TW201902922A - 粘附分子-4結合蛋白及其使用方法 - Google Patents

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法蘭多 多尼特
楊鵬
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Abstract

本文提供涉及特異性結合至粘附分子-4之抗體的組合物、方法及用途。本文亦提供用於評估樣品或患者中粘附分子-4表現之方法及用於評估癌症患者對抗癌治療劑之反應的方法。

Description

粘附分子-4結合蛋白及其使用方法
本文提供涉及特異性結合至人類粘附分子-4且偵測粘附分子-4表現量之抗體的組合物、方法及用途。
粘附分子-4，亦稱為脊髓灰白質炎病毒受體相關蛋白4 (PVRL4)，為具有約52 kDa大小的單次穿過I型跨膜蛋白，其屬於細胞粘附分子之粘附分子家族。粘附分子經由同嗜性相互作用(其中一個粘附分子-4與另一個粘附分子-4相互作用)與異嗜性相互作用(其中粘附分子-4與粘附分子家族中的另一種蛋白質(諸如粘附分子-1、粘附分子-2或粘附分子-3)相互作用)介導粘附接合點發生Ca2+非依賴性細胞-細胞粘附。(Miyoshi J等人，2007,Am J Nephrol 27:590-604；Takai等人，2003,Cancer Sci 94:655-667；Reymond N.等人，2001,Journal of Biological Chemistry , 276:43205-15)。粘附分子-4之胞外域具有三個Ig樣子域，稱為V、C1及C2。已表明，粘附分子-2中之C1域負責同嗜性相互作用，而大部分粘附分子中之V域促成異嗜性相互作用及細胞-細胞粘附。(Miyoshi J等人，2007,Am J Nephrol 27:590-604；Takai等人，2003,Cancer Sci 94:655-667；Reymond N.等人，2001,Journal of Biological Chemistry , 276:43205- 15)。
粘附分子表現於各種組織中，包括例如造血細胞、神經元、內皮細胞及上皮細胞。(Mendelsohn C等人，1989,Cell 56:855-865；Lopez M等人，1995,Gene (Amst.) 155:261-265；Lopez M等人，1998,Blood 92:4602-4611；Reymond N等人，2000,Gene (Amst.) 255:347-355；Cocchi F.等人，1998,Journal of Virology . 72:9992-10002；Takahashi K.等人，1999,Journal of Cell Biology 145:539-549；Miyoshi J等人，2007,Am J Nephrol 27:590-604；Takai等人，2003,Cancer Sci 94:655-667)。
除藉由同嗜性相互作用或與粘附分子家族中之其他蛋白質之異嗜性相互作用介導細胞-細胞粘附之外，粘附分子可以募集其他細胞粘附分子，諸如鈣黏素，或其他細胞表面受體，諸如促乳素受體。粘附分子藉由募集其他細胞表面受體，亦可充當刺激性共受體且從而具有信號傳導功能。舉例而言，在小鼠乳腺腺體中，粘附分子-4經由其細胞外及跨膜域與促乳素受體發生相互作用且結合至且隔離細胞因子信號傳導抑制因子-1 (SOCS-1)，此通常抑制傑納斯激酶-2 (Janus Kinase-2，JAK2)之激酶活性，藉此增強促乳素誘導JAK2活化及信號傳導。(Maruoka等人，2017,Journal of Biological Chemistry , doi: 10.1074/jbc.M116.769091, jbc.M116.769091, 電子出版先於印刷；Kitayama等人，2016,Journal of Biological Chemistry 291:5817-5831)。粘附分子亦可與鈣黏素協同作用以在初始細胞-細胞粘附期間誘導Rac1活性且接著快速抑制Rac1活性。(Khameeka等人，2011,PLoS ONE 6: e17841)。
迄今為止，尚未成功開發出用於特異性偵測及評估各種生物樣品中之粘附分子-4表現的抗粘附分子-4抗體。因此，需要鑑別出可以特異性偵測及評估生物樣品中之粘附分子-4表現的抗粘附分子-4抗體。
本發明提供結合至粘附分子-4 (例如人類粘附分子-4，SEQ ID NO: 43)的蛋白質，包括結合蛋白，諸如結合至粘附分子-4的抗體。此類結合蛋白，包括抗體，可以結合至粘附分子-4多肽、粘附分子-4片段，及/或粘附分子-4抗原決定基。
在某些實施例中，本發明亦提供特異性結合至表現粘附分子-4之細胞的結合蛋白，包括抗體或其片段。
本文亦提供包含編碼此類抗體之序列的聚核苷酸及載體、包含此類聚核苷酸或載體之細胞(例如宿主細胞)，及包含此類抗體之組合物、試劑及套組。在另一態樣中，本文提供用於調節粘附分子-4活性(例如活化粘附分子-4信號傳導)或粘附分子-4表現量的方法、此類抗粘附分子-4抗體之診斷方法及用途。
在一些實施例中，結合蛋白(例如抗粘附分子-4抗體)包含六個互補決定區(CDR)或少於六個CDR。在其他實施例中，結合蛋白(例如抗粘附分子-4抗體)包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下的CDR：重鏈可變區(VH) CDR1、VH CDR2、VH CDR3、輕鏈可變區(VL) CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3。在某些實施例中，結合蛋白(例如抗粘附分子-4抗體)包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之CDR：單株抗體(稱為M22-321b41.1，如本文所述)之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3，或其人類化變異體。在一些實施例中，結合蛋白(例如抗粘附分子-4抗體)進一步包含支架區或構架區，包括人類免疫球蛋白胺基酸序列或其變異體之VH FR1、VH FR2、VH FR3、VH FR4、VL FR1、VL FR2、VL FR3及/或VL FR4。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含VL，該VL包含如表 1 中所述之抗體M22-321b41.1之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。
在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段包含VH，該VH包含如表1中所述之抗體M22-321b41.1的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3。
在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段包含： (a) VL，該VL包含如表2中所述之抗體M22-321b41.1的VL FR1、VL FR2、VL FR3及VL FR4；及 (b) VH，該VH包含如表 2 中所述之抗體M22-321b41.1的VH FR1、VH FR2、VH FR3及VH FR4。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO: 7、10及12之胺基酸序列，且抗體或其抗原結合片段之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3分別包含SEQ ID NO: 15、19及23之胺基酸序列。
在另一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 3的VL。在一些實施例中，胺基酸序列包含其一或多個保守修飾。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 4的VH。在一些實施例中，胺基酸序列包含其一或多個保守修飾。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含： (a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 3的VL；及(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 4的VH。
在一些實施例中，抗體包含人類IgG1 Fc區。在其他實施例中，抗體包含突變型人類IgG1 Fc區。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 33的輕鏈恆定區。
在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 35的重鏈Fc區。
在又另一個實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 33的輕鏈恆定區；及胺基酸序列為SEQ ID NO: 35的重鏈Fc區。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 5的輕鏈。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基31-346中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基31-150中的至少一者。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基1-150中的至少一者。
在一個實施例中，人類粘附分子-4之抗原決定基不同於粘附分子-4配位體結合位點。
在一個態樣中，本文中提供一種結合至人類粘附分子-4之抗原決定基的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合至表現粘附分子-4的細胞。
在一個實施例中，結合至人類粘附分子-4之抗原決定基的抗體或其抗原結合片段用於評估得自疑似患有癌症之個體之組織樣品中的粘附分子-4表現，包含：(a)使該組織樣品與抗體或其抗原結合片段接觸；(b)偵測抗體或其抗原結合片段對該組織樣品的結合；及(c)測定該組織樣品中之粘附分子-4表現，其中將該組織樣品中之粘附分子-4表現量與粘附分子-4之參考表現量加以比較。
在某些實施例中，該抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗體為人類化抗體、人類抗體或嵌合抗體。在另一個實施例中，人類化抗體為去免疫型抗體或複合人類抗體。在某些實施例中，抗體為人類化抗體。在特定實施例中，抗體為特異性結合人類粘附分子-4的人類化抗體。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段為Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv、scFv、dsFv、雙功能抗體、三功能抗體或四功能抗體。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段為由抗體片段形成的多特異性抗體。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段與藥劑結合。在一個實施例中，藥劑為放射性同位素、金屬螯合劑、酶、螢光化合物、生物發光化合物或化學發光化合物。
本文亦提供包含本文所提供之抗體或其抗原結合片段的組合物。在某些實施例中，組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
本文亦提供包含核苷酸序列的聚核苷酸，該等核苷酸序列編碼本文所提供之抗體的VH、VL，或VH與VL。
在某些實施例中，本發明亦提供包含核苷酸序列的聚核苷酸，該等核苷酸序列編碼本文所提供之抗體的重鏈、輕鏈，或重鏈與輕鏈。
在某些實施例中，聚核苷酸可操作地連接至啟動子。
本文亦提供聚核苷酸群體，其包含：(a)第一聚核苷酸，其包含編碼本文所提供之抗體之VH或重鏈的核苷酸序列；及(b)第二聚核苷酸，其包含編碼本文所提供之抗體之VL或輕鏈的核苷酸序列。在某些實施例中，第一聚核苷酸可操作地連接至第一啟動子，且第二聚核苷酸可操作地連接至第二啟動子。
本文亦提供一種載體，其包含本文所提供之聚核苷酸。
在某些實施例中，本發明亦提供載體群體，包含：(a)第一載體，其包含編碼本文所提供之抗體之VH或重鏈的核苷酸序列，及(b)第二載體，其包含編碼本文所提供之抗體之VL或輕鏈的核苷酸序列。
在某些實施例中，本發明進一步提供載體群體，包含：(a)第一載體，其包含編碼本文所提供之抗體之VH或重鏈、可操作地連接至第一啟動子的核苷酸序列；及(b)第二載體，其包含編碼本文所提供之抗體之VL或輕鏈、可操作地連接至第二啟動子的核苷酸序列。
在某些實施例中，本發明提供包含本文所提供之聚核苷酸或聚核苷酸群體的細胞。
在某些實施例中，本發明亦提供包含本文所提供之載體或載體群體的細胞。
在某些實施例中，本發明進一步提供產生本文所提供之抗體或其抗原結合片段的經分離細胞。
本文亦提供一種細胞群，包含：(a)包含聚核苷酸的第一宿主細胞，該聚核苷酸包含編碼本文所提供之抗體之VH或重鏈的核苷酸序列；及(b)包含聚核苷酸的第二宿主細胞，該聚核苷酸包含編碼本文所提供之抗體之VL或輕鏈的核苷酸序列。
本文中進一步提供一種細胞群，包含：(a)包含聚核苷酸的第一宿主細胞，該聚核苷酸包含編碼本文所提供之抗體之VH或重鏈、可操作地連接至第一啟動子的核苷酸序列；及(b)包含聚核苷酸的第二宿主細胞，該聚核苷酸包含編碼本文所提供之抗體之VL或輕鏈、可操作地連接至第二啟動子的核苷酸序列。
本文亦提供一種套組，其包含本文所提供之抗體或其抗原結合片段。
本文亦提供一種製備抗體或其抗原結合片段的方法，該抗體或其抗原結合片段特異性結合至人類粘附分子-4之抗原決定基。在某些實施例中，該方法包含培養本文所提供之細胞以表現該抗體或其抗原結合片段。在其他實施例中，該方法包含表現本文所提供之聚核苷酸。在一個實施例中，人類粘附分子-4之抗原決定基不同於粘附分子-4配位體結合位點。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2017年6月5日所申請之美國臨時申請案第62/515,454號的優先權，該臨時申請案的全部內容以引用之方式併入本文中。 以電子方式提交之序列表之參考
本申請案以引用的方式併入以ASCII文本格式隨本申請案一起提交之序列表的電腦可讀形式(CRF)，其名稱為14369-208-228_SEQ_LISTING.txt，2018年5月31日建立且具有37,280個位元組大小。
本文提供結合蛋白，諸如結合至粘附分子-4 (包括人類粘附分子-4)的抗體。在一個實施例中，粘附分子-4抗體結合至人類粘附分子-4。在一些實施例中，分析粘附分子-4抗體活體外對粘附分子-4的結合。在其他實施例中，分析粘附分子-4抗體離體對粘附分子-4的結合。在某些實施例中，分析包括免疫組織化學(IHC)分析、螢光活化細胞分選(FACS)分析、ELISA、免疫墨點法(例如西方墨點法、點漬墨法，或細胞內西方墨點法)，及其他免疫分析。
在特定實施例中，本文所提供的結合蛋白，諸如結合至粘附分子-4的抗體，具有彼此競爭結合粘附分子-4的共同特徵。此競爭性抑制可以表明各種抗體結合至粘附分子-4之相同區域(例如相同抗原決定基)，藉此確證類似效應。在某些實施例中，本文所提供之抗粘附分子-4抗體包括人類化抗粘附分子-4抗體，諸如來源於或基於抗體M22-321b41.1的彼等抗體。在其他實施例中，本文所提供之抗粘附分子-4抗體與來源於或基於M22-321b41.1的抗體競爭結合。在一些實施例中，抗粘附分子-4抗體具有如表 1 中所述的CDR序列。在某些實施例中，抗粘附分子-4抗體結合至人類粘附分子-4之特定域(例如胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基31-346、1-150或31-150)。此外，此類結合很大程度上歸因於區域內之特定胺基酸殘基，該區域包含本文所述之抗粘附分子-4抗體所識別的抗原決定基。綜合而言，本文所述之結果證明，針對來源於或基於M22-321b41.1之抗粘附分子-4抗體(包括具有表 1 中所述之一或多個CDR的抗體)所觀測到的效應可以外推至具有相同或相似抗原決定基特異性(例如相同或相似CDR)之本文所述其他抗粘附分子-4抗體。
在本發明的一些實施例中，諸如抗粘附分子-4抗體之結合蛋白可以包含含有如表 1 中所述之一或多個CDR的免疫球蛋白可變區。在此類結合蛋白(例如抗粘附分子-4抗體)中，CDR可以與一或多個支架區或構架區(FR)連接，諸如表2中所述的彼等區域，其使CDR定向，以便達成CDR之適當抗原結合特性。此類結合蛋白，包括如本文所述之抗粘附分子-4抗體，可以在各種分析中結合至粘附分子-4。 7.1 通用技術
本文所述或所提及之技術及程序包括熟習此項技術者使用習知方法已普遍充分瞭解且/或通常使用的彼等技術及程序，諸如以下文獻中所述的廣泛利用方法：Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版，2001); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人編，2003); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed. 2009); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Albitar編，2010)；及Antibody Engineering 第1及2卷(Kontermann及Dübel編，第2版，2010)。 7.2 術語
除非另有描述，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與一般技術者通常所瞭解相同之含義。出於解釋本說明書之目的，將應用以下術語說明且只要適當，則以單數形式使用之術語亦將包括複數形式且反之亦然。所有專利、申請案、公開之申請案及其他公開案均以全文引用之方式併入。在所列術語之任何說明與以引用之方式併入本文中之任何文獻存在衝突之情況下，以下文闡述之術語說明為準。
除非另外指明，否則術語「粘附分子-4」、「粘附分子-4多肽」或「粘附分子-4蛋白」涵蓋來自任何脊椎動物來源的多肽(「多肽」與「蛋白質」在本文中可互換地使用)，包括任何原生多肽，該脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類及食蟹獼猴(cynos))、犬及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，術語包括「相關粘附分子-4多肽」，包括其SNP變異體。術語「粘附分子-4」亦涵蓋未處理的粘附分子-4以及因細胞中處理而產生之任何形式的粘附分子-4。在一些實施例中，粘附分子-4具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1。GenBank™寄存編號NM_030916 (mRNA)、NG_028109 (基因組DNA)、基因ID 81607 (基因)、NP_112178 (前驅體胺基酸序列)提供其他例示性人類粘附分子-4核酸或胺基酸序列。下文提供例示性人類粘附分子-4胺基酸序列：
GenBank™寄存編號NM_030916提供一種例示性人類粘附分子-4核酸序列：
GenBank™寄存編號AF472510、NM_027893、XM_203738、NM_001122680提供例示性小鼠粘附分子-4核酸及胺基酸序列；GenBank™寄存編號XM_005541220及XM_005541223提供例示性猴粘附分子-4核酸及胺基酸序列。
「相關粘附分子-4多肽」包括可以保持粘附分子-4活性的對偶基因變異體(例如SNP變異體)；剪接變異體；片段；衍生物；取代、缺失及插入變異體；融合多肽；及種間同源物。如熟習此項技術者將瞭解，本文所提供之抗粘附分子-4抗體可以結合至粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段、粘附分子-4抗原及/或粘附分子-4抗原決定基。「抗原決定基」可為較大粘附分子-4抗原之一部分，可為較大粘附分子-4多肽片段之一部分，該部分又可為較大粘附分子-4多肽之一部分。粘附分子-4可以原生或變性形式存在。本文所述之粘附分子-4多肽可自多種來源分離，諸如自人類組織類型或自另一來源分離，或藉由重組或合成方法製備。此項技術中亦熟知粘附分子-4多肽之直系同源物。
「粘附分子-4配位體」係指結合粘附分子-4或以其他方式與粘附分子-4相互作用的分子。粘附分子-4可以與另一個粘附分子-4分子發生同嗜性相互作用且與粘附分子家族中之其他蛋白質(諸如粘附分子-1、粘附分子-2及粘附分子-3)發生異嗜性相互作用。粘附分子-4亦可與其他表面粘附分子發生相互作用，諸如鈣黏素及其他細胞表面受體，諸如促乳素受體。粘附分子-4可以進一步與病毒顆粒及病毒顆粒上之病毒蛋白(例如麻疹病毒及脊髓灰白質炎病毒)發生相互作用。因此，粘附分子-4配位體可以包括粘附分子-1、粘附分子-2、粘附分子-3或粘附分子-4，或粘附分子家族蛋白質之任何片段。粘附分子-4配位體亦可包括其他細胞表面受體之結構域或全長分子，諸如鈣黏素或其片段，或促乳素受體或其片段。粘附分子-4配位體可以進一步包括病毒顆粒、病毒衣殼蛋白、病毒表面蛋白，及可以結合至粘附分子-4之病毒蛋白的任何片段。除本文所述或熟習此項技術者已知之天然存在之配位體之外，粘附分子-4配位體之非限制性實例包括人工產生的配位體，例如藉由自肽文庫中篩選出可以結合至粘附分子-4之肽而鑑別的配位體。
術語「粘附分子-4活性」及「粘附分子信號傳導」意謂粘附分子-4配位體結合(例如活體內或活體外)至粘附分子-4而誘導的生物效應或生物反應。該術語亦指可以模擬粘附分子-4配位體功能之分子所誘導的類似效應或反應。此類粘附分子-4配位體模擬物誘導原本由粘附分子-4配位體結合而引起的生物反應或生物效應。
術語「結合蛋白」係指一種蛋白質，其包含結合至粘附分子-4的部分(例如一或多個結合區，諸如CDR)，及視情況存在的支架或構架部分(例如一或多個支架區或構架區)，該支架或構架部分允許結合部分呈現有助於結合蛋白結合至粘附分子-4多肽、片段或抗原決定基的構形。此類結合蛋白之實例包括抗體，諸如人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、重組抗體、單鏈抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、Fab片段、F(ab')2 片段、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體，及其片段。結合蛋白可以包含例如替代蛋白質支架或移植有CDR或CDR衍生物之人工支架。此類支架包括(但不限於)來源於抗體的骨架，其包含為了例如使結合蛋白之三維結構穩定而引入的突變，以及全合成支架，其包含例如生物相容性聚合物。參見例如Korndorfer等人，2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 53(1):121-29；及Roque等人，2004, Biotechnol. Prog. 20:639-54。另外，可以使用肽抗體模擬物(「PAM」)，以及基於抗體模擬物之支架(利用纖維結合蛋白組分作為支架)。在本發明之上下文中，稱結合蛋白特異性結合或選擇性結合至粘附分子-4。
術語「抗體」、「免疫球蛋白」或「Ig」在本文中可互換地使用，且在最廣泛的意義上使用且特定地涵蓋例如個別抗粘附分子-4單株抗體(包括全長或完整單株抗體)、具有多抗原決定基或單抗原決定基特異性之抗粘附分子-4抗體組合物、多株或單價抗體、由至少兩種完整抗體形成的多價抗體、單鏈抗粘附分子-4抗體，及抗粘附分子-4抗體片段，如下文所述。抗體可為人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體及/或親和力成熟抗體，以及來自其他物種(例如小鼠及兔等)的抗體。術語「抗體」意欲包括多肽之免疫球蛋白類別內的B細胞多肽產物，其能夠結合至特定分子抗原且由兩對相同多肽鏈組成，其中各對具有一條重鏈(約50-70 kDa)及一條輕鏈(約25 kDa)，各鏈之各胺基端部分包括約100至約130或超過130個胺基酸之可變區且各鏈之各羧基端部分包括恆定區。參見例如Antibody Engineering (Borrebaeck編，第2版，1995)；及Kuby,Immunology (第3版，1997)。在特定實施例中，特定分子抗原可以被本文所提供之抗體結合，包括粘附分子-4多肽、粘附分子-4片段或粘附分子-4抗原決定基。抗體亦包括(但不限於)合成抗體、重組產生的抗體、駱駝化抗體、胞內抗體、抗個體基因型(抗Id)抗體，及上述任一者之功能片段(例如抗原結合片段，諸如粘附分子-4結合片段)，該等功能片段係指抗體重鏈或輕鏈多肽的一部分，該部分保持該片段所來源之抗體的一些或全部結合活性。功能片段(例如抗原結合片段，諸如粘附分子-4結合片段)之非限制性實例包括單鏈Fvs (scFv)、Fab片段、F(ab')片段、F(ab)2片段、F(ab')2 片段、二硫鍵連接的Fvs (dsFv)、Fd片段、Fv片段、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及微型抗體。特定言之，本文所提供之抗體包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，例如結合至粘附分子-4抗原之含有抗原結合位點的抗原結合域或分子(例如抗粘附分子-4抗體之一或多個CDR)。此類抗體片段可發現於例如Harlow及Lane,Antibodies: A Laboratory Manual (1989)；Mol. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers編，1995)；Huston等人，1993, Cell Biophysics 22:189-224；Plückthun及Skerra, 1989, Meth. Enzymol. 178:497-515；及Day,Advanced Immunochemistry (第2版，1990)。本文所提供之抗體可以屬於免疫球蛋白分子的任何類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD及IgA)或任何子類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。
「抗原」為抗體可以選擇性結合之預定抗原。靶抗原可為多肽、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。在一些實施例中，靶抗原為多肽。
術語「抗原結合片段」、「抗原結合域」、「抗原結合區」及類似術語係指抗體之該部分，其包含與抗原發生相互作用且賦予結合劑針對抗原(例如CDR)之特異性及親和力的胺基酸殘基。
術語「結合(binds)」或「結合(binding)」係指分子間的相互作用，包括例如形成複合物。相互作用可為例如非共價相互作用，包括氫鍵、離子鍵、疏水相互作用及/或凡得瓦爾相互作用(van der Waals interactions)。複合物亦可包括藉由共價或非共價鍵、相互作用或力保持在一起之兩個或超過兩個分子的結合。抗體上之單一抗原結合位點與靶分子之單一抗原決定基(諸如粘附分子-4)之間的總非共價相互作用力為抗體或功能片段針對該抗原決定基之親和力。針對單價抗原之抗體之解離速率(k解離 )相對於結合速率(k結合 )的比率(k解離 /k結合 )為解離常數KD ，該解離常數與親和力逆相關。KD 愈低，則抗體親和力愈高。KD 值因抗體與抗原之不同複合物而異且視k結合 與k解離 而定。本文所提供之抗體的解離常數KD 可以使用本文所提供的任何方法或熟習此項技術者熟知的任何其他方法測定。一個結合位點處之親和力不能始終反映抗體與抗原之間的真實相互相用力。當含有多個重複抗原決定子之複合抗原(諸如多價粘附分子-4)與含有多個結合位點之抗體接觸時，抗體與抗原在一個位點處之相互相用將增加第二個位點處的反應機率。多價抗體與抗原之間的此類多重相互作用力稱為親合力。與抗體之個別結合位點之親和力相比，抗體之親合力可為其結合能力之更佳量度。舉例而言，高親合力可以補償低親和力，如對於五聚體IgM抗體有時所發現，該等IgM抗體之親和力可低於IgG，但IgM因其多價而引起較高親合力，使得其能夠有效地結合抗原。
術語「特異性結合至粘附分子-4之抗體」、「特異性結合至粘附分子-4抗原決定基之抗體」及類似術語在本文中亦可互換地使用且係指抗體特異性結合至粘附分子-4多肽(諸如粘附分子-4抗原，或片段，或抗原決定基(例如人類粘附分子-4，諸如人類粘附分子-4多肽、抗原或抗原決定基)。特異性結合至粘附分子-4 (例如人類粘附分子-4)之抗體可以結合至粘附分子-4之胞外域或來源於該胞外域之肽。特異性結合至粘附分子-4抗原(例如人類粘附分子-4)之抗體可與相關抗原(例如食蟹獼猴粘附分子-4)交叉反應。在某些實施例中，特異性結合至粘附分子-4抗原之抗體與其他抗原(諸如(但不限於)粘附分子-1、粘附分子-2及/或粘附分子-3)不發生交叉反應。特異性結合至粘附分子-4抗原之抗體可例如藉由免疫分析、Biacore®或熟習此項技術者已知的其他技術鑑別。
「結合所關注抗原」(例如靶抗原，諸如粘附分子-4)的抗體為以足夠親和力結合抗原的抗體，使得抗體適用作靶向或偵測表現該抗原之細胞或組織的藥劑，且與其他蛋白質不發生顯著的交叉反應。在此類實施例中，抗體結合至「非標靶」蛋白質之程度小於該抗體對其特定靶蛋白之結合的約10%，例如如藉由螢光活化細胞分選(FACS)分析或RIA所測定。關於抗體對靶分子之結合，術語「特異性結合」、「特異性結合至」或「特異性針對」特定多肽或特定多肽標靶上之抗原決定基意謂結合可量測地不同於非特異性相互作用。特異性結合可例如藉由測定分子之結合、與對照分子之結合對比來量測，對照分子通常為結構類似、不具有結合活性的分子。舉例而言，特異性結合可以依據與類似於標靶(例如過量的未標記標靶)之對照分子的競爭來測定。在此情況下，若經標記之標靶對探針之結合受到過量的未標記標靶競爭性地抑制，則表示特異性結合。術語「抗粘附分子-4抗體」或「結合至粘附分子-4之抗體」包括能夠以足夠親和力結合粘附分子-4的抗體，使得該抗體適用作例如靶向粘附分子-4的診斷劑。如本文所用，術語「特異性結合」、「特異性結合至」或「特異性針對」特定多肽或特定多肽標靶上之抗原決定基係指結合，其中分子結合至特定多肽或特定多肽上之抗原決定基，而不實質上結合至任何其他多肽或多肽抗原決定基。本文提供一種特異性結合至粘附分子-4的抗粘附分子-4抗體。本文亦提供一種特異性結合至粘附分子-4而非粘附分子-1、粘附分子-2及/或粘附分子-3的抗粘附分子-4抗體。
當抗體結合至粘附分子-4抗原的親和力高於任何交叉反應性抗原(如使用實驗技術所測定，諸如放射免疫分析(RIA)及酶聯免疫吸附分析(ELISA))時，該抗體特異性結合至粘附分子-4抗原。典型地，特異性或選擇性反應為背景信號或雜訊的至少兩倍且可超過背景的10倍。關於抗體特異性的論述，參見例如Fundamental Immunology 332-36 (Paul編，第2版，1989)。或者，可以定性地測定抗體特異性，例如在IHC分析中。在此類IHC分析中，當抗體結合至表現粘附分子-4之細胞(例如以免疫組織化學方式將表現粘附分子-4之細胞染色)、但實質上不結合至不表現粘附分子-4之細胞(例如使不表現粘附分子-4之細胞實質上不染色)時，該抗體特異性地結合至粘附分子-4抗原或對粘附分子4抗原具有特異性， 舉例而言，當抗體結合至細胞(例如以免疫組織化學方式將細胞染色)的程度實質上類似於針對免疫球蛋白同型對照物所發現的結合程度時，抗體在IHC中實質上不結合至細胞，例如實質上不將細胞染色。
術語「完全人類抗體」或「人類抗體」在本文中可互換地使用且係指包含人類可變區及例如人類恆定區的抗體。在特定實施例中，該術語係指包含人類來源之可變區及恆定區的抗體。在某些實施例中，「完全人類」抗粘附分子-4抗體亦可涵蓋結合粘附分子-4多肽且由核酸序列編碼的抗體，該等核酸序列為人類生殖系免疫球蛋白核酸序列之天然存在之體細胞變異體。在一個特定實施例中，本文所提供之抗粘附分子-4抗體為完全人類抗體。術語「完全人類抗體」包括其中可變區及恆定區對應於人類生殖系免疫球蛋白序列的抗體，如Kabat等人所述(參見Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版，美國健康及人類服務部(U.S. Department of Health and Human Services), NIH公告第91-3242號)。產生完全人類抗體的例示性方法提供於例如本文的實例中，但可以使用此項技術中已知之任何方法。
片語「重組人類抗體」包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離出的人類抗體，諸如使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體所表現的抗體、自重組組合型人類抗體文庫分離出的抗體、自人類免疫球蛋白基因轉殖基因及/或轉殖染色體動物(例如小鼠或乳牛)分離出的抗體(參見例如Taylor, L. D.等人(1992)Nucl . Acids Res . 20:6287-6295)，或藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列拼接之任何其他方式所製備、表現、產生或分離出的抗體。此類重組人類抗體可以具有來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區(參見Kabat, E. A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版，美國健康及人類服務部, NIH公告第91-3242號)。然而，在某些實施例中，對此類重組人類抗體進行活體外突變誘發(或，當使用人類Ig序列轉殖基因之動物時，為活體內體細胞突變誘發)，且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列為雖然來源於人類生殖系VH及VL序列且與人類生殖系VH及VL序列相關、但可以並非天然存在於活體內人類抗體生殖系譜系內的序列。
術語「競爭」當在抗粘附分子-4抗體的上下文中使用時(例如抗體與結合蛋白結合至粘附分子-4且競爭標靶上之相同抗原決定基或結合位點)，意謂如分析所測定的競爭，其中正研究的抗體(或其結合片段)阻止或抑制參考分子(例如參考配位體或參考抗原結合蛋白，諸如參考抗體)特異性結合至共同抗原(例如粘附分子-4或其片段)。可以利用多種類型的競爭結合分析來確定測試抗體是否與參考抗體競爭結合至粘附分子-4 (例如人類粘附分子-4)。可以利用的分析實例包括固相直接或間接RIA、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(參見例如Stahli等人，1983, Methods in Enzymology 9:242-53)、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (參見例如Kirkland等人，1986, J. Immunol. 137:3614-19)、固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(參見例如Harlow及Lane,Antibodies , A Laboratory Manual (1988))、使用I-125標記的固相直接標記RIA(參見例如Morel等人，1988, Mol. Immunol. 25:7-15)，及直接標記RIA (Moldenhauer等人，1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82)。典型地，此類分析涉及使用結合至固體表面的純化抗原(例如粘附分子-4，諸如人類粘附分子-4)，或帶有未經標記之測試抗原結合蛋白(例如測試抗粘附分子-4抗體)或經標記之參考抗原結合蛋白(例如參考抗粘附分子-4抗體)的細胞。可以使用的其他例示性競爭結合分析包括ELISA、FACS、細胞粘附分析(例如如Humphries等人Methods Mol Biol. 2009;522:203-10中所述)、表面電漿子共振(SPR)，或熟習此項技術者已知之其他競爭結合分析。競爭抑制可藉由在測試抗原結合蛋白存在下測定結合至固體表面或細胞之標記的量來量測。通常，測試抗原結合蛋白質過量存在。藉由競爭分析(競爭抗體)鑑別之抗體包括與參考抗體結合至相同抗原決定基之抗體，及/或結合至鄰近抗原決定基的抗體，該鄰近抗原決定基充分靠近參考抗體所結合的抗原決定基，以致抗體出現空間位阻。關於測定競爭結合之方法的額外細節描述於本文中。通常，當競爭抗體蛋白質過量存在時，其將參考抗體對共同抗原的特異性結合抑制至少30%，例如40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些實例中，結合被抑制至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%。
如本文所用，術語「組合」在投與其他療法的上下文中係指使用超過一種療法。使用術語「組合」不限制向患有感染之個體投與療法之次序。可以在向已患有、正患有或易罹患粘附分子-4介導疾病之個體投與第二療法之前(例如之前的1分鐘、45分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週)、同時或之後(例如之後的1分鐘、45分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週)投與第一療法。任何額外的療法可以任何次序與其他額外療法投與。在某些實施例中，本文所提供之抗體可與當前為了預防、治療、管理及/或減輕粘附分子-4介導疾病而投與的一或多種療法(例如不為本文所提供之抗體的療法)組合投與。可與本文所提供之抗體組合投與之療法之非限制性實例包括鎮痛劑、麻醉劑、抗生素或免疫調節劑，或美國藥典(U . S . Pharmacopoeia )及/或醫師案頭參考(Physician ' s Desk Reference )中列舉之任何其他藥劑。
「分離」之抗體基本上不含細胞材料或來自細胞或組織來源之其他污染蛋白質及/或衍生抗體時而產生的其他污染物組分，或在化學合成時基本上不含化學前驅體或其他化學物質。語言「基本上不含細胞材料」包括其中抗體與自其中分離或重組產生該抗體之細胞的細胞組分分離的抗體製劑。因此，基本上不含細胞材料的抗體包括具有小於約30%、25%、20%、15%、10%、5%或1% (以乾重計)異源蛋白質(在本文中亦稱為「污染蛋白質」)的抗體製劑。在某些實施例中，當抗體重組產生時，其基本上不含培養基，例如培養基佔蛋白質製劑體積的小於約20%、15%、10%、5%或1%。在某些實施例中，當藉由化學合成產生抗體時，其基本上不含化學前驅體或其他化學物質，例如其與涉及蛋白質合成之化學前驅體或其他化學物質分離。因此，除所關注之抗體以外，此類抗體製劑亦具有小於約30%、25%、20%、15%、10%、5%或1% (以乾重計)化學前驅體或化合物。污染物組分亦可包括(但不限於)干擾抗體之治療用途的材料，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在某些實施例中，抗體純化至(1)大於95重量%抗體，如藉由洛瑞方法(Lowry method)所測定(Lowry等人，1951, J. Bio. Chem. 193: 265-75)，諸如96%、97%、98%或99%；(2)足以獲得N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度(藉由使用旋杯式測序儀)；(3)均質，藉由SDS-PAGE、在還原或非還原條件下、使用庫馬斯藍(Coomassie blue)或銀染色所測。由於抗體天然環境中之至少一種組分將不存在，因此，分離的抗體包括原位位於重組細胞內之抗體。然而，通常，分離之抗體將藉由至少一個純化步驟來製備。在特定實施例中，本文所提供之抗體係經分離。
4鏈抗體單元為雜四聚醣蛋白，其由兩條相同輕(L)鏈及兩條相同重(H)鏈構成。在lgG的情況下，4鏈單元通常為約150,000道爾頓。各L鏈經一個共價二硫鍵連接至H鏈，而兩條H鏈彼此經一或多個二硫鍵連接，此視H鏈同型而定。各H鏈及L鏈亦具有有規律地間隔之鏈內二硫橋鍵。各H鏈在N末端具有可變域(VH)、繼之為三個恆定域(CH)(對於α及γ鏈中之每一者而言)以及4個CH域(對於μ及ε同型而言)。各L鏈在N末端具有可變域(VL)，繼之為位於其另一端的恆定域(CL)。將VL與VH對齊，且將CL與重鏈(CH1)之第一恆定域對齊。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。VH與VL配對在一起而形成單一抗原結合位點。關於不同類別之抗體的結構及特性，參見例如Basic and Clinical Immunology 71 (Stites等人編，第8版，1994)。
術語「可變區」、「可變域」、「V區」或「V域」係指抗體之輕鏈或重鏈的一部分，其通常位於輕鏈或重鏈之胺基端且在重鏈中具有約120至130個胺基酸的長度且在輕鏈中具有約100至110個胺基酸的長度，且用於各種特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。重鏈之可變區可稱為「VH」。輕鏈之可變區可稱為「VL」。術語「可變」係指可變區之某些區段的序列在抗體間廣為不同之事實。V區介導抗原結合且定義特定抗體對其特定抗原之特異性。然而，可變性在可變區之110個胺基酸跨距內不均勻分佈。實情為，V域由以下組成：約15-30個胺基酸之弱可變(例如相對恆定)片段(稱為構架區(FR))，該等片段被較短的較大可變性(例如極度可變性)區域(稱為「高變區」，各約9-12個胺基酸長)分隔。重鏈及輕鏈之可變區各自包含由三個高變區連接之四個FR，該等FR很大程度上採用β片組態，該等高變區形成連接β片結構之環且在一些情況下形成β片結構之一部分。各鏈中之高變區藉由FR緊密結合在一起，且與另一鏈之高變區促成抗體之抗原結合位點的形成(參見例如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest (第5版，1991))。恆定區不直接涉及抗體對抗原之結合，但展現多種效應功能，諸如使抗體參與抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。可變區的序列在不同抗體之間廣泛不同。在特定實施例中，可變區為人類可變區。
術語「如Kabat中的可變區殘基編號」或「如Kabat中的胺基酸位置編號」及其變化形式，係指Kabat等人(同上)用於編譯抗體重鏈可變區或輕鏈可變區的編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可以含有對應於可變域之FR或CDR之縮短或插入的較少或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變域可以包括位於殘基52之後的單一胺基酸插入(殘基52a，根據Kabat)及位於殘基82之後的三個插入殘基(例如殘基82a、82b及82c等，根據Kabat)。可藉由在抗體序列之同源區與「標準」Kabat編號序列比對來確定所指定抗體之殘基的Kabat編號。當提及可變域中之殘基(輕鏈之約殘基1-107及重鏈之殘基1-113)時，通常使用Kabat編號系統(例如Kabat等人，同上)。當提及免疫球蛋白重鏈恆定區中之殘基時，通常使用「EU編號系統」或「EU索引」(例如Kabat等人所報導的EU索引，同上)。「如Kabat中之EU索引」係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。其他編號系統已由例如AbM、Chothia、Contact、IMGT及AHon描述且已被一般技術者充分瞭解。
「完整」抗體為包含抗原結合位點以及CL及至少重鏈恆定區CH1、CH2及CH3的抗體。恆定區可包括人類恆定區或其胺基酸序列變異體。在某些實施例中，完整抗體具有一或多種效應功能。
「抗體片段」包含完整抗體之一部分，諸如完整抗體之抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括(但不限於) Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段；雙功能抗體及雙-雙功能抗體(參見例如Holliger等人，1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:6444-48；Lu等人，2005, J. Biol. Chem. 280:19665-72；Hudson等人，2003, Nat. Med. 9:129-34; WO 93/11161；及美國專利第5,837,242號及第6,492,123號)；單鏈抗體分子(參見例如美國專利第4,946,778號；第5,260,203號；第5,482,858號；及第5,476,786號)；雙重可變域抗體(參見例如美國專利第7,612,181號)；單一可變域抗體(sdAbs)(參見例如Woolven等人，1999, Immunogenetics 50: 98-101；及Streltsov等人，2004, Proc Natl Acad Sci USA. 101:12444-49)；及由抗體片段形成的多特異性抗體。
治療抗體之「功能片段」、「結合片段」或「抗原結合片段」將展現至少一種(若非一些或全部)歸因於完整抗體的生物功能，該功能包含至少對靶抗原(例如粘附分子-4結合片段或結合至粘附分子-4的片段)的結合。
如本文所用，術語「融合蛋白」係指包含抗體之胺基酸序列及異源多肽或蛋白質(例如通常不為抗體(例如非抗粘附分子-4抗原結合抗體)之一部分的多肽或蛋白質)之胺基酸序列的多肽。術語「融合」當關於粘附分子-4或抗粘附分子-4抗體使用時，係指肽或多肽或其片段、變異體及/或衍生物與異源肽或多肽之連接。在某些實施例中，融合蛋白保持粘附分子-4或抗粘附分子-4抗體之生物活性。在某些實施例中，融合蛋白包含粘附分子-4 抗體VH區域、VL區域、VH CDR (一個、兩個或三個VH CDR)，及/或VL CDR (一個、兩個或三個VL CDR)，其中融合蛋白結合至粘附分子-4抗原決定基、粘附分子-4片段及/或粘附分子-4多肽。
術語「重鏈」當參考抗體使用時，係指約50-70 kDa之多肽鏈，其中胺基端部分包括約120至130或超過130個胺基酸之可變區，且羧基端部分包括恆定區。基於重鏈恆定區之胺基酸序列，恆定區可為五種不同類型(例如同型)之一，稱為alpha (α)、delta (δ)、epsilon (ε)、gamma (γ)及mu (µ)。不同重鏈之尺寸不同：α、δ及γ含有約450個胺基酸，而µ及ε含有約550個胺基酸。此等不同類型的重鏈當與輕鏈組合時，產生五種熟知的抗體類別(例如同型)，分別為IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，包括IgG的四種亞類，亦即IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。重鏈可為人類重鏈。
術語「輕鏈」當參考抗體使用時，係指約25 kDa之多肽鏈，其中胺基端部分包括約100至約110個或超過110個胺基酸之可變區，且羧基端部分包括包括恆定區。輕鏈之大致長度為211至217個胺基酸。基於恆定域之胺基酸序列，存在兩種不同類型，稱為kappa (κ)或lambda (λ)。輕鏈胺基酸序列在此項技術中已熟知。輕鏈可為人類輕鏈。
如本文所用，術語「宿主」係指動物，諸如哺乳動物(例如人類)。
如本文所用，術語「宿主細胞」係指可用核酸分子轉染之特定個體細胞及此類細胞之後代或潛在後代。由於繼代中可能存在突變或環境影響或核酸分子整合至宿主細胞基因體中，因此此類細胞之後代可能與核酸分子轉染之母細胞不相同。
如本文所用，術語「單株抗體」係指自基本上均質抗體群體獲得的抗體，例如構成該群體的個別抗體除可能少量存在之可能天然存在之突變之外其他相同，且各種單株抗體典型地識別抗原上之單一抗原決定基。在特定實施例中，如本文所用，「單株抗體」為由單一融合瘤或其他細胞產生之抗體，其中抗體僅結合至粘附分子-4抗原決定基，如例如藉由ELISA或此項技術中已知的其他抗原結合或競爭結合分析所測定。術語「單株」不限於用於製備抗體之任何特定方法。舉例而言，適用於本發明的單株抗體可以藉由首次由Kohler等人，1975, Nature 256:495描述的融合瘤方法製備，或可以在細菌或真核動物或植物細胞中使用重組DNA方法製備(參見例如美國專利第4,816,567號)。「單株抗體」亦可使用例如Clackson等人，1991, Nature 352:624-28及Marks等人，1991, J. Mol. Biol., 222:581-97中所述之技術、自噬菌體抗體文庫中分離。用於製備純系細胞株及由其表現之單株抗體的其他方法在此項技術中已熟知。參見例如Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人編，第5版. 2002)。本文在實例中提供產生單株抗體之例示性方法。
術語「原生」當結合生物材料(諸如核酸分子、多肽、宿主細胞及其類似物)使用時，係指發現於自然界中且未經人類操縱、修飾及/或改變(例如分離、純化、選擇)的彼等物。
本文所提供之抗體可以包括「嵌合」抗體，其中重鏈及/或輕鏈的一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中的相應序列一致或同源，而鏈的其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中的相應序列一致或同源；以及此類抗體的片段，只要其展現所需的生物活性(參見美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-55)。
非人類(例如鼠類)抗體的「人類化」形式為包括人類免疫球蛋白(例如接受者抗體)的嵌合抗體，其中原生CDR殘基經具有所需特異性、親和力及能力之來自非人類物種(例如供者抗體)(諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)之相應CDR的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之一或多個FR區殘基經相應的非人類殘基置換。另外，人類化抗體可以包含接受者抗體或供者抗體中未發現之殘基。此等修飾係為了進一步改進抗體效能而達成。人類化抗體重鏈或輕鏈可以包含至少一或多個可變區中的基本上全部，其中全部或基本上全部的CDR對應於非人類免疫球蛋白之CDR且全部或基本上全部的FR為人類免疫球蛋白序列之FR。在某些實施例中，人類化抗體將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，典型地為人類免疫球蛋白之至少一部分。關於其他細節，參見Jones等人，1986, Nature 321:522-25；Riechmann等人，1988, Nature 332:323-29；Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-96；Carter等人，1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-89；美國專利第6,800,738號、第6,719,971號、第6,639,055號、第6,407,213號及第6,054,297號。
「人類抗體」為胺基酸序列對應於由人類產生之抗體之胺基酸序列及/或已使用如本文所揭示之任一種人類抗體製備技術所製備之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義特別排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。人類抗體可以使用此項技術中已知的各種技術產生，包括噬菌體呈現文庫(Hoogenboom及Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381；Marks等人，1991, J. Mol. Biol. 222:581)及酵母呈現文庫(Chao等人，2006, Nature Protocols 1: 755-68)。Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77 (1985)；Boerner等人，1991, J. Immunol. 147(1):86-95；及van Dijk及van de Winkel, 2001, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74中所述的方法亦可利用於製備人類單株抗體。人類抗體可以如下製備：將抗原投與經修飾以回應於抗原攻擊而產生此類抗體、但內源性基因座已失能之轉殖基因動物，例如小鼠(關於XENOMOUSETM 技術，參見例如Jakobovits, 1995, Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):561-66；Brüggemann及Taussing, 1997, Curr. Opin. Biotechnol. 8(4):455-58；及美國專利第6,075,181號及第6,150,584號)。關於經由人類B細胞融合瘤技術產生的人類抗體，亦參見例如Li等人，2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-62。
「CDR」係指免疫球蛋白(Ig或抗體) VH β-片狀構架之非構架區內的三個高變區(H1、H2或H3)之一，或抗體VL β-片狀構架之非構架區內的三個高變區(L1、L2或L3)之一。因此，CDR為散置於構架區序列內之可變區序列。CDR區為熟習此項技術者所熟知且已由例如Kabat定義為抗體可變(V)域內最高變之區域(Kabat等人，1997, J. Biol. Chem. 252:6609-16；Kabat, 1978, Adv. Prot. Chem. 32:1-75)。CDR區域序列在結構上亦由Chothia定義為不為保守型β-片狀構架之一部分的彼等殘基，且因此能夠適應不同構形(Chothia及Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-17)。兩種術語在此項技術中均已充分認知。CDR區序列亦已由AbM、Contact及IMGT定義。典型抗體可變區內的CDR位置已藉由比較多種結構來確定(Al-Lazikani等人，1997, J. Mol. Biol. 273:927-48；Morea等人，2000, Methods 20:267-79)。由於高變區內之殘基數目因抗體不同而不同，因此相對於典型位置的其他殘基習知地緊鄰典型可變區編號方案中之殘基編號以a、b、c等編號(Al-Lazikani等人，同上)。此類命名法類似地已為熟習此項技術者熟知。
術語「高變區」、「HVR」或「HV」當在本文中使用時，係指抗體可變區中序列具有高變性及/或形成結構上界定之環的區域。一般而言，抗體包含六個HVR；三個位於VH中(H1、H2、H3)，且三個位於VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵蓋多種高變區描繪。Kabat互補決定區(CDR)係基於序列可變性且最常用(參見例如Kabat等人，同上). 而Chothia提及結構環之位置(參見例如Chothia及Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-17)。利用Kabat編號公約編號時，Chothia CDR-H1環的末端在H32與H34之間變化，此視環的長度而定(此原因為Kabat編號方案將插入置於H35A及H35B；若既不存在35A、亦不存在35B，則環末端位於32；若僅存在35A，則環末端位於33；若35A與35B均存在，則環末端位於34)。AbM高變區代表Kabat CDR與Chothia結構環之間的平衡，且被Oxford Molecular的AbM抗體模型化軟體利用(參見例如Antibody Engineering 第2卷(Kontermann及Dübel編，第2版，2010))。「接觸」高變區係基於可利用的複雜晶體結構之分析。來自此等高變區或CDR中之每一者的殘基標示於下文中。
最近，已開發出及廣泛採用一種通用編號系統，ImMunoGeneTics (IMGT) Information System® (Lafranc等人，2003, Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77)。IMGT為專用於人類及其他脊椎動物之免疫球蛋白(IG)、T細胞受體(TCR)及主要組織相容複合體(MHC)的整合式資訊系統。本文中，關於胺基酸序列及輕鏈或重鏈內的位置提及CDR。由於免疫球蛋白可變域結構內之CDR的「位置」在物種之間為保守的且存在於稱為環的結構中，因此使用根據結構特徵來比對可變結構域序列的編號系統容易鑑別出CDR及構架殘基。此資訊可用於將來自一個物種之免疫球蛋白之CDR殘基移植及置換至典型地來自人類抗體之受體構架中。Honegger及Plückthun, 2001, J. Mol. Biol. 309: 657-70已開發出另一種編號系統(AHon)。編號系統(包括例如Kabat編號及IMGT獨特編號系統)之間的一致性已為熟習此項技術者熟知(參見例如Kabat，同上；Chothia及Lesk，同上；Martin，同上；Lefranc等人，同上)。
高變區可以包含如下「延長的高變區」：VL中的24-36或24-34 (L1)、46-56或50-56 (L2)，及89-97或89-96 (L3)；及VH中的26-35或26-35A (H1)、50-65或49-65 (H2)及93-102、94-102或95-102 (H3)。如本文所用，術語「HVR」及「CDR」可互換地使用。
術語「恆定區」或「恆定域」係指輕鏈及重鏈之羧基端部分，其不直接涉及抗體對抗原之結合，但展現多種效應功能，諸如與Fc受體之相互相用。該術語係指免疫球蛋白分子之一部分，該部分相對於該免疫球蛋白之含有抗原結合位點的另一部分(可變區)具有更保守的胺基酸序列。恆定區可以含有重鏈之CH1、CH2及CH3區以及輕鏈之CL區。
術語「構架」或「FR」殘基係指側接CDR之可變區殘基。FR殘基存在於例如嵌合、人類化、人類、結構域抗體、雙功能抗體、線性抗體及雙特異性抗體中。FR殘基為除高變區殘基或CDR殘基之外的彼等可變域殘基。
「親和力成熟」抗體為一種抗體，其一或多個HVR中具有一或多種變異(例如胺基酸序列變異，包括變化、添加及/或缺失)，從而使抗體對抗原之親和力改良，相比之下，親本抗體則不具有彼等變異。親和力成熟抗體可以對靶抗原具有奈莫耳濃度或甚至皮莫耳濃度之親和力。藉由此項技術中已知的程序產生親和力成熟抗體。欲回顧，參見Hudson及Souriau, 2003, Nature Medicine 9:129-34；Hoogenboom, 2005, Nature Biotechnol. 23:1105-16；Quiroz及Sinclair, 2010, Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51。
「結合親和力」通常指分子(例如結合蛋白，諸如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用力總和。除非另外指明，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間1:1相互作用之固有結合親和力。結合分子X對其結合搭配物Y之親和力通常可由解離常數(KD )表示。可藉由此項技術中已知之常見方法(包括本文所述之方法)量測親和力。低親和力抗體通常緩慢結合抗原且傾向於容易解離，而高親和力抗體通常更快地結合抗原且傾向於較長時間保持結合狀態。此項技術中已知多種量測結合親和力的方法，其中任一者可用於本發明之目的。特定說明性實施例包括以下。在一個實施例中，「KD 」或「KD 值」可藉由此項技術中已知的分析量測，例如藉由結合分析。KD 可以利用RIA量測，例如使用所關注抗體之Fab形式及其抗原進行(Chen等人，1999, J. Mol Biol 293:865-81)。KD 或KD 值亦可藉由Biacore®、利用表面電漿子共振分析加以量測，例如使用Biacore®TM-2000或Biacore®TM-3000，或使用例如Octet®QK384系統、藉由生物層干涉量測術加以量測。「結合速率(on-rate)」或「結合之速率(rate of association)」或「結合速率(association rate)」或「k結合 (kon )」亦可利用上述相同的表面電漿子共振或生物層干涉量測技術、使用例如Biacore®TM-2000或Biacore®TM-3000或Octet®QK384系統測定。
片語「基本上相似」或「基本上相同」表示得自兩個影像(例如一個與本發明之抗體有關且另一個與參考抗體有關)之兩個數值或信號(例如IHC染色信號)之間的相似度足夠高，使得熟習此項技術者認為該兩個值或兩個影像之間的差異在該等值所量度之生物學特徵之背景內具有極小的或不具有生物學及/或統計顯著性。舉例而言，兩個值之間的差異可以小於約50%、小於約40%、小於約30%、小於約20%、小於約10%或小於約5%，此隨參考抗體之值而變。
如本文所用，片語「實質上增加」、「實質上減小」或「實質上不同」表示得自兩個影像(例如一個與本發明之抗體有關且另一個與參考抗體有關)之兩個數值或信號(例如IHC染色信號)之間的差異程度足夠高，使得熟習此項技術者認為該兩個值或兩個影像之間的差異在該等值所量度之生物學特徵之背景內具有統計顯著性。舉例而言，該兩個值之間的差異可大於約10%、大於約20%、大於約30%、大於約40%或大於約50%，此隨參考抗體之值而變。
抗體「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區(例如原生序列Fc區或胺基酸序列變異型Fc區)的彼等生物活性，且因抗體同型而異。抗體效應功能之實例包括：C1q結合；CDC；Fc受體結合；ADCC；吞噬作用；及B細胞活化。
如本文所用，術語「有效量」係指本文所提供之抗體或醫藥組合物足以產生所需結果的量。
在本文中，術語「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區域，包括例如原生序列Fc區、重組型Fc區及變異型Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可能變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為自位置Cys226之胺基酸殘基或自Pro230延伸至其羧基末端。可移除Fc區之C端離胺酸(殘基447，根據EU編號系統)，例如在抗體之製備或純化期間，或藉由以重組方式工程改造編碼抗體重鏈的核酸。因此，完整抗體之組合物可包含所有K447殘基均被移除之抗體群、K447殘基未移除之抗體群及含有具有及不具有K447殘基之抗體之混合物的抗體群。
「功能Fc片段」具有原生序列Fc區之「效應功能」。例示性「效應功能」包括C1q結合；CDC；Fc受體結合；ADCC；吞噬作用等。此類效應功能通常需要將Fc區與結合區或結合域(例如抗體可變區或域)組合且可以使用所揭示的各種分析加以評估。
「原生序列Fc區」包含與自然界中所發現之Fc區的胺基酸序列一致的胺基酸序列，且未被人類操縱、修飾及/或改變(例如分離、純化、選擇，包括或與其他序列(諸如可變區序列)組合)。原生序列人類IgG1 Fc區包括原生序列人類IgG1 Fc區(非A及A異型)；原生序列人類IgG2 Fc區；原生序列人類IgG3 Fc區；及原生序列人類IgG4 Fc區以及其天然存在之變異體。舉例而言，原生人類IgG1 Fc區胺基酸序列提供如下(SEQ ID NO: 35)。
「變異型Fc區」包含與原生序列Fc區之差異為至少一個胺基酸修飾(例如取代、添加或缺失)的胺基酸序列。在某些實施例中，變異型Fc區相較於原生序列Fc區或相較於親本多肽之Fc區，係在原生序列Fc區中或在親本多肽之Fc區中具有至少一個胺基酸取代，例如約一個至約十個胺基酸取代，或約一個至約五個胺基酸取代。本文中，變異型Fc區與原生序列Fc區及/或親本多肽Fc區可以具有至少約80%同源性，或與其具有至少約90%同源性，例如與其具有至少約95%同源性。
術語「變異體」當關於粘附分子-4或抗粘附分子-4抗體使用時，可以指相較於原生或未經修飾之序列包含一或多個(諸如約1至約25個、約1至約20個、約1至約15個、約1至約10個或約1至約5個)胺基酸序列取代、缺失及/或添加之肽或多肽。舉例而言，粘附分子-4變異體可以來源於原生粘附分子-4之胺基酸序列的一或多個(例如約1至約25個、約1至約20個、約1至約15個、約1至約10個或約1至約5個)變化。亦舉例而言，抗粘附分子-4抗體之變異體可以來源於原生或先前未經修飾之抗粘附分子-4抗體之胺基酸序列的一或多個(諸如約1至約25個、約1至約20個、約1至約15個、約1至約10個或約1至約5個)變化。變異體可為天然存在的，諸如對偶基因或剪接變異體，或可以人工構築。多肽變異體可由編碼變異體之相應核酸分子製備。在特定實施例中，粘附分子-4變異體或抗粘附分子-4抗體變異體相較於參考抗體，至少保持對粘附分子-4的特異性結合。在某些實施例中，變異體由核酸分子之單核苷酸多型性(SNP)變異體編碼，該核酸分子編碼粘附分子-4或抗粘附分子-4 抗體VH或VL區域或子區域，諸如一或多個CDR。
術語「載體」係指一種物質，其用於運載或包括核酸序列，包括例如編碼如本文所述之抗粘附分子-4抗體的核酸序列，以便將核酸序列引入宿主細胞中。適用的載體包括例如表現載體、質體、噬菌體載體、病毒載體、游離基因體及人工染色體，其可包括可操作以穩定整合至宿主細胞染色體中的選擇序列或標記物。另外，載體可以包括一或多個可選標記基因及適當的表現控制序列。可包括之可選標記基因例如賦予針對抗生素或毒素、補體營養缺陷型缺乏之抗性，或供應培養基中不存在之關鍵營養。表現控制序列可以包括此項技術中熟知之組成型及誘導型啟動子、轉錄增強子、轉錄終止子及其類似物。當兩種或超過兩種核酸分子共表現(例如抗體重鏈及輕鏈或抗體VH及VL)時，兩種核酸分子均可以插入例如單一表現載體或單獨的表現載體中。對於單一載體表現而言，編碼核酸可操作地連接至一個共同表現控制序列，或連接至不同表現控制序列，諸如一個誘導型啟動子及一個組成型啟動子。可使用此項技術中熟知之方法證實核酸分子引入宿主細胞中。此類方法包括例如核酸分析，諸如北方墨點法或mRNA之聚合酶鏈反應(PCR)擴增；或基因產物表現之免疫墨點法，或測試所引入之核酸序列或其相應基因產物之表現的其他適合分析方法。熟習此項技術者應瞭解，核酸分子受到足量的表現以產生所需產物(例如如本文所述的抗粘附分子-4抗體)，且進一步應瞭解，可以使用此項技術中熟知之方法最佳化表現量以達成足夠的表現。
粘附分子-4多肽「胞外域」或「ECD」係指基本上不含跨膜域及細胞質域的粘附分子-4多肽形式。舉例而言，粘附分子-4多肽ECD可以具有小於1%的此類跨膜域及/或細胞質域且可以具有小於0.5%的此類結構域。
術語「一致性」係指兩種或超過兩種多肽分子或兩種或超過兩種核酸分子之序列之間的關係，如藉由比對及比較該等序列所測定。相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列且引入空位(若需要)以達到最大序列一致性百分比之後，候選序列中之與參考多肽序列胺基酸殘基一致的胺基酸殘基百分比，且任何保守取代不視為序列一致性之一部分。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術中之技能範圍內的各種方式達成，例如使用公開可獲得的電腦軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN (DNAStar, Inc.)軟體。熟習此項技術者可確定適用於比對序列之參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何算法。
胺基酸殘基/位置之「修飾」係指主要胺基酸序列相較於起始胺基酸序列之變化，其中該變化起因於涉及該等胺基酸殘基/位置之序列變異。舉例而言，典型的修飾包括殘基被另一胺基酸取代(例如保守或非保守取代)、與該殘基/位置相鄰之一或多個(例如通常少於5、4或3個)胺基酸的插入，及/或該殘基/位置之缺失。
「抗原決定基」為抗原分子表面上供單一抗體分子結合的位點，諸如抗原(諸如粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段)表面上的局域化區域，其能夠結合至抗體之一或多個抗原結合區域，且在諸如哺乳動物(例如人類)之動物中具有能夠引發免疫反應的抗原或免疫原性活性。具有免疫原性活性之抗原決定基為引發動物中之抗體反應之多肽之一部分。具有抗原活性之抗原決定基為抗體結合之多肽之一部分，如藉由此項技術中之任何熟知方法所測定，包括例如免疫分析。抗原的抗原決定基不必定具有免疫原性。抗原決定基通常由諸如胺基酸或糖側鏈之分子之化學活性表面基團組成，且具有特定三維結構特徵以及特定的電荷特徵。抗體的抗原決定基可為線性抗原決定基或構形抗原決定基。線性抗原決定基係由蛋白質中之連續胺基酸序列形成。構形抗原決定基係由在蛋白質序列中之不連續，但在蛋白質摺疊成其三維結構時聚集在一起的胺基酸形成。所誘導之抗原決定基在蛋白質之三維結構呈改變的構形時形成，諸如在另一蛋白質或配位體活化或結合後。在某些實施例中，粘附分子-4抗原決定基為粘附分子-4多肽之三維表面特徵。在其他實施例中，粘附分子-4抗原決定基為粘附分子-4多肽之線性特徵。通常，抗原具有若干或多個不同抗原決定基且可與許多不同抗體反應。
當抗體與參考抗體識別三維空間中之相同、重疊或相鄰抗原決定基時，該兩種抗體結合「抗原決定基」、「基本上相同的抗原決定基」或「相同抗原決定基」。使用最廣泛且快速的用於確定兩種抗體是否結合至三維空間中之相同、重疊或相鄰抗原決定基之方法為競爭分析，其可以許多不同形式組態，例如使用經標記之抗原或經標記之抗體。在一些分析中，使抗原固著於96孔盤上，或表現於細胞表面上，且使用放射性、螢光或酶標記來量測未標記之抗體阻斷經標記之抗體結合的能力。
「抗原決定基定位」為鑑別抗體針對其靶抗原之結合位點或抗原決定基的方法。「抗原決定基分組」為基於抗體所識別之抗原決定基而將抗體分組的方法。更特定言之，抗原決定基分組包含利用競爭分析與計算方法的組合來區別不同抗體之抗原決定基識別特性的方法及系統，以便基於其抗原決定基識別特性而將抗體聚類且鑑別具有不同結合特異性的抗體。
如本文所用，「載劑」包括醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑，其在所使用之劑量及濃度下對暴露於其之細胞或哺乳動物無毒性。通常，生理學上可接受之載劑為水性pH緩衝溶液。生理學上可接受之載劑的實例包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(例如少於約10個胺基酸殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEEN™、聚乙二醇(PEG)及PLURONICS™。術語「載劑」亦可指稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(Freund's adjuvant)(完全或不完全))、賦形劑或媒劑。此類載劑(包括醫藥載劑)可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似物。靜脈內投與組合物(例如醫藥組合物)時，水為例示性載劑。亦可使用生理鹽水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液作為液體載劑，尤其用於可注射溶液。適合的賦形劑(例如醫藥賦形劑)包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂牛乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇及其類似物。必要時，組合物亦可含有少量濕潤劑或乳化劑，或pH緩衝劑。組合物可呈溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、散劑、持續釋放調配物及其類似物之形式。口服組合物(包括調配物)可以包括標準載劑，諸如醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、鈉糖精、纖維素、碳酸鎂等。適合醫藥載劑之實例描述於Remington及Gennaro,Remington ' s Pharmaceutical Sciences (第18版，1990)中。包括醫藥化合物的組合物可以含有抗粘附分子-4抗體(例如分離或純化形式)以及適量載劑。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受」意謂聯邦或州政府之管制機構批准或列於美國藥典 (U.S. Pharmacopia)、歐洲藥典 (European Pharmacopia)或其他公認藥典中用於動物，尤其人類。
如本文所用，「多株抗體」係指在對具有多個抗原決定基之蛋白質之免疫原性反應中產生的抗體群且因此包括針對蛋白質內之相同及不同抗原決定基之多種不同抗體。用於產生多株抗體的方法在此項技術中已知(參見例如Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人編，第5版，2002))。
「經分離之核酸」為一種核酸，例如RNA、DNA或混合型核酸，其基本上與天然伴隨原生序列之其他基因組DNA序列以及蛋白質或複合物(諸如核糖體及聚合酶)分離。「分離」的核酸分子為與存在於該核酸分子之天然來源中之其他核酸分子分離的核酸分子。此外，「分離」的核酸分子(諸如cDNA分子)可以基本上不含其他細胞材料或培養基(當藉由重組技術製備時)，或基本上不含化學前驅體或其他化學物質(當化學合成時)。在一個特定實施例中，分離或純化一或多種編碼如本文所述之抗體的核酸分子。該術語涵蓋已自天然存在之環境中移除的核酸序列，且包括重組型或經選殖之DNA分離物及化學合成類似物或藉由異源系統生物合成之類似物。實質上純分子可以包括分離的分子形式。
如本文中可互換地使用，「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度的核苷酸聚合物且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基，及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入聚合物中之任何受質。聚核苷酸可以包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。如本文所用，「寡核苷酸」係指短的、通常單股的合成聚核苷酸，其長度通常(但不一定)少於約200個核苷酸。術語「寡核苷酸」與「聚核苷酸」並非相互排斥。以上關於聚核苷酸之描述同樣且完全適用於寡核苷酸。產生本發明之抗粘附分子-4抗體的細胞可以包括親本融合瘤細胞，以及編碼抗體之核酸已引入其中的細菌及真核宿主細胞。適合的宿主細胞揭示於下文中。
除非另有說明，否則本文揭示之任何單股聚核苷酸序列之左手端為5'端；雙股聚核苷酸序列之左手方向稱為5'方向。初生RNA轉錄物之5'至3'加成方向稱為轉錄方向；DNA股上具有與RNA轉錄物相同之序列且相對於RNA轉錄物5'端為5'之序列區域稱為「上游序列」；DNA股上具有與RNA轉錄物相同之序列且相對於RNA轉錄物3'端為3'之序列區域稱為「下游序列」。
術語「重組抗體」係指藉由重組方式製備、表現、產生或分離之抗體。重組抗體可為使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體所表現的抗體、自重組組合型抗體文庫分離的抗體、自人類免疫球蛋白基因之轉殖基因及/或轉殖染色體動物(例如小鼠或乳牛)分離的抗體(參見例如Taylor等人，1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-95)，或藉由涉及免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列拼接的任何其他方式製備、表現、產生或分離的抗體。此類重組抗體可以具有可變區及恆定區，包括來源於人類生殖系免疫球蛋白序列的彼等區域(參見Kabat等人，同上)。然而，在某些實施例中，可以對此類重組抗體進行活體外突變誘發(或當使用人類Ig序列之轉殖基因動物時，為活體內體細胞突變誘發)，因此重組抗體之VH及VL區的胺基酸序列為活體內可不天然存在於人類抗體生殖系譜系內的序列，雖然該等序列來源於人類生殖系VH及VL序列且與人類生殖系VH及VL序列有關。
術語「個體」與「患者」可互換使用。如本文所用，在某些實施例中，個體為哺乳動物，諸如非靈長類動物(例如乳牛、豬、馬、貓、犬、大鼠等)或靈長類動物(例如猴及人類)。在特定實施例中，個體為人類。在一個實施例中，個體為哺乳動物，例如診斷患有本文所提供之病狀或病症的人類。在另一實施例中，個體為哺乳動物，例如處於出現本文所提供之病狀或病症之風險下的人類。
「基本上所有」係指至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或約100%。
術語「可偵測探針」係指提供可偵測信號之組合物。該術語包括(不限於)可經由其活性提供可偵測信號之任何螢光團、發色團、放射性標記、酶、抗體或抗體片段，及其類似物。
術語「可偵測藥劑」係指可用於確定所需分子(諸如如本文所述的抗粘附分子-4抗體)在樣品或個體中之存在的物質。可偵測藥劑可為能夠可視化之物質或能夠以其他方式測定及/或量測(例如定量)之物質。
術語「診斷劑」係指投與個體之有助於診斷疾病、病症或病狀之物質。此類物質可用於展現、查明及/或定義疾病引發過程之位置。在某些實施例中，診斷劑包括如本文所述的抗粘附分子-4抗體或其片段，當單獨或與物質結合且投與個體或與得自個體之樣品接觸時，有助於診斷粘附分子-4介導的疾病。
術語「編碼核酸」或其文法等效物在其關於核酸分子使用時係指一種核酸分子，其處於原生狀態或藉由熟習此項技術者熟知之方法操縱時可轉錄而產生mRNA，接著轉譯成多肽及/或其片段。反義股為此類核酸分子之補體，且編碼序列可由其推導而得。
術語「賦形劑」係指一種惰性物質，其常用作稀釋劑、媒劑、防腐劑、黏合劑或穩定劑，且包括(但不限於)蛋白質(例如血清白蛋白等)、胺基酸(例如天冬胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、甘胺酸、組胺酸等)、脂肪酸及磷脂(例如磺酸烷基酯、辛酸酯等)、界面活性劑(例如SDS、聚山梨醇酯、非離子界面活性劑等)、醣類(例如蔗糖、麥芽糖、海藻糖等)，及多元醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇等)。亦參見Remington及Gennaro,Remington ' s Pharmaceutical Sciences (第18版，1990)，其以全文引用的方式併入本文。
在肽或多肽之情形下，如本文所用之術語「片段」係指包含小於全長之胺基酸序列的肽或多肽。此類片段可以來源於胺基末端之截斷、羧基末端之截斷，及/或來自胺基酸序列之殘基的內部缺失。片段可以例如來源於替代性RNA拼接或活體內蛋白酶活性。在某些實施例中，粘附分子-4片段或抗粘附分子-4抗體片段包括多肽，該等多肽包含粘附分子-4多肽或抗粘附分子-4抗體之胺基酸序列中之至少5個鄰接胺基酸殘基、至少10個鄰接胺基酸殘基、至少15個鄰接胺基酸殘基、至少20個鄰接胺基酸殘基、至少25個鄰接胺基酸殘基、至少30個鄰接胺基酸殘基、至少40個鄰接胺基酸殘基、至少50個鄰接胺基酸殘基、至少60個鄰接胺基殘基、至少70個鄰接胺基酸殘基、至少80個鄰接胺基酸殘基、至少90個鄰接胺基酸殘基、至少鄰接100個胺基酸殘基、至少125個鄰接胺基酸殘基、至少150個鄰接胺基酸殘基、至少175個鄰接胺基酸殘基、至少200個鄰接胺基酸殘基、至少225個、至少250個、至少275個、至少300個、至少325個、至少350個、至少375個、至少400個、至少425個、至少450個、至少475個、至少500個、至少525個或至少550個鄰接胺基酸殘基的胺基酸序列。在一個特定實施例中，粘附分子-4多肽或抗粘附分子-4抗體之片段保持多肽或抗體之至少1種、至少2種、至少3種或超過3種功能。
術語「約」或「大約」意謂在指定值或範圍的20%以內、15%以內、10%以內、9%以內、8%以內、7%以內、6%以內、5%以內、4%以內、3%以內、2%以內、1%以內或更小。
「投與」或「投藥」係指注射或以其他方式將如存在於體外之物質(例如如本文所述之抗粘附分子-4抗體)物理地遞送至患者之動作，諸如藉由黏膜、皮內、靜脈內、肌肉內遞送，及/或本文所述或此項技術中已知的任何其他物理學遞送方法。
在多肽之情形下，如本文所用之術語「類似物」係指一種多肽，其與粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段或抗粘附分子-4抗體具有相似或相同功能，但不一定包含粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽之片段或抗粘附分子-4抗體之相似或相同胺基酸序列，或具有粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽之片段或抗粘附分子-4抗體之相似或相同結構。具有相似胺基酸序列之多肽係指一種滿足以下中之至少一者的多肽：(a)胺基酸序列與本文所述之粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段或抗粘附分子-4抗體至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致的多肽；(b)由在嚴格條件下與編碼本文所述之粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段或抗粘附分子-4抗體(或其VH或VL區域)之核苷酸序列中之至少5個胺基酸殘基、至少10個胺基酸殘基、至少15個胺基酸殘基、至少20個胺基酸殘基、至少25個胺基酸殘基、至少30個胺基酸殘基、至少40個胺基酸殘基、至少50個胺基酸殘基、至少60個胺基殘基、至少70個胺基酸殘基、至少80個胺基酸殘基、至少90個胺基酸殘基、至少100個胺基酸殘基、至少125個胺基酸殘基或至少150個胺基酸殘基雜交之核苷酸序列編碼的多肽(參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning : A Laboratory Manual (2001)；及Maniatis等人，Molecular Cloning : A Laboratory Manual (1982))；或(c)由與編碼本文所述之粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段或抗粘附分子-4抗體(或其VH或VL區域)之核苷酸序列至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列編碼的多肽。結構與本文所述之粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段或抗粘附分子-4抗體相似的多肽係指具有與本文所述之粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段或抗粘附分子-4抗體相似之二級、三級或四級結構的多肽。多肽結構可藉由熟習此項技術者已知之方法測定，包括(但不限於) X射線結晶學、核磁共振及結晶學電子顯微法。
在多肽之情形下，如本文所用，術語「衍生物」係指包含粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段或結合至粘附分子-4多肽之抗體之胺基酸序列的多肽，其已藉由引入胺基酸殘基取代、缺失或添加而改變。如本文所用，術語「衍生物」亦指粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段，或結合至粘附分子-4多肽的抗體，其已經化學修飾，例如藉由使任何類型的分子共價連接至多肽。舉例而言，但不為了限制，粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段或抗粘附分子-4抗體可以經化學修飾，例如藉由糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護/封端基團衍生化、蛋白分解裂解、化學裂解、調配、衣黴素(tunicamycin)代謝合成、連接至細胞配位體或其他蛋白質等。可以與天然存在的或起始肽或多肽不同(在所連接之分子之類型或位置方面)的方式修飾衍生物。衍生物進一步包括天然存在於肽或多肽上之一或多個化學基團的缺失。此外，粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段或抗粘附分子-4抗體的衍生物可以含有一或多個非經典胺基酸。多肽衍生物具有與本文所述之粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段或抗粘附分子-4抗體相似或相同的功能。
術語「組合物」旨在涵蓋視情況以指定的量含有指定成分(例如本文所提供之抗體)的產物。
如本文所用，術語「預防(prevent)」、「預防(preventing)」及「預防(prevention)」係指投與本文所提供之療法或療法組合(例如預防劑或治療劑之組合，諸如本文所提供之抗體)而使粘附分子-4介導之疾病及/或與其相關之症狀之發展、復發、發作或擴散受到完全或部分抑制。
如本文所用，術語「預防劑」係指可以完全或部分抑制個體之粘附分子-4介導疾病及/或與其相關之症狀出現、復發、發作或擴散的任何藥劑。在某些實施例中，術語「預防劑」係指本文所提供之抗體。在某些其他實施例中，術語「預防劑」係指除本文所提供之抗體之外的藥劑。在一些實施例中，預防劑為已知適用於或已用於或當前正用於預防粘附分子-4介導疾病及/或與其相關之症狀或阻礙粘附分子-4介導疾病及/或與其相關之症狀發作、發展、進展及/或嚴重程度的藥劑。在一些實施例中，預防劑為完全人類抗粘附分子-4抗體，諸如完全人類抗粘附分子-4單株抗體。
在某些實施例中，「預防上有效的血清效價」為諸如人類之個體中的血清效價，其完全或部分地抑制粘附分子-4介導疾病及/或與其相關的症狀在該個體中發展、復發、發作或擴散。
「粘附分子-4介導疾病」與「粘附分子-4介導病症」在本文中可互換地使用且係指完全或部分地由粘附分子-4引起、作為粘附分子-4之結果或與粘附分子-4相關的任何疾病。在某些實施例中，粘附分子-4異常(例如高度)表現於細胞表面上。在一些實施例中，粘附分子-4在特定的細胞類型上可以受到異常地上調。在其他實施例中，正常、異常或過度的細胞信號傳導係由粘附分子-4結合至粘附分子-4配位體而引起。在一些實施例中，粘附分子-4介導疾病為其中粘附分子-4可以用作例如人類之個體中之生物標記物的疾病。在一些實施例中，粘附分子-4介導疾病為其中粘附分子-4表現可以反映例如人類之個體之疾病進展或預後的疾病。在某些實施例中，粘附分子-4配位體為粘附分子-4受體，例如表現於細胞表面上的粘附分子-4受體。
如本文所用，術語「血清效價」係指至少10位、至少20位、至少30位或至少40位個體、至多約100位、1000位或超過1000位個體之群體的平均血清效價。
如本文所用，術語「副作用」涵蓋療法(例如預防劑或治療劑)的非想要及不良作用。非想要作用不一定為不良作用。療法(預防劑或治療劑)之不良作用可能為有害的或不適的或有風險的。副作用之實例包括腹瀉、咳嗽、胃腸炎、哮喘、噁心、嘔吐、厭食、腹部痙攣、發熱、疼痛、體重減輕、脫水、禿髮症、呼吸困難、失眠、眩暈、黏膜炎、神經及肌肉作用、疲乏、口乾及食慾不振、在投藥位點處出現皮疹或腫脹、流感樣症狀(諸如發熱、發冷及疲乏)、消化道問題及過敏反應。患者經歷之其他非所需作用多種多樣且在此項技術中已知。許多描述於Physician ' s Desk Reference (第60版，2006)中。
如本文所用，術語「治療劑」係指可以用於治療、管理或改善粘附分子-4介導疾病及/或與其相關症狀的任何藥劑。在某些實施例中，術語「治療劑」係指本文所提供之抗體。在某些其他實施例中，術語「治療劑」係指除本文所提供之抗體之外的藥劑。在一些實施例中，治療劑為已知適用於或已用於或當前正用於治療、管理或改善粘附分子-4介導疾病或一或多種與其相關症狀的藥劑。
組合療法(例如使用預防劑或治療劑)比任何兩種或超過兩種之單一療法之相加作用更有效。舉例而言，預防劑及/或治療劑組合之協同作用比單獨的單一藥劑更有效且/或允許使用較低劑量的一或多種藥劑且/或使該等藥劑投與患有粘附分子-4介導疾病之個體的頻率降低。能夠使用較低劑量的預防或治療療法及/或降低該等療法的投與頻率使得與該等療法投與個體有關之毒性減小，同時不會降低該等療法在預防、管理、治療或改善粘附分子-4介導疾病方面的功效。另外，協同作用可以改良療法在預防或管理、治療或改善粘附分子-4介導疾病方面的功效。最終，組合療法(例如預防劑或治療劑)之協同作用可以避免或減少與使用任何單一療法相關之不良或非想要副作用。
在某些實施例中，「治療上有效的血清效價」為諸如人類之個體中的血清效價，其減少該個體之與粘附分子-4介導疾病有關的嚴重程度、持續時間及/或症狀。
如本文所用，術語「療法」係指可以用於預防、管理、治療及/或改善粘附分子-4介導疾病的任何方案、方法及/或藥劑。在一些實施例中，術語「療法」係指熟習此項技術者(諸如醫療人員)已知的適用於預防、管理、治療及/或改善粘附分子-4介導疾病的生物療法、支持療法及/或其他療法。
如本文所用，術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」及「治療(treating)」係指投與一或多種療法(包括(但不限於)投與一或多種預防劑或治療劑(諸如本文所提供之抗體))而引起粘附分子-4介導疾病之進展、嚴重程度及/或持續時間減少或改善。
如本文所用，術語「管理(manage)」、「管理(managing)」及「管理(management)」係指個體自療法(例如預防劑或治療劑)獲得的有益作用，其不引起與粘附分子-4相關之病狀治癒。在某些實施例中，向個體投與一或多種療法(例如預防劑或治療劑，諸如本文所述之抗體)以「管理」本文所述之病狀或病症、其一或多種症狀，從而防止該病狀或病症進展或惡化。
如本文所用，術語「預防(prevent)」、「預防(preventing)」及「預防(prevention)」係指投與本文所提供的療法或組合療法(例如預防劑或治療劑組合，諸如本發明抗體)而使得粘附分子-4介導疾病及/或與其相關症狀之發展、復發、發作或擴散被完全或部分抑制。
如本文所用，「投與」或「投藥」係指向個體或患者(例如人類)注射或以其他方式物理地遞送物質(例如本文所提供之抗粘附分子-4抗體或其抗原結合片段)的動作，諸如藉由黏膜、體表、皮內、非經腸、靜脈內、皮下、肌肉內遞送及/或本文所述或此項技術中已知之任何其他物理遞送方法。
如本文所用，術語「有效量」或「治療有效量」係指療法(例如本文所提供的抗體或醫藥組合物)之足以降低及/或改善所指定病狀、病症或疾病及/或與其相關症狀之嚴重程度及/或持續時間的量。此等術語亦涵蓋為了減少、減緩或改善所指定疾病之推進或進展，或改善所指定疾病之復發、發展或發作，及/或改良或增強另一種療法(例如，除本文所提供之抗粘附分子-4之外的療法)之預防或治療作用而必需的量。在一些實施例中，如本文所用之「有效量」亦指達成指定結果的本文所述抗體之量。
如本文所用，術語「穩定性」及「穩定」在包含免疫特異性結合至粘附分子-4抗原之抗體之液體調配物的上下文中係指調配物中之抗體在所指定的製造、製備、運輸及儲存條件下對熱及化學去摺疊、聚集、降解或片段化的抗性。本文所提供的「穩定」調配物在所指定的製造、製備、運輸及儲存條件下保持等於或超過80%、85%、90%、95%、98%、99%或99.5%之生物活性。抗體穩定性可以藉由熟習此項技術者已知之方法、依據聚集、降解或片段化的程度、相較於參考抗體來評估，該等方法包括(但不限於)還原型毛細管凝膠電泳(rCGE)、十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及HPSEC。包含免疫特異性結合至粘附分子-4抗原之抗體之調配物的總體穩定性可以使用粘附分子-4之特定抗原決定基、藉由各種免疫學分析(包括例如ELISA及放射免疫分析)加以評估。在一些例示性調配物中，抗粘附分子-4抗體可以穩定保持兩個月、四個月、六個月、八個月、十個月、一年、十八個月、兩年、三歲或更長。
如本文所用，術語「基本上不含界面活性劑」係指免疫特異性結合至粘附分子-4抗原之抗體的調配物，該調配物含有小於0.0005%、小於0.0003%或小於0.0001%的界面活性劑及/或小於0.0005%、小於0.0003%或小於0.0001%的界面活性劑。
如本文所用，術語「基本上不含鹽」係指免疫特異性結合至粘附分子-4抗原之抗體的調配物，該調配物含有小於0.0005%、小於0.0003%或小於0.0001%的無機鹽。
如本文所用，術語「無機鹽」係指不含碳的任何化合物，其經由酸式氫或酸中之一部分或全部被金屬或起類似於金屬作用之基團置換而產生且通常在生物學材料之醫藥組合物及製劑中用作張力調節化合物。最常見的無機鹽為NaCl、KCl、NaH2 PO4 等。
如本文所用，術語「界面活性劑」係指具有兩性結構之有機物質；亦即，其由具有相反溶解傾向之基團(典型地為油溶性烴鏈及水溶性離子基團)構成。界面活性劑可以根據表面活性部分之電荷分類成陰離子型、陽離子型及非離子型界面活性劑。界面活性劑在生物學材料之各種醫藥組合物及製劑中通常用作濕潤劑、乳化劑、溶解劑及分散劑。8. 組合物及其製備方法
本文提供免疫特異性結合至粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段或粘附分子-4抗原決定基的抗體。亦提供分離的核酸，其編碼免疫特異性結合至粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段或粘附分子-4抗原決定基的抗體。進一步提供包含編碼抗體之核酸的載體及宿主細胞，該等抗體免疫特異性結合至粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段或粘附分子-4抗原決定基。亦提供製備抗體的方法，該等抗體免疫特異性結合至粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段或粘附分子-4抗原決定基。
在某些實施例中，本文所提供之抗體結合至人類及/或食蟹獼猴粘附分子-4。在一個實施例中，粘附分子-4抗體結合至人類粘附分子-4。在一個實施例中，粘附分子-4抗體結合至食蟹獼猴粘附分子-4。在一個實施例中，粘附分子-4抗體結合至人類粘附分子-4與食蟹獼猴粘附分子-4。在其他實施例中，本文所提供之抗體不結合至嚙齒動物粘附分子-4。
在一些實施例中，抗粘附分子-4抗體結合至粘附分子-4之胞外域(ECD)。在某些實施例中，抗粘附分子-4抗體結合至粘附分子-4之ECD中之不同於粘附分子-4配位體結合位點的抗原決定基。
亦提供競爭性阻斷本文所提供之抗粘附分子-4抗體結合至粘附分子-4多肽的抗體。
亦提供與本文所提供之抗粘附分子-4抗體競爭結合至粘附分子-4多肽的抗體。
在一些實施例中，抗粘附分子-4抗體不阻斷粘附分子-4配位體結合至粘附分子-4多肽。
在一些實施例中，抗粘附分子-4抗體不與粘附分子-4配位體競爭結合至粘附分子-4多肽。
在某些實施例中，該抗體不抑制粘附分子-4配位體結合至粘附分子-4。
本文所提供之抗粘附分子-4抗體亦可與例如診斷劑、可偵測劑及/或藥劑結合或以重組方式融合。進一步提供包含抗粘附分子-4抗體之組合物。
本文亦提供分離之核酸分子，其編碼結合至粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段、粘附分子-4肽或粘附分子-4抗原決定基之抗粘附分子-4抗體的免疫球蛋白重鏈、輕鏈、VH區域、VL區域、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3。
進一步提供包含核酸分子的載體及宿主細胞，該等核酸分子編碼結合至粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段、粘附分子-4肽或粘附分子-4抗原決定基的抗粘附分子-4抗體。亦提供製備結合至粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段、粘附分子-4肽或粘附分子-4抗原決定基之抗體的方法。
在一個實施例中，本發明提供在本文中可以用作診斷劑的抗粘附分子-4抗體。例示性抗體包括多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體及雜結合抗體，以及具有改良之親和力或其他特性的其變異體。9. 抗粘附分子-4抗體
本文提供的抗體為(但不限於)合成抗體、單株抗體、重組產生的抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、胞內抗體、單鏈Fvs (scFv)、駱駝化抗體、Fab片段、F(ab')片段、二硫鍵連接的Fvs (sdFv)、抗個體基因型(抗Id)抗體，及上述任一者的抗原決定基結合片段。
特定言之，本文所提供之抗體包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，亦即，含有免疫特異性結合至粘附分子-4抗原之抗原結合位點的分子。本文所提供之免疫球蛋白分子可為免疫球蛋白分子之任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。在一個特定實施例中，本文所提供之抗體為IgG抗體，諸如IgG1抗體。
抗體之變異體及衍生物包括保持特異性結合至抗原決定基之能力的抗體片段。例示性片段包括Fab片段(含有抗原結合域的抗體片段，該抗體片段包含藉由二硫鍵橋接的輕鏈及一部分重鏈)；Fab' (含有單一抗結合域的抗體片段，該抗結合域包含經由鉸鏈區連接的Fab及重鏈之另一部分)；F(ab')2 (兩個Fab'分子藉由重鏈鉸鏈區中之鏈間二硫鍵連接；Fab'分子可以針對相同或不同的抗原決定基)；包含可變區的單鏈Fab鏈，亦稱為sFv (藉由10-25個胺基酸之鏈連接在一起之抗體單一輕鏈與重鏈的可變、抗原結合決定區)；二硫鍵連接的Fv，或dsFv (藉由二硫鍵連接在一起之抗體單一輕鏈與重鏈的可變、抗原結合決定區)；駱駝化VH (抗體之單一重鏈的可變、抗原結合決定區，其中VH界面處之一些一些胺基酸為天然存在之駱駝抗體之重鏈中所發現的彼等胺基酸；雙功能抗體(當第一sFv之VH域與第二sFv之VL域一起組裝且第一sFv之VL域與第二sFv之VH域一起組裝時所形成的二聚sFv；雙功能抗體之兩個抗原結合區可以針對相同或不同的抗原決定基)；及三功能抗體(三聚sFv，其形成方式類似於雙功能抗體，但其中三個抗原結合域係以單一複合物產生；三個抗原結合域可以針對相同或不同的抗原決定基)。抗體衍生物亦包括抗體組合位點之一或多個CDR序列。當存在兩個或超過兩個CDR序列時，CDR序列可在支架上連接在一起。在某些實施例中，本文所提供之抗體包含單鏈Fv (「scFv」)。scFvs為包含抗體VH及VL域之抗體片段，其中此等域存在於單一多肽鏈中。通常，scFv多肽進一步包含介於VH與VL域之間的多肽連接子，其使得scFv能夠形成用於抗原結合的所需結構。關於scFvs之評述，參見Pluckthun於The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , 第113卷, Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag, New York, 第269-315頁(1994)。
本文所提供之抗體可以來自任何動物來源，包括鳥類及哺乳動物(例如人類、鼠類、驢、綿羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞肉)。在某些實施例中，本文所提供之抗體為人類或人類化單株抗體。如本文所用，「人類」抗體包括具有人類免疫球蛋白之胺基酸序列的抗體且包括自人類免疫球蛋白文庫或自表現來自人類基因之抗體之小鼠中分離出的抗體。
在某些實施例中，抗體為完全人類抗體，諸如免疫特異性結合粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段或粘附分子-4抗原決定基的完全人類抗體。此類完全人類抗體優於完全小鼠抗體(或其他完全或部分非人類物種抗體)、人類化抗體或嵌合抗體，以便在投與個體時使非想要或非所需副作用(諸如針對非完全人類抗體(例如來源於其他物種之抗粘附分子-4抗體)的免疫反應)之發展最小化。
在一個實施例中，本文所提供之抗體可以包括具有兩種抗體或其抗原結合片段的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中之每一者針對粘附分子-4上之不同抗原決定基。
在一些實施例中，本文所提供之抗體對於粘附分子-4多肽之指定抗原決定基具有單特異性且不會免疫特異性結合至其他抗原決定基。
在一些實施例中，本文提供結合至粘附分子-4 (包括粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段、粘附分子-4肽或粘附分子-4抗原決定基)的抗體。在一個實施例中，本文所提供之抗體結合至人類粘附分子-4。在另一個實施例中，本文所提供之抗體結合至食蟹獼猴粘附分子-4。在另一個實施例中，本文所提供之抗體結合至人類粘附分子-4及食蟹獼猴粘附分子-4。在一些實施例中，抗粘附分子-4抗體不阻斷粘附分子-4配位體結合至粘附分子-4多肽。在其他實施例中，抗粘附分子-4抗體為人類化抗體(例如包含人類恆定區)，其結合粘附分子-4，包括粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段、粘附分子-4肽或粘附分子-4抗原決定基。
在一個實施例中，包含抗體之組合物中的抗體及使用本文所提供之抗體的方法包括M22-321b41.1抗體。本文亦提供產生M22-321b41.1抗體的融合瘤。在一些實施例中，M22-321b41.1抗體係由M22-321b41.1融合瘤細胞株產生。在一些實施例中，M22-321b41.1抗體具有鼠類IgG2a/κ同型。
M22-321b41.1為小鼠來源的融合瘤細胞株。M22-321b41.1融合瘤細胞株於2017年6月13日寄存(ATCC寄存編號PTA-124245)。
在某些實施例中，抗粘附分子-4抗體包含本文所述之鼠類單株抗體的VH區域、VL區域、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3，諸如表 1 中所描繪之胺基酸序列。因此，在一些實施例中，本文所提供的經分離之抗體或其功能片段包含來自抗粘附分子-4抗體M22-321b41.1之一個、兩個及/或三個重鏈CDR及/或一個、兩個及/或三個輕鏈CDR。表 1 ： 抗體 M22 - 321b41 . 1 CDR 序列
在一些實施例中，本文所提供之抗體包含或其組成為六個CDR，例如表 1 中所標識之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3。在一些實施例中，本文所提供之抗體可以包含少於六個CDR。在一些實施例中，抗體包含或其組成為一個、兩個、三個、四個或五個選自由以下組成之群的CDR：表 1 中所標識之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3。在一些實施例中，抗體包含或其組成為一個、兩個、三個、四個或五個選自由以下組成之群的CDR：單株抗體M22-321b41.1之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3。
在一些實施例中，本文所提供之抗體包含表 1 中所列出之一或多個(例如一個、兩個或三個) VH CDR。在其他實施例中，本文所提供之抗體包含表 1 中所列出之一或多個(例如一個、兩個或三個) VL CDR。在又其他實施例中，本文所提供之抗體包含表 1 中所列出之一或多個(例如一個、兩個或三個) VH CDR及表 1 中所列出之一或多個VL CDR。因此，在一些實施例中，抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR1：Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO: 15)、Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO: 16)、接觸VH CDR1 (SEQ ID NO: 17)及例示性VH CDR1 (SEQ ID NO: 14)。在一些實施例中，抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR2：Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO: 19)、Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO: 20)、接觸VH CDR2 (SEQ ID NO: 21)，及例示性VH CDR2 (SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR3：Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、接觸VH CDR3 (SEQ ID NO: 24)及例示性VH CDR3 (SEQ ID NO: 22)。在一些實施例中，抗體包含VH CDR1及/或VH CDR2及/或VH CDR3，其獨立地選自如表 1 中描繪之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3胺基酸序列中的任一者。在一些實施例中，抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR1：Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、接觸VL CDR1 (SEQ ID NO: 8)，及例示性VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)。在另一個實施例中，抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR2：Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、接觸VL CDR2 (SEQ ID NO: 11)，及例示性VL CDR2 (SEQ ID NO: 9)。在一些實施例中，抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR3：Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、接觸VL CDR3 (SEQ ID NO: 13)，及例示性VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)。在一些實施例中，抗體包含VL CDR1及/或VL CDR2及/或VL CDR3，其獨立地選自表 1 中所描繪之VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3胺基酸序列中的任一者。
在某些實施例中，本文所提供之抗體包含VH區域，其包含：(1)具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR1：Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO: 15)、Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO: 16)、接觸VH CDR1 (SEQ ID NO: 17)，及例示性VH CDR1 (SEQ ID NO: 14)，(2)具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR2：Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO: 19)、Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO: 20)、接觸VH CDR2 (SEQ ID NO: 21)，及例示性VH CDR2 (SEQ ID NO: 18)，及(3)具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR3：Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、接觸VH CDR3 (SEQ ID NO: 24)，及例示性VH CDR3 (SEQ ID NO: 22)；以及VL區域，其包含：(1)具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR1：Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、接觸VL CDR1 (SEQ ID NO: 8)及例示性VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)，(2)具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR2：Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、接觸VL CDR2 (SEQ ID NO: 11)及例示性VL CDR2 (SEQ ID NO: 9)，及(3)具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR3：Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、接觸VL CDR3 (SEQ ID NO: 13)及例示性VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，本文所提供之抗體包含VH區域，其包含：(1)具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR1：Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO: 15)、Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO: 16)、接觸VH CDR1 (SEQ ID NO: 17)及例示性VH CDR1 (SEQ ID NO: 14)；(2)具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR2：Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO: 19)、Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO: 20)、接觸VH CDR2 (SEQ ID NO: 21)及例示性VH CDR2 (SEQ ID NO: 18)；及(3)具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR3：Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、接觸VH CDR3 (SEQ ID NO: 24)及例示性VH CDR3 (SEQ ID NO: 22)。
在其他實施例中，本文所提供之抗體包含VL區域，其包含：(1)具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR1：Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、接觸VL CDR1 (SEQ ID NO: 8)及例示性VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)；(2)具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR2：Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、接觸VL CDR2 (SEQ ID NO: 11)及例示性VL CDR2 (SEQ ID NO: 9)；及(3)具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR3：Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、接觸VL CDR3(SEQ ID NO: 13)及例示性VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)。
本文亦提供包含表 1 中所列出之一或多個(例如一個、兩個或三個) VH CDR及一或多個(例如一個、兩個或三個) VL CDR的抗體。特定言之，本文中提供一種抗體，其包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR1：Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO: 15)、Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO: 16)、接觸VH CDR1 (SEQ ID NO: 17)及例示性VH CDR1 (SEQ ID NO: 14)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR1：Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、接觸VL CDR1 (SEQ ID NO: 8)及例示性VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)。在一個實施例中，該抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR1：Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO: 15)、Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO: 16)、接觸VH CDR1 (SEQ ID NO: 17)及例示性VH CDR1 (SEQ ID NO: 14)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR2：Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、接觸VL CDR2 (SEQ ID NO: 11)及例示性VL CDR2 (SEQ ID NO: 9)。在其他實施例中，該抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR1：Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO: 15)、Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO: 16)、接觸VH CDR1 (SEQ ID NO: 17)及例示性VH CDR1 (SEQ ID NO: 14)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR3：Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、接觸VL CDR3 (SEQ ID NO: 13)及例示性VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)。在另一個實施例中，該抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR2：Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO: 19)、Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO: 20)、接觸VH CDR2 (SEQ ID NO: 21)及例示性VH CDR2 (SEQ ID NO: 18)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR1：Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、接觸VL CDR1 (SEQ ID NO: 8)及例示性VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)。在一些實施例中，抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR2：Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO: 19)、Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO: 20)、接觸VH CDR2 (SEQ ID NO: 21)及例示性VH CDR2 (SEQ ID NO: 18)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR2：Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、接觸VL CDR2 (SEQ ID NO: 11)及例示性VL CDR2 (SEQ ID NO: 9)。在一個實施例中，該抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR2：Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO: 19)、Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO: 20)、接觸VH CDR2 (SEQ ID NO: 21)及例示性VH CDR2 (SEQ ID NO: 18)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR3：Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、接觸VL CDR3 (SEQ ID NO: 13)及例示性VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)。在另一個實施例中，抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR3：Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、接觸VH CDR3 (SEQ ID NO: 24)及例示性VH CDR3 (SEQ ID NO: 22)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR1：Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、接觸VL CDR1 (SEQ ID NO: 8)及例示性VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)。在其他實施例中，該抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR3：Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、接觸VH CDR3 (SEQ ID NO: 24)及例示性VH CDR3 (SEQ ID NO: 22)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR2：Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、接觸VL CDR2 (SEQ ID NO: 11)及例示性VL CDR2 (SEQ ID NO: 9)。在一些實施例中，該抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR3：Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、接觸VH CDR3 (SEQ ID NO: 24)及例示性VH CDR3 (SEQ ID NO: 22)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR3：Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、接觸VL CDR3 (SEQ ID NO: 13)及例示性VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)。在另一個實施例中，該抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR1：Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO: 15)、Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO: 16)、接觸VH CDR1 (SEQ ID NO: 17)及例示性VH CDR1 (SEQ ID NO: 14)；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR2：Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO: 19)、Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO: 20)、接觸VH CDR2 (SEQ ID NO: 21)及例示性VH CDR2 (SEQ ID NO: 18)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR1：Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、接觸VL CDR1 (SEQ ID NO: 8)及例示性VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)。在一個實施例中，該抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR1：Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO: 15)、Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO: 16)、接觸VH CDR1 (SEQ ID NO: 17)及例示性VH CDR1 (SEQ ID NO: 14)；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR2：Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO: 19)、Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO: 20)、接觸VH CDR2 (SEQ ID NO: 21)及例示性VH CDR2 (SEQ ID NO: 18)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR2：Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、接觸VL CDR2 (SEQ ID NO: 11)及例示性VL CDR2 (SEQ ID NO: 9)。在其他實施例中，該抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR1：Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO: 15)、Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO: 16)、接觸VH CDR1 (SEQ ID NO: 17)及例示性VH CDR1 (SEQ ID NO: 14)；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR2：Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO: 19)、Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO: 20)、接觸VH CDR2 (SEQ ID NO: 21)及例示性VH CDR2 (SEQ ID NO: 18)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR3：Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、接觸VL CDR3 (SEQ ID NO: 13)及例示性VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)。在另一個實施例中，該抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR2：Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO: 19)、Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO: 20)、接觸VH CDR2 (SEQ ID NO: 21)及例示性VH CDR2 (SEQ ID NO: 18)；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR3：Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、接觸VH CDR3 (SEQ ID NO: 24)及例示性VH CDR3 (SEQ ID NO: 22)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR1：Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、接觸VL CDR1 (SEQ ID NO: 8)及例示性VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)。在一個實施例中，該抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR2：Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO: 19)、Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO: 20)、接觸VH CDR2 (SEQ ID NO: 21)及例示性VH CDR2 (SEQ ID NO: 18)；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR3：Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、接觸VH CDR3 (SEQ ID NO: 24)及例示性VH CDR3 (SEQ ID NO: 22)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR2：Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、接觸VL CDR2 (SEQ ID NO: 11)及例示性VL CDR2 (SEQ ID NO: 9)。在一個實施例中，該抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR2：Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO: 19)、Chothia VH CDR2 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21)及例示性VH CDR2 (SEQ ID NO: 18)；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR1：Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、接觸VL CDR1 (SEQ ID NO: 8)及例示性VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR2：Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、接觸VL CDR2 (SEQ ID NO: 11)及例示性VL CDR2 (SEQ ID NO: 9)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR3：Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、接觸VL CDR3 (SEQ ID NO: 13)及例示性VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)。在其他實施例中，該抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR1：Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO: 15)、Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO: 16)、接觸VH CDR1 (SEQ ID NO: 17)及例示性VH CDR1 (SEQ ID NO: 14)；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR3：Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、接觸VH CDR3 (SEQ ID NO: 24)及例示性VH CDR3 (SEQ ID NO: 22)；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR1：Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、接觸VL CDR1 (SEQ ID NO: 8)及例示性VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR2：Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、接觸VL CDR2 (SEQ ID NO: 11)及例示性VL CDR2 (SEQ ID NO: 9)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR3：Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、接觸VL CDR3 (SEQ ID NO: 13)及例示性VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)。在一些實施例中，該抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR2：Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO: 19)、Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO: 20)、接觸VH CDR2 (SEQ ID NO: 21)及例示性VH CDR2 (SEQ ID NO: 18)；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR3：Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、接觸VH CDR3 (SEQ ID NO: 24)及例示性VH CDR3 (SEQ ID NO: 22)；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR1：Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、接觸VL CDR1 (SEQ ID NO: 8)及例示性VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR2：Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、接觸VL CDR2 (SEQ ID NO: 11)及例示性VL CDR2 (SEQ ID NO: 9)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR3：Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、接觸VL CDR3 (SEQ ID NO: 13)及例示性VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)。在另一個實施例中，該抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR1：Kabat VH CDR1 (SEQ ID NO: 15)、Chothia VH CDR1 (SEQ ID NO: 16)、接觸VH CDR1 (SEQ ID NO: 17)及例示性VH CDR1 (SEQ ID NO: 14)；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR1：Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、接觸VL CDR1 (SEQ ID NO: 8)及例示性VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR2：Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、接觸VL CDR2 (SEQ ID NO: 11)及例示性VL CDR2 (SEQ ID NO: 9)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR3：Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、接觸VL CDR3 (SEQ ID NO: 13)及例示性VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)。在一個實施例中，該抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR2：Kabat VH CDR2 (SEQ ID NO: 19)、Chothia VH CDR2 (SEQ ID NO: 20)、接觸VH CDR2 (SEQ ID NO: 21)及例示性VH CDR2 (SEQ ID NO: 18)；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR1：Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、接觸VL CDR1 (SEQ ID NO: 8)及例示性VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR2：Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、接觸VL CDR2 (SEQ ID NO: 11)及例示性VL CDR2 (SEQ ID NO: 9)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR3：Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、接觸VL CDR3 (SEQ ID NO: 13)及例示性VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)。在其他實施例中，該抗體包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VH CDR3：Kabat VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、Chothia VH CDR3 (SEQ ID NO: 23)、接觸VH CDR3 (SEQ ID NO: 24)及例示性VH CDR3 (SEQ ID NO: 22)；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR1：Kabat VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、Chothia VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)、接觸VL CDR1 (SEQ ID NO: 8)及例示性VL CDR1 (SEQ ID NO: 7)；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR2：Kabat VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、Chothia VL CDR2 (SEQ ID NO: 10)、接觸VL CDR2 (SEQ ID NO: 11)及例示性VL CDR2 (SEQ ID NO: 9)；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的VL CDR3：Kabat VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、Chothia VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)、接觸VL CDR3 (SEQ ID NO: 13)及例示性VL CDR3 (SEQ ID NO: 12)。在另一個實施例中，抗體包含表 1 中所列之VH CDR與VL CDR的任何組合。
基於CDR編號系統之邊界來確定本文所述之構架區。換而言之，若根據例如Kabat、IMGT或Chothia確定CDR，則構架區為可變區中圍繞CDR的胺基酸殘基，其格式自N末端至C末端為：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。舉例而言，FR1定義為如藉由例如Kabat編號系統、IMGT編號系統或Chothia編號系統所定義之CDR1胺基酸殘基之N末端的胺基酸殘基，FR2定義為如藉由例如Kabat編號系統、IMGT編號系統或Chothia編號系統所定義之CDR1與CDR2胺基酸殘基之間的胺基酸殘基，FR3定義為如藉由例如Kabat編號系統、IMGT編號系統或Chothia編號系統所定義之CDR2與CDR3胺基酸殘基之間的胺基酸殘基，且FR4定義為如藉由例如Kabat編號系統、IMGT編號系統或Chothia編號系統所定義之CDR3胺基酸殘基之C末端的胺基酸殘基。
在一些實施例中，本文所提供的經分離之抗體或其功能片段進一步包含抗體M22-321b41.1的一個、兩個、三個及/或四個重鏈FR及/或一個、兩個、三個及/或四個輕鏈FR，如表 2 所示。 表2. M22-321b41.1 VL及VH FR胺基酸序列
在某些實施例中，本文所提供的經分離之抗體或其功能片段進一步包含來自抗體M22-321b41.1的一個、兩個、三個及/或四個重鏈FR，如表 2 所示。在一些實施例中，抗體重鏈FR來自抗體M22-321b41.1。
在一些實施例中，本文所提供的經分離之抗體或其功能片段進一步包含來自抗體M22-321b41.1的一個、兩個、三個及/或四個輕鏈FR，如表 2 所示。在一些實施例中，抗體輕鏈FR來自抗體M22-321b41.1。
在某些實施例中，本文所述之抗體或其片段包含VH區域，該VH區域包含：(1)具有SEQ ID NO: 29胺基酸的VH FR1；(2)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 30的VH FR2；(3)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 31的VH FR3；及/或(4)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 32的VH FR4。在特定實施例中，該抗體包含VH區域，該VH區域包含上文提及之VH FR1、VH FR2、VH FR3及VH FR4中的所有四者。
因此，在一個實施例中，人類化抗體包含包括胺基酸序列為SEQ ID NO: 29之VH FR1的VH區域。在一些實施例中，人類化抗體包含包括胺基酸序列為SEQ ID NO: 30之VH FR2的VH區域。在一個實施例中，人類化抗體包含包括胺基酸序列為SEQ ID NO: 31之VH FR3的VH區域。在其他實施例中，人類化抗體包含包括胺基酸序列為SEQ ID NO: 32之VH FR4的VH區域。
在一些實施例中，VL區域包含：(1)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 25的VL FR1；(2)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 26的VL FR2；(3)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 27的VL FR3；及/或(4)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 28的VL FR4。
因此，在一些實施例中，人類化抗體包含包括胺基酸序列為SEQ ID NO: 25之VL FR1的VL區域。在某些實施例中，人類化抗體包含包括胺基酸序列為SEQ ID NO: 26之VL FR2的VL區域。在一個實施例中，人類化抗體包含包括胺基酸序列為SEQ ID NO: 27之VL FR3的VL區域。在又其他實施例中，人類化抗體包含包括胺基酸序列為SEQ ID NO: 28之VL FR4的VL區域。
在一些實施例中，抗體或其片段包含VH區域及VL區域，其中該VH區域包含：(1)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 29的VH FR1；(2)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 30的VH FR2；(3)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 31的VH FR3；及/或(4)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 32的VH FR4；且其中該VL區域包含：(1)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 25的VL FR1；(2)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 26的VL FR2；(3)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 27的VL FR3；及/或(4)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 28的VL FR4。在一些實施例中，該抗體包含VH區域，該VH區域包含上文提及之VH FR1、VH FR2、VH FR3及VH FR4中的所有四者。在其他實施例中，該抗體包含VL區域，該VL區域包含上文提及之VL FR1、VL FR2、VL FR3及VL FR4中的所有四者。在又其他實施例中，該抗體包含含有上文提及之VH FR1、VH FR2、VH FR3及VH FR4中之所有四者的VH區域，及含有上文提及之VL FR1、VL FR2、VL FR3及VL FR4中之所有四者的VL區域。
本文亦提供包含表 2 中所列之一或多個(例如一個、二個、三個或四個) VH FR及一或多個(例如一個、二個、三個或四個) VL FR的抗體。特定言之，本文中提供一種包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)及VL FR1 (SEQ ID NO: 25)的抗體。在一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)及VL FR2 (SEQ ID NO: 26)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在其他實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)及VL FR1 (SEQ ID NO: 25)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)及VL FR2 (SEQ ID NO: 26)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR3 (SEQ ID NO: 31)及VL FR1 (SEQ ID NO: 25)。在其他實施例中，該抗體包含VH FR3 (SEQ ID NO: 31)及VL FR2 (SEQ ID NO: 26)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR3 (SEQ ID NO: 31)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR3 (SEQ ID NO: 31)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR4 (SEQ ID NO: 32)及VL FR1 (SEQ ID NO: 25)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR4 (SEQ ID NO: 32)及VL FR2 (SEQ ID NO: 26)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR4 (SEQ ID NO: 32)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR4 (SEQ ID NO: 32)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)及VL FR1 (SEQ ID NO: 25)。在其他實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)及VL FR2 (SEQ ID NO: 26)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)及VL FR1 (SEQ ID NO: 25)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)及VL FR2 (SEQ ID NO: 26)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在其他實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)及VL FR2 (SEQ ID NO: 26)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在其他實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)及VL FR2 (SEQ ID NO: 26)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)及VL FR2 (SEQ ID NO: 26)。在其他實施例中，抗體包含VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR2 (SEQ ID NO: 26)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)及VL FR2 (SEQ ID NO: 26)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在其他實施例中，該抗體包含VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)及VL FR1 (SEQ ID NO: 25)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)及VL FR2 (SEQ ID NO: 26)。在其他實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)及VL FR1 (SEQ ID NO: 25)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)及VL FR2 (SEQ ID NO: 26)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)及VL FR1 (SEQ ID NO: 25)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)及VL FR2 (SEQ ID NO: 26)。在其他實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)及VL FR1 (SEQ ID NO: 25)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)及VL FR2 (SEQ ID NO: 26)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在其他實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR1 (SEQ ID NO: 25)及VL FR2 (SEQ ID NO: 26)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR1 (SEQ ID NO: 25)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一些實施例中，該抗體包含VH 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(SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在其他實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)及VL FR2 (SEQ ID NO: 26)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在其他實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID 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FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在其他實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在其他實施例中，該抗體包含VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)及VL FR3 (SEQ ID NO: 27)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在另一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一些實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR1 (SEQ ID NO: 29)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一個實施例中，該抗體包含VH FR2 (SEQ ID NO: 30)、VH FR3 (SEQ ID NO: 31)、VH FR4 (SEQ ID NO: 32)、VL FR1 (SEQ ID NO: 25)、VL FR2 (SEQ ID NO: 26)、VL FR3 (SEQ ID NO: 27)及VL FR4 (SEQ ID NO: 28)。在一些實施例中，該抗體包含表 2 中所列之VH FR (SEQ ID NO: 29-32)與VL FR (SEQ ID NO: 25-28)的任何組合。
在一些實施例中，本文所提供之抗體包含VH區或VH域。在其他實施例中，本文所提供之抗體包含VL區或VL鏈。在一些實施例中，本文所提供之抗體具有(i) VH域或VH區；及/或(ii) VL域或VL區的組合。在又其他實施例中，本文所提供之抗體具有(i) VH域或VH區；及/或(ii) VL域或VL區之組合，其選自由表 1 中所述之SEQ ID NO: 3及4組成之群。
在某些實施例中，本文所提供之抗體包含VH區域，其包含：(1)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 15的VH CDR1、(2)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 19的VH CDR2；及(3)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 23的VH CDR3；及VL區域，其選自由表 1 中所述之SEQ ID NO: 3組成之群。
在其他實施例中，本文所提供之抗體包含VH區域，其選自由表 1 中所述之SEQ ID NO: 4組成之群；及VL區域，其包含：(1)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 7的VL CDR1、(2)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 10的VL CDR2及(3)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 12的VL CDR3。
本文亦提供分離之核酸分子，其編碼結合至粘附分子-4多肽、粘附分子-4多肽片段、粘附分子-4肽或粘附分子-4抗原決定基之抗粘附分子-4抗體的免疫球蛋白重鏈、輕鏈、VH區域、VL區域、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3。抗體M22-321b41.1之VL區域、輕鏈、VH區域及重鏈的例示性核酸序列展示於表 3 - 4 中。 表3. VL核酸序列 表4. VH核酸序列
在一些實施例中，本文所提供之抗體具有抗體M22-321b41.1之VH及VL胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含VH胺基酸序列SEQ ID NO: 4，及VL胺基酸序列SEQ ID NO: 3。
在某些實施例中，特異性結合至粘附分子-4多肽(例如粘附分子-4之ECD，例如人類粘附分子-4)之本文所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含胺基酸序列為GASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEY ERHNSYTCEATHKTSTSPIVKTFNRNEC (SEQ ID NO: 33)的恆定區。
在某些實施例中，特異性結合至粘附分子-4多肽(例如粘附分子-4之ECD，例如人類粘附分子-4)的本文所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈及重鏈，其中該重鏈包含具有以下胺基酸序列的恆定區：
在其他實施例中，特異性結合至粘附分子-4多肽(例如粘附分子-4之ECD，例如人類粘附分子-4)的本文所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈及重鏈，其中該重鏈包含具有以下胺基酸序列的人類IgG1 Fc區：
在一些實施例中，特異性結合至粘附分子-4多肽(例如粘附分子-4之ECD，例如人類粘附分子-4)的本文所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈及重鏈，其中該重鏈不包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 35的人類IgG1 Fc區。
在再另一個實施例中，特異性結合至粘附分子-4多肽(例如粘附分子-4之ECD，例如人類粘附分子-4)的本文所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 33的恆定區；且該重鏈包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 35的Fc區。
在某些實施例中，特異性結合至粘附分子-4多肽(例如粘附分子-4之ECD，例如人類粘附分子-4)的本文所述抗體包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含如下胺基酸序列：
在一些實施例中，特異性結合至粘附分子-4多肽(例如粘附分子-4之ECD，例如人類粘附分子-4)的本文所述抗體包含輕鏈及重鏈，其中該重鏈包含如下胺基酸序列：
在一個特定實施例中，特異性結合至粘附分子-4多肽(例如粘附分子-4之ECD，例如人類粘附分子-4)的本文所述抗體包含輕鏈及重鏈，其中(i)該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO: 5；且(ii)該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO: 6。
在又另一個態樣中，提供與例示抗體或功能片段中之一者競爭結合至粘附分子-4的抗體。此類抗體亦可與本文中例示之一種抗體結合至相同抗原決定基或重疊抗原決定基。預期與例示抗體競爭或結合至相同抗原決定基之抗體及片段會展示類似功能特性。例示抗原結合蛋白及片段包括具有本文中提供之VH及VL區以及CDR (包括表 1 中之VH及VL區以及CDR)的抗原結合蛋白及片段。因此，作為一個特定實例，所提供之抗體包括與包含以下之抗體競爭的抗體：(a)關於表 1 中所列抗體所列的CDR中之1、2、3、4、5個或所有6個；(b) VH及VL，其選自關於表 1 中所列抗體所列的VH及VL區；或(c)兩條輕鏈及兩條重鏈，其包含如關於表 1 中所列抗體指定之VH及VL。在一些實施例中，抗體為抗體M22-321b41.1。
在某些實施例中，本文所述之抗體或其抗原結合片段包含相對於抗體M22-321b41.1具有一定一致性百分比的胺基酸序列。
確定兩個序列(例如胺基酸序列或核酸序列)之間的一致性百分比可以使用數學算法來完成。用於比較兩個序列之數學算法的較佳非限制性實例為Karlin及Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268之算法，如Karlin及Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877中所修改。此類算法係經併入Altschul等人，1990, J. Mol. Biol. 215:403之NBLAST及XBLAST程式中。可利用NBLAST核苷酸程式參數集(例如對於分數=100而言，字長=12)進行BLAST核苷酸搜尋，以獲得與本文所述之核酸分子同源的核苷酸序列。可利用XBLAST程式參數集(例如對分數50而言，字長=3)進行BLAST蛋白質搜尋，以獲得與本文所述之蛋白質分子同源的胺基酸序列。為使空位比對達成比較目的，可使用如Altschul等人，1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402中所述之空位BLAST。或者，可使用PSI BLAST以進行迭代搜尋，其可偵測分子間之遠距離關係(同上)。當利用BLAST、空位BLAST及PSI Blast程式時，可使用相應程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數(參見例如全球資訊網上之國家生物技術資訊中心(NCBI)，ncbi.nlm.nih.gov)。用於比較序列之數學算法的另一個較佳非限制實例為Myers及Miller, 1988, CABIOS 4:11 17之算法。此類算法係併入ALIGN程式(2.0版)中，該ALIGN程式為GCG序列比對套裝軟體之一部分。當利用ALIGN程式來比較胺基酸序列時，可使用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4。
兩個序列之間的一致性百分比可在允許有空位或不允許有空位的情況下，使用與上文所述類似的技術來判定。在計算一致性百分比時，通常地僅計數精確匹配。
在某些實施例中，本文所述之抗體或其抗原結合片段包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 3具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性的VL域，其中該抗體免疫特異性結合至粘附分子-4。在某些實施例中，本文所述之抗體或其抗原結合片段包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 3具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性的VL域，其中該抗體免疫特異性結合至粘附分子-4，且其中該抗體包含與抗體M22-321b41.1之CDR (例如VL CDR 1-3)一致的CDR (例如VL CDR 1-3)。
在某些實施例中，本文所述之抗體或其抗原結合片段包含其中VL構架區與SEQ ID NO: 3之構架區之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性的VL域，其中該抗體免疫特異性結合至粘附分子-4。在一個特定實施例中，該抗體包含與抗體M22-321b41.1之VL CDR一致的VL CDR。
在某些實施例中，本文所述之抗體或其抗原結合片段包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 4具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性的VH域，其中該抗體免疫特異性結合至粘附分子-4。在某些實施例中，本文所述之抗體或其抗原結合片段包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 4具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性的VH域，其中該抗體免疫特異性結合至粘附分子-4，且其中該抗體包含與抗體M22-321b41.1之CDR (例如VH CDR 1-3)一致的CDR (例如VH CDR 1-3)。
在某些實施例中，本文所述之抗體或其抗原結合片段包含其中VH構架區與SEQ ID NO: 4之構架區之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性的VH域，其中該抗體免疫特異性結合至粘附分子-4。在特定實施例中，此類抗體包含與抗體M22-321b41.1之CDR (例如VH CDR 1-3)一致的CDR (例如VH CDR 1-3)。
在某些實施例中，本文所述之抗體或其抗原結合片段分別包含(i) VL域，其與胺基酸序列SEQ ID NO: 3具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性；及(ii) VH域，其與胺基酸序列SEQ ID NO: 4具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性，其中該抗體免疫特異性結合至粘附分子-4。在特定實施例中，此類抗體或其抗原結合片段包含與抗體M22-321b41.1之CDR (例如VL CDR 1-3及/或VH CDR 1-3)一致的CDR (例如VL CDR 1-3及/或VH CDR 1-3)。
在另一態樣中，本文所提供的抗體或其抗原結合片段結合至人類粘附分子-4之區域，包括抗原決定基。舉例而言，在一些實施例中，本文所提供之抗體結合至包含人類粘附分子-4之胺基酸殘基31-346 (SEQ ID NO: 2)之人類粘附分子-4 (SEQ ID NO: 1)區域、包含人類粘附分子-4之胺基酸殘基1-150 (SEQ ID NO: 45)之人類粘附分子-4(SEQ ID NO: 1)區域，或包含人類粘附分子-4之胺基酸殘基31-150 (SEQ ID NO: 46)之人類粘附分子-4 (SEQ ID NO: 1)區域。在另一態樣中，本文所提供之抗體結合至人類粘附分子-4之特定抗原決定基。人類粘附分子-4 (SEQ ID NO: 1)之胺基酸殘基31-346的胺基酸序列為：AGELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRD SQVTVDVLDPQEDSGKQVDLV (SEQ ID NO:2)。人類粘附分子-4 (SEQ ID NO: 1)之胺基酸殘基1-150的胺基酸序列為：MPLSLGAEMWGPEAWLLLLLLLASFTGRCPAGELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPL (SEQ ID NO:45)。人類粘附分子-4 (SEQ ID NO: 1)之胺基酸殘基31-150的胺基酸序列為：AGELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVL VPPL (SEQ ID NO:46)。
在一些實施例中，本文所提供之抗體結合至粘附分子-4抗原決定基，該抗原決定基為粘附分子-4多肽的三維表面特徵(例如粘附分子-4多肽之多聚體形式)。促成抗原決定基之粘附分子-4多肽區域可為多肽之相鄰胺基酸，或抗原決定基可自多肽之兩個或超過兩個非相鄰區域聚集在一起。粘附分子-4抗原決定基可以如下形式存在：(a)粘附分子-4之多聚體形式(「多聚體粘附分子-4抗原決定基」)，(b)粘附分子-4之單體形式(「單體粘附分子-4抗原決定基」)，(c)粘附分子-4之多聚體形式與單體形式，(d)粘附分子-4之多聚體形式、而非單體形式，或(e)粘附分子-4之單體形式、而非多聚體形式。舉例而言，在一些實施例中，抗原決定基僅為了以多聚體(原生)形式結合而存在或被利用，而非為了以單體(變性)形式供抗粘附分子-4抗體結合而存在或被利用。在其他實施例中，粘附分子-4抗原決定基具有粘附分子-4多肽的線性特徵(例如粘附分子-4多肽之多聚體形式或單體形式)。本文所提供之抗體可以免疫特異性結合至(a)單體形式之粘附分子-4的抗原決定基，(b)多聚體形式之粘附分子-4的抗原決定基，(c)單體、而非多聚體形式之粘附分子-4的抗原決定基，(d)多聚體、而非單體形式之粘附分子-4的抗原決定基，或(e)單體形式與多聚體形式的粘附分子-4。
本文亦提供與本文所述之抗體M22-321b41.1結合粘附分子-4之相同或重疊抗原決定基(例如位於人類粘附分子-4之ECD中的抗原決定基)的抗體，例如與本文所述之抗體M22-321b41.1競爭(例如以劑量依賴型方式)結合至粘附分子-4 (例如人類粘附分子-4之ECD)的抗體，或競爭性地抑制(例如以劑量依賴型方式)本文所述之抗體M22-321b41.1結合至粘附分子-4 (例如位於人類粘附分子-4之ECD上的抗原決定基)的抗體。
在一個特定態樣中，本文亦提供與抗體M22-321b41.1結合粘附分子-4之相同或重疊抗原決定基(例如位於人類粘附分子-4之ECD中的抗原決定基)的抗體。
可以使用常規技術(諸如本文呈現之實例中所用的彼等技術)鑑別結合至粘附分子-4之相同或重疊抗原決定基(例如位於人類粘附分子-4之ECD中的抗原決定基)的抗體。免疫分析，例如用於證明抗體阻斷另一抗體結合至靶抗原之能力的免疫分析，亦即，競爭性結合分析。競爭結合分析亦可用於確定兩種抗體是否具有針對一種抗原決定基之相似結合特異性。競爭性結合可以在受測試之免疫球蛋白抑制參考抗體特異性結合至諸如粘附分子-4之常見抗原的分析中加以測定。已知多種類型的競爭性結合分析，例如：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(參見Stahli等人，(1983) Methods in Enzymology 9:242)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (參見Kirkland等人，(1986) J. Immunol. 137:3614)；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(參見Harlow及Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)；使用I-125標記的固相直接標記RIA (參見Morel等人，(1988) Mol. Immunol. 25(1):7)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (Cheung等人，(1990) Virology 176:546)；及直接標記RIA. (Moldenhauer等人，(1990) Scand. J. Immunol. 32:77)。典型地，此類分析涉及使用與固體表面或細胞結合的純化抗原(例如粘附分子-4，諸如人類粘附分子-4之ECD)，該固體表面或細胞帶有此等未標記之測試免疫球蛋白及經標記之參考免疫球蛋白中之任一者。競爭性抑制可以藉由在測試免疫球蛋白存在下測定與固體表面或細胞結合之標記的量來量測。測試免疫球蛋白通常過量存在。通常，當競爭抗體過量存在時，其將參考抗體對共同抗原之特異性結合抑制至少50%-55%、55%-60%、60%-65%、65%-70%、70%-75%或更大。競爭結合分析可使用經標記之抗原或經標記之抗體、以多種不同形式組態。在此分析之常見型式中，使抗原固著於96孔盤上。接著使用放射性標記或酶標記來量測未經標記之抗體阻斷經標記之抗體與抗原結合的能力。關於其他細節，參見例如Wagener等人，J. Immunol., 1983, 130:2308-2315；Wagener等人，J. Immunol. Methods, 1984, 68:269-274；Kuroki等人，Cancer Res., 1990, 50:4872-4879；Kuroki等人，Immunol. Invest., 1992, 21:523-538；Kuroki等人，Hybridoma, 1992, 11:391-407，及Using Antibodies: A Laboratory Manual , Ed Harlow及David Lane編(Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, N.Y., 1999), 第386-389頁。
在某些態樣中，競爭結合分析可用於確定一種抗體之結合是否受到另一種抗體競爭性抑制(例如以劑量依賴性方式競爭性抑制)，藉此表示抗體結合基本上相同的抗原決定基或重疊的抗原決定基，例如空間上重疊的抗原決定基。此類競爭結合分析可包括例如競爭ELISA分析，其可使用經標記之抗原或經標記之抗體、以所有數目個不同形式組態。在一個特定實施例中，抗體可以在使用本文所述之抗體M22-321b41.1或其嵌合或Fab抗體或包含抗體M22-321b41.1之VH CDR及VL CDR之抗體的競爭結合分析中加以測試。
在特定態樣中，本文中提供一種抗體，其競爭性地阻斷(例如以劑量依賴型方式)包含本文所述之胺基酸序列之抗體結合(特異性結合)至粘附分子-4多肽(例如粘附分子-4之ECD，例如人類粘附分子-4)，如使用熟習此項技術者已知或本文所述之分析(例如ELISA競爭性分析)所確定。在特定態樣中，本文中提供一種抗體，其與包含本文所述之胺基酸序列(例如抗體M22-321b41.1之VL及/或VH胺基酸序列)的抗體競爭(例如以劑量依賴型方式競爭)以特異性結合至粘附分子-4多肽(例如粘附分子-4之ECD，例如人類粘附分子-4)，如使用熟習此項技術者已知或本文所述之分析(例如ELISA競爭性分析)所確定。
在特定態樣中，本文提供一種抗體，其與抗體M22-321b41.1競爭(例如以劑量依賴性方式競爭)以特異性結合至粘附分子-4多肽(例如粘附分子-4之ECD，例如人類粘附分子-4)。
在特定態樣中，本文中提供一種抗體，其與包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 3之VL鏈區域及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 4之VH鏈區域的抗體競爭(例如以劑量依賴型方式競爭)以特異性結合至粘附分子-4多肽(例如粘附分子-4之ECD，例如人類粘附分子-4)。
在一個特定態樣中，本文亦提供如下抗體：(i)與任何抗體M22-321b41.1競爭(例如以劑量依賴型方式競爭)以特異性結合至粘附分子-4多肽之抗原決定基(例如人類粘附分子-4之ECD的抗原決定基)，及(ii)在IHC分析中能夠特異性結合至粘附分子-4。
在一個特定實施例中，本文所述之抗體為一種抗體，其對粘附分子-4多肽(例如粘附分子-4之ECD，例如人類粘附分子-4)的特異性結合受到特異性結合粘附分子-4且包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 3之VL鏈區域及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 4之VH鏈區域的抗體競爭性地阻斷(例如以劑量依賴型方式阻斷)。
在一個特定態樣中，本文亦提供如下抗體，其(i)競爭性地阻斷(例如以劑量依賴型方式阻斷)抗體M22-321b41.1特異性結合至粘附分子-4多肽之抗原決定基(例如人類粘附分子-4之ECD的抗原決定基)，及(ii)在IHC分析中能夠特異性結合至粘附分子-4。
在特定態樣中，本文中提供一種抗體或其抗原結合片段，其與抗體M22-321b41.1免疫特異性結合至相同抗原決定基，該抗體M22-321b41.1包含本文所述之胺基酸序列以便特異性結合至粘附分子-4多肽(例如粘附分子-4之ECD，例如人類粘附分子-4)。熟習此項技術者已知或本文所述之分析(例如ELISA分析)可以用於確定兩種抗體是否結合至相同抗原決定基。
在一個特定實施例中，本文所述之抗體或其抗原結合片段與抗體M22-321b41.1免疫特異性結合至相同抗原決定基，該抗體M22-321b41.1特異性結合粘附分子-4且包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 3的VL鏈區域及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 4的VH鏈區域。
在一個特定態樣中，本文亦提供如下抗體：(i)其與抗體M22-321b41.1免疫特異性結合粘附分子-4多肽之相同抗原決定基(例如人類粘附分子-4之ECD的抗原決定基)；及(ii)在IHC分析中能夠特異性結合至粘附分子-4。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基31-346中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基31-75中的至少一者。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基75-125中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基100-150中的至少一者。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基125-175中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基150-200中的至少一者。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基175-225中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基200-250中的至少一者。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基225-275中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基250-300中的至少一者。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基275-325中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基300-346中的至少一者。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基1-150中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基31-150中的至少一者。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基1-10中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基5-15中的至少一者。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基10-20中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基15-25中的至少一者。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基20-30中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基25-35中的至少一者。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基30-40中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基35-45中的至少一者。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基40-50中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基45-55中的至少一者。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基50-60中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基65-75中的至少一者。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基70-80中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基75-85中的至少一者。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基80-90中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基85-95中的至少一者。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基90-100中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基95-105中的至少一者。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基100-110中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基105-115中的至少一者。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基110-120中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基115-125中的至少一者。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基120-130中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基125-135中的至少一者。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基130-140中的至少一者。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基135-145中的至少一者。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段當結合至粘附分子-4時，結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基140-150中的至少一者。
亦涵蓋上文提及之胺基酸粘附分子-4結合位點中之兩者、三者、四者、五者、六者、七者、八者、九者、十者或超過十者的任何組合。
在某些實施例中，抗體特異性結合至與粘附分子-4配位體結合位點不同之人類粘附分子-4之ECD的抗原決定基。在某些實施例中，該抗體不抑制粘附分子-4配位體結合至粘附分子-4。
在一個態樣中，本文提供特異性結合至粘附分子-4的抗體。在某些實施例中，本文提供特異性結合至人類粘附分子-4之ECD的抗體。
在某些實施例中，特異性結合至粘附分子-4的抗體結合至人類粘附分子-4之ECD，或其人類粘附分子-4之ECD的抗原決定基。在某些實施例中，抗體特異性結合至與粘附分子-4配位體結合位點不同之人類粘附分子-4之ECD的抗原決定基。
粘附分子-4活性可以與粘附分子-4之任何活性(諸如此項技術中已知或所述之彼等活性)有關。粘附分子-4活性之非限制性實例包括：粘附分子-4受體二聚合、粘附分子-4受體與其他受體雜二聚、粘附分子-4受體磷酸化、粘附分子-4受體下游信號傳導、細胞增殖(諸如粘附分子-4配位體誘導細胞增殖(例如癌細胞增殖)增強)，或細胞存活(例如癌細胞)、粘附分子-4配位體誘導抗細胞凋亡。粘附分子-4活性或粘附分子-4功能在本文中可互換地使用。在某些態樣中，藉由粘附分子-4配位體結合至粘附分子-4受體來誘導粘附分子-4活性。在某些實施例中，在粘附分子-4配位體不結合粘附分子-4受體的情況下，由於粘附分子-4受體之高度表現(或過度表現)，因此可以發生粘附分子-4活性或信號傳導的增強。細胞中的粘附分子-4高度或過度表現係指表現量比已知具有正常粘附分子-4表現或粘附分子-4活性之參考細胞的表現量高或比已知具有正常粘附分子-4表現或粘附分子-4活性之細胞群或樣品中之粘附分子-4平均表現量高至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、300%、400%或500%。粘附分子-4表現量可以藉由本文所述或熟習此項技術者已知之方法(例如西方墨點法、ELISA或免疫組織化學)來評估。10. 多株抗體
本發明之抗體可以包含多株抗體。熟習此項技術者已知製備多株抗體之方法。多株抗體可以在哺乳動物中產生，例如藉由一或多次注射免疫劑及必要時佐劑來產生。典型地，免疫劑及/或佐劑將藉由多次皮下或腹膜內注射來注射至哺乳動物中。免疫劑可以包括粘附分子-4多肽或其融合蛋白。其可以用於免疫劑與已知在待免疫之哺乳動物中具有免疫原性之蛋白質結合或在哺乳動物中免疫接種蛋白質及一或多種佐劑。此類免疫原性蛋白質之實例包括(但不限於)匙孔螺血氰蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白及大豆胰蛋白酶抑制劑，可使用之佐劑之實例包括Ribi、CpG、Poly 1C、弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)及MPL-TDM佐劑(單磷醯基脂質A、合成海藻糖二黴菌酸酯)。熟習此項技術者可以選擇免疫接種方案而無需過度實驗。接著可將哺乳動物抽血，且分析血清中之粘附分子-4抗體效價。必要時，哺乳動物可以加打直至抗體效價增加或平穩。另外地或可替代地，可自經免疫之動物獲得淋巴球，以便利用融合瘤融合及製備單株抗體，如下文所述。11. 單株抗體
或者，本發明之抗體可為單株抗體。單株抗體可以使用首次由Kohler等人，1975, Nature 256:495-97所述的融合瘤方法製得，或可以藉由重組DNA方法製得(參見例如美國專利第4,816,567號)。
在融合瘤方法中，如上文所述使小鼠或其他適當宿主動物(諸如倉鼠)免疫以產生淋巴球，該等淋巴球產生或能夠產生將特異性結合至免疫接種用之蛋白質的抗體。或者，淋巴球可在活體外免疫。免疫接種之後，分離出淋巴球且接著使用適合的融合劑(諸如聚乙二醇)使其與骨髓瘤細胞株融合，以形成融合瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies : Principles and Practice 59-103 (1986))。
接種由此製備之融合瘤細胞且在適合的培養基中生長，在某些實施例中，該培養基含有一或多種抑制未融合之親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質(亦稱為融合搭配物)。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞缺乏酵素次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於融合瘤之選擇性培養基典型地包括次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷(HAT培養基)，該等物質阻止缺乏HGPRT之細胞生長。
例示性融合搭配物骨髓瘤細胞為有效融合、支持所選產抗體細胞穩定高量產生抗體且對針對未融合之親本細胞選擇之選擇培養基敏感的細胞。例示性骨髓瘤細胞株為鼠類骨髓瘤株，諸如SP-2及衍生物，例如獲自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection, Manassas, VA)之X63-Ag8-653細胞，及獲自沙克研究所細胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, CA)之MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤所產生的彼等細胞。用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類融合骨髓瘤細胞株亦已描述(Kozbor, 1984, Immunol. 133:3001-05；及Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63 (1987))。
分析融合瘤細胞生長於其中之培養基中針對抗原之單株抗體的產生情況。融合瘤細胞產生之單株抗體的結合特異性係藉由免疫沈澱或藉由活體外結合分析(諸如RIA或ELISA)來測定。單株抗體之結合親和力可例如藉由Munson等人，1980, Anal. Biochem., 107:220-39中所述之史卡查分析(Scatchard analysis)測定。
鑑別出產生具有所要特異性、親和力及/或活性之抗體的融合瘤細胞之後，純系可藉由限制稀釋程序次選殖且藉由標準方法生長(Goding，同上)。適用於此目的之培養基包括例如DMEM或RPMI-1640培養基。此外，融合瘤細胞可在動物中以腹水腫瘤形式活體內生長，例如藉由腹膜內注射細胞至小鼠中。
次純系所分泌之單株抗體宜藉由習知抗體純化程序(諸如親和層析(例如使用蛋白質A或蛋白質G-瓊脂糖)或離子交換層析、羥磷灰石層析、凝膠電泳、滲析等)、自培養基、腹水流體或血清中分離。
編碼單株抗體之DNA容易使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合至編碼鼠類抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)分離及測序。融合瘤細胞可充當此類DNA之來源。DNA一經分離，則可置放於表現載體中，接著轉染至原本不產生抗體蛋白質的宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中，以在重組宿主細胞中達成單株抗體之合成。關於編碼抗體之DNA在細菌中重組表現的論文包括Skerra等人，1993, Curr. Opinion in Immunol. 5:256-62及Plückthun, 1992, Immunol. Revs. 130:151-88。
在一些實施例中，結合粘附分子-4抗原決定基之抗體包含由核苷酸序列編碼之VH域胺基酸序列及/或VL域胺基酸序列，該核苷酸序列(1)與編碼本文所述之VH及/或VL域中之任一者之核苷酸序列的補體在嚴格條件下雜交(例如在約45℃下，在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中與濾膜結合之DNA雜交，隨後在約50-65℃下，用0.2X SSC/0.1% SDS洗滌一或多次)、在高度嚴格條件下雜交(例如在約45℃下，在6X SSC中與濾膜結合的核酸雜交，隨後在約68℃下，在0.1X SSC/0.2% SDS中洗滌一或多次)，或在熟習此項技術者已知的其他嚴格雜交條件下雜交。參見例如Current Protocols in Molecular Biology 第I卷, 6.3.1-6.3.6及2.10.3 (Ausubel等人編，1989)。
在一些實施例中，結合粘附分子-4抗原決定基的抗體包含由核苷酸序列編碼之VH CDR胺基酸序列或VL CDR胺基酸序列，該核苷酸序列與編碼表 1 中所描繪之VH CDR及/或VL CDR中之任一者之核苷酸序列的補體在嚴格條件下雜交(例如在約45℃下，在6X SSC中與濾膜結合的DNA雜交，隨後在約50-65℃下，在0.2X SSC/0.1%SDS中洗滌一或多次)，在高度嚴格條件下雜交(例如在約45℃下，在6X SSC中與濾膜結合的核酸雜交，隨後在約68℃下，在0.1X SSC/0.2% SDS中洗滌一或多次)，或在熟習此項技術者已知的其他嚴格雜交條件下雜交(參見例如Ausubel等人，同上)。
在另一個實施例中，可以自使用例如Antibody Phage Display : Methods and Protocols (O'Brien及Aitken編，2002)所述之技術所產生的抗體噬菌體文庫中分離出單株抗體或抗體片段。在噬菌體呈現方法中，功能抗體域呈現於攜帶編碼其之聚核苷酸序列之噬菌體顆粒的表面上。可用於製備本文所述之抗體的噬菌體呈現方法之實例包括以下文獻中所揭示之方法：Brinkman等人，1995, J. Immunol. Methods 182:41-50；Ames等人，1995, J. Immunol. Methods 184:177- 186；Kettleborough等人，1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958；Persic等人，1997, Gene 187:9- 18；Burton等人，1994, Advances in Immunology 57:191-280；PCT申請案第PCT/GB91/O1 134號；國際公開案第WO 90/02809號、第WO 91/10737號、第WO 92/01047號、第WO 92/18619號、第WO 93/1 1236號、第WO 95/15982號、第WO 95/20401號及第WO97/13844號；美國專利第5,698,426號、第5,223,409號、第5,403,484號、第5,580,717號、第5,427,908號、第5,750,753號、第5,821,047號、第5,571,698號、第5,427,908號、第5,516,637號、第5,780,225號、第5,658,727號、第5,733,743號及第5,969,108號。
原則上，合成抗體純系藉由篩選噬菌體文庫來選擇，該等噬菌體文庫含有呈現與噬菌體鞘蛋白融合之抗體可變區(Fv)之各種片段的噬菌體。針對所需抗原篩選此類噬菌體文庫。能夠結合至所要抗原的表現Fv片段之純系吸附至抗原且從而與文庫中之非結合純系分離。結合純系接著自抗原溶離，且可藉由額外的抗原吸附/溶離循環進一步增濃。
可變域在功能上可以單鏈Fv (scFv)片段形式(其中VH與VL經由短柔性肽共價連接)或Fab片段形式(其中其各自與恆定域融合且發生非共價相互作用)呈現於噬菌體上，如例如Winter等人，1994, Ann. Rev. Immunol. 12:433-55中所述。
VH及VL基因譜系可以藉由PCR分別選殖且在噬菌體文庫中隨機重組，接著可以如Winter等人(同上)中所述搜尋抗原結合純系。來自免疫來源之文庫提供針對免疫原之高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，可選殖原生譜系以提供針對廣泛範圍之非自體抗原以及自體抗原之單一人類抗體來源而無需任何免疫接種，如Griffiths等人，1993, EMBO J 12:725-34所述。最後，亦可以合成方式如下製備原生文庫：自幹細胞選殖未重排V基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高度可變CDR3區域及實現活體外重排，如Hoogenboom及Winter, 1992, J. Mol. Biol. 227:381-88所述。
可藉由此項技術中已知的多種技術實現文庫之篩選。舉例而言，粘附分子-4 (例如粘附分子-4多肽、片段或抗原決定基)可以用於塗佈吸附盤之孔，在固定至吸附盤之宿主細胞上表現或用於細胞分選，與生物素結合以供塗佈抗生蛋白鏈菌素之珠粒捕捉，或在任何其他方法中用於淘選呈現文庫。選擇具有緩慢解離動力學(例如良好結合親和力)之抗體可藉由使用長時間洗滌及單價噬菌體呈現來促進，如Bass等人，1990, Proteins, 8:309-14及WO 92/09690中所述)，及藉由使用抗原之低塗佈密度來促進(如Marks等人，1992, Biotechnol. 10:779-83中所述)。
抗粘附分子-4抗體可以如下獲得：設計適於選擇所關注之噬菌體純系的抗原篩選程序，隨後使用VH及/或VL序列(例如Fv序列)或來自VH及VL序列的多個CDR序列、由所關注之噬菌體純系及Kabat等人(同上)所述的適合恆定區(例如Fc)序列構建全長抗粘附分子-4抗體純系。
本文所述之抗體亦可例如包括嵌合抗體。嵌合抗體為其中抗體之不同部分來源於不同免疫球蛋白分子的分子。舉例而言，嵌合抗體可含有與人類抗體恆定區融合的小鼠或大鼠單株抗體可變區。用於產生嵌合抗體之方法在此項技術中已知。參見例如Morrison, 1985, Science 229:1202；Oi等人，1986, BioTechniques 4:214；Gillies等人，1989, J. Immunol. Methods 125:191-2 02；及美國專利第5,807,715號、第4,816,567號、第4,816,397號及第6,331,415號。
使用諸如本文所述之彼等技術的技術產生的抗體或抗原結合片段可使用熟知的標準技術加以分離。舉例而言，抗體或抗原結合片段宜藉由習知免疫球蛋白純化程序(諸如蛋白A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析)自例如培養基、腹水液、血清、細胞溶胞物、合成反應材料或其類似物中分離。如本文所用，「經分離」或「經純化」之抗體基本上不含來自衍生抗體之細胞或組織源的細胞材料或其他蛋白質，或當以化學方式合成時基本上不含化學前驅物或其他化學品。12. 抗體片段
本發明提供結合至粘附分子-4的抗體及抗體片段。在某些情形中，使用抗體片段、而非完整抗體存在優勢。較小的片段尺寸允許快速清除，且可以改良對細胞、組織或器官的近接。關於某些抗體片段之評述，參見Hudson等人，2003, Nature Med. 9:129-34。
已開發出用於產生抗體片段的多種技術。傳統上，此等片段經由完整抗體之蛋白分解消化而產生(參見例如Morimoto等人，1992, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-17；及Brennan等人，1985, Science 229:81-83)。然而，此等片段現可由重組宿主細胞直接產生。Fab、Fv及ScFv抗體片段皆可表現於大腸桿菌或酵母細胞中及由其分泌，從而允許便捷地產生大量的此等片段。抗體片段可自上文所論述之抗體噬菌體文庫中分離。或者，Fab'-SH片段可以自大腸桿菌中直接回收且以化學方式偶聯以形成F(ab')2 片段(Carter等人，1992, Bio/Technology 10:163-67)。根據另一方法，可以自重組宿主細胞培養物中直接分離出F(ab')2 片段。活體內半衰期延長且包含救助受體結合抗原決定基殘基之Fab及F(ab')2 片段描述於美國專利第5,869,046號中。產生抗體片段的其他技術對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。在某些實施例中，抗體為單鏈Fv片段(scFv)(參見例如WO 93/16185；美國專利第5,571,894號及第5,587,458號)。Fv及scFv具有不含恆定區之完整組合位點；因此，其可適用於活體內使用期間降低之非特異性結合。可以構建scFv融合蛋白，以產生效應蛋白在scFv之胺基或羧基末端的融合物(參見例如Borrebaeck編，同上)。抗體片段亦可為「線性抗體」，例如如上文所引用之參考文獻中所述。
較小的抗體源結合結構為單獨的可變域(V域），亦稱為單一可變域抗體(sdAb)。某些類型的生物體(駱駝科及軟骨魚)具有固定於Fc等效域結構上之高親和力單一V樣域作為其免疫系統的一部分。(Woolven等人，1999, Immunogenetics 50: 98-101；及Streltsov等人，2004, Proc Natl Acad Sci USA. 101:12444-49)。V樣域(駱駝科中稱為VhH且鯊魚中稱為V-NAR)典型地呈現長表面環，從而允許滲入靶抗原空腔中。其亦藉由遮蔽疏水性表面斑點而使經分離之VH域穩定。
此等VhH及V-NAR域已用於工程改造sdAb。已使用自噬菌體文庫選擇及產生穩定、高度結合VL及VH源域之其他方法設計人類V域變異體。
本文所提供之抗體包括(但不限於)免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，例如含有結合至粘附分子-4抗原決定基之抗原結合位點的分子。本文所提供的免疫球蛋白分子可以屬於免疫球蛋白分子的任何類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD及IgA)或任何子類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。
抗體之變異體及衍生物包括保持結合至粘附分子-4抗原決定基之能力的抗體功能片段。例示性功能片段包括Fab片段(例如含有抗原結合域且包含輕鏈及重鏈之一部分(藉由二硫鍵橋接)的抗體片段)；Fab' (例如含有單一抗原結合域且包含Fab及重鏈之另一部分(經由鉸鏈區)的抗體片段)；F(ab')2 (例如兩個Fab'分子藉由重鏈鉸鏈區中之鏈間二硫鍵連接；Fab'分子可以針對相同或不同抗原決定基)；包含可變區的單鏈，亦稱為scFv (例如抗體之單一輕鏈及重鏈的可變區、抗原結合決定區，其藉由10-25個胺基酸之鏈連接在一起)；二硫鍵連接的Fv，或dsFv (例如抗體之單一輕鏈及重鏈的可變區、抗原結合決定區，其藉由二硫鍵連接在一起)；駱駝化VH (例如抗體之單一重鏈之可變區、抗原結合決定區，其中VH界面之一些胺基酸為天然存在之駱駝抗體重鏈中所發現的彼等區域)。13. 人類化抗體
本文所述之抗體可例如包括人類化抗體，例如去免疫型或複合人類抗體。
人類化抗體可包含人類恆定區序列。在某些實施例中，人類化抗體可選自任何類別之免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE；及任何同型，包括IgG1 、IgG2 、IgG3 及IgG4 。在某些實施例中，人類化抗體可包含κ或λ輕鏈恆定序列。
人類化抗體可使用此項技術中已知之多種技術來產生，包括(但不限於) CDR移植(歐洲專利第EP 239,400號；國際公開案第WO 91/09967號；及美國專利第5,225,539號、第5,530,101號及第5,585,089號)、面飾(veneering)或表面再塑(resurfacing)(歐洲專利第EP 592,106號及第EP 519,596號；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka等人，1994, Protein Engineering 7(6):805-814；及Roguska等人，1994, PNAS 91:969-973)、鏈改組(美國專利第5,565,332號)及揭示於以下中之技術：例如，美國專利第6,407,213號；美國專利第5,766,886號；WO 9317105；Tan等人，J. Immunol. 169:1119 25 (2002)；Caldas等人，Protein Eng. 13(5):353-60 (2000)；Morea等人，Methods 20(3):267 79 (2000)；Baca等人，J. Biol. Chem. 272(16):10678-84 (1997)；Roguska等人，Protein Eng. 9(10):895 904 (1996)；Couto等人，Cancer Res. 55 (23增刊):5973s- 5977s (1995)；Couto等人，Cancer Res. 55(8):1717-22 (1995)；Sandhu JS, Gene 150(2):409-10 (1994)及Pedersen等人，J. Mol. Biol. 235(3):959-73 (1994)。亦參見美國專利公開案第US 2005/0042664 A1號(2005年2月24日)，其中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本文所提供之抗體可為結合粘附分子-4 (包括人類粘附分子-4)的人類化抗體。舉例而言，本發明之人類化抗體可以包含一或多個CDR，如表 1 中所示。使非人類抗體發生人類化的多種方法在此項技術中已知。舉例而言，人類化抗體中可以引入一或多個來自非人類來源的胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基，其典型地獲自「輸入」可變域。人類化可以依循例如Jones等人，1986, Nature 321:522-25；Riechmann等人，1988, Nature 332:323-27；及Verhoeyen等人，1988, Science 239:1534-36)之方法，藉由用高變區序列取代人類抗體的相應序列來執行。
在一些情況下，藉由CDR移植來構建人類化抗體，其中將親本非人類抗體(例如嚙齒動物)之六個CDR的胺基酸序列移植至人類抗體構架上。舉例而言，Padlan等人測定CDR中僅約三分之一的殘基實際上接觸抗原，且將此等殘基稱為「特異性決定殘基」或SDR (Padlan等人，1995, FASEB J. 9:133-39)。在SDR移植技術中，僅將SDR殘基移植至人類抗體構架上(參見例如Kashmiri等人，2005, Methods 36:25-34)。
選用於製備人類化抗體的人類可變域(輕鏈與重鏈)對於減少抗原性而言非常重要。舉例而言，根據所謂的「最佳擬合」方法，針對已知人類可變域序列之整個文庫篩選非人類(例如嚙齒動物)抗體之可變域序列。可以選擇最接近嚙齒動物之人類序列作為人類化抗體之人類構架(Sims等人，1993, J. Immunol. 151:2296-308；及Chothia等人，1987, J. Mol. Biol. 196:901-17)。另一方法係使用來源於輕鏈或重鏈之特定亞群之所有人類抗體共同序列的特定構架。相同構架可以用於若干不同人類化抗體(Carter等人，1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-89；及Presta等人，1993, J. Immunol. 151:2623-32)。在一些情況下，構架來源於最豐裕的人類亞類(VL 6亞群I (VL 6I)及VH 亞群III (VH III))之共同序列。在另一方法中，使用人類生殖系基因作為構架區來源。
在基於比較CDR之一個替代範例(稱為超人類化)中，FR同源性無關。該方法由比較非人類序列與功能人類生殖系基因基因譜系組成。接著選擇編碼與鼠類序列相同或緊密相關之典型結構的此等基因。接著，在與非人類抗體共有典型結構之基因內，選擇在CDR內具有最高同源性之基因作為FR供體。最後，將非人類CDR移植至此等FR上(參見例如Tan等人，2002, J. Immunol. 169:1119-25)。
通常另外需要抗體經人類化以保持其對抗原的親和力及其他有利生物特性。為了達成此目標，根據一種方法，人類化抗體係藉由一種使用親本及人類化序列的三維模型分析親本序列及各種概念性人類化產物的方法製備。三維免疫球蛋白模型通常可獲得且為熟習此項技術者所熟悉。可利用說明且顯示所選候選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構的電腦程式。此等電腦程式包括例如WAM (Whitelegg及Rees, 2000, Protein Eng. 13:819-24)、Modeller (Sali及Blundell, 1993, J. Mol. Biol. 234:779-815)，及Swiss PDB Viewer (Guex及Peitsch, 1997, Electrophoresis 18:2714-23)。檢查此等顯示可分析殘基在候選免疫球蛋白序列之功能中的可能作用，例如分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，可以選擇FR殘基且與接受者及輸入序列組合，以便達成所需抗體特徵，諸如對靶抗原的親和力增強。一般而言，高變區殘基直接且最實質性涉及影響抗原結合。
另一種用於抗體人類化之方法係基於抗體人類化的量度，稱為人類呈肽段含量(Human String Content，HSC)。此方法比較小鼠序列與人類生殖系基因譜系且依HSC對差異進行評分。接著藉由最大化靶序列之HSC而非使用總體一致性量度來使靶序列發生人類化，以產生多種不同人類化變異體(Lazar等人，2007, Mol. Immunol. 44:1986-98)。
除上述方法之外，可使用經驗方法產生及選擇人類化抗體。此等方法包括基於使用富集技術或高通量篩選技術產生人類化變異體之大型文庫及選擇最佳純系的方法。抗體變異體可以自噬菌體、核糖體及酵母呈現文庫中分離以及藉由細菌群落篩選來分離(參見例如Hoogenboom, 2005, Nat. Biotechnol. 23:1105-16；Dufner等人，2006, Trends Biotechnol. 24:523-29；Feldhaus等人，2003, Nat. Biotechnol. 21:163-70；及Schlapschy等人，2004, Protein Eng. Des. Sel. 17:847-60)。
在FR文庫方法中，在FR中之特定位置引入一組殘基變異體，隨後篩選文庫以選擇最佳支持所移植CDR之FR。待取代之殘基可以包括鑑別為潛在促成CDR結構之「游標」殘基中的一些或全部(參見例如Foote及Winter, 1992, J. Mol . Biol. 224:487-99)，或來自Baca等人(1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84)所鑑別之一組更有限的標靶殘基。
在FR改組中，將整個FR與非人類CDR組合，而非產生所選殘基變異體之組合文庫(參見例如Dall'Acqua等人，2005, Methods 36:43-60)。可用兩步選擇程序(首先使VL發生人類化，隨後使VH發生人類化)篩選文庫用於結合。或者，可使用一步FR改組方法。已展示此類方法比兩步篩選更有效，因為所得抗體展現改良之生物化學及物理化學特性，包括增強之表現、增強之親和力及熱穩定性(參見例如Damschroder等人，2007, Mol. Immunol. 44:3049-60)。
「人類化工程改造」方法係基於基本最小特異性決定子(MSD)之實驗鑑別且基於非人類片段依序置換至人類FR文庫中及對結合的評估。其始於非人類VH及VL鏈之CDR3區域且將非人類抗體之其他區域逐漸置換至人類FR中，包括VH與VL之CDR1及CDR2。此方法典型地引起抗原決定基保持及自具有不同人類V區段CDR之多個亞類中鑑別抗體。人類化工程改造允許分離與人類生殖系基因抗體具有91-96%同源性之抗體(參見例如Alfenito, Cambridge Healthtech Institute's Third Annual PEGS, The Protein Engineering Summit, 2007)。
「人類工程改造」方法涉及藉由使抗體之胺基酸序列產生特定變化以便產生經修飾之抗體來改變非人類抗體或抗體片段，諸如小鼠或嵌合抗體或抗體片段，該經修飾之抗體在人類中的免疫原性減小，然而仍保持原始非人類抗體之所需結合特性。通常，該技術涉及將非人類(例如小鼠)抗體之胺基酸殘基依「低風險」、「中度風險」或「高風險」殘基分類。分類係使用總體風險/獎勵計算來執行，其針對取代將影響所產生抗體摺疊的風險來評估產生特定取代的預測益處(例如針對人體中的免疫原性)。可以藉由將來自非人類抗體可變區的胺基酸序列與特定或共同人類抗體序列之相應區域比對來選擇在非人類(例如小鼠)抗體序列之指定位置(例如低或中度風險)待取代的特定人類胺基酸殘基。根據比對，非人類序列中低風險或中度風險位置處之胺基酸殘基可取代人類抗體序列中之相應殘基。用於製備人類工程化蛋白質的技術更詳細地描述於Studnicka等人，1994, Protein Engineering 7:805-14；美國專利第5,766,886號、第5,770,196號、第5,821,123號及第5,869,619號；及PCT公開案WO 93/11794中。
複合人類抗體可使用例如複合人類Antibody™技術(Antitope Ltd., Cambridge, United Kingdom)來產生。為產生複合人類抗體，以避免T細胞抗原決定基的方式由多個人類抗體可變區序列之片段設計可變區序列，藉此使所得抗體之免疫原性最小化。此類抗體可包含人類恆定區序列，例如人類輕鏈及/或重鏈恆定區。
去免疫型抗體為其中T細胞抗原決定基已移除之抗體。用於產生去免疫型抗體之方法已有描述。參見例如Jones等人，Methods Mol Biol. 2009;525:405-23, xiv, 及De Groot等人，Cell. Immunol. 244:148- 153(2006))。去免疫型抗體包含T細胞抗原決定基耗乏之可變區及人類恆定區。簡言之，選殖抗體之VH及VL且隨後在T細胞增殖分析中藉由測試來源於該抗體VH及VL之重疊肽來鑑別T細胞抗原決定基。經由計算機模擬方法鑑別T細胞抗原決定基以鑑別結合至人類II類MHC之肽。在VH及VL中引入突變以消除與人類II類MHC之結合。接著利用突變之VH及VL產生去免疫型抗體。14. 人類抗體
在特定實施例中，該抗體為完全人類抗人類抗體。完全人類抗體可以藉由此項技術中已知之任何方法產生。人類抗粘附分子-4抗體可藉由將選自人源噬菌體呈現文庫之Fv純系可變域序列與已知的人類恆定域序列組合來構建。或者，本發明之人類單株抗粘附分子-4抗體可藉由融合瘤方法產生。用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜骨髓瘤細胞株已描述於例如Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001-05；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63 (1987)；及Boerner等人，1991, J. Immunol. 147:86-95。
亦可產生轉殖基因動物(例如小鼠)，其在免疫接種後，能夠在不產生內源免疫球蛋白的情況下產生完整譜系的人類抗體。表現人類抗體譜系的轉殖基因小鼠已用於產生針對多種潛在藥物標靶的高親和力人類序列單株抗體(參見例如Jakobovits, A., 1995, Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):561-66；Brüggemann及Taussing, 1997, Curr. Opin. Biotechnol. 8(4):455-58；美國專利第6,075,181號及第6,150,584號；及Lonberg等人，2005, Nature Biotechnol. 23:1117-25)。
或者，可以經由人類B淋巴球之永生化來製備人類抗體，從而產生針對靶抗原的抗體(例如此類B淋巴球可以自個體回收或可已在活體外免疫) (參見例如Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)；Boerner等人，1991, J. Immunol. 147(1):86-95；及美國專利第5,750,373號)。
亦可以使用基因改組而自非人類(例如嚙齒動物)抗體衍生人類抗體，其中人類抗體與初始非人類抗體具有相似的親和力及特異性。根據此方法(其亦稱為「抗原決定基印跡」或「引導選擇」)，用人類V域基因之基因譜系置換藉由如本文所述之噬菌體呈現技術獲得之非人類抗體片段的重鏈或輕鏈可變區，從而產生非人類鏈/人類鏈scFv或Fab嵌合體之群體。抗原選擇引起非人類鏈/人類鏈嵌合scFv或Fab分離，其中人類鏈恢復了在初始噬菌體呈現純系之相應非人類鏈移除後所毀壞的抗原結合位點(例如抗原決定基引導(印記)人類鏈搭配物的選擇)。當重複執行該方法以置換殘餘非人類鏈時，獲得人類抗體(參見例如PCT WO 93/06213；及Osbourn等人，2005, Methods 36:61-68)。不同於藉由CDR移植使非人類抗體發生人類化之傳統方式，此技術提供不具有非人類來源之FR或CDR殘基的完全人類抗體。對針對細胞表面抗原之人類化小鼠抗體執行引導選擇的實例包括存在於卵巢癌細胞上的葉酸結合蛋白(參見例如Figini等人，1998, Cancer Res. 58:991-96)及高度表現於肝細胞癌上的CD147 (參見例如Bao等人，2005, Cancer Biol. Ther. 4:1374-80)。
引導選擇方法之潛在缺點為改組一個抗體鏈同時保持另一個恆定區可引起抗原決定基漂移。為了維持非人類抗體所識別的抗原決定基，可以施加CDR保留(參見例如Klimka等人，2000, Br. J. Cancer. 83:252-60；及Beiboer等人，2000, J. Mol. Biol. 296:833-49)。在此方法中，通常保留非人類VH CDR3，因為此CDR可位於抗原結合位點之中心且可能為抗體用於抗原識別之最重要區域。然而，在一些情況下，可保留非人類抗體之VH CDR3及VL CDR3，以及VH CDR2、VL CDR2及VL CFR1。15. 多價抗體
多價抗體被表現抗體所結合之抗原之細胞內化(及/或分解代謝)的速度可以快於二價抗體。本發明之抗體可為具有三個或超過三個抗原結合位點的多價抗體(例如四價抗體)(除IgM類別之外)，其可以容易藉由編碼抗體多肽鏈之核酸的重組表現來產生。多價抗體可以包含二聚域及三個或超過三個抗原結合位點。在某些實施例中，二聚域包含(或組成為) Fc區或鉸鏈區。在此情境下，抗體將包含Fc區及Fc區胺基端的三個或超過三個抗原結合位點。在某些實施例中，多價抗體包含(或組成為)三個至約八個抗原結合位點。在一個此類實施例中，多價抗體包含(或組成為)四個抗原結合位點。多價抗體包含至少一個多肽鏈(例如兩個多肽鏈)，其中多肽鏈包含兩個或超過兩個可變域。舉例而言，多肽鏈可以包含VD1-(X1)n -VD2-(X2)n -Fc，其中VD1為第一可變域，VD2為第二可變域，Fc為Fc區的一個多肽鏈，X1及X2表示胺基酸或多肽，且n為0或1。舉例而言，多肽鏈可以包含：VH-CH1-柔性連接子-VH-CH1-Fc區鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區鏈。本文中的多價抗體可以進一步包含至少兩個(例如四個)輕鏈可變域多肽。本文中的多價抗體可以例如包含約兩個至約八個輕鏈可變域多肽。本文所涵蓋的輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域且視情況進一步包含CL域。16. Fc工程改造
可能需要藉由Fc工程改造來修飾本文所提供之抗粘附分子-4抗體。在某些實施例中，對抗體Fc區的修飾使得抗體之效應功能減少或消除。在某些實施例中，效應功能為ADCC、ADCP及/或CDC。在一些實施例中，效應功能為ADCC。在其他實施例中，效應功能為ADCP。在其他實施例中，效應功能為CDC。在一個實施例中，效應功能為ADCC及ADCP。在一個實施例中，效應功能為ADCC及CDC。在一個實施例中，效應功能為ADCP及CDC。在一個實施例中，效應功能為ADCC、ADCP及CDC。此可以藉由將一或多個胺基酸取代引入抗體Fc區中來達成。
為延長抗體之血清半衰期，可以將救助受體結合抗原決定基併入抗體(尤其抗體片段)中，如例如美國專利第5,739,277號中所述。術語「救助受體結合抗原決定基」係指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)之Fc區的抗原決定基，其負責延長IgG分子之活體內血清半衰期。17. 替代的結合劑
本發明涵蓋非免疫球蛋白結合劑，其與本文揭示之抗粘附分子-4抗體特異性結合至相同抗原決定基。在一些實施例中，非免疫球蛋白結合劑經鑑別為競爭性結合分析中置換或被本發明之抗粘附分子-4抗體置換的藥劑。此等替代結合劑可以包括例如此項技術中已知的任何經工程改造之蛋白質支架。此類支架可以包含一或多個CDR，如表 1 所示。此類支架包括例如抗運載蛋白(anticalins)，其係基於脂質運載蛋白支架，一種蛋白質結構，其特徵為支撐形成配位體結合位點之四個高變環的剛性β-圓筒。新穎的結合特異性可以藉由環區域中之靶向隨機突變誘發與功能呈現及引導選擇的組合來工程化(參見例如Skerra, 2008, FEBS J. 275:2677-83)。其他適合的支架可以包括例如阿德奈汀(adnectins)或基於人類纖維結合蛋白III之第十胞外域的單功能抗體(參見例如Koide及Koide, 2007, Methods Mol. Biol. 352: 95-109)；基於葡萄球菌蛋白質A之Z域的親和抗體(參見例如Nygren等人，2008, FEBS J. 275:2668-76)；基於錨蛋白重複蛋白的達爾平蛋白(DARPins)(參見例如Stumpp等人，2008, Drug. Discov. Today 13:695-701)；基於人類Fyn蛋白激酶之SH3域的非諾莫(fynomers)(參見例如Grabulovski等人，2007, J. Biol. Chem. 282:3196-204)；基於得自嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidolarius)之Sac7d的阿非汀(affitins)(參見例如Krehenbrink等人，2008, J. Mol. Biol. 383:1058- 68)；基於人類y-B-晶狀體球蛋白的阿非林(affilins)(參見例如Ebersbach等人，2007, J. Mol. Biol. 372:172-85)；基於膜受體蛋白質之A域的高親和性多聚體(avimers)(參見例如Silverman等人，2005, Biotechnol. 23:1556-61)；富含半胱胺酸之打結素肽(參見例如Kolmar, 2008, FEBS J. 275:2684-90)；及經工程改造的Kunitz型抑制劑(參見例如Nixon及Wood, 2006, Curr. Opin. Drug. Discov. Dev. 9:261-68)。欲回顧，參見例如Gebauer及Skerra, 2009, Curr. Opin. Chem. Biol. 13:245-55。18. 篩選粘附分子-4特異性抗體
用於產生抗體的技術已描述如上。需要時，可以進一步篩選或選擇抗體的某些生物特性，諸如其對粘附分子-4的結合特異性。篩選對靶抗原具有特異性之抗體涉及兩個態樣。首先，篩選抗體以鑑別出不結合至或低結合至不含粘附分子-4之樣品的彼等抗體。此篩選態樣鑑別出特異性識別且結合粘附分子-4、但基本上不識別或結合除粘附分子-4之外之分子的抗體。其次，篩選抗體以鑑別出強結合至或以高親和力結合至包括粘附分子-4之樣品的彼等抗體。此篩選態樣鑑別出對粘附分子-4具有高親和力且可以在如下文所述的多種分析中產生強偵測信號的抗體。兩個態樣中對抗體的篩選可以使用下文進一步描述的免疫分析完成。
在某些實施例中，首先使用ELISA篩選抗體，其中微量滴定盤塗有粘附分子-4蛋白質或其片段。不結合至或弱結合至經固著之粘附分子-4的抗體純系被排除。在一些實施例中，可以在免疫分析(例如基於ELISA的分析或西方墨點法分析)中根據與其他粘附分子同功異型物的反應性來進一步篩選結合粘附分子-4之抗體，例如使用塗有粘附分子-1、粘附分子-2或粘附分子-3的微量滴定盤來篩選。與粘附分子之另一同功異型物具有反應性的抗體純系被排除，且可以選擇僅與粘附分子-4具有反應性的抗體純系供進一步篩選。
可以根據其對不表現或低量表現粘附分子-4之陰性對照物的結合來進一步篩選抗粘附分子-4抗體。對於此類篩選而言，可以在免疫分析(例如IHC分析、ELISA分析或免疫墨點分析)中測定各種抗體純系與陰性對照物之間的結合。與任何陰性對照物具有反應性的抗體純系被排除。不同的陰性對照物(例如，對粘附分子-4表現呈陰性的不同組織或細胞株)可以含有一組不同的分子，因此多種陰性對照物可以用於確保針對一組多樣化非粘附分子-4分子來選擇候選抗粘附分子-4抗體。
可以根據對已知表現粘附分子-4之陽性對照物的結合來進一步篩選抗粘附分子-4抗體。對於此類篩選而言，可以在免疫分析(例如IHC分析、ELISA分析或免疫墨點分析)中測定各種抗體純系與陽性對照物之間的結合。選擇對陽性對照物結合強的抗體純系。可以選擇對陽性對照物結合強且對陰性對照物結合弱的抗粘附分子-4抗體作為對粘附分子-4具有特異性之抗體。與陽性對照物與陰性對照物結合之抗粘附分子-4抗體的量之間的差異為該抗粘附分子-4抗體對粘附分子-4的特異性結合。特異性結合可以用作選擇特定抗粘附分子-4抗體之準則之一。特定抗體在下文詳述的免疫分析中提供高度特異性結合。
在一些實施例中，抗粘附分子-4抗體之特異性可以藉由使結合至陰性及陽性參考物之抗粘附分子-4抗體與已藉由其他方式測定之此等參考物中之已知粘附分子-4表現量相關聯或比較來確定。參考粘附分子-4表現可為陽性粘附分子-4對照或陰性粘附分子-4對照，如下文所述。特異性抗粘附分子-4抗體對樣品或參考物的結合可以與樣品或參考物中之粘附分子-4表現相關或成比例。亦即，特異性抗粘附分子-4抗體強結合至高量表現粘附分子-4之樣品或參考物，中度結合至中量表現粘附分子-4之樣品或參考物，弱結合至低量表現粘附分子-4之樣品或參考物，且最低限度地結合(例如，結合的量與同型對照抗體結合的量大致相同)至不表現粘附分子-4之樣品或參考物。陰性或陽性對照物中的已知粘附分子-4表現可獨立地藉由下述所述的qPCR分析測定。已知粘附分子-4表現亦可獨立地使用下文所述之任何免疫分析測定，其中抗粘附分子-4抗體已預先測定具有粘附分子-4特異性。適用於證實陰性及陽性對照物中之粘附分子-4表現的免疫分析包括(舉例而言且無任何限制) IHC分析、免疫墨點分析、FACS分析或ELISA，如下文中詳細所述。在一些實施例中，由於分析之背景雜訊或由於殘餘粘附分子-4之低含量在生物學上不顯著，如下文所述，因此陰性對照物中的粘附分子-4 mRNA含量可不為零。粘附分子-4陰性對照物對於粘附分子-4可以正確地視為陰性，例如當qPCR分析中的粘附分子-4 mRNA含量基本上類似於使用一組非特異性引子所偵測的mRNA含量時，或當粘附分子-4 mRNA含量在生物學上不顯著(根據粘附分子-4陽性對照物中的粘附分子-4 mRNA含量)時。類似地，由於分析之背景雜訊或由於殘餘粘附分子-4之低含量在生物學上不顯著，因此使用另一粘附分子-4特異性抗體之免疫分析在陰性對照物中偵測到的粘附分子-4可能不為零。背景雜訊可以由除抗粘附分子-4抗體之外的分析試劑與樣品之間的非特異性相互作用引起。陰性粘附分子-4對照物對於粘附分子-4而言可以正確地視為陰性，例如當粘附分子-4特異性抗體在陰性對照物中所偵測到的粘附分子-4含量基本上類似於同型對照抗體在相同分析中的偵測含量時。在一些分析中，背景雜訊可以佔陽性對照物中所偵測信號的實質百分比。
另外，熟習此項技術者已鑑別出陽性及陰性對照物且公開於文獻中，包括陽性及/或陰性組織、細胞(包括例如細胞株)及病理學樣品。此類文獻可容易藉由搜尋資料庫(諸如Pubmed)加以鑑別(例如使用諸如粘附分子-4、表現、陽性、陰性及/或分佈之搜尋項)及分析搜尋匹配結果。
因此，與不表現粘附分子-4之陰性對照細胞結合之粘附分子-4特異性抗體或其抗原結合片段的相對量可為與表現粘附分子-4之陽性對照物結合之抗體或其抗原結合片段之量的約50%、40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.03%、0.01%、0.001%或低於0.001%。
在本文所提供之抗體或其抗原結合片段的一些實施例中，對照細胞中的陰性或陽性粘附分子-4表現獨立地藉由qPCR分析、使用第二抗體的IHC分析、使用第二抗體的免疫墨點分析、使用第二抗體的FACS分析或使用第二抗體的ELISA測定。
在本文所提供之抗體或其抗原結合片段的一些實施例中，結合至細胞之抗體或其抗原結合片段的量係藉由IHC分析、免疫墨點分析、FACS分析或ELISA測定。19. 抗體變異體
在一些實施例中，涵蓋結合至粘附分子-4之抗體的胺基酸序列修飾或本文所述之抗體的胺基酸序列修飾。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物特性，包括(但不限於)特異性、熱穩定性、表現量、效應功能、糖基化、減小之免疫原性或溶解性。因此，除本文所述之抗粘附分子-4抗體之外，預期可以製備抗粘附分子-4抗體變異體。舉例而言，抗粘附分子-4抗體變異體可以藉由在編碼DNA中引入適當核苷酸變化及/或藉由合成所需抗體或多肽來製備。熟習此項技術者瞭解胺基酸變化可以改變抗粘附分子-4抗體之轉譯後過程，諸如改變糖基化位點之數目或位置或改變膜錨定特徵。
在一些實施例中，在包含多肽(其序列中亦提供有第一麩醯胺酸)之本文所提供之任何抗體中，第一殘基中之麩醯胺酸可以用焦麩胺酸取代。此類取代天然發生於生理學條件下或活體外或離體發生於約pH 7的緩衝液中。此類取代可如下進行：使包含具有第一麩醯胺酸之多肽的抗體進行如下條件：其中第一麩醯胺酸的麩醯胺醯基環化而形成焦麩胺酸為有利的，例如在弱酸溶液(諸如乙酸鹽及三氟乙酸鹽)中。
在一些實施例中，本文所提供之抗體經化學修飾，例如藉由使任何類型的分子共價連接至抗體。抗體衍生物可以包括已經化學修飾之抗體，例如藉由糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護基團/封端基團衍生化、蛋白分解裂解、連接至細胞配位體或其他蛋白質等而經化學修飾之抗體。多種化學修飾中之任一者可藉由已知技術進行，包括(但不限於)特異性化學裂解、乙醯化、甲醯化、衣黴素之代謝合成等。另外，抗體可以含有一或多個非經典胺基酸。
變異可為編碼抗體或多肽之一或多個密碼子的取代、缺失或插入，相較於原生序列抗體或多肽，其引起胺基酸序列變化。胺基酸取代可為一個胺基酸被具有類似結構及/或化學特性之另一胺基酸置換的結果，諸如白胺酸被絲胺酸置換，例如保守胺基酸置換。熟習此項技術者已知的標準技術可以用於將突變引入編碼本文所提供分子的核苷酸序列中，包括例如引起胺基酸取代的定點誘變及PCR介導誘變。插入或缺失視情況可在約1至5個胺基酸範圍內。在某些實施例中，相對於原始分子，取代、缺失或插入包括少於25個胺基酸取代、少於20個胺基酸取代、少於15個胺基酸取代、少於10個胺基酸取代、少於5個胺基酸取代、少於4個胺基酸取代、少於3個胺基酸取代，或少於2個胺基酸取代。在一個特定實施例中，取代為在一或多個所預測之非必需胺基酸殘基處產生的保守胺基酸取代。允許發生的變異可藉由在序列中系統地產生胺基酸插入、缺失或取代且測試所得變異體之全長或成熟原生序列所展現的活性來確定。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或超過一百個殘基之多肽範圍內的胺基末端及/或羧基末端融合，以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N末端或C末端與延長抗體之血清半衰期的酶(例如對於抗體引導之酶前藥療法)或多肽的融合。
「保守胺基酸取代」為胺基酸殘基被具有類似電荷之側鏈之胺基酸殘基置換的取代。側鏈具有類似電荷之胺基酸殘基家族在此項技術中已定義。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。或者，突變可以沿著編碼序列之全部或一部分隨機引入，諸如藉由飽和突變誘發，且可以根據生物活性篩選所得突變體以鑑別保持活性的突變體。突變誘發之後，可以表現所編碼蛋白質且可以測定蛋白質活性。
抗體生物特性之實質修飾係藉由選擇維持以下之作用顯著不同的取代來實現：(a)多肽主鏈在取代區域中的結構，例如呈片狀或螺旋狀構形；(b)分子在靶點處之電荷或疏水性；或(c)側鏈之堆積。或者，可以產生保守(例如在具有類似特性及/或側鏈之胺基酸基團內)取代，以便維持特性或使特性變化不顯著。胺基酸可以根據其側鏈特性之相似性來分類(參見例如Lehninger,Biochemistry 73-75 (第2版，1975))：(1)非極性：Ala (A)、Val (V)、Leu (L)、Ile (I)、Pro (P)、Phe (F)、Trp (W)、Met (M)；(2)不帶電荷，極性：Gly (G)、Ser (S)、Thr (T)、Cys (C)、Tyr (Y)、Asn (N)、Gln (Q)；(3)酸性：Asp (D)、Glu (E)；及(4)鹼性：Lys (K)、Arg (R)、His (H)。
或者，天然存在之殘基可以基於共同的側鏈特性來分類：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性、親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向的殘基：Gly、Pro；及(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代需要將此等類別中之一者之成員換成另一類別。此類經取代之殘基亦可引入保守性取代位點中或引入其餘(非保守性)位點中。因此，在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基之抗體或其片段包含與本文所述之鼠類單株抗體的胺基酸序列至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%至少90%、至少95%或至少99%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基之抗體或其片段包含與本文所述之鼠類單株抗體之胺基酸序列至少35%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基之抗體或其片段包含與本文所述之鼠類單株抗體之胺基酸序列至少40%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基之抗體或其片段包含與本文所述之鼠類單株抗體之胺基酸序列至少45%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基之抗體或其片段包含與本文所述之鼠類單株抗體之胺基酸序列至少50%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基之抗體或其片段包含與本文所述之鼠類單株抗體之胺基酸序列至少55%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基之抗體或其片段包含與本文所述之鼠類單株抗體之胺基酸序列至少60%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基之抗體或其片段包含與本文所述之鼠類單株抗體之胺基酸序列至少65%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基之抗體或其片段包含與本文所述之鼠類單株抗體之胺基酸序列至少70%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基之抗體或其片段包含與本文所述之鼠類單株抗體之胺基酸序列至少75%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基之抗體或其片段包含與本文所述之鼠類單株抗體之胺基酸序列至少80%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基之抗體或其片段包含與本文所述之鼠類單株抗體之胺基酸序列至少85%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基之抗體或其片段包含與本文所述之鼠類單株抗體之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基之抗體或其片段包含與本文所述之鼠類單株抗體之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基之抗體或其片段包含與本文所述之鼠類單株抗體之胺基酸序列至少99%一致的胺基酸序列。
在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 - 2 中所描繪之胺基酸序列至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 - 2 中所描繪之胺基酸序列至少35%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 - 2 中所描繪之胺基酸序列至少40%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 - 2 中所描繪之胺基酸序列至少45%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 - 2 中所描繪之胺基酸序列至少50%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 - 2 中所描繪之胺基酸序列至少55%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 - 2 中所描繪之胺基酸序列至少60%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 - 2 中所描繪之胺基酸序列至少65%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 - 2 中所描繪之胺基酸序列至少70%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 - 2 中所描繪之胺基酸序列至少75%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 - 2 中所描繪之胺基酸序列至少80%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 - 2 中所描繪之胺基酸序列至少85%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 - 2 中所描繪之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 - 2 中所描繪之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列。在一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 - 2 中所描繪之胺基酸序列至少99%一致的胺基酸序列。
在又另一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 中所描繪之VH CDR胺基酸序列及/或表 1 中所描繪之VL CDR胺基酸序列至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致的VH CDR及/或VL CDR胺基酸序列。在又另一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 中所描繪之VH CDR胺基酸序列及/或表 1 中所描繪之VL CDR胺基酸序列至少35%一致的VH CDR及/或VL CDR胺基酸序列。在又另一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 中所描繪之VH CDR胺基酸序列及/或表 1 中所描繪之VL CDR胺基酸序列至少40%一致的VH CDR及/或VL CDR胺基酸序列。在又另一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 中所描繪之VH CDR胺基酸序列及/或表 1 中所描繪之VL CDR胺基酸序列至少45%一致的VH CDR及/或VL CDR胺基酸序列。在又另一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 中所描繪之VH CDR胺基酸序列及/或表 1 中所描繪之VL CDR胺基酸序列至少50%一致的VH CDR及/或VL CDR胺基酸序列。在又另一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 中所描繪之VH CDR胺基酸序列及/或表 1 中所描繪之VL CDR胺基酸序列至少55%一致的VH CDR及/或VL CDR胺基酸序列。在又另一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 中所描繪之VH CDR胺基酸序列及/或表 1 中所描繪之VL CDR胺基酸序列至少60%一致的VH CDR及/或VL CDR胺基酸序列。在又另一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 中所描繪之VH CDR胺基酸序列及/或表 1 中所描繪之VL CDR胺基酸序列至少65%一致的VH CDR及/或VL CDR胺基酸序列。在又另一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 中所描繪之VH CDR胺基酸序列及/或表 1 中所描繪之VL CDR胺基酸序列至少70%一致的VH CDR及/或VL CDR胺基酸序列。在又另一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 中所描繪之VH CDR胺基酸序列及/或表 1 中所描繪之VL CDR胺基酸序列至少75%一致的VH CDR及/或VL CDR胺基酸序列。在又另一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 中所描繪之VH CDR胺基酸序列及/或表 1 中所描繪之VL CDR胺基酸序列至少80%一致的VH CDR及/或VL CDR胺基酸序列。在又另一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 中所描繪之VH CDR胺基酸序列及/或表 1 中所描繪之VL CDR胺基酸序列至少85%一致的VH CDR及/或VL CDR胺基酸序列。在又另一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 中所描繪之VH CDR胺基酸序列及/或表 1 中所描繪之VL CDR胺基酸序列至少90%一致的VH CDR及/或VL CDR胺基酸序列。在又另一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 中所描繪之VH CDR胺基酸序列及/或表 1 中所描繪之VL CDR胺基酸序列至少95%一致的VH CDR及/或VL CDR胺基酸序列。在又另一個實施例中，結合至粘附分子-4抗原決定基的抗體或其片段包含與表 1 中所描繪之VH CDR胺基酸序列及/或表 1 中所描繪之VL CDR胺基酸序列至少99%一致的VH CDR及/或VL CDR胺基酸序列。
可以使用此項技術中已知之方法產生變異，諸如寡核苷酸介導(定點)突變誘發、丙胺酸掃描及PCR突變誘發。可以對所選殖的DNA進行定點誘變(參見例如Carter, 1986, Biochem J. 237:1-7；及Zoller等人，1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-500)、卡匣突變誘發(參見例如Wells等人，1985, Gene 34:315-23)或其他已知技術，以產生抗粘附分子-4抗體變異體DNA。
不涉及維持抗粘附分子-4抗體之適當構形的任何半胱胺酸殘基亦可用例如另一胺基酸(諸如丙胺酸或絲胺酸)取代，以改良分子的氧化穩定性及防止異常交聯。反之，可在抗粘附分子-4抗體中添加半胱胺酸鍵以改良其穩定性(尤其在抗體為諸如Fv片段之抗體片段的情況下)。
在一些實施例中，本發明之抗粘附分子-4抗體分子為「去免疫」抗體。「去免疫」抗粘附分子-4抗體為來源於人類化或嵌合抗粘附分子-4抗體的抗體，其胺基酸序列具有一或多個變異，從而使抗體免疫原性相較於對應的原始未去免疫抗體降低。用於產生此類抗體突變體之程序之一涉及鑑別及移除抗體分子之T細胞抗原決定基。第一步，可以藉由若干方法測定抗體分子之免疫原性，例如藉由活體外測定T細胞抗原決定基或電腦模擬預測此類抗原決定基，如此項技術中所知。一旦已鑑別出T細胞抗原決定基功能之關鍵殘基，則可以產生突變以移除免疫原性且保持抗體活性。欲回顧，參見例如Jones等人，2009, Methods in Molecular Biology 525:405-23。20. 活體外親和力成熟
在一些實施例中，可藉由活體外親和力成熟來製備相較於親本抗體具有改良之特性(諸如親和力、穩定性或表現量)的抗體變異體。如同天然原型，活體外親和力成熟係基於突變及選擇之原理。抗體文庫係以Fab、scFv或V域片段形式呈現於生物體(例如噬菌體、細菌、酵母或哺乳動物細胞)表面上或與其編碼mRNA或DNA結合(例如共價或非共價)。所呈現抗體之親和力選擇允許分離攜帶編碼抗體之遺傳資訊的生物體或複合物。使用呈現方法(諸如噬菌體呈現)之兩或三輪突變及選擇通常產生親和力在低奈莫耳濃度範圍內之抗體片段。親和力成熟抗體可以對靶抗原具有奈莫耳濃度或甚至皮莫耳濃度之親和力。
噬菌體呈現為廣泛用於呈現及選擇抗體的方法。抗體作為與細菌噬菌體外殼蛋白的融合物呈現於Fd或M13噬菌體表面上。選擇涉及暴露於抗原以允許噬菌體所呈現的抗體結合其標靶，一種稱為「淘選」的方法。回收結合至抗原的噬菌體且用於感染細菌，以產生噬菌體供另外多輪選擇。欲回顧，參見例如Hoogenboom, 2002, Methods. Mol. Biol. 178:1-37；及Bradbury and Marks, 2004, J. Immunol. Methods 290:29-49。
在酵母呈現系統(參見例如Boder等人，1997, Nat. Biotech. 15:553-57；及Chao等人，2006, Nat. Protocols 1:755-68)中，抗體可以作為單鏈可變融合物(scFv)(其中重鏈與輕鏈藉由柔性連接子連接)呈現。scFv與酵母凝集素蛋白質Aga2p之粘附亞單元融合，該酵母凝集素蛋白質經由與Aga1p的二硫鍵連接至酵母細胞壁。蛋白質經由Aga2p呈現使該蛋白質突出而遠離細胞表面，從而使與酵母細胞壁上的其他分子之潛在相互作用最小化。使用磁性分離及流式細胞術篩選文庫，以選擇親和力或穩定性改良的抗體。對所關注之可溶性抗原的結合係藉由用經生物素標記之抗原及第二試劑(諸如與螢光團結合的抗生蛋白鏈菌素)標記酵母來測定。抗體在表面上表現的變化可經由側接scFv之紅血球凝集素或c-Myc抗原決定基標籤之免疫螢光標記來量測。表現已表明與所呈現之蛋白質之穩定性相關，且從而可以根據改良之穩定性以及親和力來選擇抗體(參見例如Shusta等人，1999, J. Mol. Biol. 292:949-56)。酵母呈現之另一優點在於，所呈現之蛋白質在真核酵母細胞之內質網中摺疊，從而利用內質網伴隨蛋白及品質控制機構。一旦完全成熟，則可以在呈現於酵母表面上的同時方便地「滴定」抗體親和力，從而消除表現及純化各種純系的需要。酵母表面呈現之理論侷限性為功能文庫尺寸潛在地比其他呈現方法小；然而，最新方法係使用酵母細胞匹配系統產生大小經估算為1014 的組合多樣性(參見例如美國專利公開案2003/0186374；及Blaise等人，2004, Gene 342:211-18)。
在核糖體呈現中，產生抗體-核糖體-mRNA (ARM)複合物以便在無細胞系統中選擇。使編碼特定抗體文庫的DNA文庫與缺乏終止密碼子的間隔子序列進行基因融合。此間隔子序列當轉譯時，仍連接至肽基tRNA且佔據核糖體隧道，且從而允許所關注之蛋白質自核糖體突出且摺疊。mRNA、核糖體及蛋白質之所得複合物可以結合至表面所結合的配位體，從而允許經由配位體的親和力捕捉來同時分離抗體及編碼其的mRNA。接著使核糖體結合的mRNA逆轉錄回cDNA，cDNA接著可以經歷突變誘發且用於下一輪選擇(參見例如Fukuda等人，2006, Nucleic Acids Res. 34:e127)。在mRNA呈現中，抗體與mRNA之間的共價鍵係使用嘌呤黴素作為轉接分子來建立(Wilson等人，2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3750-55)。
由於此等方法完全在活體外執行，因此其提供優於其他選擇技術的兩個主要優勢。首先，文庫多樣性不受細菌細胞轉型效率的限制，而僅受存在於試管中之核糖體及不同mRNA分子的數目限制。其次，在每輪選擇(例如藉由非校正聚合酶)之後，可以容易地引入隨機突變，因為文庫在任何多樣化步驟之後無需轉型。
在哺乳動物細胞呈現系統(參見例如Bowers等人，2011, Proc Natl Acad Sci USA. 108:20455-60)中，基於與預重組D(J)區域連接的生殖系序列V基因區段來構建IgG之完全人類文庫。將重鏈及輕鏈之全長V域與人類重鏈及輕鏈恆定區組裝在一起且轉染至哺乳動物細胞株(例如HEK293)中。擴增經轉染的文庫且針對抗生蛋白鏈菌素(SA)偶聯的磁性珠粒進行若干輪陰性選擇，隨後針對SA偶聯之塗有生物素化靶蛋白、肽片段或抗原決定基的磁性珠粒進行一輪陽性選擇。擴增陽性選擇的細胞，且接著藉由數輪FACS分選，以分離出呈現特異性結合至靶蛋白、肽片段或抗原決定基之抗體的單一細胞純系。來自此等單一細胞純系的重鏈與輕鏈對經由AID再轉染以便進一步成熟。若干輪哺乳動物細胞呈現聯合AID觸發的體細胞超突變，產生高特異性、高親和力抗體。
亦可以靶向方式或經由隨機引入將多樣性引入抗體文庫之CDR或整個V基因中。先前方法包括經由高量或低量突變誘發或靶向分離體細胞超突變熱點來依序靶向抗體的所有CDR(參見例如Ho等人，2005, J. Biol. Chem. 280:607-17)或基於實驗或結構原因而疑似影響親和力的殘基。亦可藉由DNA改組或類似技術置換天然多樣化的區域來引入多樣性(參見例如Lu等人，2003, J. Biol. Chem. 278:43496-507；美國專利第5,565,332號及第6,989,250號)。替代的技術靶向延伸至構架區殘基的高變環(參見例如Bond等人，2005, J. Mol. Biol. 348:699-709)，在CDR中採用環缺失及插入或使用基於雜交的多樣化(參見例如美國專利公開案第2004/0005709號)。在CDR中產生多樣性的其他方法揭示於例如美國專利第7,985,840號中。可以用於產生抗體文庫及/或抗體親和力成熟的其他方法揭示於例如美國專利第8,685,897號及第8,603,930號中，及美國公開案第2014/0170705號、第2014/0094392號、第2012/0028301號、第2011/0183855號及第2009/0075378號中，該等文獻中之每一者以引用之方式併入本文中。
可藉由此項技術中已知的多種技術實現文庫之篩選。舉例而言，可以使粘附分子-4固著於固體載體、管柱、銷或纖維素/聚(偏二氟乙烯)膜/其他過濾器上，在固定至吸附盤的宿主細胞上表現或用於細胞分選，或與生物素結合以供抗生蛋白鏈菌素塗佈的珠粒捕捉，或用於淘選呈現文庫的任何其他方法中。
欲回顧活體外親和力成熟方法，參見例如Hoogenboom, 2005, Nature Biotechnology 23:1105-16；Quiroz及Sinclair, 2010, Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51；及其中的參考文獻。21. 抗粘附分子-4抗體的修飾
抗粘附分子-4抗體之共價修飾包括於本發明之範疇內. 共價修飾包括使抗粘附分子-4抗體之靶向胺基酸殘基與有機衍生劑反應，該有機衍生劑能夠與抗粘附分子-4抗體之所選側鏈或N末端或C末端殘基反應。其他修飾包括麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基分別去醯胺化而形成相應的麩胺醯基及天冬胺醯基殘基、脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基磷酸化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基甲基化(參見例如Creighton,Proteins : Structure and Molecular Properties 79-86 (1983))、N末端胺之乙醯化，及任何C末端羧基之醯胺化。
本發明範疇內所包括之抗粘附分子-4抗體之其他類型的共價修飾包括改變抗體或多肽之原生糖基化模式(參見例如Beck等人，2008, Curr. Pharm. Biotechnol. 9:482-501；及Walsh, 2010, Drug Discov. Today 15:773-80)，及以例如以下文獻中所述之方式使抗體連接至多種非蛋白質聚合物之一，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯：美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號；或第4,179,337號。
本發明之抗粘附分子-4抗體亦可經修飾以形成嵌合分子，該等嵌合分子包含與另一異源多肽或胺基酸序列(例如抗原決定基標籤)融合的抗粘附分子-4抗體(參見例如Terpe, 2003, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:523-33)或IgG分子之Fc區域(參見例如Aruffo,Antibody Fusion Proteins 221-42 (Chamow及Ashkenazi編，1999))。
本文亦提供包含本文所提供之抗體的融合蛋白，該抗體結合至粘附分子-4抗原及異源多肽。在一些實施例中，與抗體融合的異源多肽適用於使抗體靶向細胞表面表現粘附分子-4之細胞。
本文亦提供結合至粘附分子-4抗原的一組抗體。在特定實施例中，該組抗體對粘附分子-4抗原具有不同結合速率、不同解離速率、不同親和力，且/或對粘附分子-4抗原具有不同特異性。在一些實施例中，該組抗體包含或由約10、約25、約50、約75、約100、約125、約150、約175、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約550、約600、約650、約700、約750、約800、約850、約900、約950或約1000種或超過1000種抗體組成。該組抗體可以用於例如96孔或384孔盤中，供諸如ELISA之分析用。22. 抗粘附分子-4抗體之製備
抗粘附分子-4抗體可以藉由培養經含有抗粘附分子-4抗體編碼核酸之載體轉型或轉染的細胞來產生。編碼本發明抗體之多肽組分的聚核苷酸序列可使用標準重組技術獲得。所要聚核苷酸序列可自產抗體細胞(諸如融合瘤細胞)中分離及測序。或者，可使用核苷酸合成儀或PCR技術合成聚核苷酸。編碼多肽的序列一經獲得，即插入能夠在宿主細胞中複製及表現異源聚核苷酸的重組載體中。此項技術中可獲得且已知的許多載體可用於本發明之目的。選擇適當載體主要視插入載體中的核酸尺寸及經載體轉型的特定宿主細胞而定。適用於表現本發明抗體之宿主細胞包括原核生物，諸如太古細菌及真細菌，包括革蘭氏陰性(Gram-negative)或革蘭氏陽性生物體；真核微生物，諸如絲狀真菌或酵母；無脊椎動物細胞，諸如昆蟲或植物細胞，及脊椎動物細胞，諸如哺乳動物宿主細胞株。宿主細胞用上述表現載體轉型且在適當時在經調節之習知營養物培養基中培養以便誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所要序列的基因。宿主細胞產生的抗體係使用此項技術中已知的標準蛋白質純化方法純化。
包括載體構建、表現及純化的抗體產生方法進一步描述於Plückthun等人，Antibody Engineering: Producing antibodies in Escherichia coli: From PCR to fermentation 203-52 (McCafferty等人編，1996)；Kwong及Rader,E. coli Expression and Purification of Fab Antibody Fragments , 於Current Protocols in Protein Science (2009)；Tachibana及Takekoshi,Production of Antibody Fab Fragments in Escherischia coli , 於Antibody Expression and Production (Al-Rubeai編，2011)；及Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An編，2009).
當然，預期可以利用此項技術中已熟知的替代方法製備抗粘附分子-4抗體。舉例而言，適當胺基酸序列或其一部分可以藉由使用固相技術的直接肽合成來產生(參見例如Stewart等人，Solid-Phase Peptide Synthesis (1969)；及Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54)。活體外蛋白質合成可以使用人工技術或藉由自動化技術進行。抗粘附分子-4抗體的各種部分可以用化學方式分別合成且使用化學或酶方法組合以產生所需抗粘附分子-4抗體。或者，抗體可以自經工程改造以表現抗體的基因轉殖動物之細胞或體液(諸如牛乳)中純化，如例如美國專利第5,545,807號及第5,827,690號中所揭示。23. 免疫結合物
本發明亦提供結合物，其包含藉由合成連接子共價結合至一或多種非抗體藥劑的本發明任一種抗粘附分子-4抗體。
在一些實施例中，本文所提供之抗體與例如診斷或可偵測分子結合或重組融合。結合或重組融合的抗體可以適用於例如監測或預後粘附分子-4介導疾病之發作、發展、進展及/或嚴重程度。
此類診斷及偵測可以例如藉由使抗體與可偵測物質偶合來完成，該等可偵測物質包括(但不限於)各種酶，諸如(但不限於)辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，諸如(但不限於)抗生蛋白鏈菌素/生物素或抗生物素蛋白/生物素；螢光物質，諸如(但不限於)傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光物質，諸如(但不限於)魯米諾(luminol)；生物發光物質，諸如(但不限於)螢光素酶、螢光素或水母素；化學發光物質，諸如(但不限於)基於吖錠的化合物或HALOTAG；放射性物質，諸如(但不限於)碘(131 I、125 I、123 I及121 I)、碳(14 C)、硫(35 S)、氚(3 H)、銦(115 In、113 In、112 In及111 In)、鎝(99 Tc)、鉈(201 Ti)、鎵(68 Ga及67 Ga)、鈀(103 Pd)、鉬(99 Mo)、氙(133 Xe)、氟(18 F)、153 Sm、177 Lu、159 Gd、149 Pm、140 La、175 Yb、166 Ho、90 Y、47 Sc、186 Re、188 Re、142 Pr、105 Rh、97 Ru、68 Ge、57 Co、65 Zn、85 Sr、32 P、153 Gd、169 Yb、51 Cr、54 Mn、75 Se、113 Sn或117 Sn；各種正電子發射斷層攝影使用的正電子發射金屬；及非放射性順磁金屬離子。
本文亦提供與異源蛋白質或多肽(或其片段，例如約10、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90或約100個胺基酸之多肽)重組融合或化學結合(共價或非共價結合)的抗體，以產生融合蛋白；以及其用途。特定言之，本文提供包含本文所提供抗體之抗原結合片段(例如Fab片段、Fc片段、Fv片段、F(ab)2 片段、VH域、VH CDR、VL域或VL CDR)與異源蛋白質、多肽或肽的融合蛋白。在一個實施例中，與抗體融合的異源蛋白質、多肽或肽適用於使抗體靶向特定細胞類型，諸如表現粘附分子-4的細胞。舉例而言，結合至特定細胞類型所表現之細胞表面受體的抗體可以與本文所提供之經修飾抗體融合或結合。
此外，本文所提供之抗體可與標記物或「標籤」序列(諸如肽)融合，以促進純化。在特定實施例中，標記物或標籤胺基酸序列為六組胺酸肽，諸如pQE載體中所提供的標籤(參見例如QIAGEN, Inc.)，以及市售的多種標籤。舉例而言，如Gentz等人，1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-24中所述，六組胺酸為融合蛋白之純化提供方便。適用於純化的其他肽標籤包括(但不限於)紅血球凝集素(「HA」)標籤，其對應於來源於流感紅血球凝集素蛋白質的抗原決定基(Wilson等人，1984, Cell 37:767-78)；抗生蛋白鏈菌素/抗生物素蛋白結合肽；及「FLAG」標籤。
用於各部分(包括多肽)與抗體融合或結合的方法已知(參見例如Arnon等人，Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy , 於Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 243-56 (Reisfeld等人編，1985)；Hellstrom等人，Antibodies for Drug Delivery , 於Controlled Drug Delivery 623-53 (Robinson等人編，第2版，1987)；Thorpe,Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review , 於Monoclonal Antibodies: Biological and Clinical Applications 475-506 (Pinchera等人編，1985)；Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy , 於Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy 303-16 (Baldwin等人編，1985)；Thorpe等人，1982, Immunol. Rev. 62:119-58; 美國專利第5,336,603號、第5,622,929號、第5,359,046號、第5,349,053號、第5,447,851號、第5,723,125號、第5,783,181號、第5,908,626號、第5,844,095號及第5,112,946號；EP 307,434、EP 367,166、EP 394,827；PCT公開案WO 91/06570、WO 96/04388、WO 96/22024、WO 97/34631及WO 99/04813；Ashkenazi等人，1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-39；Traunecker等人，1988, Nature, 331:84-86；Zheng等人，1995, J. Immunol. 154:5590-600；及Vil等人，1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-41)。
融合蛋白可經由例如基因改組、基元改組、外顯子改組及/或密碼子改組(統稱為「DNA改組」)之技術產生。DNA改組可以用於改變如本文所提供之抗粘附分子-4抗體的活性，包括例如具有較高親和力及較低解離速率的抗體(參見例如美國專利第5,605,793號、第5,811,238號、第5,830,721號、第5,834,252號及第5,837,458號；Patten等人，1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82；Hansson等人，1999, J. Mol. Biol. 287:265-76；及Lorenzo及Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-13)。抗體或所編碼的抗體在重組之前可以藉由進行易錯PCR之隨機突變誘發、隨機核苷酸插入或其他方法來改變。編碼本文所提供之抗體的聚核苷酸可以與一或多種異源分子之一或多種組分、基元、區段、部分、域、片段等重組。
本文所提供之抗體亦可與第二抗體結合以形成抗體雜結合物，如例如美國專利第4,676,980號所述。
如本文所提供之結合至粘附分子-4的抗體亦可連接至特別適用於免疫分析或純化靶抗原的固體載體。此類固體載體包括(但不限於)玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、耐綸、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
連接子可為促進結合劑在細胞中釋放的「可裂解連接子」，但本文中亦涵蓋不可裂解連接子。用於本發明之結合物中的連接子包括(但不限於)酸性不穩定連接子(例如腙連接子)、含二硫鍵連接子、肽酶敏感性連接子(例如包含胺基酸(例如纈胺酸及/或瓜胺酸，諸如瓜胺酸-纈胺酸或苯丙胺酸-離胺酸)的肽連接子)、光不穩定性連接子、二甲基連接子(參見例如Chari等人，1992, Cancer Res. 52:127-31；及美國專利第5,208,020號)、硫醚連接子，或經設計以規避多藥轉運體介導抗藥性的親水性連接子(參見例如Kovtun等人，2010, Cancer Res. 70:2528-37)。
抗體與藥劑之結合物可以使用多種雙官能蛋白質偶合劑製備，雙官能蛋白質偶合劑諸如BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB及SVSB (丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)。本發明進一步預期抗體與藥劑之結合物可以使用如此項技術中所揭示的任何適合方法製備(參見例如Bioconjugate Techniques (Hermanson編，第2版，2008))。
抗體與藥劑之習知結合策略已基於涉及Lys殘基之ε-胺基或Cys殘基之硫醇基的隨機結合化學反應，從而產生異質結合物。最近開發的技術允許與抗體定點結合，從而產生均質負載且避免結合物亞群的抗原結合或藥物動力學發生變化。此等技術包括對「硫基單抗」進行工程改造，包含在重鏈及輕鏈之位置上進行半胱胺酸取代，從而提供反應性硫醇基且不中斷免疫球蛋白摺疊及組裝或改變抗原結合(參見例如Junutula等人，2008, J. Immunol. Meth. 332: 41-52；及Junutula等人，2008, Nature Biotechnol. 26:925-32)。在另一方法中，硒半胱胺酸係藉由將終止密碼子UGA解碼(自終止至硒半胱胺酸插入)將以共轉譯方式插入抗體序列中，從而允許在其他天然胺基酸存在下在硒半胱胺酸之親核硒醇基團處發生定點共價結合(參見例如Hofer等人，2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:12451-56；及Hofer等人，2009, Biochemistry 48(50):12047-57)。
在其他實施例中，本文提供與治療部分(或一或多種治療部分)結合或重組融合的抗體。抗體可與治療部分(諸如細胞毒素，例如細胞抑制劑或殺細胞劑)、治療劑或放射性金屬離子(例如α-發射體)結合或重組融合。細胞毒素或細胞毒性劑包括損害細胞之任何藥劑。治療部分包括(但不限於)抗代謝物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪(5-fluorouracil decarbazine))；烷基化劑(例如二氯甲二乙胺(mechlorethamine)、噻替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)及洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、環硫磷醯胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C (mitomycin C)，及順二氯二胺鉑(II)(DDP)，及順鉑(cisplatin))；蒽環黴素(anthracyclines)(例如道諾黴素(daunorubicin)(先前為柔紅黴素(daunomycin))及小紅莓(doxorubicin))；抗生素(例如d放線菌素(d actinomycin)(先前為放線菌素)、博萊黴素(bleomycin)、光神黴素(mithramycin)及安麯黴素(anthramycin)(AMC))；奧瑞他汀(Auristatin)分子(例如奧瑞他汀PHE、苔蘚蟲素1 (bryostatin 1)及索拉塔汀10 (solastatin 10)；參見Woyke等人，Antimicrob. Agents Chemother. 46:3802-8 (2002)；Woyke等人，Antimicrob. Agents Chemother. 45:3580-4 (2001)；Mohammad等人，Anticancer Drugs 12:735-40 (2001)；Wall等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:76-80 (1999)；Mohammad等人，Int. J. Oncol. 15:367-72 (1999)，所有該等文獻均以引用的方式併入本文中)；激素(例如糖皮質激素、孕激素、雄激素及雌激素)、DNA修復酶抑制劑(例如依託泊苷(etoposide)或拓朴替康(topotecan))、激酶抑制劑(例如化合物ST1571、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)(Kantarjian等人，Clin Cancer Res.8(7):2167-76(2002))；細胞毒性劑(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、細胞鬆弛素B (cytochalasin B)、短桿菌素D (gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根素(emetine)、絲裂黴素、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicin)、小紅莓、道諾黴素、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、放線菌素D、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同源物以及以下文獻中所揭示的彼等化合物：美國專利第6,245,759號、第6,399,633號、第6,383,790號、第6,335,156號、第6,271,242號、第6,242,196號、第6,218,410號、第6,218,372號、第6,057,300號、第6,034,053號、第5,985,877號、第5,958,769號、第5,925,376號、第5,922,844號、第5,911,995號、第5,872,223號、第5,863,904號、第5,840,745號、第5,728,868號、第5,648,239號、第5,587,459)；法呢基轉移酶抑制劑(例如R115777、BMS-214662，及例如以下文獻中所揭示的彼等物：美國專利第6,458,935號、第6,451,812號、第6,440,974號、第6,436,960號、第6,432,959號、第6,420,387號、第6,414,145號、第6,410,541號、第6,410,539號、第6,403,581號、第6,399,615號、第6,387,905號、第6,372,747號、第6,369,034號、第6,362,188號、第6,342,765號、第6,342,487號、第6,300,501號、第6,268,363號、第6,265,422號、第6,248,756號、第6,239,140號、第6,232,338號、第6,228,865號、第6,228,856號、第6,225,322號、第6,218,406號、第6,211,193號、第6,187,786號、第6,169,096號、第6,159,984號、第6,143,766號、第6,133,303號、第6,127,366號、第6,124,465號、第6,124,295號、第6,103,723號、第6,093,737號、第6,090,948號、第6,080,870號、第6,077,853號、第6,071,935號、第6,066,738號、第6,063,930號、第6,054,466號、第6,051,582號、第6,051,574號及第6,040,305號)；拓樸異構酶抑制劑(例如喜樹鹼(camptothecin)；伊立替康(irinotecan)；SN-38；拓朴替康(topotecan)；9-胺基喜樹鹼；GG-211 (GI 147211)；DX-8951f；IST-622；盧比替康(rubitecan)；派拉瑞丁(pyrazoloacridine)；XR-5000；散特平(saintopin)；UCE6；UCE1022；TAN-1518A；TAN 1518B；KT6006；KT6528；ED-110；NB-506；ED-110；NB-506；及蝴蝶黴素(rebeccamycin))；膠陀螺(bulgarein)；DNA小溝結合劑，諸如Hoescht染料33342及Hoechst染料33258；兩面針鹼(nitidine)；花椒寧鹼(fagaronine)；表小檗鹼(epiberberine)；甲氧檗因(coralyne)；β-拉帕酮(beta-lapachone)；BC-4-1；雙膦酸鹽(例如阿侖膦酸鹽(alendronate)、英卡膦酸鹽(cimadronte)、氯屈膦酸鹽(clodronate)、替魯膦酸鹽(tiludronate)、依替膦酸鹽(etidronate)、伊班膦酸鹽(ibandronate)、奈立膦酸鹽(neridronate)、奧潘膦酸鹽(olpandronate)、利塞膦酸鹽(risedronate)、吡利膦酸鹽(piridronate)、帕米膦酸鹽(pamidronate)、左侖膦酸鹽(zolendronate))、HMG-CoA還原酶抑制劑(例如洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、普伐他汀(pravastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、抑制素、西立伐他汀(cerivastatin)、來斯考(lescol)、魯匹特(lupitor)、羅素他汀(rosuvastatin)及阿托伐他汀(atorvastatin))；反義寡核苷酸(例如美國專利第6,277,832號、第5,998,596號、第5,885,834號、第5,734,033號及第5,618,709號中所揭示的彼等物)；腺苷脫胺酶抑制劑(例如磷酸氟達拉濱(Fludarabine phosphate)及2-氯去氧腺苷)；替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)(Zevalin®)；托西莫單抗(tositumomab)(Bexxar®))及其醫藥學上可接受之鹽、溶劑化物、晶籠化合物及前藥。
此外，本文所提供之抗體可與改變所指定生物反應之治療部分或藥物部分結合或重組融合。治療部分或藥物部分不應解釋為限於經典化學治療劑。舉例而言，藥物部分可為具有所要生物活性之蛋白質、肽或多肽。此類蛋白質可以包括例如毒素，諸如相思子毒素、蓖麻毒素A、綠膿桿菌外毒素、霍亂毒素或白喉毒素；蛋白質，諸如腫瘤壞死因子、γ-干擾素、α-干擾素、神經生長因子、血小板源生長因子、組織血纖維蛋白溶酶原活化劑；細胞凋亡劑，例如TNF-γ、TNF-γ、AIM I (參見國際公開案第WO 97/33899號)、AIM II (參見國際公開案第WO 97/34911號)、Fas配位體(Takahashi等人，1994, J. Immunol., 6:1567-1574)，及VEGF (參見國際公開案第WO 99/23105號)；抗血管生成劑，例如血管抑制素、內皮抑制素或凝血路徑組分(例如組織因子)；或生物反應調節劑，諸如淋巴介質(例如干擾素γ、介白素-1 (「IL-1」)、介白素-2(「IL-2」)、介白素-5 (「IL-5」)、介白素-6 (「IL-6」)、介白素-7 (「IL-7」)、介白素9 (「IL-9」)、介白素-10 (「IL-10」)、介白素-12 (「IL-12」)、介白素-15 (「IL-15」)、介白素-23 (「IL-23」)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(「GM-CSF」)，及粒細胞群落刺激因子(「G-CSF」))，或生長因子(例如生長激素(「GH」))，或凝血劑(例如鈣、維生素K、組織因子，諸如(但不限於)哈格曼因子(Hageman factor)(因子XII)、高分子量激肽原(HMWK)、前激肽釋放素(PK)、凝血蛋白質因子II (凝血酶原)、因子V、XIIa、VIII、XIIIa、XI、XIa、IX、IXa、X、磷脂及纖維蛋白單體)。
應選擇與本文所提供之免疫特異性結合至粘附分子-4抗原之抗體結合或重組融合的治療部分或藥物，以達成所需預防或治療效果。在某些實施例中，該抗體為經修飾之抗體。臨床醫師或其他醫療人員在對決定用哪種治療部分或藥物與本文所提供之抗體結合或重組融合時應考慮以下：疾病性質、疾病嚴重程度，及個體狀況。
如本文所用，「抗粘附分子-4抗體藥物結合物」或「抗粘附分子-4 ADC」係指與治療部分(或一或多種治療部分)結合或重組融合的抗粘附分子-4抗體或其抗原結合片段，或與調節指定生物反應之治療部分或藥物部分結合或重組融合的抗粘附分子-4抗體或其抗原結合片段，如上文所述。
本文中提供抗粘附分子-4 ADC，包括特異性結合至粘附分子-4的抗粘附分子-4抗體。本文亦提供抗粘附分子-4 ADC，包括本文所提供的抗粘附分子-4抗體或其抗原結合片段。24. 使用抗體及組合物的方法
在一個態樣中，本文中提供一種抑制細胞增殖(例如降低細胞數目倍增的速率、減緩細胞數目增加速率，或阻斷或防止細胞數目增加)的方法，包含使細胞與有效量的本文所提供抗粘附分子-4 ADC接觸。
在一個態樣中，本文提供抑制細胞增殖的方法，包含使細胞與抗粘附分子-4 ADC接觸，該ADC包括如本文所提供的特異性結合至粘附分子-4 (例如人類粘附分子-4之ECD或人類粘附分子-4之ECD的抗原決定基)之抗粘附分子-4抗體。在某些實施例中，使細胞與有效量的如本文所述抗粘附分子-4 ADC接觸。在一些實施例中，抗粘附分子-4 ADC結合至人類粘附分子-4之ECD。在一些實施例中，抗粘附分子-4 ADC結合至人類粘附分子-4之ECD的抗原決定基。在某些實施例中，抗粘附分子-4 ADC特異性結合至與粘附分子-4配位體結合位點不同之人類粘附分子-4之ECD的抗原決定基。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約10%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約15%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約20%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約25%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約30%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約35%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約40%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約45%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約50%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約55%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約60%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約65%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約70%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約75%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約80%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約85%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約90%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約95%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約98%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約99%。在一些實施例中，細胞增殖被抑制至少約100%。在某些實施例中，細胞增殖被抑制至少約25%至約65%。在特定實施例中，藉由本文所述之方法評估細胞增殖的抑制。在一些實施例中，藉由熟習此項技術者已知的方法評估細胞增殖的抑制。在某些實施例中，細胞增殖的抑制係相對於與抗粘附分子-4 ADC不接觸之細胞之增殖的抑制而言。在某些實施例中，細胞增殖的抑制係與無關抗體(例如不特異性結合至粘附分子-4的抗體)、無關抗體ADC或未結合之抗粘附分子-4抗體接觸之細胞增殖的抑制而言。25. 醫藥組合物
在一個態樣中，本發明進一步提供包含本發明之至少一種抗粘附分子-4 ADC的醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含1)抗粘附分子-4抗體，及2)醫藥學上可接受之載劑。
藉由將具有所需純度之抗粘附分子-4 ADC與視情況存在之生理學上可接受載劑、賦形劑或穩定劑(參見例如Remington,Remington ' s Pharmaceutical Sciences (第18版，1980))混合來製備包含抗粘附分子-4 ADC的醫藥組合物供儲存，其呈水溶液或凍乾或其他乾燥形式。
本發明之抗體可以調配成任何適合之形式用於遞送至靶細胞/組織，例如調配成微膠囊或巨乳液形式(Remington, 同上；Park等人，2005, Molecules 10:146-61；Malik等人，2007, Curr. Drug. Deliv. 4:141-51)、持續釋放調配物(Putney及Burke, 1998, Nature Biotechnol. 16:153-57)，或脂質體(Maclean等人，1997, Int. J. Oncol. 11:325-32；Kontermann, 2006, Curr. Opin. Mol. Ther. 8:39-45)。
亦可將本文所提供的抗粘附分子-4 ADC截留於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備的微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊))中、截留於膠狀藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或截留於巨乳液中。此類技術揭示於例如Remington (同上)中。
已知各種組合物及遞送系統且可以用於結合至粘附分子-4之如本文所述抗粘附分子-4 ADC，包括(但不限於)囊封於脂質體中、微米顆粒、微膠囊、能夠表現抗粘附分子-4 ADC之重組細胞、受體介導之胞吞作用(參見例如Wu及Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-32)、構建核酸作為逆轉錄病毒或其他載體之一部分等。在另一個實施例中，組合物可以控制釋放或持續釋放系統形式提供。在一個實施例中，可以使用泵浦達成控制或持續釋放(參見例如Langer, 同時；Sefton, 1987, Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201-40；Buchwald等人，1980, Surgery 88:507-16；及Saudek等人，1989, N. Engl. J. Med. 321:569-74)。在另一個實施例中，可以使用聚合物材料達成預防劑或治療劑(例如如本文所述的抗粘附分子-4 ADC)或本文所提供組合物的控制或持續釋放。(參見例如Medical Applications of Controlled Release (Langer及Wise編，1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen及Ball編，1984)；Ranger及Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61-126；Levy等人，1985, Science 228:190-92；During等人，1989, Ann. Neurol. 25:351-56；Howard等人，1989, J. Neurosurg. 71:105-12；美國專利第5,679,377號、第5,916,597號、第5,912,015號、第5,989,463號及第5,128,326號；PCT公開案第WO 99/15154號及第WO 99/20253號)。持續釋放型調配物中所用之聚合物之實例包括(但不限於)聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚乳酸交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)及聚原酸酯。在一個實施例中，持續釋放型調配物中所用之聚合物呈惰性，不含可浸出雜質，儲存穩定，無菌且可生物降解。
在又另一個實施例中，可以將控制或持續釋放系統置放於特定目標組織附近，例如鼻腔通道或肺，因此僅需要全身劑量之一部分(參見例如Goodson,Medical Applications of Controlled Release 第2卷, 115-38 (1984))。控制釋放系統論述於例如Langer, 1990, Science 249:1527-33中。熟習此項技術者已知的任何技術可以用於產生持續釋放調配物，其包含一或多種結合至粘附分子-4的如本文所述抗體(參見例如美國專利第4,526,938號、PCT公開案第WO 91/05548號及第WO 96/20698號；Ning等人，1996, Radiotherapy & Oncology 39:179-89；Song等人，1995, PDA J. of Pharma. Sci. & Tech. 50:372-97；Cleek等人，1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-54；及Lam等人，1997, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-60)。
可以藉由使具有所需純度之抗粘附分子-4 ADC與視情況存在之生理學上可接受載劑、賦形劑或穩定劑(Remington ' s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA)混合來製備本文所提供之含有一或多種本文所提供抗體的治療調配物供儲存，其呈凍乾調配物或水溶液形式。可接受的載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者為無毒的，且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；苯酚；丁醇或苯甲醇；對羥苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及莫耳甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn蛋白錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。
本文所提供之抗體亦可例如調配成脂質體。含有所關注之分子的脂質體藉由此項技術中已知之方法製備，諸如以下文獻中所述：Epstein等人，(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688；Hwang等人，(1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030；及美國專利第4,485,045號及第4,544,545號。循環時間延長的脂質體揭示於美國專利第5,013,556號中。
尤其適用之免疫脂質體可藉由逆相蒸發法、用含有磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生化磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物產生。脂質體經由孔隙尺寸限定的過濾器擠出，以產生具有所需直徑之脂質體。本文所提供之抗粘附分子-4 ADC的Fab'片段可以經由二硫鍵互換反應與脂質體結合，如Martin等人(1982)J . Biol . Chem . 257:286-288中所述。化學治療劑(諸如小紅莓)視情況包含於脂質體內；參見Gabizon等人，(1989)J . National Cancer Inst . 81(19):1484。
調配物，諸如本文所述之彼等物，視需要亦可含有超過一種活性化合物用於所治療的特定適應症。在某些實施例中，調配物包含本文所提供的抗粘附分子-4 ADC及一或多種活性化合物，該等活性化合物具有彼此無有害影響的互補活性。此類分子宜以對預期目的有效之量組合存在。舉例而言，本文所提供的抗粘附分子-4 ADC可以與一或多種其他治療劑組合。此類組合療法可以連續或同時或依序投與患者。
亦可將本文所提供的抗粘附分子-4 ADC截留於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備的微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊))中、截留於膠狀藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或截留於巨乳液中。此類技術揭示於Remington ' s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA中。
用於活體內投與之調配物可為無菌的。此容易藉由例如無菌過濾膜過濾來完成。
亦可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗粘附分子-4 ADC之固體疏水性聚合物半滲透基質，該等基質呈成形物品形式，例如膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOTTM (由乳酸-乙醇酸共聚物及亮丙立德乙酸酯(leuprolide acetate)構成之可注射微球體))，及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物允許分子釋放逾100天，但某些水凝膠釋放蛋白質的時間較短。若囊封抗體長時間留存於體內，則其可能因在37℃下暴露於水分而變性或聚集，導致生物活性損失及可能的免疫原性變化。可以設計合理的穩定策略，此視所涉及的機制而定。舉例而言，若發現聚集機制為經由硫基-二硫鍵互換而形成分子間S--S鍵，則穩定化可藉由修飾巰基殘基、自酸性溶液凍乾、控制水分含量、使用適當添加劑及開發特定聚合物基質組合物來達成。
本文所提供的醫藥組合物含有治療有效量的本文所提供之一或多種抗體及視情況存在的一或多種其他預防劑或治療劑於醫藥學上可接受之載劑中。此類醫藥組合物適用於預防、治療、管理或改善粘附分子-4介導的疾病或其一或多種症狀。
適於投與本文所提供化合物之醫藥載劑包括熟習此項技術者已知之適於特定投藥模式的任何此類載劑。
另外，本文所提供之抗體可以作為唯一的醫藥活性成分調配於組合物中或可以與其他活性成分(諸如一或多種其他預防劑或治療劑)合併。
組合物可以含有本文所提供之一或多種抗體。在一個實施例中，抗體調配成適合醫藥製劑，諸如溶液、懸浮液、錠劑、可分散錠劑、藥丸、膠囊、散劑、持續釋放調配物或酏劑以供經口投與或調配成無菌溶液或懸浮液以供非經腸投與，以及調配成經皮貼片製劑及乾燥粉末吸入劑。在一個實施例中，上述抗體係使用此項技術中熟知之技術及程序調配成醫藥組合物(參見例如Ansel (1985)Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms , 第4版，第126頁)。
在組合物中，將有效濃度的一或多種抗體或其衍生物與適合的醫藥載劑混合。投與後，組合物中的化合物濃度有效遞送治療、預防或改善粘附分子-4介導疾病或其症狀的量。
在一個實施例中，組成物經調配用於單次劑量投與。為調配組合物，將一定重量分率的化合物以有效濃度溶解、懸浮、分散或以其他方式混合在所選載劑中，以使得所治療之病狀得到減輕、預防，或一或多種症狀得到改善。
本文中提供的抗粘附分子-4 ADC在對所治療之患者缺乏非所需副作用的情況下以足以發揮治療適用效應的有效量包括於醫藥學上可接受之載劑中。治療有效濃度可憑經驗如下確定：在活體外及活體內系統中測試化合物且接著由其外推用於人類之劑量。
醫藥組合物中之抗粘附分子-4 ADC濃度取決於例如抗粘附分子-4 ADC之物理化學特徵、劑量時程，及投藥量以及熟習此項技術者已知的其他因素。
在一個實施例中，治療有效劑量產生約0.1 ng/ml至約50-100 µg/ml之抗粘附分子-4 ADC血清濃度。在另一實施例中，醫藥組合物提供每天每公斤體重約0.001 mg至約2000 mg抗粘附分子-4 ADC之劑量。可以製備單位醫藥劑型以約0.01 mg、0.1 mg或1 mg至約500 mg、1000 mg或2000 mg且在一個實施例中約10 mg至約500 mg抗粘附分子-4 ADC及/或視情況存在之每單位劑型其他必需成分之組合。
抗粘附分子-4 ADC可以一次性投與，或可分成多次較小劑量在間隔時間投與。應瞭解，治療之確切劑量及持續時間隨所治療之疾病而變，且可以使用已知測試方案或藉由自活體內或活體外測試資料外推而憑經驗確定。應注意，濃度及劑量值亦可隨待緩解之病狀的嚴重程度而變化。應進一步理解，對任何特定個體而言，特定劑量方案可以根據個體需要及投與組合物或監督組合物投與之人員的專業判斷而隨時間調整，且本文所闡述之濃度範圍僅具例示性，而不意欲限制所主張之組合物的範疇或實施。
在混合或添加抗粘附分子-4 ADC之後，所得混合物可為溶液、懸浮液、乳液或其類似物。所得混合物之形式視多種因素而定，包括預定投藥模式及化合物於所選載劑或媒劑中之溶解度。有效濃度足以改善所治療之疾病、病症或病狀之症狀且可憑經驗確定。
提供的醫藥組合物以單位劑型投與人類及動物，單位劑型諸如錠劑、膠囊、藥丸、散劑、顆粒、無菌非經腸溶液或懸浮液，及口服溶液或懸浮液，及水包油型乳液，其含有適量之化合物或其醫藥學上可接受之衍生物。在一個實施例中，抗粘附分子-4 ADC以單位劑型或多劑型調配及投與。如本文所用，單位劑型係指適用於人類及動物個體且如此項技術中所知個別包裝的實體不連續單元。各單位劑量含有足以產生所需治療作用之預定量的抗粘附分子-4 ADC，與所需醫藥載劑、媒劑或稀釋劑。單位劑型之實例包括安瓿及注射器及個別包裝之錠劑或膠囊。單位劑型可以分數份或其倍數投與。多劑型為封裝於單一容器中之待以隔離單位劑型投與的複數個相同單位劑型。多劑型之實例包含小瓶、錠劑或膠囊瓶，或品脫(pints)或加侖(gallons)瓶。因此，多劑型為封裝時未隔離之多個單位劑量。
在一些實施例中，本文所提供之一或多種抗粘附分子-4抗體存在於液體醫藥調配物中。醫藥學上可投與之液體組合物可以如下製備：例如將如上文所定義之活性化合物溶解、分散或以其他方式與視情況存在之醫藥佐劑混合於載劑(諸如水、生理鹽水、右旋糖水溶液、甘油、二醇、乙醇及其類似物)中，從而形成溶液或懸浮液。必要時，待投與之醫藥組合物亦可含有少量無毒助劑，諸如濕潤劑、乳化劑、增溶劑、pH緩衝劑及其類似物，例如乙酸鹽、檸檬酸鈉、環糊精衍生物、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺乙酸鈉、三乙醇胺油酸鹽及其他此類藥劑。
製備此類劑型之實際方法為熟習此項技術者已知的或顯而易見的；參見例如Remington ' s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA。
可製備含有0.005%至100%範圍內之抗粘附分子-4 ADC且其餘部分由無毒載劑構成的劑型或組合物。熟習此項技術者已知製備此等組合物之方法。
口服醫藥劑型為固體、凝膠或液體。固體劑型為錠劑、膠囊、顆粒及塊狀散劑。口服錠劑之類型包含經壓縮的咀嚼口含錠及可包覆腸溶包衣、包覆糖衣或包覆膜衣之錠劑。膠囊可為硬或軟明膠膠囊，而顆粒及散劑可以與熟習此項技術者已知之其他成分組合之非泡騰或泡騰形式提供。
在某些實施例中，調配物為固體劑型。在某些實施例中，調配物為膠囊或錠劑。錠劑、丸劑、膠囊、糖衣錠及其類似物可以含有一或多種以下成分或具有類似性質之化合物：黏合劑；潤滑劑；稀釋劑；滑動劑；崩解劑；著色劑；甜味劑；調味劑；濕潤劑；防吐包衣及膜包衣。黏合劑之實例包含微晶纖維素、黃蓍膠、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠溶液、糖蜜、聚乙烯吡咯啶、普維酮(povidone)、交聯普維酮(crospovidones)、蔗糖及澱粉糊。潤滑劑包括滑石、澱粉、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、石松及硬脂酸。稀釋劑包括例如乳糖、蔗糖、澱粉、高嶺土、鹽、甘露糖醇及磷酸二鈣。滑動劑包括(但不限於)膠態二氧化矽。崩解劑包括交聯羧甲基纖維素鈉、羥基乙酸澱粉鈉、海藻酸、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、膨潤土、甲基纖維素、瓊脂及羧甲基纖維素。著色劑包括例如經批准認證之水溶性FD及C染料、其混合物中之任一者；及懸浮於水合氧化鋁上之水不溶性FD及C染料。甜味劑包括蔗糖、乳糖、甘露糖醇及人造甜味劑，諸如糖精，及任何數目種噴霧乾燥調味劑。調味劑包括自植物(諸如水果)萃取之天然調味劑，及產生令人愉快感覺之化合物的合成摻合物，諸如(但不限於)胡椒薄荷及水楊酸甲酯。濕潤劑包含丙二醇單硬脂酸酯、脫水山梨糖醇單油酸酯、二乙二醇單月桂酸酯及聚氧乙烯月桂醚。防吐包衣包括脂肪酸、脂肪、蠟、蟲膠、氨化蟲膠及鄰苯二甲酸乙酸纖維素。膜衣包括羥乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙二醇4000及鄰苯二甲酸乙酸纖維素。
抗體可以保護其以免受胃酸性環境影響之組合物提供。舉例而言，組合物可以在腸溶包衣中調配，以維持其在胃中之完整性且將活性化合物釋放於腸中。組合物亦可與抗酸藥或其他此類成分組合調配。
當單位劑型為膠囊時，除上述類型之材料之外，其亦可含有液體載劑，諸如脂肪油。另外，單位劑型可含有修改單位劑型之實體形式之各種其他材料，例如糖包衣及其他腸溶劑。化合物亦可作為酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙、撒佈物、口嚼錠或其類似劑型之組分投與。除活性化合物之外，糖漿亦可含有蔗糖作為甜味劑，及某些防腐劑、染料及著色劑及調味劑。
抗粘附分子-4 ADC亦可與不削弱所要作用之其他活性物質混合或與增補所要作用之物質混合，諸如解酸劑、H2阻斷劑及利尿劑。活性成分為如本文所述的抗粘附分子-4 ADC或其醫藥學上可接受的衍生物。可以包括較高濃度(高達約98重量%)之活性成分。
在所有實施例中，錠劑及膠囊調配物可如熟習此項技術者所知進行包覆，以便修改或維持活性成分之溶解。因此，舉例而言，其可用習知腸溶可消化包衣(諸如水楊酸苯酯、蠟及鄰苯二甲酸乙酸纖維素)包覆。
在一些實施例中，調配物為液體劑型。液體口服劑型包括由非泡騰顆粒復原之水溶液、乳液、懸浮液、溶液及/或懸浮液，及由泡騰顆粒復原之泡騰製劑。水溶液包括例如酏劑及糖漿。乳液為水包油型或油包水型。
酏劑為透明、加糖之水醇性製劑。酏劑中使用的醫藥學上可接受之載劑包括溶劑。糖漿為糖(例如蔗糖)之濃縮水溶液且可含有防腐劑。乳液為兩相系統，其中一種液體以小液珠形式分散於整個另一液體中。乳液中使用的醫藥學上可接受之載劑為非水性液體、乳化劑及防腐劑。懸浮液使用醫藥學上可接受之懸浮劑及防腐劑。欲復原成液體口服劑型之非泡騰顆粒中使用的醫藥學上可接受之物質包括稀釋劑、甜味劑及濕潤劑。欲復原成液體口服劑型之泡騰顆粒中使用的醫藥學上可接受之物質包括有機酸及二氧化碳源。所有上述劑型中均使用著色劑及調味劑。
溶劑包括甘油、山梨糖醇、乙醇及糖漿。防腐劑之實例包括甘油、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸、苯甲酸鈉及乙醇。乳液中所用的非水性液體之實例包括礦物油及棉籽油。乳化劑之實例包括明膠、阿拉伯膠、黃蓍膠、膨潤土，及界面活性劑，諸如聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。懸浮劑包括羧甲基纖維素鈉、果膠、黃蓍膠、維格姆(Veegum)及阿拉伯膠。甜味劑包含蔗糖、糖漿、甘油及人造甜味劑，諸如糖精。濕潤劑包含丙二醇單硬脂酸酯、脫水山梨糖醇單油酸酯、二乙二醇單月桂酸酯及聚氧乙烯月桂醚。有機酸包括檸檬酸及酒石酸。二氧化碳之來源包括碳酸氫鈉及碳酸鈉。著色劑包括批准的經認證之水溶性FD及C染料中之任一者，及其混合物。調味劑包括自植物(諸如水果)萃取之天然調味劑，及產生令人愉快之味覺之化合物的合成摻合物。
對於固體劑型而言，在一個實施例中，將溶液或懸浮液(例如碳酸丙烯酯、植物油或三酸甘油酯中之溶液或懸浮液)囊封於明膠膠囊中。此類溶液及其製備及囊封揭示於美國專利第4,328,245號；第4,409,239號；及第4,410,545號中。對於液體劑型而言，溶液(例如聚乙二醇中之溶液)可以用足量的醫藥學上可接受之液體載劑(例如水)稀釋，該量容易根據投藥量度。
或者，可藉由將活性化合物或鹽溶解或分散於植物油、二醇、三酸甘油酯、丙二醇酯(例如碳酸丙二酯)及其他此類載劑中且將此等溶液或懸浮液囊封於硬或軟明膠膠囊殼中來製備液體或半固體口服調配物。其他適用調配物包括美國專利第RE28,819號及第4,358,603號中所闡述之彼等調配物。簡言之，此類調配物包括(但不限於)含有本文所提供化合物的彼等調配物、二烷基化單烷二醇或聚烷二醇，包括(但不限於) 1,2-二甲氧基甲烷、二乙二醇二甲醚、三乙二醇二甲醚、四乙二醇二甲醚、聚乙二醇-350-二甲醚、聚乙二醇-550-二甲醚、聚乙二醇-750-二甲醚(其中350、550及750係指聚乙二醇之近似平均分子量)，及一或多種抗氧化劑，諸如丁基化羥基甲苯(BHT)、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、沒食子酸丙酯、維生素E、對苯二酚、羥基香豆素、乙醇胺、卵磷脂、腦磷脂、抗壞血酸、蘋果酸、山梨糖醇、磷酸、硫二丙酸及其酯，及二硫代胺基甲酸酯。
其他調配物包括(但不限於)水性醇溶液，包括醫藥學上可接受之縮醛。此等調配物中使用之醇為具有一或多個羥基的醫藥學上可接受之任何水混溶性溶劑，包括(但不限於)丙二醇及乙醇。縮醛包括(但不限於)低碳數烷基醛之二(低碳數烷基)縮醛，諸如乙醛二乙醇縮乙醛。
本文中亦涵蓋非經腸投藥，在一個實施例中，非經腸投藥之特徵在於皮下、肌肉內或靜脈內注射。可注射劑可製備成習知形式，液體溶液或懸浮液形式，適於溶於或懸浮於液體中後再注射之固體形式，或乳液形式。可注射劑、溶液及乳液亦含有一或多種賦形劑。適合之賦形劑為例如水、生理鹽水、右旋糖、甘油或乙醇。另外，必要時，欲投與之醫藥組合物亦可含有少量無毒助劑，諸如濕潤劑或乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、溶解增強劑及其他此類藥劑，諸如乙酸鈉、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯及環糊精。
本文中亦涵蓋緩釋或持續釋放系統的植入，以便維持恆定的劑量水準(參見例如美國專利第3,710,795號)。簡言之，將本文提供之化合物分散於固體內部基質中，例如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、塑化或非塑化聚氯乙烯、塑化耐綸(plasticized nylon)、塑化聚對苯二甲酸伸乙酯、天然橡膠、聚異戊二烯、聚異丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚矽氧橡膠、聚二甲基矽氧烷、聚矽氧碳酸酯共聚物、親水性聚合物(諸如丙烯酸及甲基丙烯酸之酯之水凝膠)、膠原蛋白、交聯聚乙烯醇及部分水解之交聯聚乙酸乙烯酯，該固體內部基質被外部聚合物膜包圍，例如聚乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、聚矽氧橡膠、聚二甲基矽氧烷、氯丁橡膠、氯化聚乙烯、聚氯乙烯、氯乙烯與乙酸乙烯酯、偏二氯乙烯、乙烯及丙烯之共聚物、離聚物聚對苯二甲酸伸乙酯、丁基橡膠表氯醇橡膠、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三元共聚物，及乙烯/乙烯氧基乙醇共聚物，該外部聚合物膜不溶於體液中。在釋放速率控制步驟中，抗粘附分子-4 ADC擴散穿過外部聚合物膜。此類非經腸組合物中所含之抗粘附分子-4 ADC的量高度取決於其特定性質，以及化合物之活性及個體需求。
用於非經腸投藥之製劑包括注射即用型無菌溶液、臨用前即與溶劑合併的無菌無水可溶產物(諸如凍乾粉末)(包括皮下錠劑)、注射即用型無菌懸浮液、臨用前即與媒劑混合的無菌無水不溶產物，及無菌乳液。溶液可為水溶液或非水溶液。
若靜脈內投與，則適合之載劑包括生理鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，及含有增稠劑及增溶劑(諸如葡萄糖、聚乙二醇及聚丙二醇及其混合物)之溶液。
非經腸製劑中使用的醫藥學上可接受之載劑包括水性媒劑、非水性媒劑、抗微生物劑、等張劑、緩衝劑、抗氧化劑、局部麻醉劑、懸浮劑及分散劑、乳化劑、鉗合劑或螯合劑及其他醫藥學上可接受之物質。
水性媒劑之實例包括氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringers Injection)、等張右旋糖注射液、無菌水注射液、右旋糖及乳酸化林格氏注射液。非水性非經腸媒劑包括植物來源之不揮發性油、棉籽油、玉米油、芝麻油及花生油。可以將抑制細菌或抑制真菌濃度之抗微生物劑添加至封裝於多劑量容器中之非經腸製劑中，包括苯酚或甲酚、汞劑、苯甲醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞(thimerosal)、苯紮氯銨及苄索氯銨。等張劑包括氯化鈉及右旋糖。緩衝劑包括磷酸鹽及檸檬酸鹽。抗氧化劑包括硫酸氫鈉。局部麻醉劑包括普魯卡因鹽酸鹽。懸浮劑及分散劑包括羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素及聚乙烯吡咯啶酮。乳化劑包括聚山梨醇酯80 (TWEEN® 80)。金屬離子之鉗合劑或螯合劑包括EDTA。醫藥載劑亦包括乙醇、聚乙二醇及丙二醇作為水混溶媒劑，及用於調節pH之氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。
調節醫藥活性化合物之濃度，使得注射液提供可產生所需藥理學作用的有效量。如此項技術中已知，確切劑量視患者或動物之年齡、體重及狀況而定。
單位劑量非經腸製劑可以封裝於安瓿、小瓶或帶針注射器中。如此項技術中已知且所實施，用於非經腸投藥之所有製劑可為無菌的。
舉例說明，靜脈內或動脈內輸注含有活性化合物之無菌水溶液為有效投藥模式。另一實施例為視需要注射含有活動物質之無菌水性或油性溶液或懸浮液，以產生所需藥理學作用。
可注射劑經設計用於局部及全身投藥。在一個實施例中，治療有效劑量經調配而含有至少約0.1% w/w至至多約90% w/w或更高濃度(在某些實施例中，超過1% w/w)的活性化合物(相對於所治療的組織)。
抗粘附分子-4 ADC可以微米尺寸化形式或其他適合形式懸浮。所得混合物之形式視多種因素而定，包括預定投藥模式及化合物於所選載劑或媒劑中之溶解度。有效濃度足以改善病狀之症狀且可憑經驗確定。
在其他實施例中，醫藥調配物為凍乾粉末，其可經復原以便以溶液、乳液及其他混合物形式投藥。其亦可復原且調配成固體或凝膠形式。
凍乾粉末係藉由將本文所提供的抗粘附分子-4 ADC或其醫藥學上可接受的衍生物溶解於適合溶劑中來製備。在一些實施例中，凍乾粉末為無菌的。溶劑可含有改良粉末或由粉末製備之復原溶液的穩定性或其他藥理學組分的賦形劑。可使用之賦形劑包括(但不限於)右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他適合藥劑。溶劑亦可含有緩衝劑，諸如檸檬酸鹽、磷酸鈉或磷酸鉀，或熟習此項技術者已知之其他此類緩衝劑，在一個實施例中，其處於約中性pH。隨後無菌過濾溶液，隨後在熟習此項技術者已知之標準條件下凍乾，以提供所需調配物。在一個實施例中，將所得溶液分配至小瓶中凍乾。各小瓶含有單次劑量或多次劑量之化合物。凍乾粉末可在適當條件下，諸如在約4℃至室溫下儲存。
用注射用水復原此凍乾粉末得到用於非經腸投藥之調配物。復原時，將凍乾粉末添加至無菌水或其他適合載劑中。確切量視所選化合物而定。此量可以憑經驗確定。
體表混合物如關於局部及全身投與所述來製備。所得混合物可為溶液、懸浮液、乳液或其類似物，且可調配為乳膏、凝膠、軟膏、乳液、溶液、酏劑、洗劑、懸浮液、酊劑、糊劑、發泡體、氣溶膠、沖洗劑、噴霧劑、栓劑、繃帶、經皮貼片或適於體表投藥之任何其他調配物。
本文所提供之抗體可以調配成局部施用(諸如吸入)之氣溶膠(參見例如美國專利第4,044,126號、第4,414,209號及第4,364,923號，該等參考文獻描述用於遞送適用於治療發炎疾病(尤其哮喘)之類固醇的氣溶膠)。投與呼吸道之此等調配物可以單獨或與諸如乳糖之惰性載劑組合，呈霧化器用的氣溶膠或溶液形式，或吹入用的微細粉末形式。在此類情況下，調配物顆粒在一個實施例中具有小於50微米，在一個實施例中小於10微米的直徑。
化合物可調配成凝膠、乳膏及洗劑形式用於局部或體表施用，諸如體表施用於皮膚及黏膜，諸如眼中，及施用於眼或腦池內或脊柱內施用。涵蓋經皮遞送以及投與眼或黏膜或用於吸入療法的體表投藥。活性化合物之鼻用溶液亦可單獨或與醫藥學上可接受之其他賦形劑組合投與。
此等溶液，特定言之，預定眼科使用之溶液，可在適當鹽存在下調配為0.01%-10%等張溶液(約pH 5-7)。
本文亦涵蓋其他投藥途徑，諸如經皮貼片，包括離子導入及電泳裝置；及直腸投藥。
經皮貼片，包括離子導入及電泳裝置，已為熟習此項技術者熟知。舉例而言，此類貼片揭示於美國專利第6,267,983號、第6,261,595號、第6,256,533號、第6,167,301號、第6,024,975號、第6,010715號、第5,985,317號、第5,983,134號、第5,948,433號及第5,860,957號。
舉例而言，直腸投藥用之醫藥劑型為全身作用之直腸栓劑、膠囊及錠劑。直腸栓劑在本文中意謂插入直腸中之固體，其在體溫下熔融或軟化，從而釋放一或多種藥理學或治療活性成分。用於直腸栓劑中的醫藥學上可接受之物質為基質或媒劑及升高熔點之藥劑。基質實例包括可可脂(可可油)、甘油明膠、碳蠟(聚氧乙二醇)，及脂肪酸之單酸甘油酯、二酸甘油酯及三酸甘油酯之適當混合物。可使用各種基質之組合。升高栓劑熔點之藥劑包括鯨蠟及蠟。直腸栓劑可藉由壓縮方法或藉由成型來製備。在一個實施例中，直腸栓劑之重量為約2至3公克。
直腸投藥用之錠劑及膠囊可以使用醫藥學上可接受之相同物質及藉由與口服調配物相同之方法製造。
本文所提供的抗體及其他組合物亦可經調配以靶向特定組織、受體，或待治療之個體身體的其他區域。許多此類靶向方法為熟習此項技術者熟知。本文涵蓋用於本發明組合物的所有此類靶向方法。關於靶向方法之非限制性實例，參見例如美國專利第6,316,652號、第6,274,552號、第6,271,359號、第6,253,872號、第6,139,865號、第6,131,570號、第6,120,751號、第6,071,495號、第6,060,082號、第6,048,736號、第6,039,975號、第6,004,534號、第5,985,307號、第5,972,366號、第5,900,252號、第5,840,674號、第5,759,542號及第5,709,874號。在一些實施例中，本文所提供之抗粘附分子-4抗體靶向(或以其他方式投與)結腸，諸如患有粘附分子-4介導疾病或處於粘附分子-4介導疾病之風險中之患者。
在一個實施例中，脂質體懸浮液，包括靶向組織的脂質體，諸如靶向腫瘤的脂質體，亦可適用作醫藥學上可接受之載劑。此等載劑可根據熟習此項技術者已知之方法來製備。舉例而言，脂質體調配物可如美國專利第4,522,811號中所述來製備。簡言之，脂質體，諸如多層囊泡(MLV's)，可藉由在燒瓶內部乾燥蛋磷脂醯膽鹼及腦磷脂醯絲胺酸(7:3，莫耳比)而形成。添加本文所提供之化合物於不含二價陽離子之磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)中的溶液且振盪燒瓶直至脂質膜分散。洗滌所得囊泡以移除未囊封化合物，藉由離心造粒，且接著再懸浮於PBS中。26. 投藥及給藥方法
在一個特定實施例中，本文中提供一種用於預防、管理、治療及/或改善粘附分子-4介導疾病的組合物，其包含本文所提供的抗粘附分子-4 ADC。在一個實施例中，本文中提供一種用於預防粘附分子-4介導疾病的組合物，其中該組合物包含本文所提供的抗粘附分子-4 ADC。在一個實施例中，本文中提供一種用於管理粘附分子-4介導疾病之組合物，其中該組合物包含本文所提供的抗粘附分子-4 ADC。在一個實施例中，本文中提供一種用於治療粘附分子-4介導疾病的組合物，其中該組合物包含本文所提供的抗粘附分子-4 ADC。在一個實施例中，本文中提供一種用於改善粘附分子-4介導疾病的組合物，其中該組合物包含本文所提供的抗粘附分子-4 ADC。在某些實施例中，個體為有需要之個體。在一些實施例中，該個體患有粘附分子-4介導之疾病。在其他實施例中，個體處於粘附分子-4介導之疾病風險中。在一些實施例中，投藥可以預防、管理、治療或改善粘附分子-4介導之疾病。在一個實施例中，抗粘附分子-4 ADC為其中抗粘附分子-4抗體為抗體M22-321b41.1的ADC。
在一個實施例中，本文中提供一種用於預防、管理、治療及/或改善粘附分子-4介導疾病之症狀的組合物，其中該組合物包含本文所提供的抗粘附分子-4 ADC。在一個實施例中，本文中提供一種用於預防粘附分子-4介導疾病之症狀的組合物，其中該組合物包含本文所提供的抗粘附分子-4 ADC。在一個實施例中，本文中提供一種用於管理粘附分子-4介導疾病之症狀的組合物，其中該組合物包含本文所提供的抗粘附分子-4 ADC。在一個實施例中，本文中提供一種用於治療粘附分子-4介導疾病之症狀的組合物，其中該組合物包含本文所提供的抗粘附分子-4 ADC。在一個實施例中，本文中提供一種用於改善粘附分子-4介導疾病之症狀的組合物，其中該組合物包含本文所提供的抗粘附分子-4 ADC。在某些實施例中，個體為有需要之個體。在一些實施例中，該個體患有粘附分子-4介導之疾病。在其他實施例中，個體處於粘附分子-4介導之疾病風險中。在一些實施例中，投藥可以預防、管理、治療或改善粘附分子-4介導疾病之症狀。在一個實施例中，粘附分子-4抗體為抗體M22-321b41.1。
在另一個實施例中，本文中提供一種預防、管理、治療及/或改善個體之粘附分子-4介導疾病的方法，包含投與有效量的本文所提供抗粘附分子-4 ADC。在一個實施例中，本文中提供一種預防個體之粘附分子-4介導疾病的方法，包含投與有效量的本文所提供抗粘附分子-4 ADC。在一個實施例中，本文中提供一種管理個體之粘附分子-4介導疾病的方法，包含投與有效量的本文所提供抗粘附分子-4 ADC。在一個實施例中，本文中提供一種治療個體之粘附分子-4介導疾病的方法，包含投與有效量的本文所提供抗粘附分子-4 ADC。在一個實施例中，本文中提供一種改善個體之粘附分子-4介導疾病的方法，包含投與有效量的本文所提供抗粘附分子-4 ADC。在某些實施例中，個體為有需要之個體。在一些實施例中，該個體患有粘附分子-4介導之疾病。在其他實施例中，個體處於粘附分子-4介導之疾病風險中。在一些實施例中，投藥可以預防、管理、治療或改善粘附分子-4介導之疾病。在一個實施例中，抗粘附分子-4 ADC為其中抗粘附分子-4抗體為抗體M22-321b41.1的ADC。
在另一個實施例中，本文中提供一種預防、管理、治療及/或改善個體之粘附分子-4介導疾病的方法，包含投與有效量的本文所提供抗粘附分子-4 ADC。在一個實施例中，本文中提供一種預防個體之粘附分子-4介導疾病之症狀的方法，包含投與有效量的本文所提供抗粘附分子-4 ADC。在一個實施例中，本文中提供一種管理個體之粘附分子-4介導疾病之症狀的方法，包含投與有效量的本文所提供抗粘附分子-4 ADC。在一個實施例中，本文中提供一種治療個體之粘附分子-4介導疾病之症狀的方法，包含投與有效量的本文所提供抗粘附分子-4 ADC。在一個實施例中，本文中提供一種改善個體之粘附分子-4介導疾病的方法，包含投與有效量的本文所提供抗粘附分子-4 ADC。在某些實施例中，個體為有需要之個體。在一些實施例中，該個體患有粘附分子-4介導之疾病。在其他實施例中，個體處於粘附分子-4介導之疾病風險中。在一些實施例中，投藥可以預防、管理、治療或改善粘附分子-4介導疾病之症狀。在一個實施例中，抗粘附分子-4 ADC為其中抗粘附分子-4抗體為抗體M22-321b41.1的ADC。
本文所提供之抗體亦可在活體外與活體內診斷及治療方法中用於例如純化、偵測及靶向粘附分子-4抗原。舉例而言，經修飾之抗體在免疫分析中用於定性地及定量地量測生物樣品中之粘附分子-4含量。參見例如Harlow等人，Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版，1988) (其以全文引用之方式併入本文中)。
本文亦提供預防、管理、治療及/或改善粘附分子-4介導疾病之方法，其藉由向個體投與有效量的抗粘附分子-4 ADC或包含本文所提供抗粘附分子-4 ADC的醫藥組合物。在一個態樣中，抗粘附分子-4 ADC基本上純化(亦即，基本上不含限制其作用或產生非所需副作用的物質)。在某些實施例中，抗粘附分子-4 ADC中的抗體為完全人類單株抗體，諸如完全人類單株抗體。投與療法的個體可為哺乳動物，諸如非靈長類動物(例如牛、豬、馬、貓、犬、大鼠等)或靈長類動物(例如猴，諸如食蟹獼猴，或人類)。在一個實施例中，個體為人類。在另一實施例中，個體為患有粘附分子-4介導疾病之人類。
各種遞送系統已知且可用於投與預防劑或治療劑(例如本文所提供的抗粘附分子-4 ADC)，包括(但不限於)囊封於脂質體、微米顆粒、微膠囊、能夠表現抗粘附分子-4 ADC之重組細胞、受體介導之胞吞作用(參見例如Wu及Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987))、構建核酸作為逆轉錄病毒或其他載體之一部分等。投與預防劑或治療劑(例如本文所提供的抗粘附分子-4 ADC)或醫藥組合物的方法包括(但不限於)非經腸投藥(例如皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內及皮下)、硬膜外及黏膜(例如鼻內及口服途徑)。在一個特定實施例中，預防劑或治療劑(例如本文所提供的抗粘附分子-4 ADC)或醫藥組合物係鼻內、肌肉內、靜脈內或皮下投與。預防劑或治療劑或組合物可藉由任何便利途徑投與，例如藉由輸注或快速注射、藉由上皮或皮膚黏膜內層(例如口腔黏膜、鼻內黏膜、直腸及腸黏膜等)吸收，且可與其他生物學活性劑一起投與。投藥可為全身或局部的。另外，亦可使用肺部投藥，例如使用吸入器或霧化器及具有氣霧劑之調配物。參見例如美國專利第6,019,968號、第5,985,320號、第5,985,309號、第5,934,272號、第5,874,064號、第5,855,913號、第5,290,540號及第4,880,078號；及PCT公開案第WO 92/19244號、第WO 97/32572號、第WO 97/44013號、第WO 98/31346號及第WO 99/66903號，該等文獻中之每一者以全文引用之方式併入本文中。
在一個特定實施例中，可能需要向需要治療的區域局部投與預防劑或治療劑，或本文所提供的醫藥組合物。此可以如下達成：例如而非為了限制：局部輸注、體表投藥(例如藉由鼻內噴霧)、注射，或藉助於植入物，該植入物為多孔、無孔或膠狀材料，包括膜，諸如矽橡膠膜，或纖維。在一些實施例中，當投與本文所提供的抗粘附分子-4 ADC時，必須謹慎使用抗粘附分子-4 ADC不吸收的材料。
在另一個實施例中，預防劑或治療劑或本文所提供的組合物可以微脂粒(特定而言，脂質體)遞送(參見Langer, 1990, Science 249:1527-1533；Treat等人，in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein及Fidler (編), Liss, New York, 第353- 365頁(1989); Lopez-Berestein, 同上, 第317-327頁；大體見上)。
在另一個實施例中，預防劑或治療劑，或本文所提供的組合物可以控制釋放或持續釋放系統遞送。在一個實施例中，可以使用泵浦達成控制或持續釋放(參見Langer, 同上；Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20；Buchwald等人，1980, Surgery 88:507；Saudek等人，1989, N. Engl. J. Med. 321:574)。在另一個實施例中，聚合物材料可以用於達成預防劑或治療劑之控制或持續釋放(例如本文所提供的抗粘附分子-4 ADC)或本文所提供的組合物(參見例如Medical Applications of Controlled Release, Langer及Wise (編), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen及Ball (編), Wiley, New York (1984)；Ranger及Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61；亦參見Levy等人，1985, Science 228:190；During等人，1989, Ann. Neurol. 25:351；Howard等人，1989, J. Neurosurg. 7 1:105)；美國專利第5,679,377號；美國專利第5,916,597號；美國專利第5,912,015號；美國專利第5,989,463號；美國專利第5,128,326號；PCT公開案第WO 99/15154號；及PCT公開案第WO 99/20253號。持續釋放型調配物中所用之聚合物之實例包括(但不限於)聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚乳酸交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)及聚原酸酯。在一個實施例中，持續釋放型調配物中所用之聚合物呈惰性，不含可浸出雜質，儲存穩定，無菌且可生物降解。在又另一個實施例中，可以將控制或持續釋放系統置放於治療標靶附近，例如鼻腔通道或肺，因此僅需要全身劑量之一部分(參見例如Goodson, 於Medical Applications of Controlled Release, 同上, 第2卷, 第115-138頁(1984))。控制釋放系統論述於Langer之評述(1990, Science 249:1527-1533)中。熟習此項技術者已知之任何技術可以用於製備包含本文所提供之一或多種抗體的持續釋放調配物。參見例如美國專利第4,526,938號；PCT公開案WO 91/05548；PCT公開案WO 96/20698；Ning等人，1996, 「Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel,」, Radiotherapy & Oncology 39:179-189；Song等人，1995, 「Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions,」, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397；Cleek等人，1997, 「Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application,」, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854；及Lam等人，1997, 「Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery,」, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760，該等文獻中之每一者以全文引用之方式併入本文中。
在一個特定實施例中，在本文所提供的組合物為編碼預防劑或治療劑(例如本文所提供的抗粘附分子-4 ADC)之核酸的情況下，可以活體內投與核酸以促進其所編碼之預防劑或治療劑的表現，此係藉由將其構建為適當核酸表現載體之一部分且投與其，以使得其變成胞內，例如使用逆轉錄病毒載體(參見美國專利第4,980,286號)，或藉由直接注射，或藉由使用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic, Dupont)，或用脂質或細胞表面受體或轉染劑塗佈，或藉由將其與已知進入核內之同源盒樣肽連接來投與(參見例如Joliot等人，1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868)等。或者，可以將核酸引入細胞內且藉由同源重組而併入宿主細胞DNA內用於表現。
在一個特定實施例中，本文所提供的組合物包含一種、兩種或超過兩種本文所提供抗體。在另一個實施例中，本文所提供的組合物包含一種、兩種或超過兩種本文所提供抗體及除本文所提供抗粘附分子-4 ADC之外的預防劑或治療劑。在一個實施例中，已知藥劑適用於或已用於或當前用於預防、管理、治療及/或改善粘附分子-4介導的疾病。除預防劑或治療劑之外，本文所提供的組合物亦可包含載劑。
本文所提供的組合物包括適用於製造醫藥組合物(例如適於投與個體或患者的組合物)的散裝藥物組合物，其可以用於製備單位劑型。在一個實施例中，本文中提供的組合物為醫藥組合物。此類組合物包含預防或治療有效量的一或多種預防劑或治療劑(例如本文所提供之抗體或其他預防劑或治療劑)，及醫藥學上可接受之載劑。可以調配醫藥組合物以適於個體的投藥途徑。
在一個特定實施例中，術語「載劑」係指與治療劑一起投與的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全及不完全))、賦形劑或媒劑。此類醫藥載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似物。當靜脈內投與醫藥組合物時，水為例示性載劑。亦可使用生理鹽水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液作為液體載劑，尤其用於可注射溶液。適合的醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂牛乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇及其類似物。必要時，組合物亦可含有少量濕潤劑或乳化劑，或pH緩衝劑。此等組合物可呈溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、藥丸、膠囊、散劑、持續釋放調配物及其類似物之形式。口服調配物可以包括標準載劑，諸如醫藥級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。適合醫藥載劑之實例描述於Remington ' s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA中。此類組合物將含有預防或治療有效量的抗粘附分子-4 ADC，諸如純化形式，以及適量的載劑，以便提供正確投與患者的形式。調配物應適於投藥模式。
在一個實施例中，根據常規程序將組合物調配成適於靜脈內投與人類之醫藥組合物。典型地，靜脈內投與之組合物為存在於無菌等張水性緩衝液中之溶液。必要時，組合物亦可包括助溶劑或局部麻醉劑(諸如利諾卡因(lignocamne))以減輕注射部位之疼痛。然而，此類組合物可以藉由除靜脈內之外的途徑投與。
一般而言，組合物之成分係單獨提供或以單位劑型混合在一起，例如呈乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式，其存在於指示活性劑之量的氣密密封式容器(諸如安瓿或藥囊)中。在欲藉由注射投與組合物的情況下，其可用含有無菌醫藥級水或生理鹽水之輸注瓶來施配。在藉由注射投與組合物的情況下，可提供具有注射用無菌水或生理鹽水之安瓿，以便混合該等成分之後投與。
本文所提供的抗體或抗粘附分子-4 ADC可以封裝於氣密密封式容器中，諸如指示抗體或抗粘附分子-4 ADC之量的安瓿或藥囊。在一個實施例中，抗體或抗粘附分子-4 ADC係以無菌乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式用氣密密封式容器供應且可以用例如水或生理鹽水復原至適當濃度以便投與個體。在某些實施例中，抗體或抗粘附分子-4 ADC係以無菌乾燥凍乾粉末形式、以至少0.1 mg、至少0.5 mg、至少1 mg、至少2 mg或至少3 mg (諸如至少5 mg、至少10 mg、至少15 mg、至少25 mg、至少30 mg、至少35 mg、至少45 mg、至少50 mg、至少60 mg、至少75 mg、至少80 mg、至少85 mg、至少90 mg、至少95 mg或至少100 mg)之單位劑量、用氣密密封式容器供應。凍乾的抗粘附分子-4 ADC可以在其原始容器中、在2與8℃之間儲存且抗粘附分子-4 ADC可以在復原之後的12小時內投與，諸如6小時內、5小時內、3小時內，或1小時內。在一個替代性實施例中，抗體或抗粘附分子-4 ADC係以液體形式、在指示抗體或抗粘附分子-4 ADC之量及濃度的氣密密封式容器中供應。在某些實施例中，抗體或抗粘附分子-4 ADC之液體形式係以至少0.1 mg/ml、至少0.5 mg/ml或至少1 mg/ml及諸如至少5 mg/ml、至少10 mg/ml、至少15 mg/ml、至少25 mg/ml、至少30 mg/ml、至少40 mg/ml、至少50 mg/ml、至少60 mg/ml、至少70 mg/ml、至少80 mg/ml、至少90 mg/ml或至少100 mg/ml、在氣密密封式容器中供應。
本文所提供的組合物可以調配為中性或鹽形式。醫藥學上可接受之鹽包括與陰離子形成之鹽，諸如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等之鹽；及與陽離子形成之鹽，諸如衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因等之鹽。
預防劑或治療劑(例如本文所提供的抗粘附分子-4 ADC)或本文所提供組合物之有效預防、管理、治療及/或改善粘附分子-4介導疾病的量可以藉由標準臨床技術確定。
因此，可以將產生約0.1 μg/ml至約450 μg/ml且在一些實施例中至少0.1 μg/ml、至少0.2 μg/ml、至少0.4 μg/ml、至少0.5 μg/ml、至少0.6 μg/ml、至少0.8 μg/ml、至少1 μg/ml、至少1.5 μg/ml (諸如至少2 μg/ml、至少5 μg/ml、至少10 μg/ml、至少15 μg/ml、至少20 μg/ml、至少25 μg/ml、至少30 μg/ml、至少35 μg/ml、至少40 μg/ml、至少50 μg/ml、至少75 μg/ml、至少100 μg/ml、至少125 μg/ml、至少150 μg/ml、至少200 μg/ml、至少250 μg/ml、至少300 μg/ml、至少350 μg/ml、至少400 μg/ml或至少450 μg/ml)之血清效價之抗粘附分子-4 ADC或組合物的劑量投與人類以便預防、管理、治療及/或改善粘附分子-4介導的疾病。另外，視情況可採用活體外分析來幫助鑑別最佳劑量範圍。用於調配物之精確劑量亦視投藥途徑及粘附分子-4介導疾病之嚴重性而定，且應根據從業者之判斷及各患者之情況來決定。
可自來源於活體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線外推出有效劑量。
對於本文所提供之抗體而言，投與患者之劑量典型地為每公斤患者體重0.1 mg至100 mg。在一些實施例中，投與患者的劑量為每公斤患者體重約1 mg至約75 mg。在一些實施例中，投與患者的劑量在每公斤患者體重1 mg與20 mg之間，諸如每公斤患者體重1 mg至5 mg。一般而言，由於對外來多肽存在免疫反應，因此人類抗體在人體內的半衰期比其他物種的抗體更長。因此，降低人類抗體的劑量及減少投藥頻率通常為可能的。另外，本文所提供之抗體的投藥劑量及頻率可以藉由修飾(諸如脂質化)來增強抗體的吸收量及組織滲透而減小。
在一個實施例中，約100 mg/kg或低於100 mg/kg、約75 mg/kg或低於75 mg/kg、約50 mg/kg或低於50 mg/kg、約25 mg/kg或低於25 mg/kg、約10 mg/kg或低於10 mg/kg、約5 mg/kg或低於5 mg/kg、約1 mg/kg或低於1 mg/kg、約0.5 mg/kg或低於0.5 mg/kg，或約0.1 mg/kg或低於0.1 mg/kg的抗粘附分子-4 ADC投與5次、4次、3次、2次或1次，以管理粘附分子-4介導的疾病。在一些實施例中，本文中提供的抗粘附分子-4 ADC投與約1-12次，其中該等劑量視需要可以例如每週、每兩週、每月、每兩個月、每三個月等投與，如醫師所決定。在一些實施例中，可以較頻繁地投與較低劑量(例如1-15 mg/kg)(例如3-6次)。在其他實施例中，可以不大頻繁地(例如1-3次)投與較高劑量(例如25-100 mg/kg)。然而，如熟習此項技術者顯而易見，可容易確定其他給藥量及時程且在本文所提供的範疇內。
在一個特定實施例中，將含有約100 mg/kg、約75 mg/kg或低於75 mg/kg、約50 mg/kg或低於50 mg/kg、約25 mg/kg或低於25 mg/kg、約10 mg/kg或低於10 mg/kg、約5 mg/kg或低於5 mg/kg、約1 mg/kg或低於1 mg/kg、約0.5 mg/kg或低於0.5 mg/kg、約0.1 mg/kg或低於0.1 mg/kg 粘附分子-4 ADC的持續釋放調配物投與個體，諸如人類，以預防、管理、治療及/或改善粘附分子-4介導的疾病。在另一特定實施例中，將約100 mg/kg、約75 mg/kg或低於75 mg/kg、約50 mg/kg或低於50 mg/kg、約25 mg/kg或低於25 mg/kg、約10 mg/kg或低於10 mg/kg、約5 mg/kg或低於5 mg/kg、約1 mg/kg或低於1 mg/kg、約0.5 mg/kg或低於0.5 mg/kg，或約0.1 mg/kg或低於0.1 mg/kg抗粘附分子-4 ADC的藥團而非持續釋放調配物投與個體，諸如人類，以預防、管理、治療及/或改善粘附分子-4介導的疾病，且在特定時間段之後，將含有約100 mg/kg、約75 mg/kg或低於75 mg/kg、約50 mg/kg或低於50 mg/kg、約25 mg/kg或低於25 mg/kg、約10 mg/kg或低於10 mg/kg、約5 mg/kg或低於5 mg/kg、約1 mg/kg或低於1 mg/kg、約0.5 mg/kg或低於0.5 mg/kg，或約5 mg/kg或低於5 mg/kg本文所提供抗粘附分子-4 ADC的持續釋放物投與該個體(例如鼻內或肌肉內)兩次、三次或四次(諸如一次)。根據此實施例，某個時間段可為1至5天、一週、兩週或一個月。
在一些實施例中，將單次劑量的本文所提供抗粘附分子-4 ADC投與患者以預防、管理、治療及/或改善粘附分子-4介導的疾病，在一年期間以兩週(例如約14天)時間間隔投與兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次、二十一次、二十二次、二十三次、二十四次、二十五次或二十六次，其中該劑量選自由以下組成之群：約0.1 mg/kg、約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg、約50 mg/kg、約55 mg/kg、約60 mg/kg、約65 mg/kg、約70 mg/kg、約75 mg/kg、約80 mg/kg、約85 mg/kg、約90 mg/kg、約95 mg/kg、約100 mg/kg或其組合(亦即，每月的每次給藥劑量可以相同或可不同)。
在另一個實施例中，將單次劑量的本文所提供抗粘附分子-4 ADC投與患者，以預防、管理、治療及/或改善粘附分子-4介導的疾病，在一年期間以大約每月(例如約30天)的時間間隔投與兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次或十二次，其中該劑量選自由以下組成之群：約0.1 mg/kg、約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg、約50 mg/kg、約55 mg/kg、約60 mg/kg、約65 mg/kg、約70 mg/kg、約75 mg/kg、約80 mg/kg、約85 mg/kg、約90 mg/kg、約95 mg/kg、約100 mg/kg，或其組合(亦即，每月的每次給藥劑量可以相同或可不同)。
在一個實施例中，將單次劑量的本文所提供抗粘附分子-4 ADC投與患者，以預防、管理、治療及/或改善粘附分子-4介導的疾病，在一年期間以大約每兩個月(例如約60天)的時間間隔投與兩次、三次、四次、五次或六次，其中該劑量選自由以下組成之群：約0.1 mg/kg、約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg、約50 mg/kg、約55 mg/kg、約60 mg/kg、約65 mg/kg、約70 mg/kg、約75 mg/kg、約80 mg/kg、約85 mg/kg、約90 mg/kg、約95 mg/kg、約100 mg/kg或其組合(亦即，每兩個月的每次劑量可以相同或可不同)。
在一些實施例中，將單次劑量的本文所提供抗粘附分子-4 ADC投與患者，以預防、管理、治療及/或改善粘附分子-4介導的疾病，在一年期間以大約每三個月(例如約120天)的時間間隔投與兩次、三次或四次，其中該劑量選自由以下組成之群：約0.1 mg/kg、約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg、約50 mg/kg、約55 mg/kg、約60 mg/kg、約65 mg/kg、約70 mg/kg、約75 mg/kg、約80 mg/kg、約85 mg/kg、約90 mg/kg、約95 mg/kg、約100 mg/kg，或其組合(亦即，每三個月的每次劑量可以相同或可不同)。
在某些實施例中，本文所提供抗粘附分子-4 ADC的劑量投與患者的途徑為鼻內、肌肉內、靜脈內或其組合，但本文所述之其他途徑亦可接受。各劑量可以或可不藉由相同投藥途徑投與。在一些實施例中，本文所提供的抗粘附分子-4 ADC可以經由多種投藥途徑同時投與，或在本文所提供之相同或不同抗粘附分子-4 ADC的其他劑量之後投與。
在某些實施例中，本文提供的抗粘附分子-4 ADC係預防或治療性投與個體。本文所提供的抗粘附分子-4 ADC可以預防性或治療性投與個體，以便預防、減輕或改善粘附分子-4介導的疾病或其症狀。27. 基因療法
在一個特定實施例中，將包含編碼抗體或其功能衍生物之序列的核酸投與個體以用於本文所提供的方法中，例如藉助於基因療法來預防、管理、治療及/或改善粘附分子-4介導的疾病、病症或病狀。此類療法涵蓋向個體投與經表現或可表現的核酸。在一個實施例中，核酸產生其所編碼的抗體，其可以結合而得到抗粘附分子-4 ADC，且該抗體或抗粘附分子-4 ADC介導預防或治療作用。
可以使用此項技術中可利用的任何重組基因表現(或基因療法)方法。例示性方法描述如下且提供於實例章節中。
為了大體回顧基因治療方法，參見Goldspiel等人，1993, Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu及Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；以及Morgan及Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; 1993年5月, TIBTECH 11(5):155-215。此項技術中通常已知的可以使用之重組DNA技術方法描述於Ausubel等人(編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；及Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)。
在一個特定實施例中，組合物包含編碼本文所提供之抗粘附分子-4抗體的核酸，該等核酸為在適合宿主中表現抗體或嵌合蛋白或重鏈或輕鏈或其治療或藥物部分之表現載體的一部分。特定言之，此類核酸具有可操作地連接至抗粘附分子-4抗體編碼區的啟動子，諸如異源啟動子，該啟動子為誘導型或組成型且視情況具有組織特異性。在另一特定實施例中，使用核酸分子，其中抗粘附分子-4抗體編碼序列及任何其他所需序列側接促進在基因組中之所需位點發生同源重組的區域，從而得到抗粘附分子-4 ADC編碼核酸的染色體內表現(Koller及Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；Zijlstra等人，1989, Nature 342:435-438)。在一些實施例中，經表現的抗粘附分子-4抗體分子包含單鏈抗體；或者，核酸序列包括編碼抗粘附分子-4抗體之重鏈與輕鏈或其片段的序列。
核酸可以直接遞送至個體，在此情況下，使個體直接暴露於核酸或攜帶核酸的載體，或間接遞送至個體，在此情況下，首先將細胞在活體外用核酸轉型，接著移植入個體內。此兩種方法分別稱為活體內或離體基因療法。
在一個特定實施例中，活體內直接投與核酸序列，其中序列經表現以產生經編碼的產物。此可藉由此項技術中已知之多種方法中之任一種實現，例如藉由將其構建為適當核酸表現載體之一部分且投與載體，以使得序列變成細胞內，例如藉由使用缺乏型或減毒型逆轉錄病毒或其他病毒載體感染(參見美國專利第4,980,286號)，或藉由直接注射裸DNA，或使用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic, Dupont)，或塗佈脂質或細胞表面受體或轉染劑、囊封於脂質體、微米顆粒或微膠囊中，或藉由將其與已知進入核的肽連接而投與，藉由將其與經受受體介導之胞吞作用的配位體連接而投與(參見例如Wu及Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432) (其可以用於特異性表現受體的靶細胞類型)等。在另一實施例中，可形成核酸-配位體複合物，其中配位體包含促融病毒肽以分裂核內體，從而允許核酸避免溶酶體降解。在又另一個實施例中，核酸可以藉由靶向特定受體而活體內靶向細胞特異性吸收及表現(參見例如PCT公開案WO 92/06180；WO 92/22635；WO 92/20316；W093/14188；WO 93/20221)。或者，可以將核酸引入細胞內且藉由同源重組而併入宿主細胞DNA內用於表現(Koller及Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；及Zijlstra等人，1989, Nature 342:435-438)。
在一個特定實施例中，使用含有編碼抗粘附分子-4抗體之核酸序列的病毒載體。舉例而言，可以使用逆轉錄病毒載體(參見Miller等人，1993, Meth. Enzymol. 217:581-599)。此等逆轉錄病毒載體含有病毒基因組正確封裝及整合至宿主細胞DNA中所必需的組分。編碼用於基因療法之抗粘附分子-4抗體的核酸序列可以選殖入一或多種載體中，其促進基因遞送至個體中。關於逆轉錄病毒載體之更多細節可見於例如Boesen等人，1994, Biotherapy 6:291-302中，其描述使用逆轉錄病毒載體將mdr 1 基因遞送至造血幹細胞以使幹細胞對化學療法具有更大抗性。說明使用逆轉錄病毒載體進行基因療法的其他參考文獻為：Clowes等人，1994, J. Clin. Invest. 93:644-651；Klein等人，1994, Blood 83:1467-1473；Salmons及Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141；以及Grossman及Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114。
腺病毒為可以用於重組產生抗體的其他病毒載體。腺病毒為尤其具有吸引力之媒介物，用於遞送基因至呼吸道上皮。腺病毒天然地感染呼吸道上皮，其在呼吸道上皮引起輕度疾病。基於腺病毒之遞送系統的其他標靶為肝臟、中樞神經系統、內皮細胞及肌肉。腺病毒具有能夠感染非分裂細胞之優勢。Kozarsky及Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503提供基於腺病毒之基因療法的評述。Bout等人，1994, Human Gene Therapy 5:3-10展現使用腺病毒載體將基因轉移至恆河猴之呼吸道上皮。在基因療法中使用腺病毒的其他例子可以發現於Rosenfeld等人，1991, Science 252:431-434；Rosenfeld等人，1992, Cell 68:143-155；Mastrangeli等人，1993, J. Clin. Invest. 91:225-234；PCT公開案W094/12649；及Wang等人，1995, Gene Therapy 2:775-783。在一個特定實施例中，使用腺病毒載體。
亦可使用腺相關病毒(AAV)(Walsh等人，1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300；及美國專利第5,436,146號)。在一個特定實施例中，使用AAV載體表現本文所提供的抗粘附分子-4 ADC。在某些實施例中，AAV包含編碼VH域之核酸。在其他實施例中，AAV包含編碼VL域之核酸。在某些實施例中，AAV包含編碼VH域及VL域之核酸。在本文所提供方法之一些實施例中，向個體投與包含編碼VH域之核酸的AAV及包含編碼VL域之核酸的AAV。在其他實施例中，向個體投與包含編碼VH域及VL域之核酸的AAV。在某些實施例中，過度表現VH及VL域。
基因療法之另一種方法涉及藉由諸如電穿孔、脂質體轉染、磷酸鈣介導之轉染或病毒感染之方法將基因轉移至組織培養細胞中。通常，轉移方法包括將可選標記物轉移至細胞。接著在選擇下置放細胞以分離已溶解且表現所轉移基因之此等細胞。接著將此等細胞遞送至個體。
在此實施例中，將核酸引入細胞中，隨後活體內投與所得重組細胞。此類引入可藉由此項技術中已知之任何方法進行，包括(但不限於)轉染、電穿孔、顯微注射、用含有核酸序列之病毒或細菌噬菌體載體感染、細胞融合、染色體介導之基因轉移、微細胞介導之基因轉移、球形質體融合等。用於將外來基因引入細胞的多種技術在此項技術中已知(參見例如Loeffler及Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618；Cohen等人，1993, Meth. Enzymol. 217:618-644；Clin. Pharma. Ther. 29:69-92 (1985))且可以根據本文所提供之方法使用，其限制條件為不中斷接受者細胞必需的發育及生理功能。該技術應使得核酸穩定轉移至細胞中，使得核酸可由細胞表現且較佳可由其細胞後代遺傳及表現。
所得重組細胞可以藉由此項技術中已知之各種方法遞送至個體。可以靜脈內投與重組血細胞(例如造血幹細胞或祖細胞)。設想供使用的細胞之量視所需作用、患者狀態等而定，且可以由熟習此項技術者決定。
核酸可引入其中以用於基因療法之目的之細胞涵蓋任何可利用的所需細胞類型，且包括(但不限於)上皮細胞、內皮細胞、角質細胞、纖維母細胞、肌肉細胞、肝細胞；淋巴及骨髓細胞，諸如T淋巴球、B淋巴球、單核球、巨噬細胞、嗜中性球、嗜伊紅血球、巨核細胞、顆粒球；各種幹細胞或祖細胞，特定而言，造血幹細胞或祖細胞，例如自骨髓、臍帶血、周邊血液、胎兒肝臟等獲得。
在一個特定實施例中，用於基因療法之細胞為個體自體性的。
在用於基因療法的重組細胞之一個實施例中，將編碼抗粘附分子-4抗體之核酸序列引入至細胞中，使得該等核酸序列可由細胞或其後代表現，且接著以活體內方式投與重組細胞以用於治療作用。在一個特定實施例中，使用幹細胞或祖細胞。以活體外方式可以分離及維持的任何幹細胞及/或祖細胞均可以潛在地根據本文所提供方法的該實施例使用(參見例如PCT公開案WO 94/08598；Stemple及Anderson, 1992, Cell 7 1:973-985；Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229；以及Pittelkow及Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771)。
在一個特定實施例中，為了基因療法之目的而引入的核酸包含可操作地連接至編碼區的誘導型啟動子，以便可藉由控制轉錄之適當誘導劑的存在或不存在來控制核酸表現。28. 編碼抗體的聚核苷酸
亦提供包含編碼免疫特異性結合至粘附分子-4抗原決定基之本文所提供抗體的核苷酸序列。本文亦提供在高嚴格度、中嚴格度或更低嚴格度雜交條件(例如如上文所定義)下與編碼經修飾之本文所提供抗體之聚核苷酸雜交的聚核苷酸。
可藉由此項技術中已知之任何方法獲得聚核苷酸且測定聚核苷酸之核苷酸序列。由於本文所提供之某些粘附分子-4抗體的胺基酸序列係已知的，因此編碼此等抗體及此等抗體之經修飾型式的核苷酸序列可以使用此項技術中熟知之方法判定，亦即，組裝已知編碼特定胺基酸的核苷酸密碼子，以此方式產生編碼抗體之核酸。編碼抗體之此類聚核苷酸可自化學合成之寡核苷酸組裝(例如如Kutmeier等人，1994, BioTechniques 17:242中所述)，簡言之，其包括合成含有編碼抗體、片段或其變異體之序列部分的重疊寡核苷酸、對彼等寡核苷酸進行黏接及接合，及接著藉由PCR擴增所接合之寡核苷酸。
或者，編碼本文所提供抗體之聚核苷酸可以由來自適合來源(例如如本文所提供的M22-321b41.1融合瘤，其具有ATCC寄存編號PTA-124245，2017年6月13日寄存)的核酸產生。若含有編碼特定抗體之核酸的純系無法獲得，但該抗體分子之序列係已知的，則編碼免疫球蛋白之核酸可以化學方式合成，或藉由使用可與序列之3'及5'端雜交之合成引子的PCR擴增或藉由使用對特定基因序列具有特異性之寡核苷酸探針選殖以鑑別例如來自編碼該抗體之cDNA庫的cDNA純系而獲自適合來源(例如抗體cDNA庫，或由表現該抗體之任何組織或細胞(諸如經選擇以表現本文所提供抗體的融合瘤細胞)產生的cDNA庫，或自該等組織或細胞分離之核酸，諸如聚A+ RNA)。藉由PCR產生之經擴增核酸接著可以使用此項技術中熟知之任何方法來選殖至可複製的選殖載體中。
在某些實施例中，本文所提供的核酸分子包含或由以下組成：如SEQ ID NO: 38 (編碼VH)及/或SEQ ID NO: 37 (編碼VL)或其任何組合(例如，編碼本文所提供抗體(諸如全長抗體、抗體重鏈及/或輕鏈，或本文所提供的單鏈抗體)之核苷酸序列)中之任一者中所描繪之核酸序列。
在某些態樣中，本文提供包含編碼免疫特異性結合至粘附分子-4抗原之本文所述抗體或其片段(例如輕鏈可變區及/或重鏈可變區)之核苷酸序列的聚核苷酸；及載體，例如包含重組表現於宿主細胞(例如大腸桿菌及哺乳動物細胞)中之此類聚核苷酸的載體。在某些態樣中，本文提供細胞(例如宿主細胞)。本文亦提供製備本文所述之抗體及抗原結合片段的方法。
在某些態樣中，本文提供包含編碼本文所述抗體之輕鏈或重鏈之核苷酸序列的聚核苷酸。在某些實施例中，本文提供包含編碼本文所述抗體之輕鏈及重鏈之核苷酸序列的聚核苷酸。聚核苷酸可以包含編碼輕鏈的核苷酸序列，該輕鏈包含本文所述抗體之VL FR及CDR (分別參見例如表 1 - 2 )。聚核苷酸可以包含編碼重鏈的核苷酸序列，該重鏈包含本文所述抗體之VH FR及CDR (分別參見例如表 1 - 2 )。在特定實施例中，本文所述之聚核苷酸編碼包含胺基酸序列SEQ ID NO: 37之VL鏈區域。在特定實施例中，本文所述之聚核苷酸編碼包含SEQ ID NO: 38中之任一者之胺基酸序列的VH鏈區域。
在特定實施例中，本文提供包含編碼抗粘附分子-4抗體之核苷酸序列的聚核苷酸，該抗體包含三個VL鏈CDR，例如含有抗體M22-321b41.1之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3 (例如參見表 1 )。在特定實施例中，本文提供包含三個VH鏈CDR的聚核苷酸，例如含有抗體M22-321b41.1之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3 (參見例如表 1 )。
在特定實施例中，本文提供包含核苷酸序列的聚核苷酸，該核苷酸序列編碼包含VL鏈區域(例如含有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)的抗粘附分子-4抗體，該抗體包含本文所述之胺基酸序列(參見例如表 1 - 2 )。在特定實施例中，本文提供包含核苷酸序列的聚核苷酸，該核苷酸序列編碼包含VH鏈區域(例如含有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)的抗粘附分子-4抗體，該抗體包含本文所述之胺基酸序列(參見例如表 1 - 2 )。
在某些實施例中，本文所述之聚核苷酸包含編碼本文所提供之抗體的核苷酸序列，該抗體包含含有本文所述胺基酸之輕鏈可變區(VL)(參見例如表 1 )，其中該抗體免疫特異性結合至粘附分子-4多肽。
在某些實施例中，本文所述之聚核苷酸包含編碼本文所提供抗體之核苷酸序列，該抗體包含含有本文所述胺基酸序列之重鏈可變區(VH)(參見例如表 1 )，其中該抗體免疫特異性結合至粘附分子-4多肽。
在某些態樣中，聚核苷酸包含編碼本文所述抗體之核苷酸序列，該抗體包含含有具有本文所述胺基酸序列之一或多個VL FR的VL鏈區域(參見例如表 2 )，其中該抗體免疫特異性結合至粘附分子-4多肽。在某些態樣中，聚核苷酸包含編碼本文所述抗體之核苷酸序列，該抗體包含含有具有本文所述胺基酸序列之一或多個VH FR的VH鏈區域(參見例如表 2 )，其中該抗體免疫特異性結合至粘附分子-4多肽，例如人類粘附分子-4多肽。
在特定實施例中，本文所提供的聚核苷酸包含編碼本文所述抗體之核苷酸序列，該抗體包含：作為人類構架區的構架區(例如VL域及VH域之構架區)，其中該抗體免疫特異性結合粘附分子-4多肽。
在某一實施例中，本文所提供的聚核苷酸包含如表 3 中所述的核苷酸序列，其分別編碼本文所述抗體M22-321b41.1之VH或VL，該抗體免疫特異性結合至粘附分子-4多肽。 抗體的重組產生
免疫特異性結合至粘附分子-4抗原之本文所提供抗體(例如全長抗體、抗體重鏈及/或輕鏈，或本文所提供的單鏈抗體)的重組表現需要構建含有編碼該抗體之聚核苷酸的表現載體。編碼本文所提供之抗體分子、抗體重鏈或輕鏈或其片段(諸如(但不一定)含有重鏈及/或輕鏈可變域)的聚核苷酸一經獲得，即可使用此項技術中熟知的技術、藉由重組DNA技術產生用於產生抗體分子的載體。因此，本文描述藉由表現含有編碼抗體之核苷酸序列的聚核苷酸來製備蛋白質之方法。可使用熟習此項技術者熟知之方法構築含有抗體編碼序列及適當轉錄及轉譯控制信號之表現載體。此等方法包括例如活體外重組DNA技術、合成技術及活體內基因重組。亦提供可複製載體，其包含編碼本文所提供抗體分子、抗體重鏈或輕鏈、抗體重鏈或輕鏈可變域或其片段、或重鏈或輕鏈CDR的核苷酸序列，該核苷酸序列可操作地連接至啟動子。此類載體可以包括編碼抗體分子恆定區的核苷酸序列(參見例如國際公開案第WO 86/05807號及第WO 89/01036號；及美國專利第5,122,464號)且可以將抗體可變域選殖入此載體中以便表現整個重鏈、整個輕鏈，或整個重鏈與輕鏈。
表現載體係藉由習知技術轉移至宿主細胞且接著藉由習知技術培養經轉染的細胞以產生本文所提供之抗體。因此，本文亦提供含有聚核苷酸的宿主細胞，該聚核苷酸編碼本文所提供之抗體或其片段，或其重鏈或輕鏈，或其片段，或本文所提供的單鏈抗體，該聚核苷酸可操作地連接至異源啟動子。在某些實施例中，為了雙鏈抗體的表現，編碼重鏈與輕鏈的載體可以在宿主細胞中共表現以表現整個免疫球蛋白分子，如下詳述。
可以使用多種宿主表現載體系統表現本文所提供的抗體分子(參見例如美國專利第5,807,715號)。此類宿主表現系統不僅代表可藉以產生且隨後純化所關注之編碼序列的媒介物，而且代表在適當核苷酸編碼序列轉型或轉染時，可以原位表現本文所提供之抗體分子的細胞。此等系統包括(但不限於)經含有抗體編碼序列之重組細菌噬菌體DNA、質體DNA或黏質體DNA表現載體轉型的微生物，諸如細菌(例如大腸桿菌及枯草芽孢桿菌(B . subtilis ))；經含有抗體編碼序列之重組酵母表現載體轉型的酵母(例如畢赤酵母(Saccharomyces Pichia ))；經含有抗體編碼序列之重組病毒表現載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；經重組病毒表現載體(例如花椰菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus，CaMV)、菸草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV))感染或經含有抗體編碼序列之重組質體表現載體(例如Ti質體)轉型的植物細胞系統；或具有含有來源於哺乳動物細胞基因組之啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或來源於哺乳動物病毒之啟動子(例如腺病毒晚期啟動子；痘瘡病毒7.5K啟動子)之重組表現構築體的哺乳動物細胞系統(例如COS、CHO、BHK、293、NS0及3T3細胞)。可以利用諸如大腸桿菌之細菌細胞或尤其用於表現整個重組抗體分子之真核細胞表現重組抗體分子。舉例而言，哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，聯合載體，諸如來自人類細胞巨大病毒的主要中早期基因啟動子元件，為抗體的有效表現系統(Foecking等人，1986, Gene 45:101；及Cockett等人，1990, Bio/Technology 8:2)。在一些實施例中，本文所提供之抗體係在CHO細胞中產生。在一個特定實施例中，編碼免疫特異性結合至粘附分子-4抗原之本文所提供抗體之核苷酸序列的表現係藉由組成型啟動子、誘導型啟動子或組織特異性啟動子調控。
在細菌系統中，多種表現載體可有利地根據所表現之抗體分子的預期用途來選擇。舉例而言，當欲產生大量此類蛋白質時，為了產生抗體分子之醫藥組合物，導引易純化之融合蛋白產物高量表現的載體可為所需的。此類載體包括(但不限於)大腸桿菌表現載體pUR278 (Ruther等人，1983, EMBO 12:1791)，其中該抗體編碼序列可以個別地與lac Z編碼區同框連接至載體中以便產生融合蛋白；pIN載體(Inouye及Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109；Van Heeke及Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509)；及其類似物。亦可使用pGEX載體表現外來多肽與麩胱甘肽5-轉移酶(GST)的融合蛋白。一般而言，此類融合蛋白為可溶的，且可藉由吸附及結合至基質麩胱甘肽瓊脂糖珠粒、隨後在游離麩胱甘肽存在下溶離而容易自溶解細胞純化。pGEX載體經設計以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位點，以使得所選殖的靶基因產物可以自GST部分釋放。
在昆蟲系統中，使用苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica )核多角體病毒(AcNPV)作為載體來表現外來基因。病毒在草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )細胞中生長。可將抗體編碼序列個別地選殖至病毒之非必需區域(例如多角體蛋白基因)中且置於AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)之控制下。
在哺乳動物宿主細胞中，可以利用多種基於病毒之表現系統。在其中腺病毒用作表現載體之情況下，所關注之抗體編碼序列可連接至腺病毒轉錄/轉譯控制複合物，例如晚期啟動子及三聯前導序列。此嵌合基因接著可以藉由活體外或活體內重組而插入腺病毒基因組中。插入病毒基因組非必需區域(例如區域El或E3)將產生有活性且能夠在所感染宿主中表現抗體分子的重組病毒(參見例如Logan及Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359)。特定起始信號亦可為有效轉譯所插入之抗體編碼序列所必需的。此等信號包括ATG起始密碼子及相鄰序列。此外，起始密碼子必須與所要編碼序列之閱讀框架同相，以確保整個插入物之轉譯。此等外源轉譯控制信號及起始密碼子可具有多種來源，天然與合成來源。表現效率可以藉由包括適當轉錄增強子元件、轉錄終止子等而增強(參見例如Bittner等人，1987, Methods in Enzymol. 153:51-544)。
另外，可以選擇調節所插入序列之表現或以所需特定方式修飾及處理基因產物之宿主細胞株。蛋白質產物之此類修飾(例如糖基化)及處理(例如裂解)對蛋白質功能而言可能為重要的。不同宿主細胞具有用於蛋白質及基因產物之轉譯後處理及修飾的特徵及特定機制。可選擇適當細胞株或宿主系統以確保所表現之外來蛋白質的正確修飾及處理。為此目的，可使用具有用於正確處理初級轉錄物、基因產物之糖基化及磷酸化的細胞機構之真核宿主細胞。此類哺乳動物宿主細胞包括(但不限於) CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O及T47D、NS0 (不能內源性產生任何免疫球蛋白鏈之鼠類骨髓瘤細胞株)、CRL7O3O及HsS78Bst細胞。在一些實施例中，本文所提供之完全人類抗粘附分子-4單株抗體係在諸如CHO細胞之哺乳動物細胞中產生。
為了長期高產量產生重組蛋白質，可以利用穩定表現。舉例而言，可以對細胞株進行工程改造以穩定表現抗體分子。宿主細胞可經藉由適當表現控制元件(例如啟動子、增強子序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)及可選標記物控制之DNA轉型，而非使用含有病毒複製起點的表現載體轉型。引入外來DNA之後，可使經工程改造之細胞在富集培養基中生長1-2天，且接著轉換成選擇性培養基。重組質體中之可選標記物賦予選擇抗性，且允許細胞將質體穩定地整合至其染色體中且生長而形成焦點，該等焦點又可選殖入細胞株中且擴增。此方法可以有利地用於工程改造表現抗體分子之細胞株。此類經工程改造之細胞株尤其可以適用於篩選及評估與抗體分子直接或間接相互作用之組合物。
可使用多種選擇系統，包括(但不限於)單純疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977, Cell 11:223)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska及Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202)及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy等人，1980, Cell 22:8-17)基因，其分別可在tk-細胞、hgprt-細胞或aprt-細胞中使用。另外，抗代謝物抗性可以用作選擇以下基因之基礎：dhfr ，其賦予針對甲胺喋呤之抗性(Wigler等人，1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357；O'Hare等人，1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527)；gpt ，其賦予針對黴酚酸之抗性(Mulligan及Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072)；neo，其賦予針對胺基醣苷G-418之抗性(Wu及Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；及Morgan及Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；1993年5月, TIB TECH 11(5):l55-2 15)；及hygro ，其賦予針對潮黴素之抗性(Santerre等人，1984, Gene 30:147)。重組DNA技術領域中通常已知之方法可以常規地用於選擇所需重組純系，且此類方法描述於例如Ausubel 等人(編),Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；Kriegler,Gene Transfer and Expression , A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)；及第12章及第13章, Dracopoli等人(編),Current Protocols in Human Genetics , John Wiley & Sons, NY (1994)；Colberre-Garapin等人，1981, J. Mol. Biol. 150:1，該等文獻以全文引用的方式併入本文中。
抗體分子之表現量可藉由載體擴增來增加(欲回顧，參見Bebbington及Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, 第3卷(Academic Press, New York, 1987))。當表現抗體之載體系統中的標記物可擴增時，存在於宿主細胞培養物中之抑制劑的含量增加將使標記基因複本之數目增加。由於擴增區域與抗體基因相關，因此抗體之產生亦增加(Crouse等人，1983, Mol. Cell. Biol. 3:257)。
宿主細胞可以用本文所提供的兩種表現載體(編碼重鏈衍生多肽的第一載體及編碼輕鏈衍生多肽的第二載體)共轉染。兩種載體可含有相同的可選標記物，其允許重鏈及輕鏈多肽得到等量表現。或者，可以使用編碼且能夠表現重鏈與輕鏈多肽的單一載體。在此類情形下，輕鏈應置放於重鏈之前，以避免游離重鏈受到過量的毒性(Proudfoot, 1986, Nature 322:52；及Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197-2199)。重鏈及輕鏈之編碼序列可以包含cDNA或基因組DNA。
本文所提供的抗體分子已藉由重組表現產生後，即可藉由此項技術中已知之用於純化免疫球蛋白分子的任何方法將其純化，例如藉由層析(例如離子交換、親和力，尤其在蛋白質A之後藉由對特異性抗原的親和力，及篩分管柱層析)、離心、差異溶解度，或藉由用於純化蛋白質之任何其他標準技術。此外，本文所述之抗體可以與本文所述或此項技術中另外已知之異源多肽序列融合以促進純化。29. 診斷分析及偵測方法
在一個態樣中，本發明抗粘附分子-4抗體及其片段適用於偵測生物樣品中之粘附分子-4存在。此類抗粘附分子-4抗體可以包括結合至人類粘附分子-4，但不誘導粘附分子-4信號傳導活性的彼等抗體。如本文所用，術語「偵測(detecting)」或「偵測(detection)」涵蓋定量或定性偵測，且係指利用分析讀數或結果，就樣品中之粘附分子-4的存在/缺乏、樣品中之粘附分子-4相對表現量(例如，相對於一或多種參考物表現、相對於其他樣品，或相對於一或多種表現尺度)或樣品中之粘附分子-4濃度作出決定。得自分析的偵測讀數可為數值資料，例如qPCR結果、免疫分析結果，或所測蛋白質濃度；偵測讀數可為非數值資料，例如細胞或組織用抗粘附分子-4抗體染色的顯微鏡影像或粘附分子-4染色的成像流式細胞術；或偵測讀數可為可用作粘附分子-4表現之代表的任何實驗資料，如熟習此項技術者所熟知，例如螢光強度、發光強度、比色讀數，及吸收/發射光譜。分析中的偵測讀數在本文中稱為分析信號。
如本文所提供，生物樣品為具有生物學來源的樣品或材料。生物樣品包括體液、細胞或組織樣品。在一些實施例中，細胞可為經培養的細胞株、經工程改造的細胞、獲自個體(例如人類個體)之細胞的活體外或離體培養物，或獲自個體的細胞。在其他實施例中，組織樣品可以包括獲自個體(包括人類個體)的體液或組織。在一些實施例中，組織樣品包括獲自疑似患有疾病之個體之區域的樣品。因此，組織樣品可為(但不限於)組織、體液、組織溶離份，及/或自生物體(諸如哺乳動物，特定而言，人類)分離的細胞。在一個特定實施例中，將組織樣品製備成已用福馬林固定、石蠟包埋(FFPE)的切片。可以藉由熟習此項技術者熟知的方法(例如活組織檢查(包括液體活組織檢查)、手術程序、細胞塗片及靜脈切開術)，自個體(例如人類個體)獲得細胞、體液及/或組織。
在一個態樣中，本發明提供一種偵測生物樣品中粘附分子-4之存在的方法。在某些實施例中，該方法包含使生物樣品與抗粘附分子-4抗體在容許抗粘附分子-4抗體與粘附分子-4結合的條件下接觸及偵測抗粘附分子-4抗體與粘附分子-4之間的結合。
如熟習此項技術者所熟知，與生物樣品中之抗原結合之抗體的量與生物樣品中之抗原的量相關。因此，如本文所提供之抗粘附分子-4抗體結合至生物樣品中之粘附分子-4的量可以用於量測生物樣品中之粘附分子-4的量或表現量。在一些實施例中，生物樣品中之粘附分子-4的量經偵測在抗粘附分子-4抗體之線性偵測範圍內。「線性偵測範圍」係指抗原之量或濃度的範圍，在該範圍內，所結合的抗體與生物樣品中之抗原的量或濃度線性相關。此類線性範圍視以下因素而定：諸如抗體與抗原之間的親和力、用於抗體-抗原結合之抗體的濃度，及用於抗體-抗原結合的條件。
用於抗體-抗原結合之抗體的濃度可以在滴定實驗中評估。在此類滴定實驗之一個實施例中，抗體濃度依兩倍、三倍、五倍或十倍連續稀釋，且經連續稀釋的抗體各自結合至其中相應抗原之量已知的對照樣品。在一個實施例中，所需抗體濃度為藉以依抗體結合的量區分最寬線性偵測範圍的抗體濃度。
生物樣品中之粘附分子-4的表現係指在指定時間時，生物樣品中之粘附分子-4的量。所量測之粘附分子-4的表現反映了一段時間內生物樣品中的粘附分子-4積聚且可包括降解或修飾產物，諸如全長粘附分子-4、粘附分子-4片段，及天然經修飾(例如糖基化)之粘附分子-4。由於蛋白質係由mRNA轉譯而成，因此可以利用生物樣品中之mRNA含量作為生物樣品中之粘附分子-4表現的代表。
本文提供評估來自疑似患有癌症之個體之組織樣品中之粘附分子-4表現的方法，包括：(a)使該組織樣品與如本文所提供的抗體或其抗原結合片段接觸；(b)偵測該抗體或其抗原結合片段對該組織樣品的結合；(c)測定該組織樣品中之粘附分子-4表現，其中將組織樣品中之粘附分子-4表現量與粘附分子-4之參考表現量進行比較。
本文亦提供評估來自疑似患有癌症之個體之組織樣品中之粘附分子-4表現的方法，包括：(a)利用如本文所提供的抗體或其抗原結合片段對組織樣品進行IHC分析；(b)測定組織樣品中之粘附分子-4表現，其中將組織樣品中之粘附分子-4表現量與粘附分子-4參考表現量進行比較。
本文亦提供評估癌症患者對抗癌治療劑之反應的方法，該方法基於來自該患者之組織樣品中的粘附分子-4表現，包括：(a)使該組織樣品與如本文所提供的抗體或其抗原結合片段接觸；(b)偵測該組織樣品中之該抗體或其抗原結合片段的結合；(c)測定該組織樣品中之粘附分子-4表現，其中將該組織樣品中之粘附分子-4表現量與粘附分子-4參考表現量進行比較；其中粘附分子-4相較於參考物的表現量增強表示對該抗癌療法有反應。
本文亦提供評估癌症患者對抗癌治療劑之反應的方法，該方法基於來自該患者之組織樣品中的粘附分子-4表現，包括：(a)利用如本文所提供的抗體或其抗原結合片段對該組織樣品進行IHC分析；(b)測定該組織樣品中之粘附分子-4表現，其中將該組織樣品中之粘附分子-4表現量與粘附分子-4參考表現量進行比較，其中組織樣品相較於參考物中之粘附分子-4表現量增強表示對該抗癌療法有反應。
本文提供治療個體之癌症的方法，包括(a)利用如本文所提供之抗體或其抗原結合片段測定來自個體之組織樣品中的粘附分子-4表現量，其中該組織樣品中之粘附分子-4表現量高於粘附分子-4參考表現量；(b)向該個體投與抗癌治療劑。
本文提供治療個體之癌症的方法，包括(a)使來自個體的組織樣品與如本文所提供的抗體或其抗原結合片段接觸；(b)利用如本文所提供的抗體或其抗原結合片段測定來自個體之組織樣品中的粘附分子-4表現量，其中該組織樣品中之粘附分子-4表現量高於粘附分子-4之參考表現量；(c)向該個體投與抗癌治療劑。
本文提供治療個體之癌症的方法，包括(a)自該個體獲得組織樣品；(b)使來自該個體的組織樣品與如本文所提供的抗體或其抗原結合片段接觸；(c)利用如本文所提供的抗體或其抗原結合片段測定來自個體之組織樣品中的粘附分子-4表現量，其中該組織樣品中之粘附分子-4表現量高於粘附分子-4之參考表現量；(d)向該個體投與抗癌治療劑。
本文所提供的之任何方法中的個體可為人類個體且個體可以患有其中粘附分子-4表現可進行測定及/或其中粘附分子-4表現可以提供診斷、預後或預測價值的任何癌症。例示性癌症包括急性淋巴母細胞性白血病；急性淋巴母細胞性淋巴瘤；急性淋巴球性白血病；急性骨髓性白血病；急性骨髓性白血病(成年/兒童期)；腎上腺皮質癌；AIDS相關癌症；AIDS相關淋巴瘤；肛門癌；闌尾癌；星形細胞瘤；非典型畸胎樣/橫紋肌樣腫瘤；基底細胞癌；肝外膽管癌(膽管癌)；膀胱癌；骨骼骨肉瘤/惡性纖維組織細胞瘤；腦癌(成年/兒童期)；腦腫瘤，小腦星形細胞瘤(成年/兒童期)；腦腫瘤，大腦星形細胞瘤/惡性神經膠質瘤腦腫瘤；腦腫瘤，室管膜瘤；腦腫瘤，神經管胚細胞瘤；腦腫瘤，幕上原始神經外胚層腫瘤；腦腫瘤，視覺路徑及下丘腦神經膠質瘤；腦幹神經膠質瘤；乳癌；支氣管腺瘤/類癌；支氣管腫瘤；伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)；兒童期癌症；類癌胃腸腫瘤；類癌瘤；原發位點不明的成人癌瘤；原發灶不明癌；中樞神經系統胚胎腫瘤；中樞神經系統淋巴瘤，原發；子宮頸癌；兒童期腎上腺皮質癌；兒童期癌症；兒童期大腦星形細胞瘤；兒童期脊索瘤；慢性淋巴球性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增生病；結腸癌；結腸直腸癌；顱咽管瘤；皮膚T細胞淋巴瘤；促結締組織增生小型圓形細胞腫瘤；肺氣腫；子宮內膜癌；室管膜母細胞瘤；室管膜瘤；食道癌；尤文氏(Ewing)腫瘤家族中的尤文氏肉瘤；顱外生殖細胞腫瘤；性腺外生殖細胞腫瘤；肝外膽管癌；膽囊癌；胃癌；胃類癌；胃腸類癌瘤；胃腸基質腫瘤；生殖細胞腫瘤：顱外、性腺外或卵巢妊娠期滋養細胞腫瘤；原發位點不明的妊娠期滋養細胞腫瘤；神經膠質瘤；腦幹神經膠質瘤；兒童期視覺路徑及下丘腦神經膠質瘤；毛細胞白血病；頭頸癌；心臟癌症；肝細胞(肝臟)癌症；霍奇金氏淋巴瘤(hodgkin lymphoma)；下咽癌；下丘腦及視覺路徑神經膠質瘤；眼內黑色素瘤；胰島細胞癌瘤(內分泌胰臟)；卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)；腎癌(腎細胞癌)；蘭格漢氏細胞(langerhans cell)組織細胞增多症；喉癌；唇及口腔癌症；脂肪肉瘤；肝癌(原發)；肺癌；中樞神經系統原發淋巴瘤；瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(macroglobulinemia, Waldenström)；男性乳癌；骨骼/骨肉瘤之惡性纖維組織細胞瘤；神經管胚細胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；眼內(眼)黑色素瘤；梅克爾細胞癌(merkel cell cancer)；梅克爾細胞皮膚癌瘤；間皮瘤；成人惡性間皮瘤；原發灶隱藏的轉移性鱗狀頸癌；口腔癌；多發性內分泌瘤症候群；多發性骨髓瘤/漿細胞贅生物；蕈樣黴菌病，骨髓發育不良症候群；骨髓發育不良/骨髓增生性疾病；慢性骨髓性白血病；成年急性骨髓性白血病；兒童期急性骨髓性白血病；多發性骨髓瘤(骨骼骨髓癌)；慢性骨髓增生病；鼻腔及鼻竇癌；鼻咽癌；神經母細胞瘤，非小細胞肺癌；非霍奇金淋巴瘤；寡樹突神經膠質瘤；口癌；口腔癌症；口咽癌；骨骼之骨肉瘤/惡性纖維組織細胞瘤；卵巢癌；卵巢上皮細胞癌(表面上皮-基質腫瘤)；卵巢生殖細胞腫瘤；卵巢低惡性潛在腫瘤；胰臟癌；胰島細胞胰臟癌；乳頭狀瘤症；副鼻竇及鼻腔癌；副甲狀腺癌；陰莖癌；咽癌；嗜鉻細胞瘤；松果體星形細胞瘤；松果體胚細胞瘤；中等分化的松果體實質性腫瘤；松果體母細胞瘤及幕上原始神經外胚層腫瘤；垂體腫瘤；垂體腺瘤；漿細胞瘤形成/多發性骨髓瘤；胸膜肺母細胞瘤；原發中樞神經系統淋巴瘤；前列腺癌；直腸癌；腎細胞癌(腎癌)；腎盂及輸尿管移行細胞癌；涉及染色體15上之NUT基因的呼吸道癌瘤；視網膜母細胞瘤；兒童期橫紋肌肉瘤；唾液腺癌症；肉瘤，尤文氏腫瘤家族；塞紮里症候群(Sézary syndrome)；皮膚癌(黑色素瘤)；皮膚癌(非黑色素瘤)；小細胞肺癌；小腸癌軟組織肉瘤；軟組織肉瘤；脊髓腫瘤；鱗狀細胞癌；原發灶隱藏的鱗狀頸癌，轉移；胃癌；幕上原始神經外胚層腫瘤；皮膚T細胞淋巴瘤(蕈樣黴菌病及塞紮里症候群)；睪丸癌；咽喉癌；胸腺瘤；胸腺瘤及胸腺癌；甲狀腺癌；兒童期甲狀腺癌；腎盂及輸尿管之移行細胞癌；尿道癌；子宮內膜子宮癌；尿道上皮癌、膀胱癌、輸尿管癌症、尿道癌症，及臍尿管癌症，子宮肉瘤；陰道癌；外陰癌；威爾姆斯腫瘤(Wilms Tumor)；及上皮來源的表現粘附分子-4之其他癌症。
在本文所提供之方法的一些實施例中，個體(例如人類個體)疑似患有選自由以下組成之群之癌症：子宮內膜癌、尿道上皮癌、膀胱癌、輸尿管癌、尿道癌、肺癌、卵巢癌、乳癌、食道癌、胰臟癌、頭頸癌、前列腺癌、陰莖癌、肛門癌、外陰癌、臍尿管癌，及上皮來源之表現粘附分子-4的其他癌症。
如本文所用，術語「反應」係指細胞或個體或患者或個體對抗癌治療劑治療有反應或發生反應的機率。反應可以包括針對抗癌治療劑之多種反應的機率，例如(且無任何限制)癌細胞之增殖或生長減少、癌細胞之細胞死亡增加、癌細胞數目或腫瘤尺寸減少、腫瘤尺寸增大速率降低、癌症階段進展延遲、癌症階段或腫瘤尺寸消退、癌症標記物表現減少、癌症轉移減少，及/或患者結果(諸如患者身體質量恢復、患者6個月、1年、2年、3年或5年存活率，及/或患者存活持續時間)改善。在某些實施例中，反應可以依不靈敏(亦即，不大可能有反應)、靈敏(可能有反應)及/或不明確來衡量。在某些實施例中，當細胞、組織、患者或個體的腫瘤或癌細胞中展示表現顯著的粘附分子-4時，該細胞或組織或個體或患者或個體很可能對抗癌治療劑有反應。在某些實施例中，反應隨著腫瘤或癌細胞/組織中之粘附分子-4含量增加而增強。在某些實施例中，反應與腫瘤或癌細胞/組織中之粘附分子-4表現量相關。在某些實施例中，反應與腫瘤或癌細胞/組織中之粘附分子-4表現量呈線性比例。在其他實施例中，細胞、組織、患者或個體對抗癌治療劑的反應可為對粘附分子-4表現呈陰性之細胞的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、200%、250%、300%、400%、500%、750%、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或超過100倍。
如本文所用，「指示反應」係指在一種細胞、組織、人類個體或個體中的反應高於另一細胞、組織、人類個體或個體的預測。此類預測係基於某些準則產生。在一些實施例中，反應預測係基於細胞、組織、腫瘤、人類個體或個體中之粘附分子-4表現量產生。如上文所述，在某些實施例中，當細胞、組織、患者或個體在其腫瘤或癌細胞中展示表現顯著的粘附分子-4中時，預測細胞或組織或個體或患者或個體很可能對抗癌治療劑有反應。在某些實施例中，預測反應隨著腫瘤或癌細胞/組織中之粘附分子-4含量增加而增加。在某些實施例中，預測反應與腫瘤或癌細胞/組織中之粘附分子-4表現量相關。在某些實施例中，預測反應與腫瘤或癌細胞/組織中之粘附分子-4表現量呈線性比例。在其他實施例中，預測細胞、組織、患者或個體對抗癌治療劑的反應為對粘附分子-4表現呈陰性之細胞的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、200%、250%、300%、400%、500%、750%、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或超過100倍。
抗癌治療劑可為其中粘附分子-4表現可以提供診斷、預後或預測價值的任何抗癌治療劑或任何抗癌療法。在某些實施例中，治療劑為靶向其中粘附分子-4起作用之生物過程(例如信號傳導路徑、代謝途徑或蛋白質合成/降解路徑)的治療劑。在某些實施例中，治療劑為靶向粘附分子-4活性、粘附分子-4信號傳導或粘附分子-4介導疾病的治療劑。在一個特定實施例中，治療劑為抗粘附分子-4抗體或抗粘附分子-4抗體藥物結合物。
為了測定組織樣品中的粘附分子-4表現，將組織樣品中的粘附分子-4表現量與粘附分子-4之參考表現量進行比較或相關聯。如本文所用，「參考表現量」係指參考樣品中的表現量，當與測試樣品中之粘附分子-4表現量比較時提供關於測試樣品中之粘附分子-4表現的相對資訊。參考表現量可為已知表現量，例如參考樣品中之表現，其中粘附分子-4之量、濃度及/或莫耳量已知。舉例而言，參考表現量可為細胞株中的粘附分子-4表現，其中細胞已經轉染或以其他方式經工程改造以表現已知量的粘附分子-4。在一些實施例中，參考表現量可為細胞中之粘附分子-4表現，其中粘附分子-4表現已藉由本文所提供或熟習此項技術者已知的方法定量，諸如ELISA、SDS-PAGE、定量免疫沈澱及/或定量西方墨點法。在其他實施例中，參考表現量涉及超過一種參考物，諸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、75、100種及超過100種參考物。在一個實施例中，參考水準具有4種參考物：一者對粘附分子-4表現呈陰性，一者的粘附分子-4表現弱，一者具有中度的粘附分子-4表現，且一者具有高度/強粘附分子-4表現。
或者，參考表現量可為其中粘附分子-4之確切濃度或量未知、但參考樣品之狀態、活性及/或功能已知的水準。在一些實施例中，參考表現量可為來自疑似患有癌症之同一患者之非癌細胞的表現量。在此類實施例中，藉由比較測試樣品中之粘附分子-4表現與參考樣品中之粘附分子-4表現，可以相對於(例如高於、低於或基本上相同於)非癌細胞中之粘附分子-4表現來測定測試樣品中之粘附分子-4表現。在其他實施例中，參考物表現量可為癌細胞之表現量，其中藉由比較測試樣品中之粘附分子-4表現與參考樣品中之粘附分子-4表現，可以相對於(例如高於、低於或基本上相同於)癌細胞中之粘附分子-4表現來測定測試樣品中之粘附分子-4表現。在其他實施例中，參考物表現量可為來自第二個體之細胞的表現量，其中藉由比較測試樣品中之粘附分子-4表現與參考樣品中之粘附分子-4表現，可以相對於(例如高於、低於或基本上相同於)來自第二個體之細胞中的粘附分子-4表現來測定測試樣品中之粘附分子-4表現。第二個體可為不患有癌症的正常人類個體、所患癌症種類與疑似患有癌症之患者相同的人類個體，或所患癌症種類與疑似患有癌症之患者不同的人類個體。
如本文所述的參考樣品及參考細胞可為細胞株、自疑似患有癌症之患者獲得之細胞的活體外或離體培養物、自疑似患有癌症之患者獲得的細胞、自第二個體獲得之細胞的活體外或離體培養物、自第二個體獲得的細胞。
因此，在本文所提供之方法的一些實施例中，粘附分子-4之參考表現量可為該個體之癌細胞、非癌細胞或來自第二個體之非癌細胞中的粘附分子-4表現量。
如上文所述，在一些實施例中，樣品中之粘附分子-4表現可藉由使結合至樣品之抗粘附分子-4抗體與結合至陰性及陽性參考物之抗粘附分子-4抗體相關聯或比較來測定，其中參考物中之粘附分子-4表現量已知。參考物粘附分子-4表現可為陽性粘附分子-4對照物或陰性粘附分子-4對照物。如本文所用，「陽性粘附分子-4對照物」或「陽性對照物」係指已知表現大量粘附分子-4的細胞、組織、腫瘤、人類及/或個體。「陰性粘附分子-4對照物」或「陰性對照物」係指已知不表現粘附分子-4或低量表現粘附分子-4的細胞及/或組織，使得細胞或組織中之粘附分子-4在生物學上不顯著。當出現以下情況時，粘附分子-4含量在生物學上不顯著：(1)熟習此項技術者根據管家基因之蛋白質產物認為粘附分子-4表現量低；(2)低含量粘附分子-4之存在或不存在不會使細胞或組織產生生物學差異；及(3)若自細胞或組織移除或缺失之粘附分子-4的此等量不顯著，則細胞或組織將繼續以與此類移除或缺失之前基本上相同的方式發揮作用。已知的粘附分子-4表現可以獨立地藉由qPCR分析加以測定。已知的粘附分子-4表現亦可獨立地利用下文所述之任何免疫分析、使用已測定具有粘附分子-4特異性的抗粘附分子-4抗體(例如上述特異性篩選方法中所鑑別的粘附分子-4特異性抗體)加以測定。適合的免疫分析包括(例如且無任何限制) IHC分析、免疫墨點分析、FACS分析或ELISA。在一些實施例中，由於分析存在背景雜訊或由於殘餘粘附分子-4之低含量在生物學上不顯著，因此陰性對照物中的粘附分子-4 mRNA含量可不為零。粘附分子-4陰性對照物對於粘附分子-4可以正確地視為陰性，例如當qPCR分析中的粘附分子-4 mRNA含量基本上類似於使用一組非特異性引子所偵測的mRNA含量時，或當粘附分子-4 mRNA含量在生物學上不顯著(根據粘附分子-4陽性對照物中的粘附分子-4 mRNA含量)時。類似地，由於分析之背景雜訊或由於殘餘粘附分子-4之低含量在生物學上不顯著，因此使用另一粘附分子-4特異性抗體之免疫分析在陰性對照物中偵測到的粘附分子-4可能不為零。背景雜訊可以由除抗粘附分子-4抗體之外的分析試劑與樣品之間的非特異性相互作用引起。陰性粘附分子-4對照物對於粘附分子-4而言可以正確地視為陰性，例如當抗粘附分子-4抗體在陰性對照物中所偵測到的粘附分子-4含量基本上類似於同型對照抗體在相同分析中的偵測含量時。在一些分析中，背景雜訊可以佔來自粘附分子-4表現之偵測信號的實質百分比。
另外，熟習此項技術者已鑑別出陽性及陰性對照物且公開於文獻中，包括陽性及/或陰性組織、細胞(包括例如細胞株)及病理學樣品。此類文獻可容易藉由搜尋資料庫(諸如Pubmed)加以鑑別(例如使用諸如粘附分子-4、表現、陽性、陰性及/或分佈之搜尋項)及分析搜尋匹配結果。
因此，結合至不表現粘附分子-4之陰性對照細胞之抗體或其抗原結合片段的相對量可為結合至表現粘附分子-4之樣品細胞之抗體或其抗原結合片段之量的約50%、40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.03%、0.01%、0.001%或低於0.001%。
因此，在本文所提供之方法的一些實施例中，粘附分子-4的參考表現量為陰性對照物中之粘附分子-4表現量，其中陰性對照物中之粘附分子-4表現獨立地藉由qPCR分析、使用第二抗體的IHC分析、使用第二抗體的免疫墨點分析、使用第二抗體的FACS分析或使用第二抗體的ELISA加以測定。
在本文所提供之方法的其他實施例中，粘附分子-4之參考表現量為表現粘附分子-4之陽性對照細胞中的粘附分子-4表現量，其中陽性對照中的粘附分子-4表現獨立地藉由qPCR分析、使用第二抗體的IHC分析、使用第二抗體的免疫墨點分析、使用第二抗體的FACS分析或使用第二抗體的ELISA加以測定。
樣品中之粘附分子-4表現量可以不同於陽性對照物中之表現量。結合至組織樣品之抗體或其抗原結合片段的相對量可為結合至表現粘附分子-4之陽性對照細胞之抗體或其抗原結合片段之量的約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、200%、250%、300%、400%、500%、750%、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、500倍或超過500倍。
多種不同PCR或qPCR方案在此項技術中已知且例示於本文中且可以直接應用於或經調適以用於測定樣品或對照物中之粘附分子-4 mRNA含量，其可以用作樣品或對照物中之粘附分子-4蛋白質之表現量的代表。定量PCR (qPCR)(亦稱為即時PCR)應用於且經調適而用於一些實施例中，原因是其不僅提供定量的量測結果，而且減少時間及污染。如本文所用，「定量PCR (或「qPCR」)」係指如正發生之PCR擴增進度之直接監測，而無需對反應產物重複取樣。在定量PCR中，反應產物在其產生時可以經由信號傳導機制(例如螢光)加以監測且在信號上升而高於背景水準、但在反應達到平穩階段之前加以追蹤。為達成可偵測或「臨限」螢光水準所需的循環數目在PCR過程開始時直接隨著可擴增的標靶濃度而變化，從而允許量測信號強度，以便即時量測樣品中之靶核酸含量。當應用qPCR測定mRNA表現量時，mRNA逆轉錄為DNA之額外步驟係在qPCR分析之前執行。PCR方法之實例可見於文獻中(Wong等人，BioTechniques 39:75-85 (2005)；D'haene等人，Methods 50:262-270 (2010))，該文獻以全文引用的方式併入本文中。PCR分析之實例可見於美國專利第6,927,024號，其以全文引用的方式併入本文中。RT-PCR方法之實例可見於美國專利第7,122,799號中，其以全文引用的方式併入本文中。螢光原位PCR方法描述於美國專利第7,186,507號中，其以全文引用的方式併入本文中。
在一個特定實施例中，可如下進行qPCR以測定或量測粘附分子-4 mRNA含量。簡言之，測定粘附分子-4及一或多種管家基因之複製qPCR反應的平均Ct (循環臨限值)值(或在本文中可互換地稱為Cq (定量循環))。粘附分子-4之平均Ct值接著可以利用以下例示公式相對於管家基因之Ct值歸一化：粘附分子-4-ΔCt = (粘附分子-4之平均Ct - 管家基因A之平均Ct)。接著可以利用相對粘附分子-4-ΔCt測定粘附分子-4 mRNA的相對含量，例如藉由使用mRNA表現公式 = 2- ∆ Ct 。關於Ct及Cq值之概述，參見MIQE指南(Bustin等人，The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments, Clinical Chemistry 55:4 (2009))。
亦可使用此項技術中已知之用於定量樣品中之mRNA表現的其他常用方法，包括北方墨點法及原位雜交(Parker及Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999))；核糖核酸酶保護分析(Hod, Biotechniques 13:852-854 (1992))；微陣列(Hoheisel等人，Nature Reviews Genetics 7:200-210 (2006)；Jaluria等人，Microbial Cell Factories 6:4 (2007))；及聚合酶鏈反應(PCR)(Weis等人，Trends in Genetics 8:263-264 (1992))。或者，可以藉由測序技術測定mRNA表現量。用於基於測序之基因表現分析的代表性方法包括基因表現系列分析(SAGE)及藉由大規模並行標誌測序(MPSS)進行之基因表現分析。
如早先所描述，組織樣品可為(但不限於)自生物體(諸如哺乳動物，特定而言，人類)分離的組織、體液、組織溶離份及/或細胞。因此，組織樣品可以獲自個體(包括人類個體)之多種器官。在一些實施例中，組織樣品獲自疑似患有疾病、功能障礙或病症(諸如癌症)的器官。在其他實施例中，組織樣品獲自來自正接受測試之患者或來自第二人類個體的正常器官。
在本文所提供之方法的某些實施例中，組織包括來自膀胱、輸尿管、乳房、肺、結腸、直腸、卵巢、輸卵管、食道、子宮頸、子宮內膜、皮膚、喉、骨髓、唾液腺、腎臟、前列腺、腦、脊髓、胎盤、腎上腺、胰臟、副甲狀腺、腦垂體、睪丸、甲狀腺、脾、扁桃體、胸腺、心臟、胃、小腸、肝臟、骨骼肌、周邊神經、間皮或眼的組織。
結合至樣品的抗粘附分子-4抗體可以藉由此項技術中已知的多種免疫分析加以偵測，包括IHC方法、免疫墨點分析、FACS分析及ELISA。
在多種IHC方法中，可以利用抗粘附分子-4抗體偵測粘附分子-4。組織切片之IHC染色已表明為評估或偵測樣品中蛋白質之存在的可靠方法。IHC技術利用抗體探測及可視化原位細胞抗原，通常藉由發色或螢光方法來探測及可視化。IHC分析中可以使用初級抗體或抗血清(諸如特異性靶向粘附分子-4的多株抗血清及單株抗體)來偵測表現。在一些實施例中，使組織樣品與針對特定標靶的初級抗體接觸足以使抗體-標靶結合的時間。如下文更詳細地論述，該等抗體可藉由用例如放射性標記、螢光標記、半抗原標記(諸如生物素)或酶(諸如辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶)直接標記抗體本身來偵測。或者，未標記之初級抗體與對該初級抗體具有特異性的經標記之二級抗體(包含抗血清、多株抗血清或單株抗體)結合使用。IHC方案及套組在此項技術中已熟知且可市購。用於載片製備及IHC處理之自動化系統可市購。Leica BOND自動染色儀及Leica Bond Refine偵測系統為此類自動化系統之實例。
在一些實施例中，使用未標記之初級抗體，結合間接分析中之經標記之二級抗體來執行IHC分析。間接分析係利用兩種抗體偵測組織樣品中之靶蛋白，諸如粘附分子-4。首先，將未結合的初級抗體施加至組織(第一層)，與組織樣品中的靶抗原反應。接著，施加經酶標記之二級抗體，其特異性識別初級抗體之抗體同型(第二層)。二級抗體與初級抗體反應，隨後施加受質-色素原。第二層抗體可以用酶(過氧化酶)標記，該過氧化酶與色素原3,3'-二胺基聯苯胺(DAB)反應而在反應位點產生棕色沈澱物。此方法由於潛在的信號經由信號放大系統放大而靈敏且通用。
在某些實施例中，為了增加偵測靈敏性，可以使用信號放大系統。如本文所用，「信號放大系統」意謂一種試劑及方法系統，其可以用於增強來自偵測所結合之初級或二級抗體的信號。信號放大系統增強靶蛋白偵測靈敏性、增強所偵測信號，且減少偵測極限之較低邊界。存在若干類型的信號放大系統，包括酶標記系統及宏觀標記系統。此等系統/方法互不排斥且可以組合使用以得到相加效應。
宏觀標記系統為連接至或併入共同支架中的標記集合，其數目為數十(例如，藻膽蛋白)至數百萬(例如螢光微球體)。支架可以與標靶特異性親和力試劑(諸如抗體)偶聯，且併入的標記在結合後藉此一起與標靶關聯。宏觀標記中的標記可為本文所述之任何標記，諸如螢光團、半抗原、酶及/或放射性同位素。在信號放大系統之一個實施例中，使用經標記之鏈聚合物所結合的二級抗體。聚合物技術係利用可以與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、50或超過50個二級抗體分子連接之經HRP酶標記之惰性「棘」分子，從而使系統甚至更靈敏。
基於酶標記系統之信號放大系統係利用酶(諸如辣根過氧化酶(HRP)或鹼性磷酸酶)之催化活性來原位產生靶蛋白或核酸序列之高密度標記。在一個實施例中，可以使用酪醯胺增強HRP信號。在此系統中，HRP以酶方式使經標記之酪醯胺衍生物轉化成反應性高、壽命短的酪醯胺基團。經標記之活性酪醯胺基團接著與HRP抗體-標靶相互作用位點附近的殘基(主要為蛋白質酪胺酸殘基之苯酚部分)共價偶聯，引起該位點之標記數目擴增且信號局域化與擴散相關的損失最小。因此，信號可以擴增1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、50、75或100倍。如熟習此項技術者所知，酪醯胺上之標記可為本文所述之任何標記，包括螢光團、酶、半抗原、放射性同位素及/或發光器。亦可利用基於酶之其他反應產生信號放大。舉例而言，經酶標記之螢光(ELF)信號放大可利用於鹼性磷酸酶，其中鹼性磷酸酶以酶方式使弱藍色螢光受質(ELF 97磷酸鹽)裂解且將其轉化成亮黃色-綠色螢光沈澱物，該沈澱物展現異常大的斯托克位移(Stokes shift)及優良的光穩定性。基於酪醯胺之信號放大系統與ELF信號放大可購自例如ThermoFisher Scientific (Waltham, MA USA 02451)。
因此，在本文所提供之方法的一些實施例中，利用信號放大系統偵測粘附分子-4之表現量。
在一些實施例中，接著對試樣進行對比染色，以鑑別細胞及亞細胞元件。
在一些實施例中，亦可利用免疫墨點分析、使用本文所述之抗體偵測粘附分子-4之表現量。在免疫墨點分析之一些實施例中，通常(但不一定)藉由電泳分離出蛋白質且轉印至膜(通常為硝化纖維素或PVDF膜)上。類似於IHC分析，可以使用初級抗體或抗血清(諸如特異性靶向粘附分子-4的多株抗血清及單株抗體)偵測蛋白質表現。在一些實施例中，使膜與針對特定標靶之初級抗體接觸足以發生抗體-抗原結合的時間且所結合的抗體可以藉由用例如放射性標記、螢光標記、半抗原標記(諸如生物素)或酶(諸如辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶)直接標記初級抗體本身來偵測。在其他實施例中，在如上文所述的間接分析中，結合對初級抗體具有特異性之經標記之二級抗體來使用未標記之初級抗體。如本文所述，二級抗體可以用例如酶或其他可偵測標記(諸如螢光標記、發光標記、比色標記，或放射性同位素)標記。免疫墨點法方案及套組在此項技術中已熟知且可市購。用於免疫墨點法的自動化系統，例如用於西方墨點法的iBind Western系統(ThermoFisher, Waltham, MA USA 02451)可市購。免疫墨點法包括(但不限於)西方墨點法、細胞內西方墨點法及點漬墨法。點漬墨法為一種簡化程序，其中蛋白質樣品並非藉由電泳分離，而是直接點樣至膜上。細胞內西方墨點法包括將細胞接種於微量滴定盤中、固定/滲透細胞，及隨後用初級經標記之初級抗體或未經標記之初級抗體偵測，隨後用經標記之二級抗體偵測，如本文所述。
在其他實施例中，粘附分子-4之表現量亦可在流式細胞術分析(包括螢光活化細胞分選(FACS)分析)中用本文所述之抗體偵測。類似於IHC或免疫墨點分析，可以在FACS分析中使用初級抗體或抗血清(諸如特異性靶向粘附分子-4的多株抗血清及單株抗體)偵測蛋白質表現。在一些實施例中，細胞用針對特定靶蛋白的初級抗體染色足以發生抗體-抗原結合的時間且所結合的抗體可以藉由用例如螢光標記或半抗原標記直接標記初級抗體(諸如生物素標記初級抗體)來偵測。在其他實施例中，在如上文所述的間接分析中，結合對初級抗體具有特異性之經螢光標記之二級抗體來使用未標記之初級抗體。FACS提供一種基於每種細胞之特定光散射及螢光特徵來分選或分析經螢光標記之生物細胞之混合物的方法(一次一種細胞)。流式細胞儀偵測且報導經螢光染料標記之抗體的強度，其表示靶蛋白之表現量。因此，表面蛋白質(諸如粘附分子-4)之表現量可以使用針對靶蛋白之抗體偵測。亦可藉由將所滲透細胞染色來觀測非螢光細胞質蛋白質。用於執行FACS染色及分析之方法已為熟習此項技術者熟知且描述於Teresa S. Hawley及Robert G. Hawley in Flow Cytometry Protocols, Humana Press, 2011 (ISBN 1617379506, 9781617379505)中。
在其他實施例中，亦可利用免疫分析(諸如酶免疫分析(EIA)或ELISA)偵測粘附分子-4表現量。EIA與ELISA分析在此項技術中已知，例如，用於分析多種組織及樣品，包括血液、血漿、血清或骨髓。有多種ELISA分析形式可供利用，參見例如美國專利第4,016,043號、第4,424,279號及第4,018,653號，該等專利以全文引用的方式併入本文中。此等分析包括非競爭型單點與兩點或「夾心」分析，以及傳統競爭性結合分析。此等分析亦包括經標記之抗體對靶蛋白的直接結合。夾心分析為常用分析。夾心分析技術存在多種變化形式。舉例而言，在典型正向分析中，使未經標記之抗體固著於固體受質上，且使待測試之樣品與所結合的分子接觸。在培育適合時間段(即足以允許抗體-抗原複合物形成之時間段)之後，接著添加用能夠產生可偵測信號之報導體分子標記的對抗原具有特異性之第二抗體且培育，給予足夠的時間以形成抗體-抗原-經標記抗體之另一複合物。洗掉任何未反應之物質，且藉由觀測由報導體分子產生之信號來確定抗原之存在。結果可藉由簡單地觀測可見信號來定性，或可藉由與含有已知量之靶蛋白的對照樣品比較來定量。
在EIA或ELISA分析之一些實施例中，使酶與第二抗體結合。在其他實施例中，可以在ELISA分析形式中使用經螢光標記之二級抗體來代替經酶標記之二級抗體產生可偵測信號。當在特定波長之光照射下活化時，螢光染料標記之抗體吸收光能，誘導分子之可激發狀態，隨後發射可用光學顯微鏡目視偵測之特徵顏色的光。如同EIA及ELISA，允許經螢光標記之抗體結合至第一抗體-靶蛋白複合物。在洗掉未結合之試劑之後，接著使殘留三元複合物暴露於適當波長之光，觀測到的螢光表示所關注靶蛋白之存在。免疫螢光與EIA技術在此項技術中均沿用已久且揭示於本文中。
對於本文所述之免疫分析而言，可以使用多種酶或非酶標記中之任一者，只要可以分別偵測到酶活性或非酶標記即可。酶藉此產生可偵測信號，該信號可以用於偵測靶蛋白。特別適用的可偵測信號為發色或螢光信號。因此，用作標記的特別適用酶包括可利用發色或螢光受質的酶。此類發色或螢光受質可以藉由酶反應轉化為容易偵測的發色或螢光產物，該產物可以容易利用顯微法或光譜法偵測及/或定量。此類酶已為熟習此項技術者熟知，包括(但不限於)辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶及其類似物(參見Hermanson,Bioconjugate Techniques , Academic Press, San Diego (1996))。利用熟知發色或螢光受質的其他酶包括各種肽酶，其中發色或螢光肽受質可以用於偵測蛋白分解裂解反應。發色及螢光受質在細菌診斷中的用途亦熟知，包括(但不限於)使用α-半乳糖苷酶及β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、6-磷酸化-β-D-半乳糖苷6-磷酸化半乳糖水解酶、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、澱粉酶、神經胺糖酸苷酶、酯酶、脂肪酶及其類似物(Manafi等人，Microbiol . Rev . 55:335-348 (1991))，且利用已知發色或螢光受質的此類酶可容易調適以用於本發明方法中。
產生可偵測信號的各種發色或螢光受質已為熟習此項技術者熟知且可市購。可以用於可偵測信號的例示性受質包括(但不限於)辣根過氧化酶用的3,3'-二胺基聯苯胺(DAB)、3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)、氯萘酚(Chloronaphthol)(4-CN)(4-氯-1-萘酚)、2,2'-次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、鄰苯二胺二鹽酸鹽(OPD)，及3-胺基-9-乙基咔唑(AEC)；鹼性磷酸酶用的5-溴-4-氯-3-吲哚基-1-磷酸酯(BCIP)、硝基藍四唑鎓(NBT)、快速紅(快速紅TR/AS-MX)，及對硝基苯基磷酸酯(PNPP)；β-半乳糖苷酶用的1-甲基-3-吲哚基-β-D-哌喃半乳糖苷及2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-哌喃半乳糖苷；β-葡糖苷酶用的2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-葡萄哌喃糖苷；及其類似物。例示性螢光受質包括(但不限於)鹼性磷酸酶用的4-(三氟甲基)傘形酮基磷酸酯；磷酸酶用的4-甲基傘形酮基磷酸酯雙(2-胺基-2-甲基-1,3-丙二醇)、4-甲基傘形酮基磷酸酯雙(環己基銨)及4-甲基傘形酮基磷酸酯；辣根過氧化酶用的QuantaBluTM 及QuantaRedTM ；β-半乳糖苷酶用的4-甲基傘形酮基β-D-哌喃半乳糖苷、螢光素二(β-D-哌喃半乳糖苷)及萘并螢光素二-(β-D-哌喃半乳糖苷)；β-葡糖苷酶用的3-乙醯基傘形酮基β-D-葡萄哌喃糖苷及4-甲基傘形酮基-β-D-葡萄哌喃糖苷；及α-半乳糖苷酶用的4-甲基傘形酮基-α-D-哌喃半乳糖苷。用於產生可偵測信號的例示性酶及受質亦描述於例如US公開案2012/0100540中。各種可偵測酶受質(包括發色或螢光受質)已熟知且可市購(Pierce, Rockford IL; Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX; Invitrogen, Carlsbad CA; 42 Life Science; Biocare)。一般而言，將受質轉化成產物，形成沈澱物，其沈積於靶核酸位點處。其他例示性受質包括(但不限於)HRP-Green (42 Life Science)、Betazoid DAB、Cardassian DAB、Romulin AEC、Bajoran Purple、Vina Green、Deep Space Black™、Warp Red™、Vulcan Fast Red及Ferangi Blue(得自Biocare)(Concord CA; biocare.net/products/detection/chromogens)。
在免疫分析之一些實施例中，可偵測標記可以與可以具有的初級抗體或偵測未標記之初級抗體的二級抗體直接偶聯。例示性可偵測標記已為熟習此項技術者熟知，包括(但不限於)發色或螢光標記(參見Hermanson,Bioconjugate Techniques , Academic Press, San Diego (1996))。適用作標記的例示性螢光團包括(但不限於)若丹明衍生物，例如四甲基若丹明、若丹明B、若丹明6G、磺醯若丹明B、德克薩斯紅(磺醯若丹明101)、若丹明110及其衍生物，諸如四甲基若丹明-5-(或6)、麗絲胺若丹明B及其類似物；7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑(NBD)；螢光素及其衍生物；萘，諸如丹醯基(5-二甲胺基萘-1-磺醯基)；香豆素衍生物，諸如7-胺基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、7-二乙基胺基-3-[(4'-(碘乙醯基)胺基)苯基]-4-甲基香豆素(DCIA)、Alexa fluor染料(Molecular Probes)，及其類似物；4,4-二氟-4-硼雜-3a,4a-二氮雜-s-二環戊二烯并苯(BODIPYTM )及其衍生物(Molecular Probes; Eugene Oreg.)；芘及磺化芘，諸如Cascade BlueTM 及其衍生物，包括8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸，及其類似物；吡啶基噁唑衍生物及達珀西(dapoxyl)衍生物(Molecular Probes)；螢光黃(3,6-二磺酸酯-4-胺基-萘二甲醯亞胺)及其衍生物；CyDyeTM 螢光染料(Amersham/GE Healthcare Life Sciences；Piscataway NJ)，及其類似物。例示性發色團包括(但不限於)酚酞、孔雀綠、硝基芳族烴(諸如硝基苯基)、重氮基染料、達波希(4-二甲胺基偶氮苯-4'-磺醯基)，及其類似物。
可以利用熟習此項技術者熟知的方法(諸如顯微法或光譜法)使與所結合之初級或二級抗體結合的發色或螢光可偵測信號可視化。
「測定粘附分子-4表現」係指將表現粘附分子-4之測試生物樣品置於所提及之系統(或所提及之量表)中，以便熟悉所提及之系統的人員可以告知測試樣品中之粘附分子-4相對於已安置於所提及之系統中之其他樣品的相對表現。因此，此測定包括比較測試組織樣品中之粘附分子-4表現與粘附分子-4參考表現量。
在一些實施例中，所提及之系統可為定量系統，其中將測試樣品中之粘附分子-4的實際莫耳濃度或莫耳量與參考物表現量的莫耳濃度或莫耳量進行比較。在一些實施例中，可以使用與莫耳濃度或莫耳量呈線性比例的其他替代數值量測。此等替代量測之實例包括所結合抗體的螢光強度量測、所結合抗體之發光強度量測、所結合抗體之放射性量測，及/或所結合抗體之比色或發色量測。
在其他實施例中，所提及之系統可為分類系統。分類系統可以具有少至2個類別且多達3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、75、100個或超過100個類別。在一個實施例中，所提及之系統將粘附分子-4表現呈陽性的樣品歸為陽性類別(陽性)且將粘附分子-4表現呈陰性的樣品歸為陰性類別(陰性)。在此分類系統中，測定測試樣品中之粘附分子-4表現包括對測試樣品中之粘附分子-4表現與陽性參考樣品中之粘附分子-4表現及/或與陰性參考物進行比較，及若測試樣品表現粘附分子-4的水準類似於或高於陽性參考物，則將測試樣品置於陽性類別。在另一個實施例中，分類系統具有3個類別，例如陰性、中度及高度表現類別。在另一個實施例中，分類系統具有4個類別，例如陰性、低/弱、中等/中度，及高度/強表現類別。在一些態樣中，測定測試樣品中之粘附分子-4表現包括對測試樣品中之粘附分子-4表現與已知類別之粘附分子-4表現之一或多種參考水準進行比較及根據其相對於參考水準的表現將測試樣品歸類。
在一些實施例中，所提及之系統可為評分系統。評分系統可以類似於分類系統，但其中將類別置換為分數。舉例而言，陰性及陽性粘附分子-4表現之2類別系統可為0及1之評分系統，其中0意謂陰性且1意謂陽性。在另一個實施例中，3類別系統可為0、1及2之評分系統，其中0為陰性，1為低/弱表現，且2為中等/中度及高度/強表現。在另一個實施例中，4類別系統可為0、1、2及3之評分系統，其中0為陰性，1為低/弱，2為中等/中度，且3為高度/強表現。類似於分類系統，用評分系統測定測試樣品中之粘附分子-4表現包括對測試樣品中之粘附分子-4表現與具有已知分數之粘附分子-4表現之一或多種參考水準進行比較及根據其相對於參考水準的表現賦予測試樣品分數。然而，評分系統可為具有不連續及離散數字之分數(例如，0、2、4、6、8及10之系統，或1、4、6、11、13及19之系統)、具有小數之數字(例如，1、1.5、2、2.5、3、3.5等)、負數、始於任何數字的數字(例如1000、2000、3000等)，及可以用於追蹤生物樣品中之相對蛋白質表現的任何數集。
在一些實施例中，所提及之系統可為細胞百分比聯合分類或評分系統。細胞百分比與分類或評分系統之組合提供樣品之更細分級。在此組合系統中，分配來自生物樣品中的每個細胞且置於分類或評分系統中，且確定每個類別或分數的測試樣品中之大致細胞百分比。在一個實例中，可以將細胞百分比之量測與陽性及陰性粘附分子-4表現之2類別系統聯合，其中樣品不在總體上量測，而是分成對粘附分子-4表現呈陽性之細胞的百分比及對粘附分子-4表現呈陰性之細胞的百分比。舉例而言，在陽性及陰性粘附分子-4表現之2類別系統中，測試樣品若歸入2類別系統，但對粘附分子-4表現有10%細胞呈陽性且對粘附分子-4表現有90%細胞呈陰性，則對粘附分子-4表現可以呈陰性。在一個實施例中，所提及之系統包括細胞百分比聯合2類別或2分數系統。在一個實施例中，所提及之系統包括細胞百分比聯合3類別或3分數系統。在一個實施例中，所提及之系統包括細胞百分比聯合4類別或4分數系統。在一個實施例中，所提及之系統包括細胞百分比聯合5類別或5分數系統。在一個實施例中，所提及之系統包括細胞百分比聯合6類別或6分數系統。在一個實施例中，所提及之系統包括細胞百分比聯合7類別或7分數系統。在一個實施例中，所提及之系統包括細胞百分比聯合8類別或8分數系統。在一個實施例中，所提及之系統包括細胞百分比聯合9類別或9分數系統。在一個實施例中，所提及之系統包括細胞百分比聯合10類別或10分數系統。在一個實施例中，所提及之系統包括細胞百分比聯合任何分類或任何評分系統。在一個實施例中，所提及之系統包括細胞百分比聯合4分數系統，該分數系統包含0 (粘附分子-4呈陰性)、1 (低/弱粘附分子-4表現)、2 (中等/中度粘附分子-4表現)，及3 (高度/強粘附分子-4表現)。
在一些態樣中，所提及之系統可為粘附分子-4表現相對於至少一種參考蛋白質表現的比率。在一些實施例中，比率可為粘附分子-4表現之定量量測值與參考蛋白質之比率，其中定量量測值包括本文所述之彼等量測值，諸如所結合抗體之莫耳濃度、莫耳量、螢光強度量測值、所結合抗體之發光強度量測值、所結合抗體之放射性量測值，及/或所結合抗體之比色或發色量測值。在其他實施例中，根據本文所提供的任何評分系統，比率亦可為賦予粘附分子-4表現之分數與參考蛋白質之比率。參考蛋白質可為具有普通細胞功能之蛋白質，諸如肌動蛋白、GAPDH、GDI或由管家基因表現的任何蛋白質。舉例而言，若測試樣品中的粘附分子-4表現具有分數3且肌動蛋白表現具有分數1，則比率可以確定為3。
在其他態樣中，參考系統可以利用數學函數的結果，該數學函數係利用分類、分數、比率、百分比及定量量測值中之一或多者作為輸入。在一些實施例中，數學函數係使用此等運算符之混合、相加、相乘或組合將各種輸入組合，以產生關於樣品中之粘附分子-4表現及/或粘附分子-4表現量表之更細分級的資訊結果。在一個實施例中，數學函數係基於百分比與4分數系統之組合來計算H分數。舉例而言，藉由將具有各種粘附分子-4表現分數(0 = 陰性，1 = 低/弱，2 = 中度/中等，且3 = 高/強)之細胞百分比(0-100)的乘積加總來計算H分數。舉例而言：10%細胞評分為3、30%細胞評分為2、20%細胞評分為1且40%細胞評分為0的試樣具有(3 × 10) + (2 × 30)+ (1 × 20) + (0 × 40) = 110之H分數。
因此，如本文所提供，粘附分子-4表現量可以利用以下來確定：分類系統、評分系統、粘附分子-4表現相對於至少一種參考蛋白質表現之比率、細胞在該分類或評分系統中之百分比、粘附分子-4染色信號之定量量測值，或使用該分類、分數、比率、百分比及定量量測值中之一或多者作為輸入的數學函數結果。
大部分福馬林固定組織需要在免疫組織化學染色之前進行抗原修復步驟。在固定期間所形成的亞甲基橋與蛋白質發生交聯且遮蔽抗原之抗原決定基。抗原修復方法使此等亞甲基橋斷裂且暴露抗原決定基，從而允許抗體結合。在一些實施例中，藉由熱誘導抗原決定基修復(HIER)方法修復抗原。在其他實施例中，藉由酶修復(例如蛋白水解消化)方法修復抗原。對於HIER而言，可以在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃或130℃下加熱經福馬林固定、經石蠟包埋(FFPE)的組織切片。FFPE組織切片可以在此等溫度之任一者下加熱5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、150、180、240、300、360、420、480、540、600、660、720、780、840、900、960、1020、1080、1140、1200、1260、1320、1380及1440分鐘。在任一種前述溫度下執行任一種前述持續時間的HIER程序可以在pH為2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7、7.2、7.4、7.6、7.8、8、8.2、8.4、8.6、8.8、9、9.2、9.4、9.6、9.8、10、10.2、10.4、10.6、10.8、11、11.5或12的溶液中進行。在一些實施例中，HIER可以在選自由80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃組成之群之溫度下且在選自由8、8.2、8.4、8.6、8.8、9、9.2、9.4、9.6、9.8、10、10.2、10.4組成之群的pH下執行選自由5、10、15、20、25、30、35、40組成之群的持續時間。
因此，本文所提供之方法進一步包括藉由熱誘導抗原決定基修復(HIER)來修復粘附分子-4之抗原決定基的步驟。
免疫特異性結合至粘附分子-4抗原之未標記抗體、經標記抗體及其衍生物及類似物可用於診斷目的，以偵測、診斷或監測粘附分子-4介導的疾病。因此，本文提供用於偵測粘附分子-4介導疾病的方法，包含：(a)使用一或多種免疫特異性結合至粘附分子-4抗原之本文所提供抗體分析個體之細胞或組織樣品中之粘附分子-4抗原表現；及(b)將粘附分子-4抗原含量與參考水準進行比較，參考水準例如正常組織樣品(例如來自不患有粘附分子-4介導疾病之患者的組織樣品、來自疾病發作之前之同一患者的組織樣品、來自同一患者之組織樣品中的正常細胞，或來自同一患者之正常器官的正常組織樣品)中的含量，其中粘附分子-4抗原之分析含量相較於粘附分子-4抗原對照水準增加表示粘附分子-4介導的疾病。
本文亦提供一種用於診斷粘附分子-4介導疾病的診斷分析，包含：(a)使用一或多種免疫特異性結合至粘附分子-4抗原之本文所提供抗體分析個體之細胞或組織樣品中的粘附分子-4抗原含量；及(b)對粘附分子-4抗原含量與參考水準進行比較，參考水準例如正常組織樣品中的含量，其中粘附分子-4抗原分析含量相較於粘附分子-4抗原參考水準增加表示粘附分子-4介導的疾病。在某些實施例中，本文中提供一種治療個體之粘附分子-4介導疾病的方法，包含：(a)使用一或多種免疫特異性結合至粘附分子-4抗原之本文所提供抗體分析個體之細胞或組織樣品中的粘附分子-4抗原含量；及(b)對粘附分子-4抗原含量與參考水準進行比較，例如正常組織樣品中的含量，其中粘附分子-4抗原分析含量相較於粘附分子-4抗原參考水準增加表示粘附分子-4介導的疾病。在一些實施例中，該方法進一步包含(c)將有效量的本文所提供抗體投與經鑑別患有粘附分子-4介導疾病的個體。粘附分子-4介導疾病之較確定性診斷可以允許健康專業人士較早採用預防性措施或積極治療，藉此預防粘附分子-4介導疾病的發展或進一步進展。
使用如本文中所述或熟習此項技術者已知之方法，可以使用本文所提供之抗體分析生物樣品中的粘附分子-4抗原含量(參見例如Jalkanen等人，1985, J. Cell. Biol. 101:976-985；及Jalkanen等人，1987, J. Cell Biol. 105:3087-3096)。適用於偵測蛋白質基因表現之其他基於抗體的方法包括免疫分析，諸如ELISA及放射免疫分析(RIA)。適合之抗體分析標記為此項技術中已知的，且包括酶標記，諸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，諸如碘(125 I、121 I)、碳(14 C)、硫(35 S)、氚(3 H)、銦(121 In)及鎝(99 Tc)；發光標記，諸如魯米諾；及螢光標記，諸如螢光素及若丹明，及生物素。
本文所提供的一個態樣為偵測及診斷人類之粘附分子-4介導疾病。在一個實施例中，診斷包含：a)將免疫特異性結合至粘附分子-4抗原的有效量之經標記之抗體投與(例如非經腸、皮下或腹膜內)個體；b)投藥之後等待一段間隔時間，以允許經標記之抗體在個體中之表現粘附分子-4抗原的位點集中(且允許未結合之經標記分子清除至背景含量)；c)測定背景含量；及d)偵測個體中之經標記之抗體，因此偵測到經標記之抗體高於背景含量表示個體患有粘附分子-4介導的疾病。背景含量可以藉由各種方法測定，包括對經標記之分子的偵測量與預先針對特定系統確定的標準值進行比較。
此項技術中應瞭解，個體體型及所用成像系統將決定為了產生診斷影像而需要的成像部分之量。在放射性同位素部分之情況下，對於人類個體而言，所注射之放射能之量通常在約5至20毫居里之99 Tc範圍內。經標記之抗體接著在含有特定蛋白質之細胞位置積累。活體內腫瘤成像描述於S.W. Burchiel等人，「Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments.」 (第13章, 於Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel及B.A. Rhodes編，Masson Publishing Inc. (1982)。
視若干變數(包括所用標記類型及投藥模式)而定，投藥之後允許經標記之抗體在個體中之位點集中且允許未結合之經標記抗體清除至背景含量的時間間隔為6至48小時或6至24小時或6至12小時。在另一個實施例中，投藥後的時間間隔為5至20天或5至10天。
在一個實施例中，監測粘附分子-4介導的疾病係藉由重複執行診斷粘附分子-4介導疾病之方法來進行，例如初次診斷之後的一個月、初次診斷之後的六個月、初次診斷之後的一年等。
經標記之分子在個體中的存在可使用此項技術中已知之活體內掃描方法來偵測。此等方法視所用標記的類型而定。熟習此項技術者能夠決定用於偵測特定標記之適當方法。可用於本文所提供之診斷方法中的方法及裝置包括(但不限於)電腦斷層攝影(CT)、全身掃描(諸如正電子發射斷層攝影(PET))、磁共振成像(MRI)及超音波掃描(sonography)。
在一個特定實施例中，分子用放射性同位素標記且使用輻射反應性手術儀器在患者中偵測(Thurston等人，美國專利第5,441,050號)。在另一個實施例中，分子用螢光化合物標記且使用螢光反應性掃描儀器在患者中偵測。在另一個實施例中，分子經正電子發射金屬標記且使用正電子發射斷層攝影術在患者中偵測。在又另一個實施例中，分子用順磁標記進行標記且使用磁共振成像(MRI)在患者中偵測。30. 套組
本文亦提供套組，其包含封裝於適合封裝材料中之本文所提供抗體(例如抗粘附分子-4抗體)或其組合物(例如醫藥組合物)。套組視情況包括標籤或藥品說明書，包括各組分之說明或其中各組分之活體外、活體內或離體使用說明書。
術語「封裝材料」係指容納套組之各組分的物理結構。封裝材料可以維持組分無菌，且可以由常用於此類目的之材料(例如紙、波紋狀纖維、玻璃、塑膠、箔、安瓿、小瓶、管等)製成。
本文所提供的套組可以包括標籤或插頁。標籤或插頁包括「印刷物」，例如紙或紙板，其為單獨的或附著至組分、套組或封裝材料(例如盒)或附接至例如含有套組組分的安瓿、管或小瓶。標籤或插頁可另外包括電腦可讀取媒體，諸如磁碟(例如硬碟、卡、記憶體磁碟)；光碟，諸如CD-ROM/RAM或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁帶；或電儲存媒體，諸如RAM及ROM，或此等之混合，諸如磁/光學儲存媒體、FLASH媒體或記憶型卡。標籤或插頁可以包括標識製造商資訊、批號、製造地點及日期的資訊。
本文所提供的套組可以另外包括其他組分。套組之各組分可封閉於個別容器內，且所有各種容器可位於單一封裝內。套組亦可針對冷儲存而設計。套組可以進一步經設計以含有本文所提供之抗體，或含有編碼本文所提供抗體之核酸的細胞。套組中之細胞可以在適當儲存條件下維持直至即用。其他組分可以包括例如陽性或陰性參考樣品(例如來自已知患有粘附分子-4介導疾病之患者的組織樣品、來自不患有粘附分子-4介導疾病之患者的組織樣品、來自疾病發作之前之同一患者的組織樣品、來自患有粘附分子-4介導疾病之個體之組織樣品中的正常細胞，或來自同一患者之正常器官的正常組織樣品)、緩衝液、洗滌溶液、抗體偵測試劑，及/或信號放大試劑。
本文亦提供免疫特異性結合至粘附分子-4抗原的一組抗體。在特定實施例中，本文提供具有不同結合速率常數、不同解離速率常數、針對粘附分子-4抗原之不同親和力及/或針對粘附分子-4抗原之不同特異性的一組抗體。在某些實施例中，本文提供約10種、較佳約25、約50、約75、約100、約125、約150、約175、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約550、約600、約650、約700、約750、約800、約850、約900、約950或約1000種或超過1000種抗體之組。抗體組可以用於例如96孔或384孔盤中，諸如用於諸如ELISA之分析。
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解相同之含義。儘管類似或等效於本文所述者之方法及材料可用於本發明的實施或測試，但本文描述適合之方法及材料。
本文中引述的所有申請案、公開案、專利及其他參考文獻、基因庫引用及ATCC引用均以全文引用之方式併入。在有抵觸的情況下，將以說明書(包括定義)為準。
如本文所用，除非上下文另外明確指出，否則單數形式「一（a/an）」及「該(the)」包括複數個提及物。因此，舉例而言，提及「肽序列」包括複數個此類序列等。
如本文所用，通篇本文中的數值通常以範圍格式呈現。範圍格式的使用僅為了方便及簡潔起見且不應理解為對本發明之範疇的不靈活限制，除非上下文另外明確指出。因此，範圍的使用明確地包括所有可能子範圍、該範圍內的所有個別數值，及此類範圍內的所有數值或數值範圍(包括整數)，及範圍內的分數值或整數，除非上下文另外明確指出。不論範圍之廣度，此構造皆適用且適用於通篇此專利文獻中的所有上下文中。因此，舉例而言，提及範圍90-100%包括91-99%、92-98%、93-95%、91-98%、91-97%、91-96%、91-95%、91-94%、91-93%等。提及範圍90-100%亦包括91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%等，以及91.1%、91.2%、91.3%、91.4%、91.5%等，92.1%、92.2%、92.3%、92.4%、92.5%等，諸如此類。
另外，提及範圍1-3、3-5、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-225、225-250包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等。在另一實例中，提及範圍25-250、250-500、500-1,000、1,000-2,500、2,500-5,000、5,000-25,000、25,000-50,000包括此類值內的任何數值或範圍或涵蓋此類值的任何數值或範圍，例如25、26、27、28、29…250、251、252、253、254…500、501、502、503、504…等。
亦如本文所用，通篇本文中揭示一系列範圍。一系列範圍的使用包括上限與下限範圍的組合以提供另一範圍。不論範圍之廣度，此構造皆適用且適用於通篇此專利文獻中的所有上下文中。因此，舉例而言，提及一系列範圍(諸如5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-75、75-100、100-150)包括諸如5-20、5-30、5-40、5-50、5-75、5-100、5-150及10-30、10-40、10-50、10-75、10-100、10-150及20-40、20-50、20-75、20-100、20-150之範圍，諸如此類。
為了簡潔起見，本文中使用某些縮寫。一個實例為表示胺基酸殘基之單字母縮寫。胺基酸及其對應的三字母及單字母縮寫如下：
本文中藉由使用肯定的語言描述多個實施例來大體揭示本發明。本發明亦特別包括其中特定標的物被完全或部分排除的實施例，諸如物質或材料、方法步驟及條件、方案、程序、分析法或分析。因此，儘管本文中未依本發明不包括的內容來大體表述本發明，但本文揭示了未明確包括於本發明中的態樣。
已描述許多本發明實施例。然而，應瞭解各種潤飾可以在不背離本發明精神及範疇的情況下進行。因此，以下實例旨在舉例說明而非限制申請專利範圍所述的本發明範疇。 實例
此章節中的實例係為了說明，而非為了限制而提供。 實例1：抗原製備
產生人類粘附分子-4片段，例如包括人類粘附分子-4 (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列31-346的片段(SEQ ID NO: 2)，且作為抗原用於隨後的免疫接種活動。
使用市售的pET表現載體來產生6×HN標記的粘附分子4 (aa 31-346)。根據製造商說明書在BL21 (DE3)大腸桿菌中進行表現且使用基於IMAC之純化法(固著式金屬親和層析)純化。純化的粘附分子4 (aa31-346)用作免疫原。
使用經修飾的pTag5/mychis表現載體，根據製造商說明書，在293FT細胞中產生供抗體篩選用的重組粘附分子4 (aa (1-348)。蛋白質係使用基於標準IMAC之純化法純化。 實例2：產生抗體A . 抗體產生及製造
利用最初在Kohler及Milstein, Eur. J. Immunol. 6, 511 (1976)中所述的標準融合瘤技術，藉由細菌產生之人類粘附分子4蛋白質胞外域重組片段(31-346；SEQ ID NO: 2)使Balb/c小鼠免疫來產生單株抗體M22-321b41.1。融合瘤M22-321b41次選殖為M22-321b41.1，其可產生特異性結合至人類粘附分子-4蛋白質之重組胞外域(根據ELISA)的小鼠IgG2a κ抗體。另外，蛋白質A純化抗體M22-321b41.1經顯示，可特異性地將以IHC測試會表現粘附分子4之組織染色。
隨後使M22-321b41.1融合瘤細胞生長，擴增，且在液氮中活著冷凍以便長期儲存。 B.融合瘤測序
利用RT-PCR對M22-321b41.1融合瘤抗體重鏈及輕鏈基因測序。 實例3：抗體的篩選及選擇 A.篩選分析(或結合分析)
使用如上文所述產生的粘附分子-4胞外域片段(胺基酸殘基31-346)進行初始ELISA篩選。
使用大腸桿菌中所產生的粘附分子-4胞外域片段(胺基酸殘基31-346)、293FT細胞中所產生的粘附分子-4胞外域片段(胺基酸殘基1-346)、粘附分子-4-tag5及兩種對照蛋白質(一者使用pET產生且一者使用tag5產生)進行二次ELISA篩選。 B.抗體的選擇
若抗體展示重組3T3-粘附分子-4細胞染色且在對照中缺乏染色，則首先選擇該等抗體。隨後，在如根據qPCR分數所確定具有已知粘附分子-4 mRNA表現的一組陽性及陰性對照組織中測試首輪選擇的抗體。利用多種抗原修復方案測試多種濃度的抗體。若抗體在粘附分子-4-mRNA陽性組織中產生特異性染色，在粘附分子-4-mRNA陰性組織中缺乏染色，且就染色強度、染色細胞比率及非特異性背景染色而言優於所測試的對照抗粘附分子-4抗體，則選擇該等抗體。 實例4：篩選對粘附分子-4具有特異性的抗體
篩選如上文所述產生的抗體，以選出對粘附分子-4具有特異性的抗體。進行篩選，例如利用IHC分析進行篩選。簡言之，首先，利用qPCR測試來自多種來源的人類異種移植物癌症組織，例如膀胱、乳房、卵巢、胰臟、腎臟、皮膚、肺及結腸，以測定此等組織中的粘附分子-4表現量。
利用即時定量PCR (qPCR)分析測定相對的粘附分子-4 mRNA表現量。利用Bio-Rad CFX384 即時PCR偵測系統，使用SsoFast EvaGreen Supermix(Bio-Rad)及cDNA模板之5 ng RNA等效物來進行qPCR分析。利用使用下式的經修正△ Cq方法，相對於GAPDH管家基因之表現量來計算粘附分子-4 mRNA表現量：10,000*2-(Cq粘附分子-4-CqGAPDH)；粘附分子-4相對表現係相對於GAPDH單位來描述。
粘附分子-4之qPCR分析中所用的引子包括：191P4D12.1正向引子：5'-GGCTGGAGTTCAATGAGGTTTATTT-3' (SEQ ID NO: 41)；及191P4D12.2反向引子：5'-TCCAGCAGATTTCAGACTAAG AAGA-3' (SEQ ID NO: 42)。GAPDH之qPCR分析中所用的引子包括：GAPDH.1正向引子：5'-AGAACATCATCCCTGCCTCTACTG-3' (SEQ ID NO: 43)；及GAPDH.2反向引子：5'-AAATGAGCTTGACAAAG TGGTCGT-3' (SEQ ID NO: 44)。
qPCR用的cDNA模板係使用Bio-Rad iScript Advanced cDNA合成套組，由RNA合成，該RNA係利用TRIzol RNA萃取方法自組織或細胞株樣品中分離，隨後使用Qiagen RNeasy淨化套組進行RNA淨化及脫氧核糖核酸酶I消化。
例示性人類異種移植物組織展示於表5中。接著在IHC分析中使用上文所產生之抗粘附分子-4抗體，以使具有已知粘附分子-4表現量之組織染色。如下述實例5中詳細所述，類似地進行IHC分析。多種組織中之粘附分子-4的IHC染色與此等組織中的粘附分子-4 mRNA含量相關。當抗體產生的IHC染色信號與粘附分子-4 mRNA含量相關時(例如粘附分子-4 mRNA含量高的組織中出現強染色，粘附分子-4 mRNA含量中等的組織中出現中度IHC染色信號，粘附分子-4 mRNA低的組織中出現低IHC染色信號，且不表現粘附分子-4 mRNA的組織中無IHC染色信號)，選擇該抗體作為粘附分子-4特異性抗體。篩選出總共至少283種抗體純系，從而鑑別出粘附分子-4特異性抗體M22-321b41.1及M22-244b3.1.1.1。 實例5：功能分析：異種移植物組織的免疫組織化學染色
進一步評價所產生、篩選、表現及純化(例如如本文所述)的抗體在IHC分析中特異性地將表現粘附分子-4的人類異種移植物組織染色的能力。
舉例而言，在IHC分析中測試兩種抗粘附分子-4小鼠單株抗體M22-244b3.1.1.1及M22-321b41.1 分別為IgG1及IgG2a同型)。M22-244b3.1.1.1及M22-321b41.1抗體係在磷酸鹽緩衝生理鹽水pH 7.4中以1.54 mg/mL及1.3 mg/mL提供。作為陰性對照，使用針對β-2,6-聚果糖而產生之得自鼠類骨髓瘤的市售小鼠IgG2a同型對照物(純系：UPC10，Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)，該同型對照物不結合至人類粘附分子-4或其他哺乳動物抗原。
根據以下例示性方案進行IHC染色。簡言之，在IHC分析中利用間接IHC技術偵測粘附分子-4。使樣品在10%緩衝中性福馬林(formalin)中固定，加以處理且包埋於固體石蠟中，且作為4 μm組織切片製備。去石蠟及再水合之後，處理切片以便抗原修復。修復粘附分子-4中之抗原決定基，例如藉由向水性培養基中之組織切片施加熱量，通常稱為熱誘導抗原決定基修復(HIER)程序。舉例而言，藉由在Leica自動化平台上、在100℃下施加抗原決定基修復液2 (ER2，pH 8.9-9.1的基於EDTA之緩衝液) 20分鐘來修復粘附分子-4中之抗原決定基。抗原修復之後的組織切片接著與小鼠初級抗體M22-321b41.1、M22-244b3.1.1.1或IgG2a (抗體對照物)一起培育。洗滌結合有初級抗體的組織切片且用酶標記(例如過氧化酶標記)之二級抗體偵測。所結合的二級抗體例如使用Leica Bond Refine聚合物偵測系統顯色，該偵測系統可以利用過氧化酶與色素原3,3'-二胺基聯苯胺(DAB)之間的反應而在反應位點產生棕色沈澱物。接著使用光學顯微鏡(例如使用Aperio ScanScope CS (Aperio, Vista, CA))對所染色的組織切片進行掃描，成像及評價。
為了根據抗體染色程度來評估組織切片中的粘附分子-4表現量，根據IHC染色強度及癌細胞陽性比率，對所染色的組織切片進行評估、評價、分類且依不同類別或分數來記錄。類別包括強(「3」或與「3+」可互換)、中等(「2」或與「2+」可互換)，及弱(「1」或與「1+」可互換)。缺乏特異性染色記錄為陰性(「0」或與「-」可互換)。
測試具有已知粘附分子-4 mRNA表現量的人類異種移植物癌症組織，其來自多種來源，例如膀胱、乳房、卵巢、胰臟、腎臟、皮膚、肺及結腸。首先利用qPCR評估此等例示性人類異種移植物組織中的粘附分子-4 mRNA含量且展示於表5中。 表5. 抗體滴定實驗用的組織
為了找到適用於抗體的染色濃度，在如上文所述的IHC染色分析中，使用表5中所列的例示性異種移植物組織，首先以2.5 μg/mL、5.0 μg/mL及7.5 μg/mL滴定抗體M22-321b41.1及M22-244b3.1.1.1。結果展示於表6中。 表6. M22-321b41.1及M22-244b3.1.1.1滴定結果的概述
抗粘附分子-4抗體IHC染色用的最佳濃度係作為觀測到表現粘附分子-4 mRNA之組織出現抗粘附分子-4抗體IHC染色、但在粘附分子-4陰性組織中未觀測到抗粘附分子-4抗體IHC染色時的濃度確定。在2.5 μg/mL，M22-321b41.1與M22-244b3.1.1.1抗體均展示對粘附分子-4 mRNA呈陽性的人類異種移植物組織中出現陽性染色(圖1及圖2)且展示陰性對照組織中出現最小背景染色。表6及表7中的詳細染色結果表明2.5 μg/mL濃度為兩種抗體的例示性最佳濃度。 表7. 滴定M22-321b41.1及M22-244b3.1.1.1的詳細染色結果
2.5 μg/mL的M22-321b41.1抗體在粘附分子-4 mRNA陰性組織AG-K24及MDAMB-231-MFP-XCL中未引起染色(圖3及圖5)；而M22-244b3.1.1.1對粘附分子-4 mRNA陰性異種移植物癌細胞AG-K24 (圖4)及MDAMB-231-MFP-XCL (圖6)產生非特異性染色。與小鼠IgG2a陰性對照抗體一起培育的切片中未發現染色(圖7)。因此，M22-321b41.1特異性地將表現粘附分子-4 mRNA且未產生染色的組織染色，或對於不表現粘附分子-4 mRNA的組織而言，產生的染色如同同型IgG對照一樣低。
進一步測試M22-321b41.1在在如表8所示之一組擴大之陽性及陰性對照組織中的特異性。結果展示，2.5 μg/mL抗體對表現粘附分子-4 mRNA之組織及細胞具有特異性，包括AG-B1、AG-UT5、AG-L16 (圖8)、AG-Br29、AG-B11 (圖9)、AG-OV35、AG-Panc3、AG-C16、AG-C6、大鼠1 (E)-粘附分子-4及T47D。結果亦展示，抗體對不表現粘附分子-4 mRNA之組織及細胞呈陰性，包括AG-K24 (圖3)、AG-Mel10、MDA-MB-231-MFPXCL (圖5)、AG-Mel5、AG-K31、CALU-1、MDA-MB-231、UG-K3、大鼠1(E)-neo、大鼠1(E)-粘附分子-1、大鼠1(E)-粘附分子-2、大鼠1(E)-粘附分子-3、JMSU-1、Hep3B及ACHN。此等發現證明，M22-321b41.1在IHC分析中對粘附分子-4具有特異性，原因為對於在此測試的所有組織及細胞而言，M22-321b41.1使表現粘附分子-4 mRNA的組織及細胞呈陽性染色且使不表現的彼等組織及細胞呈陰性染色。(表8及表9)。 表8：粘附分子-4在一組擴大的FFPE樣品中之表現的概述(使用2.5 μg/mL M22-321b41.1) 表9. 得自該擴大組的M22-244b3.1.1.1染色結果
如上文所述產生及篩選的抗粘附分子-4抗體進一步與其他市售抗粘附分子-4抗體在IHC分析中比較。舉例而言，自Novus Biologicals (目錄號NBP1-82829)獲得粘附分子-4/PVRL4抗體(稱為「Novus PVRL4抗體」)，一種兔多株抗粘附分子-4抗體，且在IHC分析中測試其特異性地將多種異種移植物組織(其中粘附分子-4 mRNA含量已藉由qPCR測定)中之粘附分子-4染色的能力。在以2 μg/ml、1.5 μg/ml、1 μg/ml及0.5 μg/ml滴定Novus PVRL4抗體的實驗中，Novus PVRL4抗體產生的特異性粘附分子-4染色比M22-244b3.1.1.1.1抗體產生的染色弱且在所有濃度下，在不表現粘附分子-4 mRNA的MDA-MB-231異種移植物中均產生非特異性染色，如表10所示。因此，Novus PVRL4抗體對粘附分子-4無特異性。 表10：Novus PVRL4抗體在不同濃度下的染色結果
在IHC分析中，針對一組較寬的組織(其中粘附分子-4 mRNA含量已藉由qPCR測定)進一步測試Novus PVRL4抗體。不論粘附分子-4 mRNA含量，觀測到所測試的大部分異種移植物中出現背景細胞質染色，如表11所示。 表11：Novus PVRL4抗體在一組較寬之異種移植物組織中的染色結果
由於Novus PVRL4抗體為潛在具有批間可變性的可耗竭兔多株抗體，因此獲得不同的兔多株抗粘附分子-4抗體，得自ThermoFischer Scientific的PA5-30837 (稱為「Thermo PVRL4抗體」)，在IHC分析中、在三種不同異種移植物組織(其中粘附分子-4 mRNA含量已藉由qPCR測定)中測試且比較。所測試的三種異種移植物組織包括粘附分子-4 mRNA含量為478的AG-B1(+) PS26、粘附分子-4 mRNA含量為78的AG-OV35P3，及不表現粘附分子-4 mRNA的AG-Mel5 P17。Thermo PVRL4抗體在AG-B1中產生弱/中等IHC染色且在AG-OV35中產生陰性IHC染色。
因此，Novus PVRL4抗體與Thermo PVRL4抗體在IHC分析中如同本文中所產生及篩選的M22-244b3.1.1.1.1或M22-321b41.1.抗體，對粘附分子-4均無特異性。
亦獲得其他兩種市售抗體(小鼠抗粘附分子-4單株抗體MAB2659及山羊抗粘附分子-4多株抗體AF2659)(均得自R&D Systems)，且在IHC分析中、在三種不同異種移植物組織(其中粘附分子-4 mRNA含量藉由qPCR測定)中測試。所測試的三種異種移植物組織包括粘附分子-4 mRNA含量為478的AG-B1(+) PS26、粘附分子-4 mRNA含量為78的AG-OV35P3，及無粘附分子-4 mRNA的AG-Mel5 P17。MAB2659抗體當以1 μg/ml或5 μg/ml使用時，在AG-B1及AG-OV35之腫瘤周邊產生髒點狀/細胞質樣染色。山羊抗粘附分子-4多株抗體AF2659在5 μg/ml下、在AG-B1及AG-OV35中產生很強的膜染色及背景基質染色，但在1 μg/ml下產生弱染色。因此，進一步對2.5 μg/ml AF2659抗體在其他組織中進行評價。然而，AF2659抗體在不表現粘附分子-4 mRNA的MDA-MB-231異種移植物中產生背景染色。因此，MAB2659抗體與AF2659抗體如同本文中所產生及篩選的M22-321b41.1抗體均無特異性。 實例6：功能分析：主要組織的免疫組織化學染色
進一步評價抗體(例如抗粘附分子-4 M22-321b41.1，例如如本文實例中所述產生、篩選、表現及純化)在IHC分析中特異性地將表現粘附分子-4之主要人類組織染色的能力。
進行IHC分析，例如使用間接IHC技術進行IHC分析。間接IHC方法係利用兩種抗體偵測組織抗原。首先，將未結合的一級抗體施加至組織(第一層)中與組織抗原反應。接著，施加經酶標記之二級抗體，其針對其中已產生一級抗體之動物物種之IgG (第二層)。二級抗體與一級抗體反應，隨後施加受質-色素原。第二層抗體用過氧化酶標記，該過氧化酶與色素原3,3'-二胺基聯苯胺(DAB)反應而在反應位點產生棕色沈澱物。由於潛在的信號經由若干二級抗體與一級抗體上之不同抗原位點反應而放大，因此此方法靈敏且通用。
舉例而言，為了進一步增強測試靈敏度，使用經標記之鏈聚合物結合二級抗體。聚合物技術係利用經HRP酶標記之惰性聚葡萄糖「棘」分子，其連接至至多10個二級抗體分子，從而使該系統甚至更靈敏。
接著使試樣進行對比染色，以鑑別細胞及亞細胞元件。 6.A. 染色程序
IHC分析係根據以下例示性方案進行。簡言之，使組織樣品固定，處理且包埋於固體石蠟中，且製備成組織切片。接著將載片在烘箱中、在60±5℃下培育1-2小時，自烘箱中移出，且在處置之前冷卻至室溫(RT)。對組織樣品進行常規去石蠟及復水之後，進行抗原修復以逆轉福馬林固定之後發生的蛋白質交聯。抗原修復係經由組織在蛋白酶溶液中發生的蛋白水解消化來達成，或經由向水性培養基中之組織切片施加熱量來達成，通常稱為HIER程序。對於此分析而言，在Leica自動化平台上、在100℃下使用抗原決定基修復液2 (ER2，基於EDTA的緩衝液，pH 8.9-9.1) 20分鐘。
除非另有說明，否則染色經程式化以在室溫下，在使用Leica Bond自動染色器的Bond儀器上運作。簡言之，以下步驟在Leica Bond自動染色器上依如下染色方案程式化：(1)抗原決定基修復2程序(ER2)：在100℃下，20分鐘(Bond抗原決定基修復溶液2 (Leica)，部件#AR9640)；(2) 3×Bond洗滌：0分鐘(Bond洗滌溶液(Leica)，部件#AR9590)；(3)標記物：15分鐘(用小鼠抗粘附分子-4單株抗體M22-321b41.1或小鼠陰性對照IgG2a (BD Biosciences)染色，部件#550339，存在於Bond一級抗體稀釋劑(Leica)中，部件#AR9352)；(4) 3×Bond洗滌：0分鐘(Bond洗滌溶液(Leica)，部件#AR9590)；(5)初始後：8分鐘(兔抗小鼠IgG2a)；(6) 3×Bond洗滌：2分鐘(Bond洗滌溶液(Leica)，部件#AR9590)；(7)聚合物：8分鐘(抗兔聚-HRP-IgG，得自Bond聚合物改良偵測(Leica)，部件#DS9800)；(8) 2×Bond洗滌：0分鐘，2分鐘；(9) 1×去離子水：0分鐘；(10)過氧化物阻斷：5分鐘(3-4%過氧化氫)及3×Bond洗滌：0分鐘；(11) 2×去離子水：0分鐘；(12)混合DAB改良：0分鐘(66 mM 3,3-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽及≤0.1%過氧化氫，得自Bond聚合物改良偵測(Leica)，部件#DS9800)；(13)混合DAB改良：10分鐘(66 mM 3,3-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽及≤0.1%過氧化氫，得自Bond聚合物改良偵測(Leica)，部件#DS9800)；(14) 3×去離子水：0分鐘；(15)蘇木精：15分鐘(＜0.1%蘇木精，得自Bond聚合物改良偵測(Leica)，部件#DS9800)；(16) 1×去離子水：0分鐘；(17) 1×Bond洗滌：0分鐘；(18) 1×去離子水：0分鐘。如程序所指示，為了評估非特異性(背景)染色的存在，所測試的各試樣使用得自BD Biosciences的陰性試劑對照小鼠IgG2a。背景染色的存在亦為特定分析操作之合格/不合格標準。 6.B組織樣品
利用陽性及陰性對照試樣驗證及控制IHC分析的所有步驟。對於此分析而言，使用粘附分子-4表現量可變的小鼠人類腫瘤異種移植物作為對照。
經福馬林固定、經石蠟包埋的人類組織試樣係作為機構審查委員會批准來源之手術或屍檢殘留材料獲得，例如政府儲備庫(例如協同人類組織網(Cooperative Human Tissue Network))、學術合作(例如UCLA、UC Irvine)及市售來源，包括例如人類正常尿道上皮及移行細胞癌(BL802)及正常(FDA999)組織微陣列(TMA)、Biomax USA。使用實例6 . A .所述的方案測試組織樣品中的粘附分子-4表現。亦測試四種小鼠人類腫瘤異種移植物中的粘附分子-4表現，包括一者呈陰性(X14-126)、一者呈弱陽性(X14-33)、一者呈中等陽性(X14-139)及一者呈強陽性(X14-43)。 6.C 抗粘附分子-4抗體之染色濃度的滴定
藉由對異種移植物組織切片執行滴定分析(例如使用實例4及5所述的方案執行滴定分析)來測定最佳的一級抗體效價。對石蠟包埋的試樣進行滴定分析，以試圖確定最佳抗體濃度用於IHC分析。為了執行滴定分析，製備2倍連續稀釋液(括弧內為最佳濃度(2.5 μg/ml)，如實例5中所確定)且聯合匹配的其陰性對照組織切片加以測試。
根據適用於石蠟包埋試樣的IHC方案，將抗粘附分子-4抗體M22-321b41.1及其對應的陰性對照抗體施加至組織切片中，如實例4及5中所述。結果由研究病理學家使用光學顯微鏡評價且比較。研究病理學家確定最佳效價(最佳抗體濃度)作為最低效價(抗體的最低濃度)，其產生背景染色不顯著的最高染色強度。在此實例中，如表12所示，選擇2.5 μg/ml的抗體濃度且用於隨後IHC分析中。 表12：確定抗粘附分子-4 M22-321b41.1.的最佳抗體濃度 6.D. 粘附分子-4 IHC染色的評估
IHC染色之評估係由委員會認證的病理學家執行。評估染色強度且報導為0 (陰性)、1+ (弱)、2+ (中等)及3+ (強)。評估細胞染色在每種強度水準下的大致百分比或陽性染色細胞總數且以0至100%報導。
為了比較各組織間的染色，對粘附分子-4染色評估的各種參數加以直接比較或進一步處理粘附分子-4染色結果，例如以H分數計算，該H分數考慮染色強度與在特定強度範圍所染色的細胞百分比。舉例而言，藉由將在指定染色強度(0-100)下所染色之細胞的百分比與染色強度(0-3)之乘積加總來計算H-分數。舉例而言：10%細胞染色為3+、30%細胞染色為2+、20%細胞染色為1+及40%細胞未染色的試樣將具有H-分數：(3 × 10) + (2 × 30)+ (1 × 20) + (0 × 40) = 110。
使用變異係數(CV)評估H-分數的試驗內變化或精確度。分析效能的試驗內精確度係經由五次單獨試驗、利用三個陽性異種移植物試樣確定。三次單獨試驗中所測試之各組織的染色圖案大體一致時，試驗內精確度定性地視為可接受的。CV如下計算： CV = 標準差/平均值×100
舉例而言，CV小於或等於35%視為可接受的。
如表13所示，對於試驗內精確度評估而言，染色強度圖案(3+、2+、1+之組合)對於各組織在五次重複實驗期間為一致的。另外，所有組織的CV小於35%，此在可接受的例示性範圍內。因此，M22-321b41.1為在粘附分子-4 IHC分析中偵測粘附分子-4提供精確度。表 13 抗粘附分子 - 4 M22 - 321b41 . 1 在 IHC 分析中的試驗內精確度
分析效能在試驗間的再現性係經由五次單獨試驗、利用與精確度分析相同的異種移植物試樣確定。五次單獨試驗中所測試之各組織的染色圖案大體一致時，試驗內精確度定性地視為可接受的。如表14所示，對於試驗間的再現性而言，各組織的染色強度圖案(3+、2+、1+之組合)在三次重複實驗期間為一致的。另外，所有組織的CV小於35%，此在可接受的例示性範圍內。因此，M22-321b41.1為在粘附分子-4 IHC分析中偵測粘附分子-4提供再現性。 表14：抗粘附分子-4 M22-321b41.1在IHC分析中的試驗間再現性
6.A至6.D提供的參數及結果概述於下表15中： 表15：例示性參數、結果及其範圍. 6 . E 粘附分子 - 4 IHC 染色之靈敏度及特異性 .
粘附分子-4 IHC分析被視為靈敏的，例如若其使表現粘附分子-4抗原之組織呈陽性染色。粘附分子-4 IHC分析被視為特異性的，例如若觀測到不同組織類型間出現差異性染色且粘附分子-4 IHC染色與粘附分子-4抗原在染色組織中之已知表現相關。由於特異性及靈敏性的評估互不排斥，因此分析通常提供關於靈敏性及特異性之資訊。
使用M22-321b41.1之粘附分子-4 IHC分析的靈敏性及特異性係使用膀胱癌瘤之60個獨特核心及20個正常尿道上皮組織、4個小鼠人類腫瘤異種移植物及13個各種癌瘤(包括膀胱、肺及乳房)之人類完整組織切片(WTS)的TMA測定。在IHC分析中，M22-321b41.1抗體相對於粘附分子-4染色之靈敏性及特異性的概述列舉於下述表16及表17中。在此等及一些其他例示性分析中，組織樣品依據其H-分數結果分成四種類別之一：高(201-300)、中等(101-200)、低(1-100)、陰性(0)。 表16. 組織染色靈敏性概述 表 17 . 組織染色特異性概述
在用於評估M22-321b41.1之特異性及靈敏性的一些例示性分析中，比較13種WTS癌瘤的H-分數，該等癌瘤分別用已知具有粘附分子-4特異性之X抗體或抗粘附分子-4抗體M22-321b41.1 (2.5 μg/ml)染色。在絕大部分個案中，下述表18 (指示M22-321b41.1之IHC染色)中所示的比較與X抗體染色所示之已知粘附分子-4表現一致。 表18. M22-321b41.1 IHC染色與X抗體IHC染色之間的相關性
上述表18的結果再分為陽性及陰性粘附分子-4染色，以確定X抗體與抗粘附分子-4抗體M22-321b41.1之間的染色陽性相關性。若組織展示H-分數≥150，則該組織視為陽性。下述表19中的總體結果展示X抗體與抗粘附分子-4抗體M22-321b41.1之間的89%一致百分比(陽性染色組織)、100%之一致率(陰性染色組織)，及94%之總體一致率。因此，使用M22-321b41.1之粘附分子-4 IHC染色與組織中之粘附分子-4表現之間存在高度相關性。因此，使用M22-321b41.1的粘附分子-4 IHC分析具有靈敏性與特異性。 表19. 當臨限值為H-分數≥150時，粘附分子-4 X抗體相對於M22-321b41.1
使用更大的組織樣品群組進一步測定M22-321b41.1的特異性及靈敏性，包括60個膀胱癌瘤獨特核心及20個正常尿道上皮組織、4個小鼠人類腫瘤異種移植物及13個不同癌瘤(包括膀胱、肺及乳房)之人類完整組織切片(WTS)的TMA。總共有94個個案可評估，使用X抗體的IHC分析總體上偵測到95%個案(82% WTS及98% TMA)存在粘附分子-4。M22-321b41.1對癌瘤的代表性IHC染色展示於圖10及11中。亞細胞位置主要為膜及細胞質，其中一些頂端染色視為膜性。表20中的結果進一步證明使用M22-321b41.1之粘附分子-4 IHC分析的靈敏性及特異性，原因為使用M22-321b41.1之腫瘤試樣中的陽性染色百分比與癌瘤中之已知粘附分子-4表現(如使用X抗體的IHC分析所提供)一致。因此，使用M22-321b41.1的粘附分子-4 IHC分析具有靈敏性與特異性。 表20. 抗粘附分子-4抗體M22-321b41.1在不同組織之IHC染色中的靈敏性。 表20-部分I. 表20-部分II.
利用三重複包含於FDA999d中之所有33個正常人類試樣進一步測定M22-321b41.1的特異性及靈敏性。如表21中所示，抗粘附分子-4抗體M22-321b41.1的IHC染色與文獻(Rabet等人，2016)中所報導的正常細胞中之粘附分子-4表現一致，但其中正常乳房展示部分的及弱至中等的免疫反應性。粘附分子-4以中等至強的強度將紅血球染色。鱗狀上皮細胞染色較強，而基底層呈陰性。 表21. 抗粘附分子-4抗體M22-321b41.1在不同組織之IHC染色中的特異性
因此，針對粘附分子-4表現的基於M22-321b41.1之IHC分析對於粘附分子-4表現而言具有靈敏性及特異性。使用M22-321b41.1的IHC分析展示優良的精確度及再現性。 實例7：功能分析：免疫墨點法
進一步利用免疫墨點法(例如西方墨點法)評價mAb M22-321b41.1的功能特性及特異性。簡言之，對由多個粘附分子-4 mRNA陽性及粘附分子-4 mRNA陰性樣品製備的蛋白質溶解物進行SDS-PAGE，轉印至硝化纖維素膜上且用M22-321b41.1探測。抗人類GAPDH抗體用作內參考物，以證實適量且等量的全部細胞溶解物在SDS-PAGE的各凝膠泳道中解析。如圖12A中所示，在粘附分子-4-mRNA陽性NCI H322M、AG-B1及經工程改造以過度表現粘附分子-4之大鼠1(E)細胞的溶解物中，M22-321b1.1識別且將約58-60 kDa之特定色帶漬墨，此與預測的人類粘附分子-4分子量一致。在AG-B1異種移植物樣品以及NCIH322M細胞株中觀測到尺寸更小的粘附分子-4裂解產物，此與所報導的粘附分子-4排出一致(Buchanan等人，2017)。在粘附分子-4 mRNA陰性MDA-MB-231及大鼠1(E)-Neo細胞中未偵測到色帶。M22-321b41.1在西方墨點法中亦未偵測到工程化大鼠1(E)細胞所過度表現的粘附分子-1、粘附分子-2及粘附分子-3中之任一者，儘管粘附分子家族所有成員(粘附分子1-4)高度表現於工程化大鼠1(E)細胞中，如圖12B中的FACS所示。因此，M22-321b41.1在免疫墨點分析中特異性偵測到粘附分子-4。 實例8：抗原決定基定位
為了進一步對M22-321b41.1抗體所識別之粘附分子-4上之抗原決定基進行定位，選殖粘附分子-4之多個片段，轉染至細胞中，且在細胞中表現。在RIPA緩衝液中培養且溶解表現多個粘附分子-4片段的細胞。RIPA溶解物中之總蛋白濃度係使用BSA標準定量且總計20 μg經濃縮(50 mM TCEP)之溶解物在1x MES操作緩衝液中、在4-12% BT 15泳道凝膠上進行SDS-PAGE，經由I-Blot轉印至硝化纖維素膜上，用LI-COR阻斷緩衝液阻斷，用存在於1:1 LI-COR阻斷緩衝液中的2 μg/ml M22-321b41.1抗體探測。使用偵測GAPDH之α-GAPDH抗體(雞pAb，Millipore)之1:10000稀釋液作為內參考物。接著使用與IRDye 680 (Odyssey)結合之山羊抗小鼠抗體的1:5000稀釋液或與IRDye 800 (Odyssey)結合之1:5000驢抗α-雞抗體偵測與蛋白質色帶結合的抗體。M22-321b41.1抗體識別粘附分子-4片段V (胺基酸殘基1-150)(圖13)。因此，M22-321b41.1抗體識別位於人類粘附分子-4之胺基酸殘基1-150中之抗原決定基(SEQ ID NO: 45)。另外，由於M22-321b41.1抗體係針對人類粘附分子-4之胺基酸殘基31-346之粘附分子-4片段(SEQ ID NO: 2)產生，如實例1、2及3所示，因此M22-321b41.1抗體可以識別位於人類粘附分子-4之胺基酸殘基31-150中之抗原決定基(SEQ ID NO: 46)(片段1-150與片段31-346之重疊區域)。 實例9：粘附分子-4 IHC分析的診斷及預後用途
首先，使用利用M22-321b41.1抗體的IHC染色來檢查正常組織樣品中的粘附分子-4表現。在皮膚(表皮、汗腺及毛囊)、膀胱之移行上皮、唾液腺(管)、食道、乳房及胃中偵測到可變、但大部分較弱或中度的粘附分子-4表現。為了確立粘附分子-4表現與多種癌症的相關性，接著使用利用M22-321b41.1抗體的IHC染色來檢查多個腫瘤試樣中的粘附分子-4表現。粘附分子-4高度表現於膀胱癌中且較中度地表現於乳房、胰臟、肺及卵巢癌組織微陣列(TMA)中。使用相同IHC分析檢查粘附分子-4表現與膀胱癌之間的相關性揭露，TMA上的83% (524個有434個)膀胱癌呈陽性且60%藉由M22-321b41.1 IHC染色進行強染色或中度染色。
接著評價患者組織中之粘附分子-4表現(如藉由M22-321b41.1 IHC染色所測定)預測患者是否對抗癌療法(例如使用與細胞毒性劑或細胞生長抑制劑結合之抗粘附分子-4的抗癌療法)有反應的有效性，例如藉由測試滿足以下準則之患者對癌症療法的反應：(1)在組織學上已證實具有抗性或已復發的轉移惡性實體腫瘤(不包括肉瘤)；(2)患有對粘附分子-4表現呈陽性的腫瘤且粘附分子-4 IHC H-分數等於或超過150；(3)至少一種先前化學治療方案對轉移疾病已失效(若尿道上皮癌及膀胱癌個體視為不適於基於順鉑之化學療法，則無需該等個體對先前化學治療方案已失效)(Galsky等人，Journal of Clinical Oncology, 第29卷, 第17期, 2432-2438 (2011))；(4)已記錄疾病進展(若最新的全身療法為研究性免疫療法藥物)；(5)東部腫瘤協作組(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)效能狀態為0或1；(7)根據RECIST(1.1版)，患有可量測的疾病(Eisenhauer等人，European Journal of Cancer; 45(2): 228-247 (2009))。使用利用M22-321b41.1抗體的IHC分析，檢查總計184個臨床試驗試樣中的粘附分子-4表現；在所檢查的184個試樣中，180個(98%)臨床試驗試樣的H-分數超過0；且171個(93%)具有中度至高度的粘附分子-4表現(H-分數≥150)。總共44個臨床個體與納入準則匹配。此等44個患者中之腫瘤及/或轉移位點列舉於表22中。 表22. 原發腫瘤及轉移位點
將包含與微管中斷劑單甲基阿瑞他汀-E (monomethylauristatin-E)結合之完全人類抗粘附分子-4抗體(IgG1κ)的抗癌治療劑投與具有中度至高度粘附分子-4表現(H-分數≥150)的此等44個患者。所有個體接受單次30分鐘靜脈內輸注抗粘附分子-4 ADC，每週一次，歷時3週，每4週一循環(例如第1天、第8天及第15天)，直至疾病進展、不耐受治療、研究者決定或同意退出。投藥劑量包括0.5 mg/kg、0.75 mg/kg、1 mg/kg及1.25 mg/kg。研究者根據RECIST 1.1版評估患者的疾病反應，每8週(±7天)一次(RECIST，如Eisenhauer等人，European Journal of Cancer; 45(2): 228-247 (2009)中所述)。總共36位個體產生可以評價的結果。
抗粘附分子-4 ADC在皆患有表現粘附分子-4之腫瘤的經治療患者中產生抗腫瘤活性。36個患者中有十位具有部分反應，27.8%反應率(部分反應或完全反應視為反應)。抗粘附分子-4 ADC亦在肝臟轉移之10位個體中之4位(40%反應率)中及在預先經檢查點抑制劑治療之12位患者中之3位(25%反應率)中產生抗腫瘤活性。
因此，抗粘附分子-4 ADC在患有表現粘附分子-4之腫瘤的患者中產生抗腫瘤活性。 實例10：粘附分子-4 IHC分析的診斷及預後用途 - 不同群組
接著評價患者組織中之粘附分子-4表現(如藉由M22-321b41.1 IHC染色所測定)預測患者是否對抗癌療法(例如使用與細胞毒性劑或細胞生長抑制劑結合之抗粘附分子-4的抗癌療法)有反應的有效性，例如藉由測試滿足以下準則之不同患者群組對癌症療法的反應：(1)在組織學上已證實轉移惡性實體腫瘤，包括尿道上皮癌；(2)患有對粘附分子-4表現呈陽性的腫瘤且粘附分子-4 IHC H-分數等於或超過150；(3)至少一種先前化學療法對不適於基於順鉑之化學療法的轉移疾病及/或尿道上皮癌個體已失效(Galsky等人，Journal of Clinical Oncology, 第29卷, 第17期, 2432-2438 (2011))；(4)對於研究之前立即經免疫檢查點抑制劑(CPI)治療之個體而言已記錄疾病進展；(5)東部腫瘤協作組(ECOG)效能狀態為0或1；(7)根據RECIST(1.1版)，患有可量測的疾病(Eisenhauer等人，European Journal of Cancer; 45(2): 228-247 (2009))。使用利用M22-321b41.1抗體的IHC分析，檢查總計295個臨床試驗試樣中的粘附分子-4表現；在所檢查的295個試樣中，278個(94%)臨床試驗試樣的H-分數等於或大於1；且245個(83%)具有中度至高度的粘附分子-4表現(H-分數≥150)。總共58個臨床個體與納入準則匹配。此等58個患者中之腫瘤及/或轉移位點列舉於表23中。 表23. 原發腫瘤及轉移位點
將包含與微管中斷劑單甲基阿瑞他汀-E結合之完全人類抗粘附分子-4抗體(IgG1κ)的抗癌治療劑投與具有中度至高度粘附分子-4表現(H-分數≥150)的此等58個患者。所有個體接受單次30分鐘靜脈內輸注抗粘附分子-4 ADC，每週一次，歷時3週，每4週一循環(例如第1天、第8天及第15天)，直至疾病進展、不耐受治療、研究者決定或同意退出。投藥劑量包括0.5 mg/kg、0.75 mg/kg、1 mg/kg及1.25 mg/kg。研究者根據RECIST 1.1版評估患者的疾病反應，每8週(±7天)一次(RECIST，如Eisenhauer等人，European Journal of Cancer; 45(2): 228-247 (2009)中所述)。總共49位個體產生可以評價的結果。
抗粘附分子-4 ADC在皆患有表現粘附分子-4之腫瘤的經治療患者中產生抗腫瘤活性。一位患者具有完全反應且17位患者具有部分反應，得到總計36.7%反應率(部分反應與完全反應視為反應)。在1.25 mg/kg群組中，抗粘附分子-4 ADC在所治療之17位患者中之10位中產生反應，反應率為58.8%。抗粘附分子-4 ADC亦在肝臟轉移之12位個體之5位(41.7%反應率)中、在預先經檢查點抑制劑治療之16位患者中之6位(37.5%反應率)中及在預先經紫杉烷治療之20位患者中之8位(40%反應率)中產生抗腫瘤活性。
因此，抗粘附分子-4 ADC在患有表現粘附分子-4之腫瘤的患者中產生抗腫瘤活性。 實例11：抗粘附分子-4 ADC之治療用途.
評價本文所提供之抗粘附分子-4 ADC治療患有各種癌症之患者的功效，例如藉由比較經包含人類或人類化M22-321b41.1抗體之抗粘附分子-4 ADC治療之患者與經抗體同型作為安慰劑治療之對照患者的結果。簡言之，將患者隨機分組且分配至對照組或治療組。治療組患者注射一定劑量範圍的抗粘附分子-4 ADC，該劑量範圍根據在動物模型及實例9及10之彼等動物模型中最佳化的mg (抗體)/kg(體重)劑量範圍確定。注射在一段時間期間進行一次或多次。分析經治療患者的結果且定期在治療組與安慰劑組之間進行比較。
相較於安慰劑治療的患者，經抗粘附分子-4 ADC治療之患者的結果改善。相較於安慰劑療法，抗粘附分子-4 ADC療法使得在6個月、1年、2年、3年或5年的存活率提高，延長存活持續時間，降低癌症標記物含量，減小平均值或中值腫瘤尺寸，且/或減慢癌症進展。實例 12 ： 粘附分子 - 4 IHC 分析的其他診斷及預後用途
評價患者組織中之粘附分子-4表現(如藉由M22-321b41.1 IHC染色所測定)預測患者是否對抗癌療法(例如使用與細胞毒性劑或細胞生長抑制劑結合之抗粘附分子-4的抗癌療法)有反應的有效性，例如藉由使患者對癌症療法的反應與患者癌症組織中之粘附分子-4表現(根據使用粘附分子-4特異性抗體的IHC染色所測定)相關聯。簡言之，所有患者用相同的癌症治療方案治療且在使用M22-321b41.1抗體的IHC分析中測定患有癌症之患者組織中的粘附分子-4表現量，如本文所述。患者根據其癌症組織中的粘附分子-4表現而分成兩組、三組、四組或超過四組。舉例而言，在分成四組的情況下，患者分成其癌症組織中具有高度粘附分子-4表現的第一組、具有中度表現的第二組、表現低的第三組及無表現的第四組。概述對癌症治療方案的反應，如根據患者結果所反映，諸如患者身體質量、患者中的腫瘤尺寸、6個月、1年、2年、3年或5年患者存活率，或所分級的各組中之患者存活持續時間，且與各組患者中的粘附分子-4表現相關聯。使用各組的平均值或中值來確立相關性或確立各組中之個別患者的相關性。
患者癌症組織中的粘附分子-4表現表示患者對癌症治療方案的反應程度，例如使用與細胞毒性劑或細胞生長抑制劑結合之抗粘附分子-4 (稱為抗粘附分子-4 ADC)的癌症療法。其癌症組織中具有較高粘附分子-4表現的患者對癌症治療方案反應較佳，在6個月、1年、2年、3年或5年具有較高存活率，且/或活的比其癌症組織中具有較低粘附分子-4表現的患者更長。患者癌症組織中的粘附分子-4表現愈高，則癌症療法(例如抗粘附分子-4 ADC療法)對該患者愈有效。
圖 1 描繪實驗結果，其展示在粘附分子-4 mRNA陽性AG-B1異種移植物之IHC染色分析中，在2.5 μg/mL M22-321b41.1的情況下，所有癌細胞呈陽性染色。
圖 2 描繪實驗結果，其展示在粘附分子-4 mRNA陽性AG-B1異種移植物之IHC染色分析中，在2.5 μg/mL M22-244b3.1.1.1的情況下，所有癌細胞呈陽性染色。
圖 3 描繪實驗結果，其展示在粘附分子-4 mRNA陰性AG-K24異種移植物之IHC染色分析中，在2.5 μg/mL M22-321b41.1的情況下，所有細胞均未染色。
圖 4 描繪實驗結果，其展示在粘附分子-4 mRNA陰性AG-K24異種移植物之IHC染色分析中，在2.5 μg/mL M22-244b3.1.1.1的情況下，許多細胞呈陽性染色。
圖 5 描繪實驗結果，其展示在粘附分子-4 mRNA陰性MDA-MB-231-MFP-XCL異種移植物之IHC染色分析中，在2.5 μg/mL M22-321b41.1的情況下，所有細胞均未染色。
圖 6 描繪實驗結果，其展示在粘附分子-4 mRNA陰性MDA-MB-231-MFP-XCL異種移植物之IHC染色分析中，在2.5 μg/mL M22-244b3.1.1.1的情況下，許多細胞呈陽性染色。
圖 7 描繪實驗結果，其展示在粘附分子-4 mRNA陽性AG-B1異種移植物之IHC染色分析中，在2.5 μg/mL陰性對照IgG2a抗體的情況下，所有細胞均未染色。
圖 8 描繪實驗結果，其展示在粘附分子-4 mRNA陽性AG-L16異種移植物之IHC染色分析中，在2.5 μg/mL M22-321b41.1的情況下，所有癌細胞呈陽性染色。
圖 9 描繪實驗結果，其展示在粘附分子-4 mRNA陽性AG-B11異種移植物之IHC染色分析中，在2.5 μg/mL M22-321b41.1的情況下，大部分癌細胞呈陽性染色。
圖 10 描繪實驗結果，其展示粘附分子-4在尿道上皮癌之IHC染色分析中、在M22-321b41.1的情況下呈強染色。
圖 11 描繪實驗結果，其展示在乳癌之IHC染色分析中、在M22-321b41.1的情況下，粘附分子-4染色不均一。
圖 12A 描繪西方墨點法實驗結果，其展示僅在表現粘附分子-4之彼等細胞及異種移植物中特異性偵測到粘附分子-4色帶。
圖 12B 描繪對照FACS實驗結果，其展示：圖12A中經M22-321b41.1陽性漬墨的大鼠1(E)-粘附分子-4細胞高量表現粘附分子-4；且圖12A中經M22-321b41.1陰性漬墨的其他大鼠1(E)細胞高量表現粘附分子-1、粘附分子-2及粘附分子-3，表明M22-321b41.1對粘附分子-4具有特異性。
圖 13 描繪西方墨點法實驗結果，其展示：M22-321b41.1抗體識別含有粘附分子-4之V片段/域(胺基酸殘基1-150)的蛋白質色帶。上圖中，在西方墨點分析中，測試針對細胞溶胞物的M22-321b41.1抗體，該等溶胞物表現野生型全長(wt) V片段/域(V)、V及C1片段/域(V/C1)、C1及C2片段/域、C2片段/域，及陰性對照(新)。下圖中，GAPDH墨點用作內參照。

Claims (96)

  1. 一種抗體或其抗原結合片段，其 (a)可結合至會被包含以下之抗體識別之人類粘附分子-4的抗原決定基：具有胺基酸序列SEQ ID NO: 3的輕鏈可變區(VL)及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 4的重鏈可變區(VH)；或 (b)會與包含以下之抗體競爭結合至人類粘附分子-4：具有胺基酸序列SEQ ID NO: 3之VL及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 4之VH。
  2. 如請求項1之結合至粘附分子-4之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含： (a)輕鏈可變區(VL)，其包含如表1中所述之VL互補決定區1 (CDR1)、VL CDR2及VL CDR3；及/或 (b)重鏈可變區(VH)，其包含如表1中所述之VH互補決定區1 (CDR1)、VH CDR2及VH CDR3。
  3. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含： (a)輕鏈可變區(VL)，其進一步包含如表2中所述之VL構架1 (FR1)、VL FR2、VL FR3及VL FR4；及/或 (b)重鏈可變區(VH)，其進一步包含如表2中所述之VH構架1 (FR1)、VH FR2、VH FR3及VH FR4。
  4. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含： ( a )輕鏈可變區(VL)，其包含： (1)具有選自由SEQ ID NO: 7及8組成之群之胺基酸序列的VL CDR1； (2)具有選自由SEQ ID NO: 9、10及11組成之群之胺基酸序列的VL CDR2；及 (3)具有選自由SEQ ID NO: 12及13組成之群之胺基酸序列的VL CDR3； 及 (b)重鏈可變區(VH)，其包含： (1)具有選自由SEQ ID NO: 14、15、16及17組成之群之胺基酸序列的VH CDR1； (2)具有選自由SEQ ID NO: 18、19、20及21組成之群之胺基酸序列的VH CDR2；及 (3)具有選自由SEQ ID NO: 22、23及24組成之群之胺基酸序列的VH CDR3。
  5. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 7、10及12，且該VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 15、19及23，其中該VL及VH CDR序列係根據Kabat CDR定義來判定。
  6. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 3的VL。
  7. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 4之VH。
  8. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含： (a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 3之VL；及 (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 4之VH。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含小鼠IgG2 Fc、人類IgG1 Fc區，或其突變體。
  10. 如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 35的重鏈Fc區。
  11. 如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段進一步包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 33的輕鏈恆定區。
  12. 如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含： (a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 33的輕鏈恆定區；及 (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 35的重鏈Fc區。
  13. 如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 5的輕鏈。
  14. 如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 6之重鏈。
  15. 如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含： (a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 5的輕鏈；及 (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 6的重鏈。
  16. 如請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中當結合至粘附分子-4時，該抗體或抗原結合片段結合至胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基31-346中的至少一者、胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基1-150中的至少一者，或胺基酸序列SEQ ID NO: 1內之殘基31-150中的至少一者。
  17. 如請求項1至16中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合至表現粘附分子-4之細胞。
  18. 如請求項17之抗體或其抗原結合片段，其中結合陰性對照物之該抗體或其抗原結合片段的相對量為結合至陽性對照物之該抗體或其抗原結合片段之量的約10%、5%、1%、0.5%或低於0.5%。
  19. 如請求項18之抗體或其抗原結合片段，其中該陰性或陽性對照物中的粘附分子-4表現係獨立地藉由以下判定：qPCR分析、使用第二抗體的免疫組織化學分析、使用第二抗體的免疫墨點分析、使用第二抗體的螢光活化細胞分選(FACS)分析或使用第二抗體的酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
  20. 如請求項18之抗體或其抗原結合片段，其中結合至該等細胞之該抗體或其抗原結合片段的量係藉由以下判定：免疫組織化學分析、免疫墨點分析、螢光活化細胞分選(FACS)分析或酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
  21. 如請求項17至20中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該細胞包含來自組織的癌細胞。
  22. 如請求項21之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合至該癌細胞的水準高於結合至參考細胞。
  23. 如請求項22之抗體或其抗原結合片段，其中該參考細胞包含來自該相同組織的非癌細胞。
  24. 如請求項17至23中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該組織包含來自以下之組織：膀胱、輸尿管、乳房、肺、結腸、直腸、卵巢、輸卵管、食道、子宮頸、子宮內膜、皮膚、喉、骨髓、唾液腺、腎臟、前列腺、腦、脊髓、胎盤、腎上腺、胰臟、副甲狀腺、腦垂體、睪丸、甲狀腺、脾、扁桃體、胸腺、心臟、胃、小腸、肝臟、骨骼肌、周邊神經、間皮或眼。
  25. 如請求項17至24中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段之結合特異性係在免疫組織化學分析中判定。
  26. 如請求項1至25中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段不會特異性結合至粘附分子-4陰性對照物。
  27. 如請求項1至26中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為單株抗體。
  28. 如請求項1至27中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人類化、人類或嵌合抗體。
  29. 如請求項28之抗體或其抗原結合片段，其中該人類化抗體為去免疫型抗體或複合人類抗體。
  30. 如請求項1至29中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv、scFv、dsFv、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體，或由抗體片段形成的多特異性抗體。
  31. 如請求項1至30中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中位於第一殘基處的麩醯胺酸經焦麩胺酸取代。
  32. 一種聚核苷酸，其包含編碼如請求項1至31中任一項之抗體或其抗原結合片段的VH、VL，或VH與VL兩者之核甘酸序列。
  33. 一種聚核苷酸，其包含編碼如請求項1至31中任一項之抗體或其抗原結合片段的重鏈、輕鏈，或重鏈與輕鏈兩者之核苷酸序列。
  34. 如請求項32或33之聚核苷酸，其中該聚核苷酸可操作地連接至啟動子。
  35. 一種載體，其包含如請求項32或33之聚核苷酸。
  36. 一種細胞，其包含如請求項32至34中任一項之聚核苷酸。
  37. 一種細胞，其包含如請求項35之載體。
  38. 一種經分離之細胞，其產生如請求項1至31中任一項之抗體或抗原結合片段。
  39. 一種製備特異性結合至人類粘附分子-4之抗原決定基之抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含培養如請求項36至38中任一項之細胞以表現該抗體或其抗原結合片段。
  40. 一種製備特異性結合至人類粘附分子-4之抗原決定基之抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含表現如請求項32至34中任一項之聚核苷酸。
  41. 一種套組，其包含如請求項1至31中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  42. 一種用於預測癌症患者對抗癌治療劑之反應的套組，該套組包含如請求項1至31中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中若來自該患者之癌細胞對粘附分子-4表現呈陽性，則預測該癌症患者對該抗癌治療劑有反應。
  43. 一種用於預測癌症患者對抗癌治療劑之反應的套組，該套組包含用於測定來自該癌症患者之組織樣品中粘附分子-4表現之如請求項1至31中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中若該組織樣品中之粘附分子-4表現量高於粘附分子-4之參考表現量，則預測該癌症患者對該抗癌治療劑有反應。
  44. 如請求項41至43中任一項之套組，進一步包含信號放大系統。
  45. 如請求項41至44中任一項之套組，進一步包含參考樣品集。
  46. 如請求項41至45中任一項之套組，進一步包含對照抗體。
  47. 一種用於評估來自疑似患有癌症個體之組織樣品中粘附分子-4表現的方法，包含： (a)使該組織樣品與如請求項1至31中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸； (b)偵測該抗體或其抗原結合片段對該組織樣品的結合； (c)判定該組織樣品中粘附分子-4表現，其中該組織樣品中粘附分子-4表現量係與粘附分子-4之參考表現量進行比較。
  48. 如請求項47之方法，其中該癌症為選自由以下組成之群之癌症：子宮內膜癌、尿道上皮癌、膀胱癌、輸尿管癌、尿道癌、肺癌、卵巢癌、乳癌、食道癌、胰臟癌、頭頸癌、前列腺癌、陰莖癌、肛門癌、外陰癌、臍尿管癌，及上皮來源之表現粘附分子-4的其他癌症。
  49. 如請求項47或48之方法，其中粘附分子-4之該參考表現量為該個體之非癌細胞中的粘附分子-4表現量或來自第二個體之非癌細胞中的粘附分子-4表現量。
  50. 如請求項47至49中任一項之方法，其中粘附分子-4之該參考表現量為陰性對照物中之粘附分子-4表現量，其中該陰性對照物中之粘附分子-4表現係獨立地藉由以下判定：qPCR分析、使用第二抗體的免疫組織化學分析、使用第二抗體的免疫墨點分析、使用第二抗體的螢光活化細胞分選(FACS)分析或使用第二抗體的酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
  51. 如請求項50之方法，其中結合至該陰性對照物之該抗體或其抗原結合片段的相對量為結合至表現粘附分子-4之樣品細胞之該抗體或其抗原結合片段之量的約10%、5%、1%或低於1%。
  52. 如請求項47至49中任一項之方法，其中粘附分子-4之該參考表現量為陽性對照物中之粘附分子-4表現量，其中該陽性對照物中之粘附分子-4表現係獨立地藉由以下判定：qPCR分析、使用第二抗體的免疫組織化學分析、使用第二抗體的免疫墨點分析、使用第二抗體的螢光活化細胞分選(FACS)分析或使用第二抗體的酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
  53. 如請求項47至52中任一項之方法，其中該組織包含來自以下之組織：膀胱、輸尿管、乳房、肺、結腸、直腸、卵巢、輸卵管、食道、子宮頸、子宮內膜、皮膚、喉、骨髓、唾液腺、腎臟、前列腺、腦、脊髓、胎盤、腎上腺、胰臟、副甲狀腺、腦垂體、睪丸、甲狀腺、脾、扁桃體、胸腺、心臟、胃、小腸、肝臟、骨骼肌、周邊神經、間皮或眼。
  54. 如請求項47至53中任一項之方法，其中粘附分子-4之表現量係使用以下偵測：免疫組織化學(IHC)方法、免疫墨點分析、螢光活化細胞分選(FACS)分析或酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
  55. 如請求項54之方法，其中粘附分子-4之表現量係使用信號放大系統來偵測。
  56. 如請求項47至55中任一項之方法，其中粘附分子-4之表現量係使用以下判定：分類系統、評分系統、粘附分子-4表現相對於至少一種參考蛋白質表現之比率、細胞在該分類或評分系統中之百分比、粘附分子-4染色信號之定量量測值，或使用該分類、分數、比率、百分比及定量量測值中之一或多者作為輸入的數學函數結果。
  57. 如請求項47至56中任一項之方法，其中粘附分子-4之表現量係基於該粘附分子-4表現之H分數或該H分數之分類來判定。
  58. 如請求項47至57中任一項之方法，進一步包含在使該組織樣品與該抗體或該其抗原結合片段接觸之前，藉由熱誘導抗原決定基修復(HIER)來修復粘附分子-4之抗原決定基的步驟。
  59. 一種用於評估來自疑似患有癌症個體之組織樣品中之粘附分子-4表現的方法，包含： (a)利用如請求項1至31中任一項之抗體或其抗原結合片段對該組織樣品執行免疫組織化學分析； (b)判定該組織樣品中之粘附分子-4表現。
  60. 如請求項59之方法，其中該組織樣品中之粘附分子-4表現量係與粘附分子-4之參考表現量進行比較。
  61. 如請求項59或60之方法，其中該癌症為選自由以下組成之群之癌症：子宮內膜癌、尿道上皮癌、膀胱癌、輸尿管癌、尿道癌、肺癌、卵巢癌、乳癌、食道癌、胰臟癌、頭頸癌、前列腺癌、陰莖癌、肛門癌、外陰癌、臍尿管癌，及上皮來源之表現粘附分子-4的其他癌症。
  62. 如請求項59至61中任一項之方法，其中粘附分子-4之該參考表現量為該個體之非癌細胞中的粘附分子-4表現量或來自第二個體之非癌細胞中的粘附分子-4表現量。
  63. 如請求項59至62中任一項之方法，其中粘附分子-4之該參考表現量為陰性對照物中之粘附分子-4表現量，其中該陰性對照物中之粘附分子-4表現係獨立地藉由以下判定：qPCR分析、使用第二抗體的免疫組織化學分析、使用第二抗體的免疫墨點分析、使用第二抗體的螢光活化細胞分選(FACS)分析或使用第二抗體的酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
  64. 如請求項63之方法，其中結合至該陰性對照物之該抗體或其抗原結合片段的相對量為結合至表現粘附分子-4之樣品細胞之該抗體或其抗原結合片段之量的約10%、5%、1%或低於1%。
  65. 如請求項59至62中任一項之方法，其中粘附分子-4之該參考表現量為陽性對照物中之粘附分子-4表現量，其中該陽性對照物中之粘附分子-4表現係獨立地藉由以下判定qPCR分析、使用第二抗體的免疫組織化學分析、使用第二抗體的免疫墨點分析、使用第二抗體的螢光活化細胞分選(FACS)分析或使用第二抗體的酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
  66. 如請求項59至65中任一項之方法，其中該組織包含來自以下之組織：膀胱、輸尿管、乳房、肺、結腸、直腸、卵巢、輸卵管、食道、子宮頸、子宮內膜、皮膚、喉、骨髓、唾液腺、腎臟、前列腺、腦、脊髓、胎盤、腎上腺、胰臟、副甲狀腺、腦垂體、睪丸、甲狀腺、脾、扁桃體、胸腺、心臟、胃、小腸、肝臟、骨骼肌、周邊神經、間皮或眼。
  67. 如請求項59至66中任一項之方法，其中粘附分子-4之表現量係使用信號放大系統來偵測。
  68. 如請求項59至67中任一項之方法，其中粘附分子-4之表現量係使用以下判定：分類系統、評分系統、粘附分子-4表現相對於至少一種參考蛋白質表現之比率、細胞在該分類或評分系統中之百分比、粘附分子-4染色信號之定量量測值，或使用該分類、分數、比率、百分比及定量量測值中之一或多者作為輸入的數學函數結果。
  69. 如請求項59至68中任一項之方法，其中粘附分子-4之表現量係基於該粘附分子-4表現之H分數或該H分數之分類來判定。
  70. 如請求項59至69中任一項之方法，進一步包含在測定粘附分子-4之表現量之前，藉由熱誘導抗原決定基修復(HIER)來修復粘附分子-4之抗原決定基的步驟。
  71. 一種用於評估癌症患者對抗癌治療劑之反應的方法，該方法基於來自該患者組織樣品中的粘附分子-4表現，該方法包含： (a)使該組織樣品與如請求項1至31中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸； (b)偵測該抗體或其抗原結合片段對該組織樣品的結合； (c)判定該組織樣品中的粘附分子-4表現量，其中該組織樣品中的粘附分子-4表現量係與粘附分子-4之參考表現量進行比較； 其中粘附分子-4之表現量相較於該參考量增加表示對該抗癌療法有反應。
  72. 如請求項71之方法，其中該抗癌治療劑包含抗粘附分子-4抗體，或抗粘附分子-4抗體之抗體藥物結合物。
  73. 如請求項71或72之方法，其中該癌症為選自由以下組成之群之癌症：子宮內膜癌、尿道上皮癌、膀胱癌、輸尿管癌、尿道癌、肺癌、卵巢癌、乳癌、食道癌、胰臟癌、頭頸癌、前列腺癌、陰莖癌、肛門癌、外陰癌、臍尿管癌，及上皮來源之表現粘附分子-4的其他癌症。
  74. 如請求項71至73中任一項之方法，其中粘附分子-4之該參考表現量為該個體之非癌細胞中的粘附分子-4表現量或來自第二個體之非癌細胞中的粘附分子-4表現量。
  75. 如請求項71至74中任一項之方法，其中粘附分子-4之該參考表現量為陰性對照物中之粘附分子-4表現量，其中該陰性對照物中之粘附分子-4表現係獨立地藉由以下判定：qPCR分析、使用第二抗體的免疫組織化學分析、使用第二抗體的免疫墨點分析、使用第二抗體的螢光活化細胞分選(FACS)分析或使用第二抗體的酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
  76. 如請求項75之方法，其中結合至該陰性對照物之該抗體或其抗原結合片段的相對量為結合至表現粘附分子-4之樣品細胞之該抗體或其抗原結合片段之量的約10%、5%、1%或低於1%。
  77. 如請求項71至74中任一項之方法，其中粘附分子-4之該參考表現量為陽性對照物中之粘附分子-4表現量，其中該陽性對照物中之粘附分子-4表現係獨立地藉由以下判定：qPCR分析、使用第二抗體的免疫組織化學分析、使用第二抗體的免疫墨點分析、使用第二抗體的螢光活化細胞分選(FACS)分析或使用第二抗體的酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
  78. 如請求項71至77中任一項之方法，其中該組織包含來自以下之組織：膀胱、輸尿管、乳房、肺、結腸、直腸、卵巢、輸卵管、食道、子宮頸、子宮內膜、皮膚、喉、骨髓、唾液腺、腎臟、前列腺、腦、脊髓、胎盤、腎上腺、胰臟、副甲狀腺、腦垂體、睪丸、甲狀腺、脾、扁桃體、胸腺、心臟、胃、小腸、肝臟、骨骼肌、周邊神經、間皮或眼。
  79. 如請求項71至78中任一項之方法，其中粘附分子-4之表現量係使用以下判定：免疫組織化學(IHC)方法、免疫墨點分析、螢光活化細胞分選(FACS)分析或酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
  80. 如請求項71至79中任一項之方法，其中粘附分子-4之表現量係使用信號放大系統來偵測。
  81. 如請求項71至80中任一項之方法，其中粘附分子-4之表現量係使用以下來測定：分類系統、評分系統、粘附分子-4表現相對於至少一種參考蛋白質表現之比率、細胞在該分類或評分系統中之百分比、粘附分子-4染色信號之定量量測值，或使用該分類、分數、比率、百分比及定量量測值中之一或多者作為輸入的數學函數結果。
  82. 如請求項71至81中任一項之方法，其中粘附分子-4之表現量係基於該粘附分子-4表現之H分數或該H分數之分類來判定。
  83. 如請求項71至82中任一項之方法，進一步包含在測定粘附分子-4之表現量之前，藉由熱誘導抗原決定基修復(HIER)來修復粘附分子-4之抗原決定基的步驟。
  84. 一種用於評估癌症患者對抗癌治療劑之反應的方法，該方法基於來自該患者之組織樣品中的粘附分子-4表現，該方法包含： (a)利用如請求項1至31中任一項之抗體或其抗原結合片段對該組織樣品執行免疫組織化學分析； (b)測定該組織樣品中的粘附分子-4表現量，其中該組織樣品中的粘附分子-4表現量係與粘附分子-4之參考表現量進行比較， 其中該組織樣品中之粘附分子-4表現量相較於該參考量增加表示對該抗癌療法有反應。
  85. 如請求項84之方法，其中該抗癌治療劑包含抗粘附分子-4抗體，或抗粘附分子-4抗體之抗體藥物結合物。
  86. 如請求項84或85之方法，其中該癌症為選自由以下組成之群之癌症：子宮內膜癌、尿道上皮癌、膀胱癌、輸尿管癌、尿道癌、肺癌、卵巢癌、乳癌、食道癌、胰臟癌、頭頸癌、前列腺癌、陰莖癌、肛門癌、外陰癌、臍尿管癌，及上皮來源之表現粘附分子-4的其他癌症。
  87. 如請求項84至86中任一項之方法，其中粘附分子-4之該參考表現量為該個體之非癌細胞中的粘附分子-4表現量或來自第二個體之非癌細胞中的粘附分子-4表現量。
  88. 如請求項84至87中任一項之方法，其中粘附分子-4之該參考表現量為陰性對照物中之粘附分子-4表現量，其中該陰性對照物中之粘附分子-4表現係獨立地藉由以下判定：qPCR分析、使用第二抗體的免疫組織化學分析、使用第二抗體的免疫墨點分析、使用第二抗體的螢光活化細胞分選(FACS)分析或使用第二抗體的酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
  89. 如請求項88之方法，其中結合至該陰性對照物之該抗體或其抗原結合片段的相對量為結合至表現粘附分子-4之樣品細胞之該抗體或其抗原結合片段之量的約10%、5%、1%或低於1%。
  90. 如請求項84至87中任一項之方法，其中粘附分子-4之該參考表現量為陽性對照物中之粘附分子-4表現量，其中該陽性對照物中之粘附分子-4表現係獨立地藉由以下判定：qPCR分析、使用第二抗體的免疫組織化學分析、使用第二抗體的免疫墨點分析、使用第二抗體的螢光活化細胞分選(FACS)分析或使用第二抗體的酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
  91. 如請求項84至90中任一項之方法，其中該組織包含來自以下之組織：膀胱、輸尿管、乳房、肺、結腸、直腸、卵巢、輸卵管、食道、子宮頸、子宮內膜、皮膚、喉、骨髓、唾液腺、腎臟、前列腺、腦、脊髓、胎盤、腎上腺、胰臟、副甲狀腺、腦垂體、睪丸、甲狀腺、脾、扁桃體、胸腺、心臟、胃、小腸、肝臟、骨骼肌、周邊神經、間皮或眼。
  92. 如請求項84至91中任一項之方法，其中粘附分子-4之表現量係使用信號放大系統來偵測。
  93. 如請求項84至92中任一項之方法，其中粘附分子-4之表現量係使用以下來測定：分類系統、評分系統、粘附分子-4表現相對於至少一種參考蛋白質表現之比率、細胞在該分類或評分系統中之百分比、粘附分子-4染色信號之定量量測值，或使用該分類、分數、比率、百分比及定量量測值中之一或多者作為輸入的數學函數結果。
  94. 如請求項84至93中任一項之方法，其中粘附分子-4之表現量係基於該粘附分子-4表現之H分數或該H分數之分類來測定。
  95. 如請求項84至94中任一項之方法，進一步包含在測定粘附分子-4之表現量之前，藉由熱誘導抗原決定基修復(HIER)來修復粘附分子-4之抗原決定基的步驟。
  96. 如請求項47至95中任一項之方法，其中該個體為人類個體。
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