7.詳細な説明
本明細書では、ヒトネクチン4を含むネクチン4に結合する抗体などの結合性タンパク質が提供される。一実施形態では、ネクチン4抗体は、ヒトネクチン4に結合する。一部の実施形態では、ネクチン4抗体の、ネクチン4への結合を、in vitroにおいてアッセイした。他の実施形態では、ネクチン4抗体の、ネクチン4への結合を、ex vivoにおいてアッセイした。ある特定の実施形態では、アッセイは、免疫組織化学(IHC)アッセイ、蛍光活性化細胞分取(FACS)アッセイ、ELISA、免疫ブロット(例えば、ウェスタンブロット法、ドットブロッティング、又は細胞内ウェスタンブロット法)、及び他のイムノアッセイを含む。
具体的な実施形態では、本明細書で提供される、ネクチン4に結合する抗体などの結合性タンパク質は、ネクチン4への結合について、互いと競合するという、共通の特徴を共有する。この競合的阻害は、各抗体が、ネクチン4の同じ領域(例えば、同じエピトープ)に結合し、これにより、同様な効果を確保することを指し示しうる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ネクチン4抗体は、抗体であるM22-321b41.1から導出されるか、又はこれに基づき導出されたヒト化抗ネクチン4抗体などのヒト化抗ネクチン4抗体を含む。他の実施形態では、本明細書で提供される抗ネクチン4抗体は、結合について、M22-321b41.1から導出されるか、又はこれに基づき導出された抗体と競合する。一部の実施形態では、抗ネクチン4抗体は、表1に記載されたCDR配列を有する。ある特定の実施形態では、抗ネクチン4抗体は、ヒトネクチン4の特異的ドメイン(例えば、配列番号1のアミノ酸配列内の、残基31~346、1~150、又は31~150)に結合する。さらに、このような結合は、大部分、本明細書で記載される抗ネクチン4抗体により認識されるエピトープを含む領域内の、特定のアミノ酸残基に帰することができる。まとめると、本明細書で記載される結果は、M22-321b41.1から導出されるか、又はこれに基づき導出された抗ネクチン4抗体であって、表1に記載された、1又は複数のCDRを有する抗体を含む上記抗体について観察される効果を、同じであるか、又は同様なエピトープ特異性(例えば、同じであるか、又は同様なCDR)を有する、本明細書で記載される、他の抗ネクチン4抗体へと外挿しうることを裏付ける。
本開示についての、一部の実施形態では、抗ネクチン4抗体などの結合性タンパク質は、表1に記載された、1又は複数のCDRを含む、免疫グロブリン可変領域を含みうる。このような結合性タンパク質(例えば、抗ネクチン4抗体)内では、CDRを、CDR(単数又は複数)の、適正な抗原結合特性が達成されるように、CDR(単数又は複数)を方向付ける、表2に記載された足場領域又はFR領域など、1又は複数の足場領域又はフレームワーク領域(FR)と接合させることができる。本明細書で記載される抗ネクチン4抗体を含む、このような結合性タンパク質は、多様なアッセイにおいて、ネクチン4に結合しうる。
7.1 一般的技法
本明細書で記載されるか、又は言及される技法及び手順は、一般に、例えば、Sambrookら、「分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」(3版、2001);「分子生物学における最新のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」(Ausubelら編、2003);「治療用モノクローナル抗体:実験室から臨床まで(Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic)」(An編、2009);「モノクローナル抗体:方法とプロトコール(Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols)」(Albitar編、2010);及び「抗体の操作(Antibody Engineering)」、1及び2巻(Kontermann及びDubel編、2版、2010)において記載されている、広く利用される方法など、従来の方法を使用して、当業者により、十分に理解され、且つ/又は一般に用いられる技法及び手順を含む。
7.2 用語法
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的では、以下の用語についての説明が、適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語はまた、複数形も含み、この逆もまた成り立つであろう。全ての特許、出願、出願公開、及び他の刊行物は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。万一、明示された用語についての任意の説明が、参照により本明細書に組み込まれた、任意の文献と齟齬を生じる場合、下記に明示された用語の説明に従うものとする。
「ネクチン4」、「ネクチン4ポリペプチド」、又は「ネクチン4タンパク質」という用語は、そうでないことが指し示されない限りにおいて、霊長動物(例えば、ヒト及びカニクイザル(cynomolgus monkey(cyno)))、イヌ、及び齧歯動物(例えば、マウス及びラット)などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源に由来する、任意の天然ポリペプチドを含むポリペプチド(本明細書では、「ポリペプチド」と「タンパク質」とを、互換的に使用する)を包含する。ある特定の実施形態では、用語は、そのSNP変異体を含む、「類縁のネクチン4ポリペプチド」を含む。「ネクチン4」という用語はまた、プロセシングされていないネクチン4である、「全長」ネクチン4のほか、細胞内のプロセシングから生じる、ネクチン4の任意の形態も包含する。一部の実施形態では、ネクチン4は、配列番号1のアミノ酸配列を有する。GenBank(商標)受託番号:NM_030916(mRNA)、NG_028109(ゲノムのDNA)、Gene ID:81607(遺伝子)、NP_112178(前駆体アミノ酸配列)は、他の例示的な、ヒトネクチン4の核酸配列又はアミノ酸配列を提示する。例示的なヒトネクチン4アミノ酸配列を、下記:
GenBank(商標)受託番号:NM_030916は、1つの、例示的な、ヒトネクチン4の核酸配列:
GenBank(商標)受託番号:AF472510、NM_027893、XM_203738、NM_001122680は、例示的な、マウスネクチン4の核酸配列及びアミノ酸配列を提示し;GenBank(商標)受託番号:XM_005541220及びXM_005541223は、例示的な、サルネクチン4の、核酸配列及びアミノ酸配列を提示する。
「類縁のネクチン4ポリペプチド」は、ネクチン4活性を保持しうる、対立遺伝子変異体(例えば、SNP変異体);スプライス変異体;断片;誘導体;置換変異体、欠失変異体、及び挿入変異体;融合ポリペプチド;並びに種間相同体を含む。当業者が理解する通り、本明細書で提供される抗ネクチン4抗体は、ネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチド断片、ネクチン4抗原、及び/又はネクチン4エピトープに結合しうる。「エピトープ」は、大型のネクチン4ポリペプチドの一部でありうる、大型のネクチン4ポリペプチド断片の一部でありうる、大型のネクチン4抗原の一部でありうる。ネクチン4は、天然形態で存在する場合もあり、変性形態で存在する場合もある。本明細書で記載されるネクチン4ポリペプチドは、ヒト組織型など、様々な供給源、又は別の供給源から単離することもでき、組換え方法又は合成方法により調製することもできる。当技術分野ではまた、ネクチン4ポリペプチドに対するオーソログも周知である。
「ネクチン4リガンド」とは、ネクチン4と結合するか、又は他の形で相互作用する分子を指す。ネクチン4は、別のネクチン4分子との同種親和性相互作用と、ネクチン1、ネクチン2、及びネクチン3など、他のネクチンファミリータンパク質との異種親和性相互作用とを有しうる。ネクチン4はまた、カドヘリンなど、他の表面接着分子、及びプロラクチン受容体など、他の細胞表面受容体とも相互作用しうる。ネクチン4はさらに、ウイルス粒子、例えば、麻疹ウイルス及びポリオウイルス、並びにウイルス粒子上のウイルスタンパク質とも相互作用しうる。したがって、ネクチン4リガンドは、ネクチン1、ネクチン2、ネクチン3、若しくはネクチン4、又はネクチンファミリータンパク質のうちのいずれかの断片を含みうる。ネクチン4リガンドはまた、カドヘリン若しくはその断片、又はプロラクチン受容体若しくはその断片など、他の細胞表面受容体のドメイン又は全長分子も含みうる。ネクチン4リガンドは、ネクチン4に結合しうる、ウイルス粒子、ウイルスカプシドタンパク質、ウイルス表面タンパク質、及びウイルスタンパク質のうちのいずれかの断片もさらに含みうる。本明細書で記載されるか、又は当業者に公知である天然に存在するリガンド以外のネクチン4リガンドの非限定的な例は、人工的に作出されるリガンド、例えば、ネクチン4に結合しうるペプチドを得るためにペプチドのライブラリーをスクリーニングすることにより同定されるリガンドを含む。
「ネクチン4の活性」及び「ネクチンによるシグナル伝達」という用語は、例えば、in vivo又はin vitroにおいて、ネクチン4リガンドの、ネクチン4への結合により誘導される、生物学的効果又は生物学的応答を意味する。用語はまた、ネクチン4リガンドの機能を模倣する分子により誘導される、同様な効果又は応答も指す。このようなネクチン4リガンドの模倣体は、そうでなければ、ネクチン4リガンドの結合から生じる、生物学的応答又は生物学的効果を誘導する。
「結合性タンパク質」という用語は、ネクチン4に結合する部分(例えば、CDRなど、1又は複数の結合性領域)と、任意選択で、結合部分が、結合性タンパク質の、ネクチン4のポリペプチド、断片、又はエピトープへの結合を促進するコンフォメーションを取ることを可能とする、足場部分又はフレームワーク部分(例えば、1又は複数の足場領域又はフレームワーク領域)とを含むタンパク質を指す。このような結合性タンパク質の例は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、単鎖抗体、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、Fab断片、F(ab’)2断片、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、又はIgG4抗体、及びこれらの断片などの抗体を含む。結合性タンパク質は、例えば、CDR又はCDR誘導体をグラフトされた、代替的なタンパク質足場又は人工的足場を含みうる。このような足場は、例えば、結合性タンパク質の三次元構造を安定化させるように導入された突然変異を含む、抗体由来の足場のほか、例えば、生体適合性ポリマーを含む、完全合成足場を含むがこれらに限定されない。例えば、Korndorferら、2003、「タンパク質:構造、機能、及びバイオインフォマティクス(Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics)」、53(1):121~29;及びRoqueら、2004、Biotechnol.Prog.、20:639~54を参照されたい。加えて、ペプチド抗体模倣体(「PAM」)もまた、フィブロネクチン成分を、足場として利用する抗体模倣体に基づき、足場として使用することができる。本開示の文脈では、結合性タンパク質は、ネクチン4に特異的に結合するか、又はこれに選択的に結合するという。
本明細書では、「抗体」、「免疫グロブリン」、又は「Ig」という用語は、互換的に使用され、最も広い意味で使用され、具体的には、例えば、個別の抗ネクチン4モノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体又はインタクトなモノクローナル抗体を含む)、ポリエピトープ特異性又はモノエピトープ特異性を伴う抗ネクチン4抗体組成物、ポリクローナル抗体又は一価抗体、少なくとも2つのインタクトな抗体、単鎖抗ネクチン4抗体、及び下記で記載される抗ネクチン4抗体の断片から形成される多価抗体を対象とする。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び/又はアフィニティー成熟抗体のほか、他の種、例えば、マウス及びウサギなどに由来する抗体でありうる。「抗体」という用語は、特異的分子抗原に結合することが可能であり、ポリペプチド鎖の、2つの同一な対から構成されるポリペプチドであって、各対が、1つの重鎖(約50~70kDa)と、1つの軽鎖(約25kDa)とを有し、各鎖の各アミノ末端部分が、約100~約130、又はこれを超えるアミノ酸の可変領域を含み、各鎖の各カルボキシ末端部分が、定常領域を含む上記ポリペプチドの、免疫グロブリンクラス内にある、B細胞のポリペプチド産物を含むことを意図する。例えば、「抗体の操作(Antibody Engineering)」(Borrebaeck編、2版、1995);及びKuby、「免疫学(Immunology)」(3版、1997)を参照されたい。具体的な実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ネクチン4ポリペプチド、ネクチン4断片、又はネクチン4エピトープを含む、特異的分子抗原に結合しうる。抗体はまた、合成抗体、組換えにより作製された抗体、ラクダ化抗体、イントラボディー、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、及び断片が由来する抗体の結合活性の一部又は全部を保持する、抗体の重鎖ポリペプチド又は軽鎖ポリペプチドの部分を指す、上記のうちのいずれかの機能的断片(例えば、ネクチン4結合性断片などの抗原結合性断片)も含むがこれらに限定されない。非限定的な機能的断片(例えば、ネクチン4結合性断片などの抗原結合性断片)の例は、単鎖Fv(scFv)、Fab断片、F(ab’)断片、F(ab)2断片、F(ab’)2断片、ジスルフィド連結Fv(dsFv)、Fd断片、Fv断片、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、及びミニボディーを含む。特に、本明細書で提供される抗体は、免疫グロブリン分子と、免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、例えば、ネクチン4抗原に結合する抗原結合性部位を含有する抗原結合性ドメイン又は分子と(例えば、抗ネクチン4抗体の、1又は複数のCDR)を含む。このような抗体断片は、例えば、Harlow及びLane、「抗体:実験室マニュアル(Antibodies:A Laboratory Manual)」(1989);「分子生物学とバイオテクノロジー:総合的便覧(Mol.Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference)」(Myers編、1995);Hustonら、1993、Cell Biophysics、22:189~224;Pluckthun及びSkerra、1989、Meth.Enzymol.、178:497~515;並びにDay、「上級免疫化学(Advanced Immunochemistry)」(2版、1990)において見出すことができる。本明細書で提供される抗体は、免疫グロブリン分子の、任意のクラス(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、及びIgA)又は任意のサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)の抗体でありうる。
「抗原」とは、抗体が選択的に結合しうる、所定の抗原である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、又は他の天然に存在する化合物若しくは合成の化合物でありうる。一部の実施形態では、標的抗原は、ポリペプチドである。
「抗原結合性断片」、「抗原結合性ドメイン」、「抗原結合性領域」という用語、及び類似の用語は、抗原と相互作用し、結合剤に、抗原(例えば、CDR)に対する、その特異性及びアフィニティーを付与するアミノ酸残基を含む、抗体の部分を指す。
「~に結合する」又は「~に結合すること」という用語は、分子間の相互作用であって、例えば、複合体を形成する相互作用を含む上記相互作用を指す。相互作用は、例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、及び/又はファンデルワールス相互作用を含む、非共有結合的相互作用でありうる。複合体はまた、共有結合的結合若しくは非共有結合的結合、相互作用、又は力により、併せて保持される、2つ又はこれを超える分子の結合も含みうる。抗体の、単一の抗原結合性部位と、ネクチン4など、標的分子の、単一のエピトープとの、全非共有結合的相互作用の強度は、抗体又は機能的断片の、このエピトープに対するアフィニティーである。抗体の、一価抗原に対する解離速度(koff)の、会合速度(kon)に対する比(koff/kon)は、アフィニティーと反比例する、解離定数KDである。KD値が小さいほど、抗体のアフィニティーは大きい。KDの値は、抗体と抗原との、異なる複合体に応じて変動し、kon及びkoffの両方に依存する。本明細書で提供される抗体についての解離定数KDは、本明細書で提供される、任意の方法、又は当業者に周知である、他の任意の方法を使用して決定することができる。1つの結合性部位におけるアフィニティーは、抗体と抗原との相互作用の、真の強度を、常に反映するわけではない。多価ネクチン4など、複数の、反復的な抗原決定基を含有する複合体抗原が、複数の結合性部位を含有する抗体と接触する場合、1つの部位における、抗体の、抗原との相互作用は、第2の部位における反応の可能性を増大させるであろう。多価抗体と抗原との、このような複数の相互作用の強度を、アビディティーと呼ぶ。抗体のアビディティーは、その結合能についての、その個別の結合性部位のアフィニティーより良好な尺度でありうる。例えば、高アビディティーは、IgGより低アフィニティーであるが、その多価性から生じる、IgMの高アビディティーを有しうる、五量体IgM抗体において、場合によって、見出される通り、低アフィニティーを補完することが可能であり、五量体IgM抗体が、抗原に、効果的に結合することを可能とする。
本明細書では、「ネクチン4に特異的に結合する抗体」、「ネクチン4エピトープに特異的に結合する抗体」という用語、及び類似の用語もまた、互換的に使用され、ネクチン4抗原、又はネクチン4断片、又はネクチン4エピトープなどのネクチン4ポリペプチド(例えば、ヒトネクチン4ポリペプチド、ヒトネクチン4抗原、又はヒトネクチン4エピトープなどのヒトネクチン4)に特異的に結合する抗体を指す。ネクチン4(例えば、ヒトネクチン4)に特異的に結合する抗体は、ネクチン4の細胞外ドメイン又はネクチン4の細胞外ドメインに由来するペプチドに結合しうる。ネクチン4抗原(例えば、ヒトネクチン4)に特異的に結合する抗体は、類縁の抗原(例えば、カニクイザルネクチン4)と交差反応性でありうる。ある特定の実施形態では、ネクチン4抗原に特異的に結合する抗体は、ネクチン1、ネクチン2、及び/又はネクチン3などであるがこれらに限定されない、他の抗原と交差反応しない。ネクチン4抗原に特異的に結合する抗体は、例えば、イムノアッセイ、Biacore(登録商標)、又は当業者に公知の他の技法により同定することができる。
「目的の抗原に結合する」(例えば、ネクチン4などの標的抗原に結合する)抗体とは、抗体が、抗原を発現する細胞又は組織のターゲティング又は検出において、薬剤として有用であるが、他のタンパク質と、それほど交差反応しないように、抗原に、十分なアフィニティーで結合する抗体である。このような実施形態では、抗体の、「非標的」タンパク質への結合の程度は、例えば、蛍光活性化細胞分取(FACS)解析又はRIAにより決定される、抗体の、その特定の標的タンパク質への結合の約10%未満であろう。抗体の、標的分子への結合に関して、「特異的結合」、特定のポリペプチド若しくは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的に結合する」、又はこれら「に特異的である」という用語は、非特異的相互作用と、測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、分子の結合を、一般に、結合活性を有さない、同様な構造の分子である、対照分子の結合と比較して決定することにより測定することができる。例えば、特異的結合は、標的と同様な対照分子、例えば、過剰量の、標識化されていない標的との競合により決定することができる。この場合、標識化された標的の、プローブへの結合が、過剰量の、標識化されていない標的により、競合的に阻害されれば、特異的結合が指し示される。「抗ネクチン4抗体」又は「ネクチン4に結合する抗体」という用語は、抗体が、例えば、ネクチン4のターゲティングにおける診断剤として有用であるように、十分なアフィニティーにより、ネクチン4に結合することが可能な抗体を含む。本明細書で使用される、「特異的結合」、特定のポリペプチド若しくは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的に結合する」、又はこれら「に特異的である」という用語は、分子が、他のいかなるポリペプチド又はポリペプチドエピトープにも、実質的に結合せずに、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合する場合の結合を指す。本明細書では、ネクチン4に特異的に結合する抗ネクチン4抗体が提供される。本明細書ではまた、ネクチン4に、ネクチン1、ネクチン2、及び/又はネクチン3を上回って、特異的に結合する抗ネクチン4抗体も提供される。
ラジオイムノアッセイ(RIA)及び酵素免疫測定アッセイ(ELISA)などの実験技法を使用して決定される通り、それが、ネクチン4抗原に、任意の交差反応性の抗原に対するより、大きなアフィニティーで結合する場合に、抗体は、ネクチン4抗原に特異的に結合する。典型的に、特異的反応又は選択的反応は、バックグラウンドのシグナル又はノイズの、少なくとも2倍であり、バックグラウンドの10倍を超えうる。例えば、抗体の特異性に関する議論については、「基礎免疫学(Fundamental Immunology)」332~36(Paul編、2版1989)を参照されたい。代替的に、抗体の特異性は、例えば、IHCアッセイにおいて、定性的に決定することができる。このようなIHCアッセイでは、抗体が、ネクチン4を発現する細胞に結合する、例えば、これを免疫組織化学に染色するが、ネクチン4を発現しない細胞には、実質的に結合しない、例えば、これを実質的に染色しない場合に、抗体は、ネクチン4抗原に特異的に結合するか、又はネクチン4抗原に対する特異性を有する。例として述べると、抗体が、細胞に、免疫グロブリンのアイソタイプ対照について見られる結合のレベルと、実質的に同様なレベルで結合する、例えば、これを、免疫組織化学に染色する場合、抗体は、細胞に実質的に結合しない、例えば、IHCにおいて、これを実質的に染色しない。
本明細書では、「完全ヒト抗体」又は「ヒト抗体」という用語は、互換的に使用され、ヒト可変領域と、例えば、ヒト定常領域とを含む抗体を指す。具体的な実施形態では、用語は、ヒト由来の可変領域と、定常領域とを含む抗体を指す。ある特定の実施形態では、「完全ヒト」抗ネクチン4抗体はまた、ネクチン4ポリペプチドに結合し、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン核酸配列の、天然に存在する体細胞変異体である核酸配列によりコードされる抗体も包含しうる。具体的な実施形態では、本明細書で提供される抗ネクチン4抗体は、完全ヒト抗体である。「完全ヒト抗体」という用語は、Kabatら(Kabatら(1991)、「免疫学的対象となるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」、5版、U.S.Department of Health and Human Services、NIH 刊行物第91-3242号を参照されたい)により記載されている、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に対応する、可変領域及び定常領域を有する抗体を含む。完全ヒト抗体を作製する例示的方法は、例えば、本明細書の実施例に提供されるが、当技術分野で公知である、任意の方法を使用することができる。
「組換えヒト抗体」という語句は、宿主細胞にトランスフェクトされる組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体、組換え、コンビナトリアルの、ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子について、トランスジェニック及び/又はトランスクロモソーマルである動物(例えば、マウス又はウシ)から単離された抗体(例えば、Taylor,L.D.ら(1992)、Nucl.Acids Res.、20:6287~6295を参照されたい)、又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列の、他のDNA配列に照らしたスプライシングを伴う、他の任意の手段により、調製されるか、発現させるか、創出されるか、又は単離された抗体などの組換え手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、又は単離されたヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域(Kabat,E.A.ら(1991)、「免疫学的対象となるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」、5版、U.S.Department of Health and Human Services、NIH 刊行物第91-3242号を参照されたい)を有しうる。しかし、ある特定の実施形態では、このような組換えヒト抗体を、in vitroにおける突然変異誘発(又は、ヒトIg配列に対してトランスジェニックである動物を使用する場合は、in vivoにおける体細胞突然変異誘発)にかけるので、組換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のVH配列及びVL配列に由来し、これらと類縁であるが、in vivoのヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内には、天然で存在しえない配列である。
抗ネクチン4抗体(例えば、ネクチン4に結合し、標的上の、同じエピトープ又は結合性部位について競合する、抗体及び結合性タンパク質)の文脈で使用される場合の、「競合する」という用語は、アッセイにより決定される競合であって、研究下の抗体(又はその結合性断片)が、基準分子(例えば、基準リガンド、又は基準抗体など、基準の抗原結合性タンパク質)の、共通抗原(例えば、ネクチン4又はその断片)への特異的結合を防止又は阻害する、上記競合を意味する。多数種類の競合的結合アッセイを使用して、被験抗体が、基準抗体と、ネクチン4への結合(例えば、ヒトネクチン4)について競合するのかどうかを決定することができる。用いられうるアッセイの例は、直接的固相RIA又は間接的固相RIA、直接的固相酵素イムノアッセイ(EIA)又は間接的固相酵素EIA、サンドイッチ競合アッセイ(例えば、Stahliら、1983、Methods in Enzymology、9:242~53を参照されたい)、直接的固相ビオチン-アビジンEIA(例えば、Kirklandら、1986、J.Immunol.、137:3614~19を参照されたい)、直接的固相標識化アッセイ、直接的固相標識化サンドイッチアッセイ、(例えば、Harlow及びLane、「抗体:実験室マニュアル(Antibodies:A Laboratory Manual)」、(1988)を参照されたい)、I-125標識を使用する、直接的固相標識化RIA(例えば、Morelら、1988、Mol.Immunol.、25:7~15を参照されたい)、及び直接的標識化RIA(Moldenhauerら、1990、Scand.J.Immunol.、32:77~82)を含む。典型的に、このようなアッセイは、固体表面に結合させた精製抗原(例えば、ヒトネクチン4などのネクチン4)、又は標識化されていない被験抗原結合性タンパク質(例えば、被験抗ネクチン4抗体)若しくは標識化された基準抗原結合性タンパク質(例えば、基準抗ネクチン4抗体)を保有する細胞の使用を伴う。使用されうる、他の例示的競合的結合アッセイは、ELISA、FACS、細胞接着アッセイ(例えば、Humphriesら、Methods Mol Biol.、2009;522:203~10に記載されている)、表面プラズモン共鳴(SPR)、又は当業者に公知である、他の競合的結合アッセイを含む。競合的阻害は、被験抗原結合性タンパク質の存在下で、固体表面又は細胞に結合した標識の量を決定することにより測定することができる。通例、被験抗原結合性タンパク質は、過剰量で存在する。競合アッセイ(競合抗体)により同定される抗体は、抗体の、基準抗体と同じエピトープへの結合、及び/又は抗体の、基準抗体が結合するエピトープと、抗体の立体障害が生じる程度に、十分に近位である、隣接するエピトープへの結合を含む。本明細書では、競合的結合を決定するための方法に関するさらなる詳細も記載する。通例、競合する抗体タンパク質が、過剰量で存在する場合、それは、基準抗体の、共通抗原への特異的結合を、少なくとも30%、例えば、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、又は75%阻害するであろう。一部の場合には、結合は、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又はこれを超えて阻害される。
本明細書で使用される、「組み合わせて」という用語の文脈では、他の治療の投与とは、1つを超える治療の使用を指す。「組み合わせて」という用語の使用は、治療を、感染を伴う対象へと投与する順序を制約しない。第1の治療を、第2の治療の投与の前(例えば、1分間、45分間、30分間、45分間、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、又は12週間前)に、これと共時的に、又はこの後(例えば、1分間、45分間、30分間、45分間、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、又は12週間後)に、ネクチン4媒介性疾患を有したか、これを有するか、又はこれに対して感受性である対象へと投与することができる。任意のさらなる治療を、他のさらなる治療と共に、任意の順序で投与することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体を、1又は複数の治療(例えば、本明細書で提供される抗体ではない治療であって、ネクチン4媒介性疾患を防止、処置、管理、及び/又は改善するのに現在投与されている、上記治療)と組み合わせて投与することができる。本明細書で提供される抗体と組み合わせて投与されうる治療の非限定的な例は、鎮痛剤、麻酔剤、抗生剤、又は免疫調節薬剤若しくは米国薬局方及び/又は医師便覧において列挙されている、他の任意の薬剤を含む。
「単離」抗体は、抗体が由来する、細胞供給源若しくは組織供給源、及び/又は他の夾雑物成分に由来する、細胞物質若しくは他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、又は化学合成される場合の、化学的前駆物質若しくは他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という表現は、抗体を、それが単離されるか、又は組換えにより作製される細胞の細胞内成分から分離した、抗体の調製物を含む。したがって、細胞物質を実質的に含まない抗体は、約30%、25%、20%、15%、10%、5%、又は1%(乾燥重量で)未満の異種タンパク質(本明細書ではまた、「夾雑タンパク質」とも称する)を有する、抗体の調製物を含む。ある特定の実施形態では、抗体を、組換えにより作製する場合、それは、培養培地も実質的に含まない、例えば、培養培地は、タンパク質調製物の容量のうちの、約20%、15%、10%、5%、又は1%未満を表す。ある特定の実施形態では、抗体を、化学合成により作製する場合、それは、化学的前駆物質又は他の化学物質を実質的に含まない、例えば、抗体を、タンパク質の合成に関与する、化学的前駆物質又は他の化学物質から分離する。したがって、このような抗体の調製物は、約30%、25%、20%、15%、10%、5%、又は1%(乾燥重量で)未満の、目的の抗体以外の化学的前駆物質又は化合物を有する。夾雑物成分はまた、抗体の治療的使用に干渉する物質も含みうるがこれらに限定されず、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性溶質又は非タンパク質性溶質を含みうる。ある特定の実施形態では、抗体を、(1)ローリー方法(Lowryら、1951、J.Bio.Chem.、193:265~75)により決定される通り、抗体の重量で、96%、97%、98%、若しくは99%など、95%を超えるまで、(2)スピニングカップシーケネーターの使用により、N末端若しくは内部のアミノ酸配列のうちの、少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで、又は(3)クーマシーブルー染色若しくは銀染色を使用する、還元条件又は非還元条件下におけるSDS-PAGEにより、均一となるまで精製する。抗体の天然環境の、少なくとも1つの成分も存在しないので、単離抗体は、組換え細胞内のin situにおける抗体も含む。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも1つの精製ステップにより調製される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される抗体は、単離抗体である。
4鎖抗体単位とは通例、2つの同一な軽(L)鎖及び2つの同一な重(H)鎖から構成される、ヘテロ四量体の糖タンパク質である。IgGの場合、4鎖単位は一般に、約150,000ダルトンである。各L鎖が、1つの共有結合によるジスルフィド結合を介して、H鎖へと連結されるのに対し、2つのH鎖は、互いと、H鎖のアイソタイプに応じて、1又は複数のジスルフィド結合により連結されている。各H鎖及びL鎖はまた、規則的な間隔を隔てた、鎖内ジスルフィド架橋も有する。各H鎖は、N末端において、可変ドメイン(VH)に続いて、α鎖及びγ鎖の各々については、3つの定常ドメイン(CH)を有し、μアイソタイプ及びεアイソタイプについては、4つのCHドメインを有する。各L鎖は、N末端において、可変ドメイン(VL)を有し、続いて、その他方の末端において、定常ドメイン(CL)を有する。VLは、VHと並列し、CLは、重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)と並列する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとのインターフェースを形成すると考えられる。VHとVLとの対合は、一体となって、単一の抗原結合性部位を形成する。抗体の異なるクラス構造及び特性については、例えば、「免疫学の基礎と臨床(Basic and Clinical Immunology)」71(Stitesら編、8版、1994)を参照されたい。
「可変領域」、「可変ドメイン」、「V領域」、又は「Vドメイン」という用語は、抗体の軽鎖又は重鎖の部分であって、軽鎖又は重鎖のアミノ末端に一般に位置し、重鎖内の約120~130アミノ酸、及び軽鎖内の約100~110アミノ酸の長さを有し、各特定の抗体の、その特定の抗原に対する結合及び特異性において使用される、上記部分を指す。重鎖の可変領域は、「VH」と称する場合がある。軽鎖の可変領域は、「VL」と称する場合がある。「可変」という用語は、可変領域の、ある特定のセグメントの配列が、抗体の間で広範に異なるという事実を指す。V領域は、抗原への結合を媒介し、特定の抗体の、その特定の抗原に対する特異性を規定する。しかし、可変性は、可変領域のうちの、110アミノ酸の区間にわたり均等に分配されているわけではない。そうではなくて、V領域は、各々が、約9~12アミノ酸長である、「超可変領域」と呼ばれる、可変性の大きな(例えば、極めて可変性の)短い領域により隔てられた、約15~30アミノ酸のフレームワーク領域(FR)と呼ばれる、可変性の小さな(例えば、比較的不変性の)連なりからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、各々が、βシート構造の一部を接続し、場合によって、これを形成するループを形成する、3つの超可変領域により接続された、βシートの立体配置を、大部分が取る、4つのFRを含む。各鎖内の超可変領域は、FRにより、近接して、一体に保持され、他の鎖に由来する超可変領域と共に、抗体の抗原結合性部位の形成に寄与する(例えば、Kabatら、「免疫学的対象となるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」、(5版、1991)を参照されたい)。定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関与せず、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用(ADCC)及び補体依存性細胞傷害作用(CDC)への、抗体の参与など、多様なエフェクター機能を呈する。可変領域は、配列が、抗体の間で広範に異なる。具体的な実施形態では、可変領域は、ヒト可変領域である。
「Kabatにおける通りの可変領域残基の番号付け」又は「Kabatにおける通りのアミノ酸位置の番号付け」という用語、及びこれらの変化形は、Kabatら、前出における、抗体のコンピレーションによる重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のために使用された番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用すると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのFR又はCDRの短縮又はこれらへの挿入に対応する、より少数であるか、又は追加のアミノ酸を含有しうる。例えば、重鎖可変ドメインは、残基52の後における、単一のアミノ酸挿入(Kabatに従う、残基52a)と、残基82の後における、3つの挿入残基(例えば、Kabatに従う、残基82a、82b、及び82cなど)とを含みうる。Kabatによる残基の番号付けは、所与の抗体について、抗体の配列の、「標準的な」Kabat番号付け配列との相同性の領域におけるアライメントにより決定することができる。Kabatによる番号付けシステムは一般に、可変ドメイン(軽鎖の残基約1~107及び重鎖の残基約1~113)(例えば、Kabatら、前出)内の残基に言及する場合に使用される。「EU番号付けシステム」又は「EUインデックス」は一般に、免疫グロブリンの重鎖定常領域内の残基に言及する場合に使用される(例えば、Kabatら、前出において報告されているEUインデックス)。「Kabatにおける通りのEUインデックス」とは、ヒトIgG1 EU抗体の残基の番号付けを指す。他の番号付けシステムは、例えば、AbM、Chothia、Contact、IMGT、及びAHonにより記載されており、当業者により十分に理解されている。
「インタクトな」抗体とは、抗原結合性部位のほか、CLと、少なくとも重鎖定常領域である、CH1、CH2、及びCH3とを含む抗体である。定常領域は、ヒト定常領域、又はそれらのアミノ酸配列変異体を含みうる。ある特定の実施形態では、インタクトな抗体は、1又は複数のエフェクター機能を有する。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の抗原結合性領域又は可変領域など、インタクトな抗体の部分を含む。抗体断片の例は、限定なしに述べると、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びFv断片;ダイアボディー及びジダイアボディー(例えば、Holligerら、1993、Proc.Natl.Acad.Sci.、90:6444~48;Luら、2005、J.Biol.Chem.、280:19665~72;Hudsonら、2003、Nat.Med.、9:129~34;WO93/11161号;及び米国特許第5,837,242号及び同第6,492,123号を参照されたい);単鎖抗体分子(例えば、米国特許第4,946,778号;同第5,260,203号;同第5,482,858号;及び同第5,476,786号を参照されたい);二重可変ドメイン抗体(例えば、米国特許第7,612,181号を参照されたい);単一可変ドメイン抗体(sdAb)(例えば、Woolvenら、1999、Immunogenetics、50:98~101;及びStreltsovら、2004、Proc Natl Acad Sci USA.、101:12444~49を参照されたい);並びに抗体断片から形成された多特異性抗体を含む。
治療用抗体の「機能的断片」、「結合性断片」、又は「抗原結合性断片」は、インタクトな抗体へと帰せられる生物学的機能の一部又は全部ではなくとも、少なくとも1つの機能である、少なくとも標的抗原への結合を含む機能を呈するであろう(例えば、ネクチン4結合性断片又はネクチン4に結合する断片)。
本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、抗体のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド又は異種タンパク質のアミノ酸配列(例えば、通常は抗体の一部ではないポリペプチド又はタンパク質(例えば、非抗ネクチン4抗原結合性抗体))とを含むポリペプチドを指す。ネクチン4又は抗ネクチン4抗体に関して使用される場合の、「融合」という用語は、ペプチド若しくはポリペプチド、又はその断片、変異体、及び/若しくは誘導体の、異種ペプチド又はポリペプチドとの接合を指す。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ネクチン4又は抗ネクチン4抗体の生物学的活性を保持する。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ネクチン4抗体のVH領域、VL領域、VH CDR(1つ、2つ、又は3つのVH CDR)、及び/又はVL CDR(1つ、2つ、又は3つのVL CDR)を含み、この場合、融合タンパク質は、ネクチン4エピトープ、ネクチン4断片、及び/又はネクチン4ポリペプチドに結合する。
抗体に言及して使用される場合の「重鎖」という用語は、約50~70kDaのポリペプチド鎖を指し、この場合、アミノ末端部分は、約120~130又はこれを超えるアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分は、定常領域を含む。定常領域は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づき、アルファ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、及びミュー(μ)と称する、5つの別個の種類(例えば、アイソタイプ)のうちの1つでありうる。別個の重鎖は、サイズが異なる:α、δ、及びγが、約450アミノ酸を含有するのに対し、μ及びεは、約550アミノ酸を含有する。軽鎖と組み合わされると、これらの別個の種類の重鎖は、それぞれ、抗体の、5つの周知のクラス(例えば、アイソタイプ)である、IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMであって、IgGの4つのサブクラス、すなわち、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4を含む上記クラスをもたらす。重鎖は、ヒト重鎖でありうる。
抗体に言及して使用される場合の「軽鎖」という用語は、約25kDaのポリペプチド鎖を指し、この場合、アミノ末端部分は、約100~約110又はこれを超えるアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分は、定常領域を含む。軽鎖の近似的な長さは、211~217アミノ酸である。定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ(κ)又はラムダ(λ)と称する、2つの別個の種類が存在する。当技術分野では、軽鎖アミノ酸配列が周知である。軽鎖は、ヒト軽鎖でありうる。
本明細書で使用される「宿主」という用語は、哺乳動物(例えば、ヒト)などの動物を指す。
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、核酸分子をトランスフェクトされうる特定の対象細胞と、このような細胞の後代又は潜在的な後代とを指す。このような細胞の後代は、後続する世代において生じうる突然変異若しくは環境の影響、又は核酸分子の、宿主細胞ゲノムへの組込みに起因して、核酸分子をトランスフェクトされた親細胞と同一ではありえない。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、例えば、個々の抗体を含む集団は、少量で存在しうる、可能な、天然に存在する突然変異を除き、同一であり、各モノクローナル抗体は典型的に、抗原上の、単一のエピトープを認識するであろう。具体的な実施形態では、本明細書で使用される「モノクローナル抗体」は、単一のハイブリドーマ又は他の細胞により産生される抗体であり、この場合、抗体は、例えば、当技術分野で公知の、ELISA又は他の抗原結合アッセイ又は競合的結合アッセイにより決定される通り、ネクチン4エピトープだけに結合する。「モノクローナル」という用語は、抗体を作るための、任意の特定の方法に限定されない。例えば、本開示において有用なモノクローナル抗体は、Kohlerら、1975、Nature、256:495により最初に記載されたハイブリドーマ方法により調製することもでき、細菌細胞又は真核動物細胞又は植物細胞内の組換えDNA方法を使用して調製することもできる(例えば、米国特許第4,816,567号を参照されたい)。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clacksonら、1991、Nature、352:624~28;及びMarksら、1991、J.Mol.Biol.、222:581~97において記載されている技法を使用して、ファージ抗体ライブラリーからも単離することができる。当技術分野では、クローン細胞系、及びこれにより発現させるモノクローナル抗体を調製するための他の方法が周知である。例えば、「分子生物学における簡易プロトコール(Short Protocols in Molecular Biology)」(Ausubelら編、5版、2002)を参照されたい。モノクローナル抗体を作製する例示的方法は、本明細書の実施例に提供する。
核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞など、生物学的材料との関連で使用される場合の「天然」という用語は、天然において見出され、人為による操作、改変、及び/又は変化(例えば、単離、精製、選択)がなされていない生物学的材料を指す。
本明細書で提供される抗体は、重鎖及び/又は軽鎖の部分が、特定の種に由来する抗体内、又は特定の抗体クラス若しくは抗体サブクラスに属する抗体内の、対応する配列と同一又は相同である一方、鎖(単数又は複数)の残りの部分は、別の種に由来する抗体内、又は別の抗体クラス若しくは抗体サブクラスに属する抗体内の、対応する配列と同一又は相同である、「キメラ」抗体のほか、所望の生物学的活性を呈する限りにおいて、このような抗体の断片(例えば、米国特許第4,816,567号;及びMorrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、81:6851~6855(1984)を参照されたい)も含みうる。
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、天然CDRの残基を、マウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類など、非ヒト種(ドナー抗体)の、対応するCDRであって、所望の特異性、アフィニティー、及び能力を有する、上記CDRに由来する残基により置きかえた、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む、キメラ抗体である。一部の場合には、ヒト免疫グロブリンの、1又は複数のFR領域の残基を、対応する非ヒト残基により置きかえる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体内でも、ドナー抗体内でも見出されない残基も含みうる。抗体の効能をさらに精緻化するように、これらの修飾を施すことができる。ヒト化抗体の重鎖又は軽鎖は、少なくとも1つ又はこれを超える可変領域の実質的に全てを含むことが可能であり、この場合、CDRの全て又は実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのCDRの全て又は実質的に全てに対応し、FRの全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のFRの全て又は実質的に全てである。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、免疫グロブリンの定常領域(Fc)のうちの少なくとも一部、典型的に、ヒト免疫グロブリンのFcのうちの少なくとも一部を含むであろう。さらなる詳細については、例えば、Jonesら、1986、Nature、321:522~25;Riechmannら、1988、Nature、332:323~29;Presta、1992、Curr.Op.Struct.Biol.、2:593~96;Carterら、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:4285~89;米国特許第6,800,738号;同第6,719,971号;同第6,639,055号;同第6,407,213号;及び同第6,054,297号を参照されたい。
「ヒト抗体」とは、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列、及び/又は本明細書で開示される、ヒト抗体を作るための技法のうちのいずれかを使用して作られた抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体である。ヒト抗体のこの定義はとりわけ、非ヒト抗原結合性残基を含むヒト化抗体を除外する。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の、多様な技法であって、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom及びWinter、1991、J.Mol.Biol.、227:381;Marksら、1991、J.Mol.Biol.、222:581)及び酵母ディスプレイライブラリー(Chaoら、2006、Nature Protocols、1:755~68)を含む技法を使用して作製することができる。Coleら、「モノクローナル抗体とがん治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)」、77(1985);Boernerら、1991、J.Immunol.、147(1):86~95;及びvan Dijk及びvan de Winkel、2001、Curr.Opin.Pharmacol.、5:368~74において記載されている方法もまた、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用可能である。ヒト抗体は、抗原投与に応答して、このような抗体を産生するように改変されているが、それらの内因性の遺伝子座を失効化させたトランスジェニック動物、例えば、トランスジェニックマウスへと、抗原を投与することにより調製することができる(例えば、XENOMOUSE(商標)技術に関しては、Jakobovits、1995、Curr.Opin.Biotechnol.、6(5):561~66;Brueggemann及びTaussing、1997、Curr.Opin.Biotechnol.、8(4):455~58;並びに米国特許第6,075,181号及び同第6,150,584号を参照されたい)。ヒトB細胞ハイブリドーマ技術を介して作出されるヒト抗体に関しては、例えば、Liら、2006、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、103:3557~62もまた参照されたい。
「CDR」とは、免疫グロブリン(Ig又は抗体)VHのβ-シートフレームワーク、非フレームワーク領域内の、3つの超可変領域(H1、H2又はH3)のうちの1つ、又は抗体VLのβ-シートフレームワーク、非フレームワーク領域内の、3つの超可変領域(L1、L2又はL3)のうちの1つを指す。したがって、CDRとは、フレームワーク領域配列内に散在した可変領域配列である。CDR領域は、当業者に周知であり、例えば、Kabatにより、抗体可変(V)ドメイン内の最も超可変性の領域として規定されている(Kabatら、1997、J.Biol.Chem.、252:6609~16;Kabat、1978、Adv.Prot.Chem.、32:1~75)。CDR領域の配列はまた、Chothiaにより、保存的β-シートフレームワークの一部ではなく、したがって、異なるコンフォメーションに適合することが可能な残基として、構造的にも規定されている(Chothia及びLesk、1987、J.Mol.Biol.、196:901~17)。当技術分野では、いずれの用語法も、十分に認知されている。CDR領域の配列はまた、AbM、Contact、及びIMGTによっても規定されている。カノニカルな抗体可変領域内のCDRの位置は、多数の構造の比較により決定されている(Al-Lazikaniら、1997、J.Mol.Biol.、273:927~48;Moreaら、2000、Methods、20:267~79)。超可変領域内の残基の数は、異なる抗体内で変動するため、カノニカルな位置と比べたさらなる残基は、従来、カノニカルな可変領域番号付けスキームにおける残基番号の隣に、a、b、cなどを伴って番号付けされている(Al-Lazikaniら、前出)。このような命名法も同様に、当業者に周知である。
本明細書で使用される場合の「超可変領域」、「HVR」、又は「HV」という用語は、抗体の可変領域のうちの、配列が超可変性であり、且つ/又は構造的に規定されたループを形成する領域を指す。一般に、抗体は、VH(H1、H2、H3)内の3つ、及びVL(L1、L2、L3)内の3つである、6つの超可変領域を含む。いくつかの超可変領域の画定が使用されており、本明細書にも包含される。Kabatにより相補性決定領域(CDR)は、配列の可変性に基づき、最も一般に使用されている(例えば、Kabatら、前出を参照されたい)。代わって、Chothiaは、構造的ループの位置に言及する(例えば、Chothia及びLesk、1987、J.Mol.Biol.、196:901~17を参照されたい)。Kabatによる番号付け慣例法を使用して番号付けされる場合の、Chothia CDR-H1ループの末端は、ループの長さに応じて、H32~H34の間で変動する(これは、Kabatによる番号付けスキームが、H35A及びH35Bに、挿入を配置するためであり;35Aも35Bも存在しない場合、ループは、32で終わり;35Aだけが存在する場合、ループは、33で終わり;35A及び35Bのいずれもが存在する場合、ループは、34で終わる)。AbMによる超可変領域は、KabatによるCDRと、Chothiaによる構造的ループとの折衷を表し、Oxford Molecular製のAbM抗体モデル化ソフトウェアにより使用されている(例えば、「抗体の操作(Antibody Engineering)」2巻(Kontermann及びDubel編、2版、2010)を参照されたい)。「Contact」超可変領域は、利用可能な複合体結晶構造の解析に基づく。これらの超可変領域又はCDRの各々に由来する残基については、下記で言及する。
近年、ユニバーサルの番号付けシステムである、ImMunoGeneTics(IMGT)InformationSystem(登録商標)が開発され、広く採用されている(Lafrancら、2003、Dev.Comp.Immunol、27(1):55~77)。IMGTとは、ヒト及び他の脊椎動物の、免疫グロブリン(IG)、T細胞受容体(TCR)、及び主要組織適合性複合体(MHC)に特化した、統合型情報システムである。本明細書では、軽鎖内又は重鎖内の、アミノ酸配列及び位置の両方に関して、CDRに言及する。免疫グロブリン可変ドメインの構造内のCDRの「位置」は、種間で保存されており、ループと呼ばれる構造内に存在するので、構造特徴に従い、可変ドメイン配列をアライメントする番号付けシステムを使用することにより、CDR残基及びフレームワーク残基は、たやすく同定される。この情報は、1つの種の免疫グロブリンに由来するCDR残基の、典型的に、ヒト抗体に由来するアクセプターフレームワークへのグラフティング及び置きかえにおいて使用することができる。さらなる番号付けシステム(AHon)が、Honegger及びPlueckthun、2001、J.Mol.Biol、309:657~70により開発されている。当業者には、例えば、Kabatによる番号付けシステム及びIMGT固有の番号付けシステムを含む、番号付けシステム間の照応が周知である(例えば、Kabat、前出;Chothia及びLesk、前出;Martin、前出;Lefrancら、前出を参照されたい)。
超可変領域は、以下:VL内の24~36又は24~34(L1)、46~56又は50~56(L2)、及び89~97又は89~96(L3)、並びにVH内の26~35又は26~35A(H1)、50~65又は49~65(H2)、及び93~102、94~102、又は95~102(H3)の通りの「拡張超可変領域」を含みうる。本明細書で使用される、「HVR」及び「CDR」という用語は、互換的に使用される。
「定常領域」又は「定常ドメイン」という用語は、軽鎖及び重鎖のカルボキシ末端部分であって、抗体の抗原への結合に直接関与せず、多様なエフェクター機能など、Fc受容体との相互作用を呈する、上記カルボキシ末端部分を指す。用語は、抗原結合性部位を含有する可変領域である、免疫グロブリンの他の部分と比べて、より保存的なアミノ酸配列を有する、免疫グロブリン分子の部分を指す。定常領域は、重鎖のCH1、CH2、及びCH3領域と、軽鎖のCL領域とを含有しうる。
「フレームワーク」又は「FR」という用語は、CDRを挟む可変領域残基を指す。FR残基は、例えば、キメラ抗体内、ヒト化抗体内、ヒト抗体内、ドメイン抗体内、ダイアボディー内、直鎖状抗体内、及び二特異性抗体内に存在する。FR残基は、超可変領域残基又はCDR残基以外の可変ドメイン残基である。
「アフィニティー成熟」抗体とは、1又は複数のそのHVR内に、1又は複数の変更(例えば、変化、付加、及び/又は欠失を含む、アミノ酸配列の変化形)であって、抗原に対する抗体のアフィニティーの、これらの変更(単数又は複数)を有さない親抗体と比較した改善を結果としてもたらす、上記変更を伴う抗体である。アフィニティー成熟抗体は、標的抗原に対する、ナノモル単位、なお又はピコモル単位のアフィニティーを有しうる。アフィニティー成熟抗体を、当技術分野で公知の手順により作製する。総説については、Hudson及びSouriau、2003、Nature Medicine、9:129~34;Hoogenboom、2005、Nature Biotechnol.、23:1105~16;Quiroz及びSinclair、2010、Revista Ingeneria Biomedia、4:39~51を参照されたい。
「結合アフィニティー」とは一般に、分子(例えば、抗体などの結合性タンパク質)の単一の結合性部位と、その結合パートナー(例えば、抗原)との非共有結合的相互作用の総計の強度を指す。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書で使用される「結合アフィニティー」とは、結合対のメンバーの間(例えば、抗体と抗原との間)の1:1の相互作用を反映する、内在的な結合アフィニティーを指す。結合性分子Xの、その結合パートナーYに対するアフィニティーは一般に、解離定数(KD)により表すことができる。アフィニティーは、当該技術分野で公知の、一般的な方法であって、本明細書で記載される方法を含む上記方法により測定することができる。低アフィニティー抗体が一般に、抗原に、ゆっくりと結合し、且つ、たやすく解離する傾向があるのに対し、高アフィニティー抗体は一般に、抗原にすばやく結合し、且つ、長く結合を維持する傾向がある。当技術分野では、結合アフィニティーを測定する、様々な方法が公知であり、これらのうちのいずれも、本開示の目的で使用することができる。具体的な例示的実施形態は、以下を含む。一実施形態では、「KD」又は「KD値」は、当技術分野で公知のアッセイにより、例えば、結合アッセイにより測定することができる。KDは、例えば、目的の抗体のFab変化形及びその抗原により実施されるRIAにおいて測定することができる(Chenら、1999、J.Mol Biol、293:865~81)。KD又はKD値はまた、例えば、Biacore(登録商標)TM-2000又はBiacore(登録商標)TM-3000を使用するBiacore(登録商標)による表面プラズモン共鳴アッセイを使用することにより測定することもでき、例えば、Octet(登録商標)QK384システムを使用するBLI(biolayer interferometry)により測定することもできる。「オン速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「kon」もまた、例えば、Biacore(登録商標)TM-2000若しくはBiacore(登録商標)TM-3000、又はOctet(登録商標)QK384システムを使用する、上記で記載した、同じ表面プラズモン共鳴法又はBLI(biolayer interferometry)法により決定することができる。
「実質的に同様な」又は「実質的に同じ」という語句は、当業者が、値(例えば、KD値)により測定される生物学的特徴の文脈で、2つの値、又は2つの画像の間の差違を、生物学的有意性及び/又は統計学的有意性が、ほとんどないか、又はないと考えるように、2つの数値、又は2つの画像(例えば、本開示の抗体と関連する1つの画像、及び基準抗体と関連する他の画像)からのシグナル(例えば、IHC染色シグナル)の間の、十分に高度な類似性を表す。例えば、2つの値の間の差違は、基準抗体についての値の関数として、約50%未満、約40%未満、約30%未満、約20%未満、約10%未満、又は約5%未満でありうる。
本明細書で使用される、「実質的に増大した」、「実質的に低減された」、又は「実質的に異なる」という語句は、当業者が、値により測定される生物学的特徴の文脈で、2つの値又は2つの画像の間の差違を、統計学的有意性があると考えるように、2つの数値、又は2つの画像(例えば、本開示の抗体と関連する1つの画像、及び基準抗体と関連する他の画像)からのシグナル(例えば、IHC染色シグナル)の間の、十分に高度な差違を表す。例えば、前記2つの値の間の差違は、基準抗体についての値の関数として、約10%を超える、約20%を超える、約30%を超える、約40%を超える、又は約50%を超える差違でありうる。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のFc領域(例えば、天然配列のFc領域又はアミノ酸配列変異体のFc領域)に帰せられる生物学的活性を指し、抗体のアイソタイプと共に変動する。抗体のエフェクター機能の例は、C1qへの結合;CDC;Fc受容体への結合;ADCC;食作用;及びB細胞活性化を含む。
本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の転帰を結果としてもたらすのに十分な量の、本明細書で提供される抗体又は医薬組成物を指す。
本明細書では、「Fc領域」という用語を、天然配列のFc領域、組換えFc領域、及び変異Fc領域を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を規定するように使用する。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界部は、変動しうるであろうが、ヒトIgG重鎖Fc領域は通例、そのCys226位又はPro230位のアミノ酸残基から、カルボキシル末端へと連なると規定されることが多い。Fc領域の、C末端のリシン(EU番号付けシステムに従う残基447)は、例えば、抗体の作製時又は精製時に除去することもでき、抗体の重鎖をコードする核酸を、組換えにより操作することにより除去することもできる。したがって、インタクトな抗体の組成物は、全てのK447残基を除去した抗体集団、K447残基を除去していない抗体集団、及びK447残基を伴う抗体と、K447残基を伴わない抗体との混合物を有する抗体集団を含みうる。
「機能的Fc領域」は、天然配列のFc領域の「エフェクター機能」を保有する。例示的「エフェクター機能」は、C1qへの結合;CDC;Fc受容体への結合;ADCC;食作用などを含む。このようなエフェクター機能は、一般に、Fc領域を、結合性領域又は結合性ドメイン(例えば、抗体の可変領域又は可変ドメイン)と組み合わせることを要求し、開示される多様なアッセイを使用して評価することができる。
「天然配列のFc領域」は、天然において見出され、人為による操作、改変、及び/又は変化(例えば、単離、精製、選択すること、可変領域の配列など、他の配列を含むこと、又はこれらと組み合わせること)がなされていないFc領域のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を含む。天然配列のヒトIgG1 Fc領域は、天然配列のヒトIgG1 Fc領域(非Aアロタイプ及びAアロタイプ);天然配列のヒトIgG2 Fc領域;天然配列のヒトIgG3 Fc領域と;天然配列のヒトIgG4 Fc領域のほか、これらの天然に存在する変異体を含む。例えば、天然のヒトIgG1 Fc領域のアミノ酸配列を、下記(配列番号35)に提示する。
「変異体のFc領域」は、少なくとも1カ所のアミノ酸修飾(例えば、置換、付加、又は欠失)により、天然配列のFc領域のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、変異体のFc領域は、天然配列のFc領域又は親ポリペプチドのFc領域と比較した、少なくとも1カ所のアミノ酸置換、例えば、天然配列のFc領域内又は親ポリペプチドのFc領域内の、約1~約10カ所のアミノ酸置換、又は約1~約5カ所のアミノ酸置換を有する。本明細書の変異体のFc領域は、天然配列のFc領域及び/又は親ポリペプチドのFc領域との、少なくとも約80%の相同性、又はこれらとの、少なくとも約90%の相同性、例えば、これらとの、少なくとも約95%相同性を有しうる。
ネクチン4又は抗ネクチン4抗体に関して使用される場合の「変異体」という用語は、天然配列又は非修飾配列と比較して、1カ所又は複数カ所の(例えば、約1~約25、約1~約20、約1~約15、約1~約10、又は約1~約5カ所などの)アミノ酸配列の置換、欠失、及び/又は付加を含むペプチド又はポリペプチドを指す場合がある。例えば、ネクチン4の変異体は、天然のネクチン4のアミノ酸配列に対する、1カ所又は複数カ所の(例えば、約1~約25、約1~約20、約1~約15、約1~約10、又は約1~約5カ所などの)変化の結果として得ることができる。これもまた、例を目的として述べると、抗ネクチン4抗体の変異体は、天然の抗ネクチン4抗体又はあらかじめ修飾されていない抗ネクチン4抗体のアミノ酸配列に対する、1カ所又は複数カ所の(例えば、約1~約25、約1~約20、約1~約15、約1~約10、又は約1~約5カ所などの)変化の結果として得ることができる。変異体は、対立遺伝子変異体又はスプライス変異体など、天然に存在する場合もあり、人工的に構築される場合もある。ポリペプチド変異体は、変異体をコードする、対応する核酸分子から調製することができる。具体的な実施形態では、ネクチン4の変異体又は抗ネクチン4抗体の変異体は、基準抗体と比較した、ネクチン4への特異的結合を、少なくとも保持する。ある特定の実施形態では、変異体は、ネクチン4、或いは抗ネクチン4抗体のVH領域若しくはVL領域、又は1又は複数のCDRなどの部分領域をコードする核酸分子の一塩基多型(SNP)変異体によりコードされる。
「ベクター」という用語は、例えば、核酸配列を、宿主細胞へと導入するために、本明細書で記載される抗ネクチン4抗体をコードする核酸配列を含む核酸配列を保有するか、又はこれを組み入れるのに使用される物質を指す。使用のために適用可能なベクターは、例えば、宿主細胞の染色体への安定的な組込みのために作動可能な、選択配列又はマーカーを含みうる、発現ベクター、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソーム、及び人工的染色体を含む。加えて、ベクターは、1又は複数の選択用マーカー遺伝子と、適切な発現制御配列と、を含みうる。組み入れられうる選択用マーカー遺伝子は、例えば、抗生剤又は毒素に対する耐性をもたらすか、栄養要求性欠損を補完するか、又は培養培地中に存在しない、極めて重要な栄養物質を供給する。発現制御配列は、当技術分野で周知である、構成的プロモーター及び誘導可能なプロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含みうる。2つ又はこれを超える核酸分子を共発現させる(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の両方、又は抗体のVH及びVLの両方)場合、両方の核酸分子を、例えば、単一の発現ベクターへと挿入することもでき、個別の発現ベクター内に挿入することもできる。単一のベクターによる発現のために、コード核酸を、1つの共通の発現制御配列へと任意選択で連結することもでき、1つの誘導可能なプロモーター、及び1つの構成的プロモーターなど、異なる発現制御配列へと連結することもできる。核酸分子の、宿主細胞への導入は、当技術分野で周知の方法を使用して確認することができる。このような方法は、例えば、ノーザンブロット若しくはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるmRNAの増幅などの核酸解析、遺伝子産物の発現についての免疫ブロット、又は導入された核酸配列又はその対応する遺伝子産物の発現について調べるのに適する他の解析方法を含む。当業者により、核酸分子を、所望の産物(例えば、本明細書で記載される抗ネクチン4抗体)をもたらすのに十分な量で発現させることが理解され、当技術分野で周知の方法を使用して、十分な発現を得るように、発現レベルを最適化しうることが、さらに理解される。
ネクチン4ポリペプチドの「細胞外ドメイン」又は「ECD」とは、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを本質的に含まない、ネクチン4ポリペプチドの形態を指す。例えば、ネクチン4ポリペプチドECDは、このような膜貫通ドメイン及び/又は細胞質ドメインのうちの1%未満を有することが可能であり、このようなドメインのうちの0.5%未満を有しうる。
「同一性」という用語は、配列をアライメントし、比較することにより決定される、2つ若しくはこれを超えるポリペプチド分子、又は2つ若しくはこれを超える核酸分子の配列の間の関係を指す。基準ポリペプチド配列との関係における「アミノ酸配列の同一性パーセント(%)」は、配列をアライメントし、必要な場合、最大の配列同一性パーセントを達成するように、ギャップを導入し、保存的置換を、配列同一性の一部として考慮せずにおいた後における、基準ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一な、候補配列内のアミノ酸残基の百分率として規定される。アミノ酸配列の同一性パーセントを決定することを目的とするアライメントは、当技術分野の範囲内にある多様な方途により、例えば、BLASTソフトウェア、BLAST-2ソフトウェア、ALIGNソフトウェア、又はMegalign(DNAStar,Inc.)ソフトウェアなど、一般に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、配列をアライメントするのに適切なパラメーターであって、比較される配列の全長にわたり、最大のアライメントを達成するのに必要とされる、任意のアルゴリズムを含むパラメーターを決定することができる。
アミノ酸残基/位置の「修飾」とは、一次アミノ酸配列の、出発アミノ酸配列と比較した変化を指し、この場合、変化は、前記アミノ酸残基/位置を伴う、配列の変更の結果から生じる。例えば、典型的な修飾は、残基の、別のアミノ酸による置換(例えば、保存的置換又は非保存的置換)、前記残基/位置に隣接する、1若しくは複数の(例えば、一般に、5つ、4つ、又は3つより少ない)アミノ酸の挿入、及び/又は前記残基/位置の欠失を含む。
「エピトープ」とは、単一の抗体分子が結合する、抗原分子の表面上の部位であって、抗体の、1又は複数の抗原結合性領域に結合することが可能であり、哺乳動物(例えば、ヒト)などの動物において、抗原性又は免疫原性活性を有し、免疫応答を誘発することが可能な、ネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチド断片など、抗原の表面上の局在化領域などの、上記部位である。免疫原活性を有するエピトープは、動物において抗体応答を誘発する、ポリペプチドの部分である。抗原活性を有するエピトープは、例えば、イムノアッセイを含む、当技術分野で周知である、任意の方法により決定される通り、抗体が結合するポリペプチドの部分である。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。エピトープは、アミノ酸又は糖側鎖など、化学的活性表面の分子の群分けからなることが多く、特異的三次元構造特徴のほか、特異的電荷特徴を有する。抗体のエピトープは、直鎖状エピトープの場合もあり、コンフォメーションエピトープの場合もある。直鎖状エピトープは、タンパク質内のアミノ酸の連続する配列により形成される。コンフォメーションエピトープは、タンパク質が、その三次元構造へとフォールディングすると、一体となる、タンパク質配列内の、不連続なアミノ酸から形成される。誘導型エピトープは、別のタンパク質又はリガンドの活性化又は結合の後など、タンパク質の三次元構造が、変更されたコンフォメーションにある場合に形成される。ある特定の実施形態では、ネクチン4エピトープは、ネクチン4ポリペプチドの三次元表面特徴である。他の実施形態では、ネクチン4エピトープは、ネクチン4ポリペプチドの直鎖状特徴である。一般に、抗原は、いくつかのエピトープ又は多くの異なるエピトープを有し、多くの異なる抗体と反応しうる。
2つの抗体が、三次元空間内の、同一であるか、重複するか、又は隣接するエピトープを認識する場合に、抗体は、「エピトープ」、基準抗体と「本質的に同じエピトープ」、又は「同じエピトープ」に結合する。2つの抗体が、三次元空間内の、同一であるか、重複するか、又は隣接するエピトープに結合するのかどうかを決定するための、最も広く使用され、且つ、迅速な方法は、例えば、標識化された抗原又は標識化された抗体を使用して、いくつかの異なるフォーマットで構成されうる、競合アッセイである。一部のアッセイでは、抗原を、96ウェルプレート上に固定化するか、又は細胞表面上に発現させ、放射性標識、蛍光標識、又は酵素標識を使用して、標識化されていない抗体が、標識化された抗体の結合を遮断する能力を測定する。
「エピトープマッピング」とは、それらの標的抗原上の、抗体の結合性部位又はエピトープを同定する工程である。「エピトープビニング」とは、それらが認識するエピトープに基づき、抗体を群分けする工程である。より特定すると、エピトープビニングは、抗体を、それらのエピトープ認識特性に基づきクラスター化し、顕著に異なる結合特異性を有する抗体を同定するための、コンピューターによる工程と組み合わせて、競合アッセイを使用して、異なる抗体のエピトープ認識特性を区別するための方法及びシステムを含む。
本明細書で使用される「担体」は、用いられる用量及び濃度で、それらへと曝露される細胞又は哺乳動物に非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤を含む。生理学的に許容される担体は、水性のpH緩衝液であることが多い。生理学的に許容される担体の例は、リン酸、クエン酸、ヒスチジン、及び他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸を含む抗酸化剤;低分子量の(約10アミノ酸残基より少ない)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリシンなどのアミノ酸;単糖、二糖、及び、グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む、他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール;ナトリウムなどの塩形成対イオン;並びに/又はTWEEN(商標)、ポリエチレングリコール(PEG)、及びPLURONICS(商標)などの非イオン性界面活性剤を含む。「担体」という用語はまた、希釈剤、アジュバント(例えば、フロイントのアジュバント(完全又は不完全))、賦形剤、又は媒体も指す場合がある。医薬担体を含む、このような担体は、水、石油、動物油、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油など、植物由来又は合成由来の油を含む油などの滅菌液体でありうる。水は、組成物(例えば、医薬組成物)を、静脈内投与する場合の、例示的担体である。生理食塩液及びデキストロース水溶液及びグリセロール溶液もまた、特に、注射用液のための液体担体として用いることができる。適切な賦形剤(例えば、医薬の賦形剤)は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、オオムギ、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。所望の場合、組成物はまた、少量の保湿剤若しくは乳化剤、又はpH緩衝剤も含有しうる。組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、持続放出製剤などの形態を取りうる。経口製剤を含む経口組成物は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの、標準的な担体を含みうる。適切な医薬担体の例については、Remington及びGennaro、「レミントンの製薬科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)」、(18版、1990)において記載されている。医薬化合物を含む組成物は、単離形態又は精製された形態の抗ネクチン4抗体を、例えば、適量の担体と併せて含有しうる。
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、動物、及び、より特定すると、ヒトにおける使用について、米国連邦政府若しくは米国州政府の規制機関により承認されているか、又は米国薬局方、欧州薬局方、若しくは他の一般に認知された薬局方において列挙されていることを意味する。
本明細書で使用される「ポリクローナル抗体」とは、多くのエピトープを有するタンパク質に対する免疫原性応答により作出される抗体集団を指し、したがって、タンパク質内の、同じエピトープ又は異なるエピトープを指向する、様々な異なる抗体を含む。当技術分野では、ポリクローナル抗体を作製するための方法が公知である(例えば、「分子生物学における簡易プロトコール(Short Protocols in Molecular Biology)」(Ausubelら編、5版、2002)を参照されたい)。
「単離核酸」とは、核酸、例えば、RNA、DNA、又は他のゲノムDNA配列のほか、タンパク質、又は天然では、天然配列に付随する、リボソーム及びポリメラーゼなどの複合体から実質的に分離された混合核酸である。「単離」核酸分子は、核酸分子の天然供給源中に存在する、他の核酸分子から分離された核酸分子である。さらに、cDNA分子などの「単離」核酸分子は、組換え技法により作製される場合の、他の細胞物質若しくは培養培地、又は化学合成される場合の、化学的前駆物質又は他の化学物質を、実質的に含まない場合がある。具体的な実施形態では、本明細書で記載される抗体をコードする、1又は複数の核酸分子は、単離又は精製されている。用語は、それらの天然に存在する環境から除去された核酸配列を包含し、組換え単離物、又はクローニングされたDNA単離物、及び化学合成された類似体、又は異種系により、生物学的に合成された類似体を含む。実質的に純粋な分子は、分子の単離形態を含みうる。
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNA及びRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド若しくは修飾塩基、及び/又はこれらの類似体、或いはDNAポリメラーゼ又はRNAポリメラーゼにより、ポリマーへと組み込まれる場合もあり、合成反応によりポリマーへと組み込まれる場合もある、任意の基質でありうる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含みうる。本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、一般に、約200ヌクレオチド未満であるが、必ずしもそうではない長さの、短鎖であり、一般に、一本鎖である、合成ポリヌクレオチド、を指す。「オリゴヌクレオチド」という用語と、「ポリヌクレオチド」という用語は、互いに排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の記載は、オリゴヌクレオチドに対しても、同等、且つ、完全に適用可能である。本開示の抗ネクチン4抗体を産生する細胞は、親ハイブリドーマ細胞のほか、抗体をコードする核酸を導入した、細菌宿主細胞及び真核宿主細胞を含みうる。適切な宿主細胞については、下記に開示する。
そうでないことが指定されない限り、本明細書で開示される、任意の一本鎖のポリヌクレオチド配列の左手末端は、5’末端であり;二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向を、5’方向と称する。新生RNA転写物の、5’から3’への付加方向を、転写方向と称し;RNA転写物の5’側から5’末端であるRNA転写物と同じ配列を有する、DNA鎖上の配列領域を、「上流の配列」と称し;RNA転写物の3’側から3’末端であるRNA転写物と同じ配列を有する、DNA鎖上の配列領域を、「下流の配列」と称する。
「組換え抗体」という用語は、組換え手段により、調製されるか、発現させるか、創出されるか、又は単離された抗体を指す。組換え抗体は、宿主細胞にトランスフェクトするための組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体、組換え、コンビナトリアルの、抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子について、トランスジェニック及び/又はトランスクロモソーマルである動物(例えば、マウス又はウシ)から単離された抗体(例えば、Taylorら、1992、Nucl.Acids Res.、20:6287~6295を参照されたい)、又は免疫グロブリン遺伝子配列の、他のDNA配列に照らしたスプライシングを伴う、他の任意の手段により、調製されるか、発現させるか、創出されるか、又は単離された抗体でありうる。このような組換え抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を含む可変領域及び定常領域(Kabatら、前出を参照されたい)を有しうる。しかし、ある特定の実施形態では、このような組換え抗体を、in vitroにおける突然変異誘発(又は、ヒトIg配列に対してトランスジェニックである動物を使用する場合は、in vivoにおける体細胞突然変異誘発)にかけうるので、組換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のVH配列及びVL配列に由来し、これらと類縁であるが、in vivoのヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内には、天然で存在しえない配列である。
「対象」及び「患者」という用語は、互換的に使用することができる。本明細書で使用された、ある特定の実施形態では、対象は、非霊長動物(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど)又は霊長動物(例えば、サル又はヒト)などの哺乳動物である。具体的な実施形態では、対象は、ヒトである。一実施形態では、対象は、本明細書で提供される状態又は障害を伴うと診断された哺乳動物、例えば、ヒトである。別の実施形態では、対象は、本明細書で提供される状態又は障害を発症する危険性がある哺乳動物、例えば、ヒトである。
「実質的に全ての」とは、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、又は約100%を指す。
「検出用プローブ」という用語は、検出可能なシグナルをもたらす組成物を指す。用語は、限定なしに述べると、その活性を介して、検出可能なシグナルをもたらすものなど、任意のフルオロフォア、発色団、放射性標識、酵素、抗体又は抗体断片を含む。
「検出剤」という用語は、試料又は対象における、本明細書で記載される抗ネクチン4抗体など、所望の分子の存在(exsistence又はpresence)を確認するのに使用されうる物質を指す。検出剤は、視覚化することが可能な物質、又は他の形で決定及び/若しくは測定する(例えば、定量化により)ことが可能な物質でありうる。
「診断剤」という用語は、対象へと投与される物質であって、疾患、障害、又は状態の診断の一助となる、上記物質を指す。このような物質を使用して、疾患を引き起こす過程の局在化を明らかにし、特定し、且つ/又は規定することができる。ある特定の実施形態では、診断剤は、単独で、又は物質とコンジュゲートさせ、対象へと投与するか、又は対象に由来する試料と接触させると、ネクチン4媒介性疾患の診断の一助となる、本明細書で記載される抗ネクチン4抗体又はその断片を含む。
核酸分子に言及して使用される場合の「コード核酸」という用語又はその文法的同等物は、その天然状態において、又は当業者に周知の方法により操作された場合に、mRNAをもたらすように転写され、次いで、ポリペプチド及び/又はその断片へと翻訳されうる核酸分子を指す。アンチセンス鎖とは、このような核酸分子の相補体であり、コード配列を、これから導くことができる。
「賦形剤」という用語は、一般に、希釈剤、媒体、防腐剤、結合剤、又は安定化剤として使用される不活性物質を指し、タンパク質(例えば、血清アルブミンなど)、アミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、グリシン、ヒスチジンなど)、脂肪酸及びリン脂質(例えば、スルホン酸アルキル、カプリラートなど)、界面活性剤(例えば、SDS、ポリソルバート、非イオン界面活性剤など)、糖(例えば、スクロース、マルトース、トレハロースなど)、並びにポリオール(例えば、マンニトール、ソルビトールなど)を含むがこれらに限定されない。また、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Remington及びGennaro、「レミントンの製薬科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)」、(18版、1990)も参照されたい。
本明細書の、ペプチド又はポリペプチドの文脈で使用される、「断片」という用語は、全長未満のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドを指す。このような断片は、例えば、アミノ末端における切断から生じる場合もあり、カルボキシ末端における切断から生じる場合もあり、且つ/又はアミノ酸配列に由来する残基(単数又は複数)の内部欠失から生じる場合もある。断片は、例えば、代替的なRNAスプライシングから生じる場合もあり、in vivoにおけるプロテアーゼ活性から生じる場合もある。ある特定の実施形態では、ネクチン4の断片又は抗ネクチン4抗体の断片は、ネクチン4ポリペプチド又は抗ネクチン4抗体のアミノ酸配列のうちの少なくとも5連続アミノ酸残基、少なくとも10連続アミノ酸残基、少なくとも15連続アミノ酸残基、少なくとも20連続アミノ酸残基、少なくとも25連続アミノ酸残基、少なくとも30連続アミノ酸残基、少なくとも40連続アミノ酸残基、少なくとも50連続アミノ酸残基、少なくとも60連続アミノ酸残基、少なくとも70連続アミノ酸残基、少なくとも80連続アミノ酸残基、少なくとも90連続アミノ酸残基、少なくとも100連続アミノ酸残基、少なくとも125連続アミノ酸残基、少なくとも150連続アミノ酸残基、少なくとも175連続アミノ酸残基、少なくとも200連続アミノ酸残基、少なくとも225、少なくとも250、少なくとも275、少なくとも300、少なくとも325、少なくとも350、少なくとも375、少なくとも400、少なくとも425、少なくとも450、少なくとも475、少なくとも500、少なくとも525、又は少なくとも550連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。具体的な実施形態では、ネクチン4ポリペプチドの断片又は抗ネクチン4抗体は、ポリペプチド又は抗体の、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、又はこれを超える機能を保持する。
「約」及び「およそ」という用語は、所与の値又は範囲から、20%以内、15%以内、10%以内、9%以内、8%以内、7%以内、6%以内、5%以内、4%以内、3%以内、2%以内、1%以内、又はこれ未満を意味する。
「~を投与する」又は「投与」とは、経粘膜送達、皮内送達、静脈内送達、筋内送達、及び/又は本明細書で記載されているか、若しくは当技術分野で公知である、物理的送達の、他の任意の方法などにより、体外に存在する物質(例えば、本明細書で記載される抗ネクチン4抗体)を、患者へと注射するか、又は他の形で物理的に送達する行為を指す。
本明細書のポリペプチドの文脈で使用される、「類似体」という用語は、ネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチドの断片、若しくは抗ネクチン4抗体と同様な機能又は同一な機能を保有するが、ネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチドの断片、若しくは抗ネクチン4抗体と同様なアミノ酸配列又は同一なアミノ酸配列を必ずしも含むか、又はネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチドの断片、若しくは抗ネクチン4抗体と同様な構造又は同一な構造を必ずしも有するわけではないポリペプチドを指す。同様なアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、以下:(a)本明細書で記載されるネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチドの断片、又は抗ネクチン4抗体のアミノ酸配列と、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチド;(b)厳密な条件(例えば、Sambrookら、「分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」(2001);及びManiatisら、「分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」(1982)を参照されたい)下で、本明細書で記載されるネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチドの断片、又は抗ネクチン4抗体(又はそのVH領域又はVL領域)をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、少なくとも5アミノ酸残基、少なくとも10アミノ酸残基、少なくとも15アミノ酸残基、少なくとも20アミノ酸残基、少なくとも25アミノ酸残基、少なくとも30アミノ酸残基、少なくとも40アミノ酸残基、少なくとも50アミノ酸残基、少なくとも60アミノ酸残基、少なくとも70アミノ酸残基、少なくとも80アミノ酸残基、少なくとも90アミノ酸残基、少なくとも100アミノ酸残基、少なくとも125アミノ酸残基、若しくは少なくとも150アミノ酸残基の、上記ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド;又は(c)本明細書で記載されるネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチドの断片、又は抗ネクチン4抗体(又はそのVH領域又はVL領域)をコードするヌクレオチド配列と、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、若しくは少なくとも99%同一なヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのうちの少なくとも1つを満たすポリペプチドを指す。本明細書で記載されるネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチドの断片、又は抗ネクチン4抗体と同様な構造を伴うポリペプチドとは、本明細書で記載されるネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチドの断片、又は抗ネクチン4抗体と同様な、二次構造、三次構造、又は四次構造を有するポリペプチドを指す。ポリペプチドの構造は、X線結晶構造解析、核磁気共鳴、及び電子顕微鏡による結晶構造解析を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の方法により決定することができる。
ポリペプチドの文脈において、本明細書で使用される「誘導体」という用語は、アミノ酸残基の置換、欠失、又は付加の導入により変更された、ネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチドの断片、又はネクチン4ポリペプチドに結合する抗体のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。本明細書で使用される「誘導体」という用語はまた、例えば、任意の種類の分子の、ポリペプチドへの共有結合的接合により化学的に修飾された、ネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチドの断片、又はネクチン4ポリペプチドに結合する抗体も指す。限定を目的としないが、例えば、ネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチドの断片、又は抗ネクチン4抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護(protecting/blocking)基による誘導体化、タンパク質分解性切断、化学的切断、製剤化、ツニカマイシンの代謝的合成、細胞のリガンド又は他のタンパク質への連結などにより化学修飾することができる。誘導体は、接合させる分子の種類又は位置において、天然に存在するペプチド若しくはポリペプチド、又は出発ペプチド若しくは出発ポリペプチドと異なる形で修飾される。誘導体は、ペプチド上又はポリペプチド上に天然で存在する、1又は複数の化学的基の欠失をさらに含む。さらに、ネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチドの断片、又は抗ネクチン4抗体の誘導体は、1又は複数の、非古典的アミノ酸を含有しうる。ポリペプチド誘導体は、本明細書で記載されるネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチドの断片、又は抗ネクチン4抗体と同様な機能又は同一な機能を保有する。
「組成物」という用語は、任意選択で、指定された量の、指定された成分(例えば、本明細書で提供される抗体)を含有する生成物を包含することを意図する。
本明細書で使用される「~を防止する」、「~を防止すること」、及び「防止」という用語は、ネクチン4媒介性疾患及び/又はこれと関連する症状の、発症、再発、発病、又は拡大の、完全な阻害又は部分的な阻害であって、本明細書で提供される治療又は治療の組合せの投与(例えば、本明細書で提供される抗体などの、予防剤又は治療剤の組合せ)の結果として得られる、上記阻害を指す。
本明細書で使用される、「予防剤」という用語は、対象における、ネクチン4媒介性疾患及び/又はこれと関連する症状の、発症、再発、発病、又は拡大を、完全に、又は部分的に阻害しうる、任意の薬剤を指す。ある特定の実施形態では、「予防剤」という用語は、本明細書で提供される抗体を指す。ある特定の他の実施形態では、「予防剤」という用語は、本明細書で提供される抗体以外の薬剤を指す。一部の実施形態では、予防剤は、ネクチン4媒介性疾患及び/若しくはこれと関連する症状を防止するか、又はネクチン4媒介性疾患及び/若しくはこれと関連する症状の、発病、発症、進行、及び/又は重症度を抑えるのに有用であることが公知であるか、又はこのために使用されたことがあるか、若しくは現在使用されつつある薬剤である。具体的な実施形態では、予防剤は、完全ヒト抗ネクチン4モノクローナル抗体などの、完全ヒト抗ネクチン4抗体である。
ある特定の実施形態では、「予防的に有効な血清力価」とは、ヒトなどの対象における血清力価であって、前記対象における、ネクチン4媒介性疾患及び/又はこれと関連する症状の、発症、再発、発病、又は拡大を、完全に、又は部分的に阻害する、上記血清力価である。
本明細書では、「ネクチン4媒介性疾患」及び「ネクチン4媒介性障害」は、互換的に使用され、ネクチン4により完全に、若しくは部分的に引き起こされるか、この結果であるか、又はこれと相関する、任意の疾患を指す。ある特定の実施形態では、ネクチン4は、細胞の表面上で、異常に(例えば、高度に)発現する。一部の実施形態では、ネクチン4は、特定の細胞型において、異常に上方調節されうる。他の実施形態では、ネクチン4の、ネクチン4リガンドへの結合により、正常な細胞シグナル伝達、異常な細胞シグナル伝達、又は過剰な細胞シグナル伝達が引き起こされる。一部の実施形態では、ネクチン4媒介性疾患とは、ネクチン4を、対象、例えば、ヒトにおけるバイオマーカーとして使用しうる疾患である。一部の実施形態では、ネクチン4媒介性疾患とは、ネクチン4の発現が、対象、例えば、ヒトにおける疾患の進行又は予後を反映しうる疾患である。ある特定の実施形態では、ネクチン4リガンドは、例えば、細胞の表面上に発現するネクチン4受容体である。
本明細書で使用される「血清力価」という用語は、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、又は少なくとも40例~最大で約100、1000、又はこれを超える対象の集団内の、平均血清力価を指す。
本明細書で使用される「副作用」という用語は、治療(例えば、予防剤又は治療剤)の、望ましくない作用及び有害作用を包含する。望ましくない作用は、必ずしも有害ではない。治療(例えば、予防剤又は治療剤)に由来する有害作用は、害を及ぼす場合もあり、不快な場合もあり、危険な場合もある。副作用の例は、下痢、咳、胃腸炎、喘鳴、悪心、嘔吐、拒食症、腹部痙攣、発熱、疼痛、体重の減少、脱水、禿頭、呼吸困難、不眠、めまい、粘膜炎、神経作用及び筋肉作用、疲労感、口渇、並びに食欲不振、投与部位における発赤又は腫脹、発熱、悪寒、及び疲労感などの流感様症状、消化管問題、並びにアレルギー反応を含む。患者により経験される、さらなる所望されない効果は、多数であり、当技術分野で公知である。多くは、医師便覧(60版、2006)において記載されている。
本明細書で使用される、「治療剤」という用語は、ネクチン4媒介性疾患及び/又はこれと関連する症状の処置、管理、又は改善において使用されうる、任意の薬剤を指す。ある特定の実施形態では、「治療剤」という用語は、本明細書で提供される抗体を指す。ある特定の他の実施形態では、「治療剤」という用語は、本明細書で提供される抗体以外の薬剤を指す。一部の実施形態では、治療剤は、ネクチン4媒介性疾患又は1又は複数のこれと関連する症状の処置、管理、又は改善に有用であることが公知であるか、又はこのために使用されたことがあるか、若しくは現在使用されつつある薬剤である。
治療(例えば、予防剤又は治療剤の使用)の組合せは、2つ又はこれを超える、任意の単剤療法の相加効果より有効である。例えば、予防剤及び/又は治療剤の組合せによる相乗効果は、単剤単独より有効であり、且つ/或いはネクチン4媒介性疾患を伴う対象に対する、薬剤のうちの1若しくは複数の低投与量、及び/又は前記薬剤の低投与頻度の使用を可能とする。低投与量の予防的治療若しくは治療的治療を利用し、且つ/又は前記治療を低頻度で投与する能力は、ネクチン4媒介性疾患の防止、管理、処置、又は改善における、前記治療の有効性を低減せずに、対象への前記治療の投与と関連する毒性を軽減する。加えて、相乗効果は、ネクチン4媒介性疾患の防止、又は管理、処置、若しくは改善における治療の有効性の改善を結果としてもたらしうる。最後に、治療(例えば、予防剤又は治療剤)の組合せによる相乗効果は、任意の単剤療法の使用と関連する、有害であるか、又は望ましくない副作用を回避又は軽減しうる。
ある特定の実施形態では、「治療的に有効な血清力価」とは、ヒトなどの対象における血清力価であって、前記対象における、ネクチン4媒介性疾患と関連する重症度、持続時間、及び/又は症状を軽減する、上記血清力価である。
本明細書で使用される、「治療」という用語は、ネクチン4媒介性疾患の防止、管理、処置、及び/又は改善において使用されうる、任意のプロトコール、方法、及び/又は薬剤を指す。ある特定の実施形態では、「複数の治療」及び「治療」という用語は、医療従事者などの当業者に公知である、ネクチン4媒介性疾患の防止、管理、処置、及び/又は改善に有用な、生物療法、支持療法、及び/又は他の治療を指す。
本明細書で使用される、「~を処置する」、「処置」、及び「~を処置すること」という用語は、1又は複数の治療(本明細書で提供される抗体など、1又は複数の予防剤又は治療剤の投与を含むがこれらに限定されない)の投与から結果として得られる、ネクチン4媒介性疾患の、進行、重症度、及び/又は持続時間の軽減又は改善を指す。
本明細書で使用される、「~を管理する」、「~を管理すること」、及び「管理」という用語は、対象が、治療(例えば、予防剤又は治療剤)から導出する、有益な効果であって、ネクチン4と関連する状態の治癒を結果としてもたらすわけではない、上記効果を指す。ある特定の実施形態では、状態又は障害の進行又は増悪を防止するように、対象に、1又は複数の治療(本明細書で記載される抗体などの、予防剤又は治療剤)を投与して、本明細書で記載される状態又は障害、これらの1又は複数の症状「を管理する」。
本明細書で使用される「~を防止する」、「~を防止すること」、及び「防止」という用語は、ネクチン4媒介性疾患及び/又はこれと関連する症状の、発症、再発、発病、又は拡大の、完全な阻害又は部分的な阻害であって、本明細書で提供される治療又は治療の組合せの投与(本発明の抗体など、予防剤又は治療剤の組合せ)の結果として得られる、上記阻害を指す。
本明細書で使用される、「~を投与する」又は「投与」とは、経粘膜送達、外用送達、皮内送達、非経口送達、静脈内送達、皮下送達、筋内送達、及び/又は本明細書で記載されているか、若しくは当技術分野で公知である、物理的送達の、他の任意の方法などにより、物質(例えば、本明細書で記載される抗ネクチン4抗体又はその抗原結合性断片)を、対象又は患者(例えば、ヒト)へと注射するか、又は他の形で物理的に送達する行為を指す。
本明細書で使用される、「有効量」又は「治療有効量」という用語は、所与の状態、障害、若しくは疾患及び/又はこれらと関連する症状の重症度及び/又は持続時間を軽減及び/又は改善するのに十分な量の治療(例えば、本明細書で提供される抗体又は医薬組成物)を指す。これらの用語はまた、所与の疾患の悪化若しくは進行の軽減、緩徐化、若しくは改善、所与の疾患の再発、発症、若しくは発病の軽減、緩徐化、若しくは改善のために、且つ/又は別の治療(例えば、本明細書で提供される抗ネクチン4抗体以外の治療)予防効果若しくは治療効果(単数又は複数)を改善若しくは増強するのに必要な量も包含する。一部の実施形態では、本明細書で使用される「有効量」はまた、指定された結果を達成するための、本明細書で記載される抗体の量も指す。
本明細書の、ネクチン4抗原に免疫特異的に結合する抗体を含む液体製剤の文脈で使用される「安定性」及び「安定的」という用語は、所与の製造条件、調製条件、輸送条件、及び保存条件下における、製剤中の抗体の、熱的アンフォールディング及び化学的アンフォールディング、凝集、分解、又は断片化に対する耐性を指す。本明細書で提供される「安定的」製剤は、所与の製造条件、調製条件、輸送条件、及び保存条件下で、80%、85%、90%、95%、98%、99%、又は99.5%以上の生物学的活性を保持する。抗体の安定性は、還元型キャピラリーゲル電気泳動(rCGE)、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)、及びHPSECを含むがこれらに限定されない、当業者に公知の方法を介した、凝集、分解、又は断片化の、基準抗体と比較した程度により評価することができる。ネクチン4抗原に免疫特異的に結合する抗体を含む製剤の全体的安定性は、ネクチン4の特異的エピトープを使用する、多様な免疫学的アッセイであって、例えば、ELISA及びラジオイムノアッセイを含む上記免疫学的アッセイにより評価することができる。一部の例示的製剤では、抗ネクチン4抗体は、2カ月間、4カ月間、6カ月間、8カ月間、10カ月間、1年間、18カ月間、2年間、3年間、又はこれを超える期間にわたり安定でありうる。
本明細書で使用される「界面活性剤を実質的に含まない」という用語は、ネクチン4抗原に免疫特異的に結合する抗体の製剤であって、界面活性剤のうちの0.0005%未満、0.0003%未満、若しくは0.0001%未満、及び/又は界面活性剤のうちの0.0005%未満、0.0003%未満、若しくは0.0001%未満を含有する、上記製剤を指す。
本明細書で使用される「塩を実質的に含まない」という用語は、ネクチン4抗原に免疫特異的に結合する抗体の製剤であって、無機塩のうちの0.0005%未満、0.0003%未満、又は0.0001%未満を含有する、上記製剤を指す。
本明細書で使用される「無機塩」という用語は、炭素を含有しない、任意の化合物であって、酸の水素又は酸の一部又は全部の、金属又は金属と同様に作用する基による置きかえから生じ、生物学的材料による医薬組成物中及び調製物中で、張性調整化合物として使用されることが多い、上記化合物を指す。最も一般的な無機塩は、NaCl、KCl、NaH2PO4などである。
本明細書で使用される「界面活性剤」という用語は、有機物質を有する両親媒性構造を指す;すなわち、界面活性剤は、反対の可溶性傾向基、典型的に、油溶性炭化水素鎖及び水溶性イオン基から構成される。界面活性剤は、表面活性部分の電荷に応じて、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、及び非イオン性界面活性剤へと分類することができる。界面活性剤は、生物学的材料による、多様な医薬組成物及び調製物のための、保湿剤、乳化剤、可溶化剤、及び分散剤として使用されることが多い。
8.組成物及びこれを作製する方法
本明細書では、ネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチド断片、又はネクチン4エピトープに免疫特異的に結合する抗体が提供される。また、ネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチド断片、又はネクチン4エピトープに免疫特異的に結合する抗体をコードする単離核酸も提供される。ネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチド断片、又はネクチン4エピトープに免疫特異的に結合する抗体をコードする核酸を含むベクター及び宿主細胞もさらに提供される。また、ネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチド断片、又はネクチン4エピトープに免疫特異的に結合する抗体を作製する方法も提供される。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒトネクチン4及び/又はカニクイザルネクチン4に結合する。一実施形態では、ネクチン4抗体は、ヒトネクチン4に結合する。一実施形態では、ネクチン4抗体は、カニクイザルネクチン4に結合する。一実施形態では、ネクチン4抗体は、ヒトネクチン4及びカニクイザルネクチン4の両方に結合する。他の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、齧歯動物ネクチン4に結合しない。
一部の実施形態では、抗ネクチン4抗体は、ネクチン4の細胞外ドメイン(ECD)に結合する。ある特定の実施形態では、抗ネクチン4抗体は、ネクチン4リガンド結合性部位とは別個である、ネクチン4のECD内のエピトープに結合する。
また、本明細書で提供される抗ネクチン4抗体の、ネクチン4ポリペプチドへの結合を競合的に遮断する抗体も提供される。
また、ネクチン4ポリペプチドへの結合について、本明細書で提供される抗ネクチン4抗体と競合する抗体も提供される。
一部の実施形態では、抗ネクチン4抗体は、ネクチン4リガンドの、ネクチン4ポリペプチドへの結合を遮断しない。
一部の実施形態では、抗ネクチン4抗体は、ネクチン4リガンドと、ネクチン4ポリペプチドへの結合について競合しない。
ある特定の実施形態では、ネクチン4リガンドの、ネクチン4への結合は、抗体により阻害されない。
本明細書で提供される抗ネクチン4抗体はまた、例えば、診断剤、検出剤、及び/又は薬剤へとコンジュゲートさせるか、又は組換えにより融合させることもできる。抗ネクチン4抗体を含む組成物もさらに提供される。
本明細書ではまた、ネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチド断片、ネクチン4ペプチド、又はネクチン4エピトープに結合する抗ネクチン4抗体の免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、VH領域、VL領域、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及び/又はVL CDR3をコードする単離核酸分子も提供される。
ネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチド断片、ネクチン4ペプチド、又はネクチン4エピトープに結合する抗ネクチン4抗体をコードする核酸分子を含むベクター及び宿主細胞もさらに提供される。また、ネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチド断片、ネクチン4ペプチド、又はネクチン4エピトープに結合する抗体を作製する方法も提供される。
一実施形態では、本開示は、本明細書で診断剤として使用されうる抗ネクチン4抗体を提供する。例示的抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及びヘテロコンジュゲート抗体のほか、アフィニティー又は他の特性を改善した、これらの変異体を含む。
9.抗ネクチン4抗体
本明細書で提供される抗体は、合成抗体、モノクローナル抗体、組換えにより作製された抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二特異性抗体、イントラボディー、単鎖Fv(scFv)、ラクダ化抗体、Fab断片、F(ab’)断片、ジスルフィド連結Fv(sdFv)、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、及び上記のうちのいずれかのエピトープ結合性断片を含むがこれらに限定されない。
特に、本明細書で提供される抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、ネクチン4抗原に免疫特異的に結合する抗原結合性部位を含有する分子を含む。本明細書で提供される免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の、任意の種類(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)、又はサブクラスの分子でありうる。具体的な実施形態では、本明細書で提供される抗体は、IgG1抗体などのIgG抗体である。
抗体の変異体及び誘導体は、エピトープに特異的に結合する能力を保持する抗体断片を含む。例示的な断片は、Fab断片(抗原結合性ドメインを含有し、ジスルフィド結合により架橋された、軽鎖及び重鎖の一部を含む抗体断片);Fab’(例えば、Fabと、ヒンジ領域を介する重鎖のさらなる部分とを含む、単一の抗原結合性ドメインを含有する抗体断片);F(ab’)2(重鎖のヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合により接合させた、2つのFab’分子;Fab’分子は、同じエピトープを指向する場合もあり、異なるエピトープを指向する場合もある);sFvとしてもまた公知である、可変領域を含む単鎖のFab鎖(10~25アミノ酸の鎖により、一体に連結された、抗体の単一の軽鎖及び重鎖の可変性の抗原結合性決定領域);ジスルフィド連結Fv又はdsFv(ジスルフィド結合により、一体に連結された、抗体の単一の軽鎖及び重鎖の可変性の抗原結合性決定領域);ラクダ化VH(VHインターフェースにおける一部のアミノ酸が、天然に存在するラクダ抗体の重鎖内で見出される抗体の単一の重鎖の可変性の抗原結合性決定領域);ダイアボディー(第1のsFvのVHドメインが、第2のsFvのVLドメインと共にアセンブルされ、第1のsFvのVLドメインが、第2のsFvのVHドメインと共にアセンブルされる場合に形成される、二量体化sFv;ダイアボディーの2つの抗原結合性領域は、同じエピトープを指向する場合もあり、異なるエピトープを指向する場合もある);及びトリアボディー(ダイアボディーと同様に形成されるが、3つの抗原結合性ドメインが、単一の複合体内で創出される、三量体化sFv;3つの抗原結合性領域は、同じエピトープを指向する場合もあり、異なるエピトープを指向する場合もある)を含む。抗体の誘導体はまた、抗原結合性部位の、1又は複数のCDR配列も含む。2つ又はこれを超えるCDR配列が存在する場合、CDR配列は、足場上に、併せて連結することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、単鎖Fv(「scFv」)を含む。scFvは、抗体のVHドメイン及びVLドメインを含む抗体断片であり、この場合、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、scFvポリペプチドは、scFvが、抗原結合に所望される構造を形成することを可能とする、VHドメインと、VLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。scFvの総説については、Pluckthun、「モノクローナル抗体の薬理学(Pharmacology of Monoclonal Antibodies)」、113巻、Rosenburg及びMoore編、Springer-Verlag、New York、269~315頁(1994)を参照されたい。
本明細書で提供される抗体は、鳥類及び哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、又はニワトリ)を含む、任意の動物に由来しうる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体である。本明細書で使用される、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリー、又は抗体をヒト遺伝子から発現するマウスから単離された抗体を含む。
ある特定の実施形態では、抗体は、完全ヒトネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチド断片、又はネクチン4エピトープに免疫特異的に結合する抗体など、完全ヒト抗体である。このような完全ヒト抗体であれば、対象へと投与する場合、非完全ヒト抗体(例えば、他の種に由来する抗ネクチン4抗体)を指向する免疫応答など、望ましくないか、又は不要な副作用の発生を最小化するのに、完全マウス(又は他の完全非ヒト種抗体若しくは部分的な非ヒト種抗体)、ヒト化抗体、又はキメラ抗体より有利であろう。
一実施形態では、本明細書で提供される抗体は、それらの各々が、ネクチン4上の、異なるエピトープを指向する、2つの抗体又はその抗原結合性断片を有する、二特異性抗体又はその抗原結合性断片を含みうる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ネクチン4ポリペプチドの所与のエピトープに対して、単一特異性であり、他のエピトープに免疫特異的に結合しない。
本明細書の一部の実施形態では、ネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチド断片、ネクチン4ペプチド、又はネクチン4エピトープを含むネクチン4に結合する抗体が提供される。一実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒトネクチン4に結合する。別の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、カニクイザルネクチン4に結合する。別の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒトネクチン4及びカニクイザルネクチン4に結合する。一部の実施形態では、抗ネクチン4抗体は、ネクチン4リガンドの、ネクチン4ポリペプチドへの結合を遮断しない。他の実施形態では、抗ネクチン4抗体は、ネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチド断片、ネクチン4ペプチド、又はネクチン4エピトープを含むネクチン4に結合するヒト化抗体(例えば、ヒト定常領域を含む)である。
一実施形態では、本明細書で提供される抗体、又は抗体を含む組成物、及び抗体を使用する方法は、M22-321b41.1抗体を含む。本明細書ではまた、M22-321b41.1抗体を産生するハイブリドーマも提供される。一部の実施形態では、M22-321b41.1抗体を、M22-321b41.1ハイブリドーマ細胞系から作製する。一部の実施形態では、M22-321b41.1抗体は、マウスIgG2a/カッパアイソタイプを有する。
M22-321b41.1とは、マウス由来のハイブリドーマ細胞系である。M22-321b41.1ハイブリドーマ細胞系は、2017年6月13日に寄託された(ATCC受託番号:PTA-124245)。
ある特定の実施形態では、抗ネクチン4抗体は、表1で描示されたアミノ酸配列など、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のVH領域、VL領域、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及び/又はVL CDR3を含む。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される単離抗体又はその機能的断片は、抗ネクチン4抗体であるM22-321b41.1に由来する、1つ、2つ、及び/若しくは3つの重鎖CDR、並びに/又は1つ、2つ、及び/若しくは3つの軽鎖CDRを含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、6つのCDR、例えば、表1で同定された、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及び/又はVL CDR3を含むか、又はこれらからなる。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、6つより少ないCDRを含みうる。一部の実施形態では、抗体は、表1で同定された、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及び/又はVL CDR3からなる群から選択される、1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つのCDRを含むか、又はこれらからなる。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体であるM22-321b41.1の、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及び/又はVL CDR3からなる群から選択される、1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つのCDRを含むか、又はこれらからなる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、表1に列挙された、1又は複数の(例えば、1つ、2つ、又は3つの)VH CDRを含む。他の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、表1に列挙された、1又は複数の(例えば、1つ、2つ、又は3つの)VL CDRを含む。さらに他の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、表1に列挙された、1又は複数の(例えば、1つ、2つ、又は3つの)VH CDRと、表1に列挙された、1又は複数のVL CDRとを含む。したがって、一部の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1を含む。一部の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2を含む。一部の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3を含む。一部の実施形態では、抗体は、表1に描示された、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3アミノ酸配列(単数又は複数)のうちのいずれか1つから独立に選択される、VH CDR1及び/又はVH CDR2及び/又はVH CDR3を含む。一部の実施形態では、抗体は、Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む。別の実施形態では、抗体は、Kabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。一部の実施形態では、抗体は、Kabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。一部の実施形態では、抗体は、表1に描示された、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3アミノ酸配列のうちのいずれか1つから独立に選択される、VL CDR1及び/又はVL CDR2及び/又はVL CDR3を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、(1)Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;(2)Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;並びに(3)Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3を含むVH領域と;(1)Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;(2)Kabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びに(3)Kabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含むVL領域とを含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、(1)Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;(2)Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;並びに(3)Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3を含むVH領域を含む。
他の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、(1)Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;(2)Kabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びに(3)Kabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含むVL領域を含む。
本明細書ではまた、表1に列挙された1又は複数の(例えば、1つ、2つ、又は3つの)VH CDRと、1又は複数の(例えば、1つ、2つ、又は3つの)VL CDRとを含む抗体も提供される。特に、本明細書では、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;並びにKabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む抗体が提供される。一実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;並びにKabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。他の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。別の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;並びにKabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む。一部の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;並びにKabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。一実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、
Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。別の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;並びにKabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む。他の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;並びにKabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。一部の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。別の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VH CDR2(配列番号19)、
Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;並びにKabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む。一実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;並びにKabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。他の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。別の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、
Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;並びにKabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む。一部の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;並びにKabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。一実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。
別の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;並びにKabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む。他の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;並びにKabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。一部の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、
Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。別の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;並びにKabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。一実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。
他の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。別の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;並びにKabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。一部の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。一実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR2(配列番号19)、
Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。別の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;並びにKabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。他の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。一部の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR3(配列番号23)、
Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;Kabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。別の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;並びにKabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む。一実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VH CDR2(配列番号19)、
Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;並びにKabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。他の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。別の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VL CDR1(配列番号7)、
Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;並びにKabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。一部の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。一実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;、Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、
Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。別の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;並びにKabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。他の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、
Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。一部の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;Kabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。別の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;並びにKabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。一実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。他の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;Kabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、
及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。別の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;並びにKabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。一部の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、
及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。一実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;Kabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、
及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。別の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;Kabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。他の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;Kabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、
Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。一部の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;Kabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。別の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR1(配列番号15)、Chothia VH CDR1(配列番号16)、Contact VH CDR1(配列番号17)、及び例示的VH CDR1(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;Kabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、
及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。一実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR2(配列番号19)、Chothia VH CDR2(配列番号20)、Contact VH CDR2(配列番号21)、及び例示的VH CDR2(配列番号18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;Kabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。他の実施形態では、抗体は、Kabat VH CDR3(配列番号23)、Chothia VH CDR3(配列番号23)、Contact VH CDR3(配列番号24)、及び例示的VH CDR3(配列番号22)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;Kabat VL CDR1(配列番号7)、Chothia VL CDR1(配列番号7)、Contact VL CDR1(配列番号8)、及び例示的VL CDR1(配列番号7)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;Kabat VL CDR2(配列番号10)、Chothia VL CDR2(配列番号10)、Contact VL CDR2(配列番号11)、及び例示的VL CDR2(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びにKabat VL CDR3(配列番号12)、Chothia VL CDR3(配列番号12)、Contact VL CDR3(配列番号13)、及び例示的VL CDR3(配列番号12)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。別の実施形態では、抗体は、表1に列挙された、VH CDRと、VL CDRとの任意の組合せを含む。
本明細書で記載されるフレームワーク領域は、CDR番号付けシステムの境界部に基づいて決定する。言い換えれば、CDRを、例えば、Kabat、IMGT、又はChothiaにより決定する場合、フレームワーク領域は、N末端から、C末端へと:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4のフォーマットで、可変領域内のCDRを取り囲むアミノ酸残基である。例えば、FR1は、例えば、Kabat番号付けシステム、IMGT番号付けシステム、又はChothia番号付けシステムにより規定される通り、CDR1のアミノ酸残基に対してN末端側のアミノ酸残基として規定され、FR2は、例えば、Kabat番号付けシステム、IMGT番号付けシステム、又はChothia番号付けシステムにより規定される通り、CDR1のアミノ酸残基と、CDR2のアミノ酸残基との間のアミノ酸残基として規定され、FR3は、例えば、Kabat番号付けシステム、IMGT番号付けシステム、又はChothia番号付けシステムにより規定される通り、CDR2のアミノ酸残基と、CDR3のアミノ酸残基との間のアミノ酸残基として規定され、FR4は、例えば、Kabat番号付けシステム、IMGT番号付けシステム、又はChothia番号付けシステムにより規定される通り、CDR3のアミノ酸残基に対してC末端側のアミノ酸残基として規定される。
一部の実施形態では、本明細書で提供される単離抗体又はその機能的断片は、表2に示された抗体であるM22-321b41.1に由来する、1つ、2つ、3つ、及び/若しくは4つの重鎖FR、並びに/又は1つ、2つ、3つ、及び/若しくは4つの軽鎖FRをさらに含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される単離抗体又はその機能的断片は、表2に示された抗体であるM22-321b41.1に由来する、1つ、2つ、3つ、及び/又は4つの重鎖FRをさらに含む。一部の実施形態では、抗体の重鎖FR(単数又は複数)は、抗体であるM22-321b41.1に由来する。
一部の実施形態では、本明細書で提供される単離抗体又はその機能的断片は、表2に示された抗体であるM22-321b41.1に由来する、1つ、2つ、3つ、及び/又は4つの軽鎖FRをさらに含む。一部の実施形態では、抗体の軽鎖FR(単数又は複数)は、抗体であるM22-321b41.1に由来する。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体又はその断片は、(1)配列番号29のアミノ酸配列を有するVH FR1;(2)配列番号30のアミノ酸配列を有するVH FR2;(3)配列番号31のアミノ酸配列を有するVH FR3;及び/又は(4)配列番号32のアミノ酸配列を有するVH FR4を含むVH領域を含む。具体的な実施形態では、抗体は、上記で言及したVH FR1、VH FR2、VH FR3、及びVH FR4の4つ全てを含むVH領域を含む。
したがって、一実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号29のアミノ酸配列を有するVH FR1を含むVH領域を含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号30のアミノ酸配列を有するVH FR2を含むVH領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号31のアミノ酸配列を有するVH FR3を含むVH領域を含む。他の実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号32のアミノ酸配列を有するVH FR4を含むVH領域を含む。
一部の実施形態では、VL領域は、(1)配列番号25のアミノ酸配列を有するVL FR1;(2)配列番号26のアミノ酸配列を有するVL FR2;(3)配列番号27のアミノ酸配列を有するVL FR3;及び/又は(4)配列番号28のアミノ酸配列を有するVL FR4を含む。
したがって、一部の実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号25のアミノ酸配列を有するVL FR1を含むVL領域を含む。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号26のアミノ酸配列を有するVL FR2を含むVL領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号27のアミノ酸配列を有するVL FR3を含むVL領域を含む。さらに他の実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号28のアミノ酸配列を有するVL FR4を含むVL領域を含む。
一部の実施形態では、抗体又はその断片は、VH領域と、VL領域とを含み、この場合、VH領域は、(1)配列番号29のアミノ酸配列を有するVH FR1;(2)配列番号30のアミノ酸配列を有するVH FR2;(3)配列番号31のアミノ酸配列を有するVH FR3;及び/又は(4)配列番号32のアミノ酸配列を有するVH FR4を含み;VL領域は、(1)配列番号25のアミノ酸配列を有するVL FR1;(2)配列番号26のアミノ酸配列を有するVL FR2;(3)配列番号27のアミノ酸配列を有するVL FR3;及び/又は(4)配列番号28のアミノ酸配列を有するVL FR4を含む。一部の実施形態では、抗体は、上記で言及したVH FR1、VH FR2、VH FR3、及びVH FR4の4つ全てを含むVH領域を含む。他の実施形態では、抗体は、上記で言及したVL FR1、VL FR2、VL FR3、及びVL FR4の4つ全てを含むVL領域を含む。さらに他の実施形態では、抗体は、上記で言及したVH FR1、VH FR2、VH FR3、及びVH FR4の4つ全てを含むVH領域と、上記で言及したVL FR1、VL FR2、VL FR3、及びVL FR4の4つ全てを含むVL領域とを含む。
本明細書ではまた、表2に列挙された、1又は複数の(例えば、1つ、2つ、3つ、又は4つの)VH FRと、1又は複数の(例えば、1つ、2つ、3つ、又は4つの)VL FRとを含む抗体も提供される。特に、本明細書では、VH FR1(配列番号29)と、VL FR1(配列番号25)とを含む抗体が提供される。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VL FR1(配列番号25)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)とを含む。
他の実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR4(配列番号32)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR4(配列番号32)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VL FR1(配列番号25)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。
一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。
一部の実施形態では、抗体は、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR4(配列番号32)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。
他の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)とVL FR4(配列番号28)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。
別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、
VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。
一実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。
他の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。
別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。
一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。
一実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。
一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。
一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。
一実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。
一実施形態では、抗体はVH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。
一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。
一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。
別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。
一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。別の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR2(配列番号30)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。他の実施形態では、抗体は、VH FR1(配列番号29)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。
一実施形態では、抗体は、VH FR2(配列番号30)と、VH FR3(配列番号31)と、VH FR4(配列番号32)と、VL FR1(配列番号25)と、VL FR2(配列番号26)と、VL FR3(配列番号27)と、VL FR4(配列番号28)とを含む。一部の実施形態では、抗体は、表2に列挙された、VH FR(配列番号29~32)と、VL FR(配列番号25~28)との任意の組合せを含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、VH領域又はVHドメインを含む。他の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、VL領域又はVLドメインを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、(i)VHドメイン若しくはVH領域;及び/又は(ii)VLドメイン若しくはVL領域の組合せを有する。さらに他の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、表1に明示された、配列番号3及び4からなる群から選択される、(i)VHドメイン若しくはVH領域;及び/又は(ii)VLドメイン若しくはVL領域の組合せを有する。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、(1)配列番号15のアミノ酸配列を有するVH CDR1;(2)配列番号19のアミノ酸配列を有するVH CDR2;及び(3)配列番号23のアミノ酸配列を有するVH CDR3を含むVH領域と;表1に明示された配列番号3からなる群から選択されるVL領域とを含む。
他の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、表1に明示された配列番号4からなる群から選択されるVH領域と;(1)配列番号7のアミノ酸配列を有するVL CDR1;(2)配列番号10のアミノ酸配列を有するVL CDR2;及び(3)配列番号12のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含むVL領域とを含む。
本明細書ではまた、ネクチン4ポリペプチド、ネクチン4ポリペプチド断片、ネクチン4ペプチド、又はネクチン4エピトープに結合する抗ネクチン4抗体の免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、VH領域、VL領域、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及び/又はVL CDR3をコードする単離核酸分子も提供される。抗体であるM22-321b41.1の、VL領域、軽鎖、VH領域、及び重鎖についての例示的核酸配列を、表3~4に示す。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、抗体であるM22-321b41.1の、VHアミノ酸配列と、VLアミノ酸配列とを有する。一部の実施形態では、抗体は、配列番号4のVHアミノ酸配列と、配列番号3のVLアミノ酸配列とを含む。
ある特定の実施形態では、ネクチン4ポリペプチド(例えば、ネクチン4、例えば、ヒトネクチン4のECD)に特異的に結合する、本明細書で記載される抗体又はその抗原結合性断片は、軽鎖と重鎖とを含み、この場合、軽鎖は、
GASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEY ERHNSYTCEATHKTSTSPIVKTFNRNEC(配列番号33)
のアミノ酸配列を有する定常領域を含む。
ある特定の実施形態では、ネクチン4ポリペプチド(例えば、ネクチン4、例えば、ヒトネクチン4のECD)に特異的に結合する、本明細書で記載される抗体又はその抗原結合性断片は、軽鎖と重鎖とを含み、この場合、重鎖は、
(配列番号34)
のアミノ酸配列を有する定常領域を含む。
他の実施形態では、ネクチン4ポリペプチド(例えば、ネクチン4、例えば、ヒトネクチン4のECD)に特異的に結合する、本明細書で記載される抗体又はその抗原結合性断片は、軽鎖と重鎖とを含み、この場合、重鎖は、
(配列番号35)
のアミノ酸配列を有するヒトIgG1 Fc領域を含む。
一部の実施形態では、ネクチン4ポリペプチド(例えば、ネクチン4、例えば、ヒトネクチン4のECD)に特異的に結合する、本明細書で記載される抗体又はその抗原結合性断片は、軽鎖と重鎖とを含み、この場合、重鎖は、配列番号35のアミノ酸配列を有するヒトIgG1 Fc領域を含まない。
さらに別の実施形態では、ネクチン4ポリペプチド(例えば、ネクチン4、例えば、ヒトネクチン4のECD)に特異的に結合する、本明細書で記載される抗体又はその抗原結合性断片は、軽鎖と重鎖とを含み、この場合、軽鎖は、配列番号33のアミノ酸配列を有する定常領域を含み;重鎖は、配列番号35のアミノ酸配列を有するFc領域を含む。
ある特定の実施形態では、ネクチン4ポリペプチド(例えば、ネクチン4、例えば、ヒトネクチン4のECD)に特異的に結合する、本明細書で記載される抗体は、軽鎖と重鎖とを含み、この場合、軽鎖は、以下:
(配列番号5)
の通りのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ネクチン4ポリペプチド(例えば、ネクチン4、例えば、ヒトネクチン4のECD)に特異的に結合する、本明細書で記載される抗体は、軽鎖と重鎖とを含み、この場合、重鎖は、以下:
(配列番号6)
の通りのアミノ酸配列を含む。
特定の一実施形態では、ネクチン4ポリペプチド(例えば、ネクチン4、例えば、ヒトネクチン4のECD)に特異的に結合する、本明細書で記載される抗体は、軽鎖と重鎖とを含み、この場合、(i)軽鎖は、配列番号5のアミノ酸配列を含み;(ii)重鎖は、配列番号6のアミノ酸配列を含む。
さらに別の態様では、例示される抗体又は機能的断片のうちの1つと、ネクチン4への結合について競合する抗体が提供される。このような抗体はまた、本明細書で例示される抗体、又は重複するエピトープのうちの1つと同じエピトープにも結合しうる。例示される抗体と同じエピトープと競合するか、又はこれに結合する、抗体及び断片は、類似する機能的特性を示すことが予測される。例示される抗原結合性タンパク質及び断片は、表1におけるVH領域及びVL領域、並びにCDRを含む、本明細書で提供される、VH領域及びVL領域、並びにCDRを伴う、抗原結合性タンパク質及び断片を含む。したがって、具体例として、提供される抗体は、(a)表1に列挙された抗体について列挙されるCDRのうちの、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又は6つ全て;(b)表1に列挙された抗体について列挙されるVH領域及びVL領域から選択される、VH及びVL;又は(c)表1に列挙された抗体について指定されるVH及びVLを含む、2つの軽鎖及び2つの重鎖を含む抗体と競合する抗体を含む。一部の実施形態では、抗体は、抗体であるM22-321b41.1である。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体、又はその抗原結合性断片は、抗体であるM22-321b41.1と比べて、ある特定のパーセント同一性を伴うアミノ酸配列を含む。
2つの配列(例えば、アミノ酸配列又は核酸配列)の間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達することができる。2つの配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin及びAltschul、1993、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、90:5873~5877において改変された、Karlin及びAltschul、1990、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、87:2264~2268のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschulら、1990、J.Mol.Biol.、215:403のNBLASTプログラム及びXBLASTプログラムへと組み込まれている。例えば、スコア=100、ワード長=12とする、NBLASTによるヌクレオチドプログラムのパラメーターセットにより、BLASTによるヌクレオチド検索を実施して、本明細書で記載される核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。例えば、スコア=50、ワード長=3とする、XBLASTによるプログラムのパラメーターセットにより、BLASTによるタンパク質検索を実施して、本明細書で記載される核酸分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的として、ギャップを施したアライメントを得るために、Gapped BLASTを、Altschulら、1997、Nucleic Acids Res.、25:3389~3402において記載されている通りに利用することができる。代替的に、PSI Blastを使用して、分子間の遠隔の関係を検出する、繰り返し検索を実施することもできる(同上)。BLASTプログラム、Gapped BLASTプログラム、及びPSI Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムの(例えば、XBLAST及びNBLASTの)デフォルトのパラメーターを使用することができる(例えば、インターネットのhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov上の、National Center for Biotechnology Information(NCBI)を参照されたい)。配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの、別の好ましい、非限定的な例は、Myers及びMiller、1988、CABIOS、4:1117のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version 2.0)へと組み込まれている。アミノ酸配列を比較するために、ALIGNプログラムを利用する場合、PAM120重み残基表、ギャップ長ペナルティー=12、及びギャップペナルティー=4を使用することができる。
2つの配列の間の同一性パーセントは、ギャップを許容するか又はギャップを許容しない、上記で記載した技法と類似の技法を使用して決定することができる。同一性パーセントの計算では、正確なマッチだけをカウントする。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体、又はその抗原結合性断片は、配列番号3のアミノ酸配列に対する、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも98%の配列同一性を有するVLドメインを含み、この場合、抗体は、ネクチン4に免疫特異的に結合する。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体、又はその抗原結合性断片は、配列番号3のアミノ酸配列に対する、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも98%の配列同一性を有するVLドメインを含み、この場合、抗体は、ネクチン4に免疫特異的に結合し、且つ、抗体は、抗体であるM22-321b41.1のCDR(例えば、VL CDR 1~3)と同一なCDR(例えば、VL CDR 1~3)を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体、又はその抗原結合性断片は、配列番号3のフレームワーク領域のアミノ酸配列に対する、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも98%の配列同一性を有するVLフレームワーク領域を含むVLドメインを含み、この場合、抗体は、ネクチン4に免疫特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、抗体であるM22-321b41.1のVL CDRと同一なVL CDRを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体、又はその抗原結合性断片は、配列番号4のアミノ酸配列に対する、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも98%の配列同一性を有するVHドメインを含み、この場合、抗体は、ネクチン4に免疫特異的に結合する。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体、又はその抗原結合性断片は、配列番号4のアミノ酸配列に対する、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも98%の配列同一性を有するVHドメインを含み、この場合、抗体は、ネクチン4に免疫特異的に結合し、且つ、抗体は、抗体であるM22-321b41.1のCDR(例えば、VH CDR1~3)と同一なCDR(例えば、VH CDR1~3)を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体、又はその抗原結合性断片は、配列番号4のフレームワーク領域のアミノ酸配列に対する、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも98%の配列同一性を有するVHフレームワーク領域を含むVHドメインを含み、この場合、抗体は、ネクチン4に免疫特異的に結合する。具体的な実施形態では、このような抗体は、抗体であるM22-321b41.1のCDR(例えば、VH CDR1~3)と同一なCDR(例えば、VH CDR1~3)を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体、又はその抗原結合性断片は、(i)配列番号3のアミノ酸配列に対する、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも98%の配列同一性を有するVLドメイン、及び(ii)配列番号4のアミノ酸配列に対する、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも98%の配列同一性を有するVHドメインのそれぞれを含み、この場合、抗体は、ネクチン4に免疫特異的に結合する。具体的な実施形態では、このような抗体又はその抗原結合性断片は、抗体であるM22-321b41.1のCDR(例えば、VL CDR 1~3及び/又はVH CDR1~3)と同一なCDR(例えば、VL CDR 1~3及び/又はVH CDR1~3)を含む。
別の態様では、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片は、ヒトネクチン4のエピトープを含む領域に結合する。例えば、一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒトネクチン4のアミノ酸残基31~346(配列番号2)を含む、ヒトネクチン4(配列番号1)の領域、アミノ酸残基1~150(配列番号45)を含む、ヒトネクチン4(配列番号1)の領域、又はアミノ酸残基31~150(配列番号46)を含む、ヒトネクチン4(配列番号1)の領域に結合する。さらに別の態様では、本明細書で提供される抗体は、ヒトネクチン4の特異的エピトープに結合する。ヒトネクチン4(配列番号1)の、アミノ酸残基31~346のアミノ酸配列は、
(配列番号2)である。ヒトネクチン4(配列番号1)の、アミノ酸残基1~150のアミノ酸配列は、
(配列番号45)である。ヒトネクチン4(配列番号1)の、アミノ酸残基31~150のアミノ酸配列は、
(配列番号46)である。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ネクチン4ポリペプチドの三次元表面特徴のネクチン4エピトープ(例えば、ネクチン4ポリペプチドの多量体形態における)に結合する。エピトープに寄与する、ネクチン4ポリペプチドの領域は、ポリペプチドの連続アミノ酸の場合もあり、エピトープは、ポリペプチドの、2つ又はこれを超える非連続領域から、一体となる場合もある。ネクチン4エピトープは、(a)ネクチン4の多量体形態(「多量体のネクチン4エピトープ」)、(b)ネクチン4の単量体形態(「単量体のネクチン4エピトープ」)、(c)ネクチン4の多量体形態及び単量体形態の両方、(d)ネクチン4の多量体形態であるが、単量体形態ではない形態、又は(e)ネクチン4の単量体形態であるが、多量体形態ではない形態において存在しうる。例えば、一部の実施形態では、エピトープは、多量体(天然)形態だけにおいて存在するか、又は抗ネクチン4抗体により結合可能であり、単量体(変性)形態において存在したり、抗ネクチン4抗体により結合可能であったりしない。他の実施形態では、ネクチン4エピトープは、ネクチン4ポリペプチドの直鎖状特徴(例えば、ネクチン4ポリペプチドの多量体形態又は単量体形態における)である。本明細書で提供される抗体は、(a)ネクチン4の、単量体形態のエピトープ、(b)ネクチン4の、多量体形態のエピトープ、(c)ネクチン4の、単量体形態であるが、多量体形態ではない形態のエピトープ、(d)ネクチン4の、多量体形態であるが、単量体形態ではない形態のエピトープ、又は(e)ネクチン4の単量体形態及び多量体形態の両方に免疫特異的に結合しうる。
本明細書ではまた、ネクチン4の、本明細書で記載される抗体であるM22-321b41.1と、同じであるか、又は重複するエピトープ(例えば、ヒトネクチン4のECD内に位置するエピトープ)に結合する抗体、例えば、ネクチン4(例えば、ヒトネクチン4のECD)への結合について、本明細書で記載される抗体であるM22-321b41.1と競合する(例えば、用量依存的に)か、又は本明細書で記載される抗体であるM22-321b41.1の、ネクチン4への結合(例えば、ヒトネクチン4のECD上に位置するエピトープ)を競合的に阻害する(例えば、用量依存的に)抗体も提供される。
本明細書の具体的な態様ではまた、ネクチン4の、抗体であるM22-321b41.1と、同じであるか、又は重複するエピトープ(例えば、ヒトネクチン4のECD内に位置するエピトープ)に結合する抗体も提供される。
ネクチン4の、同じであるか、又は重複するエピトープ(例えば、ヒトネクチン4のECD内に位置するエピトープ)に結合する抗体は、本明細書で提供される例において利用される技法など、規定の技法を使用して同定することができる。イムノアッセイは、例えば、1つの抗体が、別の抗体の、標的抗原への結合を遮断する能力、すなわち、競合的結合アッセイを裏付けるのに使用される。2つの抗体が、エピトープに対して、同様な結合特異性を有するのかどうかを決定するのに、競合結合アッセイもまた使用することができる。競合的結合は、被験免疫グロブリンが、基準抗体の、ネクチン4など、共通抗原への特異的結合を阻害するアッセイにおいて決定することができる。多数種類の競合的結合アッセイ、例えば、直接的固相ラジオイムノアッセイ(RIA)又は間接的固相RIA、直接的固相酵素イムノアッセイ(EIA)又は間接的固相酵素EIA、サンドイッチ競合アッセイ(Stahliら(1983)、Methods in Enzymology、9:242を参照されたい);直接的固相ビオチン-アビジンEIA(Kirklandら(1986)、J.Immunol.、137:3614を参照されたい);直接的固相標識化アッセイ、直接的固相標識化サンドイッチアッセイ、(Harlow及びLane(1988)、「抗体:実験室マニュアル(Antibodies:A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Pressを参照されたい);I-125標識を使用する、直接的固相標識化RIA(Morelら(1988)、Mol.Immunol.、25(1):7を参照されたい);直接的固相ビオチン-アビジンEIA(Cheungら(1990)、Virology、176:546);及び直接的標識化RIA(Moldenhauerら(1990)、Scand J.Immunol.、32:77)が公知である。典型的に、このようなアッセイは、固体表面に結合させた精製抗原(例えば、ヒトネクチン4のECDなどのネクチン4)、又はこれらの、標識化されていない被験免疫グロブリン若しくは標識化された基準免疫グロブリンを保有する細胞の使用を伴う。競合的阻害は、被験免疫グロブリンの存在下で、固体表面又は細胞に結合した標識の量を決定することにより測定することができる。通例、被験免疫グロブリンは、過剰量で存在する。通例、競合する抗体が、過剰量で存在する場合、それは、基準抗体の、共通抗原への特異的結合を、少なくとも50~55%、55~60%、60~65%、65~70%、70~75%、又はこれを超えて阻害するであろう。競合結合アッセイは、標識化された抗原又は標識化された抗体を使用する、多数の異なるフォーマットで構成することができる。このアッセイの一般形では、抗原を、96ウェルプレート上に固定化する。次いで、放射性標識又は酵素標識を使用して、標識化されていない抗体が、標識化された抗体の、抗原への結合を遮断する能力を測定する。さらなる詳細については、例えば、Wagenerら、J.Immunol.、1983、130:2308~2315;Wagenerら、J.Immunol.Methods、1984、68:269~274;Kurokiら、Cancer Res.、1990、50:4872~4879;Kurokiら、Immunol.Invest.、1992、21:523~538;Kurokiら、Hybridoma、1992、11:391~407;並びに「抗体の使用:実験室マニュアル(Using Antibodies:A Laboratory Manual)」、Harlow及びDavid Lane編(Cold Springs Harbor Laboratory Press、Cold Springs Harbor、N.Y.、1999)、386~389頁を参照されたい。
ある特定の態様では、競合結合アッセイを使用して、抗体の結合が、別の抗体により、例えば、用量依存的に、競合的に阻害されるのかどうかを決定することができ、これにより、抗体が、本質的に同じエピトープ、又は重複するエピトープ、例えば、立体的に重複するエピトープに結合することを示す。このような競合結合アッセイは、例えば、標識化された抗原又は標識化された抗体を使用する、いくつかの異なるフォーマットで構成されうる、競合ELISAアッセイを含みうる。特定の実施形態では、抗体は、本明細書で記載される抗体であるM22-321b41.1、又はそのキメラ抗体若しくはFab抗体、又は抗体であるM22-321b41.1のVH CDR及びVL CDRを含む抗体との競合結合アッセイにおいて調べることができる。
本明細書の具体的な態様では、当業者に公知であるか、又は本明細書で記載されるアッセイ(例えば、ELISA競合アッセイ)を使用して決定される通りに、本明細書で記載されるアミノ酸配列を含む抗体の結合を、ネクチン4ポリペプチド(例えば、ネクチン4、例えば、ヒトネクチン4のECD)への特異的結合について、競合的に遮断する(例えば、用量依存的に)抗体が提供される。本明細書の具体的な態様では、当業者に公知であるか、又は本明細書で記載されるアッセイ(例えば、ELISA競合アッセイ)を使用して決定される通りに、ネクチン4ポリペプチド(例えば、ネクチン4、例えば、ヒトネクチン4のECD)への特異的結合について、本明細書で記載されるアミノ酸配列(例えば、抗体であるM22-321b41.1のVLアミノ酸配列及び/又はVHアミノ酸配列)を含む抗体と競合する(例えば、用量依存的に)抗体が提供される。
本明細書の具体的な態様では、ネクチン4ポリペプチド(例えば、ネクチン4、例えば、ヒトネクチン4のECD)への特異的結合について、抗体であるM22-321b41.1と競合する(例えば、用量依存的に)抗体が提供される。
本明細書の具体的な態様では、ネクチン4ポリペプチド(例えば、ネクチン4、例えば、ヒトネクチン4のECD)への特異的結合について、配列番号3のアミノ酸配列を有するVL鎖領域と、配列番号4のアミノ酸配列を有するVH鎖領域とを含む抗体と競合する(例えば、用量依存的に)抗体が提供される。
本明細書の具体的な態様ではまた、(i)ネクチン4ポリペプチドのエピトープ(例えば、ヒトネクチン4のECDのエピトープ)への特異的結合について、抗体であるM22-321b41.1と競合し(例えば、用量依存的に)、(ii)IHCアッセイにおいて、ネクチン4に特異的に結合することが可能である抗体も提供される。
具体的な実施形態では、本明細書で記載される抗体は、ネクチン4に特異的に結合し、ネクチン4ポリペプチド(例えば、ネクチン4、例えば、ヒトネクチン4のECD)への特異的結合のための、配列番号3のアミノ酸配列を有するVL鎖領域と、配列番号4のアミノ酸配列を有するVH鎖領域とを含む抗体により競合的に遮断される(例えば、用量依存的に)抗体である。
本明細書の具体的な態様ではまた、(i)抗体であるM22-321b41.1を、ネクチン4ポリペプチドのエピトープ(例えば、ヒトネクチン4のECDのエピトープ)への特異的結合について競合的に遮断し(例えば、用量依存的に);(ii)IHCアッセイにおいて、ネクチン4に特異的に結合することが可能である抗体も提供される。
本明細書の具体的な態様では、抗体であるM22-321b41.1のエピトープと同じエピトープに免疫特異的に結合する抗体、又はその抗原結合性断片であって、ネクチン4ポリペプチド(例えば、ネクチン4、例えば、ヒトネクチン4のECD)への特異的結合のための、本明細書で記載されるアミノ酸配列を含む上記抗体、又はその抗原結合性断片が提供される。当業者に公知であるか、又は本明細書で記載されるアッセイ(例えば、ELISAアッセイ)を使用して、2つの抗体が、同じエピトープに結合するのかどうかを決定することができる。
具体的な実施形態では、本明細書で記載される抗体、又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に特異的に結合し、配列番号3のアミノ酸配列を有するVL鎖領域と、配列番号4のアミノ酸配列を有するVH鎖領域とを含む抗体であるM22-321b41.1のエピトープと同じエピトープに免疫特異的に結合する。
本明細書の具体的な態様ではまた、(i)抗体であるM22-321b41.1のエピトープと同じ、ネクチン4ポリペプチドのエピトープ(例えば、ヒトネクチン4のECDのエピトープ)に免疫特異的に結合し;(ii)IHCアッセイにおいて、ネクチン4に特異的に結合することが可能である抗体も提供される。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基31~346のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基31~75のうちの少なくとも1つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基75~125のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基100~150のうちの少なくとも1つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基125~175のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基150~200のうちの少なくとも1つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基175~225のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基200~250のうちの少なくとも1つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基225~275のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基250~300のうちの少なくとも1つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基275~325のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基300~346のうちの少なくとも1つに結合する。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基1~150のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基31~150のうちの少なくとも1つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基1~10のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基5~15のうちの少なくとも1つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基10~20のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基15~25のうちの少なくとも1つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基20~30のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基25~35のうちの少なくとも1つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基30~40のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基35~45のうちの少なくとも1つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基40~50のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基45~55のうちの少なくとも1つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基50~60のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基65~75のうちの少なくとも1つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基70~80のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基75~85のうちの少なくとも1つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基80~90のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基85~95のうちの少なくとも1つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基90~100のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基95~105のうちの少なくとも1つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基100~110のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基105~115のうちの少なくとも1つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基110~120のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基115~125のうちの少なくとも1つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基120~130のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基125~135のうちの少なくとも1つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基130~140のうちの少なくとも1つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基135~145のうちの少なくとも1つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン4に結合する場合に、配列番号1のアミノ酸配列内の残基140~150のうちの少なくとも1つに結合する。
上記で言及したアミノ酸のうちの2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、又はこれを超えるアミノ酸の任意の組合せによるネクチン4結合部位もまた想定される。
ある特定の実施形態では、抗体は、ネクチン4リガンド結合性部位とは別個である、ヒトネクチン4のECDのエピトープに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、ネクチン4リガンドの、ネクチン4への結合は、抗体により阻害されない。
本明細書の一態様では、ネクチン4に特異的に結合する抗体が提供される。本明細書のある特定の実施形態では、ヒトネクチン4のECDに特異的に結合する抗体が提供される。
ある特定の実施形態では、ネクチン4に特異的に結合する抗体は、ヒトネクチン4のECD、又はヒトネクチン4のECDのエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗体は、ネクチン4リガンド結合性部位とは別個である、ヒトネクチン4のECDのエピトープに特異的に結合する。
ネクチン4活性は、公知であるか、又は当技術分野で記載されているネクチン4活性など、ネクチン4の任意の活性に関しうる。ネクチン4活性の非限定的な例は、ネクチン4受容体の二量体化、ネクチン4受容体の、他の受容体とのヘテロ二量体化、ネクチン4受容体のリン酸化、ネクチン4受容体の下流におけるシグナル伝達、細胞増殖(例えば、がん細胞増殖)の、ネクチン4リガンド誘導性増強などの細胞増殖、又は細胞生存(例えば、がん細胞)、ネクチン4リガンド誘導性抗アポトーシス活性を含む。本明細書では、ネクチン4活性又はネクチン4機能を互換的に使用する。ある特定の態様では、ネクチン4活性は、ネクチン4リガンドの、ネクチン4受容体への結合により誘導される。ある特定の実施形態では、ネクチン4の活性又はシグナル伝達の増大は、ネクチン4受容体の高発現(又は過剰発現)に起因して、ネクチン4リガンドの、ネクチン4受容体への結合の非存在下で生じうる。細胞内のネクチン4の高発現又は過剰発現とは、正常なネクチン4発現若しくはネクチン4活性を有することが既知である基準細胞の発現レベルを、少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、300%、400%、若しくは500%超えるか、又は正常なネクチン4発現若しくはネクチン4活性を有することが既知である、細胞又は試料の集団内の、ネクチン4の平均発現レベルを超える発現レベルを指す。ネクチン4の発現レベルは、本明細書で記載されるか、又は当業者に公知の方法(例えば、ウェスタンブロット法、ELISA、又はIHC)により評価することができる。
10.ポリクローナル抗体
本開示の抗体は、ポリクローナル抗体を含みうる。ポリクローナル抗体を調製する方法は、当業者に公知である。ポリクローナル抗体は、哺乳動物において、例えば、免疫化剤、及び、所望の場合、アジュバントの、1回又は複数回の注射により惹起することができる。典型的に、免疫化剤及び/又はアジュバントは、哺乳動物において、複数回の皮下注射又は腹腔内注射により注射する。免疫化剤は、ネクチン4ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を、免疫化される哺乳動物において、免疫原性であることが公知のタンパク質とコンジュゲートするか、又は哺乳動物を、タンパク質と、1又は複数のアジュバントとで免疫化することは、有用でありうる。このような免疫原性タンパク質の例は、スカシガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロビン、及びダイズトリプシン阻害剤を含むがこれらに限定されない。用いられうるアジュバントの例は、Ribi、CpG、Poly1C、フロイントの完全アジュバント、及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリルリピドA、合成ジコリノミコール酸トレハロース)を含む。免疫化プロトコールは、当業者が、不要な実験を伴わずに選択することができる。次いで、哺乳動物から採血し、血清を、ネクチン4抗体力価についてアッセイすることができる。所望の場合、抗体力価が、増大するか、又はプラトー状態に達するまで、哺乳動物に追加投与することができる。加えて、又は代替的に、リンパ球は、下記で記載されるハイブリドーマからのモノクローナル抗体の融合及び調製のために、免疫化動物から得ることもできる。
11.モノクローナル抗体
本開示の抗体は、代替的に、モノクローナル抗体でありうる。モノクローナル抗体は、Kohlerら、1975、Nature、256:495~97により最初に記載された、ハイブリドーマ方法を使用して作ることもでき、組換えDNA方法(例えば、米国特許第4,816,567号を参照されたい)により作ることもできる。
ハイブリドーマ方法では、マウス又はハムスターなど、他の適切な宿主動物を、上記で記載した通りに免疫化して、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、又はこれらを産生することが可能なリンパ球を誘発する。代替的に、リンパ球は、in vitroにおいて免疫化することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離し、次いで、ポリエチレングリコールなど、適切な融合剤を使用して、骨髄腫細胞系と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding、「モノクローナル抗体:原理と実際(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)」、59~103(1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、ある特定の実施形態では、融合させていない、親骨髄腫細胞(また、融合パートナーとも称する)の増殖又は生存を阻害する、1又は複数の物質を含有する、適切な培養培地中に播種し、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素である、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠く場合、ハイブリドーマのための選択的培養培地は、典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含み(HAT培地)、これは、HGPRT欠損細胞の増殖を防止する。
例示的な、融合パートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による、安定的な高レベルの抗体の産生を支援し、融合させていない親細胞に対して選択する選択的培地に感受性である骨髄腫細胞である。例示的な骨髄腫細胞系は、American Type Cuture Collection(Manassas、VA)から入手可能な、SP-2細胞及び派生細胞、例えば、X63-Ag8-653細胞などのマウス骨髄腫系、並びにSalk Institute Cell Distribution Center(San Diego、CA)から入手可能な、MOPC-21マウス腫瘍及びMPC-11マウス腫瘍に由来する、マウス骨髄腫系である。ヒトモノクローナル抗体を作製するための、ヒト骨髄腫細胞系及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞系についてもまた、記載されている(Kozbor、1984、Immunol.、133:3001~05;及びBrodeurら、「モノクローナル抗体の作製技法と応用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)」、51~63(1987))。
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地を、抗原を指向するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、又はRIA若しくはELISAなど、in vitroにおける結合アッセイにより決定する。モノクローナル抗体の結合アフィニティーは、例えば、Munsonら、1980、Anal.Biochem.、107:220~39において記載されている、スカッチャード解析により決定することができる。
所望の特異性、アフィニティー、及び/又は活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定したら、クローンを、限界希釈手順によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding、前出)。この目的に適する培養培地は、例えば、DMEM培地又はRPMI-1640培地を含む。加えて、例えば、細胞の、マウスへの、i.p.注射により、ハイブリドーマ細胞を、in vivoにおいて、動物における腹水腫瘍として増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体を、例えば、アフィニティークロマトグラフィー(例えば、プロテインA-セファロース又はプロテインG-セファロースを使用する)又はイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析など、従来の抗体精製手順により、培養培地、腹水、又は血清から、適切に分離する。
モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手順を使用して(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)、たやすく単離され、シーケンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの供給源として用いられうる。単離したら、DNAを、発現ベクターに入れることができ、次いで、そうしなければ抗体タンパク質を産生しない、大腸菌(E.coli)細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞に、これらをトランスフェクトして、組換え宿主細胞内の、モノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードするDNAの、細菌内の組換え発現についての総説論文は、Skerraら、1993、Curr.Opinion in Immunol.、5:256~62、及びPlueckthun、1992、Immunol.Revs.、130:151~88を含む。
一部の実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体は、厳密な条件(例えば、結合したDNAを、6倍濃度の塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中、約45℃で濾過するハイブリダイゼーションに続く、0.2倍濃度のSSC/0.1%のSDS中、約50~65℃で、1回又は複数回の洗浄)下で、高度に厳密な条件(例えば、結合した核酸を、6倍濃度のSSC中、約45℃で濾過するハイブリダイゼーションに続く、0.1倍濃度のSSC/0.2%のSDS中、約68℃で、1回又は複数回の洗浄)下で、又は当業者に公知である、他の厳密なハイブリダイゼーション条件下で、本明細書で記載されるVHドメイン及び/又はVLドメインのうちのいずれか1つをコードするヌクレオチド配列の相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる、VHドメインのアミノ酸配列及び/又はVLドメインのアミノ酸配列を含む。例えば、「分子生物学における最新のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」、I巻、6.3.1~6.3.6及び2.10.3(Ausubelら編、1989)を参照されたい。
一部の実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体は、厳密な条件(例えば、結合したDNAを、6倍濃度のSSC中、約45℃で濾過するハイブリダイゼーションに続く、0.2倍濃度のSSC/0.1%のSDS中、約50~65℃で、1回又は複数回の洗浄)下で、高度に厳密な条件(例えば、結合した核酸を、6倍濃度のSSC中、約45℃で濾過するハイブリダイゼーションに続く、0.1倍濃度のSSC/0.2%のSDS中、約68℃で、1回又は複数回の洗浄)下で、又は当業者に公知である(例えば、Ausubelら、前出を参照されたい)、他の厳密なハイブリダイゼーション条件下で、表1に描示されたVH CDR及び/又はVL CDRのうちのいずれか1つをコードするヌクレオチド配列の相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる、VH CDRのアミノ酸配列又はVL CDRのアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態では、モノクローナル抗体又は抗体断片は、例えば、「抗体のファージディスプレイ:方法及びプロトコール(Antibody Phage Display:Methods and Protocols)」(O’Brien及びAitken編、2002)において記載されている技法を使用して作出された抗体ファージライブラリーから単離することができる。ファージディスプレイ方法では、機能的な抗体ドメインを、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面上に提示する。本明細書で記載される抗体を作製するのに使用されうるファージディスプレイ方法の例は、Brinkmanら、1995、J.Immunol.Methods、182:41~50;Amesら、1995、J.Immunol.Methods、184:177~186;Kettleboroughら、1994、Eur.J.Immunol.、24:952~958;Persicら、1997、Gene、187:9~18;Burtonら、1994、Advances in Immunology、57:191~280;PCT出願第PCT/GB91/01134号;国際公開第WO90/02809号、同第WO91/10737号、同第WO92/01047号、同第WO92/18619号、同第WO93/11236号、同第WO95/15982号、同第WO95/20401号、及び同第WO97/13844号;並びに米国特許第5,698,426号、同第5,223,409号、同第5,403,484号、同第5,580,717号、同第5,427,908号、同第5,750,753号、同第5,821,047号、同第5,571,698号、同第5,427,908号、同第5,516,637号、同第5,780,225号、同第5,658,727号、同第5,733,743号、及び同第5,969,108号において開示されているファージディスプレイ方法を含む。
原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質へと融合させた、抗体可変領域(Fv)の多様な断片を提示するファージを含有するファージライブラリーをスクリーニングすることにより選択する。このようなファージライブラリーを、所望の抗原に対してスクリーニングする。所望の抗原への結合が可能なFv断片を発現するクローンは、抗原へと吸着されるので、ライブラリー内の非結合クローンから分離される。次いで、結合クローンを、抗原から溶離させ、抗原への吸着/溶離の、さらなるサイクルにより、さらに濃縮する。
可変ドメインは、例えば、Winterら、1994、Ann.Rev.Immunol.、12:433~55において記載されている通り、VHとVLとを、短い可撓性ペプチドを介して、共有結合的に連結した、単鎖Fv(scFv)断片として、又はVH及びVLの各々を、定常ドメインへと融合させ、非共有結合的に相互作用させたFab断片として、ファージ上で、機能的に提示することができる。
VH遺伝子及びVL遺伝子のレパートリーは、Winterら、前出において記載されている通り、PCRにより、個別にクローニングし、ファージライブラリー内で、ランダムに組み換え、次いで、これらを、抗原結合性クローンについて検索することができる。免疫化供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマの構築を要求せずに、免疫原に対する、高アフィニティーの抗体をもたらす。代替的に、ナイーブレパートリーをクローニングして、広範にわたる非自己に対するヒト抗体の単一の供給源をもたらし、また、Griffithsら、1993、EMBO J、12:725~34により記載されている、免疫化を伴わない自己抗原に対するヒト抗体の単一の供給源ももたらすことができる。最後に、ナイーブライブラリーはまた、例えば、Hoogenboom及びWinter、1992、J.Mol.Biol.、227:381~88により記載されている通り、幹細胞に由来する、再配列されていないV遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するPCRプライマーを使用して、高度に可変性のCDR3領域をコードし、in vitroにおける再配列を達成することにより、合成により作ることもできる。
ライブラリーのスクリーニングは、当技術分野で公知の、多様な技法により達することができる。例えば、ネクチン4(例えば、ネクチン4のポリペプチド、断片、又はエピトープ)は、吸着プレートのウェルをコーティングするのに使用することもでき、吸着プレートへと固定した宿主細胞上で発現させることもでき、細胞分取において使用することもでき、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズによる捕捉のために、ビオチンへとコンジュゲートさせることもでき、パニングディスプレイライブラリーのための、他の任意の方法において使用することもできる。解離反応速度の遅い(例えば、結合アフィニティーが良好な)抗体の選択は、Bassら、1990、Proteins、8:309~14;及び同第WO92/09690号において記載されている、長時間の洗浄及び一価ファージディスプレイの使用、並びにMarksら、1992、Biotechnol.、10:779~83において記載されている、抗原の低コーティング密度の使用により促進することができる。
抗ネクチン4抗体は、目的のファージクローンを選択するための、適切な抗原スクリーニング手順に続き、Kabatら、前出において記載されている、目的のファージクローン及び適切な定常領域(例えば、Fc)配列に由来する、VH配列及び/又はVL配列(例えば、Fv配列)、又はVH配列及びVL配列に由来する、多様なCDR配列を使用する、全長抗ネクチン4抗体クローンの構築をデザインすることにより得ることができる。
本明細書で記載される抗体はまた、例えば、キメラ抗体も含みうる。キメラ抗体とは、抗体の異なる部分が、異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。例えば、キメラ抗体は、ヒト抗体の定常領域へと融合させた、マウスモノクローナル抗体又はラットモノクローナル抗体の可変領域を含有しうる。当技術分野では、キメラ抗体を作製するための方法が公知である。例えば、Morrison、1985、Science、229:1202;Oiら、1986、BioTechniques、4:214;Gilliesら、1989、J.Immunol.Methods、125:191~202;並びに米国特許第5,807,715号、同第4,816,567号、同第4,816,397号、及び同第6,331,415号を参照されたい。
本明細書で記載される技法などの技法を使用して作製される、抗体又は抗原結合性断片は、周知の標準的な技法を使用して単離することができる。例えば、抗体又は抗原結合性断片は、例えば、プロテインA-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなど、従来の免疫グロブリン精製手順により、例えば、培養培地、腹水、血清、細胞溶解物、合成反応材料などから、適切に分離することができる。本明細書で使用される、「単離」抗体又は「精製」抗体は、抗体が由来する、細胞供給源若しくは組織供給源に由来する、細胞物質若しくは他のタンパク質を実質的に含まないか、又は化学合成される場合の、化学的前駆物質若しくは他の化学物質を実質的に含まない。
12.抗体断片
本開示は、ネクチン4に結合する抗体及び抗体断片を提供する。ある特定の状況では、全抗体ではなく、抗体断片を使用することが有利である。小サイズの断片は、急速なクリアランスを可能とし、細胞、組織、又は臓器への接近の改善をもたらしうる。ある特定の抗体断片の総説については、Hudsonら、2003、Nature Med.、9:129~34を参照されたい。
抗体断片を産生するための多様な技法が開発されている。従来、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化を介して導出された(例えば、Morimotoら、1992、J.Biochem.Biophys.Methods、24:107~17;及びBrennanら、1985、Science、229:81~83を参照されたい)。しかし、今やこれらの断片は、組換え宿主細胞に直接産生させることができる。Fab抗体断片、Fv抗体断片、及びscFv抗体断片は全て、大腸菌又は酵母細胞で発現し、大腸菌又は酵母細胞から分泌されうるので、大量のこれらの断片の、容易な作製が可能となる。抗体断片は、上記で論じた抗体ファージライブラリーから単離することができる。代替的に、Fab’-SH断片は、大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングさせて、F(ab’)2断片を形成することもできる(Carterら、1992、Bio/Technology、10:163~67)。別の手法に従い、F(ab’)2断片を、組換え宿主細胞培養物から直接単離することもできる。in vivo半減期を延長したFab断片及びF(ab’)2断片であって、サルベージ受容体結合性エピトープ残基を含む上記断片については、例えば、米国特許第5,869,046号において記載されている。当業者には、抗体断片を作製するための他の技法も明らかであろう。ある特定の実施形態では、抗体は、単鎖Fv断片(scFv)である(例えば、WO93/16185号;米国特許第5,571,894号及び同第5,587,458号を参照されたい)。Fv及びscFvは、定常領域を欠くインタクトな結合性部位を有するので、in vivoにおける使用時に、非特異的結合を低減するのに適する。scFvによる融合タンパク質を構築して、scFvのアミノ末端又はカルボキシ末端における、エフェクタータンパク質の融合をもたらすこともできる(例えば、Borrebaeck編、前出を参照されたい)。例えば、抗体断片はまた、上記で引用した参考文献において記載されている「直鎖状抗体」でもありうる。
小型の、抗体由来の結合性構造は、単一可変ドメイン抗体(sdAb)ともまた称する、個別の可変ドメイン(Vドメイン)である。ある特定の種類の生物である、ラクダ科動物及び軟骨魚は、Fcと同等なドメイン構造上に搭載された、高アフィニティーの単一のV様ドメインを、それらの免疫系の一部として有する(Woolvenら、1999、Immunogenetics、50:98~101;及びStreltsovら、2004、Proc Natl Acad Sci USA.、101:12444~49)。V様ドメイン(ラクダ科動物では、VhHと呼ばれ、サメでは、V-NARと呼ばれる)は、典型的に、標的抗原の空隙への貫入を可能とする、長い表面ループを提示する。V様ドメインはまた、疎水性表面パッチをマスキングすることにより、孤立したVHドメインを安定化させもする。
これらのVhHドメイン及びV-NARドメインは、sdAbを操作するのに使用されている。ファージライブラリーからの選択及び他の手法を使用して、ヒトVドメイン変異体がデザインされており、これらは、安定的で、結合性が高度の、VL由来ドメイン及びVH由来ドメインを結果としてもたらした。
本明細書で提供される抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、例えば、ネクチン4エピトープに結合する抗原結合性部位を含有する分子を含むがこれらに限定されない。本明細書で提供される免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の、任意のクラス(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、及びIgA)又は任意のサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)の抗体でありうる。
抗体の変異体及び誘導体は、ネクチン4エピトープに結合する能力を保持する、抗体の機能的断片を含む。例示的な機能的断片は、Fab断片(例えば、抗原結合性ドメインを含有し、ジスルフィド結合により架橋された、軽鎖及び重鎖の一部を含む抗体断片);Fab’(例えば、Fabと、ヒンジ領域を介する重鎖のさらなる部分とを含む、単一の抗原結合性ドメインを含有する抗体断片);F(ab’)2(例えば、重鎖のヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合により接合させた、2つのFab’分子;Fab’分子は、同じエピトープを指向する場合もあり、異なるエピトープを指向する場合もある);scFvとしてもまた公知である、可変領域を含む単鎖(例えば、10~25アミノ酸の鎖により、一体に連結された、抗体の単一の軽鎖及び重鎖の可変性の抗原結合性決定領域);ジスルフィド連結Fv又はdsFv(例えば、ジスルフィド結合により、一体に連結された、抗体の単一の軽鎖及び重鎖の可変性の抗原結合性決定領域);ラクダ化VH(例えば、VHインターフェースにおける一部のアミノ酸が、天然に存在するラクダ抗体の重鎖内で見出される抗体の単一の重鎖の可変性の抗原結合性決定領域)を含む。
13.ヒト化抗体
本明細書で記載される抗体は、例えば、ヒト化抗体、例えば、脱免疫化ヒト抗体又は複合ヒト抗体を含みうる。
ヒト化抗体は、ヒト定常領域の配列を含みうる。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgA、及びIgEを含む、免疫グロブリンの任意のクラスと、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4を含む、任意のアイソタイプとから選択することができる。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、カッパ又はラムダの軽鎖定常配列を含みうる。
ヒト化抗体は、CDRグラフティング(欧州特許第EP239,400号;国際公開第WO91/09967号;並びに米国特許第5,225,539号、同第5,530,101号、及び同第6,316,652号)、ベニヤ化又はリサーフェシング(欧州特許第EP592,106号及び同第EP519,596号;Padlan、1991、Molecular Immunology、28(4/5):489~498;Studnickaら、1994、Protein Engineering、7(6):805~814;及びRoguskaら、1994、PNAS、91:969~973)、鎖シャフリング(米国特許第5,565,332号)、及び、例えば、米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、WO9317105号、Tanら、J.Immunol.、169:111925(2002)、Caldasら、Protein Eng.13(5):353~60(2000)、Moreaら、Methods、20(3):26779(2000)、Bacaら、J.Biol.Chem.、272(16):10678~84(1997)、Roguskaら、Protein Eng.、9(10):895904(1996)、Coutoら、Cancer Res.、55(増刊23号):5973~5977頁(1995)、Coutoら、Cancer Res.、55(8):1717~22(1995)、Sandhu JS、Gene、150(2):409~10(1994)、及びPedersenら、J.Mol.Biol.、235(3):959~73(1994)において開示されている技法を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の様々な技法を使用して作製することができる。また、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許公開第US2005/0042664A1号(2005年2月24日)も参照されたい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒトネクチン4を含むネクチン4に結合するヒト化抗体でありうる。例えば、本開示のヒト化抗体は、表1に示される、1又は複数のCDRを含みうる。当技術分野では、非ヒト抗体をヒト化するための、多様な方法が公知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒト供給源である供給源から、それへと導入される、1又は複数のアミノ酸残基を有しうる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的に、「インポート」可変ドメインから採取される、「インポート」残基と称することが多い。ヒト化は、例えば、Jonesら、1986、Nature 321:522~25;Riechmannら、1988、Nature、332:323~27;及びVerhoeyenら、1988、Science、239:1534~36の方法に従い、超可変領域の配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することにより実施することができる。
場合によって、ヒト化抗体は、親非ヒト抗体(例えば、齧歯動物)の、6つのCDRのアミノ酸配列を、ヒト抗体フレームワークへとグラフトする、CDRグラフティングにより構築する。例えば、Padlanらは、実際に抗原に接触するのは、CDR内の残基のうちの約3分の1だけであることを決定し、これらを「特異性決定残基」又はSDRと名付けた(Padlanら、1995、FASEB J.、9:133~39)。SDRグラフティング技法では、SDR残基だけを、ヒト抗体フレームワークへとグラフトする(例えば、Kashmiriら、2005、Methods、36:25~34を参照されたい)。
ヒト化抗体を作るのに使用される、ヒト可変ドメインの、軽鎖及び重鎖の両方の選択は、抗原性を低減するのに重要でありうる。例えば、いわゆる「ベストフィット」方法に従い、非ヒト(例えば、齧歯動物)抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリーの全体に対してスクリーニングする。齧歯動物の配列に最も近縁のヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワークとして選択することができる(Simsら、1993、J.Immunol.、151:2296~308;及びChothiaら、1987、J.Mol.Biol.、196:901~17)。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定の亜群の、全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する、特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体のために、同じフレームワークを使用することができる(Carterら、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:4285~89;及びPrestaら、1993、J.Immunol.、151:2623~32)。場合によって、フレームワークは、最も存在量が多いヒトサブクラスである、VL6亜群I(VL6I)及びVH亜群III(VHIII)のコンセンサス配列に由来する。別の方法では、ヒト生殖細胞系列遺伝子を、フレームワーク領域の供給源として使用する。
超ヒト化と呼ばれるCDRの比較に基づく、代替的なパラダイムでは、FRの相同性は、重要でない。方法は、非ヒト配列の、機能的なヒト生殖細胞系列遺伝子レパートリーとの比較からなる。次いで、マウス配列と同じであるか、又は近縁である、カノニカルな構造をコードする遺伝子を選択する。次に、カノニカルな構造を、非ヒト抗体と共有する遺伝子内で、CDR内の相同性が最大である遺伝子を、FRドナーとして選び出す。最後に、非ヒトCDRを、これらのFRへとグラフトする(例えば、Tanら、2002、J.Immunol.、169:1119~25を参照されたい)。
さらに一般に、抗原に対するそれらのアフィニティー、及び他の好適な生物学的特性を保持しながら、抗体をヒト化することが所望される。この目標を達成するために、1つの方法に従い、ヒト化抗体を、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用する、親配列及び多様な概念上のヒト化産物に対する解析工程により調製する。三次元免疫グロブリンモデルが、一般に、利用可能であり、当業者は、これらに精通している。選択された候補免疫グロブリン配列の、蓋然的な三次元コンフォメーション構造を例示及び提示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらは、例えば、WAM(Whitelegg及びRees、2000、Protein Eng.、13:819~24)、Modeller(Sali及びBlundell、1993、J.Mol.Biol.、234:779~815)、及びSwiss PDB Viewer(Guex及びPeitsch、1997、Electrophoresis、18:2714~23)を含む。これらの表示についての精査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基に推測される役割についての解析、例えば、候補免疫グロブリンが、その抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基についての解析を可能とする。このようにして、標的抗原(単数又は複数)に対するアフィニティーの上昇など、所望の抗体特徴が、達成されるように、FR残基が、レシピエント配列及びインポート配列から選択され、組み合わされうる。一般に、超可変領域残基は、直接、且つ、最も実質的に、抗原結合への影響に関与しうる。
抗体をヒト化するための別の方法は、HSC(Human String Content)と称する抗体のヒト性についての計量に基づく。この方法は、マウス配列を、ヒト生殖細胞系列遺伝子のレパートリーと比較し、差違を、HSCとしてスコアリングする。次いで、グローバルな同一性尺度を使用して、複数の多様なヒト化変異体を作出するのではなく、そのHSCを最大化することにより、標的配列をヒト化する(Lazarら、2007、Mol.Immunol.、44:1986~98)。
上記で記載した方法に加えて、経験的方法を使用して、ヒト化抗体を作出し、選択することができる。これらの方法は、エンリッチメント技術又はハイスループットスクリーニング技法を使用する、ヒト化変異体の大規模なライブラリーの作出及び最良のクローンの選択に基づく方法を含む。抗体の変異体は、ファージライブラリー、リボソームライブラリー、及び酵母ディスプレイライブラリーから単離しうるほか、細菌コロニーのスクリーニングによっても単離することができる(例えば、Hoogenboom、2005、Nat.Biotechnol.、23:1105~16;Dufnerら、2006、Trends Biotechnol.、24:523~29;Feldhausら、2003、Nat.Biotechnol.、21:163~70;及びSchlapschyら、2004、Protein Eng.Des.Sel.、17:847~60を参照されたい)。
FRライブラリー手法では、残基変異体のコレクションを、FR内の特異的位置に導入に続き、ライブラリーをスクリーニングして、グラフトされたCDRを、最もよく支持するFRを選択する。置換される残基は、CDR構造に潜在的に寄与するものとして同定される「ベニヤ」残基の一部又は全部を含む場合もあり(例えば、Foote及びWinter、1992、J.Mol.Biol.、224:487~99を参照されたい)、Bacaら(1997、J.Biol.Chem.、272:10678~84)により同定される、標的残基の限定的なセットに由来する場合もある。
FRシャフリングでは、全FRを、選択された残基変異体のコンビナトリアルライブラリーを創出するのではなく、非ヒトCDRと組み合わせる(例えば、Dall’Acquaら、2005、Methods、36:43~60を参照されたい)。ライブラリーは、結合について、まず、VLをヒト化するのに続き、VHをヒト化する、2ステップ工程でスクリーニングすることができる。代替的に、1ステップのFRシャフリング工程も使用することができる。このような工程は、結果として得られる抗体が、発現の増強、アフィニティーの増大、及び熱的安定性を含む、生化学的特性及び物理化学的特性の改善を呈したので、2ステップスクリーニングより効率的であることが示されている(例えば、Damschroderら、2007、Mol. Immunol.、44:3049~60を参照されたい)。
「ヒューマニアリング」方法は、実験による、不可欠のMSD(minimum specificity determinant)の同定に基づき、非ヒト断片の、ヒトFRライブラリーへの逐次的な置きかえ及び結合の評価に基づく。ヒューマニアリング方法は、非ヒトVH鎖及び非ヒトVL鎖のCDR3の領域で始まり、VH及びVLの両方の、CDR1及びCDR2を含む、非ヒト抗体の他の領域を、ヒトFRへと、徐々に置きかえる。この方法は、典型的に、顕著に異なるヒトVセグメントのCDRを伴う、複数のサブクラスからの、エピトープの保持及び抗体の同定を結果としてもたらす。ヒューマニアリングは、ヒト生殖細胞系列遺伝子による抗体と、91~96%相同な抗体の単離を可能とする(例えば、Alfenito、Cambridge Healthtech Institute’s Third Annual PEGS、Protein Engineering Summit、2007を参照されたい)。
「ヒト操作」方法は、ヒトにおける免疫原性を低減する一方で、元の非ヒト抗体の所望の結合特性を保持する修飾抗体を作製するように、抗体のアミノ酸配列へと特異的変化を施すことにより、マウス抗体又はキメラ抗体又は抗体断片などの非ヒト抗体又は抗体断片を変更するステップを伴う。一般に、技法は、非ヒト(例えば、マウス)抗体のアミノ酸残基を、「低危険性」残基、「中程度の危険性」残基、又は「高危険性」残基として分類するステップを伴う。分類は、特定の置換を施すことに予測される利益(例えば、ヒトにおける免疫原性のための)を、結果として得られる抗体のフォールディングに置換が影響を及ぼす危険性に対して査定する、グローバルな危険性/有益性の計算を使用して実施する。非ヒト(例えば、マウス)抗体配列の、所与の位置(例えば、低危険性又は中程度の危険性)において置換される、特定のヒトアミノ酸残基は、非ヒト抗体の可変領域に由来するアミノ酸配列を、特異的であるか、又はコンセンサスのヒト抗体配列の、対応する領域とアライメントすることにより選択することができる。アライメントに従い、低危険性又は中程度の危険性の位置における、非ヒト配列内のアミノ酸残基で、ヒト抗体配列内の対応する残基を置換することができる。ヒト操作タンパク質を作るための技法については、Studnickaら、1994、Protein Engineering、7:805~14;米国特許第5,766,886号;同第5,770,196号;同第5,821,123号;及び同第5,869,619号;及びPCT公開第WO93/11794号において、より詳細に記載されている。
複合ヒト抗体は、例えば、Composite Human Antibody(商標)技術(Antitope Ltd.、Cambridge、United Kingdom)を使用して作出することができる。複合ヒト抗体を作出するために、可変領域の配列を、T細胞エピトープを回避する形で、複数のヒト抗体の可変領域の配列の断片からデザインし、これにより、結果として得られる抗体の免疫原性を最小化する。このような抗体は、ヒト定常領域の配列、例えば、ヒト軽鎖定常領域及び/又はヒト重鎖定常領域を含みうる。
脱免疫化抗体とは、T細胞エピトープが除去された抗体である。脱免疫化抗体を作るための方法については、記載されている。例えば、Jonesら、Methods Mol Biol.、2009;525:405~23、xiv、及びDe Grootら、Cell.Immunol.、244:148~153(2006)を参照されたい。脱免疫化抗体は、T細胞エピトープ枯渇可変領域と、ヒト定常領域とを含む。略述すると、抗体のVH及びVLを、クローニングし、その後、T細胞増殖アッセイにおいて、抗体のVH及びVLに由来する重複ペプチドを調べることにより、T細胞エピトープを同定する。コンピューターによる方法を介して、T細胞エピトープを同定して、ヒトMHCクラスIIに結合するペプチドを同定する。VH及びVLに、突然変異を導入して、ヒトMHCクラスIIへの結合を失効化させる。次いで、突然変異させたVH及びVLを利用して、脱免疫化抗体を作出する。
14.ヒト抗体
具体的な実施形態では、抗体は、完全ヒト抗ヒト抗体である。完全ヒト抗体は、当技術分野で公知である、任意の方法により作製することができる。ヒト抗ネクチン4抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択される、Fvクローン可変ドメイン配列(単数又は複数)を、公知のヒト定常ドメイン配列(単数又は複数)と組み合わせることにより構築することができる。代替的に、本開示の抗ネクチン4ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法により作ることができる。ヒトモノクローナル抗体を作製するための、ヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞系については、例えば、Kozbor、1984、J.Immunol.、133:3001~05;Brodeurら、「モノクローナル抗体の作製技法と応用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)」、51~63(1987);及びBoernerら、1991、J.Immunol.、147:86~95により記載されている。
また、免疫化されると、内因性免疫グロブリンの産生の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能な、トランスジェニック動物(例えば、マウス)を作製することも可能である。ヒト抗体レパートリーを発現するトランスジェニックマウスは、多種多様な潜在的薬物標的に対する、高アフィニティーヒト配列モノクローナル抗体を作出するのに使用されている(例えば、Jakobovits,A.、1995、Curr.Opin.Biotechnol.、6(5):561~66;Brueggemann及びTaussing、1997、Curr.Opin.Biotechnol.、8(4):455~58;米国特許第6,075,181号及び同第6,150,584号;並びにLonbergら、2005、Nature Biotechnol.、23:1117~25を参照されたい)。
代替的に、ヒト抗体は、標的抗原を指向する抗体を産生する、ヒトBリンパ球の不死化を介して調製することもできる(例えば、このようなBリンパ球は、個体から回収することもでき、in vitroにおいて免疫化しておくこともできる)(例えば、Coleら、「モノクローナル抗体とがん治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)」(1985);Boernerら、1991、J.Immunol.、147(1):86~95;及び米国特許第5,750,373号を参照されたい)。
また、遺伝子シャフリングも、ヒト抗体を、非ヒト抗体、例えば、齧歯動物抗体から導出するのにも使用することができ、この場合、ヒト抗体は、非ヒト出発抗体と同様のアフィニティー及び特異性を有する。「エピトープインプリンティング」又は「誘導式選択」ともまた呼ばれるこの方法に従い、本明細書で記載されるファージディスプレイ技法により得られる、非ヒト抗体断片の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を、ヒトVドメイン遺伝子のレパートリーで置きかえ、非ヒト鎖/ヒト鎖によるscFvキメラ又はFabキメラの集団を創出する。抗原による選択の結果として、非ヒト鎖/ヒト鎖によるキメラscFv又はキメラFabが単離され、この場合、ヒト鎖は、初代ファージディスプレイクローン内で、対応する非ヒト鎖を除去したときに破壊される抗原結合性部位を回復する(例えば、エピトープは、ヒト鎖パートナーの選択を誘導する(刷り込まれる))。残存する非ヒト鎖を置きかえるための工程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる(PCT WO93/06213;及びOsbournら、2005、Methods、36:61~68を参照されたい)。従来の、非ヒト抗体の、CDRグラフティングによるヒト化と異なり、この技法は、非ヒト由来のFR残基又はCDR残基を有さない、完全ヒト抗体をもたらす。細胞表面抗原に対するマウス抗体をヒト化する、誘導式選択の例は、卵巣がん細胞上に存在する、葉酸結合性タンパク質(例えば、Figiniら、1998、Cancer Res.、58:991~96を参照されたい)、及び肝細胞癌上で高度に発現する、CD147(例えば、Baoら、2005、がんBiol.Ther.、4:1374~80を参照されたい)を含む。
誘導式選択手法の潜在的な欠点は、1つの抗体鎖をシャフリングしながら、他の抗体鎖を一定に保てば、エピトープドリフトを結果としてもたらしうることである。非ヒト抗体により認識されるエピトープを維持するために、CDR保持を適用することができる(例えば、Klimkaら、2000、Br.J.Cancer、83:252~60;及びBeiboerら、2000、J.Mol.Biol.、296:833~49を参照されたい)。この方法では一般に、非ヒトVH CDR3は、抗原結合性部位の中心にある場合があり、抗原認識のための、抗体の最重要領域でありうるので、このCDRを保持する。しかし、一部の場合には、非ヒト抗体の、VH CDR3及びVL CDR3のほか、VH CDR2、VL CDR2、及びVL CDR1を保持することもできる。
15.多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体より急速に内部化されうる(及び/又は異化されうる)。本開示の抗体は、3つ又はこれを超える抗原結合性部位を伴う多価抗体(IgMクラス以外の抗体である)(例えば、四価抗体)の場合があり、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により、たやすく作製することができる。多価抗体は、二量体化ドメイン、及び3つ又はこれを超える抗原結合性部位を含みうる。ある特定の実施形態では、二量体化ドメインは、Fc領域又はヒンジ領域を含む(又はこれらからなる)。この状況では、抗体は、Fc領域と、Fc領域に対してアミノ末端側にある、3つ又はこれを超える抗原結合性部位とを含むであろう。ある特定の実施形態では、多価抗体は、例えば、3つ~約8つの抗原結合性部位を含む(又はこれらからなる)。このような一実施形態では、多価抗体は、4つの抗原結合性部位を含む(又はこれらからなる)。多価抗体は、少なくとも1つのポリペプチド鎖(例えば、2つのポリペプチド鎖)を含み、この場合、ポリペプチド鎖(単数又は複数)は、2つ又はこれを超える可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖(単数又は複数)は、VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc[配列中、VD1は、第1の可変ドメインであり、VD2は、第2の可変ドメインであり、Fcは、Fc領域の1つのポリペプチド鎖であり、X1及びX2は、アミノ酸又はポリペプチドを表し、nは、0又は1である]を含みうる。例えば、ポリペプチド鎖(単数又は複数)は、VH-CH1-可撓性リンカー-VH-CH1-Fc領域鎖;又はVH-CH1-VH-CH1-Fc領域鎖を含みうる。本明細書の多価抗体は、少なくとも2つ(例えば、4つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドもさらに含みうる。本明細書の多価抗体は、例えば、約2つ~約8つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含みうる。本明細書で想定される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意選択で、CLドメインをさらに含む。
16.Fcの操作
本明細書で提供される抗ネクチン4抗体を、Fcの操作により修飾することが所望されうる。ある特定の実施形態では、抗体のFc領域への修飾は、抗体のエフェクター機能の減少又は消失を結果としてもたらす。ある特定の実施形態では、エフェクター機能は、ADCC、ADCP、及び/又はCDCである。一部の実施形態では、エフェクター機能は、ADCCである。他の実施形態では、エフェクター機能は、ADCPである。他の実施形態では、エフェクター機能は、CDCである。一実施形態では、エフェクター機能は、ADCC及びADCPである。一実施形態では、エフェクター機能は、ADCC及びCDCである。一実施形態では、エフェクター機能は、ADCP及びCDCである。一実施形態では、エフェクター機能は、ADCC、ADCP及びCDCである。これは、抗体のFc領域内に、1又は複数のアミノ酸置換を導入することにより達成することができる。
抗体の血清半減期を延長するために、例えば、米国特許第5,739,277号において記載されている通りに、サルベージ受容体結合性エピトープを、抗体(とりわけ、抗体断片)へと組み込むことができる。「サルベージ受容体結合性エピトープ」という用語は、IgG分子(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4)のFc領域のエピトープであって、IgG分子の、in vivoにおける血清半減期を延長する一因となるエピトープを指す。
17.代替的な結合剤
本開示は、本明細書で開示される抗ネクチン4抗体と同じエピトープに特異的に結合する、非免疫グロブリン結合剤を包含する。一部の実施形態では、非免疫グロブリン結合剤は、競合的結合アッセイにおいて、本開示の抗ネクチン4抗体を押しやるか、又はこれにより押しやられる薬剤として同定される。これらの代替的な結合剤は、例えば、当技術分野で公知である、操作タンパク質足場のうちのいずれかを含みうる。このような足場は、表1に示される、1又は複数のCDRを含みうる。このような足場は、例えば、リガンド結合性部位を形成する、4つの超可変ループを支持する、非可撓性のベータ-バレルを特徴とするタンパク質構造である、リポカリン足場に基づく、アンチカリンを含む。新規の結合特異性は、機能ディスプレイ及び誘導式選択と組み合わせた、ループ領域内の、ターゲティングされたランダム突然変異誘発により操作することができる(例えば、Skerra、2008、FEBS J.、275:2677~83を参照されたい)。他の適切な足場は、例えば、ヒトフィブロネクチンIIIの第10細胞外ドメインに基づく、アドネクチン又はモノボディー(例えば、Koide及びKoide、2007、Methods、Mol.Biol.、352:95~109を参照されたい);ブドウ球菌性プロテインAのZドメインに基づく、アフィボディー(例えば、Nygrenら、2008、FEBS J.、275:2668~76を参照されたい));アンキリンリピートタンパク質に基づく、DARPins(例えば、Stumppら、2008、Drug.Discov.Today、13:695~701を参照されたい));ヒトFynタンパク質キナーゼのSH3ドメインに基づく、フィノマー(例えば、Grabulovskiら、2007、J.Biol.Chem.、282:3196~204を参照されたい));スルフォロブス・アシドラリウス(Sulfolobus acidolarius)に由来するSac7dに基づく、アフィチン(例えば、Krehenbrinkら、2008、J.Mol.Biol.、383:1058~68を参照されたい));ヒトy-B-クリスタリンに基づく、アフィリン(例えば、Ebersbachら、2007、J.Mol.Biol.、372:172~85を参照されたい));膜受容体タンパク質のAドメインに基づく、アビマー(例えば、Silvermanら、2005、Biotechnol.、23:1556~61を参照されたい);システインに富むノッティンペプチド(例えば、Kolmar、2008、FEBS J.、275:2684~90を参照されたい);及び操作Kunitz型阻害剤(例えば、Nixon及びWood、2006、Curr.Opin.Drug.Discov.Dev.、9:261~68を参照されたい)を含みうる。総説については、例えば、Gebauer及びSkerra、2009、Curr.Opin.Chem.Biol.、13:245~55を参照されたい。
18.ネクチン4特異的抗体についてのスクリーニング
上記では、抗体を作出するための技法について記載してきた。抗体は、所望に応じて、ネクチン4に対するそれらの結合特異性など、ある特定の生物学的特徴について、さらにスクリーニング又は選択することができる。標的抗原に特異的な抗体についてのスクリーニングは、2つの側面を伴う。まず、抗体のスクリーニングは、ネクチン4を含有しない試料に結合しないか、又はこれへの結合が低度である抗体を同定する。スクリーニングのこの側面は、ネクチン4を特異的に認識し、これに結合するが、ネクチン4以外の分子を実質的に認識しないか、又はこれらに結合しない抗体を同定する。第2に、抗体のスクリーニングは、ネクチン4を含む試料に、強く、又は高アフィニティーで結合する抗体を同定する。スクリーニングのこの側面は、ネクチン4に対する高アフィニティーを有し、下記で記載される多様なアッセイにおいて、強い検出シグナルをもたらしうる抗体を同定する。両方の側面における、抗体についてのスクリーニングは、下記でさらに記載される、イムノアッセイを使用して達することができる。
ある特定の実施形態では、まず、マイクロ滴定プレートを、ネクチン4タンパク質又はその断片でコーティングする、ELISAを使用して、抗体をスクリーニングする。固定化ネクチン4に結合しないか、又はこれへの結合が弱い抗体のクローンを除去する。一部の実施形態では、例えば、ネクチン1、ネクチン2、又はネクチン3でコーティングされたマイクロ滴定プレートを使用して、イムノアッセイ、例えば、ELISAベースのアッセイ又はウェスタンブロットアッセイにおいて、他のネクチンアイソフォームに対する反応性について、ネクチン4に結合する抗体を、さらにスクリーニングすることができる。ネクチンの別のアイソフォームに対して反応性である抗体のクローンを除去し、ネクチン4に対して反応性である抗体のクローンだけを、さらなるスクリーニングのために選択することができる。
抗ネクチン4抗体は、ネクチン4を発現しないか、又はこの発現が低レベルである陰性対照へのその結合についてさらにスクリーニングすることができる。このようなスクリーンのために、抗体の多様なクローンと陰性対照との結合を、イムノアッセイ、例えば、IHCアッセイ、ELISAアッセイ、又は免疫ブロットアッセイにおいて決定することができる。任意の陰性対照に対して反応性である抗体のクローンを除去する。異なる陰性対照(例えば、ネクチン4の発現について陰性である、異なる組織又は細胞系)は、異なる分子のセットを含有しうるので、複数の陰性対照を使用して、候補抗ネクチン4抗体が、非ネクチン4分子の多様なセットに対して選択されることを確認することができる。
抗ネクチン4抗体は、ネクチン4を発現することが公知である陽性対照への結合についてさらにスクリーニングすることができる。このようなスクリーンのために、抗体の多様なクローンと陽性対照との結合を、イムノアッセイ、例えば、IHCアッセイ、ELISAアッセイ、又は免疫ブロットアッセイにおいて決定することができる。陽性対照に強く結合する抗体のクローンを選択する。陽性対照への結合が強く、且つ、陰性対照への結合が弱い、抗ネクチン4抗体を、ネクチン4に特異的な抗体として選択することができる。陽性対照に結合した抗ネクチン4抗体の量と、陰性対照に結合した抗ネクチン4抗体の量との差違は、この抗ネクチン4抗体の、ネクチン4に対する比結合である。比結合は、特異的な抗ネクチン4抗体を選択するための基準のうちの1つとして使用することができる。特異的抗体は、下記で詳細に記載されるイムノアッセイにおいて、高比結合をもたらす。
一部の実施形態では、抗ネクチン4抗体の特異性は、抗ネクチン4抗体の、陰性基準物質及び陽性基準物質への結合を、他の手段により決定された、これらの基準物質中の、既知のネクチン4発現レベルと相関させるか、又は比較することにより決定することができる。基準ネクチン4発現は、下記で記載される、ネクチン4陽性対照又はネクチン4陰性対照でありうる。特異的な抗ネクチン4抗体の、試料又は基準物質への結合は、試料中又は基準物質中のネクチン4の発現と相関又は比例する。すなわち、特異的な抗ネクチン4抗体は、高レベルのネクチン4を発現する試料又は基準物質に強く結合し、中レベルを発現する試料又は基準物質に中程度に結合し、低レベルを発現する試料又は基準物質に弱く結合し、ネクチン4を発現しない試料又は基準物質に最小限に結合する(例えば、アイソタイプ対照抗体が結合するのと同じレベルで結合する)。陰性対照又は陽性対照における、既知のネクチン4発現は、下記で詳細に記載されるqPCRアッセイにより、独立に決定することができる。既知のネクチン4発現はまた、ネクチン4特異的であることが既に決定されている抗ネクチン4抗体を用いる、下記に記載される、任意のイムノアッセイを使用して、独立に決定することもできる。陰性対照及び陽性対照におけるネクチン4の発現を確認するのに適切なイムノアッセイは、例を目的として、いかなる限定も伴わずに述べると、下記で詳細に記載される、IHCアッセイ、免疫ブロットアッセイ、FACSアッセイ、又はELISAを含む。一部の実施形態では、陰性対照中のネクチン4 mRNAレベルは、下記で記載される通り、アッセイのバックグラウンドノイズに起因して、又は生物学的に著明ではない、低レベルの残存ネクチン4に起因して、ゼロではありえない。ネクチン4陰性対照は、例えば、qPCRアッセイにおけるネクチン4 mRNAレベルが、非特異的プライマーのセットにより検出されるmRNAのレベルと、実質的に同様である場合、又はネクチン4 mRNAレベルが、ネクチン4陽性対照におけるにおけるネクチン4 mRNAレベルに照らして、生物学的に著明ではない場合に、ネクチン4について、適正に陰性であると考えることができる。同様に、別のネクチン4特異的抗体を、陰性対照中使用するイムノアッセイにより検出されるネクチン4も、アッセイのバックグラウンドノイズに起因して、又は生物学的に著明ではない、低レベルの残存ネクチン4に起因して、ゼロではありえない。バックグラウンドノイズは、抗ネクチン4抗体以外のアッセイ試薬と試料との、非特異的相互作用により引き起こされうる。ネクチン4陰性対照は、例えば、ネクチン4特異的抗体により検出される、陰性対照中のネクチン4レベルが、同じアッセイにおける、アイソタイプ対照抗体による検出レベルと、実質的に同様である場合に、ネクチン4について、適正に陰性であると考えることができる。一部のアッセイでは、バックグラウンドノイズは、陽性対照中の、検出シグナルの実質的な百分率に相当しうる。
加えて、陽性及び/又は陰性の組織、細胞(例えば、細胞系を含む)、並びに病理学的試料を含む、陽性対照及び陰性対照は、文献において、当業者により、同定され、公表されている。このような文献は、Pubmedなどのデータベースを検索し(例えば、ネクチン4、発現、陽性、陰性、及び/又は分布などの検索用語を使用して)、検索ヒットを解析することにより、たやすく同定することができる。
したがって、ネクチン4の発現を伴わない陰性対照細胞に結合した、ネクチン4特異的抗体又はその抗原結合性断片の相対量は、ネクチン4を発現する陽性対照に結合する抗体又はその抗原結合性断片の量の、約50%、40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.03%、0.01%、0.001%、又はこれ未満でありうる。
本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片についての一部の実施形態では、対照細胞内の、ネクチン4の、陰性又は陽性の発現は、独立に、qPCRアッセイ、第2の抗体を用いるIHCアッセイ、第2の抗体を用いる免疫ブロットアッセイ、第2の抗体を用いるFACSアッセイ、又は第2の抗体を用いるELISAにより決定される。
本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片についての一部の実施形態では、細胞に結合した抗体又はその抗原結合性断片の量は、IHCアッセイ、免疫ブロットアッセイ、FACSアッセイ、又はELISAにより決定される。
19.抗体の変異体
一部の実施形態では、本明細書で記載される、ネクチン4に結合する抗体の、アミノ酸配列の修飾(単数又は複数)が想定される。例えば、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、免疫原性の低減、又は可溶性を含むがこれらに限定されない、抗体の結合アフィニティー及び/又は他の生物学的特性を改善することが所望でありうる。したがって、本明細書で記載される抗ネクチン4抗体に加えて、抗ネクチン4抗体の変異体も調製しうることが想定される。例えば、抗ネクチン4抗体の変異体は、適切なヌクレオチド変化を、コードするDNAへと導入することにより調製することもでき、且つ/又は所望の抗体若しくはポリペプチドの合成により調製することもできる。当業者は、アミノ酸変化が、グリコシル化部位の数若しくは位置の変化、又は膜アンカリング特徴の変更など、抗ネクチン4抗体の翻訳後過程を変更しうることを理解する。
一部の実施形態では、第1のグルタミンをその配列内に有するポリペプチドを含む、本明細書で提供される抗体のいずれにおいても、第1の残基におけるグルタミンをピログルタミン酸で置換することができる。このような置換は、天然の生理学的条件で、又はin vitro若しくはex vivoの、pHを約7とする緩衝液中で生じる。このような置換は、第1のグルタミンを有するポリペプチドを含む抗体を、ピログルタミン酸を形成する、第1のグルタミンのグルタミニルの環化が優先される条件下、例えば、酢酸及びトリフルオロ酢酸などの弱酸溶液下に置くことにより実施することができる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体を、例えば、任意の種類の分子の、抗体への共有結合的接合により化学的に修飾する。抗体の誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護(protecting/blocking)基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞のリガンド又は他のタンパク質への連結などにより、化学修飾された抗体を含みうる。多数の化学的修飾のうちのいずれかは、特異的な化学的切断、アセチル化、製剤化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含むがこれらに限定されない、公知の技法により実行することができる。加えて、抗体は、1又は複数の、非古典的アミノ酸を含有しうる。
変異は、抗体又はポリペプチドをコードする、1又は複数のコドンの置換、欠失、又は挿入であって、天然配列の抗体又はポリペプチドと比較した、アミノ酸配列の変化を結果としてもたらす、上記置換、欠失、又は挿入でありうる。アミノ酸置換は、ロイシンの、セリンによる置きかえ、例えば、保存的なアミノ酸の置きかえなど、同様な構造的特性及び/又は化学的特性を有する、1つのアミノ酸を、別のアミノ酸で置きかえることの結果でありうる。例えば、アミノ酸置換を結果としてもたらす、部位指向突然変異誘発及びPCR媒介性突然変異誘発を含む、当業者に公知の標準的技法を使用して、本明細書で提供される分子をコードするヌクレオチド配列内に、突然変異を導入することができる。挿入又は欠失は、任意選択で、約1~5アミノ酸の範囲でありうる。ある特定の実施形態では、置換、欠失、又は挿入は、元の分子と比べて、25カ所より少ないアミノ酸置換、20カ所より少ないアミノ酸置換、15カ所より少ないアミノ酸置換、10カ所より少ないアミノ酸置換、5カ所より少ないアミノ酸置換、4カ所より少ないアミノ酸置換、3カ所より少ないアミノ酸置換、又は2カ所より少ないアミノ酸置換を含む。具体的な実施形態では、置換は、1又は複数の、予測される、非必須アミノ酸残基においてなされる、保存的アミノ酸置換である。許容される変異は、配列内に、アミノ酸の挿入、欠失、又は置換を、体系的に施し、結果として得られる変異体を、全長天然配列又は成熟天然配列が呈する活性について調べることにより決定することができる。
アミノ酸配列の挿入は、1残基~100又はこれを超える残基のほか、単一のアミノ酸残基又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含有することポリペプチドの長さの範囲の、アミノ末端融合体及び/又はカルボキシル末端融合体を含む。末端挿入の例は、N末端のメチオニル残基を伴う抗体を含む。抗体分子の、他の挿入変異体は、抗体のN末端又はC末端の、酵素(例えば、抗体指向酵素によるプロドラッグ療法)又は抗体の血清半減期を延長するポリペプチドへの融合体を含む。
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を、同様な電荷を伴う側鎖を有するアミノ酸残基で置きかえるアミノ酸置換である。当技術分野では、同様な電荷を伴う側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非帯電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ-分枝状側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を伴うアミノ酸を含む。代替的に、突然変異は、飽和突然変異誘発などにより、コード配列の全部又は一部に沿って、ランダムに導入することもでき、結果として得られる突然変異体を、生物学的活性についてスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発の後、コードされたタンパク質を発現させ、タンパク質の活性を決定することができる。
抗体の生物学的特性の、実質的な修飾は、(a)置換領域内の、ポリペプチドの構造骨格、例えば、シートヘリックスコンフォメーション又はヘリックスコンフォメーション、(b)標的部位における、分子の電荷若しくは疎水性、又は(c)側鎖のバルクの維持に対するそれらの効果が著明に異なる置換を選択することにより達することができる。代替的に、保存的(例えば、同様な特性及び/又は側鎖による、アミノ酸群内の)置換は、特性を維持するか、又はこれを著明に変化させないように施すことができる。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性:(1)非極性:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M);(2)非帯電極性:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q);(3)酸性:Asp(D)、Glu(E);及び(4)塩基性:Lys(K)、Arg(R)、His(H)に従い、群分けすることができる(例えば、Lehninger、Biochemistry、73~75(2版、1975)を参照されたい)。
代替的に、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性:(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性の親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性:Asp、Glu;(4)塩基性:His、Lys、Arg;(5)鎖の配向性に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;及び(6)芳香族:Trp、Tyr、Pheに基づき、群へと分けることができる。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを、別のクラスのメンバーと交換することを伴う。このような置換残基はまた、保存的置換部位へと導入することもでき、残りの(非保存的)部位へと導入することもできる。したがって、一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも35%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも40%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも45%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも50%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも55%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも60%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも65%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも70%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも75%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも85%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも99%同一なアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1~2で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1~2で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも35%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1~2で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも40%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1~2で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも45%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1~2で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも50%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1~2で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも55%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1~2で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも60%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1~2で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも65%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1~2で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも70%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1~2で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも75%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1~2で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1~2で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも85%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1~2で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1~2で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1~2で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも99%同一なアミノ酸配列を含む。
さらに別の実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1で描示されたVH CDRのアミノ酸配列、及び/又は表1で描示されたVL CDRのアミノ酸配列と、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%同一な、VH CDR及び/又はVL CDRのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1で描示されたVH CDRのアミノ酸配列、及び/又は表1で描示されたVL CDRのアミノ酸配列と、少なくとも35%同一な、VH CDR及び/又はVL CDRのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1で描示されたVH CDRのアミノ酸配列、及び/又は表1で描示されたVL CDRのアミノ酸配列と、少なくとも40%同一な、VH CDR及び/又はVL CDRのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1で描示されたVH CDRのアミノ酸配列、及び/又は表1で描示されたVL CDRのアミノ酸配列と、少なくとも45%同一な、VH CDR及び/又はVL CDRのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1で描示されたVH CDRのアミノ酸配列、及び/又は表1で描示されたVL CDRのアミノ酸配列と、少なくとも50%同一な、VH CDR及び/又はVL CDRのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1で描示されたVH CDRのアミノ酸配列、及び/又は表1で描示されたVL CDRのアミノ酸配列と、少なくとも55%同一な、VH CDR及び/又はVL CDRのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1で描示されたVH CDRのアミノ酸配列、及び/又は表1で描示されたVL CDRのアミノ酸配列と、少なくとも60%同一な、VH CDR及び/又はVL CDRのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1で描示されたVH CDRのアミノ酸配列、及び/又は表1で描示されたVL CDRのアミノ酸配列と、少なくとも65%同一な、VH CDR及び/又はVL CDRのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1で描示されたVH CDRのアミノ酸配列、及び/又は表1で描示されたVL CDRのアミノ酸配列と、少なくとも70%同一な、VH CDR及び/又はVL CDRのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1で描示されたVH CDRのアミノ酸配列、及び/又は表1で描示されたVL CDRのアミノ酸配列と、少なくとも75%同一な、VH CDR及び/又はVL CDRのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1で描示されたVH CDRのアミノ酸配列、及び/又は表1で描示されたVL CDRのアミノ酸配列と、少なくとも80%同一な、VH CDR及び/又はVL CDRのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1で描示されたVH CDRのアミノ酸配列、及び/又は表1で描示されたVL CDRのアミノ酸配列と、少なくとも85%同一な、VH CDR及び/又はVL CDRのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1で描示されたVH CDRのアミノ酸配列、及び/又は表1で描示されたVL CDRのアミノ酸配列と、少なくとも90%同一な、VH CDR及び/又はVL CDRのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1で描示されたVH CDRのアミノ酸配列、及び/又は表1で描示されたVL CDRのアミノ酸配列と、少なくとも95%同一な、VH CDR及び/又はVL CDRのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン4エピトープに結合する抗体又はその断片は、表1で描示されたVH CDRのアミノ酸配列、及び/又は表1で描示されたVL CDRのアミノ酸配列と、少なくとも99%同一な、VH CDR及び/又はVL CDRのアミノ酸配列を含む。
変化形は、オリゴヌクレオチド媒介性(部位指向)突然変異誘発、アラニン走査、及びPCR突然変異誘発など、当技術分野で公知の方法を使用して作ることができる。部位指向突然変異誘発(例えば、Carter、1986、BiochemJ.、237:1~7;及びZollerら、1982、Nucl.Acids Res.、10:6487~500を参照されたい)、カセット突然変異誘発(例えば、Wellsら、1985、Gene、34:315~23を参照されたい)、又は他の公知の技法を、クローニングされたDNA上で実施して、抗ネクチン4抗体の変異体DNAを作製することができる。
抗ネクチン4抗体の適正なコンフォメーションの維持に関与しない、任意のシステイン残基もまた、例えば、アラニン又はセリンなど、別のアミノ酸で置換して、分子の酸化に対する安定性を改善し、異常な架橋を防止することができる。結果として、システイン結合(単数又は複数)を、抗ネクチン4抗体へと付加して、その安定性を改善することもできる(例えば、抗体が、Fv断片などの抗体断片である場合)。
一部の実施形態では、本開示の抗ネクチン4抗体分子は、「脱免疫化」抗体である。「脱免疫化」抗ネクチン4抗体は、それぞれの、元の非脱免疫化抗体と比較した、抗体の免疫原性の軽減を結果としてもたらす、そのアミノ酸配列内の、1又は複数の変更を有する、ヒト化抗ネクチン4抗体又はキメラ抗ネクチン4抗体から導出された抗体である。このような抗体の突然変異体を作出するための手順の1つは、抗体分子のT細胞エピトープの同定及び除去を伴う。第1のステップでは、抗体分子の免疫原性は、いくつかの方法、例えば、当技術分野で公知の通り、T細胞エピトープの、in vitroにおける決定、又はこのようなエピトープの、コンピューターによる予測により決定することができる。T細胞エピトープ機能に極めて重要な残基を同定したら、免疫原性を除去し、抗体活性を保持するように、突然変異を施すことができる。総説については、例えば、Jonesら、2009、Methods in Molecular Biology、525:405~23を参照されたい。
20.in vitroにおけるアフィニティー成熟
一部の実施形態では、親抗体と比較して改善された、アフィニティー、安定性、又は発現レベルなどの特性を有する抗体の変異体は、in vitroにおけるアフィニティー成熟により調製することができる。天然の原型と同様に、in vitroにおけるアフィニティー成熟は、突然変異及び選択の原理に基づく。抗体のライブラリーは、生物(例えば、ファージ、細菌細胞、酵母細胞、又は哺乳動物細胞)の表面上にあるか、又はそれらのコードmRNA若しくはコードDNAと会合した(例えば、共有結合的に会合するか、又は非共有結合的に会合した)、Fab断片、scFv断片、又はVドメイン断片として提示される。提示された抗体の、アフィニティーによる選択は、抗体をコードする遺伝情報を保有する生物又は複合体の単離を可能とする。ファージディスプレイなどの提示方法を使用する、2又は3ラウンドの突然変異及び選択は通例、低ナノモル範囲のアフィニティーを伴う抗体断片を結果としてもたらす。アフィニティー成熟抗体は、標的抗原に対する、ナノモル単位、なお又はピコモル単位のアフィニティーを有しうる。
ファージディスプレイは、抗体の提示及び選択のための、普及した方法である。抗体は、Fdバクテリオファージ又はM13バクテリオファージの表面において、バクテリオファージコートタンパク質との融合体として提示される。選択は、「パニング」と称する工程である、ファージにより提示された抗体が、それらの標的に結合することを可能とする曝露の工程を伴う。抗原に結合したファージを回収し、細菌に感染させて、さらなるラウンドの選択のためのファージをもたらすのに使用する。総説については、例えば、Hoogenboom、2002、Methods Mol.Biol.、178:1~37;並びにBradbury及びMarks、2004、J.Immunol.Methods、290:29~49を参照されたい。
酵母ディスプレイ系(例えば、Boderら、1997、Nat.Biotech.、15:553~57;及びChaoら、2006、Nat.Protocols、1:755~68を参照されたい)では、抗体は、重鎖と軽鎖とを、可撓性リンカーにより接続した、単鎖可変融合体(scFv)として提示することができる。scFvを、酵母アグルチニンタンパク質であるAga2pの接着サブユニットと融合させると、Aga2pは、Aga1pへのジスルフィド結合を介して、酵母細胞壁と接合する。Aga2pを介するタンパク質の提示は、タンパク質を、細胞表面から突出させ、酵母細胞壁上の他の分子との潜在的な相互作用を最小化する。磁気による分離及びフローサイトメトリーを使用して、アフィニティー又は安定性が改善された抗体について選択するように、ライブラリーをスクリーニングする。目的の可溶性抗原への結合は、ビオチニル化抗原及びフルオロフォアへとコンジュゲートさせたストレプトアビジンなどの二次試薬による酵母の標識化により決定する。抗体の表面発現の変動は、scFvを挟む、ヘマグルチニンエピトープタグ又はc-Mycエピトープタグの、免疫蛍光による標識化を介して測定することができる。発現は、提示されたタンパク質の安定性と相関することが示されているので、抗体を、安定性のほか、アフィニティーの改善についても選択することができる(例えば、Shustaら、1999、J.Mol.Biol.、292:949~56を参照されたい)。酵母ディスプレイのさらなる利点は、提示されたタンパク質が、酵母真核細胞の小胞体内にフォールディングされ、小胞体シャペロン及び品質管理機構を利用することである。成熟が完了したら、酵母の表面上に提示しながら、抗体アフィニティーを「滴定する」ことが可能であり、各クローンの発現及び精製に対する必要が廃されるので好都合である。酵母表面ディスプレイの理論的限界は、他のディスプレイ方法のライブラリーサイズより潜在的に小さな、機能的ライブラリーサイズであるが、最近の手法は、酵母細胞の交配系を使用して、1014のサイズであると推定される、コンビナトリアルの多様性を創出する(例えば、米国特許公開第2003/0186374号;及びBlaiseら、2004、Gene、342:211~18を参照されたい)。
リボソームディスプレイでは、無細胞系内の選択のために、抗体-リボソーム-mRNA(ARM)複合体を作出する。特定の抗体のライブラリーのためのDNAライブラリーコードを、終止コドンを欠くスペーサー配列と遺伝子融合させる。このスペーサー配列は、翻訳されてもなおペプチジルtRNAと接合しており、リボソームトンネルを占有するので、目的のタンパク質の、リボソームの外部への突出及びフォールディングを可能とする。結果として得られる、mRNA、リボソーム、及びタンパク質の複合体は、表面に結合したリガンドに結合することが可能であり、リガンドによるアフィニティー捕捉を介して、抗体及びそのコードmRNAの同時的な単離を可能とする。次いで、リボソームに結合したmRNAは、逆転写されてcDNAへと戻り、次いで、cDNAは、突然変異誘発を受け、次ラウンドの選択において使用されうる(例えば、Fukudaら、2006、Nucleic Acids Res.、34:e127を参照されたい)。mRNAディスプレイでは、抗体とmRNAとの共有結合は、ピューロマイシンをアダプター分子として使用して確立する(Wilsonら、2001、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、98:3750~55)。
これらの方法は、完全に、in vitroにおいて実施されるので、他の選択技術を上回る、2つの主要な利点をもたらす。まず、ライブラリーの多様性は、細菌細胞の形質転換効率に限定されず、試験管内に存在する、リボソーム及び異なるmRNA分子の数だけにより限定される。第2に、任意の多様化ステップの後で、形質転換しなければならないライブラリーは存在しないので、各選択ラウンドの後で、例えば、非プルーフリーディングポリメラーゼにより、ランダム突然変異を容易に導入することができる。
哺乳動物細胞ディスプレイ系(例えば、Bowersら、2011、Proc Natl Acad Sci USA.、108:20455~60を参照されたい)では、IgGの完全ヒトライブラリーを、あらかじめ組み換えられたD(J)領域へと接合させた、生殖細胞系列配列のV遺伝子セグメントに基づき構築する。重鎖及び軽鎖の全長V領域を、ヒト重鎖及びヒト軽鎖の定常領域とアセンブルし、哺乳動物の細胞系(例えば、HEK293)に、これをトランスフェクトする。トランスフェクトされたライブラリーを、拡大し、ストレプトアビジン(SA)カップリング磁気ビーズに対する、いくつかのラウンドの陰性選択に続く、ビオチニル化標的タンパク質、ペプチド断片、又はエピトープでコーティングされたSAカップリング磁気ビーズに対する、1ラウンドの陽性選択にかけた。陽性選択された細胞を拡大し、次いで、1ラウンドのFACSにより分取して、標的のタンパク質、ペプチド断片、又はエピトープに特異的に結合する抗体を提示する、単一細胞クローンを単離する。これらの単一細胞クローンに由来する重鎖と軽鎖との対を、さらなる成熟のために、AIDと共に、リトランスフェクトする。AID誘発型体細胞超変異とカップリングさせた、いくつかのラウンドの哺乳動物細胞ディスプレイは、高特異性の高アフィニティー抗体を作出する。
多様性はまた、抗体ライブラリーのCDR又は全V遺伝子へと、ターゲティングされた形で導入することもでき、ランダム導入を介して導入することもできる。前者の手法は、高レベル又は低レベルの突然変異誘発を介して、抗体の全てのCDRを、逐次的にターゲティングするか、或いは体細胞超突然変異の孤立したホットスポット(例えば、Hoら、2005、J.Biol.Chem.、280:607~17を参照されたい)、又は実験ベースで、若しくは構造的理由で、アフィニティーに影響を及ぼすことが疑われる残基をターゲティングするステップを含む。多様性はまた、DNAシャフリング又は同様な技法を介して、天然の、多様な領域の置きかえにより導入することもできる(例えば、Luら、2003、J.Biol.Chem.、278:43496~507;米国特許第5,565,332号及び同第6,989,250号を参照されたい)。代替的な技法は、フレームワーク領域の残基へと伸長する、超可変ループをターゲティングし(例えば、Bondら、2005、J.Mol.Biol.、348:699~709を参照されたい)CDR内の、ループの欠失及び挿入を用いるか、又はハイブリダイゼーションベースの多様化を使用する(例えば、米国特許公開第2004/0005709号を参照されたい)。CDR内の多様性を作出する、さらなる方法については、例えば、米国特許第7,985,840号において開示されている。抗体ライブラリーを作出し、且つ/又は抗体のアフィニティー成熟を発生させるのに使用されうる、さらなる方法については、例えば、それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第8,685,897号、及び同第8,603,930号、並びに米国公開第2014/0170705号、同第2014/0094392号、同第2012/0028301号、同第2011/0183855号、及び同第2009/0075378号において開示されている。
ライブラリーのスクリーニングは、当技術分野で公知の、多様な技法により達することができる。例えば、ネクチン4は、固体支持体、カラム、ピン、又はセルロース/ポリ(フッ化ビニリデン)膜/他のフィルターへと固定化することもでき、吸着プレートへと固定された宿主細胞上で発現させることもでき、細胞分取において使用することもでき、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズによる捕捉のために、ビオチンへとコンジュゲートさせることもでき、ディスプレイライブラリーをパニングするための、他の任意の方法において使用することもできる。
in vitroにおけるアフィニティー成熟方法の総説については、例えば、Hoogenboom、2005、Nature Biotechnology、23:1105~16;Quiroz及びSinclair、2010、Revista Ingeneria Biomedia、4:39~51;及びこれらにおける参考文献を参照されたい。
21.抗ネクチン4抗体の修飾
抗ネクチン4抗体共有結合的修飾は、本開示の範囲内に含まれる。共有結合的修飾は、抗ネクチン4抗体の標的アミノ酸残基を、抗ネクチン4抗体の、選択された側鎖残基又はN末端残基若しくはC末端残基と反応することが可能な、有機誘導体化剤と反応させることを含む。他の修飾は、グルタミニル残基及びアスパラギニル残基の、それぞれ、対応する、グルタミル残基及びアスパルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル残基又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン側鎖、アルギニン側鎖、及びヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化(例えば、Creighton、「タンパク質:構造と分子特性(Proteins:Structure and Molecular Properties)」、79~86(1983)を参照されたい)、N末端のアミンのアセチル化、及び任意のC末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本開示の範囲内に含まれる、抗ネクチン4抗体の共有結合的修飾の他の種類は、抗体又はポリペプチドの、天然のグリコシル化パターンを変更すること(例えば、Beckら、2008、Curr.Pharm.Biotechnol.、9:482~501;及びWalsh、2010、Drug Discov.Today、15:773~80を参照されたい)、及び抗体を、様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのうちの1つへと、例えば、米国特許第4,640,835号;同第4,496,689号;同第4,301,144号;同第4,670,417号;同第4,791,192;又は同第4,179,337号において明示されている形で連結することを含む。
本開示の抗ネクチン4抗体はまた、別の、異種ポリペプチド配列又は異種アミノ酸配列、例えば、エピトープタグへと融合させた抗ネクチン4抗体を含むキメラ分子(例えば、Terpe、2003、Appl.Microbiol.Biotechnol.、60:523~33を参照されたい)、又はIgG分子のFc領域(例えば、Aruffo、「抗体融合タンパク質(Antibody Fusion Proteins)」、221~42(Chamow及びAshkenazi編、1999)を参照されたい)を形成するようにも修飾することができる。
本明細書ではまた、本明細書で提供されるネクチン4抗原に結合する抗体と、異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質も提供される。一部の実施形態では、抗体を融合させた異種ポリペプチドは、抗体を、細胞表面でネクチン4を発現した細胞へとターゲティングするために有用である。
本明細書ではまた、ネクチン4抗原に結合する抗体のパネルも提供される。具体的な実施形態では、抗体のパネルは、ネクチン4抗原に対する、異なる会合速度、異なる解離速度、異なるアフィニティー、及び/又はネクチン4抗原に対する、異なる特異性を有する。一部の実施形態では、パネルは、約10、約25、約50、約75、約100、約125、約150、約175、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約550、約600、約650、約700、約750、約800、約850、約900、約950、又は約1000、又はこれを超える抗体を含むか、又はこれらからなる。抗体のパネルは、例えば、ELISAなどのアッセイなどのための、96ウェルプレート又は384ウェルプレートにおいて使用することができる。
22.抗ネクチン4抗体の調製
抗ネクチン4抗体は、抗ネクチン4抗体をコードする核酸を含有するベクターで形質転換された細胞、又はこれをトランスフェクトされた細胞を培養することにより作製することができる。本開示の抗体のポリペプチド構成要素をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技法を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離し、シーケンシングすることができる。代替的に、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成器又はPCR技法を使用して合成することもできる。得られたら、ポリペプチドをコードする配列を、宿主細胞内で複製し、異種ポリヌクレオチドを発現させることが可能な組換えベクターへと挿入する。当技術分野で利用可能であり、公知である、多くのベクターを、本開示の目的で使用することができる。適切なベクターの選択は、主に、ベクターへと挿入される核酸のサイズ、及びベクターにより形質転換される特定の宿主細胞に依存するであろう。本開示の抗体を発現させるのに適する宿主細胞は、古細菌及びグラム陰性生物又はグラム陽性生物を含む真正細菌などの原核細胞、線維状真菌又は酵母などの真核微生物、昆虫細胞又は植物細胞などの非脊椎動物細胞、及び哺乳動物などの脊椎動物細胞の宿主細胞系を含む。宿主細胞を、上記で記載した発現ベクターで形質転換し、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適するように修飾された、従来の栄養培地中で培養した。宿主細胞により産生された抗体は、当技術分野で公知の、標準的なタンパク質精製方法を使用して精製する。
抗体を作製するための方法であって、ベクターの構築、発現、及び精製を含む上記方法については、Plueckthunら、「抗体の操作:大腸菌における抗体の作製:PCRから発酵まで(Antibody Engineering:Producing antibodies in Escherichia coli:From PCR to fermentation)」、203~52(McCaffertyら編、1996);Kwong及びRader、「Fab抗体断片の、大腸菌による発現及び精製(E.coli Expression and Purification of Fab Antibody Fragments)」、「タンパク質科学における最新のプロトコール(Current Protocols in Protein Science)」(2009);Tachibana及びTakekoshi、「大腸菌における抗体Fab断片の作製(Production of Antibody Fab Fragments in Escherischia coli)」、「抗体の発現及び作製(Antibody Expression and Production)」(Al-Rubeai編、2011);並びに「治療用モノクローナル抗体:実験室から臨床まで(Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic)」(An編、2009)においてさらに記載されている。
当然ながら、当技術分野で周知の、代替的な方法を用いて、抗ネクチン4抗体を調製することも想定される。例えば、適切なアミノ酸配列又はその部分は、固相法を使用する直接的ペプチド合成により作製することができる(例えば、Stewartら、「固相ペプチド合成(Solid-Phase Peptide Synthesis)」、(1969);及びMerrifield、1963、J.Am.Chem.Soc.、85:2149~54を参照されたい)。in vitroにおけるタンパク質合成は、手動技法を使用して実施することもでき、自動化により実施することもできる。抗ネクチン4抗体の多様な部分は、個別に化学合成し、化学方法又は酵素方法を使用して、所望の抗ネクチン4抗体を作製するように組み合わせることができる。代替的に、抗体は、例えば、米国特許第5,545,807号及び同第5,827,690号において開示されている通り、抗体を発現するように操作されたトランスジェニック動物の、細胞又はミルクなどの体液から精製することもできる。
23.イムノコンジュゲート
本開示はまた、合成リンカーにより、1又は複数の非抗体薬剤へと共有結合的に結合させた、本開示の抗ネクチン4抗体のうちのいずれか1つを含むコンジュゲートも提供する。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体を、例えば、診断用分子又は検出可能な分子とコンジュゲートさせるか、又は組換えにより融合させる。コンジュゲートさせるか、又は組換えにより融合させた抗体は、例えば、ネクチン4媒介性疾患の、発病、発症、進行、及び/又は重症度をモニタリング又は予後診断するために有用でありうる。
このような診断及び検出は、例えば、抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼなどであるがこれらに限定されない、多様な酵素;ストレプトアビジン/ビオチン又はアビジン/ビオチンなどであるがこれらに限定されない補欠分子族;ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、又はフィコエリトリンなどであるがこれらに限定されない蛍光物質;ルミノールなどであるがこれらに限定されない、発光物質;ルシフェラーゼ、ルシフェリン、又はエクオリンなどであるがこれらに限定されない生物発光物質;アクリジニウムベースの化合物又はHALOTAGなどであるがこれらに限定されない化学発光物質;ヨウ素(131I、125I、123I、及び121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(115In、113In、112In、及び111In)、テクネシウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、ガリウム(68Ga及び67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(133Xe)、フッ素(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、又は117Snなどであるがこれらに限定されない放射性物質;ポジトロン放出金属を使用する、多様なポジトロン放出断層撮影法;及び非放射性常磁性金属イオンを含むがこれらに限定されない検出用物質へとカップリングすることにより達することができる。
本明細書ではまた、融合タンパク質を作出するように、異種タンパク質又は異種ポリペプチド(又はその断片、例えば、約10、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、又は約100アミノ酸のポリペプチド)へと、組換えにより融合させるか、又は化学的にコンジュゲートさせた(共有結合的コンジュゲーション又は非共有結合的コンジュゲーション)抗体のほか、それらの使用も提供される。特に、本明細書では、本明細書で提供される抗体の抗原結合性断片(例えば、Fab断片、Fc断片、Fv断片、F(ab)2断片、VHドメイン、VH CDR、VLドメイン、又はVL CDR)と、異種タンパク質、異種ポリペプチド、又は異種ペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。一実施形態では、抗体を融合させた、異種タンパク質、異種ポリペプチド、又は異種ペプチドは、抗体を、ネクチン4を発現する細胞など、特定の細胞型へとターゲティングするのに有用である。例えば、特定の細胞型が発現する細胞表面受容体に結合する抗体を、本明細書で提供される修飾抗体へと、融合させるか、又はコンジュゲートさせることができる。
さらに、本明細書で提供される抗体は、精製を容易とするように、ペプチドなどのマーカー配列又は「タグ」配列と融合させることができる。具体的な実施形態では、マーカー又はタグのアミノ酸配列は、それらのうちの多くが市販されている中でも、pQEベクター(例えば、QIAGEN,Inc.を参照されたい)において提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチドである。例えば、Gentzら、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86:821~24において記載されている通り、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の好都合な精製をもたらす。精製に有用な、他のペプチドタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する、ヘマグルチニン(「HA」)タグ(Wilsonら、1984、Cell、37:767~78)、ストレプトアビジン/アビジン結合ペプチド、及び「FLAG」タグを含むがこれらに限定されない。
部分(ポリペプチドを含む)を、抗体へと融合又はコンジュゲートさせるための方法は、公知である(例えば、Arnonら、「がん治療における薬物の免疫ターゲティングのためのモノクローナル抗体(Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy)」、「モノクローナル抗体とがん治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)」、243~56(Reisfeldら編、1985);Hellstromら、「薬物送達のための抗体(Antibodies for Drug Delivery)」、「薬物送達の制御(Controlled Drug Delivery)」、623~53(Robinsonら編、2版、1987);Thorpe、「がん治療における細胞傷害作用剤のキャリア抗体:総説(Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy:A Review)」、「モノクローナル抗体:生物学的応用及び臨床的応用(Monoclonal Antibodies:Biological and Clinical Applications)」、475~506(Pincheraら編、1985);「がん治療における放射性標識化抗体の治療的使用についての解析、結果、及び将来的展望(Analysis,Results,and Future Prospective of Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy)」、「がんの検出及び治療のためのモノクローナル抗体(Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy)」、303~16(Baldwinら編、1985);Thorpeら、1982、Immunol.Rev.、62:119~58;米国特許第5,336,603号;同第5,622,929号;同第5,359,046号;同第5,349,053号;同第5,447,851号;同第5,723,125号;同第5,783,181号;同第5,908,626号;同第5,844,095号;及び同第5,112,946号;EP307,434;EP367,166;EP394,827;PCT公開第WO91/06570号、同第WO96/04388号、同第WO96/22024号、同第WO97/34631号、及び同第WO99/04813号;Ashkenaziら、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88:10535~39;Trauneckerら、1988、Nature、331:84~86;Zhengら、1995、J.Immunol.、154:5590~600;及びVilら、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:11337~41を参照されたい)。
融合タンパク質は、例えば、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、及び/又はコドンシャフリング(「DNAシャフリング」と総称する)技法を介して作出することができる。DNAシャフリングを用いて、例えば、アフィニティーが大きく、解離速度が小さい抗体を含む、本明細書で提供される抗ネクチン4抗体の活性を変更することができる(例えば、米国特許第5,605,793号;同第5,811,238号;同第5,830,721号;同第5,834,252号;及び同第5,837,458号;Pattenら、1997、Curr.Opinion Biotechnol.、8:724~33;Harayama、1998、Trends Biotechnol.、16(2):76~82;Hanssonら、1999、J.Mol.Biol.、287:265~76;並びにLorenzo及びBlasco、1998、Biotechniques、24(2):308~13を参照されたい)。抗体、又はコードされる抗体は、組換えの前に、エラープローンPCR、ランダムヌクレオチド挿入、又は他の方法を介する、ランダム突然変異誘発にかけることにより変更することができる。本明細書で提供される抗体をコードするポリヌクレオチドは、1又は複数の異種分子の、1又は複数の構成要素、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などにより組み換えることができる。
本明細書で提供される抗体はまた、例えば、米国特許第4,676,980号において記載されている通り、抗体ヘテロコンジュゲートを形成するように、第2の抗体へもコンジュゲートすることができる。
本明細書で提供される、ネクチン4に結合する抗体はまた、特に、イムノアッセイ又は標的抗原の精製に有用な、固体支持体へと接合させることもできる。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンを含むがこれらに限定されない。
リンカーは、細胞内のコンジュゲート薬剤の放出を容易とする「切断型リンカー」でありうるが、本明細書では、非切断型リンカーもまた想定される。本開示のコンジュゲートにおける使用のためのリンカーは、限定なしに述べると、酸不安定性リンカー(例えば、ヒドラゾンリンカー)、ジスルフィドを含有するリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー(例えば、バリン及び/若しくはシトルリン、シトルリン-バリン、又はフェニルアラニン-リシンなどのアミノ酸を含む、例えば、ペプチドリンカー)、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーを含む(例えば、Chariら、1992、Cancer Res.、52:127~31;及び米国特許第5,208,020号を参照されたい)、多剤輸送体媒介性耐性を回避するようにデザインされた、チオエーテルリンカー又は親水性リンカー(例えば、Kovtunら、2010、Cancer Res.、70:2528~37を参照されたい)。
抗体及び薬剤のコンジュゲートは、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、スルホ-SMPB、及びSVSB(スクシンイミジル-(4-ビニルスルホン)ベンゾアートなど、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作ることができる。本開示はさらに、当技術分野で開示される、任意の適切な方法を使用して、抗体及び薬剤のコンジュゲートを調製しうることも想定する(例えば、「バイオコンジュゲート技法(Bioconjugate Techniques)」(Hermanson編、2版、2008)を参照されたい)。
抗体及び薬剤のための、従来のコンジュゲーション戦略は、Lys残基のε-アミノ基又はCys残基のチオール基を伴う、ランダムコンジュゲーション化学反応であって、異種コンジュゲートを結果としてもたらす、上記化学反応に基づく。近年になって開発された技法は、同種ローディングを結果としてもたらし、抗原結合性又は薬物動態が変更されたコンジュゲート亜集団を回避する、抗体との部位特異的コンジュゲーションを可能とする。これらは、重鎖上及び軽鎖上の位置におけるシステイン置換を含む、「チオmab」の操作であって、反応性のチオール基をもたらすが、免疫グロブリンのフォールディング及びアセンブリーを破壊したり、抗原結合を変更したりしない、上記操作を含む(例えば、Junutulaら、2008、J.Immunol.Meth.、332:41~52;及びJunutulaら、2008、Nature Biotechnol.、26:925~32を参照されたい)。別の方法では、終止コドンであるUGAを、終結部から、セレノシステイン挿入部へと再コードすることにより、セレノシステインを、抗体配列へと、共翻訳により挿入し、他の天然アミノ酸の存在下において、セレノシステインの求核性セレノール基における、部位特異的共有結合的コンジュゲーションを可能とする(例えば、Hoferら、2008、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、105:12451~56;及びHoferら、2009、Biochemistry、48(50):12047~57を参照されたい)。
本明細書の他の実施形態では、治療用部分(又は1若しくは複数の治療用部分)へとコンジュゲートさせるか、又は組換えにより融合させた抗体が提供される。抗体は、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制剤又は殺細胞剤、治療剤、又は放射性金属イオン、例えば、アルファ放射体などの治療用部分とコンジュゲートさせるか、又は組換えにより融合させることができる。細胞毒素又は細胞傷害剤は、細胞に有害な、任意の薬剤を含む。治療用部分は、代謝拮抗剤(例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシル デカルバジン);アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロランブシル、メルファラン、カルムスチン(BCNU)、及びロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、及びシス-ジクロロジアミン白金(II)(DDP、シスプラチン);アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(旧称:ダウノマイシン)及びドキソルビシン);抗生剤(例えば、ダクチノマイシン(旧称:アクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン(AMC));アウリスタチン分子(例えば、アウリスタチンPHE、ブリオスタチン1、及びソラスタチン10;それらの全てが、参照により本明細書に組み込まれる、Woykeら、Antimicrob.Agents Chemother.、46:3802~8(2002)、Woykeら、Antimicrob.Agents Chemother.、45:3580~4(2001)、Mohammadら、Anticancer Drugs、12:735~40(2001)、Wallら、Biochem.Biophys.Res.Commun.、266:76~80(1999)、Mohammadら、Int.J.Oncol.15:367~72(1999)を参照されたい。);ホルモン(例えば、グルココルチコイド、プロゲスチン、アンドロゲン、及びエストロゲン)、DNA修復酵素阻害剤(例えば、エトポシド又はトポテカン)、キナーゼ阻害剤(例えば、化合物ST1571である、メシル酸イマチニブ(Kantarjianら、Clin Cancer Res.、8(7):2167~76(2002));細胞傷害剤(例えば、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにこれらの類似体又は相同体、並びに米国特許第6,245,759号、同第6,399,633号、同第6,383,790号、同第6,335,156号、同第6,271,242号、同第6,242,196号、同第6,218,410号、同第6,218,372号、同第6,057,300号、同第6,034,053号、同第5,985,877号、同第5,958,769号、同第5,925,376号、同第5,922,844号、同第5,911,995号、同第5,872,223号、同第5,863,904号、同第5,840,745号、同第5,728,868号、同第5,648,239号、同第5,587,459号において開示されている化合物);ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤(例えば、R115777、BMS-214662、並びに例えば、米国特許第6,458,935号、同第6,451,812号、同第6,440,974号、同第6,436,960号、同第6,432,959号、同第6,420,387号、同第6,414,145号、同第6,410,541号、同第6,410,539号、同第6,403,581号、同第6,399,615号、同第6,387,905号、同第6,372,747号、同第6,369,034号、同第6,362,188号、同第6,342,765号、同第6,342,487号、同第6,300,501号、同第6,268,363号、同第6,265,422号、同第6,248,756号、同第6,239,140号、同第6,232,338号、同第6,228,865号、同第6,228,856号、同第6,225,322号、同第6,218,406号、同第6,211,193号、同第6,187,786号、同第6,169,096号、同第6,159,984号、同第6,143,766号、同第6,133,303号、同第6,127,366号、同第6,124,465号、同第6,124,295号、同第6,103,723号、同第6,093,737号、同第6,090,948号、同第6,080,870号、同第6,077,853号、同第6,071,935号、同第6,066,738号、同第6,063,930号、同第6,054,466号、同第6,051,582号、同第6,051,574号、及び同第6,040,305号により開示されているファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤);トポイソメラーゼ阻害剤(例えば、カンプトテシン;イリノテカン;SN-38;トポテカン;9-アミノカンプトテシン;GG-211(GI147211);DX-8951f;IST-622;ルビテカン;ピラゾロアクリジン;XR-5000;サイントピン;UCE6;UCE1022;TAN-1518A;TAN1518B;KT6006;KT6528;ED-110;NB-506;ED-110;NB-506;及びレベカマイシン);ブルガレイン;Hoescht色素33342及びHoechst色素33258などのDNA副溝結合剤;ニチジン;ファガロニン;エピベルベリン;コラリン;ベータ-ラパコン;BC-4-1;ピスホスホナート(例えば、アレンドロナート、シマドロナート(cimadronte)、クロドロナート、チルドロナート、エチドロナート、イバンドロナート、ナリドロナート、オルパンドロナート、リセンドロナート、ピリドロナート、パミドロナート、ゾレンドロナート)、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤(例えば、ロバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、スタチン、セリバスタチン、レスコール、ルピトール、ロスバスタチン、及びアトルバスタチン);アンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、米国特許第6,277,832号、同第5,998,596号、同第5,885,834号、同第5,734,033号、及び同第5,618,709号に開示されているアンチセンスオリゴヌクレオチド);アデノシンデアミナーゼ阻害剤(例えば、フルダラビンリン酸エステル及び2-クロロデオキシアデノシン);イブリツモマブチウキセタン(Zevalin(登録商標));トシツモマブ(Bexxar(登録商標)))、並びにこれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、クラスレート、及びプロドラッグを含むがこれらに限定されない。
さらに、本明細書で提供される抗体は、所与の生物学的応答を修飾する、治療用部分又は薬物部分へとコンジュゲートさせるか、又は組換えにより融合させることができる。治療用部分又は薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されるとみなされるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を保有する、タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドでありうる。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナスエクソトキシン、コレラ毒素、又はジフテリア毒素などの毒素;腫瘍壊死因子、γ-インターフェロン、α-インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質、アポトーシス剤、例えば、TNF-γ、TNF-γ、AIM I(国際公開第WO97/33899号を参照されたい)、AIM II(国際公開第WO97/34911号を参照されたい)、Fasリガンド(Takahashiら、1994、J.Immunol.、6:1567~1574)、及びVEGF(国際公開第WO99/23105号を参照されたい)、抗血管新生剤、例えば、アンギオスタチン、エンドスタチン、若しくは凝固経路の構成要素(例えば、組織因子);又は例えば、リンホカイン(例えば、インターフェロンガンマ、インターロイキン1(「IL-1」)、インターロイキン2(「IL-2」)、インターロイキン5(「IL-5」)、インターロイキン6(「IL-6」)、インターロイキン7(「IL-7」)、インターロイキン9(「IL-9」)、インターロイキン10(「IL-10」)、インターロイキン12(「IL-12」)、インターロイキン15(「IL-15」)、インターロイキン23(「IL-23」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM-CSF」)、及び顆粒球コロニー刺激因子(「G-CSF」))、又は増殖因子(例えば、成長ホルモン(「GH」))、又は凝固薬剤(例えば、カルシウム、ビタミンK、ハーゲマン因子(第XII因子)、高分子量キニノーゲン(HMWK)、プレカリクレイン(PK)、凝固タンパク質である第II因子(プロトロンビン)、第V因子、第XIIa因子、第VIII因子、第XIIIa因子、第XI因子、第XIa因子、第IX因子、第IXa因子、第X因子、リン脂質、及びフィブリン単量体などであるがこれらに限定されない組織因子)などの生物学的応答修飾剤を含みうる。
ネクチン4抗原に免疫特異的に結合する、本明細書で提供される抗体へとコンジュゲートさせるか、又は組換えにより融合させた治療用部分又は薬物は、所望の予防効果又は治療的効果(単数又は複数)を達成するように選び出すべきである。ある特定の実施形態では、抗体は、修飾抗体である。臨床医又は他の医療従事者は、どの治療用部分又は薬物を、本明細書で提供される抗体へとコンジュゲートさせるか、又は組換えにより融合させるのかについて決定する場合に、以下:疾患の性格、疾患の重症度、及び対象の状態について考慮すべきである。
本明細書で使用される、「抗ネクチン4抗体薬物コンジュゲート」又は「抗ネクチン4 ADC」とは、治療用部分(又は1若しくは複数の治療用部分)へとコンジュゲートさせるか、若しくは組換えにより融合させた抗ネクチン4抗体若しくはその抗原結合性断片、又は上記で記載した所与の生物学的応答を修飾する治療用部分若しくは薬物部分へとコンジュゲートさせるか、若しくは組換えにより融合させた抗ネクチン4抗体若しくはその抗原結合性断片を指す。
本明細書では、ネクチン4に特異的に結合する抗ネクチン4抗体を含む、抗ネクチン4 ADCが提供される。本明細書ではまた、本明細書で提供される、抗ネクチン4抗体又はその抗原結合性断片を含む、抗ネクチン4 ADCも提供される。
24.抗体及び組成物を使用する方法
本明細書の一態様では、細胞の増殖を阻害する(例えば、細胞数の倍加の速度を低減するか、細胞数の増大の速度を緩徐化するか、又は細胞数の増大を遮断若しくは防止する)方法であって、細胞を、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン4 ADCと接触させるステップを含む上記方法が提供される。
本明細書の一態様では、細胞の増殖を阻害する方法であって、細胞を、本明細書で提供される、ネクチン4(例えば、ヒトネクチン4のECD、又はヒトネクチン4のECDのエピトープ)に特異的に結合する抗ネクチン4抗体を含む、抗ネクチン4 ADCと接触させるステップを含む上記方法が提供される。ある特定の実施形態では、細胞を、本明細書で記載される、有効量の抗ネクチン4 ADCと接触させる。一部の実施形態では、抗ネクチン4 ADCは、ヒトネクチン4のECDに結合する。一部の実施形態では、抗ネクチン4 ADCは、ヒトネクチン4のECDのエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗ネクチン4 ADCは、ネクチン4リガンド結合性部位とは別個である、ヒトネクチン4のECDのエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約10%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約15%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約20%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約25%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約30%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約35%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約40%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約45%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約50%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約55%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約60%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約65%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約70%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約75%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約80%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約85%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約90%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約95%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約98%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約99%阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約100%阻害する。ある特定の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約25%~約65%阻害する。具体的な実施形態では、細胞の増殖の阻害を、本明細書で記載される方法により評価する。一部の実施形態では、細胞の増殖の阻害を、当業者に公知の方法により評価する。ある特定の実施形態では、細胞の増殖の阻害は、抗ネクチン4 ADCと接触させない細胞の増殖の阻害と比べた阻害である。ある特定の実施形態では、細胞の増殖の阻害は、非類縁抗体(例えば、ネクチン4に特異的に結合しない抗体)、非類縁抗体によるADC、又は非コンジュゲート抗ネクチン4抗体と接触させた細胞の増殖の阻害と比べた阻害である。
25.医薬組成物
一態様では、本開示は、少なくとも1つの、本開示の抗ネクチン4 ADCを含む医薬組成物をさらに提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、1)抗ネクチン4抗体と、2)薬学的に許容される担体とを含む。
抗ネクチン4 ADCを含む医薬組成物は、保存のために、所望の純度を有する抗ネクチン4 ADCを、任意選択の、生理学的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤(例えば、Remington、「レミントンの製薬科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)」(18版、1980)を参照されたい)と、水溶液の形態又は凍結乾燥又は他の乾燥形態で混合することにより調製される。
本開示の抗体は、標的細胞/組織への送達に適する、任意の形態で、例えば、マイクロカプセル又はマクロエマルジョンとして(Remington、前出;Parkら、2005、Molecules、10:146~61;Malikら、2007、Curr.Drug.Deliv.、4:141~51)、徐放製剤として(Putney及びBurke、1998、Nature Biotechnol.、16:153~57)、又はリポソーム内に(Macleanら、1997、Int.J.Oncol.、11:325~32;Kontermann、2006、Curr.Opin.Mol.Ther.、8:39~45)製剤化することができる。
本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCはまた、例えば、コアセルベーション技法により、又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル)内、又はマクロエマルジョン中の、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル内又はゼラチンマイクロカプセル内及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル内に封入することもできる。このような技法については、Remington、前出において開示されている。
リポソーム内、マイクロ粒子内、マイクロカプセル内の封入、抗ネクチン4 ADCを発現させることが可能な組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス(例えば、Wu及びWu、1987、J.Biol.Chem.、262:4429~32を参照されたい)、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築などを含むがこれらに限定されない、多様な組成物及び送達系が公知であり、本明細書で記載される、ネクチン4に結合する抗ネクチン4 ADCと共に使用することができる。別の実施形態では、組成物を、制御放出系又は徐放系として提供することができる。一実施形態では、ポンプを使用して、制御放出又は徐放を達成することができる(例えば、Langer、前出;Sefton、1987、Crit.Ref.Biomed.Eng.、14:201~40;Buchwaldら、1980、Surgery、88:507~16;Saudekら、1989、N.Engl.J.Med.、321:569~74を参照されたい)。別の実施形態では、ポリマー材料を使用して、予防剤又は治療剤(例えば、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADC)、又は本明細書で提供される組成物の制御放出又は徐放を達成することができる(例えば、「制御放出の医学的応用(Medical Applications of Controlled Release)」(Langer及びWise編、1974);「薬物バイオアベイラビリティーの制御、医薬品のデザイン、及び効能(Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance)」(Smolen及びBall編、1984);Ranger及びPeppas、1983、J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.、23:61~126;Levyら、1985、Science、228:190~92;Duringら、1989、Ann.Neurol.、25:351~56;Howardら、1989、J.Neurosurg.、71:105~12;米国特許第5,679,377号;米国特許第5,916,597号;米国特許第5,912,015号;米国特許第5,989,463号;及び米国特許第5,128,326号;PCT公開第WO99/15154号及びPCT公開第WO99/20253号を参照されたい)。徐放製剤中で使用されるポリマーの例は、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリラート)、ポリ(メチルメタクリラート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-co-ビニル酢酸)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(PLG)、ポリ無水物、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(PLA)、ポリ(ラクチド-co-グリコリド)(PLGA)、及びポリオルトエステルを含むがこれらに限定されない。一実施形態では、徐放製剤中で使用されるポリマーは、不活性であり、溶出性の不純物を含まず、保存時に安定であり、無菌であり、且つ生体分解性である。
さらに別の実施形態では、制御放出系又は徐放系は、特定の標的組織、例えば、鼻腔又は肺の近傍に留置することができるので、全身用量の一部しか要求しない(例えば、Goodson、「制御放出の医学的応用(Medical Applications of Controlled Release)」、2巻、115~138頁(1984)を参照されたい)。徐放系については、Langer、1990、Science、249:1527~1533により論じられている。当業者に公知の任意の技法を使用して、1又は複数の、本明細書で提供される、ネクチン4に結合する抗体を含む徐放製剤を作製することができる(例えば、米国特許第4,526,938号、PCT公開第WO91/05548号、及び同第WO96/20698号、Ningら、1996、Radiotherapy & Oncology、39:179~89、Songら、1995、PDA J.of Pharma.Sci.& Tech.、50:372~97、Cleekら、1997、Pro.Int’l.Symp.Contorol Rel.Bioact.Mater.、24:853~54、及びLamら、1997、Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.、24:759~60を参照されたい)。
1又は複数の、本明細書で提供される抗体を含有する治療用製剤は、所望の純度を有する抗ネクチン4 ADCを、任意選択の、生理学的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤(「レミントンの製薬科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)」(1990)、Mack Publishing Co.、Easton、PA)と、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で混合することにより、保存のために調製することができる。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる投与量及び濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、ヒスチジン、及び他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム塩化物;フェノール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール;メチルパラベン又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾールなど);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリシンなどのアミノ酸;単糖、二糖、及び、グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む、他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);並びに/又はTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)、若しくはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤を含む。
本明細書で提供される抗体はまた、例えば、リポソーム内に製剤化することもできる。目的の分子を含有するリポソームは、Epsteinら(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82:3688;Hwangら(1980)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77:4030;並びに米国特許第4,485,045号、及び同第4,544,545号において記載されている方法など、当技術分野で公知の方法により調製される。循環時間を増強したリポソームについては、米国特許第5,013,556号において開示されている。
特に有用なイムノリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を含有する脂質組成物を伴う逆相蒸発方法により作出することができる。規定された小孔径のフィルターを介して、リポソームを押し出して、所望の直径を伴うリポソームをもたらす。本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCのFab’断片を、Martinら(1982)、J.Biol.Chem.、257:286~288に記載されている通り、ジスルフィド交換反応を介して、リポソームへとコンジュゲートさせることができる。任意選択で、化学療法剤(ドキソルビシンなど)を、リポソーム内に含有させることができる。Gabizonら(1989)、J.National Cancer Inst.、81(19):1484を参照されたい。
本明細書で記載される製剤などの製剤はまた、処置される特定の適応に必要な、1つを超える活性化合物も含有しうる。ある特定の実施形態では、製剤は、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCと、互いに、有害な影響を及ぼさない、補完的な活性を伴う、1又は複数の活性化合物とを含む。このような分子は、意図される目的に有効な量で、組み合わせて、適切に存在する。例えば、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCは、1又は複数の他の治療剤と組み合わせることができる。このような組合せ療法を、患者へと、連続的に投与することもでき、同時に投与することもでき、逐次的に投与することもできる。
本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCはまた、例えば、コアセルベーション技法により、又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル)内、又はマクロエマルジョン中の、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル内又はゼラチンマイクロカプセル内及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル内に封入することもできる。このような技法については、「レミントンの製薬科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)」(1990)、Mack Publishing Co.、Easton、PAにおいて開示されている。
in vivoにおける投与に使用される製剤は、滅菌製剤でありうる。これは、滅菌濾過膜を介する濾過によりたやすく達せられる。
また、持続放出調製物も調製することができる。適切な持続放出調製物の例は、抗ネクチン4 ADCを含有する、固体の疎水性ポリマーによる半透性マトリックスであって、成型品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態にあるマトリックスを含む。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ハイドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリル酸)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタマートとのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商標)(乳酸-グリコール酸コポリマーと、酢酸ロイプロリドとから構成される注射用マイクロスフェア)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーが、100日間を超えて、分子の放出を可能とするのに対し、ある特定のハイドロゲルは、タンパク質を放出する期間が短い。封入された抗体は、長時間にわたり、体内にとどまるが、37℃の水分へと曝露される結果として、変性又は凝集し、生体活性の喪失及び可能な免疫原性の変化を結果としてもたらす場合がある。関与する機構に応じた、安定化のための妥当な戦略を案出することができる。例えば、凝集機構が、チオ-ジスルフィド交換を介する、分子間S-S結合の形成であると判明すれば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含量を制御し、適切な添加剤を使用し、特異的なポリマーマトリックス組成物を開発することにより達成することができる。
本明細書で提供される医薬組成物は、治療有効量の、本明細書で提供される抗体のうちの1又は複数と、任意選択で、1又は複数の、さらなる予防剤又は治療剤を、薬学的に許容される担体中に含有する。このような医薬組成物は、ネクチン4媒介性疾患、又はその症状のうちの1又は複数の防止、処置、管理、又は改善において有用である。
本明細書で提供される化合物の投与に適する医薬担体は、特定の投与方式に適することが当業者に公知である、任意のこのような担体を含む。
加えて、本明細書で提供される抗体は、組成物中の唯一の薬学的有効成分として製剤化することもでき、他の有効成分(1又は複数の、他の予防剤又は治療剤など)と組み合わせることもできる。
組成物は、1又は複数の、本明細書で提供される抗体を含有しうる。一実施形態では、抗体は、経口投与のための、溶液、懸濁液、錠剤、分散性錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、徐放製剤、若しくはエリキシル剤、又は非経口投与のための滅菌溶液若しくは懸濁液のほか、経皮パッチ調製物及び乾燥粉末吸入器など、適切な医薬調製物へと製剤化することができる。一実施形態では、上記で記載した抗体を、当技術分野で周知の技法及び手順(例えば、Ansel(1985)、「医薬剤形入門(Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms)」、4版、126頁を参照されたい)を使用して、医薬組成物へと製剤化する。
組成物中では、有効濃度の、1又は複数の抗体又はそれらの誘導体を、適切な医薬担体と混合する。組成物中の化合物の濃度は、投与されると、ネクチン4媒介性疾患又はその症状を処置、防止、又は改善する量の送達に有効である。
一実施形態では、組成物を、単回投与のために製剤化する。処置される状態が、緩和されるか、防止されるか、又は1若しくは複数の症状が改善されるように、組成物を製剤化するために、化合物の重量画分を、選択された担体中、有効濃度で、溶解させるか、懸濁させるか、分散させるか、又は他の形で混合する。
本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを、薬学的に許容される担体中に、処置される患者に対する、所望されない副作用の非存在下で、治療的に有用な効果を及ぼすのに十分な有効量で組み入れる。治療有効濃度は、規定の方法を使用して、in vitro系及びin vivo系において、化合物を調べることにより、経験的に決定し、次いで、ヒトに対する投与のために、これから外挿することができる。
医薬組成物中の抗ネクチン4 ADCの濃度は、例えば、抗ネクチン4 ADCの物理化学的特徴、投与スケジュール、及び投与される量のほか、当業者に公知の他の因子に依存するであろう。
一実施形態では、治療有効投与量は、約0.1ng/ml~約50~100μg/mlの、抗ネクチン4 ADCの血清濃度をもたらす。別の実施形態では、医薬組成物は、1日当たり、体重1キログラム当たり約0.001mg~約2000mgの抗ネクチン4 ADCの投与量をもたらす。単位医薬剤形は、単位剤形当たり、約0.01mg、0.1mg、又は1mg~約500mg、1000mg、又は2000mgをもたらし、一実施形態では、約10mg~約500mgの抗ネクチン4 ADC、及び/又は他の任意選択の不可欠の成分の組合せをもたらすように調製することができる。
抗ネクチン4 ADCは、一度に投与することもでき、ある時間間隔で投与される、多数の小用量へと分けることもできる。処置の正確な投与量及び持続時間は、処置される疾患の関数であり、公知の試験プロトコールを使用して、又は、in vivo又はin vitroにおける試験データからの外挿により、経験的に決定しうることが理解される。濃度及び投与量の値はまた、軽減される状態の重症度によっても変動しうることに留意されたい。任意の特定の対象に応じて、時間経過にわたり、個別の必要、及び組成物を投与するか、又は組成物の投与を監視する担当者の職業的判断に従い、具体的投与レジメンを調整することが可能であり、本明細書で明示される濃度範囲が、例示的なものであるに過ぎず、特許請求される組成物の範囲又は実用を限定することを意図するものではないことをさらに理解されたい。
抗ネクチン4 ADCを混合又は添加したら、結果として得られる混合物は、溶液、懸濁液、エマルジョンなどでありうる。結果として得られる混合物の形態は、意図される投与方式、及び選択される担体中又は媒体中の、化合物の可溶性を含む、いくつかの因子に依存する。有効濃度は、処置される疾患、障害、又は状態の症状を改善するために十分であり、経験的に決定することができる。
医薬組成物は、適切な数量の化合物又は薬学的に許容されるその誘導体を含有する、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉剤、顆粒剤、滅菌非経口溶液又は非経口懸濁液、及び経口溶液又は経口懸濁液、並びに油-水エマルジョンなどの単位剤形で、ヒト及び動物への投与のために提供される。一実施形態では、抗ネクチン4 ADCを、製剤化し、単位剤形又は複数回投与のための剤形で投与する。本明細書で使用される単位剤形とは、当技術分野で公知の通り、ヒト対象及び動物対象に適し、個別にパッケージングされた、物理的に個別の単位を指す。各単位剤形は、要求される医薬担体、媒体、又は希釈剤と会合させた、所望の治療的効果をもたらすのに十分な、所定の数量の抗ネクチン4 ADCを含有する。単位剤形の例は、アンプル及びシリンジ、並びに個別にパッケージングされた錠剤又はカプセル剤を含む。単位剤形を、その分数形又は倍数形により投与することができる。複数回投与のための剤形とは、単位剤形の分割により投与される、単一の容器内にパッケージングされた、複数の、同一な単位剤形である。複数回投与のための剤形の例は、バイアル、錠剤若しくはカプセル剤のボトル、又はピント単位若しくはガロン単位のボトルを含む。よって、複数回投与のための剤形とは、パッケージングにより分割されない単位用量の倍数形である。
一部の実施形態では、本明細書で提供される、1又は複数の抗ネクチン4抗体は、液体の医薬製剤である。液体の、薬学的に投与可能な組成物は、例えば、上記で規定した活性化合物と、任意選択の医薬用アジュバントとを、例えば、水、生理食塩液、デキストロース水溶液、グリセロール、グリコール、エタノールなどの担体中に溶解させるか、分散させるか、又は混合して、これにより、溶液又は懸濁液を形成することにより、調製することができる。所望の場合、投与される医薬組成物はまた、保湿剤、乳化剤、可溶化剤、例えば、酢酸、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミンなどのpH緩衝剤、及び他のこのような薬剤など、少量の非毒性補助物質も含有しうる。
当業者には、このような剤形を調製する、実際の方法が公知であるか、又は明らかであろう。例えば、「レミントンの製薬科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)」(1990)、Mack Publishing Co.、Easton、PAを参照されたい。
非毒性担体から構成される残量との関係で、抗ネクチン4 ADCを、0.005%~100%の範囲で含有する剤形又は組成物を調製することができる。当業者には、これらの組成物を調製するための方法が公知である。
経口医薬剤形は、固体、ゲル、又は液体である。固体剤形は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、及びバルク粉剤である。経口錠剤の種類は、圧縮され、咀嚼可能な、ドロップ剤及び錠剤であって、腸溶性コーティングされる場合もあり、糖コーティングされる場合もあり、フィルムコーティングされる場合もある、上記ドロップ剤及び錠剤を含む。カプセルが、硬質ゼラチンカプセルの場合もあり、軟質ゼラチンカプセル剤の場合もある一方、顆粒剤及び粉剤は、当業者に公知の他の成分の組合せを伴う、非発泡性形態で提供することもでき、発泡性形態で提供することもできる。
ある特定の実施形態では、製剤は、固体剤形である。ある特定の実施形態では、製剤は、カプセル剤又は錠剤である。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分:結合剤;滑沢剤;希釈剤;流動促進剤;崩壊剤;着色剤;甘味剤;芳香剤;保湿剤;催吐性コーティング;及びフィルムコーティングのうちの1又は複数、又は同様な性質の化合物を含有しうる。結合剤の例は、結晶セルロース、トラガントガム、グルコース溶液、アラビアゴム液、ゼラチン溶液、糖蜜、ポリビニルピロリドン、ポビドン、クロスポビドン、スクロース、及びデンプンペーストを含む。滑沢剤は、滑石、デンプン、ステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸カルシウム、石松子、及びステアリン酸を含む。希釈剤は、例えば、ラクトース、スクロース、デンプン、カオリン、塩、マンニトール、及びリン酸二カルシウムを含む。流動促進剤は、コロイド状二酸化ケイ素を含むがこれらに限定されない。崩壊剤は、クロスカルメロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、アルギン酸、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、ベントナイト、メチルセルロース、寒天、及びカルボキシメチルセルロースを含む。着色剤は、例えば、承認及び公認された、水溶性のFD色素及びC色素、これらの混合物;並びに水酸化アルミニウム上に懸濁させた、水に不溶性のFD色素及びC色素のうちのいずれかを含む。甘味剤は、スクロース、ラクトース、マンニトール、及びサッカリンなどの人工的甘味剤、並びに任意の数の噴霧乾燥芳香剤を含む。芳香剤は、果実などの植物から抽出された天然芳香剤、並びにペパーミント及びサリチル酸メチルなどであるがこれらに限定されない、清涼感をもたらす化合物の合成ブレンドを含む。保湿剤は、モノステアリン酸プロピレングリコール、モノオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ジエチレングリコール、及びポリオキシエチレンラウリルエーテルを含む。催吐性コーティングは、脂肪酸、脂肪、蝋、シェラック、アンモニア化シェラック、及びフタル酸酢酸セルロースを含む。フィルムコーティングは、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリエチレングリコール4000、及びフタル酸酢酸セルロースを含む。
抗体を、胃の酸性環境からそれを保護する組成物により提供することができる。例えば、組成物は、胃内でその完全性を維持し、腸内で活性化合物を放出する、腸溶性コーティングにより製剤化することができる。組成物はまた、制酸剤又は他のこのような成分と組み合わせても製剤化することができる。
単位剤形が、カプセルである場合、それは、上記種類の材料に加えて、脂肪油などの液体担体も含有しうる。加えて、単位剤形は、投与単位の物理的形態を修飾する、多様な他の材料、例えば、糖及び他の腸溶剤によるコーティングを含有しうる。化合物はまた、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェハー剤、スプリンクル剤、チューインガムなどの成分としても投与することができる。シロップ剤は、活性化合物に加えて、甘味剤としてのスクロース、並びにある特定の防腐剤、色素及び着色剤及び芳香剤を含有しうる。
抗ネクチン4 ADCはまた、所望の作用を損なわない、他の活性材料、又は制酸剤、H2遮断剤、及び利尿剤など、所望の作用を補完する材料とも混合することができる。有効成分は、本明細書で記載される抗ネクチン4 ADC、又は薬学的に許容されるその誘導体である。高濃度、重量で最大約98%の有効成分を組み入れることができる。
全ての実施形態では、錠剤及びカプセル剤による製剤は、有効成分の溶解を修飾するか、又は持続させるために、当業者が公知の通りにコーティングすることができる。したがって、例えば、錠剤及びカプセル剤による製剤は、サリチル酸フェニル、蝋、及びフタル酸酢酸セルロースなど、従来の、腸内摂取可能なコーティングでコーティングすることができる。
一部の実施形態では、製剤は、液体剤形である。液体の経口剤形は、非発泡性顆粒剤から復元される、水溶液、エマルジョン、懸濁液、溶液、及び/又は懸濁液、並びに発泡性顆粒剤から復元される発泡性調製物を含む。水溶液は、例えば、エリキシル剤及びシロップ剤を含む。エマルジョンは、水中油エマルジョン又は油中水エマルジョンである。
エリキシル剤とは、透明で、甘味を付した、含水アルコール性調製物である。エリキシル剤中で使用される、薬学的に許容される担体は、溶媒を含む。シロップ剤とは、糖、例えば、スクロースの濃縮水溶液であり、防腐剤を含有しうる。エマルジョンとは、1つの液体を、別の液体の全体にわたり、小さな球体の形態で分散させた、2相系である。エマルジョン中で使用される、薬学的に許容される担体は、非水性液体、乳化剤、及び防腐剤である。懸濁液は、薬学的に許容される懸濁剤及び防腐剤を使用する。液体経口剤形へと復元される、非発泡性顆粒剤中で使用される、薬学的に許容される材料は、希釈剤、甘味剤、及び保湿剤を含む。液体経口剤形へと復元される、発泡性顆粒剤中で使用される、薬学的に許容される材料は、有機酸及び二酸化炭素の供給源を含む。着色剤及び芳香剤を、上記剤形の全てで使用する。
溶媒は、グリセリン、ソルビトール、エチルアルコール、及びシロップ剤を含む。防腐剤の例は、グリセリン、メチルパラベン及びプロピルパラベン、安息香酸、安息香酸ナトリウム、並びにアルコールを含む。エマルジョン中で利用される、非水溶液の例は、鉱物油及び綿実油を含む。乳化剤の例は、ゼラチン、アカシア、トラガント、ベントナイト、及びモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどの界面活性剤を含む。懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ペクチン、トラガント、Veegum、及びアカシアを含む。甘味剤は、スクロース、シロップ剤、グリセリン、及びサッカリンなどの人工甘味剤を含む。保湿剤は、モノステアリン酸プロピレングリコール、モノオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ジエチレングリコール、及びポリオキシエチレンラウリルエーテルを含む。有機酸は、クエン酸及び酒石酸を含む。二酸化炭素の供給源は、炭酸水素ナトリウム及び炭酸ナトリウムを含む。着色剤は、承認され、公認された、水溶性のFD色素及びC色素、並びにこれらの混合物のうちのいずれかを含む。芳香剤は、果実などの植物から抽出された天然芳香剤、及び香味感をもたらす化合物の合成ブレンドを含む。
一実施形態では、固体剤形のために、例えば、炭酸プロピレン中、植物油中、又はトリグリセリド中の、溶液又は懸濁液を、ゼラチンカプセル内に封入する。このような溶液、並びにその調製及び封入については、米国特許第4,328,245号;同第4,409,239号;及び同第4,410,545号において開示されている。液体剤形のために、例えば、ポリエチレングリコール中の溶液は、十分な数量の、薬学的に許容される液体担体、例えば、投与のために容易に測定される、水で希釈することができる。
代替的に、液体又は半固体の経口製剤は、活性化合物又は塩を、植物油中、グリコール中、トリグリセリド中、プロピレングリコールエステル(例えば、炭酸プロピレン)中、及び他のこのような担体中に溶解又は分散させ、これらの溶液又は懸濁液を、硬質又は軟質のゼラチンカプセル殻内に封入することにより調製することができる。他の有用な製剤は、米国再発行特許第28,819号及び同第4,358,603号に明示された製剤を含む。略述すると、このような製剤は、本明細書で提供される化合物を含有する製剤、1,2-ジメトキシメタン、ジグリム、トリグリム、テトラグリム、ポリエチレングリコール350-ジメチルエーテル、ポリエチレングリコール550-ジメチルエーテル、ポリエチレングリコール750-ジメチルエーテル[呼称中、350、550、及び750は、ポリエチレングリコールの、近似的な平均分子量を指す]を含むがこれらに限定されない、ジアルキル化モノアルキレングリコール又はジアルキル化ポリアルキレングリコール、並びにブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、没食子酸プロピル、ビタミンE、ヒドロキノン、ヒドロキシクマリン、エタノールアミン、レシチン、セファリン、アスコルビン酸、リンゴ酸、ソルビトール、リン酸、チオジプロピオン酸及びそのエステル、並びにジチオカルバマートなど、1又は複数の抗酸化剤を含むがこれらに限定されない。
他の製剤は、薬学的に許容されるアセタールを含むアルコール水溶液を含むがこれらに限定されない。これらの製剤中で使用されるアルコールは、プロピレングリコール及びエタノールを含むがこれらに限定されない、1又は複数のヒドロキシル基を有する、任意の薬学的に許容される水混和性溶媒である。アセタールは、アセトアルデヒドジエチルアセタールなど、低級アルキルアルデヒドの、ジ(低級アルキル)アセタールを含むがこれらに限定されない。
一実施形態では、非経口投与は、注射を特徴とし、皮下注射、筋内注射、又は静脈内注射は、本明細書でもまた想定される。注射剤は、溶液若しくは懸濁液、注射の前に、液体中に溶解若しくは懸濁させるのに適する固体形態、又はエマルジョンとしての、従来の形態で調製することができる。注射剤、溶液、及びエマルジョンはまた、1又は複数の賦形剤も含有する。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩液、デキストロース、グリセロール、又はエタノールである。加えて、所望の場合、投与される医薬組成物はまた、保湿剤又は乳化剤、pH緩衝剤、安定化剤、可溶性増強剤、並びに例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、及びシクロデキストリンなど、他のこのような薬剤など、少量の非毒性補助物質も含有しうる。
本明細書ではまた、一定レベルの投与量を維持するような徐放システム又は持続放出システムの植込み(例えば、米国特許第3,710,795号を参照されたい)も想定される。略述すると、本明細書で提供される化合物を、固体の内部マトリックス、例えば、ポリメチルメタクリラート、ポリブチルメタクリラート、可塑化ポリ塩化ビニル又は非可塑化ポリ塩化ビニル、可塑化ナイロン、可塑化ポリエチレンテレフタル酸、天然ゴム、ポリイソプレン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリエチレン、エチレン-酢酸ビニルコポリマー、シリコーンゴム、ポリジメチルシロキサン、シリコーン炭酸コポリマー、アクリル酸及びメタクリル酸のエステルによるハイドロゲル、コラーゲン、架橋されたポリビニルアルコール、及び架橋された、部分的に加水分解されたポリ酢酸ビニルなどの親水性ポリマーであって、外側のポリマー膜、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン/プロピレンコポリマー、エチレン/エチルアクリル酸コポリマー、エチレン/酢酸ビニルコポリマー、シリコーンゴム、ポリジメチルシロキサン、ネオプレンゴム、塩素化ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、酢酸ビニルを伴う塩化ビニルコポリマー、塩化ビニリデン、エチレン及びプロピレン、アイオノマー、ポリエチレンテレフタラート、ブチルゴム、エピクロロヒドリンゴム、エチレン/ビニルアルコールコポリマー、エチレン/酢酸ビニル/ビニルアルコールテルポリマー、並びに体液中で非可溶性である、エチレン/ビニルオキシエタノールコポリマーにより取り囲まれた、上記親水性ポリマー中に分散させる。抗ネクチン4 ADCは、放出律速段階にある、外側のポリマー膜を介して拡散する。このような非経口組成物中に含有される抗ネクチン4 ADCの量は、その特異的性質のほか、化合物の活性、及び対象の必要に高度に依存する。
非経口投与のための調製物は、注射の準備ができた滅菌溶液、使用の直前に、溶媒と組み合わせる準備ができた、皮下錠剤を含む、凍結乾燥粉剤などの滅菌乾燥可溶性産物、注射の準備ができた滅菌懸濁液、使用の直前に、媒体と組み合わせる準備ができた、滅菌乾燥不溶性産物、及び滅菌エマルジョンを含む。溶液は、水性の場合もあり、非水性の場合もある。
静脈内投与された場合、適切な担体は、生理学的食塩液又はリン酸緩衝生理食塩液(PBS)と、グルコース、ポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコール、並びにこれらの混合物など、増粘剤及び可溶化剤を含有する溶液とを含む。
非経口調製物中で使用される、薬学的に許容される担体は、水性媒体、非水性媒体、抗微生物薬剤、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁剤及び分散剤、乳化剤、封鎖剤又はキレート剤、及び他の薬学的に許容される物質を含む。
水性媒体の例は、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張性デキストロース注射液、滅菌水注射液、デキストロース、及び乳酸加リンゲル注射液を含む。非水性非経口媒体は、植物由来の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、及びラッカセイ油を含む。静菌濃度又は静真菌濃度の抗微生物剤を、フェノール又はクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、p-ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル及びp-ヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、並びに塩化ベンゼトニウムを含む、複数回投与用容器内にパッケージングされた非経口調製物へと添加することができる。等張性剤は、塩化ナトリウム及びデキストロースを含む。緩衝剤は、リン酸緩衝液及びクエン酸緩衝液を含む。抗酸化剤は、重硫酸ナトリウムを含む。局所麻酔剤は、プロカイン塩酸塩を含む。懸濁剤及び分散剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンを含む。乳化剤は、ポリソルバート80(TWEEN(登録商標)80)を含む。金属イオンの封鎖剤又はキレート剤は、EDTAを含む。医薬担体はまた、水混和性媒体のための、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコール;並びにpH調整のための、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、又は乳酸も含む。
薬学的活性化合物の濃度は、注射が、所望の薬理学的効果を生み出すのに有効な量をもたらすように調整する。正確な用量は、当技術分野で公知である通り、患者又は動物の、年齢、体重、及び状態に依存する。
単位用量の非経口調製物は、アンプル内、バイアル内、又は注射針を伴うシリンジ内にパッケージングすることができる。非経口投与のための、全ての調製物は、当技術分野で、公知であり、実施されている通り、滅菌調製物でありうる。
例示的に述べると、活性化合物を含有する、滅菌水溶液の静脈内注入又は動脈内注入は、効果的な投与方式である。別の実施形態は、所望の薬理学的効果をもたらす必要に応じて注射される活性材料を含有する、滅菌で、水性又は油性の、溶液又は懸濁液である。
注射剤を、局所投与及び全身投与のためにデザインする。一実施形態では、治療有効投与量は、少なくとも約0.1% w/wであり、最大で約90% w/w、又はこれを超える濃度を含有するように製剤化することができ、ある特定の実施形態では、処置される組織(単数又は複数)に対する、1% w/wを超える濃度の活性化合物を含有するように製剤化することができる。
抗ネクチン4 ADCは、微粒化形態又は他の適切な形態で懸濁させることができる。結果として得られる混合物の形態は、意図される投与方式、及び選択される担体中又は媒体中の、化合物の可溶性を含む、いくつかの因子に依存する。有効濃度は、状態の症状を改善ために十分であり、経験的に決定することができる。
他の実施形態では、医薬製剤は、溶液、エマルジョン、及び他の混合物としての投与のために復元されうる、凍結乾燥粉末である。医薬製剤はまた、固体又はゲルとして、復元及び製剤化することもできる。
凍結乾燥粉剤は、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADC、又は薬学的に許容されるその誘導体を、適切な溶媒中に溶解させることにより調製する。一部の実施形態では、凍結乾燥粉剤は、滅菌凍結乾燥粉剤である。溶媒は、粉剤又は粉剤から調製された復元溶液の、安定性を改善する賦形剤、又は他の薬理学的成分を含有しうる。使用されうる賦形剤は、デキストロース、ソルビトール、果糖、トウモロコシシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロース、又は他の適切な薬剤を含むがこれらに限定されない。溶媒はまた、クエン酸緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、又はリン酸カリウム緩衝液、又は、一実施形態では、pHをほぼ中性とする、当業者に公知である、他のこのような緩衝液などの緩衝液も含有しうる。後続する、溶液の滅菌濾過に続く、当業者に公知の、標準的な条件下における凍結乾燥処理は、所望の製剤をもたらす。一実施形態では、結果として得られる溶液を、凍結乾燥処理のためのバイアルへと分配するであろう。各バイアルは、化合物の単回投与のための投与量又は複数回投与のための投与量を含有するであろう。凍結乾燥粉剤は、約4℃~室温など、適切な条件下で保存することができる。
注射のための、この凍結乾燥粉末の、水による復元は、非経口投与における使用のための製剤をもたらす。復元のために、凍結乾燥粉末を、滅菌水又は他の適切な担体へと添加する。正確な量は、選択される化合物に依存する。このような量は、経験的に決定することができる。
外用混合物は、局所投与及び全身投与について記載されている通りに調製される。結果として得られる混合物は、溶液、懸濁液、エマルジョンなどであることが可能であり、クリーム、ゲル、軟膏、エマルジョン、溶液、エリキシル剤、ローション、懸濁液、チンキ剤、ペースト剤、フォーム、エアゾール、灌流液、スプレー、坐剤、包帯剤、皮膚用パッチ、又は外用投与に適する、他の任意の製剤として製剤化することができる。
本明細書で提供される抗体は、吸入などによる外用適用のためのエアゾールとして製剤化することができる(例えば、炎症性疾患、特に、喘息の処置に有用な、ステロイドを送達するためのエアゾールについて記載する、米国特許第4,044,126号、同第4,414,209号、及び同第4,364,923号を参照されたい)。気管への投与のためのこれらの製剤は、単独の、又はラクトースなどの不活性担体と組み合わせた、噴霧器用のエアゾール又は溶液の形態の場合もあり、吹送のための超微粒粉剤としての形態の場合もある。一実施形態では、このような場合、製剤の粒子は、50ミクロン未満、一実施形態では、10ミクロン未満の直径を有するであろう。
化合物は局所適用又は外用適用のために、例えば、ゲル、クリーム、及びローションの形態で、眼内など、皮膚及び粘膜への外用適用のために、及び眼への適用のために、又は槽内適用又は髄腔内適用のために製剤化することもできる。外用投与は、経皮送達のために想定され、また、眼若しくは粘膜への投与のために、又は吸入療法のためにも想定される。単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた活性化合物の経鼻溶液もまた、投与することができる。
これらの溶液、特に、眼科使用が意図される溶液は、適切な塩を伴う、0.01%~10%、pH約5~7の等張液として製剤化することができる。
本明細書ではまた、イオントフォレーシスデバイス及び電気泳動デバイスを含む経皮パッチ、並びに直腸内投与など、他の投与経路も想定される。
当業者には、イオントフォレーシスデバイス及び電気泳動デバイスを含む経皮パッチが周知である。例えば、このようなパッチについては、米国特許第6,267,983号、同第6,261,595号、同第6,256,533号、同第6,167,301号、同第6,024,975号、同第6,010,715号、同第5,985,317号、同第5,983,134号、同第5,948,433号、及び同第5,860,957号において開示されている。
例えば、直腸内投与のための医薬剤形は、全身効果のための、直腸内坐剤、カプセル剤、及び錠剤である。本明細書で使用される直腸内坐剤とは、直腸への挿入のための固体であって、体温で溶融又は軟化し、1又は複数の薬理学的有効成分又は治療有効成分を放出する、上記固体を意味する。直腸内坐剤中で利用される、薬学的に許容される材料は、融点を上げるための基剤又は媒体及び薬剤である。基剤の例は、ココアバター(テオブロマ油)、グリセリン-ゼラチン、カーボワックス(ポリオキシエチレングリコール)、並びに脂肪酸の、モノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリドの適切な混合物を含む。多様な基剤の組合せを使用することができる。坐剤の融点を上げるための基剤は、鯨蝋及び蝋を含む。直腸内坐剤は、圧縮方法により調製することもでき、成形により調製することもできる。一実施形態では、直腸内坐剤の重量は、約2~3グラムである。
同じ薬学的に許容される物質を使用して、経口投与のための製剤のための同じ方法により、直腸内投与のための錠剤及びカプセル剤を製造することができる。
本明細書で提供される抗体及び他の組成物はまた、処置される対象の体内の特定の組織、受容体、又は他の領域へとターゲティングされるようにも製剤化することができる。当業者には、多くのこのようなターゲティング方法が周知である。本明細書では、全てのこのようなターゲティング方法が、本組成物における使用のために想定される。ターゲティング方法の非限定的な例については、例えば、米国特許第6,316,652号、同第6,274,552号、同第6,271,359号、同第6,253,872号、同第6,139,865号、同第6,131,570号、同第6,120,751号、同第6,071,495号、同第6,060,082号、同第6,048,736号、同第6,039,975号、同第6,004,534号、同第5,985,307号、同第5,972,366号、同第5,900,252号、同第5,840,674号、同第5,759,542号、及び同第5,709,874号を参照されたい。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ネクチン4抗体を、ネクチン4媒介性疾患を有するか、又はこれを有する危険性がある患者などにおける結腸へとターゲティングする(又は他の形で投与する)。
一実施形態では、腫瘍ターゲティングリポソームなどの組織ターゲティングリポソームを含む、リポソーム懸濁液もまた、薬学的に許容される担体として適しうる。これらは、当業者に公知の方法に従い調製することができる。例えば、リポソーム製剤は、米国特許第4,522,811号において記載されている通りに調製することができる。略述すると、多重膜ベシクル(MLV)などのリポソームは、卵黄ホスファチジルコリンと、脳ホスファチジルセリンと(7:3のモル比)を、フラスコ内で乾燥させることにより形成することができる。本明細書で提供される化合物の、二価カチオンを欠く、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)中溶液を添加し、脂質の薄膜が分散するまで、フラスコを振盪する。結果として得られるベシクルを洗浄して、封入されなかった化合物を除去し、遠心分離によりペレット化し、次いで、PBS中に再懸濁させる。
26.投与及び投薬の方法
本明細書の具体的な実施形態では、ネクチン4媒介性疾患の防止、管理、処置、及び/又は改善における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを含む上記組成物が提供される。本明細書の一実施形態では、ネクチン4媒介性疾患の防止における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを含む上記組成物が提供される。本明細書の一実施形態では、ネクチン4媒介性疾患の管理における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを含む上記組成物が提供される。本明細書の一実施形態では、ネクチン4媒介性疾患の処置における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを含む上記組成物が提供される。本明細書の一実施形態では、ネクチン4媒介性疾患の改善における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを含む上記組成物が提供される。ある特定の実施形態では、対象は、それを必要とする対象である。一部の実施形態では、対象は、ネクチン4媒介性疾患を有する。他の実施形態では、対象は、ネクチン4媒介性疾患を有する危険性がある。一部の実施形態では、投与は、ネクチン4媒介性疾患の防止、管理、処置、又は改善を結果としてもたらす。一実施形態では、抗ネクチン4 ADCは、抗ネクチン4抗体が、抗体M22-321b41.1であるADCである。
本明細書の一実施形態では、ネクチン4媒介性疾患の症状の防止、管理、処置、及び/又は改善における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを含む上記組成物が提供される。本明細書の一実施形態では、ネクチン4媒介性疾患の症状の防止における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを含む上記組成物が提供される。本明細書の一実施形態では、ネクチン4媒介性疾患の症状の管理における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを含む上記組成物が提供される。本明細書の一実施形態では、ネクチン4媒介性疾患の症状の処置における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを含む上記組成物が提供される。本明細書の一実施形態では、ネクチン4媒介性疾患の症状の改善における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを含む上記組成物が提供される。ある特定の実施形態では、対象は、それを必要とする対象である。一部の実施形態では、対象は、ネクチン4媒介性疾患を有する。他の実施形態では、対象は、ネクチン4媒介性疾患を有する危険性がある。一部の実施形態では、投与は、ネクチン4媒介性疾患の症状の防止、管理、処置、又は改善を結果としてもたらす。一実施形態では、ネクチン4抗体は、抗体であるM22-321b41.1である。
別の実施形態では、本明細書では、対象におけるネクチン4媒介性疾患を防止、管理、処置、及び/又は改善する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン4 ADCを投与するステップを含む上記方法が提供される。本明細書の一実施形態では、対象におけるネクチン4媒介性疾患を防止する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン4 ADCを投与するステップを含む上記方法が提供される。本明細書の一実施形態では、対象におけるネクチン4媒介性疾患を管理する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン4 ADCを投与するステップを含む上記方法が提供される。本明細書の一実施形態では、対象におけるネクチン4媒介性疾患を処置する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン4 ADCを投与するステップを含む上記方法が提供される。本明細書の一実施形態では、対象におけるネクチン4媒介性疾患を改善する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン4 ADCを投与するステップを含む上記方法が提供される。ある特定の実施形態では、対象は、それを必要とする対象である。一部の実施形態では、対象は、ネクチン4媒介性疾患を有する。他の実施形態では、対象は、ネクチン4媒介性疾患を有する危険性がある。一部の実施形態では、投与は、ネクチン4媒介性疾患の防止、管理、処置、又は改善を結果としてもたらす。一実施形態では、抗ネクチン4 ADCは、抗ネクチン4抗体が、抗体M22-321b41.1であるADCである。
別の実施形態では、本明細書では、対象におけるネクチン4媒介性疾患の症状を防止、管理、処置、及び/又は改善する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン4 ADCを投与するステップを含む上記方法が提供される。本明細書の一実施形態では、対象におけるネクチン4媒介性疾患の症状を防止する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン4 ADCを投与するステップを含む上記方法が提供される。本明細書の一実施形態では、対象におけるネクチン4媒介性疾患の症状を管理する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン4 ADCを投与するステップを含む上記方法が提供される。本明細書の一実施形態では、対象におけるネクチン4媒介性疾患の症状を処置する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン4 ADCを投与するステップを含む上記方法が提供される。本明細書の一実施形態では、対象におけるネクチン4媒介性疾患を改善する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン4 ADCを投与するステップを含む上記方法が提供される。ある特定の実施形態では、対象は、それを必要とする対象である。一部の実施形態では、対象は、ネクチン4媒介性疾患を有する。他の実施形態では、対象は、ネクチン4媒介性疾患を有する危険性がある。一部の実施形態では、投与は、ネクチン4媒介性疾患の症状の防止、管理、処置、又は改善を結果としてもたらす。一実施形態では、抗ネクチン4 ADCは、抗ネクチン4抗体が、抗体M22-321b41.1であるADCである。
本明細書で提供される抗体はまた、例えば、in vitro及びin vivoの診断方法及び治療方法の両方において、ネクチン4抗原を精製、検出、及びターゲティングするのにも使用することができる。例えば、修飾抗体は、生物学的試料中のネクチン4のレベルを、定性的、且つ、定量的に測定するために、イムノアッセイにおいて使用される。例えば、Harlowら、「抗体:実験室マニュアル(Antibodies:A Laboratory Manual)」、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、2版、1988)(参照によりその全体において本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
本明細書ではまた、対象へと、有効量の抗ネクチン4 ADC、又は本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを含む医薬組成物を投与することにより、ネクチン4媒介性疾患を防止、管理、処置、及び/又は改善する方法も提供される。一態様では、抗ネクチン4 ADCは、実質的に精製されている(すなわち、その効果を制限するか、又は所望されない副作用をもたらす物質を実質的に含まない)。ある特定の実施形態では、抗ネクチン4 ADC内の抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体などのヒトモノクローナル抗体である。治療を投与される対象は、非霊長動物(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど)又は霊長動物(例えば、カニクイザルなどのサル又はヒト)などの哺乳動物でありうる。一実施形態では、対象は、ヒトである。別の実施形態では、対象は、ネクチン4媒介性疾患を伴うヒトである。
リポソーム内、マイクロ粒子内、マイクロカプセル内の封入、抗ネクチン4 ADCを発現させることが可能な組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス(例えば、Wu及びWu、J.Biol.Chem.、262:4429~4432(1987)を参照されたい)、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築などを含むがこれらに限定されない、多様な送達系が公知であり、予防剤又は治療剤(例えば、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADC)を投与するのに使用することができる。予防剤若しくは治療剤(例えば、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADC)、又は医薬組成物を投与する方法は、非経口投与(例えば、皮内投与、筋内投与、腹腔内投与、静脈内投与、及び皮下投与)、硬膜外投与、経粘膜投与(例えば、経鼻経路及び経口経路)を含むがこれらに限定されない。具体的な実施形態では、予防剤若しくは治療剤(例えば、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADC)、又は医薬組成物を、鼻腔内投与、筋内投与、静脈内投与、又は皮下投与する。予防剤若しくは治療剤、又は組成物は、任意の好都合な経路、例えば、注入又はボーラス注射、上皮又は皮膚粘膜内壁(例えば、口腔粘膜、鼻腔粘膜、直腸粘膜、及び腸粘膜など)を介する吸収によりにより投与することができ、他の生物学的活性薬剤と併せて投与することができる。投与は、全身投与の場合もあり、局所投与の場合もある。加えて、例えば、吸入器又は噴霧器、及びエアゾール化剤を伴う製剤の使用により、肺内投与もまた用いることができる。例えば、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第6,019,968号、同第5,985,320号、同第5,985,309号、同第5,934,272号、同第5,874,064号、同第5,855,913号、同第5,290,540号、及び同第4,880,078号;並びにPCT公開第WO92/19244号、同第WO97/32572号、同第WO97/44013号、同第WO98/31346号、及び同第WO99/66903号を参照されたい。
具体的な実施形態では、本明細書で提供される予防剤若しくは治療剤、又は医薬組成物を、処置を必要とする領域へと局所投与することが所望でありうる。これは、例えば、局所注入により達成することもでき、外用投与により(例えば、鼻腔内スプレーにより)により達成することもでき、シラスティック膜などの膜又は繊維を含む、多孔性材料、非多孔性材料、又はゼラチン性材料であるインプラントにより達成することもできるが、限定を目的とするわけではない。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを投与する場合、抗ネクチン4 ADCが吸着しない材料を使用するように注意しなければならない。
別の実施形態では、本明細書で提供される予防剤若しくは治療剤、又は組成物を、ベシクル、特に、リポソームで送達することができる(Langer、1990、Science、249:1527~1533;Treatら、「感染性疾患及びがんの治療におけるリポソーム(Liposomes in Therapy of Infectious Disease and Cancer)」、Lopez-Berestein及びFidler(編)、Liss、New York、353~365頁(1989);Lopez-Berestein、同上、317~327頁を参照されたい;一般に、同上を参照されたい)。
別の実施形態では、本明細書で提供される予防剤若しくは治療剤、又は組成物を、制御放出系又は徐放系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用して、制御放出又は徐放を達成することができる(Langer、前出;Sefton、1987、CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.、14:20;Buchwaldら、1980、Surgery、88:507;Saudekら、1989、N.Engl.J.Med.、321:574を参照されたい)。別の実施形態では、ポリマー材料を使用して、予防剤又は治療剤(例えば、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADC)、又は本明細書で提供される組成物の制御放出又は徐放を達成することができる(例えば、「制御放出の医学的応用(Medical Applications of Controlled Release)」、Langer及びWise(編)、CRC Pres.、Boca Raton、Florida(1974);「薬物バイオアベイラビリティーの制御、医薬品のデザイン、及び効能(Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance)」、Smolen及びBall(編)、Wiley、New York(1984);Ranger及びPeppas、1983、J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.、23:61を参照されたい;また、Levyら、1985、Science、228:190;Duringら、1989、Ann.Neurol.、25:351;Howardら、1989、J.Neurosurg.、71:105;米国特許第5,679,377号;米国特許第5,916,597号;米国特許第5,912,015号;米国特許第5,989,463号;米国特許第5,128,326号;PCT公開第WO99/15154号;及びPCT公開第WO99/20253号も参照されたい)。徐放製剤中で使用されるポリマーの例は、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリラート)、ポリ(メチルメタクリラート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-co-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(PLG)、ポリ無水物、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(PLA)、ポリ(ラクチド-co-グリコリド)(PLGA)、及びポリオルトエステルを含むがこれらに限定されない。ある実施形態では、徐放製剤中で使用されるポリマーは、不活性、溶出性の不純物非含有、保存時に安定、無菌、及び生体分解性である。さらに別の実施形態では、制御放出系又は徐放系は、治療標的、すなわち、鼻腔又は肺の近傍に留置することができるので、全身用量の一部しか要求しない(例えば、Goodson、「制御放出の医学的応用(Medical Applications of Controlled Release)」、前出、2巻、115~138頁(1984)を参照されたい)。徐放系については、Langer(1990、Science、249:1527~1533)による総説において論じられている。当業者に公知の任意の技法を使用して、1又は複数の、本明細書で提供される抗体を含む徐放製剤を作製することができる。例えば、それらの各々が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第4,526,938号、PCT公開第WO91/05548号、PCT公開第WO96/20698号、Ningら、1996、「徐放ゲルを使用する、ヒト結腸がんの腫瘍内放射線免疫療法(Intratumoral Radioimmunotherapy of Human Colon Cancer Xenograft Using Sustained-Release Gel)」、Radiotherapy & Oncology、39:179~189、Songら、1995、「長時間循環型エマルジョンの、抗体媒介型肺ターゲティング(Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions)」、PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology、50:372~397、Cleekら、1997、「心血管への応用のための、bFGF抗体の生体分解性ポリマー担体(Biodegradable Polymeric Carriers for bFGF Antibody for Cardiovascular Application)」、Pro.Int’l.Symp.Contorol Rel.Bioact.Mater.、24:853~854、及びLamら、1997、「局所到達のための組換えヒト化モノクローナル抗体のマイクロカプセル化(Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery」、Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.、24:759~760を参照されたい。
本明細書で提供される組成物が、予防剤又は治療剤(例えば、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADC)をコードする核酸である、具体的な実施形態では、核酸を、適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えば、レトロウイルスベクターの使用により、核酸が、細胞内核酸となるように、ベクターを投与すること(米国特許第4,980,286号を参照されたい)により、或いは直接的な注射、又はマイクロ粒子ボンバードメント(例えば、遺伝子銃;Biolistic、Dupont)、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくはトランスフェクション剤によるコーティングの使用により、或いは核酸を、核に侵入することが公知であるホメオボックス様ペプチドと連結して投与すること(例えば、Joliotら、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88:1864~1868を参照されたい)などにより、そのコードされる予防剤又は治療剤の発現を促進するように、核酸を、in vivoにおいて投与することができる。代替的に、核酸は、細胞内に導入し、相同組換えによる発現のために、宿主細胞DNA内に組み込むことができる。
具体的な実施形態では、本明細書で提供される組成物は、1つ、2つ、又はこれを超える、本明細書で提供される抗体を含む。別の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、1つ、2つ、又はこれを超える、本明細書で提供される抗体、及び本明細書で提供される抗ネクチン4 ADC以外の予防剤又は治療剤を含む。一実施形態では、薬剤は、ネクチン4媒介性疾患の防止、管理、処置、及び/又は改善に有用であることが公知であるか、又はこれらのために使用されているか、若しくは現在使用されている。予防剤又は治療剤に加えて、本明細書で提供される組成物はまた、担体も含みうる。
本明細書で提供される組成物は、単位剤形の調製に使用されうる医薬組成物(例えば、対象又は患者への投与に適する組成物)の製造において有用な、バルクの薬物組成物を含む。ある実施形態では、本明細書で提供される組成物は、医薬組成物である。このような組成物は、予防有効量又は治療有効量の、1又は複数の予防剤又は治療剤(例えば、本明細書で提供される抗体、又は他の予防剤若しくは治療剤)と、薬学的に許容される担体とを含む。医薬組成物は、対象への投与経路に適するように製剤化することができる。
具体的な実施形態では、「担体」という用語は、治療的を、それらと共に投与する、希釈剤、アジュバント(例えば、フロイントのアジュバント(完全及び不完全))、賦形剤、又は媒体を指す。このような医薬担体は、水、石油、動物油、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油など、植物由来又は合成由来の油を含む油などの滅菌液体でありうる。水は、医薬組成物を、静脈内投与する場合の、例示的担体である。生理食塩液及びデキストロース水溶液及びグリセロール溶液もまた、特に、注射用液のための液体担体として用いることができる。適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、オオムギ、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。所望の場合、組成物はまた、少量の保湿剤若しくは乳化剤、又はpH緩衝剤も含有しうる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、持続放出製剤などの形態を取りうる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの、標準的な担体を含みうる。適切な医薬担体の例については、「レミントンの製薬科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)」(1990)、Mack Publishing Co.、Easton、PAにおいて記載されている。このような組成物は、精製形態の抗ネクチン4 ADCなど、予防有効量又は治療有効量の抗ネクチン4 ADCを、患者への適正な投与のための形態をもたらすように、適量の担体と併せて含有するであろう。製剤は、投与方式に適するべきである。
ある実施形態では、組成物を、ヒトへの静脈内投与に適合させた医薬組成物として、規定の手順に従い製剤化する。典型的に、静脈内投与のための組成物は、滅菌水性等張緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤、及び注射部位における疼痛を和らげるための、リグノカインなどの局所麻酔剤も含みうる。しかし、このような組成物は、静脈内経路以外の経路を介して投与することもできる。
一般に、本明細書で提供される組成物の成分を、例えば、活性の薬剤の数量を指し示すアンプル又は小袋などの密封容器内に、乾燥滅菌した凍結乾燥粉剤、又は水分を含まない濃縮物として、個別に、又は単位剤形中に一体に混合して供給する。組成物を、注入により投与する場合、組成物を、医薬グレードの滅菌水又は生理食塩液を含有する注入ボトルにより分注することができる。組成物を、注射により投与する場合、投与の前に、成分を混合しうるように、注射用滅菌水又は生理食塩液のアンプルを用意することができる。
本明細書で提供される抗体又は抗ネクチン4 ADCは、抗体又は抗ネクチン4 ADCの数量を指し示すアンプル又は小袋などの密封容器内にパッケージングすることができる。一実施形態では、抗体又は抗ネクチン4 ADCを、密封容器内で、乾燥滅菌した凍結乾燥粉剤、又は水分を含まない濃縮物として供給し、例えば、水又は生理食塩液で、対象への投与に適切な濃度へと復元することができる。ある特定の実施形態では、抗体又は抗ネクチン4 ADCを、単位投与量を、少なくとも5mg、少なくとも10mg、少なくとも15mg、少なくとも25mg、少なくとも30mg、少なくとも35mg、少なくとも45mg、少なくとも50mg、少なくとも60mg、少なくとも75mg、少なくとも80mg、少なくとも85mg、少なくとも90mg、少なくとも95mg、又は少なくとも100mgなど、少なくとも0.1mg、少なくとも0.5mg、少なくとも1mg、少なくとも2mg、又は少なくとも3mgとする、密封容器内の乾燥滅菌凍結乾燥粉剤として供給する。凍結乾燥抗ネクチン4 ADCは、その元の容器内、2~8℃の間で保存することができ、抗ネクチン4 ADCは、復元後、6時間以内、5時間以内、3時間以内、又は1時間以内など、12時間以内に投与することができる。代替的な実施形態では、抗体又は抗ネクチン4 ADCを、抗体又は抗ネクチン4 ADCの数量及び濃度を指し示す密封容器内の液体形態で供給する。ある特定の実施形態では、抗体又は抗ネクチン4 ADCの液体形態を、密封容器内に、少なくとも5mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくとも15mg/ml、少なくとも25mg/ml、少なくとも30mg/ml、少なくとも40mg/ml、少なくとも50mg/ml、少なくとも60mg/ml、少なくとも70mg/ml、少なくとも80mg/ml、少なくとも90mg/ml、又は少なくとも100mg/mlなど、少なくとも0.1mg/ml、少なくとも0.5mg/ml、又は少なくとも1mg/mlで供給する。
本明細書で提供される組成物は、中性形態又は塩形態として製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するアニオンなどのアニオンと共に形成される塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するカチオンなどのカチオンと共に形成される塩を含む。
ネクチン4媒介性疾患の防止、管理、処置、及び/又は改善において有効となる、本明細書で提供される予防剤若しくは治療剤(例えば、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADC)又は組成物の量は、標準的な臨床技法により決定することができる。
したがって、約0.1μg/ml~約450μg/mlであり、一部の実施形態では、少なくとも0.1μg/ml、少なくとも0.2μg/ml、少なくとも0.4μg/ml、少なくとも0.5μg/ml、少なくとも0.6μg/ml、少なくとも0.8μg/ml、少なくとも1μg/ml、少なくとも1.5μg/ml、など、少なくとも2μg/ml、少なくとも5μg/ml、少なくとも10μg/ml、少なくとも15μg/ml、少なくとも20μg/ml、少なくとも25μg/ml、少なくとも30μg/ml、少なくとも35μg/ml、少なくとも40μg/ml、少なくとも50μg/ml、少なくとも75μg/ml、少なくとも100μg/ml、少なくとも125μg/ml、少なくとも150μg/ml、少なくとも200μg/ml、少なくとも250μg/ml、少なくとも300μg/ml、少なくとも350μg/ml、少なくとも400μg/ml、又は少なくとも450μg/mlの血清力価を結果としてもたらす投与量の、抗ネクチン4 ADC又は組成物を、ネクチン4媒介性疾患の防止、管理、処置、及び/又は改善のために、ヒトへと投与することができる。加えて、任意選択で、in vitroアッセイを用いて、最適の投与量範囲を同定する一助とすることもできる。製剤中で用いられる、正確な用量はまた、投与経路、及びネクチン4媒介性疾患の重篤度にも依存し、医療従事者の判断及び各患者の状況に従い決定されるべきである。
有効用量は、in vitroにおける試験系、又は動物モデルによる試験系から導出された用量反応曲線から外挿することができる。
本明細書で提供される抗体について、患者へと投与される投与量は、典型的に、患者の体重1kg当たり、0.1mg~100mgである。一部の実施形態では、患者へと投与される投与量は、患者の体重1kg当たり、約1mg~約75mgである。一部の実施形態では、患者へと投与される投与量は、患者の体重1kg当たり、1mg~5mgなど、患者の体重1kg当たり、1mg~20mgの間である。一般に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫応答に起因して、他の種に由来する抗体より、ヒト体内の半減期が長い。したがって、低用量のヒト抗体及び低頻度の投与が可能であることが多い。さらに、本明細書で提供される抗体の投与量及び投与頻度は、例えば、脂質化などの修飾により、抗体の取込み及び組織への浸透を増強することにより低減することもできる。
一実施形態では、約100mg/kg又はこれ未満、約75mg/kg又はこれ未満、約50mg/kg又はこれ未満、約25mg/kg又はこれ未満、約10mg/kg又はこれ未満、約5mg/kg又はこれ未満、約1mg/kg又はこれ未満、約0.5mg/kg、又はこれ未満、又は約0.1mg/kg、又はこれ未満の抗ネクチン4 ADCを、5回、4回、3回、2回、又は1回投与して、ネクチン4媒介性疾患を管理する。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを、約1~12回にわたり投与するが、この場合、投与は、必要に応じて、例えば、毎週、隔週、毎月、隔月、3カ月ごとなど、医師により決定される通りに実施することができる。一部の実施形態では、低用量(例えば、1~15mg/kg)を、高頻度(例えば、3~6回)で投与することができる。他の実施形態では、高用量(例えば、25~100mg/kg)を、低頻度(例えば、1~3回)で投与することができる。しかし、当業者に明らかとなる通り、他の投与量及び投与スケジュールも、容易に決定可能であり、本明細書で提供される範囲内にある。
具体的な実施形態では、徐放製剤中に、約100mg/kg、約75mg/kg又はこれ未満、約50mg/kg又はこれ未満、約25mg/kg又はこれ未満、約10mg/kg又はこれ未満、約5mg/kg又はこれ未満、約1mg/kg又はこれ未満、約0.5mg/kg又はこれ未満、約0.1mg/kg、又はこれ未満の抗ネクチン4 ADCを、ヒトなどの対象へと投与して、ネクチン4媒介性疾患を防止、管理、処置、及び/又は改善する。別の特異的実施形態では、徐放製剤中にはない、約100mg/kg、約75mg/kg又はこれ未満、約50mg/kg又はこれ未満、約25mg/kg又はこれ未満、約10mg/kg又はこれ未満、約5mg/kg又はこれ未満、約1mg/kg又はこれ未満、約0.5mg/kg、又はこれ未満、又は約0.1mg/kg、又はこれ未満の、ボーラスの抗ネクチン4 ADCを、ヒトなどの対象へと投与して、ネクチン4媒介性疾患を防止、管理、処置、及び/又は改善し、ある特定の期間の後、徐放製剤中に、約100mg/kg、約75mg/kg又はこれ未満、約50mg/kg又はこれ未満、約25mg/kg又はこれ未満、約10mg/kg又はこれ未満、約5mg/kg又はこれ未満、約1mg/kg又はこれ未満、約0.5mg/kg、又はこれ未満、又は約5mg/kg、又はこれ未満の、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを、前記対象へと、2、3、又は4回(1回など)にわたり、(例えば、鼻腔内又は筋内)投与する。この実施形態に従い、ある特定の期間は、1~5日間、1週間、2週間、又は1カ月間でありうる。
一部の実施形態では、単一用量の、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを、1年の経過にわたり、隔週(例えば、約14日間)の間隔で、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、又は26回、患者へと投与して、ネクチン4媒介性疾患を防止、管理、処置、及び/又は改善するが、この場合、用量は、約0.1mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg、約35mg/kg、約40mg/kg、約45mg/kg、約50mg/kg、約55mg/kg、約60mg/kg、約65mg/kg、約70mg/kg、約75mg/kg、約80mg/kg、約85mg/kg、約90mg/kg、約95mg/kg、約100mg/kg、又はこれらの組合せ(すなわち、毎月の各用量は、同一な場合もあり、同一でない場合もある)からなる群から選択される。
別の実施形態では、単一用量の、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを、1年の経過にわたり、ほぼ毎月(例えば、約30日間)の間隔で、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12回、患者へと投与して、ネクチン4媒介性疾患を防止、管理、処置、及び/又は改善するが、この場合、用量は、約0.1mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg、約35mg/kg、約40mg/kg、約45mg/kg、約50mg/kg、約55mg/kg、約60mg/kg、約65mg/kg、約70mg/kg、約75mg/kg、約80mg/kg、約85mg/kg、約90mg/kg、約95mg/kg、約100mg/kg、又はこれらの組合せ(すなわち、毎月の各用量は、同一な場合もあり、同一でない場合もある)からなる群から選択される。
一実施形態では、単一用量の、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを、1年の経過にわたり、ほぼ隔月(例えば、約60日間)の間隔で、2、3、4、5、又は6回、患者へと投与して、ネクチン4媒介性疾患を防止、管理、処置、及び/又は改善するが、この場合、用量は、約0.1mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg、約35mg/kg、約40mg/kg、約45mg/kg、約50mg/kg、約55mg/kg、約60mg/kg、約65mg/kg、約70mg/kg、約75mg/kg、約80mg/kg、約85mg/kg、約90mg/kg、約95mg/kg、約100mg/kg、又はこれらの組合せ(すなわち、隔月の各用量は、同一な場合もあり、同一でない場合もある)からなる群から選択される。
一部の実施形態では、単一用量の、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを、1年の経過にわたり、ほぼ3カ月ごと(例えば、約120日間)の間隔で、2、3、又は4回、患者へと投与して、ネクチン4媒介性疾患を防止、管理、処置、及び/又は改善するが、この場合、用量は、約0.1mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg、約35mg/kg、約40mg/kg、約45mg/kg、約50mg/kg、約55mg/kg、約60mg/kg、約65mg/kg、約70mg/kg、約75mg/kg、約80mg/kg、約85mg/kg、約90mg/kg、約95mg/kg、約100mg/kg、又はこれらの組合せ(すなわち、3カ月ごとの各用量は、同一な場合もあり、同一でない場合もある)からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCの、患者への投与のための投与経路は、鼻腔内、筋内、静脈内、又はこれらの組合せであるが、本明細書で記載される、他の経路もまた、許容可能である。各用量は、同一の投与経路により投与する場合もあり、そうでない場合もある。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCは、複数の投与経路を介して、同時に投与することもでき、同じであるか、又は異なる、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCの、他の投与に後続して投与することもできる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを、対象へと、予防的に投与することもでき、治療的に投与することもできる。本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCは、ネクチン4媒介性疾患又はその症状を、防止し、減少させ、又は改善するように、対象へと、予防的に投与することもでき、治療的に投与することもできる。
27.遺伝子治療
具体的な実施形態では、抗体又はその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸を、遺伝子治療を目的として、例えば、ネクチン4媒介性の疾患、障害、又は状態を、防止、管理、処置、及び/又は改善する、本明細書で提供される方法における使用のために、対象へと投与する。このような治療は、対象への、発現させた核酸又は発現可能な核酸の投与により実施される治療を包含する。ある実施形態では、核酸は、それらによりコードされる抗体をもたらし、これをコンジュゲートさせて、抗ネクチン4 ADCをもたらすことができ、抗体又は抗ネクチン4 ADCは、予防効果又は治療効果を媒介する。
当技術分野で利用可能な、組換え遺伝子発現(又は遺伝子治療)のための方法のうちのいずれかを使用することができる。例示的方法については、下記に記載し、実施例節に提供する。
遺伝子治療方法の一般的総説については、Goldspielら、1993、Clinical Pharmacy、12:488~505;Wu及びWu、1991、Biotherapy、3:87~95;Tolstoshev、1993、Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.、32:573~596;Mulligan、1993、Science、260:926~932;並びにMorgan及びAnderson、1993、Ann.Rev.Biochem.、62:191~217、1993年5月、TIB TECH11(5):l55~215を参照されたい。使用されうる、組換えDNA技術についての、当技術分野で一般に公知の方法については、Ausubelら(編)、「分子生物学における最新のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」、John Wiley & Sons、NY(1993);及びKriegler、「遺伝子の導入及び発現:実験室マニュアル(Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual)」、Stockton Press、NY(1990)において記載されている。
具体的な実施形態では、組成物は、本明細書で提供される抗ネクチン4抗体をコードする核酸であって、適切な宿主において、抗体、又はキメラタンパク質、又は重鎖若しくは軽鎖、又はこれらの治療用部分又は薬物部分を発現させる発現ベクターの一部である上記核酸を含む。特に、このような核酸は、抗ネクチン4抗体のコード領域に作動可能に連結した異種プロモーターであって、誘導可能なプロモーター又は構成的プロモーターであり、任意選択で、組織特異的プロモーターである上記異種プロモーターなどのプロモーターを有する。別の特定の実施形態では、抗ネクチン4抗体コード配列、及び他の任意の所望の配列が、ゲノム内の所望の部位における相同組換えを促進する領域により挟まれ、このため、抗ネクチン4 ADCコード核酸の染色体内発現をもたらす核酸分子(Koller及びSmithies、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86:8932~8935;Zijlstraら、1989、Nature、342:435~438)を使用する。一部の実施形態では、発現させた抗ネクチン4抗体分子は、単鎖抗体を含み;代替的に、核酸配列は、抗ネクチン4抗体内の、重鎖及び軽鎖の両方、又はこれらの断片をコードする配列を含む。
核酸の、対象への送達は、対象が、核酸又は核酸保有ベクターへと、直接曝露される直接的送達の場合もあり、細胞を、まず、in vitroにおいて、核酸により形質転換し、次いで、対象へと植え込む、間接的送達の場合もある。これらの2つの手法は、それぞれ、in vivoにおける遺伝子治療、又はex vivoにおける遺伝子治療として公知である。
具体的な実施形態では、核酸配列を、in vivoにおいて直接投与し、この場合、配列は、発現して、コードされる産物をもたらす。これは、当技術分野で公知の多数の方法のうちのいずれかにより、例えば、それらを、適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えば、欠損性レトロウイルス若しくは弱毒化レトロウイルス又は他のウイルスベクターを使用する感染により、配列が、細胞内配列となるように、ベクターを投与することにより(米国特許第4,980,286号を参照されたい)達することもでき、ネイキッドDNAの直接的な注射により達することもでき、マイクロ粒子ボンバードメント(例えば、遺伝子銃;Biolistic、Dupont)、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくはトランスフェクション剤によるコーティング、リポソーム、マイクロ粒子、若しくはマイクロカプセル内の封入の使用により達することもでき、それらを、核に侵入することが公知であるペプチドと連結して投与すること、それを、受容体媒介性エンドサイトーシス下に置かれるリガンドと連結して投与すること(例えば、Wu及びWu、1987、J.Biol.Chem.、262:4429~4432を参照されたい)(これは、受容体を特異的に発現する細胞型をターゲティングするのに使用することができる)などにより達することもできる。別の実施形態では、リガンドが、エンドソームを破壊して、核酸が、リソソームによる分解を回避することを可能とするように、融合性ウイルスペプチドを含む、核酸-リガンド複合体を形成することができる。さらに別の実施形態では、特異的受容体をターゲティングすることにより、in vivoにおいて、細胞による特異的な取込み及び発現のために、核酸をターゲティングすることができる(例えば、PCT公開第WO92/06180号;WO92/22635号;WO92/20316号;W093/14188、WO93/20221号を参照されたい)。代替的に、核酸を、細胞内に導入し、相同な組換えにより、発現のための宿主細胞のDNA内に組み込むこともできる(Koller及びSmithies、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86:8932~8935;並びにZijlstraら、1989、Nature、342:435~438)。
具体的な実施形態では、抗ネクチン4抗体をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを使用する。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる(Millerら、1993、Meth.Enzymol.、217:581~599を参照されたい)。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージング、及び宿主細胞DNAへの組込みを補正するために必要な構成要素を含有する。遺伝子治療において使用される、抗ネクチン4抗体をコードする核酸配列を、対象への遺伝子の送達を容易とする、1又は複数のベクターへとクローニングすることができる。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、幹細胞を、化学療法に対して、より耐性とするために、mdr 1遺伝子を、造血幹細胞へと送達する、レトロウイルスベクターの使用について記載する、Boesenら、1994、Biotherapy、6:291~302において見出すことができる。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用について例示する、他の参考文献は、Clowesら、1994、J.Clin.Invest.、93:644~651;Kleinら、1994、Blood、83:1467~1473;Salmons及びGunzberg、1993、Human Gene Therapy、4:129~141;並びにGrossman及びWilson、1993、Curr.Opin.in Genetics and Devel.、3:110~114である。
アデノウイルスは、組換えによる抗体の作製において使用されうる、他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、とりわけ、遺伝子を、呼吸器上皮へと送達するのに魅力的な媒体である。アデノウイルスは、天然で、呼吸器上皮に感染し、そこで、軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの送達系のための、他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、及び筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することが可能であるという利点を有する。Kozarsky及びWilson、1993、Current Opinion in Genetics and Development、3:499~503は、アデノウイルスベースの遺伝子治療についての総説を提示する。Boutら、1994、Human Gene Therapy、5:3~10は、アカゲザルの呼吸器上皮への遺伝子の導入のための、アデノウイルスベクターの使用を裏付けた。遺伝子治療における、アデノウイルスの使用の他の場合は、Rosenfeldら、1991、Science、252:431~434;Rosenfeldら、1992、Cell、68:143~155;Mastrangeliら、1993、J.Clin.Invest.、91:225~234;PCT公開第WO94/12649号;及びWangら、1995、Gene Therapy、2:775~783において見出すことができる。具体的な実施形態では、アデノウイルスベクターを使用する。
アデノ随伴ウイルス(AAV)もまた、利用することができる(Walshら、1993、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、204:289~300;及び米国特許第5,436,146号)。具体的な実施形態では、AAVベクターを使用して、本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCを発現させる。ある特定の実施形態では、AAVは、VHドメインをコードする核酸を含む。他の実施形態では、AAVは、VLドメインをコードする核酸を含む。ある特定の実施形態では、AAVは、VHドメインと、VLドメインとをコードする核酸を含む。本明細書で提供される方法についての一部の実施形態では、対象に、VHドメインをコードする核酸を含むAAVと、VLドメインをコードする核酸を含むAAVとを投与する。他の実施形態では、対象に、VHドメインと、VLドメインとをコードする核酸を含むAAVを投与する。ある特定の実施形態では、VHドメイン及びVLドメインを過剰発現させる。
遺伝子治療への別の手法は、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、又はウイルス感染などの方法により、組織培養物中の細胞へと、遺伝子を導入するステップを伴う。通例、導入方法は、選択用マーカーの、細胞への導入を含む。次いで、細胞を、選択下に置いて、転写された遺伝子を、取り込み、発現している細胞を単離する。次いで、これらの細胞を、対象へと送達する。
この実施形態では、核酸を、細胞へと導入してから、結果として得られる組換え細胞を、in vivoにおいて投与する。このような導入は、トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスベクター又はバクテリオファージベクターの感染、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、微小核細胞媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知である、任意の方法により実行することができる。当技術分野では、外来遺伝子を、細胞へと導入するための、多数の技法が公知であり(例えば、Loeffler及びBehr、1993、Meth.Enzymol.、217:599~618;Cohenら、1993、Meth.Enzymol.、217:618~644;Clin.Pharma.Ther.、29:69~92(1985)を参照されたい)、レシピエント細胞の、必要な発生機能及び生理学的機能を破壊しないことを条件として本明細書で提供される方法に従い使用することができる。核酸が、その後代細胞により、遺伝可能及び発現可能であるなど、細胞により発現可能であるように、技法は、細胞への、核酸の安定導入をもたらす。
結果として得られる組換え細胞を、当技術分野で公知である、多様な方法により、対象へと送達することができる。組換え血液細胞(例えば、造血幹細胞又は前駆細胞)を、静脈内投与することができる。使用に想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者により決定されうる。
遺伝子治療を目的として、核酸を導入しうる細胞は、任意の所望の、利用可能な細胞型を包含し、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞;Tリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの、リンパ系細胞及び骨髄系細胞;多様な幹細胞又は前駆細胞、特に、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓から得られる、造血幹細胞又は前駆細胞などを含むがこれらに限定されない。
具体的な実施形態では、遺伝子治療のために使用される細胞は、対象に対する自家細胞である。
遺伝子治療において、組換え細胞を使用する実施形態では、抗ネクチン4抗体をコードする核酸配列を、それらが、細胞又はそれらの後代により発現可能となるように、細胞へと導入し、次いで、組換え細胞を、治療的効果のために、in vivoで投与する。具体的な実施形態では、幹細胞又は前駆細胞を使用する。in vitroにおいて単離し、維持しうる、任意の幹細胞及び/又は前駆細胞を、本明細書で提供される方法の、この実施形態に従い、潜在的に使用することができる(例えば、PCT公開第WO94/08598号;Stemple及びAnderson、1992、Cell、71:973~985;Rheinwald、1980、Meth.Cell Bio.、21A:229;並びにPittelkow及びScott、1986、Mayo Clinic Proc.、61:771を参照されたい)。
具体的な実施形態では、適切な転写のインデューサーの存在又は非存在を制御することにより、核酸の発現が制御可能となるように、遺伝子治療を目的として導入される核酸は、コード領域に作動可能に連結した誘導可能なプロモーターを含む。
28.抗体をコードするポリヌクレオチド
また、ネクチン4エピトープに免疫特異的に結合する、本明細書で提供される抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも提供される。本明細書ではまた、例えば、上述で規定した、高厳密性、中程度の厳密性、又は低厳密性のハイブリダイゼーション条件下で、本明細書で提供される修飾抗体をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドも提供される。
当技術分野で公知である、任意の方法により、ポリヌクレオチドを得、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。本明細書で提供される、ある特定のネクチン4抗体のアミノ酸配列は、既知であるので、当技術分野で周知の方法を使用して、これらの抗体をコードするヌクレオチド配列、及びこれらの抗体の修飾形を決定することができる、すなわち、抗体をコードする核酸を作出するような形で、特定のアミノ酸をコードすることが既知であるヌクレオチドコドンをアセンブルする。抗体をコードする、このようなポリヌクレオチドは、化学合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブルすることができ(例えば、Kutmeierら、1994、BioTechniques、17:242に記載されている)、これは、略述すると、抗体、断片、又はこれらの変異体をコードする配列の部分を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成と、これらのオリゴヌクレオチドをアニール及びライゲーションすることと、次いで、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドの、PCRによる増幅とを伴う。
代替的に、本明細書で提供される抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源(例えば、2017年6月13日に寄託された、ATCC受託番号:PTA-124245を有する、本明細書で提供されるM22-321b41.1ハイブリドーマ)に由来する核酸から作出することができる。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンは利用可能でないが、抗体分子の配列は公知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学合成することもでき、配列の3’末端及び5’末端にハイブリダイズすることが可能な合成プライマーを使用するPCR増幅により、又は、例えば、抗体をコードするcDNAライブラリーに由来するcDNAクローンを同定するように、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用して、クローニングすることにより、適切な供給源(例えば、抗体のcDNAライブラリー、又は本明細書で提供される抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞など、抗体を発現する、任意の組織又は細胞から作出されたcDNAライブラリー、又はこれらから単離された、ポリA+RNAなどの核酸)から得ることもできる。次いで、当技術分野で周知である、任意の方法を使用して、PCRにより作出される、増幅された核酸を、複製用のクローニングベクターへとクローニングすることができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号38(VHをコードする)及び/若しくは配列番号37(VLをコードする)のうちのいずれか1つ、又はこれらの任意の組合せにおいて描示される核酸配列(例えば、本明細書で提供される、全長抗体、抗体の重鎖及び/若しくは軽鎖、又は単鎖抗体など、本明細書で提供される抗体をコードするヌクレオチド配列としての)を含むか、又はこれらからなる。
本明細書のある特定の態様では、ネクチン4抗原に免疫特異的に結合する、本明細書で記載される抗体又はその断片(例えば、軽鎖可変領域及び/又は重鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、宿主細胞(例えば、大腸菌(E. coli)及び哺乳動物細胞)における組換え発現のためのベクター、例えば、このようなポリヌクレオチドを含むベクターとが提供される。本明細書のある特定の態様では、細胞(例えば、宿主細胞)が提供される。本明細書ではまた、本明細書で記載される抗体及び抗原結合性断片を作製する方法も提供される。
本明細書のある特定の態様では、本明細書で記載される抗体の、軽鎖又は重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。本明細書のある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体の、軽鎖と重鎖とをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドは、本明細書で記載される抗体のVL FR及びVL CDRを含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列(例えば、それぞれ、表1~2を参照されたい)を含みうる。ポリヌクレオチドは、本明細書で記載される抗体のVH FR及びVH CDRを含む重鎖をコードするヌクレオチド配列(例えば、それぞれ、表1~2を参照されたい)を含みうる。具体的な実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドは、配列番号37のアミノ酸配列を含むVL鎖領域をコードする。具体的な実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドは、配列番号38のアミノ酸配列を含むVH鎖領域をコードする。
本明細書の特定の実施形態では、3つのVL鎖CDRを含む、例えば、抗体であるM22-321b41.1の、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3(例えば、表1を参照されたい)を含有する、抗ネクチン4抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。本明細書の具体的な実施形態では、3つのVH鎖CDRを含む、例えば、抗体であるM22-321b41.1の、VH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3(例えば、表1を参照されたい)を含有する、ポリヌクレオチドが提供される。
本明細書の特定の実施形態では、VL鎖領域を含む、例えば、本明細書で記載されるアミノ酸配列(例えば、表1~2を参照されたい)を含む、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4を含有する、抗ネクチン4抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。本明細書の具体的な実施形態では、VH鎖領域を含む、例えば、本明細書で記載されるアミノ酸配列(例えば、表1~2を参照されたい)を含む、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4を含有する、抗ネクチン4抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドは、本明細書で記載されるアミノ酸配列(例えば、表1を参照されたい)を含む軽(VL)鎖可変領域を含む、本明細書で提供される抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、この場合、抗体は、ネクチン4ポリペプチドに免疫特異的に結合する。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドは、本明細書で記載されるアミノ酸配列(例えば、表1を参照されたい)を含む重(VH)鎖可変領域を含む、本明細書で提供される抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、この場合、抗体は、ネクチン4ポリペプチドに免疫特異的に結合する。
ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは、本明細書で記載されるアミノ酸配列(例えば、表2を参照されたい)を有する、1又は複数のVL FRを含むVL鎖領域を含む、本明細書で記載される抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、この場合、抗体は、ネクチン4ポリペプチドに免疫特異的に結合する。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは、本明細書で記載されるアミノ酸配列(例えば、表2を参照されたい)を有する、1又は複数のVH FRを含むVH鎖領域を含む、本明細書で記載される抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、この場合、抗体は、ネクチン4ポリペプチド、例えば、ヒトネクチン4ポリペプチドに免疫特異的に結合する。
具体的な実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、ヒトフレームワーク領域であるフレームワーク領域(例えば、VLドメイン及びVHドメインのフレームワーク領域)を含む、本明細書で記載される抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、この場合、抗体は、ネクチン4ポリペプチドに免疫特異的に結合する。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、ネクチン4ポリペプチドに免疫特異的に結合する、本明細書で記載される抗体であるM22-321b41.1の、それぞれ、VH又はVLをコードする、表3に記載されたヌクレオチド配列を含む。
組換えによる抗体の作製
ネクチン4抗原に免疫特異的に結合する、本明細書で提供される抗体(例えば、本明細書で提供される、全長抗体、抗体の重鎖及び/若しくは軽鎖、又は単鎖抗体)の、組換えによる発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を要求する。本明細書で提供される抗体分子、抗体の重鎖若しくは軽鎖、又はこれらの断片(重鎖可変ドメイン及び/又は軽鎖可変ドメインなどであるが、必ずしもこれらを含有しない)をコードするポリヌクレオチドを得たら、当技術分野で周知の技法を使用する組換えDNA技術により、抗体分子を作製するためのベクターを作製することができる。したがって、本明細書では、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることにより、タンパク質を調製するための方法について記載する。当業者に周知の方法を使用して、抗体コード配列と、適切な転写制御シグナル及び翻訳制御シグナルとを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、in vitroにおける組換えDNA技法、合成技法、及びin vivoにおける遺伝子組換えを含む。また、プロモーターに作動可能に連結した、本明細書で提供される抗体分子、抗体の重鎖若しくは軽鎖、抗体若しくはその断片の重鎖可変ドメイン若しくは軽鎖可変ドメイン、又は重鎖CDR若しくは軽鎖CDRをコードするヌクレオチド配列を含む、複製用ベクターも提供される。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列(例えば、国際公開第WO86/05807号及び同第WO89/01036号;及び米国特許第5,122,464号を参照されたい)を含むことが可能であり、抗体の可変ドメインを、重鎖の全体、軽鎖の全体、又は重鎖及び軽鎖の両方の全体を発現させるために、このようなベクターへとクローニングすることができる。
発現ベクターを、従来の技法により、宿主細胞へと転写し、次いで、トランスフェクトされた細胞を、従来の技法により、培養して、本明細書で提供される抗体を作製する。したがって、本明細書ではまた、異種プロモーターに作動可能に連結した、本明細書で提供される抗体若しくはその断片、又はその重鎖若しくは軽鎖、又はこれらの断片、又は本明細書で提供される単鎖抗体をコードするヌクレオチドを含有する宿主細胞も提供される。二本鎖抗体を発現させるための、ある特定の実施形態では、下記で詳述される通り、免疫グロブリン分子の全体を発現させるために、重鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターを、宿主細胞内で共発現させることができる。
様々な宿主発現ベクター系を利用して、本明細書で提供される抗体分子を発現させることができる(例えば、米国特許第5,807,715号を参照されたい)。このような宿主発現系は、目的のコード配列を産生し、その後、精製しうる媒体を表わすが、また、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換されるか、又はトランスフェクトされると、in situにおいて、本明細書で提供される抗体分子を発現しうる細胞も表す。これらは、抗体コード配列を含有する、組換えバクテリオファージDNA発現ベクター、組換えプラスミドDNA発現ベクター、若しくは組換えコスミドDNA発現ベクターにより形質転換した細菌(例えば、大腸菌及び枯草菌(B.subtilis));抗体コード配列を含有する、組換え酵母発現ベクターにより形質転換した酵母(例えば、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ピキア属(Pichia))などの微生物;VLPポリペプチドのコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系;抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)を感染させるか、若しくは抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)により形質転換した植物細胞系;又は、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)、若しくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター;牛痘ウイルス7.5Kプロモーター)を含有する組換え発現構築物を保有する、哺乳動物細胞系(例えば、COS細胞、CHO細胞、BHK細胞、293細胞、NS0細胞、3T3細胞)を含むがこれらに限定されない。組換え抗体分子を発現させるために、大腸菌(Escherichia coli)などの細菌細胞を使用することもでき、とりわけ、全組換え抗体分子を発現させるために、真核細胞を使用することもできる。例えば、ヒトサイトメガロウイルスに由来する主要即初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと併用される、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの哺乳動物細胞は、抗体のための有効な発現系である(Foeckingら、1986、Gene、45:101;及びCockettら、1990、Bio/Technology、8:2)。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、CHO細胞内で作製する。具体的な実施形態では、ネクチン4抗原に免疫特異的に結合する、本明細書で提供される抗体をコードするヌクレオチド配列の発現を、構成的プロモーター、誘導可能なプロモーター、又は組織特異的プロモーターにより調節する。
細菌系では、発現させる抗体分子に意図される使用に応じて、多数の発現ベクターを選択することができて有利である。例えば、抗体分子による医薬組成物を作出するために、大量の、このような抗体を作製する場合、たやすく精製される、高レベルの融合タンパク質産物の発現を方向付けるベクターが所望されうる。このようなベクターは、融合タンパク質を作製するように、抗体コード配列を、lac Zのコード領域と、インフレームで、個別に、ベクターへとライゲーションしうる大腸菌発現ベクターである、pUR278(Rutherら、1983、EMBO12:1791);pINベクター(Inouye及びInouye、1985、Nucleic Acids Res.、13:3101~3109;Van Heeke及びSchuster、1989、J.Biol.Chem.、24:5503~5509)などを含むがこれらに限定されない。外来ポリペプチドを、グルタチオン5-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させるのに、pGEXベクターもまた使用することができる。一般に、このような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスである、グルタチオンアガロースビーズへの吸着及び結合により、溶解させた細胞から容易に精製するのに続き、遊離グルタチオンの存在下における溶離を行うことができる。pGEXベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物が、GST部分から放出されうるように、トロンビン又は第Xa因子プロテアーゼの切断部位を含むようにデザインする。
昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)を、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用する。ウイルスは、ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)細胞内で増殖する。抗体コード配列は、ウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子領域)へと個別にクローニングすることができ、また、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に置くことができる。
哺乳動物の宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、目的の抗体コード配列を、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及び三連リーダー配列とライゲーションすることができる。次いで、in vitro又はin vivoにおける組換えにより、このキメラ遺伝子を、アデノウイルスゲノム内に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、E1領域又はE3領域)内に挿入する結果として、感染させた宿主内で生存可能であり、抗体分子を発現することが可能な組換えウイルスがもたらされるであろう(例えば、Logan及びShenk、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81:355~359を参照されたい)。挿入された抗体コード配列を効率的に翻訳するために、特異的な開始シグナルもまた要求されうる。これらのシグナルは、ATG開始コドン、及び隣接配列を含む。さらに、インサート全体の翻訳を確保するために、開始コドンは、所望されるコード配列のリーディングフレームとインフェーズでなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナル及び開始コドンは、様々な由来であることが可能であり、天然及び合成のいずれでもありうる。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを組み入れることにより、増強することができる(Bittnerら、1987、Methods in Enzymol.、153:51~544を参照されたい)。
加えて、挿入した配列の発現をモジュレートするか、又は遺伝子産物を、所望される特異的な形で、修飾及びプロセシングする宿主細胞株も選び出すことができる。タンパク質産物に対するこのような修飾(例えば、グリコシル化)及びプロセシング(例えば、切断)は、タンパク質の機能に重要でありうる。異なる宿主細胞は、翻訳後において、タンパク質及び遺伝子産物をプロセシング及び修飾するのに特徴的で特異的な機構を有する。発現させる外来タンパク質の適正な修飾及びプロセシングを確保するために、適切な細胞系又は宿主系を選び出すことができる。この目的で、一次転写物を適正にプロセシングし、遺伝子産物を適正にグリコシル化及びリン酸化するための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。このような哺乳動物の宿主細胞は、CHO細胞、VERY細胞、BHK細胞、Hela細胞、COS細胞、MDCK細胞、293細胞、3T3細胞、W138細胞、BT483細胞、Hs578T細胞、HTB2細胞、BT2O細胞及びT47D細胞、NS0細胞(内因的には免疫グロブリン鎖を産生しない、マウス骨髄腫細胞系)、CRL7O3O細胞、並びにHsS78Bst細胞を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書で提供される、完全ヒト抗ネクチン4モノクローナル抗体は、CHO細胞など、哺乳動物細胞内で作製する。
組換えタンパク質の、長期にわたる、高収率の作製のために、安定的発現を利用することができる。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞系は、操作細胞系でありうる。ウイルス性の複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)及び選択用マーカーにより制御されるDNAにより形質転換することができる。外来DNAの導入後、操作細胞を、濃縮培地中、1~2日間にわたり増殖させることができ、次いで、選択用培地へと切り替える。組換えプラスミド内の選択用マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が、プラスミドを、それらの染色体へと、安定的に組み込み、増殖し、増殖巣を形成することを可能とし、これを、細胞系へと、クローニングし、拡大することができる。この方法は、抗体分子を発現する細胞系を操作するのに使用しうるので有利である。このような操作細胞系は、特に、抗体分子と、直接的又は間接的に相互作用する組成物のスクリーニング及び査定において有用でありうる。
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら、1977、Cell、11:223)、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska及びSzybalski、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、48:202)、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら、1980、Cell、22:8~17)遺伝子を含むがこれらに限定されない、いくつかの選択系を、それぞれ、tk細胞、hgprt細胞、又はaprt細胞において用いることができる。また、代謝拮抗剤耐性も、以下の遺伝子:メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr(Wiglerら、1980、Natl.Acad.Sci.USA、77:357;O’Hareら、1981、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、78:1527);ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt(Mulligan及びBerg、1981、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、78:2072);アミノグリコシドであるG-418に対する耐性を付与するneo(Wu及びWu、1991、Biotherapy、3:87~95;Tolstoshev、1993、Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.、32:573~596;Mulligan、1993、Science、260:926~932;並びにMorgan及びAnderson、1993、Ann.Rev.Biochem.、62:191~217、1993年5月、TIB TECH11(5):l55~215);及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygro(Santerreら、1984、Gene、30:147)についての選択の基盤として使用することができる。組換えDNA技術についての、当技術分野で一般に公知の方法を、規定通りに適用して、所望の組換えクローンを選択することができ、このような方法については、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、例えば、Ausubelら(編)、「分子生物学における最新のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」、John Wiley & Sons、NY(1993);Kriegler、「遺伝子の導入及び発現:実験室マニュアル(Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual)」、Stockton Press、NY(1990);並びにDracopoliら(編)、「ヒト遺伝学における最新プロトコール(Current Protocols in Human Genetics)」、John Wiley & Sons、NY(1994)、12及び13章;Colberre-Garapinら、1981、J.Mol.Biol.、150:1において記載されている。
抗体分子の発現レベルは、ベクターの増幅により増大させることができる(総説については、Bebbington及びHentschel、「DNAクローニングにおいて、哺乳動物細胞内でクローニングされる遺伝子を発現させるための、遺伝子の増幅に基づく、ベクターの使用(The use of vectors based on gene amplification for expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning)」、3巻(Academic Press、New York、1987)を参照されたい)。抗体を発現させるベクター系内のマーカーが、増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの上昇は、マーカー遺伝子のコピー数を増大させるであろう。増幅された領域は、抗体遺伝子と関連するので、抗体の産生もまた、増大するであろう(Crouseら、1983、Mol.Cell.Biol.、3:257)。
宿主細胞に、第1のベクターが、重鎖由来のポリペプチドをコードし、第2のベクターが、軽鎖由来のポリペプチドをコードする、本明細書で提供される、2つの発現ベクターを共トランスフェクトすることができる。2つのベクターは、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの、同等な発現を可能とする、同一な選択用マーカーを含有しうる。代替的に、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、これらを発現させることが可能な、単一のベクターを使用することもできる。このような状況では、軽鎖を、重鎖の前に配置して、毒性である遊離重鎖の過剰を回避すべきである(Proudfoot、1986、Nature、322:52;及びKohler、1980、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77:2197~2199)。重鎖及び軽鎖のコード配列は、cDNA又はゲノムDNAを含みうる。
本明細書で提供される抗体分子を、組換え発現により作製したら、これを、免疫グロブリン分子を精製するために、当技術分野で公知である、任意の方法、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特に、プロテインAクロマトグラフィーの後における、特異的抗原についてのアフィニティークロマトグラフィー、及びサイズ除外クロマトグラフィー)、遠心分離、示差的可溶性、又はタンパク質を精製するための、他の任意の標準的な技法により精製することができる。さらに、本明細書で提供される抗体を、本明細書で記載されるか、又は本明細書以外の当技術分野で公知の、異種ポリペプチド配列と融合させて、精製を容易とすることができる。
29.診断的アッセイ及び検出方法
一態様では、本開示の抗ネクチン4抗体及びそれらの断片は、生物学的試料中の、ネクチン4の存在を検出するために有用である。このような抗ネクチン4抗体は、ヒトネクチン4に結合するが、ネクチン4のシグナル伝達活性を誘導しない抗ネクチン4抗体を含みうる。本明細書で使用される「~を検出すること」又は「検出」という用語は、定量的検出又は定性的検出を包含し、アッセイのリードアウト又は結果を使用して、試料中のネクチン4の存在/非存在、試料中のネクチン4の相対発現レベル(例えば、1若しくは複数の基準発現と比べた相対発現レベル、他の試料と比べた相対発現レベル、又は1若しくは複数の発現スケールと比べた相対発現レベル)、又は試料中のネクチン4の濃度に関する決定を下すことを指す。アッセイから検出されたリードアウトは、数値データ、例えば、qPCRの結果、イムノアッセイの結果、又は測定されたタンパク質濃度の場合もあり;検出されたリードアウトは、非数値データ、例えば、顕微鏡画像における、抗ネクチン4抗体による、細胞又は組織の染色、又はイメージングフローサイトメトリーにおける、ネクチン4の染色の場合もあり;検出されたリードアウトは、当業者に周知の通り、ネクチン4の発現についてのプロキシとして使用されうる、任意の実験のデータ、例えば、蛍光強度、発光強度、比色の読取り、及び吸光/発光分光法の場合もある。本明細書では、アッセイで検出されたリードアウトを、アッセイのシグナルと称する。
本明細書で提供される、生物学的試料とは、生物学的由来を有する、試料又は材料である。生物学的試料は、体液試料、細胞試料、又は組織試料を含む。一部の実施形態では、細胞は、培養細胞系の場合もあり、操作細胞の場合もあり、対象、例えば、ヒト対象から得られた細胞の、in vitro若しくはex vivoにおける培養物の場合もあり、対象から得られた細胞の場合もある。他の実施形態では、組織試料は、ヒト対象を含む対象から得られた体液又は組織を含みうる。一部の実施形態では、組織試料は、疾患を有することが疑われる対象の領域に由来する試料を含む。したがって、組織試料は、哺乳動物、特に、ヒトなどの生物から単離された、組織、体液、組織画分、及び/又は細胞でありうるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、組織試料を、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)切片へと調製する。細胞、体液、及び/又は組織は、当業者に周知の方法、例えば、生検(液体生検を含む)、外科手順、細胞スミア、及び瀉血により、対象、例えば、ヒト対象から得ることができる。
一態様では、本開示は、生物学的試料中の、ネクチン4の存在を検出する方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、抗ネクチン4抗体の、ネクチン4への結合を許容する条件下で、生物学的試料を、抗ネクチン4抗体と接触させるステップと、抗ネクチン4抗体と、ネクチン4との結合を検出するステップとを含む。
当業者に周知の通り、生物学的試料中の抗原に結合した抗体の量は、生物学的試料中の抗原の量と相関する。したがって、本明細書で提供される抗ネクチン4抗体の、生物学的試料中のネクチン4への結合の量を使用して、生物学的試料中の、ネクチン4の量又は発現レベルを測定することができる。一部の実施形態では、生物学的試料中のネクチン4の量を、抗ネクチン4抗体の線形検出範囲内で検出する。「線形検出範囲」とは、抗原の量又は濃度の範囲であって、その中では、結合した抗体が、生物学的試料中の抗原の量又は濃度と、線形的に相関する、上記範囲を指す。このような線形範囲は、抗体と抗原とのアフィニティー、抗体-抗原間結合のために使用される抗体の濃度、及び抗体-抗原間結合のために使用される条件などの因子に依存する。
抗体-抗原間結合のために使用される抗体の濃度は、滴定実験において評価することができる。このような滴定実験についての一実施形態では、抗体の濃度を、2倍、3倍、5倍、又は10倍の倍率で系列希釈し、系列希釈された抗体を、各々、既知量の、対応する抗原を伴う対照試料に結合させた。一実施形態では、所望の抗体濃度は、抗体の結合量が、最も広い線形検出範囲を示差化する濃度である。
生物学的試料中のネクチン4の発現は、所与の時点における、生物学的試料中のネクチン4の量を指す。測定されるネクチン4の発現は、ある期間にわたる、生物学的試料中のネクチン4の蓄積を反映し、全長ネクチン4、ネクチン4の断片、及び天然で修飾された、例えば、グリコシル化されたネクチン4など、分解産物又は修飾産物を含みうる。タンパク質は、mRNAから翻訳されるので、生物学的試料中のmRNAのレベルは、生物学的試料中のネクチン4の発現についてのプロキシとして使用することができる。
本明細書では、がんを有することが疑われる対象に由来する組織試料中のネクチン4の発現を評価するための方法であって、(a)前記組織試料を、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと;(b)前記抗体又はその抗原結合性断片の、前記組織試料への結合を検出するステップと;(c)組織試料中の、ネクチン4の発現を決定するステップであって、組織試料中の、ネクチン4の発現レベルを、ネクチン4の基準発現レベルと比較する上記ステップとを含む上記方法が提供される。
本明細書ではまた、がんを有することが疑われる対象に由来する組織試料中のネクチン4の発現を評価するための方法であって、(a)本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片により、組織試料についての、IHCアッセイを実施するステップと;(b)組織試料中の、ネクチン4の発現を決定するステップとを含み、組織試料中の、ネクチン4の発現レベルを、ネクチン4の基準発現レベルと比較する方法も提供される。
本明細書ではまた、がん患者の、抗がん治療剤に対する応答性を評価するための方法であって、前記患者に由来する組織試料中の、ネクチン4の発現に基づき、(a)前記組織試料を、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと;(b)前記抗体又はその抗原結合性断片の、前記組織試料への結合を検出するステップと;(c)組織試料中の、ネクチン4の発現を決定するステップであって、組織試料中の、ネクチン4の発現レベルを、ネクチン4の基準発現レベルと比較する上記ステップとを含み、ネクチン4の発現レベルの、基準と比較した上昇が、前記抗がん治療に対する応答性を示す方法も提供される。
本明細書ではまた、がん患者の、抗がん治療剤に対する応答性を評価するための方法であって、前記患者に由来する組織試料中の、ネクチン4の発現に基づき、(a)本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片により、組織試料についての、IHCアッセイを実施するステップと;(b)組織試料中の、ネクチン4の発現を決定するステップであって、組織試料中の、ネクチン4の発現レベルを、ネクチン4の基準発現レベルと比較する上記ステップとを含み、組織試料中のネクチン4の発現レベルの、基準と比較した上昇が、前記抗がん治療に対する応答性を示す方法も提供される。
本明細書では、対象におけるがんを処置する方法であって、(a)本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片により、対象に由来する組織試料中の、ネクチン4の発現レベルを決定するステップであって、組織試料中の、ネクチン4の発現レベルが、ネクチン4の基準発現レベルより高い上記ステップと;(b)抗がん治療剤を、対象へと投与するステップを含む上記方法が提供される。
本明細書では、対象におけるがんを処置する方法であって、(a)対象に由来する組織試料を、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと;(b)本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片により、対象に由来する組織試料中の、ネクチン4の発現レベルを決定するステップであって、組織試料中の、ネクチン4の発現レベルが、ネクチン4の基準発現レベルより高い上記ステップと;(c)抗がん治療剤を、対象へと投与するステップを含む上記方法が提供される。
本明細書では、対象におけるがんを処置する方法であって、(a)組織試料を、対象から得るステップと;(b)対象に由来する組織試料を、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと;(c)本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片により、対象に由来する組織試料中の、ネクチン4の発現レベルを決定するステップであって、組織試料中の、ネクチン4の発現レベルが、ネクチン4の基準発現レベルより高い上記ステップと;(d)抗がん治療剤を、対象へと投与するステップを含む上記方法が提供される。
本明細書で提供される方法のうちのいずれかにおける対象は、ヒト対象であることが可能であり、対象は、それについてネクチン4の発現の決定を実施しうる任意のがん、及び/又はネクチン4の発現がそれについての診断的価値、予後診断的価値、若しくは予測的価値をもたらしうる任意のがんを有しうる。例示的ながんは、急性リンパ芽球性白血病;急性リンパ芽球性リンパ腫;急性リンパ球性白血病;急性骨髄性(myelogenous)白血病;急性骨髄性(myeloid)白血病(成人型/小児型);副腎皮質癌;AIDS関連がん;AIDS関連リンパ腫;肛門がん;虫垂がん;星状細胞腫;AT/RT(atypical teratoid/rhabdoi)腫瘍;基底細胞癌;胆管がん、肝外(胆管癌);膀胱がん;骨肉腫/悪性線維性組織球腫;脳がん(成人型/小児型);小脳星状細胞腫(成人型/小児型)である脳腫瘍;大脳星状細胞腫/悪性神経膠腫である、脳腫瘍;上衣腫である、脳腫瘍;髄芽腫である、脳腫瘍;原始神経外胚葉腫瘍である、脳腫瘍;視経路視床下部神経膠腫である、脳腫瘍;脳幹神経膠腫;乳がん;気管支腺腫/カルチノイド;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;小児がん;消化管カルチノイド腫瘍;カルチノイド腫瘍;原発不明成人癌;原発不明癌;中枢神経系胚芽腫;原発性中枢神経系リンパ腫;子宮頸がん;小児副腎皮質癌;小児がん;小児大脳星状細胞腫;小児脊索種;慢性リンパ球性白血病;慢性骨髄性(myelogenous)白血病;慢性骨髄性(myeloid)白血病;慢性骨髄増殖性障害;結腸がん;結腸直腸がん;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;線維形成性小細胞腫瘍;肺気腫;子宮内膜がん;上衣芽細胞腫;上衣腫;食道がん;ユーイング腫瘍ファミリー内のユーイング肉腫;頭蓋外胚細胞腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝外胆管がん;胆嚢がん;胃(gastric(stomach))がん;胃カルチノイド;消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質腫瘍;胚細胞腫瘍;頭蓋外絨毛性腫瘍、性腺外絨毛性腫瘍、又は妊娠性卵巣絨毛性腫瘍;原発不明妊娠性絨毛性腫瘍;神経膠腫;脳幹神経膠腫;小児視経路視床下部神経膠腫;毛様細胞白血病;頭頚部がん;心臓がん;肝細胞(肝)がん;ホジキンリンパ腫;下咽頭がん;視経路視床下部神経膠腫;眼内黒色腫;膵島細胞癌(膵臓内分泌癌);カポジ肉腫;腎臓がん(腎細胞がん);ランゲルハンス細胞組織球増殖症;喉頭がん;口唇口腔がん;脂肪肉腫;(原発性)肝がん;肺がん;原発性中枢神経系リンパ腫;ワルデンシュトレームマクログロブリン血症;男性乳がん;骨悪性線維性組織球腫/骨肉腫;髄芽腫;髄様上皮腫;黒色腫;眼内(眼)黒色腫;メルケル細胞がん;メルケル細胞皮膚癌;中皮腫;成人悪性中皮腫;原発不明転移性扁平上皮性頸部がん;口腔がん;多発性内分泌腫瘍症候群;多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉腫、骨髄異形成症候群;骨髄異形成性疾患/骨髄増殖性疾患;慢性骨髄性(myelogenous)白血病;成人急性骨髄性(myeloid)白血病;小児急性骨髄性(myeloid)白血病;多発性骨髄腫(骨髄がん);慢性骨髄増殖性障害;鼻腔副鼻腔がん;鼻咽頭がん;神経芽腫、非小細胞肺がん;非ホジキンリンパ腫;希突起神経膠腫;口腔がん(oral cancer、oral cavity cancer);口腔咽頭がん;骨肉腫及び骨悪性線維性組織球腫;卵巣がん;卵巣上皮がん(表面上皮-間質腫瘍);卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度潜在性腫瘍;膵臓がん;膵島細胞性膵臓がん;乳頭腫症;副鼻腔鼻腔がん;副甲状腺癌;陰茎がん;咽頭がん;褐色細胞腫;松果体星状細胞腫;松果体胚細胞腫;中分化型松果体実質細胞腫瘍;松果体芽細胞腫及び原始神経外胚葉腫瘍;下垂体腫瘍;形質細胞腫/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系リンパ腫;前立腺癌;直腸がん;腎細胞癌(腎がん);腎盂尿管移行上皮がん;第15染色体上のNUT遺伝子に関与する気管癌;網膜芽細胞腫;小児横紋筋肉腫;唾液腺がん;ユーイング腫瘍ファミリーの肉腫;セザリー症候群;皮膚がん(黒色腫);皮膚がん(非黒色腫);小細胞肺がん;小腸がん、軟部組織肉腫;軟部組織肉腫;脊髄腫瘍;扁平上皮がん;原発不明転移性扁平上皮性頸部がん;胃(gastric(stomach))がん;原始神経外胚葉腫瘍;皮膚T細胞リンパ腫(菌状息肉腫及びセザリー症候群);精巣がん;咽頭がん;胸腺腫;胸腺腫及び胸腺癌;甲状腺がん;小児甲状腺がん;腎盂尿管移行上皮がん;尿道がん;子宮内膜がん;尿路上皮がん、膀胱がん、尿管がん、尿道がん、及び尿膜管がん、子宮肉腫;膣がん;外陰がん;ウィルムス腫瘍;及びネクチン4を発現する上皮由来の他のがんを含む。
本明細書で提供される方法についての一部の実施形態では、対象、例えば、ヒト対象は、子宮内膜がん、尿路上皮がん、膀胱がん、尿管がん、尿道がん、肺がん、卵巣がん、乳がん、食道がん、膵臓がん、頭頸部がん、前立腺がん、陰茎がん、肛門がん、外陰がん、尿膜管がん、及びネクチン4を発現する上皮由来の他のがんからなる群から選択されるがんを有することが疑われる。
本明細書で使用される「応答性」という用語は、細胞又は個体又は患者又は対象が、抗がん治療剤による処置に対して、応答するか、又は反応を有する可能性を指す。応答性は、例えば、抗がん治療剤に対する、広範にわたる反応の可能性、がん性細胞の増殖(proliferation又はgrowth)の減少、がん性細胞の細胞死の増大、がん性細胞の数若しくは腫瘍サイズの低減、腫瘍サイズの増大速度の低減、がん病期の進行の遅滞、がん病期又は腫瘍サイズの退縮、がんマーカーの発現の低減、がん転移の低減、並びに/又は患者の体重の回復、6カ月後、1年後、2年後、3年後、又は5年後における患者の生存率、及び/若しくは患者の生存時間など、患者転帰の改善を含みうるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、応答性を、非感受性(すなわち、応答する可能性が小さい)、感受性(応答する可能性が大きい)、及び/又は不定として等級付けすることができる。ある特定の実施形態では、細胞、組織、患者、又は対象が、その腫瘍内又はがん性細胞内の、ネクチン4の著明な発現を示す場合、細胞又は組織又は個体又は患者又は対象は、抗がん治療剤に応答する可能性が高い。ある特定の実施形態では、応答性は、腫瘍細胞/組織内又はがん性細胞/組織内のネクチン4のレベルの上昇と共に上昇する。ある特定の実施形態では、応答性は、腫瘍細胞/組織又はがん性細胞/組織の、ネクチン4の発現のレベルと相関する。ある特定の実施形態では、応答性は、腫瘍細胞/組織又はがん性細胞/組織の、ネクチン4の発現のレベルと正比例する。他の実施形態では、細胞、組織、患者、又は対象の、抗がん治療剤に対する応答性は、ネクチン4の発現について陰性である細胞の、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、200%、250%、300%、400%、500%、750%、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、又はこれを超える応答性でありうる。
本明細書で使用される、「応答性を示す」とは、応答性が、1つの細胞、組織、ヒト個体、又は対象において、別の細胞、組織、ヒト個体、又は対象よりも大きいという予測を指す。このような予測は、ある特定の基準に基づきなされる。一部の実施形態では、応答性の予測は、細胞、組織、腫瘍、ヒト個体、又は対象における、ネクチン4の発現レベルに基づきなされる。上記で記載した通り、ある特定の実施形態では、細胞、組織、患者、又は対象が、その腫瘍内又はがん性細胞内の、ネクチン4の著明な発現を示す場合、細胞又は組織又は個体又は患者又は対象は、抗がん治療剤に応答する可能性が高いと予測される。ある特定の実施形態では、応答性は、腫瘍細胞/組織内又はがん性細胞/組織内のネクチン4のレベルの上昇と共に上昇すると予測される。ある特定の実施形態では、応答性は、腫瘍細胞/組織又はがん性細胞/組織の、ネクチン4の発現のレベルと相関すると予測される。ある特定の実施形態では、応答性は、腫瘍細胞/組織又はがん性細胞/組織の、ネクチン4の発現のレベルと正比例すると予測される。他の実施形態では、細胞、組織、患者、又は対象の、抗がん治療剤に対する応答性は、ネクチン4の発現について陰性である細胞の、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、200%、250%、300%、400%、500%、750%、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、又はこれを超える応答性であると予測される。
抗がん治療剤は、ネクチン4の発現が、診断値、予後診断値、又は予測値をもたらしうる、任意の抗がん治療剤、又は任意の抗がん治療でありうる。ある特定の実施形態では、治療剤は、ネクチン4が役割を果たす生物学的過程、例えば、シグナル伝達経路、代謝経路、又はタンパク質合成/分解経路をターゲティングする治療剤である。ある特定の実施形態では、治療剤は、ネクチン4活性、ネクチン4シグナル伝達、又はネクチン4媒介性疾患をターゲティングする治療剤である。具体的な実施形態では、治療剤は、抗ネクチン4抗体又は抗ネクチン4抗体薬物コンジュゲートである。
組織試料中の、ネクチン4の発現を決定するために、組織試料中の、ネクチン4の発現レベルを、ネクチン4の基準発現レベルと比較するか、又は相関させる。本明細書で使用される「基準発現レベル」とは、被験試料中のネクチン4の発現レベルと比較した場合に、被験試料中のネクチン4の発現についての相対的情報ともたらす、基準試料中の発現レベルを指す。基準発現レベルは、既知の発現レベル、例えば、ネクチン4の量、濃度、及び/又はモル数量が既知である場合の、基準試料中の発現でありうる。例えば、基準発現レベルは、細胞が、既知量のネクチン4を発現するようにトランスフェクトされているか、又は他の形で操作されている場合の、細胞系内のネクチン4の発現でありうる。一部の実施形態では、基準発現レベルは、ネクチン4の発現が、ELISA、SDS-PAGE、定量的免疫沈降、及び/又は定量的ウェスタンブロット法など、本明細書で提供されるか、又は当業者に公知の方法により定量化された場合の、細胞内のネクチン4の発現でありうる。他の実施形態では、基準発現レベルは、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、75、100、及びこれを超える基準など、1つを超える基準を伴う。一実施形態では、基準レベルは、4つの基準:ネクチン4の発現について陰性の基準、ネクチン4の弱い発現を伴う基準、ネクチン4の中程度の発現を伴う基準、及びネクチン4の高発現/強い発現を伴う基準を有する。
代替的に、基準発現レベルは、ネクチン4の正確な濃度又は数量は、未知であるが、基準試料の状態、活性、及び/又は機能は、既知であるレベルでありうる。一部の実施形態では、基準発現レベルは、がんを有することが疑われる、同じ患者に由来する非がん性細胞の基準発現レベルでありうる。このような実施形態では、被験試料中のネクチン4の発現を、基準試料中のネクチン4の発現と比較することにより、非がん性細胞のネクチン4の発現と比べた(例えば、これより高度であるか、低度であるか、又はこれと実質的に同じ)、被験試料中のネクチン4の発現を決定することができる。他の実施形態では、基準発現レベルは、がん性細胞の基準発現レベルであることが可能であり、この場合、被験試料中のネクチン4の発現を、基準試料中のネクチン4の発現と比較することにより、がん性細胞のネクチン4の発現と比べた(例えば、これより高度であるか、低度であるか、又はこれと実質的に同じ)、被験試料中のネクチン4の発現を決定することができる。他の実施形態では、基準発現レベルは、第2の対象に由来する細胞の基準発現レベルであることが可能であり、この場合、被験試料中のネクチン4の発現を、基準試料中のネクチン4の発現と比較することにより、第2の対象に由来する細胞のネクチン4の発現と比べた(例えば、これより高度であるか、低度であるか、又はこれと実質的に同じ)、被験試料中のネクチン4の発現を決定することができる。第2の対象は、がんを有さない正常ヒト対象の場合もあり、患者が有することを疑われるがんと同じ種類のがんを有するヒト対象の場合もあり、患者が有することを疑われるがんと異なる種類のがんを有するヒト対象の場合もある。
本明細書で記載される基準試料及び基準細胞は、細胞系、がんを有することが疑われる患者から得られた細胞の、in vitro又はex vivoにおける培養物、がんを有することが疑われる患者から得られた細胞、第2の対象から得られた細胞の、in vitro又はex vivoにおける培養物、第2の対象から得られた細胞でありうる。
したがって、本明細書で提供される方法についての一部の実施形態では、ネクチン4の基準発現レベルは、前記対象の、がん性細胞、非がん性細胞、又は第2の対象に由来する非がん性細胞における、ネクチン4の発現レベルでありうる。
上記で記載した通り、一部の実施形態では、試料中のネクチン4の発現は、抗ネクチン4抗体の、試料への結合を、抗ネクチン4抗体の、陰性基準物質及び陽性基準物質への結合であって、基準物質中の、ネクチン4発現レベルが既知である、上記結合と相関させるか、又は比較することにより決定することができる。基準ネクチン4発現は、ネクチン4陽性対照又はネクチン4陰性対照でありうる。本明細書で使用される、「ネクチン4陽性対照」又は「陽性対照」とは、著明量のネクチン4を発現することが既知である、細胞、組織、腫瘍、ヒト、及び/又は対象を指す。「ネクチン4陰性対照」又は「陰性対照」とは、ネクチン4を発現しないか、又はネクチン4の発現が低レベルであり、結果として細胞内又は組織内のネクチン4が生物学的に著明ではないことが既知である細胞及び/又は組織を指す。(1)当業者が、ネクチン4の発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子のタンパク質産物に照らして、低度であると考える場合;(2)低量のネクチン4の存在又は非存在が、細胞又は組織に対して、生物学的差違をもたらさない場合;及び(3)これらの著明ではない量のネクチン4を、細胞又は組織から、除去又は欠損させても、細胞又は組織が、このような除去又は欠損の前と実質的に同じ形で機能し続ける場合、ネクチン4レベルは、生物学的に著明ではない。既知のネクチン4発現は、qPCRアッセイにより、独立に決定することができる。既知のネクチン4発現はまた、ネクチン4特異的であることが決定されている抗ネクチン4抗体(例えば、上記で記載した特異性スクリーニング方法において同定された、ネクチン4特異的抗体)を用いる、下記に記載される、任意のイムノアッセイを使用して、独立に決定することもできる。適切なイムノアッセイは、例を目的として、いかなる限定も伴わずに述べると、IHCアッセイ、免疫ブロットアッセイ、FACSアッセイ、又はELISAを含む。一部の実施形態では、陰性対照中のネクチン4 mRNAレベルは、アッセイのバックグラウンドノイズに起因して、又は生物学的に著明ではない、低レベルの残存ネクチン4に起因して、ゼロではありえない。ネクチン4陰性対照は、例えば、qPCRアッセイにおけるネクチン4 mRNAレベルが、非特異的プライマーのセットにより検出されるmRNAのレベルと、実質的に同様である場合、又はネクチン4 mRNAレベルが、ネクチン4陽性対照におけるにおけるネクチン4 mRNAレベルに照らして、生物学的に著明ではない場合に、ネクチン4について、適正に陰性であると考えることができる。同様に、別のネクチン4特異的抗体を、陰性対照中使用するイムノアッセイにより検出されるネクチン4も、アッセイのバックグラウンドノイズに起因して、又は生物学的に著明ではない、低レベルの残存ネクチン4に起因して、ゼロではありえない。バックグラウンドノイズは、抗ネクチン4抗体以外のアッセイ試薬と試料との、非特異的相互作用により引き起こされうる。ネクチン4陰性対照は、例えば、抗ネクチン4抗体により検出される、陰性対照中のネクチン4レベルが、同じアッセイにおける、アイソタイプ対照抗体による検出レベルと、実質的に同様である場合に、ネクチン4について、適正に陰性であると考えることができる。一部のアッセイでは、バックグラウンドノイズは、ネクチン4の発現による、検出シグナルの実質的な百分率に相当しうる。
加えて、陽性及び/又は陰性の組織、細胞(例えば、細胞系を含む)、並びに病理学的試料を含む、陽性対照及び陰性対照は、文献において、当業者により、同定され、公表されている。このような文献は、Pubmedなどのデータベースを検索し(例えば、ネクチン4、発現、陽性、陰性、及び/又は分布などの検索用語を使用して)、検索ヒットを解析することにより、たやすく同定することができる。
したがって、ネクチン4の発現を伴わない陰性対照細胞に結合した抗体又はその抗原結合性断片の相対量は、ネクチン4を発現する試料細胞に結合した抗体又はその抗原結合性断片の量の、約50%、40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.03%、0.01%、0.001%、又はこれ未満でありうる。
したがって、本明細書で提供される方法についての一部の実施形態では、ネクチン4の基準発現レベルは、陰性対照におけるネクチン4の発現レベルであり、この場合、陰性対照におけるネクチン4の発現は、独立に、qPCRアッセイ、第2の抗体を用いるIHCアッセイ、第2の抗体を用いる免疫ブロットアッセイ、第2の抗体を用いるFACSアッセイ、又は第2の抗体を用いるELISAにより決定される。
本明細書で提供される方法についての他の実施形態では、ネクチン4の基準発現レベルは、ネクチン4を発現する陽性対照細胞におけるネクチン4の発現レベルであり、この場合、陽性対照におけるネクチン4の発現は、独立に、qPCRアッセイ、第2の抗体を用いるIHCアッセイ、第2の抗体を用いる免疫ブロットアッセイ、第2の抗体を用いるFACSアッセイ、又は第2の抗体を用いるELISAにより決定される。
試料中の、ネクチン4の発現レベルは、陽性対照における発現レベルと異なりうる。組織試料に結合した抗体又はその抗原結合性断片の相対量は、ネクチン4を発現する陽性対照細胞に結合した抗体又はその抗原結合性断片の量の、約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、200%、250%、300%、400%、500%、750%、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、500倍、又はこれを超える量でありうる。
当技術分野では、多くの異なるPCRプロトコール又はqPCRプロトコールが公知であり、本明細書の下記でも例示し、試料中又は対照中のネクチン4タンパク質の発現レベルについてのプロキシとして使用されうる、試料中又は対照中のネクチン4 mRNAレベルを決定するために、直接適用するか又は適合させることができる。一部の実施形態では、定量的PCR(qPCR)(また、リアルタイムPCRとも称する)は、定量的測定だけでなく、時間の短縮及び夾雑の低減もたらすので、これを適用するか又は適合させる。本明細書で使用される「定量的PCR」(又は「qPCR」)とは、それが反応産物を繰り返してサンプリングする必要なしに行われるので、PCR増幅の進行を、直接モニタリングすることを指す。定量的PCRでは、反応産物が発生し、追跡されるのは、シグナルがバックグラウンドレベルを上回って上昇した後であるが、反応がプラトー状態に到達する前であるので、シグナル発生機構(例えば、蛍光)を介して反応産物をモニタリングすることができる。検出可能レベル又は「閾値」レベルの蛍光を達成するのに要求されるサイクル数は、PCR工程の開始時における増幅可能な標的の濃度と共に直接変動し、シグナル強度の尺度が、試料中の標的核酸の量の尺度をリアルタイムでもたらすことを可能としている。qPCRを適用して、mRNAの発現レベルを決定する場合、mRNAを、DNAへと逆転写する、追加のステップを、qPCR解析の前に実施する。PCR方法の例は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、文献(Wongら、BioTechniques、39:75~85(2005);D’haeneら、Methods、50:262~270(2010))において見出すことができる。PCRアッセイの例は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第6,927,024号において見出すことができる。RT-PCR方法の例は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第7,122,799号において見出すことができる。蛍光in situ PCR方法については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第7,186,507号において記載されている。
具体的な一実施形態では、qPCRを実施して、以下の通りに、ネクチン4 mRNAレベルを決定又は測定することができる。略述すると、ネクチン4及び1又は複数のハウスキーピング遺伝子についての、多連qPCR反応の平均値Ct値(サイクル閾値)(又は、本明細書では、互換的に、Cq(定量化サイクル)とも称する)を決定する。次いで、以下の例示的な式:ネクチン4ΔCt=(ネクチン4の平均値Ct-ハウスキーピング遺伝子Aの平均値Ct)を使用して、ネクチン4についての平均値Ct値を、ハウスキーピング遺伝子のCt値に照らして正規化する。次いで、相対ネクチン4ΔCtを使用して、例えば、mRNA発現=2-ΔCtの式を使用することにより、ネクチン4 mRNAの相対レベルを決定することができる。Ct値及びCq値の概要については、MIQEガイドライン(Bustinら、「MIQEガイドライン:定量的リアルタイムPCR実験の公表のための最小限の情報(MIQE Guidelines:Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments)」、Clinical Chemistry、55:4(2009))を参照されたい。
また、試料中のmRNA発現の定量化のための、他の一般に使用される、当技術分野で公知の方法であって、ノーザンブロット法及びin situハイブリダイゼーション(Parker及びBarnes、Methods in Molecular Biology、106:247~283(1999));RNアーゼ保護アッセイ(Hod、Biotechniques、13:852~854(1992));マイクロアレイ(Hoheiselら、Nature Reviews Genetics、7:200~210(2006);Jaluriaら、Microbial Cell Factories、6:4(2007));及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Weisら、Trends in Genetics、8:263~264(1992))を含む上記方法も使用することができる。代替的に、mRNA発現のレベルは、シーケンシング技法により決定することができる。シーケンシングベースの遺伝子発現解析のための代表的な方法は、SAGE(serial analysis of gene expression)、及びMPSS(massively parallel signature sequencing)による遺伝子発現解析を含む。
前出で記載した通り、組織試料は、哺乳動物、特に、ヒトなどの生物から単離された、組織、体液、組織画分、及び/又は細胞でありうるがこれらに限定されない。したがって、組織試料は、ヒト対象を含む対象の、様々な臓器から得ることができる。一部の実施形態では、組織試料を、がんなどの疾患、機能不全、又は障害を有することが疑われる臓器から得る。他の実施形態では、組織試料を、被験患者又は第2のヒト対象に由来する正常臓器から得る。
本明細書で提供される方法についてのある特定の実施形態では、組織は、膀胱、尿管、乳腺、肺、結腸、直腸、卵巣、卵管、食道、頸部、子宮内膜、皮膚、喉頭、骨髄、唾液腺、腎臓、前立腺、脳、脊髄、胎盤、副腎、膵臓、副甲状腺、下垂体、精巣、甲状腺、脾臓、扁桃腺、胸腺、心臓、胃、小腸、肝臓、骨格筋、末梢神経、中皮、又は眼に由来する組織を含む。
試料に結合した抗ネクチン4抗体は、当技術分野で公知の、様々なイムノアッセイであって、IHC法、免疫ブロットアッセイ、FACSアッセイ、及びELISAを含む上記イムノアッセイにより検出することができる。
ネクチン4は、様々なIHC手法において、抗ネクチン4抗体により検出することができる。組織切片のIHC染色は、試料中のタンパク質の存在を、評価又は検出する、信頼できる方法であることが示されている。IHC技法は、プローブに対する抗体を利用し、一般に、発色方法又は蛍光方法により、in situにおいて、細胞の抗原を視覚化する。ネクチン4を特異的にターゲティングする、ポリクローナル抗血清及びモノクローナル抗体などの一次抗体又は抗血清を使用して、IHCアッセイにおける発現を検出することができる。一部の実施形態では、組織試料を、抗体-標的間結合が生じるのに十分な時間にわたり、特異的標的に対する一次抗体と接触させることができ、抗体は、抗体自体における直接的標識、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼなどの酵素により検出することができる。代替的に、標識化されていない一次抗体を、一次抗体に特異的な抗血清、ポリクローナル抗血清、又はモノクローナル抗体を含む、標識化された二次抗体と共に使用する。当技術分野では、IHCのプロトコール及びキットが周知であり、市販されている。スライド調製及びIHCプロセシングのための自動式システムが、市販されている。Leica BOND Autostainer及びLeica Bond Refine Detectionシステムは、このような自動式システムの例である。
一部の実施形態では、IHCアッセイは、間接的アッセイにおいて、標識化された二次抗体と併用した、標識化されていない一次抗体により実施する。間接的アッセイは、組織試料中のネクチン4など、標的タンパク質の検出のために、2つの抗体を利用する。まず、非コンジュゲート一次抗体を、組織(第1層)へと適用し、組織抗原と反応させる。次に、一次抗体の抗体アイソタイプを特異的に認識する、酵素標識化二次抗体を適用する(第2層)。二次抗体を、一次抗体と反応させるのに続き、色原体である基質を適用する。第2層抗体を、ペルオキシダーゼなどの酵素で標識化し、これを、色原体である3,3’-ジアミノベンジジン(DAB)と反応させて、反応部位において、褐色の沈殿物をもたらす。この方法は、一次抗体上の、シグナル増幅システムを介する、潜在的なシグナル増幅に起因して、高感度且つ多目的な方法である。
ある特定の実施形態では、検出の感度を増大させるために、シグナル増幅システムを使用することができる。本明細書で使用される「シグナル増幅システム」とは、結合した一次抗体又は二次抗体の検出に由来するシグナルを増大させるのに使用されうる、試薬及び方法のシステムを意味する。シグナル増幅システムは、標的タンパク質検出の感度を増大させ、検出されるシグナルを増大させ、検出下限を低下させる。酵素標識化システム及びマクロ標識化システムを含む、いくつかの種類のシグナル増幅システムが存在する。これらのシステム/手法は、互いに排他的ではなく、相加効果のために、組み合わせて使用することができる。
マクロ標識システム又はマクロ標識化システムとは、共通の足場へと接合させるか、又はこの中に組み込んだ、数十(例えば、フィコビリタンパク質)~数百万(例えば、蛍光マイクロスフェア)単位の、標識番号付けの総体である。足場を、抗体などの標的特異的アフィニティー試薬とカップリングさせることができ、組み込まれた標識は、これにより、結合すると、標的と、総体的に会合する。マクロ標識内の標識は、フルオロフォア、ハプテン、酵素、及び/又は放射性同位元素など、本明細書で記載される標識のうちのいずれかでありうる。シグナル増幅システムについての一実施形態では、標識化された鎖ポリマーをコンジュゲートさせた二次抗体を使用した。ポリマー技術は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、50、又はこれを超える分子の二次抗体を接合させることができる、デキストランのHRP酵素標識化不活性「スパイン」分子を利用し、システムを、なおより高感度とした。
酵素標識化システムに基づくシグナル増幅システムは、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)又はアルカリホスファターゼなどの酵素の触媒活性を利用して、in situにおいて、標的タンパク質又は標的核酸配列の、高密度の標識化を行う。一実施形態では、チラミドを使用して、HRPのシグナルを増大させることができる。このようなシステムでは、HRPは、標識化されたチラミド誘導体を、高度に反応性で、短命のチラミドラジカルへと、酵素的に転換する。次いで、標識化された活性チラミドラジカルは、HRP-抗体-標的相互作用部位の近傍において、残基(主に、タンパク質のチロシン残基のフェノール部分)と、共有結合的にカップリングする結果として、シグナル局在化の、拡散と関連する喪失を最小限として、部位における標識数の増幅をもたらす。結果として、シグナルを、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、50、75、又は100倍に増幅することができる。当業者に公知の通り、チラミド上の標識は、フルオロフォア、酵素、ハプテン、放射性同位元素、及び/又はホトホアを含む、本明細書で記載される、任意の標識でありうる。他の酵素ベースの反応を利用して、シグナル増幅を創出することもできる。例えば、酵素標識化蛍光(ELF)シグナル増幅が、アルカリホスファターゼに利用可能であり、この場合、アルカリホスファターゼは、弱い青色蛍光基質(ELF 97 phosphate)を、酵素的に切断し、明るい黄緑色の蛍光沈殿物へと転換し、異例に大きなストークスシフト及び優れた光安定性を呈する。チラミドベースのシグナル増幅システム及びELFシグナル増幅のいずれも、例えば、ThermoFisher Scientific(Waltham、MA USA 02451)から市販されている。
したがって、本明細書で提供される方法についての一部の実施形態では、ネクチン4の発現レベルを、シグナル増幅システムにより検出する。
次いで、一部の実施形態では、検体を対比染色して、細胞要素及び細胞内要素を同定する。
一部の実施形態では、ネクチン4の発現レベルはまた、免疫ブロットアッセイを使用して、本明細書で記載される抗体により検出することもできる。免疫ブロットアッセイについての一部の実施形態では、タンパク質は、電気泳動により分離され、膜(通例、ニトロセルロース膜又はPVDF膜)へと転写されることが多い(が、そうしなくともよい)。IHCアッセイと同様に、ネクチン4を特異的にターゲティングする、ポリクローナル抗血清及びモノクローナル抗体などの一次抗体又は抗血清を使用して、タンパク質の発現を検出することができる。一部の実施形態では、膜を、抗体-標的間結合が生じるのに十分な時間にわたり、特異的標的に対する一次抗体と接触させることができ、結合した抗体は、抗体自体における直接的標識、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼなどの酵素により検出することができる。他の実施形態では、標識化されていない一次抗体を、一次抗体に特異的な抗血清、ポリクローナル抗血清、又はモノクローナル抗体を含む、標識化された二次抗体と共に使用する。本明細書で記載される通り、二次抗体は、例えば、酵素、又は蛍光標識、発光標識、比色標識、若しくは放射性同位元素など、他の検出可能な標識により標識化することができる。当技術分野では、免疫ブロット法のプロトコール及びキットが周知であり、市販されている。免疫ブロットのための自動式システム、例えば、iBind Western Systems for Western blotting(ThermoFisher、Waltham、MA USA 02451)が、市販されている。免疫ブロット法は、ウェスタンブロット、細胞内ウェスタンブロット、及びドットブロットを含むがこれらに限定されない。ドットブロットは、タンパク質試料を、電気泳動により分離せず、膜上に直接スポッティングする、簡略型手順である。細胞内ウェスタンブロットは、細胞を、マイクロ滴定プレート内に播種すること、細胞を、固定/透過化すること、一次標識化一次抗体又は標識化されていない一次抗体による、その後の検出に続く、本明細書で記載される、標識化された二次抗体による検出を伴う。
他の実施形態では、ネクチン4の発現レベルはまた、蛍光活性化細胞分取(FACS)アッセイを含む、フローサイトメトリーアッセイにおいて、本明細書で記載される抗体により検出することもできる。IHCアッセイ又は免疫ブロットアッセイと同様に、ネクチン4を特異的にターゲティングする、ポリクローナル抗血清及びモノクローナル抗体などの一次抗体又は抗血清を使用して、FACSアッセイにおいて、タンパク質の発現を検出することができる。一部の実施形態では、細胞を、抗体-標的間結合が生じるのに十分な時間にわたり、特異的標的タンパク質に対する一次抗体で染色させることができ、結合した抗体は、一次抗体上の直接的標識、例えば、一次抗体上の、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識により検出することができる。他の実施形態では、標識化されていない一次抗体を、一次抗体に特異的な、標識化された二次抗体と共に、上記で記載した間接的アッセイにおいて使用する。FACSは、各細胞の、特異的な光の散乱及び蛍光特徴に基づき、蛍光的に標識化された生物学的細胞の混合物の、一度に1つずつの細胞を、分取又は解析するための方法を提供する。したがって、フローサイトメーターは、標的タンパク質の発現レベルを指し示す、蛍光色素でタグ付けされた抗体を検出し、その強度について報告する。したがって、表面タンパク質(ネクチン4など)の発現レベルは、標的タンパク質に対する抗体を使用して検出することができる。非蛍光細胞質タンパク質はまた、透過化細胞を、染色することによっても観察することができる。当業者には、FACSによる染色及び解析を実施するための方法が周知であり、Teresa S.Hawley及びRobert G.Hawley、「フローサイトメトリープロトコール(Flow Cytometry Protocols)」、Humana Press、2011(ISBN 1617379506、9781617379505)により記載されている。
他の実施形態では、ネクチン4の発現レベルはまた、酵素イムノアッセイ(EIA)又はELISAなどのイムノアッセイを使用して検出することもできる。当技術分野では、例えば、血液、血漿、血清又は骨髄を含む、多種多様な組織及び試料についてアッセイするために、EIAアッセイ及びELISAアッセイのいずれもが公知である。広範にわたるELISAアッセイフォーマットが利用可能であり、例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第4,016,043号、同第4,424,279号、及び同第4,018,653号を参照されたい。これらは、非競合型の、単一部位アッセイ及び二部位アッセイの両方、又は「サンドイッチ」アッセイのほか、従来の非競合的結合アッセイを含む。これらのアッセイはまた、標識化抗体の、標的タンパク質への直接的結合も含む。サンドイッチアッセイは、一般に使用されるアッセイである。サンドイッチアッセイ技法の、いくつかの変化形が存在する。例えば、典型的なフォワードアッセイでは、標識化されていない抗体を、固体基質上に固定化し、被験試料を、結合させた分子と接触させる。次いで、抗体-抗原間複合体の形成を可能とするのに十分な時間にわたる、適切なインキュベーション時間の後、検出可能なシグナルをもたらすことが可能なレポーター分子で標識化された、抗原に特異的な第2の抗体を添加し、インキュベートし、抗体-抗原-標識化抗体間の、別の複合体の形成に十分な時間を与える。反応しなかった任意の材料を洗い流し、抗原の存在を、レポーター分子によりもたらされるシグナルの観察により決定する。結果は、可視的なシグナルの簡単な観察による、定性的結果の場合もあり、公知の量の標的タンパク質を含有する対照試料と比較することによる、定量化された結果の場合もある。
EIAアッセイ又はELISAアッセイについての一部の実施形態では、酵素を、第2の抗体へとへとコンジュゲートさせる。他の実施形態では、蛍光標識化二次抗体を、酵素標識化二次抗体の代わりに使用して、ELISAアッセイフォーマットのための、検出可能なシグナルをもたらすことができる。特定の波長の光を伴う照射により活性化させられると、蛍光色素で標識化された抗体は、光エネルギーを吸収し、分子内の状態を、励起状態へと誘導するのに続いて、光学顕微鏡で、視覚的に検出可能な、特徴的な色の光の発光を誘導する。EIA及びELISAと同様に、蛍光標識化抗体を、第1の抗体-標的タンパク質複合体に結合させる。次いで、結合しなかった試薬を洗い流した後で、残りの三次複合体を、適切な波長の光へと曝露すると、観察される蛍光は、目的の標的タンパク質の存在を指し示す。免疫蛍光技法及びEIA技法は、いずれも、当技術分野において、極めて十分に確立されており、本明細書でも開示される。
本明細書で記載されるイムノアッセイのために、酵素活性標識又は非酵素標識が、それぞれ、検出されうる限りにおいて、多数の酵素標識又は非酵素標識のうちのいずれかを利用することができる。これにより、酵素は、標的タンパク質を検出するのに利用されうる、検出可能なシグナルをもたらす。特に有用な検出可能シグナルは、発色シグナル又は蛍光発生シグナルである。したがって、特に、標識としての使用に有用な酵素は、発色基質又は蛍光発生基質が利用可能な酵素を含む。このような発色基質又は蛍光発生基質は、酵素反応により、たやすく検出可能な発色生成物又は蛍光生成物へと転換することができ、これらは、顕微鏡法又は分光法を使用して、たやすく検出及び/又は定量化することができる。このような酵素は、当業者に周知であり、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどを含むがこれらに限定されない(Hermanson、「バイオコンジュゲート技法(Bioconjugate Techniques)」、Academic Press、San Diego(1996)を参照されたい)。周知の発色基質又は蛍光発生基質を有する、他の酵素は、多様なペプチダーゼを含み、この場合、発色ペプチド基質及び蛍光発生ペプチド基質を利用して、タンパク質分解性切断反応を検出することができる。細菌診断法では、α-ガラクトシダーゼ及びβ-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、6-ホスホ-β-D-ガラクトシド6-ホスホガラクトヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ、α-グルコシダーゼ、アミラーゼ、ノイラミニダーゼ、エステラーゼ、リパーゼなどの使用を含むがこれらに限定されない、発色基質及び蛍光発生基質の使用もまた周知であり(Manafiら、Microbiol.Rev.、55:335~348(1991))、公知の発色基質又は蛍光発生基質を伴う、このような酵素は、本発明の方法における使用のために、たやすく適合させることができる。
当業者には、検出可能なシグナルをもたらす、多様な発色基質又は蛍光発生基質が周知であり、市販されている。検出可能なシグナルをもたらすのに利用しうる例示的基質は、西洋ワサビペルオキシダーゼのための、3,3’-ジアミノベンジジン(DAB)、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB)、クロロナフトール(4-CN)(4-クロロ-1-ナフトール)、2,2’-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS)、o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド(OPD)、及び3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC);アルカリホスファターゼのための、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-1-リン酸(BCIP)、ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)、Fast Red(Fast Red TR/AS-MX)、及びp-ニトロフェニルリン酸(PNPP);β-ガラクトシダーゼのための、1-メチル-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド及び2-メトキシ-4-(2-ニトロビニル)フェニルβ-D-ガラクトピラノシド;β-グルコシダーゼのための、2-メトキシ-4-(2-ニトロビニル)フェニルβ-D-グルコピラノシドなどを含むがこれらに限定されない。例示的な蛍光発生基質は、アルカリホスファターゼのための、4-(トリフルオロメチル)ウンベリフェリルリン酸;ホスファターゼのための、4-メチルウンベリフェリルリン酸ビス(2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール)、4-メチルウンベリフェリルリン酸ビス(シクロヘキシルアンモニウム)、及び4-メチルウンベリフェリルリン酸;西洋ワサビペルオキシダーゼのためのQuantaBlu(商標)及びQuantaRed(商標);β-ガラクトシダーゼのための、4-メチルウンベリフェリルβ-D-ガラクトピラノシド、フルオレセインジ(β-D-ガラクトピラノシド)、及びナフトフルオロセインジ(β-D-ガラクトピラノシド);β-グルコシダーゼのための、3-アセチルウンベリフェリルβ-D-グルコピラノシド及び4-メチルウンベリフェリル-β-D-グルコピラノシド;並びにα-ガラクトシダーゼのための、4-メチルウンベリフェリル-α-D-ガラクトピラノシドを含むがこれらに限定されない。検出可能なシグナルをもたらすための、例示的な酵素及び基質についてはまた、例えば、米国公開第2012/0100540号においても記載されている。発色基質又は蛍光発生基質を含む、多様な検出用酵素基質は、周知であり、市販されている(Pierce、Rockford IL;Santa Cruz Biotechnology、Dallas TX;Invitrogen、Carlsbad CA;42 Life Science;Biocare)。一般に、基質は、標的核酸の部位に沈着する、沈殿物を形成する産物へと転換される。他の例示的な基質は、HRP-Green(42 Life Science)、Biocare(Concord CA;biocare.net/products/detection/chromogens)製のBetazoid DAB、Cardassian DAB、Romulin AEC、Bajoran Purple、Vina Green、Deep Space Black(商標)、Warp Red(商標)、Vulcan Fast Red及びFerangi Blueを含むがこれらに限定されない。
イムノアッセイについての一部の実施形態では、検出用標識は、一次抗体又は標識化されていない一次抗体を検出する二次抗体へと、直接カップリングさせることができる。当業者には、発色標識又は蛍光標識(Hermanson、「バイオコンジュゲート技法(Bioconjugate Techniques)」、Academic Press、San Diego(1996)を参照されたい)を含むがこれらに限定されない、例示的検出用標識が周知である。標識として有用な、例示的フルオロフォアは、ローダミン誘導体、例えば、テトラメチルローダミン、ローダミンB、ローダミン6G、スルホローダミンB、Texas Red(スルホローダミン101)、ローダミン110、及びテトラメチルローダミン-5-(又は6)、リサミンローダミンBなど、これらの誘導体など;7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール(NBD);フルオレセイン及びその誘導体;ダンシル(5-ジメチルアミノナフタレン-1-スルホニル)などのナフタレン;7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸(AMCA)、7-ジエチルアミノ-3-[(4’-(ヨードアセチル)アミノ)フェニル]-4-メチルクマリン(DCIA)、Alexa fluor色素(Molecular Probes)などのクマリン誘導体;4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン(BODIPY(商標))及びその誘導体(Molecular Probes;Eugene Oreg.);Cascade Blue(商標)及び8-メトキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸を含むその誘導体などのピレン及びスルホン酸化ピレン;ピリジルオキサゾール誘導体及びダポキシル誘導体(Molecular Probes);Lucifer Yellow(3,6-ジスルホナート-4-アミノ-ナフタルイミド)及びその誘導体;CyDye(商標)蛍光色素(Amersham/GE Healthcare Life Sciences;Piscataway NJ)などを含むがこれらに限定されない。例示的な発色団は、フェノールフタレイン、マラカイトグリーン、ニトロフェニルなどのニトロ芳香族、ジアゾ色素、ダブシル(4-ジメチルアミノアゾベンゼン-4’-スルホニル)などを含むがこれらに限定されない。
顕微鏡法又は分光法など、当業者に周知の方法を利用して、一次抗体又は二次抗体と関連する結合した、検出可能な発色シグナル又は蛍光シグナルを視覚化することができる。
「ネクチン4の発現を決定すること」とは、言及されるシステムに精通した人が、被験試料中のネクチン4の相対発現について、言及されるシステム下に位置づけられた他の試料との関係で判断しうるように、被験生物学的試料中のネクチン4の発現を、言及されるシステム(又は言及されるスケール)下に置くことを指す。結果として、このような決定は、被験組織試料中のネクチン4の発現を、ネクチン4の基準発現レベルと比較することを伴う。
一部の実施形態では、言及されるシステムは、被験試料中の、ネクチン4の、実際のモル濃度又はモル数量を、基準発現レベルのモル濃度又はモル数量と比較する定量的システムでありうる。一部の実施形態では、モル濃度又はモル数量と正比例する、他のサロゲートの数値による測定値を使用することができる。これらのサロゲート測定値の例は、結合した抗体の蛍光強度測定値、結合した抗体の発光強度測定値、結合した抗体の放射能測定値、及び/又は結合した抗体の比色測定値若しくは発色測定値を含む。
他の実施形態では、言及されるシステムは、カテゴリー化システムでありうる。カテゴリー化システムは、少なくて、2つのカテゴリーを有することが可能であり、多くて、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、75、100、又はこれを超えるカテゴリーを有しうる。一実施形態では、言及されるシステムは、ネクチン4の発現について陽性である試料についての陽性カテゴリー(陽性)と、ネクチン4の発現について陰性である試料についての陰性カテゴリー(陰性)とを有する。このようなカテゴリー化システムでは、被験試料中のネクチン4の発現を決定することは、被験試料中のネクチン4の発現を、陽性基準試料及び/又は陰性基準試料のネクチン4の発現と比較し、被験試料が、ネクチン4を、陽性基準と同等レベル又は高レベルで発現する場合は、被験試料を、陽性カテゴリー下に置くことを伴う。別の実施形態では、カテゴリー化システムは、3つのカテゴリー、例えば、陰性カテゴリー、中発現カテゴリー、及び高発現カテゴリーを有する。別の実施形態では、カテゴリー化システムは、4つのカテゴリー、例えば、陰性カテゴリー、低発現/弱い発現カテゴリー、中発現/中程度の発現カテゴリー、及び高発現/強い発現カテゴリーを有する。一部の態様では、被験試料中のネクチン4の発現を決定することは、被験試料中のネクチン4の発現を、既知のカテゴリーの、ネクチン4の発現についての、1又は複数の基準と比較し、被験試料を、基準(単数又は複数)に照らしたその相対発現に従い、カテゴリー下に置くことを伴う。
一部の実施形態では、言及されるシステムは、スコアリングシステムでありうる。スコアリングシステムは、カテゴリーを、スコアで置きかえることを除き、カテゴリー化システムと同様でありうる。例えば、ネクチン4の陰性発現及び陽性発現による2カテゴリーシステムは、0及び1のスコアリングシステムであることが可能であり、この場合、0は、陰性を意味し、1は、陽性を意味する。別の実施形態では、3カテゴリーシステムは、0、1、及び2のスコアリングシステムであることが可能であり、この場合、0は、陰性であり、1は、低発現/弱い発現であり、2は、中発現/中程度の発現及び高発現/強い発現である。別の実施形態では、4カテゴリーシステムは、0、1、2、及び3のスコアリングシステムであることが可能であり、この場合、0は、陰性であり、1は、低発現/弱い発現であり、2は、中発現/中程度の発現であり、3は、高発現/強い発現である。カテゴリー化システムと同様に、スコアリングシステムで、被験試料中のネクチン4の発現を決定することは、被験試料中のネクチン4の発現を、公知のスコアを有する、ネクチン4の発現についての、1又は複数の基準と比較し、被験試料に、基準に照らしたその相対発現に従い、スコアを割り当てることを伴う。スコアリングシステムは、しかしながら、不連続数及び離散数(例えば、0、2、4、6、8、及び10のシステム、又は1、4、6、11、13、及び19のシステム)、分数(例えば、1、1.5、2、2.5、3、3.5など)を伴う数、負の数、任意の数(例えば、1000、2000、3000など)から始まる数、及び生物学的試料中の相対タンパク質発現を追跡するのに使用されうる、任意の数のセットによるスコアでありうる。
一部の実施形態では、言及されるシステムは、カテゴリー化システム又はスコアリングシステムと併用した細胞の百分率でありうる。細胞の百分率の、カテゴリー化システム又はスコアリングシステムとの組合せは、試料の、より精緻な悪性度評価をもたらす。このような組合せシステムでは、生物学的試料に由来する各細胞を、カテゴリー化システム又はスコアリングシステムへと割り当てるか、又はこの下に置き、各カテゴリー又は各スコアにおける、被験試料の細胞の近似的な百分率を決定する。一例では、細胞の百分率の測定を、ネクチン4の陽性発現及び陰性発現による2カテゴリーシステムとカップリングさせることができるが、この場合、試料を、全体としては測定せず、ネクチン4の発現について陽性である細胞の百分率と、ネクチン4の発現について陰性である細胞の百分率とに分ける。例えば、ネクチン4の陽性発現及び陰性発現による2カテゴリーシステムでは、被験試料は、2カテゴリーシステム下に置かれるが、10%の細胞が、ネクチン4の発現について陽性であり、90%の細胞が、ネクチン4の発現について陰性である場合、ネクチン4の発現について陰性でありうる。一実施形態では、言及されるシステムは、2カテゴリーシステム又は2スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、3カテゴリーシステム又は3スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、4カテゴリーシステム又は4スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、5カテゴリーシステム又は5スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、6カテゴリーシステム又は6スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、7カテゴリーシステム又は7スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、8カテゴリーシステム又は8スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、9カテゴリーシステム又は9スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、10カテゴリーシステム又は10スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、任意のカテゴリー化又は任意のスコアリングシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、0(ネクチン4について陰性)、1(ネクチン4の低発現/弱い発現)、2(ネクチン4の中発現/中程度の発現)、及び3(ネクチン4の高発現/強い発現)を含む4スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。
一部の態様では、言及されるシステムは、ネクチン4の発現の、少なくとも1つの基準タンパク質の発現に対する比でありうる。一部の実施形態では、比は、ネクチン4の発現の定量的測定値と、基準タンパク質の発現の定量的測定値との比であることが可能であり、この場合、定量的測定値は、モル濃度、モル数量、結合した抗体の蛍光強度測定値、結合した抗体の発光強度測定値、結合した抗体の放射能測定値、及び/又は結合した抗体比色測定値若しくは発色測定値など、本明細書で記載される定量的測定値を含む。他の実施形態では、比はまた、本明細書で提供される、任意のスコアリングシステムに従い、ネクチン4の発現へと割り当てられるスコアと、基準タンパク質へと割り当てられるスコアとの比でもありうるであろう。基準タンパク質は、アクチン、GAPDH、GDI、又はハウスキーピング遺伝子が発現する任意のタンパク質など、通常の細胞機能を有するタンパク質でありうるであろう。例えば、被験試料が、ネクチン4の発現について、3のスコアを有し、アクチンの発現について、1のスコアを有する場合、比は、3であると決定することができる。
他の態様では、基準システムは、カテゴリー化、スコア、比、百分率、及び定量的測定値のうちの1又は複数を入力として使用する、数学的関数の結果を利用しうる。一部の実施形態では、数学的関数は、試料中のネクチン4の発現、及び/又はネクチン4の発現スケールにおける、より精緻なグラデーションについての、より詳細な情報をもたらす結果を生み出すように、これらの演算子を、複合させるか、足し合わせるか、掛け合わせるか、又は組み合わせることを使用して、多様な入力を組み合わせる。一実施形態では、数学的関数は、百分率と、4スコアシステムとの組合せに基づき、Hスコアを計算する。例えば、Hスコアは、細胞の百分率(0~100)と、細胞の各ネクチン4発現スコア(0=陰性、1=低/弱い、2=中程度の/中、及び3=高/強い)との積を足し合わせることにより計算した。例えば、10%の細胞が3とスコアリングされ、30%の細胞が2とスコアリングされ、20%の細胞が1とスコアリングされ、及び40%の細胞が0とスコアリングされる検体であれば、(3×10)+(2×30)+(1×20)+(0×40)=110のHスコアを有するであろう。
したがって、本明細書で提供される通り、ネクチン4の発現レベルは、カテゴリー化システム、スコアリングシステム、ネクチン4の発現の、少なくとも1つの基準タンパク質の発現に対する比、前記カテゴリー化システム又はスコアリングシステムにおける細胞の百分率、ネクチン4の染色シグナルの定量的測定値、又は前記カテゴリー化、スコア、比、百分率、及び定量的測定値のうちの1若しくは複数を入力として使用する数学的関数の結果を使用して決定することができる。
大半のホルマリン固定組織は、免疫組織化学染色の前に、抗原賦活化ステップを要求する。固定時に形成されるメチレン架橋は、タンパク質を架橋し、抗原のエピトープを遮蔽する。抗原賦活化方法は、これらのメチレン架橋を切断し、エピトープを露出させ、抗体が結合することを可能とする。一部の実施形態では、抗原を、熱誘導エピトープ賦活化(HIER)方法により賦活化させる。他の実施形態では、抗原を、酵素賦活化(例えば、タンパク質分解性消化)方法により賦活化させる。HIERのために、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片は、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃、又は130℃で加熱することができる。FFPE組織切片は、これらの温度のうちのいずれかで、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、150、180、240、300、360、420、480、540、600、660、720、780、840、900、960、1020、1080、1140、1200、1260、1320、1380、及び1440分間にわたり加熱することができる。前述の温度のうちのいずれかで、前述の持続時間のうちのいずれかにわたるHIER手順を、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7、7.2、7.4、7.6、7.8、8、8.2、8.4、8.6、8.8、9、9.2、9.4、9.6、9.8、10、10.2、10.4、10.6、10.8、11、11.5、又は12のpHを有する溶液中で実施することができる。一部の実施形態では、HIERを、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃からなる群から選択される温度で、5、10、15、20、25、30、35、40からなる群から選択される持続時間にわたり、8、8.2、8.4、8.6、8.8、9、9.2、9.4、9.6、9.8、10、10.2、10.4からなる群から選択されるpHで実施することができる。
したがって、本明細書で提供される方法は、熱誘導エピトープ賦活化(HIER)により、ネクチン4のエピトープを賦活化させるステップをさらに含む。
ネクチン4抗原に免疫特異的に結合する、非標識化抗体、標識化抗体、並びにこれらの誘導体及び類似体は、ネクチン4媒介性疾患を検出、診断、又はモニタリングする診断目的で使用することができる。したがって、本明細書では、ネクチン4媒介性疾患を検出するための方法であって、(a)ネクチン4抗原に免疫特異的に結合する、1又は複数の、本明細書で提供される抗体を使用して、対象の細胞試料中又は組織試料中の、ネクチン4抗原の発現についてアッセイするステップと;(b)ネクチン4抗原のレベルを、基準レベル、例えば、正常組織試料(例えば、ネクチン4媒介性疾患を有さない患者に由来する組織試料、疾患発病の前における同じ患者に有来する組織試料、同じ患者に由来する組織試料中の正常細胞、又は同じ患者に由来する正常臓器に由来する正常組織試料)中のレベルと比較するステップであって、ネクチン4抗原のアッセイレベルの、ネクチン4抗原の対照レベルと比較した上昇が、ネクチン4媒介性疾患を示す上記ステップとを含む上記方法が提供される。
本明細書ではまた、ネクチン4媒介性疾患を診断するための診断アッセイであって、(a)ネクチン4抗原に免疫特異的に結合する、1又は複数の、本明細書で提供される抗体を使用して、個体の細胞試料中又は組織試料中の、ネクチン4抗原のレベルについてアッセイするステップと;(b)ネクチン4抗原のレベルを、基準レベル、例えば、正常組織試料中のレベルと比較するステップであって、ネクチン4抗原のアッセイレベルの、ネクチン4抗原の基準レベルと比較した上昇が、ネクチン4媒介性疾患を示す上記ステップとを含む上記診断アッセイも提供される。本明細書のある特定の実施形態では、対象におけるネクチン4媒介性疾患を処置する方法であって、(a)ネクチン4抗原に免疫特異的に結合する、1又は複数の、本明細書で提供される抗体を使用して、対象の細胞試料中又は組織試料中の、ネクチン4抗原のレベルについてアッセイするステップと;(b)ネクチン4抗原のレベルを、基準レベル、例えば、正常組織試料中のレベルと比較するステップであって、ネクチン4抗原のアッセイレベルの、ネクチン4抗原の基準レベルと比較した上昇が、ネクチン4媒介性疾患を示す上記ステップとを含む上記方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、(c)有効量の、本明細書で提供される抗体を、ネクチン4媒介性疾患を有すると同定された対象へと投与するステップをさらに含む。ネクチン4媒介性疾患についての、より明確な診断は、医療従事者が、早期に、防止的措置又は侵襲的処置を用い、これにより、ネクチン4媒介性疾患の発生、又はさらなる進行を防止することを可能とする。
本明細書で提供される抗体を使用して、本明細書で記載されるか、又は当業者に公知の、古典的な免疫組織化学方法を使用して、生物学的試料中のネクチン4抗原レベルについてアッセイすることができる(例えば、Jalkanenら、1985、J.Cell.Biol.、101:976~985;及びJalkanenら、1987、J.Cell Biol.、105:3087~3096を参照されたい)。タンパク質の遺伝子発現を検出するのに有用な、他の抗体ベースの方法は、ELISA及びラジオイムノアッセイ(RIA)などのイムノアッセイを含む。当技術分野では、適切な抗体アッセイ標識が公知であり、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識;ヨウ素(125I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(121In)、及びテクネシウム(99Tc)などの放射性同位元素;ルミノールなどの発光標識;並びにフルオレセイン及びローダミンなどの蛍光標識、並びにビオチンを含む。
本明細書で提供される一態様は、ヒトにおけるネクチン4媒介性疾患の検出及び診断である。一実施形態では、診断は、a)対象へと、有効量の標識化されたネクチン4抗原に免疫特異的に結合する抗体を投与する(例えば、非経口、皮下、又は腹腔内)ステップと;b)標識化された抗体が、対象の部位において濃縮され、そこで、ネクチン4抗原が発現すること(そして、結合しなかった標識化分子が、バックグラウンドレベルまでクリアランスされること)を可能とするために、投与後の時間間隔を待機するステップと;c)バックグラウンドレベルを決定するステップと;d)標識化された抗体の、バックグラウンドレベルを上回る検出が、対象は、ネクチン4媒介性疾患を有することを指し示すように、対象において、標識化された抗体を検出するステップとを含む。バックグラウンドレベルは、検出された標識化分子の量を、特定のシステムについて、既に決定された、標準的な値と比較するステップを含む、多様な方法により決定することができる。
当技術分野では、対象のサイズ及び使用されるイメージングシステムが、診断用画像を作製するのに必要とされるイメージング部分の数量を決定することが理解されるであろう。放射性同位元素部分の場合、ヒト対象のために、注入される放射性物質の数量は、通常、99Tc約5~20ミリキュリーの範囲であろう。次いで、標識化された抗体は、特異的タンパク質を含有する細胞の位置に蓄積されるであろう。in vivoにおける腫瘍イメージングについては、S.W.Burchielら、「放射性標識化された抗体及びそれらの断片についての免疫薬物動態(Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments)」(13章「腫瘍イメージング:がんの放射化学的検出(Tumor Imaging:Radiochemical Detection of Cancer)」、S.W.Burchiel及びB.A.Rhodes編、Masson Publishing Inc.(1982)において記載されている。
使用される標識の種類及び投与方式、標識化された抗体が、対象の部位において濃縮され、結合しなかった標識化分子が、バックグラウンドレベルまでクリアランスされることを可能とするための、投与後の時間間隔を含む、いくつかの変数は、6~48時間、又は6~24時間、又は6~12時間である。別の実施形態では、投与後の時間間隔は、5~20日間又は5~10日間である。
一実施形態では、ネクチン4媒介性疾患のモニタリングは、例えば、初回診断の1カ月後、初回診断の6カ月後、初回診断の1年後など、ネクチン4媒介性疾患を診断するための方法を反復することにより実行する。
標識化された分子の存在は、対象において、in vivo走査のための、当技術分野で公知の方法を使用して検出することができる。これらの方法は、使用される標識の種類に依存する。当業者は、特定の標識を検出するのに適切な方法を決定することが可能であろう。本明細書で提供される診断方法において使用されうる方法及びデバイスは、コンピューター断層撮影(CT)、全身走査など、ポジトロン放出断層撮影(PET)、磁気共鳴イメージング(MRI)、及び超音波法を含むがこれらに限定されない。
具体的な実施形態では、分子を、放射性同位元素で標識化し、患者において、放射線応答性手術器具を使用して検出する(Thurstonら、米国特許第5,441,050号)。別の実施形態では、分子を、蛍光化合物で標識化し、患者において、蛍光応答性走査器具を使用して検出する。別の実施形態では、分子を、ポジトロン放出金属で標識化し、患者において、ポジトロン放出断層撮影を使用して検出する。さらに別の実施形態では、分子を、常磁性標識で標識化し、患者において、磁気共鳴イメージング(MRI)を使用して検出する。
30.キット
本明細書ではまた、本明細書で提供される抗体(例えば、抗ネクチン4抗体)、又はその組成物(例えば、医薬組成物)を含むキットであって、適切なパッケージング材料へとパッケージングされた、上記キットも提供される。キットは、任意選択で、構成要素についての記載、又はその中の構成要素の、in vitro、in vivo、若しくはex vivoにおける使用のための指示書を含む、表示又は添付文書を含む。
「パッケージング材料」という用語は、キットの構成要素を格納する物理的構造を指す。パッケージング材料は、構成要素を、無菌的に維持し、一般に、このような目的で使用される材料(例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル、バイアル、チューブなど)から作ることができる。
本明細書で提供されるキットは、表示又は添付文書を含みうる。表示又は添付文書は、「印刷物」、例えば、別個の紙又はボール紙、或いは構成要素、キット、若しくは梱包材料(例えば、箱)へと固定されるか、又は、例えば、キットの構成要素を含有するアンプル、チューブ、若しくはバイアルへと貼り付けた、紙又はボール紙を含む。表示又は添付文書は、加えて、ディスク(例えば、ハードディスク、カード、又はメモリーディスク)、CD-ROM若しくはDVD-ROM/RAM、DVD、MP3などの光学ディスク、磁気テープ、又はRAM及びROMなどの電子的記憶メディアなどのコンピューター読取り型メディア、或いは磁気/光学記憶メディア、FLASHメディア、又はメモリー型カードなど、これらのハイブリッド体を含みうる。表示又は添付文書は、製造元情報、ロット番号、製造元の所在地、及び日付を同定する情報を含みうる。
本明細書で提供されるキットは、加えて、他の成分を含みうる。キットの各構成要素は、個別の容器内に封入することができ、多様な容器の全ては、単一のパッケージに入れることができる。キットはまた、低温保存のためにデザインすることもできる。キットは、本明細書で提供される抗体、又は本明細書で提供される抗体をコードする核酸を含有する細胞を含有するように、さらにデザインすることもできる。キット内の細胞は、使用する準備ができるまで、適切な保存条件下で維持することができる。さらなる構成要素は、例を目的とすると、陽性基準試料又は陰性基準試料(例えば、ネクチン4媒介性疾患を有することが公知の患者に由来する組織試料、ネクチン4媒介性疾患を有さない患者に由来する組織試料、疾患発病の前における同じ患者に有来する組織試料、ネクチン4媒介性疾患を伴う対象に由来する組織試料中の正常細胞、又は同じ患者に由来する正常臓器に由来する正常組織試料)、緩衝液、洗浄液、抗体検出試薬、及び/又はシグナル増幅試薬を含みうる。
本明細書ではまた、ネクチン4抗原に免疫特異的に結合する抗体のパネルも提供される。本明細書の具体的な実施形態では、ネクチン4抗原に対する、異なる会合速度定数、異なる解離速度定数、異なるアフィニティー、及び/又はネクチン4抗原に対する、異なる特異性を有する抗体のパネルが提供される。本明細書のある特定の実施形態では、約10、好ましくは、約25、約50、約75、約100、約125、約150、約175、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約550、約600、約650、約700、約750、約800、約850、約900、約950、又は約1000、又はこれを超える抗体のパネルが提供される。抗体のパネルは、例えば、ELISAなどのアッセイなどのための、96ウェルプレート又は384ウェルプレートにおいて使用することができる。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で記載される方法及び材料と、同様又は同等な方法及び材料を、本発明の実施又は試験において使用しうるが、本明細書では、適切な方法及び材料について記載する。
本明細書で引用される、全ての出願、公開、特許、及び他の参考文献、GenBankの引例及びATCCの引例は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。齟齬を生じる場合は、定義を含む本明細書に従う。
文脈により、そうでないことが明示的に指し示されない限りにおいて、本明細書で使用される、単数形の「ある(a)」、「ある(an)」、及び「その(the)」は、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「あるペプチド配列」への言及は、複数の、このような配列などを含む。
本明細書で使用される数値は、本文献の全体にわたる範囲フォーマットで提供されることが多い。範囲フォーマットの使用は、簡便さ及び簡略さだけのために使用されるものであり、文脈により、そうでないことが明確に指し示されない限りにおいて、本発明の範囲に対する、厳格な限定とみなすべきではない。したがって、文脈により、そうでないことが明確に指し示されない限りにおいて、範囲の使用は、全ての可能な部分範囲、この範囲内の、全ての個別の数値、及びこのような範囲内の整数を含む、全ての数値又は数値範囲、並びに範囲内の値の分数又は整数を明示的に含む。この構築は、本特許文献の全体にわたり、範囲の幅に関わらず、且つ、全ての文脈において適用される。したがって、例えば、90~100%の範囲への言及は、91~99%、92~98%、93~95%、91~98%、91~97%、91~96%、91~95%、91~94%、91~93%などを含む。90~100%の範囲への言及はまた、91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%などのほか、91.1%、91.2%、91.3%、91.4%、91.5%など、92.1%、92.2%、92.3%、92.4%、92.5%なども含む。
加えて、1~3、3~5、5~10、10~20、20~30、30~40、40~50、50~60、60~70、70~80、80~90、90~100、100~110、110~120、120~130、130~140、140~150、150~160、160~170、170~180、180~190、190~200、200~225、225~250の範囲への言及は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20などを含む。さらなる例では、25~250、250~500、500~1,000、1,000~2,500、2,500~5,000、5,000~25,000、25,000~50,000の範囲への言及は、このような値、例えば、25、26、27、28、29・・・250、251、252、253、254・・・500、501、502、503、504・・・などの中にあるか、又はこれらを包含する、任意の数値又は範囲を含む。
これもまた本明細書で使用される通り、一連の範囲については、本文献の全体にわたり開示する。一連の範囲の使用は、別の範囲をもたらすための、上方範囲と下方範囲との組合せを含む。この構築は、本特許文献の全体にわたり、範囲の幅に関わらず、且つ、全ての文脈において適用される。したがって、例えば、5~10、10~20、20~30、30~40、40~50、50~75、75~100、100~150など、一連の範囲への言及は、5~20、5~30、5~40、5~50、5~75、5~100、5~150、及び10~30、10~40、10~50、10~75、10~100、10~150、及び20~40、20~50、20~75、20~100、20~150などの範囲を含む。
本明細書では、簡略のために、ある特定の略号を使用する。一例は、アミノ酸残基を表す、一文字式の略号である。アミノ酸並びにそれらの対応する、三文字式及び一文字式の略号は、以下の通りである。
本発明は、本明細書において、多数の実施形態について記載する、確言的表現を使用して、一般に開示される。本発明は、物質若しくは材料、方法ステップ及び条件、プロトコール、手順、アッセイ、又は解析など、特定の対象物を、完全に、又は部分的に除外した実施形態もまた、具体的に含む。したがって、本明細書では、本発明は、一般に、本発明が含まないものとの関係では表現されないが、それにもかかわらず、本明細書では、本発明に明示的に含まれない態様も開示される。
本発明のいくつかの実施形態について記載してきた。しかしながら、本発明の精神及び範囲から逸脱しない限りにおいて、多様な改変を施しうることが理解されるであろう。したがって、以下の例は、意図された特許請求の範囲において記載される、本発明を例示することを意図するものであり、この範囲を限定することを意図するものではない。
本節における例は、例示を目的として与えられるものであり、限定を目的として与えられるものではない。
(例1)
抗原の調製
ヒトネクチン4の断片、例えば、ヒトネクチン4(配列番号1)のアミノ酸配列31~346(配列番号2)を含む断片を作出し、その後の免疫化キャンペーンのための抗原として使用した。
市販のpET発現ベクターを使用して、6×HNでタグ付けされたネクチン4(アミノ酸31~346)を作製した。発現は、製造元の指示書に従い、BL21(DE3)大腸菌内で実行し、IMACベースの精製(固定化金属アフィニティークロマトグラフィー)を使用して精製した。精製されたネクチン4(アミノ酸31~346)を、免疫原として使用した。
製造元の指示書に従い、修飾pTag5/mychis発現ベクターを使用して、抗体スクリーニングのための組換えネクチン4(アミノ酸1~348)を、293FT細胞内で作製した。標準的なIMACベースの精製を使用して、タンパク質を精製した。
(例2)
抗体の作出
A.抗体の作出及び作製
モノクローナル抗体であるM22-321b41.1を、元は、Kohler及びMilstein、Eur.J.Immunol.、6、511(1976)において記載された、標準的なハイブリドーマ技法を使用して、Balb/Cマウスを、細菌により産生された、ヒトネクチン4タンパク質の細胞外ドメインの組換え断片(31~346;配列番号2)で免疫化することにより作出した。ハイブリドーマであるM22-321b41を、ELISAにより示される通り、ヒトネクチン4タンパク質の組換え細胞外ドメインに特異的に結合する、マウスIgG2aカッパ抗体を産生する、M22-321b41.1としてサブクローニングした。加えて、プロテインAで精製された抗体であるM22-321b41.1は、IHCにより、ネクチン4を発現する被験組織を、特異的に染色することが示された。
その後、M22-321b41.1ハイブリドーマ細胞を、増殖させ、拡大し、長期にわたる保存のために、液体窒素中で、生存可能な形で凍結させた。
B.ハイブリドーマによるシーケンシング
RT-PCRを使用して、M22-321b41.1ハイブリドーマ抗体の重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子をシーケンシングした。
(例3)
抗体のスクリーニング及び選択
A.スクリーニングアッセイ(又は結合アッセイ)
一次ELISAスクリーンを、上記で記載した通りに作製された、ネクチン4細胞外ドメインの断片(アミノ酸残基31~346)により実施した。
二次ELISAスクリーンを、大腸菌内で作製された、ネクチン4細胞外ドメインの断片(アミノ酸残基31~346)、293FT細胞内で作製された、ネクチン4細胞外ドメインの断片(アミノ酸残基1~346)、ネクチン4-タグ5、及び2つの対照タンパク質(pETにより作製された対照タンパク質、及びタグ5により作製された対照タンパク質)により実施した。
B.抗体の選択
まず、それらが、組換え3T3-ネクチン4細胞において染色を示し、対照における染色を欠いた場合に、抗体を選択した。その後、まず、選択された抗体を、qPCRスコアにより決定される通り、ネクチン4 mRNAの発現が既知である、陽性対照組織及び陰性対照組織のパネルにおいて調べた。抗体を、多様な濃度で、多様な抗原賦活化プロトコールにより調べた。それらが、ネクチン4 mRNA陽性組織内の特異的染色をもたらし、ネクチン4 mRNA陰性組織内の染色を欠き、染色強度、染色細胞の比、及び非特異的バックグラウンド染色に関して調べられた、対照抗ネクチン4抗体より良好であった場合に、抗体を選択した。
(例4)
ネクチン4に特異的な抗体についてのスクリーニング
上記で記載した通りに作出された抗体をスクリーニングして、ネクチン4について特異的な抗体を選択した。スクリーニングは、例えば、IHCアッセイを使用して実施した。略述すると、多様な由来、例えば、膀胱、乳腺、卵巣、膵臓、腎臓、皮膚、肺、及び結腸からのヒト異種移植がん組織を、まず、qPCRにおいて調べて、これらの組織内の、ネクチン4の発現のレベルを決定した。
リアルタイム定量的PCR(qPCR)解析を用いて、ネクチン4 mRNAの相対発現レベルを決定した。qPCRアッセイは、Bio-Rad CFX384 Real-Time PCR検出システムを、SsoFast EvaGreen Supermix(Bio-Rad)、及び5ngの、cDNA鋳型のRNA同等物と共に使用して実施した。以下の式:10,000×2-(Cqネクチン4-CqGAPDH)による、改変デルタCq方法を使用して、ネクチン4 mRNA発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子である、GAPDHの発現レベルと対比して計算し、ネクチン4の相対発現は、GAPDH単位と対比して記載した。
ネクチン4のqPCR解析において用いられるプライマーは、191P4D12.1フォワードプライマー:5’-GGCTGGAGTTCAATGAGGTTTATTT-3’(配列番号41)と;191P4D12.2リバースプライマー:5’-TCCAGCAGATTTCAGACTAAGAAGA-3’(配列番号42)とを含む。GAPDHのqPCR解析において用いられるプライマーは、GAPDH.1フォワードプライマー:5’-AGAACATCATCCCTGCCTCTACTG-3’(配列番号43)と;GAPDH.2リバースプライマー:5’-AAATGAGCTTGACAAAGTGGTCGT-3’(配列番号44)とを含む。
qPCRのためのcDNA鋳型は、TRIzol RNA抽出法を使用して、組織試料又は細胞系試料から単離されたRNAから、Bio-Rad iScript Advanced cDNA合成キットを使用して合成するのに続き、Qiagen RNeasyクリーンアップキットを使用して、RNAクリーンアップと、DNaseI消化とを行った。
例示的なヒト異種移植組織を、表5に示した。次いで、上記で作出した抗ネクチン4抗体を、IHCアッセイにおいて使用して、ネクチン4の発現レベルが既知である組織を染色した。IHCアッセイは、下記の例5で詳細に記載するのと同様に実施した。多様な組織内のネクチン4についてのIHC染色は、これらの組織内のネクチン4 mRNAレベルと相関した。それが、ネクチン4 mRNAレベルと相関する、IHC染色シグナル、例えば、高レベルのネクチン4 mRNAと相関する、強い組織内の染色、中レベルのネクチン4 mRNAと相関する、中程度の、組織内のIHC染色シグナル、低ネクチン4 mRNAと相関する、組織内の、低IHC染色シグナルをもたらし、ネクチン4 mRNAを発現しない組織内のIHC染色シグナルをもたらさなかった場合に、抗体を、ネクチン4特異的抗体として選択した。合計で、少なくとも283の抗体クローンをスクリーニングし、ネクチン4特異的抗体である、M22-321b41.1及びM22-244b3.1.1.1の同定をもたらした。
(例5)
機能的アッセイ:異種移植組織についての免疫組織化学染色
例えば、本明細書で記載される通りに、作出し、スクリーニングし、発現させ、精製した抗体を、IHCアッセイにおいて、ネクチン4を発現するヒト異種移植組織を特異的に染色する、それらの能力についてさらに査定した。
例えば、2つの抗ネクチン4マウスモノクローナル抗体である、M22-244b3.1.1.1及びM22-321b41.1(それぞれ、IgG1アイソタイプ及びIgG2aアイソタイプ)を、IHCアッセイにおいて調べた。M22-244b3.1.1.1及びM22-321b41.1抗体を、リン酸緩衝生理食塩液、pH7.4中に、1.54mg/mL及び1.3mg/mLで用意した。陰性対照として、マウス骨髄腫に由来する、市販のマウスIgG2aアイソタイプ対照(クローン:UPC10、Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)であって、β-2,6-フルクトサンに対して惹起され、ヒトネクチン4又は他の哺乳動物抗原に結合しない、上記アイソタイプ対照を使用した。
IHC染色は、以下の例示的プロトコールに従い実施した。略述すると、IHCアッセイにおいて、間接的IHC技法を使用して、ネクチン4を検出した。試料を、10%の緩衝中性ホルマリン中で固定し、加工し、パラフィン蝋へと包埋し、4μmの組織切片として調製した。脱パラフィン化及び再水和の後、切片を、抗原賦活化のために処理した。ネクチン4内の抗原エピトープは、例えば、一般に、熱誘導型エピトープ賦活化(HIER)手順と称する、水性培地中の組織切片への熱の適用により賦活化させた。例えば、ネクチン4内の抗原エピトープは、Leica製の自動式プラットフォーム上、100℃で、20分間にわたり、Epitope Retrieval 2(ER2;pH8.9~9.1のEDTAベースの緩衝液)を適用することにより賦活化させた。次いで、抗原賦活化の後における組織切片を、マウス一次抗体である、M22-321b41.1、M22-244b3.1.1.1、又はIgG2a(抗体対照)と共にインキュベートした。一次抗体と結合した組織切片を、洗浄し、酵素標識化二次抗体、例えば、ペルオキシダーゼ標識化二次抗体により検出した。例えば、反応部位において、褐色の沈殿物をもたらす、ペルオキシダーゼと、色原体である、3,3’-ジアミノベンジジン(DAB)との反応を使用しうる、Leica Bond Refineポリマー検出システムを使用して、結合した二次抗体を発色させた。次いで、例えば、Aperio ScanScope CS(Aperio、Vista、CA)を使用して、染色された組織切片を、走査し、イメージングし、光学顕微鏡により査定した。
組織切片内の、ネクチン4の発現レベルを、抗体染色のレベルにより評価するために、染色された組織切片を、IHC染色の強度及びがん細胞の陽性度の比に従い、評価し、査定し、異なるカテゴリー又はスコアへとカテゴリー化し、記録した。カテゴリーは、強い(「3」又は「3+」と互換的である)、中程度(「2」又は「2+」と互換的である)、及び弱い(「1」又は「1+」と互換的である)を含む。特異的染色の欠如は、陰性(「0」又は「-」と互換的である)として記録した。
ネクチン4 mRNAの発現レベルが既知である、多様な由来、例えば、膀胱、乳腺、卵巣、膵臓、腎臓、皮膚、肺、及び結腸からのヒト異種移植がん組織について調べた。qPCRを使用して、これらの例示的なヒト異種移植組織内のネクチン4 mRNAのレベルを、まず、評価し、表5に示す。
抗体に適正な染色濃度を見出すために、表5に列挙された、例示的な異種移植組織を、上記で記載した通りに、IHC染色アッセイにおいて使用して、抗体であるM22-321b41.1及びM22-244b3.1.1.1を、まず、2.5μg/mL、5.0μg/mL、及び7.5μg/mLにおいて滴定した。結果を、表6に示した。
抗ネクチン4抗体のIHC染色に最適の濃度は、抗ネクチン4抗体IHC染色が、ネクチン4 mRNAを発現する組織内では観察されたが、ネクチン4陰性組織内では観察されなかった濃度で決定した。2.5μg/mLでは、M22-321b41.1抗体及びM22-244b3.1.1.1抗体のいずれも、ネクチン4 mRNAについて陽性のヒト異種移植組織内の陽性染色を示し(図1及び図2)、陰性対照組織内の、最小のバックグラウンド染色を示した。表6と、表7における詳細な染色結果とは、2.5μg/mLの濃度が、両方の抗体について、例示的な最適濃度であったことを指し示す。
2.5μg/mLのM22-321b41.1抗体が、ネクチン4 mRNA陰性組織である、AG-K24内及びMDAMB-231-MFP-XCL内の染色をもたらさなかった(図3及び図5)のに対し;M22-244b3.1.1.1は、ネクチン4 mRNA陰性異種移植がん細胞である、AG-K24内(図4)及びMDAMB-231-MFP-XCL内(図6)の、非特異的染色を示した。マウスIgG2a陰性対照抗体と共にインキュベートされた切片内では、染色が見られなかった(図7)。したがって、M22-321b41.1は、ネクチン4 mRNAを発現する組織を、特異的に染色し、ネクチン4 mRNAを発現しない組織については、染色をもたらさないか、又はアイソタイプのIgG対照と同程度に低度の染色をもたらした。
M22-321b41.1の特異性を、表8に示される、陽性対照組織及び陰性対照組織の拡大パネルにおいて、さらに調べた。結果は、2.5μg/mLにおける抗体が、ネクチン4 mRNAを発現する組織及び細胞であって、AG-B1、AG-UT5、AG-L16(図8)、AG-Br29、AG-B11(図9)、AG-OV35、AG-Panc3、AG-C16、AG-C6、Rat1(E)-ネクチン4、及びT47Dを含む組織及び細胞に特異的であることを示した。結果はまた、抗体が、ネクチン4 mRNAを発現しない組織及び細胞であって、AG-K24(図3)、AG-Mel10、MDA-MB-231-MFPXCL(図5)、AG-Mel5、AG-K31、CALU-1、MDA-MB-231、UG-K3、Rat1(E)-neo、Rat1(E)-ネクチン1、Rat1(E)-ネクチン2、Rat1(E)-ネクチン3、JMSU-1、Hep3B、及びACHNを含む組織及び細胞について陰性であることも示した。これらの知見は、本例における全ての被験組織及び被験細胞について、M22-321b41.1は、ネクチン4 mRNAを発現する組織及び細胞を陽性染色し、ネクチン4 mRNAを発現しない組織及び細胞を陰性染色した(表8及び表9)ため、M22-321b41.1が、IHCアッセイにおいて、ネクチン4に特異的であることを裏付けた。
上記で記載した通りに作出され、スクリーニングされた抗ネクチン4抗体を、IHCアッセイにおいて、他の市販の抗ネクチン4抗体とさらに比較した。例えば、ウサギポリクローナル抗ネクチン4抗体である、Novus Biologicals(型番:NBP1-82829)製のネクチン4/PVRL4抗体(「Novus製PVRL4抗体」と称する)を得、ネクチン4 mRNAレベルが、qPCRにより決定されている、多様な異種移植組織内のIHCアッセイにおいて、ネクチン4を特異的に染色する、その能力について調べた。Novus製PVRL4抗体を、2μg/ml、1.5μg/ml、1μg/ml、及び0.5μg/mlにおいて滴定した実験において、Novus製PVRL4抗体は、M22-244b3.1.1.1.1抗体によりもたらされる特異的ネクチン4染色より弱い、特異的ネクチン4染色をもたらし、表10に示される通り、ネクチン4 mRNAを発現しないMDA-MB-231 xeno内に、全ての濃度で、非特異的染色をもたらした。したがって、Novus製PVRL4抗体は、ネクチン4について非特異的であった。
Novus製PVRL4抗体を、ネクチン4 mRNAレベルが、qPCRにより決定されている、広範な組織パネルに対するIHCアッセイにおいてさらに調べた。表11に示される通り、ネクチン4 mRNAレベルに関わらず、被験異種移植片の大部分において、バックグラウンドの細胞質染色を観察した。
Novus製PVRL4抗体は、ロット間の潜在的なばらつきを伴う、枯渇性のウサギポリクローナル抗体であるので、ThermoFischer Scientific製の、異なるウサギポリクローナル抗ネクチン4抗体である、PA5-30837(「Thermo PVRL4抗体」とする)、を得、ネクチン4 mRNAレベルが、qPCRにより決定されている、3つの異なる異種移植組織内のIHCアッセイにおいて、調べ、比較した。3つの被験異種移植組織は、ネクチン4 mRNAレベルを478とするAG-B1(+)PS26、ネクチン4 mRNAレベルを78とするAG-OV35P3、及びネクチン4 mRNAを発現しないAG-Mel5 P17を含んだ。Thermo PVRL4抗体は、AG-B1内の、弱い/中程度のIHC染色と、AG-OV35内の、陰性IHC染色とをもたらした。
したがって、Novus製PVRL4抗体も、Thermo PVRL4抗体も、本明細書で作出され、スクリーニングされるM22-244b3.1.1.1.1又はM22-321b41.1抗体ほど、IHCアッセイにおいて、ネクチン4に対して特異的ではなかった。
いずれもR&D Systems製である、他の2つの市販抗体(マウス抗ネクチン4モノクローナル抗体であるMAB2659、及びヤギポリクローナル抗ネクチン4抗体であるAF2659)もまた、得、ネクチン4 mRNAレベルが、qPCRにより決定されている、3つの異なる異種移植組織内のIHCアッセイにおいて調べた。3つの被験異種移植組織は、ネクチン4 mRNAレベルを478とするAG-B1(+)PS26、ネクチン4 mRNAレベルを78とするAG-OV35P3、及びネクチン4 mRNAを伴わないAG-Mel5 P17を含んだ。1μg/ml又は5μg/mlで使用された場合のMAB2659抗体は、AG-B1内及びAG-OV35内の腫瘍の周縁部において、くすんだ斑点状/細胞質様の染色をもたらした。ヤギポリクローナル抗ネクチン4抗体であるAF2659は、5μg/mlでは、AG-B1内及びAG-OV35内で、バックグラウンドの間質染色を伴う、強い膜性染色をもたらしたが、1μg/mlでは、弱い染色をもたらした。したがって、AF2659抗体を、他の組織内、2.5μg/mlでも、さらに査定した。しかし、AF2659抗体は、ネクチン4 mRNAを発現しないMDA-MB-231異種移植片内でも、バックグラウンド染色をもたらした。したがって、MAB2659抗体も、AF2659抗体も、本明細書で作出され、スクリーニングされるM22-321b41.1抗体ほど、特異的ではなかった。
(例6)
機能的アッセイ:一次組織の免疫組織化学染色
例えば、本明細書の例において記載される通りに、作出され、スクリーニングされ、発現させ、精製された抗体、例えば、抗ネクチン4 M22-321b41.1を、IHCアッセイにおいて、ネクチン4を発現する一次ヒト組織を特異的に染色するそれらの能力について、さらに査定した。
IHCアッセイは、例えば、間接的IHC技法を使用して実施した。間接的IHC方法は、組織抗原を検出するために、2つの抗体を利用した。まず、非コンジュゲート一次抗体を、組織(第1層)へと適用し、組織抗原と反応させた。次に、一次抗体が惹起された動物種のIgGを指向する、酵素標識化二次抗体を適用した(第2層)。二次抗体を、一次抗体と反応させるのに続き、色原体である基質を適用した。第2層抗体を、酵素ペルオキシダーゼで標識化し、これを、色原体である3,3’-ジアミノベンジジン(DAB)と反応させて、反応部位において、褐色の沈殿物をもたらした。この方法は、一次抗体上の、異なる抗原性部位との、いくつかの二次抗体反応を介する、潜在的なシグナル増幅に起因して、高感度且つ多目的な方法である。
試験の感度をさらに増大させるための例として述べると、標識化鎖ポリマーコンジュゲート二次抗体を使用した。ポリマー技術は、最大で10分子の二次抗体を接合させた、デキストランのHRP酵素標識化不活性「スパイン」分子を利用し、システムを、なおより高感度とした。
次いで、検体を対比染色して、細胞要素及び細胞内要素を同定した。
6.A.染色手順
IHCアッセイは、以下の例示的プロトコールに従い実施した。略述すると、組織試料を、固定し、加工し、パラフィン蝋へと包埋し、組織切片として調製した。次いで、スライドを、オーブン内、60±5℃で、1~2時間にわたりインキュベートし、オーブンから取り出し、先に進む前に、室温(RT)へと冷却した。組織試料に対する、規定の脱パラフィン化及び再水和の後、抗原賦活化を実施して、ホルマリン固定後に生じたタンパク質架橋を元に戻した。抗原賦活化は、プロテアーゼ溶液中の、組織のタンパク質分解性消化を介して、又は一般に、HIER手順と称する、水性培地への組織切片への熱適用を介して達成した。このアッセイのために、Leica製の自動式プラットフォーム上、100℃で、20分間にわたり、Epitope Retrieval 2(ER2;pH8.9~9.1のEDTAベースの緩衝液)を使用した。
そうでないことが指定されない限り、Leica Bond Autostainerを、RTで使用して、Bond製の計器上でなされるように、染色をプログラムした。略述すると、以下のステップ:(1)Epitope Retrieval 2手順(ER2):100℃で、20分間にわたる(Bond Epitope Retrieval Solution 2(Leica)、型番:AR9640);(2)3回にわたるBond Wash:0分間(Bond Wash Solution(Leica)、型番:AR9590);(3)マーカー:15分間(Bond Primary Antibody Diluent(Leica)、型番:AR9352中の、マウスモノクローナル抗ネクチン4抗体であるM22-321b41.1又は陰性対照マウスIgG2a(BD Biosciences)型番:550339による染色);(4)3回にわたるBond Wash:0分間(Bond Wash Solution(Leica)、型番:AR9590);(5)一次後:8分間(ウサギ抗マウスIgG2a);(6)3回にわたるBond Wash:2分間(Bond Wash Solution(Leica)、型番:AR9590);(7)ポリマー:8分間(Bond Polymer Refine Detection(Leica)、型番:DS9800からの、抗ウサギポリHRP-IgG);(8)2回にわたるBond Wash:0分間、2分間;(9)1回にわたる脱塩水:0分間;(10)Peroxide Block:5分間(3~4%の過酸化水素)及び3回にわたるBond Wash:0分間;(11)2回にわたる脱塩水:0分間;(12)Mixed DAB refine:0分間(Bond Polymer Refine Detection(Leica)、型番:DS9800からの、66mMの3,3-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド及び≦0.1%の過酸化水素);(13)Mixed DAB refine:10分間(Bond Polymer Refine Detection(Leica)、型番:DS9800からの、66mMの3,3-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド及び≦0.1%の過酸化水素);(14)3回にわたる脱塩水:0分間;(15)ヘマトキシリン:15分間(Bond Polymer Refine Detection(Leica)、型番:DS9800からの、<0.1%のヘマトキシリン);(16)1回にわたる脱塩水:0分間;(17)1回にわたるBond Wash:0分間;(18)1回にわたる脱塩水:0分間を、染色プロトコールとして、Leica Bond autostainerへとプログラムした。手順において指し示した通り、陰性試薬対照である、BD Biosciences製のマウスIgG2aを、各検体試験のために使用して、非特異的(バックグラウンド)染色の存在について査定した。バックグラウンド染色の存在はまた、特定のアッセイ試行の許容/棄却のための基準でもあった。
6.B 組織試料
陽性対照検体及び陰性対照検体を利用して、IHC解析の全てのステップをバリデートし、制御した。このアッセイのために、可変レベルのネクチン4の発現を伴う、マウスへのヒト腫瘍異種移植片を、対照として使用した。
ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト組織検体を、施設内治験審査委員会に承認された供給源、例えば、政府のリポジトリー(例えば、Cooperative Human Tissue Network)、学術提携(例えば、UCLA、UC Irvine)、並びに例えば、ヒト正常尿路上皮組織マイクロアレイ(TMA)及び移行上皮癌(BL802)及び正常(FDA999)組織マイクロアレイ(TMA)、Biomax USAを含む市販の供給源からの、手術に由来する残余材料又は剖検として得た。例6.Aに記載したプロトコールを使用して、組織試料を、ネクチン4の発現について調べた。ネクチン4の発現についての、陰性(X14-126)1例の、弱い陽性(X14-33)1例、中程度の陽性(X14-139)1例、及び強い陽性(X14-43)1例を含む、4例のマウスヒト腫瘍異種移植片についてもまた調べた。
6.C 抗ネクチン4抗体の染色濃度の滴定
最適の一次抗体力価は、例えば、例4及び5で記載したプロトコールを使用して、異種移植組織切片に対して、滴定解析を実施することにより決定した。パラフィン包埋検体についての滴定解析は、IHCアッセイに最適の抗体濃度を決定する取組みの中で実施した。滴定解析を実施するために、例5で決定した最適の濃度(2.5μg/ml)を含む、2倍の系列希釈液を調製し、マッチさせた、それらの陰性対照組織切片について調べた。
例4及び5において言明した、パラフィン包埋検体に適切なIHCプロトコールに従い、抗ネクチン4抗体であるM22-321b41.1と、その対応する陰性対照抗体とを、組織切片へと適用した。結果は、病理研究医が、光学顕微鏡を使用して、査定及び比較した。病理研究医は、最適の力価(最適の抗体濃度)を、著明なバックグラウンド染色を伴わずに、最高の染色強度をもたらした、最低の力価(最低の抗体濃度)として決定した。この例では、表12により示される通り、2.5μg/mlの抗体濃度を選択し、その後のIHCアッセイにおいて使用した。
6.D.ネクチン4のIHC染色についての評価
IHC染色についての評価は、委員会により認定された病理医が実施した。染色強度を評価し、0(陰性)、1+(弱い)、2+(中程度の)、及び3+(強い)として報告した。各強度レベル又は陽性染色された細胞全体における細胞染色の近似的百分率を評価し、0~100%において報告した。
組織間で染色を比較するために、ネクチン4染色評価の多様なパラメーターを、直接比較するか、又はネクチン4染色の結果を、さらに加工した、例えば、染色強度、及び具体的な強度範囲で染色された細胞の百分率の両方について検討する、Hスコアとして計算した。例えば、Hスコアは、所与の染色強度(0~100)で染色された細胞の百分率と、染色強度(0~3)との積を足し合わせることにより計算した。例えば、10%の細胞染色3+、30%の細胞染色2+、20%の細胞染色1+、及び40%の細胞非染色を伴う検体であれば、(3×10)+(2×30)+(1×20)+(0×40)=110のHスコアを有するであろう。
変動係数(CV)を使用して、Hスコアの試行内変動又は精度を評価した。アッセイの性能についての試行内精度は、3例の陽性異種移植片検体を利用する、5回の個別の試行から決定した。定性的に、試行内精度は、一般に、3回の個別の試行における、各組織試験の、一貫した染色パターンにより、許容可能と考えた。CVは、以下:
CV=標準偏差/平均値×100
の通りに計算した。
例えば、35%未満であるか、又はこれと等しいCVを、許容可能と考えた。
試行内精度評価についての表13に示される通り、染色強度のパターン(3+、2+、1+の組合せ)は、各組織について、5連にわたり一貫した。さらに、全組織についてのCVは、例示的な許容範囲内である、35%未満であった。したがって、M22-321b41.1は、ネクチン4IHCアッセイにおける、ネクチン4の検出についての精度をもたらした。
アッセイの性能についての試行内再現性は、精度アッセイのための検体と同じ異種移植片検体を利用する、5回の個別の試行から決定した。定性的に、試行内精度は、一般に、5回の個別の試行における、各組織試験の、一貫した染色パターンにより、許容可能と考えた。試行内再現性についての表14に示される通り、染色強度のパターン(3+、2+、1+の組合せ)は、各組織について、3連にわたり一貫した。さらに、全ての組織についてのCVは、例示的な許容範囲内である、35%未満であった。したがって、M22-321b41.1は、ネクチン4IHCアッセイにおける、ネクチン4の検出についての再現性をもたらした。
6.A~6.Dにより提示したパラメーター及び結果を、以下の表15:
にまとめる。
6.E ネクチン4のIHC染色についての感度及び特異度
例えば、それが、ネクチン4抗原を発現した組織を、陽性染色した場合、ネクチン4 IHCアッセイを、高感度と考えた。例えば、多様な組織型にわたり、示差的染色を観察し、ネクチン4 IHC染色が、染色された組織内の、ネクチン4抗原の、既知の発現と相関する場合、ネクチン4 IHCアッセイを、特異的と考えた。特異度及び感度についての評価は、相互に排他的ではなかったので、アッセイは、しばしば、感度及び特異度の両方についての情報をもたらした。
M22-321b41.1によるネクチン4 IHCアッセイの感度及び特異度は、膀胱癌の固有のコア60例及び正常尿路上皮組織20例、マウスへのヒト腫瘍異種移植片4例、並びに膀胱、肺、及び乳腺を含む、多様な癌腫についての、ヒト全組織切片(WTS)13例からなるTMAにより決定した。IHCアッセイにおけるネクチン4染色に関する、M22-321b41.1抗体の感度及び特異性についての概要を、下記の表16及び表17に列挙する。これらの例示的アッセイ及び他の一部の例示的アッセイでは、組織試料を、それらのHスコアの結果により、4つのカテゴリー:高(201~300)、中程度(101~200)、低(1~100)、陰性(0)のうちの1つへと分けた。
M22-321b41.1の特異度及び感度を評価するための、一部の例示的アッセイでは、13例のWTS癌腫についての、それぞれ、2.5μg/mlの、ネクチン4に特異的であることが既知であるX抗体、又は抗ネクチン4抗体であるM22-321b41.1による染色からのHスコアを比較した。下記の表18に示される比較は、M22-321b41.1によるIHC染色が、大部分の検体例において、X抗体の染色により示される、既知のネクチン4発現と符合することを指し示した。
上記の表18からの結果を、陽性ネクチン4染色及び陰性ネクチン4染色へと再分類して、X抗体と、抗ネクチン4抗体であるM22-321b41.1との間の、染色の陽性度の相関を決定した。それが≧150のHスコアを示した場合に、組織を陽性と考えた。下記の表19における全体的知見は、陽性染色された組織についての、X抗体と、抗ネクチン4抗体であるM22-321b41.1との一致の百分率89%、陰性染色された組織についての一致率100%、及び全体の一致率94%を示した。したがって、M22-321b41.1によるネクチン4 IHC染色と、組織内のネクチン4の発現との間には、高度の相関がみられる。したがって、M22-321b41.1によるネクチン4 IHCアッセイは、高感度であり、且つ、特異的である。
膀胱癌の固有のコア60例及び正常尿路上皮組織20例、マウスへのヒト腫瘍異種移植片4例、並びに膀胱、肺、及び乳腺を含む、多様な癌腫についての、ヒト全組織切片(WTS)13例からなるTMAを含む、組織試料の大型のセットを使用して、M22-321b41.1の特異度及び感度を、さらに決定した。合計94例の検体例は、X抗体を用いるIHCアッセイによる検体例のうちの95%(WTS中の82%及びTMA中の98%)における、ネクチン4の全般的検出について査定可能であった。M22-321b41.1による、癌腫の、代表的なIHC染色を、図10及び11に示す。細胞内局在化は、大半が膜及び細胞質における局在化であり、一部の頂端部染色も、膜への局在化であると考えた。M22-321b41.1による、腫瘍検体内の陽性染色の百分率が、X抗体を用いるIHCアッセイによりもたらされる、癌腫内の、既知のネクチン4発現と符合したため、表20における結果は、M22-321b41.1によるネクチン4 IHCアッセイの感度及び特異度をさらに裏付けた。したがって、M22-321b41.1によるネクチン4 IHCアッセイは、高感度であり、且つ、特異的であった。
M22-321b41.1の特異度及び感度を、FDA999dにおいて、三連で含有された、全33例の正常ヒト検体からさらに決定した。表21に示す通り、抗ネクチン4抗体であるM22-321b41.1によるIHC染色は、正常乳腺が、部分的、且つ、弱い~中程度の免疫反応性を示したことを除き、文献(Rabetら、2016)において報告されている、正常細胞内のネクチン4の発現と符合した。赤血球は、ネクチン4について、中程度~強い強度で、染色された。扁平上皮は、強く染色されたが、基底層は、陰性であった。
したがって、M22-321b41.1に基づく、ネクチン4の発現についてのIHCアッセイは、ネクチン4の発現について、高感度及び特異的である。M22-321b41.1を用いるIHCアッセイは、優れた精度及び再現性を示した。
(例7)
機能的アッセイ:免疫ブロット法
mAbである、M22-321b41.1の、機能的な特性及び特異性を、免疫ブロット、例えば、ウェスタンブロット法においてさらに査定した。略述すると、多様なネクチン4 mRNA陽性試料及びネクチン4 mRNA陰性試料から調製されたタンパク質溶解物を、SDS-PAGEにかけ、ニトロセルロース膜へと転写し、M22-321b41.1でプロービングした。抗ヒトGAPDH抗体を、適切且つ同等な量の全細胞溶解物が、SDS-PAGEの各ゲルレーン内で分離されることを確認するためのローディング対照として使用した。図12Aにおいて示す通り、M22-321b1.1は、約58~60kDaの特異的バンドを認識してブロッティングを生じ、これは、ネクチン4を過剰発現するように操作された、ネクチン4-mRNA陽性の、NCI H322M細胞、AG-B1細胞、及びRat1(E)細胞の溶解物中で予測されるヒトネクチン4分子量と符合した。AG-B1異種移植片試料中のほか、NCI H322M細胞系では、小サイズのネクチン4切断産物が観察されたことは、報告されているネクチン4の切断と符合した(Buchananら、2017)。ネクチン4 mRNA陰性である、MDA-MB-231細胞内及びRat1(E)-Neo細胞内では、バンドが検出されなかった。図12BにおけるFACSにより示される通り、操作Rat1(E)細胞は、全てのネクチンファミリーメンバー(ネクチン1~4)を、高度に発現したが、M22-321b41.1はまた、ウェスタンブロット法において、操作Rat1(E)細胞が過剰発現したネクチン1、ネクチン2、及びネクチン3のいずれも検出しなかった。したがって、M22-321b41.1は、免疫ブロットアッセイにおいて、ネクチン4を、特異的に検出した。
(例8)
エピトープマッピング
M22-321b41.1抗体により認識される、ネクチン4上のエピトープを、さらにマッピングするために、多様なネクチン4の断片を、クローニングし、細胞に、これらをトランスフェクトし、細胞内で発現させた。多様なネクチン4断片を発現する細胞を培養し、RIPA緩衝液中で溶解させた。BSA標準物質を使用して、RIPA溶解物の全タンパク質濃度を定量化し、合計20μgの還元(50mMのTCEP)溶解物を、1倍濃度のMESランニング緩衝液中に、4~12%のBTによる15レーンゲル上のSDS-PAGEにかけ、I-Blotにより、ニトロセルロース膜へと転写し、LI-CORブロッキング緩衝液によりブロッキングし、1:1のLI-CORブロッキング緩衝液中に、2μg/mlのM22-321b41.1抗体でプロービングした。希釈率1:10000のα-GAPDH抗体(Chicken pAb、Millipore)を、使用して、ローディング対照としてのGAPDHを検出した。次いで、タンパク質に結合した抗体のバンドを、希釈率1:5000の、IRDye 680(Odyssey)とコンジュゲートさせたヤギ抗マウス抗体、又は1:5000の、IRDye 800(Odyssey)とコンジュゲートさせたロバ抗α-Chickenにより検出し、Odysseyシステムにより視覚化した。M22-321b41.1抗体は、ネクチン4断片V(アミノ酸残基1~150)(図13)を認識した。したがって、M22-321b41.1抗体は、ヒトネクチン4のアミノ酸残基1~150(配列番号45)に位置するエピトープを認識した。さらに、M22-321b41.1抗体を、例1、2、及び3に示した、ヒトネクチン4のアミノ酸残基31~346(配列番号2)のネクチン4断片に対して作出したため、M22-321b41.1抗体は、ヒトネクチン4のアミノ酸残基31~150(配列番号46)(断片1~150と、断片31~346との重複領域)に位置するエピトープも認識しうる。
(例9)
ネクチン4 IHCアッセイの診断的使用及び予後診断的使用
M22-321b41.1抗体によるIHC染色を使用して、ネクチン4の発現を、まず、正常組織試料中で検討した。ばらつきはあるが、大半が弱いか又は中程度の、ネクチン4の発現を、皮膚(表皮、汗腺、及び毛包)、膀胱の移行上皮、唾液腺(管)、食道、乳腺、及び胃において検出した。次いで、ネクチン4の発現を、多様ながんと相関させるため、M22-321b41.1抗体によるIHC染色を使用して、ネクチン4の発現を、多様な腫瘍検体中で検討した。ネクチン4は、膀胱がん内で高度に発現し、乳がん、膵臓がん、肺がん、及び卵巣がんの組織マイクロアレイ(TMA)では、より中程度の発現を示した。同じIHCアッセイを使用する、ネクチン4の発現と、膀胱がんとの相関についての検討は、TMA上の膀胱がんのうちの83%(524例中434例)が、陽性であり、60%が、M22-321b41.1のIHC染色により、強く、又は中程度に染色されることを明らかにした。
次いで、例えば、以下の基準:(1)組織学的に確認された、転移性の悪性充実性腫瘍(肉腫を除外する)であって、耐性であるか、又は再発した、転移性の悪性充実性腫瘍を有すること;(2)ネクチン4の発現について陽性であり、150と等しいか、又はこれを超える、ネクチン4 IHCHスコアを有する腫瘍を有すること;(3)転移性疾患のための、少なくとも1つの、以前の化学療法レジメンで失敗していること(シスプラチンベースの化学療法に不適合であると考えられる場合、尿路上皮がん及び膀胱がんの対象は、以前の化学療法レジメンで失敗していることは要求されない)(Galskyら、Journal of Clinical Oncology、29巻、17号、2432~2438(2011));(4)最近の全身処置が、治験免疫療法薬であった場合に、疾患の進行が記録されていること;(5)Eastern Cooperative Oncology Group(ECOG)パフォーマンスステータスが、0又は1であること;(7)RECIST(version 1.1)に従い測定可能な疾患を有すること(Eisenhauerら、European Journal of Cancer、45(2):228~247(2009))を満たす患者における、がん治療に対する応答について調べることにより、患者が、抗がん治療(例えば、細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤へとコンジュゲートさせた抗ネクチン4を使用する抗がん治療)に対して応答性となるのかどうかの予測における、M22-321b41.1のIHC染色により決定される、患者組織内の、ネクチン4の発現の有効性について査定した。M22-321b41.1抗体を用いるIHCアッセイを使用して、合計184例の臨床試験検体を、それらのネクチン4発現について検討し;検討された184例の検体のうち、180例(98%)の臨床試験検体は、0を超えるHスコアを有し;171例(93%)は、中程度~高ネクチン4発現(Hスコア≧150)を有した。全体で、44例の臨床対象が、組入れ基準に合致した。これらの44例の患者における腫瘍部位及び/又は転移部位を、表22に列挙する。
中程度~高ネクチン4発現(Hスコア≧150)を有した、これらの44例の患者に、微小管破壊剤であるモノメチルアウリスタチンEへとコンジュゲートさせた、完全ヒト抗ネクチン4抗体(IgG1κ)を含む抗がん治療剤を投与した。全ての対象は、疾患の進行、処置に対する非忍容性、治験責任医師による決定、又は同意文書の取下げが生じるまで、抗ネクチン4 ADCの、毎週1回、30分間で、4週間ごとのサイクルのうちの3週間にわたる(例えば、1、8、及び15日目における)、IV注入を施された。投与される用量は、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、及び1.25mg/kgを含んだ。患者における疾患応答は、8週間(±7日間)ごとに1回、RECIST version 1.1に従い、治験責任医師が評価した(Eisenhauerら、European Journal of Cancer、45(2):228~247(2009)において記載されているRECIST)。合計36例の対象が、査定されうる結果をもたらした。
抗ネクチン4 ADCは、全てが、ネクチン4を発現する腫瘍を有する、処置される患者において、抗腫瘍活性をもたらした。36例中10例の患者が、部分寛解を示し、27.8%の奏効率(奏効としてカウントされる、部分寛解又は完全寛解の両方)を示した。抗ネクチン4 ADCはまた、肝転移を伴う、10例中4例の対象(40%の奏効率)、及びかつてチェックポイント阻害剤で処置された、12例中3例の患者(25%の奏効率)における抗腫瘍活性ももたらした。
したがって、抗ネクチン4 ADCは、ネクチン4を発現する腫瘍を有する患者において、抗腫瘍活性をもたらした。
(例10)
ネクチン4 IHCアッセイの診断的使用及び予後診断的使用(異なるコホート)
次いで、例えば、以下の基準:(1)尿路上皮がんを含む、組織学的に確認された、転移性の悪性充実性腫瘍を有すること;(2)ネクチン4の発現について陽性であり、150と等しいか、又はこれを超える、ネクチン4 IHCHスコアを有する腫瘍を有すること;(3)転移性疾患及び/又はシスプラチンベースの化学療法に不適合であった尿路上皮がん対象のための、1つ又は1つを超える、以前の化学療法で失敗していること(Galskyら、Journal of Clinical Oncology、29巻、17号、2432~2438(2011));(4)研究の直前において、免疫チェックポイント阻害剤(CPI)で処置された対象について、疾患の進行が記録されていること;(5)Eastern Cooperative Oncology Group(ECOG)パフォーマンスステータスが、0又は1であること;(7)RECIST(version 1.1)に従い測定可能な疾患を有すること(Eisenhauerら、European Journal of Cancer、45(2):228~247(2009))を満たす患者の異なるコホートにおける、がん治療に対する応答について調べることにより、患者が、抗がん治療(例えば、細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤へとコンジュゲートさせた抗ネクチン4を使用する抗がん治療)に対して応答性となるのかどうかの予測における、M22-321b41.1のIHC染色により決定される、患者組織内の、ネクチン4の発現の有効性ついて査定した。M22-321b41.1抗体を用いるIHCアッセイを使用して、合計295例の臨床試験検体を、それらのネクチン4発現について検討し;検討された295例の検体のうち、278例(94%)の臨床試験検体は、1と等しいか、又はこれを超えるHスコアを有し;245例(83%)は、中程度~高ネクチン4発現(Hスコア≧150)を有した。全体で、58例の臨床対象が、組入れ基準に合致した。これらの58例の患者における腫瘍部位及び/又は転移部位を、表23に列挙する。
中程度~高ネクチン4発現(Hスコア≧150)を有する、これらの58例の患者に、微小管破壊剤であるモノメチルアウリスタチンEへとコンジュゲートさせた、完全ヒト抗ネクチン4抗体(IgG1κ)を含む抗がん治療剤を投与した。全ての対象は、疾患の進行、処置に対する非忍容性、治験責任医師による決定、又は同意文書の取下げが生じるまで、抗ネクチン4 ADCの、毎週1回、30分間で、4週間ごとのサイクルのうちの3週間にわたる(例えば、1、8、及び15日目における)、IV注入を施された。投与される用量は、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、及び1.25mg/kgを含む。患者における疾患応答は、8週間(±7日間)ごとに1回、RECIST version 1.1に従い、治験責任医師が評価した(Eisenhauerら、European Journal of Cancer、45(2):228~247(2009)において記載されているRECIST)。合計49例の対象が、査定されうる結果をもたらした。
抗ネクチン4 ADCは、全てが、ネクチン4を発現する腫瘍を有する、処置される患者において、抗腫瘍活性をもたらした。1例の患者が、完全寛解を示し、17例の患者が、部分寛解を示す結果として、合計で36.7%の奏効率(奏効としてカウントされる、部分寛解又は完全寛解の両方)をもたらした。1.25mg/kg群では、抗ネクチン4 ADCは、処置された17例中10例の患者において、奏効をもたらし、58.8%の奏効率をもたらした。抗ネクチン4 ADCはまた、肝転移を伴う、12例中5例の対象(41.7%奏効率)、かつて、チェックポイント阻害剤で処置された、16例中6例患者(37.5%奏効率)、及びかつて、タキサンで処置された、20例中8例患者(40%奏効率)においても、抗腫瘍活性をもたらした。
したがって、抗ネクチン4 ADCは、ネクチン4を発現する腫瘍を有する患者において、抗腫瘍活性をもたらした。
(例11)
抗ネクチン4 ADCの治療的使用
本明細書で提供される抗ネクチン4 ADCの、多様ながんを伴う患者の処置における有効性は、例えば、ヒトM22-321b41.1抗体又はヒト化M22-321b41.1抗体を含む抗ネクチン4 ADCで処置された患者の転帰と、プラセボとしての抗体アイソタイプで処置された対照患者の転帰とを比較することにより査定する。略述すると、患者を無作為化し、対照群又は処置群へと割り付ける。処置群内の患者には、抗ネクチン4 ADCを、動物モデルにおいて最適化された、1kg(の体重)当たりの用量mg(の抗体)の範囲、及び/又は例9及び10における用量範囲に従い決定される用量範囲で注射する。注射は、ある期間にわたり、1回又は複数回行われる。処置された患者における転帰は、処置群と、プラセボ群との間で、定期的に解析及び比較する。
転帰は、抗ネクチン4 ADCで処置された患者において、プラセボで処置された患者と比較した場合に、改善される。プラセボ処置と比較した場合、抗ネクチン4 ADC処置は、6カ月後、1年後、2年後、3年後、又は5年後における高生存率をもたらし、生存期間を延長し、がんマーカーのレベルを低減し、平均値又は中央値の腫瘍サイズを低減し、且つ/又はがんの進行を遅らせる。
(例12)
ネクチン4 IHCアッセイの、さらなる診断的使用及び予後診断的使用
患者が、抗がん治療(例えば、細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤へとコンジュゲートさせた抗ネクチン4を使用する抗がん治療)に対して応答性となるのかどうかの予測における、M22-321b41.1のIHC染色により決定される、患者組織内の、ネクチン4の発現の有効性ついて、例えば、患者の、がん治療への応答を、ネクチン4特異的抗体を用いるIHC染色から決定される、患者のがん組織内のネクチン4の発現と相関させることにより査定する。略述すると、全ての患者を、同じがん処置レジメンで処置し、がんを有する患者の組織内のネクチン4の発現レベルを、本明細書で記載されるM22-321b41.1抗体を使用するIHCアッセイにおいて決定する。それらのがん組織内の、ネクチン4の発現に従い、患者を、2つ、3つ、4つ、又はこれを超える群へと層別化する。例えば、4つの群への層別化では、患者を、それらのがん組織内のネクチン4発現が高度である第1の群、発現が中程度である第2の群、発現が低度である第3の群、及び発現が見られない第4の群へと分割する。各層別化群内の患者の体重、患者における腫瘍のサイズ、6カ月後、1年後、2年後、3年後、若しくは5年後における患者の生存率、又は患者の生存期間などの患者転帰により反映される、がん処置レジメンへの応答をまとめ、各群内の患者によるネクチン4の発現と相関させる。相関は、各群平均値又は中央値を使用して実施するか、又は各群内の個別の患者について実施する。
患者のがん組織内のネクチン4の発現は、患者が、どのようにして、がん処置レジメン、例えば、細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤とコンジュゲートさせた抗ネクチン4(抗ネクチン4 ADCと称する)を使用するがん治療に応答するのかを示す。それらのがん組織内のネクチン4発現が高度である患者は、がん処置レジメンへの応答が良好であり、6カ月後、1年後、2年後、3年後、又は5年後における生存率が高く、且つ/又はそれらのがん組織内のネクチン4発現が低度である患者より長く生存する。患者のがん組織内のネクチン4の発現が高度であるほど、がん治療、例えば、抗ネクチン4 ADC処置は、患者にとって、より有効である。