JP7168590B2 - ネクチン４結合性タンパク質及びその使用方法 - Google Patents

ネクチン４結合性タンパク質及びその使用方法 Download PDF

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Description

１．分野
本明細書では、ヒトネクチン４に特異的に結合し、ネクチン４の発現レベルを検出する抗体を伴う組成物、方法、及び使用が提供される。
２．関連出願の相互参照
本出願は、その全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年６月５日に出願された、米国仮出願第６２／５１５，４５４号に対する優先権の利益を主張する。
３．電子的に提出された配列表への言及
本出願は、本出願と共に提出され、「１４３６９－２０８－２２８＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔ」と題され、２０１８年５月３１日に作成され、３７，２８０バイトのサイズである、ＡＳＣＩＩテキストフォーマットにおける、参照により、配列表のコンピューター読取り可能形態（ＣＲＦ）を組み込む。
４．背景
ポリオウイルス受容体関連タンパク質４（ＰＶＲＬ４）としてもまた公知のネクチン４は、細胞接着分子のネクチンファミリーに属する、約５２ｋＤａのサイズの、Ｉ型１回膜貫通タンパク質である。ネクチンは、接着結合において、１つのネクチン４が、別のネクチン４と相互作用する、同種親和性相互作用、及びネクチン４が、ネクチン１、ネクチン２、又はネクチン３など、別のネクチンファミリータンパク質と相互作用する異種親和性相互作用の両方を介して、Ｃａ２＋非依存性細胞間接着を媒介する（Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｊら、２００７、Ａｍ Ｊ Ｎｅｐｈｒｏｌ、２７：５９０～６０４；Ｔａｋａｉら、２００３、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ、９４：６５５～６６７；Ｒｅｙｍｏｎｄ Ｎ．ら、２００１、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７６：４３２０５～１５）。ネクチン４の細胞外ドメインは、Ｖ、Ｃ１、Ｃ２と称する、３つのＩｇ様サブドメインを有する。ネクチン２内のＣ１ドメインが、同種親和性相互作用の一因となるのに対し、大半のネクチン分子のＶドメインは、異種親和性相互作用及び細胞間接着に寄与することが示されている（Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｊら、２００７、Ａｍ Ｊ Ｎｅｐｈｒｏｌ、２７：５９０～６０４；Ｔａｋａｉら、２００３、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ、９４：６５５～６６７；ＲｅｙｍｏｎｄＮ．ら、２００１、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７６：４３２０５～１５）。
ネクチンは、例えば、造血細胞、神経細胞、内皮細胞、及び上皮細胞を含む、多様な組織内で発現する（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ Ｃら、１９８９、Ｃｅｌｌ、５６：８５５～８６５；Ｌｏｐｅｚ Ｍら、１９９８、 Ｂｌｏｏｄ、９２：４６０２－４６１１；Ｒｅｙｍｏｎｄ Ｎら、２０００、Ｇｅｎｅ（Ａｍｓｔ．）２５５：３４７－３５５；Ｃｏｃｃｈｉ Ｆ．ら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７２：９９９２～１０００２；Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ．ら、１９９９、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４５：５３９～５４９；Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｊら、２００７、Ａｍ Ｊ Ｎｅｐｈｒｏｌ、２７：５９０～６０４；Ｔａｋａｉら、２００３、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ ９４：６５５～６６７）。
同種親和性相互作用、又は他のネクチンファミリータンパク質との異種親和性相互作用による細胞間接着を媒介する以外に、ネクチンは、カドヘリンなど、他の細胞接着分子、又はプロラクチン受容体など、他の細胞表面受容体を動員しうる。他の細胞表面受容体を動員することにより、ネクチンはまた、刺激性共受容体としても用いられ、したがって、シグナル伝達機能を有する場合もある。例えば、マウス乳腺内で、ネクチン４は、その細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを介して、プロラクチン受容体と相互作用し、通常は、ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）のキナーゼ活性を阻害するＳＯＣＳ－１（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ－ｏｆ－ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ－１）に結合し、これを隔離し、これにより、プロラクチン誘導性のＪＡＫ２の活性化及びシグナル伝達を増強する（Ｍａｒｕｏｋａら、２０１７、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１６．７６９０９１、ｊｂｃ．Ｍ１１６．７６９０９１、Ｅｐｕｂによる刊行前公開版；Ｋｉｔａｙａｍａら、２０１６、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９１：５８１７～５８３１）。ネクチンはまた、初期の細胞間接着時において、カドヘリンと協同作用して、Ｒａｃ１活性を誘導し、次いで、これを、迅速に抑制する場合もある（Ｋｈａｍｅｅｋａら、２０１１、ＰＬｏＳ ＯＮＥ６：ｅ１７８４１）。
多様な生物学的試料中のネクチン４の発現を特異的に検出し、評価するために、これまでに開発された、抗ネクチン４抗体は、成功を収めていない。したがって、生物学的試料中のネクチン４の発現を特異的に検出し、評価しうる、抗ネクチン４抗体を同定することが必要とされている。
５．概要
本開示は、ネクチン４（例えば、ヒトネクチン４である、配列番号４３）に結合するタンパク質であって、ネクチン４に結合する抗体などの結合性タンパク質を含む上記タンパク質を提供する。抗体を含む、このような結合性タンパク質は、ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４断片、及び／又はネクチン４エピトープに結合しうる。
ある特定の実施形態では、本開示はまた、ネクチン４を発現する細胞に特異的に結合する抗体又はその断片を含む結合性タンパク質も提供する。
本明細書ではまた、このような抗体をコードする配列を含むポリヌクレオチド及びベクター、このようなポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞（例えば、宿主細胞）、並びにこのような抗体を含む組成物、試薬、及びキットも提供される。本明細書の別の態様では、ネクチン４の活性をモジュレートする（例えば、ネクチン４シグナル伝達を活性化させる）か、又はネクチン４の発現レベルをモジュレートするための方法、診断方法、及びこのような抗ネクチン４抗体の使用が提供される。
一部の実施形態では、結合性タンパク質（例えば、抗ネクチン４抗体）は、６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、又は６つより少ないＣＤＲを含む。他の実施形態では、結合性タンパク質（例えば、抗ネクチン４抗体）は、重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及び／又はＶＬ ＣＤＲ３から選択される、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含む。ある特定の実施形態では、結合性タンパク質（例えば、抗ネクチン４抗体）は、本明細書で記載される、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１と称するモノクローナル抗体、又はそのヒト化変異体の、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及び／又はＶＬ ＣＤＲ３から選択される、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、結合性タンパク質（例えば、抗ネクチン４抗体）は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列、又はその変異体の、ＶＨ ＦＲ１、ＶＨ ＦＲ２、ＶＨ ＦＲ３、ＶＨ ＦＲ４、ＶＬ ＦＲ１、ＶＬ ＦＲ２、ＶＬ ＦＲ３、及び／又はＶＬ ＦＲ４を含む、足場領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）をさらに含む。
一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、表１に明示された、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、表１に明示された、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨを含む。
他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、
（ａ）表２に明示された、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１のＶＬ ＦＲ１、ＶＬ ＦＲ２、ＶＬ ＦＲ３、及びＶＬ ＦＲ４を含むＶＬと；
（ｂ）表２に明示された、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１のＶＨ ＦＲ１、ＶＨ ＦＲ２、ＶＨ ＦＲ３、及びＶＨ ＦＲ４を含むＶＨと
を含む。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号７、１０、及び１２のアミノ酸配列を含み、抗体又はその抗原結合性断片のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１５、１９、及び２３のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、１箇所又は複数箇所の、その保存的修飾を含む。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、１箇所又は複数箇所の、その保存的修飾を含む。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬと；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
一部の実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。他の実施形態では、抗体は、突然変異体のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域をさらに含む。
他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖Ｆｃ領域をさらに含む。
さらに別の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域と；配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖Ｆｃ領域とをさらに含む。
一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基３１～３４６のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基３１～１５０のうちの少なくとも１つに結合する。ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基１～１５０のうちの少なくとも１つに結合する。
一実施形態では、ヒトネクチン４のエピトープは、ネクチン４リガンド結合性部位とは別個である。
本明細書の一態様では、ヒトネクチン４のエピトープに結合する抗体又はその抗原結合性断片であって、ネクチン４を発現する細胞に特異的に結合する上記抗体又はその抗原結合性断片が提供される。
一実施形態では、ヒトネクチン４のエピトープに結合する抗体又はその抗原結合性断片を使用して、がんを有することが疑われる対象に由来する組織試料中のネクチン４の発現を評価し、（ａ）前記組織試料を、抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと；（ｂ）前記抗体又はその抗原結合性断片の、前記組織試料への結合を検出するステップと；（ｃ）組織試料中の、ネクチン４の発現を決定するステップであって、組織試料中の、ネクチン４の発現レベルを、ネクチン４の基準発現レベルと比較する上記ステップとを含む。
ある特定の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト抗体、又はキメラ抗体である。別の実施形態では、ヒト化抗体は、脱免疫化抗体又は複合ヒト抗体である。ある特定の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。具体的な実施形態では、抗体は、ヒトネクチン４に特異的に結合するヒト化抗体である。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディー、トリアボディー、又はテトラボディーである。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、抗体断片から形成された多特異性抗体である。
一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片を、薬剤へとコンジュゲートさせる。一実施形態では、薬剤は、放射性同位元素、金属キレート剤、酵素、蛍光化合物、生物発光化合物、又は化学発光化合物である。
本明細書ではまた、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片を含む組成物も提供される。ある特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
本明細書ではまた、本明細書で提供される抗体のうちの、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも提供される。
ある特定の実施形態では、本開示はまた、本明細書で提供される抗体のうちの、重鎖、軽鎖、又は重鎖及び軽鎖の両方をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも提供する。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを、プロモーターに作動可能に連結する。
本明細書ではまた、（ａ）本明細書で提供される抗体のＶＨ又は重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のポリヌクレオチドと、（ｂ）本明細書で提供される抗体のＶＬ又は軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のポリヌクレオチドとを含む、ポリヌクレオチドの集団も提供される。ある特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチドを、第１のプロモーターに作動可能に連結し、第２のポリヌクレオチドを、第２のプロモーターに作動可能に連結する。
本明細書ではまた、本明細書で提供されるポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。
ある特定の実施形態では、本開示はまた、（ａ）本明細書で提供される抗体のＶＨ又は重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、（ｂ）本明細書で提供される抗体のＶＬ又は軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターとを含む、ベクターの集団も提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）本明細書で提供される抗体のＶＨ又は重鎖をコードするヌクレオチド配列であって、第１のプロモーターに作動可能に連結した、上記ヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、（ｂ）本明細書で提供される抗体のＶＬ又は軽鎖をコードするヌクレオチド配列であって、第２のプロモーターに作動可能に連結した、上記ヌクレオチド配列を含む、第２のベクターとを含む、ベクターの集団をさらに提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供されるポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの集団を含む細胞を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示はまた、本明細書で提供されるベクター又はベクターの集団を含む細胞も提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片を産生する単離細胞をさらに提供する。
本明細書ではまた、（ａ）本明細書で提供される抗体のＶＨ又は重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、第１の宿主細胞と、（ｂ）本明細書で提供される抗体のＶＬ又は軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、第２の宿主細胞とを含む、細胞の集団も提供される。
さらに、本明細書では、（ａ）本明細書で提供される抗体のＶＨ又は重鎖をコードするヌクレオチド配列であって、第１のプロモーターに作動可能に連結した、上記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、第１の宿主細胞と、（ｂ）本明細書で提供される抗体のＶＬ又は軽鎖をコードするヌクレオチド配列であって、第２のプロモーターに作動可能に連結した、上記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、第２の宿主細胞とを含む、細胞の集団が提供される。
本明細書ではまた、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片を含むキットも提供される。
本明細書ではまた、ヒトネクチン４のエピトープに特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片を作製する方法も提供される。ある特定の実施形態では、方法は、本明細書で提供される細胞を培養して、抗体又はその抗原結合性断片を発現させるステップを含む。他の実施形態では、方法は、本明細書で提供されるポリヌクレオチドを発現させるステップを含む。一実施形態では、ヒトネクチン４のエピトープは、ネクチン４リガンド結合性部位とは別個である。
６．図面の簡単な説明
全てのがん性細胞が、２．５μｇ／ｍＬのＭ２２－３２１ｂ４１．１による、ネクチン４ ｍＲＮＡ陽性ＡＧ－Ｂ１異種移植片についてのＩＨＣ染色アッセイにおいて、陽性染色されたことを示す、実験の結果を描示する図である。
全てのがん性細胞が、２．５μｇ／ｍＬのＭ２２－２４４ｂ３．１．１．１による、ネクチン４ ｍＲＮＡ陽性ＡＧ－Ｂ１異種移植片についてのＩＨＣ染色アッセイにおいて、陽性染色されたことを示す、実験の結果を描示する図である。
全ての細胞が、２．５μｇ／ｍＬのＭ２２－３２１ｂ４１．１による、ネクチン４ ｍＲＮＡ陰性ＡＧ－Ｋ２４異種移植片についてのＩＨＣ染色アッセイにおいて、染色されたわけではないことを示す、実験の結果を描示する図である。
多くの細胞が、２．５μｇ／ｍＬのＭ２２－２４４ｂ３．１．１．１による、ネクチン４ ｍＲＮＡ陰性ＡＧ－Ｋ２４異種移植片についてのＩＨＣ染色アッセイにおいて、陽性染色されたことを示す、実験の結果を描示する図である。
全ての細胞が、２．５μｇ／ｍＬのＭ２２－３２１ｂ４１．１による、ネクチン４ ｍＲＮＡ陰性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＭＦＰ－ＸＣＬ異種移植片についてのＩＨＣ染色アッセイにおいて、染色されたわけではないことを示す、実験の結果を描示する図である。
多くの細胞が、２．５μｇ／ｍＬのＭ２２－２４４ｂ３．１．１．１による、ネクチン４ ｍＲＮＡ陰性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＭＦＰ－ＸＣＬ異種移植片についてのＩＨＣ染色アッセイにおいて、陽性染色されたことを示す、実験の結果を描示する図である。
全ての細胞が、２．５μｇ／ｍＬの陰性対照であるＩｇＧ２ａ抗体による、ネクチン４ ｍＲＮＡ陽性ＡＧ－Ｂ１異種移植片についてのＩＨＣ染色アッセイにおいて、染色されたわけではないことを示す、実験の結果を描示する図である。
全てのがん性細胞が、２．５μｇ／ｍＬのＭ２２－３２１ｂ４１．１による、ネクチン４ ｍＲＮＡ陽性ＡＧ－Ｌ１６異種移植片についてのＩＨＣ染色アッセイにおいて、陽性染色されたことを示す、実験の結果を描示する図である。
がん性細胞の大部分が、２．５μｇ／ｍＬのＭ２２－３２１ｂ４１．１による、ネクチン４ ｍＲＮＡ陽性ＡＧ－Ｂ１１異種移植片についてのＩＨＣ染色アッセイにおいて、陽性染色されたことを示す、実験の結果を描示する図である。
Ｍ２２－３２１ｂ４１．１による、尿路上皮癌についてのＩＨＣ染色アッセイにおける、強いネクチン４染色を示す実験の結果を描示する図である。
Ｍ２２－３２１ｂ４１．１による、乳癌についてのＩＨＣ染色アッセイにおける、ネクチン４染色の不均一性を示す実験の結果を描示する図である。
図１２Ａは、ネクチン４を発現する細胞及び異種移植片だけにおける、ネクチン４バンドの特異的検出を示す、ウェスタンブロット実験の結果を描示する図である。
図１２Ｂは、図１２Ａにおいて、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１により、陽性のブロットをもたらした、Ｒａｔ１（Ｅ）－ネクチン４細胞が、高レベルのネクチン４を発現し；図１２Ａにおいて、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１により、陰性のブロットをもたらした、他のＲａｔ１（Ｅ）細胞が、高レベルのネクチン１、ネクチン２、及びネクチン３を発現したことを示すことから、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１が、ネクチン４に特異的であることを指し示す、対照ＦＡＣＳ実験の結果を描示する図である。
Ｍ２２－３２１ｂ４１．１抗体が、ネクチン４のＶ断片／ドメイン（アミノ酸残基１～１５０）を含有するタンパク質バンドを認識したことを示す、ウェスタンブロット実験の結果を描示する図である。上パネルでは、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１抗体を、野生型全長（ｗｔ）、Ｖ断片／ドメイン（Ｖ）、Ｖ及びＣ１断片／ドメイン（Ｖ／Ｃ１）、Ｃ１及びＣ２断片／ドメイン、Ｃ２断片／ドメイン、並びに陰性対照（ｎｅｏ）を発現する細胞溶解物に対するウェスタンブロットアッセイにおいて調べた。下パネルでは、ＧＡＰＤＨのブロッティングを、ローディング対照として使用した。
７．詳細な説明
本明細書では、ヒトネクチン４を含むネクチン４に結合する抗体などの結合性タンパク質が提供される。一実施形態では、ネクチン４抗体は、ヒトネクチン４に結合する。一部の実施形態では、ネクチン４抗体の、ネクチン４への結合を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてアッセイした。他の実施形態では、ネクチン４抗体の、ネクチン４への結合を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてアッセイした。ある特定の実施形態では、アッセイは、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）アッセイ、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット（例えば、ウェスタンブロット法、ドットブロッティング、又は細胞内ウェスタンブロット法）、及び他のイムノアッセイを含む。
具体的な実施形態では、本明細書で提供される、ネクチン４に結合する抗体などの結合性タンパク質は、ネクチン４への結合について、互いと競合するという、共通の特徴を共有する。この競合的阻害は、各抗体が、ネクチン４の同じ領域（例えば、同じエピトープ）に結合し、これにより、同様な効果を確保することを指し示しうる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ネクチン４抗体は、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１から導出されるか、又はこれに基づき導出されたヒト化抗ネクチン４抗体などのヒト化抗ネクチン４抗体を含む。他の実施形態では、本明細書で提供される抗ネクチン４抗体は、結合について、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１から導出されるか、又はこれに基づき導出された抗体と競合する。一部の実施形態では、抗ネクチン４抗体は、表１に記載されたＣＤＲ配列を有する。ある特定の実施形態では、抗ネクチン４抗体は、ヒトネクチン４の特異的ドメイン（例えば、配列番号１のアミノ酸配列内の、残基３１～３４６、１～１５０、又は３１～１５０）に結合する。さらに、このような結合は、大部分、本明細書で記載される抗ネクチン４抗体により認識されるエピトープを含む領域内の、特定のアミノ酸残基に帰することができる。まとめると、本明細書で記載される結果は、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１から導出されるか、又はこれに基づき導出された抗ネクチン４抗体であって、表１に記載された、１又は複数のＣＤＲを有する抗体を含む上記抗体について観察される効果を、同じであるか、又は同様なエピトープ特異性（例えば、同じであるか、又は同様なＣＤＲ）を有する、本明細書で記載される、他の抗ネクチン４抗体へと外挿しうることを裏付ける。
本開示についての、一部の実施形態では、抗ネクチン４抗体などの結合性タンパク質は、表１に記載された、１又は複数のＣＤＲを含む、免疫グロブリン可変領域を含みうる。このような結合性タンパク質（例えば、抗ネクチン４抗体）内では、ＣＤＲを、ＣＤＲ（単数又は複数）の、適正な抗原結合特性が達成されるように、ＣＤＲ（単数又は複数）を方向付ける、表２に記載された足場領域又はＦＲ領域など、１又は複数の足場領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）と接合させることができる。本明細書で記載される抗ネクチン４抗体を含む、このような結合性タンパク質は、多様なアッセイにおいて、ネクチン４に結合しうる。
７．１ 一般的技法
本明細書で記載されるか、又は言及される技法及び手順は、一般に、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（３版、２００１）；「分子生物学における最新のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００３）；「治療用モノクローナル抗体：実験室から臨床まで（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ）」（Ａｎ編、２００９）；「モノクローナル抗体：方法とプロトコール（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」（Ａｌｂｉｔａｒ編、２０１０）；及び「抗体の操作（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、１及び２巻（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｂｅｌ編、２版、２０１０）において記載されている、広く利用される方法など、従来の方法を使用して、当業者により、十分に理解され、且つ／又は一般に用いられる技法及び手順を含む。
７．２ 用語法
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的では、以下の用語についての説明が、適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語はまた、複数形も含み、この逆もまた成り立つであろう。全ての特許、出願、出願公開、及び他の刊行物は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。万一、明示された用語についての任意の説明が、参照により本明細書に組み込まれた、任意の文献と齟齬を生じる場合、下記に明示された用語の説明に従うものとする。
「ネクチン４」、「ネクチン４ポリペプチド」、又は「ネクチン４タンパク質」という用語は、そうでないことが指し示されない限りにおいて、霊長動物（例えば、ヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ（ｃｙｎｏ）））、イヌ、及び齧歯動物（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源に由来する、任意の天然ポリペプチドを含むポリペプチド（本明細書では、「ポリペプチド」と「タンパク質」とを、互換的に使用する）を包含する。ある特定の実施形態では、用語は、そのＳＮＰ変異体を含む、「類縁のネクチン４ポリペプチド」を含む。「ネクチン４」という用語はまた、プロセシングされていないネクチン４である、「全長」ネクチン４のほか、細胞内のプロセシングから生じる、ネクチン４の任意の形態も包含する。一部の実施形態では、ネクチン４は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号：ＮＭ＿０３０９１６（ｍＲＮＡ）、ＮＧ＿０２８１０９（ゲノムのＤＮＡ）、Ｇｅｎｅ ＩＤ：８１６０７（遺伝子）、ＮＰ＿１１２１７８（前駆体アミノ酸配列）は、他の例示的な、ヒトネクチン４の核酸配列又はアミノ酸配列を提示する。例示的なヒトネクチン４アミノ酸配列を、下記：
Figure 0007168590000001
（配列番号１）
に提示する。
ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号：ＮＭ＿０３０９１６は、１つの、例示的な、ヒトネクチン４の核酸配列：
Figure 0007168590000002
（配列番号３６）
を提示する。
ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号：ＡＦ４７２５１０、ＮＭ＿０２７８９３、ＸＭ＿２０３７３８、ＮＭ＿００１１２２６８０は、例示的な、マウスネクチン４の核酸配列及びアミノ酸配列を提示し；ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号：ＸＭ＿００５５４１２２０及びＸＭ＿００５５４１２２３は、例示的な、サルネクチン４の、核酸配列及びアミノ酸配列を提示する。
「類縁のネクチン４ポリペプチド」は、ネクチン４活性を保持しうる、対立遺伝子変異体（例えば、ＳＮＰ変異体）；スプライス変異体；断片；誘導体；置換変異体、欠失変異体、及び挿入変異体；融合ポリペプチド；並びに種間相同体を含む。当業者が理解する通り、本明細書で提供される抗ネクチン４抗体は、ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチド断片、ネクチン４抗原、及び／又はネクチン４エピトープに結合しうる。「エピトープ」は、大型のネクチン４ポリペプチドの一部でありうる、大型のネクチン４ポリペプチド断片の一部でありうる、大型のネクチン４抗原の一部でありうる。ネクチン４は、天然形態で存在する場合もあり、変性形態で存在する場合もある。本明細書で記載されるネクチン４ポリペプチドは、ヒト組織型など、様々な供給源、又は別の供給源から単離することもでき、組換え方法又は合成方法により調製することもできる。当技術分野ではまた、ネクチン４ポリペプチドに対するオーソログも周知である。
「ネクチン４リガンド」とは、ネクチン４と結合するか、又は他の形で相互作用する分子を指す。ネクチン４は、別のネクチン４分子との同種親和性相互作用と、ネクチン１、ネクチン２、及びネクチン３など、他のネクチンファミリータンパク質との異種親和性相互作用とを有しうる。ネクチン４はまた、カドヘリンなど、他の表面接着分子、及びプロラクチン受容体など、他の細胞表面受容体とも相互作用しうる。ネクチン４はさらに、ウイルス粒子、例えば、麻疹ウイルス及びポリオウイルス、並びにウイルス粒子上のウイルスタンパク質とも相互作用しうる。したがって、ネクチン４リガンドは、ネクチン１、ネクチン２、ネクチン３、若しくはネクチン４、又はネクチンファミリータンパク質のうちのいずれかの断片を含みうる。ネクチン４リガンドはまた、カドヘリン若しくはその断片、又はプロラクチン受容体若しくはその断片など、他の細胞表面受容体のドメイン又は全長分子も含みうる。ネクチン４リガンドは、ネクチン４に結合しうる、ウイルス粒子、ウイルスカプシドタンパク質、ウイルス表面タンパク質、及びウイルスタンパク質のうちのいずれかの断片もさらに含みうる。本明細書で記載されるか、又は当業者に公知である天然に存在するリガンド以外のネクチン４リガンドの非限定的な例は、人工的に作出されるリガンド、例えば、ネクチン４に結合しうるペプチドを得るためにペプチドのライブラリーをスクリーニングすることにより同定されるリガンドを含む。
「ネクチン４の活性」及び「ネクチンによるシグナル伝達」という用語は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ネクチン４リガンドの、ネクチン４への結合により誘導される、生物学的効果又は生物学的応答を意味する。用語はまた、ネクチン４リガンドの機能を模倣する分子により誘導される、同様な効果又は応答も指す。このようなネクチン４リガンドの模倣体は、そうでなければ、ネクチン４リガンドの結合から生じる、生物学的応答又は生物学的効果を誘導する。
「結合性タンパク質」という用語は、ネクチン４に結合する部分（例えば、ＣＤＲなど、１又は複数の結合性領域）と、任意選択で、結合部分が、結合性タンパク質の、ネクチン４のポリペプチド、断片、又はエピトープへの結合を促進するコンフォメーションを取ることを可能とする、足場部分又はフレームワーク部分（例えば、１又は複数の足場領域又はフレームワーク領域）とを含むタンパク質を指す。このような結合性タンパク質の例は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、単鎖抗体、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体、及びこれらの断片などの抗体を含む。結合性タンパク質は、例えば、ＣＤＲ又はＣＤＲ誘導体をグラフトされた、代替的なタンパク質足場又は人工的足場を含みうる。このような足場は、例えば、結合性タンパク質の三次元構造を安定化させるように導入された突然変異を含む、抗体由来の足場のほか、例えば、生体適合性ポリマーを含む、完全合成足場を含むがこれらに限定されない。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒら、２００３、「タンパク質：構造、機能、及びバイオインフォマティクス（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）」、５３（１）：１２１～２９；及びＲｏｑｕｅら、２００４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、２０：６３９～５４を参照されたい。加えて、ペプチド抗体模倣体（「ＰＡＭ」）もまた、フィブロネクチン成分を、足場として利用する抗体模倣体に基づき、足場として使用することができる。本開示の文脈では、結合性タンパク質は、ネクチン４に特異的に結合するか、又はこれに選択的に結合するという。
本明細書では、「抗体」、「免疫グロブリン」、又は「Ｉｇ」という用語は、互換的に使用され、最も広い意味で使用され、具体的には、例えば、個別の抗ネクチン４モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体又はインタクトなモノクローナル抗体を含む）、ポリエピトープ特異性又はモノエピトープ特異性を伴う抗ネクチン４抗体組成物、ポリクローナル抗体又は一価抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体、単鎖抗ネクチン４抗体、及び下記で記載される抗ネクチン４抗体の断片から形成される多価抗体を対象とする。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び／又はアフィニティー成熟抗体のほか、他の種、例えば、マウス及びウサギなどに由来する抗体でありうる。「抗体」という用語は、特異的分子抗原に結合することが可能であり、ポリペプチド鎖の、２つの同一な対から構成されるポリペプチドであって、各対が、１つの重鎖（約５０～７０ｋＤａ）と、１つの軽鎖（約２５ｋＤａ）とを有し、各鎖の各アミノ末端部分が、約１００～約１３０、又はこれを超えるアミノ酸の可変領域を含み、各鎖の各カルボキシ末端部分が、定常領域を含む上記ポリペプチドの、免疫グロブリンクラス内にある、Ｂ細胞のポリペプチド産物を含むことを意図する。例えば、「抗体の操作（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、２版、１９９５）；及びＫｕｂｙ、「免疫学（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（３版、１９９７）を参照されたい。具体的な実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４断片、又はネクチン４エピトープを含む、特異的分子抗原に結合しうる。抗体はまた、合成抗体、組換えにより作製された抗体、ラクダ化抗体、イントラボディー、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び断片が由来する抗体の結合活性の一部又は全部を保持する、抗体の重鎖ポリペプチド又は軽鎖ポリペプチドの部分を指す、上記のうちのいずれかの機能的断片（例えば、ネクチン４結合性断片などの抗原結合性断片）も含むがこれらに限定されない。非限定的な機能的断片（例えば、ネクチン４結合性断片などの抗原結合性断片）の例は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、及びミニボディーを含む。特に、本明細書で提供される抗体は、免疫グロブリン分子と、免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、例えば、ネクチン４抗原に結合する抗原結合性部位を含有する抗原結合性ドメイン又は分子と（例えば、抗ネクチン４抗体の、１又は複数のＣＤＲ）を含む。このような抗体断片は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、「抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９８９）；「分子生物学とバイオテクノロジー：総合的便覧（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」（Ｍｙｅｒｓ編、１９９５）；Ｈｕｓｔｏｎら、１９９３、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２２：１８９～２２４；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ及びＳｋｅｒｒａ、１９８９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１７８：４９７～５１５；並びにＤａｙ、「上級免疫化学（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」（２版、１９９０）において見出すことができる。本明細書で提供される抗体は、免疫グロブリン分子の、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）又は任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）の抗体でありうる。
「抗原」とは、抗体が選択的に結合しうる、所定の抗原である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、又は他の天然に存在する化合物若しくは合成の化合物でありうる。一部の実施形態では、標的抗原は、ポリペプチドである。
「抗原結合性断片」、「抗原結合性ドメイン」、「抗原結合性領域」という用語、及び類似の用語は、抗原と相互作用し、結合剤に、抗原（例えば、ＣＤＲ）に対する、その特異性及びアフィニティーを付与するアミノ酸残基を含む、抗体の部分を指す。
「～に結合する」又は「～に結合すること」という用語は、分子間の相互作用であって、例えば、複合体を形成する相互作用を含む上記相互作用を指す。相互作用は、例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、及び／又はファンデルワールス相互作用を含む、非共有結合的相互作用でありうる。複合体はまた、共有結合的結合若しくは非共有結合的結合、相互作用、又は力により、併せて保持される、２つ又はこれを超える分子の結合も含みうる。抗体の、単一の抗原結合性部位と、ネクチン４など、標的分子の、単一のエピトープとの、全非共有結合的相互作用の強度は、抗体又は機能的断片の、このエピトープに対するアフィニティーである。抗体の、一価抗原に対する解離速度（ｋｏｆｆ）の、会合速度（ｋｏｎ）に対する比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）は、アフィニティーと反比例する、解離定数ＫＤである。ＫＤ値が小さいほど、抗体のアフィニティーは大きい。ＫＤの値は、抗体と抗原との、異なる複合体に応じて変動し、ｋｏｎ及びｋｏｆｆの両方に依存する。本明細書で提供される抗体についての解離定数ＫＤは、本明細書で提供される、任意の方法、又は当業者に周知である、他の任意の方法を使用して決定することができる。１つの結合性部位におけるアフィニティーは、抗体と抗原との相互作用の、真の強度を、常に反映するわけではない。多価ネクチン４など、複数の、反復的な抗原決定基を含有する複合体抗原が、複数の結合性部位を含有する抗体と接触する場合、１つの部位における、抗体の、抗原との相互作用は、第２の部位における反応の可能性を増大させるであろう。多価抗体と抗原との、このような複数の相互作用の強度を、アビディティーと呼ぶ。抗体のアビディティーは、その結合能についての、その個別の結合性部位のアフィニティーより良好な尺度でありうる。例えば、高アビディティーは、ＩｇＧより低アフィニティーであるが、その多価性から生じる、ＩｇＭの高アビディティーを有しうる、五量体ＩｇＭ抗体において、場合によって、見出される通り、低アフィニティーを補完することが可能であり、五量体ＩｇＭ抗体が、抗原に、効果的に結合することを可能とする。
本明細書では、「ネクチン４に特異的に結合する抗体」、「ネクチン４エピトープに特異的に結合する抗体」という用語、及び類似の用語もまた、互換的に使用され、ネクチン４抗原、又はネクチン４断片、又はネクチン４エピトープなどのネクチン４ポリペプチド（例えば、ヒトネクチン４ポリペプチド、ヒトネクチン４抗原、又はヒトネクチン４エピトープなどのヒトネクチン４）に特異的に結合する抗体を指す。ネクチン４（例えば、ヒトネクチン４）に特異的に結合する抗体は、ネクチン４の細胞外ドメイン又はネクチン４の細胞外ドメインに由来するペプチドに結合しうる。ネクチン４抗原（例えば、ヒトネクチン４）に特異的に結合する抗体は、類縁の抗原（例えば、カニクイザルネクチン４）と交差反応性でありうる。ある特定の実施形態では、ネクチン４抗原に特異的に結合する抗体は、ネクチン１、ネクチン２、及び／又はネクチン３などであるがこれらに限定されない、他の抗原と交差反応しない。ネクチン４抗原に特異的に結合する抗体は、例えば、イムノアッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、又は当業者に公知の他の技法により同定することができる。
「目的の抗原に結合する」（例えば、ネクチン４などの標的抗原に結合する）抗体とは、抗体が、抗原を発現する細胞又は組織のターゲティング又は検出において、薬剤として有用であるが、他のタンパク質と、それほど交差反応しないように、抗原に、十分なアフィニティーで結合する抗体である。このような実施形態では、抗体の、「非標的」タンパク質への結合の程度は、例えば、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）解析又はＲＩＡにより決定される、抗体の、その特定の標的タンパク質への結合の約１０％未満であろう。抗体の、標的分子への結合に関して、「特異的結合」、特定のポリペプチド若しくは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的に結合する」、又はこれら「に特異的である」という用語は、非特異的相互作用と、測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、分子の結合を、一般に、結合活性を有さない、同様な構造の分子である、対照分子の結合と比較して決定することにより測定することができる。例えば、特異的結合は、標的と同様な対照分子、例えば、過剰量の、標識化されていない標的との競合により決定することができる。この場合、標識化された標的の、プローブへの結合が、過剰量の、標識化されていない標的により、競合的に阻害されれば、特異的結合が指し示される。「抗ネクチン４抗体」又は「ネクチン４に結合する抗体」という用語は、抗体が、例えば、ネクチン４のターゲティングにおける診断剤として有用であるように、十分なアフィニティーにより、ネクチン４に結合することが可能な抗体を含む。本明細書で使用される、「特異的結合」、特定のポリペプチド若しくは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的に結合する」、又はこれら「に特異的である」という用語は、分子が、他のいかなるポリペプチド又はポリペプチドエピトープにも、実質的に結合せずに、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合する場合の結合を指す。本明細書では、ネクチン４に特異的に結合する抗ネクチン４抗体が提供される。本明細書ではまた、ネクチン４に、ネクチン１、ネクチン２、及び／又はネクチン３を上回って、特異的に結合する抗ネクチン４抗体も提供される。
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの実験技法を使用して決定される通り、それが、ネクチン４抗原に、任意の交差反応性の抗原に対するより、大きなアフィニティーで結合する場合に、抗体は、ネクチン４抗原に特異的に結合する。典型的に、特異的反応又は選択的反応は、バックグラウンドのシグナル又はノイズの、少なくとも２倍であり、バックグラウンドの１０倍を超えうる。例えば、抗体の特異性に関する議論については、「基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」３３２～３６（Ｐａｕｌ編、２版１９８９）を参照されたい。代替的に、抗体の特異性は、例えば、ＩＨＣアッセイにおいて、定性的に決定することができる。このようなＩＨＣアッセイでは、抗体が、ネクチン４を発現する細胞に結合する、例えば、これを免疫組織化学に染色するが、ネクチン４を発現しない細胞には、実質的に結合しない、例えば、これを実質的に染色しない場合に、抗体は、ネクチン４抗原に特異的に結合するか、又はネクチン４抗原に対する特異性を有する。例として述べると、抗体が、細胞に、免疫グロブリンのアイソタイプ対照について見られる結合のレベルと、実質的に同様なレベルで結合する、例えば、これを、免疫組織化学に染色する場合、抗体は、細胞に実質的に結合しない、例えば、ＩＨＣにおいて、これを実質的に染色しない。
本明細書では、「完全ヒト抗体」又は「ヒト抗体」という用語は、互換的に使用され、ヒト可変領域と、例えば、ヒト定常領域とを含む抗体を指す。具体的な実施形態では、用語は、ヒト由来の可変領域と、定常領域とを含む抗体を指す。ある特定の実施形態では、「完全ヒト」抗ネクチン４抗体はまた、ネクチン４ポリペプチドに結合し、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン核酸配列の、天然に存在する体細胞変異体である核酸配列によりコードされる抗体も包含しうる。具体的な実施形態では、本明細書で提供される抗ネクチン４抗体は、完全ヒト抗体である。「完全ヒト抗体」という用語は、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔら（１９９１）、「免疫学的対象となるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ 刊行物第９１－３２４２号を参照されたい）により記載されている、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に対応する、可変領域及び定常領域を有する抗体を含む。完全ヒト抗体を作製する例示的方法は、例えば、本明細書の実施例に提供されるが、当技術分野で公知である、任意の方法を使用することができる。
「組換えヒト抗体」という語句は、宿主細胞にトランスフェクトされる組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体、組換え、コンビナトリアルの、ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子について、トランスジェニック及び／又はトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウス又はウシ）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら（１９９２）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０：６２８７～６２９５を参照されたい）、又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列の、他のＤＮＡ配列に照らしたスプライシングを伴う、他の任意の手段により、調製されるか、発現させるか、創出されるか、又は単離された抗体などの組換え手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、又は単離されたヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）、「免疫学的対象となるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ 刊行物第９１－３２４２号を参照されたい）を有しうる。しかし、ある特定の実施形態では、このような組換えヒト抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックである動物を使用する場合は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける体細胞突然変異誘発）にかけるので、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ配列及びＶＬ配列に由来し、これらと類縁であるが、ｉｎ ｖｉｖｏのヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内には、天然で存在しえない配列である。
抗ネクチン４抗体（例えば、ネクチン４に結合し、標的上の、同じエピトープ又は結合性部位について競合する、抗体及び結合性タンパク質）の文脈で使用される場合の、「競合する」という用語は、アッセイにより決定される競合であって、研究下の抗体（又はその結合性断片）が、基準分子（例えば、基準リガンド、又は基準抗体など、基準の抗原結合性タンパク質）の、共通抗原（例えば、ネクチン４又はその断片）への特異的結合を防止又は阻害する、上記競合を意味する。多数種類の競合的結合アッセイを使用して、被験抗体が、基準抗体と、ネクチン４への結合（例えば、ヒトネクチン４）について競合するのかどうかを決定することができる。用いられうるアッセイの例は、直接的固相ＲＩＡ又は間接的固相ＲＩＡ、直接的固相酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）又は間接的固相酵素ＥＩＡ、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉら、１９８３、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、９：２４２～５３を参照されたい）、直接的固相ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄら、１９８６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７：３６１４～１９を参照されたい）、直接的固相標識化アッセイ、直接的固相標識化サンドイッチアッセイ、（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、「抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、（１９８８）を参照されたい）、Ｉ－１２５標識を使用する、直接的固相標識化ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌら、１９８８、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２５：７～１５を参照されたい）、及び直接的標識化ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら、１９９０、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：７７～８２）を含む。典型的に、このようなアッセイは、固体表面に結合させた精製抗原（例えば、ヒトネクチン４などのネクチン４）、又は標識化されていない被験抗原結合性タンパク質（例えば、被験抗ネクチン４抗体）若しくは標識化された基準抗原結合性タンパク質（例えば、基準抗ネクチン４抗体）を保有する細胞の使用を伴う。使用されうる、他の例示的競合的結合アッセイは、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、細胞接着アッセイ（例えば、Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、２００９；５２２：２０３～１０に記載されている）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、又は当業者に公知である、他の競合的結合アッセイを含む。競合的阻害は、被験抗原結合性タンパク質の存在下で、固体表面又は細胞に結合した標識の量を決定することにより測定することができる。通例、被験抗原結合性タンパク質は、過剰量で存在する。競合アッセイ（競合抗体）により同定される抗体は、抗体の、基準抗体と同じエピトープへの結合、及び／又は抗体の、基準抗体が結合するエピトープと、抗体の立体障害が生じる程度に、十分に近位である、隣接するエピトープへの結合を含む。本明細書では、競合的結合を決定するための方法に関するさらなる詳細も記載する。通例、競合する抗体タンパク質が、過剰量で存在する場合、それは、基準抗体の、共通抗原への特異的結合を、少なくとも３０％、例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、又は７５％阻害するであろう。一部の場合には、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はこれを超えて阻害される。
本明細書で使用される、「組み合わせて」という用語の文脈では、他の治療の投与とは、１つを超える治療の使用を指す。「組み合わせて」という用語の使用は、治療を、感染を伴う対象へと投与する順序を制約しない。第１の治療を、第２の治療の投与の前（例えば、１分間、４５分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）に、これと共時的に、又はこの後（例えば、１分間、４５分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に、ネクチン４媒介性疾患を有したか、これを有するか、又はこれに対して感受性である対象へと投与することができる。任意のさらなる治療を、他のさらなる治療と共に、任意の順序で投与することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体を、１又は複数の治療（例えば、本明細書で提供される抗体ではない治療であって、ネクチン４媒介性疾患を防止、処置、管理、及び／又は改善するのに現在投与されている、上記治療）と組み合わせて投与することができる。本明細書で提供される抗体と組み合わせて投与されうる治療の非限定的な例は、鎮痛剤、麻酔剤、抗生剤、又は免疫調節薬剤若しくは米国薬局方及び／又は医師便覧において列挙されている、他の任意の薬剤を含む。
「単離」抗体は、抗体が由来する、細胞供給源若しくは組織供給源、及び／又は他の夾雑物成分に由来する、細胞物質若しくは他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、又は化学合成される場合の、化学的前駆物質若しくは他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という表現は、抗体を、それが単離されるか、又は組換えにより作製される細胞の細胞内成分から分離した、抗体の調製物を含む。したがって、細胞物質を実質的に含まない抗体は、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、又は１％（乾燥重量で）未満の異種タンパク質（本明細書ではまた、「夾雑タンパク質」とも称する）を有する、抗体の調製物を含む。ある特定の実施形態では、抗体を、組換えにより作製する場合、それは、培養培地も実質的に含まない、例えば、培養培地は、タンパク質調製物の容量のうちの、約２０％、１５％、１０％、５％、又は１％未満を表す。ある特定の実施形態では、抗体を、化学合成により作製する場合、それは、化学的前駆物質又は他の化学物質を実質的に含まない、例えば、抗体を、タンパク質の合成に関与する、化学的前駆物質又は他の化学物質から分離する。したがって、このような抗体の調製物は、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、又は１％（乾燥重量で）未満の、目的の抗体以外の化学的前駆物質又は化合物を有する。夾雑物成分はまた、抗体の治療的使用に干渉する物質も含みうるがこれらに限定されず、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性溶質又は非タンパク質性溶質を含みうる。ある特定の実施形態では、抗体を、（１）ローリー方法（Ｌｏｗｒｙら、１９５１、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、１９３：２６５～７５）により決定される通り、抗体の重量で、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％など、９５％を超えるまで、（２）スピニングカップシーケネーターの使用により、Ｎ末端若しくは内部のアミノ酸配列のうちの、少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）クーマシーブルー染色若しくは銀染色を使用する、還元条件又は非還元条件下におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、均一となるまで精製する。抗体の天然環境の、少なくとも１つの成分も存在しないので、単離抗体は、組換え細胞内のｉｎ ｓｉｔｕにおける抗体も含む。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される抗体は、単離抗体である。
４鎖抗体単位とは通例、２つの同一な軽（Ｌ）鎖及び２つの同一な重（Ｈ）鎖から構成される、ヘテロ四量体の糖タンパク質である。ＩｇＧの場合、４鎖単位は一般に、約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖が、１つの共有結合によるジスルフィド結合を介して、Ｈ鎖へと連結されるのに対し、２つのＨ鎖は、互いと、Ｈ鎖のアイソタイプに応じて、１又は複数のジスルフィド結合により連結されている。各Ｈ鎖及びＬ鎖はまた、規則的な間隔を隔てた、鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端において、可変ドメイン（ＶＨ）に続いて、α鎖及びγ鎖の各々については、３つの定常ドメイン（ＣＨ）を有し、μアイソタイプ及びεアイソタイプについては、４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端において、可変ドメイン（ＶＬ）を有し、続いて、その他方の末端において、定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬは、ＶＨと並列し、ＣＬは、重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と並列する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとのインターフェースを形成すると考えられる。ＶＨとＶＬとの対合は、一体となって、単一の抗原結合性部位を形成する。抗体の異なるクラス構造及び特性については、例えば、「免疫学の基礎と臨床（Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」７１（Ｓｔｉｔｅｓら編、８版、１９９４）を参照されたい。
「可変領域」、「可変ドメイン」、「Ｖ領域」、又は「Ｖドメイン」という用語は、抗体の軽鎖又は重鎖の部分であって、軽鎖又は重鎖のアミノ末端に一般に位置し、重鎖内の約１２０～１３０アミノ酸、及び軽鎖内の約１００～１１０アミノ酸の長さを有し、各特定の抗体の、その特定の抗原に対する結合及び特異性において使用される、上記部分を指す。重鎖の可変領域は、「ＶＨ」と称する場合がある。軽鎖の可変領域は、「ＶＬ」と称する場合がある。「可変」という用語は、可変領域の、ある特定のセグメントの配列が、抗体の間で広範に異なるという事実を指す。Ｖ領域は、抗原への結合を媒介し、特定の抗体の、その特定の抗原に対する特異性を規定する。しかし、可変性は、可変領域のうちの、１１０アミノ酸の区間にわたり均等に分配されているわけではない。そうではなくて、Ｖ領域は、各々が、約９～１２アミノ酸長である、「超可変領域」と呼ばれる、可変性の大きな（例えば、極めて可変性の）短い領域により隔てられた、約１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、可変性の小さな（例えば、比較的不変性の）連なりからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、各々が、βシート構造の一部を接続し、場合によって、これを形成するループを形成する、３つの超可変領域により接続された、βシートの立体配置を、大部分が取る、４つのＦＲを含む。各鎖内の超可変領域は、ＦＲにより、近接して、一体に保持され、他の鎖に由来する超可変領域と共に、抗体の抗原結合性部位の形成に寄与する（例えば、Ｋａｂａｔら、「免疫学的対象となるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、（５版、１９９１）を参照されたい）。定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関与せず、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）への、抗体の参与など、多様なエフェクター機能を呈する。可変領域は、配列が、抗体の間で広範に異なる。具体的な実施形態では、可変領域は、ヒト可変領域である。
「Ｋａｂａｔにおける通りの可変領域残基の番号付け」又は「Ｋａｂａｔにおける通りのアミノ酸位置の番号付け」という用語、及びこれらの変化形は、Ｋａｂａｔら、前出における、抗体のコンピレーションによる重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のために使用された番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用すると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮又はこれらへの挿入に対応する、より少数であるか、又は追加のアミノ酸を含有しうる。例えば、重鎖可変ドメインは、残基５２の後における、単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従う、残基５２ａ）と、残基８２の後における、３つの挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔに従う、残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）とを含みうる。Ｋａｂａｔによる残基の番号付けは、所与の抗体について、抗体の配列の、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列との相同性の領域におけるアライメントにより決定することができる。Ｋａｂａｔによる番号付けシステムは一般に、可変ドメイン（軽鎖の残基約１～１０７及び重鎖の残基約１～１１３）（例えば、Ｋａｂａｔら、前出）内の残基に言及する場合に使用される。「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」は一般に、免疫グロブリンの重鎖定常領域内の残基に言及する場合に使用される（例えば、Ｋａｂａｔら、前出において報告されているＥＵインデックス）。「Ｋａｂａｔにおける通りのＥＵインデックス」とは、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基の番号付けを指す。他の番号付けシステムは、例えば、ＡｂＭ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃｏｎｔａｃｔ、ＩＭＧＴ、及びＡＨｏｎにより記載されており、当業者により十分に理解されている。
「インタクトな」抗体とは、抗原結合性部位のほか、ＣＬと、少なくとも重鎖定常領域である、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３とを含む抗体である。定常領域は、ヒト定常領域、又はそれらのアミノ酸配列変異体を含みうる。ある特定の実施形態では、インタクトな抗体は、１又は複数のエフェクター機能を有する。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の抗原結合性領域又は可変領域など、インタクトな抗体の部分を含む。抗体断片の例は、限定なしに述べると、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディー及びジダイアボディー（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０：６４４４～４８；Ｌｕら、２００５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８０：１９６６５～７２；Ｈｕｄｓｏｎら、２００３、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、９：１２９～３４；ＷＯ９３／１１１６１号；及び米国特許第５，８３７，２４２号及び同第６，４９２，１２３号を参照されたい）；単鎖抗体分子（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号；同第５，２６０，２０３号；同第５，４８２，８５８号；及び同第５，４７６，７８６号を参照されたい）；二重可変ドメイン抗体（例えば、米国特許第７，６１２，１８１号を参照されたい）；単一可変ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、Ｗｏｏｌｖｅｎら、１９９９、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、５０：９８～１０１；及びＳｔｒｅｌｔｓｏｖら、２００４、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．、１０１：１２４４４～４９を参照されたい）；並びに抗体断片から形成された多特異性抗体を含む。
治療用抗体の「機能的断片」、「結合性断片」、又は「抗原結合性断片」は、インタクトな抗体へと帰せられる生物学的機能の一部又は全部ではなくとも、少なくとも１つの機能である、少なくとも標的抗原への結合を含む機能を呈するであろう（例えば、ネクチン４結合性断片又はネクチン４に結合する断片）。
本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、抗体のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド又は異種タンパク質のアミノ酸配列（例えば、通常は抗体の一部ではないポリペプチド又はタンパク質（例えば、非抗ネクチン４抗原結合性抗体））とを含むポリペプチドを指す。ネクチン４又は抗ネクチン４抗体に関して使用される場合の、「融合」という用語は、ペプチド若しくはポリペプチド、又はその断片、変異体、及び／若しくは誘導体の、異種ペプチド又はポリペプチドとの接合を指す。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ネクチン４又は抗ネクチン４抗体の生物学的活性を保持する。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ネクチン４抗体のＶＨ領域、ＶＬ領域、ＶＨ ＣＤＲ（１つ、２つ、又は３つのＶＨ ＣＤＲ）、及び／又はＶＬ ＣＤＲ（１つ、２つ、又は３つのＶＬ ＣＤＲ）を含み、この場合、融合タンパク質は、ネクチン４エピトープ、ネクチン４断片、及び／又はネクチン４ポリペプチドに結合する。
抗体に言及して使用される場合の「重鎖」という用語は、約５０～７０ｋＤａのポリペプチド鎖を指し、この場合、アミノ末端部分は、約１２０～１３０又はこれを超えるアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分は、定常領域を含む。定常領域は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づき、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、及びミュー（μ）と称する、５つの別個の種類（例えば、アイソタイプ）のうちの１つでありうる。別個の重鎖は、サイズが異なる：α、δ、及びγが、約４５０アミノ酸を含有するのに対し、μ及びεは、約５５０アミノ酸を含有する。軽鎖と組み合わされると、これらの別個の種類の重鎖は、それぞれ、抗体の、５つの周知のクラス（例えば、アイソタイプ）である、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであって、ＩｇＧの４つのサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む上記クラスをもたらす。重鎖は、ヒト重鎖でありうる。
抗体に言及して使用される場合の「軽鎖」という用語は、約２５ｋＤａのポリペプチド鎖を指し、この場合、アミノ末端部分は、約１００～約１１０又はこれを超えるアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分は、定常領域を含む。軽鎖の近似的な長さは、２１１～２１７アミノ酸である。定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）又はラムダ（λ）と称する、２つの別個の種類が存在する。当技術分野では、軽鎖アミノ酸配列が周知である。軽鎖は、ヒト軽鎖でありうる。
本明細書で使用される「宿主」という用語は、哺乳動物（例えば、ヒト）などの動物を指す。
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、核酸分子をトランスフェクトされうる特定の対象細胞と、このような細胞の後代又は潜在的な後代とを指す。このような細胞の後代は、後続する世代において生じうる突然変異若しくは環境の影響、又は核酸分子の、宿主細胞ゲノムへの組込みに起因して、核酸分子をトランスフェクトされた親細胞と同一ではありえない。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、例えば、個々の抗体を含む集団は、少量で存在しうる、可能な、天然に存在する突然変異を除き、同一であり、各モノクローナル抗体は典型的に、抗原上の、単一のエピトープを認識するであろう。具体的な実施形態では、本明細書で使用される「モノクローナル抗体」は、単一のハイブリドーマ又は他の細胞により産生される抗体であり、この場合、抗体は、例えば、当技術分野で公知の、ＥＬＩＳＡ又は他の抗原結合アッセイ又は競合的結合アッセイにより決定される通り、ネクチン４エピトープだけに結合する。「モノクローナル」という用語は、抗体を作るための、任意の特定の方法に限定されない。例えば、本開示において有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５により最初に記載されたハイブリドーマ方法により調製することもでき、細菌細胞又は真核動物細胞又は植物細胞内の組換えＤＮＡ方法を使用して調製することもできる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４～２８；及びＭａｒｋｓら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１～９７において記載されている技法を使用して、ファージ抗体ライブラリーからも単離することができる。当技術分野では、クローン細胞系、及びこれにより発現させるモノクローナル抗体を調製するための他の方法が周知である。例えば、「分子生物学における簡易プロトコール（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ａｕｓｕｂｅｌら編、５版、２００２）を参照されたい。モノクローナル抗体を作製する例示的方法は、本明細書の実施例に提供する。
核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞など、生物学的材料との関連で使用される場合の「天然」という用語は、天然において見出され、人為による操作、改変、及び／又は変化（例えば、単離、精製、選択）がなされていない生物学的材料を指す。
本明細書で提供される抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の部分が、特定の種に由来する抗体内、又は特定の抗体クラス若しくは抗体サブクラスに属する抗体内の、対応する配列と同一又は相同である一方、鎖（単数又は複数）の残りの部分は、別の種に由来する抗体内、又は別の抗体クラス若しくは抗体サブクラスに属する抗体内の、対応する配列と同一又は相同である、「キメラ」抗体のほか、所望の生物学的活性を呈する限りにおいて、このような抗体の断片（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８１：６８５１～６８５５（１９８４）を参照されたい）も含みうる。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、天然ＣＤＲの残基を、マウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類など、非ヒト種（ドナー抗体）の、対応するＣＤＲであって、所望の特異性、アフィニティー、及び能力を有する、上記ＣＤＲに由来する残基により置きかえた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む、キメラ抗体である。一部の場合には、ヒト免疫グロブリンの、１又は複数のＦＲ領域の残基を、対応する非ヒト残基により置きかえる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体内でも、ドナー抗体内でも見出されない残基も含みうる。抗体の効能をさらに精緻化するように、これらの修飾を施すことができる。ヒト化抗体の重鎖又は軽鎖は、少なくとも１つ又はこれを超える可変領域の実質的に全てを含むことが可能であり、この場合、ＣＤＲの全て又は実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲの全て又は実質的に全てに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲの全て又は実質的に全てである。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）のうちの少なくとも一部、典型的に、ヒト免疫グロブリンのＦｃのうちの少なくとも一部を含むであろう。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２～２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３～２９；Ｐｒｅｓｔａ、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３～９６；Ｃａｒｔｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５～８９；米国特許第６，８００，７３８号；同第６，７１９，９７１号；同第６，６３９，０５５号；同第６，４０７，２１３号；及び同第６，０５４，２９７号を参照されたい。
「ヒト抗体」とは、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列、及び／又は本明細書で開示される、ヒト抗体を作るための技法のうちのいずれかを使用して作られた抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体である。ヒト抗体のこの定義はとりわけ、非ヒト抗原結合性残基を含むヒト化抗体を除外する。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の、多様な技法であって、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１）及び酵母ディスプレイライブラリー（Ｃｈａｏら、２００６、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１：７５５～６８）を含む技法を使用して作製することができる。Ｃｏｌｅら、「モノクローナル抗体とがん治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」、７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６～９５；及びｖａｎ Ｄｉｊｋ及びｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、２００１、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５：３６８～７４において記載されている方法もまた、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用可能である。ヒト抗体は、抗原投与に応答して、このような抗体を産生するように改変されているが、それらの内因性の遺伝子座を失効化させたトランスジェニック動物、例えば、トランスジェニックマウスへと、抗原を投与することにより調製することができる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関しては、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、６（５）：５６１～６６；Ｂｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ及びＴａｕｓｓｉｎｇ、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８（４）：４５５～５８；並びに米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して作出されるヒト抗体に関しては、例えば、Ｌｉら、２００６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：３５５７～６２もまた参照されたい。
「ＣＤＲ」とは、免疫グロブリン（Ｉｇ又は抗体）ＶＨのβ－シートフレームワーク、非フレームワーク領域内の、３つの超可変領域（Ｈ１、Ｈ２又はＨ３）のうちの１つ、又は抗体ＶＬのβ－シートフレームワーク、非フレームワーク領域内の、３つの超可変領域（Ｌ１、Ｌ２又はＬ３）のうちの１つを指す。したがって、ＣＤＲとは、フレームワーク領域配列内に散在した可変領域配列である。ＣＤＲ領域は、当業者に周知であり、例えば、Ｋａｂａｔにより、抗体可変（Ｖ）ドメイン内の最も超可変性の領域として規定されている（Ｋａｂａｔら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５２：６６０９～１６；Ｋａｂａｔ、１９７８、Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．、３２：１～７５）。ＣＤＲ領域の配列はまた、Ｃｈｏｔｈｉａにより、保存的β－シートフレームワークの一部ではなく、したがって、異なるコンフォメーションに適合することが可能な残基として、構造的にも規定されている（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１～１７）。当技術分野では、いずれの用語法も、十分に認知されている。ＣＤＲ領域の配列はまた、ＡｂＭ、Ｃｏｎｔａｃｔ、及びＩＭＧＴによっても規定されている。カノニカルな抗体可変領域内のＣＤＲの位置は、多数の構造の比較により決定されている（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７３：９２７～４８；Ｍｏｒｅａら、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０：２６７～７９）。超可変領域内の残基の数は、異なる抗体内で変動するため、カノニカルな位置と比べたさらなる残基は、従来、カノニカルな可変領域番号付けスキームにおける残基番号の隣に、ａ、ｂ、ｃなどを伴って番号付けされている（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、前出）。このような命名法も同様に、当業者に周知である。
本明細書で使用される場合の「超可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」という用語は、抗体の可変領域のうちの、配列が超可変性であり、且つ／又は構造的に規定されたループを形成する領域を指す。一般に、抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）内の３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）内の３つである、６つの超可変領域を含む。いくつかの超可変領域の画定が使用されており、本明細書にも包含される。Ｋａｂａｔにより相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の可変性に基づき、最も一般に使用されている（例えば、Ｋａｂａｔら、前出を参照されたい）。代わって、Ｃｈｏｔｈｉａは、構造的ループの位置に言及する（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１～１７を参照されたい）。Ｋａｂａｔによる番号付け慣例法を使用して番号付けされる場合の、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１ループの末端は、ループの長さに応じて、Ｈ３２～Ｈ３４の間で変動する（これは、Ｋａｂａｔによる番号付けスキームが、Ｈ３５Ａ及びＨ３５Ｂに、挿入を配置するためであり；３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループは、３２で終わり；３５Ａだけが存在する場合、ループは、３３で終わり；３５Ａ及び３５Ｂのいずれもが存在する場合、ループは、３４で終わる）。ＡｂＭによる超可変領域は、ＫａｂａｔによるＣＤＲと、Ｃｈｏｔｈｉａによる構造的ループとの折衷を表し、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ製のＡｂＭ抗体モデル化ソフトウェアにより使用されている（例えば、「抗体の操作（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」２巻（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｂｅｌ編、２版、２０１０）を参照されたい）。「Ｃｏｎｔａｃｔ」超可変領域は、利用可能な複合体結晶構造の解析に基づく。これらの超可変領域又はＣＤＲの各々に由来する残基については、下記で言及する。
近年、ユニバーサルの番号付けシステムである、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（登録商標）が開発され、広く採用されている（Ｌａｆｒａｎｃら、２００３、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２７（１）：５５～７７）。ＩＭＧＴとは、ヒト及び他の脊椎動物の、免疫グロブリン（ＩＧ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に特化した、統合型情報システムである。本明細書では、軽鎖内又は重鎖内の、アミノ酸配列及び位置の両方に関して、ＣＤＲに言及する。免疫グロブリン可変ドメインの構造内のＣＤＲの「位置」は、種間で保存されており、ループと呼ばれる構造内に存在するので、構造特徴に従い、可変ドメイン配列をアライメントする番号付けシステムを使用することにより、ＣＤＲ残基及びフレームワーク残基は、たやすく同定される。この情報は、１つの種の免疫グロブリンに由来するＣＤＲ残基の、典型的に、ヒト抗体に由来するアクセプターフレームワークへのグラフティング及び置きかえにおいて使用することができる。さらなる番号付けシステム（ＡＨｏｎ）が、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、２００１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、３０９：６５７～７０により開発されている。当業者には、例えば、Ｋａｂａｔによる番号付けシステム及びＩＭＧＴ固有の番号付けシステムを含む、番号付けシステム間の照応が周知である（例えば、Ｋａｂａｔ、前出；Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、前出；Ｍａｒｔｉｎ、前出；Ｌｅｆｒａｎｃら、前出を参照されたい）。
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超可変領域は、以下：ＶＬ内の２４～３６又は２４～３４（Ｌ１）、４６～５６又は５０～５６（Ｌ２）、及び８９～９７又は８９～９６（Ｌ３）、並びにＶＨ内の２６～３５又は２６～３５Ａ（Ｈ１）、５０～６５又は４９～６５（Ｈ２）、及び９３～１０２、９４～１０２、又は９５～１０２（Ｈ３）の通りの「拡張超可変領域」を含みうる。本明細書で使用される、「ＨＶＲ」及び「ＣＤＲ」という用語は、互換的に使用される。
「定常領域」又は「定常ドメイン」という用語は、軽鎖及び重鎖のカルボキシ末端部分であって、抗体の抗原への結合に直接関与せず、多様なエフェクター機能など、Ｆｃ受容体との相互作用を呈する、上記カルボキシ末端部分を指す。用語は、抗原結合性部位を含有する可変領域である、免疫グロブリンの他の部分と比べて、より保存的なアミノ酸配列を有する、免疫グロブリン分子の部分を指す。定常領域は、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域と、軽鎖のＣＬ領域とを含有しうる。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」という用語は、ＣＤＲを挟む可変領域残基を指す。ＦＲ残基は、例えば、キメラ抗体内、ヒト化抗体内、ヒト抗体内、ドメイン抗体内、ダイアボディー内、直鎖状抗体内、及び二特異性抗体内に存在する。ＦＲ残基は、超可変領域残基又はＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
「アフィニティー成熟」抗体とは、１又は複数のそのＨＶＲ内に、１又は複数の変更（例えば、変化、付加、及び／又は欠失を含む、アミノ酸配列の変化形）であって、抗原に対する抗体のアフィニティーの、これらの変更（単数又は複数）を有さない親抗体と比較した改善を結果としてもたらす、上記変更を伴う抗体である。アフィニティー成熟抗体は、標的抗原に対する、ナノモル単位、なお又はピコモル単位のアフィニティーを有しうる。アフィニティー成熟抗体を、当技術分野で公知の手順により作製する。総説については、Ｈｕｄｓｏｎ及びＳｏｕｒｉａｕ、２００３、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、９：１２９～３４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３：１１０５～１６；Ｑｕｉｒｏｚ及びＳｉｎｃｌａｉｒ、２０１０、Ｒｅｖｉｓｔａ Ｉｎｇｅｎｅｒｉａ Ｂｉｏｍｅｄｉａ、４：３９～５１を参照されたい。
「結合アフィニティー」とは一般に、分子（例えば、抗体などの結合性タンパク質）の単一の結合性部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との非共有結合的相互作用の総計の強度を指す。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書で使用される「結合アフィニティー」とは、結合対のメンバーの間（例えば、抗体と抗原との間）の１：１の相互作用を反映する、内在的な結合アフィニティーを指す。結合性分子Ｘの、その結合パートナーＹに対するアフィニティーは一般に、解離定数（ＫＤ）により表すことができる。アフィニティーは、当該技術分野で公知の、一般的な方法であって、本明細書で記載される方法を含む上記方法により測定することができる。低アフィニティー抗体が一般に、抗原に、ゆっくりと結合し、且つ、たやすく解離する傾向があるのに対し、高アフィニティー抗体は一般に、抗原にすばやく結合し、且つ、長く結合を維持する傾向がある。当技術分野では、結合アフィニティーを測定する、様々な方法が公知であり、これらのうちのいずれも、本開示の目的で使用することができる。具体的な例示的実施形態は、以下を含む。一実施形態では、「ＫＤ」又は「ＫＤ値」は、当技術分野で公知のアッセイにより、例えば、結合アッセイにより測定することができる。ＫＤは、例えば、目的の抗体のＦａｂ変化形及びその抗原により実施されるＲＩＡにおいて測定することができる（Ｃｈｅｎら、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２９３：８６５～８１）。ＫＤ又はＫＤ値はまた、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－２０００又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－３０００を使用するＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）による表面プラズモン共鳴アッセイを使用することにより測定することもでき、例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫ３８４システムを使用するＢＬＩ（ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）により測定することもできる。「オン速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」もまた、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－２０００若しくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－３０００、又はＯｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫ３８４システムを使用する、上記で記載した、同じ表面プラズモン共鳴法又はＢＬＩ（ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）法により決定することができる。
「実質的に同様な」又は「実質的に同じ」という語句は、当業者が、値（例えば、ＫＤ値）により測定される生物学的特徴の文脈で、２つの値、又は２つの画像の間の差違を、生物学的有意性及び／又は統計学的有意性が、ほとんどないか、又はないと考えるように、２つの数値、又は２つの画像（例えば、本開示の抗体と関連する１つの画像、及び基準抗体と関連する他の画像）からのシグナル（例えば、ＩＨＣ染色シグナル）の間の、十分に高度な類似性を表す。例えば、２つの値の間の差違は、基準抗体についての値の関数として、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、又は約５％未満でありうる。
本明細書で使用される、「実質的に増大した」、「実質的に低減された」、又は「実質的に異なる」という語句は、当業者が、値により測定される生物学的特徴の文脈で、２つの値又は２つの画像の間の差違を、統計学的有意性があると考えるように、２つの数値、又は２つの画像（例えば、本開示の抗体と関連する１つの画像、及び基準抗体と関連する他の画像）からのシグナル（例えば、ＩＨＣ染色シグナル）の間の、十分に高度な差違を表す。例えば、前記２つの値の間の差違は、基準抗体についての値の関数として、約１０％を超える、約２０％を超える、約３０％を超える、約４０％を超える、又は約５０％を超える差違でありうる。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（例えば、天然配列のＦｃ領域又はアミノ酸配列変異体のＦｃ領域）に帰せられる生物学的活性を指し、抗体のアイソタイプと共に変動する。抗体のエフェクター機能の例は、Ｃ１ｑへの結合；ＣＤＣ；Ｆｃ受容体への結合；ＡＤＣＣ；食作用；及びＢ細胞活性化を含む。
本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の転帰を結果としてもたらすのに十分な量の、本明細書で提供される抗体又は医薬組成物を指す。
本明細書では、「Ｆｃ領域」という用語を、天然配列のＦｃ領域、組換えＦｃ領域、及び変異Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するように使用する。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界部は、変動しうるであろうが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通例、そのＣｙｓ２２６位又はＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基から、カルボキシル末端へと連なると規定されることが多い。Ｆｃ領域の、Ｃ末端のリシン（ＥＵ番号付けシステムに従う残基４４７）は、例えば、抗体の作製時又は精製時に除去することもでき、抗体の重鎖をコードする核酸を、組換えにより操作することにより除去することもできる。したがって、インタクトな抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基を除去した抗体集団、Ｋ４４７残基を除去していない抗体集団、及びＫ４４７残基を伴う抗体と、Ｋ４４７残基を伴わない抗体との混合物を有する抗体集団を含みうる。
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列のＦｃ領域の「エフェクター機能」を保有する。例示的「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑへの結合；ＣＤＣ；Ｆｃ受容体への結合；ＡＤＣＣ；食作用などを含む。このようなエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ領域を、結合性領域又は結合性ドメイン（例えば、抗体の可変領域又は可変ドメイン）と組み合わせることを要求し、開示される多様なアッセイを使用して評価することができる。
「天然配列のＦｃ領域」は、天然において見出され、人為による操作、改変、及び／又は変化（例えば、単離、精製、選択すること、可変領域の配列など、他の配列を含むこと、又はこれらと組み合わせること）がなされていないＦｃ領域のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を含む。天然配列のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、天然配列のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非Ａアロタイプ及びＡアロタイプ）；天然配列のヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域と；天然配列のヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のほか、これらの天然に存在する変異体を含む。例えば、天然のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ酸配列を、下記（配列番号３５）に提示する。
「変異体のＦｃ領域」は、少なくとも１カ所のアミノ酸修飾（例えば、置換、付加、又は欠失）により、天然配列のＦｃ領域のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、変異体のＦｃ領域は、天然配列のＦｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した、少なくとも１カ所のアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域内又は親ポリペプチドのＦｃ領域内の、約１～約１０カ所のアミノ酸置換、又は約１～約５カ所のアミノ酸置換を有する。本明細書の変異体のＦｃ領域は、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域との、少なくとも約８０％の相同性、又はこれらとの、少なくとも約９０％の相同性、例えば、これらとの、少なくとも約９５％相同性を有しうる。
ネクチン４又は抗ネクチン４抗体に関して使用される場合の「変異体」という用語は、天然配列又は非修飾配列と比較して、１カ所又は複数カ所の（例えば、約１～約２５、約１～約２０、約１～約１５、約１～約１０、又は約１～約５カ所などの）アミノ酸配列の置換、欠失、及び／又は付加を含むペプチド又はポリペプチドを指す場合がある。例えば、ネクチン４の変異体は、天然のネクチン４のアミノ酸配列に対する、１カ所又は複数カ所の（例えば、約１～約２５、約１～約２０、約１～約１５、約１～約１０、又は約１～約５カ所などの）変化の結果として得ることができる。これもまた、例を目的として述べると、抗ネクチン４抗体の変異体は、天然の抗ネクチン４抗体又はあらかじめ修飾されていない抗ネクチン４抗体のアミノ酸配列に対する、１カ所又は複数カ所の（例えば、約１～約２５、約１～約２０、約１～約１５、約１～約１０、又は約１～約５カ所などの）変化の結果として得ることができる。変異体は、対立遺伝子変異体又はスプライス変異体など、天然に存在する場合もあり、人工的に構築される場合もある。ポリペプチド変異体は、変異体をコードする、対応する核酸分子から調製することができる。具体的な実施形態では、ネクチン４の変異体又は抗ネクチン４抗体の変異体は、基準抗体と比較した、ネクチン４への特異的結合を、少なくとも保持する。ある特定の実施形態では、変異体は、ネクチン４、或いは抗ネクチン４抗体のＶＨ領域若しくはＶＬ領域、又は１又は複数のＣＤＲなどの部分領域をコードする核酸分子の一塩基多型（ＳＮＰ）変異体によりコードされる。
「ベクター」という用語は、例えば、核酸配列を、宿主細胞へと導入するために、本明細書で記載される抗ネクチン４抗体をコードする核酸配列を含む核酸配列を保有するか、又はこれを組み入れるのに使用される物質を指す。使用のために適用可能なベクターは、例えば、宿主細胞の染色体への安定的な組込みのために作動可能な、選択配列又はマーカーを含みうる、発現ベクター、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソーム、及び人工的染色体を含む。加えて、ベクターは、１又は複数の選択用マーカー遺伝子と、適切な発現制御配列と、を含みうる。組み入れられうる選択用マーカー遺伝子は、例えば、抗生剤又は毒素に対する耐性をもたらすか、栄養要求性欠損を補完するか、又は培養培地中に存在しない、極めて重要な栄養物質を供給する。発現制御配列は、当技術分野で周知である、構成的プロモーター及び誘導可能なプロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含みうる。２つ又はこれを超える核酸分子を共発現させる（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の両方、又は抗体のＶＨ及びＶＬの両方）場合、両方の核酸分子を、例えば、単一の発現ベクターへと挿入することもでき、個別の発現ベクター内に挿入することもできる。単一のベクターによる発現のために、コード核酸を、１つの共通の発現制御配列へと任意選択で連結することもでき、１つの誘導可能なプロモーター、及び１つの構成的プロモーターなど、異なる発現制御配列へと連結することもできる。核酸分子の、宿主細胞への導入は、当技術分野で周知の方法を使用して確認することができる。このような方法は、例えば、ノーザンブロット若しくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるｍＲＮＡの増幅などの核酸解析、遺伝子産物の発現についての免疫ブロット、又は導入された核酸配列又はその対応する遺伝子産物の発現について調べるのに適する他の解析方法を含む。当業者により、核酸分子を、所望の産物（例えば、本明細書で記載される抗ネクチン４抗体）をもたらすのに十分な量で発現させることが理解され、当技術分野で周知の方法を使用して、十分な発現を得るように、発現レベルを最適化しうることが、さらに理解される。
ネクチン４ポリペプチドの「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」とは、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを本質的に含まない、ネクチン４ポリペプチドの形態を指す。例えば、ネクチン４ポリペプチドＥＣＤは、このような膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインのうちの１％未満を有することが可能であり、このようなドメインのうちの０．５％未満を有しうる。
「同一性」という用語は、配列をアライメントし、比較することにより決定される、２つ若しくはこれを超えるポリペプチド分子、又は２つ若しくはこれを超える核酸分子の配列の間の関係を指す。基準ポリペプチド配列との関係における「アミノ酸配列の同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントし、必要な場合、最大の配列同一性パーセントを達成するように、ギャップを導入し、保存的置換を、配列同一性の一部として考慮せずにおいた後における、基準ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一な、候補配列内のアミノ酸残基の百分率として規定される。アミノ酸配列の同一性パーセントを決定することを目的とするアライメントは、当技術分野の範囲内にある多様な方途により、例えば、ＢＬＡＳＴソフトウェア、ＢＬＡＳＴ－２ソフトウェア、ＡＬＩＧＮソフトウェア、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｉｎｃ．）ソフトウェアなど、一般に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、配列をアライメントするのに適切なパラメーターであって、比較される配列の全長にわたり、最大のアライメントを達成するのに必要とされる、任意のアルゴリズムを含むパラメーターを決定することができる。
アミノ酸残基／位置の「修飾」とは、一次アミノ酸配列の、出発アミノ酸配列と比較した変化を指し、この場合、変化は、前記アミノ酸残基／位置を伴う、配列の変更の結果から生じる。例えば、典型的な修飾は、残基の、別のアミノ酸による置換（例えば、保存的置換又は非保存的置換）、前記残基／位置に隣接する、１若しくは複数の（例えば、一般に、５つ、４つ、又は３つより少ない）アミノ酸の挿入、及び／又は前記残基／位置の欠失を含む。
「エピトープ」とは、単一の抗体分子が結合する、抗原分子の表面上の部位であって、抗体の、１又は複数の抗原結合性領域に結合することが可能であり、哺乳動物（例えば、ヒト）などの動物において、抗原性又は免疫原性活性を有し、免疫応答を誘発することが可能な、ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチド断片など、抗原の表面上の局在化領域などの、上記部位である。免疫原活性を有するエピトープは、動物において抗体応答を誘発する、ポリペプチドの部分である。抗原活性を有するエピトープは、例えば、イムノアッセイを含む、当技術分野で周知である、任意の方法により決定される通り、抗体が結合するポリペプチドの部分である。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。エピトープは、アミノ酸又は糖側鎖など、化学的活性表面の分子の群分けからなることが多く、特異的三次元構造特徴のほか、特異的電荷特徴を有する。抗体のエピトープは、直鎖状エピトープの場合もあり、コンフォメーションエピトープの場合もある。直鎖状エピトープは、タンパク質内のアミノ酸の連続する配列により形成される。コンフォメーションエピトープは、タンパク質が、その三次元構造へとフォールディングすると、一体となる、タンパク質配列内の、不連続なアミノ酸から形成される。誘導型エピトープは、別のタンパク質又はリガンドの活性化又は結合の後など、タンパク質の三次元構造が、変更されたコンフォメーションにある場合に形成される。ある特定の実施形態では、ネクチン４エピトープは、ネクチン４ポリペプチドの三次元表面特徴である。他の実施形態では、ネクチン４エピトープは、ネクチン４ポリペプチドの直鎖状特徴である。一般に、抗原は、いくつかのエピトープ又は多くの異なるエピトープを有し、多くの異なる抗体と反応しうる。
２つの抗体が、三次元空間内の、同一であるか、重複するか、又は隣接するエピトープを認識する場合に、抗体は、「エピトープ」、基準抗体と「本質的に同じエピトープ」、又は「同じエピトープ」に結合する。２つの抗体が、三次元空間内の、同一であるか、重複するか、又は隣接するエピトープに結合するのかどうかを決定するための、最も広く使用され、且つ、迅速な方法は、例えば、標識化された抗原又は標識化された抗体を使用して、いくつかの異なるフォーマットで構成されうる、競合アッセイである。一部のアッセイでは、抗原を、９６ウェルプレート上に固定化するか、又は細胞表面上に発現させ、放射性標識、蛍光標識、又は酵素標識を使用して、標識化されていない抗体が、標識化された抗体の結合を遮断する能力を測定する。
「エピトープマッピング」とは、それらの標的抗原上の、抗体の結合性部位又はエピトープを同定する工程である。「エピトープビニング」とは、それらが認識するエピトープに基づき、抗体を群分けする工程である。より特定すると、エピトープビニングは、抗体を、それらのエピトープ認識特性に基づきクラスター化し、顕著に異なる結合特異性を有する抗体を同定するための、コンピューターによる工程と組み合わせて、競合アッセイを使用して、異なる抗体のエピトープ認識特性を区別するための方法及びシステムを含む。
本明細書で使用される「担体」は、用いられる用量及び濃度で、それらへと曝露される細胞又は哺乳動物に非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤を含む。生理学的に許容される担体は、水性のｐＨ緩衝液であることが多い。生理学的に許容される担体の例は、リン酸、クエン酸、ヒスチジン、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量の（約１０アミノ酸残基より少ない）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及び、グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む、他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤を含む。「担体」という用語はまた、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントのアジュバント（完全又は不完全））、賦形剤、又は媒体も指す場合がある。医薬担体を含む、このような担体は、水、石油、動物油、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油など、植物由来又は合成由来の油を含む油などの滅菌液体でありうる。水は、組成物（例えば、医薬組成物）を、静脈内投与する場合の、例示的担体である。生理食塩液及びデキストロース水溶液及びグリセロール溶液もまた、特に、注射用液のための液体担体として用いることができる。適切な賦形剤（例えば、医薬の賦形剤）は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、オオムギ、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。所望の場合、組成物はまた、少量の保湿剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含有しうる。組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、持続放出製剤などの形態を取りうる。経口製剤を含む経口組成物は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの、標準的な担体を含みうる。適切な医薬担体の例については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ及びＧｅｎｎａｒｏ、「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、（１８版、１９９０）において記載されている。医薬化合物を含む組成物は、単離形態又は精製された形態の抗ネクチン４抗体を、例えば、適量の担体と併せて含有しうる。
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、動物、及び、より特定すると、ヒトにおける使用について、米国連邦政府若しくは米国州政府の規制機関により承認されているか、又は米国薬局方、欧州薬局方、若しくは他の一般に認知された薬局方において列挙されていることを意味する。
本明細書で使用される「ポリクローナル抗体」とは、多くのエピトープを有するタンパク質に対する免疫原性応答により作出される抗体集団を指し、したがって、タンパク質内の、同じエピトープ又は異なるエピトープを指向する、様々な異なる抗体を含む。当技術分野では、ポリクローナル抗体を作製するための方法が公知である（例えば、「分子生物学における簡易プロトコール（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ａｕｓｕｂｅｌら編、５版、２００２）を参照されたい）。
「単離核酸」とは、核酸、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は他のゲノムＤＮＡ配列のほか、タンパク質、又は天然では、天然配列に付随する、リボソーム及びポリメラーゼなどの複合体から実質的に分離された混合核酸である。「単離」核酸分子は、核酸分子の天然供給源中に存在する、他の核酸分子から分離された核酸分子である。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離」核酸分子は、組換え技法により作製される場合の、他の細胞物質若しくは培養培地、又は化学合成される場合の、化学的前駆物質又は他の化学物質を、実質的に含まない場合がある。具体的な実施形態では、本明細書で記載される抗体をコードする、１又は複数の核酸分子は、単離又は精製されている。用語は、それらの天然に存在する環境から除去された核酸配列を包含し、組換え単離物、又はクローニングされたＤＮＡ単離物、及び化学合成された類似体、又は異種系により、生物学的に合成された類似体を含む。実質的に純粋な分子は、分子の単離形態を含みうる。
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド若しくは修飾塩基、及び／又はこれらの類似体、或いはＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼにより、ポリマーへと組み込まれる場合もあり、合成反応によりポリマーへと組み込まれる場合もある、任意の基質でありうる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含みうる。本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、一般に、約２００ヌクレオチド未満であるが、必ずしもそうではない長さの、短鎖であり、一般に、一本鎖である、合成ポリヌクレオチド、を指す。「オリゴヌクレオチド」という用語と、「ポリヌクレオチド」という用語は、互いに排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の記載は、オリゴヌクレオチドに対しても、同等、且つ、完全に適用可能である。本開示の抗ネクチン４抗体を産生する細胞は、親ハイブリドーマ細胞のほか、抗体をコードする核酸を導入した、細菌宿主細胞及び真核宿主細胞を含みうる。適切な宿主細胞については、下記に開示する。
そうでないことが指定されない限り、本明細書で開示される、任意の一本鎖のポリヌクレオチド配列の左手末端は、５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向を、５’方向と称する。新生ＲＮＡ転写物の、５’から３’への付加方向を、転写方向と称し；ＲＮＡ転写物の５’側から５’末端であるＲＮＡ転写物と同じ配列を有する、ＤＮＡ鎖上の配列領域を、「上流の配列」と称し；ＲＮＡ転写物の３’側から３’末端であるＲＮＡ転写物と同じ配列を有する、ＤＮＡ鎖上の配列領域を、「下流の配列」と称する。
「組換え抗体」という用語は、組換え手段により、調製されるか、発現させるか、創出されるか、又は単離された抗体を指す。組換え抗体は、宿主細胞にトランスフェクトするための組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体、組換え、コンビナトリアルの、抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子について、トランスジェニック及び／又はトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウス又はウシ）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒら、１９９２、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０：６２８７～６２９５を参照されたい）、又は免疫グロブリン遺伝子配列の、他のＤＮＡ配列に照らしたスプライシングを伴う、他の任意の手段により、調製されるか、発現させるか、創出されるか、又は単離された抗体でありうる。このような組換え抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を含む可変領域及び定常領域（Ｋａｂａｔら、前出を参照されたい）を有しうる。しかし、ある特定の実施形態では、このような組換え抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックである動物を使用する場合は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける体細胞突然変異誘発）にかけうるので、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ配列及びＶＬ配列に由来し、これらと類縁であるが、ｉｎ ｖｉｖｏのヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内には、天然で存在しえない配列である。
「対象」及び「患者」という用語は、互換的に使用することができる。本明細書で使用された、ある特定の実施形態では、対象は、非霊長動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）又は霊長動物（例えば、サル又はヒト）などの哺乳動物である。具体的な実施形態では、対象は、ヒトである。一実施形態では、対象は、本明細書で提供される状態又は障害を伴うと診断された哺乳動物、例えば、ヒトである。別の実施形態では、対象は、本明細書で提供される状態又は障害を発症する危険性がある哺乳動物、例えば、ヒトである。
「実質的に全ての」とは、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％を指す。
「検出用プローブ」という用語は、検出可能なシグナルをもたらす組成物を指す。用語は、限定なしに述べると、その活性を介して、検出可能なシグナルをもたらすものなど、任意のフルオロフォア、発色団、放射性標識、酵素、抗体又は抗体断片を含む。
「検出剤」という用語は、試料又は対象における、本明細書で記載される抗ネクチン４抗体など、所望の分子の存在（ｅｘｓｉｓｔｅｎｃｅ又はｐｒｅｓｅｎｃｅ）を確認するのに使用されうる物質を指す。検出剤は、視覚化することが可能な物質、又は他の形で決定及び／若しくは測定する（例えば、定量化により）ことが可能な物質でありうる。
「診断剤」という用語は、対象へと投与される物質であって、疾患、障害、又は状態の診断の一助となる、上記物質を指す。このような物質を使用して、疾患を引き起こす過程の局在化を明らかにし、特定し、且つ／又は規定することができる。ある特定の実施形態では、診断剤は、単独で、又は物質とコンジュゲートさせ、対象へと投与するか、又は対象に由来する試料と接触させると、ネクチン４媒介性疾患の診断の一助となる、本明細書で記載される抗ネクチン４抗体又はその断片を含む。
核酸分子に言及して使用される場合の「コード核酸」という用語又はその文法的同等物は、その天然状態において、又は当業者に周知の方法により操作された場合に、ｍＲＮＡをもたらすように転写され、次いで、ポリペプチド及び／又はその断片へと翻訳されうる核酸分子を指す。アンチセンス鎖とは、このような核酸分子の相補体であり、コード配列を、これから導くことができる。
「賦形剤」という用語は、一般に、希釈剤、媒体、防腐剤、結合剤、又は安定化剤として使用される不活性物質を指し、タンパク質（例えば、血清アルブミンなど）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、グリシン、ヒスチジンなど）、脂肪酸及びリン脂質（例えば、スルホン酸アルキル、カプリラートなど）、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、ポリソルバート、非イオン界面活性剤など）、糖（例えば、スクロース、マルトース、トレハロースなど）、並びにポリオール（例えば、マンニトール、ソルビトールなど）を含むがこれらに限定されない。また、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ及びＧｅｎｎａｒｏ、「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、（１８版、１９９０）も参照されたい。
本明細書の、ペプチド又はポリペプチドの文脈で使用される、「断片」という用語は、全長未満のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドを指す。このような断片は、例えば、アミノ末端における切断から生じる場合もあり、カルボキシ末端における切断から生じる場合もあり、且つ／又はアミノ酸配列に由来する残基（単数又は複数）の内部欠失から生じる場合もある。断片は、例えば、代替的なＲＮＡスプライシングから生じる場合もあり、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるプロテアーゼ活性から生じる場合もある。ある特定の実施形態では、ネクチン４の断片又は抗ネクチン４抗体の断片は、ネクチン４ポリペプチド又は抗ネクチン４抗体のアミノ酸配列のうちの少なくとも５連続アミノ酸残基、少なくとも１０連続アミノ酸残基、少なくとも１５連続アミノ酸残基、少なくとも２０連続アミノ酸残基、少なくとも２５連続アミノ酸残基、少なくとも３０連続アミノ酸残基、少なくとも４０連続アミノ酸残基、少なくとも５０連続アミノ酸残基、少なくとも６０連続アミノ酸残基、少なくとも７０連続アミノ酸残基、少なくとも８０連続アミノ酸残基、少なくとも９０連続アミノ酸残基、少なくとも１００連続アミノ酸残基、少なくとも１２５連続アミノ酸残基、少なくとも１５０連続アミノ酸残基、少なくとも１７５連続アミノ酸残基、少なくとも２００連続アミノ酸残基、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００、少なくとも５２５、又は少なくとも５５０連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。具体的な実施形態では、ネクチン４ポリペプチドの断片又は抗ネクチン４抗体は、ポリペプチド又は抗体の、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又はこれを超える機能を保持する。
「約」及び「およそ」という用語は、所与の値又は範囲から、２０％以内、１５％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、又はこれ未満を意味する。
「～を投与する」又は「投与」とは、経粘膜送達、皮内送達、静脈内送達、筋内送達、及び／又は本明細書で記載されているか、若しくは当技術分野で公知である、物理的送達の、他の任意の方法などにより、体外に存在する物質（例えば、本明細書で記載される抗ネクチン４抗体）を、患者へと注射するか、又は他の形で物理的に送達する行為を指す。
本明細書のポリペプチドの文脈で使用される、「類似体」という用語は、ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチドの断片、若しくは抗ネクチン４抗体と同様な機能又は同一な機能を保有するが、ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチドの断片、若しくは抗ネクチン４抗体と同様なアミノ酸配列又は同一なアミノ酸配列を必ずしも含むか、又はネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチドの断片、若しくは抗ネクチン４抗体と同様な構造又は同一な構造を必ずしも有するわけではないポリペプチドを指す。同様なアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、以下：（ａ）本明細書で記載されるネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチドの断片、又は抗ネクチン４抗体のアミノ酸配列と、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｂ）厳密な条件（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（２００１）；及びＭａｎｉａｔｉｓら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９８２）を参照されたい）下で、本明細書で記載されるネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチドの断片、又は抗ネクチン４抗体（又はそのＶＨ領域又はＶＬ領域）をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、少なくとも５アミノ酸残基、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１５アミノ酸残基、少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも２５アミノ酸残基、少なくとも３０アミノ酸残基、少なくとも４０アミノ酸残基、少なくとも５０アミノ酸残基、少なくとも６０アミノ酸残基、少なくとも７０アミノ酸残基、少なくとも８０アミノ酸残基、少なくとも９０アミノ酸残基、少なくとも１００アミノ酸残基、少なくとも１２５アミノ酸残基、若しくは少なくとも１５０アミノ酸残基の、上記ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド；又は（ｃ）本明細書で記載されるネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチドの断片、又は抗ネクチン４抗体（又はそのＶＨ領域又はＶＬ領域）をコードするヌクレオチド配列と、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのうちの少なくとも１つを満たすポリペプチドを指す。本明細書で記載されるネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチドの断片、又は抗ネクチン４抗体と同様な構造を伴うポリペプチドとは、本明細書で記載されるネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチドの断片、又は抗ネクチン４抗体と同様な、二次構造、三次構造、又は四次構造を有するポリペプチドを指す。ポリペプチドの構造は、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴、及び電子顕微鏡による結晶構造解析を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の方法により決定することができる。
ポリペプチドの文脈において、本明細書で使用される「誘導体」という用語は、アミノ酸残基の置換、欠失、又は付加の導入により変更された、ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチドの断片、又はネクチン４ポリペプチドに結合する抗体のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。本明細書で使用される「誘導体」という用語はまた、例えば、任意の種類の分子の、ポリペプチドへの共有結合的接合により化学的に修飾された、ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチドの断片、又はネクチン４ポリペプチドに結合する抗体も指す。限定を目的としないが、例えば、ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチドの断片、又は抗ネクチン４抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、公知の保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ／ｂｌｏｃｋｉｎｇ）基による誘導体化、タンパク質分解性切断、化学的切断、製剤化、ツニカマイシンの代謝的合成、細胞のリガンド又は他のタンパク質への連結などにより化学修飾することができる。誘導体は、接合させる分子の種類又は位置において、天然に存在するペプチド若しくはポリペプチド、又は出発ペプチド若しくは出発ポリペプチドと異なる形で修飾される。誘導体は、ペプチド上又はポリペプチド上に天然で存在する、１又は複数の化学的基の欠失をさらに含む。さらに、ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチドの断片、又は抗ネクチン４抗体の誘導体は、１又は複数の、非古典的アミノ酸を含有しうる。ポリペプチド誘導体は、本明細書で記載されるネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチドの断片、又は抗ネクチン４抗体と同様な機能又は同一な機能を保有する。
「組成物」という用語は、任意選択で、指定された量の、指定された成分（例えば、本明細書で提供される抗体）を含有する生成物を包含することを意図する。
本明細書で使用される「～を防止する」、「～を防止すること」、及び「防止」という用語は、ネクチン４媒介性疾患及び／又はこれと関連する症状の、発症、再発、発病、又は拡大の、完全な阻害又は部分的な阻害であって、本明細書で提供される治療又は治療の組合せの投与（例えば、本明細書で提供される抗体などの、予防剤又は治療剤の組合せ）の結果として得られる、上記阻害を指す。
本明細書で使用される、「予防剤」という用語は、対象における、ネクチン４媒介性疾患及び／又はこれと関連する症状の、発症、再発、発病、又は拡大を、完全に、又は部分的に阻害しうる、任意の薬剤を指す。ある特定の実施形態では、「予防剤」という用語は、本明細書で提供される抗体を指す。ある特定の他の実施形態では、「予防剤」という用語は、本明細書で提供される抗体以外の薬剤を指す。一部の実施形態では、予防剤は、ネクチン４媒介性疾患及び／若しくはこれと関連する症状を防止するか、又はネクチン４媒介性疾患及び／若しくはこれと関連する症状の、発病、発症、進行、及び／又は重症度を抑えるのに有用であることが公知であるか、又はこのために使用されたことがあるか、若しくは現在使用されつつある薬剤である。具体的な実施形態では、予防剤は、完全ヒト抗ネクチン４モノクローナル抗体などの、完全ヒト抗ネクチン４抗体である。
ある特定の実施形態では、「予防的に有効な血清力価」とは、ヒトなどの対象における血清力価であって、前記対象における、ネクチン４媒介性疾患及び／又はこれと関連する症状の、発症、再発、発病、又は拡大を、完全に、又は部分的に阻害する、上記血清力価である。
本明細書では、「ネクチン４媒介性疾患」及び「ネクチン４媒介性障害」は、互換的に使用され、ネクチン４により完全に、若しくは部分的に引き起こされるか、この結果であるか、又はこれと相関する、任意の疾患を指す。ある特定の実施形態では、ネクチン４は、細胞の表面上で、異常に（例えば、高度に）発現する。一部の実施形態では、ネクチン４は、特定の細胞型において、異常に上方調節されうる。他の実施形態では、ネクチン４の、ネクチン４リガンドへの結合により、正常な細胞シグナル伝達、異常な細胞シグナル伝達、又は過剰な細胞シグナル伝達が引き起こされる。一部の実施形態では、ネクチン４媒介性疾患とは、ネクチン４を、対象、例えば、ヒトにおけるバイオマーカーとして使用しうる疾患である。一部の実施形態では、ネクチン４媒介性疾患とは、ネクチン４の発現が、対象、例えば、ヒトにおける疾患の進行又は予後を反映しうる疾患である。ある特定の実施形態では、ネクチン４リガンドは、例えば、細胞の表面上に発現するネクチン４受容体である。
本明細書で使用される「血清力価」という用語は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、又は少なくとも４０例～最大で約１００、１０００、又はこれを超える対象の集団内の、平均血清力価を指す。
本明細書で使用される「副作用」という用語は、治療（例えば、予防剤又は治療剤）の、望ましくない作用及び有害作用を包含する。望ましくない作用は、必ずしも有害ではない。治療（例えば、予防剤又は治療剤）に由来する有害作用は、害を及ぼす場合もあり、不快な場合もあり、危険な場合もある。副作用の例は、下痢、咳、胃腸炎、喘鳴、悪心、嘔吐、拒食症、腹部痙攣、発熱、疼痛、体重の減少、脱水、禿頭、呼吸困難、不眠、めまい、粘膜炎、神経作用及び筋肉作用、疲労感、口渇、並びに食欲不振、投与部位における発赤又は腫脹、発熱、悪寒、及び疲労感などの流感様症状、消化管問題、並びにアレルギー反応を含む。患者により経験される、さらなる所望されない効果は、多数であり、当技術分野で公知である。多くは、医師便覧（６０版、２００６）において記載されている。
本明細書で使用される、「治療剤」という用語は、ネクチン４媒介性疾患及び／又はこれと関連する症状の処置、管理、又は改善において使用されうる、任意の薬剤を指す。ある特定の実施形態では、「治療剤」という用語は、本明細書で提供される抗体を指す。ある特定の他の実施形態では、「治療剤」という用語は、本明細書で提供される抗体以外の薬剤を指す。一部の実施形態では、治療剤は、ネクチン４媒介性疾患又は１又は複数のこれと関連する症状の処置、管理、又は改善に有用であることが公知であるか、又はこのために使用されたことがあるか、若しくは現在使用されつつある薬剤である。
治療（例えば、予防剤又は治療剤の使用）の組合せは、２つ又はこれを超える、任意の単剤療法の相加効果より有効である。例えば、予防剤及び／又は治療剤の組合せによる相乗効果は、単剤単独より有効であり、且つ／或いはネクチン４媒介性疾患を伴う対象に対する、薬剤のうちの１若しくは複数の低投与量、及び／又は前記薬剤の低投与頻度の使用を可能とする。低投与量の予防的治療若しくは治療的治療を利用し、且つ／又は前記治療を低頻度で投与する能力は、ネクチン４媒介性疾患の防止、管理、処置、又は改善における、前記治療の有効性を低減せずに、対象への前記治療の投与と関連する毒性を軽減する。加えて、相乗効果は、ネクチン４媒介性疾患の防止、又は管理、処置、若しくは改善における治療の有効性の改善を結果としてもたらしうる。最後に、治療（例えば、予防剤又は治療剤）の組合せによる相乗効果は、任意の単剤療法の使用と関連する、有害であるか、又は望ましくない副作用を回避又は軽減しうる。
ある特定の実施形態では、「治療的に有効な血清力価」とは、ヒトなどの対象における血清力価であって、前記対象における、ネクチン４媒介性疾患と関連する重症度、持続時間、及び／又は症状を軽減する、上記血清力価である。
本明細書で使用される、「治療」という用語は、ネクチン４媒介性疾患の防止、管理、処置、及び／又は改善において使用されうる、任意のプロトコール、方法、及び／又は薬剤を指す。ある特定の実施形態では、「複数の治療」及び「治療」という用語は、医療従事者などの当業者に公知である、ネクチン４媒介性疾患の防止、管理、処置、及び／又は改善に有用な、生物療法、支持療法、及び／又は他の治療を指す。
本明細書で使用される、「～を処置する」、「処置」、及び「～を処置すること」という用語は、１又は複数の治療（本明細書で提供される抗体など、１又は複数の予防剤又は治療剤の投与を含むがこれらに限定されない）の投与から結果として得られる、ネクチン４媒介性疾患の、進行、重症度、及び／又は持続時間の軽減又は改善を指す。
本明細書で使用される、「～を管理する」、「～を管理すること」、及び「管理」という用語は、対象が、治療（例えば、予防剤又は治療剤）から導出する、有益な効果であって、ネクチン４と関連する状態の治癒を結果としてもたらすわけではない、上記効果を指す。ある特定の実施形態では、状態又は障害の進行又は増悪を防止するように、対象に、１又は複数の治療（本明細書で記載される抗体などの、予防剤又は治療剤）を投与して、本明細書で記載される状態又は障害、これらの１又は複数の症状「を管理する」。
本明細書で使用される「～を防止する」、「～を防止すること」、及び「防止」という用語は、ネクチン４媒介性疾患及び／又はこれと関連する症状の、発症、再発、発病、又は拡大の、完全な阻害又は部分的な阻害であって、本明細書で提供される治療又は治療の組合せの投与（本発明の抗体など、予防剤又は治療剤の組合せ）の結果として得られる、上記阻害を指す。
本明細書で使用される、「～を投与する」又は「投与」とは、経粘膜送達、外用送達、皮内送達、非経口送達、静脈内送達、皮下送達、筋内送達、及び／又は本明細書で記載されているか、若しくは当技術分野で公知である、物理的送達の、他の任意の方法などにより、物質（例えば、本明細書で記載される抗ネクチン４抗体又はその抗原結合性断片）を、対象又は患者（例えば、ヒト）へと注射するか、又は他の形で物理的に送達する行為を指す。
本明細書で使用される、「有効量」又は「治療有効量」という用語は、所与の状態、障害、若しくは疾患及び／又はこれらと関連する症状の重症度及び／又は持続時間を軽減及び／又は改善するのに十分な量の治療（例えば、本明細書で提供される抗体又は医薬組成物）を指す。これらの用語はまた、所与の疾患の悪化若しくは進行の軽減、緩徐化、若しくは改善、所与の疾患の再発、発症、若しくは発病の軽減、緩徐化、若しくは改善のために、且つ／又は別の治療（例えば、本明細書で提供される抗ネクチン４抗体以外の治療）予防効果若しくは治療効果（単数又は複数）を改善若しくは増強するのに必要な量も包含する。一部の実施形態では、本明細書で使用される「有効量」はまた、指定された結果を達成するための、本明細書で記載される抗体の量も指す。
本明細書の、ネクチン４抗原に免疫特異的に結合する抗体を含む液体製剤の文脈で使用される「安定性」及び「安定的」という用語は、所与の製造条件、調製条件、輸送条件、及び保存条件下における、製剤中の抗体の、熱的アンフォールディング及び化学的アンフォールディング、凝集、分解、又は断片化に対する耐性を指す。本明細書で提供される「安定的」製剤は、所与の製造条件、調製条件、輸送条件、及び保存条件下で、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は９９．５％以上の生物学的活性を保持する。抗体の安定性は、還元型キャピラリーゲル電気泳動（ｒＣＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、及びＨＰＳＥＣを含むがこれらに限定されない、当業者に公知の方法を介した、凝集、分解、又は断片化の、基準抗体と比較した程度により評価することができる。ネクチン４抗原に免疫特異的に結合する抗体を含む製剤の全体的安定性は、ネクチン４の特異的エピトープを使用する、多様な免疫学的アッセイであって、例えば、ＥＬＩＳＡ及びラジオイムノアッセイを含む上記免疫学的アッセイにより評価することができる。一部の例示的製剤では、抗ネクチン４抗体は、２カ月間、４カ月間、６カ月間、８カ月間、１０カ月間、１年間、１８カ月間、２年間、３年間、又はこれを超える期間にわたり安定でありうる。
本明細書で使用される「界面活性剤を実質的に含まない」という用語は、ネクチン４抗原に免疫特異的に結合する抗体の製剤であって、界面活性剤のうちの０．０００５％未満、０．０００３％未満、若しくは０．０００１％未満、及び／又は界面活性剤のうちの０．０００５％未満、０．０００３％未満、若しくは０．０００１％未満を含有する、上記製剤を指す。
本明細書で使用される「塩を実質的に含まない」という用語は、ネクチン４抗原に免疫特異的に結合する抗体の製剤であって、無機塩のうちの０．０００５％未満、０．０００３％未満、又は０．０００１％未満を含有する、上記製剤を指す。
本明細書で使用される「無機塩」という用語は、炭素を含有しない、任意の化合物であって、酸の水素又は酸の一部又は全部の、金属又は金属と同様に作用する基による置きかえから生じ、生物学的材料による医薬組成物中及び調製物中で、張性調整化合物として使用されることが多い、上記化合物を指す。最も一般的な無機塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４などである。
本明細書で使用される「界面活性剤」という用語は、有機物質を有する両親媒性構造を指す；すなわち、界面活性剤は、反対の可溶性傾向基、典型的に、油溶性炭化水素鎖及び水溶性イオン基から構成される。界面活性剤は、表面活性部分の電荷に応じて、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、及び非イオン性界面活性剤へと分類することができる。界面活性剤は、生物学的材料による、多様な医薬組成物及び調製物のための、保湿剤、乳化剤、可溶化剤、及び分散剤として使用されることが多い。
８．組成物及びこれを作製する方法
本明細書では、ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチド断片、又はネクチン４エピトープに免疫特異的に結合する抗体が提供される。また、ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチド断片、又はネクチン４エピトープに免疫特異的に結合する抗体をコードする単離核酸も提供される。ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチド断片、又はネクチン４エピトープに免疫特異的に結合する抗体をコードする核酸を含むベクター及び宿主細胞もさらに提供される。また、ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチド断片、又はネクチン４エピトープに免疫特異的に結合する抗体を作製する方法も提供される。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒトネクチン４及び／又はカニクイザルネクチン４に結合する。一実施形態では、ネクチン４抗体は、ヒトネクチン４に結合する。一実施形態では、ネクチン４抗体は、カニクイザルネクチン４に結合する。一実施形態では、ネクチン４抗体は、ヒトネクチン４及びカニクイザルネクチン４の両方に結合する。他の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、齧歯動物ネクチン４に結合しない。
一部の実施形態では、抗ネクチン４抗体は、ネクチン４の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合する。ある特定の実施形態では、抗ネクチン４抗体は、ネクチン４リガンド結合性部位とは別個である、ネクチン４のＥＣＤ内のエピトープに結合する。
また、本明細書で提供される抗ネクチン４抗体の、ネクチン４ポリペプチドへの結合を競合的に遮断する抗体も提供される。
また、ネクチン４ポリペプチドへの結合について、本明細書で提供される抗ネクチン４抗体と競合する抗体も提供される。
一部の実施形態では、抗ネクチン４抗体は、ネクチン４リガンドの、ネクチン４ポリペプチドへの結合を遮断しない。
一部の実施形態では、抗ネクチン４抗体は、ネクチン４リガンドと、ネクチン４ポリペプチドへの結合について競合しない。
ある特定の実施形態では、ネクチン４リガンドの、ネクチン４への結合は、抗体により阻害されない。
本明細書で提供される抗ネクチン４抗体はまた、例えば、診断剤、検出剤、及び／又は薬剤へとコンジュゲートさせるか、又は組換えにより融合させることもできる。抗ネクチン４抗体を含む組成物もさらに提供される。
本明細書ではまた、ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチド断片、ネクチン４ペプチド、又はネクチン４エピトープに結合する抗ネクチン４抗体の免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、ＶＨ領域、ＶＬ領域、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及び／又はＶＬ ＣＤＲ３をコードする単離核酸分子も提供される。
ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチド断片、ネクチン４ペプチド、又はネクチン４エピトープに結合する抗ネクチン４抗体をコードする核酸分子を含むベクター及び宿主細胞もさらに提供される。また、ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチド断片、ネクチン４ペプチド、又はネクチン４エピトープに結合する抗体を作製する方法も提供される。
一実施形態では、本開示は、本明細書で診断剤として使用されうる抗ネクチン４抗体を提供する。例示的抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及びヘテロコンジュゲート抗体のほか、アフィニティー又は他の特性を改善した、これらの変異体を含む。
９．抗ネクチン４抗体
本明細書で提供される抗体は、合成抗体、モノクローナル抗体、組換えにより作製された抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二特異性抗体、イントラボディー、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ラクダ化抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び上記のうちのいずれかのエピトープ結合性断片を含むがこれらに限定されない。
特に、本明細書で提供される抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、ネクチン４抗原に免疫特異的に結合する抗原結合性部位を含有する分子を含む。本明細書で提供される免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又はサブクラスの分子でありうる。具体的な実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＩｇＧ１抗体などのＩｇＧ抗体である。
抗体の変異体及び誘導体は、エピトープに特異的に結合する能力を保持する抗体断片を含む。例示的な断片は、Ｆａｂ断片（抗原結合性ドメインを含有し、ジスルフィド結合により架橋された、軽鎖及び重鎖の一部を含む抗体断片）；Ｆａｂ’（例えば、Ｆａｂと、ヒンジ領域を介する重鎖のさらなる部分とを含む、単一の抗原結合性ドメインを含有する抗体断片）；Ｆ（ａｂ’）２（重鎖のヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合により接合させた、２つのＦａｂ’分子；Ｆａｂ’分子は、同じエピトープを指向する場合もあり、異なるエピトープを指向する場合もある）；ｓＦｖとしてもまた公知である、可変領域を含む単鎖のＦａｂ鎖（１０～２５アミノ酸の鎖により、一体に連結された、抗体の単一の軽鎖及び重鎖の可変性の抗原結合性決定領域）；ジスルフィド連結Ｆｖ又はｄｓＦｖ（ジスルフィド結合により、一体に連結された、抗体の単一の軽鎖及び重鎖の可変性の抗原結合性決定領域）；ラクダ化ＶＨ（ＶＨインターフェースにおける一部のアミノ酸が、天然に存在するラクダ抗体の重鎖内で見出される抗体の単一の重鎖の可変性の抗原結合性決定領域）；ダイアボディー（第１のｓＦｖのＶＨドメインが、第２のｓＦｖのＶＬドメインと共にアセンブルされ、第１のｓＦｖのＶＬドメインが、第２のｓＦｖのＶＨドメインと共にアセンブルされる場合に形成される、二量体化ｓＦｖ；ダイアボディーの２つの抗原結合性領域は、同じエピトープを指向する場合もあり、異なるエピトープを指向する場合もある）；及びトリアボディー（ダイアボディーと同様に形成されるが、３つの抗原結合性ドメインが、単一の複合体内で創出される、三量体化ｓＦｖ；３つの抗原結合性領域は、同じエピトープを指向する場合もあり、異なるエピトープを指向する場合もある）を含む。抗体の誘導体はまた、抗原結合性部位の、１又は複数のＣＤＲ配列も含む。２つ又はこれを超えるＣＤＲ配列が存在する場合、ＣＤＲ配列は、足場上に、併せて連結することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）を含む。ｓｃＦｖは、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む抗体断片であり、この場合、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが、抗原結合に所望される構造を形成することを可能とする、ＶＨドメインと、ＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、「モノクローナル抗体の薬理学（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９～３１５頁（１９９４）を参照されたい。
本明細書で提供される抗体は、鳥類及び哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、又はニワトリ）を含む、任意の動物に由来しうる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体である。本明細書で使用される、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリー、又は抗体をヒト遺伝子から発現するマウスから単離された抗体を含む。
ある特定の実施形態では、抗体は、完全ヒトネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチド断片、又はネクチン４エピトープに免疫特異的に結合する抗体など、完全ヒト抗体である。このような完全ヒト抗体であれば、対象へと投与する場合、非完全ヒト抗体（例えば、他の種に由来する抗ネクチン４抗体）を指向する免疫応答など、望ましくないか、又は不要な副作用の発生を最小化するのに、完全マウス（又は他の完全非ヒト種抗体若しくは部分的な非ヒト種抗体）、ヒト化抗体、又はキメラ抗体より有利であろう。
一実施形態では、本明細書で提供される抗体は、それらの各々が、ネクチン４上の、異なるエピトープを指向する、２つの抗体又はその抗原結合性断片を有する、二特異性抗体又はその抗原結合性断片を含みうる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ネクチン４ポリペプチドの所与のエピトープに対して、単一特異性であり、他のエピトープに免疫特異的に結合しない。
本明細書の一部の実施形態では、ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチド断片、ネクチン４ペプチド、又はネクチン４エピトープを含むネクチン４に結合する抗体が提供される。一実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒトネクチン４に結合する。別の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、カニクイザルネクチン４に結合する。別の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒトネクチン４及びカニクイザルネクチン４に結合する。一部の実施形態では、抗ネクチン４抗体は、ネクチン４リガンドの、ネクチン４ポリペプチドへの結合を遮断しない。他の実施形態では、抗ネクチン４抗体は、ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチド断片、ネクチン４ペプチド、又はネクチン４エピトープを含むネクチン４に結合するヒト化抗体（例えば、ヒト定常領域を含む）である。
一実施形態では、本明細書で提供される抗体、又は抗体を含む組成物、及び抗体を使用する方法は、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１抗体を含む。本明細書ではまた、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１抗体を産生するハイブリドーマも提供される。一部の実施形態では、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１抗体を、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１ハイブリドーマ細胞系から作製する。一部の実施形態では、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１抗体は、マウスＩｇＧ２ａ／カッパアイソタイプを有する。
Ｍ２２－３２１ｂ４１．１とは、マウス由来のハイブリドーマ細胞系である。Ｍ２２－３２１ｂ４１．１ハイブリドーマ細胞系は、２０１７年６月１３日に寄託された（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ－１２４２４５）。
ある特定の実施形態では、抗ネクチン４抗体は、表１で描示されたアミノ酸配列など、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のＶＨ領域、ＶＬ領域、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及び／又はＶＬ ＣＤＲ３を含む。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される単離抗体又はその機能的断片は、抗ネクチン４抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１に由来する、１つ、２つ、及び／若しくは３つの重鎖ＣＤＲ、並びに／又は１つ、２つ、及び／若しくは３つの軽鎖ＣＤＲを含む。
Figure 0007168590000004
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、６つのＣＤＲ、例えば、表１で同定された、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及び／又はＶＬ ＣＤＲ３を含むか、又はこれらからなる。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、６つより少ないＣＤＲを含みうる。一部の実施形態では、抗体は、表１で同定された、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及び／又はＶＬ ＣＤＲ３からなる群から選択される、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのＣＤＲを含むか、又はこれらからなる。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１の、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及び／又はＶＬ ＣＤＲ３からなる群から選択される、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのＣＤＲを含むか、又はこれらからなる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、表１に列挙された、１又は複数の（例えば、１つ、２つ、又は３つの）ＶＨ ＣＤＲを含む。他の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、表１に列挙された、１又は複数の（例えば、１つ、２つ、又は３つの）ＶＬ ＣＤＲを含む。さらに他の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、表１に列挙された、１又は複数の（例えば、１つ、２つ、又は３つの）ＶＨ ＣＤＲと、表１に列挙された、１又は複数のＶＬ ＣＤＲとを含む。したがって、一部の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、抗体は、表１に描示された、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列（単数又は複数）のうちのいずれか１つから独立に選択される、ＶＨ ＣＤＲ１及び／又はＶＨ ＣＤＲ２及び／又はＶＨ ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１を含む。別の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、抗体は、表１に描示された、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列のうちのいずれか１つから独立に選択される、ＶＬ ＣＤＲ１及び／又はＶＬ ＣＤＲ２及び／又はＶＬ ＣＤＲ３を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、（１）Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；（２）Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；並びに（３）Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ領域と；（１）Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；（２）Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；並びに（３）Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬ領域とを含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、（１）Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；（２）Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；並びに（３）Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ領域を含む。
他の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、（１）Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；（２）Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；並びに（３）Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。
本明細書ではまた、表１に列挙された１又は複数の（例えば、１つ、２つ、又は３つの）ＶＨ ＣＤＲと、１又は複数の（例えば、１つ、２つ、又は３つの）ＶＬ ＣＤＲとを含む抗体も提供される。特に、本明細書では、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１を含む抗体が提供される。一実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含む。他の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含む。一実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、
Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１を含む。他の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、
Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１を含む。一実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含む。他の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、
Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含む。一実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。
別の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１を含む。他の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、
Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含む。一実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。一実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、
Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含む。他の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、
Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１を含む。一実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、
Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含む。他の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、
Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。一実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、
Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含む。他の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、
Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含む。一実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。他の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、
及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、
及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。一実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、
及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。他の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、
Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１５）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１６）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１７）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、
及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。一実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号２１）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。他の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２３）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２４）、及び例示的ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号８）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１０）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号１１）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；並びにＫａｂａｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）、Ｃｏｎｔａｃｔ ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１３）、及び例示的ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗体は、表１に列挙された、ＶＨ ＣＤＲと、ＶＬ ＣＤＲとの任意の組合せを含む。
本明細書で記載されるフレームワーク領域は、ＣＤＲ番号付けシステムの境界部に基づいて決定する。言い換えれば、ＣＤＲを、例えば、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、又はＣｈｏｔｈｉａにより決定する場合、フレームワーク領域は、Ｎ末端から、Ｃ末端へと：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４のフォーマットで、可変領域内のＣＤＲを取り囲むアミノ酸残基である。例えば、ＦＲ１は、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム、ＩＭＧＴ番号付けシステム、又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムにより規定される通り、ＣＤＲ１のアミノ酸残基に対してＮ末端側のアミノ酸残基として規定され、ＦＲ２は、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム、ＩＭＧＴ番号付けシステム、又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムにより規定される通り、ＣＤＲ１のアミノ酸残基と、ＣＤＲ２のアミノ酸残基との間のアミノ酸残基として規定され、ＦＲ３は、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム、ＩＭＧＴ番号付けシステム、又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムにより規定される通り、ＣＤＲ２のアミノ酸残基と、ＣＤＲ３のアミノ酸残基との間のアミノ酸残基として規定され、ＦＲ４は、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム、ＩＭＧＴ番号付けシステム、又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムにより規定される通り、ＣＤＲ３のアミノ酸残基に対してＣ末端側のアミノ酸残基として規定される。
一部の実施形態では、本明細書で提供される単離抗体又はその機能的断片は、表２に示された抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１に由来する、１つ、２つ、３つ、及び／若しくは４つの重鎖ＦＲ、並びに／又は１つ、２つ、３つ、及び／若しくは４つの軽鎖ＦＲをさらに含む。
Figure 0007168590000005
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される単離抗体又はその機能的断片は、表２に示された抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１に由来する、１つ、２つ、３つ、及び／又は４つの重鎖ＦＲをさらに含む。一部の実施形態では、抗体の重鎖ＦＲ（単数又は複数）は、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１に由来する。
一部の実施形態では、本明細書で提供される単離抗体又はその機能的断片は、表２に示された抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１に由来する、１つ、２つ、３つ、及び／又は４つの軽鎖ＦＲをさらに含む。一部の実施形態では、抗体の軽鎖ＦＲ（単数又は複数）は、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１に由来する。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体又はその断片は、（１）配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＦＲ１；（２）配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＦＲ２；（３）配列番号３１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＦＲ３；及び／又は（４）配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＦＲ４を含むＶＨ領域を含む。具体的な実施形態では、抗体は、上記で言及したＶＨ ＦＲ１、ＶＨ ＦＲ２、ＶＨ ＦＲ３、及びＶＨ ＦＲ４の４つ全てを含むＶＨ領域を含む。
したがって、一実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＦＲ１を含むＶＨ領域を含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＦＲ２を含むＶＨ領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号３１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＦＲ３を含むＶＨ領域を含む。他の実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＦＲ４を含むＶＨ領域を含む。
一部の実施形態では、ＶＬ領域は、（１）配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＦＲ１；（２）配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＦＲ２；（３）配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＦＲ３；及び／又は（４）配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＦＲ４を含む。
したがって、一部の実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＦＲ１を含むＶＬ領域を含む。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＦＲ２を含むＶＬ領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＦＲ３を含むＶＬ領域を含む。さらに他の実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＦＲ４を含むＶＬ領域を含む。
一部の実施形態では、抗体又はその断片は、ＶＨ領域と、ＶＬ領域とを含み、この場合、ＶＨ領域は、（１）配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＦＲ１；（２）配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＦＲ２；（３）配列番号３１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＦＲ３；及び／又は（４）配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＦＲ４を含み；ＶＬ領域は、（１）配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＦＲ１；（２）配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＦＲ２；（３）配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＦＲ３；及び／又は（４）配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＦＲ４を含む。一部の実施形態では、抗体は、上記で言及したＶＨ ＦＲ１、ＶＨ ＦＲ２、ＶＨ ＦＲ３、及びＶＨ ＦＲ４の４つ全てを含むＶＨ領域を含む。他の実施形態では、抗体は、上記で言及したＶＬ ＦＲ１、ＶＬ ＦＲ２、ＶＬ ＦＲ３、及びＶＬ ＦＲ４の４つ全てを含むＶＬ領域を含む。さらに他の実施形態では、抗体は、上記で言及したＶＨ ＦＲ１、ＶＨ ＦＲ２、ＶＨ ＦＲ３、及びＶＨ ＦＲ４の４つ全てを含むＶＨ領域と、上記で言及したＶＬ ＦＲ１、ＶＬ ＦＲ２、ＶＬ ＦＲ３、及びＶＬ ＦＲ４の４つ全てを含むＶＬ領域とを含む。
本明細書ではまた、表２に列挙された、１又は複数の（例えば、１つ、２つ、３つ、又は４つの）ＶＨ ＦＲと、１又は複数の（例えば、１つ、２つ、３つ、又は４つの）ＶＬ ＦＲとを含む抗体も提供される。特に、本明細書では、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）とを含む抗体が提供される。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）とを含む。
他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。
一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。
一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。
他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）とＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。
別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、
ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。
一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。
他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。
別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。
一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。
一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。
一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。
一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。
一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。
一実施形態では、抗体はＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。
一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。
一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。
別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。
一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。別の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。他の実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ１（配列番号２９）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。
一実施形態では、抗体は、ＶＨ ＦＲ２（配列番号３０）と、ＶＨ ＦＲ３（配列番号３１）と、ＶＨ ＦＲ４（配列番号３２）と、ＶＬ ＦＲ１（配列番号２５）と、ＶＬ ＦＲ２（配列番号２６）と、ＶＬ ＦＲ３（配列番号２７）と、ＶＬ ＦＲ４（配列番号２８）とを含む。一部の実施形態では、抗体は、表２に列挙された、ＶＨ ＦＲ（配列番号２９～３２）と、ＶＬ ＦＲ（配列番号２５～２８）との任意の組合せを含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＶＨ領域又はＶＨドメインを含む。他の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＶＬ領域又はＶＬドメインを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、（ｉ）ＶＨドメイン若しくはＶＨ領域；及び／又は（ｉｉ）ＶＬドメイン若しくはＶＬ領域の組合せを有する。さらに他の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、表１に明示された、配列番号３及び４からなる群から選択される、（ｉ）ＶＨドメイン若しくはＶＨ領域；及び／又は（ｉｉ）ＶＬドメイン若しくはＶＬ領域の組合せを有する。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、（１）配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；（２）配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；及び（３）配列番号２３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ領域と；表１に明示された配列番号３からなる群から選択されるＶＬ領域とを含む。
他の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、表１に明示された配列番号４からなる群から選択されるＶＨ領域と；（１）配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；（２）配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；及び（３）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬ領域とを含む。
本明細書ではまた、ネクチン４ポリペプチド、ネクチン４ポリペプチド断片、ネクチン４ペプチド、又はネクチン４エピトープに結合する抗ネクチン４抗体の免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、ＶＨ領域、ＶＬ領域、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及び／又はＶＬ ＣＤＲ３をコードする単離核酸分子も提供される。抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１の、ＶＬ領域、軽鎖、ＶＨ領域、及び重鎖についての例示的核酸配列を、表３～４に示す。
Figure 0007168590000006
Figure 0007168590000007
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１の、ＶＨアミノ酸配列と、ＶＬアミノ酸配列とを有する。一部の実施形態では、抗体は、配列番号４のＶＨアミノ酸配列と、配列番号３のＶＬアミノ酸配列とを含む。
ある特定の実施形態では、ネクチン４ポリペプチド（例えば、ネクチン４、例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ）に特異的に結合する、本明細書で記載される抗体又はその抗原結合性断片は、軽鎖と重鎖とを含み、この場合、軽鎖は、
ＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹ ＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＴＦＮＲＮＥＣ（配列番号３３）
のアミノ酸配列を有する定常領域を含む。
ある特定の実施形態では、ネクチン４ポリペプチド（例えば、ネクチン４、例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ）に特異的に結合する、本明細書で記載される抗体又はその抗原結合性断片は、軽鎖と重鎖とを含み、この場合、重鎖は、
Figure 0007168590000008
（配列番号３４）
のアミノ酸配列を有する定常領域を含む。
他の実施形態では、ネクチン４ポリペプチド（例えば、ネクチン４、例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ）に特異的に結合する、本明細書で記載される抗体又はその抗原結合性断片は、軽鎖と重鎖とを含み、この場合、重鎖は、
Figure 0007168590000009
（配列番号３５）
のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
一部の実施形態では、ネクチン４ポリペプチド（例えば、ネクチン４、例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ）に特異的に結合する、本明細書で記載される抗体又はその抗原結合性断片は、軽鎖と重鎖とを含み、この場合、重鎖は、配列番号３５のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含まない。
さらに別の実施形態では、ネクチン４ポリペプチド（例えば、ネクチン４、例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ）に特異的に結合する、本明細書で記載される抗体又はその抗原結合性断片は、軽鎖と重鎖とを含み、この場合、軽鎖は、配列番号３３のアミノ酸配列を有する定常領域を含み；重鎖は、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＦｃ領域を含む。
ある特定の実施形態では、ネクチン４ポリペプチド（例えば、ネクチン４、例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ）に特異的に結合する、本明細書で記載される抗体は、軽鎖と重鎖とを含み、この場合、軽鎖は、以下：
Figure 0007168590000010
（配列番号５）
の通りのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ネクチン４ポリペプチド（例えば、ネクチン４、例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ）に特異的に結合する、本明細書で記載される抗体は、軽鎖と重鎖とを含み、この場合、重鎖は、以下：
Figure 0007168590000011
（配列番号６）
の通りのアミノ酸配列を含む。
特定の一実施形態では、ネクチン４ポリペプチド（例えば、ネクチン４、例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ）に特異的に結合する、本明細書で記載される抗体は、軽鎖と重鎖とを含み、この場合、（ｉ）軽鎖は、配列番号５のアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）重鎖は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
さらに別の態様では、例示される抗体又は機能的断片のうちの１つと、ネクチン４への結合について競合する抗体が提供される。このような抗体はまた、本明細書で例示される抗体、又は重複するエピトープのうちの１つと同じエピトープにも結合しうる。例示される抗体と同じエピトープと競合するか、又はこれに結合する、抗体及び断片は、類似する機能的特性を示すことが予測される。例示される抗原結合性タンパク質及び断片は、表１におけるＶＨ領域及びＶＬ領域、並びにＣＤＲを含む、本明細書で提供される、ＶＨ領域及びＶＬ領域、並びにＣＤＲを伴う、抗原結合性タンパク質及び断片を含む。したがって、具体例として、提供される抗体は、（ａ）表１に列挙された抗体について列挙されるＣＤＲのうちの、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つ全て；（ｂ）表１に列挙された抗体について列挙されるＶＨ領域及びＶＬ領域から選択される、ＶＨ及びＶＬ；又は（ｃ）表１に列挙された抗体について指定されるＶＨ及びＶＬを含む、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含む抗体と競合する抗体を含む。一部の実施形態では、抗体は、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１である。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体、又はその抗原結合性断片は、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１と比べて、ある特定のパーセント同一性を伴うアミノ酸配列を含む。
２つの配列（例えば、アミノ酸配列又は核酸配列）の間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達することができる。２つの配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９０：５８７３～５８７７において改変された、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７：２２６４～２２６８のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラムへと組み込まれている。例えば、スコア＝１００、ワード長＝１２とする、ＮＢＬＡＳＴによるヌクレオチドプログラムのパラメーターセットにより、ＢＬＡＳＴによるヌクレオチド検索を実施して、本明細書で記載される核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。例えば、スコア＝５０、ワード長＝３とする、ＸＢＬＡＳＴによるプログラムのパラメーターセットにより、ＢＬＡＳＴによるタンパク質検索を実施して、本明細書で記載される核酸分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的として、ギャップを施したアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９～３４０２において記載されている通りに利用することができる。代替的に、ＰＳＩ Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠隔の関係を検出する、繰り返し検索を実施することもできる（同上）。ＢＬＡＳＴプログラム、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラム、及びＰＳＩ Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムの（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴの）デフォルトのパラメーターを使用することができる（例えば、インターネットのｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ上の、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）を参照されたい）。配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの、別の好ましい、非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ、４：１１１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）へと組み込まれている。アミノ酸配列を比較するために、ＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティー＝１２、及びギャップペナルティー＝４を使用することができる。
２つの配列の間の同一性パーセントは、ギャップを許容するか又はギャップを許容しない、上記で記載した技法と類似の技法を使用して決定することができる。同一性パーセントの計算では、正確なマッチだけをカウントする。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体、又はその抗原結合性断片は、配列番号３のアミノ酸配列に対する、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の配列同一性を有するＶＬドメインを含み、この場合、抗体は、ネクチン４に免疫特異的に結合する。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体、又はその抗原結合性断片は、配列番号３のアミノ酸配列に対する、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の配列同一性を有するＶＬドメインを含み、この場合、抗体は、ネクチン４に免疫特異的に結合し、且つ、抗体は、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１のＣＤＲ（例えば、ＶＬ ＣＤＲ １～３）と同一なＣＤＲ（例えば、ＶＬ ＣＤＲ １～３）を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体、又はその抗原結合性断片は、配列番号３のフレームワーク領域のアミノ酸配列に対する、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の配列同一性を有するＶＬフレームワーク領域を含むＶＬドメインを含み、この場合、抗体は、ネクチン４に免疫特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１のＶＬ ＣＤＲと同一なＶＬ ＣＤＲを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体、又はその抗原結合性断片は、配列番号４のアミノ酸配列に対する、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の配列同一性を有するＶＨドメインを含み、この場合、抗体は、ネクチン４に免疫特異的に結合する。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体、又はその抗原結合性断片は、配列番号４のアミノ酸配列に対する、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の配列同一性を有するＶＨドメインを含み、この場合、抗体は、ネクチン４に免疫特異的に結合し、且つ、抗体は、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１のＣＤＲ（例えば、ＶＨ ＣＤＲ１～３）と同一なＣＤＲ（例えば、ＶＨ ＣＤＲ１～３）を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体、又はその抗原結合性断片は、配列番号４のフレームワーク領域のアミノ酸配列に対する、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の配列同一性を有するＶＨフレームワーク領域を含むＶＨドメインを含み、この場合、抗体は、ネクチン４に免疫特異的に結合する。具体的な実施形態では、このような抗体は、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１のＣＤＲ（例えば、ＶＨ ＣＤＲ１～３）と同一なＣＤＲ（例えば、ＶＨ ＣＤＲ１～３）を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体、又はその抗原結合性断片は、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列に対する、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の配列同一性を有するＶＬドメイン、及び（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列に対する、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の配列同一性を有するＶＨドメインのそれぞれを含み、この場合、抗体は、ネクチン４に免疫特異的に結合する。具体的な実施形態では、このような抗体又はその抗原結合性断片は、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１のＣＤＲ（例えば、ＶＬ ＣＤＲ １～３及び／又はＶＨ ＣＤＲ１～３）と同一なＣＤＲ（例えば、ＶＬ ＣＤＲ １～３及び／又はＶＨ ＣＤＲ１～３）を含む。
別の態様では、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片は、ヒトネクチン４のエピトープを含む領域に結合する。例えば、一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒトネクチン４のアミノ酸残基３１～３４６（配列番号２）を含む、ヒトネクチン４（配列番号１）の領域、アミノ酸残基１～１５０（配列番号４５）を含む、ヒトネクチン４（配列番号１）の領域、又はアミノ酸残基３１～１５０（配列番号４６）を含む、ヒトネクチン４（配列番号１）の領域に結合する。さらに別の態様では、本明細書で提供される抗体は、ヒトネクチン４の特異的エピトープに結合する。ヒトネクチン４（配列番号１）の、アミノ酸残基３１～３４６のアミノ酸配列は、
Figure 0007168590000012
（配列番号２）である。ヒトネクチン４（配列番号１）の、アミノ酸残基１～１５０のアミノ酸配列は、
Figure 0007168590000013
（配列番号４５）である。ヒトネクチン４（配列番号１）の、アミノ酸残基３１～１５０のアミノ酸配列は、
Figure 0007168590000014
（配列番号４６）である。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ネクチン４ポリペプチドの三次元表面特徴のネクチン４エピトープ（例えば、ネクチン４ポリペプチドの多量体形態における）に結合する。エピトープに寄与する、ネクチン４ポリペプチドの領域は、ポリペプチドの連続アミノ酸の場合もあり、エピトープは、ポリペプチドの、２つ又はこれを超える非連続領域から、一体となる場合もある。ネクチン４エピトープは、（ａ）ネクチン４の多量体形態（「多量体のネクチン４エピトープ」）、（ｂ）ネクチン４の単量体形態（「単量体のネクチン４エピトープ」）、（ｃ）ネクチン４の多量体形態及び単量体形態の両方、（ｄ）ネクチン４の多量体形態であるが、単量体形態ではない形態、又は（ｅ）ネクチン４の単量体形態であるが、多量体形態ではない形態において存在しうる。例えば、一部の実施形態では、エピトープは、多量体（天然）形態だけにおいて存在するか、又は抗ネクチン４抗体により結合可能であり、単量体（変性）形態において存在したり、抗ネクチン４抗体により結合可能であったりしない。他の実施形態では、ネクチン４エピトープは、ネクチン４ポリペプチドの直鎖状特徴（例えば、ネクチン４ポリペプチドの多量体形態又は単量体形態における）である。本明細書で提供される抗体は、（ａ）ネクチン４の、単量体形態のエピトープ、（ｂ）ネクチン４の、多量体形態のエピトープ、（ｃ）ネクチン４の、単量体形態であるが、多量体形態ではない形態のエピトープ、（ｄ）ネクチン４の、多量体形態であるが、単量体形態ではない形態のエピトープ、又は（ｅ）ネクチン４の単量体形態及び多量体形態の両方に免疫特異的に結合しうる。
本明細書ではまた、ネクチン４の、本明細書で記載される抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１と、同じであるか、又は重複するエピトープ（例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ内に位置するエピトープ）に結合する抗体、例えば、ネクチン４（例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ）への結合について、本明細書で記載される抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１と競合する（例えば、用量依存的に）か、又は本明細書で記載される抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１の、ネクチン４への結合（例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ上に位置するエピトープ）を競合的に阻害する（例えば、用量依存的に）抗体も提供される。
本明細書の具体的な態様ではまた、ネクチン４の、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１と、同じであるか、又は重複するエピトープ（例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ内に位置するエピトープ）に結合する抗体も提供される。
ネクチン４の、同じであるか、又は重複するエピトープ（例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ内に位置するエピトープ）に結合する抗体は、本明細書で提供される例において利用される技法など、規定の技法を使用して同定することができる。イムノアッセイは、例えば、１つの抗体が、別の抗体の、標的抗原への結合を遮断する能力、すなわち、競合的結合アッセイを裏付けるのに使用される。２つの抗体が、エピトープに対して、同様な結合特異性を有するのかどうかを決定するのに、競合結合アッセイもまた使用することができる。競合的結合は、被験免疫グロブリンが、基準抗体の、ネクチン４など、共通抗原への特異的結合を阻害するアッセイにおいて決定することができる。多数種類の競合的結合アッセイ、例えば、直接的固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は間接的固相ＲＩＡ、直接的固相酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）又は間接的固相酵素ＥＩＡ、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉら（１９８３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、９：２４２を参照されたい）；直接的固相ビオチン－アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄら（１９８６）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７：３６１４を参照されたい）；直接的固相標識化アッセイ、直接的固相標識化サンドイッチアッセイ、（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）、「抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）；Ｉ－１２５標識を使用する、直接的固相標識化ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌら（１９８８）、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２５（１）：７を参照されたい）；直接的固相ビオチン－アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇら（１９９０）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７６：５４６）；及び直接的標識化ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら（１９９０）、Ｓｃａｎｄ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：７７）が公知である。典型的に、このようなアッセイは、固体表面に結合させた精製抗原（例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤなどのネクチン４）、又はこれらの、標識化されていない被験免疫グロブリン若しくは標識化された基準免疫グロブリンを保有する細胞の使用を伴う。競合的阻害は、被験免疫グロブリンの存在下で、固体表面又は細胞に結合した標識の量を決定することにより測定することができる。通例、被験免疫グロブリンは、過剰量で存在する。通例、競合する抗体が、過剰量で存在する場合、それは、基準抗体の、共通抗原への特異的結合を、少なくとも５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、又はこれを超えて阻害するであろう。競合結合アッセイは、標識化された抗原又は標識化された抗体を使用する、多数の異なるフォーマットで構成することができる。このアッセイの一般形では、抗原を、９６ウェルプレート上に固定化する。次いで、放射性標識又は酵素標識を使用して、標識化されていない抗体が、標識化された抗体の、抗原への結合を遮断する能力を測定する。さらなる詳細については、例えば、Ｗａｇｅｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８３、１３０：２３０８～２３１５；Ｗａｇｅｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８４、６８：２６９～２７４；Ｋｕｒｏｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９９０、５０：４８７２～４８７９；Ｋｕｒｏｋｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９２、２１：５２３～５３８；Ｋｕｒｏｋｉら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９９２、１１：３９１～４０７；並びに「抗体の使用：実験室マニュアル（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｈａｒｌｏｗ及びＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９９）、３８６～３８９頁を参照されたい。
ある特定の態様では、競合結合アッセイを使用して、抗体の結合が、別の抗体により、例えば、用量依存的に、競合的に阻害されるのかどうかを決定することができ、これにより、抗体が、本質的に同じエピトープ、又は重複するエピトープ、例えば、立体的に重複するエピトープに結合することを示す。このような競合結合アッセイは、例えば、標識化された抗原又は標識化された抗体を使用する、いくつかの異なるフォーマットで構成されうる、競合ＥＬＩＳＡアッセイを含みうる。特定の実施形態では、抗体は、本明細書で記載される抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１、又はそのキメラ抗体若しくはＦａｂ抗体、又は抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１のＶＨ ＣＤＲ及びＶＬ ＣＤＲを含む抗体との競合結合アッセイにおいて調べることができる。
本明細書の具体的な態様では、当業者に公知であるか、又は本明細書で記載されるアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ競合アッセイ）を使用して決定される通りに、本明細書で記載されるアミノ酸配列を含む抗体の結合を、ネクチン４ポリペプチド（例えば、ネクチン４、例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ）への特異的結合について、競合的に遮断する（例えば、用量依存的に）抗体が提供される。本明細書の具体的な態様では、当業者に公知であるか、又は本明細書で記載されるアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ競合アッセイ）を使用して決定される通りに、ネクチン４ポリペプチド（例えば、ネクチン４、例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ）への特異的結合について、本明細書で記載されるアミノ酸配列（例えば、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１のＶＬアミノ酸配列及び／又はＶＨアミノ酸配列）を含む抗体と競合する（例えば、用量依存的に）抗体が提供される。
本明細書の具体的な態様では、ネクチン４ポリペプチド（例えば、ネクチン４、例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ）への特異的結合について、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１と競合する（例えば、用量依存的に）抗体が提供される。
本明細書の具体的な態様では、ネクチン４ポリペプチド（例えば、ネクチン４、例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ）への特異的結合について、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＬ鎖領域と、配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ鎖領域とを含む抗体と競合する（例えば、用量依存的に）抗体が提供される。
本明細書の具体的な態様ではまた、（ｉ）ネクチン４ポリペプチドのエピトープ（例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤのエピトープ）への特異的結合について、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１と競合し（例えば、用量依存的に）、（ｉｉ）ＩＨＣアッセイにおいて、ネクチン４に特異的に結合することが可能である抗体も提供される。
具体的な実施形態では、本明細書で記載される抗体は、ネクチン４に特異的に結合し、ネクチン４ポリペプチド（例えば、ネクチン４、例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ）への特異的結合のための、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＬ鎖領域と、配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ鎖領域とを含む抗体により競合的に遮断される（例えば、用量依存的に）抗体である。
本明細書の具体的な態様ではまた、（ｉ）抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１を、ネクチン４ポリペプチドのエピトープ（例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤのエピトープ）への特異的結合について競合的に遮断し（例えば、用量依存的に）；（ｉｉ）ＩＨＣアッセイにおいて、ネクチン４に特異的に結合することが可能である抗体も提供される。
本明細書の具体的な態様では、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１のエピトープと同じエピトープに免疫特異的に結合する抗体、又はその抗原結合性断片であって、ネクチン４ポリペプチド（例えば、ネクチン４、例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ）への特異的結合のための、本明細書で記載されるアミノ酸配列を含む上記抗体、又はその抗原結合性断片が提供される。当業者に公知であるか、又は本明細書で記載されるアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）を使用して、２つの抗体が、同じエピトープに結合するのかどうかを決定することができる。
具体的な実施形態では、本明細書で記載される抗体、又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に特異的に結合し、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＬ鎖領域と、配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ鎖領域とを含む抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１のエピトープと同じエピトープに免疫特異的に結合する。
本明細書の具体的な態様ではまた、（ｉ）抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１のエピトープと同じ、ネクチン４ポリペプチドのエピトープ（例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤのエピトープ）に免疫特異的に結合し；（ｉｉ）ＩＨＣアッセイにおいて、ネクチン４に特異的に結合することが可能である抗体も提供される。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基３１～３４６のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基３１～７５のうちの少なくとも１つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基７５～１２５のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基１００～１５０のうちの少なくとも１つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基１２５～１７５のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基１５０～２００のうちの少なくとも１つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基１７５～２２５のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基２００～２５０のうちの少なくとも１つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基２２５～２７５のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基２５０～３００のうちの少なくとも１つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基２７５～３２５のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基３００～３４６のうちの少なくとも１つに結合する。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基１～１５０のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基３１～１５０のうちの少なくとも１つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基１～１０のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基５～１５のうちの少なくとも１つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基１０～２０のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基１５～２５のうちの少なくとも１つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基２０～３０のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基２５～３５のうちの少なくとも１つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基３０～４０のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基３５～４５のうちの少なくとも１つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基４０～５０のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基４５～５５のうちの少なくとも１つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基５０～６０のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基６５～７５のうちの少なくとも１つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基７０～８０のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基７５～８５のうちの少なくとも１つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基８０～９０のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基８５～９５のうちの少なくとも１つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基９０～１００のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基９５～１０５のうちの少なくとも１つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基１００～１１０のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基１０５～１１５のうちの少なくとも１つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基１１０～１２０のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基１１５～１２５のうちの少なくとも１つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基１２０～１３０のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基１２５～１３５のうちの少なくとも１つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基１３０～１４０のうちの少なくとも１つに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基１３５～１４５のうちの少なくとも１つに結合する。他の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ネクチン４に結合する場合に、配列番号１のアミノ酸配列内の残基１４０～１５０のうちの少なくとも１つに結合する。
上記で言及したアミノ酸のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はこれを超えるアミノ酸の任意の組合せによるネクチン４結合部位もまた想定される。
ある特定の実施形態では、抗体は、ネクチン４リガンド結合性部位とは別個である、ヒトネクチン４のＥＣＤのエピトープに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、ネクチン４リガンドの、ネクチン４への結合は、抗体により阻害されない。
本明細書の一態様では、ネクチン４に特異的に結合する抗体が提供される。本明細書のある特定の実施形態では、ヒトネクチン４のＥＣＤに特異的に結合する抗体が提供される。
ある特定の実施形態では、ネクチン４に特異的に結合する抗体は、ヒトネクチン４のＥＣＤ、又はヒトネクチン４のＥＣＤのエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗体は、ネクチン４リガンド結合性部位とは別個である、ヒトネクチン４のＥＣＤのエピトープに特異的に結合する。
ネクチン４活性は、公知であるか、又は当技術分野で記載されているネクチン４活性など、ネクチン４の任意の活性に関しうる。ネクチン４活性の非限定的な例は、ネクチン４受容体の二量体化、ネクチン４受容体の、他の受容体とのヘテロ二量体化、ネクチン４受容体のリン酸化、ネクチン４受容体の下流におけるシグナル伝達、細胞増殖（例えば、がん細胞増殖）の、ネクチン４リガンド誘導性増強などの細胞増殖、又は細胞生存（例えば、がん細胞）、ネクチン４リガンド誘導性抗アポトーシス活性を含む。本明細書では、ネクチン４活性又はネクチン４機能を互換的に使用する。ある特定の態様では、ネクチン４活性は、ネクチン４リガンドの、ネクチン４受容体への結合により誘導される。ある特定の実施形態では、ネクチン４の活性又はシグナル伝達の増大は、ネクチン４受容体の高発現（又は過剰発現）に起因して、ネクチン４リガンドの、ネクチン４受容体への結合の非存在下で生じうる。細胞内のネクチン４の高発現又は過剰発現とは、正常なネクチン４発現若しくはネクチン４活性を有することが既知である基準細胞の発現レベルを、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、若しくは５００％超えるか、又は正常なネクチン４発現若しくはネクチン４活性を有することが既知である、細胞又は試料の集団内の、ネクチン４の平均発現レベルを超える発現レベルを指す。ネクチン４の発現レベルは、本明細書で記載されるか、又は当業者に公知の方法（例えば、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、又はＩＨＣ）により評価することができる。
１０．ポリクローナル抗体
本開示の抗体は、ポリクローナル抗体を含みうる。ポリクローナル抗体を調製する方法は、当業者に公知である。ポリクローナル抗体は、哺乳動物において、例えば、免疫化剤、及び、所望の場合、アジュバントの、１回又は複数回の注射により惹起することができる。典型的に、免疫化剤及び／又はアジュバントは、哺乳動物において、複数回の皮下注射又は腹腔内注射により注射する。免疫化剤は、ネクチン４ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を、免疫化される哺乳動物において、免疫原性であることが公知のタンパク質とコンジュゲートするか、又は哺乳動物を、タンパク質と、１又は複数のアジュバントとで免疫化することは、有用でありうる。このような免疫原性タンパク質の例は、スカシガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロビン、及びダイズトリプシン阻害剤を含むがこれらに限定されない。用いられうるアジュバントの例は、Ｒｉｂｉ、ＣｐＧ、Ｐｏｌｙ１Ｃ、フロイントの完全アジュバント、及びＭＰＬ－ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成ジコリノミコール酸トレハロース）を含む。免疫化プロトコールは、当業者が、不要な実験を伴わずに選択することができる。次いで、哺乳動物から採血し、血清を、ネクチン４抗体力価についてアッセイすることができる。所望の場合、抗体力価が、増大するか、又はプラトー状態に達するまで、哺乳動物に追加投与することができる。加えて、又は代替的に、リンパ球は、下記で記載されるハイブリドーマからのモノクローナル抗体の融合及び調製のために、免疫化動物から得ることもできる。
１１．モノクローナル抗体
本開示の抗体は、代替的に、モノクローナル抗体でありうる。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５～９７により最初に記載された、ハイブリドーマ方法を使用して作ることもでき、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）により作ることもできる。
ハイブリドーマ方法では、マウス又はハムスターなど、他の適切な宿主動物を、上記で記載した通りに免疫化して、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、又はこれらを産生することが可能なリンパ球を誘発する。代替的に、リンパ球は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて免疫化することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離し、次いで、ポリエチレングリコールなど、適切な融合剤を使用して、骨髄腫細胞系と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、「モノクローナル抗体：原理と実際（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、５９～１０３（１９８６））。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、ある特定の実施形態では、融合させていない、親骨髄腫細胞（また、融合パートナーとも称する）の増殖又は生存を阻害する、１又は複数の物質を含有する、適切な培養培地中に播種し、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素である、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための選択的培養培地は、典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これは、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。
例示的な、融合パートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による、安定的な高レベルの抗体の産生を支援し、融合させていない親細胞に対して選択する選択的培地に感受性である骨髄腫細胞である。例示的な骨髄腫細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能な、ＳＰ－２細胞及び派生細胞、例えば、Ｘ６３－Ａｇ８－６５３細胞などのマウス骨髄腫系、並びにＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能な、ＭＯＰＣ－２１マウス腫瘍及びＭＰＣ－１１マウス腫瘍に由来する、マウス骨髄腫系である。ヒトモノクローナル抗体を作製するための、ヒト骨髄腫細胞系及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞系についてもまた、記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１～０５；及びＢｒｏｄｅｕｒら、「モノクローナル抗体の作製技法と応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、５１～６３（１９８７））。
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地を、抗原を指向するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、又はＲＩＡ若しくはＥＬＩＳＡなど、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける結合アッセイにより決定する。モノクローナル抗体の結合アフィニティーは、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、１９８０、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０～３９において記載されている、スカッチャード解析により決定することができる。
所望の特異性、アフィニティー、及び／又は活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定したら、クローンを、限界希釈手順によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ、前出）。この目的に適する培養培地は、例えば、ＤＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ－１６４０培地を含む。加えて、例えば、細胞の、マウスへの、ｉ．ｐ．注射により、ハイブリドーマ細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、動物における腹水腫瘍として増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体を、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ－セファロース又はプロテインＧ－セファロースを使用する）又はイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析など、従来の抗体精製手順により、培養培地、腹水、又は血清から、適切に分離する。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、たやすく単離され、シーケンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの供給源として用いられうる。単離したら、ＤＮＡを、発現ベクターに入れることができ、次いで、そうしなければ抗体タンパク質を産生しない、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞に、これらをトランスフェクトして、組換え宿主細胞内の、モノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードするＤＮＡの、細菌内の組換え発現についての総説論文は、Ｓｋｅｒｒａら、１９９３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５：２５６～６２、及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、１９９２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．、１３０：１５１～８８を含む。
一部の実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体は、厳密な条件（例えば、結合したＤＮＡを、６倍濃度の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃で濾過するハイブリダイゼーションに続く、０．２倍濃度のＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中、約５０～６５℃で、１回又は複数回の洗浄）下で、高度に厳密な条件（例えば、結合した核酸を、６倍濃度のＳＳＣ中、約４５℃で濾過するハイブリダイゼーションに続く、０．１倍濃度のＳＳＣ／０．２％のＳＤＳ中、約６８℃で、１回又は複数回の洗浄）下で、又は当業者に公知である、他の厳密なハイブリダイゼーション条件下で、本明細書で記載されるＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインのうちのいずれか１つをコードするヌクレオチド配列の相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる、ＶＨドメインのアミノ酸配列及び／又はＶＬドメインのアミノ酸配列を含む。例えば、「分子生物学における最新のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｉ巻、６．３．１～６．３．６及び２．１０．３（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８９）を参照されたい。
一部の実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体は、厳密な条件（例えば、結合したＤＮＡを、６倍濃度のＳＳＣ中、約４５℃で濾過するハイブリダイゼーションに続く、０．２倍濃度のＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中、約５０～６５℃で、１回又は複数回の洗浄）下で、高度に厳密な条件（例えば、結合した核酸を、６倍濃度のＳＳＣ中、約４５℃で濾過するハイブリダイゼーションに続く、０．１倍濃度のＳＳＣ／０．２％のＳＤＳ中、約６８℃で、１回又は複数回の洗浄）下で、又は当業者に公知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照されたい）、他の厳密なハイブリダイゼーション条件下で、表１に描示されたＶＨ ＣＤＲ及び／又はＶＬ ＣＤＲのうちのいずれか１つをコードするヌクレオチド配列の相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる、ＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列又はＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態では、モノクローナル抗体又は抗体断片は、例えば、「抗体のファージディスプレイ：方法及びプロトコール（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ及びＡｉｔｋｅｎ編、２００２）において記載されている技法を使用して作出された抗体ファージライブラリーから単離することができる。ファージディスプレイ方法では、機能的な抗体ドメインを、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面上に提示する。本明細書で記載される抗体を作製するのに使用されうるファージディスプレイ方法の例は、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２：４１～５０；Ａｍｅｓら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８４：１７７～１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：９５２～９５８；Ｐｅｒｓｉｃら、１９９７、Ｇｅｎｅ、１８７：９～１８；Ｂｕｒｔｏｎら、１９９４、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５７：１９１～２８０；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号；国際公開第ＷＯ９０／０２８０９号、同第ＷＯ９１／１０７３７号、同第ＷＯ９２／０１０４７号、同第ＷＯ９２／１８６１９号、同第ＷＯ９３／１１２３６号、同第ＷＯ９５／１５９８２号、同第ＷＯ９５／２０４０１号、及び同第ＷＯ９７／１３８４４号；並びに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号、及び同第５，９６９，１０８号において開示されているファージディスプレイ方法を含む。
原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質へと融合させた、抗体可変領域（Ｆｖ）の多様な断片を提示するファージを含有するファージライブラリーをスクリーニングすることにより選択する。このようなファージライブラリーを、所望の抗原に対してスクリーニングする。所望の抗原への結合が可能なＦｖ断片を発現するクローンは、抗原へと吸着されるので、ライブラリー内の非結合クローンから分離される。次いで、結合クローンを、抗原から溶離させ、抗原への吸着／溶離の、さらなるサイクルにより、さらに濃縮する。
可変ドメインは、例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、１９９４、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：４３３～５５において記載されている通り、ＶＨとＶＬとを、短い可撓性ペプチドを介して、共有結合的に連結した、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はＶＨ及びＶＬの各々を、定常ドメインへと融合させ、非共有結合的に相互作用させたＦａｂ断片として、ファージ上で、機能的に提示することができる。
ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、Ｗｉｎｔｅｒら、前出において記載されている通り、ＰＣＲにより、個別にクローニングし、ファージライブラリー内で、ランダムに組み換え、次いで、これらを、抗原結合性クローンについて検索することができる。免疫化供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマの構築を要求せずに、免疫原に対する、高アフィニティーの抗体をもたらす。代替的に、ナイーブレパートリーをクローニングして、広範にわたる非自己に対するヒト抗体の単一の供給源をもたらし、また、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９３、ＥＭＢＯ Ｊ、１２：７２５～３４により記載されている、免疫化を伴わない自己抗原に対するヒト抗体の単一の供給源ももたらすことができる。最後に、ナイーブライブラリーはまた、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１～８８により記載されている通り、幹細胞に由来する、再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける再配列を達成することにより、合成により作ることもできる。
ライブラリーのスクリーニングは、当技術分野で公知の、多様な技法により達することができる。例えば、ネクチン４（例えば、ネクチン４のポリペプチド、断片、又はエピトープ）は、吸着プレートのウェルをコーティングするのに使用することもでき、吸着プレートへと固定した宿主細胞上で発現させることもでき、細胞分取において使用することもでき、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズによる捕捉のために、ビオチンへとコンジュゲートさせることもでき、パニングディスプレイライブラリーのための、他の任意の方法において使用することもできる。解離反応速度の遅い（例えば、結合アフィニティーが良好な）抗体の選択は、Ｂａｓｓら、１９９０、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、８：３０９～１４；及び同第ＷＯ９２／０９６９０号において記載されている、長時間の洗浄及び一価ファージディスプレイの使用、並びにＭａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０：７７９～８３において記載されている、抗原の低コーティング密度の使用により促進することができる。
抗ネクチン４抗体は、目的のファージクローンを選択するための、適切な抗原スクリーニング手順に続き、Ｋａｂａｔら、前出において記載されている、目的のファージクローン及び適切な定常領域（例えば、Ｆｃ）配列に由来する、ＶＨ配列及び／又はＶＬ配列（例えば、Ｆｖ配列）、又はＶＨ配列及びＶＬ配列に由来する、多様なＣＤＲ配列を使用する、全長抗ネクチン４抗体クローンの構築をデザインすることにより得ることができる。
本明細書で記載される抗体はまた、例えば、キメラ抗体も含みうる。キメラ抗体とは、抗体の異なる部分が、異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。例えば、キメラ抗体は、ヒト抗体の定常領域へと融合させた、マウスモノクローナル抗体又はラットモノクローナル抗体の可変領域を含有しうる。当技術分野では、キメラ抗体を作製するための方法が公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１２０２；Ｏｉら、１９８６、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４：２１４；Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２５：１９１～２０２；並びに米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、同第４，８１６，３９７号、及び同第６，３３１，４１５号を参照されたい。
本明細書で記載される技法などの技法を使用して作製される、抗体又は抗原結合性断片は、周知の標準的な技法を使用して単離することができる。例えば、抗体又は抗原結合性断片は、例えば、プロテインＡ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなど、従来の免疫グロブリン精製手順により、例えば、培養培地、腹水、血清、細胞溶解物、合成反応材料などから、適切に分離することができる。本明細書で使用される、「単離」抗体又は「精製」抗体は、抗体が由来する、細胞供給源若しくは組織供給源に由来する、細胞物質若しくは他のタンパク質を実質的に含まないか、又は化学合成される場合の、化学的前駆物質若しくは他の化学物質を実質的に含まない。
１２．抗体断片
本開示は、ネクチン４に結合する抗体及び抗体断片を提供する。ある特定の状況では、全抗体ではなく、抗体断片を使用することが有利である。小サイズの断片は、急速なクリアランスを可能とし、細胞、組織、又は臓器への接近の改善をもたらしうる。ある特定の抗体断片の総説については、Ｈｕｄｓｏｎら、２００３、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、９：１２９～３４を参照されたい。
抗体断片を産生するための多様な技法が開発されている。従来、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化を介して導出された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４：１０７～１７；及びＢｒｅｎｎａｎら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１～８３を参照されたい）。しかし、今やこれらの断片は、組換え宿主細胞に直接産生させることができる。Ｆａｂ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、及びｓｃＦｖ抗体断片は全て、大腸菌又は酵母細胞で発現し、大腸菌又は酵母細胞から分泌されうるので、大量のこれらの断片の、容易な作製が可能となる。抗体断片は、上記で論じた抗体ファージライブラリーから単離することができる。代替的に、Ｆａｂ’－ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングさせて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することもできる（Ｃａｒｔｅｒら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６３～６７）。別の手法に従い、Ｆ（ａｂ’）２断片を、組換え宿主細胞培養物から直接単離することもできる。ｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長したＦａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片であって、サルベージ受容体結合性エピトープ残基を含む上記断片については、例えば、米国特許第５，８６９，０４６号において記載されている。当業者には、抗体断片を作製するための他の技法も明らかであろう。ある特定の実施形態では、抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である（例えば、ＷＯ９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい）。Ｆｖ及びｓｃＦｖは、定常領域を欠くインタクトな結合性部位を有するので、ｉｎ ｖｉｖｏにおける使用時に、非特異的結合を低減するのに適する。ｓｃＦｖによる融合タンパク質を構築して、ｓｃＦｖのアミノ末端又はカルボキシ末端における、エフェクタータンパク質の融合をもたらすこともできる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、前出を参照されたい）。例えば、抗体断片はまた、上記で引用した参考文献において記載されている「直鎖状抗体」でもありうる。
小型の、抗体由来の結合性構造は、単一可変ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）ともまた称する、個別の可変ドメイン（Ｖドメイン）である。ある特定の種類の生物である、ラクダ科動物及び軟骨魚は、Ｆｃと同等なドメイン構造上に搭載された、高アフィニティーの単一のＶ様ドメインを、それらの免疫系の一部として有する（Ｗｏｏｌｖｅｎら、１９９９、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、５０：９８～１０１；及びＳｔｒｅｌｔｓｏｖら、２００４、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．、１０１：１２４４４～４９）。Ｖ様ドメイン（ラクダ科動物では、ＶｈＨと呼ばれ、サメでは、Ｖ－ＮＡＲと呼ばれる）は、典型的に、標的抗原の空隙への貫入を可能とする、長い表面ループを提示する。Ｖ様ドメインはまた、疎水性表面パッチをマスキングすることにより、孤立したＶＨドメインを安定化させもする。
これらのＶｈＨドメイン及びＶ－ＮＡＲドメインは、ｓｄＡｂを操作するのに使用されている。ファージライブラリーからの選択及び他の手法を使用して、ヒトＶドメイン変異体がデザインされており、これらは、安定的で、結合性が高度の、ＶＬ由来ドメイン及びＶＨ由来ドメインを結果としてもたらした。
本明細書で提供される抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、例えば、ネクチン４エピトープに結合する抗原結合性部位を含有する分子を含むがこれらに限定されない。本明細書で提供される免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）又は任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）の抗体でありうる。
抗体の変異体及び誘導体は、ネクチン４エピトープに結合する能力を保持する、抗体の機能的断片を含む。例示的な機能的断片は、Ｆａｂ断片（例えば、抗原結合性ドメインを含有し、ジスルフィド結合により架橋された、軽鎖及び重鎖の一部を含む抗体断片）；Ｆａｂ’（例えば、Ｆａｂと、ヒンジ領域を介する重鎖のさらなる部分とを含む、単一の抗原結合性ドメインを含有する抗体断片）；Ｆ（ａｂ’）２（例えば、重鎖のヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合により接合させた、２つのＦａｂ’分子；Ｆａｂ’分子は、同じエピトープを指向する場合もあり、異なるエピトープを指向する場合もある）；ｓｃＦｖとしてもまた公知である、可変領域を含む単鎖（例えば、１０～２５アミノ酸の鎖により、一体に連結された、抗体の単一の軽鎖及び重鎖の可変性の抗原結合性決定領域）；ジスルフィド連結Ｆｖ又はｄｓＦｖ（例えば、ジスルフィド結合により、一体に連結された、抗体の単一の軽鎖及び重鎖の可変性の抗原結合性決定領域）；ラクダ化ＶＨ（例えば、ＶＨインターフェースにおける一部のアミノ酸が、天然に存在するラクダ抗体の重鎖内で見出される抗体の単一の重鎖の可変性の抗原結合性決定領域）を含む。
１３．ヒト化抗体
本明細書で記載される抗体は、例えば、ヒト化抗体、例えば、脱免疫化ヒト抗体又は複合ヒト抗体を含みうる。
ヒト化抗体は、ヒト定常領域の配列を含みうる。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む、免疫グロブリンの任意のクラスと、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む、任意のアイソタイプとから選択することができる。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、カッパ又はラムダの軽鎖定常配列を含みうる。
ヒト化抗体は、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第ＥＰ２３９，４００号；国際公開第ＷＯ９１／０９９６７号；並びに米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、及び同第６，３１６，６５２号）、ベニヤ化又はリサーフェシング（欧州特許第ＥＰ５９２，１０６号及び同第ＥＰ５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、１９９１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２８（４／５）：４８９～４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７（６）：８０５～８１４；及びＲｏｇｕｓｋａら、１９９４、ＰＮＡＳ、９１：９６９～９７３）、鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）、及び、例えば、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、ＷＯ９３１７１０５号、Ｔａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６９：１１１９２５（２００２）、Ｃａｌｄａｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３（５）：３５３～６０（２０００）、Ｍｏｒｅａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０（３）：２６７７９（２０００）、Ｂａｃａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２（１６）：１０６７８～８４（１９９７）、Ｒｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、９（１０）：８９５９０４（１９９６）、Ｃｏｕｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５５（増刊２３号）：５９７３～５９７７頁（１９９５）、Ｃｏｕｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５５（８）：１７１７～２２（１９９５）、Ｓａｎｄｈｕ ＪＳ、Ｇｅｎｅ、１５０（２）：４０９～１０（１９９４）、及びＰｅｄｅｒｓｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３５（３）：９５９～７３（１９９４）において開示されている技法を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の様々な技法を使用して作製することができる。また、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許公開第ＵＳ２００５／００４２６６４Ａ１号（２００５年２月２４日）も参照されたい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒトネクチン４を含むネクチン４に結合するヒト化抗体でありうる。例えば、本開示のヒト化抗体は、表１に示される、１又は複数のＣＤＲを含みうる。当技術分野では、非ヒト抗体をヒト化するための、多様な方法が公知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒト供給源である供給源から、それへと導入される、１又は複数のアミノ酸残基を有しうる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的に、「インポート」可変ドメインから採取される、「インポート」残基と称することが多い。ヒト化は、例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２～２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３～２７；及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４～３６の方法に従い、超可変領域の配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することにより実施することができる。
場合によって、ヒト化抗体は、親非ヒト抗体（例えば、齧歯動物）の、６つのＣＤＲのアミノ酸配列を、ヒト抗体フレームワークへとグラフトする、ＣＤＲグラフティングにより構築する。例えば、Ｐａｄｌａｎらは、実際に抗原に接触するのは、ＣＤＲ内の残基のうちの約３分の１だけであることを決定し、これらを「特異性決定残基」又はＳＤＲと名付けた（Ｐａｄｌａｎら、１９９５、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、９：１３３～３９）。ＳＤＲグラフティング技法では、ＳＤＲ残基だけを、ヒト抗体フレームワークへとグラフトする（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６：２５～３４を参照されたい）。
ヒト化抗体を作るのに使用される、ヒト可変ドメインの、軽鎖及び重鎖の両方の選択は、抗原性を低減するのに重要でありうる。例えば、いわゆる「ベストフィット」方法に従い、非ヒト（例えば、齧歯動物）抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリーの全体に対してスクリーニングする。齧歯動物の配列に最も近縁のヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワークとして選択することができる（Ｓｉｍｓら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２２９６～３０８；及びＣｈｏｔｈｉａら、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１～１７）。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定の亜群の、全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する、特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体のために、同じフレームワークを使用することができる（Ｃａｒｔｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５～８９；及びＰｒｅｓｔａら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２６２３～３２）。場合によって、フレームワークは、最も存在量が多いヒトサブクラスである、ＶＬ６亜群Ｉ（ＶＬ６Ｉ）及びＶＨ亜群ＩＩＩ（ＶＨＩＩＩ）のコンセンサス配列に由来する。別の方法では、ヒト生殖細胞系列遺伝子を、フレームワーク領域の供給源として使用する。
超ヒト化と呼ばれるＣＤＲの比較に基づく、代替的なパラダイムでは、ＦＲの相同性は、重要でない。方法は、非ヒト配列の、機能的なヒト生殖細胞系列遺伝子レパートリーとの比較からなる。次いで、マウス配列と同じであるか、又は近縁である、カノニカルな構造をコードする遺伝子を選択する。次に、カノニカルな構造を、非ヒト抗体と共有する遺伝子内で、ＣＤＲ内の相同性が最大である遺伝子を、ＦＲドナーとして選び出す。最後に、非ヒトＣＤＲを、これらのＦＲへとグラフトする（例えば、Ｔａｎら、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６９：１１１９～２５を参照されたい）。
さらに一般に、抗原に対するそれらのアフィニティー、及び他の好適な生物学的特性を保持しながら、抗体をヒト化することが所望される。この目標を達成するために、１つの方法に従い、ヒト化抗体を、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用する、親配列及び多様な概念上のヒト化産物に対する解析工程により調製する。三次元免疫グロブリンモデルが、一般に、利用可能であり、当業者は、これらに精通している。選択された候補免疫グロブリン配列の、蓋然的な三次元コンフォメーション構造を例示及び提示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらは、例えば、ＷＡＭ（Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇ及びＲｅｅｓ、２０００、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１３：８１９～２４）、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ（Ｓａｌｉ及びＢｌｕｎｄｅｌｌ、１９９３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３４：７７９～８１５）、及びＳｗｉｓｓ ＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒ（Ｇｕｅｘ及びＰｅｉｔｓｃｈ、１９９７、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１８：２７１４～２３）を含む。これらの表示についての精査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基に推測される役割についての解析、例えば、候補免疫グロブリンが、その抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基についての解析を可能とする。このようにして、標的抗原（単数又は複数）に対するアフィニティーの上昇など、所望の抗体特徴が、達成されるように、ＦＲ残基が、レシピエント配列及びインポート配列から選択され、組み合わされうる。一般に、超可変領域残基は、直接、且つ、最も実質的に、抗原結合への影響に関与しうる。
抗体をヒト化するための別の方法は、ＨＳＣ（Ｈｕｍａｎ Ｓｔｒｉｎｇ Ｃｏｎｔｅｎｔ）と称する抗体のヒト性についての計量に基づく。この方法は、マウス配列を、ヒト生殖細胞系列遺伝子のレパートリーと比較し、差違を、ＨＳＣとしてスコアリングする。次いで、グローバルな同一性尺度を使用して、複数の多様なヒト化変異体を作出するのではなく、そのＨＳＣを最大化することにより、標的配列をヒト化する（Ｌａｚａｒら、２００７、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４：１９８６～９８）。
上記で記載した方法に加えて、経験的方法を使用して、ヒト化抗体を作出し、選択することができる。これらの方法は、エンリッチメント技術又はハイスループットスクリーニング技法を使用する、ヒト化変異体の大規模なライブラリーの作出及び最良のクローンの選択に基づく方法を含む。抗体の変異体は、ファージライブラリー、リボソームライブラリー、及び酵母ディスプレイライブラリーから単離しうるほか、細菌コロニーのスクリーニングによっても単離することができる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、２００５、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３：１１０５～１６；Ｄｕｆｎｅｒら、２００６、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２４：５２３～２９；Ｆｅｌｄｈａｕｓら、２００３、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２１：１６３～７０；及びＳｃｈｌａｐｓｃｈｙら、２００４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．、１７：８４７～６０を参照されたい）。
ＦＲライブラリー手法では、残基変異体のコレクションを、ＦＲ内の特異的位置に導入に続き、ライブラリーをスクリーニングして、グラフトされたＣＤＲを、最もよく支持するＦＲを選択する。置換される残基は、ＣＤＲ構造に潜在的に寄与するものとして同定される「ベニヤ」残基の一部又は全部を含む場合もあり（例えば、Ｆｏｏｔｅ及びＷｉｎｔｅｒ、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２４：４８７～９９を参照されたい）、Ｂａｃａら（１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：１０６７８～８４）により同定される、標的残基の限定的なセットに由来する場合もある。
ＦＲシャフリングでは、全ＦＲを、選択された残基変異体のコンビナトリアルライブラリーを創出するのではなく、非ヒトＣＤＲと組み合わせる（例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６：４３～６０を参照されたい）。ライブラリーは、結合について、まず、ＶＬをヒト化するのに続き、ＶＨをヒト化する、２ステップ工程でスクリーニングすることができる。代替的に、１ステップのＦＲシャフリング工程も使用することができる。このような工程は、結果として得られる抗体が、発現の増強、アフィニティーの増大、及び熱的安定性を含む、生化学的特性及び物理化学的特性の改善を呈したので、２ステップスクリーニングより効率的であることが示されている（例えば、Ｄａｍｓｃｈｒｏｄｅｒら、２００７、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４：３０４９～６０を参照されたい）。
「ヒューマニアリング」方法は、実験による、不可欠のＭＳＤ（ｍｉｎｉｍｕｍ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）の同定に基づき、非ヒト断片の、ヒトＦＲライブラリーへの逐次的な置きかえ及び結合の評価に基づく。ヒューマニアリング方法は、非ヒトＶＨ鎖及び非ヒトＶＬ鎖のＣＤＲ３の領域で始まり、ＶＨ及びＶＬの両方の、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含む、非ヒト抗体の他の領域を、ヒトＦＲへと、徐々に置きかえる。この方法は、典型的に、顕著に異なるヒトＶセグメントのＣＤＲを伴う、複数のサブクラスからの、エピトープの保持及び抗体の同定を結果としてもたらす。ヒューマニアリングは、ヒト生殖細胞系列遺伝子による抗体と、９１～９６％相同な抗体の単離を可能とする（例えば、Ａｌｆｅｎｉｔｏ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ｔｈｉｒｄ Ａｎｎｕａｌ ＰＥＧＳ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｕｍｍｉｔ、２００７を参照されたい）。
「ヒト操作」方法は、ヒトにおける免疫原性を低減する一方で、元の非ヒト抗体の所望の結合特性を保持する修飾抗体を作製するように、抗体のアミノ酸配列へと特異的変化を施すことにより、マウス抗体又はキメラ抗体又は抗体断片などの非ヒト抗体又は抗体断片を変更するステップを伴う。一般に、技法は、非ヒト（例えば、マウス）抗体のアミノ酸残基を、「低危険性」残基、「中程度の危険性」残基、又は「高危険性」残基として分類するステップを伴う。分類は、特定の置換を施すことに予測される利益（例えば、ヒトにおける免疫原性のための）を、結果として得られる抗体のフォールディングに置換が影響を及ぼす危険性に対して査定する、グローバルな危険性／有益性の計算を使用して実施する。非ヒト（例えば、マウス）抗体配列の、所与の位置（例えば、低危険性又は中程度の危険性）において置換される、特定のヒトアミノ酸残基は、非ヒト抗体の可変領域に由来するアミノ酸配列を、特異的であるか、又はコンセンサスのヒト抗体配列の、対応する領域とアライメントすることにより選択することができる。アライメントに従い、低危険性又は中程度の危険性の位置における、非ヒト配列内のアミノ酸残基で、ヒト抗体配列内の対応する残基を置換することができる。ヒト操作タンパク質を作るための技法については、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７：８０５～１４；米国特許第５，７６６，８８６号；同第５，７７０，１９６号；同第５，８２１，１２３号；及び同第５，８６９，６１９号；及びＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１１７９４号において、より詳細に記載されている。
複合ヒト抗体は、例えば、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）技術（Ａｎｔｉｔｏｐｅ Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して作出することができる。複合ヒト抗体を作出するために、可変領域の配列を、Ｔ細胞エピトープを回避する形で、複数のヒト抗体の可変領域の配列の断片からデザインし、これにより、結果として得られる抗体の免疫原性を最小化する。このような抗体は、ヒト定常領域の配列、例えば、ヒト軽鎖定常領域及び／又はヒト重鎖定常領域を含みうる。
脱免疫化抗体とは、Ｔ細胞エピトープが除去された抗体である。脱免疫化抗体を作るための方法については、記載されている。例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、２００９；５２５：４０５～２３、ｘｉｖ、及びＤｅ Ｇｒｏｏｔら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４４：１４８～１５３（２００６）を参照されたい。脱免疫化抗体は、Ｔ細胞エピトープ枯渇可変領域と、ヒト定常領域とを含む。略述すると、抗体のＶＨ及びＶＬを、クローニングし、その後、Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、抗体のＶＨ及びＶＬに由来する重複ペプチドを調べることにより、Ｔ細胞エピトープを同定する。コンピューターによる方法を介して、Ｔ細胞エピトープを同定して、ヒトＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドを同定する。ＶＨ及びＶＬに、突然変異を導入して、ヒトＭＨＣクラスＩＩへの結合を失効化させる。次いで、突然変異させたＶＨ及びＶＬを利用して、脱免疫化抗体を作出する。
１４．ヒト抗体
具体的な実施形態では、抗体は、完全ヒト抗ヒト抗体である。完全ヒト抗体は、当技術分野で公知である、任意の方法により作製することができる。ヒト抗ネクチン４抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択される、Ｆｖクローン可変ドメイン配列（単数又は複数）を、公知のヒト定常ドメイン配列（単数又は複数）と組み合わせることにより構築することができる。代替的に、本開示の抗ネクチン４ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法により作ることができる。ヒトモノクローナル抗体を作製するための、ヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞系については、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１～０５；Ｂｒｏｄｅｕｒら、「モノクローナル抗体の作製技法と応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、５１～６３（１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：８６～９５により記載されている。
また、免疫化されると、内因性免疫グロブリンの産生の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能な、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することも可能である。ヒト抗体レパートリーを発現するトランスジェニックマウスは、多種多様な潜在的薬物標的に対する、高アフィニティーヒト配列モノクローナル抗体を作出するのに使用されている（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．、１９９５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、６（５）：５６１～６６；Ｂｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ及びＴａｕｓｓｉｎｇ、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８（４）：４５５～５８；米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号；並びにＬｏｎｂｅｒｇら、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３：１１１７～２５を参照されたい）。
代替的に、ヒト抗体は、標的抗原を指向する抗体を産生する、ヒトＢリンパ球の不死化を介して調製することもできる（例えば、このようなＢリンパ球は、個体から回収することもでき、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて免疫化しておくこともできる）（例えば、Ｃｏｌｅら、「モノクローナル抗体とがん治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６～９５；及び米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい）。
また、遺伝子シャフリングも、ヒト抗体を、非ヒト抗体、例えば、齧歯動物抗体から導出するのにも使用することができ、この場合、ヒト抗体は、非ヒト出発抗体と同様のアフィニティー及び特異性を有する。「エピトープインプリンティング」又は「誘導式選択」ともまた呼ばれるこの方法に従い、本明細書で記載されるファージディスプレイ技法により得られる、非ヒト抗体断片の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置きかえ、非ヒト鎖／ヒト鎖によるｓｃＦｖキメラ又はＦａｂキメラの集団を創出する。抗原による選択の結果として、非ヒト鎖／ヒト鎖によるキメラｓｃＦｖ又はキメラＦａｂが単離され、この場合、ヒト鎖は、初代ファージディスプレイクローン内で、対応する非ヒト鎖を除去したときに破壊される抗原結合性部位を回復する（例えば、エピトープは、ヒト鎖パートナーの選択を誘導する（刷り込まれる））。残存する非ヒト鎖を置きかえるための工程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる（ＰＣＴ ＷＯ９３／０６２１３；及びＯｓｂｏｕｒｎら、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６：６１～６８を参照されたい）。従来の、非ヒト抗体の、ＣＤＲグラフティングによるヒト化と異なり、この技法は、非ヒト由来のＦＲ残基又はＣＤＲ残基を有さない、完全ヒト抗体をもたらす。細胞表面抗原に対するマウス抗体をヒト化する、誘導式選択の例は、卵巣がん細胞上に存在する、葉酸結合性タンパク質（例えば、Ｆｉｇｉｎｉら、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５８：９９１～９６を参照されたい）、及び肝細胞癌上で高度に発現する、ＣＤ１４７（例えば、Ｂａｏら、２００５、がんＢｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．、４：１３７４～８０を参照されたい）を含む。
誘導式選択手法の潜在的な欠点は、１つの抗体鎖をシャフリングしながら、他の抗体鎖を一定に保てば、エピトープドリフトを結果としてもたらしうることである。非ヒト抗体により認識されるエピトープを維持するために、ＣＤＲ保持を適用することができる（例えば、Ｋｌｉｍｋａら、２０００、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８３：２５２～６０；及びＢｅｉｂｏｅｒら、２０００、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９６：８３３～４９を参照されたい）。この方法では一般に、非ヒトＶＨ ＣＤＲ３は、抗原結合性部位の中心にある場合があり、抗原認識のための、抗体の最重要領域でありうるので、このＣＤＲを保持する。しかし、一部の場合には、非ヒト抗体の、ＶＨ ＣＤＲ３及びＶＬ ＣＤＲ３のほか、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ１を保持することもできる。
１５．多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体より急速に内部化されうる（及び／又は異化されうる）。本開示の抗体は、３つ又はこれを超える抗原結合性部位を伴う多価抗体（ＩｇＭクラス以外の抗体である）（例えば、四価抗体）の場合があり、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により、たやすく作製することができる。多価抗体は、二量体化ドメイン、及び３つ又はこれを超える抗原結合性部位を含みうる。ある特定の実施形態では、二量体化ドメインは、Ｆｃ領域又はヒンジ領域を含む（又はこれらからなる）。この状況では、抗体は、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域に対してアミノ末端側にある、３つ又はこれを超える抗原結合性部位とを含むであろう。ある特定の実施形態では、多価抗体は、例えば、３つ～約８つの抗原結合性部位を含む（又はこれらからなる）。このような一実施形態では、多価抗体は、４つの抗原結合性部位を含む（又はこれらからなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（例えば、２つのポリペプチド鎖）を含み、この場合、ポリペプチド鎖（単数又は複数）は、２つ又はこれを超える可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖（単数又は複数）は、ＶＤ１－（Ｘ１）ｎ－ＶＤ２－（Ｘ２）ｎ－Ｆｃ［配列中、ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２は、アミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは、０又は１である］を含みうる。例えば、ポリペプチド鎖（単数又は複数）は、ＶＨ－ＣＨ１－可撓性リンカー－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ領域鎖を含みうる。本明細書の多価抗体は、少なくとも２つ（例えば、４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドもさらに含みうる。本明細書の多価抗体は、例えば、約２つ～約８つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含みうる。本明細書で想定される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意選択で、ＣＬドメインをさらに含む。
１６．Ｆｃの操作
本明細書で提供される抗ネクチン４抗体を、Ｆｃの操作により修飾することが所望されうる。ある特定の実施形態では、抗体のＦｃ領域への修飾は、抗体のエフェクター機能の減少又は消失を結果としてもたらす。ある特定の実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び／又はＣＤＣである。一部の実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。他の実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＰである。他の実施形態では、エフェクター機能は、ＣＤＣである。一実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰである。一実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣである。一実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＰ及びＣＤＣである。一実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣである。これは、抗体のＦｃ領域内に、１又は複数のアミノ酸置換を導入することにより達成することができる。
抗体の血清半減期を延長するために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号において記載されている通りに、サルベージ受容体結合性エピトープを、抗体（とりわけ、抗体断片）へと組み込むことができる。「サルベージ受容体結合性エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープであって、ＩｇＧ分子の、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を延長する一因となるエピトープを指す。
１７．代替的な結合剤
本開示は、本明細書で開示される抗ネクチン４抗体と同じエピトープに特異的に結合する、非免疫グロブリン結合剤を包含する。一部の実施形態では、非免疫グロブリン結合剤は、競合的結合アッセイにおいて、本開示の抗ネクチン４抗体を押しやるか、又はこれにより押しやられる薬剤として同定される。これらの代替的な結合剤は、例えば、当技術分野で公知である、操作タンパク質足場のうちのいずれかを含みうる。このような足場は、表１に示される、１又は複数のＣＤＲを含みうる。このような足場は、例えば、リガンド結合性部位を形成する、４つの超可変ループを支持する、非可撓性のベータ－バレルを特徴とするタンパク質構造である、リポカリン足場に基づく、アンチカリンを含む。新規の結合特異性は、機能ディスプレイ及び誘導式選択と組み合わせた、ループ領域内の、ターゲティングされたランダム突然変異誘発により操作することができる（例えば、Ｓｋｅｒｒａ、２００８、ＦＥＢＳ Ｊ．、２７５：２６７７～８３を参照されたい）。他の適切な足場は、例えば、ヒトフィブロネクチンＩＩＩの第１０細胞外ドメインに基づく、アドネクチン又はモノボディー（例えば、Ｋｏｉｄｅ及びＫｏｉｄｅ、２００７、Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３５２：９５～１０９を参照されたい）；ブドウ球菌性プロテインＡのＺドメインに基づく、アフィボディー（例えば、Ｎｙｇｒｅｎら、２００８、ＦＥＢＳ Ｊ．、２７５：２６６８～７６を参照されたい））；アンキリンリピートタンパク質に基づく、ＤＡＲＰｉｎｓ（例えば、Ｓｔｕｍｐｐら、２００８、Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ、１３：６９５～７０１を参照されたい））；ヒトＦｙｎタンパク質キナーゼのＳＨ３ドメインに基づく、フィノマー（例えば、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉら、２００７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８２：３１９６～２０４を参照されたい））；スルフォロブス・アシドラリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｌａｒｉｕｓ）に由来するＳａｃ７ｄに基づく、アフィチン（例えば、Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋら、２００８、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３８３：１０５８～６８を参照されたい））；ヒトｙ－Ｂ－クリスタリンに基づく、アフィリン（例えば、Ｅｂｅｒｓｂａｃｈら、２００７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３７２：１７２～８５を参照されたい））；膜受容体タンパク質のＡドメインに基づく、アビマー（例えば、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００５、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３：１５５６～６１を参照されたい）；システインに富むノッティンペプチド（例えば、Ｋｏｌｍａｒ、２００８、ＦＥＢＳ Ｊ．、２７５：２６８４～９０を参照されたい）；及び操作Ｋｕｎｉｔｚ型阻害剤（例えば、Ｎｉｘｏｎ及びＷｏｏｄ、２００６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖ．、９：２６１～６８を参照されたい）を含みうる。総説については、例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ及びＳｋｅｒｒａ、２００９、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、１３：２４５～５５を参照されたい。
１８．ネクチン４特異的抗体についてのスクリーニング
上記では、抗体を作出するための技法について記載してきた。抗体は、所望に応じて、ネクチン４に対するそれらの結合特異性など、ある特定の生物学的特徴について、さらにスクリーニング又は選択することができる。標的抗原に特異的な抗体についてのスクリーニングは、２つの側面を伴う。まず、抗体のスクリーニングは、ネクチン４を含有しない試料に結合しないか、又はこれへの結合が低度である抗体を同定する。スクリーニングのこの側面は、ネクチン４を特異的に認識し、これに結合するが、ネクチン４以外の分子を実質的に認識しないか、又はこれらに結合しない抗体を同定する。第２に、抗体のスクリーニングは、ネクチン４を含む試料に、強く、又は高アフィニティーで結合する抗体を同定する。スクリーニングのこの側面は、ネクチン４に対する高アフィニティーを有し、下記で記載される多様なアッセイにおいて、強い検出シグナルをもたらしうる抗体を同定する。両方の側面における、抗体についてのスクリーニングは、下記でさらに記載される、イムノアッセイを使用して達することができる。
ある特定の実施形態では、まず、マイクロ滴定プレートを、ネクチン４タンパク質又はその断片でコーティングする、ＥＬＩＳＡを使用して、抗体をスクリーニングする。固定化ネクチン４に結合しないか、又はこれへの結合が弱い抗体のクローンを除去する。一部の実施形態では、例えば、ネクチン１、ネクチン２、又はネクチン３でコーティングされたマイクロ滴定プレートを使用して、イムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡベースのアッセイ又はウェスタンブロットアッセイにおいて、他のネクチンアイソフォームに対する反応性について、ネクチン４に結合する抗体を、さらにスクリーニングすることができる。ネクチンの別のアイソフォームに対して反応性である抗体のクローンを除去し、ネクチン４に対して反応性である抗体のクローンだけを、さらなるスクリーニングのために選択することができる。
抗ネクチン４抗体は、ネクチン４を発現しないか、又はこの発現が低レベルである陰性対照へのその結合についてさらにスクリーニングすることができる。このようなスクリーンのために、抗体の多様なクローンと陰性対照との結合を、イムノアッセイ、例えば、ＩＨＣアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、又は免疫ブロットアッセイにおいて決定することができる。任意の陰性対照に対して反応性である抗体のクローンを除去する。異なる陰性対照（例えば、ネクチン４の発現について陰性である、異なる組織又は細胞系）は、異なる分子のセットを含有しうるので、複数の陰性対照を使用して、候補抗ネクチン４抗体が、非ネクチン４分子の多様なセットに対して選択されることを確認することができる。
抗ネクチン４抗体は、ネクチン４を発現することが公知である陽性対照への結合についてさらにスクリーニングすることができる。このようなスクリーンのために、抗体の多様なクローンと陽性対照との結合を、イムノアッセイ、例えば、ＩＨＣアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、又は免疫ブロットアッセイにおいて決定することができる。陽性対照に強く結合する抗体のクローンを選択する。陽性対照への結合が強く、且つ、陰性対照への結合が弱い、抗ネクチン４抗体を、ネクチン４に特異的な抗体として選択することができる。陽性対照に結合した抗ネクチン４抗体の量と、陰性対照に結合した抗ネクチン４抗体の量との差違は、この抗ネクチン４抗体の、ネクチン４に対する比結合である。比結合は、特異的な抗ネクチン４抗体を選択するための基準のうちの１つとして使用することができる。特異的抗体は、下記で詳細に記載されるイムノアッセイにおいて、高比結合をもたらす。
一部の実施形態では、抗ネクチン４抗体の特異性は、抗ネクチン４抗体の、陰性基準物質及び陽性基準物質への結合を、他の手段により決定された、これらの基準物質中の、既知のネクチン４発現レベルと相関させるか、又は比較することにより決定することができる。基準ネクチン４発現は、下記で記載される、ネクチン４陽性対照又はネクチン４陰性対照でありうる。特異的な抗ネクチン４抗体の、試料又は基準物質への結合は、試料中又は基準物質中のネクチン４の発現と相関又は比例する。すなわち、特異的な抗ネクチン４抗体は、高レベルのネクチン４を発現する試料又は基準物質に強く結合し、中レベルを発現する試料又は基準物質に中程度に結合し、低レベルを発現する試料又は基準物質に弱く結合し、ネクチン４を発現しない試料又は基準物質に最小限に結合する（例えば、アイソタイプ対照抗体が結合するのと同じレベルで結合する）。陰性対照又は陽性対照における、既知のネクチン４発現は、下記で詳細に記載されるｑＰＣＲアッセイにより、独立に決定することができる。既知のネクチン４発現はまた、ネクチン４特異的であることが既に決定されている抗ネクチン４抗体を用いる、下記に記載される、任意のイムノアッセイを使用して、独立に決定することもできる。陰性対照及び陽性対照におけるネクチン４の発現を確認するのに適切なイムノアッセイは、例を目的として、いかなる限定も伴わずに述べると、下記で詳細に記載される、ＩＨＣアッセイ、免疫ブロットアッセイ、ＦＡＣＳアッセイ、又はＥＬＩＳＡを含む。一部の実施形態では、陰性対照中のネクチン４ ｍＲＮＡレベルは、下記で記載される通り、アッセイのバックグラウンドノイズに起因して、又は生物学的に著明ではない、低レベルの残存ネクチン４に起因して、ゼロではありえない。ネクチン４陰性対照は、例えば、ｑＰＣＲアッセイにおけるネクチン４ ｍＲＮＡレベルが、非特異的プライマーのセットにより検出されるｍＲＮＡのレベルと、実質的に同様である場合、又はネクチン４ ｍＲＮＡレベルが、ネクチン４陽性対照におけるにおけるネクチン４ ｍＲＮＡレベルに照らして、生物学的に著明ではない場合に、ネクチン４について、適正に陰性であると考えることができる。同様に、別のネクチン４特異的抗体を、陰性対照中使用するイムノアッセイにより検出されるネクチン４も、アッセイのバックグラウンドノイズに起因して、又は生物学的に著明ではない、低レベルの残存ネクチン４に起因して、ゼロではありえない。バックグラウンドノイズは、抗ネクチン４抗体以外のアッセイ試薬と試料との、非特異的相互作用により引き起こされうる。ネクチン４陰性対照は、例えば、ネクチン４特異的抗体により検出される、陰性対照中のネクチン４レベルが、同じアッセイにおける、アイソタイプ対照抗体による検出レベルと、実質的に同様である場合に、ネクチン４について、適正に陰性であると考えることができる。一部のアッセイでは、バックグラウンドノイズは、陽性対照中の、検出シグナルの実質的な百分率に相当しうる。
加えて、陽性及び／又は陰性の組織、細胞（例えば、細胞系を含む）、並びに病理学的試料を含む、陽性対照及び陰性対照は、文献において、当業者により、同定され、公表されている。このような文献は、Ｐｕｂｍｅｄなどのデータベースを検索し（例えば、ネクチン４、発現、陽性、陰性、及び／又は分布などの検索用語を使用して）、検索ヒットを解析することにより、たやすく同定することができる。
したがって、ネクチン４の発現を伴わない陰性対照細胞に結合した、ネクチン４特異的抗体又はその抗原結合性断片の相対量は、ネクチン４を発現する陽性対照に結合する抗体又はその抗原結合性断片の量の、約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０３％、０．０１％、０．００１％、又はこれ未満でありうる。
本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片についての一部の実施形態では、対照細胞内の、ネクチン４の、陰性又は陽性の発現は、独立に、ｑＰＣＲアッセイ、第２の抗体を用いるＩＨＣアッセイ、第２の抗体を用いる免疫ブロットアッセイ、第２の抗体を用いるＦＡＣＳアッセイ、又は第２の抗体を用いるＥＬＩＳＡにより決定される。
本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片についての一部の実施形態では、細胞に結合した抗体又はその抗原結合性断片の量は、ＩＨＣアッセイ、免疫ブロットアッセイ、ＦＡＣＳアッセイ、又はＥＬＩＳＡにより決定される。
１９．抗体の変異体
一部の実施形態では、本明細書で記載される、ネクチン４に結合する抗体の、アミノ酸配列の修飾（単数又は複数）が想定される。例えば、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、免疫原性の低減、又は可溶性を含むがこれらに限定されない、抗体の結合アフィニティー及び／又は他の生物学的特性を改善することが所望でありうる。したがって、本明細書で記載される抗ネクチン４抗体に加えて、抗ネクチン４抗体の変異体も調製しうることが想定される。例えば、抗ネクチン４抗体の変異体は、適切なヌクレオチド変化を、コードするＤＮＡへと導入することにより調製することもでき、且つ／又は所望の抗体若しくはポリペプチドの合成により調製することもできる。当業者は、アミノ酸変化が、グリコシル化部位の数若しくは位置の変化、又は膜アンカリング特徴の変更など、抗ネクチン４抗体の翻訳後過程を変更しうることを理解する。
一部の実施形態では、第１のグルタミンをその配列内に有するポリペプチドを含む、本明細書で提供される抗体のいずれにおいても、第１の残基におけるグルタミンをピログルタミン酸で置換することができる。このような置換は、天然の生理学的条件で、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｅｘ ｖｉｖｏの、ｐＨを約７とする緩衝液中で生じる。このような置換は、第１のグルタミンを有するポリペプチドを含む抗体を、ピログルタミン酸を形成する、第１のグルタミンのグルタミニルの環化が優先される条件下、例えば、酢酸及びトリフルオロ酢酸などの弱酸溶液下に置くことにより実施することができる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体を、例えば、任意の種類の分子の、抗体への共有結合的接合により化学的に修飾する。抗体の誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、公知の保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ／ｂｌｏｃｋｉｎｇ）基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞のリガンド又は他のタンパク質への連結などにより、化学修飾された抗体を含みうる。多数の化学的修飾のうちのいずれかは、特異的な化学的切断、アセチル化、製剤化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含むがこれらに限定されない、公知の技法により実行することができる。加えて、抗体は、１又は複数の、非古典的アミノ酸を含有しうる。
変異は、抗体又はポリペプチドをコードする、１又は複数のコドンの置換、欠失、又は挿入であって、天然配列の抗体又はポリペプチドと比較した、アミノ酸配列の変化を結果としてもたらす、上記置換、欠失、又は挿入でありうる。アミノ酸置換は、ロイシンの、セリンによる置きかえ、例えば、保存的なアミノ酸の置きかえなど、同様な構造的特性及び／又は化学的特性を有する、１つのアミノ酸を、別のアミノ酸で置きかえることの結果でありうる。例えば、アミノ酸置換を結果としてもたらす、部位指向突然変異誘発及びＰＣＲ媒介性突然変異誘発を含む、当業者に公知の標準的技法を使用して、本明細書で提供される分子をコードするヌクレオチド配列内に、突然変異を導入することができる。挿入又は欠失は、任意選択で、約１～５アミノ酸の範囲でありうる。ある特定の実施形態では、置換、欠失、又は挿入は、元の分子と比べて、２５カ所より少ないアミノ酸置換、２０カ所より少ないアミノ酸置換、１５カ所より少ないアミノ酸置換、１０カ所より少ないアミノ酸置換、５カ所より少ないアミノ酸置換、４カ所より少ないアミノ酸置換、３カ所より少ないアミノ酸置換、又は２カ所より少ないアミノ酸置換を含む。具体的な実施形態では、置換は、１又は複数の、予測される、非必須アミノ酸残基においてなされる、保存的アミノ酸置換である。許容される変異は、配列内に、アミノ酸の挿入、欠失、又は置換を、体系的に施し、結果として得られる変異体を、全長天然配列又は成熟天然配列が呈する活性について調べることにより決定することができる。
アミノ酸配列の挿入は、１残基～１００又はこれを超える残基のほか、単一のアミノ酸残基又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含有することポリペプチドの長さの範囲の、アミノ末端融合体及び／又はカルボキシル末端融合体を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端のメチオニル残基を伴う抗体を含む。抗体分子の、他の挿入変異体は、抗体のＮ末端又はＣ末端の、酵素（例えば、抗体指向酵素によるプロドラッグ療法）又は抗体の血清半減期を延長するポリペプチドへの融合体を含む。
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を、同様な電荷を伴う側鎖を有するアミノ酸残基で置きかえるアミノ酸置換である。当技術分野では、同様な電荷を伴う側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ－分枝状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を伴うアミノ酸を含む。代替的に、突然変異は、飽和突然変異誘発などにより、コード配列の全部又は一部に沿って、ランダムに導入することもでき、結果として得られる突然変異体を、生物学的活性についてスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発の後、コードされたタンパク質を発現させ、タンパク質の活性を決定することができる。
抗体の生物学的特性の、実質的な修飾は、（ａ）置換領域内の、ポリペプチドの構造骨格、例えば、シートヘリックスコンフォメーション又はヘリックスコンフォメーション、（ｂ）標的部位における、分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖のバルクの維持に対するそれらの効果が著明に異なる置換を選択することにより達することができる。代替的に、保存的（例えば、同様な特性及び／又は側鎖による、アミノ酸群内の）置換は、特性を維持するか、又はこれを著明に変化させないように施すことができる。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）非帯電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；及び（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）に従い、群分けすることができる（例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７３～７５（２版、１９７５）を参照されたい）。
代替的に、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の配向性に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅに基づき、群へと分けることができる。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを、別のクラスのメンバーと交換することを伴う。このような置換残基はまた、保存的置換部位へと導入することもでき、残りの（非保存的）部位へと導入することもできる。したがって、一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも３５％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも４０％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも４５％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも５５％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも６０％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも６５％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、本明細書で記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と、少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１～２で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１～２で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも３５％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１～２で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも４０％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１～２で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも４５％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１～２で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１～２で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも５５％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１～２で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも６０％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１～２で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも６５％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１～２で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１～２で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１～２で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１～２で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１～２で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１～２で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１～２で描示されたアミノ酸配列と、少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含む。
さらに別の実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１で描示されたＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列、及び／又は表１で描示されたＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一な、ＶＨ ＣＤＲ及び／又はＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１で描示されたＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列、及び／又は表１で描示されたＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも３５％同一な、ＶＨ ＣＤＲ及び／又はＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１で描示されたＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列、及び／又は表１で描示されたＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも４０％同一な、ＶＨ ＣＤＲ及び／又はＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１で描示されたＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列、及び／又は表１で描示されたＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも４５％同一な、ＶＨ ＣＤＲ及び／又はＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１で描示されたＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列、及び／又は表１で描示されたＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一な、ＶＨ ＣＤＲ及び／又はＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１で描示されたＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列、及び／又は表１で描示されたＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも５５％同一な、ＶＨ ＣＤＲ及び／又はＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１で描示されたＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列、及び／又は表１で描示されたＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも６０％同一な、ＶＨ ＣＤＲ及び／又はＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１で描示されたＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列、及び／又は表１で描示されたＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも６５％同一な、ＶＨ ＣＤＲ及び／又はＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１で描示されたＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列、及び／又は表１で描示されたＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも７０％同一な、ＶＨ ＣＤＲ及び／又はＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１で描示されたＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列、及び／又は表１で描示されたＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも７５％同一な、ＶＨ ＣＤＲ及び／又はＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１で描示されたＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列、及び／又は表１で描示されたＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも８０％同一な、ＶＨ ＣＤＲ及び／又はＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１で描示されたＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列、及び／又は表１で描示されたＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも８５％同一な、ＶＨ ＣＤＲ及び／又はＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１で描示されたＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列、及び／又は表１で描示されたＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一な、ＶＨ ＣＤＲ及び／又はＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１で描示されたＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列、及び／又は表１で描示されたＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一な、ＶＨ ＣＤＲ及び／又はＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ネクチン４エピトープに結合する抗体又はその断片は、表１で描示されたＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列、及び／又は表１で描示されたＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも９９％同一な、ＶＨ ＣＤＲ及び／又はＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を含む。
変化形は、オリゴヌクレオチド媒介性（部位指向）突然変異誘発、アラニン走査、及びＰＣＲ突然変異誘発など、当技術分野で公知の方法を使用して作ることができる。部位指向突然変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒ、１９８６、ＢｉｏｃｈｅｍＪ．、２３７：１～７；及びＺｏｌｌｅｒら、１９８２、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１０：６４８７～５００を参照されたい）、カセット突然変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、１９８５、Ｇｅｎｅ、３４：３１５～２３を参照されたい）、又は他の公知の技法を、クローニングされたＤＮＡ上で実施して、抗ネクチン４抗体の変異体ＤＮＡを作製することができる。
抗ネクチン４抗体の適正なコンフォメーションの維持に関与しない、任意のシステイン残基もまた、例えば、アラニン又はセリンなど、別のアミノ酸で置換して、分子の酸化に対する安定性を改善し、異常な架橋を防止することができる。結果として、システイン結合（単数又は複数）を、抗ネクチン４抗体へと付加して、その安定性を改善することもできる（例えば、抗体が、Ｆｖ断片などの抗体断片である場合）。
一部の実施形態では、本開示の抗ネクチン４抗体分子は、「脱免疫化」抗体である。「脱免疫化」抗ネクチン４抗体は、それぞれの、元の非脱免疫化抗体と比較した、抗体の免疫原性の軽減を結果としてもたらす、そのアミノ酸配列内の、１又は複数の変更を有する、ヒト化抗ネクチン４抗体又はキメラ抗ネクチン４抗体から導出された抗体である。このような抗体の突然変異体を作出するための手順の１つは、抗体分子のＴ細胞エピトープの同定及び除去を伴う。第１のステップでは、抗体分子の免疫原性は、いくつかの方法、例えば、当技術分野で公知の通り、Ｔ細胞エピトープの、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける決定、又はこのようなエピトープの、コンピューターによる予測により決定することができる。Ｔ細胞エピトープ機能に極めて重要な残基を同定したら、免疫原性を除去し、抗体活性を保持するように、突然変異を施すことができる。総説については、例えば、Ｊｏｎｅｓら、２００９、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、５２５：４０５～２３を参照されたい。
２０．ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるアフィニティー成熟
一部の実施形態では、親抗体と比較して改善された、アフィニティー、安定性、又は発現レベルなどの特性を有する抗体の変異体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるアフィニティー成熟により調製することができる。天然の原型と同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるアフィニティー成熟は、突然変異及び選択の原理に基づく。抗体のライブラリーは、生物（例えば、ファージ、細菌細胞、酵母細胞、又は哺乳動物細胞）の表面上にあるか、又はそれらのコードｍＲＮＡ若しくはコードＤＮＡと会合した（例えば、共有結合的に会合するか、又は非共有結合的に会合した）、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、又はＶドメイン断片として提示される。提示された抗体の、アフィニティーによる選択は、抗体をコードする遺伝情報を保有する生物又は複合体の単離を可能とする。ファージディスプレイなどの提示方法を使用する、２又は３ラウンドの突然変異及び選択は通例、低ナノモル範囲のアフィニティーを伴う抗体断片を結果としてもたらす。アフィニティー成熟抗体は、標的抗原に対する、ナノモル単位、なお又はピコモル単位のアフィニティーを有しうる。
ファージディスプレイは、抗体の提示及び選択のための、普及した方法である。抗体は、Ｆｄバクテリオファージ又はＭ１３バクテリオファージの表面において、バクテリオファージコートタンパク質との融合体として提示される。選択は、「パニング」と称する工程である、ファージにより提示された抗体が、それらの標的に結合することを可能とする曝露の工程を伴う。抗原に結合したファージを回収し、細菌に感染させて、さらなるラウンドの選択のためのファージをもたらすのに使用する。総説については、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、２００２、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１７８：１～３７；並びにＢｒａｄｂｕｒｙ及びＭａｒｋｓ、２００４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２９０：２９～４９を参照されたい。
酵母ディスプレイ系（例えば、Ｂｏｄｅｒら、１９９７、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：５５３～５７；及びＣｈａｏら、２００６、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１：７５５～６８を参照されたい）では、抗体は、重鎖と軽鎖とを、可撓性リンカーにより接続した、単鎖可変融合体（ｓｃＦｖ）として提示することができる。ｓｃＦｖを、酵母アグルチニンタンパク質であるＡｇａ２ｐの接着サブユニットと融合させると、Ａｇａ２ｐは、Ａｇａ１ｐへのジスルフィド結合を介して、酵母細胞壁と接合する。Ａｇａ２ｐを介するタンパク質の提示は、タンパク質を、細胞表面から突出させ、酵母細胞壁上の他の分子との潜在的な相互作用を最小化する。磁気による分離及びフローサイトメトリーを使用して、アフィニティー又は安定性が改善された抗体について選択するように、ライブラリーをスクリーニングする。目的の可溶性抗原への結合は、ビオチニル化抗原及びフルオロフォアへとコンジュゲートさせたストレプトアビジンなどの二次試薬による酵母の標識化により決定する。抗体の表面発現の変動は、ｓｃＦｖを挟む、ヘマグルチニンエピトープタグ又はｃ－Ｍｙｃエピトープタグの、免疫蛍光による標識化を介して測定することができる。発現は、提示されたタンパク質の安定性と相関することが示されているので、抗体を、安定性のほか、アフィニティーの改善についても選択することができる（例えば、Ｓｈｕｓｔａら、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９２：９４９～５６を参照されたい）。酵母ディスプレイのさらなる利点は、提示されたタンパク質が、酵母真核細胞の小胞体内にフォールディングされ、小胞体シャペロン及び品質管理機構を利用することである。成熟が完了したら、酵母の表面上に提示しながら、抗体アフィニティーを「滴定する」ことが可能であり、各クローンの発現及び精製に対する必要が廃されるので好都合である。酵母表面ディスプレイの理論的限界は、他のディスプレイ方法のライブラリーサイズより潜在的に小さな、機能的ライブラリーサイズであるが、最近の手法は、酵母細胞の交配系を使用して、１０１４のサイズであると推定される、コンビナトリアルの多様性を創出する（例えば、米国特許公開第２００３／０１８６３７４号；及びＢｌａｉｓｅら、２００４、Ｇｅｎｅ、３４２：２１１～１８を参照されたい）。
リボソームディスプレイでは、無細胞系内の選択のために、抗体－リボソーム－ｍＲＮＡ（ＡＲＭ）複合体を作出する。特定の抗体のライブラリーのためのＤＮＡライブラリーコードを、終止コドンを欠くスペーサー配列と遺伝子融合させる。このスペーサー配列は、翻訳されてもなおペプチジルｔＲＮＡと接合しており、リボソームトンネルを占有するので、目的のタンパク質の、リボソームの外部への突出及びフォールディングを可能とする。結果として得られる、ｍＲＮＡ、リボソーム、及びタンパク質の複合体は、表面に結合したリガンドに結合することが可能であり、リガンドによるアフィニティー捕捉を介して、抗体及びそのコードｍＲＮＡの同時的な単離を可能とする。次いで、リボソームに結合したｍＲＮＡは、逆転写されてｃＤＮＡへと戻り、次いで、ｃＤＮＡは、突然変異誘発を受け、次ラウンドの選択において使用されうる（例えば、Ｆｕｋｕｄａら、２００６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３４：ｅ１２７を参照されたい）。ｍＲＮＡディスプレイでは、抗体とｍＲＮＡとの共有結合は、ピューロマイシンをアダプター分子として使用して確立する（Ｗｉｌｓｏｎら、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８：３７５０～５５）。
これらの方法は、完全に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて実施されるので、他の選択技術を上回る、２つの主要な利点をもたらす。まず、ライブラリーの多様性は、細菌細胞の形質転換効率に限定されず、試験管内に存在する、リボソーム及び異なるｍＲＮＡ分子の数だけにより限定される。第２に、任意の多様化ステップの後で、形質転換しなければならないライブラリーは存在しないので、各選択ラウンドの後で、例えば、非プルーフリーディングポリメラーゼにより、ランダム突然変異を容易に導入することができる。
哺乳動物細胞ディスプレイ系（例えば、Ｂｏｗｅｒｓら、２０１１、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．、１０８：２０４５５～６０を参照されたい）では、ＩｇＧの完全ヒトライブラリーを、あらかじめ組み換えられたＤ（Ｊ）領域へと接合させた、生殖細胞系列配列のＶ遺伝子セグメントに基づき構築する。重鎖及び軽鎖の全長Ｖ領域を、ヒト重鎖及びヒト軽鎖の定常領域とアセンブルし、哺乳動物の細胞系（例えば、ＨＥＫ２９３）に、これをトランスフェクトする。トランスフェクトされたライブラリーを、拡大し、ストレプトアビジン（ＳＡ）カップリング磁気ビーズに対する、いくつかのラウンドの陰性選択に続く、ビオチニル化標的タンパク質、ペプチド断片、又はエピトープでコーティングされたＳＡカップリング磁気ビーズに対する、１ラウンドの陽性選択にかけた。陽性選択された細胞を拡大し、次いで、１ラウンドのＦＡＣＳにより分取して、標的のタンパク質、ペプチド断片、又はエピトープに特異的に結合する抗体を提示する、単一細胞クローンを単離する。これらの単一細胞クローンに由来する重鎖と軽鎖との対を、さらなる成熟のために、ＡＩＤと共に、リトランスフェクトする。ＡＩＤ誘発型体細胞超変異とカップリングさせた、いくつかのラウンドの哺乳動物細胞ディスプレイは、高特異性の高アフィニティー抗体を作出する。
多様性はまた、抗体ライブラリーのＣＤＲ又は全Ｖ遺伝子へと、ターゲティングされた形で導入することもでき、ランダム導入を介して導入することもできる。前者の手法は、高レベル又は低レベルの突然変異誘発を介して、抗体の全てのＣＤＲを、逐次的にターゲティングするか、或いは体細胞超突然変異の孤立したホットスポット（例えば、Ｈｏら、２００５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８０：６０７～１７を参照されたい）、又は実験ベースで、若しくは構造的理由で、アフィニティーに影響を及ぼすことが疑われる残基をターゲティングするステップを含む。多様性はまた、ＤＮＡシャフリング又は同様な技法を介して、天然の、多様な領域の置きかえにより導入することもできる（例えば、Ｌｕら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：４３４９６～５０７；米国特許第５，５６５，３３２号及び同第６，９８９，２５０号を参照されたい）。代替的な技法は、フレームワーク領域の残基へと伸長する、超可変ループをターゲティングし（例えば、Ｂｏｎｄら、２００５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３４８：６９９～７０９を参照されたい）ＣＤＲ内の、ループの欠失及び挿入を用いるか、又はハイブリダイゼーションベースの多様化を使用する（例えば、米国特許公開第２００４／０００５７０９号を参照されたい）。ＣＤＲ内の多様性を作出する、さらなる方法については、例えば、米国特許第７，９８５，８４０号において開示されている。抗体ライブラリーを作出し、且つ／又は抗体のアフィニティー成熟を発生させるのに使用されうる、さらなる方法については、例えば、それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６８５，８９７号、及び同第８，６０３，９３０号、並びに米国公開第２０１４／０１７０７０５号、同第２０１４／００９４３９２号、同第２０１２／００２８３０１号、同第２０１１／０１８３８５５号、及び同第２００９／００７５３７８号において開示されている。
ライブラリーのスクリーニングは、当技術分野で公知の、多様な技法により達することができる。例えば、ネクチン４は、固体支持体、カラム、ピン、又はセルロース／ポリ（フッ化ビニリデン）膜／他のフィルターへと固定化することもでき、吸着プレートへと固定された宿主細胞上で発現させることもでき、細胞分取において使用することもでき、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズによる捕捉のために、ビオチンへとコンジュゲートさせることもでき、ディスプレイライブラリーをパニングするための、他の任意の方法において使用することもできる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるアフィニティー成熟方法の総説については、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２３：１１０５～１６；Ｑｕｉｒｏｚ及びＳｉｎｃｌａｉｒ、２０１０、Ｒｅｖｉｓｔａ Ｉｎｇｅｎｅｒｉａ Ｂｉｏｍｅｄｉａ、４：３９～５１；及びこれらにおける参考文献を参照されたい。
２１．抗ネクチン４抗体の修飾
抗ネクチン４抗体共有結合的修飾は、本開示の範囲内に含まれる。共有結合的修飾は、抗ネクチン４抗体の標的アミノ酸残基を、抗ネクチン４抗体の、選択された側鎖残基又はＮ末端残基若しくはＣ末端残基と反応することが可能な、有機誘導体化剤と反応させることを含む。他の修飾は、グルタミニル残基及びアスパラギニル残基の、それぞれ、対応する、グルタミル残基及びアスパルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル残基又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン側鎖、アルギニン側鎖、及びヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、「タンパク質：構造と分子特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」、７９～８６（１９８３）を参照されたい）、Ｎ末端のアミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本開示の範囲内に含まれる、抗ネクチン４抗体の共有結合的修飾の他の種類は、抗体又はポリペプチドの、天然のグリコシル化パターンを変更すること（例えば、Ｂｅｃｋら、２００８、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９：４８２～５０１；及びＷａｌｓｈ、２０１０、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ、１５：７７３～８０を参照されたい）、及び抗体を、様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのうちの１つへと、例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２；又は同第４，１７９，３３７号において明示されている形で連結することを含む。
本開示の抗ネクチン４抗体はまた、別の、異種ポリペプチド配列又は異種アミノ酸配列、例えば、エピトープタグへと融合させた抗ネクチン４抗体を含むキメラ分子（例えば、Ｔｅｒｐｅ、２００３、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、６０：５２３～３３を参照されたい）、又はＩｇＧ分子のＦｃ領域（例えば、Ａｒｕｆｆｏ、「抗体融合タンパク質（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、２２１～４２（Ｃｈａｍｏｗ及びＡｓｈｋｅｎａｚｉ編、１９９９）を参照されたい）を形成するようにも修飾することができる。
本明細書ではまた、本明細書で提供されるネクチン４抗原に結合する抗体と、異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質も提供される。一部の実施形態では、抗体を融合させた異種ポリペプチドは、抗体を、細胞表面でネクチン４を発現した細胞へとターゲティングするために有用である。
本明細書ではまた、ネクチン４抗原に結合する抗体のパネルも提供される。具体的な実施形態では、抗体のパネルは、ネクチン４抗原に対する、異なる会合速度、異なる解離速度、異なるアフィニティー、及び／又はネクチン４抗原に対する、異なる特異性を有する。一部の実施形態では、パネルは、約１０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、又は約１０００、又はこれを超える抗体を含むか、又はこれらからなる。抗体のパネルは、例えば、ＥＬＩＳＡなどのアッセイなどのための、９６ウェルプレート又は３８４ウェルプレートにおいて使用することができる。
２２．抗ネクチン４抗体の調製
抗ネクチン４抗体は、抗ネクチン４抗体をコードする核酸を含有するベクターで形質転換された細胞、又はこれをトランスフェクトされた細胞を培養することにより作製することができる。本開示の抗体のポリペプチド構成要素をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技法を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離し、シーケンシングすることができる。代替的に、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成器又はＰＣＲ技法を使用して合成することもできる。得られたら、ポリペプチドをコードする配列を、宿主細胞内で複製し、異種ポリヌクレオチドを発現させることが可能な組換えベクターへと挿入する。当技術分野で利用可能であり、公知である、多くのベクターを、本開示の目的で使用することができる。適切なベクターの選択は、主に、ベクターへと挿入される核酸のサイズ、及びベクターにより形質転換される特定の宿主細胞に依存するであろう。本開示の抗体を発現させるのに適する宿主細胞は、古細菌及びグラム陰性生物又はグラム陽性生物を含む真正細菌などの原核細胞、線維状真菌又は酵母などの真核微生物、昆虫細胞又は植物細胞などの非脊椎動物細胞、及び哺乳動物などの脊椎動物細胞の宿主細胞系を含む。宿主細胞を、上記で記載した発現ベクターで形質転換し、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適するように修飾された、従来の栄養培地中で培養した。宿主細胞により産生された抗体は、当技術分野で公知の、標準的なタンパク質精製方法を使用して精製する。
抗体を作製するための方法であって、ベクターの構築、発現、及び精製を含む上記方法については、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎら、「抗体の操作：大腸菌における抗体の作製：ＰＣＲから発酵まで（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：Ｆｒｏｍ ＰＣＲ ｔｏ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」、２０３～５２（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら編、１９９６）；Ｋｗｏｎｇ及びＲａｄｅｒ、「Ｆａｂ抗体断片の、大腸菌による発現及び精製（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｂ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）」、「タンパク質科学における最新のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」（２００９）；Ｔａｃｈｉｂａｎａ及びＴａｋｅｋｏｓｈｉ、「大腸菌における抗体Ｆａｂ断片の作製（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆａｂ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｓｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」、「抗体の発現及び作製（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」（Ａｌ－Ｒｕｂｅａｉ編、２０１１）；並びに「治療用モノクローナル抗体：実験室から臨床まで（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ）」（Ａｎ編、２００９）においてさらに記載されている。
当然ながら、当技術分野で周知の、代替的な方法を用いて、抗ネクチン４抗体を調製することも想定される。例えば、適切なアミノ酸配列又はその部分は、固相法を使用する直接的ペプチド合成により作製することができる（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら、「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、（１９６９）；及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９～５４を参照されたい）。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるタンパク質合成は、手動技法を使用して実施することもでき、自動化により実施することもできる。抗ネクチン４抗体の多様な部分は、個別に化学合成し、化学方法又は酵素方法を使用して、所望の抗ネクチン４抗体を作製するように組み合わせることができる。代替的に、抗体は、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号及び同第５，８２７，６９０号において開示されている通り、抗体を発現するように操作されたトランスジェニック動物の、細胞又はミルクなどの体液から精製することもできる。
２３．イムノコンジュゲート
本開示はまた、合成リンカーにより、１又は複数の非抗体薬剤へと共有結合的に結合させた、本開示の抗ネクチン４抗体のうちのいずれか１つを含むコンジュゲートも提供する。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体を、例えば、診断用分子又は検出可能な分子とコンジュゲートさせるか、又は組換えにより融合させる。コンジュゲートさせるか、又は組換えにより融合させた抗体は、例えば、ネクチン４媒介性疾患の、発病、発症、進行、及び／又は重症度をモニタリング又は予後診断するために有用でありうる。
このような診断及び検出は、例えば、抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼなどであるがこれらに限定されない、多様な酵素；ストレプトアビジン／ビオチン又はアビジン／ビオチンなどであるがこれらに限定されない補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、又はフィコエリトリンなどであるがこれらに限定されない蛍光物質；ルミノールなどであるがこれらに限定されない、発光物質；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、又はエクオリンなどであるがこれらに限定されない生物発光物質；アクリジニウムベースの化合物又はＨＡＬＯＴＡＧなどであるがこれらに限定されない化学発光物質；ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、及び１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、及び１１１Ｉｎ）、テクネシウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ及び６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、又は１１７Ｓｎなどであるがこれらに限定されない放射性物質；ポジトロン放出金属を使用する、多様なポジトロン放出断層撮影法；及び非放射性常磁性金属イオンを含むがこれらに限定されない検出用物質へとカップリングすることにより達することができる。
本明細書ではまた、融合タンパク質を作出するように、異種タンパク質又は異種ポリペプチド（又はその断片、例えば、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、又は約１００アミノ酸のポリペプチド）へと、組換えにより融合させるか、又は化学的にコンジュゲートさせた（共有結合的コンジュゲーション又は非共有結合的コンジュゲーション）抗体のほか、それらの使用も提供される。特に、本明細書では、本明細書で提供される抗体の抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｃ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメイン、又はＶＬ ＣＤＲ）と、異種タンパク質、異種ポリペプチド、又は異種ペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。一実施形態では、抗体を融合させた、異種タンパク質、異種ポリペプチド、又は異種ペプチドは、抗体を、ネクチン４を発現する細胞など、特定の細胞型へとターゲティングするのに有用である。例えば、特定の細胞型が発現する細胞表面受容体に結合する抗体を、本明細書で提供される修飾抗体へと、融合させるか、又はコンジュゲートさせることができる。
さらに、本明細書で提供される抗体は、精製を容易とするように、ペプチドなどのマーカー配列又は「タグ」配列と融合させることができる。具体的な実施形態では、マーカー又はタグのアミノ酸配列は、それらのうちの多くが市販されている中でも、ｐＱＥベクター（例えば、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．を参照されたい）において提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチドである。例えば、Ｇｅｎｔｚら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：８２１～２４において記載されている通り、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の好都合な精製をもたらす。精製に有用な、他のペプチドタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する、ヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８４、Ｃｅｌｌ、３７：７６７～７８）、ストレプトアビジン／アビジン結合ペプチド、及び「ＦＬＡＧ」タグを含むがこれらに限定されない。
部分（ポリペプチドを含む）を、抗体へと融合又はコンジュゲートさせるための方法は、公知である（例えば、Ａｒｎｏｎら、「がん治療における薬物の免疫ターゲティングのためのモノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」、「モノクローナル抗体とがん治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」、２４３～５６（Ｒｅｉｓｆｅｌｄら編、１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「薬物送達のための抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、「薬物送達の制御（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、６２３～５３（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、２版、１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「がん治療における細胞傷害作用剤のキャリア抗体：総説（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ）」、「モノクローナル抗体：生物学的応用及び臨床的応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、４７５～５０６（Ｐｉｎｃｈｅｒａら編、１９８５）；「がん治療における放射性標識化抗体の治療的使用についての解析、結果、及び将来的展望（Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」、「がんの検出及び治療のためのモノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ）」、３０３～１６（Ｂａｌｄｗｉｎら編、１９８５）；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２：１１９～５８；米国特許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，７２３，１２５号；同第５，７８３，１８１号；同第５，９０８，６２６号；同第５，８４４，０９５号；及び同第５，１１２，９４６号；ＥＰ３０７，４３４；ＥＰ３６７，１６６；ＥＰ３９４，８２７；ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０６５７０号、同第ＷＯ９６／０４３８８号、同第ＷＯ９６／２２０２４号、同第ＷＯ９７／３４６３１号、及び同第ＷＯ９９／０４８１３号；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：１０５３５～３９；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：８４～８６；Ｚｈｅｎｇら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４：５５９０～６００；及びＶｉｌら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１１３３７～４１を参照されたい）。
融合タンパク質は、例えば、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、及び／又はコドンシャフリング（「ＤＮＡシャフリング」と総称する）技法を介して作出することができる。ＤＮＡシャフリングを用いて、例えば、アフィニティーが大きく、解離速度が小さい抗体を含む、本明細書で提供される抗ネクチン４抗体の活性を変更することができる（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号；同第５，８３４，２５２号；及び同第５，８３７，４５８号；Ｐａｔｔｅｎら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８：７２４～３３；Ｈａｒａｙａｍａ、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６（２）：７６～８２；Ｈａｎｓｓｏｎら、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８７：２６５～７６；並びにＬｏｒｅｎｚｏ及びＢｌａｓｃｏ、１９９８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２４（２）：３０８～１３を参照されたい）。抗体、又はコードされる抗体は、組換えの前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入、又は他の方法を介する、ランダム突然変異誘発にかけることにより変更することができる。本明細書で提供される抗体をコードするポリヌクレオチドは、１又は複数の異種分子の、１又は複数の構成要素、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などにより組み換えることができる。
本明細書で提供される抗体はまた、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号において記載されている通り、抗体ヘテロコンジュゲートを形成するように、第２の抗体へもコンジュゲートすることができる。
本明細書で提供される、ネクチン４に結合する抗体はまた、特に、イムノアッセイ又は標的抗原の精製に有用な、固体支持体へと接合させることもできる。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンを含むがこれらに限定されない。
リンカーは、細胞内のコンジュゲート薬剤の放出を容易とする「切断型リンカー」でありうるが、本明細書では、非切断型リンカーもまた想定される。本開示のコンジュゲートにおける使用のためのリンカーは、限定なしに述べると、酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾンリンカー）、ジスルフィドを含有するリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー（例えば、バリン及び／若しくはシトルリン、シトルリン－バリン、又はフェニルアラニン－リシンなどのアミノ酸を含む、例えば、ペプチドリンカー）、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーを含む（例えば、Ｃｈａｒｉら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２：１２７～３１；及び米国特許第５，２０８，０２０号を参照されたい）、多剤輸送体媒介性耐性を回避するようにデザインされた、チオエーテルリンカー又は親水性リンカー（例えば、Ｋｏｖｔｕｎら、２０１０、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、７０：２５２８～３７を参照されたい）。
抗体及び薬剤のコンジュゲートは、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、スルホ－ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾアートなど、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作ることができる。本開示はさらに、当技術分野で開示される、任意の適切な方法を使用して、抗体及び薬剤のコンジュゲートを調製しうることも想定する（例えば、「バイオコンジュゲート技法（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ編、２版、２００８）を参照されたい）。
抗体及び薬剤のための、従来のコンジュゲーション戦略は、Ｌｙｓ残基のε－アミノ基又はＣｙｓ残基のチオール基を伴う、ランダムコンジュゲーション化学反応であって、異種コンジュゲートを結果としてもたらす、上記化学反応に基づく。近年になって開発された技法は、同種ローディングを結果としてもたらし、抗原結合性又は薬物動態が変更されたコンジュゲート亜集団を回避する、抗体との部位特異的コンジュゲーションを可能とする。これらは、重鎖上及び軽鎖上の位置におけるシステイン置換を含む、「チオｍａｂ」の操作であって、反応性のチオール基をもたらすが、免疫グロブリンのフォールディング及びアセンブリーを破壊したり、抗原結合を変更したりしない、上記操作を含む（例えば、Ｊｕｎｕｔｕｌａら、２００８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、３３２：４１～５２；及びＪｕｎｕｔｕｌａら、２００８、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２６：９２５～３２を参照されたい）。別の方法では、終止コドンであるＵＧＡを、終結部から、セレノシステイン挿入部へと再コードすることにより、セレノシステインを、抗体配列へと、共翻訳により挿入し、他の天然アミノ酸の存在下において、セレノシステインの求核性セレノール基における、部位特異的共有結合的コンジュゲーションを可能とする（例えば、Ｈｏｆｅｒら、２００８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０５：１２４５１～５６；及びＨｏｆｅｒら、２００９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８（５０）：１２０４７～５７を参照されたい）。
本明細書の他の実施形態では、治療用部分（又は１若しくは複数の治療用部分）へとコンジュゲートさせるか、又は組換えにより融合させた抗体が提供される。抗体は、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制剤又は殺細胞剤、治療剤、又は放射性金属イオン、例えば、アルファ放射体などの治療用部分とコンジュゲートさせるか、又は組換えにより融合させることができる。細胞毒素又は細胞傷害剤は、細胞に有害な、任意の薬剤を含む。治療用部分は、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシル デカルバジン）；アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ、シスプラチン）；アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧称：ダウノマイシン）及びドキソルビシン）；抗生剤（例えば、ダクチノマイシン（旧称：アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））；アウリスタチン分子（例えば、アウリスタチンＰＨＥ、ブリオスタチン１、及びソラスタチン１０；それらの全てが、参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｏｙｋｅら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４６：３８０２～８（２００２）、Ｗｏｙｋｅら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４５：３５８０～４（２００１）、Ｍｏｈａｍｍａｄら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ、１２：７３５～４０（２００１）、Ｗａｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２６６：７６～８０（１９９９）、Ｍｏｈａｍｍａｄら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１５：３６７～７２（１９９９）を参照されたい。）；ホルモン（例えば、グルココルチコイド、プロゲスチン、アンドロゲン、及びエストロゲン）、ＤＮＡ修復酵素阻害剤（例えば、エトポシド又はトポテカン）、キナーゼ阻害剤（例えば、化合物ＳＴ１５７１である、メシル酸イマチニブ（Ｋａｎｔａｒｊｉａｎら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、８（７）：２１６７～７６（２００２））；細胞傷害剤（例えば、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにこれらの類似体又は相同体、並びに米国特許第６，２４５，７５９号、同第６，３９９，６３３号、同第６，３８３，７９０号、同第６，３３５，１５６号、同第６，２７１，２４２号、同第６，２４２，１９６号、同第６，２１８，４１０号、同第６，２１８，３７２号、同第６，０５７，３００号、同第６，０３４，０５３号、同第５，９８５，８７７号、同第５，９５８，７６９号、同第５，９２５，３７６号、同第５，９２２，８４４号、同第５，９１１，９９５号、同第５，８７２，２２３号、同第５，８６３，９０４号、同第５，８４０，７４５号、同第５，７２８，８６８号、同第５，６４８，２３９号、同第５，５８７，４５９号において開示されている化合物）；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、Ｒ１１５７７７、ＢＭＳ－２１４６６２、並びに例えば、米国特許第６，４５８，９３５号、同第６，４５１，８１２号、同第６，４４０，９７４号、同第６，４３６，９６０号、同第６，４３２，９５９号、同第６，４２０，３８７号、同第６，４１４，１４５号、同第６，４１０，５４１号、同第６，４１０，５３９号、同第６，４０３，５８１号、同第６，３９９，６１５号、同第６，３８７，９０５号、同第６，３７２，７４７号、同第６，３６９，０３４号、同第６，３６２，１８８号、同第６，３４２，７６５号、同第６，３４２，４８７号、同第６，３００，５０１号、同第６，２６８，３６３号、同第６，２６５，４２２号、同第６，２４８，７５６号、同第６，２３９，１４０号、同第６，２３２，３３８号、同第６，２２８，８６５号、同第６，２２８，８５６号、同第６，２２５，３２２号、同第６，２１８，４０６号、同第６，２１１，１９３号、同第６，１８７，７８６号、同第６，１６９，０９６号、同第６，１５９，９８４号、同第６，１４３，７６６号、同第６，１３３，３０３号、同第６，１２７，３６６号、同第６，１２４，４６５号、同第６，１２４，２９５号、同第６，１０３，７２３号、同第６，０９３，７３７号、同第６，０９０，９４８号、同第６，０８０，８７０号、同第６，０７７，８５３号、同第６，０７１，９３５号、同第６，０６６，７３８号、同第６，０６３，９３０号、同第６，０５４，４６６号、同第６，０５１，５８２号、同第６，０５１，５７４号、及び同第６，０４０，３０５号により開示されているファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン；イリノテカン；ＳＮ－３８；トポテカン；９－アミノカンプトテシン；ＧＧ－２１１（ＧＩ１４７２１１）；ＤＸ－８９５１ｆ；ＩＳＴ－６２２；ルビテカン；ピラゾロアクリジン；ＸＲ－５０００；サイントピン；ＵＣＥ６；ＵＣＥ１０２２；ＴＡＮ－１５１８Ａ；ＴＡＮ１５１８Ｂ；ＫＴ６００６；ＫＴ６５２８；ＥＤ－１１０；ＮＢ－５０６；ＥＤ－１１０；ＮＢ－５０６；及びレベカマイシン）；ブルガレイン；Ｈｏｅｓｃｈｔ色素３３３４２及びＨｏｅｃｈｓｔ色素３３２５８などのＤＮＡ副溝結合剤；ニチジン；ファガロニン；エピベルベリン；コラリン；ベータ－ラパコン；ＢＣ－４－１；ピスホスホナート（例えば、アレンドロナート、シマドロナート（ｃｉｍａｄｒｏｎｔｅ）、クロドロナート、チルドロナート、エチドロナート、イバンドロナート、ナリドロナート、オルパンドロナート、リセンドロナート、ピリドロナート、パミドロナート、ゾレンドロナート）、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（例えば、ロバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、スタチン、セリバスタチン、レスコール、ルピトール、ロスバスタチン、及びアトルバスタチン）；アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、米国特許第６，２７７，８３２号、同第５，９９８，５９６号、同第５，８８５，８３４号、同第５，７３４，０３３号、及び同第５，６１８，７０９号に開示されているアンチセンスオリゴヌクレオチド）；アデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えば、フルダラビンリン酸エステル及び２－クロロデオキシアデノシン）；イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））；トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）））、並びにこれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、クラスレート、及びプロドラッグを含むがこれらに限定されない。
さらに、本明細書で提供される抗体は、所与の生物学的応答を修飾する、治療用部分又は薬物部分へとコンジュゲートさせるか、又は組換えにより融合させることができる。治療用部分又は薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されるとみなされるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を保有する、タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドでありうる。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナスエクソトキシン、コレラ毒素、又はジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、γ－インターフェロン、α－インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質、アポトーシス剤、例えば、ＴＮＦ－γ、ＴＮＦ－γ、ＡＩＭ Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９号を参照されたい）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照されたい）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：１５６７～１５７４）、及びＶＥＧＦ（国際公開第ＷＯ９９／２３１０５号を参照されたい）、抗血管新生剤、例えば、アンギオスタチン、エンドスタチン、若しくは凝固経路の構成要素（例えば、組織因子）；又は例えば、リンホカイン（例えば、インターフェロンガンマ、インターロイキン１（「ＩＬ－１」）、インターロイキン２（「ＩＬ－２」）、インターロイキン５（「ＩＬ－５」）、インターロイキン６（「ＩＬ－６」）、インターロイキン７（「ＩＬ－７」）、インターロイキン９（「ＩＬ－９」）、インターロイキン１０（「ＩＬ－１０」）、インターロイキン１２（「ＩＬ－１２」）、インターロイキン１５（「ＩＬ－１５」）、インターロイキン２３（「ＩＬ－２３」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ－ＣＳＦ」）、及び顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ－ＣＳＦ」））、又は増殖因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」））、又は凝固薬剤（例えば、カルシウム、ビタミンＫ、ハーゲマン因子（第ＸＩＩ因子）、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）、プレカリクレイン（ＰＫ）、凝固タンパク質である第ＩＩ因子（プロトロンビン）、第Ｖ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩａ因子、第ＩＸ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘ因子、リン脂質、及びフィブリン単量体などであるがこれらに限定されない組織因子）などの生物学的応答修飾剤を含みうる。
ネクチン４抗原に免疫特異的に結合する、本明細書で提供される抗体へとコンジュゲートさせるか、又は組換えにより融合させた治療用部分又は薬物は、所望の予防効果又は治療的効果（単数又は複数）を達成するように選び出すべきである。ある特定の実施形態では、抗体は、修飾抗体である。臨床医又は他の医療従事者は、どの治療用部分又は薬物を、本明細書で提供される抗体へとコンジュゲートさせるか、又は組換えにより融合させるのかについて決定する場合に、以下：疾患の性格、疾患の重症度、及び対象の状態について考慮すべきである。
本明細書で使用される、「抗ネクチン４抗体薬物コンジュゲート」又は「抗ネクチン４ ＡＤＣ」とは、治療用部分（又は１若しくは複数の治療用部分）へとコンジュゲートさせるか、若しくは組換えにより融合させた抗ネクチン４抗体若しくはその抗原結合性断片、又は上記で記載した所与の生物学的応答を修飾する治療用部分若しくは薬物部分へとコンジュゲートさせるか、若しくは組換えにより融合させた抗ネクチン４抗体若しくはその抗原結合性断片を指す。
本明細書では、ネクチン４に特異的に結合する抗ネクチン４抗体を含む、抗ネクチン４ ＡＤＣが提供される。本明細書ではまた、本明細書で提供される、抗ネクチン４抗体又はその抗原結合性断片を含む、抗ネクチン４ ＡＤＣも提供される。
２４．抗体及び組成物を使用する方法
本明細書の一態様では、細胞の増殖を阻害する（例えば、細胞数の倍加の速度を低減するか、細胞数の増大の速度を緩徐化するか、又は細胞数の増大を遮断若しくは防止する）方法であって、細胞を、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン４ ＡＤＣと接触させるステップを含む上記方法が提供される。
本明細書の一態様では、細胞の増殖を阻害する方法であって、細胞を、本明細書で提供される、ネクチン４（例えば、ヒトネクチン４のＥＣＤ、又はヒトネクチン４のＥＣＤのエピトープ）に特異的に結合する抗ネクチン４抗体を含む、抗ネクチン４ ＡＤＣと接触させるステップを含む上記方法が提供される。ある特定の実施形態では、細胞を、本明細書で記載される、有効量の抗ネクチン４ ＡＤＣと接触させる。一部の実施形態では、抗ネクチン４ ＡＤＣは、ヒトネクチン４のＥＣＤに結合する。一部の実施形態では、抗ネクチン４ ＡＤＣは、ヒトネクチン４のＥＣＤのエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗ネクチン４ ＡＤＣは、ネクチン４リガンド結合性部位とは別個である、ヒトネクチン４のＥＣＤのエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約１０％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約１５％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約２０％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約２５％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約３０％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約３５％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約４０％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約４５％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約５０％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約５５％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約６０％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約６５％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約７０％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約７５％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約８０％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約８５％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約９０％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約９５％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約９８％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約９９％阻害する。一部の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約１００％阻害する。ある特定の実施形態では、細胞の増殖を、少なくとも約２５％～約６５％阻害する。具体的な実施形態では、細胞の増殖の阻害を、本明細書で記載される方法により評価する。一部の実施形態では、細胞の増殖の阻害を、当業者に公知の方法により評価する。ある特定の実施形態では、細胞の増殖の阻害は、抗ネクチン４ ＡＤＣと接触させない細胞の増殖の阻害と比べた阻害である。ある特定の実施形態では、細胞の増殖の阻害は、非類縁抗体（例えば、ネクチン４に特異的に結合しない抗体）、非類縁抗体によるＡＤＣ、又は非コンジュゲート抗ネクチン４抗体と接触させた細胞の増殖の阻害と比べた阻害である。
２５．医薬組成物
一態様では、本開示は、少なくとも１つの、本開示の抗ネクチン４ ＡＤＣを含む医薬組成物をさらに提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、１）抗ネクチン４抗体と、２）薬学的に許容される担体とを含む。
抗ネクチン４ ＡＤＣを含む医薬組成物は、保存のために、所望の純度を有する抗ネクチン４ ＡＤＣを、任意選択の、生理学的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」（１８版、１９８０）を参照されたい）と、水溶液の形態又は凍結乾燥又は他の乾燥形態で混合することにより調製される。
本開示の抗体は、標的細胞／組織への送達に適する、任意の形態で、例えば、マイクロカプセル又はマクロエマルジョンとして（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、前出；Ｐａｒｋら、２００５、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１０：１４６～６１；Ｍａｌｉｋら、２００７、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．、４：１４１～５１）、徐放製剤として（Ｐｕｔｎｅｙ及びＢｕｒｋｅ、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６：１５３～５７）、又はリポソーム内に（Ｍａｃｌｅａｎら、１９９７、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、１１：３２５～３２；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、２００６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、８：３９～４５）製剤化することができる。
本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣはまた、例えば、コアセルベーション技法により、又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）内、又はマクロエマルジョン中の、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル内又はゼラチンマイクロカプセル内及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル内に封入することもできる。このような技法については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、前出において開示されている。
リポソーム内、マイクロ粒子内、マイクロカプセル内の封入、抗ネクチン４ ＡＤＣを発現させることが可能な組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ及びＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２：４４２９～３２を参照されたい）、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築などを含むがこれらに限定されない、多様な組成物及び送達系が公知であり、本明細書で記載される、ネクチン４に結合する抗ネクチン４ ＡＤＣと共に使用することができる。別の実施形態では、組成物を、制御放出系又は徐放系として提供することができる。一実施形態では、ポンプを使用して、制御放出又は徐放を達成することができる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．、１４：２０１～４０；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０、Ｓｕｒｇｅｒｙ、８８：５０７～１６；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２１：５６９～７４を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用して、予防剤又は治療剤（例えば、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣ）、又は本明細書で提供される組成物の制御放出又は徐放を達成することができる（例えば、「制御放出の医学的応用（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ）」（Ｌａｎｇｅｒ及びＷｉｓｅ編、１９７４）；「薬物バイオアベイラビリティーの制御、医薬品のデザイン、及び効能（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）」（Ｓｍｏｌｅｎ及びＢａｌｌ編、１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ及びＰｅｐｐａｓ、１９８３、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２３：６１～１２６；Ｌｅｖｙら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８：１９０～９２；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２５：３５１～５６；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、７１：１０５～１２；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；及び米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／１５１５４号及びＰＣＴ公開第ＷＯ９９／２０２５３号を参照されたい）。徐放製剤中で使用されるポリマーの例は、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリラート）、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン－ｃｏ－ビニル酢酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、及びポリオルトエステルを含むがこれらに限定されない。一実施形態では、徐放製剤中で使用されるポリマーは、不活性であり、溶出性の不純物を含まず、保存時に安定であり、無菌であり、且つ生体分解性である。
さらに別の実施形態では、制御放出系又は徐放系は、特定の標的組織、例えば、鼻腔又は肺の近傍に留置することができるので、全身用量の一部しか要求しない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、「制御放出の医学的応用（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ）」、２巻、１１５～１３８頁（１９８４）を参照されたい）。徐放系については、Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５２７～１５３３により論じられている。当業者に公知の任意の技法を使用して、１又は複数の、本明細書で提供される、ネクチン４に結合する抗体を含む徐放製剤を作製することができる（例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０５５４８号、及び同第ＷＯ９６／２０６９８号、Ｎｉｎｇら、１９９６、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、３９：１７９～８９、Ｓｏｎｇら、１９９５、ＰＤＡ Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．＆ Ｔｅｃｈ．、５０：３７２～９７、Ｃｌｅｅｋら、１９９７、Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｏｒｏｌ Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．、２４：８５３～５４、及びＬａｍら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．、２４：７５９～６０を参照されたい）。
１又は複数の、本明細書で提供される抗体を含有する治療用製剤は、所望の純度を有する抗ネクチン４ ＡＤＣを、任意選択の、生理学的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤（「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」（１９９０）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）と、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で混合することにより、保存のために調製することができる。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる投与量及び濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、ヒスチジン、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム塩化物；フェノール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール；メチルパラベン又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及び、グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む、他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
本明細書で提供される抗体はまた、例えば、リポソーム内に製剤化することもできる。目的の分子を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８；Ｈｗａｎｇら（１９８０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０；並びに米国特許第４，４８５，０４５号、及び同第４，５４４，５４５号において記載されている方法など、当技術分野で公知の方法により調製される。循環時間を増強したリポソームについては、米国特許第５，０１３，５５６号において開示されている。
特に有用なイムノリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含有する脂質組成物を伴う逆相蒸発方法により作出することができる。規定された小孔径のフィルターを介して、リポソームを押し出して、所望の直径を伴うリポソームをもたらす。本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣのＦａｂ’断片を、Ｍａｒｔｉｎら（１９８２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７：２８６～２８８に記載されている通り、ジスルフィド交換反応を介して、リポソームへとコンジュゲートさせることができる。任意選択で、化学療法剤（ドキソルビシンなど）を、リポソーム内に含有させることができる。Ｇａｂｉｚｏｎら（１９８９）、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、８１（１９）：１４８４を参照されたい。
本明細書で記載される製剤などの製剤はまた、処置される特定の適応に必要な、１つを超える活性化合物も含有しうる。ある特定の実施形態では、製剤は、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣと、互いに、有害な影響を及ぼさない、補完的な活性を伴う、１又は複数の活性化合物とを含む。このような分子は、意図される目的に有効な量で、組み合わせて、適切に存在する。例えば、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣは、１又は複数の他の治療剤と組み合わせることができる。このような組合せ療法を、患者へと、連続的に投与することもでき、同時に投与することもでき、逐次的に投与することもできる。
本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣはまた、例えば、コアセルベーション技法により、又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）内、又はマクロエマルジョン中の、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル内又はゼラチンマイクロカプセル内及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル内に封入することもできる。このような技法については、「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」（１９９０）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡにおいて開示されている。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける投与に使用される製剤は、滅菌製剤でありうる。これは、滅菌濾過膜を介する濾過によりたやすく達せられる。
また、持続放出調製物も調製することができる。適切な持続放出調製物の例は、抗ネクチン４ ＡＤＣを含有する、固体の疎水性ポリマーによる半透性マトリックスであって、成型品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態にあるマトリックスを含む。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリル酸）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸とγエチル－Ｌ－グルタマートとのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマーと、酢酸ロイプロリドとから構成される注射用マイクロスフェア）などの分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、及びポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン－酢酸ビニル及び乳酸－グリコール酸などのポリマーが、１００日間を超えて、分子の放出を可能とするのに対し、ある特定のハイドロゲルは、タンパク質を放出する期間が短い。封入された抗体は、長時間にわたり、体内にとどまるが、３７℃の水分へと曝露される結果として、変性又は凝集し、生体活性の喪失及び可能な免疫原性の変化を結果としてもたらす場合がある。関与する機構に応じた、安定化のための妥当な戦略を案出することができる。例えば、凝集機構が、チオ－ジスルフィド交換を介する、分子間Ｓ－Ｓ結合の形成であると判明すれば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含量を制御し、適切な添加剤を使用し、特異的なポリマーマトリックス組成物を開発することにより達成することができる。
本明細書で提供される医薬組成物は、治療有効量の、本明細書で提供される抗体のうちの１又は複数と、任意選択で、１又は複数の、さらなる予防剤又は治療剤を、薬学的に許容される担体中に含有する。このような医薬組成物は、ネクチン４媒介性疾患、又はその症状のうちの１又は複数の防止、処置、管理、又は改善において有用である。
本明細書で提供される化合物の投与に適する医薬担体は、特定の投与方式に適することが当業者に公知である、任意のこのような担体を含む。
加えて、本明細書で提供される抗体は、組成物中の唯一の薬学的有効成分として製剤化することもでき、他の有効成分（１又は複数の、他の予防剤又は治療剤など）と組み合わせることもできる。
組成物は、１又は複数の、本明細書で提供される抗体を含有しうる。一実施形態では、抗体は、経口投与のための、溶液、懸濁液、錠剤、分散性錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、徐放製剤、若しくはエリキシル剤、又は非経口投与のための滅菌溶液若しくは懸濁液のほか、経皮パッチ調製物及び乾燥粉末吸入器など、適切な医薬調製物へと製剤化することができる。一実施形態では、上記で記載した抗体を、当技術分野で周知の技法及び手順（例えば、Ａｎｓｅｌ（１９８５）、「医薬剤形入門（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」、４版、１２６頁を参照されたい）を使用して、医薬組成物へと製剤化する。
組成物中では、有効濃度の、１又は複数の抗体又はそれらの誘導体を、適切な医薬担体と混合する。組成物中の化合物の濃度は、投与されると、ネクチン４媒介性疾患又はその症状を処置、防止、又は改善する量の送達に有効である。
一実施形態では、組成物を、単回投与のために製剤化する。処置される状態が、緩和されるか、防止されるか、又は１若しくは複数の症状が改善されるように、組成物を製剤化するために、化合物の重量画分を、選択された担体中、有効濃度で、溶解させるか、懸濁させるか、分散させるか、又は他の形で混合する。
本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを、薬学的に許容される担体中に、処置される患者に対する、所望されない副作用の非存在下で、治療的に有用な効果を及ぼすのに十分な有効量で組み入れる。治療有効濃度は、規定の方法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系及びｉｎ ｖｉｖｏ系において、化合物を調べることにより、経験的に決定し、次いで、ヒトに対する投与のために、これから外挿することができる。
医薬組成物中の抗ネクチン４ ＡＤＣの濃度は、例えば、抗ネクチン４ ＡＤＣの物理化学的特徴、投与スケジュール、及び投与される量のほか、当業者に公知の他の因子に依存するであろう。
一実施形態では、治療有効投与量は、約０．１ｎｇ／ｍｌ～約５０～１００μｇ／ｍｌの、抗ネクチン４ ＡＤＣの血清濃度をもたらす。別の実施形態では、医薬組成物は、１日当たり、体重１キログラム当たり約０．００１ｍｇ～約２０００ｍｇの抗ネクチン４ ＡＤＣの投与量をもたらす。単位医薬剤形は、単位剤形当たり、約０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ、又は１ｍｇ～約５００ｍｇ、１０００ｍｇ、又は２０００ｍｇをもたらし、一実施形態では、約１０ｍｇ～約５００ｍｇの抗ネクチン４ ＡＤＣ、及び／又は他の任意選択の不可欠の成分の組合せをもたらすように調製することができる。
抗ネクチン４ ＡＤＣは、一度に投与することもでき、ある時間間隔で投与される、多数の小用量へと分けることもできる。処置の正確な投与量及び持続時間は、処置される疾患の関数であり、公知の試験プロトコールを使用して、又は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおける試験データからの外挿により、経験的に決定しうることが理解される。濃度及び投与量の値はまた、軽減される状態の重症度によっても変動しうることに留意されたい。任意の特定の対象に応じて、時間経過にわたり、個別の必要、及び組成物を投与するか、又は組成物の投与を監視する担当者の職業的判断に従い、具体的投与レジメンを調整することが可能であり、本明細書で明示される濃度範囲が、例示的なものであるに過ぎず、特許請求される組成物の範囲又は実用を限定することを意図するものではないことをさらに理解されたい。
抗ネクチン４ ＡＤＣを混合又は添加したら、結果として得られる混合物は、溶液、懸濁液、エマルジョンなどでありうる。結果として得られる混合物の形態は、意図される投与方式、及び選択される担体中又は媒体中の、化合物の可溶性を含む、いくつかの因子に依存する。有効濃度は、処置される疾患、障害、又は状態の症状を改善するために十分であり、経験的に決定することができる。
医薬組成物は、適切な数量の化合物又は薬学的に許容されるその誘導体を含有する、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉剤、顆粒剤、滅菌非経口溶液又は非経口懸濁液、及び経口溶液又は経口懸濁液、並びに油－水エマルジョンなどの単位剤形で、ヒト及び動物への投与のために提供される。一実施形態では、抗ネクチン４ ＡＤＣを、製剤化し、単位剤形又は複数回投与のための剤形で投与する。本明細書で使用される単位剤形とは、当技術分野で公知の通り、ヒト対象及び動物対象に適し、個別にパッケージングされた、物理的に個別の単位を指す。各単位剤形は、要求される医薬担体、媒体、又は希釈剤と会合させた、所望の治療的効果をもたらすのに十分な、所定の数量の抗ネクチン４ ＡＤＣを含有する。単位剤形の例は、アンプル及びシリンジ、並びに個別にパッケージングされた錠剤又はカプセル剤を含む。単位剤形を、その分数形又は倍数形により投与することができる。複数回投与のための剤形とは、単位剤形の分割により投与される、単一の容器内にパッケージングされた、複数の、同一な単位剤形である。複数回投与のための剤形の例は、バイアル、錠剤若しくはカプセル剤のボトル、又はピント単位若しくはガロン単位のボトルを含む。よって、複数回投与のための剤形とは、パッケージングにより分割されない単位用量の倍数形である。
一部の実施形態では、本明細書で提供される、１又は複数の抗ネクチン４抗体は、液体の医薬製剤である。液体の、薬学的に投与可能な組成物は、例えば、上記で規定した活性化合物と、任意選択の医薬用アジュバントとを、例えば、水、生理食塩液、デキストロース水溶液、グリセロール、グリコール、エタノールなどの担体中に溶解させるか、分散させるか、又は混合して、これにより、溶液又は懸濁液を形成することにより、調製することができる。所望の場合、投与される医薬組成物はまた、保湿剤、乳化剤、可溶化剤、例えば、酢酸、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミンなどのｐＨ緩衝剤、及び他のこのような薬剤など、少量の非毒性補助物質も含有しうる。
当業者には、このような剤形を調製する、実際の方法が公知であるか、又は明らかであろう。例えば、「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」（１９９０）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを参照されたい。
非毒性担体から構成される残量との関係で、抗ネクチン４ ＡＤＣを、０．００５％～１００％の範囲で含有する剤形又は組成物を調製することができる。当業者には、これらの組成物を調製するための方法が公知である。
経口医薬剤形は、固体、ゲル、又は液体である。固体剤形は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、及びバルク粉剤である。経口錠剤の種類は、圧縮され、咀嚼可能な、ドロップ剤及び錠剤であって、腸溶性コーティングされる場合もあり、糖コーティングされる場合もあり、フィルムコーティングされる場合もある、上記ドロップ剤及び錠剤を含む。カプセルが、硬質ゼラチンカプセルの場合もあり、軟質ゼラチンカプセル剤の場合もある一方、顆粒剤及び粉剤は、当業者に公知の他の成分の組合せを伴う、非発泡性形態で提供することもでき、発泡性形態で提供することもできる。
ある特定の実施形態では、製剤は、固体剤形である。ある特定の実施形態では、製剤は、カプセル剤又は錠剤である。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分：結合剤；滑沢剤；希釈剤；流動促進剤；崩壊剤；着色剤；甘味剤；芳香剤；保湿剤；催吐性コーティング；及びフィルムコーティングのうちの１又は複数、又は同様な性質の化合物を含有しうる。結合剤の例は、結晶セルロース、トラガントガム、グルコース溶液、アラビアゴム液、ゼラチン溶液、糖蜜、ポリビニルピロリドン、ポビドン、クロスポビドン、スクロース、及びデンプンペーストを含む。滑沢剤は、滑石、デンプン、ステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸カルシウム、石松子、及びステアリン酸を含む。希釈剤は、例えば、ラクトース、スクロース、デンプン、カオリン、塩、マンニトール、及びリン酸二カルシウムを含む。流動促進剤は、コロイド状二酸化ケイ素を含むがこれらに限定されない。崩壊剤は、クロスカルメロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、アルギン酸、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、ベントナイト、メチルセルロース、寒天、及びカルボキシメチルセルロースを含む。着色剤は、例えば、承認及び公認された、水溶性のＦＤ色素及びＣ色素、これらの混合物；並びに水酸化アルミニウム上に懸濁させた、水に不溶性のＦＤ色素及びＣ色素のうちのいずれかを含む。甘味剤は、スクロース、ラクトース、マンニトール、及びサッカリンなどの人工的甘味剤、並びに任意の数の噴霧乾燥芳香剤を含む。芳香剤は、果実などの植物から抽出された天然芳香剤、並びにペパーミント及びサリチル酸メチルなどであるがこれらに限定されない、清涼感をもたらす化合物の合成ブレンドを含む。保湿剤は、モノステアリン酸プロピレングリコール、モノオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ジエチレングリコール、及びポリオキシエチレンラウリルエーテルを含む。催吐性コーティングは、脂肪酸、脂肪、蝋、シェラック、アンモニア化シェラック、及びフタル酸酢酸セルロースを含む。フィルムコーティングは、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリエチレングリコール４０００、及びフタル酸酢酸セルロースを含む。
抗体を、胃の酸性環境からそれを保護する組成物により提供することができる。例えば、組成物は、胃内でその完全性を維持し、腸内で活性化合物を放出する、腸溶性コーティングにより製剤化することができる。組成物はまた、制酸剤又は他のこのような成分と組み合わせても製剤化することができる。
単位剤形が、カプセルである場合、それは、上記種類の材料に加えて、脂肪油などの液体担体も含有しうる。加えて、単位剤形は、投与単位の物理的形態を修飾する、多様な他の材料、例えば、糖及び他の腸溶剤によるコーティングを含有しうる。化合物はまた、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェハー剤、スプリンクル剤、チューインガムなどの成分としても投与することができる。シロップ剤は、活性化合物に加えて、甘味剤としてのスクロース、並びにある特定の防腐剤、色素及び着色剤及び芳香剤を含有しうる。
抗ネクチン４ ＡＤＣはまた、所望の作用を損なわない、他の活性材料、又は制酸剤、Ｈ２遮断剤、及び利尿剤など、所望の作用を補完する材料とも混合することができる。有効成分は、本明細書で記載される抗ネクチン４ ＡＤＣ、又は薬学的に許容されるその誘導体である。高濃度、重量で最大約９８％の有効成分を組み入れることができる。
全ての実施形態では、錠剤及びカプセル剤による製剤は、有効成分の溶解を修飾するか、又は持続させるために、当業者が公知の通りにコーティングすることができる。したがって、例えば、錠剤及びカプセル剤による製剤は、サリチル酸フェニル、蝋、及びフタル酸酢酸セルロースなど、従来の、腸内摂取可能なコーティングでコーティングすることができる。
一部の実施形態では、製剤は、液体剤形である。液体の経口剤形は、非発泡性顆粒剤から復元される、水溶液、エマルジョン、懸濁液、溶液、及び／又は懸濁液、並びに発泡性顆粒剤から復元される発泡性調製物を含む。水溶液は、例えば、エリキシル剤及びシロップ剤を含む。エマルジョンは、水中油エマルジョン又は油中水エマルジョンである。
エリキシル剤とは、透明で、甘味を付した、含水アルコール性調製物である。エリキシル剤中で使用される、薬学的に許容される担体は、溶媒を含む。シロップ剤とは、糖、例えば、スクロースの濃縮水溶液であり、防腐剤を含有しうる。エマルジョンとは、１つの液体を、別の液体の全体にわたり、小さな球体の形態で分散させた、２相系である。エマルジョン中で使用される、薬学的に許容される担体は、非水性液体、乳化剤、及び防腐剤である。懸濁液は、薬学的に許容される懸濁剤及び防腐剤を使用する。液体経口剤形へと復元される、非発泡性顆粒剤中で使用される、薬学的に許容される材料は、希釈剤、甘味剤、及び保湿剤を含む。液体経口剤形へと復元される、発泡性顆粒剤中で使用される、薬学的に許容される材料は、有機酸及び二酸化炭素の供給源を含む。着色剤及び芳香剤を、上記剤形の全てで使用する。
溶媒は、グリセリン、ソルビトール、エチルアルコール、及びシロップ剤を含む。防腐剤の例は、グリセリン、メチルパラベン及びプロピルパラベン、安息香酸、安息香酸ナトリウム、並びにアルコールを含む。エマルジョン中で利用される、非水溶液の例は、鉱物油及び綿実油を含む。乳化剤の例は、ゼラチン、アカシア、トラガント、ベントナイト、及びモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどの界面活性剤を含む。懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ペクチン、トラガント、Ｖｅｅｇｕｍ、及びアカシアを含む。甘味剤は、スクロース、シロップ剤、グリセリン、及びサッカリンなどの人工甘味剤を含む。保湿剤は、モノステアリン酸プロピレングリコール、モノオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ジエチレングリコール、及びポリオキシエチレンラウリルエーテルを含む。有機酸は、クエン酸及び酒石酸を含む。二酸化炭素の供給源は、炭酸水素ナトリウム及び炭酸ナトリウムを含む。着色剤は、承認され、公認された、水溶性のＦＤ色素及びＣ色素、並びにこれらの混合物のうちのいずれかを含む。芳香剤は、果実などの植物から抽出された天然芳香剤、及び香味感をもたらす化合物の合成ブレンドを含む。
一実施形態では、固体剤形のために、例えば、炭酸プロピレン中、植物油中、又はトリグリセリド中の、溶液又は懸濁液を、ゼラチンカプセル内に封入する。このような溶液、並びにその調製及び封入については、米国特許第４，３２８，２４５号；同第４，４０９，２３９号；及び同第４，４１０，５４５号において開示されている。液体剤形のために、例えば、ポリエチレングリコール中の溶液は、十分な数量の、薬学的に許容される液体担体、例えば、投与のために容易に測定される、水で希釈することができる。
代替的に、液体又は半固体の経口製剤は、活性化合物又は塩を、植物油中、グリコール中、トリグリセリド中、プロピレングリコールエステル（例えば、炭酸プロピレン）中、及び他のこのような担体中に溶解又は分散させ、これらの溶液又は懸濁液を、硬質又は軟質のゼラチンカプセル殻内に封入することにより調製することができる。他の有用な製剤は、米国再発行特許第２８，８１９号及び同第４，３５８，６０３号に明示された製剤を含む。略述すると、このような製剤は、本明細書で提供される化合物を含有する製剤、１，２－ジメトキシメタン、ジグリム、トリグリム、テトラグリム、ポリエチレングリコール３５０－ジメチルエーテル、ポリエチレングリコール５５０－ジメチルエーテル、ポリエチレングリコール７５０－ジメチルエーテル［呼称中、３５０、５５０、及び７５０は、ポリエチレングリコールの、近似的な平均分子量を指す］を含むがこれらに限定されない、ジアルキル化モノアルキレングリコール又はジアルキル化ポリアルキレングリコール、並びにブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、没食子酸プロピル、ビタミンＥ、ヒドロキノン、ヒドロキシクマリン、エタノールアミン、レシチン、セファリン、アスコルビン酸、リンゴ酸、ソルビトール、リン酸、チオジプロピオン酸及びそのエステル、並びにジチオカルバマートなど、１又は複数の抗酸化剤を含むがこれらに限定されない。
他の製剤は、薬学的に許容されるアセタールを含むアルコール水溶液を含むがこれらに限定されない。これらの製剤中で使用されるアルコールは、プロピレングリコール及びエタノールを含むがこれらに限定されない、１又は複数のヒドロキシル基を有する、任意の薬学的に許容される水混和性溶媒である。アセタールは、アセトアルデヒドジエチルアセタールなど、低級アルキルアルデヒドの、ジ（低級アルキル）アセタールを含むがこれらに限定されない。
一実施形態では、非経口投与は、注射を特徴とし、皮下注射、筋内注射、又は静脈内注射は、本明細書でもまた想定される。注射剤は、溶液若しくは懸濁液、注射の前に、液体中に溶解若しくは懸濁させるのに適する固体形態、又はエマルジョンとしての、従来の形態で調製することができる。注射剤、溶液、及びエマルジョンはまた、１又は複数の賦形剤も含有する。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩液、デキストロース、グリセロール、又はエタノールである。加えて、所望の場合、投与される医薬組成物はまた、保湿剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、可溶性増強剤、並びに例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、及びシクロデキストリンなど、他のこのような薬剤など、少量の非毒性補助物質も含有しうる。
本明細書ではまた、一定レベルの投与量を維持するような徐放システム又は持続放出システムの植込み（例えば、米国特許第３，７１０，７９５号を参照されたい）も想定される。略述すると、本明細書で提供される化合物を、固体の内部マトリックス、例えば、ポリメチルメタクリラート、ポリブチルメタクリラート、可塑化ポリ塩化ビニル又は非可塑化ポリ塩化ビニル、可塑化ナイロン、可塑化ポリエチレンテレフタル酸、天然ゴム、ポリイソプレン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリエチレン、エチレン－酢酸ビニルコポリマー、シリコーンゴム、ポリジメチルシロキサン、シリコーン炭酸コポリマー、アクリル酸及びメタクリル酸のエステルによるハイドロゲル、コラーゲン、架橋されたポリビニルアルコール、及び架橋された、部分的に加水分解されたポリ酢酸ビニルなどの親水性ポリマーであって、外側のポリマー膜、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン／プロピレンコポリマー、エチレン／エチルアクリル酸コポリマー、エチレン／酢酸ビニルコポリマー、シリコーンゴム、ポリジメチルシロキサン、ネオプレンゴム、塩素化ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、酢酸ビニルを伴う塩化ビニルコポリマー、塩化ビニリデン、エチレン及びプロピレン、アイオノマー、ポリエチレンテレフタラート、ブチルゴム、エピクロロヒドリンゴム、エチレン／ビニルアルコールコポリマー、エチレン／酢酸ビニル／ビニルアルコールテルポリマー、並びに体液中で非可溶性である、エチレン／ビニルオキシエタノールコポリマーにより取り囲まれた、上記親水性ポリマー中に分散させる。抗ネクチン４ ＡＤＣは、放出律速段階にある、外側のポリマー膜を介して拡散する。このような非経口組成物中に含有される抗ネクチン４ ＡＤＣの量は、その特異的性質のほか、化合物の活性、及び対象の必要に高度に依存する。
非経口投与のための調製物は、注射の準備ができた滅菌溶液、使用の直前に、溶媒と組み合わせる準備ができた、皮下錠剤を含む、凍結乾燥粉剤などの滅菌乾燥可溶性産物、注射の準備ができた滅菌懸濁液、使用の直前に、媒体と組み合わせる準備ができた、滅菌乾燥不溶性産物、及び滅菌エマルジョンを含む。溶液は、水性の場合もあり、非水性の場合もある。
静脈内投与された場合、適切な担体は、生理学的食塩液又はリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）と、グルコース、ポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコール、並びにこれらの混合物など、増粘剤及び可溶化剤を含有する溶液とを含む。
非経口調製物中で使用される、薬学的に許容される担体は、水性媒体、非水性媒体、抗微生物薬剤、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁剤及び分散剤、乳化剤、封鎖剤又はキレート剤、及び他の薬学的に許容される物質を含む。
水性媒体の例は、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張性デキストロース注射液、滅菌水注射液、デキストロース、及び乳酸加リンゲル注射液を含む。非水性非経口媒体は、植物由来の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、及びラッカセイ油を含む。静菌濃度又は静真菌濃度の抗微生物剤を、フェノール又はクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル及びｐ－ヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、並びに塩化ベンゼトニウムを含む、複数回投与用容器内にパッケージングされた非経口調製物へと添加することができる。等張性剤は、塩化ナトリウム及びデキストロースを含む。緩衝剤は、リン酸緩衝液及びクエン酸緩衝液を含む。抗酸化剤は、重硫酸ナトリウムを含む。局所麻酔剤は、プロカイン塩酸塩を含む。懸濁剤及び分散剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンを含む。乳化剤は、ポリソルバート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）を含む。金属イオンの封鎖剤又はキレート剤は、ＥＤＴＡを含む。医薬担体はまた、水混和性媒体のための、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコール；並びにｐＨ調整のための、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、又は乳酸も含む。
薬学的活性化合物の濃度は、注射が、所望の薬理学的効果を生み出すのに有効な量をもたらすように調整する。正確な用量は、当技術分野で公知である通り、患者又は動物の、年齢、体重、及び状態に依存する。
単位用量の非経口調製物は、アンプル内、バイアル内、又は注射針を伴うシリンジ内にパッケージングすることができる。非経口投与のための、全ての調製物は、当技術分野で、公知であり、実施されている通り、滅菌調製物でありうる。
例示的に述べると、活性化合物を含有する、滅菌水溶液の静脈内注入又は動脈内注入は、効果的な投与方式である。別の実施形態は、所望の薬理学的効果をもたらす必要に応じて注射される活性材料を含有する、滅菌で、水性又は油性の、溶液又は懸濁液である。
注射剤を、局所投与及び全身投与のためにデザインする。一実施形態では、治療有効投与量は、少なくとも約０．１％ ｗ／ｗであり、最大で約９０％ ｗ／ｗ、又はこれを超える濃度を含有するように製剤化することができ、ある特定の実施形態では、処置される組織（単数又は複数）に対する、１％ ｗ／ｗを超える濃度の活性化合物を含有するように製剤化することができる。
抗ネクチン４ ＡＤＣは、微粒化形態又は他の適切な形態で懸濁させることができる。結果として得られる混合物の形態は、意図される投与方式、及び選択される担体中又は媒体中の、化合物の可溶性を含む、いくつかの因子に依存する。有効濃度は、状態の症状を改善ために十分であり、経験的に決定することができる。
他の実施形態では、医薬製剤は、溶液、エマルジョン、及び他の混合物としての投与のために復元されうる、凍結乾燥粉末である。医薬製剤はまた、固体又はゲルとして、復元及び製剤化することもできる。
凍結乾燥粉剤は、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣ、又は薬学的に許容されるその誘導体を、適切な溶媒中に溶解させることにより調製する。一部の実施形態では、凍結乾燥粉剤は、滅菌凍結乾燥粉剤である。溶媒は、粉剤又は粉剤から調製された復元溶液の、安定性を改善する賦形剤、又は他の薬理学的成分を含有しうる。使用されうる賦形剤は、デキストロース、ソルビトール、果糖、トウモロコシシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロース、又は他の適切な薬剤を含むがこれらに限定されない。溶媒はまた、クエン酸緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、又はリン酸カリウム緩衝液、又は、一実施形態では、ｐＨをほぼ中性とする、当業者に公知である、他のこのような緩衝液などの緩衝液も含有しうる。後続する、溶液の滅菌濾過に続く、当業者に公知の、標準的な条件下における凍結乾燥処理は、所望の製剤をもたらす。一実施形態では、結果として得られる溶液を、凍結乾燥処理のためのバイアルへと分配するであろう。各バイアルは、化合物の単回投与のための投与量又は複数回投与のための投与量を含有するであろう。凍結乾燥粉剤は、約４℃～室温など、適切な条件下で保存することができる。
注射のための、この凍結乾燥粉末の、水による復元は、非経口投与における使用のための製剤をもたらす。復元のために、凍結乾燥粉末を、滅菌水又は他の適切な担体へと添加する。正確な量は、選択される化合物に依存する。このような量は、経験的に決定することができる。
外用混合物は、局所投与及び全身投与について記載されている通りに調製される。結果として得られる混合物は、溶液、懸濁液、エマルジョンなどであることが可能であり、クリーム、ゲル、軟膏、エマルジョン、溶液、エリキシル剤、ローション、懸濁液、チンキ剤、ペースト剤、フォーム、エアゾール、灌流液、スプレー、坐剤、包帯剤、皮膚用パッチ、又は外用投与に適する、他の任意の製剤として製剤化することができる。
本明細書で提供される抗体は、吸入などによる外用適用のためのエアゾールとして製剤化することができる（例えば、炎症性疾患、特に、喘息の処置に有用な、ステロイドを送達するためのエアゾールについて記載する、米国特許第４，０４４，１２６号、同第４，４１４，２０９号、及び同第４，３６４，９２３号を参照されたい）。気管への投与のためのこれらの製剤は、単独の、又はラクトースなどの不活性担体と組み合わせた、噴霧器用のエアゾール又は溶液の形態の場合もあり、吹送のための超微粒粉剤としての形態の場合もある。一実施形態では、このような場合、製剤の粒子は、５０ミクロン未満、一実施形態では、１０ミクロン未満の直径を有するであろう。
化合物は局所適用又は外用適用のために、例えば、ゲル、クリーム、及びローションの形態で、眼内など、皮膚及び粘膜への外用適用のために、及び眼への適用のために、又は槽内適用又は髄腔内適用のために製剤化することもできる。外用投与は、経皮送達のために想定され、また、眼若しくは粘膜への投与のために、又は吸入療法のためにも想定される。単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた活性化合物の経鼻溶液もまた、投与することができる。
これらの溶液、特に、眼科使用が意図される溶液は、適切な塩を伴う、０．０１％～１０％、ｐＨ約５～７の等張液として製剤化することができる。
本明細書ではまた、イオントフォレーシスデバイス及び電気泳動デバイスを含む経皮パッチ、並びに直腸内投与など、他の投与経路も想定される。
当業者には、イオントフォレーシスデバイス及び電気泳動デバイスを含む経皮パッチが周知である。例えば、このようなパッチについては、米国特許第６，２６７，９８３号、同第６，２６１，５９５号、同第６，２５６，５３３号、同第６，１６７，３０１号、同第６，０２４，９７５号、同第６，０１０，７１５号、同第５，９８５，３１７号、同第５，９８３，１３４号、同第５，９４８，４３３号、及び同第５，８６０，９５７号において開示されている。
例えば、直腸内投与のための医薬剤形は、全身効果のための、直腸内坐剤、カプセル剤、及び錠剤である。本明細書で使用される直腸内坐剤とは、直腸への挿入のための固体であって、体温で溶融又は軟化し、１又は複数の薬理学的有効成分又は治療有効成分を放出する、上記固体を意味する。直腸内坐剤中で利用される、薬学的に許容される材料は、融点を上げるための基剤又は媒体及び薬剤である。基剤の例は、ココアバター（テオブロマ油）、グリセリン－ゼラチン、カーボワックス（ポリオキシエチレングリコール）、並びに脂肪酸の、モノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリドの適切な混合物を含む。多様な基剤の組合せを使用することができる。坐剤の融点を上げるための基剤は、鯨蝋及び蝋を含む。直腸内坐剤は、圧縮方法により調製することもでき、成形により調製することもできる。一実施形態では、直腸内坐剤の重量は、約２～３グラムである。
同じ薬学的に許容される物質を使用して、経口投与のための製剤のための同じ方法により、直腸内投与のための錠剤及びカプセル剤を製造することができる。
本明細書で提供される抗体及び他の組成物はまた、処置される対象の体内の特定の組織、受容体、又は他の領域へとターゲティングされるようにも製剤化することができる。当業者には、多くのこのようなターゲティング方法が周知である。本明細書では、全てのこのようなターゲティング方法が、本組成物における使用のために想定される。ターゲティング方法の非限定的な例については、例えば、米国特許第６，３１６，６５２号、同第６，２７４，５５２号、同第６，２７１，３５９号、同第６，２５３，８７２号、同第６，１３９，８６５号、同第６，１３１，５７０号、同第６，１２０，７５１号、同第６，０７１，４９５号、同第６，０６０，０８２号、同第６，０４８，７３６号、同第６，０３９，９７５号、同第６，００４，５３４号、同第５，９８５，３０７号、同第５，９７２，３６６号、同第５，９００，２５２号、同第５，８４０，６７４号、同第５，７５９，５４２号、及び同第５，７０９，８７４号を参照されたい。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ネクチン４抗体を、ネクチン４媒介性疾患を有するか、又はこれを有する危険性がある患者などにおける結腸へとターゲティングする（又は他の形で投与する）。
一実施形態では、腫瘍ターゲティングリポソームなどの組織ターゲティングリポソームを含む、リポソーム懸濁液もまた、薬学的に許容される担体として適しうる。これらは、当業者に公知の方法に従い調製することができる。例えば、リポソーム製剤は、米国特許第４，５２２，８１１号において記載されている通りに調製することができる。略述すると、多重膜ベシクル（ＭＬＶ）などのリポソームは、卵黄ホスファチジルコリンと、脳ホスファチジルセリンと（７：３のモル比）を、フラスコ内で乾燥させることにより形成することができる。本明細書で提供される化合物の、二価カチオンを欠く、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中溶液を添加し、脂質の薄膜が分散するまで、フラスコを振盪する。結果として得られるベシクルを洗浄して、封入されなかった化合物を除去し、遠心分離によりペレット化し、次いで、ＰＢＳ中に再懸濁させる。
２６．投与及び投薬の方法
本明細書の具体的な実施形態では、ネクチン４媒介性疾患の防止、管理、処置、及び／又は改善における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを含む上記組成物が提供される。本明細書の一実施形態では、ネクチン４媒介性疾患の防止における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを含む上記組成物が提供される。本明細書の一実施形態では、ネクチン４媒介性疾患の管理における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを含む上記組成物が提供される。本明細書の一実施形態では、ネクチン４媒介性疾患の処置における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを含む上記組成物が提供される。本明細書の一実施形態では、ネクチン４媒介性疾患の改善における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを含む上記組成物が提供される。ある特定の実施形態では、対象は、それを必要とする対象である。一部の実施形態では、対象は、ネクチン４媒介性疾患を有する。他の実施形態では、対象は、ネクチン４媒介性疾患を有する危険性がある。一部の実施形態では、投与は、ネクチン４媒介性疾患の防止、管理、処置、又は改善を結果としてもたらす。一実施形態では、抗ネクチン４ ＡＤＣは、抗ネクチン４抗体が、抗体Ｍ２２－３２１ｂ４１．１であるＡＤＣである。
本明細書の一実施形態では、ネクチン４媒介性疾患の症状の防止、管理、処置、及び／又は改善における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを含む上記組成物が提供される。本明細書の一実施形態では、ネクチン４媒介性疾患の症状の防止における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを含む上記組成物が提供される。本明細書の一実施形態では、ネクチン４媒介性疾患の症状の管理における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを含む上記組成物が提供される。本明細書の一実施形態では、ネクチン４媒介性疾患の症状の処置における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを含む上記組成物が提供される。本明細書の一実施形態では、ネクチン４媒介性疾患の症状の改善における使用のための組成物であって、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを含む上記組成物が提供される。ある特定の実施形態では、対象は、それを必要とする対象である。一部の実施形態では、対象は、ネクチン４媒介性疾患を有する。他の実施形態では、対象は、ネクチン４媒介性疾患を有する危険性がある。一部の実施形態では、投与は、ネクチン４媒介性疾患の症状の防止、管理、処置、又は改善を結果としてもたらす。一実施形態では、ネクチン４抗体は、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１である。
別の実施形態では、本明細書では、対象におけるネクチン４媒介性疾患を防止、管理、処置、及び／又は改善する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン４ ＡＤＣを投与するステップを含む上記方法が提供される。本明細書の一実施形態では、対象におけるネクチン４媒介性疾患を防止する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン４ ＡＤＣを投与するステップを含む上記方法が提供される。本明細書の一実施形態では、対象におけるネクチン４媒介性疾患を管理する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン４ ＡＤＣを投与するステップを含む上記方法が提供される。本明細書の一実施形態では、対象におけるネクチン４媒介性疾患を処置する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン４ ＡＤＣを投与するステップを含む上記方法が提供される。本明細書の一実施形態では、対象におけるネクチン４媒介性疾患を改善する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン４ ＡＤＣを投与するステップを含む上記方法が提供される。ある特定の実施形態では、対象は、それを必要とする対象である。一部の実施形態では、対象は、ネクチン４媒介性疾患を有する。他の実施形態では、対象は、ネクチン４媒介性疾患を有する危険性がある。一部の実施形態では、投与は、ネクチン４媒介性疾患の防止、管理、処置、又は改善を結果としてもたらす。一実施形態では、抗ネクチン４ ＡＤＣは、抗ネクチン４抗体が、抗体Ｍ２２－３２１ｂ４１．１であるＡＤＣである。
別の実施形態では、本明細書では、対象におけるネクチン４媒介性疾患の症状を防止、管理、処置、及び／又は改善する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン４ ＡＤＣを投与するステップを含む上記方法が提供される。本明細書の一実施形態では、対象におけるネクチン４媒介性疾患の症状を防止する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン４ ＡＤＣを投与するステップを含む上記方法が提供される。本明細書の一実施形態では、対象におけるネクチン４媒介性疾患の症状を管理する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン４ ＡＤＣを投与するステップを含む上記方法が提供される。本明細書の一実施形態では、対象におけるネクチン４媒介性疾患の症状を処置する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン４ ＡＤＣを投与するステップを含む上記方法が提供される。本明細書の一実施形態では、対象におけるネクチン４媒介性疾患を改善する方法であって、本明細書で提供される、有効量の抗ネクチン４ ＡＤＣを投与するステップを含む上記方法が提供される。ある特定の実施形態では、対象は、それを必要とする対象である。一部の実施形態では、対象は、ネクチン４媒介性疾患を有する。他の実施形態では、対象は、ネクチン４媒介性疾患を有する危険性がある。一部の実施形態では、投与は、ネクチン４媒介性疾患の症状の防止、管理、処置、又は改善を結果としてもたらす。一実施形態では、抗ネクチン４ ＡＤＣは、抗ネクチン４抗体が、抗体Ｍ２２－３２１ｂ４１．１であるＡＤＣである。
本明細書で提供される抗体はまた、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの診断方法及び治療方法の両方において、ネクチン４抗原を精製、検出、及びターゲティングするのにも使用することができる。例えば、修飾抗体は、生物学的試料中のネクチン４のレベルを、定性的、且つ、定量的に測定するために、イムノアッセイにおいて使用される。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、「抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２版、１９８８）（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本明細書ではまた、対象へと、有効量の抗ネクチン４ ＡＤＣ、又は本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを含む医薬組成物を投与することにより、ネクチン４媒介性疾患を防止、管理、処置、及び／又は改善する方法も提供される。一態様では、抗ネクチン４ ＡＤＣは、実質的に精製されている（すなわち、その効果を制限するか、又は所望されない副作用をもたらす物質を実質的に含まない）。ある特定の実施形態では、抗ネクチン４ ＡＤＣ内の抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体などのヒトモノクローナル抗体である。治療を投与される対象は、非霊長動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）又は霊長動物（例えば、カニクイザルなどのサル又はヒト）などの哺乳動物でありうる。一実施形態では、対象は、ヒトである。別の実施形態では、対象は、ネクチン４媒介性疾患を伴うヒトである。
リポソーム内、マイクロ粒子内、マイクロカプセル内の封入、抗ネクチン４ ＡＤＣを発現させることが可能な組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ及びＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２：４４２９～４４３２（１９８７）を参照されたい）、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築などを含むがこれらに限定されない、多様な送達系が公知であり、予防剤又は治療剤（例えば、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣ）を投与するのに使用することができる。予防剤若しくは治療剤（例えば、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣ）、又は医薬組成物を投与する方法は、非経口投与（例えば、皮内投与、筋内投与、腹腔内投与、静脈内投与、及び皮下投与）、硬膜外投与、経粘膜投与（例えば、経鼻経路及び経口経路）を含むがこれらに限定されない。具体的な実施形態では、予防剤若しくは治療剤（例えば、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣ）、又は医薬組成物を、鼻腔内投与、筋内投与、静脈内投与、又は皮下投与する。予防剤若しくは治療剤、又は組成物は、任意の好都合な経路、例えば、注入又はボーラス注射、上皮又は皮膚粘膜内壁（例えば、口腔粘膜、鼻腔粘膜、直腸粘膜、及び腸粘膜など）を介する吸収によりにより投与することができ、他の生物学的活性薬剤と併せて投与することができる。投与は、全身投与の場合もあり、局所投与の場合もある。加えて、例えば、吸入器又は噴霧器、及びエアゾール化剤を伴う製剤の使用により、肺内投与もまた用いることができる。例えば、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０，５４０号、及び同第４，８８０，０７８号；並びにＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１９２４４号、同第ＷＯ９７／３２５７２号、同第ＷＯ９７／４４０１３号、同第ＷＯ９８／３１３４６号、及び同第ＷＯ９９／６６９０３号を参照されたい。
具体的な実施形態では、本明細書で提供される予防剤若しくは治療剤、又は医薬組成物を、処置を必要とする領域へと局所投与することが所望でありうる。これは、例えば、局所注入により達成することもでき、外用投与により（例えば、鼻腔内スプレーにより）により達成することもでき、シラスティック膜などの膜又は繊維を含む、多孔性材料、非多孔性材料、又はゼラチン性材料であるインプラントにより達成することもできるが、限定を目的とするわけではない。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを投与する場合、抗ネクチン４ ＡＤＣが吸着しない材料を使用するように注意しなければならない。
別の実施形態では、本明細書で提供される予防剤若しくは治療剤、又は組成物を、ベシクル、特に、リポソームで送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５２７～１５３３；Ｔｒｅａｔら、「感染性疾患及びがんの治療におけるリポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ）」、Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ及びＦｉｄｌｅｒ（編）、Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３５３～３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、同上、３１７～３２７頁を参照されたい；一般に、同上を参照されたい）。
別の実施形態では、本明細書で提供される予防剤若しくは治療剤、又は組成物を、制御放出系又は徐放系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用して、制御放出又は徐放を達成することができる（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．、１４：２０；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０、Ｓｕｒｇｅｒｙ、８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２１：５７４を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用して、予防剤又は治療剤（例えば、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣ）、又は本明細書で提供される組成物の制御放出又は徐放を達成することができる（例えば、「制御放出の医学的応用（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ）」、Ｌａｎｇｅｒ及びＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；「薬物バイオアベイラビリティーの制御、医薬品のデザイン、及び効能（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）」、Ｓｍｏｌｅｎ及びＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ及びＰｅｐｐａｓ、１９８３、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２３：６１を参照されたい；また、Ｌｅｖｙら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、７１：１０５；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／１５１５４号；及びＰＣＴ公開第ＷＯ９９／２０２５３号も参照されたい）。徐放製剤中で使用されるポリマーの例は、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリラート）、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン－ｃｏ－酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、及びポリオルトエステルを含むがこれらに限定されない。ある実施形態では、徐放製剤中で使用されるポリマーは、不活性、溶出性の不純物非含有、保存時に安定、無菌、及び生体分解性である。さらに別の実施形態では、制御放出系又は徐放系は、治療標的、すなわち、鼻腔又は肺の近傍に留置することができるので、全身用量の一部しか要求しない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、「制御放出の医学的応用（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ）」、前出、２巻、１１５～１３８頁（１９８４）を参照されたい）。徐放系については、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５２７～１５３３）による総説において論じられている。当業者に公知の任意の技法を使用して、１又は複数の、本明細書で提供される抗体を含む徐放製剤を作製することができる。例えば、それらの各々が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第４，５２６，９３８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０５５４８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／２０６９８号、Ｎｉｎｇら、１９９６、「徐放ゲルを使用する、ヒト結腸がんの腫瘍内放射線免疫療法（Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｕｓｉｎｇ Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ－Ｒｅｌｅａｓｅ Ｇｅｌ）」、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、３９：１７９～１８９、Ｓｏｎｇら、１９９５、「長時間循環型エマルジョンの、抗体媒介型肺ターゲティング（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｌｕｎｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｏｎｇ－Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）」、ＰＤＡ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５０：３７２～３９７、Ｃｌｅｅｋら、１９９７、「心血管への応用のための、ｂＦＧＦ抗体の生体分解性ポリマー担体（Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ ｂＦＧＦ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｏｒｏｌ Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．、２４：８５３～８５４、及びＬａｍら、１９９７、「局所到達のための組換えヒト化モノクローナル抗体のマイクロカプセル化（Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ Ｌｏｃａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．、２４：７５９～７６０を参照されたい。
本明細書で提供される組成物が、予防剤又は治療剤（例えば、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣ）をコードする核酸である、具体的な実施形態では、核酸を、適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えば、レトロウイルスベクターの使用により、核酸が、細胞内核酸となるように、ベクターを投与すること（米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい）により、或いは直接的な注射、又はマイクロ粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくはトランスフェクション剤によるコーティングの使用により、或いは核酸を、核に侵入することが公知であるホメオボックス様ペプチドと連結して投与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：１８６４～１８６８を参照されたい）などにより、そのコードされる予防剤又は治療剤の発現を促進するように、核酸を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて投与することができる。代替的に、核酸は、細胞内に導入し、相同組換えによる発現のために、宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
具体的な実施形態では、本明細書で提供される組成物は、１つ、２つ、又はこれを超える、本明細書で提供される抗体を含む。別の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、１つ、２つ、又はこれを超える、本明細書で提供される抗体、及び本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣ以外の予防剤又は治療剤を含む。一実施形態では、薬剤は、ネクチン４媒介性疾患の防止、管理、処置、及び／又は改善に有用であることが公知であるか、又はこれらのために使用されているか、若しくは現在使用されている。予防剤又は治療剤に加えて、本明細書で提供される組成物はまた、担体も含みうる。
本明細書で提供される組成物は、単位剤形の調製に使用されうる医薬組成物（例えば、対象又は患者への投与に適する組成物）の製造において有用な、バルクの薬物組成物を含む。ある実施形態では、本明細書で提供される組成物は、医薬組成物である。このような組成物は、予防有効量又は治療有効量の、１又は複数の予防剤又は治療剤（例えば、本明細書で提供される抗体、又は他の予防剤若しくは治療剤）と、薬学的に許容される担体とを含む。医薬組成物は、対象への投与経路に適するように製剤化することができる。
具体的な実施形態では、「担体」という用語は、治療的を、それらと共に投与する、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントのアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は媒体を指す。このような医薬担体は、水、石油、動物油、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油など、植物由来又は合成由来の油を含む油などの滅菌液体でありうる。水は、医薬組成物を、静脈内投与する場合の、例示的担体である。生理食塩液及びデキストロース水溶液及びグリセロール溶液もまた、特に、注射用液のための液体担体として用いることができる。適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、オオムギ、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。所望の場合、組成物はまた、少量の保湿剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含有しうる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、持続放出製剤などの形態を取りうる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの、標準的な担体を含みうる。適切な医薬担体の例については、「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」（１９９０）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡにおいて記載されている。このような組成物は、精製形態の抗ネクチン４ ＡＤＣなど、予防有効量又は治療有効量の抗ネクチン４ ＡＤＣを、患者への適正な投与のための形態をもたらすように、適量の担体と併せて含有するであろう。製剤は、投与方式に適するべきである。
ある実施形態では、組成物を、ヒトへの静脈内投与に適合させた医薬組成物として、規定の手順に従い製剤化する。典型的に、静脈内投与のための組成物は、滅菌水性等張緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤、及び注射部位における疼痛を和らげるための、リグノカインなどの局所麻酔剤も含みうる。しかし、このような組成物は、静脈内経路以外の経路を介して投与することもできる。
一般に、本明細書で提供される組成物の成分を、例えば、活性の薬剤の数量を指し示すアンプル又は小袋などの密封容器内に、乾燥滅菌した凍結乾燥粉剤、又は水分を含まない濃縮物として、個別に、又は単位剤形中に一体に混合して供給する。組成物を、注入により投与する場合、組成物を、医薬グレードの滅菌水又は生理食塩液を含有する注入ボトルにより分注することができる。組成物を、注射により投与する場合、投与の前に、成分を混合しうるように、注射用滅菌水又は生理食塩液のアンプルを用意することができる。
本明細書で提供される抗体又は抗ネクチン４ ＡＤＣは、抗体又は抗ネクチン４ ＡＤＣの数量を指し示すアンプル又は小袋などの密封容器内にパッケージングすることができる。一実施形態では、抗体又は抗ネクチン４ ＡＤＣを、密封容器内で、乾燥滅菌した凍結乾燥粉剤、又は水分を含まない濃縮物として供給し、例えば、水又は生理食塩液で、対象への投与に適切な濃度へと復元することができる。ある特定の実施形態では、抗体又は抗ネクチン４ ＡＤＣを、単位投与量を、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３０ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも６０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇ、少なくとも８０ｍｇ、少なくとも８５ｍｇ、少なくとも９０ｍｇ、少なくとも９５ｍｇ、又は少なくとも１００ｍｇなど、少なくとも０．１ｍｇ、少なくとも０．５ｍｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも２ｍｇ、又は少なくとも３ｍｇとする、密封容器内の乾燥滅菌凍結乾燥粉剤として供給する。凍結乾燥抗ネクチン４ ＡＤＣは、その元の容器内、２～８℃の間で保存することができ、抗ネクチン４ ＡＤＣは、復元後、６時間以内、５時間以内、３時間以内、又は１時間以内など、１２時間以内に投与することができる。代替的な実施形態では、抗体又は抗ネクチン４ ＡＤＣを、抗体又は抗ネクチン４ ＡＤＣの数量及び濃度を指し示す密封容器内の液体形態で供給する。ある特定の実施形態では、抗体又は抗ネクチン４ ＡＤＣの液体形態を、密封容器内に、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも６０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも９０ｍｇ／ｍｌ、又は少なくとも１００ｍｇ／ｍｌなど、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、又は少なくとも１ｍｇ／ｍｌで供給する。
本明細書で提供される組成物は、中性形態又は塩形態として製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するアニオンなどのアニオンと共に形成される塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するカチオンなどのカチオンと共に形成される塩を含む。
ネクチン４媒介性疾患の防止、管理、処置、及び／又は改善において有効となる、本明細書で提供される予防剤若しくは治療剤（例えば、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣ）又は組成物の量は、標準的な臨床技法により決定することができる。
したがって、約０．１μｇ／ｍｌ～約４５０μｇ／ｍｌであり、一部の実施形態では、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．２μｇ／ｍｌ、少なくとも０．４μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも０．６μｇ／ｍｌ、少なくとも０．８μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも１．５μｇ／ｍｌ、など、少なくとも２μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくとも３０μｇ／ｍｌ、少なくとも３５μｇ／ｍｌ、少なくとも４０μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも７５μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも１２５μｇ／ｍｌ、少なくとも１５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも３５０μｇ／ｍｌ、少なくとも４００μｇ／ｍｌ、又は少なくとも４５０μｇ／ｍｌの血清力価を結果としてもたらす投与量の、抗ネクチン４ ＡＤＣ又は組成物を、ネクチン４媒介性疾患の防止、管理、処置、及び／又は改善のために、ヒトへと投与することができる。加えて、任意選択で、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、最適の投与量範囲を同定する一助とすることもできる。製剤中で用いられる、正確な用量はまた、投与経路、及びネクチン４媒介性疾患の重篤度にも依存し、医療従事者の判断及び各患者の状況に従い決定されるべきである。
有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける試験系、又は動物モデルによる試験系から導出された用量反応曲線から外挿することができる。
本明細書で提供される抗体について、患者へと投与される投与量は、典型的に、患者の体重１ｋｇ当たり、０．１ｍｇ～１００ｍｇである。一部の実施形態では、患者へと投与される投与量は、患者の体重１ｋｇ当たり、約１ｍｇ～約７５ｍｇである。一部の実施形態では、患者へと投与される投与量は、患者の体重１ｋｇ当たり、１ｍｇ～５ｍｇなど、患者の体重１ｋｇ当たり、１ｍｇ～２０ｍｇの間である。一般に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫応答に起因して、他の種に由来する抗体より、ヒト体内の半減期が長い。したがって、低用量のヒト抗体及び低頻度の投与が可能であることが多い。さらに、本明細書で提供される抗体の投与量及び投与頻度は、例えば、脂質化などの修飾により、抗体の取込み及び組織への浸透を増強することにより低減することもできる。
一実施形態では、約１００ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約７５ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約５０ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約２５ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約１０ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約５ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約１ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約０．５ｍｇ／ｋｇ、又はこれ未満、又は約０．１ｍｇ／ｋｇ、又はこれ未満の抗ネクチン４ ＡＤＣを、５回、４回、３回、２回、又は１回投与して、ネクチン４媒介性疾患を管理する。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを、約１～１２回にわたり投与するが、この場合、投与は、必要に応じて、例えば、毎週、隔週、毎月、隔月、３カ月ごとなど、医師により決定される通りに実施することができる。一部の実施形態では、低用量（例えば、１～１５ｍｇ／ｋｇ）を、高頻度（例えば、３～６回）で投与することができる。他の実施形態では、高用量（例えば、２５～１００ｍｇ／ｋｇ）を、低頻度（例えば、１～３回）で投与することができる。しかし、当業者に明らかとなる通り、他の投与量及び投与スケジュールも、容易に決定可能であり、本明細書で提供される範囲内にある。
具体的な実施形態では、徐放製剤中に、約１００ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約５０ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約２５ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約１０ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約５ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約１ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約０．５ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約０．１ｍｇ／ｋｇ、又はこれ未満の抗ネクチン４ ＡＤＣを、ヒトなどの対象へと投与して、ネクチン４媒介性疾患を防止、管理、処置、及び／又は改善する。別の特異的実施形態では、徐放製剤中にはない、約１００ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約５０ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約２５ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約１０ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約５ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約１ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約０．５ｍｇ／ｋｇ、又はこれ未満、又は約０．１ｍｇ／ｋｇ、又はこれ未満の、ボーラスの抗ネクチン４ ＡＤＣを、ヒトなどの対象へと投与して、ネクチン４媒介性疾患を防止、管理、処置、及び／又は改善し、ある特定の期間の後、徐放製剤中に、約１００ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約５０ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約２５ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約１０ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約５ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約１ｍｇ／ｋｇ又はこれ未満、約０．５ｍｇ／ｋｇ、又はこれ未満、又は約５ｍｇ／ｋｇ、又はこれ未満の、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを、前記対象へと、２、３、又は４回（１回など）にわたり、（例えば、鼻腔内又は筋内）投与する。この実施形態に従い、ある特定の期間は、１～５日間、１週間、２週間、又は１カ月間でありうる。
一部の実施形態では、単一用量の、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを、１年の経過にわたり、隔週（例えば、約１４日間）の間隔で、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６回、患者へと投与して、ネクチン４媒介性疾患を防止、管理、処置、及び／又は改善するが、この場合、用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、又はこれらの組合せ（すなわち、毎月の各用量は、同一な場合もあり、同一でない場合もある）からなる群から選択される。
別の実施形態では、単一用量の、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを、１年の経過にわたり、ほぼ毎月（例えば、約３０日間）の間隔で、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２回、患者へと投与して、ネクチン４媒介性疾患を防止、管理、処置、及び／又は改善するが、この場合、用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、又はこれらの組合せ（すなわち、毎月の各用量は、同一な場合もあり、同一でない場合もある）からなる群から選択される。
一実施形態では、単一用量の、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを、１年の経過にわたり、ほぼ隔月（例えば、約６０日間）の間隔で、２、３、４、５、又は６回、患者へと投与して、ネクチン４媒介性疾患を防止、管理、処置、及び／又は改善するが、この場合、用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、又はこれらの組合せ（すなわち、隔月の各用量は、同一な場合もあり、同一でない場合もある）からなる群から選択される。
一部の実施形態では、単一用量の、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを、１年の経過にわたり、ほぼ３カ月ごと（例えば、約１２０日間）の間隔で、２、３、又は４回、患者へと投与して、ネクチン４媒介性疾患を防止、管理、処置、及び／又は改善するが、この場合、用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、又はこれらの組合せ（すなわち、３カ月ごとの各用量は、同一な場合もあり、同一でない場合もある）からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣの、患者への投与のための投与経路は、鼻腔内、筋内、静脈内、又はこれらの組合せであるが、本明細書で記載される、他の経路もまた、許容可能である。各用量は、同一の投与経路により投与する場合もあり、そうでない場合もある。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣは、複数の投与経路を介して、同時に投与することもでき、同じであるか、又は異なる、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣの、他の投与に後続して投与することもできる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを、対象へと、予防的に投与することもでき、治療的に投与することもできる。本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣは、ネクチン４媒介性疾患又はその症状を、防止し、減少させ、又は改善するように、対象へと、予防的に投与することもでき、治療的に投与することもできる。
２７．遺伝子治療
具体的な実施形態では、抗体又はその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸を、遺伝子治療を目的として、例えば、ネクチン４媒介性の疾患、障害、又は状態を、防止、管理、処置、及び／又は改善する、本明細書で提供される方法における使用のために、対象へと投与する。このような治療は、対象への、発現させた核酸又は発現可能な核酸の投与により実施される治療を包含する。ある実施形態では、核酸は、それらによりコードされる抗体をもたらし、これをコンジュゲートさせて、抗ネクチン４ ＡＤＣをもたらすことができ、抗体又は抗ネクチン４ ＡＤＣは、予防効果又は治療効果を媒介する。
当技術分野で利用可能な、組換え遺伝子発現（又は遺伝子治療）のための方法のうちのいずれかを使用することができる。例示的方法については、下記に記載し、実施例節に提供する。
遺伝子治療方法の一般的総説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、１９９３、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ、１２：４８８～５０５；Ｗｕ及びＷｕ、１９９１、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、３：８７～９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、３２：５７３～５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０：９２６～９３２；並びにＭｏｒｇａｎ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６２：１９１～２１７、１９９３年５月、ＴＩＢ ＴＥＣＨ１１（５）：ｌ５５～２１５を参照されたい。使用されうる、組換えＤＮＡ技術についての、当技術分野で一般に公知の方法については、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、「分子生物学における最新のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；及びＫｒｉｅｇｌｅｒ、「遺伝子の導入及び発現：実験室マニュアル（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）において記載されている。
具体的な実施形態では、組成物は、本明細書で提供される抗ネクチン４抗体をコードする核酸であって、適切な宿主において、抗体、又はキメラタンパク質、又は重鎖若しくは軽鎖、又はこれらの治療用部分又は薬物部分を発現させる発現ベクターの一部である上記核酸を含む。特に、このような核酸は、抗ネクチン４抗体のコード領域に作動可能に連結した異種プロモーターであって、誘導可能なプロモーター又は構成的プロモーターであり、任意選択で、組織特異的プロモーターである上記異種プロモーターなどのプロモーターを有する。別の特定の実施形態では、抗ネクチン４抗体コード配列、及び他の任意の所望の配列が、ゲノム内の所望の部位における相同組換えを促進する領域により挟まれ、このため、抗ネクチン４ ＡＤＣコード核酸の染色体内発現をもたらす核酸分子（Ｋｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈｉｅｓ、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：８９３２～８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：４３５～４３８）を使用する。一部の実施形態では、発現させた抗ネクチン４抗体分子は、単鎖抗体を含み；代替的に、核酸配列は、抗ネクチン４抗体内の、重鎖及び軽鎖の両方、又はこれらの断片をコードする配列を含む。
核酸の、対象への送達は、対象が、核酸又は核酸保有ベクターへと、直接曝露される直接的送達の場合もあり、細胞を、まず、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、核酸により形質転換し、次いで、対象へと植え込む、間接的送達の場合もある。これらの２つの手法は、それぞれ、ｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子治療、又はｅｘ ｖｉｖｏにおける遺伝子治療として公知である。
具体的な実施形態では、核酸配列を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて直接投与し、この場合、配列は、発現して、コードされる産物をもたらす。これは、当技術分野で公知の多数の方法のうちのいずれかにより、例えば、それらを、適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えば、欠損性レトロウイルス若しくは弱毒化レトロウイルス又は他のウイルスベクターを使用する感染により、配列が、細胞内配列となるように、ベクターを投与することにより（米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい）達することもでき、ネイキッドＤＮＡの直接的な注射により達することもでき、マイクロ粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくはトランスフェクション剤によるコーティング、リポソーム、マイクロ粒子、若しくはマイクロカプセル内の封入の使用により達することもでき、それらを、核に侵入することが公知であるペプチドと連結して投与すること、それを、受容体媒介性エンドサイトーシス下に置かれるリガンドと連結して投与すること（例えば、Ｗｕ及びＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２：４４２９～４４３２を参照されたい）（これは、受容体を特異的に発現する細胞型をターゲティングするのに使用することができる）などにより達することもできる。別の実施形態では、リガンドが、エンドソームを破壊して、核酸が、リソソームによる分解を回避することを可能とするように、融合性ウイルスペプチドを含む、核酸－リガンド複合体を形成することができる。さらに別の実施形態では、特異的受容体をターゲティングすることにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、細胞による特異的な取込み及び発現のために、核酸をターゲティングすることができる（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号；ＷＯ９２／２２６３５号；ＷＯ９２／２０３１６号；Ｗ０９３／１４１８８、ＷＯ９３／２０２２１号を参照されたい）。代替的に、核酸を、細胞内に導入し、相同な組換えにより、発現のための宿主細胞のＤＮＡ内に組み込むこともできる（Ｋｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈｉｅｓ、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：８９３２～８９３５；並びにＺｉｊｌｓｔｒａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：４３５～４３８）。
具体的な実施形態では、抗ネクチン４抗体をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを使用する。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９３、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１７：５８１～５９９を参照されたい）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージング、及び宿主細胞ＤＮＡへの組込みを補正するために必要な構成要素を含有する。遺伝子治療において使用される、抗ネクチン４抗体をコードする核酸配列を、対象への遺伝子の送達を容易とする、１又は複数のベクターへとクローニングすることができる。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、幹細胞を、化学療法に対して、より耐性とするために、ｍｄｒ １遺伝子を、造血幹細胞へと送達する、レトロウイルスベクターの使用について記載する、Ｂｏｅｓｅｎら、１９９４、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、６：２９１～３０２において見出すことができる。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用について例示する、他の参考文献は、Ｃｌｏｗｅｓら、１９９４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９３：６４４～６５１；Ｋｌｅｉｎら、１９９４、Ｂｌｏｏｄ、８３：１４６７～１４７３；Ｓａｌｍｏｎｓ及びＧｕｎｚｂｅｒｇ、１９９３、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、４：１２９～１４１；並びにＧｒｏｓｓｍａｎ及びＷｉｌｓｏｎ、１９９３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．、３：１１０～１１４である。
アデノウイルスは、組換えによる抗体の作製において使用されうる、他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、とりわけ、遺伝子を、呼吸器上皮へと送達するのに魅力的な媒体である。アデノウイルスは、天然で、呼吸器上皮に感染し、そこで、軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの送達系のための、他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、及び筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することが可能であるという利点を有する。Ｋｏｚａｒｓｋｙ及びＷｉｌｓｏｎ、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、３：４９９～５０３は、アデノウイルスベースの遺伝子治療についての総説を提示する。Ｂｏｕｔら、１９９４、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、５：３～１０は、アカゲザルの呼吸器上皮への遺伝子の導入のための、アデノウイルスベクターの使用を裏付けた。遺伝子治療における、アデノウイルスの使用の他の場合は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：４３１～４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２、Ｃｅｌｌ、６８：１４３～１５５；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら、１９９３、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９１：２２５～２３４；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；及びＷａｎｇら、１９９５、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２：７７５～７８３において見出すことができる。具体的な実施形態では、アデノウイルスベクターを使用する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）もまた、利用することができる（Ｗａｌｓｈら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、２０４：２８９～３００；及び米国特許第５，４３６，１４６号）。具体的な実施形態では、ＡＡＶベクターを使用して、本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣを発現させる。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、ＶＨドメインをコードする核酸を含む。他の実施形態では、ＡＡＶは、ＶＬドメインをコードする核酸を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、ＶＨドメインと、ＶＬドメインとをコードする核酸を含む。本明細書で提供される方法についての一部の実施形態では、対象に、ＶＨドメインをコードする核酸を含むＡＡＶと、ＶＬドメインをコードする核酸を含むＡＡＶとを投与する。他の実施形態では、対象に、ＶＨドメインと、ＶＬドメインとをコードする核酸を含むＡＡＶを投与する。ある特定の実施形態では、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを過剰発現させる。
遺伝子治療への別の手法は、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、又はウイルス感染などの方法により、組織培養物中の細胞へと、遺伝子を導入するステップを伴う。通例、導入方法は、選択用マーカーの、細胞への導入を含む。次いで、細胞を、選択下に置いて、転写された遺伝子を、取り込み、発現している細胞を単離する。次いで、これらの細胞を、対象へと送達する。
この実施形態では、核酸を、細胞へと導入してから、結果として得られる組換え細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて投与する。このような導入は、トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスベクター又はバクテリオファージベクターの感染、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、微小核細胞媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知である、任意の方法により実行することができる。当技術分野では、外来遺伝子を、細胞へと導入するための、多数の技法が公知であり（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ及びＢｅｈｒ、１９９３、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１７：５９９～６１８；Ｃｏｈｅｎら、１９９３、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１７：６１８～６４４；Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａ．Ｔｈｅｒ．、２９：６９～９２（１９８５）を参照されたい）、レシピエント細胞の、必要な発生機能及び生理学的機能を破壊しないことを条件として本明細書で提供される方法に従い使用することができる。核酸が、その後代細胞により、遺伝可能及び発現可能であるなど、細胞により発現可能であるように、技法は、細胞への、核酸の安定導入をもたらす。
結果として得られる組換え細胞を、当技術分野で公知である、多様な方法により、対象へと送達することができる。組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞又は前駆細胞）を、静脈内投与することができる。使用に想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者により決定されうる。
遺伝子治療を目的として、核酸を導入しうる細胞は、任意の所望の、利用可能な細胞型を包含し、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの、リンパ系細胞及び骨髄系細胞；多様な幹細胞又は前駆細胞、特に、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓から得られる、造血幹細胞又は前駆細胞などを含むがこれらに限定されない。
具体的な実施形態では、遺伝子治療のために使用される細胞は、対象に対する自家細胞である。
遺伝子治療において、組換え細胞を使用する実施形態では、抗ネクチン４抗体をコードする核酸配列を、それらが、細胞又はそれらの後代により発現可能となるように、細胞へと導入し、次いで、組換え細胞を、治療的効果のために、ｉｎ ｖｉｖｏで投与する。具体的な実施形態では、幹細胞又は前駆細胞を使用する。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて単離し、維持しうる、任意の幹細胞及び／又は前駆細胞を、本明細書で提供される方法の、この実施形態に従い、潜在的に使用することができる（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号；Ｓｔｅｍｐｌｅ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９２、Ｃｅｌｌ、７１：９７３～９８５；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ、１９８０、Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．、２１Ａ：２２９；並びにＰｉｔｔｅｌｋｏｗ及びＳｃｏｔｔ、１９８６、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．、６１：７７１を参照されたい）。
具体的な実施形態では、適切な転写のインデューサーの存在又は非存在を制御することにより、核酸の発現が制御可能となるように、遺伝子治療を目的として導入される核酸は、コード領域に作動可能に連結した誘導可能なプロモーターを含む。
２８．抗体をコードするポリヌクレオチド
また、ネクチン４エピトープに免疫特異的に結合する、本明細書で提供される抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも提供される。本明細書ではまた、例えば、上述で規定した、高厳密性、中程度の厳密性、又は低厳密性のハイブリダイゼーション条件下で、本明細書で提供される修飾抗体をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドも提供される。
当技術分野で公知である、任意の方法により、ポリヌクレオチドを得、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。本明細書で提供される、ある特定のネクチン４抗体のアミノ酸配列は、既知であるので、当技術分野で周知の方法を使用して、これらの抗体をコードするヌクレオチド配列、及びこれらの抗体の修飾形を決定することができる、すなわち、抗体をコードする核酸を作出するような形で、特定のアミノ酸をコードすることが既知であるヌクレオチドコドンをアセンブルする。抗体をコードする、このようなポリヌクレオチドは、化学合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブルすることができ（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、１９９４、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１７：２４２に記載されている）、これは、略述すると、抗体、断片、又はこれらの変異体をコードする配列の部分を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成と、これらのオリゴヌクレオチドをアニール及びライゲーションすることと、次いで、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドの、ＰＣＲによる増幅とを伴う。
代替的に、本明細書で提供される抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源（例えば、２０１７年６月１３日に寄託された、ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ－１２４２４５を有する、本明細書で提供されるＭ２２－３２１ｂ４１．１ハイブリドーマ）に由来する核酸から作出することができる。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンは利用可能でないが、抗体分子の配列は公知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学合成することもでき、配列の３’末端及び５’末端にハイブリダイズすることが可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅により、又は、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーに由来するｃＤＮＡクローンを同定するように、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用して、クローニングすることにより、適切な供給源（例えば、抗体のｃＤＮＡライブラリー、又は本明細書で提供される抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞など、抗体を発現する、任意の組織又は細胞から作出されたｃＤＮＡライブラリー、又はこれらから単離された、ポリＡ＋ＲＮＡなどの核酸）から得ることもできる。次いで、当技術分野で周知である、任意の方法を使用して、ＰＣＲにより作出される、増幅された核酸を、複製用のクローニングベクターへとクローニングすることができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号３８（ＶＨをコードする）及び／若しくは配列番号３７（ＶＬをコードする）のうちのいずれか１つ、又はこれらの任意の組合せにおいて描示される核酸配列（例えば、本明細書で提供される、全長抗体、抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖、又は単鎖抗体など、本明細書で提供される抗体をコードするヌクレオチド配列としての）を含むか、又はこれらからなる。
本明細書のある特定の態様では、ネクチン４抗原に免疫特異的に結合する、本明細書で記載される抗体又はその断片（例えば、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）及び哺乳動物細胞）における組換え発現のためのベクター、例えば、このようなポリヌクレオチドを含むベクターとが提供される。本明細書のある特定の態様では、細胞（例えば、宿主細胞）が提供される。本明細書ではまた、本明細書で記載される抗体及び抗原結合性断片を作製する方法も提供される。
本明細書のある特定の態様では、本明細書で記載される抗体の、軽鎖又は重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。本明細書のある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体の、軽鎖と重鎖とをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドは、本明細書で記載される抗体のＶＬ ＦＲ及びＶＬ ＣＤＲを含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列（例えば、それぞれ、表１～２を参照されたい）を含みうる。ポリヌクレオチドは、本明細書で記載される抗体のＶＨ ＦＲ及びＶＨ ＣＤＲを含む重鎖をコードするヌクレオチド配列（例えば、それぞれ、表１～２を参照されたい）を含みうる。具体的な実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドは、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬ鎖領域をコードする。具体的な実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドは、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ鎖領域をコードする。
本明細書の特定の実施形態では、３つのＶＬ鎖ＣＤＲを含む、例えば、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１の、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３（例えば、表１を参照されたい）を含有する、抗ネクチン４抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。本明細書の具体的な実施形態では、３つのＶＨ鎖ＣＤＲを含む、例えば、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１の、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３（例えば、表１を参照されたい）を含有する、ポリヌクレオチドが提供される。
本明細書の特定の実施形態では、ＶＬ鎖領域を含む、例えば、本明細書で記載されるアミノ酸配列（例えば、表１～２を参照されたい）を含む、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含有する、抗ネクチン４抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。本明細書の具体的な実施形態では、ＶＨ鎖領域を含む、例えば、本明細書で記載されるアミノ酸配列（例えば、表１～２を参照されたい）を含む、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含有する、抗ネクチン４抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドは、本明細書で記載されるアミノ酸配列（例えば、表１を参照されたい）を含む軽（ＶＬ）鎖可変領域を含む、本明細書で提供される抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、この場合、抗体は、ネクチン４ポリペプチドに免疫特異的に結合する。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドは、本明細書で記載されるアミノ酸配列（例えば、表１を参照されたい）を含む重（ＶＨ）鎖可変領域を含む、本明細書で提供される抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、この場合、抗体は、ネクチン４ポリペプチドに免疫特異的に結合する。
ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは、本明細書で記載されるアミノ酸配列（例えば、表２を参照されたい）を有する、１又は複数のＶＬ ＦＲを含むＶＬ鎖領域を含む、本明細書で記載される抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、この場合、抗体は、ネクチン４ポリペプチドに免疫特異的に結合する。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは、本明細書で記載されるアミノ酸配列（例えば、表２を参照されたい）を有する、１又は複数のＶＨ ＦＲを含むＶＨ鎖領域を含む、本明細書で記載される抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、この場合、抗体は、ネクチン４ポリペプチド、例えば、ヒトネクチン４ポリペプチドに免疫特異的に結合する。
具体的な実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、ヒトフレームワーク領域であるフレームワーク領域（例えば、ＶＬドメイン及びＶＨドメインのフレームワーク領域）を含む、本明細書で記載される抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、この場合、抗体は、ネクチン４ポリペプチドに免疫特異的に結合する。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、ネクチン４ポリペプチドに免疫特異的に結合する、本明細書で記載される抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１の、それぞれ、ＶＨ又はＶＬをコードする、表３に記載されたヌクレオチド配列を含む。
組換えによる抗体の作製
ネクチン４抗原に免疫特異的に結合する、本明細書で提供される抗体（例えば、本明細書で提供される、全長抗体、抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖、又は単鎖抗体）の、組換えによる発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を要求する。本明細書で提供される抗体分子、抗体の重鎖若しくは軽鎖、又はこれらの断片（重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインなどであるが、必ずしもこれらを含有しない）をコードするポリヌクレオチドを得たら、当技術分野で周知の技法を使用する組換えＤＮＡ技術により、抗体分子を作製するためのベクターを作製することができる。したがって、本明細書では、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることにより、タンパク質を調製するための方法について記載する。当業者に周知の方法を使用して、抗体コード配列と、適切な転写制御シグナル及び翻訳制御シグナルとを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける組換えＤＮＡ技法、合成技法、及びｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子組換えを含む。また、プロモーターに作動可能に連結した、本明細書で提供される抗体分子、抗体の重鎖若しくは軽鎖、抗体若しくはその断片の重鎖可変ドメイン若しくは軽鎖可変ドメイン、又は重鎖ＣＤＲ若しくは軽鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む、複製用ベクターも提供される。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列（例えば、国際公開第ＷＯ８６／０５８０７号及び同第ＷＯ８９／０１０３６号；及び米国特許第５，１２２，４６４号を参照されたい）を含むことが可能であり、抗体の可変ドメインを、重鎖の全体、軽鎖の全体、又は重鎖及び軽鎖の両方の全体を発現させるために、このようなベクターへとクローニングすることができる。
発現ベクターを、従来の技法により、宿主細胞へと転写し、次いで、トランスフェクトされた細胞を、従来の技法により、培養して、本明細書で提供される抗体を作製する。したがって、本明細書ではまた、異種プロモーターに作動可能に連結した、本明細書で提供される抗体若しくはその断片、又はその重鎖若しくは軽鎖、又はこれらの断片、又は本明細書で提供される単鎖抗体をコードするヌクレオチドを含有する宿主細胞も提供される。二本鎖抗体を発現させるための、ある特定の実施形態では、下記で詳述される通り、免疫グロブリン分子の全体を発現させるために、重鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターを、宿主細胞内で共発現させることができる。
様々な宿主発現ベクター系を利用して、本明細書で提供される抗体分子を発現させることができる（例えば、米国特許第５，８０７，７１５号を参照されたい）。このような宿主発現系は、目的のコード配列を産生し、その後、精製しうる媒体を表わすが、また、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換されるか、又はトランスフェクトされると、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて、本明細書で提供される抗体分子を発現しうる細胞も表す。これらは、抗体コード配列を含有する、組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、組換えプラスミドＤＮＡ発現ベクター、若しくは組換えコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換した細菌（例えば、大腸菌及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；抗体コード配列を含有する、組換え酵母発現ベクターにより形質転換した酵母（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ））などの微生物；ＶＬＰポリペプチドのコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させるか、若しくは抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）により形質転換した植物細胞系；又は、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、若しくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；牛痘ウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保有する、哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、ＮＳ０細胞、３Ｔ３細胞）を含むがこれらに限定されない。組換え抗体分子を発現させるために、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの細菌細胞を使用することもでき、とりわけ、全組換え抗体分子を発現させるために、真核細胞を使用することもできる。例えば、ヒトサイトメガロウイルスに由来する主要即初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと併用される、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞は、抗体のための有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、１９８６、Ｇｅｎｅ、４５：１０１；及びＣｏｃｋｅｔｔら、１９９０、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：２）。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＨＯ細胞内で作製する。具体的な実施形態では、ネクチン４抗原に免疫特異的に結合する、本明細書で提供される抗体をコードするヌクレオチド配列の発現を、構成的プロモーター、誘導可能なプロモーター、又は組織特異的プロモーターにより調節する。
細菌系では、発現させる抗体分子に意図される使用に応じて、多数の発現ベクターを選択することができて有利である。例えば、抗体分子による医薬組成物を作出するために、大量の、このような抗体を作製する場合、たやすく精製される、高レベルの融合タンパク質産物の発現を方向付けるベクターが所望されうる。このようなベクターは、融合タンパク質を作製するように、抗体コード配列を、ｌａｃ Ｚのコード領域と、インフレームで、個別に、ベクターへとライゲーションしうる大腸菌発現ベクターである、ｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、１９８３、ＥＭＢＯ１２：１７９１）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ及びＩｎｏｕｙｅ、１９８５、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１３：３１０１～３１０９；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ及びＳｃｈｕｓｔｅｒ、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４：５５０３～５５０９）などを含むがこれらに限定されない。外来ポリペプチドを、グルタチオン５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるのに、ｐＧＥＸベクターもまた使用することができる。一般に、このような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスである、グルタチオンアガロースビーズへの吸着及び結合により、溶解させた細胞から容易に精製するのに続き、遊離グルタチオンの存在下における溶離を行うことができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物が、ＧＳＴ部分から放出されうるように、トロンビン又は第Ｘａ因子プロテアーゼの切断部位を含むようにデザインする。
昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用する。ウイルスは、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞内で増殖する。抗体コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子領域）へと個別にクローニングすることができ、また、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
哺乳動物の宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、目的の抗体コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及び三連リーダー配列とライゲーションすることができる。次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏにおける組換えにより、このキメラ遺伝子を、アデノウイルスゲノム内に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１領域又はＥ３領域）内に挿入する結果として、感染させた宿主内で生存可能であり、抗体分子を発現することが可能な組換えウイルスがもたらされるであろう（例えば、Ｌｏｇａｎ及びＳｈｅｎｋ、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３５５～３５９を参照されたい）。挿入された抗体コード配列を効率的に翻訳するために、特異的な開始シグナルもまた要求されうる。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン、及び隣接配列を含む。さらに、インサート全体の翻訳を確保するために、開始コドンは、所望されるコード配列のリーディングフレームとインフェーズでなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナル及び開始コドンは、様々な由来であることが可能であり、天然及び合成のいずれでもありうる。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを組み入れることにより、増強することができる（Ｂｉｔｔｎｅｒら、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１～５４４を参照されたい）。
加えて、挿入した配列の発現をモジュレートするか、又は遺伝子産物を、所望される特異的な形で、修飾及びプロセシングする宿主細胞株も選び出すことができる。タンパク質産物に対するこのような修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能に重要でありうる。異なる宿主細胞は、翻訳後において、タンパク質及び遺伝子産物をプロセシング及び修飾するのに特徴的で特異的な機構を有する。発現させる外来タンパク質の適正な修飾及びプロセシングを確保するために、適切な細胞系又は宿主系を選び出すことができる。この目的で、一次転写物を適正にプロセシングし、遺伝子産物を適正にグリコシル化及びリン酸化するための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。このような哺乳動物の宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＹ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＴ４８３細胞、Ｈｓ５７８Ｔ細胞、ＨＴＢ２細胞、ＢＴ２Ｏ細胞及びＴ４７Ｄ細胞、ＮＳ０細胞（内因的には免疫グロブリン鎖を産生しない、マウス骨髄腫細胞系）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ細胞、並びにＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書で提供される、完全ヒト抗ネクチン４モノクローナル抗体は、ＣＨＯ細胞など、哺乳動物細胞内で作製する。
組換えタンパク質の、長期にわたる、高収率の作製のために、安定的発現を利用することができる。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞系は、操作細胞系でありうる。ウイルス性の複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）及び選択用マーカーにより制御されるＤＮＡにより形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、操作細胞を、濃縮培地中、１～２日間にわたり増殖させることができ、次いで、選択用培地へと切り替える。組換えプラスミド内の選択用マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が、プラスミドを、それらの染色体へと、安定的に組み込み、増殖し、増殖巣を形成することを可能とし、これを、細胞系へと、クローニングし、拡大することができる。この方法は、抗体分子を発現する細胞系を操作するのに使用しうるので有利である。このような操作細胞系は、特に、抗体分子と、直接的又は間接的に相互作用する組成物のスクリーニング及び査定において有用でありうる。
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７、Ｃｅｌｌ、１１：２２３）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ及びＳｚｙｂａｌｓｋｉ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、４８：２０２）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、１９８０、Ｃｅｌｌ、２２：８～１７）遺伝子を含むがこれらに限定されない、いくつかの選択系を、それぞれ、ｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、又はａｐｒｔ細胞において用いることができる。また、代謝拮抗剤耐性も、以下の遺伝子：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９８０、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：３５７；Ｏ’Ｈａｒｅら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：１５２７）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＢｅｒｇ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：２０７２）；アミノグリコシドであるＧ－４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｗｕ及びＷｕ、１９９１、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、３：８７～９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、３２：５７３～５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０：９２６～９３２；並びにＭｏｒｇａｎ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６２：１９１～２１７、１９９３年５月、ＴＩＢ ＴＥＣＨ１１（５）：ｌ５５～２１５）；及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、１９８４、Ｇｅｎｅ、３０：１４７）についての選択の基盤として使用することができる。組換えＤＮＡ技術についての、当技術分野で一般に公知の方法を、規定通りに適用して、所望の組換えクローンを選択することができ、このような方法については、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、「分子生物学における最新のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、「遺伝子の導入及び発現：実験室マニュアル（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）；並びにＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、「ヒト遺伝学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）、１２及び１３章；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎら、１９８１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５０：１において記載されている。
抗体分子の発現レベルは、ベクターの増幅により増大させることができる（総説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ及びＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、「ＤＮＡクローニングにおいて、哺乳動物細胞内でクローニングされる遺伝子を発現させるための、遺伝子の増幅に基づく、ベクターの使用（Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ）」、３巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照されたい）。抗体を発現させるベクター系内のマーカーが、増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの上昇は、マーカー遺伝子のコピー数を増大させるであろう。増幅された領域は、抗体遺伝子と関連するので、抗体の産生もまた、増大するであろう（Ｃｒｏｕｓｅら、１９８３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３：２５７）。
宿主細胞に、第１のベクターが、重鎖由来のポリペプチドをコードし、第２のベクターが、軽鎖由来のポリペプチドをコードする、本明細書で提供される、２つの発現ベクターを共トランスフェクトすることができる。２つのベクターは、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの、同等な発現を可能とする、同一な選択用マーカーを含有しうる。代替的に、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、これらを発現させることが可能な、単一のベクターを使用することもできる。このような状況では、軽鎖を、重鎖の前に配置して、毒性である遊離重鎖の過剰を回避すべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ、３２２：５２；及びＫｏｈｌｅｒ、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：２１９７～２１９９）。重鎖及び軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含みうる。
本明細書で提供される抗体分子を、組換え発現により作製したら、これを、免疫グロブリン分子を精製するために、当技術分野で公知である、任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特に、プロテインＡクロマトグラフィーの後における、特異的抗原についてのアフィニティークロマトグラフィー、及びサイズ除外クロマトグラフィー）、遠心分離、示差的可溶性、又はタンパク質を精製するための、他の任意の標準的な技法により精製することができる。さらに、本明細書で提供される抗体を、本明細書で記載されるか、又は本明細書以外の当技術分野で公知の、異種ポリペプチド配列と融合させて、精製を容易とすることができる。
２９．診断的アッセイ及び検出方法
一態様では、本開示の抗ネクチン４抗体及びそれらの断片は、生物学的試料中の、ネクチン４の存在を検出するために有用である。このような抗ネクチン４抗体は、ヒトネクチン４に結合するが、ネクチン４のシグナル伝達活性を誘導しない抗ネクチン４抗体を含みうる。本明細書で使用される「～を検出すること」又は「検出」という用語は、定量的検出又は定性的検出を包含し、アッセイのリードアウト又は結果を使用して、試料中のネクチン４の存在／非存在、試料中のネクチン４の相対発現レベル（例えば、１若しくは複数の基準発現と比べた相対発現レベル、他の試料と比べた相対発現レベル、又は１若しくは複数の発現スケールと比べた相対発現レベル）、又は試料中のネクチン４の濃度に関する決定を下すことを指す。アッセイから検出されたリードアウトは、数値データ、例えば、ｑＰＣＲの結果、イムノアッセイの結果、又は測定されたタンパク質濃度の場合もあり；検出されたリードアウトは、非数値データ、例えば、顕微鏡画像における、抗ネクチン４抗体による、細胞又は組織の染色、又はイメージングフローサイトメトリーにおける、ネクチン４の染色の場合もあり；検出されたリードアウトは、当業者に周知の通り、ネクチン４の発現についてのプロキシとして使用されうる、任意の実験のデータ、例えば、蛍光強度、発光強度、比色の読取り、及び吸光／発光分光法の場合もある。本明細書では、アッセイで検出されたリードアウトを、アッセイのシグナルと称する。
本明細書で提供される、生物学的試料とは、生物学的由来を有する、試料又は材料である。生物学的試料は、体液試料、細胞試料、又は組織試料を含む。一部の実施形態では、細胞は、培養細胞系の場合もあり、操作細胞の場合もあり、対象、例えば、ヒト対象から得られた細胞の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｅｘ ｖｉｖｏにおける培養物の場合もあり、対象から得られた細胞の場合もある。他の実施形態では、組織試料は、ヒト対象を含む対象から得られた体液又は組織を含みうる。一部の実施形態では、組織試料は、疾患を有することが疑われる対象の領域に由来する試料を含む。したがって、組織試料は、哺乳動物、特に、ヒトなどの生物から単離された、組織、体液、組織画分、及び／又は細胞でありうるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、組織試料を、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片へと調製する。細胞、体液、及び／又は組織は、当業者に周知の方法、例えば、生検（液体生検を含む）、外科手順、細胞スミア、及び瀉血により、対象、例えば、ヒト対象から得ることができる。
一態様では、本開示は、生物学的試料中の、ネクチン４の存在を検出する方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、抗ネクチン４抗体の、ネクチン４への結合を許容する条件下で、生物学的試料を、抗ネクチン４抗体と接触させるステップと、抗ネクチン４抗体と、ネクチン４との結合を検出するステップとを含む。
当業者に周知の通り、生物学的試料中の抗原に結合した抗体の量は、生物学的試料中の抗原の量と相関する。したがって、本明細書で提供される抗ネクチン４抗体の、生物学的試料中のネクチン４への結合の量を使用して、生物学的試料中の、ネクチン４の量又は発現レベルを測定することができる。一部の実施形態では、生物学的試料中のネクチン４の量を、抗ネクチン４抗体の線形検出範囲内で検出する。「線形検出範囲」とは、抗原の量又は濃度の範囲であって、その中では、結合した抗体が、生物学的試料中の抗原の量又は濃度と、線形的に相関する、上記範囲を指す。このような線形範囲は、抗体と抗原とのアフィニティー、抗体－抗原間結合のために使用される抗体の濃度、及び抗体－抗原間結合のために使用される条件などの因子に依存する。
抗体－抗原間結合のために使用される抗体の濃度は、滴定実験において評価することができる。このような滴定実験についての一実施形態では、抗体の濃度を、２倍、３倍、５倍、又は１０倍の倍率で系列希釈し、系列希釈された抗体を、各々、既知量の、対応する抗原を伴う対照試料に結合させた。一実施形態では、所望の抗体濃度は、抗体の結合量が、最も広い線形検出範囲を示差化する濃度である。
生物学的試料中のネクチン４の発現は、所与の時点における、生物学的試料中のネクチン４の量を指す。測定されるネクチン４の発現は、ある期間にわたる、生物学的試料中のネクチン４の蓄積を反映し、全長ネクチン４、ネクチン４の断片、及び天然で修飾された、例えば、グリコシル化されたネクチン４など、分解産物又は修飾産物を含みうる。タンパク質は、ｍＲＮＡから翻訳されるので、生物学的試料中のｍＲＮＡのレベルは、生物学的試料中のネクチン４の発現についてのプロキシとして使用することができる。
本明細書では、がんを有することが疑われる対象に由来する組織試料中のネクチン４の発現を評価するための方法であって、（ａ）前記組織試料を、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと；（ｂ）前記抗体又はその抗原結合性断片の、前記組織試料への結合を検出するステップと；（ｃ）組織試料中の、ネクチン４の発現を決定するステップであって、組織試料中の、ネクチン４の発現レベルを、ネクチン４の基準発現レベルと比較する上記ステップとを含む上記方法が提供される。
本明細書ではまた、がんを有することが疑われる対象に由来する組織試料中のネクチン４の発現を評価するための方法であって、（ａ）本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片により、組織試料についての、ＩＨＣアッセイを実施するステップと；（ｂ）組織試料中の、ネクチン４の発現を決定するステップとを含み、組織試料中の、ネクチン４の発現レベルを、ネクチン４の基準発現レベルと比較する方法も提供される。
本明細書ではまた、がん患者の、抗がん治療剤に対する応答性を評価するための方法であって、前記患者に由来する組織試料中の、ネクチン４の発現に基づき、（ａ）前記組織試料を、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと；（ｂ）前記抗体又はその抗原結合性断片の、前記組織試料への結合を検出するステップと；（ｃ）組織試料中の、ネクチン４の発現を決定するステップであって、組織試料中の、ネクチン４の発現レベルを、ネクチン４の基準発現レベルと比較する上記ステップとを含み、ネクチン４の発現レベルの、基準と比較した上昇が、前記抗がん治療に対する応答性を示す方法も提供される。
本明細書ではまた、がん患者の、抗がん治療剤に対する応答性を評価するための方法であって、前記患者に由来する組織試料中の、ネクチン４の発現に基づき、（ａ）本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片により、組織試料についての、ＩＨＣアッセイを実施するステップと；（ｂ）組織試料中の、ネクチン４の発現を決定するステップであって、組織試料中の、ネクチン４の発現レベルを、ネクチン４の基準発現レベルと比較する上記ステップとを含み、組織試料中のネクチン４の発現レベルの、基準と比較した上昇が、前記抗がん治療に対する応答性を示す方法も提供される。
本明細書では、対象におけるがんを処置する方法であって、（ａ）本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片により、対象に由来する組織試料中の、ネクチン４の発現レベルを決定するステップであって、組織試料中の、ネクチン４の発現レベルが、ネクチン４の基準発現レベルより高い上記ステップと；（ｂ）抗がん治療剤を、対象へと投与するステップを含む上記方法が提供される。
本明細書では、対象におけるがんを処置する方法であって、（ａ）対象に由来する組織試料を、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと；（ｂ）本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片により、対象に由来する組織試料中の、ネクチン４の発現レベルを決定するステップであって、組織試料中の、ネクチン４の発現レベルが、ネクチン４の基準発現レベルより高い上記ステップと；（ｃ）抗がん治療剤を、対象へと投与するステップを含む上記方法が提供される。
本明細書では、対象におけるがんを処置する方法であって、（ａ）組織試料を、対象から得るステップと；（ｂ）対象に由来する組織試料を、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと；（ｃ）本明細書で提供される抗体又はその抗原結合性断片により、対象に由来する組織試料中の、ネクチン４の発現レベルを決定するステップであって、組織試料中の、ネクチン４の発現レベルが、ネクチン４の基準発現レベルより高い上記ステップと；（ｄ）抗がん治療剤を、対象へと投与するステップを含む上記方法が提供される。
本明細書で提供される方法のうちのいずれかにおける対象は、ヒト対象であることが可能であり、対象は、それについてネクチン４の発現の決定を実施しうる任意のがん、及び／又はネクチン４の発現がそれについての診断的価値、予後診断的価値、若しくは予測的価値をもたらしうる任意のがんを有しうる。例示的ながんは、急性リンパ芽球性白血病；急性リンパ芽球性リンパ腫；急性リンパ球性白血病；急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病；急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病（成人型／小児型）；副腎皮質癌；ＡＩＤＳ関連がん；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；肛門がん；虫垂がん；星状細胞腫；ＡＴ／ＲＴ（ａｔｙｐｉｃａｌ ｔｅｒａｔｏｉｄ／ｒｈａｂｄｏｉ）腫瘍；基底細胞癌；胆管がん、肝外（胆管癌）；膀胱がん；骨肉腫／悪性線維性組織球腫；脳がん（成人型／小児型）；小脳星状細胞腫（成人型／小児型）である脳腫瘍；大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫である、脳腫瘍；上衣腫である、脳腫瘍；髄芽腫である、脳腫瘍；原始神経外胚葉腫瘍である、脳腫瘍；視経路視床下部神経膠腫である、脳腫瘍；脳幹神経膠腫；乳がん；気管支腺腫／カルチノイド；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；小児がん；消化管カルチノイド腫瘍；カルチノイド腫瘍；原発不明成人癌；原発不明癌；中枢神経系胚芽腫；原発性中枢神経系リンパ腫；子宮頸がん；小児副腎皮質癌；小児がん；小児大脳星状細胞腫；小児脊索種；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病；慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病；慢性骨髄増殖性障害；結腸がん；結腸直腸がん；頭蓋咽頭腫；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；線維形成性小細胞腫瘍；肺気腫；子宮内膜がん；上衣芽細胞腫；上衣腫；食道がん；ユーイング腫瘍ファミリー内のユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管がん；胆嚢がん；胃（ｇａｓｔｒｉｃ（ｓｔｏｍａｃｈ））がん；胃カルチノイド；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質腫瘍；胚細胞腫瘍；頭蓋外絨毛性腫瘍、性腺外絨毛性腫瘍、又は妊娠性卵巣絨毛性腫瘍；原発不明妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；脳幹神経膠腫；小児視経路視床下部神経膠腫；毛様細胞白血病；頭頚部がん；心臓がん；肝細胞（肝）がん；ホジキンリンパ腫；下咽頭がん；視経路視床下部神経膠腫；眼内黒色腫；膵島細胞癌（膵臓内分泌癌）；カポジ肉腫；腎臓がん（腎細胞がん）；ランゲルハンス細胞組織球増殖症；喉頭がん；口唇口腔がん；脂肪肉腫；（原発性）肝がん；肺がん；原発性中枢神経系リンパ腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；男性乳がん；骨悪性線維性組織球腫／骨肉腫；髄芽腫；髄様上皮腫；黒色腫；眼内（眼）黒色腫；メルケル細胞がん；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；成人悪性中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部がん；口腔がん；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍；菌状息肉腫、骨髄異形成症候群；骨髄異形成性疾患／骨髄増殖性疾患；慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病；成人急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病；小児急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病；多発性骨髄腫（骨髄がん）；慢性骨髄増殖性障害；鼻腔副鼻腔がん；鼻咽頭がん；神経芽腫、非小細胞肺がん；非ホジキンリンパ腫；希突起神経膠腫；口腔がん（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ、ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ｃａｎｃｅｒ）；口腔咽頭がん；骨肉腫及び骨悪性線維性組織球腫；卵巣がん；卵巣上皮がん（表面上皮－間質腫瘍）；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度潜在性腫瘍；膵臓がん；膵島細胞性膵臓がん；乳頭腫症；副鼻腔鼻腔がん；副甲状腺癌；陰茎がん；咽頭がん；褐色細胞腫；松果体星状細胞腫；松果体胚細胞腫；中分化型松果体実質細胞腫瘍；松果体芽細胞腫及び原始神経外胚葉腫瘍；下垂体腫瘍；形質細胞腫／多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系リンパ腫；前立腺癌；直腸がん；腎細胞癌（腎がん）；腎盂尿管移行上皮がん；第１５染色体上のＮＵＴ遺伝子に関与する気管癌；網膜芽細胞腫；小児横紋筋肉腫；唾液腺がん；ユーイング腫瘍ファミリーの肉腫；セザリー症候群；皮膚がん（黒色腫）；皮膚がん（非黒色腫）；小細胞肺がん；小腸がん、軟部組織肉腫；軟部組織肉腫；脊髄腫瘍；扁平上皮がん；原発不明転移性扁平上皮性頸部がん；胃（ｇａｓｔｒｉｃ（ｓｔｏｍａｃｈ））がん；原始神経外胚葉腫瘍；皮膚Ｔ細胞リンパ腫（菌状息肉腫及びセザリー症候群）；精巣がん；咽頭がん；胸腺腫；胸腺腫及び胸腺癌；甲状腺がん；小児甲状腺がん；腎盂尿管移行上皮がん；尿道がん；子宮内膜がん；尿路上皮がん、膀胱がん、尿管がん、尿道がん、及び尿膜管がん、子宮肉腫；膣がん；外陰がん；ウィルムス腫瘍；及びネクチン４を発現する上皮由来の他のがんを含む。
本明細書で提供される方法についての一部の実施形態では、対象、例えば、ヒト対象は、子宮内膜がん、尿路上皮がん、膀胱がん、尿管がん、尿道がん、肺がん、卵巣がん、乳がん、食道がん、膵臓がん、頭頸部がん、前立腺がん、陰茎がん、肛門がん、外陰がん、尿膜管がん、及びネクチン４を発現する上皮由来の他のがんからなる群から選択されるがんを有することが疑われる。
本明細書で使用される「応答性」という用語は、細胞又は個体又は患者又は対象が、抗がん治療剤による処置に対して、応答するか、又は反応を有する可能性を指す。応答性は、例えば、抗がん治療剤に対する、広範にわたる反応の可能性、がん性細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ又はｇｒｏｗｔｈ）の減少、がん性細胞の細胞死の増大、がん性細胞の数若しくは腫瘍サイズの低減、腫瘍サイズの増大速度の低減、がん病期の進行の遅滞、がん病期又は腫瘍サイズの退縮、がんマーカーの発現の低減、がん転移の低減、並びに／又は患者の体重の回復、６カ月後、１年後、２年後、３年後、又は５年後における患者の生存率、及び／若しくは患者の生存時間など、患者転帰の改善を含みうるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、応答性を、非感受性（すなわち、応答する可能性が小さい）、感受性（応答する可能性が大きい）、及び／又は不定として等級付けすることができる。ある特定の実施形態では、細胞、組織、患者、又は対象が、その腫瘍内又はがん性細胞内の、ネクチン４の著明な発現を示す場合、細胞又は組織又は個体又は患者又は対象は、抗がん治療剤に応答する可能性が高い。ある特定の実施形態では、応答性は、腫瘍細胞／組織内又はがん性細胞／組織内のネクチン４のレベルの上昇と共に上昇する。ある特定の実施形態では、応答性は、腫瘍細胞／組織又はがん性細胞／組織の、ネクチン４の発現のレベルと相関する。ある特定の実施形態では、応答性は、腫瘍細胞／組織又はがん性細胞／組織の、ネクチン４の発現のレベルと正比例する。他の実施形態では、細胞、組織、患者、又は対象の、抗がん治療剤に対する応答性は、ネクチン４の発現について陰性である細胞の、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、７５０％、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、又はこれを超える応答性でありうる。
本明細書で使用される、「応答性を示す」とは、応答性が、１つの細胞、組織、ヒト個体、又は対象において、別の細胞、組織、ヒト個体、又は対象よりも大きいという予測を指す。このような予測は、ある特定の基準に基づきなされる。一部の実施形態では、応答性の予測は、細胞、組織、腫瘍、ヒト個体、又は対象における、ネクチン４の発現レベルに基づきなされる。上記で記載した通り、ある特定の実施形態では、細胞、組織、患者、又は対象が、その腫瘍内又はがん性細胞内の、ネクチン４の著明な発現を示す場合、細胞又は組織又は個体又は患者又は対象は、抗がん治療剤に応答する可能性が高いと予測される。ある特定の実施形態では、応答性は、腫瘍細胞／組織内又はがん性細胞／組織内のネクチン４のレベルの上昇と共に上昇すると予測される。ある特定の実施形態では、応答性は、腫瘍細胞／組織又はがん性細胞／組織の、ネクチン４の発現のレベルと相関すると予測される。ある特定の実施形態では、応答性は、腫瘍細胞／組織又はがん性細胞／組織の、ネクチン４の発現のレベルと正比例すると予測される。他の実施形態では、細胞、組織、患者、又は対象の、抗がん治療剤に対する応答性は、ネクチン４の発現について陰性である細胞の、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、７５０％、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、又はこれを超える応答性であると予測される。
抗がん治療剤は、ネクチン４の発現が、診断値、予後診断値、又は予測値をもたらしうる、任意の抗がん治療剤、又は任意の抗がん治療でありうる。ある特定の実施形態では、治療剤は、ネクチン４が役割を果たす生物学的過程、例えば、シグナル伝達経路、代謝経路、又はタンパク質合成／分解経路をターゲティングする治療剤である。ある特定の実施形態では、治療剤は、ネクチン４活性、ネクチン４シグナル伝達、又はネクチン４媒介性疾患をターゲティングする治療剤である。具体的な実施形態では、治療剤は、抗ネクチン４抗体又は抗ネクチン４抗体薬物コンジュゲートである。
組織試料中の、ネクチン４の発現を決定するために、組織試料中の、ネクチン４の発現レベルを、ネクチン４の基準発現レベルと比較するか、又は相関させる。本明細書で使用される「基準発現レベル」とは、被験試料中のネクチン４の発現レベルと比較した場合に、被験試料中のネクチン４の発現についての相対的情報ともたらす、基準試料中の発現レベルを指す。基準発現レベルは、既知の発現レベル、例えば、ネクチン４の量、濃度、及び／又はモル数量が既知である場合の、基準試料中の発現でありうる。例えば、基準発現レベルは、細胞が、既知量のネクチン４を発現するようにトランスフェクトされているか、又は他の形で操作されている場合の、細胞系内のネクチン４の発現でありうる。一部の実施形態では、基準発現レベルは、ネクチン４の発現が、ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、定量的免疫沈降、及び／又は定量的ウェスタンブロット法など、本明細書で提供されるか、又は当業者に公知の方法により定量化された場合の、細胞内のネクチン４の発現でありうる。他の実施形態では、基準発現レベルは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、及びこれを超える基準など、１つを超える基準を伴う。一実施形態では、基準レベルは、４つの基準：ネクチン４の発現について陰性の基準、ネクチン４の弱い発現を伴う基準、ネクチン４の中程度の発現を伴う基準、及びネクチン４の高発現／強い発現を伴う基準を有する。
代替的に、基準発現レベルは、ネクチン４の正確な濃度又は数量は、未知であるが、基準試料の状態、活性、及び／又は機能は、既知であるレベルでありうる。一部の実施形態では、基準発現レベルは、がんを有することが疑われる、同じ患者に由来する非がん性細胞の基準発現レベルでありうる。このような実施形態では、被験試料中のネクチン４の発現を、基準試料中のネクチン４の発現と比較することにより、非がん性細胞のネクチン４の発現と比べた（例えば、これより高度であるか、低度であるか、又はこれと実質的に同じ）、被験試料中のネクチン４の発現を決定することができる。他の実施形態では、基準発現レベルは、がん性細胞の基準発現レベルであることが可能であり、この場合、被験試料中のネクチン４の発現を、基準試料中のネクチン４の発現と比較することにより、がん性細胞のネクチン４の発現と比べた（例えば、これより高度であるか、低度であるか、又はこれと実質的に同じ）、被験試料中のネクチン４の発現を決定することができる。他の実施形態では、基準発現レベルは、第２の対象に由来する細胞の基準発現レベルであることが可能であり、この場合、被験試料中のネクチン４の発現を、基準試料中のネクチン４の発現と比較することにより、第２の対象に由来する細胞のネクチン４の発現と比べた（例えば、これより高度であるか、低度であるか、又はこれと実質的に同じ）、被験試料中のネクチン４の発現を決定することができる。第２の対象は、がんを有さない正常ヒト対象の場合もあり、患者が有することを疑われるがんと同じ種類のがんを有するヒト対象の場合もあり、患者が有することを疑われるがんと異なる種類のがんを有するヒト対象の場合もある。
本明細書で記載される基準試料及び基準細胞は、細胞系、がんを有することが疑われる患者から得られた細胞の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおける培養物、がんを有することが疑われる患者から得られた細胞、第２の対象から得られた細胞の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおける培養物、第２の対象から得られた細胞でありうる。
したがって、本明細書で提供される方法についての一部の実施形態では、ネクチン４の基準発現レベルは、前記対象の、がん性細胞、非がん性細胞、又は第２の対象に由来する非がん性細胞における、ネクチン４の発現レベルでありうる。
上記で記載した通り、一部の実施形態では、試料中のネクチン４の発現は、抗ネクチン４抗体の、試料への結合を、抗ネクチン４抗体の、陰性基準物質及び陽性基準物質への結合であって、基準物質中の、ネクチン４発現レベルが既知である、上記結合と相関させるか、又は比較することにより決定することができる。基準ネクチン４発現は、ネクチン４陽性対照又はネクチン４陰性対照でありうる。本明細書で使用される、「ネクチン４陽性対照」又は「陽性対照」とは、著明量のネクチン４を発現することが既知である、細胞、組織、腫瘍、ヒト、及び／又は対象を指す。「ネクチン４陰性対照」又は「陰性対照」とは、ネクチン４を発現しないか、又はネクチン４の発現が低レベルであり、結果として細胞内又は組織内のネクチン４が生物学的に著明ではないことが既知である細胞及び／又は組織を指す。（１）当業者が、ネクチン４の発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子のタンパク質産物に照らして、低度であると考える場合；（２）低量のネクチン４の存在又は非存在が、細胞又は組織に対して、生物学的差違をもたらさない場合；及び（３）これらの著明ではない量のネクチン４を、細胞又は組織から、除去又は欠損させても、細胞又は組織が、このような除去又は欠損の前と実質的に同じ形で機能し続ける場合、ネクチン４レベルは、生物学的に著明ではない。既知のネクチン４発現は、ｑＰＣＲアッセイにより、独立に決定することができる。既知のネクチン４発現はまた、ネクチン４特異的であることが決定されている抗ネクチン４抗体（例えば、上記で記載した特異性スクリーニング方法において同定された、ネクチン４特異的抗体）を用いる、下記に記載される、任意のイムノアッセイを使用して、独立に決定することもできる。適切なイムノアッセイは、例を目的として、いかなる限定も伴わずに述べると、ＩＨＣアッセイ、免疫ブロットアッセイ、ＦＡＣＳアッセイ、又はＥＬＩＳＡを含む。一部の実施形態では、陰性対照中のネクチン４ ｍＲＮＡレベルは、アッセイのバックグラウンドノイズに起因して、又は生物学的に著明ではない、低レベルの残存ネクチン４に起因して、ゼロではありえない。ネクチン４陰性対照は、例えば、ｑＰＣＲアッセイにおけるネクチン４ ｍＲＮＡレベルが、非特異的プライマーのセットにより検出されるｍＲＮＡのレベルと、実質的に同様である場合、又はネクチン４ ｍＲＮＡレベルが、ネクチン４陽性対照におけるにおけるネクチン４ ｍＲＮＡレベルに照らして、生物学的に著明ではない場合に、ネクチン４について、適正に陰性であると考えることができる。同様に、別のネクチン４特異的抗体を、陰性対照中使用するイムノアッセイにより検出されるネクチン４も、アッセイのバックグラウンドノイズに起因して、又は生物学的に著明ではない、低レベルの残存ネクチン４に起因して、ゼロではありえない。バックグラウンドノイズは、抗ネクチン４抗体以外のアッセイ試薬と試料との、非特異的相互作用により引き起こされうる。ネクチン４陰性対照は、例えば、抗ネクチン４抗体により検出される、陰性対照中のネクチン４レベルが、同じアッセイにおける、アイソタイプ対照抗体による検出レベルと、実質的に同様である場合に、ネクチン４について、適正に陰性であると考えることができる。一部のアッセイでは、バックグラウンドノイズは、ネクチン４の発現による、検出シグナルの実質的な百分率に相当しうる。
加えて、陽性及び／又は陰性の組織、細胞（例えば、細胞系を含む）、並びに病理学的試料を含む、陽性対照及び陰性対照は、文献において、当業者により、同定され、公表されている。このような文献は、Ｐｕｂｍｅｄなどのデータベースを検索し（例えば、ネクチン４、発現、陽性、陰性、及び／又は分布などの検索用語を使用して）、検索ヒットを解析することにより、たやすく同定することができる。
したがって、ネクチン４の発現を伴わない陰性対照細胞に結合した抗体又はその抗原結合性断片の相対量は、ネクチン４を発現する試料細胞に結合した抗体又はその抗原結合性断片の量の、約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０３％、０．０１％、０．００１％、又はこれ未満でありうる。
したがって、本明細書で提供される方法についての一部の実施形態では、ネクチン４の基準発現レベルは、陰性対照におけるネクチン４の発現レベルであり、この場合、陰性対照におけるネクチン４の発現は、独立に、ｑＰＣＲアッセイ、第２の抗体を用いるＩＨＣアッセイ、第２の抗体を用いる免疫ブロットアッセイ、第２の抗体を用いるＦＡＣＳアッセイ、又は第２の抗体を用いるＥＬＩＳＡにより決定される。
本明細書で提供される方法についての他の実施形態では、ネクチン４の基準発現レベルは、ネクチン４を発現する陽性対照細胞におけるネクチン４の発現レベルであり、この場合、陽性対照におけるネクチン４の発現は、独立に、ｑＰＣＲアッセイ、第２の抗体を用いるＩＨＣアッセイ、第２の抗体を用いる免疫ブロットアッセイ、第２の抗体を用いるＦＡＣＳアッセイ、又は第２の抗体を用いるＥＬＩＳＡにより決定される。
試料中の、ネクチン４の発現レベルは、陽性対照における発現レベルと異なりうる。組織試料に結合した抗体又はその抗原結合性断片の相対量は、ネクチン４を発現する陽性対照細胞に結合した抗体又はその抗原結合性断片の量の、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、７５０％、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、５００倍、又はこれを超える量でありうる。
当技術分野では、多くの異なるＰＣＲプロトコール又はｑＰＣＲプロトコールが公知であり、本明細書の下記でも例示し、試料中又は対照中のネクチン４タンパク質の発現レベルについてのプロキシとして使用されうる、試料中又は対照中のネクチン４ ｍＲＮＡレベルを決定するために、直接適用するか又は適合させることができる。一部の実施形態では、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）（また、リアルタイムＰＣＲとも称する）は、定量的測定だけでなく、時間の短縮及び夾雑の低減もたらすので、これを適用するか又は適合させる。本明細書で使用される「定量的ＰＣＲ」（又は「ｑＰＣＲ」）とは、それが反応産物を繰り返してサンプリングする必要なしに行われるので、ＰＣＲ増幅の進行を、直接モニタリングすることを指す。定量的ＰＣＲでは、反応産物が発生し、追跡されるのは、シグナルがバックグラウンドレベルを上回って上昇した後であるが、反応がプラトー状態に到達する前であるので、シグナル発生機構（例えば、蛍光）を介して反応産物をモニタリングすることができる。検出可能レベル又は「閾値」レベルの蛍光を達成するのに要求されるサイクル数は、ＰＣＲ工程の開始時における増幅可能な標的の濃度と共に直接変動し、シグナル強度の尺度が、試料中の標的核酸の量の尺度をリアルタイムでもたらすことを可能としている。ｑＰＣＲを適用して、ｍＲＮＡの発現レベルを決定する場合、ｍＲＮＡを、ＤＮＡへと逆転写する、追加のステップを、ｑＰＣＲ解析の前に実施する。ＰＣＲ方法の例は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、文献（Ｗｏｎｇら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３９：７５～８５（２００５）；Ｄ’ｈａｅｎｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、５０：２６２～２７０（２０１０））において見出すことができる。ＰＣＲアッセイの例は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９２７，０２４号において見出すことができる。ＲＴ－ＰＣＲ方法の例は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１２２，７９９号において見出すことができる。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ方法については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１８６，５０７号において記載されている。
具体的な一実施形態では、ｑＰＣＲを実施して、以下の通りに、ネクチン４ ｍＲＮＡレベルを決定又は測定することができる。略述すると、ネクチン４及び１又は複数のハウスキーピング遺伝子についての、多連ｑＰＣＲ反応の平均値Ｃｔ値（サイクル閾値）（又は、本明細書では、互換的に、Ｃｑ（定量化サイクル）とも称する）を決定する。次いで、以下の例示的な式：ネクチン４ΔＣｔ＝（ネクチン４の平均値Ｃｔ－ハウスキーピング遺伝子Ａの平均値Ｃｔ）を使用して、ネクチン４についての平均値Ｃｔ値を、ハウスキーピング遺伝子のＣｔ値に照らして正規化する。次いで、相対ネクチン４ΔＣｔを使用して、例えば、ｍＲＮＡ発現＝２－ΔＣｔの式を使用することにより、ネクチン４ ｍＲＮＡの相対レベルを決定することができる。Ｃｔ値及びＣｑ値の概要については、ＭＩＱＥガイドライン（Ｂｕｓｔｉｎら、「ＭＩＱＥガイドライン：定量的リアルタイムＰＣＲ実験の公表のための最小限の情報（ＭＩＱＥ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ：Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５５：４（２００９））を参照されたい。
また、試料中のｍＲＮＡ発現の定量化のための、他の一般に使用される、当技術分野で公知の方法であって、ノーザンブロット法及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｐａｒｋｅｒ及びＢａｒｎｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０６：２４７～２８３（１９９９））；ＲＮアーゼ保護アッセイ（Ｈｏｄ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３：８５２～８５４（１９９２））；マイクロアレイ（Ｈｏｈｅｉｓｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７：２００～２１０（２００６）；Ｊａｌｕｒｉａら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ、６：４（２００７））；及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８：２６３～２６４（１９９２））を含む上記方法も使用することができる。代替的に、ｍＲＮＡ発現のレベルは、シーケンシング技法により決定することができる。シーケンシングベースの遺伝子発現解析のための代表的な方法は、ＳＡＧＥ（ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、及びＭＰＳＳ（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）による遺伝子発現解析を含む。
前出で記載した通り、組織試料は、哺乳動物、特に、ヒトなどの生物から単離された、組織、体液、組織画分、及び／又は細胞でありうるがこれらに限定されない。したがって、組織試料は、ヒト対象を含む対象の、様々な臓器から得ることができる。一部の実施形態では、組織試料を、がんなどの疾患、機能不全、又は障害を有することが疑われる臓器から得る。他の実施形態では、組織試料を、被験患者又は第２のヒト対象に由来する正常臓器から得る。
本明細書で提供される方法についてのある特定の実施形態では、組織は、膀胱、尿管、乳腺、肺、結腸、直腸、卵巣、卵管、食道、頸部、子宮内膜、皮膚、喉頭、骨髄、唾液腺、腎臓、前立腺、脳、脊髄、胎盤、副腎、膵臓、副甲状腺、下垂体、精巣、甲状腺、脾臓、扁桃腺、胸腺、心臓、胃、小腸、肝臓、骨格筋、末梢神経、中皮、又は眼に由来する組織を含む。
試料に結合した抗ネクチン４抗体は、当技術分野で公知の、様々なイムノアッセイであって、ＩＨＣ法、免疫ブロットアッセイ、ＦＡＣＳアッセイ、及びＥＬＩＳＡを含む上記イムノアッセイにより検出することができる。
ネクチン４は、様々なＩＨＣ手法において、抗ネクチン４抗体により検出することができる。組織切片のＩＨＣ染色は、試料中のタンパク質の存在を、評価又は検出する、信頼できる方法であることが示されている。ＩＨＣ技法は、プローブに対する抗体を利用し、一般に、発色方法又は蛍光方法により、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて、細胞の抗原を視覚化する。ネクチン４を特異的にターゲティングする、ポリクローナル抗血清及びモノクローナル抗体などの一次抗体又は抗血清を使用して、ＩＨＣアッセイにおける発現を検出することができる。一部の実施形態では、組織試料を、抗体－標的間結合が生じるのに十分な時間にわたり、特異的標的に対する一次抗体と接触させることができ、抗体は、抗体自体における直接的標識、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼなどの酵素により検出することができる。代替的に、標識化されていない一次抗体を、一次抗体に特異的な抗血清、ポリクローナル抗血清、又はモノクローナル抗体を含む、標識化された二次抗体と共に使用する。当技術分野では、ＩＨＣのプロトコール及びキットが周知であり、市販されている。スライド調製及びＩＨＣプロセシングのための自動式システムが、市販されている。Ｌｅｉｃａ ＢＯＮＤ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ及びＬｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎシステムは、このような自動式システムの例である。
一部の実施形態では、ＩＨＣアッセイは、間接的アッセイにおいて、標識化された二次抗体と併用した、標識化されていない一次抗体により実施する。間接的アッセイは、組織試料中のネクチン４など、標的タンパク質の検出のために、２つの抗体を利用する。まず、非コンジュゲート一次抗体を、組織（第１層）へと適用し、組織抗原と反応させる。次に、一次抗体の抗体アイソタイプを特異的に認識する、酵素標識化二次抗体を適用する（第２層）。二次抗体を、一次抗体と反応させるのに続き、色原体である基質を適用する。第２層抗体を、ペルオキシダーゼなどの酵素で標識化し、これを、色原体である３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と反応させて、反応部位において、褐色の沈殿物をもたらす。この方法は、一次抗体上の、シグナル増幅システムを介する、潜在的なシグナル増幅に起因して、高感度且つ多目的な方法である。
ある特定の実施形態では、検出の感度を増大させるために、シグナル増幅システムを使用することができる。本明細書で使用される「シグナル増幅システム」とは、結合した一次抗体又は二次抗体の検出に由来するシグナルを増大させるのに使用されうる、試薬及び方法のシステムを意味する。シグナル増幅システムは、標的タンパク質検出の感度を増大させ、検出されるシグナルを増大させ、検出下限を低下させる。酵素標識化システム及びマクロ標識化システムを含む、いくつかの種類のシグナル増幅システムが存在する。これらのシステム／手法は、互いに排他的ではなく、相加効果のために、組み合わせて使用することができる。
マクロ標識システム又はマクロ標識化システムとは、共通の足場へと接合させるか、又はこの中に組み込んだ、数十（例えば、フィコビリタンパク質）～数百万（例えば、蛍光マイクロスフェア）単位の、標識番号付けの総体である。足場を、抗体などの標的特異的アフィニティー試薬とカップリングさせることができ、組み込まれた標識は、これにより、結合すると、標的と、総体的に会合する。マクロ標識内の標識は、フルオロフォア、ハプテン、酵素、及び／又は放射性同位元素など、本明細書で記載される標識のうちのいずれかでありうる。シグナル増幅システムについての一実施形態では、標識化された鎖ポリマーをコンジュゲートさせた二次抗体を使用した。ポリマー技術は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、５０、又はこれを超える分子の二次抗体を接合させることができる、デキストランのＨＲＰ酵素標識化不活性「スパイン」分子を利用し、システムを、なおより高感度とした。
酵素標識化システムに基づくシグナル増幅システムは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼなどの酵素の触媒活性を利用して、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて、標的タンパク質又は標的核酸配列の、高密度の標識化を行う。一実施形態では、チラミドを使用して、ＨＲＰのシグナルを増大させることができる。このようなシステムでは、ＨＲＰは、標識化されたチラミド誘導体を、高度に反応性で、短命のチラミドラジカルへと、酵素的に転換する。次いで、標識化された活性チラミドラジカルは、ＨＲＰ－抗体－標的相互作用部位の近傍において、残基（主に、タンパク質のチロシン残基のフェノール部分）と、共有結合的にカップリングする結果として、シグナル局在化の、拡散と関連する喪失を最小限として、部位における標識数の増幅をもたらす。結果として、シグナルを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７５、又は１００倍に増幅することができる。当業者に公知の通り、チラミド上の標識は、フルオロフォア、酵素、ハプテン、放射性同位元素、及び／又はホトホアを含む、本明細書で記載される、任意の標識でありうる。他の酵素ベースの反応を利用して、シグナル増幅を創出することもできる。例えば、酵素標識化蛍光（ＥＬＦ）シグナル増幅が、アルカリホスファターゼに利用可能であり、この場合、アルカリホスファターゼは、弱い青色蛍光基質（ＥＬＦ ９７ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を、酵素的に切断し、明るい黄緑色の蛍光沈殿物へと転換し、異例に大きなストークスシフト及び優れた光安定性を呈する。チラミドベースのシグナル増幅システム及びＥＬＦシグナル増幅のいずれも、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ ＵＳＡ ０２４５１）から市販されている。
したがって、本明細書で提供される方法についての一部の実施形態では、ネクチン４の発現レベルを、シグナル増幅システムにより検出する。
次いで、一部の実施形態では、検体を対比染色して、細胞要素及び細胞内要素を同定する。
一部の実施形態では、ネクチン４の発現レベルはまた、免疫ブロットアッセイを使用して、本明細書で記載される抗体により検出することもできる。免疫ブロットアッセイについての一部の実施形態では、タンパク質は、電気泳動により分離され、膜（通例、ニトロセルロース膜又はＰＶＤＦ膜）へと転写されることが多い（が、そうしなくともよい）。ＩＨＣアッセイと同様に、ネクチン４を特異的にターゲティングする、ポリクローナル抗血清及びモノクローナル抗体などの一次抗体又は抗血清を使用して、タンパク質の発現を検出することができる。一部の実施形態では、膜を、抗体－標的間結合が生じるのに十分な時間にわたり、特異的標的に対する一次抗体と接触させることができ、結合した抗体は、抗体自体における直接的標識、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼなどの酵素により検出することができる。他の実施形態では、標識化されていない一次抗体を、一次抗体に特異的な抗血清、ポリクローナル抗血清、又はモノクローナル抗体を含む、標識化された二次抗体と共に使用する。本明細書で記載される通り、二次抗体は、例えば、酵素、又は蛍光標識、発光標識、比色標識、若しくは放射性同位元素など、他の検出可能な標識により標識化することができる。当技術分野では、免疫ブロット法のプロトコール及びキットが周知であり、市販されている。免疫ブロットのための自動式システム、例えば、ｉＢｉｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ ＵＳＡ ０２４５１）が、市販されている。免疫ブロット法は、ウェスタンブロット、細胞内ウェスタンブロット、及びドットブロットを含むがこれらに限定されない。ドットブロットは、タンパク質試料を、電気泳動により分離せず、膜上に直接スポッティングする、簡略型手順である。細胞内ウェスタンブロットは、細胞を、マイクロ滴定プレート内に播種すること、細胞を、固定／透過化すること、一次標識化一次抗体又は標識化されていない一次抗体による、その後の検出に続く、本明細書で記載される、標識化された二次抗体による検出を伴う。
他の実施形態では、ネクチン４の発現レベルはまた、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）アッセイを含む、フローサイトメトリーアッセイにおいて、本明細書で記載される抗体により検出することもできる。ＩＨＣアッセイ又は免疫ブロットアッセイと同様に、ネクチン４を特異的にターゲティングする、ポリクローナル抗血清及びモノクローナル抗体などの一次抗体又は抗血清を使用して、ＦＡＣＳアッセイにおいて、タンパク質の発現を検出することができる。一部の実施形態では、細胞を、抗体－標的間結合が生じるのに十分な時間にわたり、特異的標的タンパク質に対する一次抗体で染色させることができ、結合した抗体は、一次抗体上の直接的標識、例えば、一次抗体上の、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識により検出することができる。他の実施形態では、標識化されていない一次抗体を、一次抗体に特異的な、標識化された二次抗体と共に、上記で記載した間接的アッセイにおいて使用する。ＦＡＣＳは、各細胞の、特異的な光の散乱及び蛍光特徴に基づき、蛍光的に標識化された生物学的細胞の混合物の、一度に１つずつの細胞を、分取又は解析するための方法を提供する。したがって、フローサイトメーターは、標的タンパク質の発現レベルを指し示す、蛍光色素でタグ付けされた抗体を検出し、その強度について報告する。したがって、表面タンパク質（ネクチン４など）の発現レベルは、標的タンパク質に対する抗体を使用して検出することができる。非蛍光細胞質タンパク質はまた、透過化細胞を、染色することによっても観察することができる。当業者には、ＦＡＣＳによる染色及び解析を実施するための方法が周知であり、Ｔｅｒｅｓａ Ｓ．Ｈａｗｌｅｙ及びＲｏｂｅｒｔ Ｇ．Ｈａｗｌｅｙ、「フローサイトメトリープロトコール（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２０１１（ＩＳＢＮ １６１７３７９５０６、９７８１６１７３７９５０５）により記載されている。
他の実施形態では、ネクチン４の発現レベルはまた、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）又はＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイを使用して検出することもできる。当技術分野では、例えば、血液、血漿、血清又は骨髄を含む、多種多様な組織及び試料についてアッセイするために、ＥＩＡアッセイ及びＥＬＩＳＡアッセイのいずれもが公知である。広範にわたるＥＬＩＳＡアッセイフォーマットが利用可能であり、例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第４，０１６，０４３号、同第４，４２４，２７９号、及び同第４，０１８，６５３号を参照されたい。これらは、非競合型の、単一部位アッセイ及び二部位アッセイの両方、又は「サンドイッチ」アッセイのほか、従来の非競合的結合アッセイを含む。これらのアッセイはまた、標識化抗体の、標的タンパク質への直接的結合も含む。サンドイッチアッセイは、一般に使用されるアッセイである。サンドイッチアッセイ技法の、いくつかの変化形が存在する。例えば、典型的なフォワードアッセイでは、標識化されていない抗体を、固体基質上に固定化し、被験試料を、結合させた分子と接触させる。次いで、抗体－抗原間複合体の形成を可能とするのに十分な時間にわたる、適切なインキュベーション時間の後、検出可能なシグナルをもたらすことが可能なレポーター分子で標識化された、抗原に特異的な第２の抗体を添加し、インキュベートし、抗体－抗原－標識化抗体間の、別の複合体の形成に十分な時間を与える。反応しなかった任意の材料を洗い流し、抗原の存在を、レポーター分子によりもたらされるシグナルの観察により決定する。結果は、可視的なシグナルの簡単な観察による、定性的結果の場合もあり、公知の量の標的タンパク質を含有する対照試料と比較することによる、定量化された結果の場合もある。
ＥＩＡアッセイ又はＥＬＩＳＡアッセイについての一部の実施形態では、酵素を、第２の抗体へとへとコンジュゲートさせる。他の実施形態では、蛍光標識化二次抗体を、酵素標識化二次抗体の代わりに使用して、ＥＬＩＳＡアッセイフォーマットのための、検出可能なシグナルをもたらすことができる。特定の波長の光を伴う照射により活性化させられると、蛍光色素で標識化された抗体は、光エネルギーを吸収し、分子内の状態を、励起状態へと誘導するのに続いて、光学顕微鏡で、視覚的に検出可能な、特徴的な色の光の発光を誘導する。ＥＩＡ及びＥＬＩＳＡと同様に、蛍光標識化抗体を、第１の抗体－標的タンパク質複合体に結合させる。次いで、結合しなかった試薬を洗い流した後で、残りの三次複合体を、適切な波長の光へと曝露すると、観察される蛍光は、目的の標的タンパク質の存在を指し示す。免疫蛍光技法及びＥＩＡ技法は、いずれも、当技術分野において、極めて十分に確立されており、本明細書でも開示される。
本明細書で記載されるイムノアッセイのために、酵素活性標識又は非酵素標識が、それぞれ、検出されうる限りにおいて、多数の酵素標識又は非酵素標識のうちのいずれかを利用することができる。これにより、酵素は、標的タンパク質を検出するのに利用されうる、検出可能なシグナルをもたらす。特に有用な検出可能シグナルは、発色シグナル又は蛍光発生シグナルである。したがって、特に、標識としての使用に有用な酵素は、発色基質又は蛍光発生基質が利用可能な酵素を含む。このような発色基質又は蛍光発生基質は、酵素反応により、たやすく検出可能な発色生成物又は蛍光生成物へと転換することができ、これらは、顕微鏡法又は分光法を使用して、たやすく検出及び／又は定量化することができる。このような酵素は、当業者に周知であり、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどを含むがこれらに限定されない（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「バイオコンジュゲート技法（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９６）を参照されたい）。周知の発色基質又は蛍光発生基質を有する、他の酵素は、多様なペプチダーゼを含み、この場合、発色ペプチド基質及び蛍光発生ペプチド基質を利用して、タンパク質分解性切断反応を検出することができる。細菌診断法では、α－ガラクトシダーゼ及びβ－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、６－ホスホ－β－Ｄ－ガラクトシド６－ホスホガラクトヒドロラーゼ、β－グルコシダーゼ、α－グルコシダーゼ、アミラーゼ、ノイラミニダーゼ、エステラーゼ、リパーゼなどの使用を含むがこれらに限定されない、発色基質及び蛍光発生基質の使用もまた周知であり（Ｍａｎａｆｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、５５：３３５～３４８（１９９１））、公知の発色基質又は蛍光発生基質を伴う、このような酵素は、本発明の方法における使用のために、たやすく適合させることができる。
当業者には、検出可能なシグナルをもたらす、多様な発色基質又は蛍光発生基質が周知であり、市販されている。検出可能なシグナルをもたらすのに利用しうる例示的基質は、西洋ワサビペルオキシダーゼのための、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、クロロナフトール（４－ＣＮ）（４－クロロ－１－ナフトール）、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ－フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）、及び３－アミノ－９－エチルカルバゾール（ＡＥＣ）；アルカリホスファターゼのための、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－１－リン酸（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、Ｆａｓｔ Ｒｅｄ（Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ／ＡＳ－ＭＸ）、及びｐ－ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）；β－ガラクトシダーゼのための、１－メチル－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド及び２－メトキシ－４－（２－ニトロビニル）フェニルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド；β－グルコシダーゼのための、２－メトキシ－４－（２－ニトロビニル）フェニルβ－Ｄ－グルコピラノシドなどを含むがこれらに限定されない。例示的な蛍光発生基質は、アルカリホスファターゼのための、４－（トリフルオロメチル）ウンベリフェリルリン酸；ホスファターゼのための、４－メチルウンベリフェリルリン酸ビス（２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール）、４－メチルウンベリフェリルリン酸ビス（シクロヘキシルアンモニウム）、及び４－メチルウンベリフェリルリン酸；西洋ワサビペルオキシダーゼのためのＱｕａｎｔａＢｌｕ（商標）及びＱｕａｎｔａＲｅｄ（商標）；β－ガラクトシダーゼのための、４－メチルウンベリフェリルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド、フルオレセインジ（β－Ｄ－ガラクトピラノシド）、及びナフトフルオロセインジ（β－Ｄ－ガラクトピラノシド）；β－グルコシダーゼのための、３－アセチルウンベリフェリルβ－Ｄ－グルコピラノシド及び４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルコピラノシド；並びにα－ガラクトシダーゼのための、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ガラクトピラノシドを含むがこれらに限定されない。検出可能なシグナルをもたらすための、例示的な酵素及び基質についてはまた、例えば、米国公開第２０１２／０１００５４０号においても記載されている。発色基質又は蛍光発生基質を含む、多様な検出用酵素基質は、周知であり、市販されている（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ ＴＸ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ；４２ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｂｉｏｃａｒｅ）。一般に、基質は、標的核酸の部位に沈着する、沈殿物を形成する産物へと転換される。他の例示的な基質は、ＨＲＰ－Ｇｒｅｅｎ（４２ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｂｉｏｃａｒｅ（Ｃｏｎｃｏｒｄ ＣＡ；ｂｉｏｃａｒｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ／ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｓ）製のＢｅｔａｚｏｉｄ ＤＡＢ、Ｃａｒｄａｓｓｉａｎ ＤＡＢ、Ｒｏｍｕｌｉｎ ＡＥＣ、Ｂａｊｏｒａｎ Ｐｕｒｐｌｅ、Ｖｉｎａ Ｇｒｅｅｎ、Ｄｅｅｐ Ｓｐａｃｅ Ｂｌａｃｋ（商標）、Ｗａｒｐ Ｒｅｄ（商標）、Ｖｕｌｃａｎ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ及びＦｅｒａｎｇｉ Ｂｌｕｅを含むがこれらに限定されない。
イムノアッセイについての一部の実施形態では、検出用標識は、一次抗体又は標識化されていない一次抗体を検出する二次抗体へと、直接カップリングさせることができる。当業者には、発色標識又は蛍光標識（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「バイオコンジュゲート技法（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９６）を参照されたい）を含むがこれらに限定されない、例示的検出用標識が周知である。標識として有用な、例示的フルオロフォアは、ローダミン誘導体、例えば、テトラメチルローダミン、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、スルホローダミンＢ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（スルホローダミン１０１）、ローダミン１１０、及びテトラメチルローダミン－５－（又は６）、リサミンローダミンＢなど、これらの誘導体など；７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール（ＮＢＤ）；フルオレセイン及びその誘導体；ダンシル（５－ジメチルアミノナフタレン－１－スルホニル）などのナフタレン；７－アミノ－４－メチルクマリン－３－酢酸（ＡＭＣＡ）、７－ジエチルアミノ－３－［（４’－（ヨードアセチル）アミノ）フェニル］－４－メチルクマリン（ＤＣＩＡ）、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）などのクマリン誘導体；４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン（ＢＯＤＩＰＹ（商標））及びその誘導体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ Ｏｒｅｇ．）；Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（商標）及び８－メトキシピレン－１，３，６－トリスルホン酸を含むその誘導体などのピレン及びスルホン酸化ピレン；ピリジルオキサゾール誘導体及びダポキシル誘導体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ（３，６－ジスルホナート－４－アミノ－ナフタルイミド）及びその誘導体；ＣｙＤｙｅ（商標）蛍光色素（Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）などを含むがこれらに限定されない。例示的な発色団は、フェノールフタレイン、マラカイトグリーン、ニトロフェニルなどのニトロ芳香族、ジアゾ色素、ダブシル（４－ジメチルアミノアゾベンゼン－４’－スルホニル）などを含むがこれらに限定されない。
顕微鏡法又は分光法など、当業者に周知の方法を利用して、一次抗体又は二次抗体と関連する結合した、検出可能な発色シグナル又は蛍光シグナルを視覚化することができる。
「ネクチン４の発現を決定すること」とは、言及されるシステムに精通した人が、被験試料中のネクチン４の相対発現について、言及されるシステム下に位置づけられた他の試料との関係で判断しうるように、被験生物学的試料中のネクチン４の発現を、言及されるシステム（又は言及されるスケール）下に置くことを指す。結果として、このような決定は、被験組織試料中のネクチン４の発現を、ネクチン４の基準発現レベルと比較することを伴う。
一部の実施形態では、言及されるシステムは、被験試料中の、ネクチン４の、実際のモル濃度又はモル数量を、基準発現レベルのモル濃度又はモル数量と比較する定量的システムでありうる。一部の実施形態では、モル濃度又はモル数量と正比例する、他のサロゲートの数値による測定値を使用することができる。これらのサロゲート測定値の例は、結合した抗体の蛍光強度測定値、結合した抗体の発光強度測定値、結合した抗体の放射能測定値、及び／又は結合した抗体の比色測定値若しくは発色測定値を含む。
他の実施形態では、言及されるシステムは、カテゴリー化システムでありうる。カテゴリー化システムは、少なくて、２つのカテゴリーを有することが可能であり、多くて、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、又はこれを超えるカテゴリーを有しうる。一実施形態では、言及されるシステムは、ネクチン４の発現について陽性である試料についての陽性カテゴリー（陽性）と、ネクチン４の発現について陰性である試料についての陰性カテゴリー（陰性）とを有する。このようなカテゴリー化システムでは、被験試料中のネクチン４の発現を決定することは、被験試料中のネクチン４の発現を、陽性基準試料及び／又は陰性基準試料のネクチン４の発現と比較し、被験試料が、ネクチン４を、陽性基準と同等レベル又は高レベルで発現する場合は、被験試料を、陽性カテゴリー下に置くことを伴う。別の実施形態では、カテゴリー化システムは、３つのカテゴリー、例えば、陰性カテゴリー、中発現カテゴリー、及び高発現カテゴリーを有する。別の実施形態では、カテゴリー化システムは、４つのカテゴリー、例えば、陰性カテゴリー、低発現／弱い発現カテゴリー、中発現／中程度の発現カテゴリー、及び高発現／強い発現カテゴリーを有する。一部の態様では、被験試料中のネクチン４の発現を決定することは、被験試料中のネクチン４の発現を、既知のカテゴリーの、ネクチン４の発現についての、１又は複数の基準と比較し、被験試料を、基準（単数又は複数）に照らしたその相対発現に従い、カテゴリー下に置くことを伴う。
一部の実施形態では、言及されるシステムは、スコアリングシステムでありうる。スコアリングシステムは、カテゴリーを、スコアで置きかえることを除き、カテゴリー化システムと同様でありうる。例えば、ネクチン４の陰性発現及び陽性発現による２カテゴリーシステムは、０及び１のスコアリングシステムであることが可能であり、この場合、０は、陰性を意味し、１は、陽性を意味する。別の実施形態では、３カテゴリーシステムは、０、１、及び２のスコアリングシステムであることが可能であり、この場合、０は、陰性であり、１は、低発現／弱い発現であり、２は、中発現／中程度の発現及び高発現／強い発現である。別の実施形態では、４カテゴリーシステムは、０、１、２、及び３のスコアリングシステムであることが可能であり、この場合、０は、陰性であり、１は、低発現／弱い発現であり、２は、中発現／中程度の発現であり、３は、高発現／強い発現である。カテゴリー化システムと同様に、スコアリングシステムで、被験試料中のネクチン４の発現を決定することは、被験試料中のネクチン４の発現を、公知のスコアを有する、ネクチン４の発現についての、１又は複数の基準と比較し、被験試料に、基準に照らしたその相対発現に従い、スコアを割り当てることを伴う。スコアリングシステムは、しかしながら、不連続数及び離散数（例えば、０、２、４、６、８、及び１０のシステム、又は１、４、６、１１、１３、及び１９のシステム）、分数（例えば、１、１．５、２、２．５、３、３．５など）を伴う数、負の数、任意の数（例えば、１０００、２０００、３０００など）から始まる数、及び生物学的試料中の相対タンパク質発現を追跡するのに使用されうる、任意の数のセットによるスコアでありうる。
一部の実施形態では、言及されるシステムは、カテゴリー化システム又はスコアリングシステムと併用した細胞の百分率でありうる。細胞の百分率の、カテゴリー化システム又はスコアリングシステムとの組合せは、試料の、より精緻な悪性度評価をもたらす。このような組合せシステムでは、生物学的試料に由来する各細胞を、カテゴリー化システム又はスコアリングシステムへと割り当てるか、又はこの下に置き、各カテゴリー又は各スコアにおける、被験試料の細胞の近似的な百分率を決定する。一例では、細胞の百分率の測定を、ネクチン４の陽性発現及び陰性発現による２カテゴリーシステムとカップリングさせることができるが、この場合、試料を、全体としては測定せず、ネクチン４の発現について陽性である細胞の百分率と、ネクチン４の発現について陰性である細胞の百分率とに分ける。例えば、ネクチン４の陽性発現及び陰性発現による２カテゴリーシステムでは、被験試料は、２カテゴリーシステム下に置かれるが、１０％の細胞が、ネクチン４の発現について陽性であり、９０％の細胞が、ネクチン４の発現について陰性である場合、ネクチン４の発現について陰性でありうる。一実施形態では、言及されるシステムは、２カテゴリーシステム又は２スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、３カテゴリーシステム又は３スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、４カテゴリーシステム又は４スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、５カテゴリーシステム又は５スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、６カテゴリーシステム又は６スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、７カテゴリーシステム又は７スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、８カテゴリーシステム又は８スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、９カテゴリーシステム又は９スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、１０カテゴリーシステム又は１０スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、任意のカテゴリー化又は任意のスコアリングシステムと併用した細胞の百分率を含む。一実施形態では、言及されるシステムは、０（ネクチン４について陰性）、１（ネクチン４の低発現／弱い発現）、２（ネクチン４の中発現／中程度の発現）、及び３（ネクチン４の高発現／強い発現）を含む４スコアシステムと併用した細胞の百分率を含む。
一部の態様では、言及されるシステムは、ネクチン４の発現の、少なくとも１つの基準タンパク質の発現に対する比でありうる。一部の実施形態では、比は、ネクチン４の発現の定量的測定値と、基準タンパク質の発現の定量的測定値との比であることが可能であり、この場合、定量的測定値は、モル濃度、モル数量、結合した抗体の蛍光強度測定値、結合した抗体の発光強度測定値、結合した抗体の放射能測定値、及び／又は結合した抗体比色測定値若しくは発色測定値など、本明細書で記載される定量的測定値を含む。他の実施形態では、比はまた、本明細書で提供される、任意のスコアリングシステムに従い、ネクチン４の発現へと割り当てられるスコアと、基準タンパク質へと割り当てられるスコアとの比でもありうるであろう。基準タンパク質は、アクチン、ＧＡＰＤＨ、ＧＤＩ、又はハウスキーピング遺伝子が発現する任意のタンパク質など、通常の細胞機能を有するタンパク質でありうるであろう。例えば、被験試料が、ネクチン４の発現について、３のスコアを有し、アクチンの発現について、１のスコアを有する場合、比は、３であると決定することができる。
他の態様では、基準システムは、カテゴリー化、スコア、比、百分率、及び定量的測定値のうちの１又は複数を入力として使用する、数学的関数の結果を利用しうる。一部の実施形態では、数学的関数は、試料中のネクチン４の発現、及び／又はネクチン４の発現スケールにおける、より精緻なグラデーションについての、より詳細な情報をもたらす結果を生み出すように、これらの演算子を、複合させるか、足し合わせるか、掛け合わせるか、又は組み合わせることを使用して、多様な入力を組み合わせる。一実施形態では、数学的関数は、百分率と、４スコアシステムとの組合せに基づき、Ｈスコアを計算する。例えば、Ｈスコアは、細胞の百分率（０～１００）と、細胞の各ネクチン４発現スコア（０＝陰性、１＝低／弱い、２＝中程度の／中、及び３＝高／強い）との積を足し合わせることにより計算した。例えば、１０％の細胞が３とスコアリングされ、３０％の細胞が２とスコアリングされ、２０％の細胞が１とスコアリングされ、及び４０％の細胞が０とスコアリングされる検体であれば、（３×１０）＋（２×３０）＋（１×２０）＋（０×４０）＝１１０のＨスコアを有するであろう。
したがって、本明細書で提供される通り、ネクチン４の発現レベルは、カテゴリー化システム、スコアリングシステム、ネクチン４の発現の、少なくとも１つの基準タンパク質の発現に対する比、前記カテゴリー化システム又はスコアリングシステムにおける細胞の百分率、ネクチン４の染色シグナルの定量的測定値、又は前記カテゴリー化、スコア、比、百分率、及び定量的測定値のうちの１若しくは複数を入力として使用する数学的関数の結果を使用して決定することができる。
大半のホルマリン固定組織は、免疫組織化学染色の前に、抗原賦活化ステップを要求する。固定時に形成されるメチレン架橋は、タンパク質を架橋し、抗原のエピトープを遮蔽する。抗原賦活化方法は、これらのメチレン架橋を切断し、エピトープを露出させ、抗体が結合することを可能とする。一部の実施形態では、抗原を、熱誘導エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）方法により賦活化させる。他の実施形態では、抗原を、酵素賦活化（例えば、タンパク質分解性消化）方法により賦活化させる。ＨＩＥＲのために、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片は、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、１００℃、１０５℃、１１０℃、１１５℃、１２０℃、１２５℃、又は１３０℃で加熱することができる。ＦＦＰＥ組織切片は、これらの温度のうちのいずれかで、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１５０、１８０、２４０、３００、３６０、４２０、４８０、５４０、６００、６６０、７２０、７８０、８４０、９００、９６０、１０２０、１０８０、１１４０、１２００、１２６０、１３２０、１３８０、及び１４４０分間にわたり加熱することができる。前述の温度のうちのいずれかで、前述の持続時間のうちのいずれかにわたるＨＩＥＲ手順を、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７、７．２、７．４、７．６、７．８、８、８．２、８．４、８．６、８．８、９、９．２、９．４、９．６、９．８、１０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１、１１．５、又は１２のｐＨを有する溶液中で実施することができる。一部の実施形態では、ＨＩＥＲを、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、１００℃、１０５℃、１１０℃、１１５℃からなる群から選択される温度で、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０からなる群から選択される持続時間にわたり、８、８．２、８．４、８．６、８．８、９、９．２、９．４、９．６、９．８、１０、１０．２、１０．４からなる群から選択されるｐＨで実施することができる。
したがって、本明細書で提供される方法は、熱誘導エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）により、ネクチン４のエピトープを賦活化させるステップをさらに含む。
ネクチン４抗原に免疫特異的に結合する、非標識化抗体、標識化抗体、並びにこれらの誘導体及び類似体は、ネクチン４媒介性疾患を検出、診断、又はモニタリングする診断目的で使用することができる。したがって、本明細書では、ネクチン４媒介性疾患を検出するための方法であって、（ａ）ネクチン４抗原に免疫特異的に結合する、１又は複数の、本明細書で提供される抗体を使用して、対象の細胞試料中又は組織試料中の、ネクチン４抗原の発現についてアッセイするステップと；（ｂ）ネクチン４抗原のレベルを、基準レベル、例えば、正常組織試料（例えば、ネクチン４媒介性疾患を有さない患者に由来する組織試料、疾患発病の前における同じ患者に有来する組織試料、同じ患者に由来する組織試料中の正常細胞、又は同じ患者に由来する正常臓器に由来する正常組織試料）中のレベルと比較するステップであって、ネクチン４抗原のアッセイレベルの、ネクチン４抗原の対照レベルと比較した上昇が、ネクチン４媒介性疾患を示す上記ステップとを含む上記方法が提供される。
本明細書ではまた、ネクチン４媒介性疾患を診断するための診断アッセイであって、（ａ）ネクチン４抗原に免疫特異的に結合する、１又は複数の、本明細書で提供される抗体を使用して、個体の細胞試料中又は組織試料中の、ネクチン４抗原のレベルについてアッセイするステップと；（ｂ）ネクチン４抗原のレベルを、基準レベル、例えば、正常組織試料中のレベルと比較するステップであって、ネクチン４抗原のアッセイレベルの、ネクチン４抗原の基準レベルと比較した上昇が、ネクチン４媒介性疾患を示す上記ステップとを含む上記診断アッセイも提供される。本明細書のある特定の実施形態では、対象におけるネクチン４媒介性疾患を処置する方法であって、（ａ）ネクチン４抗原に免疫特異的に結合する、１又は複数の、本明細書で提供される抗体を使用して、対象の細胞試料中又は組織試料中の、ネクチン４抗原のレベルについてアッセイするステップと；（ｂ）ネクチン４抗原のレベルを、基準レベル、例えば、正常組織試料中のレベルと比較するステップであって、ネクチン４抗原のアッセイレベルの、ネクチン４抗原の基準レベルと比較した上昇が、ネクチン４媒介性疾患を示す上記ステップとを含む上記方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、（ｃ）有効量の、本明細書で提供される抗体を、ネクチン４媒介性疾患を有すると同定された対象へと投与するステップをさらに含む。ネクチン４媒介性疾患についての、より明確な診断は、医療従事者が、早期に、防止的措置又は侵襲的処置を用い、これにより、ネクチン４媒介性疾患の発生、又はさらなる進行を防止することを可能とする。
本明細書で提供される抗体を使用して、本明細書で記載されるか、又は当業者に公知の、古典的な免疫組織化学方法を使用して、生物学的試料中のネクチン４抗原レベルについてアッセイすることができる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、１９８５、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１０１：９７６～９８５；及びＪａｌｋａｎｅｎら、１９８７、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０５：３０８７～３０９６を参照されたい）。タンパク質の遺伝子発現を検出するのに有用な、他の抗体ベースの方法は、ＥＬＩＳＡ及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイを含む。当技術分野では、適切な抗体アッセイ標識が公知であり、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識；ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１２１Ｉｎ）、及びテクネシウム（９９Ｔｃ）などの放射性同位元素；ルミノールなどの発光標識；並びにフルオレセイン及びローダミンなどの蛍光標識、並びにビオチンを含む。
本明細書で提供される一態様は、ヒトにおけるネクチン４媒介性疾患の検出及び診断である。一実施形態では、診断は、ａ）対象へと、有効量の標識化されたネクチン４抗原に免疫特異的に結合する抗体を投与する（例えば、非経口、皮下、又は腹腔内）ステップと；ｂ）標識化された抗体が、対象の部位において濃縮され、そこで、ネクチン４抗原が発現すること（そして、結合しなかった標識化分子が、バックグラウンドレベルまでクリアランスされること）を可能とするために、投与後の時間間隔を待機するステップと；ｃ）バックグラウンドレベルを決定するステップと；ｄ）標識化された抗体の、バックグラウンドレベルを上回る検出が、対象は、ネクチン４媒介性疾患を有することを指し示すように、対象において、標識化された抗体を検出するステップとを含む。バックグラウンドレベルは、検出された標識化分子の量を、特定のシステムについて、既に決定された、標準的な値と比較するステップを含む、多様な方法により決定することができる。
当技術分野では、対象のサイズ及び使用されるイメージングシステムが、診断用画像を作製するのに必要とされるイメージング部分の数量を決定することが理解されるであろう。放射性同位元素部分の場合、ヒト対象のために、注入される放射性物質の数量は、通常、９９Ｔｃ約５～２０ミリキュリーの範囲であろう。次いで、標識化された抗体は、特異的タンパク質を含有する細胞の位置に蓄積されるであろう。ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍イメージングについては、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「放射性標識化された抗体及びそれらの断片についての免疫薬物動態（Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）」（１３章「腫瘍イメージング：がんの放射化学的検出（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）」、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ及びＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２）において記載されている。
使用される標識の種類及び投与方式、標識化された抗体が、対象の部位において濃縮され、結合しなかった標識化分子が、バックグラウンドレベルまでクリアランスされることを可能とするための、投与後の時間間隔を含む、いくつかの変数は、６～４８時間、又は６～２４時間、又は６～１２時間である。別の実施形態では、投与後の時間間隔は、５～２０日間又は５～１０日間である。
一実施形態では、ネクチン４媒介性疾患のモニタリングは、例えば、初回診断の１カ月後、初回診断の６カ月後、初回診断の１年後など、ネクチン４媒介性疾患を診断するための方法を反復することにより実行する。
標識化された分子の存在は、対象において、ｉｎ ｖｉｖｏ走査のための、当技術分野で公知の方法を使用して検出することができる。これらの方法は、使用される標識の種類に依存する。当業者は、特定の標識を検出するのに適切な方法を決定することが可能であろう。本明細書で提供される診断方法において使用されうる方法及びデバイスは、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、全身走査など、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、及び超音波法を含むがこれらに限定されない。
具体的な実施形態では、分子を、放射性同位元素で標識化し、患者において、放射線応答性手術器具を使用して検出する（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態では、分子を、蛍光化合物で標識化し、患者において、蛍光応答性走査器具を使用して検出する。別の実施形態では、分子を、ポジトロン放出金属で標識化し、患者において、ポジトロン放出断層撮影を使用して検出する。さらに別の実施形態では、分子を、常磁性標識で標識化し、患者において、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を使用して検出する。
３０．キット
本明細書ではまた、本明細書で提供される抗体（例えば、抗ネクチン４抗体）、又はその組成物（例えば、医薬組成物）を含むキットであって、適切なパッケージング材料へとパッケージングされた、上記キットも提供される。キットは、任意選択で、構成要素についての記載、又はその中の構成要素の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、若しくはｅｘ ｖｉｖｏにおける使用のための指示書を含む、表示又は添付文書を含む。
「パッケージング材料」という用語は、キットの構成要素を格納する物理的構造を指す。パッケージング材料は、構成要素を、無菌的に維持し、一般に、このような目的で使用される材料（例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル、バイアル、チューブなど）から作ることができる。
本明細書で提供されるキットは、表示又は添付文書を含みうる。表示又は添付文書は、「印刷物」、例えば、別個の紙又はボール紙、或いは構成要素、キット、若しくは梱包材料（例えば、箱）へと固定されるか、又は、例えば、キットの構成要素を含有するアンプル、チューブ、若しくはバイアルへと貼り付けた、紙又はボール紙を含む。表示又は添付文書は、加えて、ディスク（例えば、ハードディスク、カード、又はメモリーディスク）、ＣＤ－ＲＯＭ若しくはＤＶＤ－ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤ、ＭＰ３などの光学ディスク、磁気テープ、又はＲＡＭ及びＲＯＭなどの電子的記憶メディアなどのコンピューター読取り型メディア、或いは磁気／光学記憶メディア、ＦＬＡＳＨメディア、又はメモリー型カードなど、これらのハイブリッド体を含みうる。表示又は添付文書は、製造元情報、ロット番号、製造元の所在地、及び日付を同定する情報を含みうる。
本明細書で提供されるキットは、加えて、他の成分を含みうる。キットの各構成要素は、個別の容器内に封入することができ、多様な容器の全ては、単一のパッケージに入れることができる。キットはまた、低温保存のためにデザインすることもできる。キットは、本明細書で提供される抗体、又は本明細書で提供される抗体をコードする核酸を含有する細胞を含有するように、さらにデザインすることもできる。キット内の細胞は、使用する準備ができるまで、適切な保存条件下で維持することができる。さらなる構成要素は、例を目的とすると、陽性基準試料又は陰性基準試料（例えば、ネクチン４媒介性疾患を有することが公知の患者に由来する組織試料、ネクチン４媒介性疾患を有さない患者に由来する組織試料、疾患発病の前における同じ患者に有来する組織試料、ネクチン４媒介性疾患を伴う対象に由来する組織試料中の正常細胞、又は同じ患者に由来する正常臓器に由来する正常組織試料）、緩衝液、洗浄液、抗体検出試薬、及び／又はシグナル増幅試薬を含みうる。
本明細書ではまた、ネクチン４抗原に免疫特異的に結合する抗体のパネルも提供される。本明細書の具体的な実施形態では、ネクチン４抗原に対する、異なる会合速度定数、異なる解離速度定数、異なるアフィニティー、及び／又はネクチン４抗原に対する、異なる特異性を有する抗体のパネルが提供される。本明細書のある特定の実施形態では、約１０、好ましくは、約２５、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、又は約１０００、又はこれを超える抗体のパネルが提供される。抗体のパネルは、例えば、ＥＬＩＳＡなどのアッセイなどのための、９６ウェルプレート又は３８４ウェルプレートにおいて使用することができる。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で記載される方法及び材料と、同様又は同等な方法及び材料を、本発明の実施又は試験において使用しうるが、本明細書では、適切な方法及び材料について記載する。
本明細書で引用される、全ての出願、公開、特許、及び他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋの引例及びＡＴＣＣの引例は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。齟齬を生じる場合は、定義を含む本明細書に従う。
文脈により、そうでないことが明示的に指し示されない限りにおいて、本明細書で使用される、単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「あるペプチド配列」への言及は、複数の、このような配列などを含む。
本明細書で使用される数値は、本文献の全体にわたる範囲フォーマットで提供されることが多い。範囲フォーマットの使用は、簡便さ及び簡略さだけのために使用されるものであり、文脈により、そうでないことが明確に指し示されない限りにおいて、本発明の範囲に対する、厳格な限定とみなすべきではない。したがって、文脈により、そうでないことが明確に指し示されない限りにおいて、範囲の使用は、全ての可能な部分範囲、この範囲内の、全ての個別の数値、及びこのような範囲内の整数を含む、全ての数値又は数値範囲、並びに範囲内の値の分数又は整数を明示的に含む。この構築は、本特許文献の全体にわたり、範囲の幅に関わらず、且つ、全ての文脈において適用される。したがって、例えば、９０～１００％の範囲への言及は、９１～９９％、９２～９８％、９３～９５％、９１～９８％、９１～９７％、９１～９６％、９１～９５％、９１～９４％、９１～９３％などを含む。９０～１００％の範囲への言及はまた、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％などのほか、９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４％、９１．５％など、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％なども含む。
加えて、１～３、３～５、５～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、１４０～１５０、１５０～１６０、１６０～１７０、１７０～１８０、１８０～１９０、１９０～２００、２００～２２５、２２５～２５０の範囲への言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０などを含む。さらなる例では、２５～２５０、２５０～５００、５００～１，０００、１，０００～２，５００、２，５００～５，０００、５，０００～２５，０００、２５，０００～５０，０００の範囲への言及は、このような値、例えば、２５、２６、２７、２８、２９・・・２５０、２５１、２５２、２５３、２５４・・・５００、５０１、５０２、５０３、５０４・・・などの中にあるか、又はこれらを包含する、任意の数値又は範囲を含む。
これもまた本明細書で使用される通り、一連の範囲については、本文献の全体にわたり開示する。一連の範囲の使用は、別の範囲をもたらすための、上方範囲と下方範囲との組合せを含む。この構築は、本特許文献の全体にわたり、範囲の幅に関わらず、且つ、全ての文脈において適用される。したがって、例えば、５～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～７５、７５～１００、１００～１５０など、一連の範囲への言及は、５～２０、５～３０、５～４０、５～５０、５～７５、５～１００、５～１５０、及び１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～７５、１０～１００、１０～１５０、及び２０～４０、２０～５０、２０～７５、２０～１００、２０～１５０などの範囲を含む。
本明細書では、簡略のために、ある特定の略号を使用する。一例は、アミノ酸残基を表す、一文字式の略号である。アミノ酸並びにそれらの対応する、三文字式及び一文字式の略号は、以下の通りである。
Figure 0007168590000015
本発明は、本明細書において、多数の実施形態について記載する、確言的表現を使用して、一般に開示される。本発明は、物質若しくは材料、方法ステップ及び条件、プロトコール、手順、アッセイ、又は解析など、特定の対象物を、完全に、又は部分的に除外した実施形態もまた、具体的に含む。したがって、本明細書では、本発明は、一般に、本発明が含まないものとの関係では表現されないが、それにもかかわらず、本明細書では、本発明に明示的に含まれない態様も開示される。
本発明のいくつかの実施形態について記載してきた。しかしながら、本発明の精神及び範囲から逸脱しない限りにおいて、多様な改変を施しうることが理解されるであろう。したがって、以下の例は、意図された特許請求の範囲において記載される、本発明を例示することを意図するものであり、この範囲を限定することを意図するものではない。
本節における例は、例示を目的として与えられるものであり、限定を目的として与えられるものではない。
（例１）
抗原の調製
ヒトネクチン４の断片、例えば、ヒトネクチン４（配列番号１）のアミノ酸配列３１～３４６（配列番号２）を含む断片を作出し、その後の免疫化キャンペーンのための抗原として使用した。
市販のｐＥＴ発現ベクターを使用して、６×ＨＮでタグ付けされたネクチン４（アミノ酸３１～３４６）を作製した。発現は、製造元の指示書に従い、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌内で実行し、ＩＭＡＣベースの精製（固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）を使用して精製した。精製されたネクチン４（アミノ酸３１～３４６）を、免疫原として使用した。
製造元の指示書に従い、修飾ｐＴａｇ５／ｍｙｃｈｉｓ発現ベクターを使用して、抗体スクリーニングのための組換えネクチン４（アミノ酸１～３４８）を、２９３ＦＴ細胞内で作製した。標準的なＩＭＡＣベースの精製を使用して、タンパク質を精製した。
（例２）
抗体の作出
Ａ．抗体の作出及び作製
モノクローナル抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１を、元は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６、５１１（１９７６）において記載された、標準的なハイブリドーマ技法を使用して、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、細菌により産生された、ヒトネクチン４タンパク質の細胞外ドメインの組換え断片（３１～３４６；配列番号２）で免疫化することにより作出した。ハイブリドーマであるＭ２２－３２１ｂ４１を、ＥＬＩＳＡにより示される通り、ヒトネクチン４タンパク質の組換え細胞外ドメインに特異的に結合する、マウスＩｇＧ２ａカッパ抗体を産生する、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１としてサブクローニングした。加えて、プロテインＡで精製された抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１は、ＩＨＣにより、ネクチン４を発現する被験組織を、特異的に染色することが示された。
その後、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１ハイブリドーマ細胞を、増殖させ、拡大し、長期にわたる保存のために、液体窒素中で、生存可能な形で凍結させた。
Ｂ．ハイブリドーマによるシーケンシング
ＲＴ－ＰＣＲを使用して、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１ハイブリドーマ抗体の重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子をシーケンシングした。
（例３）
抗体のスクリーニング及び選択
Ａ．スクリーニングアッセイ（又は結合アッセイ）
一次ＥＬＩＳＡスクリーンを、上記で記載した通りに作製された、ネクチン４細胞外ドメインの断片（アミノ酸残基３１～３４６）により実施した。
二次ＥＬＩＳＡスクリーンを、大腸菌内で作製された、ネクチン４細胞外ドメインの断片（アミノ酸残基３１～３４６）、２９３ＦＴ細胞内で作製された、ネクチン４細胞外ドメインの断片（アミノ酸残基１～３４６）、ネクチン４－タグ５、及び２つの対照タンパク質（ｐＥＴにより作製された対照タンパク質、及びタグ５により作製された対照タンパク質）により実施した。
Ｂ．抗体の選択
まず、それらが、組換え３Ｔ３－ネクチン４細胞において染色を示し、対照における染色を欠いた場合に、抗体を選択した。その後、まず、選択された抗体を、ｑＰＣＲスコアにより決定される通り、ネクチン４ ｍＲＮＡの発現が既知である、陽性対照組織及び陰性対照組織のパネルにおいて調べた。抗体を、多様な濃度で、多様な抗原賦活化プロトコールにより調べた。それらが、ネクチン４ ｍＲＮＡ陽性組織内の特異的染色をもたらし、ネクチン４ ｍＲＮＡ陰性組織内の染色を欠き、染色強度、染色細胞の比、及び非特異的バックグラウンド染色に関して調べられた、対照抗ネクチン４抗体より良好であった場合に、抗体を選択した。
（例４）
ネクチン４に特異的な抗体についてのスクリーニング
上記で記載した通りに作出された抗体をスクリーニングして、ネクチン４について特異的な抗体を選択した。スクリーニングは、例えば、ＩＨＣアッセイを使用して実施した。略述すると、多様な由来、例えば、膀胱、乳腺、卵巣、膵臓、腎臓、皮膚、肺、及び結腸からのヒト異種移植がん組織を、まず、ｑＰＣＲにおいて調べて、これらの組織内の、ネクチン４の発現のレベルを決定した。
リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）解析を用いて、ネクチン４ ｍＲＮＡの相対発現レベルを決定した。ｑＰＣＲアッセイは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ３８４ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ検出システムを、ＳｓｏＦａｓｔ ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、及び５ｎｇの、ｃＤＮＡ鋳型のＲＮＡ同等物と共に使用して実施した。以下の式：１０，０００×２－（Ｃｑネクチン４－ＣｑＧＡＰＤＨ）による、改変デルタＣｑ方法を使用して、ネクチン４ ｍＲＮＡ発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子である、ＧＡＰＤＨの発現レベルと対比して計算し、ネクチン４の相対発現は、ＧＡＰＤＨ単位と対比して記載した。
ネクチン４のｑＰＣＲ解析において用いられるプライマーは、１９１Ｐ４Ｄ１２．１フォワードプライマー：５’－ＧＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＡＴＧＡＧＧＴＴＴＡＴＴＴ－３’（配列番号４１）と；１９１Ｐ４Ｄ１２．２リバースプライマー：５’－ＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＴＣＡＧＡＣＴＡＡＧＡＡＧＡ－３’（配列番号４２）とを含む。ＧＡＰＤＨのｑＰＣＲ解析において用いられるプライマーは、ＧＡＰＤＨ．１フォワードプライマー：５’－ＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＣＴＣＴＡＣＴＧ－３’（配列番号４３）と；ＧＡＰＤＨ．２リバースプライマー：５’－ＡＡＡＴＧＡＧＣＴＴＧＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＣＧＴ－３’（配列番号４４）とを含む。
ｑＰＣＲのためのｃＤＮＡ鋳型は、ＴＲＩｚｏｌ ＲＮＡ抽出法を使用して、組織試料又は細胞系試料から単離されたＲＮＡから、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｉＳｃｒｉｐｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｃＤＮＡ合成キットを使用して合成するのに続き、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙクリーンアップキットを使用して、ＲＮＡクリーンアップと、ＤＮａｓｅＩ消化とを行った。
例示的なヒト異種移植組織を、表５に示した。次いで、上記で作出した抗ネクチン４抗体を、ＩＨＣアッセイにおいて使用して、ネクチン４の発現レベルが既知である組織を染色した。ＩＨＣアッセイは、下記の例５で詳細に記載するのと同様に実施した。多様な組織内のネクチン４についてのＩＨＣ染色は、これらの組織内のネクチン４ ｍＲＮＡレベルと相関した。それが、ネクチン４ ｍＲＮＡレベルと相関する、ＩＨＣ染色シグナル、例えば、高レベルのネクチン４ ｍＲＮＡと相関する、強い組織内の染色、中レベルのネクチン４ ｍＲＮＡと相関する、中程度の、組織内のＩＨＣ染色シグナル、低ネクチン４ ｍＲＮＡと相関する、組織内の、低ＩＨＣ染色シグナルをもたらし、ネクチン４ ｍＲＮＡを発現しない組織内のＩＨＣ染色シグナルをもたらさなかった場合に、抗体を、ネクチン４特異的抗体として選択した。合計で、少なくとも２８３の抗体クローンをスクリーニングし、ネクチン４特異的抗体である、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１及びＭ２２－２４４ｂ３．１．１．１の同定をもたらした。
（例５）
機能的アッセイ：異種移植組織についての免疫組織化学染色
例えば、本明細書で記載される通りに、作出し、スクリーニングし、発現させ、精製した抗体を、ＩＨＣアッセイにおいて、ネクチン４を発現するヒト異種移植組織を特異的に染色する、それらの能力についてさらに査定した。
例えば、２つの抗ネクチン４マウスモノクローナル抗体である、Ｍ２２－２４４ｂ３．１．１．１及びＭ２２－３２１ｂ４１．１（それぞれ、ＩｇＧ１アイソタイプ及びＩｇＧ２ａアイソタイプ）を、ＩＨＣアッセイにおいて調べた。Ｍ２２－２４４ｂ３．１．１．１及びＭ２２－３２１ｂ４１．１抗体を、リン酸緩衝生理食塩液、ｐＨ７．４中に、１．５４ｍｇ／ｍＬ及び１．３ｍｇ／ｍＬで用意した。陰性対照として、マウス骨髄腫に由来する、市販のマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（クローン：ＵＰＣ１０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）であって、β－２，６－フルクトサンに対して惹起され、ヒトネクチン４又は他の哺乳動物抗原に結合しない、上記アイソタイプ対照を使用した。
ＩＨＣ染色は、以下の例示的プロトコールに従い実施した。略述すると、ＩＨＣアッセイにおいて、間接的ＩＨＣ技法を使用して、ネクチン４を検出した。試料を、１０％の緩衝中性ホルマリン中で固定し、加工し、パラフィン蝋へと包埋し、４μｍの組織切片として調製した。脱パラフィン化及び再水和の後、切片を、抗原賦活化のために処理した。ネクチン４内の抗原エピトープは、例えば、一般に、熱誘導型エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）手順と称する、水性培地中の組織切片への熱の適用により賦活化させた。例えば、ネクチン４内の抗原エピトープは、Ｌｅｉｃａ製の自動式プラットフォーム上、１００℃で、２０分間にわたり、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ２（ＥＲ２；ｐＨ８．９～９．１のＥＤＴＡベースの緩衝液）を適用することにより賦活化させた。次いで、抗原賦活化の後における組織切片を、マウス一次抗体である、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１、Ｍ２２－２４４ｂ３．１．１．１、又はＩｇＧ２ａ（抗体対照）と共にインキュベートした。一次抗体と結合した組織切片を、洗浄し、酵素標識化二次抗体、例えば、ペルオキシダーゼ標識化二次抗体により検出した。例えば、反応部位において、褐色の沈殿物をもたらす、ペルオキシダーゼと、色原体である、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）との反応を使用しうる、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｒｅｆｉｎｅポリマー検出システムを使用して、結合した二次抗体を発色させた。次いで、例えば、Ａｐｅｒｉｏ ＳｃａｎＳｃｏｐｅ ＣＳ（Ａｐｅｒｉｏ、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）を使用して、染色された組織切片を、走査し、イメージングし、光学顕微鏡により査定した。
組織切片内の、ネクチン４の発現レベルを、抗体染色のレベルにより評価するために、染色された組織切片を、ＩＨＣ染色の強度及びがん細胞の陽性度の比に従い、評価し、査定し、異なるカテゴリー又はスコアへとカテゴリー化し、記録した。カテゴリーは、強い（「３」又は「３＋」と互換的である）、中程度（「２」又は「２＋」と互換的である）、及び弱い（「１」又は「１＋」と互換的である）を含む。特異的染色の欠如は、陰性（「０」又は「－」と互換的である）として記録した。
ネクチン４ ｍＲＮＡの発現レベルが既知である、多様な由来、例えば、膀胱、乳腺、卵巣、膵臓、腎臓、皮膚、肺、及び結腸からのヒト異種移植がん組織について調べた。ｑＰＣＲを使用して、これらの例示的なヒト異種移植組織内のネクチン４ ｍＲＮＡのレベルを、まず、評価し、表５に示す。
Figure 0007168590000016
抗体に適正な染色濃度を見出すために、表５に列挙された、例示的な異種移植組織を、上記で記載した通りに、ＩＨＣ染色アッセイにおいて使用して、抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１及びＭ２２－２４４ｂ３．１．１．１を、まず、２．５μｇ／ｍＬ、５．０μｇ／ｍＬ、及び７．５μｇ／ｍＬにおいて滴定した。結果を、表６に示した。
Figure 0007168590000017
抗ネクチン４抗体のＩＨＣ染色に最適の濃度は、抗ネクチン４抗体ＩＨＣ染色が、ネクチン４ ｍＲＮＡを発現する組織内では観察されたが、ネクチン４陰性組織内では観察されなかった濃度で決定した。２．５μｇ／ｍＬでは、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１抗体及びＭ２２－２４４ｂ３．１．１．１抗体のいずれも、ネクチン４ ｍＲＮＡについて陽性のヒト異種移植組織内の陽性染色を示し（図１及び図２）、陰性対照組織内の、最小のバックグラウンド染色を示した。表６と、表７における詳細な染色結果とは、２．５μｇ／ｍＬの濃度が、両方の抗体について、例示的な最適濃度であったことを指し示す。
Figure 0007168590000018
Figure 0007168590000019
Figure 0007168590000020
２．５μｇ／ｍＬのＭ２２－３２１ｂ４１．１抗体が、ネクチン４ ｍＲＮＡ陰性組織である、ＡＧ－Ｋ２４内及びＭＤＡＭＢ－２３１－ＭＦＰ－ＸＣＬ内の染色をもたらさなかった（図３及び図５）のに対し；Ｍ２２－２４４ｂ３．１．１．１は、ネクチン４ ｍＲＮＡ陰性異種移植がん細胞である、ＡＧ－Ｋ２４内（図４）及びＭＤＡＭＢ－２３１－ＭＦＰ－ＸＣＬ内（図６）の、非特異的染色を示した。マウスＩｇＧ２ａ陰性対照抗体と共にインキュベートされた切片内では、染色が見られなかった（図７）。したがって、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１は、ネクチン４ ｍＲＮＡを発現する組織を、特異的に染色し、ネクチン４ ｍＲＮＡを発現しない組織については、染色をもたらさないか、又はアイソタイプのＩｇＧ対照と同程度に低度の染色をもたらした。
Ｍ２２－３２１ｂ４１．１の特異性を、表８に示される、陽性対照組織及び陰性対照組織の拡大パネルにおいて、さらに調べた。結果は、２．５μｇ／ｍＬにおける抗体が、ネクチン４ ｍＲＮＡを発現する組織及び細胞であって、ＡＧ－Ｂ１、ＡＧ－ＵＴ５、ＡＧ－Ｌ１６（図８）、ＡＧ－Ｂｒ２９、ＡＧ－Ｂ１１（図９）、ＡＧ－ＯＶ３５、ＡＧ－Ｐａｎｃ３、ＡＧ－Ｃ１６、ＡＧ－Ｃ６、Ｒａｔ１（Ｅ）－ネクチン４、及びＴ４７Ｄを含む組織及び細胞に特異的であることを示した。結果はまた、抗体が、ネクチン４ ｍＲＮＡを発現しない組織及び細胞であって、ＡＧ－Ｋ２４（図３）、ＡＧ－Ｍｅｌ１０、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＭＦＰＸＣＬ（図５）、ＡＧ－Ｍｅｌ５、ＡＧ－Ｋ３１、ＣＡＬＵ－１、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＵＧ－Ｋ３、Ｒａｔ１（Ｅ）－ｎｅｏ、Ｒａｔ１（Ｅ）－ネクチン１、Ｒａｔ１（Ｅ）－ネクチン２、Ｒａｔ１（Ｅ）－ネクチン３、ＪＭＳＵ－１、Ｈｅｐ３Ｂ、及びＡＣＨＮを含む組織及び細胞について陰性であることも示した。これらの知見は、本例における全ての被験組織及び被験細胞について、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１は、ネクチン４ ｍＲＮＡを発現する組織及び細胞を陽性染色し、ネクチン４ ｍＲＮＡを発現しない組織及び細胞を陰性染色した（表８及び表９）ため、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１が、ＩＨＣアッセイにおいて、ネクチン４に特異的であることを裏付けた。
Figure 0007168590000021
Figure 0007168590000022
Figure 0007168590000023
上記で記載した通りに作出され、スクリーニングされた抗ネクチン４抗体を、ＩＨＣアッセイにおいて、他の市販の抗ネクチン４抗体とさらに比較した。例えば、ウサギポリクローナル抗ネクチン４抗体である、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（型番：ＮＢＰ１－８２８２９）製のネクチン４／ＰＶＲＬ４抗体（「Ｎｏｖｕｓ製ＰＶＲＬ４抗体」と称する）を得、ネクチン４ ｍＲＮＡレベルが、ｑＰＣＲにより決定されている、多様な異種移植組織内のＩＨＣアッセイにおいて、ネクチン４を特異的に染色する、その能力について調べた。Ｎｏｖｕｓ製ＰＶＲＬ４抗体を、２μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、及び０．５μｇ／ｍｌにおいて滴定した実験において、Ｎｏｖｕｓ製ＰＶＲＬ４抗体は、Ｍ２２－２４４ｂ３．１．１．１．１抗体によりもたらされる特異的ネクチン４染色より弱い、特異的ネクチン４染色をもたらし、表１０に示される通り、ネクチン４ ｍＲＮＡを発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ｘｅｎｏ内に、全ての濃度で、非特異的染色をもたらした。したがって、Ｎｏｖｕｓ製ＰＶＲＬ４抗体は、ネクチン４について非特異的であった。
Figure 0007168590000024
Ｎｏｖｕｓ製ＰＶＲＬ４抗体を、ネクチン４ ｍＲＮＡレベルが、ｑＰＣＲにより決定されている、広範な組織パネルに対するＩＨＣアッセイにおいてさらに調べた。表１１に示される通り、ネクチン４ ｍＲＮＡレベルに関わらず、被験異種移植片の大部分において、バックグラウンドの細胞質染色を観察した。
Figure 0007168590000025
Ｎｏｖｕｓ製ＰＶＲＬ４抗体は、ロット間の潜在的なばらつきを伴う、枯渇性のウサギポリクローナル抗体であるので、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製の、異なるウサギポリクローナル抗ネクチン４抗体である、ＰＡ５－３０８３７（「Ｔｈｅｒｍｏ ＰＶＲＬ４抗体」とする）、を得、ネクチン４ ｍＲＮＡレベルが、ｑＰＣＲにより決定されている、３つの異なる異種移植組織内のＩＨＣアッセイにおいて、調べ、比較した。３つの被験異種移植組織は、ネクチン４ ｍＲＮＡレベルを４７８とするＡＧ－Ｂ１（＋）ＰＳ２６、ネクチン４ ｍＲＮＡレベルを７８とするＡＧ－ＯＶ３５Ｐ３、及びネクチン４ ｍＲＮＡを発現しないＡＧ－Ｍｅｌ５ Ｐ１７を含んだ。Ｔｈｅｒｍｏ ＰＶＲＬ４抗体は、ＡＧ－Ｂ１内の、弱い／中程度のＩＨＣ染色と、ＡＧ－ＯＶ３５内の、陰性ＩＨＣ染色とをもたらした。
したがって、Ｎｏｖｕｓ製ＰＶＲＬ４抗体も、Ｔｈｅｒｍｏ ＰＶＲＬ４抗体も、本明細書で作出され、スクリーニングされるＭ２２－２４４ｂ３．１．１．１．１又はＭ２２－３２１ｂ４１．１抗体ほど、ＩＨＣアッセイにおいて、ネクチン４に対して特異的ではなかった。
いずれもＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製である、他の２つの市販抗体（マウス抗ネクチン４モノクローナル抗体であるＭＡＢ２６５９、及びヤギポリクローナル抗ネクチン４抗体であるＡＦ２６５９）もまた、得、ネクチン４ ｍＲＮＡレベルが、ｑＰＣＲにより決定されている、３つの異なる異種移植組織内のＩＨＣアッセイにおいて調べた。３つの被験異種移植組織は、ネクチン４ ｍＲＮＡレベルを４７８とするＡＧ－Ｂ１（＋）ＰＳ２６、ネクチン４ ｍＲＮＡレベルを７８とするＡＧ－ＯＶ３５Ｐ３、及びネクチン４ ｍＲＮＡを伴わないＡＧ－Ｍｅｌ５ Ｐ１７を含んだ。１μｇ／ｍｌ又は５μｇ／ｍｌで使用された場合のＭＡＢ２６５９抗体は、ＡＧ－Ｂ１内及びＡＧ－ＯＶ３５内の腫瘍の周縁部において、くすんだ斑点状／細胞質様の染色をもたらした。ヤギポリクローナル抗ネクチン４抗体であるＡＦ２６５９は、５μｇ／ｍｌでは、ＡＧ－Ｂ１内及びＡＧ－ＯＶ３５内で、バックグラウンドの間質染色を伴う、強い膜性染色をもたらしたが、１μｇ／ｍｌでは、弱い染色をもたらした。したがって、ＡＦ２６５９抗体を、他の組織内、２．５μｇ／ｍｌでも、さらに査定した。しかし、ＡＦ２６５９抗体は、ネクチン４ ｍＲＮＡを発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１異種移植片内でも、バックグラウンド染色をもたらした。したがって、ＭＡＢ２６５９抗体も、ＡＦ２６５９抗体も、本明細書で作出され、スクリーニングされるＭ２２－３２１ｂ４１．１抗体ほど、特異的ではなかった。
（例６）
機能的アッセイ：一次組織の免疫組織化学染色
例えば、本明細書の例において記載される通りに、作出され、スクリーニングされ、発現させ、精製された抗体、例えば、抗ネクチン４ Ｍ２２－３２１ｂ４１．１を、ＩＨＣアッセイにおいて、ネクチン４を発現する一次ヒト組織を特異的に染色するそれらの能力について、さらに査定した。
ＩＨＣアッセイは、例えば、間接的ＩＨＣ技法を使用して実施した。間接的ＩＨＣ方法は、組織抗原を検出するために、２つの抗体を利用した。まず、非コンジュゲート一次抗体を、組織（第１層）へと適用し、組織抗原と反応させた。次に、一次抗体が惹起された動物種のＩｇＧを指向する、酵素標識化二次抗体を適用した（第２層）。二次抗体を、一次抗体と反応させるのに続き、色原体である基質を適用した。第２層抗体を、酵素ペルオキシダーゼで標識化し、これを、色原体である３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と反応させて、反応部位において、褐色の沈殿物をもたらした。この方法は、一次抗体上の、異なる抗原性部位との、いくつかの二次抗体反応を介する、潜在的なシグナル増幅に起因して、高感度且つ多目的な方法である。
試験の感度をさらに増大させるための例として述べると、標識化鎖ポリマーコンジュゲート二次抗体を使用した。ポリマー技術は、最大で１０分子の二次抗体を接合させた、デキストランのＨＲＰ酵素標識化不活性「スパイン」分子を利用し、システムを、なおより高感度とした。
次いで、検体を対比染色して、細胞要素及び細胞内要素を同定した。
６．Ａ．染色手順
ＩＨＣアッセイは、以下の例示的プロトコールに従い実施した。略述すると、組織試料を、固定し、加工し、パラフィン蝋へと包埋し、組織切片として調製した。次いで、スライドを、オーブン内、６０±５℃で、１～２時間にわたりインキュベートし、オーブンから取り出し、先に進む前に、室温（ＲＴ）へと冷却した。組織試料に対する、規定の脱パラフィン化及び再水和の後、抗原賦活化を実施して、ホルマリン固定後に生じたタンパク質架橋を元に戻した。抗原賦活化は、プロテアーゼ溶液中の、組織のタンパク質分解性消化を介して、又は一般に、ＨＩＥＲ手順と称する、水性培地への組織切片への熱適用を介して達成した。このアッセイのために、Ｌｅｉｃａ製の自動式プラットフォーム上、１００℃で、２０分間にわたり、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ２（ＥＲ２；ｐＨ８．９～９．１のＥＤＴＡベースの緩衝液）を使用した。
そうでないことが指定されない限り、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒを、ＲＴで使用して、Ｂｏｎｄ製の計器上でなされるように、染色をプログラムした。略述すると、以下のステップ：（１）Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ２手順（ＥＲ２）：１００℃で、２０分間にわたる（Ｂｏｎｄ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２（Ｌｅｉｃａ）、型番：ＡＲ９６４０）；（２）３回にわたるＢｏｎｄ Ｗａｓｈ：０分間（Ｂｏｎｄ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｅｉｃａ）、型番：ＡＲ９５９０）；（３）マーカー：１５分間（Ｂｏｎｄ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｌｅｉｃａ）、型番：ＡＲ９３５２中の、マウスモノクローナル抗ネクチン４抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１又は陰性対照マウスＩｇＧ２ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）型番：５５０３３９による染色）；（４）３回にわたるＢｏｎｄ Ｗａｓｈ：０分間（Ｂｏｎｄ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｅｉｃａ）、型番：ＡＲ９５９０）；（５）一次後：８分間（ウサギ抗マウスＩｇＧ２ａ）；（６）３回にわたるＢｏｎｄ Ｗａｓｈ：２分間（Ｂｏｎｄ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｅｉｃａ）、型番：ＡＲ９５９０）；（７）ポリマー：８分間（Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（Ｌｅｉｃａ）、型番：ＤＳ９８００からの、抗ウサギポリＨＲＰ－ＩｇＧ）；（８）２回にわたるＢｏｎｄ Ｗａｓｈ：０分間、２分間；（９）１回にわたる脱塩水：０分間；（１０）Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｂｌｏｃｋ：５分間（３～４％の過酸化水素）及び３回にわたるＢｏｎｄ Ｗａｓｈ：０分間；（１１）２回にわたる脱塩水：０分間；（１２）Ｍｉｘｅｄ ＤＡＢ ｒｅｆｉｎｅ：０分間（Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（Ｌｅｉｃａ）、型番：ＤＳ９８００からの、６６ｍＭの３，３－ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド及び≦０．１％の過酸化水素）；（１３）Ｍｉｘｅｄ ＤＡＢ ｒｅｆｉｎｅ：１０分間（Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（Ｌｅｉｃａ）、型番：ＤＳ９８００からの、６６ｍＭの３，３－ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド及び≦０．１％の過酸化水素）；（１４）３回にわたる脱塩水：０分間；（１５）ヘマトキシリン：１５分間（Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（Ｌｅｉｃａ）、型番：ＤＳ９８００からの、＜０．１％のヘマトキシリン）；（１６）１回にわたる脱塩水：０分間；（１７）１回にわたるＢｏｎｄ Ｗａｓｈ：０分間；（１８）１回にわたる脱塩水：０分間を、染色プロトコールとして、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒへとプログラムした。手順において指し示した通り、陰性試薬対照である、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のマウスＩｇＧ２ａを、各検体試験のために使用して、非特異的（バックグラウンド）染色の存在について査定した。バックグラウンド染色の存在はまた、特定のアッセイ試行の許容／棄却のための基準でもあった。
６．Ｂ 組織試料
陽性対照検体及び陰性対照検体を利用して、ＩＨＣ解析の全てのステップをバリデートし、制御した。このアッセイのために、可変レベルのネクチン４の発現を伴う、マウスへのヒト腫瘍異種移植片を、対照として使用した。
ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト組織検体を、施設内治験審査委員会に承認された供給源、例えば、政府のリポジトリー（例えば、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ）、学術提携（例えば、ＵＣＬＡ、ＵＣ Ｉｒｖｉｎｅ）、並びに例えば、ヒト正常尿路上皮組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）及び移行上皮癌（ＢＬ８０２）及び正常（ＦＤＡ９９９）組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）、Ｂｉｏｍａｘ ＵＳＡを含む市販の供給源からの、手術に由来する残余材料又は剖検として得た。例６．Ａに記載したプロトコールを使用して、組織試料を、ネクチン４の発現について調べた。ネクチン４の発現についての、陰性（Ｘ１４－１２６）１例の、弱い陽性（Ｘ１４－３３）１例、中程度の陽性（Ｘ１４－１３９）１例、及び強い陽性（Ｘ１４－４３）１例を含む、４例のマウスヒト腫瘍異種移植片についてもまた調べた。
６．Ｃ 抗ネクチン４抗体の染色濃度の滴定
最適の一次抗体力価は、例えば、例４及び５で記載したプロトコールを使用して、異種移植組織切片に対して、滴定解析を実施することにより決定した。パラフィン包埋検体についての滴定解析は、ＩＨＣアッセイに最適の抗体濃度を決定する取組みの中で実施した。滴定解析を実施するために、例５で決定した最適の濃度（２．５μｇ／ｍｌ）を含む、２倍の系列希釈液を調製し、マッチさせた、それらの陰性対照組織切片について調べた。
例４及び５において言明した、パラフィン包埋検体に適切なＩＨＣプロトコールに従い、抗ネクチン４抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１と、その対応する陰性対照抗体とを、組織切片へと適用した。結果は、病理研究医が、光学顕微鏡を使用して、査定及び比較した。病理研究医は、最適の力価（最適の抗体濃度）を、著明なバックグラウンド染色を伴わずに、最高の染色強度をもたらした、最低の力価（最低の抗体濃度）として決定した。この例では、表１２により示される通り、２．５μｇ／ｍｌの抗体濃度を選択し、その後のＩＨＣアッセイにおいて使用した。
Figure 0007168590000026
６．Ｄ．ネクチン４のＩＨＣ染色についての評価
ＩＨＣ染色についての評価は、委員会により認定された病理医が実施した。染色強度を評価し、０（陰性）、１＋（弱い）、２＋（中程度の）、及び３＋（強い）として報告した。各強度レベル又は陽性染色された細胞全体における細胞染色の近似的百分率を評価し、０～１００％において報告した。
組織間で染色を比較するために、ネクチン４染色評価の多様なパラメーターを、直接比較するか、又はネクチン４染色の結果を、さらに加工した、例えば、染色強度、及び具体的な強度範囲で染色された細胞の百分率の両方について検討する、Ｈスコアとして計算した。例えば、Ｈスコアは、所与の染色強度（０～１００）で染色された細胞の百分率と、染色強度（０～３）との積を足し合わせることにより計算した。例えば、１０％の細胞染色３＋、３０％の細胞染色２＋、２０％の細胞染色１＋、及び４０％の細胞非染色を伴う検体であれば、（３×１０）＋（２×３０）＋（１×２０）＋（０×４０）＝１１０のＨスコアを有するであろう。
変動係数（ＣＶ）を使用して、Ｈスコアの試行内変動又は精度を評価した。アッセイの性能についての試行内精度は、３例の陽性異種移植片検体を利用する、５回の個別の試行から決定した。定性的に、試行内精度は、一般に、３回の個別の試行における、各組織試験の、一貫した染色パターンにより、許容可能と考えた。ＣＶは、以下：
ＣＶ＝標準偏差／平均値×１００
の通りに計算した。
例えば、３５％未満であるか、又はこれと等しいＣＶを、許容可能と考えた。
試行内精度評価についての表１３に示される通り、染色強度のパターン（３＋、２＋、１＋の組合せ）は、各組織について、５連にわたり一貫した。さらに、全組織についてのＣＶは、例示的な許容範囲内である、３５％未満であった。したがって、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１は、ネクチン４ＩＨＣアッセイにおける、ネクチン４の検出についての精度をもたらした。
Figure 0007168590000027
Figure 0007168590000028
アッセイの性能についての試行内再現性は、精度アッセイのための検体と同じ異種移植片検体を利用する、５回の個別の試行から決定した。定性的に、試行内精度は、一般に、５回の個別の試行における、各組織試験の、一貫した染色パターンにより、許容可能と考えた。試行内再現性についての表１４に示される通り、染色強度のパターン（３＋、２＋、１＋の組合せ）は、各組織について、３連にわたり一貫した。さらに、全ての組織についてのＣＶは、例示的な許容範囲内である、３５％未満であった。したがって、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１は、ネクチン４ＩＨＣアッセイにおける、ネクチン４の検出についての再現性をもたらした。
Figure 0007168590000029
Figure 0007168590000030
６．Ａ～６．Ｄにより提示したパラメーター及び結果を、以下の表１５：
Figure 0007168590000031
にまとめる。
６．Ｅ ネクチン４のＩＨＣ染色についての感度及び特異度
例えば、それが、ネクチン４抗原を発現した組織を、陽性染色した場合、ネクチン４ ＩＨＣアッセイを、高感度と考えた。例えば、多様な組織型にわたり、示差的染色を観察し、ネクチン４ ＩＨＣ染色が、染色された組織内の、ネクチン４抗原の、既知の発現と相関する場合、ネクチン４ ＩＨＣアッセイを、特異的と考えた。特異度及び感度についての評価は、相互に排他的ではなかったので、アッセイは、しばしば、感度及び特異度の両方についての情報をもたらした。
Ｍ２２－３２１ｂ４１．１によるネクチン４ ＩＨＣアッセイの感度及び特異度は、膀胱癌の固有のコア６０例及び正常尿路上皮組織２０例、マウスへのヒト腫瘍異種移植片４例、並びに膀胱、肺、及び乳腺を含む、多様な癌腫についての、ヒト全組織切片（ＷＴＳ）１３例からなるＴＭＡにより決定した。ＩＨＣアッセイにおけるネクチン４染色に関する、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１抗体の感度及び特異性についての概要を、下記の表１６及び表１７に列挙する。これらの例示的アッセイ及び他の一部の例示的アッセイでは、組織試料を、それらのＨスコアの結果により、４つのカテゴリー：高（２０１～３００）、中程度（１０１～２００）、低（１～１００）、陰性（０）のうちの１つへと分けた。
Figure 0007168590000032
Figure 0007168590000033
Ｍ２２－３２１ｂ４１．１の特異度及び感度を評価するための、一部の例示的アッセイでは、１３例のＷＴＳ癌腫についての、それぞれ、２．５μｇ／ｍｌの、ネクチン４に特異的であることが既知であるＸ抗体、又は抗ネクチン４抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１による染色からのＨスコアを比較した。下記の表１８に示される比較は、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１によるＩＨＣ染色が、大部分の検体例において、Ｘ抗体の染色により示される、既知のネクチン４発現と符合することを指し示した。
Figure 0007168590000034
上記の表１８からの結果を、陽性ネクチン４染色及び陰性ネクチン４染色へと再分類して、Ｘ抗体と、抗ネクチン４抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１との間の、染色の陽性度の相関を決定した。それが≧１５０のＨスコアを示した場合に、組織を陽性と考えた。下記の表１９における全体的知見は、陽性染色された組織についての、Ｘ抗体と、抗ネクチン４抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１との一致の百分率８９％、陰性染色された組織についての一致率１００％、及び全体の一致率９４％を示した。したがって、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１によるネクチン４ ＩＨＣ染色と、組織内のネクチン４の発現との間には、高度の相関がみられる。したがって、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１によるネクチン４ ＩＨＣアッセイは、高感度であり、且つ、特異的である。
Figure 0007168590000035
膀胱癌の固有のコア６０例及び正常尿路上皮組織２０例、マウスへのヒト腫瘍異種移植片４例、並びに膀胱、肺、及び乳腺を含む、多様な癌腫についての、ヒト全組織切片（ＷＴＳ）１３例からなるＴＭＡを含む、組織試料の大型のセットを使用して、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１の特異度及び感度を、さらに決定した。合計９４例の検体例は、Ｘ抗体を用いるＩＨＣアッセイによる検体例のうちの９５％（ＷＴＳ中の８２％及びＴＭＡ中の９８％）における、ネクチン４の全般的検出について査定可能であった。Ｍ２２－３２１ｂ４１．１による、癌腫の、代表的なＩＨＣ染色を、図１０及び１１に示す。細胞内局在化は、大半が膜及び細胞質における局在化であり、一部の頂端部染色も、膜への局在化であると考えた。Ｍ２２－３２１ｂ４１．１による、腫瘍検体内の陽性染色の百分率が、Ｘ抗体を用いるＩＨＣアッセイによりもたらされる、癌腫内の、既知のネクチン４発現と符合したため、表２０における結果は、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１によるネクチン４ ＩＨＣアッセイの感度及び特異度をさらに裏付けた。したがって、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１によるネクチン４ ＩＨＣアッセイは、高感度であり、且つ、特異的であった。
Figure 0007168590000036
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Ｍ２２－３２１ｂ４１．１の特異度及び感度を、ＦＤＡ９９９ｄにおいて、三連で含有された、全３３例の正常ヒト検体からさらに決定した。表２１に示す通り、抗ネクチン４抗体であるＭ２２－３２１ｂ４１．１によるＩＨＣ染色は、正常乳腺が、部分的、且つ、弱い～中程度の免疫反応性を示したことを除き、文献（Ｒａｂｅｔら、２０１６）において報告されている、正常細胞内のネクチン４の発現と符合した。赤血球は、ネクチン４について、中程度～強い強度で、染色された。扁平上皮は、強く染色されたが、基底層は、陰性であった。
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したがって、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１に基づく、ネクチン４の発現についてのＩＨＣアッセイは、ネクチン４の発現について、高感度及び特異的である。Ｍ２２－３２１ｂ４１．１を用いるＩＨＣアッセイは、優れた精度及び再現性を示した。
（例７）
機能的アッセイ：免疫ブロット法
ｍＡｂである、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１の、機能的な特性及び特異性を、免疫ブロット、例えば、ウェスタンブロット法においてさらに査定した。略述すると、多様なネクチン４ ｍＲＮＡ陽性試料及びネクチン４ ｍＲＮＡ陰性試料から調製されたタンパク質溶解物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロース膜へと転写し、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１でプロービングした。抗ヒトＧＡＰＤＨ抗体を、適切且つ同等な量の全細胞溶解物が、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの各ゲルレーン内で分離されることを確認するためのローディング対照として使用した。図１２Ａにおいて示す通り、Ｍ２２－３２１ｂ１．１は、約５８～６０ｋＤａの特異的バンドを認識してブロッティングを生じ、これは、ネクチン４を過剰発現するように操作された、ネクチン４－ｍＲＮＡ陽性の、ＮＣＩ Ｈ３２２Ｍ細胞、ＡＧ－Ｂ１細胞、及びＲａｔ１（Ｅ）細胞の溶解物中で予測されるヒトネクチン４分子量と符合した。ＡＧ－Ｂ１異種移植片試料中のほか、ＮＣＩ Ｈ３２２Ｍ細胞系では、小サイズのネクチン４切断産物が観察されたことは、報告されているネクチン４の切断と符合した（Ｂｕｃｈａｎａｎら、２０１７）。ネクチン４ ｍＲＮＡ陰性である、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞内及びＲａｔ１（Ｅ）－Ｎｅｏ細胞内では、バンドが検出されなかった。図１２ＢにおけるＦＡＣＳにより示される通り、操作Ｒａｔ１（Ｅ）細胞は、全てのネクチンファミリーメンバー（ネクチン１～４）を、高度に発現したが、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１はまた、ウェスタンブロット法において、操作Ｒａｔ１（Ｅ）細胞が過剰発現したネクチン１、ネクチン２、及びネクチン３のいずれも検出しなかった。したがって、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１は、免疫ブロットアッセイにおいて、ネクチン４を、特異的に検出した。
（例８）
エピトープマッピング
Ｍ２２－３２１ｂ４１．１抗体により認識される、ネクチン４上のエピトープを、さらにマッピングするために、多様なネクチン４の断片を、クローニングし、細胞に、これらをトランスフェクトし、細胞内で発現させた。多様なネクチン４断片を発現する細胞を培養し、ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させた。ＢＳＡ標準物質を使用して、ＲＩＰＡ溶解物の全タンパク質濃度を定量化し、合計２０μｇの還元（５０ｍＭのＴＣＥＰ）溶解物を、１倍濃度のＭＥＳランニング緩衝液中に、４～１２％のＢＴによる１５レーンゲル上のＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、Ｉ－Ｂｌｏｔにより、ニトロセルロース膜へと転写し、ＬＩ－ＣＯＲブロッキング緩衝液によりブロッキングし、１：１のＬＩ－ＣＯＲブロッキング緩衝液中に、２μｇ／ｍｌのＭ２２－３２１ｂ４１．１抗体でプロービングした。希釈率１：１００００のα－ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｈｉｃｋｅｎ ｐＡｂ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、使用して、ローディング対照としてのＧＡＰＤＨを検出した。次いで、タンパク質に結合した抗体のバンドを、希釈率１：５０００の、ＩＲＤｙｅ ６８０（Ｏｄｙｓｓｅｙ）とコンジュゲートさせたヤギ抗マウス抗体、又は１：５０００の、ＩＲＤｙｅ ８００（Ｏｄｙｓｓｅｙ）とコンジュゲートさせたロバ抗α－Ｃｈｉｃｋｅｎにより検出し、Ｏｄｙｓｓｅｙシステムにより視覚化した。Ｍ２２－３２１ｂ４１．１抗体は、ネクチン４断片Ｖ（アミノ酸残基１～１５０）（図１３）を認識した。したがって、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１抗体は、ヒトネクチン４のアミノ酸残基１～１５０（配列番号４５）に位置するエピトープを認識した。さらに、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１抗体を、例１、２、及び３に示した、ヒトネクチン４のアミノ酸残基３１～３４６（配列番号２）のネクチン４断片に対して作出したため、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１抗体は、ヒトネクチン４のアミノ酸残基３１～１５０（配列番号４６）（断片１～１５０と、断片３１～３４６との重複領域）に位置するエピトープも認識しうる。
（例９）
ネクチン４ ＩＨＣアッセイの診断的使用及び予後診断的使用
Ｍ２２－３２１ｂ４１．１抗体によるＩＨＣ染色を使用して、ネクチン４の発現を、まず、正常組織試料中で検討した。ばらつきはあるが、大半が弱いか又は中程度の、ネクチン４の発現を、皮膚（表皮、汗腺、及び毛包）、膀胱の移行上皮、唾液腺（管）、食道、乳腺、及び胃において検出した。次いで、ネクチン４の発現を、多様ながんと相関させるため、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１抗体によるＩＨＣ染色を使用して、ネクチン４の発現を、多様な腫瘍検体中で検討した。ネクチン４は、膀胱がん内で高度に発現し、乳がん、膵臓がん、肺がん、及び卵巣がんの組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）では、より中程度の発現を示した。同じＩＨＣアッセイを使用する、ネクチン４の発現と、膀胱がんとの相関についての検討は、ＴＭＡ上の膀胱がんのうちの８３％（５２４例中４３４例）が、陽性であり、６０％が、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１のＩＨＣ染色により、強く、又は中程度に染色されることを明らかにした。
次いで、例えば、以下の基準：（１）組織学的に確認された、転移性の悪性充実性腫瘍（肉腫を除外する）であって、耐性であるか、又は再発した、転移性の悪性充実性腫瘍を有すること；（２）ネクチン４の発現について陽性であり、１５０と等しいか、又はこれを超える、ネクチン４ ＩＨＣＨスコアを有する腫瘍を有すること；（３）転移性疾患のための、少なくとも１つの、以前の化学療法レジメンで失敗していること（シスプラチンベースの化学療法に不適合であると考えられる場合、尿路上皮がん及び膀胱がんの対象は、以前の化学療法レジメンで失敗していることは要求されない）（Ｇａｌｓｋｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２９巻、１７号、２４３２～２４３８（２０１１））；（４）最近の全身処置が、治験免疫療法薬であった場合に、疾患の進行が記録されていること；（５）Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータスが、０又は１であること；（７）ＲＥＣＩＳＴ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．１）に従い測定可能な疾患を有すること（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、４５（２）：２２８～２４７（２００９））を満たす患者における、がん治療に対する応答について調べることにより、患者が、抗がん治療（例えば、細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤へとコンジュゲートさせた抗ネクチン４を使用する抗がん治療）に対して応答性となるのかどうかの予測における、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１のＩＨＣ染色により決定される、患者組織内の、ネクチン４の発現の有効性について査定した。Ｍ２２－３２１ｂ４１．１抗体を用いるＩＨＣアッセイを使用して、合計１８４例の臨床試験検体を、それらのネクチン４発現について検討し；検討された１８４例の検体のうち、１８０例（９８％）の臨床試験検体は、０を超えるＨスコアを有し；１７１例（９３％）は、中程度～高ネクチン４発現（Ｈスコア≧１５０）を有した。全体で、４４例の臨床対象が、組入れ基準に合致した。これらの４４例の患者における腫瘍部位及び／又は転移部位を、表２２に列挙する。
Figure 0007168590000049
中程度～高ネクチン４発現（Ｈスコア≧１５０）を有した、これらの４４例の患者に、微小管破壊剤であるモノメチルアウリスタチンＥへとコンジュゲートさせた、完全ヒト抗ネクチン４抗体（ＩｇＧ１κ）を含む抗がん治療剤を投与した。全ての対象は、疾患の進行、処置に対する非忍容性、治験責任医師による決定、又は同意文書の取下げが生じるまで、抗ネクチン４ ＡＤＣの、毎週１回、３０分間で、４週間ごとのサイクルのうちの３週間にわたる（例えば、１、８、及び１５日目における）、ＩＶ注入を施された。投与される用量は、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び１．２５ｍｇ／ｋｇを含んだ。患者における疾患応答は、８週間（±７日間）ごとに１回、ＲＥＣＩＳＴ ｖｅｒｓｉｏｎ １．１に従い、治験責任医師が評価した（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、４５（２）：２２８～２４７（２００９）において記載されているＲＥＣＩＳＴ）。合計３６例の対象が、査定されうる結果をもたらした。
抗ネクチン４ ＡＤＣは、全てが、ネクチン４を発現する腫瘍を有する、処置される患者において、抗腫瘍活性をもたらした。３６例中１０例の患者が、部分寛解を示し、２７．８％の奏効率（奏効としてカウントされる、部分寛解又は完全寛解の両方）を示した。抗ネクチン４ ＡＤＣはまた、肝転移を伴う、１０例中４例の対象（４０％の奏効率）、及びかつてチェックポイント阻害剤で処置された、１２例中３例の患者（２５％の奏効率）における抗腫瘍活性ももたらした。
したがって、抗ネクチン４ ＡＤＣは、ネクチン４を発現する腫瘍を有する患者において、抗腫瘍活性をもたらした。
（例１０）
ネクチン４ ＩＨＣアッセイの診断的使用及び予後診断的使用（異なるコホート）
次いで、例えば、以下の基準：（１）尿路上皮がんを含む、組織学的に確認された、転移性の悪性充実性腫瘍を有すること；（２）ネクチン４の発現について陽性であり、１５０と等しいか、又はこれを超える、ネクチン４ ＩＨＣＨスコアを有する腫瘍を有すること；（３）転移性疾患及び／又はシスプラチンベースの化学療法に不適合であった尿路上皮がん対象のための、１つ又は１つを超える、以前の化学療法で失敗していること（Ｇａｌｓｋｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２９巻、１７号、２４３２～２４３８（２０１１））；（４）研究の直前において、免疫チェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）で処置された対象について、疾患の進行が記録されていること；（５）Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータスが、０又は１であること；（７）ＲＥＣＩＳＴ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．１）に従い測定可能な疾患を有すること（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、４５（２）：２２８～２４７（２００９））を満たす患者の異なるコホートにおける、がん治療に対する応答について調べることにより、患者が、抗がん治療（例えば、細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤へとコンジュゲートさせた抗ネクチン４を使用する抗がん治療）に対して応答性となるのかどうかの予測における、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１のＩＨＣ染色により決定される、患者組織内の、ネクチン４の発現の有効性ついて査定した。Ｍ２２－３２１ｂ４１．１抗体を用いるＩＨＣアッセイを使用して、合計２９５例の臨床試験検体を、それらのネクチン４発現について検討し；検討された２９５例の検体のうち、２７８例（９４％）の臨床試験検体は、１と等しいか、又はこれを超えるＨスコアを有し；２４５例（８３％）は、中程度～高ネクチン４発現（Ｈスコア≧１５０）を有した。全体で、５８例の臨床対象が、組入れ基準に合致した。これらの５８例の患者における腫瘍部位及び／又は転移部位を、表２３に列挙する。
Figure 0007168590000050
中程度～高ネクチン４発現（Ｈスコア≧１５０）を有する、これらの５８例の患者に、微小管破壊剤であるモノメチルアウリスタチンＥへとコンジュゲートさせた、完全ヒト抗ネクチン４抗体（ＩｇＧ１κ）を含む抗がん治療剤を投与した。全ての対象は、疾患の進行、処置に対する非忍容性、治験責任医師による決定、又は同意文書の取下げが生じるまで、抗ネクチン４ ＡＤＣの、毎週１回、３０分間で、４週間ごとのサイクルのうちの３週間にわたる（例えば、１、８、及び１５日目における）、ＩＶ注入を施された。投与される用量は、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び１．２５ｍｇ／ｋｇを含む。患者における疾患応答は、８週間（±７日間）ごとに１回、ＲＥＣＩＳＴ ｖｅｒｓｉｏｎ １．１に従い、治験責任医師が評価した（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、４５（２）：２２８～２４７（２００９）において記載されているＲＥＣＩＳＴ）。合計４９例の対象が、査定されうる結果をもたらした。
抗ネクチン４ ＡＤＣは、全てが、ネクチン４を発現する腫瘍を有する、処置される患者において、抗腫瘍活性をもたらした。１例の患者が、完全寛解を示し、１７例の患者が、部分寛解を示す結果として、合計で３６．７％の奏効率（奏効としてカウントされる、部分寛解又は完全寛解の両方）をもたらした。１．２５ｍｇ／ｋｇ群では、抗ネクチン４ ＡＤＣは、処置された１７例中１０例の患者において、奏効をもたらし、５８．８％の奏効率をもたらした。抗ネクチン４ ＡＤＣはまた、肝転移を伴う、１２例中５例の対象（４１．７％奏効率）、かつて、チェックポイント阻害剤で処置された、１６例中６例患者（３７．５％奏効率）、及びかつて、タキサンで処置された、２０例中８例患者（４０％奏効率）においても、抗腫瘍活性をもたらした。
したがって、抗ネクチン４ ＡＤＣは、ネクチン４を発現する腫瘍を有する患者において、抗腫瘍活性をもたらした。
（例１１）
抗ネクチン４ ＡＤＣの治療的使用
本明細書で提供される抗ネクチン４ ＡＤＣの、多様ながんを伴う患者の処置における有効性は、例えば、ヒトＭ２２－３２１ｂ４１．１抗体又はヒト化Ｍ２２－３２１ｂ４１．１抗体を含む抗ネクチン４ ＡＤＣで処置された患者の転帰と、プラセボとしての抗体アイソタイプで処置された対照患者の転帰とを比較することにより査定する。略述すると、患者を無作為化し、対照群又は処置群へと割り付ける。処置群内の患者には、抗ネクチン４ ＡＤＣを、動物モデルにおいて最適化された、１ｋｇ（の体重）当たりの用量ｍｇ（の抗体）の範囲、及び／又は例９及び１０における用量範囲に従い決定される用量範囲で注射する。注射は、ある期間にわたり、１回又は複数回行われる。処置された患者における転帰は、処置群と、プラセボ群との間で、定期的に解析及び比較する。
転帰は、抗ネクチン４ ＡＤＣで処置された患者において、プラセボで処置された患者と比較した場合に、改善される。プラセボ処置と比較した場合、抗ネクチン４ ＡＤＣ処置は、６カ月後、１年後、２年後、３年後、又は５年後における高生存率をもたらし、生存期間を延長し、がんマーカーのレベルを低減し、平均値又は中央値の腫瘍サイズを低減し、且つ／又はがんの進行を遅らせる。
（例１２）
ネクチン４ ＩＨＣアッセイの、さらなる診断的使用及び予後診断的使用
患者が、抗がん治療（例えば、細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤へとコンジュゲートさせた抗ネクチン４を使用する抗がん治療）に対して応答性となるのかどうかの予測における、Ｍ２２－３２１ｂ４１．１のＩＨＣ染色により決定される、患者組織内の、ネクチン４の発現の有効性ついて、例えば、患者の、がん治療への応答を、ネクチン４特異的抗体を用いるＩＨＣ染色から決定される、患者のがん組織内のネクチン４の発現と相関させることにより査定する。略述すると、全ての患者を、同じがん処置レジメンで処置し、がんを有する患者の組織内のネクチン４の発現レベルを、本明細書で記載されるＭ２２－３２１ｂ４１．１抗体を使用するＩＨＣアッセイにおいて決定する。それらのがん組織内の、ネクチン４の発現に従い、患者を、２つ、３つ、４つ、又はこれを超える群へと層別化する。例えば、４つの群への層別化では、患者を、それらのがん組織内のネクチン４発現が高度である第１の群、発現が中程度である第２の群、発現が低度である第３の群、及び発現が見られない第４の群へと分割する。各層別化群内の患者の体重、患者における腫瘍のサイズ、６カ月後、１年後、２年後、３年後、若しくは５年後における患者の生存率、又は患者の生存期間などの患者転帰により反映される、がん処置レジメンへの応答をまとめ、各群内の患者によるネクチン４の発現と相関させる。相関は、各群平均値又は中央値を使用して実施するか、又は各群内の個別の患者について実施する。
患者のがん組織内のネクチン４の発現は、患者が、どのようにして、がん処置レジメン、例えば、細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤とコンジュゲートさせた抗ネクチン４（抗ネクチン４ ＡＤＣと称する）を使用するがん治療に応答するのかを示す。それらのがん組織内のネクチン４発現が高度である患者は、がん処置レジメンへの応答が良好であり、６カ月後、１年後、２年後、３年後、又は５年後における生存率が高く、且つ／又はそれらのがん組織内のネクチン４発現が低度である患者より長く生存する。患者のがん組織内のネクチン４の発現が高度であるほど、がん治療、例えば、抗ネクチン４ ＡＤＣ処置は、患者にとって、より有効である。
配列番号１：＜２２３＞ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿１１２１７８
配列番号２～３５：＜２２３＞合成ポリペプチド
配列番号３６：＜２２３＞ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０３０９１６
配列番号３７～４４：＜２２３＞合成ポリヌクレオチド

Claims (14)

  1. ヒトネクチン４のエピトープに結合する抗体又はその抗原結合性断片であって、
    該抗体又はその抗原結合性断片が、
    （ａ）（１）配列番号７及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ相補性決定領域 １（ＣＤＲ１）、
    （２）配列番号９、１０、及び１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、並びに
    （３）配列番号１２及び１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３
    を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と；
    （ｂ）（１）配列番号１４、１５、１６、及び１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ相補性決定領域 ＣＤＲ１、
    （２）配列番号１８、１９、２０、及び２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、並びに
    （３）配列番号２２、２３、及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３
    を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と；
    を含む、上記抗体又はその抗原結合性断片。
  2. ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号７、１０、及び１２のアミノ酸配列を含み、並びにＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１５、１９、及び２３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ配列及びＶＨ ＣＤＲ配列が、ＫａｂａｔによるＣＤＲ定義に従い決定される、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  3. （ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬと；
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＨと
    を含む、請求項１又は請求項２に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  4. 前記抗体又はその抗原結合性断片が、マウスＩｇＧ２ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域、又はこれらの突然変異体を含む、或いは
    前記抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖Ｆｃ領域を含む、或いは
    前記抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、
    請求項１から３までのいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  5. （ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖と；
    （ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖と
    を含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  6. ｉ）請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片のＶＨ及びＶＬ、或いは
    ｉｉ）請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片の重鎖及び軽鎖
    をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
  7. 請求項６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  8. 請求項６に記載のポリヌクレオチド又は請求項７に記載のベクターを含む細胞。
  9. ヒトネクチン４のエピトープに特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片を作製する方法であって、請求項８に記載の細胞を培養して、前記抗体又はその抗原結合性断片を発現させるステップを含む、上記方法。
  10. 請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片を含むキット。
  11. がんを有することが疑われる対象に由来する組織試料中のネクチン４の発現を評価するための方法であって、
    （ａ）前記組織試料を、請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと；
    （ｂ）前記抗体又はその抗原結合性断片の、前記組織試料への結合を検出するステップと；
    （ｃ）組織試料中の、ネクチン４の発現を決定するステップであって、組織試料中の、ネクチン４の発現レベルを、ネクチン４の基準発現レベルと比較する上記ステップと
    を含む、上記方法。
  12. がんを有することが疑われる対象に由来する組織試料中のネクチン４の発現を評価するための方法であって、
    （ａ）請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片により、組織試料についての、免疫組織化学アッセイを実施するステップと；
    （ｂ）組織試料中の、ネクチン４の発現を決定するステップと
    を含む、上記方法。
  13. がん患者の、抗がん治療剤に対する応答性を評価するための方法であって、該評価が、前記患者に由来する組織試料中のネクチン４の発現に基づくものであり、
    （ａ）前記組織試料を、請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと；
    （ｂ）前記抗体又はその抗原結合性断片の、前記組織試料への結合を検出するステップと；
    （ｃ）組織試料中の、ネクチン４の発現レベルを決定するステップであって、組織試料中の、ネクチン４の発現レベルを、ネクチン４の基準発現レベルと比較する上記ステップと
    を含み、
    ネクチン４の発現レベルの、ネクチン４の基準発現レベルと比較した上昇が、前記抗がん治療剤に対する応答性を示す、
    上記方法。
  14. がん患者の、抗がん治療剤に対する応答性を評価するための方法であって、該評価が、前記患者に由来する組織試料中のネクチン４の発現に基づくものであり、
    （ａ）請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片により、組織試料についての、免疫組織化学アッセイを実施するステップと；
    （ｂ）組織試料中の、ネクチン４の発現レベルを決定するステップであって、組織試料中の、ネクチン４の発現レベルを、ネクチン４の基準発現レベルと比較する上記ステップと
    を含み、
    組織試料中のネクチン４の発現レベルの、ネクチン４の基準発現レベルと比較した上昇が、前記抗がん治療剤に対する応答性を示す、
    上記方法。
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