0VK5 E3 Amigdala (N) 0 0 NA 0 | NA 0 | NA 100 0 0 0 NS 0 0-1+F 0 FDA999d 0VK5 E4 Timo (N) 0 0 NA 0 1 NA 0 1 NA 100 0 0 0 NS 0 0 0 1 1 FDA999d 0VK5 E5 Timo (N) 0 0 NA 0 | NA 0 | NA 100 0 0 0 NS 0 0 0

FDA999d 0VK5 E6 Timo (N) 0 0 NA 0 1 NA 0 l NA 100 0 0 0 NS 0 0 0 1 1 FDA999d 0VK5 E7 Medula Espinhal 0 0 NA 0 | NA 0 I NA 100 0 0 0 NS 0 0 0 (N)

FDA999d 0VK5 E8 Medula Espinhal 0 0 NA 0 | NA 0 | NA 100 0 0 0 NS 0 0 0 (N) FDA999d 0VK5 E9 Medula Espinhal 0 25 c 5 1C 0 1 NA 70 85 30 0 NS 0 0 0 (N) 1 1

MANCHAMENTO DE ARTIGO DE TESTE DE MANCHAMENTO DE ARTIGO DE TESTE DE OUTROS TIPOS DE

INFORMAÇÕES DE ESPÉCIME GERAL CÉLULAS DISTINTAS CÉLULAS ID de Localização Localização de isotipo Pontuação % de Musculo Fitroblasto Células inflam Nº de ecução de TMA Linhagem 3+% 3+SUB 2+% 2+SUB 1+SUB 0% H Nectina Liso Estroma adesão cellular/Tecido 1+% execução de TMA Endotelio

TECIDO FDA999d 0VK5 Fl Pulmão(N) 0 0 NA 10 IM,C 20 IM,C 70 40 30 0 0 0 0 0 Epitélio Bronquial 1 I Pontuado 350/362 FDA999d 0VK5 F2 Pulmão(N) 0 0 NA 0 1 NA 0 100 0 0 0 0 0 0 0 | NA FDA999d 0VK5 F3 Pulmão(N) 0 0 NA 0 | NA 0 | NA 100 0 0 0 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 F4 Músculo NA 1 NA I NA NS NS NS Cardíaco (N) 0 0 0 1 0 i 100 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 F5 Músculo 0 0 NA 0 | NA 0 | NA 100 0 0 0 NS NS 0 NS Cardíaco (N) FDA999d 0VK5 F6 Músculo NA 1 NA l NA NS NS NS Cardíaco (N) 0 0 0 1 0 100 0 0 0 0 1 1 Camada Basal Neg: FDA999d 0VK5 F7 Esôfago(N) 0 70 M,C 10 |M,C 0 | NA 20 230 80 0 2+ 0 0 2+ RBC’s = 1 1 3+ FDA999d 0VK5 F8 Esôfago(N) 0 o NA 0 | NA 0 | NA 100 0 0 0 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 F9 Esôfago(N) 0 30 M,C 30 IM,C 10 IM,C 30 160 70 0 3+ 0 0 3+ Camda Basal Neg 1 i FDA999d 0VK5 G1 Estômago (N) 0 0 NA 0 1 NA 0 100 0 0 0 0 0 0 0 | NA FDA999d 0VK5 G2 Estômago (N) 0 0 NA 0 | NA 0 | NA 100 0 0 0 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 G3 Estômago (N) 0 0 NA 0 1 NA 0 I NA 100 0 0 0 0 0 0 0 1 i FDA999d 0VK5 G4 Intestino 0 0 NA 0 | NA 0 | NA 100 0 0 0 0 0 0 0 Delgado (N) FDA999d 0VK5 G5 Intestino 0 NA NA NA 1 NA NA 1 NA NA NA NA NA NA NA NA NA Nenhum epitélop Delgado (N) 1 observado FDA999d 0VK5 G6 Intestino 0 NA 1 NA 1 NA Delgado (N) 0 0 0 100 0 0 0 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 G7 Cólon (NAT) 0 o NA 0 | NA 0 | NA 100 0 0 0 0 0 0 2+

FDA999d 0VK5 G8 Cólon (NAT) 0 NA 1 NA l NA 0 0 1 0 1 100 0 0 0 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 G9 Cólon (NAT) 0 0 NA 0 | NA 0 | NA 100 0 0 0 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 Hl Fígado (N) NA 1 NA I NA 0 0 0 1 0 i 100 0 0 0 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 H2 Fígado (N) 0 0 NA 0 | NA 0 | NA 100 0 0 0 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 H3 Fígado (N) 0 0 NA 0 | NA 0 | NA 100 0 0 0 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 H4 Glândula 0 0 NA 15 'C 10 ic 75 40 25 0 NS 0 0 0 Mostly ductal cells salivar (N) 1 1 staining FDA999d 0VK5 H5 Glândula 0 0 NA 0 | NA 10 1 90 10 10 0 NS 0 0 2+ salivar (N) ic

INFORMAÇÕES DE ESPÉCIME GERAL CÉLULAS DISTINTAS CÉLULAS ID de Localização Linhagem Pontuação % de Musculo Fitroblasto Células inflam 351/362 Nº de adesão Localização Estroma ecução de TMA cellular/Tecido de isotipo 3+% 3+SUB 2+% 2+SUB 1+% 1+SUB 0% H Nectina Endotelio Liso

TECIDO 1 1 0 Células serosas + FDA999d 0VK5 H6 Glândula salivar (N) 0 10 1 c 10 iC NA 80 50 20 0 NS 0 0 0 manchamento de células c 1 1c ductais Manchamento de túbluo FDA999d 0VK5 H7 Rim (N) 0 0 1 NA 5 0 NA 95 10 5 0 NS NS 0 NS i 1c proximal FDA999d 0VK5 H8 Rim (N) 0 0 | NA 0 | NA 0 NA 100 0 0 0 NS NS 0 0 FDA999d 0VK5 H9 Rim (N) 1 NA 1 NA NA NS NS 0 0 0 1 0 100 0 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 II Próstata (N) 1 NA 1 30 C 0 0 10 1c 60 50 40 0 3+ 0 0 0 FDA999d 0VK5 12 Próstata (N) 0 0 | NA 0 I NA 0 NA 100 0 0 0 2+ 0 0 0 FDA999d 0VK5 13 Próstata (N) 1 NA 1c C 70 40 30 3+ 0 0 10 i 20 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 14 Endométrio (N) 0 20 | M,C 20 I o NA 60 100 40 0 0 0 0 NS |M FDA999d 0VK5 15 Endométrio (N) 1 NA 1 NA NA NS 0 0 1 0 1 0 100 0 0 0 0 0 0 1 NA 1M Majoritariamente FDA999d 0VK5 Endométrio (N) M 40 NS machamento apical 16 0 0 20 20 60 60 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 17 Colo uterino (NAT) 0 0 | NA 20 |M 10 M 70 50 30 0 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 18 Colo uterino (NAT) 70 1 M,C 1 M,C 0 NA 0 i 20 10 250 90 0 0 0 0 0 Basal citoplasmático 3+

1 1 Basal ectocérvico não FDA999d 0VK5 19 Colo uterino (NAT) 0 45 IM,C 5 iM,C 5 C 45 150 55 0 0 0 0 0 machado Músculo Esquelético i 1 FDA999d 0VK5 JI 0 0 | NA 0 I NA 0 NA 100 0 0 0 0 0 0 NS (N) FDA999d 0VK5 J2 Músculo Esquelético 1 NA 1 NA NA NS (N) 0 0 0 i 100 0 0 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 J3 Músculo Esquelético | NA | NA NA NS (N) 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 J4 Pele (N) 1 NA 1 NA NA Pele pigmentada 0 0 1 0 1 0 100 0 0 0 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 J5 Pele (N) IM,C ! M,C NA 0 80 10 0 10 260 90 0 0 0 0 0 Camada Basal Negativa FDA999d 0VK5 J6 Pele (N) 0 70 |M,C 20 |M,C 0 NA 10 250 90 0 0 0 0 3+ FDA999d 0VK5 J7 Peripheral Nerve (N) 0 1 NA 1 NA NA NS 0 i 0 1 0 100 0 0 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 J8 Peripheral Nerve (N) 0 0 | NA 0 | NA 0 NA 100 0 0 0 0 0 0 NS FDA999d 0VK5 J9 Peripheral Nerve (N) 0 1 NA 1 NA NA NS OccIC =2+ 0 1 0 1 0 100 0 0 0 0 0 0 352/362 FDA999d 0VK5 KI Mesotélio (N) 0 0 1 NA 0 1 NA 0 NA 100 0 0 0 NS 0 0 0

INFORMAÇÕES DE ESPÉCIME GERAL CÉLULAS DISTINTAS CÉLULAS ID de Localização Linhagem Localização Pontuação % de Musculo Fitroblasto Células inflam Nº de adesão Estroma ecução de TMA cellular/Tecido de isotipo 3+% 3+SUB 2+% 2+SUB 1+% 1+SUB 0% H Nectina Endotelio Liso

TECIDO FDA999d 0VK5 K2 Mesotélio (N) 0 1 NA 0 1 NA 0 1 NA NS 0 I 1 I 100 0 0 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 K3 Mesotélio (N) 0 0 1 NA 0 1 NA 100 0 0 0 NS 0 0 0 0 | NA FDA999d 0VK5 K4 Olho(NAT) 0 | NA 0 | NA 0 | NA NS 0 1 100 0 0 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 K5 Olho(NAT) 0 0 1 NA 0 1 NA 0 I NA 100 0 0 0 NS 0 0 0 i I i i i i FDA999d 0VK5 K6 Olho(NAT) 0 I NA 0 I NA 0 I NA NS 0 100 0 0 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 K7 Laringe (NAT) 0 I NA 5 |M,C 5 |M,C 90 15 0 1 1 10 0 0 0 0 0 FDA999d 0VK5 K8 Laringe (NAT) 0 25 IM,C 15 ■ M,C 0 1 NA 60 105 40 0 0 0 0-1 + 0 Camada Basal Neg.

0 1 NA 0 1 NA 0 1 NA Frqagmento de epitélop FDA999d 0VK5 K9 Laringe (NAT) 0 100 0 0 0 0 0 0 0 i 1 I escasso presente COMENTÁRIO/OBSERVAÇÃO GERAL: NA = Não Aplicável Occ = Ocasional N = Normal F = Focal Positivo NS = Não observado Sc = Dispersado C = Manchamento Citoplásmico NAT = Tecido de câncer adjacente normal IC = Células Inflamatórias M = Manchamento de Membrana

353/362

[0647] Portanto, o ensaio de IHC para expressão da Nectina-4 com base no M22-321b41.1 é sensível e específico para expressão da Nectina-4. O ensaio de IHC com M22-321b41.1 mostrou precisão e reprodutividade excelente.

[0648] EXEMPLO 7: ENSAIOS FUNCIONAIS: IMMUNOBLOTTING

[0649] A propriedade funcional e a especificidade de mAb M22-321b41.1 foram adicionalmente avaliadas em immunoblotting, por exemplo, em Western blotting. Brevemente, os lisados de proteína preparados a partir de várias amostras de mRNA de Nectina-4-positiva e mRNA de Nectina-4-negativo foram individualizadas para SDS-PAGE, transferidas para uma membrana de nitrocelulose e sondadas com M22-321b41.1. O anticorpo GAPDH anti-humano foi usado como um controle de carga para confirmar que quantidades adequadas e iguais de lisado de célula total fossem resolvidas em cada pista de gel no SDS-PAGE. Como mostrado na FIG. 12A, M22-321b1.1 é reconhecido e manchou uma banda específica de ~ 58-60 kDa, consistente com o peso molecular de Nectina-4 humana previsto, em lisados de células de Nectina-4-mRNA-positiva NCI H322M, AG-B1 e Rat1(E) geneticamente modificadas para sobrep-expressar Nectina-4. Produtos de clivagem de Nectina-4 clivagem dimensionados menores foram observados nas amostras de xenoenxerto de AG-B1 bem como na linhagem celular NCIH322M, consistente com derramamento reportado de Nectina-4. (Buchanan et al., 2017.) Nenhuma banda foi detectada em células de mRNA de Nectina-4-negativa MDA-MB- 231 e Rat1(E)-Neo. M22-321b41.1 também não detectou qualquer uma dentre a Nectina-1, Nectina-2 e Nectina-3 sobre-expressadas por células de Rat1(E) geneticamente modificada em Western blotting, apesar de todos os membros da família de Nectina (Nectina 1 a 4) serem altamente expressados nas células de Rat1(E) geneticamente modificadas como mostrado por FACS na FIG. 12B. Portanto, M22-321b41.1 especificamente detectou Nectina-4 em um ensaio de immunoblotting.

[0650] EXEMPLO 8: MAPEAMENTO DE EPÍTOPO

[0651] Para mapear adicionalmente o epítopo na Nectina-4 reconhecida por anticorpo M22-321b41.1, vários fragmentos de Nectina-4 foram clonados, transfectados em células e expressados em células. As células que expressam vários fragmentos de Nectina-4 foram cultivados e lisados em tampão de RIPA. As concentrações protéicas totais dos lisados de RIPA foram quantificadas com o uso de BSA padrão e um total de 20 μg de lisados reduzidos (50 mM de TCEP) foram individualizados para SDS-PAGE em uma pista de gel de BT a 4 a 12% em 1x MES de tampão de excecução, transferido com I-Blot para a membrana de nitrocelulose, bloqueado com tampão de bloqueio de LI-COR, sondado com 2 μg/ml de anticorpo M22-321b41.1 em 1:1 de tampão de bloquei de LI-COR. Uma diluição de 1:10.000 de um anticorpo α-GAPDH (Chicken pAb, Millipore) foi usado para detectar GAPDH como um controle de carga. A ligação de anticorpos às bandas de proteína foi, então, detectada com diluição de 1:5.000 de anticorpo de Cabra-anti-Camundongo conjugado com IRDye 680 (Odyssey) ou 1:5.000 Burro anti-α-Galinha conjugado com IRDye 800 (Odyssey) e visualizado no sistema odyssey. O fragmento de Nectina-4 V reconhecido por anticorpo M22-321b41.1 (resíduos de aminoácidos 1- 150) (Figure 13). Portanto, o anticorpo M22-321b41.1 reconheceu um epítopo localizado em resíduos de aminoácidos 1 a 150 (SEQ ID NO:45) da Nectina-4 humana. Ademais, devido ao anticorpo M22-321b41.1 ter sido gerado contra um fragmento de Nectina-4 de resíduos de aminoácidos 31 a 346 (SEQ ID NO:2) da Nectina-4 humana como mostrado nos Exemplos 1, 2 e 3, o anticorpo M22-321b41.1 pode reconhecer um epítopo localizado em resíduos de aminoácidos 31 a 150 (SEQ ID NO:46) da Nectina-4 humana (a região sobreposta de fragmento 1 a 150 e fragmento 31 a 346).

[0652] EXEMPLO 9: Uso de Diagnóstico e Prognóstico dos ensaios de IHC de Nectina-4

[0653] A expressão da Nectina-4 foi primeiro examinada em amostras de tecido normais com o uso de manchamento de IHC com o anticorpo M22-321b41.1.

Variável, mas majoritariamente fraca ou moderada, a expressão da Nectina-4 foi detectada na pele (epiderme, glândulas salivares e folículos capilares), epitélio transicional de bexiga, glândula salivar (dutos), esôfago, seio e estômago. Para correlacionar a expressão da Nectina-4 com vários cânceres, a expressão da Nectina-4 foi, então, examinada em vários espécimes de tumor com o uso de manchamento de IHC com anticorpo M22-321b41.1. A Nectina-4 foi altamente expressada em câncer de bexiga e foi expressada mais moderada no câncer de micromatriz de tecido de seio, pancreático, pulmonar e de ovário (TMA). O exame da correlação entre a expressão da Nectina-4 e os cânceres de bexiga com o uso do mesmo ensaio de IHC revelou que 83% (434 dentre 524) dos cânceres de bexiga em TMA foram positivos e 60% foram forte ou moderadamente por manchamento de IHC de M22-321b41.1.

[0654] A eficácia da expressão da Nectina-4 em um tecido de paciente como determinada por manchamento de IHC de M22-321b41.1 na previsão da possibilidade de um paciente ser responsivo a uma terapia anticâncer (por exemplo, uma terapia anticâncer com o uso de anti-Nectina-4 conjugado a agentes citotóxicos ou citostáticos), foi, então, avaliada, por exemplo, testando-se a resposta a uma terapia contra câncer em pacientes que cumpre os seguintes critérios: (1) ter tumores sólidos malignos metastáticos histologicamente confirmados (excluir sarcomas) que são resistentes ou recorrentes; (2) ter um tumor positivo que falhou em pelo menos um regime de quimioterapia anterior para doença metastática (não exige-se que indivíduos com câncer urotelial e de bexiga tenham falhado em regime de quimioterapia anterior se considerados inadequados para quimioterapia à base de cisplatina) (Galsky et. al., Journal of Clinical Oncology, volume 29, nº17, 2.432 a

2.438 (2011)); (4) ter progressão de doença documentada se o tratamento sistêmico mais recente foi um fármaco imunoterapêutico investigacional; (5) ter estado de desempenho do Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) de 0 ou 1; (7) que tem doença mensurável de acordo com RECIST (versão 1.1) (Eisenhauer, et. al.

European Journal of Cancer; 45(2): 228-247 (2009)). Um total de 184 espécimes de teste clínico foram examinados quanto a sua expressão da Nectina-4 com o uso de um ensaio de IHC com anticorpo M22-321b41.1; dos 184 espécimes examinados, 180 (98%) dos espécimes de teste clínico tiveram uma Pontuação H maior que 0; e 171 (93%) tiveram expressão moderada a alta da Nectina-4 (Pontuações H≥150). De modo geral, 44 indivíduos clínicos foram compatíveis com os critérios de inclusão. O sítio do tumor e/ou metástase nesses 44 pacientes foi listado na Tabela 22.

Tabela 22. Sítio de Tumor Primário e Metástase Sítio de Tumor Primário Bexiga 28 (63,6) Pelvis Renal 10 (22,7) Ureter 3 (6,8) Bexiga, outra Histologia 2 (4,5) Outro 1 (2,3) Sítio de Metástase Visceral 25 (56,8) Fígado 10 (22,7) Pulmão 20 (45,5)

[0655] Esses 44 pacientes que tiveram expressão moderada a alta da Nectina-4 (Pontuações H≥150) foram administrados com um agente terapêutico anticâncer que compreendem um anticorpo anti-Nectina-4 totalmente humano (IgG1κ) conjugado a monometilauristatin-E de agente de rompimento microtubular.

Todos os indivíduos receberam uma infusão IV por 30 min única da anti-Nectina-4 ADC uma vez por semana por 3 semanas a cada ciclo de 4 semanas (por exemplo, em dias 1, 8 e 15), até a progressão da doença, intolerância a tratamento, decisão de investigador ou remoção consensual. As doses administradas incluíram 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg e 1,25 mg/kg. A resposta de doença nos pacientes foi avaliada por Eisenhauer, et. al. European Journal of Cancer; 45(2): 228 a 247 (2009)). Um total de 36 indivíduos produziu resultados que podem ser avaliados.

[0656] O ADC de anti-Nectina-4 produção de atividade antitumoral nos pacientes tratados que têm tumores que expressam Nectina-4. Dez dentre os 36 pacientes tiveram respostas parciais, uma taxa de resposta de 27,8% (tanto com resposta parcial como completa foram consideradas como uma resposta). O ADC de anti-Nectina-4 também produziu atividade antitumoral em 4 dentre os 10 indivíduos com metástase de fígado (40% de taxa de resposta) e em 3 dentre os 12 pacientes anteriormente tratados com inibidores de ponto de verificação (25% de taxa de resposta).

[0657] Portanto, ADC de anti-Nectina-4 produziu atividade antitumoral no pacientes que têm tumores que expressam Nectina-4.

[0658] EXEMPLO 10: Uso de Diagnóstico e Prognóstico dos ensaios de IHC de Um Coorte Diferente de Nectina-4

[0659] A eficácia da expressão da Nectina-4 em um tecido de paciente como determinada por manchamento de IHC de M22-321b41.1 na previsão da possibilidade de um paciente ser responsivo a uma terapia anticâncer (por exemplo, uma terapia anticâncer com o uso de anti-Nectina-4 conjugado a agentes citotóxicos ou citostáticos), foi, então, avaliada, por exemplo, testando-se a resposta a uma terapia contra câncer em um coorte diferente de pacientes que cumprem os seguintes critérios: (1) ter tumores sólidos malignos metastáticos histologicamente confirmados, incluindo câncer urotelial; (2) ter um tumor positivo para expressão da Nectina-4 e ter uma Pontuação H de IHC de Nectina-4 igual a ou maior que 150; (3) ter falhado em uma ou mais que uma quimioterapia anterior para indivíduos com doença metastática e/ou câncer urotelial que foram inadequados para quimioterapia à base de cisplatina (Galsky et al., Journal of Clinical Oncology, volume 29, nº 17,

2.432 a 2.438 (2011)); (4) que tem progressão da doença documentada para indivíduos tratados com um inibidor de ponto de verificação imune (CPI) imediatamente antes do estudo; (5) ter estado de desempenho de Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) de 0 ou 1; (7) que tem doença mensurável de acordo com RECIST (versão 1.1) (Eisenhauer, et al. European Journal of Cancer; 45(2): 228 a 247 (2009)). Um total de 295 espécimes de teste clínico foram examinados quanto a sua expressão da Nectina-4 com o uso de um ensaio de IHC com anticorpo M22-321b41.1; dos 295 espécimes examinados, 278 (94%) de espécimes de teste clínico tiveram uma Pontuação H igual a ou maior que 1; e 245 (83%) tiveram expressão moderada a alta da Nectina-4 (Pontuações H≥150). De modo geral, 58 indivíduos clínicos compatíveis com os critérios de inclusão. O sítio do tumor e/ou metástase nesses 58 pacientes foi listado na Tabela 23.

Tabela 23. Site de Tumor Primário e Metástase Sítio de Tumor Primário N (%) Bexiga 39 (67,2) Pelvis Renal 14 (24,1) Ureter 4 (6,9) Outro, Rim Direito 1 (1 a 7) Sítio de Metástase N (%) Visceral 34 (58,6) Fígado 16 (27,6) Pulmão 26 (44,8)

[0660] Esses 58 pacientes que têm expressão moderada a alta da Nectina-4 (Pontuações H ≥150) foram administrados com um agente terapêutico anticâncer que compreende um anticorpo anti-Nectina-4 totalmente humano (IgG1κ) conjugado a monometilauristatin-E de agente de rompimento microtubular. Todos os indivíduos receberam uma infusão IV por 30 min única do ADC de anti-Nectina-4 uma vez por semana por 3 semanas a cada ciclo de 4 semanas (por exemplo, nos dias 1, 8 e 15), até a progressão da doença, intolerância a tratamento, decisão de investigador ou remoção consensual. Doses administrada incluem 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg e 1,25 mg/kg. A resposta a doença nos pacientes foi avaliada por investigador por RECIST versão 1.1 uma vez a cada 8 semanas (± 7 dias) (RECIST como descrito em Eisenhauer, et. al. European Journal of Cancer; 45(2): 228 a 247 (2009)). Um total de 49 indivíduos produziram resultados que podem ser avaliados.

[0661] O ADC de anti-Nectina-4 produziu atividade antitumoral nos pacientes tratados que têm tumores que expressam Nectina-4. Um paciente teve uma response completa e 17 pacientes tiveram respostas parciais, resultando em um total 36,7% de taxa de resposta (com resposta tanto parcial quanto completa consideradas como uma response). No grupo de 1,25 mg/kg, o ADC de anti-Nectina- 4 produziu resposta em 10 dentre os 17 pacientes tratados, uma taxa de resposta de 58,8%. O ADC de anti-Nectina-4 também produziu atividade antitumoral em 5 dentre os 12 indivíduos com metástase de fígado (41,7% de taxa de resposta), em 6 dentre os 16 pacientes anteriormente tratados com inibidores de ponto de verificação (37,5% de taxa de resposta) e em 8 dentre 20 pacientes anteriormente com taxanos (40% de taxa de resposta).

[0662] Portanto, o ADC de anti-Nectina-4 produziu atividade antitumoral nos pacientes que têm tumores que expressam Nectina-4.

[0663] EXEMPLO 11: Uso Terapêutico do ADC de Anti-Nectina-4.

[0664] A eficácia de ADC de anti-Nectina-4 fornecida no presente documento no tratamento de pacientes com vários cânceres é avaliada, por exemplo, comparando-se o resultado de pacientes tratados com ADC de anti-Nectina-4 que compreendem um anticorpo M22-321b41.1 humano ou humanizado e pacientes de controle tratados com isotipo de anticorpo como placebo. Brevemente, os pacientes são aleatorizados e atribuídos ao grupo de controle ou ao grupo de tratamento.

Pacientes no grupo de tratamento são injetados com ADC de anti-Nectina-4 em uma faixa de doses, que são determinadas de acordo com a faixa de mg (de anticorpos)

por kg (de peso corporal) doses otimizadas em modelos animais e ou aqueles no Exemplo 9 e 10. A injeção ocorre uma vez ou múltiplas vezes ao longo de um período de tempo. Os resultados nos pacientes tratados são analisados e comparados entre o grupo de tratamento e o grupo de placebo periodicamente.

[0665] O resultado aprimora em pacientes tratados com ADC de anti- Nectina-4 quando comparados com aqueles tratados com placebo. Quando comparado ao tratamento com placebo, o tratamento de ADC de anti-Nectina-4 resulta em taxa de sobrevivência maior em 6 meses, 1 anos, 2 anos, 3 anos ou 5 anos, aumento de duração de sobrevivência, nível reduzido de marcadores de câncer, média reduzida ou tamanho de tumor médio e/ou progressão mais lenta do câncer.

[0666] EXEMPLO 12: Uso de Diagnóstico e Prognóstico Adicionais dos Ensaios de IHC de Nectina-4.

[0667] A eficácia da expressão da Nectina-4 em um tecido de paciente, como determinado por manchamento de IHC de M22-321b41.1 na previsão da possibilidade de um paciente ser responsivo a uma terapia anticâncer (por exemplo, uma terapia anticâncer com o uso de anti-Nectina-4 conjugado a agentes citotóxicos ou citostáticos), é avaliada, por exemplo, correlacionando-se a resposta de pacientes a um terapia contra câncer com a expressão da Nectina-4 nos tecidos cancerosos de paciente determinados a partir de manchamento de IHC com o anticorpo específico para Nectina-4. Brevemente, todos os pacientes são tratados com o mesmo regime de tratamento de câncer e níveis de expressão da Nectina-4 nos tecidos do pacientes que têm câncer são determinados em ensaios de IHC com o uso de anticorpo M22-321b41.1 como descrito no presente documento. Os pacientes são estratificados em dois, três, quatro ou mais grupos de acordo com a expressão da Nectina-4 nos seus tecidos cancerosos. Para expressão 4 em seus tecidos cancerosos, um segundo grupo com expressão moderada, um terceiro grupo com baixa expressão e um quarto grupo com nenhuma expressão. A resposta ao regime de tratamento de câncer, como refletido pelo resultado de paciente, como a massa corporal do pacientes, o tamanho do tumor no pacientes, a taxa de sobrevivência de paciente de 6 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos ou 5 anos ou a duração de sobrevivência dos pacientes em cada grupo estratificado são resumidos e correlacionados à expressão da Nectina-4 dos pacientes em cada grupo. A correlação é realizada com o uso dos valores médios ou medianos de cada grupo para o paciente individual em cada grupo.

[0668] A expressão da Nectina-4 nos tecidos cancerosos de paciente é indicativo de como o paciente responderá a um regime de tratamento de câncer, por exemplo, uma terapia contra câncer com o uso de anti-Nectina-4 conjugado a agentes citotóxicos ou citostáticos (denominado ADC de anti-Nectina-4). Os pacientes com expressão da Nectina-4 mais alta em seus tecidos cancerosos respondem melhor ao regime de tratamento de câncer, têm taxa de sobrevivência superior a 6 meses, 1 anos, 2 anos, 3 anos ou 5 anos e/ou vivem mais que os pacientes com expressão da Nectina-4 mais baixa em seus tecidos cancerosos.

Quanto maior for a expressão da Nectina-4 nos tecidos cancerosos do paciente, mais eficaz será a terapia contra câncer, por exemplo, tratamento de ADC de anti- Nectina-4, é para o paciente.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo CARACTERIZADO pelo fato de que (a) se liga a um epítopo da Nectina-4 humana reconhecido por um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia leve (VL) que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3 e uma região variável de cadeia pesada (VH) que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4; ou (b) compete pela ligação à Nectina-4 humana com um anticorpo que compreende uma VL que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3 e um VH que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da reivindicação 1 CARACTERIZADO pelo fato de que se liga à Nectina-4, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a região de determinação de complementaridade 1 da VL (CDR1), a VL CDR2 e a VL CDR3 que são apresentadas na Tabela 1; e/ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a região de determinação de complementaridade 1 da VH (CDR1), a VH CDR2 e a VH CDR3 que são apresentadas na Tabela 1.

3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende ainda a framework 1 da VL (FR1), a VL FR2, a VL FR3 e a VL FR4 que são apresentadas na Tabela 2; e/ou

(b) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende ainda a framework 1 da VH (FR1), a VH FR2, a VH FR3 e a VH FR4 que são apresentadas na Tabela 2.

4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende: (1) uma VL CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOS:7 e 8; (2) uma VL CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOS:9, 10 e 11; e (3) uma VL CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 12 e 13; e (b) uma região variável de cadeia leve (VH) que compreende: (1) uma VH CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOS:14, 15, 16 e 17; (2) uma VH CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOS:18, 19, 20 e 21; e (3) uma VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOS:22, 23 e 24.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a VL CDR1, a VL CDR2 e a VL CDR3 compreendem as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS:7, 10 e 12, respectivamente e a VH CDR1, a VH CDR2 e a VH CDR3 compreendem as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS:15, 19 e 23, respectivamente, em que as ditas sequências de CDR de VL e VH são determinadas de acordo com a definição de CDR de Kabat.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3.

7. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4.

8. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3; e (b) uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4.

9. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-8, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um Fc de IgG2 de camundongo, uma região Fc de IgG1 humana ou um mutante da mesma.

10. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-8, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região Fc de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:35.

11. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-8, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ainda uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33.

12. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-8, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33; e (b) uma região Fc de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:35.

13. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-8, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5.

14. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-8, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada que compreendem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6.

15. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-8, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5; e (b) uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6.

16. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-15, CARACTERIZADO pelo fato de que, quando ligado à

Nectina-4, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno se liga a pelo menos um dos resíduos 31-346 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, pelo menos um dos resíduos 1-150 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1 ou pelo menos um dos resíduos 31-150 dentro de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1.

17. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-16, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente a uma célula que expressa Nectina-4.

18. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade relativa do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ligada a um controle negativo é aproximadamente 10%, 5%, 1%, 0,5% ou menos da quantidade do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ligada a um controle positivo.

19. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a expressão da Nectina-4 no controle negativo ou positivo é independentemente determinado por um ensaio de qPCR, um ensaio de imunohistoquímica com um segundo anticorpo, um ensaio de immunoblotting com um segundo anticorpo, um ensaio de separação de células ativadas por fluorescência (FACS) com um segundo anticorpo ou um Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA) com um segundo anticorpo.

20. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ligadas às células é determinada por um ensaio de imunohistoquímica, um ensaio de immunoblotting, um ensaio de separação de células ativadas por fluorescência (FACS) ou um Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA).

21. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 17-20, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula compreende uma célula cancerosa de um tecido.

22. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga à dita célula cancerosa em um nível maior que a uma célula de referência.

23. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula de referência compreende uma célula não cancerosa do mesmo tecido.

24. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 17-23, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito tecido compreende um tecido da bexiga, do ureter, da mama, do pulmão, do cólon, do reto, do ovário, da trompa de Falópio, do esôfago, do colo do útero, do endométrio uterino, da pele, da laringe, da medula óssea, da glândula salivar, do rim, da próstata, do cérebro, de medula espinhal, da placenta, da adrenal, do pâncreas, da paratireoide, da hipófise, do testículo, da tireoide, do baço, das amígdalas, do timo, do coração, do estômago, do intestino delgado, do fígado, do músculo esquelético, do nervo periférico, do mesotélio ou do olho.

25. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 17-24, CARACTERIZADO pelo fato de que a especificidade de ligação do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é determinada em um ensaio de imuno-histoquímica.

26. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-25, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não se liga especificamente a um controle negativo da Nectina-4.

27. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-26, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

28. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-27, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado, humano ou quimérico.

29. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo humanizado é um anticorpo desimunizado ou um anticorpo humano compósito.

30. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-29, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um Fab, um Fab’, um F(ab’)2, um Fv, um scFv, um dsFv, um diabody, um triabody, um tetrabody ou um anticorpo multiespecífico formado de fragmentos de anticorpo.

31. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-30, CARACTERIZADO pelo fato de que a glutamina no primeiro resíduo é substituída por um piroglutamato.

32. Polinucleotídeo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende sequências de nucleotídeos que codificam uma VH, uma VL ou tanto uma VH quanto uma VL do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-31.

33. Polinucleotídeo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende sequências de nucleotídeos que codificam uma cadeia pesada, uma cadeia leve ou tanto uma cadeia pesada quanto uma cadeia leve do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-31.

34. Polinucleotídeo da reivindicação 32 ou 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o polinucleotídeo está ligado de forma operacional a um promotor.

35. Vetor CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o polinucleotídeo da reivindicação 32 ou 33.

36. Célula CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 32 a 34.

37. Célula CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o vetor da reivindicação 35.

38. Célula isolada CARACTERIZADA pelo fato de que produz o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-31.

39. Método de produção de um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um epítopo da Nectina-4 humana, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a cultura da célula de qualquer uma das reivindicações 36 a 38 para expressar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

40. Método de produção de um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um epítopo da Nectina-4 humana, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a expressão do polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 32 a 34.

41. Kit CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-

31.

42. Kit para prever a capacidade de resposta de um paciente com câncer a um tratamento anticâncer CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-31, em que é previsto se o dito paciente com câncer é capaz de responder ao tratamento anticâncer se uma célula cancerosa do dito paciente for positiva em relação à expressão da Nectina-4.

43. Kit para prever a capacidade de resposta de um paciente com câncer a um tratamento anticâncer CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-31 para a determinação da expressão da Nectina-4 em uma amostra de tecido do paciente com câncer, em que é previsto se o dito paciente com câncer é capaz de responder ao tratamento anticâncer se o nível de expressão da Nectina-4 na amostra de tecido for maior que um nível de expressão de referência da Nectina-4.

44. Kit de qualquer uma das reivindicações 41-43, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda um sistema de amplificação de sinal.

45. Kit de qualquer uma das reivindicações 41-44, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda um conjunto de amostras de referência.

46. Kit de qualquer uma das reivindicações 41-45, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda um anticorpo de controle.

47. Método para avaliação da expressão da Nectina-4 em uma amostra de tecido de um indivíduo suspeito de ter câncer, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) o contato da dita amostra de tecido com o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-31; (b) a detecção da ligação do dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo à dita amostra de tecido; (c) a determinação da expressão da Nectina-4 na amostra de tecido, em que o nível de expressão da Nectina-4 na amostra de tecido é comparado com um nível de expressão de referência da Nectina-4.

48. Método da reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é um câncer selecionado de um grupo que consiste de câncer endometrial, câncer urotelial, câncer de bexiga, câncer de um ureter, câncer de uma uretra, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, câncer de próstata, câncer de pênis, câncer de ânus, cânceres da vulva, câncer de ovário e outros cânceres de origem epitelial nos quais a Nectina-4 é expressa.

49. Método da reivindicação 47 ou 48, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão de referência da Nectina-4 é o nível de expressão da Nectina-4 nas células não cancerosas do dito indivíduo ou nas células não cancerosas de um segundo indivíduo.

50. Método da reivindicação 47-49, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão de referência da Nectina-4 é o nível de expressão da Nectina-4 em um controle negativo, em que a expressão da Nectina-4 no controle negativo é independentemente determinada por um ensaio de qPCR, um ensaio de imunohistoquímica com um segundo anticorpo, um ensaio de immunoblotting com um segundo anticorpo, um ensaio de separação de células ativadas por fluorescência (FACS) com um segundo anticorpo ou um Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA) com um segundo anticorpo.

51. Método da reivindicação 50, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade relativa do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ligada ao controle negativo é aproximadamente 10%, 5%, 1% ou menos da quantidade do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ligada à célula da amostra que expressa a Nectina-4.

52. Método da reivindicação 47-49, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão de referência da Nectina-4 é o nível de expressão da Nectina-4 em um controle positivo, em que a expressão da Nectina-4 no controle positivo é independentemente determinada por um ensaio de qPCR, um ensaio de imunohistoquímica com um segundo anticorpo, um ensaio de immunoblotting com um segundo anticorpo, um ensaio de separação de células ativadas por fluorescência (FACS) com um segundo anticorpo ou um Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA) com um segundo anticorpo.

53. Método de qualquer uma das reivindicações 47-52, CARACTERIZADO pelo fato de que o tecido compreende um tecido da bexiga, do ureter, da mama, do pulmão, do cólon, do reto, do ovário, da trompa de Falópio, do esôfago, do colo do útero, do endométrio uterino, da pele, da laringe, da medula óssea, da glândula salivar, do rim, da próstata, do cérebro, da medula espinhal, da placenta, da adrenal, do pâncreas, da paratireoide, da hipófise, do testículo, da tireoide, do baço, das amígdalas, do timo, do coração, do estômago, do intestino delgado, do fígado, do músculo esquelético, do nervo periférico, do mesotélio ou do olho.

54. Método de qualquer uma das reivindicações 47-53, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão da Nectina-4 é detectado utilizando uma abordagem de imunohistoquímica (IHC), um ensaio de immunoblotting, um ensaio de separação de células ativadas por fluorescência (FACS) ou um Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA).

55. Método da reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão da Nectina-4 é detectado com um sistema de amplificação de sinal.

56. Método de qualquer uma das reivindicações 47-55, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão da Nectina-4 é determinado utilizando um sistema de categorização, um sistema de classificação, uma proporção da expressão da Nectina-4 para a expressão de pelo menos uma proteína de referência, a porcentagem de células no dito sistema de categorização ou de classificação, uma medida quantitativa do sinal de coloração da Nectina-4 ou um resultado de uma função matemática utilizando um ou mais dos ditos categorização, escore, proporção, porcentagem e medida quantitativa como informação de entrada.

57. Método de qualquer uma das reivindicações 47-56, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão da Nectina-4 é determinado com base em um H-Score da dita expressão da Nectina-4 ou categorização do dito H-Score.

58. Método de qualquer uma das reivindicações 47-57, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma etapa de recuperação do epítopo da Nectina-4 através da recuperação do epítopo induzida por calor (HIER) antes do contato da dita amostra de tecido com o dito anticorpo ou o dito fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

59. Método para avaliação da expressão da Nectina-4 em uma amostra de tecido de um indivíduo suspeito de ter câncer, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) a realização de um ensaio de imunohistoquímica na amostra de tecido com o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-31; (b) a determinação da expressão da Nectina-4 na amostra de tecido.

60. Método da reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão da Nectina-4 na amostra de tecido é comparado com um nível de expressão de referência da Nectina-4.

61. Método da reivindicação 59 ou 60, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é um câncer selecionado de um grupo que consiste de câncer endometrial, câncer urotelial, câncer de bexiga, câncer de um ureter, câncer de uma uretra, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, câncer de próstata, câncer de pênis, câncer de ânus, cânceres da vulva, câncer de ovário e outros cânceres de origem epitelial nos quais a Nectina-4 é expressa.

62. Método de qualquer uma das reivindicações 59-61, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão de referência da Nectina-4 é o nível de expressão da Nectina-4 nas células não cancerosas do dito indivíduo ou nas células não cancerosas de um segundo indivíduo.

63. Método da reivindicação 59-62, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão de referência da Nectina-4 é o nível de expressão da Nectina-4 em um controle negativo, em que a expressão da Nectina-4 no controle negativo é independentemente determinada por um ensaio de qPCR, um ensaio de imunohistoquímica com um segundo anticorpo, um ensaio de immunoblotting com um segundo anticorpo, um ensaio de separação de células ativadas por fluorescência (FACS) com um segundo anticorpo ou um Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA) com um segundo anticorpo.

64. Método da reivindicação 63, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade relativa do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ligada ao controle negativo é aproximadamente 10%, 5%, 1% ou menos da quantidade do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ligada à célula da amostra que expressa a Nectina-4.

65. Método da reivindicação 59-62, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão de referência da Nectina-4 é o nível de expressão da Nectina-4 em um controle positivo CARACTERIZADO pelo fato de que a expressão da Nectina-4 no controle positivo é independentemente determinada por um ensaio de qPCR, um ensaio de imunohistoquímica com um segundo anticorpo, um ensaio de immunoblotting com um segundo anticorpo, um ensaio de separação de células ativadas por fluorescência (FACS) com um segundo anticorpo ou um Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA) com um segundo anticorpo.

66. Método de qualquer uma das reivindicações 59-65, CARACTERIZADO pelo fato de que o tecido compreende um tecido da bexiga, do ureter, da mama, do pulmão, do cólon, do reto, do ovário, da trompa de Falópio, do esôfago, do colo do útero, do endométrio uterino, da pele, da laringe, da medula óssea, glândula salivar, rim, próstata, cérebro, medula espinhal, placenta, adrenal, pâncreas, paratireoide, da hipófise, do testículo, da tireoide, do baço, das amígdalas, do timo, do coração, do estômago, do intestino delgado, do fígado, do músculo esquelético, do nervo periférico, do mesotélio ou do olho.

67. Método da reivindicação 59-66, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão da Nectina-4 é detectado com um sistema de amplificação de sinal.

68. Método de qualquer uma das reivindicações 59-67, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão da Nectina-4 é determinado utilizando um sistema de categorização, um sistema de classificação, uma proporção da expressão da Nectina-4 para a expressão de pelo menos uma proteína de referência, a porcentagem de células no dito sistema de categorização ou de classificação, uma medida quantitativa do sinal de coloração da Nectina-4 ou um resultado de uma função matemática utilizando um ou mais dos ditos categorização, escore, proporção, porcentagem e medida quantitativa como informação de entrada.

69. Método de qualquer uma das reivindicações 59-68, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão da Nectina-4 é determinado com base em um H-Score da dita expressão da Nectina-4 ou categorização do dito H-Score.

70. Método de qualquer uma das reivindicações 59-69, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma etapa de recuperação do epítopo da Nectina-4 através da recuperação do epítopo induzida por calor (HIER) antes da determinação do nível de expressão da Nectina-4.

71. Método para avaliação da capacidade de resposta de um paciente com câncer a um agente terapêutico anticâncer, o dito método baseado na expressão da

Nectina-4 em uma amostra de tecido do dito paciente, CARACTERIZADO pelo fato de que compreend: (a) o contato da dita amostra de tecido com o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-31; (b) a detecção da ligação do dito anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo à dita amostra de tecido; (c) a determinação do nível de expressão da Nectina-4 na amostra de tecido, em que o nível de expressão da Nectina-4 na amostra de tecido é comparado com um nível de expressão de referência da Nectina-4; em que um nível de expressão da Nectina-4 aumentado comparado com a referência é indicativo de capacidade de resposta à dita terapia anticâncer.

72. Método de qualquer uma das reivindicações 71, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente terapêutico anticâncer compreende um anticorpo anti-Nectina-4 ou um conjugado de fármaco e anticorpo de um anticorpo anti-Nectina-4.

73. Método da reivindicação 71 ou 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é um câncer selecionado de um grupo que consiste de câncer endometrial, câncer urotelial, câncer de bexiga, câncer de um ureter, câncer de uma uretra, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, câncer de próstata, câncer de pênis, câncer de ânus, cânceres da vulva, câncer de ovário e outros cânceres de origem epitelial no qual a Nectina-4 é expressa.

74. Método de qualquer uma das reivindicações 71-73, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão de referência da Nectina-4 é o nível de expressão da Nectina-4 nas células não cancerosas do dito indivíduo ou células não cancerosas de um segundo indivíduo.

75. Método da reivindicação 71-74, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão de referência da Nectina-4 é o nível de expressão da Nectina-4 em um controle negativo, em que a expressão da Nectina-4 no controle negativo é independentemente determinada por um ensaio de qPCR, um ensaio de imunohistoquímica com um segundo anticorpo, um ensaio de immunoblotting com um segundo anticorpo, um ensaio de separação de células ativadas por fluorescência (FACS) com um segundo anticorpo ou um Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA) com um segundo anticorpo.

76. Método da reivindicação 75, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade relativa do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ligada ao controle negativo é aproximadamente 10%, 5%, 1% ou menos da quantidade do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ligada à célula da amostra que expressa a Nectina-4.

77. Método da reivindicação 71-74, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão de referência da Nectina-4 é o nível de expressão da Nectina-4 em um controle positivo, em que a expressão da Nectina-4 no controle positivo é independentemente determinada por um ensaio de qPCR, um ensaio de imunohistoquímica com um segundo anticorpo, um ensaio de immunoblotting com um segundo anticorpo, um ensaio de separação de células ativadas por fluorescência (FACS) com um segundo anticorpo ou um Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA) com um segundo anticorpo.

78. Método de qualquer uma das reivindicações 71-77, CARACTERIZADO pelo fato de que o tecido compreende um tecido da bexiga, do ureter, da mama, do pulmão, do cólon, do reto, do ovário, da trompa de Falópio, do esôfago, do colo do útero, do endométrio uterino, da pele, da laringe, da medula óssea, glândula salivar, rim, próstata, cérebro, medula espinhal, placenta, adrenal, pâncreas, paratireoide, da hipófise, do testículo, da tireoide, do baço, das amígdalas, do timo, do coração, do estômago, do intestino delgado, do fígado, do músculo esquelético, do nervo periférico, do mesotélio ou do olho.

79. Método de qualquer uma das reivindicações 71-78, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão da Nectina-4 é detectado utilizando uma abordagem de imunohistoquímica (IHC), um ensaio de immunoblotting, ensaio de separação de células ativadas por fluorescência (FACS) ou Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA).

80. Método da reivindicação 71-79, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão da Nectina-4 é detectado com um sistema de amplificação de sinal.

81. Método de qualquer uma das reivindicações 71-80, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão da Nectina-4 é determinado utilizando um sistema de categorização, um sistema de classificação, uma proporção da expressão da Nectina-4 para a expressão de pelo menos uma proteína de referência, porcentagem de células no dito sistema de categorização ou de classificação, uma medida quantitativa do sinal de coloração da Nectina-4 ou um resultado de uma função matemática utilizando um ou mais dos ditos categorização, escore, proporção, porcentagem e medida quantitativa como informação de entrada.

82. Método de qualquer uma das reivindicações 71-81, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão da Nectina-4 é determinado com base em um H-Score da dita expressão da Nectina-4 ou categorização do dito H-Score.

83. Método de qualquer uma das reivindicações 71-82, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma etapa de recuperação do epítopo da Nectina-4 através da recuperação do epítopo induzida por calor (HIER) antes da determinação do nível de expressão da Nectina-4.

84. Método para avaliação da capacidade de resposta de um paciente com câncer a um agente terapêutico anticâncer, o dito método baseado na expressão da Nectina-4 em uma amostra de tecido do dito paciente, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:

(a) a realização de um ensaio de imunohistoquímica na amostra de tecido com o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1-31; (b) a determinação do nível de expressão da Nectina-4 na amostra de tecido, em que o nível de expressão da Nectina-4 na amostra de tecido é comparado com um nível de expressão de referência da Nectina-4, em que um nível de expressão da Nectina-4 aumentado na amostra de tecido comparado com a referência é indicativo de capacidade de resposta à dita terapia anticâncer.

85. Método de qualquer uma das reivindicações 84, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente terapêutico anticâncer compreende um anticorpo anti-Nectina-4 ou um conjugado de fármaco e anticorpo de um anticorpo anti-Nectina-4.

86. Método da reivindicação 84 ou 85, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é um câncer selecionado de um grupo que consiste de câncer endometrial, câncer urotelial, câncer de bexiga, câncer de um ureter, câncer de uma uretra, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, câncer de próstata, câncer de pênis, câncer de ânus, cânceres da vulva, câncer de ovário e outros cânceres de origem epitelial no qual a Nectina-4 é expressa.

87. Método de qualquer uma das reivindicações 84-86, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão de referência da Nectina-4 é o nível de expressão da Nectina-4 nas células não cancerosas do dito indivíduo ou células não cancerosas de um segundo indivíduo.

88. Método da reivindicação 84-87, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão de referência da Nectina-4 é o nível de expressão da Nectina-4 em um controle negativo, em que a expressão da Nectina-4 no controle negativo é independentemente determinada por um ensaio de qPCR, um ensaio de imunohistoquímica com um segundo anticorpo, um ensaio de immunoblotting com um segundo anticorpo, um ensaio de separação de células ativadas por fluorescência (FACS) com um segundo anticorpo ou um Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA) com um segundo anticorpo.

89. Método da reivindicação 88, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade relativa do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ligada ao controle negativo é aproximadamente 10%, 5%, 1% ou menos da quantidade do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ligada à célula da amostra que expressa a Nectina-4.

90. Método da reivindicação 84-87, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão de referência da Nectina-4 é o nível de expressão da Nectina-4 em um controle positivo, em que a expressão da Nectina-4 no controle positivo é independentemente determinada por um ensaio de qPCR, um ensaio de imunohistoquímica com um segundo anticorpo, um ensaio de immunoblotting com um segundo anticorpo, um ensaio de separação de células ativadas por fluorescência (FACS) com um segundo anticorpo ou um Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA) com um segundo anticorpo.

91. Método de qualquer uma das reivindicações 84-90, CARACTERIZADO pelo fato de que o tecido compreende um tecido da bexiga, do ureter, da mama, do pulmão, do cólon, do reto, do ovário, da trompa de Falópio, do esôfago, do colo do útero, do endométrio uterino, da pele, da laringe, da medula óssea, glândula salivar, rim, próstata, cérebro, medula espinhal, placenta, adrenal, pâncreas, paratireoide, da hipófise, do testículo, da tireoide, do baço, das amígdalas, do timo, do coração, do estômago, do intestino delgado, do fígado, do músculo esquelético, do nervo periférico, do mesotélio ou do olho.

92. Método da reivindicação 84-91, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão da Nectina-4 é detectado com um sistema de amplificação de sinal.

93. Método de qualquer uma das reivindicações 84-92, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão da Nectina-4 é determinado utilizando um sistema de categorização, um sistema de classificação, uma proporção da expressão da Nectina-4 para a expressão de pelo menos uma proteína de referência, porcentagem de células no dito sistema de categorização ou de classificação, uma medida quantitativa do sinal de coloração da Nectina-4 ou um resultado de uma função matemática utilizando um ou mais dos ditos categorização, escore, proporção, porcentagem e medida quantitativa como informação de entrada.

94. Método de qualquer uma das reivindicações 84-93, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão da Nectina-4 é determinado com base em um H-Score da dita expressão da Nectina-4 ou categorização do dito H-Score.

95. Método de qualquer uma das reivindicações 84-94, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma etapa de recuperação do epítopo da Nectina-4 através da recuperação do epítopo induzida por calor (HIER) antes da determinação do nível de expressão da Nectina-4.

96. Método de qualquer uma das reivindicações 47-95, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo humano.