CN111051345A - 柄蛋白-4结合蛋白及其使用方法 - Google Patents

柄蛋白-4结合蛋白及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了涉及特异性结合柄蛋白‑4的抗体的组合物、方法和用途。本文还提供了用于评估样品或患者中柄蛋白‑4表达的方法以及用于评估癌症患者对抗‑癌症治疗剂响应性的方法。

Description

柄蛋白-4结合蛋白及其使用方法
1.技术领域
本文提供了涉及特异性结合人柄蛋白-4(Nectin-4)并检测柄蛋白-4表达水平的抗体的组合物、方法和用途。
2.相关申请的交叉引用
本申请要求2017年6月5日提交的美国临时申请号62/515,454的优先权和权益，通过引用将该申请的全部内容纳入本文。
3.对提交的序列表的引用
该申请通过引用纳入与本申请一同提交，名为14369-208-228_SEQ_LISTING.txt，创建于2018年5月31日，大小为37,280字节，ASCII文本格式的计算机可读形式(CRF)序列表。
4.背景
柄蛋白-4也称之为脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白4(PVRL4)，其是属于细胞粘附分子柄蛋白家族的大小约为52kDa的单次通过I型跨膜蛋白。柄蛋白经由同嗜性(homophilic)相互作用和异嗜性(heterophilic)相互作用在粘附连接处介导Ca2+非依赖性细胞间粘附，所述同嗜性相互作用中柄蛋白-4与另一柄蛋白-4相互作用，所述异嗜性相互作用中柄蛋白-4与另一柄蛋白家族蛋白如柄蛋白-1、柄蛋白-2或柄蛋白-3相互作用。(Miyoshi J等,2007,Am J Nephrol 27:590–604；Takai等,2003,Cancer Sci 94:655–667；Reymond N.等,2001,Journal of Biological Chemistry,276:43205-15)。柄蛋白-4的胞外域具有称之为V、C1和C2的3个Ig样亚结构域。已经证明柄蛋白-2中的C1结构域负责同嗜性相互作用，而大多数柄蛋白分子的V结构域导致异嗜性相互作用和细胞间粘附。(Miyoshi J等,2007,Am JNephrol 27:590–604；Takai等,2003,Cancer Sci 94:655–667；Reymond N.等,2001,Journal of Biological Chemistry,276:43205-15)。
柄蛋白表达于各种组织，包括例如，造血，神经元，内皮和上皮细胞。(MendelsohnC等,1989,Cell 56:855–865；Lopez M等,1995,Gene(Amst.)155:261–265；Lopez M等,1998,Blood 92:4602–4611；Reymond N等,2000,Gene(Amst.)255:347–355；Cocchi F.等,1998,Journal of Virology.72:9992–10002；Takahashi K.等,1999,Journal of CellBiology 145:539–549；Miyoshi J等,2007,Am J Nephrol 27:590–604；Takai等,2003,Cancer Sci 94:655–667)。
除了通过与其他柄蛋白家族蛋白的异嗜性相互作用或同嗜性相互作用介导细胞间粘附，柄蛋白可以招募其他细胞粘附分子如钙粘蛋白或其他细胞表面受体如催乳素受体。通过招募其他细胞表面受体，柄蛋白还可以作为刺激性共受体并以此具有信号转导功能。例如，在小鼠乳腺中，柄蛋白-4与催乳素受体通过其胞外或跨膜结构域相互作用并结合和隔绝(sequester)通常抑制Janus激酶(JAK2)激酶活性的细胞因子信号抑制因子-1(suppressor-of-cytokinesignaling-1，SOCS-1)，从而增强催乳素诱导的JAK2活化和信号转导。(Maruoka等,2017,Journal of Biological Chemistry,doi:10.1074/jbc.M116.769091,jbc.M116.769091,印刷前电子出版；Kitayama等,2016,Journal ofBiological Chemistry 291:5817-5831)。柄蛋白还可以与钙粘蛋白合作以诱导然后快速抑制初始细胞间粘附期间的Rac1活性。(Khameeka等,2011,PLoS ONE 6:e17841)。
迄今为止缺乏成功开发的抗-柄蛋白-4抗体用于特异性检测并评估各种生物样品中的柄蛋白-4表达。因此，需要鉴定可以特异性检测并评估生物样品中柄蛋白-4表达的抗-柄蛋白-4抗体。
5.发明内容
本公开提供了结合柄蛋白-4(例如，人柄蛋白-4，SEQ ID NO:43)的蛋白质，包括结合蛋白，如结合柄蛋白-4的抗体。包括抗体在内的这类结合蛋白可以结合柄蛋白-4多肽，柄蛋白-4片段和/或柄蛋白-4表位。
在某些实施方式中，本公开还提供了特异性结合表达柄蛋白-4的细胞的结合蛋白，包括抗体或其片段。
本文还提供了含有编码这类抗体的序列的载体和多核苷酸，含有这类多核苷酸或载体的细胞(例如，宿主细胞)，以及含有这类抗体的组合物、试剂和试剂盒。在另一方面中，本文提供了用于调节柄蛋白-4活性(例如，激活柄蛋白-4信号转导)或柄蛋白-4表达水平的方法，这类抗-柄蛋白-4抗体的用途和诊断方法。
在一些实施方式中，结合蛋白(例如，抗-柄蛋白-4抗体)包含6个互补决定区(CDR)或少于6个CDR。在其他实施方式中，结合蛋白(例如，抗-柄蛋白-4抗体)包含1、2、3、4、5或6个CDR，所述CDR选自重链可变区(VH)CDR1、VH CDR2、VH CDR3、轻链可变区(VL)CDR1、VLCDR2和/或VL CDR3。在某些实施方式中，结合蛋白(例如，抗-柄蛋白-4抗体)包含1、2、3、4、5或6个CDR，所述CDR选自本文称之为M22-321b41.1的单克隆抗体的VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3，或其人源化变体。在某些实施方式中，结合蛋白(例如，抗-柄蛋白-4抗体)还包含支架区域或框架区域(FR)，其包括人免疫球蛋白氨基酸序列或其变体的VH FR1、VH FR2、VH FR3、VH FR4、VL FR1、VL FR2、VL FR3和/或VL FR4。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含VL，所述VL含有表1中所示抗体M22-321b41.1的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含VH，所述VH含有表1中所示抗体M22-321b41.1的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：
(a)VL，所述VL含有表2中所示抗体M22-321b41.1的VL FR1、VL FR2、VL FR3和VLFR4；和
(b)VH，所述VH含有表2中所示抗体M22-321b41.1的VH FR1、VH FR2、VH FR3和VHFR4。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:7、10和12，而抗体或其抗原结合片段的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:15、19和23。
在另一实施方式中，抗体或其抗原结合片段具有含氨基酸序列SEQ ID NO:3的VL。在一些实施方式中，氨基酸序列含有一个或多个保守性修饰。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段具有含氨基酸序列SEQ ID NO:4的VH。在一些实施方式中，氨基酸序列含有一个或多个保守性修饰。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段具有：(a)含氨基酸序列SEQ ID NO:3的VL；和(b)含氨基酸序列SEQ ID NO:4的VH。
在一些实施方式中，抗体包含人IgG1 Fc区。在其他实施方式中，抗体包含突变型人IgG1 Fc区。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段还具有含氨基酸序列SEQ ID NO:33的轻链恒定区。
在其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段还具有含氨基酸序列SEQ ID NO:35的重链Fc区。
在其他实施方式中，抗体或其抗原结合片段还具有含氨基酸序列SEQ ID NO:33的轻链恒定区；和具有含氨基酸序列SEQ ID NO:35的重链Fc区。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段具有含氨基酸序列SEQ ID NO:5的轻链。
在某些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基31-346中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基31-150中的至少一个。在某些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基1-150中的至少一个。
在一实施方式中，人柄蛋白-4的表位不同于柄蛋白-4配体结合位点。
在一方面中，本文提供了结合人柄蛋白-4表位的抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段特异性地结合表达柄蛋白-4的细胞。
在一实施方式中，将结合人柄蛋白-4表位的抗体或其抗原结合片段用于评估来自疑似患有癌症的对象的组织样品中的柄蛋白-4表达，这包括：(a)将所述组织样品与抗体或其抗原结合片段接触；(b)检测所述抗体或其抗原结合片段与所述组织样品的结合；和(c)确定组织样品中柄蛋白-4的表达，其中，组织样品中柄蛋白-4的表达水平与柄蛋白-4的参照表达水平比较。
在某些实施方式中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，抗体是人源化、人或嵌合抗体。在另一实施方式中，人源化抗体是去免疫化抗体或复合人抗体。在某些实施方式中，抗体是人源化抗体。在具体实施方式中，抗体是与人柄蛋白-4特异性结合的人源化抗体。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、双抗体、三抗体或四抗体。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段是由抗体片段形成的多特异性抗体。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段与试剂偶联。在一实施方式中，试剂是放射性同位素，金属螯合剂，酶，荧光化合物，生物发光化合物或化学发光化合物。
本文还提供了包含本文所提供的抗体或其抗原结合片段的组合物。在某些实施方式中，组合物还包含药学上可接受的运载体。
本文还提供了包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码本文所提供的抗体的VH，VL，或VH和VL两者。
在某些实施方式中，本公开还提供了包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码本文所提供的抗体的重链，轻链或重链和轻链两者。
在某些实施方式中，多核苷酸操作性地连接于启动子。
本文还提供了多核苷酸群，其包含：(a)第一多核苷酸，其包含编码本文所提供的抗体的重链或VH的核苷酸序列，和(b)第二多核苷酸，其包含编码本文所提供的抗体的轻链或VL的核苷酸序列。在某些实施方式中，第一多核苷酸操作性地连接于第一启动子，而第二多核苷酸操作性地连接于第二启动子。
本文还提供了载体，其包含本文所提供的多核苷酸。
在某些实施方式中，本公开还提供了载体群，其包含：(a)第一载体，其包含编码本文所提供的抗体的重链或VH的核苷酸序列，和(b)第二载体，其包含编码本文所提供的抗体的轻链或VL的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本公开进一步提供了载体群，其包含：(a)包含编码本文所提供的抗体的重链或VH的核苷酸序列的第一载体，其操作性地连接于第一启动子，和(b)包含编码本文所提供的抗体的轻链或VL的核苷酸序列的第二载体，其操作性连接于第二启动子。
在某些实施方式中，本公开提供了包含本文所提供的多核苷酸或多核苷酸群的细胞。
在某些实施方式中，本公开还提供了包含本文所提供的载体或载体群的细胞。
在某些实施方式中，本公开进一步提供了产生本文所提供的抗体或其抗原结合片段的分离的细胞。
本文还提供了细胞群，其包含：(a)含有多核苷酸的第一宿主细胞，所述多核苷酸包含编码本文所提供的抗体的重链或VH的核苷酸序列，和(b)含有多核苷酸的第二宿主细胞，所述多核苷酸含编码本文所提供的抗体的轻链或VL的核苷酸序列。
本文进一步提供了细胞群，其包含：(a)含有多核苷酸的第一宿主细胞，所述多核苷酸包含编码本文所提供的抗体的重链或VH的核苷酸序列，其操作性地连接于第一启动子，和(b)含有多核苷酸的第二宿主细胞，所述多核苷酸包含编码本文所提供的抗体的轻链或VL的核苷酸序列，其操作性连接于第二启动子。
本文还提供了包含本文所提供的抗体或其抗原结合片段的试剂盒。
本文还提供了制备特异性结合人柄蛋白-4表位的抗体和其抗原结合片段的方法。在某些实施方式中，该方法包括培养本文所提供的细胞以表达抗体或抗原结合片段。在其他实施方式中，该方法包括表达本文所提供的多核苷酸。在一实施方式中，人柄蛋白-4的表位不同于柄蛋白-4配体结合位点。
6.附图说明
图1描述了这样的实验结果，其显示所有的癌细胞在使用2.5μg/mL M22-321b41.1的柄蛋白-4 mRNA-阳性AG-B1异种移植物IHC染色试验中被阳性染色。
图2描述了这样的实验结果，其显示所有的癌细胞在使用2.5μg/mL M22-244b3.1.1.1的柄蛋白-4 mRNA-阳性AG-B1异种移植物IHC染色试验中被阳性染色。
图3描述了这样的实验结果，其显示所有细胞在使用2.5μg/mL M22-321b41.1的柄蛋白-4 mRNA-阴性AG-K24异种移植物IHC染色试验中未被染色。
图4描述了这样的实验结果，其显示许多细胞在使用2.5μg/mL M22-244b3.1.1.1的柄蛋白-4 mRNA-阴性AG-K24异种移植物IHC染色试验中被阳性染色。
图5描述了这样的实验结果，其显示所有细胞在使用2.5μg/mL M22-321b41.1的柄蛋白-4 mRNA-阴性MDA-MB-231-MFP-XCL异种移植物IHC染色试验中未被染色。
图6描述了这样的实验结果，其显示许多细胞在使用2.5μg/mL M22-244b3.1.1.1的柄蛋白-4 mRNA-阴性MDA-MB-231-MFP-XCL异种移植物IHC染色试验中被阳性染色。
图7描述了这样的实验结果，其显示所有细胞在使用2.5μg/mL阴性对照IgG2a抗体的柄蛋白-4 mRNA-阳性AG-K24异种移植物IHC染色试验中未被染色。
图8描述了这样的实验结果，其显示所有的癌细胞在使用2.5μg/mL M22-321b41.1的柄蛋白-4 mRNA-阳性AG-L16异种移植物IHC染色试验中被阳性染色。
图9描述了这样的实验结果，其显示大多数癌细胞在使用2.5μg/mL M22-321b41.1的柄蛋白-4 mRNA-阳性AG-B11异种移植物IHC染色试验中被阳性染色。
图10描述了这样的试验结果，其显示了使用M22-321b41.1的尿路上皮癌IHC染色试验中的强柄蛋白-4染色。
图11描述了这样的试验结果，其显示了使用M22-321b41.1的乳腺癌IHC染色试验中柄蛋白-4染色的异质性。
图12A描述了Western印迹实验的结果，其显示仅在这些细胞以及表达柄蛋白-4的异种移植物中特异性检测柄蛋白-4条带。
图12B描述了对照FACS实验的结果，其显示在图12A中经M22-321b41.1阳性印迹的Rat1(E)-柄蛋白-4细胞表达高水平的柄蛋白-4；而在图12A中经M22-321b41.1阴性印迹的Rat1(E)细胞表达高水平的柄蛋白-1、柄蛋白-2和柄蛋白-3，这表明M22-321b41.1对柄蛋白具有特异性。
图13描述了Western印迹实验的结果，其显示M22-321b41.1抗体识别含有柄蛋白-4的V片段/结构域(氨基酸残基1-150)的蛋白质条带。在上组图中，在Western印迹实验针对表达野生型全长(wt)，V片段/结构域(V)，V和C1片段/结构域(V/C1)，C1和C2片段/结构域，C2片段/结构域和阴性对照(neo)的细胞裂解物测试M22-321b41.1抗体。在下组图中，GAPDH的印迹用作加样对照。
7.具体实施方式
本文提供了结合蛋白，如结合柄蛋白-4包括人柄蛋白-4的抗体。在一实施方式中，柄蛋白-4抗体结合人柄蛋白-4。在一些实施方式中，柄蛋白-4抗体与柄蛋白-4的结合在体外测试。在其他实施方式中，柄蛋白-4抗体与柄蛋白-4的结合离体测试。在某些实施方式中，测试包括免疫组织化学(IHC)试验，荧光激活细胞分选(FACS)试验，ELISA，免疫印迹(例如，Western印迹，斑点印迹或细胞内Western印迹)和其他免疫试验。
在特定实施方式中，本文所提供的结合蛋白，如结合柄蛋白-4的抗体，具有彼此之间竞争结合柄蛋白-4的共同特征。该竞争性抑制可以表示各抗体结合柄蛋白-4相同的区域(例如，相同的表位)，从而主张相似的效果。在某些实施方式中，本文所提供的抗-柄蛋白-4抗体包括人源化抗-柄蛋白-4抗体，诸如源自或基于抗体M22-321b41.1的那些。在其他实施方式中，本文所提供的抗-柄蛋白-4抗体与源自或基于抗体M22-321b41.1的抗体竞争结合。在一些实施方式中，抗-柄蛋白-4抗体具有如表1中所述的CDR序列。在某些实施方式中，抗-柄蛋白-4抗体结合人柄蛋白-4特定的结构域(例如，氨基酸序列SEQ ID NO:1内的残基31-346、1-150或31-150)。此外，这类结合可以很大程度上归因于区域内的氨基酸残基，其包含本文所述抗-柄蛋白-4抗体所识别的表位。总而言之，本文所述的结果证明了，针对源自或基于M22-321b41.1的抗-柄蛋白-4抗体，包括具有表1中所述的一个或多个CDR的抗体所观测到的效果可以推导至本文所述具有相同或相似表位特异性(例如，相同或相似CDR)的其他抗-柄蛋白-4抗体。
在本公开的一些实施方式中，结合蛋白如抗-柄蛋白-4抗体可以包含免疫球蛋可变区，其包含如表1所述的一个或多个CDR。在这类结合蛋白(例如，抗-柄蛋白-4抗体)中，CDR可以与定向CDR的一个或多个支架区域或框架区域(FR)(如表2中所述的那些)连接，从而实现CDR适当的抗原结合特性。这类结合蛋白，包括本文所述的抗-柄蛋白-4抗体，可以在各种试验中结合柄蛋白-4。
7.1常规技术
本文所述或所引用的技术或方法包括本领域技术人员通常所熟知和/或一般通过常规方法采用的那些，例如，Sambrook等,《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)(第三版，2001)；《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols inMolecular Biology)(Ausubel等编著,2003)；《治疗性单克隆抗体：从实验室和到临床》(Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic)(An等2009)；《单克隆抗体：方法和方案》(Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols)(Albitar等2010)；和《抗体工程改造》(Antibody Engineering)卷1和2(Kontermann和Dübel编著,第2版，2010)中所述广泛应用的方法。
7.2术语
除非另外描述，本文中所使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的同样含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义的描述，并且在适当时，以单数使用的术语将包括复数，反之亦然。所有专利、申请、公开申请和其它出版物通过引用全文纳入。在所示任何术语描述与通过引用纳入本文的任何文件相冲突的情况中，将以下述术语的描述为准。
除非另有说明，术语“柄蛋白-4”、“柄蛋白-4多肽”或“柄蛋白-4蛋白”涵盖多肽(“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用)包括任何天然多肽，来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物，如灵长类(例如，人和食蟹猴(猕猴)，狗和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方式中，该术语包括“相关柄蛋白-4多肽”，包括其SNP变体。术语“柄蛋白-4”还涵盖“全长”未加工的柄蛋白-4以及细胞中加工所得的柄蛋白-4的任何形式。在一些实施方式中，柄蛋白-4具有氨基酸序列SEQ ID NO:1。GenBankTM登录号NM_030916(mRNA)，NG_028109(基因组DNA)，Gene ID 81607(基因)，NP_112178(前体氨基酸序列)提供了其他示例性的人柄蛋白-4核酸或氨基酸序列。如下提供了示例性的人柄蛋白-4氨基酸序列：
MPLSLGAEMWGPEAWLLLLLLLASFTGRCPAGELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASVVVVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHTDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRAEEEEDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV(SEQ ID NO:1)
GenBankTM登录号NM_030916提供了一个示例性人柄蛋白-4核酸序列：
atgcccctgtccctgggagccgagatgtgggggcctgaggcctggctgctgctgctgctactgctggcatcatttacaggccggtgccccgcgggtgagctggagacctcagacgtggtaactgtggtgctgggccaggacgcaaaactgccctgcttctaccgaggggactccggcgagcaagtggggcaagtggcatgggctcgggtggacgcgggcgaaggcgcccaggaactagcgctactgcactccaaatacgggcttcatgtgagcccggcttacgagggccgcgtggagcagccgccgcccccacgcaaccccctggacggctcagtgctcctgcgcaacgcagtgcaggcggatgagggcgagtacgagtgccgggtcagcaccttccccgccggcagcttccaggcgcggctgcggctccgagtgctggtgcctcccctgccctcactgaatcctggtccagcactagaagagggccagggcctgaccctggcagcctcctgcacagctgagggcagcccagcccccagcgtgacctgggacacggaggtcaaaggcacaacgtccagccgttccttcaagcactcccgctctgctgccgtcacctcagagttccacttggtgcctagccgcagcatgaatgggcagccactgacttgtgtggtgtcccatcctggcctgctccaggaccaaaggatcacccacatcctccacgtgtccttccttgctgaggcctctgtgaggggccttgaagaccaaaatctgtggcacattggcagagaaggagctatgctcaagtgcctgagtgaagggcagccccctccctcatacaactggacacggctggatgggcctctgcccagtggggtacgagtggatggggacactttgggctttcccccactgaccactgagcacagcggcatctacgtctgccatgtcagcaatgagttctcctcaagggattctcaggtcactgtggatgttcttgacccccaggaagactctgggaagcaggtggacctagtgtcagcctcggtggtggtggtgggtgtgatcgccgcactcttgttctgccttctggtggtggtggtggtgctcatgtcccgataccatcggcgcaaggcccagcagatgacccagaaatatgaggaggagctgaccctgaccagggagaactccatccggaggctgcattcccatcacacggaccccaggagccagccggaggagagtgtagggctgagagccgagggccaccctgatagtctcaaggacaacagtagctgctctgtgatgagtgaagagcccgagggccgcagttactccacgctgaccacggtgagggagatagaaacacagactgaactgctgtctccaggctctgggcgggccgaggaggaggaagatcaggatgaaggcatcaaacaggccatgaaccattttgttcaggagaatgggaccctacgggccaagcccacgggcaatggcatctacatcaatgggcggggacacctggtctga(SEQ ID NO:36)
GenBankTM登录号AF472510，NM_027893，XM_203738，NM_001122680提供了示例性的小鼠柄蛋白-4核酸和氨基酸序列；GenBankTM登录号XM_005541220和XM_005541223提供了示例性的猴柄蛋白-4核酸和氨基酸序列。
“相关柄蛋白-4多肽”包括等位基因变体(例如，SNP变体)；剪接变体；片段；衍生物；取代，缺失和插入变体；融合多肽；和种间同源物，它们可以保留柄蛋白-4活性。本领域技术人员将意识到的是，本文提供的抗-柄蛋白-4抗体可以结合柄蛋白-4多肽，柄蛋白-4多肽片段，柄蛋白-4抗原和/或柄蛋白-4表位。“表位”可以是较大柄蛋白-4抗原的部分，其可以是较大柄蛋白-4多肽片段的部分，其反过来可以是较大柄蛋白-4多肽的部分。柄蛋白-4可以天然或截短的形式存在。本文所述的柄蛋白-4多肽可分离自各种来源，如分离自人组织类型或其他来源，或通过重组或合成方法制备。柄蛋白-4多肽的直系同源物为本领域所熟知。
“柄蛋白-4配体”指结合柄蛋白-4或以其他方式与柄蛋白-4相互作用的分子。柄蛋白-4可以与另一柄蛋白-4分子具有同嗜性相互作用并与其他柄蛋白家族蛋白诸如柄蛋白-1、柄蛋白-2和柄蛋白-3具有异嗜性相互作用。柄蛋白-4还可以与其他表面粘附分子诸如钙粘蛋白和其他细胞表面受体诸如催乳素受体相互作用。柄蛋白-4可以进一步与病毒颗粒或病毒颗粒上的病毒蛋白，例如，麻疹病毒和脊髓灰质炎病毒相互作用。因此，柄蛋白-4配体可以可以包括柄蛋白-1、柄蛋白-2、柄蛋白-3或柄蛋白-4或任何柄蛋白家族蛋白的片段。柄蛋白-4配体还可以包括其他细胞表面受体的结构域或全长分子，如钙粘蛋白或其片段，或者催乳素受体或其片段。柄蛋白-4配体可以进一步包括病毒颗粒，病毒衣壳蛋白，病毒表面蛋白，以及可以结合柄蛋白-4的任何病毒蛋白的片段。柄蛋白-4配体的非限制性示例，除了本文所示或本领域技术人员已知的天然产生的配体，包括人工生成的配体，例如，通过筛选肽文库可以结合柄蛋白-4的配体而鉴定的配体。
术语“柄蛋白-4活性”和“柄蛋白信号转导”表示由柄蛋白-4配体与柄蛋白-4的结合(例如，体内或体外)所诱导的生物效应或生物响应。该术语还指代由可以模拟柄蛋白-4配体功能的分子所诱导的相似的效应或响应。这类柄蛋白-4配体模拟物诱导否则将有柄蛋白-4配体结合所导致的生物效应或生物响应。
术语“结合蛋白”指这样的蛋白质，其包含结合柄蛋白-4的部分(例如，一个或多个结合区域诸如CDR)和，任选地，支架或框架部分(例如，一个或多个支架或框架区域)，其允许结合部分采用促进结合蛋白与柄蛋白-4多肽、片段或表位结合的构型。这类结合蛋白的示例包括抗体，如人抗体，人源化抗体，嵌合抗体，重组抗体，单链抗体，双抗体，三抗体，四抗体，Fab片段，F(ab’)2片段，IgD抗体，IgE抗体，IgM抗体，IgG1抗体，IgG2抗体，IgG3抗体或IgG4抗体，和其片段。例如，结合蛋白可以包含具有移植的CDR或CDR衍生物的替代性蛋白支架或人工支架。这类支架包括但不限于，抗体衍生的支架，其包含导入的突变以稳定结合蛋白的三维结构，以及完全合成的支架，其包含例如生物相容性聚合物。参见例如，Korndorfer等,2003,蛋白质：结构、功能和生物信息学(Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics)53(1):121-29；和Roque等,2004,Biotechnol.Prog.20:639-54。此外，可以使用肽抗体模拟物(“PAM”)以及基于利用纤连蛋白组件作为支架的抗体模拟物的支架。在本公开的上下文中，结合蛋白据信特异性地结合或选择性地结合柄蛋白-4。
术语“抗体”、“免疫球蛋白”或“Ig”在本文可互换使用，并以最广泛的含义使用并且具体涵盖，例如，个体抗-柄蛋白-4单克隆抗体(包含全长或完整的单克隆抗体)，抗-柄蛋白-4抗体组合物，具有多表位或单表位特异性，多克隆或单价抗体，多价抗体，形成自至少两个完整的抗体，单链抗-柄蛋白-4抗体，和抗-柄蛋白-4抗体的片段，如下所述。抗体可以是人的，人源化的，嵌合的和/或亲和力(affinity)成熟的，以及来自其他物种的抗体，例如，小鼠和兔等。术语“抗体”旨在包括能够结合特异性分子抗原且包含两对相同的多肽链的免疫球蛋白类多肽内的B细胞的多肽产物，其中各对多肽链具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，各链的各氨基末端部分包含约100-约130或更多氨基酸的可变区，并且各链的各羧基末端包含恒定区。参见例如，《抗体工程改造》(Antibody Engineering)(Borrebaeck编著，第2版1995)；和Kuby,《免疫学》(Immunology)(第3版1997)。在特定实施方式中，特定分子抗原可以通过本文所提供的抗体结合，包括柄蛋白-4多肽，柄蛋白-4片段或柄蛋白-4表位。抗体还包括但不限于，合成抗体，重组产生的抗体，骆驼化抗体，内抗体(intrabody)，抗-独特型(抗-Id)抗体，和上述任意一种的功能性片段(例如，抗原结合片段，如柄蛋白-4结合片段)，其指保留衍生该片段的抗体的一些或全部结合活性的抗体重链或轻链多肽的部分。功能性片段(例如，抗原结合片段，如柄蛋白-4结合片段)的非限制性示例包括单链Fv(scFv)，Fab片段，F(ab’)片段，F(ab)2片段，F(ab’)2片段，二硫键连接的Fv(dsFv)，Fd片段，Fv片段，双抗体，三抗体，四抗体和迷你抗体。具体地，本文所提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋分子的免疫活性部分，例如，抗原结合结构域或含有结合柄蛋白-4的抗原结合位点(例如，抗-柄蛋白-4抗体的一个或多个CDR)的分子。这类抗体片段可以见于，例如，Harlow和Lane,《抗体实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual)(1989)；《分子生物学和生物技术：全面案头参考》(Mol.Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference)(Myers等，1995)；Huston等,1993,Cell Biophysics 22:189-224；Plückthun和Skerra,1989,Meth.Enzymol.178:497-515；和Day,高级免疫化学(Advanced Immunochemistry)(第2版1990)。本文所提供的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚型(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
“抗原”是抗体可以选择性结合的预定抗原。靶抗原可以是多肽，碳水化合物，核酸，脂质，半抗原或其他天然存在或合成的化合物。在一些实施方式中，靶抗原是多肽。
术语“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”、“抗原结合区域”和相似的术语指这样的抗体部分，其包含与抗原相互作用并赋予结合剂其对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基(例如，CDR)。
术语“结合”或“缔合”指分子之间的相互作用，包括，例如，以形成复合物。例如，相互作用可以是非共价的相互作用，包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华相互作用。复合物还可以包括通过共价键或非共价键、相互作用或力将两个或更多个分子结合在一起。抗体上单个抗原结合位点和靶分子(如柄蛋白-4)的单个表位之间的全部非共价相互作用的强度是抗体或功能性片段对于表位的亲和力。抗体对于单克隆抗原的解离速率(koff)与结合速率(kon)比例(koff/kon)是解离常数(KD)，其与亲和力成反比。KD值越低，抗体的亲和力越高。KD值随不同的抗体和抗原复合物变化并且依赖于kon和koff。本文所提供的抗体的解离常数KD可以使用本文所提供的任何方法或者为本领域技术人员所熟知的任何方法确定。一个结合位点的亲和力常常并不反应抗体和抗原之间相互作用真正的强度。当含有多个、重复抗原决定簇的复合抗原，如多价柄蛋白-4与含有多个结合位点的抗原接触之时，一个位点处的抗原与抗体的相互作用将增加第二位点处反应的可能性。多价抗体和抗原之间这类多重相互作用的强度称之为亲合力(avidity)。抗体的亲合力可以比其个别结合位点的亲和力更好地测量抗体的结合能力。例如，高亲合力可以补偿低亲和力，如五聚IgM抗体中有时所发现的，其可以具有比IgG低的亲和力，但是因其多价性而导致的高IgM亲合力能够使其更有效地结合抗原。
术语“特异性结合柄蛋白-4的抗体”、“特异性结合柄蛋白-4表位的抗体”和类似术语在本文中可互换使用并且指特异性结合柄蛋白-4多肽如柄蛋白-4抗原或片段或表位(例如，人柄蛋白-4如人柄蛋白-4多肽、抗原或表位)的抗体。特异性结合柄蛋白-4(例如，人柄蛋白-4)的抗体可以结合衍生自柄蛋白-4胞外域的肽或胞外域。特异性结合柄蛋白-4抗原(例如，人柄蛋白-4)的抗体可以与相关抗原(例如，猕猴柄蛋白-4)交叉反应。在某些实施方式中，特异性结合柄蛋白-4抗原的抗体不与其他抗原诸如但不限于柄蛋白-1、柄蛋白-2和/或柄蛋白-3交叉反应。特异性结合柄蛋白-4抗原的抗体可以通过例如，免疫试验、
Figure BDA0002378599980000141
或本领域技术人员已知的其他技术鉴定。
“结合感兴趣抗原”(例如靶抗原，如柄蛋白-4)的抗体是以足够的亲和力结合该抗原从而使得该抗体可用作靶向或检测表达该抗原的细胞或组织的治疗剂、且不与其他蛋白质发生明显交叉反应的抗体。在这类实施方式中，抗体与“非靶标”蛋白结合的程度将小于抗体与其特定靶蛋白的结合的约10％，例如，如通过荧光活化的细胞分选(FACS)分析或RIA所确定。就抗体与靶分子的结合而言，针对特定多肽或特定多肽靶标上的表位，术语“特异性结合”、“特异性结合于”或“对……具有特异性”是指相对于非特异性相互作用而言具有可检测到的区别的结合。例如，特异性结合可通过测定某分子的结合并与对照分子的结合进行比较来测量，对照分子通常是结构上相似但没有结合活性的分子。例如，可通过与靶标相似的对照分子(例如过量的未标记的靶标)的竞争来确定特异性结合。在这种情况下，如果标记靶标与探针的结合被过量的未标记靶标竞争性抑制，则表明特异性结合。术语“抗-柄蛋白-4抗体”或“结合柄蛋白-4的抗体”包括能够以足够的亲和力结合柄蛋白-4的抗体，由此该抗体可用作靶向柄蛋白-4中的诊断剂。针对特定多肽或特定多肽靶标上的表位，本文所用术语“特异性结合”、“特异性结合于”或“对……具有特异性”指其中分子在不存在显著结合任何其他多肽或多肽表位的情况下结合特定多肽或特定多肽上的表位。本文提供了特异性结合柄蛋白-4的抗-柄蛋白-4抗体。本文还提供了特异性结合柄蛋白-4而非柄蛋白-1、柄蛋白-2和/或柄蛋白-3的抗-柄蛋白-4抗体。
使用实验技术如放射免疫试验(RIA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)确定，当抗体以比任何交叉反应抗原更高的亲和力结合柄蛋白-4抗原时，该抗体特异性结合柄蛋白-4抗原。通常，特异性或选择性反应将为背景信号或噪声的至少两倍并且可以为超过背景10倍。参见例如，《免疫学基础》(Fundamental Immunology)332-36(Paul编著，第2版1989)关于抗体特异性的讨论。或者，例如，在IHC试验中，可以定性确定抗体的特异性。在这样的IHC试验中，当抗体结合，例如，免疫组织化学染色，表达柄蛋白-4的细胞但是基本上不结合，例如，基本上不染色不表达柄蛋白-4的细胞，该抗体特异性结合柄蛋白-4抗原或对柄蛋白4抗原具有特异性。例如，当抗体以与免疫球蛋同种型对照结合水平基本相似水平结合，例如，免疫组织化学染色细胞，该抗体基本上不结合，例如，基本上不染色，IHC中的细胞。
术语“完全人抗体”或“人抗体”在本文可以互换使用并且指包含人可变区和例如人恒定区的抗体。在具体实施方式中，该术语指含有人来源的可变区和恒定区的抗体。在某些实施方式中，“完全人”抗-柄蛋白-4抗体还可以涵盖结合柄蛋白-4多肽并由核酸序列所编码的抗体，所述核酸序列为天然产生的人种系免疫球蛋白核酸序列体变体。在具体实施方式中，本文所提供的抗-柄蛋白-4抗体为完全人抗体。术语“完全人抗体”包括具有对应人种系免疫球蛋白序列可变和恒定区的抗体，如Kabat等(参见，Kabat等(1991)《免疫学热门 蛋白质序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，美国卫生与公共服务部，NIH公开出版号91-3242)所述。产生完全人抗体的示例性方法提供于例如本文的实施例，但是可以使用本领域已知的任何方法。
短语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、创造或分离的人抗体，诸如使用转染到宿主细胞的重组表达载体表达的抗体，分离自重组、组合人抗体库的抗体，分离自人免疫球蛋白基因转基因和/或转染色体(transchromosomal)动物(例如，小鼠或牛)的抗体(参见例如，Taylor,L.D.等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或通过涉及切割人免疫球蛋基因序列成其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、创造或分离的抗体。这类重组人抗体可以具有源自人种系免疫球蛋序列的可变或恒定区(参见，Kabat等(1991)《免疫学热 门蛋白质序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，美国卫生与公共服务部，NIH公开出版号91-3242)。然而，在某些实施方式中，这类重组人抗体经历体外诱变(或者，当使用人Ig序列转基因动物，体内体诱变)并因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然衍生自或与人种系VH和VL序列相关，其可能并不天然出现在体内人抗体种系库(repertoire)内的序列。
术语“竞争”当用于抗-柄蛋白-4抗体(例如，结合柄蛋白-4并竞争靶标上的相同表位或结合位点的抗体和结合蛋白)上下文时表示由试验所确定的竞争，其中处于研究的抗体(或其结合片段)防止或抑制参照分子(例如，参照配体或参照抗原结合蛋白，如参照抗体)与共同抗原(例如，柄蛋白-4或其片段)的特异性结合。许多类型的竞争结合试验可以用于确定测试抗体是否与参照抗体竞争结合柄蛋白-4(人柄蛋白-4)。可以采用的试验的示例包括，固相直接或间接RIA，固相直接或间接酶免疫试验(EIA)，夹心(sandwich)竞争试验(参见例如，Stahli等,1983,酶学方法(Methods in Enzymology)9:242-53)，固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如，Kirkland等,1986,J.Immunol.137:3614-19)，固相直接标记试验，固相直接标记夹心试验(参见例如，Harlow和Lane，《抗体实验室手册》(Antibodies,A Laboratory Manual)(1988))，使用I-125标签的固相直接标签RIA(参见例如，Morel等,1988,Mol.Immunol.25:7-15)和直接标记RIA(Moldenhauer等,1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)。通常，这类试验涉及使用结合固体表面的纯化抗原(例如，柄蛋白-4，如人柄蛋白-4)，或携带未标记的测试抗原结合蛋白(例如，抗-柄蛋白-4抗体)或标记的参照抗原结合蛋白(例如，参照抗-柄蛋白-4抗体)的细胞。可以使用的其他示例性竞争结合试验包括ELISA、FACS、细胞粘附试验(例如，Humphries等.Methods Mol Biol.2009；522:203-10所述)，表面等离振子共振(SPR)或本领域技术人员已知的其他竞争性结合试验。可以通过确定在测试抗原结合蛋白存在的情况下结合固体表面或细胞的标签的量来测量竞争性抑制。通常，所述测试抗原结合蛋白过量存在。通过竞争试验鉴定的抗体(竞争抗体)包括与参照抗体结合相同的表位的抗体和/或结合足够接近参照所结合的表位，从而发生抗体空间位阻的邻近表位的抗体。本文描述了关于确定竞争性结合的方法的其他详细信息。通常，当竞争抗体蛋白过量存在时，其将抑制至少30％，例如，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％或75％参照抗体与常见抗原的特异性结合。在一些实例中，抑制至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更多结合。
在给予其他治疗方法的上下文中，本文所用术语“联用”指使用超过一种疗法。术语“联用”的使用并不限于给予患有感染的对象治疗方法的顺序。第一疗法可以在给予患有、已经患有或者疑似患有柄蛋白-4介导的疾病的对象第二疗法之前给予(例如，1分钟、45分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时给予或之后给予(例如，1分钟、45分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)。任何额外的疗法可以任何顺序与其他额外的疗法给予.在某些实施方式中，本文所提供的抗体可以与一种或多种疗法(例如，不是本文所提供的抗体的疗法，其被当下给予以预防、治疗、控制和/或减轻柄蛋白-4介导的疾病)联用。可以与本文所提供的抗体联用的疗法的非限制性示例包括镇痛药，麻醉药，抗生素或免疫调节剂或《美国药典》(U.S.Pharmacopoeia)和/或《医生案头参考》(Physician’s Desk Reference)任何其他药物。
“分离的”抗体是基本上不含细胞材料或来自细胞或组织来源的其他污染性蛋白质和/或衍生抗体的其他污染组分，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。术语“基本上不含细胞材料”包括抗体的制备物，其中抗体与其所分离或重组产生的细胞的细胞组分相分离。因此，基本上不含细胞材料的抗体包括具有少于约30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％(干重)异源性蛋白质(本文还将其称之为“污染蛋白质”)的蛋白质制备物。在某些实施方式中，当抗体是经重组产生的，其基本上不含培养基，例如，存在少于约20％、15％、10％、5％或1％蛋白质制备体积的培养基。在某些实施方式中，当抗体是通过化学合成产生的，其基本上不含化学前体或其他化学物质，例如，其与化学前体或蛋白质合成所涉及的其他化学物质相分离。因此，抗体的这类制备物具有少于约30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％(干重)化学前体或除了感兴趣的抗体以外的化合物。污染组合还可以包括但不限于，将干扰抗体治疗性用途的材料，并且可以包括酶、激素或其他蛋白质性(proteinaceous)或非蛋白质性(nonproteinaceous)溶质。在某些实施方式中，将抗体纯化(1)至通过Lowry方法(Lowry等,1951,J.Bio.Chem.193:265-75)确定为重量抗体大于95％，如96％、97％、98％或99％，(2)至通过使用转杯式(spinning cup)测序仪足以获得内部氨基酸序列或N-末端至少15个残基的程度，或者(3)至通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或银染色确定具有均质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不会存在。然而，通常，分离抗体的制备经历至少一个纯化步骤。在具体实施方式中，本文所提供的抗体是分离的。
4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成的异四聚体糖蛋白。在IgG的情况下，4-链单元通常约为150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两条H链根据H链同种型通过一个或多个二硫键相互连接。各H链和L链也具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N端具有可变结构域(VH)，随后是α和γ链各自的三个恒定结构域(CH)，以及μ和ε同种型的四个CH结构域。每条L链在N端具有可变结构域(VL)，在其另一端具有恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。据信某些特定氨基酸残基会形成轻链和重链可变域之间的界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类型抗体的结构和特性，参见例如，《基础和临床免疫学》(Basic and ClinicalImmunology)71(Stites等编著，第8版1994)。
术语“可变区”、“可变结构域”、“V区域”或“V结构域”指通常位于轻链或重链的氨基末端且在重链中长度为约120-130个氨基酸和在轻链中长度为约100-110个氨基酸抗体轻链或重链的部分，并且用于各特定抗体与其特定抗原的特异性和结合。重链的可变区可以称之为“VH”。轻链的可变区可以称之为“VL”。术语“可变”指可变区的某些区段在序列上在抗体间广泛变化的事实。V区介导抗原结合并限定了具体抗体对其具体抗原的特异性。然而，可变性在可变区的110个氨基酸跨度中并不是均匀分布的。相反，V区由称之为框架区(FR)的约15-30个氨基酸的较少可变的(例如，相对稳定的)的延伸组成，这些延伸被称之为“超变区”长度各为9-12个氨基酸具有较大可变性(例如，极致可变性)的较短区域分隔。重链和轻链可变区各自包含4个FR，主要采用β-片层构象，通过3个超变区结合，其形成连接β-片层结构的环，并且在一些情况中，形成部分β-片层结构的部分。各链中的超变区被FR聚集在一起，紧密相邻，与另一条链的超变区一起形成抗体的抗原结合位点(参见例如，Kabat等,《免疫学感兴趣的蛋白质序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)(第5版1991))。恒定区并不直接参与抗体与抗原的结合，但是展现出各种效应物功能，诸如使抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。不同抗体之间的可变区序列差异很大。在具体实施方式中，可变区是人可变区。
术语“根据Kabat编号的可变区残基”或“根据Kabat编号的氨基酸位置”及其变化形式指用于Kabat等,引用如上中抗体汇编的重链可变区或轻链可变区的编码系统。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含较少或额外的氨基酸序列，其对应可变结构域CDR或FR的缩短或插入。例如，重链可变区可以包含残基52后的单个氨基酸插入(根据Kabat，残基52a)和残基82后的3个插入残基(例如，根据kabat，残基82a、82b和82c等)。可以通过用“标准”Kabat编号序列比对抗体序列同源性区域就给定抗体测定残基的Kabat编号。当表示可变结构域中的残基时，通常使用Kabat编号系统(大约为轻链的残基1-107和重链的残基1-113)(例如，Kabat等,引用如上)。当表示免疫球蛋重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”(例如，如Kabat等,引用如上中所报告的EU索引)。“Kabat中的EU索引”指IgG 1EU抗体的残基编号。已经描述了其他编号系统，例如，通过AbM、Chothia、Contact、IMGT和AHon，以及本领域普通技术人员所熟知的。
“完整”抗体是这样的抗体，其包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定区，CH1、CH2和CH3。恒定区可以包含人恒定区或其氨基酸序列变体。在某些实施方式中，完整抗体具有一种或多种效应物功能。
“抗体片段”包含完整抗体的部分，诸如完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的示例包括但不限于，Fab，Fab’，F(ab’)2，和Fv片段；双抗体和二-双抗体(参见例如，Holliger等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.90:6444-48；Lu等，2005，J.Biol.Chem.280:19665-72；Hudson等，2003，Nat.Med.9:129-34；WO 93/11161；和美国专利号5,837,242和6,492,123)；单链抗体分子(参见例如，美国专利号4,946,778；5,260,203；5,482,858；和5,476,786)；双可变结构域抗体(参见例如，美国专利号7,612,181)；单可变结构域抗体(sdAb)(参见例如，Woolven等，1999，Immunogenetics 50:98-101；和Streltsov等，2004，Proc Natl Acad Sci USA.101:12444-49)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
治疗性抗体的“功能性片段”、“结合片段”或“抗原结合片段”将展现出至少一种或者一些或者所有归因于完整抗体的生物功能，该功能至少包括与靶抗原结合(例如，柄蛋白-4结合片段或结合柄蛋白-4的片段)。
本文所用术语“融合蛋白”指这样的多肽，其包含抗体的氨基酸序列和异源性多肽或蛋白(例如，通常不是抗体一部分的多肽或蛋白(例如，非-抗-柄蛋白-4抗原结合抗体))的氨基酸序列.术语“融合”当与柄蛋白-4或抗-柄蛋白-4抗体关联使用时指将肽或多肽或其片段、变体和/或衍生物与异源性肽或多肽连接。在某些实施方式中，融合蛋白保留柄蛋白-4或抗-柄蛋白-4抗体的生物活性。在某些实施方式中，融合蛋白包含柄蛋白-4抗体VH区、VL区、VH CDR(1、2或3个VH CDR)和/或VL CDR(1、2或3个VL CDR)，其中融合蛋白结合柄蛋白-4表位、柄蛋白-4片段和/或柄蛋白-4多肽。
术语“重链”当参照抗体使用时指约50-70kDa的多肽链，其中氨基末端部分包含约120-130或更多个氨基酸的可变区，而羧基末端部分包含恒定区。恒定区可以是5个不同类型(例如，同种型)之一，基于重链恒定区的氨基酸序列，称之为α、δ、ε、γ和μ。不同的重链具有不同的大小，α、δ和γ含有大约450个氨基酸，而μ和ε含有大约550个氨基酸。当与轻链组合时，这些不同类型的重链产生5个熟知类型(例如，同种型)的抗体，分别为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包含4个亚型IgG，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。重链可以是人重链。
术语“轻链”当参照抗体使用时指约25kDa的多肽链，其中氨基末端部分包含约100-约110或更多个氨基酸的可变区，而羧基末端部分包含恒定区。轻链的大致长度为约211-217个氨基酸。存在两种不同的类型，基于恒定区的氨基酸序列，称之为κ或λ。本领域熟知轻链氨基酸序列。轻链可以是人轻链。
本文所用术语“宿主”指动物，如哺乳动物(例如，人)。
本文所用术语“宿主细胞”指可以经核酸分子转染的特定对象细胞以及这类细胞的后代或潜在后代。这类细胞的后代可能与经核酸分子转染的亲本细胞不相同，因为后续传代或整合核酸分子到宿主细胞基因组中可能出现的突变或环境影响。
本文所用术语“单克隆抗体”指获自基本均一抗体群体的抗体，例如，除了以少量存在的可能天然发生的突变外，群体包含的单独抗体是相同的，并且各单克隆抗体通常将识别抗原上的单一表位。在具体实施方式中，本文所用“单克隆抗体”是单一杂交瘤或其他细胞所产生的抗体，其中抗体仅结合柄蛋白-4表位，例如通过ELISA或本领域已知的其他抗原结合或竞争性结合试验所确定。术语“单克隆抗体”不限于用于生成抗体的任何特定方法。例如，能够用于本公开的单克隆抗体可以这样制备，通过首先由Kohler等,1975,Nature256:495所述的杂交瘤方法，或者通过在细菌或真核动物或植物细胞中使用重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)。也可通过例如Clackson等，Nature 352:624-28(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222:581-97(1991)所述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。用于制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其他方法为本领域技术人员所熟知。参见例如，《分子生物学简明方案》(Short Protocols in Molecular Biology)(Ausubel等编著，第5版2002)。本文所述实施例提供了产生单克隆抗体的示例性方法。
术语“天然的”当与诸如核酸分子、多肽、宿主细胞等生物材料联用时指它们存在于自然中并且未通过人为介入操纵、修饰和/或改变(例如，分离、纯化、选择)。
本文所提供的抗体可以包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种的抗体的相应序列相同或同源或者属于特定抗体类型或亚类，而该链或这些链的其余部分与衍生自另一物种的抗体的相应序列相同或同源或者属于特定抗体类型或亚类，以及这类抗体的片段，只要它们展现出有所需生物学活性(参见，美国专利号4,816,567；和Morrison等，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-55)。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是这样的嵌合抗体，其包含人免疫球蛋白(例如，受体抗体)，其中天然CDR残基被具有所需特异性、亲和力和性能的来自非人物种(例如，供体抗体)如小鼠、大鼠或兔相应的CDR的残基所取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的一个或多个FR区残基被相应的非人残基所替换。而且，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。人源化抗体重链或轻链可以包含几乎所有的至少一个或更多个可变区，其中全部或基本上全部的CDR对应于非人免疫球蛋白的那些CDR，并且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的FR。在某些实施方式中，人源化抗体将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节，参见，Jones等.,1986,Nature 321:522-25；Riechmann等,1988,Nature 332:323-29；Presta,1992,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-96；Carter等,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89；美国专利号6,800,738；6,719,971；6,639,055；6,407,213；和6,054,297。
“人抗体”具有这样的氨基酸序列，其对应于人产生的抗体和/或已经使用本文所公开用于制备人抗体的任何技术制备。人抗体的定义特异性地排除了含有非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.227:381；Marks等,1991,J.Mol.Biol.222:581)和酵母展示文库(Chao等,2006,Nature Protocols 1:755-68)。同样能够用于制备人单克隆抗体的方法述于Cole等,《单克隆抗体和癌症疗法》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)77(1985)；Boerner等,1991,J.Immunol.147(1):86-95；和van Dijk和vande Winkel,2001,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74。人抗体可以通过将抗原给予这样的转基因动物制备，所述转基因动物已经修饰以响应抗原性攻击而产生这类抗体，但是其内源性基因座已经失效，例如，小鼠(参见例如，Jakobovits,1995,Curr.Opin.Biotechnol.6(5):561-66；Brüggemann和Taussing,1997,Curr.Opin.Biotechnol.8(4):455-58；和美国专利号6,075,181和6,150,584，关于XENOMOUSETM技术)。同样参见例如，Li等,2006,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:3557-62，关于经由人B细胞杂交瘤技术生成人抗体。
“CDR”指免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ-片层框架的非框架区内的3个超变区(H1、H2或H3)，或者抗体VLβ-片层框架的非框架区内的3个超变区(L1、L2或L3)。相应地，CDR是分布于框架区序列内的可变区序列。CDR为本领域技术人员所熟知并且已经通过例如Kabat鉴定为抗体可变(V)结构域内具有最高超变性(hypervariability)的区域(Kabat等,1997,J.Biol.Chem.252:6609-16；Kabat,1978,Adv.Prot.Chem.32:1-75)。CDR区序列也通过Chothia在结构上进行了定义，这些残基不是保守β-片层框架的部分，并且因此能够适应不同的构象(Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-17)。本领域中已熟知两种术语。也已经通过AbM、Contact和IMGT定义了CDR区序列。标准抗体可变区内CDR的位置已经通过比较许多结构确定(Al-Lazikani等,1997,J.Mol.Biol.273:927-48；Morea等,2000,Methods20:267-79)。因为超变区内残基的数量随不同的抗体而编号，相对于标准位置的额外的残基通常用常规可变区编号方案中残基编号旁的a、b、c等编号(Al-Lazikani等,引用如上)。这类命名法同样为本领域技术人员所熟知。
术语“超变区”、“HVR”或“HV”当在本文中使用时指在序列中具有超可变性和/或形成结构限定的环的抗体可变区的区域。通常，抗体包含6个超变区，3个在VH中(H1、H2、H3)且3个在VL中(L1、L2、L3)。本文使用并包括许多超变区描述。Kabat互补决定区(CDR)基于序列可变性并且是最为常用的(参见例如，Kabat等.,引用如上)。Chothia指的则是结构环的位置(参见例如，Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-17)。取决于环的长度，当使用Kabat编号方法时，Chothia CDR-H1环的末端在H32和H34之间变化(这是因为Kabat编号方案将插入置于H35A和H35B；如果35A和35B都不存在，那么环在32结束；如果仅存在35A，那么环在33结束；如果同时存在35A和35B，那么环在34结束)。AbM超变区表示Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并且被牛津分子科技公司(Oxford Molecular)的AbM抗体建模软件所使用(参见例如，《抗体工程改造》(Antibody Engineering)第2卷(Kontermann和Dübel编著，第2版2010))。“contact”超变区基于可变复合物晶体结构的分析。下文注释了来自这些超变区或CDR中各种的残基。
最佳，已经开发并广泛采用了通用编号系统ImMunoGeneTics(IMGT)Information
Figure BDA0002378599980000241
(Lafranc等,2003,Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77)。IMGT是专供人类和其他脊椎动物的免疫球蛋(IG)、T细胞受体(TCR)和主要组织相容复合物(MHC)的整合信息系统。因此，就氨基酸序列和轻链或重链内的位置表示CDR。因为免疫球蛋白可变结构域结构内CDR的“位置”在物种间相对保守并以称之为环的结构存在，通过使用根据结构特征比对可变结构域序列的编号系统，容易鉴定CDR和框架残基。该信息可以用于移植或替换来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基到受体框架，其通常来自人抗体。Honegger和Plückthun,2001,J.Mol.Biol.309:657-70已经开发了额外的编号系统(AHon)。编号系统包括，例如，Kabat编号和IMGT独特编号系统，之间的对应关系为本领域技术人员所熟知(参见例如，Kabat,引用如上；Chothia和Lesk,引用如上；Martin,引用如上；Lefranc等,引用如上)。
<u>IMGT</u> <u>Kabat</u> <u>AbM</u> <u>Chothia</u> <u>Contact</u>
V<sub>H</sub> CDR1 27-38 31-35 26-35 26-32 30-35
V<sub>H</sub> CDR2 56-65 50-65 50-58 53-55 47-58
V<sub>H</sub> CDR3 105-117 95-102 95-102 96-101 93-101
V<sub>L</sub> CDR1 27-38 24-34 24-34 26-32 30-36
V<sub>L</sub> CDR2 56-65 50-56 50-56 50-52 46-55
V<sub>L</sub> CDR3 105-117 89-97 89-97 91-96 89-96
超变区可以包含如下“延伸的超变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)，和VH中的26-35或26-35A(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。本文所用术语“HVR”和“CDR”可以互换使用。
术语“恒定区”或“恒定结构域”指不直接参与抗体与抗原的结合但是展现出各种效应物功能，诸如与Fc受体相互作用的轻链和重链的羧基末端部分。该术语指免疫球蛋白分子的部分，其相对于免疫球蛋的其他部分(可变区，包含抗原结合位点)具有更加保守氨基酸序列的。该恒定区可以包含重链的CH1、CH2和CH3区和轻链的CL区。
术语“框架”或“FR”指侧接CDR的那些可变区残基。例如，FR残基存在于嵌合、人源化、人、结构域抗体、双抗体、线性抗体和双特异性抗体。FR残基是除了超变区残基或CDR残基之外的那些可变结构域残基。
“亲和力成熟的”抗体在其一个或多个HVR中具有一个或多个改变(例如，氨基酸序列变异，包括改变、添加和/或缺失)，其导致相对于不具有这些改变的亲本抗体，抗体对抗原的亲和力改善。亲和力成熟的抗体可以具有对靶抗原纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域已知的方法产生。综述参见Hudson和Souriau,2003,NatureMedicine 9:129-34；Hoogenboom,2005,Nature Biotechnol.23:1105-16；Quiroz和Sinclair,2010,Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51。
“结合亲和力”通常指分子(例如，结合蛋白，如抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。结合分子X对其结合伴侣Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文所述的那些方法。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并倾向于容易地解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并倾向于保持更长的结合。本领域已知测量结合亲和力的各种方法，出于本公开的目的，可以使用其中任一种。具体示例性实施方式包括下述。在一实施方式中，“KD”或“KD值”可以通过本领域已知的试验测量，例如，通过结合试验。KD可以在RIA中测量，例如，使用感兴趣的抗体的Fab形式和其抗原(Chen等,1999,J.MolBiol 293:865-81)。测量KD或KD值还可以通过使用表面等离振子共振试验通过
Figure BDA0002378599980000251
使用例如，
Figure BDA0002378599980000252
TM-2000或
Figure BDA0002378599980000253
TM-3000，或通过生物层干扰量度法(BiolayerInterferometry)，使用例如，
Figure BDA0002378599980000254
QK384系统。“on-速率”或“结合的速率”或“结合速率”或“kon”还可以使用上述相同的表面等离振子共振或生物层干扰量度法技术确定，使用例如，
Figure BDA0002378599980000255
TM-2000或
Figure BDA0002378599980000256
TM-3000，或者
Figure BDA0002378599980000257
QK384系统。
短语“基本上相似的”或“基本上相同的”表示来自两个图像(例如，一个与本公开的抗体相关，而另一个与参照抗体相关)的两个数值或信号(例如，IHC染色信号)之间足够高程度的相似性，从而使本领域技术人员将认为两个值或两个图像之间的差异在通过值(例如，KD值)测量的生物特征内具有小的或没有生物和/或统计学显著性。例如，两个值之间的差异可以小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％或小于约5％，随着参照抗体值而变化。
本文所用短语“基本上增加的”或“基本上降低的”或“基本上不同的”表示来自两个图像(例如，一个与本公开的抗体相关，而另一个与参照抗体相关)的两个数值或信号(例如，IHC染色信号)之间足够高程度的不同，从而使本领域技术人员将认为两个值或两个图像之间的差异在通过值测量的生物特征具有统计学显著性。例如，两个值之间的差异可以大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％、大于约50％，随着参照抗体值而变化。
抗体“效应物功能”指归因于抗体Fc区(例如，天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性，并且随着抗体同种型变化。抗体效应物功能的示例包括：C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；和B细胞活化。
如本文所用术语“有效量”指足以产生所需结果的本文所提供的抗体或药物组合物的量。
如本文所用术语“Fc区”定义了免疫球蛋白重链的C-末端区域，包括例如，天然序列Fc区，重组Fc区域和变体Fc区。虽然免疫球蛋白Fc区的边界可能变化，但是人IgG重链Fc区通常被定义为由处于位置Cys226的氨基酸残基或由Pro230延伸至其羧基末端。例如，在产生或纯化抗体的过程中，或通过重组工程改造编码抗体重链的核酸，可以去除Fc区的C-末端赖氨酸(根据EU编号系统，残基447)。相应地，完整抗体的组合物可以包含去除所有K447残基的抗体群，没有去除K447残基的抗体群，以及含有具有或没有K447残基的抗体的混合物的抗体群。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应物功能”。示例性“效应物功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；等。这类效应物功能通常需要Fc区与结合区或结合结构域(例如，抗体可变区或结构域)组合并使用所公开的各种试验评估。
“天然序列Fc区”包含与天然存在的Fc区氨基酸序列相同的氨基酸序列，并且未经人所操纵、修饰和/或改变(例如，分离、纯化、选择，包括或与其他序列诸如可变区序列组合)。天然序列人IgG1 Fc区包含天然序列人IgG1 Fc区(非-A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区，以及其天然存在的变体。例如，下文提供了天然人IgG1 Fc区氨基酸序列(SEQ ID NO:35)。
“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰(例如，取代、添加或缺失)而与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在某些实施方式中，变体Fc区相较于天然序列Fc区或相较于亲本多肽的Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如，天然序列Fc区或亲本多肽Fc区中约1-约10个氨基酸取代，或约1-约5个氨基酸取代。本文所述变体Fc区可以与天然序列Fc区和/或与亲本多肽Fc区具有至少约80％的同源性，或者与其具有至少约90％同源性，例如，与其具有至少约95％同源性。
当术语“变体”与柄蛋白-4或抗-柄蛋白-4抗体关联使用时可以指相较于天然或未修饰的序列而言含有含有一个或多个(例如，约1-约25，约1-约20，约1-15，约1-约10，或约1-约5个)氨基酸序列取代、缺失和/或添加的肽或多肽。例如，柄蛋白-4变体可以产生自对天然柄蛋白-4氨基酸序列的一个或多个(例如，约1-约25，约1-约20，约1-15，约1-约10，或约1-约5个)改变。又例如，抗-柄蛋白-4抗体的变体可以产生自对天然或先前未经修饰的抗-柄蛋白-4抗体的氨基酸序列的一个或多个(例如，约1-约25，约1-约20，约1-15，约1-约10，或约1-约5个)改变。变体可以是天然产生的，如等位基因或剪接变体，或者可以是人工构建的。多肽变体可以由编码变体的对应的核酸分子制备。在具体实施方式中，柄蛋白-4变体或抗-柄蛋白-4抗体变体相较于参照抗体至少保留对柄蛋白-4的特异性结合。在某些实施方式中，变体由核酸分子的单核苷酸多态性(SNP)变体编码，所述核酸分子编码柄蛋白或抗-柄蛋白-4抗体VH或VL区或亚区，如一个或多个CDR。
术语“载体”指用于携带或包含核酸序列的物质，包括例如，编码本文所述抗-柄蛋白-4抗体的核酸序列，从而将核酸序列导入宿主细胞。适合使用的载体包括例如，表达载体，质粒，噬菌体载体，病毒载体，附加体和人工染色体，其可以包括可操作地用于稳定整合到宿主细胞染色体的标志物或选择序列。或者，载体可以包含一个或多个可选择标志物基因和适当的表达控制序列。例如，可以包括的可选择标志物基因提供了对抗体或毒素的抗性，补充营养缺陷，或提供生长培养基中不存在的关键营养素。表达控制序列可以包含组成型和诱导型启动子，转录增强子，转录终止子等，其均为本领域所熟知。当两个或更多个核酸分子将共表达(例如，抗体重链和轻链，或者抗体VH和VL)时，可以将核酸分子插入，例如，单个表达载体或分开的表达载体中。对于单个表达载体，编码核酸可以操作性地连接一个常见表达控制序列或连接不同的表达控制序列，如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。将核酸分子导入宿主细胞可以使用本领域所熟知的方法确认。这类方法包括例如，核酸分析，如Northern印迹或mRNA的聚合酶链式反应(PCR)扩增，针对基因产物表达的免疫印迹，或其他合适的分析性方法以测试导入的核酸序列或其对应的基因产物的表达。本领域技术人员应当理解的是，核酸分子以足够的量表达以产生所需产物(例如，本文所述的抗-柄蛋白-4抗体)，并且应当进一步理解的是，使用本领域所熟知的方法，可以优化表达水平以获得足够的表达。
柄蛋白-4多肽“胞外域”或“ECD”指基本上不含跨膜和胞质结构域的柄蛋白-4多肽的形式。例如，柄蛋白-4多肽ECD可以具有少于1％的这类跨膜和/或胞质结构域，并且可以具有少于0.5％的这类结构域。
术语“相同性(identity)”指通过比对和比较序列确定两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子序列之间的关系。相对于参照多肽序列的“氨基酸序列相同性百分数(％)”定义为，比对序列并导入缺口后(如果需要)以实现最大序列相同性百分比之后，候选序列中与参照多肽序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，且不考虑将任何保守性取代作为序列相同性的部分。以测定氨基酸序列相同性百分率为目的比对可以本领域技术范围内的不同方式实现，例如，使用公共渠道可获得的计算机软件如BLAST，BLAST-2，ALIGN或MEGALIGN(DNAStar有限公司)软件。本领域技术人员能够确定用于比对序列的合适参数，包括使比较的序列实现全长最大对齐所需的任何算法。
氨基酸残基/位置的“修饰”是指氨基酸一级序列与起始氨基酸序列相比的变化，其中该变化由涉及所述氨基酸残基/位置的序列改变所致。例如，典型的修饰包括用另一氨基酸取代残基(例如，保守或非保守取代)，在所述残基/位置邻近插入一个或多个(例如，通常少于5、4或3个)氨基酸，和/或使所述残基/位置缺失。
“表位”是抗原分子表面上结合单个抗体分子的位点，如抗原(如柄蛋白-4多肽、柄蛋白-4多肽片段)表面上的局部区域，其能够结合抗体的一个或多个抗原结合区，并且在动物如哺乳动物(例如，人)中具有抗原或免疫原性活性，其能够激发免疫应答。具有免疫原性活性的表位是在动物中激发抗体应答的多肽的部分。具有抗原活性的表位是由本领域所熟知的任何方法，包括例如免疫试验，所确定结合抗体的多肽的部分。抗原表位不一定需要是免疫原性的。表位常常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成且有特定的三维结构性质以及特定的电荷性质。抗体表位可为线性表位或具有构象的表位。线性表位通过蛋白质中的连续序列形成。构象表位由蛋白质序列中不连续的氨基酸形成，但是它们在蛋白质折叠成其三维结构后聚集在一起。当蛋白质的三维结构处于改变的构象时，诸如激活或结合另一蛋白质或配体后，形成诱导型表位。在某些实施方式中，柄蛋白-4表位是柄蛋白-4多肽的三维表面特征。在其他实施方式中，柄蛋白-4表位是柄蛋白-4多肽的线性特征。通常，抗原具有数个或许多不同的表位并且可以与许多不同的抗体反应。
当某种抗体与参照抗体在三维空间中中识别相同、重叠或邻近表位时，该抗体与参照抗体结合“表位”、“基本上相同的表位”或“相同的表位”。用于确定两种抗体是否结合三维空间中相同、重叠或邻近表位所广泛使用且快速的方法是竞争性试验，其可以许多不同的形式设置，例如，使用标记的抗原或标记的抗体。在一些实施方式中，抗原固定于96孔板，或表达于细胞表面，并且未标记的抗体阻断标记的抗体结合的能力使用放射性、荧光或酶标记测量。
“表位作图”是鉴别抗体在其目标抗原上结合位点或表位的过程。“表位分类(epitope binning)”是基于抗体所识别的表位对抗体进行分组的过程。更具体而言，表位分类包括用于辨别不同抗体的表位识别特性的方法和系统，使用与基于抗体的表位识别特性的抗体聚类结合的竞争试验以及识别具有特定结合特异性的抗体的计算过程。
本文所用“运载体”包括药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂，其对以所用剂量和浓度暴露于的细胞或哺乳动物没有毒性。生理学上可接受的运载体通常是水性pH缓冲溶液。生理学上可接受的运载体的示例包括，缓冲液，如磷酸，柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(例如，少于约10个氨基酸残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨糖醇；成盐的抗衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM，聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。术语“运载体”还可以指稀释剂，佐剂(例如，弗氏佐剂(完全或不完全))，赋形剂或载剂。这类运载体，包括药物运载体，可以是无菌液体，如水和油，包括来自石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等。当静脉内给予组合物(例如，药学组合物)时，水是示例性运载体。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体运载体，特别适用于注射液。合适的赋形剂(例如，药物赋形剂)包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物也可含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂等的形式。口服组合物，包括制剂，可含有标准运载体，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物运载体的示例述于Remington和Gennaro,《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(第18版1990)。组合物，包括药物化合物，可以包含抗-柄蛋白-4抗体，例如，处于分离或纯化的形式，以及合适量的运载体。
本文所用术语“药学上可接受的”表示经联邦或州政府管理机构批准，或《美国药 典》(United States Pharmacopeia)、《欧洲药典》(European Pharmacopeia)或其它公认药典所列用于动物应用，更具体用于人。
本文所用“多克隆抗体”指对具有许多表位的蛋白质的免疫原性响应中生成的抗体群并且因此包括涉及蛋白质内相同或不同表位的各种不同蛋白质。。用于制造多克隆抗体的方法为本领域所知(参见例如，《分子生物学简明方案》(Short Protocols inMolecular Biology)(Ausubel等编著，第5版2002)。
“分离核酸”是这样的核酸，例如，RNA、DNA或混合的核酸，其基本上分离自其他基因组DNA序列以及蛋白质或复合物如核糖体和聚合酶，其天然伴随着天然序列。“分离的”核酸分子是分离自存在于核酸分子天然来源的其他核酸分子的核酸分子。此外，“分离的”核酸分子，如cDNA分子，通过重组技术产生时，可以基本不含其它细胞物质或培养基，或通过化学方法合成时，基本不含化学物质前体或其它化学物质。在具体实施方式中，编码本文所述抗体的一种或多种核酸分子经分离或纯化。该术语涵盖已经从其天然存在的环境中移除的核酸序列，并且包括重组或克隆DNA分离物和通过异源系统生物合成的类似物或化学合成的类似物。基本上纯的分子可以包括分子的分离形式。
本文所用“多核苷酸”或“核酸”在本文可以互换使用，指代任何长度的核苷酸聚合物并包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或者可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应纳入聚合物的任何底物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和其类似物。本文所用“寡核苷酸”指短的，通常为单链，合成的多核苷酸，它们通常(但是不是必需)的长度小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”彼此并不互相排斥。对于多核苷酸的上述描述同样也完全适用于寡核苷酸。产生本公开抗-柄蛋白-4抗体的细胞可以包括亲本杂交瘤细胞，以及细菌和真核宿主细胞，其中已经导入了编码抗体的核酸。如下公开了合适的宿主细胞。
除非另有说明，本文所公开的单链多核苷酸序列的左手端为5’端；双链多核苷酸序列的左手方向称作5’方向。新生RNA转录本的5'至3'方向称作转录方向；DNA链上具有与RNA转录本相同序列且为RNA转录本5'端的5'的序列区域称作“上游序列”；DNA链上具有与RNA转录相同的序列且为RNA转录本3'端的3'的序列区域称作“下游序列”。
术语“重组抗体”指通过重组手段制备、表达、创造或分离的抗体。重组抗体可以是：使用转染到宿主细胞的重组表达细胞表达的抗体，分离自重组、组合人抗体库的抗体，分离自人免疫球蛋白基因转基因和/或转染色体(transchromosomal)动物(例如，小鼠或牛)的抗体(Taylor等,1992,Nucl.Acids Res.20:6287-95)或通过涉及剪接免疫球蛋基因序列至其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、创造或分离的抗体。这类重组抗体可以具有可变区和恒定区，包括源自人种系免疫球蛋白序列的那些(参见，Kabat等，引用如上)。然而，在某些实施方式中，这类重组抗体可以经历体外诱变(或者，当使用人Ig序列转基因动物，体内体诱变)，因此对重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列进行测序，虽然衍生自或与人种系VH和VL序列相关，其可能并不天然出现在体内人抗体种系库(repertoire)内。
术语“对象”和“患者”可互换使用。在一些实施方式中，本文所用的对象是指哺乳动物，如非灵长类动物(例如，牛，猪，马，猫，狗，大鼠等)或灵长类动物(例如，猴子和人)。在具体实施方式中，该对象是人。在一实施方式中，对象是诊断患有本文所提供的病症或紊乱的哺乳动物，例如，人。在另一实施方式中，对象是处于发展出本文所提供的病症或紊乱的风险中的哺乳动物，例如，人。
“基本上所有”指至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或约100％。
术语“可检测探针”指提供可检测信号的组合物。该术语包括但不限于，经由其活性提供可检测信号的任何荧光团，发色团，放射性标记，酶，抗体或抗体片段等。
术语“可检测试剂”指可以用于探查样品或对象中所需分子如本文所述抗-柄蛋白-4抗体存在或出现的物质。可检测试剂可以是能够可见的物质，或者是需要以其他方式确定和/或测量(例如，通过定量)的物质。
术语“诊断剂”指给予对象协助诊断疾病、紊乱或病症的物质。这类物质可以用于揭示，查明和/或定义致病过程的定位。在某些实施方式中，诊断剂包括当其单独或与物质偶联时的本文所述的抗-柄蛋白-4抗体或其片段，并给予对象或与来自对象的样品接触，协助诊断柄蛋白-4介导的疾病。
术语“编码核酸”或其语法上的等同形式当其用于指代核酸分子时指处于其天然状态的核酸分子或者当通过本领域技术人员所熟知的方法操纵时可以经转录以产生mRNA，然后其被翻译成多肽或其片段。反义链与这类核酸分子互补，并且可以由此推导出编码序列。
术语“赋形剂”指这样的惰性物质，其通常用作稀释剂、载剂、防腐剂、粘合剂或稳定剂，包括但不限于，蛋白质(例如，血清白蛋白等)，氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，精氨酸，甘氨酸，组氨酸等)，脂肪酸和磷脂(例如，烷基磺酸酯，辛酸等)，表面活性剂(例如，SDS，聚山梨酸酯，非离子表面活性剂等)，糖类(例如，蔗糖，麦芽糖，海藻糖等)和多元醇(例如，甘露醇，山梨糖醇等)。同样参见Remington和Gennaro,《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(第18版1990)，其通过引用全文纳入本文作参考。
在肽或多肽的上下文中，本文所用术语“片段”指含有小于全长氨基酸序列的肽或多肽。例如，这类片段可以来自于氨基酸末端的截短，羧基末端的截短和/或氨基酸序列残基的内部缺失。例如，片段可以产生自选择性RNA剪接或原位蛋白酶活性。在某些实施方式中，柄蛋白-4片段或抗-柄蛋白-4抗体片段包括含有这样氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列为柄蛋白-4片段或抗-柄蛋白-4抗体氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少30个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325、至少350、至少375、至少400、至少425、至少450、至少475、至少500、至少525或至少550个连续氨基酸残基。在具体实施方式中，柄蛋白-4多肽或抗-柄蛋白-4抗体的片段保留至少1项、至少2项、至少3项或更多项多肽或抗体的功能。
术语“约”或“大致”表示给定值或范围内20％、内15％、内10％、内9％、内8％、内7％、内6％、内5％、内4％、内3％、内2％、内1％或更少。
“给予”或“给药”指注射或以其他方式物理递送存在于体外的物质(例如，本文所述抗-柄蛋白-4抗体)到患者中，如通过粘膜、皮内、静脉内、肌肉内递送，和/或本文所述或本领域已知的任何其他物理递送方法。
在多肽的上下文中，本文所用术语“类似物”指这样的多肽，其与柄蛋白-4多肽、柄蛋白-4多肽的片段或抗-柄蛋白-4抗体具有相似或相同功能，但是并不必须包含与柄蛋白-4多肽、柄蛋白-4多肽的片段或抗-柄蛋白-4抗体相似或相同的氨基酸序列，或者具有与柄蛋白-4多肽、柄蛋白-4多肽的片段或抗-柄蛋白-4抗体相似或相同的结构。具有相似氨基酸序列的多肽指满足下述至少一种内容的的多肽：(a)具有这样氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与本文所述柄蛋白-4多肽、柄蛋白-4多肽的片段或抗-柄蛋白-4抗体的氨基酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同；(b)由这样的核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列在严谨条件下与编码本文所述的柄蛋白-4多肽、柄蛋白-4多肽的片段或抗-柄蛋白-4抗体(或其VH或VL区)的核苷酸序列在至少5个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少15个氨基酸残基、至少20个氨基酸残基、至少25个氨基酸残基、至少30个氨基酸残基、至少40个氨基酸残基、至少50个氨基酸残基、至少60个氨基残基、至少70个氨基酸残基、至少80个氨基酸残基、至少90个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基、至少125个氨基酸残基或至少150个氨基酸残基处杂交(参见例如，Sambrook等,《分子克隆： 实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(2001)；和Maniatis等,《分子克 隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(1982))；或(c)由这样的核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列与编码本文所述的柄蛋白-4多肽、柄蛋白-4多肽的片段或抗-柄蛋白-4抗体(或其VH或VL区)的核苷酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同。具有与本文所述柄蛋白-4多肽、柄蛋白-4多肽的片段或抗-柄蛋白-4抗体相似结构的多肽指这样的多肽，其具有与本文所述的柄蛋白-4多肽、柄蛋白-4多肽的片段或抗-柄蛋白-4抗体相似的二级、三级或四级结构。多肽的结构可以通过本领域技术人员已知的方法确定，包括但不限于，X射线晶体学，核磁共振和晶体电子显微镜。
在多肽的上下文中，本文所用术语“衍生物”指这样的多肽，其包含与已经通过导入氨基酸残基取代、缺失或添加而改变的柄蛋白-4多肽、柄蛋白-4多肽的片段或与柄蛋白-4多肽结合的抗-柄蛋白-4抗体的氨基酸序列。本文所用术语“衍生物”还指这样的柄蛋白-4多肽、柄蛋白-4多肽的片段或与柄蛋白-4多肽结合的抗体，其已经化学修饰，例如，通过共价连接任何类型的分子与多肽。例如但不限于，柄蛋白-4多肽、柄蛋白-4多肽的片段或抗-柄蛋白-4抗体可以经化学修饰，例如，通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/阻断基团衍生、蛋白水解切割、化学切割、制剂化、衣霉素的代谢合成、连接于细胞配体或其它蛋白质等。以与天然产生的或起始肽或多肽不同的方式(连接的分子的位置或类型上)修饰衍生物。衍生物还包含一个或多个化学基团的缺失，所述化学基团天然存在于肽或多肽上。此外，柄蛋白-4多肽、柄蛋白-4多肽的片段或抗-柄蛋白-4抗体可以包含一种或多种非经典氨基酸。多肽衍生物具有与本文所述柄蛋白-4多肽、柄蛋白-4多肽的片段或抗-柄蛋白-4抗体相似或相同的功能。
术语“组合物”旨在涵盖含有特定成分(例如，本文所提供的抗体)的产物，任选地，处于特定的量。
本文所用术语“预防”、“阻止”和“防止”指通过给予本文所提供的疗法或疗法的组合(例如，预防性或治疗性试剂如本文所提供的抗体的组合)来完全或部分抑制柄蛋白-4介导的疾病和/或与之相关的症状的发展、复发、发作或传播。
本文所用术语“预防性试剂”指可以完全或部分抑制对象中柄蛋白-4介导的疾病和/或与之相关的症状的发展、复发、发作或传播的任何试剂。在某些实施方式中，术语“预防性试剂”指本文所提供的抗体。在某些其他实施方式中，术语“预防性试剂”指除了本文所提供的抗体以外的试剂。在一些实施方式中，预防性试剂是已知将能够用于或者已经或者当下正在被用于预防柄蛋白-4介导的疾病和/或与之相关的症状或阻碍柄蛋白-4介导的疾病和/或与之相关的症状的发作、发展、进展和/或严重程度的试剂。在具体实施方式中，治疗性试剂是完全人抗-柄蛋白-4抗体，如完全人抗-柄蛋白-4单克隆抗体。
在某些实施方式中，“预防有效的血清效价”是对象诸如人中这样的血清效价，其完全或部分抑制所述对象中柄蛋白-4介导的疾病和/或与之相关的症状的发展、复发、发作或传播。
“柄蛋白-4介导的疾病”和“柄蛋白-4介导的紊乱”在本文可以互换使用并且指由柄蛋白-4完全或部分所导致，为其结果或与之关联的任何疾病。在某些实施方式中，柄蛋白-4在细胞表面上异常(例如，高)表达。在一些实施方式中，柄蛋白-4在特定细胞类型上被异常上调。在其他实施方式中，柄蛋白-4与柄蛋白-4抗体的结合导致正常、异常或过量细胞信号转导。在一些实施方式中，柄蛋白-4介导的疾病是其中柄蛋白-4可以用作对象(例如，人)中生物标志物的疾病。在一些实施方式中，柄蛋白-4介导的疾病是其中柄蛋白-4表达可以反映对象(例如，人)中疾病进展或预后的疾病。在某些实施方式中，柄蛋白-4配体是柄蛋白-4受体，例如，表达于细胞表面的柄蛋白-4受体。
本文所用术语“血清效价”指至少10、至少20、至少30或至少40个对象上至约100、1000或更多个对象的群体中的平均血清效价。
本文所用术语“副作用”涵盖疗法(例如，预防性或治疗性试剂)不需要的或不利作用。不需要的作用并不一定是不利的。疗法(例如，预防性或治疗性试剂)的不利作用可能是有害的或不适的或者有风险的。副作用的示例包括腹泻，咳嗽，肠胃炎，喘息，恶心，呕吐，厌食，腹部绞痛，发烧，疼痛，体重减轻，脱水，脱发，呼吸困难，失眠，头晕，粘膜炎，神经和肌肉效应，疲劳，口干和食欲不振，给药部位出现皮疹或肿胀，类似流感的症状，如发烧，发冷和疲倦，消化道问题和过敏反应。患者所经历的其他不希望的作用有许多并且为本领域所知。许多述于《医生案头参考》(Physician’s Desk Reference)(第60版，2006)。
本文所用术语“治疗性试剂”指可以用于治疗、控制或改善柄蛋白-4介导的疾病和/或与之相关的症状的任何试剂。在某些实施方式中，术语“治疗性试剂”指本文所提供的抗体。在某些其他实施方式中，术语“治疗性试剂”指除了本文所提供的抗体以外的试剂。在一些实施方式中，治疗性试剂是已知将能够用于或者已经或者当下正在被用于治疗、控制或改善柄蛋白-4介导的疾病和/或与之相关的症状的试剂。
疗法(例如，使用预防性或治疗试剂)的组合比任何两种或更多种单一疗法的累加效应更有效。例如，预防性和/或治疗性试剂的组合的协同效应比单独的单一试剂更有效和/或允许使用较低剂量的一种或更多种试剂和/或向患有柄蛋白-4介导的疾病的患者更低频率地给予所述试剂。利用较低剂量的预防性或治疗性疗法和/或更低频率给予所述疗法的能力降低了与向对象给予所述疗法相关的毒性，而不会降低所述疗法在预防、控制、治疗或改善柄蛋白-4介导的疾病中的功效。此外，协同效应可以导致疗法在在预防、控制、治疗或改善柄蛋白-4介导的疾病中的功效改善。最终，疗法(例如，预防性或治疗性试剂)的组合的协同效应可以避免或减少与使用任何单一疗法相关的不利或不希望的副作用。
在某些实施方式中，“治疗有效的血清效价”是对象诸如人中这样的血清效价，其降低所述对象中与柄蛋白-4介导的疾病相关的严重程度、持续时间和/或症状。
本文所用术语“疗法/治疗”指可以用于预防、控制、治疗和/或改善柄蛋白-4介导的疾病任何方案、方法和/或试剂。在某些实施方式中，术语“疗法”和“治疗”指生物疗法，支持性疗法和/或本领域技术人员如医疗工作者所知能够用于预防、管理、治疗和/或改善柄蛋白-4介导的疾病的其他疗法。
本文所用术语“治疗”、“处理”和“进行治疗/处理”指通过给予一种或多种疗法(包括但不限于，给予一种或多种预防性或治疗性试剂，如本文所提供的抗体)导致降低或改善柄蛋白-4介导的疾病的进展、严重程度和/或持续时间。
本文所用术语“控制”、“管理”和“调控”指对象由疗法(例如，预防性或治疗性试剂)中所获得的有益效果，其不导致治愈与柄蛋白-4相关的病症。在某些实施方式中，给予对象一种或多种疗法(例如，预防性或治疗性试剂，如本文所述的抗体)以“控制”本文所述病症或紊乱，其一种或多种症状，从而防止疾病或病症的进展或恶化。
本文所用术语“预防”、“阻止”和“防止”指通过给予本文所提供的疗法或疗法的组合(例如，预防性或治疗性试剂如本发明的抗体的组合)来全部或部分抑制柄蛋白-4介导的疾病和/或与之相关的症状的发展、复发、发作或传播。
如本文所用，“给予”或“给药”指注射或以其他方式物理递送物质(例如，本文所提供的抗-柄蛋白-4抗体或其抗原结合片段)到对象或患者(例如，人)中，如通过粘膜、局部、皮内、肠胃外、静脉内、皮下、肌肉内递送，和/或本文所述或本领域已知的任何其他物理递送方法。
本文所用术语“有效量”或“治疗有效量”指足以降低和/或减轻给定病症、紊乱或疾病和/或与之相关的症状的严重程度和/或持续时间的疗法(例如，本文所提供的抗体或药物组合物)的量。这些术语还涵盖降低、减缓或改善给定疾病恶化或进展，降低、减缓或改善给定疾病复发、发展或发作，和/或改善或增强另一疗法(例如，除了本文所提供的抗-柄蛋白-4抗体以外其他的疗法)预防性或治疗性效果所需要的量。在一些实施方式中，本文所用“有效量”还指本文所述抗体实现特定结果的量。
本文所用术语“稳定性”和“稳定的”在含有免疫特异性结合柄蛋白-4抗原的抗体的液体制剂的下文中指在给定生产、制备、运输和储存条件下，制剂中抗体对热和化学折叠、聚集、降解或片段化的抗性。本文所提供的“稳定的”制剂在给定生产、制备、运输和储存条件下保留等于或者超过80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.5％的生物活性。抗体的稳定性可以通过相较于参照抗体的聚集、降解或片段化程度评估，通过本领域技术人员已知的方法，包括但不限于，降低的毛细管凝胶电泳(rCGE)，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和HPSEC。包含免疫特异性结合柄蛋白-4抗原的抗体的制剂的整体稳定性可以通过各种免疫试验评估，包括例如，使用柄蛋白-4特定表位的放射免疫试验和ELISA。在一些示例性制剂中，抗-柄蛋白-4抗体可以稳定2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、1年、18个月、2年、3年或更长。
本文所用术语“基本上不含表面活性剂”指免疫特异性结合柄蛋白-4抗原的抗体的制剂，所述制剂包含少于0.0005％、少于0.0003％或少于0.0001％的表面活性剂和/或少于0.0005％、少于0.0003％或少于0.0001％的表面活性剂。
本文所用术语“基本上不含盐”指免疫特异性结合柄蛋白-4抗原的抗体的制剂，所述制剂包含少于0.0005％、少于0.0003％或少于0.0001％的无机盐。
本文所用术语“无机盐”指不包含产生自通过金属或类似金属作用的基团取代部分或全部酸氢或酸而产生的碳的任何化合物，并且通常在药物组合物和生物材料制备物中用作张力调节化合物。最常见的无机盐为NaCl、KCl、NaH2PO4等。
本文所用术语“表面活性剂”指具有两性结构的有机物质；即，它们由具有相反溶解趋势的基团组成，通常是油溶性烃链和水溶性离子基团。依据表面活性部分的电荷，表面活性剂可以分类成阴离子、阳离子和非离子表面活性剂。表面活性剂通常用作各种药物组合物和生物材料的制备物的润湿剂，乳化剂，增溶剂和分散剂。
8.组合物和制造方法
本文提供了抗体，所述抗体免疫特异性地结合柄蛋白-4多肽，柄蛋白-4多肽片段或柄蛋白-4表位。本文还提供了编码这样抗体的分离核酸，所述抗体免疫特异性地结合柄蛋白-4多肽，柄蛋白-4多肽片段或柄蛋白-4表位。进一步提供了含有编码这样抗体的核酸的载体和宿主细胞，所述抗体免疫特异性地结合柄蛋白-4多肽，柄蛋白-4多肽片段或柄蛋白-4表位。还提供了制造这样抗体的方法，所述抗体免疫特异性地结合柄蛋白-4多肽，柄蛋白-4多肽片段或柄蛋白-4表位。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体结合人和/或猕猴柄蛋白-4。在一实施方式中，柄蛋白-4抗体结合人柄蛋白-4。在一实施方式中，柄蛋白-4抗体结合猕猴柄蛋白-4。在一实施方式中，柄蛋白-4抗体结合人柄蛋白-4和猕猴柄蛋白-4。在其他实施方式中，本文所提供的抗体不结合啮齿动物柄蛋白-4。
在一些实施方式中，抗-柄蛋白-4抗体结合柄蛋白-4的胞外域(ECD)。在某些实施方式中，抗-柄蛋白-4抗体结合柄蛋白-4的ECD中的表位，这不同于柄蛋白-4配体结合位点。
还提供了抗体，其竞争性地阻断本文所提供的抗-柄蛋白-4抗体结合柄蛋白-4多肽。
还提供了抗体，其与本文所提供的抗-柄蛋白-4抗体竞争结合柄蛋白-4多肽。
在一些实施方式中，抗-柄蛋白-4抗体不阻断柄蛋白-4配体与柄蛋白-4多肽的结合。
在一些实施方式中，抗-柄蛋白-4抗体不与柄蛋白-4配体竞争结合柄蛋白-4多肽。
在某些实施方式中，柄蛋白-4配体与柄蛋白-4的结合不被抗体抑制。
本文所提供的抗-柄蛋白-4抗体还可以与例如诊断剂、可检测试剂和/或试剂偶联或重组融合。进一步提供了含有抗-柄蛋白-4抗体的组合物。
本文还提供了分离的核酸分子，其编码结合柄蛋白-4多肽、柄蛋白-4多肽片段、柄蛋白-4肽或柄蛋白-4表位的抗-柄蛋白-4抗体的免疫球蛋白重链，轻链，VH区，VL区，VHCDR1，VH CDR2，VH CDR3，VL CDR1，VL CDR2和/或VL CDR3。
进一步提供了含有编码抗-柄蛋白-4抗体的核酸分子的载体和宿主细胞，所述抗-柄蛋白-4抗体结合柄蛋白-4多肽，柄蛋白-4多肽片段或柄蛋白-4表位。还提供了制造这样抗体的方法，所述抗体结合柄蛋白-4多肽，柄蛋白-4多肽片段、柄蛋白-4肽或柄蛋白-4表位。
在一实施方式中，本公开提供了抗-柄蛋白-4抗体，其可用作为本文所述的诊断剂。示例性的抗体包括多克隆、单克隆、人源化、人和异源偶联抗体，以及其亲和力或其他特性改善的变体。
9.抗-柄蛋白-4抗体
本文了提供抗体，包括但不限于，合成抗体，单克隆抗体，重组产生的抗体，人抗体，人源化抗体，嵌合抗体，双特异性抗体，内抗体，单链Fv(scFv)，骆驼化抗体，Fab片段，F(ab’)片段，二硫键连接的Fv(sdFv)，抗独特型(抗-Id)抗体和上述任一种的表位结合片段。
具体地，本文所提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特异性结合柄蛋白-4抗原的抗原结合位点的分子。本文所提供的免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。在具体实施方式中，本文所提供的抗体是IgG抗体，如IgG1抗体。
抗体的变体和衍生物包括保留特异性结合表位能力的抗体片段。示例性的片段包括：Fab片段(这样的抗体片段，其含有抗原结合结构域并包含轻链通过以及二硫键桥接的部分重链)；Fab'(这样的抗体片段，其包含含有Fab的单个抗结合结构域以及通过铰链区的重链)；F(ab')2(通过重链铰链区中的二硫键连接的两个Fab'分子；Fab'可以针对相同或不同的表位)；包含可变区的单链Fab链，也称之为sFv(抗体单个轻链和重链的可变抗原结合决定区，通过10-25个氨基酸的链连接在一起)；二硫键连接的Fv，或dsFv(抗体单个轻链和重链的可变抗原结合决定区，通过二硫键连接在一起)；骆驼化的VH(抗体单个重链的可变抗原结合决定区，其中VH界面处的一些氨基酸存在于自然产生的骆驼抗体的重链中)；双抗体(当第一sFv的VH结构域与第二sFv的VL结构域组装时和第一sFv的VL结构域与第二sFv的VH结构域组装时形成的二聚化的sFv；双抗体的两个抗原结合结构域可以针对相同或不同的表位)；和三抗体(三聚化的sFv，以类似于双抗体的方式形成，但是其中3个抗原结合结构域以单个复合物创造；3个抗原结合结构域可以针对相同或不同的表位)。抗体的衍生物还包括抗体结合位点的一条或更多条CDR序列。当两条或更多条CDR序列存在时，CDR序列可以在支架上连接在一起。在某些实施方式中，本文所提供的抗体包含单链Fv(“scFv”)。scFv是包含抗体VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其能够令scFv形成抗原结合所需的结构。有关scFv的综述参见Pluckthun，《单克隆抗体药理学》(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies),第113卷,Rosenburg和Moore编著施普林格出版社(Springer-Verlag),纽约,第269-315页(1994)。
本文所提供的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟和哺乳动物(例如，人、鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡)。在某些实施方式中，本文所提供的抗体是人或人源化的单克隆抗体。如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体并且包括分离自人免疫球蛋白文库或表达来自人基因的抗体的小鼠的抗体。
在某些实施方式中，抗体是完全人抗体，如免疫特异性地结合柄蛋白-4多肽，柄蛋白-4多肽片段或柄蛋白-4表位的完全人抗体。当给予对象时，这类完全人抗体将优于完全小鼠(或其他完全或部分非人物种抗体)、人源化抗体或嵌合抗体以使不希望或不需要的副作用，如针对非完全人抗体(例如，源自其他物种的抗-柄蛋白-4抗体)的免疫响应的发展最小化。
在一实施方式中，本文提供的抗体可以包括具有两个抗体或其抗原结合片段的双特异性抗体或其抗原结合片段，其各自针对柄蛋白-4上不同的表位。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体对柄蛋白-4多肽给定的表位具有单特异性并且不免疫特异性地结合其他表位。
在一些实施方式中，本文提供了这样的抗体，所述抗体结合柄蛋白-4，包括柄蛋白-4多肽，柄蛋白-4多肽片段、柄蛋白-4肽或柄蛋白-4表位。在一实施方式中，本文所提供的抗体结合人柄蛋白-4。在另一实施方式中，本文所提供的抗体结合猕猴柄蛋白-4。在另一实施方式中，本文所提供的抗体结合人柄蛋白-4和猕猴柄蛋白-4。在一些实施方式中，抗-柄蛋白-4抗体不阻断柄蛋白-4配体与柄蛋白-4多肽的结合。在其他实施方式中，抗-柄蛋白-4抗体是人源化抗体(例如，包含人恒定区)，其结合柄蛋白-4，包括柄蛋白-4多肽，柄蛋白-4多肽片段、柄蛋白-4肽或柄蛋白-4表位。
在一实施方式中，包含抗体的组合物以及使用本文所提供的抗体的方法的抗体包括M22-321b41.1抗体。本文还提供了产生M22-321b41.1抗体的杂交瘤。在一些实施方式中，M22-321b41.1抗体产生自M22-321b41.1杂交瘤细胞系。在一些实施方式中，M22-321b41.1抗体具有鼠IgG2a/κ同种型。
M22-321b41.1是小鼠来源的杂交瘤细胞系。M22-321b41.1杂交瘤细胞系于2017年6月13日保藏(ATCC登录号PTA-124245)。
在某些实施方式中，抗-柄蛋白-4抗体包含本文所述鼠单克隆抗体的VH区、VL区、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3，诸如表1中所述的氨基酸序列。因此，在一些实施方式中，本文所提供的分离的抗体或其功能性片段包含抗-柄蛋白-4抗体M22-321b41.1的1、2和/或3个重链CDR和/或1、2和/或3个轻链CDR。
表1：抗体M22-321b41.1 CDR序列
Figure BDA0002378599980000421
在一些实施方式中，本文所提供的抗体包含或由6个CDR组成，例如，表1中所鉴定的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在一些实施方式中，本文所提供的抗体可以包含少于6个CDR。在一些实施方式中，抗体包含或由1、2、3、4或5个CDR组成，所述CDR选自下组：表1中所鉴定的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在一些实施方式中，抗体包含或由1、2、3、4或5个CDR组成，所述CDR选自下组：单克隆抗体M22-321b41.1的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体包含表1中所列的1个或多个(例如，1、2或3个)VH CDR。在其他实施方式中，本文所提供的抗体包含表1中所列的1个或多个(例如，1、2或3个)VL CDR。在其他实施方式中，本文所提供的抗体包含表1中所列的1个或多个(例如，1、2或3个)VH CDR和表1中所列的1个或多个VL CDR。因此，在一些实施方式中，抗体包含具有氨基酸序列的VH CDR1，所述氨基酸序列选自下组：Kabat VH CDR1(SEQ ID NO:15)、Chothia VH CDR1(SEQ ID NO:16)、Contact VH CDR1(SEQ ID NO:17)和示例性VH CDR1(SEQ ID NO:14)。在一些实施方式中，抗体包含具有氨基酸序列的VH CDR2，所述氨基酸序列选自下组：Kabat VH CDR2(SEQ ID NO:19)、Chothia VH CDR2(SEQ ID NO:20)、ContactVH CDR2(SEQ ID NO:21)和示例性VH CDR2(SEQ ID NO:18)。在一些实施方式中，抗体包含具有氨基酸序列的VH CDR3，所述氨基酸序列选自下组：Kabat VH CDR3(SEQ ID NO:23)、Chothia VH CDR3(SEQ ID NO:23)、Contact VH CDR3(SEQ ID NO:24)和示例性VH CDR3(SEQ ID NO:22)。在一些实施方式中，抗体包含独立地选自表1中所述VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3氨基酸序列中任一种的VH CDR1和/或VH CDR2和/或VH CDR3。在一些实施方式中，抗体包含具有氨基酸序列的VL CDR1，所述氨基酸序列选自下组：Kabat VL CDR1(SEQ ID NO:7)、Chothia VL CDR1(SEQ ID NO:7)、Contact VL CDR1(SEQ ID NO:8)和示例性VL CDR1(SEQ ID NO:7)。在另一实施方式中，抗体包含具有氨基酸序列的VL CDR2，所述氨基酸序列选自下组：Kabat VL CDR2(SEQ ID NO:10)、Chothia VL CDR2(SEQ ID NO:10)、Contact VLCDR2(SEQ ID NO:11)和示例性VL CDR2(SEQ ID NO:9)。在一些实施方式中，抗体包含具有氨基酸序列的VL CDR3，所述氨基酸序列选自下组：Kabat VL CDR3(SEQ ID NO:12)、Chothia VL CDR3(SEQ ID NO:12)、Contact VL CDR3(SEQ ID NO:13)和示例性VL CDR3(SEQ ID NO:12)。在一些实施方式中，抗体包含独立地选自表1中所述VL CDR1、VL CDR2、VLCDR3氨基酸序列中任一种的VL CDR1和/或VL CDR2和/或VL CDR3。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含：(1)具有选自下组的氨基酸序列的VH CDR1：Kabat VH CDR1(SEQ ID NO:15)，Chothia VH CDR1(SEQID NO:16)，Contact VH CDR1(SEQ ID NO:17)和示例性VH CDR1(SEQ ID NO:14)；(2)具有选自下组的氨基酸序列的VH CDR2：Kabat VH CDR2(SEQ ID NO:19)，Chothia VH CDR2(SEQID NO:20)，Contact VH CDR2(SEQ ID NO:21)和示例性VH CDR2(SEQ ID NO:18)；和(3)具有选自下组的氨基酸序列的VH CDR3：Kabat VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Chothia VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Contact VH CDR3(SEQ ID NO:24)和示例性VH CDR3(SEQ ID NO:22)；并且所述VL区包含：(1)具有选自下组的氨基酸序列的VL CDR1：Kabat VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Chothia VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Contact VL CDR1(SEQ ID NO:8)和示例性VL CDR1(SEQ ID NO:7)；(2)具有选自下组的氨基酸序列的VL CDR2：Kabat VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Chothia VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Contact VL CDR2(SEQ ID NO:11)和示例性VLCDR2(SEQ ID NO:9)；和(3)具有选自下组的氨基酸序列的VL CDR3：Kabat VL CDR3(SEQ IDNO:12)，Chothia VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Contact VL CDR3(SEQ ID NO:13)和示例性VLCDR3(SEQ ID NO:12)。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体包含VH区，其包含(1)具有选自下组的氨基酸序列的VH CDR1：Kabat VH CDR1(SEQ ID NO:15)，Chothia VH CDR1(SEQ ID NO:16)，Contact VH CDR1(SEQ ID NO:17)和示例性VH CDR1(SEQ ID NO:14)；(2)具有选自下组的氨基酸序列的VH CDR2：Kabat VH CDR2(SEQ ID NO:19)，Chothia VH CDR2(SEQ ID NO:20)，Contact VH CDR2(SEQ ID NO:21)和示例性VH CDR2(SEQ ID NO:18)；和(3)具有选自下组的氨基酸序列的VH CDR3：Kabat VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Chothia VH CDR3(SEQ IDNO:23)，Contact VH CDR3(SEQ ID NO:24)和示例性VH CDR3(SEQ ID NO:22)。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体包含VL区，其包含(1)具有选自下组的氨基酸序列的VL CDR1：Kabat VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Chothia VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Contact VL CDR1(SEQ ID NO:8)和示例性VL CDR1(SEQ ID NO:7)；(2)具有选自下组的氨基酸序列的VL CDR2：Kabat VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Chothia VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Contact VL CDR2(SEQ ID NO:11)和示例性VL CDR2(SEQ ID NO:9)；和(3)具有选自下组的氨基酸序列的VL CDR3：Kabat VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Chothia VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Contact VL CDR3(SEQ ID NO:13)和示例性VL CDR3(SEQ ID NO:12)。
本文还提供了这样的抗体，其包含表1中所列的1个或多个(例如，1、2或3个)VHCDR和1个或多个(例如，1、2或3个)VL CDR。具体地，本文提供了这样的抗体，其包含VH CDR1和VL CDR1，所述VH CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR1(SEQ ID NO:15)，Chothia VH CDR1(SEQ ID NO:16)，Contact VH CDR1(SEQ ID NO:17)和示例性VH CDR1(SEQ ID NO:14)；且所述VL CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Chothia VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Contact VL CDR1(SEQ ID NO:8)和示例性VL CDR1(SEQ ID NO:7)。在一实施方式中，抗体包含VH CDR1和VL CDR2，所述VH CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR1(SEQ ID NO:15)，Chothia VH CDR1(SEQ ID NO:16)，Contact VH CDR1(SEQ ID NO:17)和示例性VH CDR1(SEQ ID NO:14)；且所述VL CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Chothia VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Contact VL CDR2(SEQ ID NO:11)和示例性VL CDR2(SEQ ID NO:9)。在一实施方式中，抗体包含VH CDR1和VL CDR3，所述VH CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR1(SEQ ID NO:15)，Chothia VH CDR1(SEQ ID NO:16)，Contact VH CDR1(SEQ ID NO:17)和示例性VH CDR1(SEQ ID NO:14)；且所述VL CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VLCDR3(SEQ ID NO:12)，Chothia VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Contact VL CDR3(SEQ ID NO:13)和示例性VL CDR3(SEQ ID NO:12)。在另一实施方式中，抗体包含VH CDR2和VL CDR1，所述VH CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR2(SEQ ID NO:19)，Chothia VH CDR2(SEQ ID NO:20)，Contact VH CDR2(SEQ ID NO:21)和示例性VH CDR2(SEQ ID NO:18)；且所述VL CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Chothia VLCDR1(SEQ ID NO:7)，Contact VL CDR1(SEQ ID NO:8)和示例性VL CDR1(SEQ ID NO:7)。在一些实施方式中，抗体包含VH CDR2和VL CDR2，所述VH CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR2(SEQ ID NO:19)，Chothia VH CDR2(SEQ ID NO:20)，Contact VH CDR2(SEQID NO:21)和示例性VH CDR2(SEQ ID NO:18)；且所述VL CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Chothia VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Contact VL CDR2(SEQID NO:11)和示例性VL CDR2(SEQ ID NO:9)。在一实施方式中，抗体包含VH CDR2和VLCDR3，所述VH CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR2(SEQ ID NO:19)，ChothiaVH CDR2(SEQ ID NO:20)，Contact VH CDR2(SEQ ID NO:21)和示例性VH CDR2(SEQ ID NO:18)；且所述VL CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR3(SEQ ID NO:12)，ChothiaVL CDR3(SEQ ID NO:12)，Contact VL CDR3(SEQ ID NO:13)和示例性VL CDR3(SEQ ID NO:12)。在另一实施方式中，抗体包含VH CDR3和VL CDR1，所述VH CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Chothia VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Contact VHCDR3(SEQ ID NO:24)和示例性VH CDR3(SEQ ID NO:22)；且所述VL CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Chothia VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Contact VLCDR1(SEQ ID NO:8)和示例性VL CDR1(SEQ ID NO:7)。在一实施方式中，抗体包含VH CDR3和VL CDR2，所述VH CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Chothia VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Contact VH CDR3(SEQ ID NO:24)和示例性VH CDR3(SEQ ID NO:22)；且所述VL CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Chothia VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Contact VL CDR2(SEQ ID NO:11)和示例性VLCDR2(SEQ ID NO:9)。在一些实施方式中，抗体包含VH CDR3和VL CDR3，所述VH CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Chothia VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Contact VH CDR3(SEQ ID NO:24)和示例性VH CDR3(SEQ ID NO:22)；且所述VL CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Chothia VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Contact VL CDR3(SEQ ID NO:13)和示例性VL CDR3(SEQ ID NO:12)。在另一实施方式中，抗体包含VH CDR1、VH CDR2和VL CDR1，所述VH CDR1具有选自下组的氨基酸序列：KabatVH CDR1(SEQ ID NO:15)，Chothia VH CDR1(SEQ ID NO:16)，Contact VH CDR1(SEQ IDNO:17)和示例性VH CDR1(SEQ ID NO:14)；所述VH CDR2具有选自下组的氨基酸序列：KabatVH CDR2(SEQ ID NO:19)，Chothia VH CDR2(SEQ ID NO:20)，Contact VH CDR2(SEQ IDNO:21)和示例性VH CDR2(SEQ ID NO:18)；且所述VL CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Chothia VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Contact VL CDR1(SEQID NO:8)和示例性VL CDR1(SEQ ID NO:7)。在一实施方式中，抗体包含VH CDR1、VH CDR2和VL CDR2，所述VH CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR1(SEQ ID NO:15)，Chothia VH CDR1(SEQ ID NO:16)，Contact VH CDR1(SEQ ID NO:17)和示例性VH CDR1(SEQ ID NO:14)；所述VH CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR2(SEQ ID NO:19)，Chothia VH CDR2(SEQ ID NO:20)，Contact VH CDR2(SEQ ID NO:21)和示例性VHCDR2(SEQ ID NO:18)；且所述VL CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR2(SEQ IDNO:10)，Chothia VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Contact VL CDR2(SEQ ID NO:11)和示例性VLCDR2(SEQ ID NO:9)。在其他实施方式中，抗体包含VH CDR1、VH CDR2和VL CDR3，所述VHCDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR1(SEQ ID NO:15)，Chothia VH CDR1(SEQID NO:16)，Contact VH CDR1(SEQ ID NO:17)和示例性VH CDR1(SEQ ID NO:14)；所述VHCDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR2(SEQ ID NO:19)，Chothia VH CDR2(SEQID NO:20)，Contact VH CDR2(SEQ ID NO:21)和示例性VH CDR2(SEQ ID NO:18)；且所述VLCDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Chothia VL CDR3(SEQID NO:12)，Contact VL CDR3(SEQ ID NO:13)和示例性VL CDR3(SEQ ID NO:12)。在另一实施方式中，抗体包含VH CDR2、VH CDR3和VL CDR1，所述VH CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR2(SEQ ID NO:19)，Chothia VH CDR2(SEQ ID NO:20)，Contact VH CDR2(SEQ ID NO:21)和示例性VH CDR2(SEQ ID NO:18)；所述VH CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Chothia VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Contact VH CDR3(SEQ ID NO:24)和示例性VH CDR3(SEQ ID NO:22)；且所述VL CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Chothia VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Contact VL CDR1(SEQ ID NO:8)和示例性VL CDR1(SEQ ID NO:7)。在一些实施方式中，抗体包含VH CDR2、VHCDR3和VL CDR2，所述VH CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR2(SEQ ID NO:19)，Chothia VH CDR2(SEQ ID NO:20)，Contact VH CDR2(SEQ ID NO:21)和示例性VHCDR2(SEQ ID NO:18)；所述VH CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR3(SEQ IDNO:23)，Chothia VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Contact VH CDR3(SEQ ID NO:24)和示例性VHCDR3(SEQ ID NO:22)；且所述VL CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR2(SEQ IDNO:10)，Chothia VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Contact VL CDR2(SEQ ID NO:11)和示例性VLCDR2(SEQ ID NO:9)。在一实施方式中，抗体包含VH CDR2、VH CDR3和VL CDR3，所述VH CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR2(SEQ ID NO:19)，Chothia VH CDR2(SEQ IDNO:20)，Contact VH CDR2(SEQ ID NO:21)和示例性VH CDR2(SEQ ID NO:18)；所述VH CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Chothia VH CDR3(SEQ IDNO:23)，Contact VH CDR3(SEQ ID NO:24)和示例性VH CDR3(SEQ ID NO:22)；且所述VLCDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Chothia VL CDR3(SEQID NO:12)，Contact VL CDR3(SEQ ID NO:13)和示例性VL CDR3(SEQ ID NO:12)。在另一实施方式中，抗体包含VH CDR1、VH CDR3和VL CDR1，所述VH CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR1(SEQ ID NO:15)，Chothia VH CDR1(SEQ ID NO:16)，Contact VH CDR1(SEQ ID NO:17)和示例性VH CDR1(SEQ ID NO:14)；所述VH CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Chothia VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Contact VH CDR3(SEQ ID NO:24)和示例性VH CDR3(SEQ ID NO:22)；且所述VL CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Chothia VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Contact VL CDR1(SEQ ID NO:8)和示例性VL CDR1(SEQ ID NO:7)。在其他实施方式中，抗体包含VH CDR1、VHCDR3和VL CDR2，所述VH CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR1(SEQ ID NO:15)，Chothia VH CDR1(SEQ ID NO:16)，Contact VH CDR1(SEQ ID NO:17)和示例性VHCDR1(SEQ ID NO:14)；所述VH CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR3(SEQ IDNO:23)，Chothia VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Contact VH CDR3(SEQ ID NO:24)和示例性VHCDR3(SEQ ID NO:22)；且所述VL CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR2(SEQ IDNO:10)，Chothia VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Contact VL CDR2(SEQ ID NO:11)和示例性VLCDR2(SEQ ID NO:9)。在一些实施方式中，抗体包含VH CDR1、VH CDR3和VL CDR3，所述VHCDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR1(SEQ ID NO:15)，Chothia VH CDR1(SEQID NO:16)，Contact VH CDR1(SEQ ID NO:17)和示例性VH CDR1(SEQ ID NO:14)；所述VHCDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Chothia VH CDR3(SEQID NO:23)，Contact VH CDR3(SEQ ID NO:24)和示例性VH CDR3(SEQ ID NO:22)；且所述VLCDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Chothia VL CDR3(SEQID NO:12)，Contact VL CDR3(SEQ ID NO:13)和示例性VL CDR3(SEQ ID NO:12)。在另一实施方式中，抗体包含VH CDR1、VL CDR1和VL CDR2，所述VH CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR1(SEQ ID NO:15)，Chothia VH CDR1(SEQ ID NO:16)，Contact VH CDR1(SEQ ID NO:17)和示例性VH CDR1(SEQ ID NO:14)；所述VL CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Chothia VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Contact VL CDR1(SEQ ID NO:8)和示例性VL CDR1(SEQ ID NO:7)；且所述VL CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Chothia VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Contact VL CDR2(SEQ ID NO:11)和示例性VL CDR2(SEQ ID NO:9)。在一实施方式中，抗体包含VH CDR1、VLCDR1和VL CDR3，所述VH CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR1(SEQ ID NO:15)，Chothia VH CDR1(SEQ ID NO:16)，Contact VH CDR1(SEQ ID NO:17)和示例性VHCDR1(SEQ ID NO:14)；所述VL CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR1(SEQ IDNO:7)，Chothia VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Contact VL CDR1(SEQ ID NO:8)和示例性VLCDR1(SEQ ID NO:7)；且所述VL CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR3(SEQ IDNO:12)，Chothia VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Contact VL CDR3(SEQ ID NO:13)和示例性VLCDR3(SEQ ID NO:12)。在其他实施方式中，抗体包含VH CDR1、VL CDR2和VL CDR3，所述VHCDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR1(SEQ ID NO:15)，Chothia VH CDR1(SEQID NO:16)，Contact VH CDR1(SEQ ID NO:17)和示例性VH CDR1(SEQ ID NO:14)；所述VLCDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Chothia VL CDR2(SEQID NO:10)，Contact VL CDR2(SEQ ID NO:11)和示例性VL CDR2(SEQ ID NO:9)；且所述VLCDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Chothia VL CDR3(SEQID NO:12)，Contact VL CDR3(SEQ ID 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VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Contact VL CDR3(SEQ ID NO:13)和示例性VL CDR3(SEQ ID NO:12)。在一些实施方式中，抗体包含VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR2和VL CDR3，所述VH CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR1(SEQ ID NO:15)，Chothia VH CDR1(SEQ ID NO:16)，Contact VHCDR1(SEQ ID NO:17)和示例性VH CDR1(SEQ ID NO:14)；所述VH CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR2(SEQ ID NO:19)，Chothia VH CDR2(SEQ ID NO:20)，Contact VHCDR2(SEQ ID NO:21)和示例性VH CDR2(SEQ ID NO:18)；所述VH CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Chothia VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Contact VHCDR3(SEQ ID NO:24)和示例性VH CDR3(SEQ ID NO:22)；所述VL CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Chothia VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Contact VLCDR2(SEQ ID NO:11)和示例性VL CDR2(SEQ ID NO:9)；且所述VL CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Chothia VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Contact VLCDR3(SEQ ID NO:13)和示例性VL CDR3(SEQ ID NO:12)。在另一实施方式中，抗体包含VHCDR1、VH CDR2、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，所述VH CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR1(SEQ ID NO:15)，Chothia VH CDR1(SEQ ID NO:16)，Contact VH CDR1(SEQID NO:17)和示例性VH CDR1(SEQ ID NO:14)；所述VH CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR2(SEQ ID NO:19)，Chothia VH CDR2(SEQ ID NO:20)，Contact VH CDR2(SEQID NO:21)和示例性VH CDR2(SEQ ID NO:18)；所述VL CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Chothia VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Contact VL CDR1(SEQID NO:8)和示例性VL CDR1(SEQ ID NO:7)；所述VL CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Chothia VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Contact VL CDR2(SEQID NO:11)和示例性VL CDR2(SEQ ID NO:9)；且所述VL CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Chothia VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Contact VL CDR3(SEQID NO:13)和示例性VL CDR3(SEQ ID NO:12)。在其他实施方式中，抗体包含VH CDR1、VHCDR3、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3所述VH CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR1(SEQ ID NO:15)，Chothia VH CDR1(SEQ ID NO:16)，Contact VH CDR1(SEQ ID NO:17)和示例性VH CDR1(SEQ ID NO:14)；所述VH CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Chothia VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Contact VH CDR3(SEQ ID NO:24)和示例性VH CDR3(SEQ ID NO:22)；所述VL CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Chothia VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Contact VL CDR1(SEQ ID NO:8)和示例性VL CDR1(SEQ ID NO:7)；所述VL CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR2(SEQID NO:10)，Chothia VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Contact VL CDR2(SEQ ID NO:11)和示例性VL CDR2(SEQ ID NO:9)；且所述VL CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR3(SEQID NO:12)，Chothia VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Contact VL CDR3(SEQ ID NO:13)和示例性VL CDR3(SEQ ID NO:12)。在一些实施方式中，抗体包含VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3，所述VH CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR2(SEQ ID NO:19)，Chothia VH CDR2(SEQ ID NO:20)，Contact VH CDR2(SEQ ID NO:21)和示例性VHCDR2(SEQ ID NO:18)；所述VH CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR3(SEQ IDNO:23)，Chothia VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Contact VH CDR3(SEQ ID NO:24)和示例性VHCDR3(SEQ ID NO:22)；所述VL CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR1(SEQ IDNO:7)，Chothia VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Contact VL CDR1(SEQ ID NO:8)和示例性VLCDR1(SEQ ID NO:7)；所述VL CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR2(SEQ IDNO:10)，Chothia VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Contact VL CDR2(SEQ ID NO:11)和示例性VLCDR2(SEQ ID NO:9)；且所述VL CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR3(SEQ IDNO:12)，Chothia VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Contact VL CDR3(SEQ ID NO:13)和示例性VLCDR3(SEQ ID NO:12)。在另一实施方式中，抗体包含VH CDR1、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，所述VH CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR1(SEQ ID NO:15)，Chothia VHCDR1(SEQ ID NO:16)，Contact VH CDR1(SEQ ID NO:17)和示例性VH CDR1(SEQ ID NO:14)；所述VL CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Chothia VLCDR1(SEQ ID NO:7)，Contact VL CDR1(SEQ ID NO:8)和示例性VL CDR1(SEQ ID NO:7)；所述VL CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Chothia VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Contact VL CDR2(SEQ ID NO:11)和示例性VL CDR2(SEQ ID NO:9)；且所述VL CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Chothia VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Contact VL CDR3(SEQ ID NO:13)和示例性VL CDR3(SEQ ID NO:12)。在一实施方式中，抗体包含VH CDR2、VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，所述VH CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR2(SEQ ID NO:19)，Chothia VH CDR2(SEQ ID NO:20)，Contact VH CDR2(SEQ ID NO:21)和示例性VH CDR2(SEQ ID NO:18)；所述VL CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Chothia VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Contact VL CDR1(SEQ ID NO:8)和示例性VL CDR1(SEQ ID NO:7)；所述VL CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Chothia VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Contact VL CDR2(SEQ ID NO:11)和示例性VL CDR2(SEQ ID NO:9)；且所述VL CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Chothia VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Contact VL CDR3(SEQ ID NO:13)和示例性VL CDR3(SEQ ID NO:12)。在其他实施方式中，抗体包含VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，所述VH CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Chothia VH CDR3(SEQ ID NO:23)，Contact VH CDR3(SEQID NO:24)和示例性VH CDR3(SEQ ID NO:22)；所述VL CDR1具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Chothia VL CDR1(SEQ ID NO:7)，Contact VL CDR1(SEQID NO:8)和示例性VL CDR1(SEQ ID NO:7)；所述VL CDR2具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Chothia VL CDR2(SEQ ID NO:10)，Contact VL CDR2(SEQID NO:11)和示例性VL CDR2(SEQ ID NO:9)；且所述VL CDR3具有选自下组的氨基酸序列：Kabat VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Chothia VL CDR3(SEQ ID NO:12)，Contact VL CDR3(SEQID NO:13)和示例性VL CDR3(SEQ ID NO:12)。在另一实施方式中，抗体包含表1中所列VHCDR和VL CDR的任意组合。
本文所述框架区基于CDR编号系统的边界确定。换言之，如果CDR是通过例如Kabat、IMGT或Chothia确定的，那么框架区是围绕可变区中的CDR的氨基酸残基，从N-末端到C-末端形式为：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。例如，FR1定义为氨基酸残基N-末端至CDR1氨基酸残基，通过例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义，FR2定义为CDR1和CDR2氨基酸残基之间的氨基酸残基，通过例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义，FR3定义为CDR2和CDR3氨基酸残基之间的氨基酸残基，通过例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义，且FR4定义为氨基酸残基C-末端至CDR3氨基酸残基，通过例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义。
在一些实施方式中，本文所提供的分离的抗体或其功能性片段进一步包含如表2所示抗体M22-321b41.1的1、2、3和/或4个重链FR和/或1、2、3和/或4个轻链FR。
表2：M22-321b41.1 VL和VH FR氨基酸序列
Figure BDA0002378599980000601
在某些实施方式中，本文所提供的分离的抗体或其功能性片段进一步包含如表2所示抗体M22-321b41.1的1、2、3和/或4个重链FR。在一些实施方式中，抗体重链FR来自抗体M22-321b41.1。
在一些实施方式中，本文所提供的分离的抗体或其功能性片段进一步包含如表2所示抗体M22-321b41.1的1、2、3和/或4个轻链FR。在一些实施方式中，抗体轻链FR来自抗体M22-321b41.1。
在某些实施方式中，本文所述抗体或其片段包含VH区，其包含：(1)具有氨基酸序列SEQ ID NO:29的VH FR1；(2)具有氨基酸序列SEQ ID NO:30的VH FR2；(3)具有氨基酸序列SEQ ID NO:31的VH FR3；和/或(4)具有氨基酸序列SEQ ID NO:32的VH FR4。在具体实施方式中，抗体包含VH区，其包含所有4个上述VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。
相应地，在一实施方式中，人源化抗体包含VH区，其含有具有氨基酸序列SEQ IDNO:29的VH FR1。在一些实施方式中，人源化抗体包含VH区，其含有具有氨基酸序列SEQ IDNO:30的VH FR2。在一实施方式中，人源化抗体包含VH区，其含有具有氨基酸序列SEQ IDNO:31的VH FR3。在其他实施方式中，人源化抗体包含VH区，其含有具有氨基酸序列SEQ IDNO:32的VH FR4。
在一些实施方式中，VL区包含：(1)具有氨基酸序列SEQ ID NO:25的VL FR1；(2)具有氨基酸序列SEQ ID NO:26的VL FR2；(3)具有氨基酸序列SEQ ID NO:27的VL FR3；和/或(4)具有氨基酸序列SEQ ID NO:28的VL FR4。
相应地，在一些实施方式中，人源化抗体包含VL区，其含有具有氨基酸序列SEQ IDNO:25的VL FR1。在某些实施方式中，人源化抗体包含VL区，其含有具有氨基酸序列SEQ IDNO:26的VL FR2。在一实施方式中，人源化抗体包含VL区，其含有具有氨基酸序列SEQ IDNO:27的VL FR3。在其他实施方式中，人源化抗体包含VL区，其含有具有氨基酸序列SEQ IDNO:28的VL FR4。
在一些实施方式中，抗体或其片段包含VH区和VL区，其中VH区包含：(1)具有氨基酸序列SEQ ID NO:29的VH FR1；(2)具有氨基酸序列SEQ ID NO:30的VH FR2；(3)具有氨基酸序列SEQ ID NO:31的VH FR3；和/或(4)具有氨基酸序列SEQ ID NO:32的VH FR4；并且其中VL区包含：(1)具有氨基酸序列SEQ ID NO:25的VL FR1；(2)具有氨基酸序列SEQ ID NO:26的VL FR2；(3)具有氨基酸序列SEQ ID NO:27的VL FR3；和/或(4)具有氨基酸序列SEQ IDNO:28的VL FR4。在一些实施方式中，抗体包含VH区，其包含所有4个上述VH FR1、VH FR2、VHFR3和VH FR4。在其他实施方式中，抗体包含VL区，其包含所有4个上述VL FR1、VL FR2、VLFR3和VL FR4。在其他实施方式中，抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含所有4个上述VHFR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4，且所述VL区包含所有4个上述VL FR1、VL FR2、VL FR3和VLFR4。
本文还提供了这样的抗体，其包含表2中所列的1个或多个(例如，1、2、3或4个)VHFR和1个或多个(例如，1、2、3或4个)VL FR。具体地，本文提供了这样的抗体，其包含VH FR1(SEQ ID NO:29)和VL FR1(SEQ ID NO:25)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)和VL FR2(SEQ ID NO:26)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)和VLFR3(SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)和VL FR4(SEQID NO:28)。在其他实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)和VL FR1(SEQ ID NO:25)。在一实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)和VL FR2(SEQ ID NO:26)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一实施方式中，抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:31)和VL FR1(SEQ ID NO:25)。在其他实施方式中，抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:31)和VL FR2(SEQ ID NO:26)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR3(SEQ IDNO:31)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:31)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一实施方式中，抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:32)和VL FR1(SEQID NO:25)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:32)和VL FR2(SEQ ID NO:26)。在一实施方式中，抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:32)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:32)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)和VL FR1(SEQ ID NO:25)。在其他实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)和VL FR2(SEQID NO:26)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQID NO:30)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)和VL FR1(SEQ ID NO:25)。在一实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)和VL FR2(SEQ ID NO:26)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在其他实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)和VL FR4(SEQ IDNO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VL FR1(SEQ ID NO:25)和VLFR2(SEQ ID NO:26)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VL FR1(SEQ IDNO:25)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VLFR1(SEQ ID NO:25)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ IDNO:29)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，抗体包含VHFR1(SEQ ID NO:29)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在其他实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VL FR1(SEQ ID NO:25)和VL FR2(SEQID NO:26)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VL FR1(SEQ ID NO:25)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VL FR1(SEQID NO:25)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，抗体包含VHFR2(SEQ ID NO:30)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:31)、VL FR1(SEQ ID NO:25)和VL FR2(SEQ IDNO:26)。在其他实施方式中，抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:31)、VL FR1(SEQ ID NO:25)和VLFR3(SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:31)、VL FR1(SEQ IDNO:25)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:31)、VLFR2(SEQ ID NO:26)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一实施方式中，抗体包含VH FR3(SEQ IDNO:31)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一实施方式中，抗体包含VHFR3(SEQ ID NO:31)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)和VL FR2(SEQ ID NO:26)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:32)，VL FR1(SEQ ID NO:25)和VL FR3(SEQID NO:27)。在其他实施方式中，抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一实施方式中，抗体包含VH FR4(SEQ ID NO:32)，VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VHFR4(SEQ ID NO:32)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)和VLFR1(SEQ ID NO:25)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ IDNO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)和VL FR2(SEQ ID NO:26)。在其他实施方式中，抗体包含VHFR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)和VL FR3(SEQ IDNO:27)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VHFR3(SEQ ID NO:31)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR4(SEQ ID NO:32)和VL FR1(SEQ ID NO:25)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR4(SEQ IDNO:32)和VL FR2(SEQ ID NO:26)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VHFR2(SEQ ID NO:30)、VH FR4(SEQ ID NO:32)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR4(SEQ ID NO:32)和VLFR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR3(SEQ IDNO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)和VL FR1(SEQ ID NO:25)。在一些实施方式中，抗体包含VHFR1(SEQ ID NO:29)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)和VL FR2(SEQ IDNO:26)。在其他实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29),VH FR3(SEQ ID NO:31)、VHFR4(SEQ ID NO:32)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ IDNO:29)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ IDNO:32)和VL FR1(SEQ ID NO:25)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VHFR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)和VL FR2(SEQ ID NO:26)。在一实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30),VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)和VLFR3(SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ IDNO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在其他实施方式中，抗体包含VHFR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VL FR1(SEQ ID NO:25)和VL FR2(SEQ IDNO:26)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VLFR1(SEQ ID NO:25)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VL FR1(SEQ ID NO:25)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VL FR2(SEQ IDNO:26)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VHFR2(SEQ ID NO:30)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VLFR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR3(SEQ IDNO:31)、VL FR1(SEQ ID NO:25)和VL FR2(SEQ ID NO:26)。在其他实施方式中，抗体包含VHFR1(SEQ ID NO:29)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VL FR1(SEQ ID NO:25)和VL FR3(SEQ IDNO:27)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VLFR1(SEQ ID NO:25)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ IDNO:29)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VL FR2(SEQ IDNO:26)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VHFR3(SEQ ID NO:31)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)和VLFR2(SEQ ID NO:26)。在其他实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR4(SEQ IDNO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，抗体包含VHFR1(SEQ ID NO:29)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)和VL FR4(SEQ IDNO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VLFR2(SEQ ID NO:26)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ IDNO:29)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR3(SEQ IDNO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VHFR3(SEQ ID NO:31)、VL FR1(SEQ ID NO:25)和VL FR2(SEQ ID NO:26)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VL FR1(SEQ ID NO:25)和VLFR3(SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ IDNO:31)、VL FR1(SEQ ID NO:25)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在其他实施方式中，抗体包含VHFR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VL FR2(SEQ ID 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FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在其他实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VL FR2(SEQ ID NO:26)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在其他实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR2(SEQ ID NO:26)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR2(SEQ ID NO:26)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在其他实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR2(SEQ ID NO:26)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在其他实施方式中，抗体包含VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR3(SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ IDNO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQID NO:25)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ IDNO:32)、VL FR2(SEQ ID NO:26)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ IDNO:31)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ ID NO:29)、VH FR2(SEQ IDNO:30)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在其他实施方式中，抗体包含VH FR1(SEQ IDNO:29)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQ ID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一实施方式中，抗体包含VH FR2(SEQ ID NO:30)、VH FR3(SEQ ID NO:31)、VH FR4(SEQ ID NO:32)、VL FR1(SEQID NO:25)、VL FR2(SEQ ID NO:26)、VL FR3(SEQ ID NO:27)和VL FR4(SEQ ID NO:28)。在一些实施方式中，抗体包含表2中所列VH FR(SEQ ID NO:29-32)和VL FR(SEQ ID NO:25-28)的任意组合。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体包含VH区或VH结构域。在其他实施方式中，本文所提供的抗体包含VL区或VL结构域。在某些实施方式中，本文所提供的抗体具有这样的组合：(i)VH结构域或VH区；和/或(ii)VL结构域或VL区。在其他实施方式中，本文所提供的抗体具有这样的组合：(i)VH结构域或VH区；和/或(ii)VL结构域或VL区，其选自如表1所示SEQ ID NO:3和4。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体包含VH区，其包含：(1)具有氨基酸序列SEQID NO:15的VH CDR1；(2)具有氨基酸序列SEQ ID NO:19的VH CDR2；和(3)具有氨基酸序列SEQ ID NO:23的VH CDR3；以及VL区，其选自如表1所示的SEQ ID NO:3。
在其他实施方式中，本文所提供的抗体包含VH区，其选自如表1所示的SEQ ID NO:4；以及VL区，其包含(1)具有氨基酸序列SEQ ID NO:7的VL CDR1；(2)具有氨基酸序列SEQID NO:10的VL CDR2；和(3)具有氨基酸序列SEQ ID NO:12的VL CDR3。
本文还提供了分离核酸分子，其编码结合柄蛋白-4多肽、柄蛋白-4多肽片段、柄蛋白-4肽或柄蛋白-4表位的抗-柄蛋白-4抗体的免疫球蛋白重链，轻链，VH区，VL区，VH CDR1，VH CDR2，VH CDR3，VL CDR1，VL CDR2和/或VL CDR3。针对抗体M22-321b41.1的VL区、轻链、VH区和重链的示例性核酸序列示于表3-4。
表3：VL核酸序列
Figure BDA0002378599980000751
表4：VH核酸序列
Figure BDA0002378599980000761
在一些实施方式中，本文所提供的抗体具有抗体M22-321b41.1的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体包含VH氨基酸序列SEQ ID NO:4和VL氨基酸序列SEQ ID NO:3。
在某些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合柄蛋白-4多肽(例如，柄蛋白-4例如人柄蛋白-4的ECD)，包含轻链和重链，其中轻链包含具有下述氨基酸序列的恒定区：
GASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKTFNRNEC(SEQ ID NO:33)。
在某些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合柄蛋白-4多肽(例如，柄蛋白-4例如人柄蛋白-4的ECD)，包含轻链和重链，其中重链包含具有下述氨基酸序列的恒定区：
SSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO:34)。
在其他实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合柄蛋白-4多肽(例如，柄蛋白-4例如人柄蛋白-4的ECD)，包含轻链和重链，其中重链包含具有下述氨基酸序列的人IgG1 Fc区：
PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO:35)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合柄蛋白-4多肽(例如，柄蛋白-4例如人柄蛋白-4的ECD)，包含轻链和重链，其中重链不包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:35的人IgG1 Fc区。
在另一实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合柄蛋白-4多肽(例如，柄蛋白-4例如人柄蛋白-4的ECD)，包含轻链和重链，其中轻链包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:33的恒定区；而重链包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:35的Fc区。
在某些实施方式中，本文所述的抗体，其特异性地结合柄蛋白-4多肽(例如，柄蛋白-4例如人柄蛋白-4的ECD)，包含轻链和重链，其中轻链含有下述氨基酸序列：
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYHMSNLASGVPDRFTSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPFTFGGGTKLETKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKTFNRNEC(SEQ ID NO:5)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体，其特异性地结合柄蛋白-4多肽(例如，柄蛋白-4例如人柄蛋白-4的ECD)，包含轻链和重链，其中重链含有下述氨基酸序列：
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTYWMQWVKQRPGQGLEWIGSIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYIQLSTLASEDSAVYYCAREYYGLDYWGQGTTLTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO:6)。
在一具体实施方式中，本文所述的抗体，其特异性地结合柄蛋白-4多肽(例如，柄蛋白-4例如人柄蛋白-4的ECD)，包含轻链和重链，其中(i)轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:5；而(ii)重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:6。
在另一方面中，提供这样的抗体，所述抗体与示例的抗体之一或其功能性片段竞争结合柄蛋白-4。这类抗体还可以结合与本文所示例的抗体的表位相同的表位，或重叠的表位。与示例的抗体竞争或结合相同表位的抗体和片段预期将显示相似的功能特性。示例的抗原结合蛋白和片段包括具有VH和VL区，和本文所提供的CDR的那些，包括表1中的那些。因此，作为具体的示例，提供的抗体包括与下述抗体竞争的那些，所述抗体包含：(a)表1中所列抗体的1、2、3、4、5或所有6个CDR；(b)选自表1中所列抗体的VH和VL区的VH和VL；或(c)含有指定为表1中所列抗体的VH和VL的两条轻链和两条重链。在一些实施方式中，抗体是抗体M22-321b41.1。
在某些实施方式中，本文所述抗体或其抗原结合片段包含相对于抗体M22-321b41.1具有一定百分比相同性的氨基酸序列。
可采用数学算法实现确定两条序列(例如，氨基酸序列或核酸序列)之间的百分比相同性。用于比较两个序列的数学算法的优选的非限制性示例是Karlin和Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264 2268的算法，如Karlin和Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873 5877中的修改。所述算法整合在Altschul等，1990,J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序中。可以用NBLAST核苷酸程序参数集进行BLAST核苷酸搜索，例如，对于得分＝100，字长＝12，以获得与本文所述核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序参数集进行BLAST蛋白质搜索，例如，得分50，字长＝3，以获得与本文所述蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得出于比较目的的缺口比对结果，可以如Altschul等,1997,Nucleic Acids Res.25:3389 3402所述利用带缺口BLAST。或者，可以使用PSI BLAST以进行迭代搜索，其检测分子之间的远近关系(引用同上)。利用BLAST、带缺口BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见例如，国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information(NCBI))互联网，ncbi.nlm.nih.gov)。用于比较序列的数学算法的另一个优选的非限制性示例是Myers和Miller，1988,CABIOS 4:11 17的算法。这样的算法被并入ALIGN程序(版本2.0)，其是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120加权残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。
两条序列间的百分比相同性可以使用与上述技术相似的技术确定，在允许缺口的情况下或不允许的情况下。在计算百分比相同性中，通常仅对精确匹配计数。
在某些实施方式中，本文所述抗体或其抗原结合片段包含与氨基酸序列SEQ IDNO:3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列相同性的VL结构域，其中抗体免疫特异性地结合柄蛋白-4。在某些实施方式中，本文所述抗体或其抗原结合片段包含与氨基酸序列SEQ ID NO:3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列相同性的VL结构域，其中抗体免疫特异性地结合柄蛋白-4，并且其中抗体包含与抗体M22-321b41.1的CDR(例如，VL CDR 1-3)相同的CDR(例如，VL CDR 1-3)。
在某些实施方式中，本文所述抗体或其抗原结合片段包含含有VL框架区的VL结构域，其与SEQ ID NO:3的框架区氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列相同性，其中抗体免疫特异性地结合柄蛋白-4。在具体实施方式中，抗体包含与抗体M22-321b41.1的VL CDR相同的VL CDR。
在某些实施方式中，本文所述抗体或其抗原结合片段包含与氨基酸序列SEQ IDNO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列相同性的VH结构域，其中抗体免疫特异性地结合柄蛋白-4。在某些实施方式中，本文所述抗体或其抗原结合片段包含与氨基酸序列SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列相同性的VH结构域，其中抗体免疫特异性地结合柄蛋白-4，并且其中抗体包含与抗体M22-321b41.1的CDR(例如，VH CDR 1-3)相同的CDR(例如，VH CDR 1-3)。
在某些实施方式中，本文所述抗体或其抗原结合片段包含含有VH框架区的VH结构域，其与SEQ ID NO:4的框架区氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列相同性，其中抗体免疫特异性地结合柄蛋白-4。在特定实施方式中，这类抗体包含与抗体M22-321b41.1的CDR(例如，VH CDR 1-3)相同的CDR(例如，VH CDR 1-3)。
在某些实施方式中，本文所述抗体或其抗原结合片段分别包含(i)与氨基酸序列SEQ ID NO:3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列相同性的VL结构域，和(ii)与氨基酸序列SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列相同性的VH结构域，其中抗体免疫特异性地结合柄蛋白-4。在特定实施方式中，这类抗体或其抗原结合片段包含与抗体M22-321b41.1的CDR(例如，VL CDR 1-3和/或VHCDR1-3)相同的CDR(例如，VL CDR 1-3和/或VH CDR 1-3)。
在另一方面中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段结合人柄蛋白-4的区域，包括表位。例如，在一些实施方式中，本文所提供的抗体结合人柄蛋白-4(SEQ ID NO:1)含有人柄蛋白-4氨基酸残基31-346(SEQ ID NO:2)的区域，人柄蛋白-4(SEQ ID NO:1)含有人柄蛋白-4氨基酸残基1-150(SEQ ID NO:45)的区域，或人柄蛋白-4(SEQ ID NO:1)含有人柄蛋白-4氨基酸残基31-150(SEQ ID NO:46)的区域。在另一方面中，本文所提供的抗体结合人柄蛋白-4的特定表位。人柄蛋白-4(SEQ ID NO:1)氨基酸残基31-346的氨基酸序列为：
AGELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLV(SEQ ID NO:2)。人柄蛋白-4(SEQ ID NO:1)氨基酸残基1-150的氨基酸序列为：
MPLSLGAEMWGPEAWLLLLLLLASFTGRCPAGELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPL(SEQ ID NO:45)。人柄蛋白-4(SEQ ID NO:1)氨基酸残基31-150的氨基酸序列为：
AGELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPL(SEQ ID NO:46)。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体结合柄蛋白-4表位，其是柄蛋白-4多肽三维结构表面特征(例如，处于柄蛋白-4多肽的多聚体形式)。有助于表位的柄蛋白-4多肽的区域可以是多肽的连续氨基酸，或者该表位可以来自多肽的两个或更多个非连续区域。柄蛋白-4表位可以这样存在：(a)柄蛋白-4的多聚体形式(“多聚体柄蛋白-4表位”)，(b)柄蛋白-4的单体形式(“单体柄蛋白-4表位”)，(c)柄蛋白-4的多聚体和单体形式，(d)多聚体形式，而非柄蛋白-4的单体形式，或(e)单体形式，而非柄蛋白-4的多聚体形式。例如，在一些实施方式中，表位仅以多聚体(天然)形式存在或供抗-柄蛋白-4抗体结合，而不以单体(变性的)形式存在或供抗-柄蛋白-4抗体结合。在其他实施方式中，柄蛋白-4表位是柄蛋白-4多肽的线性特征(例如，以柄蛋白-4多肽的多聚体形式或单体形式)。本文提供的抗体可以免疫特异性地结合：(a)单体形式的柄蛋白-4的表位，(b)多聚体形式的柄蛋白-4的表位，(c)单体而非多聚体形式的柄蛋白-4的表位，(d)多聚体形式而非单体形式的柄蛋白-4的表位，或(e)单体形式和多聚体形式的柄蛋白-4。
本文还提供了结合与本文所述抗体M22-321b41.1相同的或重叠的柄蛋白-4表位(例如，位于人柄蛋白-4的ECD的表位)的抗体，例如，这样的抗体，其与本文所述抗体M22-321b41.1竞争(例如，以剂量依赖性方式)结合柄蛋白-4(例如，人柄蛋白-4的ECD)，或者竞争性抑制(例如，以剂量依赖性方式)本文所述抗体M22-321b41.1结合柄蛋白-4(例如，位于人柄蛋白-4的ECD的表位)。
在具体方面中，本文还提供了这样的抗体，其结合与抗体M22-321b41.1相同的或重叠的柄蛋白-4表位(例如，位于人柄蛋白-4的ECD的表位)。
结合柄蛋白-4的相同或重叠表位(例如，位于人柄蛋白-4的ECD的表位)的抗体可以使用常规技术如本文示例中所利用的那些来鉴定。例如，可以使用免疫试验来证明一个抗体阻断另一抗体与靶抗原的结合的能力，即竞争性结合试验。竞争结合试验还可以用于确定两个抗体是否具有对表位相似的结合特异性。可以在这样的试验中确定竞争性结合，所述试验中经测试的免疫球蛋白抑制参照抗体与常见抗原如柄蛋白-4的特异性结合。已知许多类型的竞争性结合试验，例如：固相直接或间接放射免疫试验(RIA)，固相直接或间接酶免疫试验(EIA)，夹心(sandwich)竞争试验(参见Stahli等.,(1983)酶学方法(Methodsin Enzymology)9:242)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见，Kirkland等,(1986)J.Immunol.137:3614)；固相直接标记试验，固相直接标记夹心试验(参见Harlow和Lane,(1988)《抗体实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual),冷泉港出版社(ColdSpring Harbor Press))；使用I-125标签的固相直接标签RIA(参见，Morel等,(1988)Mol.Immunol.25(1):7)；固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung等,(1990)Virology 176:546)；和直接标记RIA(Moldenhauer等,(1990)Scand J.Immunol.32:77)。通常，这类试验涉及使用与固体表面结合的纯化抗原(例如，柄蛋白-4，如人柄蛋白-4的ECD)或携带它们的细胞，未标记的测试免疫球蛋白和标记的参照免疫球蛋白。可以通过确定在测试免疫球蛋白存在的情况下与固体表面或细胞结合的标签的量来测量竞争性抑制。通常，所述测试免疫球蛋白过量存在。通常，当竞争抗体过量存在时，其将抑制至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或更多的参照抗体与共同抗原的特异性结合。使用标记的抗原或标记的抗体，可以大量不同形式设置竞争结合试验。在该试验的普通形式中，抗原固定于96孔板。然后，未标记的抗体阻断标记的抗体与抗原结合的能力使用放射性或酶标记测量。进一步的详情参见例如，Wagener等,J.Immunol.,1983,130:2308-2315；Wagener等,J.Immunol.Methods,1984,68:269-274；Kuroki等,Cancer Res.,1990,50:4872-4879；Kuroki等,Immunol.Invest.,1992,21:523-538；Kuroki等,Hybridoma,1992,11:391-407，以及《使用抗体：实验室手册》(Using Antibodies:A Laboratory Manual)Ed Harlow和David Lane编辑(冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港，1999)，第386-389页。
在某些方面中，竞争结合试验可以用于确定抗体的结合是否被另一抗体竞争性抑制，例如，以剂量依赖方式，从而发出这样的信号，即抗体基本上结合相同的表位，或重叠的表位，例如，空间重叠的表位。这类竞争结合试验可以包括，例如，竞争ELISA试验，使用标记的抗原或标记的抗体，可以大量不同形式对其进行设置。在特定实施方式中，可以在竞争结合试验中用本文所述的抗体M22-321b41.1，或其嵌合或Fab抗体，或含有抗体M22-321b41.1的VH CDR和VL CDR的抗体测试抗体。
在特定方面中，本文提供了这样的抗体，其竞争性阻断(例如，以剂量依赖方式)包含本文所述氨基酸序列的抗体特异性结合柄蛋白-4多肽(例如，柄蛋白-4例如人柄蛋白-4的ECD)，如使用本领域技术人员已知或本文所述的试验确定(例如，ELISA竞争性试验)。在特定方面中，本文提供了这样的抗体，其与包含本文所述氨基酸序列(例如，抗体M22-321b41.1的VL和/或VH氨基酸序列)的抗体竞争特异性结合(例如，以剂量依赖方式)柄蛋白-4多肽柄蛋白-4多肽(例如，柄蛋白-4例如人柄蛋白-4的ECD)，如使用本领域技术人员已知或本文所述的试验确定(例如，ELISA竞争性试验)。
在特定方面中，本文提供了这样的抗体，其与抗体M22-321b41.1竞争(例如，以剂量依赖方式)特异性结合柄蛋白-4多肽(例如，柄蛋白-4例如人柄蛋白-4的ECD)。
在特定方面中，本文提供了这样的抗体，其与VL链区具有氨基酸序列SEQ ID NO:3且VH链区域具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的抗体竞争(例如，以剂量依赖方式)特异性结合柄蛋白-4多肽(例如，柄蛋白-4例如人柄蛋白-4的ECD)。
在特定方面中，本文还提供了这样的抗体，其(1)与抗体M22-321b41.1竞争(例如，以剂量依赖方式)特异性结合柄蛋白-4多肽的表位(例如，人柄蛋白-4的ECD的表位)，和(ii)能够特异性地结合IHC试验中的柄蛋白-4。
在特定实施方式中，本文所描述的抗体是这样的抗体，其被特异性地结合柄蛋白-4并包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的VL链区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的VH链区域的抗体竞争性地阻断(例如，以剂量依赖方式)特异性结合柄蛋白-4多肽(例如，柄蛋白-4例如人柄蛋白-4的ECD)。
在特定方面中，本文还提供了这样的抗体，其(1)竞争性地阻断(例如，以剂量依赖方式)抗体M22-321b41.1特异性结合柄蛋白-4多肽的表位(例如，人柄蛋白-4的ECD的表位)，和(ii)能够特异性地结合IHC试验中的柄蛋白-4。
在特定方面中，本文提供了这样的抗体或其抗原结合片段，其免疫特异性地结合与包含本文所述氨基酸序列用于特异性结合柄蛋白-4多肽(例如，柄蛋白-4例如人柄蛋白-4的ECD)的抗体M22-321b41.1的表位相同的表位。本领域技术人员已知或本文所述的试验(例如，ELISA试验)可以用于确定两个抗体是否结合相同的表位。
在特定实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合与特异性地结合柄蛋白-4并包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的VL链区和具有氨基酸序列SEQ IDNO:4的VH链区的抗体M22-321b41.1的表位相同的表位。
在特定方面中，本文还提供了这样的抗体，其(1)免疫特异性地结合与抗体M22-321b41.1的表位相同的柄蛋白-4多肽的表位(例如，人柄蛋白-4的ECD的表位)，和(ii)能够特异性地结合IHC试验中的柄蛋白-4。
在某些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基31-346中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基31-75中的至少一个。在其他实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基75-125中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基100-150中的至少一个。在其他实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基125-175中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQID NO:1内残基150-200中的至少一个。在其他实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基175-225中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基200-250中的至少一个。在其他实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基225-275中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基250-300中的至少一个。在其他实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQID NO:1内残基275-325中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基300-346中的至少一个。
在某些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基1-150中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基31-150中的至少一个。在其他实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基1-10中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基5-15中的至少一个。在其他实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基10-20中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基15-25中的至少一个。在其他实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基20-30中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基25-35中的至少一个。在其他实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基30-40中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基35-45中的至少一个。在其他实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基40-50中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基45-55中的至少一个。在其他实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基50-60中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基65-75中的至少一个。在其他实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基70-80中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基75-85中的至少一个。在其他实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基80-90中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基85-95中的至少一个。在其他实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基90-100中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基95-105中的至少一个。在其他实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基100-110中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ IDNO:1内残基105-115中的至少一个。在其他实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基110-120中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基115-125中的至少一个。在其他实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基120-130中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基125-135中的至少一个。在其他实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQID NO:1内残基130-140中的至少一个。在一些实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基135-145中的至少一个。在其他实施方式中，当与柄蛋白-4结合时，抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基140-150中的至少一个。
还考虑了2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个上述氨基酸柄蛋白-4结合位点的任意组合。
在某些实施方式中，抗体特异性地结合不同于柄蛋白-4配体结合位点的人柄蛋白-4的ECD的表位。在某些实施方式中，柄蛋白-4配体与柄蛋白-4的结合不被抗体抑制。
在一方面中，本文提供了特异性地结合柄蛋白-4的抗体。在某些实施方式中，本文提供了特异性地结合人柄蛋白-4的ECD的抗体。
在某些实施方式中，特异性地结合柄蛋白-4的抗体结合人柄蛋白-4的ECD或人柄蛋白-4的ECD的表位。在某些实施方式中，抗体特异性地结合不同于柄蛋白-4配体结合位点的人柄蛋白-4的ECD的表位。
柄蛋白-4活性可以涉及柄蛋白-4的任何活性，诸如本领域所知或所述的那些。柄蛋白-4活性的非限制性示例包括：柄蛋白-4受体二聚化，柄蛋白-4受体与其他受体的异源二聚化，柄蛋白-4受体磷酸化，柄蛋白-4受体的信号转导下游，细胞增殖诸如柄蛋白-4配体诱导的细胞增殖(例如，癌细胞增殖)增强，或细胞存活(例如，癌细胞)，柄蛋白-4配体诱导的抗细胞凋亡。柄蛋白-4活性或柄蛋白-4功能在本文可互换使用。在某些方面中，柄蛋白-4活性由结合柄蛋白-4受体的柄蛋白-4配体所诱导。在某些实施方式中，在不存在柄蛋白-4配体结合柄蛋白-4受体的情况下，由于柄蛋白-4受体的高表达(或过表达)，柄蛋白-4活性或信号转导可能出现增强。细胞中柄蛋白-4的高表达或过表达指这样的表达水平，所述表达水平超过已知具有正常柄蛋白-4表达或柄蛋白-4活性的参照细胞的表达水平或者超过已知具有正常柄蛋白-4表达或柄蛋白-4活性的样品或细胞群中柄蛋白-4的平均表达水平至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、400％或500％。柄蛋白-4的表达水平可以通过本文所述或者本领域技术人员已知的方法评估(例如，Western印迹，ELISA或IHC)。
10.多克隆抗体
本公开的抗体可以包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法为本领域技术人员所知。可以在哺乳动物中，例如，通过免疫剂(immunizing agent)和(如果需要)佐剂的一次或多次注射产生多克隆抗体。通常，免疫剂和/或佐剂将通过多次皮下或腹膜内注射注射到哺乳动物中。免疫剂可以包括柄蛋白-4多肽或其融合蛋白。将免疫剂与已知在经免疫的哺乳动物中具有免疫原性的蛋白质偶联或者用蛋白质和一种或多种佐剂免疫哺乳动物可能是有用的。这类免疫原性蛋白的示例包括但不限于，匙孔血蓝蛋白，血清白蛋白，牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以采用的佐剂的示例包括Ribi，CpG，Poly 1C，弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A，合成海藻糖二硬脂酸酯)。免疫方案可以由本领域技术人员选择,无需过度实验。然后可以将哺乳动物放血，并测定血清中柄蛋白-4抗体的效价。如果需要，可以加强哺乳动物的免疫力，直到抗体效价增加或稳定。或者，可以从免疫动物中获得淋巴细胞，用于从下文所述的杂交瘤融合和制备单克隆抗体。
11.单克隆抗体
本公开的抗体还可以是单克隆抗体。可采用由Kohler等,1975,Nature 256:495-97首次公开的杂交瘤方法或采用重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)来制备单克隆抗体。
在杂交瘤方法中，对小鼠或其它合适的宿主动物(如仓鼠)进行如上所述的免疫，以引发产生或能够产生特异性结合免疫所用蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者，可体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，并随后用合适的融合试剂(如聚乙二醇)使其与骨髓瘤细胞系融合，形成杂交瘤细胞(Goding,《单克隆抗体：原理和实践》(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice)59-103(1986))。
将如此制备的杂交瘤细胞接种于合适的培养基并培养，在某些实施方式中，所述培养基优选含有能抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞(也称为融合伴侣)生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么针对杂交瘤的选择性培养基通常将包含次黄嘌呤，氨蝶呤和胸苷(HAT培养基)，其防止HGPRT缺陷型细胞的生长。
示例性的融合伴侣骨髓瘤细胞是能高效融合、支持所选抗体生产细胞稳定高水平产生抗体，且对选择性针对未融合亲代细胞的选择性培养基敏感的那些细胞。示例性的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，如SP-2及其衍生物，例如，获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(弗吉尼亚州玛纳萨斯)的X63-Ag8-653细胞，和衍生自获自索尔克研究所细胞销售中心(Salk Institute Cell Distribution Center)(加利福尼亚圣地亚哥)的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些。也已记载将人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于生产人单克隆抗体(Kozbor,1984,Immunol.133:3001-05；和Brodeur等,《单克隆抗体生产技术和应用》(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)51-63(1987))。
测试杂交瘤在其中生长的培养基用于生产直接针对抗原的单克隆抗体。通过杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀法或通过体外结合试验如RIA或ELISA确定。可通过例如Munson等,1980,Anal.Biochem.107:220-39中描述的Scatchard分析法确定单克隆抗体的结合亲和力。
一旦鉴定到产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过标准方法对该克隆进行培养并通过有限稀释步骤对其进行亚克隆(Goding，引用如上)。适用于此目的的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以作为腹水肿瘤在动物体内生长，例如，通过将细胞腹膜内(i.p.)注射到小鼠中。
由亚克隆所分泌的单克隆抗体通过常规抗体纯化过程从培养基、腹水液体或血清合适地分离，例如，亲和色谱法(例如，使用蛋白A或蛋白G-琼脂糖)或离子交换色谱，羟基磷灰石色谱，凝胶电泳，透析等。
用常规方法(例如，利用能特异性结合编码鼠抗体重链和轻链基因的寡核苷酸探针)易于分离和测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞可以作为这类DNA的来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染入宿主细胞，例如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或否则不会产生抗体蛋白的骨髓瘤细胞，以实现重组宿主细胞中的单克隆抗体合成。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra等,1993,Curr.Opinion in Immunol.5:256-62和Plückthun,1992,Immunol.Revs.130:151-88。
在一些实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体包含由这样的核苷酸序列编码的VH结构域的氨基酸序列和/或VL结构域的氨基酸序列，所述核苷酸序列在下述条件下与(1)编码本文所述VH和/或VL结构域中任一项的核苷酸序列的补体杂交：在严谨条件下(例如，在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45℃下与过滤器结合的(filter-bound)DNA杂交，然后在0.2X SSC/0.1％SDS中在约50-65℃下洗涤一次或多次)，在高严谨条件下(例如，在6X SSC中在约45℃下与过滤器结合的核酸杂交，然后在0.1X SSC/0.2％SDS中在约68℃下洗涤一次或多次)，或在本领域技术人员已知的其他严谨杂交条件下参见例如，《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)卷I,6.3.1-6.3.6和2.10.3(Ausubel等编著,1989)。
在一些实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体包含由这样的核苷酸序列编码的VHCDR的氨基酸序列或VL CDR的氨基酸序列，所述核苷酸序列在下述条件下与编码表1所述VHCDR和/或VL CDR中任一项的核苷酸序列的互补物杂交：在严谨条件下(例如，在6X SSC中在约45℃下与过滤器结合的DNA杂交，然后在0.2X SSC/0.1％SDS中在约50-65℃下洗涤一次或多次)，在高严谨条件下(例如，在6X SSC中在约45℃下与过滤器结合的核酸杂交，然后在0.1X SSC/0.2％SDS中在约68℃下洗涤一次或多次)或在本领域技术人员已知的其他严谨杂交条件下(参见例如，Ausubel等,引用如上)。
在其他实施方式中，可以从采用例如《抗体噬菌体展示：方法和方案》(Antibody Phage Display:Methods and Protocols)(O’Brien和Aitken编著,2002)中所述技术产生的抗体噬菌体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域在噬菌体颗粒的表面展示，所述噬菌体颗粒携带了编码其的多核苷酸序列。可以用于制备本文所述抗体的噬菌体展示方法的示例包括公开于下述的方法：Brinkman等,1995,J.Immunol.Methods 182:41-50；Ames等,1995,J.Immunol.Methods 184:177-186；Kettleborough等.,1994,Eur.J.Immunol.24:952-958；Persic等,1997,Gene 187:9-18；Burton等.,1994,Advances in Immunology 57:191-280；PCT申请号PCT/GB91/O1 134；国际公开号WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401和WO97/13844；和美国专利公号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108。
原则上，通过筛选含有展示融合至噬菌体衣壳蛋白的抗体可变区(Fv)的各种片段的噬菌体的噬菌体文库选择合成抗体克隆。针对所需抗原筛选这类噬菌体文库。能够结合所需抗原的表达Fv片段的克隆被吸附到抗原并因此与文库中不结合的克隆分离。然后将结合克隆从抗原洗脱，并且可以通过额外的抗原吸收/洗脱循环进一步富集。
可变结构域可以功能性地展示于噬菌体，以单链Fv(scFv)片段或Fab片段，所述scFV片段中VH和VL通过短的、可变肽共价连接，而所述Fab片段中它们各自融合至恒定结构域并非共价地相互作用，例如，如Winter等,1994,Ann.Rev.Immunol.12:433-55中所述。
VH和VL基因的储库可以通过PCR分别克隆，然后随机重组到噬菌体文库中，然后可以将其用于寻找抗原结合克隆，如Winter等,引用如上所述。来自经免疫的来源的文库提供了对免疫原的高亲和力抗体，不需要构建杂交瘤。或者，可以克隆天然库以提供针对许多非自体以及自体抗原的人抗体的单一来源，不需要任何免疫作用，如Griffiths等,1993,EMBOJ 12:725-34中所述。最后，还可以这样合成制备天然文库，通过克隆来自干细胞的未重新排列的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物来编码高可变CDR3区域并实现体外重新排列，例如，如Hoogenboom和Winter,1992,J.Mol.Biol.227:381-88所述。
还可以通过本领域已知的各种技术实现筛选文库。例如，柄蛋白-4(例如，柄蛋白-4多肽、片段或表位)可以用于涂覆吸收板的孔，表达于固定于吸收板或用于细胞分选的宿主细胞，偶联生物素用于用链霉亲和素涂覆的珠捕获，或者用于淘选展示文库的任何其他方法。可以这样促进使用缓慢的解离动力学(例如，良好的结合亲和力)选择抗体：通过使用如Bass等,1990,Proteins 8:309-14和WO 92/09690中所述的单价噬菌体展示和长洗涤，和通过使用如Marks等,1992,Biotechnol.10:779-83中所述的抗原低涂覆密度。
抗-柄蛋白-4抗体可以这样获得：通过设计合适的抗原分泌过程以选择感兴趣的噬菌体克隆，然后使用来自感兴趣的噬菌体克隆的VH和/或VL序列(例如，Fv序列)或来自VH和VL的各种CDR序列以及Kabat等,引用如上中所述合适的恒定区(Fc)序列来构建全长抗-柄蛋白-4抗体克隆。
例如，本文所述的抗体还可以包括嵌合抗体。嵌合抗体是这样的分子，其中，抗体的不同部分源自不同的免疫球蛋白分子。例如，嵌合抗体可以包含小鼠或大鼠单克隆抗体的可变区，融合至人抗体的恒定区。产生嵌合抗体的方法为本领域已知。参见例如，Morrison,1985,Science 229:1202；Oi等,1986,BioTechniques 4:214；Gillies等,1989,J.Immunol.Methods 125:191-202；和美国专利号5,807,715、4,816,567、4,816,397和6,331,415。
使用诸如本文所述的那些技术产生的抗体或抗原结合片段可以使用标准、熟知的技术分离。例如，可以通过常规免疫球蛋白纯化过程，例如，蛋白质A-琼脂糖，羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和力色谱由例如，培养基，腹水液体，血清，细胞裂解物，合成反应材料等合适地分离抗体或抗原结合片段。如本文所用，“分离的”或“纯化的”抗体是基本上不含细胞材料或来自产生抗体的细胞或组织来源的蛋白质，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。
12.抗体片段
本公开提供结合柄蛋白-4的抗体和抗体片段。在某些情况下，采用抗体片段比采用完整抗体更具优势。片段的较小尺寸使其能被快速清除，且可使其进入细胞、组织或器官得以改善。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等,2003,Nature Med.9:129-34。
已开发了产生抗体片段的各种技术。传统上，这些片段是通过蛋白酶水解消化完整抗体产生的(参见例如，Morimoto等.,1992,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-17；和Brennan等,1985,Science 229:81-83)。然而，现在这些片段可以通过重组宿主细胞直接产生。Fab、Fv和scFv抗体片段均可在大肠杆菌或酵母细胞中表达或由其分泌，因此能够温和的产生大量这些片段。抗体片段可以分离自上述讨论的抗体噬菌体文库。或者，Fab'-SH片段可由大肠杆菌直接回收，并经化学偶联形成F(ab')2片段(Carter等,1992,Bio/Technology10:163-67)。根据另一方式，F(ab')2片段可以直接分离自重组宿主细胞培养物。体内半衰期增加的包含补救受体结合表位残基的Fab和F(ab’)2片段述于例如，美国专利号5,869,046。本领域技术人员明白产生抗体片段的其它技术。在某些实施方式中，抗体是单链Fv片段(scFv)(参见例如，WO 93/16185；美国专利号5,571,894和5,587,458)。Fv和scFV具有缺乏恒定区的完整结合位点；因此，它们可能适合在体内使用时降低非特异性结合。可以构建scFv融合蛋白，以实现在scFv的氨基或羧基末端融合效应物蛋白(参见例如，Borrebaeck编著，引用如上)。抗体片段还可以是“线性抗体”例如，如上述所述引用的参考文献所述。
较小的抗体来源结合结构是分开的可变结构域(V结构域)，也称之为单可变结构域抗体(sdAb)。某些类型的生物体，骆驼和软骨鱼，具有固定在Fc等价结构域结构上的高亲和力单V样结构域作为它们免疫系统的部分(Woolven等,1999,Immunogenetics 50:98-101；和Streltsov等,2004,Proc Natl Acad Sci USA.101:12444-49)。V样结构域(在骆驼中称之为VhH，在鲨鱼中称之为V-NAR)通常展示长表面环，其能够穿透靶抗原的腔体。它们还通过掩蔽疏水性表面贴片(patche)来使分离的VH结构域稳定。
这些VhH和V-NAR结构域已经用于工程改造sdAb。已经使用来自噬菌体文库的选择和其他方法设计了人V结构域变体，产生稳定、高结合VL-和VH-来源的结构域。
本文所提供的抗体包括但不限于，免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如，包含结合柄蛋白-4表位的抗原结合位点的分子。本文所提供的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚型(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
抗体的变体和衍生物包括保留结合柄蛋白-4表位能力的功能性抗体片段。示例性功能性片段包括Fab片段(例如，包含抗原结合结构域并包含通过二硫键桥接的部分重链和轻链的抗体片段)；Fab'(例如，包含单个抗原结合结构域的抗体片段，所述单个抗原结合结构域包含Fab和通过铰链区的重链的额外部分)；F(ab’)2(例如，通过重链铰链区中的链间二硫键连接的两个Fab'分子；Fab'分子可以针对相同或不同的表位)；含有可变区的单链，也称之为scFv(例如，通过10-25个氨基酸链连接在一起的单个轻链和重链的可变抗原结合决定区)；二硫键连接的Fv，或dsFv(例如，通过二硫键连接在一起的单个轻链和重链的可变抗原结合决定区)；骆驼化的VH(例如，抗体单个重链的可变抗原结合决定区，其中位于VH界面的一些氨基酸是存在于天然产生的骆驼抗体的重链中的那些)。
13.人源化抗体
例如，本文所述的抗体可以包括人源化抗体，例如，去免疫化或复合人抗体。
人源化抗体可以包含人恒定区序列。在某些实施方式中，人源化抗体可以选自任何类型的免疫球蛋白，包括IgM，IgG，IgD，IgA和IgE，以及任何同种型，包括IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。在某些实施方式中，人源化抗体可以包含κ或λ轻链恒定序列。
人源化抗体可以使用本领域已知的各种技术生产，包括但不限于CDR移植(欧洲专利号EP 239,400；国际公开号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)，镶面(veneer)或表面重塑(欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka等,1994,Protein Engineering 7(6):805-814；和Roguska等,1994,PNAS 91:969-973)，链改组(美国专利号5,565,332)，以及例如，美国专利号6,407,213，美国专利号5,766,886，WO 9317105,Tan等,J.Immunol.169:1119 25(2002)，Caldas等,Protein Eng.13(5):353-60(2000)，Morea等,Methods 20(3):267 79(2000)，Baca等,J.Biol.Chem.272(16):10678-84(1997)，Roguska等,Protein Eng.9(10):895 904(1996)，Couto等,Cancer Res.55(23Supp):5973s-5977s(1995)，Couto等,Cancer Res.55(8):1717-22(1995)，Sandhu JS,Gene 150(2):409-10(1994)，和Pedersen等,J.Mol.Biol.235(3):959-73(1994)中所公开的技术。还参见美国专利号US 2005/0042664 A1(2005年2月24日)，其各自通过引用其全部内容纳入本文。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体可以是结合柄蛋白-4包括人柄蛋白-4的人源化抗体。例如，本公开的人源化抗体可以包含表1中所示的一个或多个CDR。用于对非人抗体进行人源化的各种方法为本领域已知。例如，人源化抗体可以具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常被称为“输入”残基，它们一般取自“输入”可变结构域。例如，人源化过程可以按照Jones等,1986,Nature 321:522-25；Riechmann等,1988,Nature 332:323-27；和Verhoeyen等,1988,Science 239:1534-36)的方法通过用人抗体的相应序列取代超变区序列。
在一些情况中，人源化抗体通过CDR移植构建，其中将亲本非人抗体(例如，啮齿动物)的6个CDR的氨基酸序列移植到人抗体框架。例如，Padlan等确定仅有1/3的CDR中的残基实际上接触抗原，并将它们称为“特异性决定残基”或SDR(Padlan等,1995,FASEB J.9:133-39)。在SDR移植的技术中，仅将SDR残基移植到人抗体框架上(参见例如，Kashmiri等,2005,Methods36:25-34)。
将用于制造人源化抗体的人可变区结构域(轻链和重链)的选择对于降低抗原性是十分重要的。例如，按照所谓的“最佳拟合”方法，针对整个已知的人可变结构域序列文库筛选非人(例如，啮齿动物)抗体可变结构域的序列。与啮齿动物的序列最接近的人序列可以选作人源化抗体的人框架(Sims等,1993,J.Immunol.151:2296-308；和Chothia等,1987,J.Mol.Biol.196:901-17)。另一种方法采用特定的框架，其衍生自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列。这种相同框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89；和Presta等,1993,J.Immunol.151:2623-32)。在一些情况中，框架衍生自最丰富的人亚类VL6亚组I(VL6I)和VH亚组III(VHIII)的共有序列。在另一方法中，人种系基因用作框架区的来源。
在基于称之为超人源化的CDR比较的另一范例中，FR同源性是不相关的。该方法包括比较非人序列与功能性人种系基因库。然后选择编码与鼠序列相同或密切相关的标准结构的这些基因。其后，在与非人抗体共有标准结构的基因内，将在CDR内具有最高同源性的基因选作FR供体。最终，将非人CDR移植到这些FR(参见例如，Tan等,2002,J.Immunol.169:1119-25)。
通常进一步希望抗体经人源化并保留其对抗原的亲和力和其他有利的生物学特性。为了实现该目标，根据一种方法，通过这样的过程制备人源化抗体，所述过程使用亲本和人源化序列的三维模型来分析亲本序列和各种概念上的人源化产物。本领域技术人员通常可获得并且熟悉三维免疫球蛋白模型。也可利用计算机程序阐明和显示所选的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。这些包括例如，WAM(Whitelegg和Rees,2000,ProteinEng.13:819-24)，Modeller(Sali和Blundell,1993,J.Mol.Biol.234:779-815)，和SwissPDB Viewer(Guex和Peitsch,1997,Electrophoresis 18:2714-23)。检视这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，例如，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此方式，可选择FR残基并从受者和输入序列中组合，从而获得所需抗体特征，例如对靶抗原的亲和性增加。通常，超变区残基直接和最显著地参与影响抗原结合。
抗体免疫化的另一方法是基于抗体人源性(humanness)的度量，称之为人类字符串内容(string content)(HSC)。该方法比较小鼠序列与人种系基因的库，并将差异评分为HSC。然后，通过将其HSC最大化对靶序列进行人源化，而不是使用全局身份度量来生成多个不同的人源化变体(Lazar等,2007,Mol.Immunol.44:1986-98)。
除了上述方法之外，还可以使用经验方法生产和选择人源化抗体。这些方法包括基于使用富集技术或高通量筛选技术选择最佳克隆以及生成人源化变体的大文库的那些方法。抗体变体可以分离自噬菌体、核糖体和酵母展示文库以及通过细菌集落筛选(参见例如，Hoogenboom,2005,Nat.Biotechnol.23:1105-16；Dufner等,2006,TrendsBiotechnol.24:523-29；Feldhaus等,2003,Nat.Biotechnol.21:163-70；和Schlapschy等,2004,Protein Eng.Des.Sel.17:847-60)。
在FR文库方法中，将残基变体的集合导入FR中特定的位置，然后筛选文库以选择最佳支持移植的CDR的FR。待取代的残基可以包括鉴定为潜在地有助于CDR结构的一些或所有“Vernier”残基。(参见例如，Foote和Winter,1992,J.Mol.Biol.224:487-99)或来自通过Baca等(1997,J.Biol.Chem.272:10678-84)所鉴定的更有限的靶残基集合。
在FR改组中，整个FR与非人CDR组合，而不是创造选定残基变体的组合文库(参见例如，Dall’Acqua等,2005,Methods 36:43-60)。可以通过两步过程筛选文库的结合，首先是人源化VL，然后是VH。或者，可以使用一步FR改组过程。这类过程已经被证明比两步筛选更高效，因为所得抗体展现出改善的生物化学和物理化学特性，包括表达增强，亲和力增强和热稳定性(参见例如，Damschroder等,2007,Mol.Immunol.44:3049-60)。
该“人源化工程改造(humaneering)”方法基于实验性鉴定必需最小特异性决定簇(minimum specificity determinant，MSC)并且基于将非人片段顺序替换到人FR的文库中并评估结合。其开始于非人VH和VL链的CDR3区，并逐步将非人抗体的其他区域替换到人FR，包括VH和VL的CDR1和CDR2。该方法通常导致表位保留并鉴定具有不同人V区段CDR的多个亚类的抗体。人源化工程改造允许分离与人种系基因抗体具有91-96％同源性的抗体(参见例如，Alfenito,Cambridge Healthtech Institute’s Third Annual PEGS,The ProteinEngineering Summit,2007)。
该“人工程改造”方法涉及改变非人抗体或抗体片段，如小鼠或嵌合抗体或抗体片段，其通过对抗体的氨基酸序列进行特定变化，从而产生在人类中免疫原性降低的经修饰的抗体，尽管如此，保留了原始非人抗体所需的结合特性。通常，该技术涉及将非人(例如，小鼠)抗体的氨基酸残基分类为“低风险”、“中度风险”或“高风险”残基。该分类使用全局风险/奖励计算进行，对特定取代(例如，对人类的免疫原性)的预期益处针对取代将会影响所得抗体折叠的风险进行评估。可以通过将来自非人抗体可变区的氨基酸序列与特定或共同人抗体序列的相应区域进行比较来选择非人(例如，小鼠)抗体序列给定位置(例如，低或中度风险)处待取代的特定人氨基酸残基。非人序列中处于低或中度风险位置的氨基酸残基可以根据比对用人抗体序列中相应的残基取代。用于制备本文所述的经人工程改造的蛋白质的技术更详细地述于Studnicka等,1994,Protein Engineering 7:805-14；美国专利号5,766,886；5,770,196；5,821,123；和5,869,619；和PCT公开号WO 93/11794。
复合人抗体可以使用例如Composite Human AntibodyTM技术(Antitope股份有限公司，英国剑桥)生成。为了生成复合人抗体，由来自多个人抗体可变区序列的片段以避免T细胞表位的方式设计可变区序列，从而使产生的抗体的免疫原性最小化。这类抗体可以包含人恒定区序列，例如，人轻链和/或重链恒定区。
去免疫化抗体是其中T细胞表位已经被去除的抗体。已经描述了用于制备去免疫化抗体的方法。参见例如，Jones等,Methods Mol Biol.2009；525:405-23,xiv，和De Groot等,Cell.Immunol.244:148-153(2006))。去免疫化抗体包含T细胞表位耗尽的可变区和人恒定区。简言之，克隆抗体的VH和VL，而T细胞表位通过在T细胞增殖试验中测试源自抗体VH和VL的重叠肽随后鉴定。经由计算机模拟方法鉴定T细胞表位以鉴定与人MHC II型结合的肽。将突变导入VH和VL以消除与人MHC II型的结合。然后利用突变的VH和VL生成去免疫化抗体。
14.人抗体
在具体实施方式中，抗体是完全人抗-人抗体。完全人抗体可以通过本领域已知的任何方法产生。可以通过将选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列与已知的人恒定结构域序列组合来构建人抗-柄蛋白-4抗体。或者，本公开的人单克隆抗-柄蛋白-4抗体可以通过杂交瘤方法制备。已经描述了将人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于生产人单克隆抗体，例如，Kozbor,1984,J.Immunol.133:3001-05；Brodeur等,《单克隆抗体 生产技术和应用》51-63(1987)；和Boerner等,1991,J.Immunol.147:86-95。
还有可能产生这样的转基因动物(例如，小鼠)，其能够在免疫后在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的完全库。表达人抗体库的转基因小鼠已经用于针对许多种潜在的药物靶标生成高亲和力人序列单克隆抗体(参见例如，Jakobovits,A.,1995,Curr.Opin.Biotechnol.6(5):561-66；Brü ggemann和Taussing,1997,Curr.Opin.Biotechnol.8(4):455-58；美国专利号6,075,181和6,150,584；和Lonberg等,2005,Nature Biotechnol.23:1117-25)。
或者，人抗体可以经由对产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞进行免疫制备(例如，这类B淋巴细胞可以回收自个体或者可能已经体外免疫化的)(参见例如，Cole等,《单克 隆抗体与癌症治疗》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)(1985)；Boerner等,1991,J.Immunol.147(1):86-95；和美国专利号5,750,373)。
基因改组还可以用于由非人例如，啮齿动物抗体衍生人抗体，其中该人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。根据该方法(其也被称之为“表位印刻(epitopeimprinting)”或“导向选择(guided selection)”)，通过本文所述噬菌体展示技术获得的非人抗体片段的重链或轻链可变区被人V结构域基因的库替换，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合体的群体。使用抗原的选择导致分离非人链/人链嵌合scFv或Fab，其中人链恢复在去除原代噬菌体展示克隆中相应非人链后破坏的抗原结合位点(例如，表位引导(印刻)人链伴侣的选择)。当重复该过程从而替换剩余的非人链时，获得人抗体(参见例如，PCT WO93/06213；和Osbourn等,2005,Methods 36:61-68)。不同于非人抗体通过CDR移植的传统人源化，该技术完全提供了人抗体，其不具有非人来源的FR或CDR残基。对人源化小鼠抗体进行针对细胞表面抗原的导向选择的示例包括存在于卵巢癌细胞上的叶酸结合蛋白质(参见例如，Figini等,1998,Cancer Res.58:991-96)和CD147，其在肝细胞癌上高度表达(参见例如，Bao等,2005,Cancer Biol.Ther.4:1374-80)。
导向选择方法潜在的缺点是将一个抗体链改组同时保持另一抗体链恒定可能导致表位漂移。为了保持通过非人抗体识别的表位，可以采用CDR保留(参见例如，Klimka等,2000,Br.J.Cancer.83:252-60；和Beiboer等,2000,J.Mol.Biol.296:833-49)。在该方法中，通常保留非人VH CDR3，因为该CDR可能位于抗原结合位点的中心并且可能是用于抗原识别最重要的抗体区域。然而，在一些情况中，可以保留非人抗体的VH CDR3和VL CDR3以及VH CDR2、VL CDR2和VL CDR1。
15.多价抗体
多价抗体可以比二价抗体更快地被表达与抗体结合的抗原的细胞内化(和/或代谢)。本公开的抗体可以是多价抗体(除了IgM类)，具有三个或更多个抗原结合位点(例如，四价抗体)，其可以通过重组表达编码抗体多肽链的核酸容易地产生。多价抗体可以包含二聚化结构域以及三个或更多个抗原结合位点。在某些实施方式中，二聚化结构域包含(或由下述内容组成)Fc区或铰链区。在这种情况下，抗体将包含Fc区以及Fc区氨基末端的三个或更多个抗原结合位点。在某些实施方式中，多价抗体包含(或由下述内容组成)三个至约八个抗原结合位点。在一个这类实施方式中，多价抗体包含(或由下述内容组成)四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(例如，两条多肽链)，其中多肽链包含两个或更多个可变结构域。例如，多肽链可以包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，且n为0或1。例如，多肽链可以包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文所述的多价抗体还可以包含至少两个(例如，四个)轻链可变结构域多肽。例如，本文所述的多价抗体可以包含约两个至约八个轻链可变结构域多肽。本文考虑的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，以及任选地，进一步包含CL结构域。
Fc工程改造
可能需要通过Fc工程改造修饰本文所提供的抗-柄蛋白-4抗体。在某些实施方式中，对于抗体Fc区的修饰导致抗体效应物功能的降低或消失。在某些实施方式中，效应物功能是ADCC、ADCP和/或CDC。在一些实施方式中，效应物功能是ADCC。在其他实施方式中，效应物功能是ADCP。在其他实施方式中，效应物功能是CDC。在一实施方式中，效应物功能是ADCC和ADCP。在一实施方式中，效应物功能是ADCC和CDC。在一实施方式中，效应物功能是ADCP和CDC。在一实施方式中，效应物功能是ADCC、ADCP和CDC。这可以通过将一个或多个氨基酸取代导入抗体Fc区实现。
为了提高抗体的血清半衰期，可将补救受体结合表位纳入该抗体(尤其是抗体片段)，例如如美国专利号5,739,277中所述。术语“补救受体结合表位”是指IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc区中负责增加IgG分子体内血清半衰期的表位。
16.其他结合试剂
本公开涵盖了特异性结合与本文所述抗-柄蛋白-4抗体相同表位的非免疫球蛋白结合剂。在一些实施方式中，鉴定非免疫球蛋白结合剂为这样的试剂，所述试剂在竞争性结合试验中替换本公开的抗-柄蛋白-4抗体或被本公开的抗-柄蛋白-4抗体替换。这些其他结合试剂可以包括例如，本领域已知经工程改造的蛋白支架中的任一种。这类支架可以包含如表1所示的一个或多个CDR。这类支架包括，例如，抗运载蛋白(anticalin)，其基于脂质运载蛋白支架，该蛋白结构的特征是具有支持形成配体结合位点的四个高变环的刚性β-桶(beta-barrel)。可以工程改造新型结合特异性，其通过环区域中的随机诱变，联合功能性展示和导向选择(参见例如，Skerra,2008,FEBS J.275:2677-83)。其他合适的支架可以包括例如，阿迪连接素(adnectin)，或单体，基于人纤连蛋白的第十胞外域(参见例如，Koide和Koide,2007,Methods Mol.Biol.352:95-109)；亲和体(affibody)，基于葡萄球菌蛋白A的Z结构域(参见例如，Nygren等,2008,FEBS J.275:2668-76)；DARP素(DARPin)，基于锚蛋白重复蛋白(参见例如，Stumpp等,2008,Drug.Discov.Today 13:695-701)；fynomer，基于人Fyn蛋白激酶的SH3结构域(参见例如，Grabulovski等,2007,J.Biol.Chem.282:3196-204)；affitin，基于来自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidolarius)的Sac7d(参见例如，Krehenbrink等,2008,J.Mol.Biol.383:1058-68)；粘合素(affilin)，基于人y-B-晶体蛋白(参见例如，Ebersbach等,2007,J.Mol.Biol.372:172-85)；avimer，基于膜受体蛋白的A结构域(参见例如，Silverman等,2005,Biotechnol.23:1556-61)半胱氨酸富集绳结蛋白(knottin)肽(参见例如，Kolmar,2008,FEBS J.275:2684-90)；和工程改造的Kunitz型抑制剂(参见例如，Nixon和Wood,2006,Curr.Opin.Drug.Discov.Dev.9:261-68)。综述参见例如，Gebauer和Skerra,2009,Curr.Opin.Chem.Biol.13:245-55。
17.筛选柄蛋白-4特异性抗体
上文已经描述了用于生成抗体的方法。可以进一步按需筛选或选择抗体的某些生物学特征，如它们对于柄蛋白-4的结合特异性。筛选对靶抗原具有特异性的抗体涉及两个方面。第一，筛选抗体以鉴定与不包含柄蛋白-4的样品不结合或具有较低结合的抗体。该方面的筛选鉴定这样的抗体，其特异性识别和结合柄蛋白-4，但是基本上不识别或结合除了柄蛋白-4以外的分子。第二，筛选抗体以鉴定与包含柄蛋白-4的样品强烈结合或具有高亲和力的抗体。该方面的筛选鉴定这样的抗体，所述抗体对柄蛋白-4具有高亲和力并且可以在下述各种试验中给予强检测信号。以两方面对抗体进行筛选可以使用下文进一步描述的免疫试验实现。
在某些实施方式中，最初使用ELIAS筛选抗体，其中微滴定板用柄蛋白-4或其片段涂覆。将不结合或较弱地结合固定的柄蛋白-4的抗体克隆清除。在一些实施方式中，可以进一步筛选结合柄蛋白-4的抗体在免疫试验(例如，基于ELISA的试验或western印迹试验)对其他柄蛋白同种型的反应性，例如，使用经柄蛋白-1、柄蛋白-2或柄蛋白-3涂覆的微滴定板。清除对柄蛋白的另一同种型具有反应性的抗体克隆，可以选择仅对柄蛋白-4具有反应性的抗体克隆用于进一步筛选。
可以进一步筛选抗-柄蛋白-4抗体与阴性对照的结合，所述阴性对照不表达或表达低水平的柄蛋白-4。对于这类筛选，抗体的各种克隆和阴性对照之间的结合可以在免疫试验中确定，例如，IHC试验、ELISA试验或免疫印迹试验。清除对于任何阴性对照具有反应性的抗体克隆。不同的阴性对照(例如，对于柄蛋白-4表达呈阴性的不同的组织或细胞系)可以包含不同的分子集合，因此多个阴性对照可以用于保证针对非-柄蛋白-4分子的各种集合选择候选抗-柄蛋白-4抗体。
可以进一步筛选抗-柄蛋白-4抗体与阳性对照的结合，所述阳性对照已知将表达柄蛋白-4。对于这类筛选，抗体的各种克隆和阳性对照之间的结合可以在免疫试验中确定，例如，IHC试验、ELISA试验或免疫印迹试验。选择对阳性对照具有强结合的抗体克隆。可以将这样的抗-柄蛋白-4抗体选作对柄蛋白-4具有特异性的抗体，其强烈结合阳性对照且弱结合阴性对照。与阳性和阴性对照结合的抗-柄蛋白-4抗体的量之间的差异是抗-柄蛋白-4抗体与柄蛋白-4的特异性结合。特异性结合可以用作是选择特异性抗-柄蛋白-4抗体的标准之一。特异性抗体在下文详述的免疫试验中提供了高特异性结合。
在一些实施方式中，抗-柄蛋白-4抗体的特异性可以通过与阴性和阳性参照结合的抗-柄蛋白-4抗体与这些参照中已经通过其他方式确定的已知柄蛋白-4表达水平相关联或比较确定。参照柄蛋白-4表达可以是阳性柄蛋白-4对照或者阴性柄蛋白-4对照，如下所述。特定抗-柄蛋白-4抗体与样品或参照的结合可以与样品或参照中的柄蛋白-4表达相关联或成比例。也就是，特定抗-柄蛋白-4抗体强烈结合表达高水平柄蛋白-4的参照或样品，中度结合表达中间水平的那些，弱结合表达低水平的那些，并且最低限度地结合(例如，以与同种型对照抗体结合大致相同的水平结合)不表达柄蛋白-4的那些。阴性或阳性对照中已知的柄蛋白-4表达可以独立地通过下文详述的qPCE试验确定。已知的柄蛋白-4表达还可以独立地使用藉由之前已经确定具有柄蛋白-4特异性的抗-柄蛋白-4抗体的任何下述免疫试验确定。用于在阴性和阳性对照中确认柄蛋白-4表达的合适的免疫试验包括，例如但不限于，IHC试验，免疫印迹试验，FACS试验或ELISA试验，如下所详述。在一些实施方式中，阴性对照中的柄蛋白-4mRNA水平可能并不为零，因为试验的背景噪声或者因为生物学非限制性低水平的剩余柄蛋白-4，如下所述。阴性柄蛋白-4对照可以被恰当地认为对柄蛋白-4呈阴性，例如，当qPCR试验中的柄蛋白-4 mRNA水平与用一组非特异性引物所检测的mRNA水平基本相似时，或者当柄蛋白-4 mRNA水平就阳性柄蛋白-4对照中柄蛋白-4 mRNA水平而言是生物学非显著性的时。相似地，阴性对照中通过使用另一柄蛋白-4特异性抗体的免疫试验所检测的柄蛋白-4可能并不为零，因为试验的背景噪声或者因为生物学非显著性低水平的剩余柄蛋白-4。背景噪声可以是由于试验试剂而非抗-柄蛋白-4抗体和样品之间的非特异性相互作用所导致的。阴性柄蛋白-4对照可以被恰当地认为对柄蛋白-4呈阴性，例如，当阴性对照中通过柄蛋白-4特异性抗体所检测的柄蛋白-4水平与相同试验中来自同种型对照抗体的检测水平基本上相似时。在一些试验中，背景噪声可以占阳性对照中检测到的信号的大量百分比。
此外，本领域技术人员已经在文献中鉴定并公开了阳性和阴性对照，包括阳性和/或阴性组织、细胞(包括例如，细胞系)和病例样品。可以通过搜索数据库容易地鉴定这类文献，如Pubmed(例如，使用搜索术语诸如柄蛋白-4，表达，阳性，阴性和/或分布)，并分析研究热点。
因此，结合没有柄蛋白-4表达的阴性对照细胞的柄蛋白-4特异性抗体或其抗原结合片段的相对量可以是结合表达柄蛋白-4的阳性对照的抗体或其抗原结合片段的量的约50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.03％、0.01％、0.001％或更少。
在本文所提供的抗体或其抗原结合片段的一些实施方式中，对照细胞中的阴性或阳性柄蛋白-4表达独立地通过qPCR试验、使用二抗的IHC试验、使用二抗的免疫印迹试验、使用二抗的FACS试验或使用二抗的ELISA确定。
在本文所提供的抗体或其抗原结合片段的一些实施方式中，结合细胞的抗体或其抗原结合片段的量通过ICH试验、免疫印迹试验、FACS试验或ELISA确定。
18.抗体变体
在一些实施方式中，考虑了结合柄蛋白-4或本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性，包括但不限于，特异性，热稳定性，表达水平，效应物功能，糖基化，免疫原性降低或溶解性。因此，除了本文所述的抗-柄蛋白-4抗体，考虑了可以制备抗-柄蛋白-4抗体变体。例如，抗-柄蛋白-4抗体变体可以通过将合适的核苷酸改变导入编码DNA和/或通过合成所需抗体或多肽制备。本领域技术人员将理解的是，氨基酸改变可能改变抗-柄蛋白-4抗体的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数量或位置或者改变膜锚定特征。
在一些实施方式中，在本文所提供包含在其序列中具有第一谷氨酰胺的多肽的任何抗体中，也提供了位于第一残基的谷氨酰胺可以被谷氨酰胺取代。这类取代天然出现于生理条件或在pH约为7的体外或离体缓冲液中。这类取代可以这样进行：使包含具有第一谷氨酰胺的多肽的抗体处于有利于第一谷氨酰胺谷氨酰胺酰基环化形成焦谷氨酸的条件下，例如，在弱酸如乙酸盐和三氟乙酸盐的溶液中的条件中。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体经化学修饰，例如，通过共价连接任何类型的分子与抗体。抗体衍生物可以包括，已经化学修饰的抗体，例如，通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/阻断基团衍生、蛋白水解切割、连接于细胞配体或其它蛋白质等。通过已知技术可进行多种化学修饰中的任一种，包括但不限于：特异性化学切割、乙酰化、制剂、衣霉素的代谢合成等。此外，抗体可以包含一种或多种非经典氨基酸。
变异可以是取代、缺失或插入相较于天然序列抗体或多肽导致氨基酸序列改变的一个或多个编码抗体或多肽的密码子。氨基酸取代可以是用具有相似结构和/或化学特性的一种氨基酸替换另一氨基酸的结果，诸如用丝氨酸置换亮氨酸，例如，保守性氨基酸替换。本来技术人员已知的标准技术可以用于将突变导入编码本文所述提供的分子的核苷酸序列，包括例如，定点诱变和PCR介导的诱变，其导致氨基酸取代。插入或缺失可以任选地在1-5个氨基酸范围。在某些实施方式中，取代、缺失或插入包括相对于原始分子少于25个氨基酸取代，少于20个氨基酸取代，少于15个氨基酸取代，少于10个氨基酸取代，少于5个氨基酸取代，少于4个氨基酸取代，少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。在具体实施方式中，取代是位于一个或多个预测的非必须氨基酸残基处的保守性氨基酸取代。可通过对在序列中的氨基酸进行系统化插入、缺失或取代并测试所得变体由全长或成熟天然序列所展示的活性来确定允许的改变。
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基到包含100个或更多个残基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合体，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的示例包括具有N-末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入型变体包括抗体的N-或C-末端与增强抗体血清半衰期的多肽或酶(例如，抗体导向的酶前药疗法)的融合体。
“保守性氨基酸取代”是氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基取代。本领域已定义具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。或者，也可沿编码序列的全部或部分随机引入突变(例如通过饱和诱变)，然后可筛选所得突变体的生物学活性，以鉴定保持活性的突变体。诱变后，编码的蛋白质可以表达并且可以确定蛋白质的活性。
通过选择取代产生抗体生物学特性的实质改变，所选取代在维持以下方面的效果上差异显著：(a)取代区域中多肽骨架的结构，例如片层或螺旋构型，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或者(c)侧链体积。或者，可以产生保守性(例如，具有相似特性和/或侧链的氨基酸基团内)取代，从而维持或不显著地改变特性。氨基酸可以根据其侧链性质中的相似性分组(参见例如，Lehninger,《生物化学》(Biochemistry)73-75(第2版1975))：(1)非极性Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；和(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。
或者，天然产生的残基可以基于共同的侧链特性分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性氨基酸取代需要这些类别之一的成员与另一类别交换。这类取代的残基还可以导入保守性取代位点中，或者剩余的(非保守性)位点。因此，在一实施方式中，结合柄蛋白-4的抗体或其片段包含与本文所述鼠单克隆抗体的氨基酸序列至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与本文所述鼠单克隆抗体的氨基酸序列至少35％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与本文所述鼠单克隆抗体的氨基酸序列至少40％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与本文所述鼠单克隆抗体的氨基酸序列至少45％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与本文所述鼠单克隆抗体的氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与本文所述鼠单克隆抗体的氨基酸序列至少55％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与本文所述鼠单克隆抗体的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与本文所述鼠单克隆抗体的氨基酸序列至少65％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与本文所述鼠单克隆抗体的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与本文所述鼠单克隆抗体的氨基酸序列至少75％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与本文所述鼠单克隆抗体的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与本文所述鼠单克隆抗体的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与本文所述鼠单克隆抗体的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与本文所述鼠单克隆抗体的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与本文所述鼠单克隆抗体的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列。
在一实施方式中，结合柄蛋白-4的抗体或其片段包含与表1-2中所述氨基酸序列至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1-2中所述氨基酸序列至少35％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1-2中所述氨基酸序列至少40％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1-2中所述氨基酸序列至少45％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1-2中所述氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1-2中所述氨基酸序列至少55％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1-2中所述氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1-2中所述氨基酸序列至少65％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1-2中所述氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1-2中所述氨基酸序列至少75％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1-2中所述氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1-2中所述氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1-2中所述氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1-2中所述氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1-2中所述氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列。
在另一实施方式中，结合柄蛋白-4的抗体或其片段包含与表1中所述VH CDR氨基酸序列和/或表1中所述VL CDR氨基酸序列至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的VH CDR和/或VL CDR氨基酸序列。在另一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1中所述VH CDR氨基酸序列和/或表1中所述VL CDR氨基酸序列至少35％相同的VH CDR和/或VL CDR氨基酸序列。在另一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1中所述VH CDR氨基酸序列和/或表1中所述VL CDR氨基酸序列至少40％相同的VH CDR和/或VL CDR氨基酸序列。。在另一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1中所述VH CDR氨基酸序列和/或表1中所述VL CDR氨基酸序列至少45％相同的VH CDR和/或VL CDR氨基酸序列。在另一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1中所述VH CDR氨基酸序列和/或表1中所述VL CDR氨基酸序列至少50％相同的VH CDR和/或VL CDR氨基酸序列。在另一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1中所述VH CDR氨基酸序列和/或表1中所述VL CDR氨基酸序列至少55％相同的VH CDR和/或VL CDR氨基酸序列。在另一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1中所述VH CDR氨基酸序列和/或表1中所述VL CDR氨基酸序列至少45％相同的VHCDR和/或VL CDR氨基酸序列。。在另一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1中所述VH CDR氨基酸序列和/或表1中所述VL CDR氨基酸序列至少65％相同的VH CDR和/或VL CDR氨基酸序列。。在另一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1中所述VH CDR氨基酸序列和/或表1中所述VL CDR氨基酸序列至少70％相同的VH CDR和/或VL CDR氨基酸序列。。在另一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1中所述VH CDR氨基酸序列和/或表1中所述VL CDR氨基酸序列至少75％相同的VH CDR和/或VL CDR氨基酸序列。。在另一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1中所述VH CDR氨基酸序列和/或表1中所述VL CDR氨基酸序列至少80％相同的VH CDR和/或VL CDR氨基酸序列。在另一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1中所述VH CDR氨基酸序列和/或表1中所述VL CDR氨基酸序列至少85％相同的VH CDR和/或VL CDR氨基酸序列。在另一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1中所述VH CDR氨基酸序列和/或表1中所述VL CDR氨基酸序列至少90％相同的VH CDR和/或VLCDR氨基酸序列。在另一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1中所述VH CDR氨基酸序列和/或表1中所述VL CDR氨基酸序列至少95％相同的VH CDR和/或VL CDR氨基酸序列。在另一实施方式中，结合柄蛋白-4表位的抗体或其片段包含与表1中所述VHCDR氨基酸序列和/或表1中所述VL CDR氨基酸序列至少99％相同的VH CDR和/或VL CDR氨基酸序列。
改变可采用本领域已知的方法进行，例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描以及PCR诱变。定点诱变(参见例如，Carter,1986,Biochem J.237:1-7；和Zoller等,1982,Nucl.Acids Res.10:6487-500)，盒式诱变(参见例如，Wells等,1985,Gene 34:315-23)，或其他已知的技术可以在克隆的DNA上进行，以产生抗-柄蛋白-4抗体变体DNA。
也可对不涉及保持抗-柄蛋白-4抗体适当构象的任何半胱氨酸残基进行取代，例如，用另一氨基酸，如丙氨酸或丝氨酸以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可将一个或多个半胱氨酸键加入抗-柄蛋白-4抗体以改善其稳定性(例如，在抗体为抗体片段(如Fv片段)的情况下)。
某些实施方式中，本公开的抗-柄蛋白-4抗体分子是“去免疫的”抗体。“去免疫的”抗-柄蛋白-4抗体是衍生自人源化或嵌合抗-柄蛋白-4抗体的抗体，其在氨基酸序列中具有一个或多个改变，导致抗体的免疫原性相较于相应的原始非去免疫化抗体降低。用于生成这类抗体突变体的过程之一涉及鉴定和去除抗体分子的T细胞表位。在第一步中，抗体分子的免疫原性可以通过多种方法确定，例如，通过体外确定T细胞表位或计算机模拟预测这类表位，如本领域已知。一旦已经鉴定了对于T细胞表位功能至关重要的残基，可以制造突变以去除免疫原性并保留抗体活性。综述参见例如，Jones等,2009,Methods in MolecularBiology 525:405-23。
19.体外亲和力成熟
在一些实施方式中，可以通过体外亲和力成熟制备相较于亲本抗体具有特性诸如亲和力、稳定性或表达水平改善的抗体变体。类似于天然原型，体外亲和力成熟基于突变和选择的原则。抗体的文库展示为Fab、scFv或V结构域片段，它们位于生物体(例如，噬菌体、细菌、酵母或哺乳动物细胞)的表面或者与其编码mRNA或DNA相关联(例如，共价地或非共价地)。展示的抗体的亲和力选择允许分离携带编码抗体的遗传信息的生物体或复合物。使用展示方法诸如噬菌体展示进行2或3轮突变通常导致抗体片段具有低纳摩尔范围的亲和力。亲和力成熟的抗体可以具有对靶抗原纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。
噬菌体展示是用于抗体展示和选择的普遍方法。抗体在Fd或M13细菌噬菌体的表面展示为针对细菌噬菌体衣壳蛋白的融合体。选择涉及暴露于抗原以允许噬菌体展示的抗体结合其靶标，称之为“淘选”的过程。回收与抗原结合的噬菌体并用于感染细菌以产生用于其他轮选择的噬菌体。综述参见例如，Hoogenboom,2002,Methods.Mol.Biol.178:1-37；和Bradbury和Marks,2004,J.Immunol.Methods 290:29-49。
在酵母展示系统(参见例如，Boder等,1997,Nat.Biotech.15:553–57；和Chao等,2006,Nat.Protocols 1:755-68)中，抗体可以展示为单链可变融合体(scFv)，其中重链和轻链通过柔性接头连接。scFv与酵母凝集素蛋白Aga2p的粘性亚基融合，其通过对Aga1p的二硫键连接至酵母细胞壁。通过Aga2p展示蛋白质可将蛋白质投射到远离细胞表面的位置，从而使酵母细胞壁上其他分子之间潜在的相互作用最小化。磁力分离和流式细胞术用于筛选文库以选择亲和力或稳定性改善的抗体。与感兴趣的可溶性抗原的结合通过用生物素化的抗原以及二级试剂诸如与荧光团偶联的链霉亲和素标记酵母确定。抗体表面表达中的变异可以通过对侧接scFv的c-Myc表位标签或凝集素进行免疫荧光标记测量。已经证明表达与展示的蛋白质的稳定性相关联，并且因此可以选择抗体改善的稳定性以及亲和力(参见例如，Shusta等,1999,J.Mol.Biol.292:949-56)。酵母展示的另一优势是展示的蛋白质在真核酵母细胞的内质网中折叠，利用内质网伴侣和质量控制机制。一旦成熟完成，可以方便地“滴定”抗体亲和力，同时展示于酵母表面，消除各克隆表达和纯化的需求。酵母表面展示的理论限制是可能比其他展示方法小的功能性文库大小；然而，最近的方法使用酵母细胞的交配系统以产生预估大小为1014的组合多样性(参见例如，美国专利公开号2003/0186374；和Blaise等,2004,Gene 342:211–18)。
在核糖体展示中，生成抗体-核糖体-mRNA(ARM)复合物，用于无细胞系统中的选择。编码抗体特定文库的DNA文库与缺少终止密码子的间隔子序列遗传融合。当该间隔子序列翻译时，其仍然与肽基tRNA连接并且占据核糖体通道，并因此允许感兴趣的蛋白质伸出核糖体并折叠。所得mRNA、核糖体和蛋白质的复合物可以结合表面结合配体，允许通过使用配体的亲和力捕获同时分离抗体和其编码mRNA。然后将核糖体结合的mRAN逆转录回cDNA中，然后其可以经历诱变并用于下一轮选择中(参见例如，Fukuda等,2006,Nucleic AcidsRes.34:e127)。在mRNA展示中，抗体和mRAN之间的共价键使用嘌呤毒素作为衔接子分子建立(Wilson等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:3750-55)。
因为这些方法全部在体外进行，所以它们相较于其他选择技术可以提供两个主要优势。第一，文库的多样性并不受限于细菌细胞的转化效率，而是仅限于存在于试管中的核糖体和不同的mRNA分子的数量。第二，各选择轮后可以容易地导入随机突变，例如，通过非校对的聚合酶，因为在任何多样化步骤中没有文库必须被转化。
在哺乳动物细胞展示系统(参见例如，Bowers等,2011,Proc Natl Acad SciUSA.108:20455-60)中，基于连接至预重组的(prerecombined)D(J)区的种系序列V-基因区段构建IgG的完全人文库。将重链和轻链的全长V区域与人重链和轻链恒定区组装并转染到哺乳动物细胞系(例如，HER293)中。扩增转染的文库并进行针对链霉亲和素(SA)偶联的磁珠的多轮阴性选择，然后进行针对涂覆有生物素化的靶蛋白、肽片段或表位的SA偶联的磁珠的一轮阳性选择。扩增阳性选择的细胞，然后通过多轮FACS分选以分离展示特异性结合靶蛋白、肽片段或表位的抗体的单细胞克隆。来自这些单细胞克隆的重链和轻链对经AID再转染用于进一步成熟。多轮哺乳动物细胞展示，与AID触发的体细胞超变异偶联，生成高特异性、高亲和力抗体。
还可以靶向的方式或经由随机导入将多样性导入抗体文库的CDR或整个V基因。前一种方法包括经由高或低水平的诱变依次靶向抗体的所有CDR或靶向体细胞超突变分离的热点(参见例如，Ho等,2005,J.Biol.Chem.280:607-17)或者疑似在实验基础或结果原因影响亲和力的残基。多样性还可以经由DNA改组或相似技术通过置换天然具有多样性的区域导入(参见例如，Lu等,2003,J.Biol.Chem.278:43496-507；美国专利号5,565,332和6,989,250)。针对延伸到框架区残基中的超变环的其他技术(参见例如，Bond等,2005,J.Mol.Biol.348:699-709)采用环缺失和插入CDR或使用基于杂交的多样化(参见例如，美国专利号2004/0005709)。在CDR中生成多样性的其他方法公开于例如，美国专利号7,985,840。可以用于生成抗体文库和/或抗体亲和力成熟的其他方法公开于，例如，美国专利号8,685,897和8,603,930，和美国专利公开号2014/0170705、2014/0094392、2012/0028301、2011/0183855和2009/0075378，其各自通过引用纳入本文。
还可以通过本领域已知的各种技术实现筛选文库。例如，柄蛋白-4可以固定在固体支持物、柱、针或纤维素/聚(偏氟乙烯)膜/其他过滤器，表达于固定于吸收板或用于细胞分选的宿主细胞，或者偶联生物素用于用链霉亲和素涂覆的珠捕获，或者用于淘选展示文库的任何其他方法。
体外亲和力成熟方法的综述参见例如，Hoogenboom,2005,Nature Biotechnology23:1105-16；Quiroz和Sinclair,2010,Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51；以及其中的参考文献。
20.抗-柄蛋白-4抗体的修饰
抗-柄蛋白-4抗体的共价修饰包括在本发明范围内。共价修饰包括使抗-柄蛋白-4抗体的靶向氨基酸残基与有机衍生剂反应，所述有机衍生剂能够与抗-连接-4抗体选定的侧链或N-或C-末端残基反应。其他修饰包括谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基分别脱酰胺成相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酸残基的羟基磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基甲基化(参见例如，Creighton,《蛋白质结构和分子特性》(Proteins:Structure and Molecular Properties)79-86(1983))，N-末端胺的乙酰化和任何C-末端羧基的酰胺化。
本公开范围内包括的抗-柄蛋白-4抗体的共价修饰的其他类型包括，改变抗体或多肽的天然糖基化模式(参见例如，Beck等,2008,Curr.Pharm.Biotechnol.9:482-501；和Walsh,2010,Drug Discov.Today 15:773-80)，和连接抗体与各种非蛋白性(nonproteinaceous)聚合物中的一种，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧烷基，以例如，美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；或4,179,337中所述方式。
本公开的抗-柄蛋白-4抗体还可以经修饰以形成嵌合分子，其包含彼此融合的抗-柄蛋白-4抗体，异源性多肽或氨基酸序列，例如，表位标签(参见例如，Terpe,2003,Appl.Microbiol.Biotechnol.60:523-33)或IgG分子的Fc区(参见例如，Aruffo,《抗体融合蛋白》(Antibody Fusion Proteins)221-42(Chamow and Ashkenazi eds.,1999))。
本文还提了融合蛋白，其包含本文提供的结合柄蛋白-4抗原的抗体和异源性多肽。在一些实施方式中，抗体与之融合的异源性多肽能够用于靶向抗体至具有细胞表面表达的柄蛋白-4的细胞。
本文还提供了结合柄蛋白-4抗原的抗体组。在具体实施方式中，抗体组对于柄蛋白-4抗原具有不同的结合速率，不同的解离速率，不同的亲和力，和/或对于柄蛋白-4抗原不同的特异性。在一些实施方式中，该组包含或由下述内容组成：约10、约25、约50、约75、约100、约125、约150、约175、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950或约1000个抗体或更多。例如，抗体组可以用于在96孔或384孔板中的试验，诸如ELISA。
21.抗-柄蛋白-4抗体的制备
可以通过培养经含有编码抗-柄蛋白-4抗体的核酸的载体转化或转染的细胞产生抗-柄蛋白-4抗体。可以使用标准重组技术获得编码本公开抗体多肽组分的多核苷酸序列。所需多核苷酸序列可以分离自或序列化(sequence)自产生抗体的细胞，诸如杂交瘤细胞。或者，可以使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，将编码多肽的序列插入能够在宿主细胞中复制和表达异源性多核苷酸的重组载体中。为了本公开的目的，可以使用本领域已知的许多载体。合适载体的选择将主要取决于待插入载体中的核酸的大小以及待用该载体转化的特定宿主细胞。适合表达本公开的抗体的宿主细胞包括原核生物，如古细菌和真细菌，包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，真核微生物如丝状真菌或酵母菌，无脊椎动物细胞如昆虫或植物细胞，和脊椎动物细胞如哺乳动物宿主细胞系。宿主细胞经上述表达载体转化并在常规营养培养基中培养，所述营养培养基经适当修饰用于诱导启动子，选择转化体，或扩增编码所需序列的基因。通过宿主细胞产生的抗体使用本领域已知的纯化方法进行纯化。
包括载体构建，表达和纯化的抗体生产方法进一步述于Plückthun等,《抗体工程 改造：由PCR到发酵在大肠杆菌中产生抗体》(Antibody Engineering:Producing antibodies in Escherichia coli:From PCR to fermentation)203-52(McCafferty等编著,1996)；Kwong和Rader,大肠杆菌表达和纯化Fab抗体片段(E.coli Expression andPurification of Fab Antibody Fragments),载于《新编蛋白质科学》(Current Protocols in Protein Science)(2009)；Tachibana和Takekoshi,在大肠杆菌中产生抗体Fab片段(Production of Antibody Fab Fragments in Escherischia coli),述于《抗体 表达和产生》(Antibody Expression and Production)(Al-Rubeai编著,2011)；和《治疗性 单克隆抗体：从实验室和到临床》(Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic)(An编著,2009)。
当然，考虑了可以采用本领域所熟知的其他方法来制备抗-柄蛋白-4抗体。例如，可以使用固相技术通过直接肽合成来产生适当的氨基酸序列或其部分(参见例如，Stewart等,《固相肽合成》(Solid-Phase Peptide Synthesis)(1969)；和Merrifield,1963,J.Am.Chem.Soc.85:2149-54)。体外蛋白质合成可以使用手动技术或通过自动化进行。抗-柄蛋白-4抗体的各个部分可以单独地化学合成，并使用化学或酶促方法组合以产生所需的抗-柄蛋白-4抗体。或者，抗体可以纯化自转基因动物的细胞或体液如乳汁，所述转基因动物经工程改造以表达抗体，如例如美国专利号5,545,807和5,827,690所公开。
22.免疫偶联物
本公开还提供了偶联物，其含有通过合成接头与一种或多种非抗体试剂共价结合的本文所公开的抗-柄蛋白-4抗体中的任一种。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体与例如诊断性或可检测分子偶联或重组融合。偶联或重组融合的抗体可以用于例如，监测或预测柄蛋白-4介导的结冰的发作、发展、进展和/或严重程度。
这类诊断和检测可以通过下述内容实现，例如，通过将抗体与可检测物质偶联，所述可检测物质包括但不限于，各种酶，诸如但不限于，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；修复基团，诸如但不限于，链霉亲和素/生物素或亲和素/生物素；荧光物质，诸如但不限于伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，若丹明，二氯三嗪胺荧光素，丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，诸如但不限于鲁米诺；生物发光材料，诸如但不限于，萤光素酶，萤光素或水母发光蛋白；化学发光材料，诸如但不限于基于吖啶的化合物或HALOTAG；放射性物质，诸如但不限于碘(131I，125I，123I和121I,)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，铟(115In，113In，112In和111In)，锝(99Tc)，铊(201Ti)，镓(68Ga和67Ga)，钯(103Pd)，钼(99Mo)，氙(133Xe)，氟(18F)，153Sm，177Lu，159Gd，149Pm，140La，175Yb，166Ho，90Y，47Sc，186Re，188Re，142Pr，105Rh，97Ru，68Ge，57Co，65Zn，85Sr，32P，153Gd，169Yb，51Cr，54Mn，75Se，113Sn或117Sn；使用各种正电子发射断层扫描技术的正电子发射金属；和非放射性顺磁性金属离子。
本文还提供了这样的抗体以及其用途，所述抗体重组融合或化学偶联(共价或非共价偶联)至异源性蛋白质或多肽(或其片段，例如，约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90或约100个氨基酸长的多肽)以生成融合蛋白。具体的，本文提供了这样的融合蛋白，其含有本文所提供抗体的抗原结合片段(例如，Fab片段，Fc片段，Fv片段，F(ab)2片段、VH结构域，VH CDR，VL结构域或VL CDR)和异源性蛋白质、多肽或肽。在一实施方式中，抗体与之融合的异源性蛋白质、多肽或肽能够用于靶向抗体至特定的细胞类型，诸如表达柄蛋白-4的细胞。例如，结合特定细胞类型表达所表达的细胞表面受体的抗体可以与本文所提供的经修饰的抗体融合或偶联。
此外，本文所提供的抗体可以与标志物或“标签”序列诸如肽融合以促进纯化。在具体实施方式中，标志物或标签氨基酸序列是六组氨酸肽，诸如pQE载体(参见例如，凯杰有限公司(QIAGEN,Inc)提供的标签等，其中许多标记可市售获得。例如，如Gentz等,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-24中所述，六组氨酸提供了方便的融合蛋白纯化方法。能够用于纯化的其他肽标签包括但不限于，血球凝集素(“HA”)标签，其对应衍生自流感血球凝集素蛋白的表位(Wilson等,1984,Cell 37:767-78)，链霉亲和素/亲和素结合肽，和“FLAG”标签。
已知用于融合或偶联部分(包括多肽)至抗体的方法(参见例如，Arnon等,用于癌症治疗药物免疫靶向的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies for Immunotargeting ofDrugs in Cancer Therapy),述于《单克隆抗体和癌症疗法》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)243-56(Reisfeld等编著,1985)；Hellstrom等,用于药物递送的抗体Antibodies for Drug Delivery,述于《控释药物递送》(Controlled Drug Delivery)623-53(Robinson等编著,第2版1987)；Thorpe,癌症疗法中细胞毒性试剂的抗体运载体的综述(Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy:A Review),述于《单克隆抗体：生物学和临床引用》(Monoclonal Antibodies:Biological and Clinical Applications)475-506(Pinchera等编著,1985)：放射标记抗体在癌症治疗中的应用分析、结果和未来展望(Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Useof Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy),述于《癌症检测和治疗的单克隆抗体》(Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy)303-16(Baldwin等编著,1985)；Thorpe等,1982,Immunol.Rev.62:119-58；美国专利号5,336,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851；5,723,125；5,783,181；5,908,626；5,844,095和5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；EP 394,827；PCT公开号WO 91/06570，WO 96/04388，WO 96/22024，WO 97/34631和WO 99/04813；Ashkenazi等,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:10535-39；Traunecker等,1988,Nature,331:84-86；Zheng等,1995,J.Immunol.154:5590-600；和Vil等,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-41)。
融合蛋白可以这样产生，例如，通过基因改组，基序改组，外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)的技术。可以采用DNA改组以改变本文所提供的抗-柄蛋白-4抗体的活性，包括例如，具有较高亲和力和较低解离速率的抗体(参见例如，美国专利号5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252；and 5,837,458；Patten等,1997,Curr.OpinionBiotechnol.8:724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2):76-82；Hansson等,1999,J.Mol.Biol.287:265-76；和Lorenzo和Blasco,1998,Biotechniques 24(2):308-13)。抗体或编码的抗体可以通过进行随机诱变，其通过易错PCR，随机核苷酸插入或重组之前的其他方法改变。编码本文所提供的抗体的多核苷酸可以与一个或多个异源性分子的一个或多个组件、基序、节段、部分、结构域、片段等重组。
本文所提供的抗体还可以与二抗偶联以形成抗体异源偶联物，诸如例如美国专利号4,676,980所述的。
如本文所提供的结合柄蛋白-4的抗体还可以连接固体支持物，其特别能够用于靶抗原的免疫试验或纯化。固体支持物包括但不限于，玻璃，纤维素，聚丙烯酰胺，尼龙，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。
接头可以是促进细胞内偶联的试剂释放的“可切割接头”，但是本文也考虑了不可切割接头。用于本公开偶联物的接头包括但不限于，酸不稳定接头(例如，腙接头)，含二硫键的接头，肽酶敏感的接头(例如，含氨基酸的肽接头，例如缬氨酸和/或瓜氨酸，例如瓜氨酸-缬氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸)，光不稳定接头，二甲基连接基(参见例如，Chari等,1992,Cancer Res.52:127-31；和美国专利号5,208,020)，硫醚接头，或设计为逃避多药转运物介导的抗性的亲水性接头(参见例如，Kovtun等,2010,Cancer Res.70:2528-37)。
可以使用各种双功能蛋白偶联剂，如BMPS，EMCS，GMBS，HBVS，LC-SMCC，MBS，MPBH，SBAP，SIA，SIAB，SMCC，SMPB，SMPH，磺基-EMCS，磺基-GMBS，磺基-KMUS，磺基-MBS，磺基-SIAB，磺基-SMCC，磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸盐)制备抗体和试剂的偶联物。本公开进一步考虑了可以使用本领域所公开的任何合适的方法(参见例如《生物偶联技术》(Bioconjugate Techniques)(Hermanson编，第二版，2008))制备抗体和试剂的偶联物。
用于抗体和试剂的常规偶联策略基于涉及Lys残基的ε-氨基基团和Cys残基的硫醇基团的随机偶联化学，其导致异源性偶联物。最近研发的技术允许位点特异性偶联抗体，实现同质加载(homogeneous loading)并避免了具有改变的抗原结合或药代动力学的偶联亚群。这些技术包括工程改造“硫代mab(thiomab)”，其在提供反应性硫醇基团并且不破坏免疫球蛋白折叠和组装或改变抗原结合的重链和轻链上的位置包含半胱氨酸取代(参见例如，Junutula等,2008,J.Immunol.Meth.332:41-52；和Junutula等,2008,NatureBiotechnol.26:925-32)。在另一方法中，将硒代半胱氨酸这样共翻译地(cotranslationally)插入抗体序列，通过将终止密码子UGA从终止重新编码到硒代半胱氨酸插入，在其他天然氨基酸存在的情况下，允许硒代半胱氨酸亲核硒醇基团处的位点特异性共价偶联。
在其他实施方式中，本文提供了与治疗性部分(或者一个或多个治疗性部分)偶联或重组融合的抗体。抗体可以偶联或重组融合治疗性部分，诸如细胞毒素，例如，细胞抑制剂或杀细胞剂，治疗剂或放射性金属离子，例如，α-发射体。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害的任何试剂。治疗性部分包括但不限于，抗代谢物(例如，甲氨蝶呤，6-巯基嘌呤，6-硫代鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶脱卡巴嗪)；烷基化剂(例如，甲氯乙胺，噻菌灵苯丁酸氮芥，美法仑，卡莫司汀(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)，环磷酰胺(cyclothosphamide)，白消安(busulfan)，二溴甘露醇，链脲佐菌素，丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)和顺铂)；蒽环类药物(例如，柔红霉素(daunorubicin)(之前为道诺霉素(daunomycin))和阿霉素(doxorubicin))；抗生素(例如d放线菌素(之前为放线菌素)，博来霉素(bleomycin)，光神霉素和蒽霉素(anthramycin，AMC))；奥瑞抑素(Auristatin)分子(例如，奥瑞抑素PHE，苔藓抑素1和索拉抑素(solastatin)10；参见Woyke等,Antimicrob.Agents Chemother.46:3802-8(2002)，Woyke等,Antimicrob.Agents Chemother.45:3580-4(2001)，Mohammad等,Anticancer Drugs 12:735-40(2001)，Wall等,Biochem.Biophys.Res.Commun.266:76-80(1999)，Mohammad等,Int.J.Oncol.15:367-72(1999)，其各自通过引用纳入本文)；激素(糖皮质激素，孕激素，雄激素和雌激素)，DNA修复酶抑制剂(例如，依托泊苷或拓扑替康)，激酶抑制剂(例如，化合物ST1571，甲磺酸伊马替尼(Kantarjian等,Clin Cancer Res.8(7):2167-76(2002))；细胞毒性剂(例如，紫杉醇，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，吐根碱(emetine)，丝裂霉素，依托泊苷，替诺泊苷(tenoposide)，长春新碱(vincristine)，长春花碱(vinblastine)，秋水仙碱(colchicin)，阿霉素(doxorubicin)，柔红霉素(daunorubicin)，二羟基蒽醌二酮，米托蒽醌，光神霉素(mithramycin)，放线菌素D，1-脱氢睾丸素，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素和其类似物或同系物和美国专利号6,245,759、6,399,633、6,383,790、6,335,156、6,271,242、6,242,196、6,218,410、6,218,372、6,057,300、6,034,053、5,985,877、5,958,769、5,925,376、5,922,844、5,911,995、5,872,223、5,863,904、5,840,745、5,728,868、5,648,239、5,587,459中公开的那些化合物；法尼基转移酶抑制剂(例如，R115777，BMS-214662，和例如美国专利号6,458,935、6,451,812、6,440,974、6,436,960、6,432,959、6,420,387、6,414,145、6,410,541、6,410,539、6,403,581、6,399,615、6,387,905、6,372,747、6,369,034、6,362,188、6,342,765、6,342,487、6,300,501、6,268,363、6,265,422、6,248,756、6,239,140、6,232,338、6,228,865、6,228,856、6,225,322、6,218,406、6,211,193、6,187,786、6,169,096、6,159,984、6,143,766、6,133,303、6,127,366、6,124,465、6,124,295、6,103,723、6,093,737、6,090,948、6,080,870、6,077,853、6,071,935、6,066,738、6,063,930、6,054,466、6,051,582、6,051,574和6,040,305所公开的那些)；拓扑异构酶抑制剂(例如，喜树碱；伊立替康；SN-38；托泊替康；9-氨基喜树碱；GG-211(GI 147211)；DX-8951f；IST-622；鲁比替康；甲氧基吡唑啉吖啶(pyrazoloacridine)；XR-5000；善尼托平(saintopin)；UCE6；UCE1022；TAN-1518A；TAN 1518B；KT6006；KT6528；ED-110；NB-506；ED-110；NB-506；和蝴蝶霉素(rebeccamycin))；布戈瑞宁(bulgarein)；DNA小沟结合剂，如霍斯特(Hoescht)染料33342和霍斯特染料33258；宁替丁(nitidine)；法加隆宁(fagaronine)；表小檗碱(epiberberine)；珊瑚碱(coralyne)；β-拉帕醌(beta-lapachone)；BC-4-1；二膦酸盐(例如，阿仑膦酸盐(alendronate)，西玛磷酸盐(cimadronte)，氯膦酸盐(clodronate)，替鲁膦酸盐(tiludronate)，依替膦酸盐(etidronate)，伊班膦酸盐(ibandronate)，奈立膦酸盐(neridronate)，欧盘磷酸盐(olpandronate)，利塞膦酸盐(risedronate)，吡膦酸盐(piridronate)，帕米膦酸盐(pamidronate)，唑来膦酸盐(zolendronate))HMG-CoA还原酶抑制剂，(例如，洛伐他汀，辛伐他汀，阿托伐他汀，普伐他汀，氟伐他汀，他汀类，西伐他汀，氟伐他汀，卢普妥(lupitor)，瑞舒伐他汀和阿托伐他汀)；反义寡核苷酸(例如，美国专利号6,277,832、5,998,596、5,885,834、5,734,033和5,618,709中所公开的那些)；腺苷脱氨酶抑制剂(例如，氟达拉滨磷酸酯和2-氯脱氧腺苷)；替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)
Figure BDA0002378599980001191
托西莫单抗(tositumomab)
Figure BDA0002378599980001192
)和其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物和前药。
此外，本文所提供的抗体可以偶联或重组融合至改变给定生物反应的治疗性部分或药物部分。治疗性部分或药物部分并不应被解释为仅限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是拥有所需生物活性的蛋白质、肽或多肽。这类蛋白质可以包括例如，毒素，诸如相思豆毒素(abrin)，蓖麻毒蛋白A，假单胞菌外毒素，霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质，诸如肿瘤坏死因子，γ-干扰素，α-干扰素，神经生长因子，血小板衍生生长因子，组织纤溶酶原激活剂，凋亡因子，例如，TNF-γ，TNF-γ，AIM I(参见，国际公开号WO 97/33899)，AIM II(参见，国际公开号WO 97/34911)，Fas配体(Takahashi等,1994,J.Immunol.,6:1567-1574)，和VEGF(参见，国际公开号WO 99/23105)，抗-血管生成剂，例如，血管抑制素，内皮抑素或凝血途径的组件(例如，组织因子)；或，生物响应调节剂，例如，淋巴因子(例如，干扰素γ，白细胞介素-1(“IL-1”)，白细胞介素-2(“IL-2”)，白细胞介素-5(“IL-5”)，白细胞介素-6(“IL-6”)，白细胞介素-7(“IL-7”)，白细胞介素9(“IL-9”)，白细胞介素-10(“IL-10”)，白细胞介素-12(“IL-12”)，白细胞介素-15(“IL-15”)，白细胞介素-23(“IL-23”)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)，和粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”))，或生长因子(例如，生长激素(“GH”))，或凝结剂(例如，钙，维生素K，组织因子，诸如但不限于哈格曼因子(Hagemanfactor)(因子XII)，高分子量激肽原(HMWK)，前激肽释放酶(PK)，凝血蛋白因子II(凝血酶原)，因子V，XIIa，VIII，XIIIa，XI，XIa，IX，IXa，X，磷脂和纤维蛋白单体)。
应当选择与本文所提供免疫特异性结合柄蛋白-4抗原的抗体偶联或重组融合的治疗性部分或药物，以实现所需预防或治疗效果。在某些实施方式中，抗体是经修饰的抗体。当决定何种治疗性部分或药物与本文所提供的抗体偶联或重组融合时，临床医生或其医疗工作人员应当考虑下述内容：疾病的性质，疾病的严重程度和对象的状态。
本文所用“抗-柄蛋白-4抗体药物偶联物”或“抗-柄蛋白-4 ADC”指偶联或重组融合治疗性部分(或一个或多个治疗性部分)的抗-柄蛋白-4抗体或其抗原结合片段，或偶联或重组融合如上所述改变给定生物响应的治疗性部分或药物部分的抗-柄蛋白-4抗体或其抗原结合片段。
本文提供了抗-柄蛋白-4 ADC，包括特异性结合柄蛋白-4的抗-柄蛋白-4抗体。本文还提供了抗-柄蛋白-4 ADC，包括本文所提供的抗-柄蛋白-4抗体或其抗原结合片段。
23.使用抗体和组合物的方法
在一个方面中，本文提供了抑制(例如，降低细胞数量倍增的速率，减缓细胞数量增加的速率，或阻断或防止细胞数量增加)细胞增殖的方法，其包括将细胞与有效量的本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC接触。
在一个方面中，本文提供了抑制细胞增殖的方法，其包括将细胞与抗-柄蛋白-4ADC接触，包括本文所提供的特异性结合柄蛋白-4的抗-柄蛋白-4抗体(例如，人柄蛋白-4的ECD或人柄蛋白-4的ECD的表位)。在某些实施方式中，细胞与有效量的本文所述抗-柄蛋白-4 ADC接触。在一些实施方式中，抗-柄蛋白-4 ADC结合人柄蛋白-4的ECD。在一些实施方式中，抗-柄蛋白-4 ADC结合人柄蛋白-4的ECD的表位。在某些实施方式中，抗-柄蛋白-4 ADC特异性地结合不同于柄蛋白-4配体结合位点的人柄蛋白-4的ECD的表位。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约10％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约15％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约20％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约25％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约30％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约35％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约40％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约45％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约50％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约55％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约60％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约65％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约70％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约75％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约80％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约85％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约90％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约95％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约98％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约99％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约100％。在一些实施方式中，细胞的增殖被抑制至少约25％至约65％。在具体实施方式中，细胞增殖的抑制通过本文所述的方法评估。在具体实施方式中，细胞增殖的抑制通过本领域技术人员所知的方法评估。在某些实施方式中，细胞增殖的抑制是相对于并未与抗-柄蛋白-4 ADC接触的细胞的增殖的抑制而言的。在某些实施方式中，细胞增殖的抑制是相对于并与不相关抗体(例如，不特异性结合柄蛋白-4的抗体)，不相关抗体的ADC或未偶联的抗-柄蛋白-4抗体接触的细胞的增殖的抑制而言的。
24.药物组合物
在一个方面中，本公开还提供了药物组合物，其包含至少一种本公开的抗-柄蛋白-4 ADC。在一个实施方式中，药物组合物包含：1)抗-柄蛋白-4抗体，和2)药学上可接受的运载体。
包含抗-柄蛋白-4 ADC的药物组合物通过下述方式制备保存：将具有所需纯度的抗-柄蛋白-4 ADC与任选的生理学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂(参见例如，Remington,《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)(第18版，1980))混合，制成水性溶液的形式或冻干或其他干燥的形式。
本公开的抗体可以任何合适的形式配制用于递送至靶细胞/组织，例如，以微胶囊或巨乳液(macroemulsion)(Remington,引用如上；Park等,2005,Molecules 10:146-61；Malik等,2007,Curr.Drug.Deliv.4:141-51)，以缓释制剂(Putney和Burke,1998,NatureBiotechnol.16:153-57)，或者以脂质体(Maclean等,1997,Int.J.Oncol.11:325-32；Kontermann,2006,Curr.Opin.Mol.Ther.8:39-45)。
本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC还可以包入微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或界面聚合制备，例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，或可包入胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或包入巨乳液。例如，合适的技术在Remington,引用如上中公开。
已知并且可以与本文所述结合柄蛋白-4的抗-柄蛋白-4 ADC联用的各种组合物和递送系统包括但不限于，包封于脂质体，微颗粒，微胶囊，重组细胞，其能够表达抗-柄蛋白-4 ADC，受体介导的内吞作用(参见例如，Wu和Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-32)，构建核酸作为逆转录病毒或其他载体的部分等。在另一实施方式中，组合物可以作为控释或缓释系统提供。在一实施方式中，可以使用泵以实现控释或缓释(参见例如，Langer,引用如上；Sefton,1987,Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201-40；Buchwald等,1980,Surgery 88:507-16；和Saudek等,1989,N.Engl.J.Med.321:569-74)。在另一实施方式中，聚合材料可以用于实现控释或缓释预防性或治疗性试剂(例如，本文所述的抗-柄蛋白-4 ADC)或本文所提供的组合物(参见例如，《控释的医疗应用》(Medical Applications of Controlled Release)(Langer和Wise编著,1974)；《控释药物生物利用度：药物产品设计和性能》(Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance)(Smolen和Ball编著,1984)；Ranger和Peppas,1983,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61-126；Levy等,1985,Science 228:190-92；During等,1989,Ann.Neurol.25:351-56；Howard等,1989,J.Neurosurg.71:105-12：美国专利号5,679,377；5,916,597；5,912,015；5,989,463；和5,128,326；PCT公开号WO 99/15154和WO 99/20253)。用于缓释制剂的聚合物的示例包括但不限于，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸)，聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)，聚(甲基丙烯酸)，聚乙交酯(PLG)，聚酐，聚(N-乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙烯醇)，聚丙烯酰胺，聚(乙二醇)，聚交酯(PLA)，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一实施方式中，用于缓释制剂中的聚合物是惰性的，无可浸出杂质的，储存稳定的，无菌的并且是可生物降解的。
在另一实施方式中，控释或缓释放系统可以放置在特定靶组织，例如，鼻道或肺附近，因此仅需要该全身剂量的部分(参见例如，Goodson,《控释的医疗应用》(Medical Applications of Controlled Release)第2卷,115-38(1984))。控释系统述于，例如，Langer,1990,Science 249:1527-33。本领域技术人员已知的任何技术可以用于产生含有结合本文所述柄蛋白-4的一种或多种抗体的缓释制剂(参见例如，美国专利号4,526,938，PCT公开号WO 91/05548和WO 96/20698，Ning等,1996,Radiotherapy&Oncology 39:179-89；Song等,1995,PDA J.of Pharma.Sci.&Tech.50:372-97；Cleek等,1997,Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-54；和Lam等,1997,Proc.Int’l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24:759-60)。
包含本文所提供的一种或多种抗体的治疗性制剂可以通过如下方式制备保存：将具有所需纯度的抗-柄蛋白-4 ADC与任选的药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂(《雷明顿药物科学》(1990)麦克出版公司(Mack Publishing Co.),宾夕法尼亚州伊斯顿)混合，制成冻干制剂或水性溶液的形式。在所用剂量和浓度下，可接受的运载体、赋形剂或稳定剂通常是对受者无毒的，并且包括：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，如钠；金属络合物(如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如，TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
例如，本文所提供的抗体还可以配制成脂质体。包含感兴趣的分子的脂质体通过本领域已知的方法制备，诸如述于Epstein等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688；Hwang等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030；和美国专利公开号4,485,045和4,544,545。美国专利号5,013,556中公开了循环时间延长的脂质体。
可通过反相蒸发方法，利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生特别有用的免疫脂质体。使脂质体通过孔隙大小确定的滤器挤出，以得到具有所需直径的脂质体。可以如Martin等(1982)J.Biol.Chem.257:286-288所述经由二硫互换反应将本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC的Fab’片段与脂质体偶联。化疗剂(诸如多柔比星)任选地包含于脂质体中；参见Gabizon等,(1989)J.National Cancer Inst.81(19):1484。
制剂，诸如本文所述的那些，可以包含超过一种对正在进行治疗的特定迹象而言所需的活性化合物。在某些实施方式中，制剂包含本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC以及具有彼此不产生负面影响的互补活性的一种或多种活性化合物。这些分子适合以目标效果有效量存在于组合中。例如，本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC可以与一种或多种其他治疗剂组合。这类联合疗法可以给予连续或同时或依次给予患者。
本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC还可以包入微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或界面聚合制备，例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，或可包入胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或包入巨乳液。这类公开于《雷明顿药物科学》(1990)麦克出版公司,宾夕法尼亚州伊斯顿。
用于体内给药的制剂可以是无菌的。这可通过例如无菌滤膜过滤容易地实现。
还可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含有抗-柄蛋白-4 ADC的固体疏水性聚合物的半渗透基质，其中该基质是成型制品形式，例如膜或微胶囊。缓释基质的例子包括：聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚丙交酯(美国专利号3,773,919)，L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物释放分子的时间能够超过100天，某些水凝胶释放蛋白质的时间则较短。包入胶囊的抗体能在体内长期留存，它们因接触37℃潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性降低、免疫原性也可能改变。取决于相关的机制，可设计合理方案实现稳定化。例如，如果发现聚集机制是通过硫代基(thio-)-二硫键互换形成的分子间S--S键，可以通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制水分含量、使用合适添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定化。
本文所提供的药物组合物在药学上可接受的运载体中包含治疗有效量的一种或多种本文所提供的抗体，和任选地一种或多种其他预防性治疗剂。这类药物组合物能够用于预防、治疗、控制或改善柄蛋白-4介导的疾病或其一种或多种症状。
适合用于本文所提供的化合物给药的药物运载体包括本领域技术人员已知适合用于特定模式的给药的任何这类运载体。
此外，本文所提供的抗体可以配制成组合物中的单一药物活性成分或者可以与其他活性成分(诸如一种或多种其他预防性或治疗性试剂)组合。
组合物可以包含本文所提供的一种或多种抗体。在一实施方式中，可以将抗体配制成合适的药物制备物，诸如溶液剂，混悬剂，片剂，可分散片剂，丸剂，胶囊剂，粉末剂，缓释制剂或酏剂，用于口服给药或于无菌溶液或悬浮液中用于肠胃外给药，以及透皮贴剂和干粉吸入器。在一实施方式中，使用本领域已知的技术和方法将上述抗体配制为药物组合物(参见例如Ansel(1985)《药物剂型导论》(Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms),第4版,第126页)。
在该组合物中，有效浓度的一种或多种抗体或其衍生物与合适的药物运载体混合。组合物中化合物的浓度能够有效递送这样的量，在其给药后治疗、预防或改善柄蛋白-4介导的疾病或其症状。
在一个实施方式中，配制组合物用于单剂量给药。为了配制组合物，化合物的重量部分以有效浓度溶解、悬浮、分散或以其他方式混合于选定的运载体，从而使治疗的病症缓解、预防，或者改善一种或多种症状。
本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC以足以在不能存在不期望的副作用的情况下对经治疗的患者产生治疗有用作用的有效量包含在药学上可接受的运载体中。治疗有效浓度可以通过在体外和体内系统中使用常规方法测试化合物来凭经验地确定，然后由此推断出针对人的剂量。
药物组合物中抗-柄蛋白-4 ADC的浓度将依赖于，例如，抗-柄蛋白-4 ADC的物理化学性质，剂量方案，和给予的量以及本领域技术人员已知的其他因素。
在一实施方式中，治疗有效剂量产生约0.1ng/ml至约50-100μg/ml的抗-柄蛋白-4ADC血清浓度。在另一实施方式中，药物组合物提供了每天约0.001mg至约2000mg抗-柄蛋白-4 ADC/千克体重的剂量。可以制备药物剂量单元以提供各剂量单元形式约0.01mg，0.1mg或1mg至约500mg，1000mg或2000mg，并且在一实施方式中，约10mg至约500mg的抗-柄蛋白-4 ADC和/或其他任选的必需成分的组合。
抗-柄蛋白-4 ADC可以给予一次，或者可以分成数个较小的剂量，每隔一段时间给予。应理解，治疗的精确剂量和持续时间随着正在治疗的疾病变化，并且可以使用已知的测试方案凭经验确定，或者通过体内或体外测试数据外推。需要注意的是，浓度和剂量还会根据待缓解的病症严重程度而变化。还应理解，对于任何具体的对象，可以随着时间根据个体的需求以及给予或监督组合物给予的人员的专业判断来调节具体的给药方案，本文所列浓度范围仅仅是示例性的，不会对所要求保护的组合物的范围或实施构成限制。
在混合或添加抗-柄蛋白-4 ADC后，所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳液等。所得混合物的形式取决于许多因素，包括目标给药模式以及化合物在选定运载体或载剂中的溶解度。有效浓度足以改善治疗的疾病、紊乱或病症的症状并且可以凭经验确定。
提供了药物组合物用于以单位剂型给予人和动物，诸如片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、颗粒剂、无菌胃肠道外溶液剂或混悬剂和口服溶液剂或混悬剂以及油水乳液，其含有合适量的化合物或其药学上可接受的衍生物。在一实施方式中，抗-柄蛋白-4 ADC配制为单位剂型或多重剂型并以单位剂型或多重剂型进行给药。本文所用单位剂型指适合人和动物对象的物理离散单位并如本领域所知独立地包装。各单位剂量含有预定量的抗-柄蛋白-4ADC，其与所需药物运载体、载剂或稀释剂联用时足以产生需要的治疗效果。单位剂型的示例包括安瓿和注射器和单独包装的片剂或胶囊剂。单位剂型可以逐份给予或给予多份。多重剂型是包装在单个容器内的多个相同的单位剂型，从而以分开的单位剂型形式给予。多重剂型的示例包括小瓶、片剂或胶囊剂瓶或者品脱或加仑瓶。因此，多剂量形式是包装中未分开的单位剂量的倍数。
在一些实施方式中，本文所提供的一种或多种抗-柄蛋白-4抗体处于液体药物制剂。药学上可给予的液体组合物可以(例如)通过以下方式制备：将上述定义的活性化合物和任选的药物佐剂溶解、分散或以其他方式混合于运载体中，例如，水、盐水、水性右旋糖、甘油、二醇、乙醇等，从而形成溶液或混悬液。如果需要，待给予的药物组合物可还包含少量无毒辅助物质，如润湿剂，乳化剂，增溶剂，pH缓冲剂等，例如，乙酸盐，柠檬酸钠、环糊精衍生物、单月桂酸去水山梨糖醇酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯和其他这类试剂。
制备这种剂型的实际方法是已知的，或是本领域技术人员所明白的；例如参见《雷明顿药物科学》(1990)麦克出版公司,宾夕法尼亚州伊斯顿。
可制备包含0.005％至100％范围内抗-柄蛋白-3ADC的剂型或组合物，余量由非毒性运载体补足。本领域技术人员已知制备这些组合物的方法。
口服药物剂型是固体、凝胶或液体。固体剂型是片剂、胶囊、颗粒和分散粉末。口服片剂的类型包括压制的，可咀嚼的锭剂和可以是肠溶包衣的，糖包衣的或薄膜包衣的片剂。胶囊可以是硬明胶胶囊或软明胶胶囊，而颗粒和粉末可以非泡腾或泡腾的形式与本领域技术人员已知的其他成分组合提供。
在某些实施方式中，制剂是固体剂型。在某些实施方式中，制剂是胶囊或片剂。片剂、丸剂、胶囊、含片等可含有下述成分或具有相似特性的化合物中的一种或多种：粘合剂；润滑剂；稀释剂；助滑剂；崩解剂；着色剂；甜味剂；调味剂；润湿剂；催吐包衣；和薄膜衣。粘合剂的例子包括微晶纤维素，黄蓍胶，葡萄糖溶液，阿拉伯胶，明胶溶液，糖蜜，聚乙烯吡咯烷酮，聚维酮，交聚维酮，蔗糖和淀粉糊。润滑剂包括滑石粉，淀粉，硬脂酸镁或钙，石松粉和硬脂酸。稀释剂包括例如，乳糖，蔗糖，淀粉，高岭土，盐，甘露醇和磷酸氢钙。助滑剂包括但不限于二氧化硅胶体。崩解剂包括交联羧甲基纤维素钠，羟乙酸淀粉钠，海藻酸，玉米淀粉，马铃薯淀粉，皂土，甲基纤维素，琼脂和羧甲基纤维素。着色剂包括，例如，任何经批准的经认证的水溶性FD和C染料，其混合物；以及悬浮于水合氧化铝上的水不溶性FD和C染料。甜味剂包括蔗糖，乳糖，甘露醇和人造甜味剂如糖精，和任何数量的喷雾干燥香料。调味剂包括从植物如水果中提取的天然香料和产生令人愉悦感觉的化合物的合成混合物，诸如但不限于薄荷和水杨酸甲酯。润湿剂包括丙二醇单硬脂酸酯，脱水山梨糖醇单油酸酯，二甘醇单月桂酸酯和聚氧乙烯月桂醚。催吐包衣包括脂肪酸，脂肪，蜡，虫胶，氨化虫胶和邻苯二甲酸醋酸纤维素。薄膜包衣包括羟乙基纤维素，羧甲基纤维素钠，聚乙二醇4000和邻苯二甲酸醋酸纤维素。
抗体可以这样的组合物提供，所述组合物保护其免于胃的酸性环境。例如，可以在肠溶包衣中配制，保持其在胃中的完整性，并在肠中释放活性化合物。还可以联合抗酸剂或其他类似成分配制组合物。
当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料以外，它可以包含液体运载体(如脂肪油)。此外，剂量单位形式可含有多种其他材料，其修饰剂量单位的物理形式，例如糖和其他肠溶试剂的包衣。化合物还可以酏剂、悬浮剂、糖浆、晶片，糖屑，口香糖等的组分给予。除活性化合物之外，糖浆还可含有作为甜味剂的蔗糖和某些防腐剂、染料和着色剂和调味剂。
抗-柄蛋白-4 ADC还可以与不损害所需作用的其他活性材料混合物，或者与补充所需作用的物质，诸如抗酸剂，H2阻滞剂和利尿剂混合。活性成分是本文所述的抗-柄蛋白-4 ADC或其药学上可接受的衍生物。可以包括较高浓度，高达约98％重量的活性成分。
在所有实施方式中，片剂或胶囊制剂可以如本领域技术人员已知进行包衣，从而修饰或维持活性成分的释放。因此，例如，可以用常规的肠溶性包衣，如水杨酸苯酯，蜡和醋酸邻苯二甲酸纤维素包衣。
在一些实施方式中，制剂是液体剂型。液体口服剂型包括由非泡腾颗粒重建的水溶液，乳液，悬浮液，溶液和/或悬浮液和由泡腾颗粒重建的泡腾制剂。水性溶液包括例如，酏剂和糖浆。乳液是水包油或油包水的。
酏剂是透明、甜化的水醇制备物。用于酏剂中的药学上可接受的运载体包括溶剂。糖浆是糖例如蔗糖的浓缩水溶液，并且可以包含防腐剂。乳液是两相系统，其中一种液体以小颗粒形式分散在另一种液体中。乳剂中所用药学上可接受的运载体是非水液体，乳化剂和防腐剂。悬浮液使用药学上可接受的悬浮剂和防腐剂。将被重建成液体口服剂型的非泡腾颗粒中使用的药学上可接受的物质，包括稀释剂，甜味剂和湿润剂。将被重建成液体口服剂型的泡腾颗粒中使用的药学上可接受的物质，包括有机酸和二氧化碳的来源。着色剂和调味剂将用于上述所有剂型中。
溶剂包括甘油，山梨糖醇，乙醇和糖浆。防腐剂的示例包括甘油，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，苯甲酸，苯甲酸钠和醇。乳液中所利用的非水液体的示例包括矿物油和棉籽油。乳化剂的实例包括明胶，阿拉伯胶，黄芪胶，皂土和表面活性剂，如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。悬浮剂包括羧甲基纤维素钠，果胶，黄芪胶，Veegum和阿拉伯胶。甜味剂包括蔗糖，糖浆，甘油和人造甜味剂如糖精。润湿剂包括丙二醇单硬脂酸酯，脱水山梨糖醇单油酸酯，二甘醇单月桂酸酯和聚氧乙烯月桂醚。有机酸包括柠檬酸和酒石酸。二氧化碳的来源包括碳酸氢钠和碳酸钠。着色剂包括任何批准的认证的水溶性FD和C染料及其混合物。调味剂包括从植物如水果中提取的天然调味剂，以及产生令人愉悦的口感的化合物的合成混合物。
在一个实施方式中，对于固体剂型，在例如碳酸亚丙酯，植物油或甘油三酸酯中的溶液或悬浮液被封装在明胶胶囊中。这类溶液及其制备物和封装物公开于美国专利号4,328,245；4,409,239；和4,410,545。对于液体剂型，例如在聚乙二醇中的溶液可以用足够量的药学上可接受的液体运载体例如水将其稀释，以易于测量给药。
或者，液体或半固体口服制剂可通过将活性化合物或盐溶解或分散在植物油，乙二醇，甘油三酸酯，丙二醇酯(例如，碳酸亚丙酯)和其他这类运载体中，并将这些溶液或悬浮液封装于硬或软明胶胶囊壳中来制备。其他有用的制剂包括美国专利号RE28,819和4,358,603中所示的那些。简言之，这类制剂包括但不限于，含有本文提供的化合物的那些，二烷基化的单或聚亚烷基二醇，包括但不限于1,2-二甲氧基甲烷，二甘醇二甲醚，三甘醇二甲醚，四甘醇二甲醚，聚乙二醇-350-二甲醚，聚乙二醇-550-二甲醚，聚乙二醇-750-二甲醚，其中350、550和750指聚乙二醇的大致平均分子量，以及一种或多种抗氧化剂，如丁基化羟基甲苯(BHT)，丁基化羟基茴香醚(BHA)，没食子酸丙酯，维生素E，对苯二酚，羟基香豆素，乙醇胺，卵磷脂，脑磷脂，抗坏血酸，苹果酸，山梨糖醇，磷酸，硫代二丙酸及其酯和二硫代氨基甲酸酯。
其他制剂包括但不限于，包含药学上可接受的乙缩醛的醇水溶液。用于这些制剂中的醇是具有一个或多个羟基的任何药学上可接受的水混溶性溶剂，包括但不限于丙二醇和乙醇。缩醛包括但不限于，低级烷基醛的二(低级烷基)缩醛，如乙醛二乙基缩醛。
在一实施方式中，肠胃外给药的特征在于注射，考虑了皮下，肌肉内或静脉内。注射剂(injectable)可以常规形式制备，例如液体溶液或悬浮液，适合于在注射前在液体中形成溶液或悬浮的固体形式或乳液。注射剂，溶液和乳液还包含一种或多种赋形剂。合适的赋形剂是例如水，盐水，右旋糖，甘油或乙醇。此外，如果需要，待给予的药物组合物还可包含少量的无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，稳定剂，溶解增强剂，以及其它此类试剂，例如乙酸钠，脱水山梨糖醇单月桂酸酯，三乙醇胺油酸酯和环糊精。
本文还考虑了缓释或持续释放系统的植入，从而维持恒定的剂量水平(参见例如，美国专利号3,710,795)。简言之，本文所提供的化合物分散于固体内部基质中，例如，聚甲基丙烯酸甲酯，聚甲基丙烯酸丁酯，增塑或未增塑的聚氯乙烯，增塑的尼龙，增塑的聚对苯二甲酸乙二醇酯，天然橡胶，聚异戊二烯，聚异丁烯，聚丁二烯，聚乙烯，乙烯-乙酸乙烯酯共聚物，硅橡胶，聚二甲基硅氧烷，碳酸硅酯共聚物，亲水性聚合物，如丙烯酸和甲基丙烯酸酯的水凝胶，胶原蛋白，交联的聚乙烯醇和交联的部分水解的聚乙酸乙烯酯，其被外部聚合物膜包围，例如，聚乙烯，聚丙烯，乙烯/丙烯共聚物，乙烯/丙烯酸乙酯共聚物，乙烯/乙酸乙烯酯共聚物，硅橡胶，聚二甲基硅氧烷，氯丁橡胶，氯化聚乙烯，聚氯乙烯，与乙酸乙烯酯的氯乙烯共聚物，偏二氯乙烯，乙烯和丙烯，离聚物聚对苯二甲酸乙二醇酯，丁基橡胶环氧氯丙烷橡胶，乙烯/乙烯/乙烯醇共聚物，乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三聚物和乙烯/乙烯氧基乙醇共聚物，其不溶于体液。抗-柄蛋白-4 ADC通过释放速率控制步骤中的外部聚合物膜溶解。此类肠胃外组合物中包含的抗-柄蛋白-4 ADC的量高度取决于其具体性质，化合物的活性和对象的需求。
用于胃肠道外给药的制剂包括准备注射的无菌溶液、无菌干燥可溶性产品(如冻干的粉末)、准备在使用前与溶剂混合的物质(包括皮下片剂)、准备注射的无菌悬浮液、准备在使用前与载剂混合的无菌干燥不溶性产品和无菌乳液。溶液可以是水性或非水性的。
如果静脉内给予，合适的运载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)以及含有增稠和增溶剂(葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物)的溶液。
胃肠道外制剂中使用的药学上可接受的运载体包括水性载剂、非水性载剂、抗微生物剂、等渗剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、助悬和分散剂、乳化剂、掩蔽或螯合剂和其他药学上可接受的物质。
水性载剂的示例包括氯化钠注射剂，林格注射剂，等渗右旋糖注射剂，无菌水注射剂，右旋糖和乳酸林格注射剂。非水性肠胃外载剂包括植物来源的非挥发性油，棉籽油，玉米油，芝麻油和花生油。可以将抗细菌或抗真菌浓度的抗微生物剂添加到装在多剂量容器中的肠胃外制剂中，其包括苯酚或甲酚，汞，苯甲醇，氯丁醇，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，硫柳汞，苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和葡聚糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉药包括盐酸普鲁卡因。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨酯80(
Figure BDA0002378599980001311
80)。金属离子的掩蔽剂或螯合剂包括EDTA。药物运载体还包括乙醇，聚乙二醇和丙二醇，用于水混溶性载剂；以及氢氧化钠，盐酸，柠檬酸或乳酸，用于调节pH。
调节药物活性化合物的浓度，使得注射剂提供有效量以产生所需的药理作用。如本领域中已知的，确切的剂量取决于患者或动物的年龄，体重和状况。
单位剂量肠胃外制剂可以包装在安瓿瓶，小瓶或带针注射器中。如本领域已知和实践的，用于肠胃外给予的所有制剂可以是无菌的。
示例性地，包含活性化合物的无菌水溶液的静脉内或动脉内输注是有效的给药方式。另一实施方式是包含产生所需药理作用所需注射的活性材料的无菌水性或油性溶液或悬浮液。
注射剂设计用于局部和全身给药。在一实施方式中，配制治疗有效剂量的制剂以包含至少约0.1％w/w至约90％w/w或更高的浓度，在某些实施方式中，向治疗的组织给予大于1％w/w的活性化合物。
抗-柄蛋白-4 ADC可以微粒化的或其他合适的形式悬浮。所得混合物的形式取决于许多因素，包括目标给药模式以及化合物在选定运载体或载体中的溶解度。有效浓度足以改善治疗的病症的症状并且可以凭经验确定。
在其他实施方式中，药物制剂是冻干的粉末，其可以被重建以溶液，乳液和其它混合物的形式给药。它们也可以被重建并配制成固体或凝胶。
通过将本文提供的抗-柄蛋白-4 ADC或其药学上可接受的衍生物溶解在合适的溶剂中来制备冻干粉末。在一些实施方式中，冻干粉末是无菌的。溶剂可以包含赋形剂或粉末或由粉末制备的重建溶液的其它药理成分，该赋形剂改善稳定性。可以使用的赋形剂包括但不限于，葡萄糖，山梨醇，果糖，玉米糖浆，木糖醇，甘油，葡萄糖，蔗糖或其他合适的试剂。在一实施方式中，溶剂还可以包含缓冲剂，如柠檬酸盐，磷酸钠或磷酸钾或本领域技术人员已知的其他此类缓冲剂，约中性pH。所需的制剂由依次无菌过滤溶液随后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干而提供。在一实施方式中，将所得溶液分配到小瓶中以冻干。各小瓶将包含单剂量或多剂量的化合物。冻干的粉末可在适当条件下储存，如在约4℃至室温下。
用注射用水重建该冻干粉可提供用于肠胃外给药的制剂。对于重建，将冻干粉末添加至无菌水或其他合适的运载体。确切的量取决于所选化合物。该量可以根据经验确定。
如所述制备局部混合物用于局部和全身给药。所得混合物可以是溶液，悬浮液，乳液等，并且可以配制成乳膏，凝胶，软膏，乳液，溶液，酏剂，洗剂，悬浮液，酊剂，糊剂，泡沫，气雾剂，灌洗剂，喷雾剂，栓剂，绷带，皮肤贴片或其他适合局部给药的任何其他制剂。
本文所提供的抗体可以配制成气雾剂用于局部施用，如通过吸入(参见例如，美国专利号4,044,126、4,414,209和4,364,923，描述了能够用于治疗炎性疾病，尤其是哮喘的递送类固醇的气雾剂)。用于呼吸道给药的这些制剂可以是喷雾剂或用于喷雾器的溶液的形式，或者是用于吹入的微细粉末的形式，其单独使用或与惰性运载体如乳糖联用。在这样的情况下，制剂的颗粒的直径，在一实施方式中将小于50微米，在一实施方式中将小于10微米。
可以配制化合物用于局部或局部施用，如用于以凝胶，乳膏和洗剂的形式局部施用于皮肤和粘膜如眼，并用于施用于眼或用于颅内或脊柱内施用。考虑了将局部给药用于透皮递送，也考虑了用于眼或粘膜给药，或用于吸入疗法。也可以单独或与其他药学上可接受的赋形剂组合地施用活性化合物的鼻溶液。
这些溶液，特别是旨在用于眼科的溶液，可以配制成0.01％-10％的等渗溶液，pH为约5-7，具有适当的盐。
本文还考虑了其他给药途径，如透皮贴片，包括离子电渗疗法和电泳装置，和直肠给药。
本领域技术人员已知透皮贴片，包括离子电渗疗法和电泳装置。例如，美国专利号6,267,983、6,261,595、6,256,533、6,167,301、6,024,975、6,010715、5,985,317、5,983,134、5,948,433和5,860,957中所公开的这类贴片。
例如，用于直肠给药的药物剂型是直肠栓剂，胶囊和片剂具有全身作用。本文所用的直肠栓剂是指用于插入直肠的固体，其在体温下熔化或软化，释放一种或多种药理或治疗活性成分。直肠栓剂中使用的药学上可接受的物质是提高熔点的试剂和载剂或碱。碱的示例包括可可脂(可可油)，甘油-明胶，碳水化合物(聚氧乙二醇)和脂肪酸的甘油单酯，甘油二酯和甘油三酯的适当混合物。可以使用各种碱的组合。提高栓剂熔点的试剂包括乙酸精和蜡。直肠栓剂可以通过压缩方法或通过模制来制备。在一个实施方式中，直肠栓剂的重量为约2至3gm。
用于直肠给药的片剂和胶囊可以使用与口服给药制剂相同的药学上可接受的物质和相同的方法制造。
本文所提供的抗体和其他组合物还可被配制为靶向待治疗对象的特定组织，受体或身体的其他区域。本领域技术人员熟知许多这类靶向方法。本文考虑了所有此类靶向方法用于本发明组合物中。对于靶向方法的非限制性示例，参见例如，美国专利号6,316,652，6,274,552，6,271,359，6,253,872，6,139,865，6,131,570，6,120,751，6,071,495，6,060,082，6,048,736，6,039,975，6,004,534，5,985,307，5,972,366，5,900,252，5,840,674，5,759,542和5,709,874。在一些实施方式中，本文所提供的抗-柄蛋白-4抗体靶向(或以其他方式给予)结肠，诸如在患有或处于患柄蛋白-4介导的疾病风险中的患者中。
在一个实施方式中，脂质体悬浮液，包括靶向组织的脂质体，如靶向肿瘤的脂质体，也可以适合作为药学上可接受的运载体。可以根据本领域技术人员已知的方法制备它们。例如，可以如美国专利号4,522,811中所述制备脂质体制剂。简言之，可以通过干燥烧瓶内部的蛋状磷脂酰胆碱和脑磷脂酰丝氨酸(摩尔比为7：3)来形成脂质体诸如多层囊泡(MVL)。添加本文提供的化合物在缺乏二价阳离子的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的溶液，摇动烧瓶直至脂质膜分散。洗涤所得的囊泡以除去未封装的化合物，通过离心沉淀，然后重悬于PBS中。
25.给药和剂量的方法
在具体实施方式中，本文提供了用于预防、控制、治疗和/或改善柄蛋白-4介导的疾病的组合物，包括本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC。在具体实施方式中，本文提供了用于预防柄蛋白-4介导的疾病的组合物，其中，该组合物包括本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC。在具体实施方式中，本文提供了用于管理柄蛋白-4介导的疾病的组合物，其中，该组合物包括本文所提供的抗-柄蛋白-4ADC。在具体实施方式中，本文提供了用于治疗柄蛋白-4介导的疾病的组合物，其中，该组合物包括本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC。在具体实施方式中，本文提供了用于改善柄蛋白-4介导的疾病的组合物，其中，该组合物包括本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC。在某些实施方式中，该对象是有此需要的对象。在一些实施方式中，对象患有柄蛋白-4介导的疾病。在其他实施方式中，对象处于患柄蛋白-4介导的疾病的风险中。在一些实施方式中，给药导致预防、控制、治疗或改善柄蛋白-4介导的疾病。在一实施方式中，抗-柄蛋白-4 ADC是ADC，其中抗-柄蛋白-4抗体是抗体M22-321b41.1。
在一实施方式中，本文提供了用于预防、控制、治疗和/或改善柄蛋白-4介导的疾病的症状的组合物，其中，该组合物包括本文所提供的抗-柄蛋白-4ADC。在具体实施方式中，本文提供了用于预防柄蛋白-4介导的疾病的症状的组合物，其中，该组合物包括本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC。在具体实施方式中，本文提供了用于控制柄蛋白-4介导的疾病的症状的组合物，其中，该组合物包括本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC。在具体实施方式中，本文提供了用于治疗柄蛋白-4介导的疾病的症状的组合物，其中，该组合物包括本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC。在具体实施方式中，本文提供了用于改善柄蛋白-4介导的疾病的症状的组合物，其中，该组合物包括本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC。在某些实施方式中，该对象是有此需要的对象。在一些实施方式中，对象患有柄蛋白-4介导的疾病。在其他实施方式中，对象处于患柄蛋白-4介导的疾病的风险中。在一些实施方式中，给药导致预防、控制、治疗或改善柄蛋白-4介导的疾病的症状。在一实施方式中，柄蛋白-4抗体是抗体M22-321b41.1。
在另一实施方式中，本文提供了预防、控制、治疗和/或改善对象中柄蛋白-4介导的疾病的方法，包括给予有效量的本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC。在另一实施方式中，本文提供了预防对象中柄蛋白-4介导的疾病的方法，包括给予有效量的本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC。在另一实施方式中，本文提供了控制对象中柄蛋白-4介导的疾病的方法，包括给予有效量的本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC。在另一实施方式中，本文提供了治疗对象中柄蛋白-4介导的疾病的方法，包括给予有效量的本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC。在另一实施方式中，本文提供了改善对象中柄蛋白-4介导的疾病的方法，包括给予有效量的本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC。在某些实施方式中，该对象是有此需要的对象。在一些实施方式中，对象患有柄蛋白-4介导的疾病。在其他实施方式中，对象处于患柄蛋白-4介导的疾病的风险中。在一些实施方式中，给药导致预防、控制、治疗或改善柄蛋白-4介导的疾病。在一实施方式中，抗-柄蛋白-4 ADC是ADC，其中抗-柄蛋白-4抗体是抗体M22-321b41.1。
在另一实施方式中，本文提供了预防、控制、治疗和/或改善对象中柄蛋白-4介导的疾病的症状的方法，包括给予有效量的本文所提供的抗-柄蛋白-4ADC。在另一实施方式中，本文提供了预防对象中柄蛋白-4介导的疾病的症状的方法，包括给予有效量的本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC。在另一实施方式中，本文提供了控制对象中柄蛋白-4介导的疾病的症状的方法，包括给予有效量的本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC。在另一实施方式中，本文提供了治疗对象中柄蛋白-4介导的疾病的症状的方法，包括给予有效量的本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC。在另一实施方式中，本文提供了改善对象中柄蛋白-4介导的疾病的方法，包括给予有效量的本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC。在某些实施方式中，该对象是有此需要的对象。在一些实施方式中，对象患有柄蛋白-4介导的疾病。在其他实施方式中，对象处于患柄蛋白-4介导的疾病的风险中。在一些实施方式中，给药导致预防、控制、治疗或改善柄蛋白-4介导的疾病的症状。在一实施方式中，抗-柄蛋白-4 ADC是ADC，其中抗-柄蛋白-4抗体是抗体M22-321b41.1。
本文所提供的抗体还可以在体外和体内诊断性和治疗性方法中用于例如，纯化、检测和靶向柄蛋白-4抗原。例如，经修饰的抗体已经用于免疫试验中，用于定性和定量测量生物样品中的柄蛋白-4的水平。参见例如，Harlow等，《抗体：实验室手册》(Antibodies:ALaboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第2版，1988)(通过引用其全部内容纳入本文)。
本文还提供了预防、控制、治疗和/或改善柄蛋白-4介导的疾病的方法，通过向对象给予有效量的抗-柄蛋白-4 ADC或含有本文所提供的抗-柄蛋白-4ADC的药物组合物。在一方面中，抗-柄蛋白-4 ADC是基本纯化的(即，基本上不含有限制其作用或产生不希望有的副作用的物质)。在某些实施方式中，抗-柄蛋白-4 ADC中的抗体是完全人单克隆抗体，如完全人单克隆抗体。给予疗法的对象可以是哺乳动物，如非灵长类动物(例如，牛，猪，马，猫，狗，大鼠等)或灵长类动物(例如，猕猴或人)。在一个实施方式中，对象是人。在另一实施方式中，对象是患有柄蛋白-4介导的疾病的人。
已知并且可以用于递送预防性或治疗性试剂(例如，本文所提供的抗-柄蛋白-4ADC)的各种递送系统包括但不限于，包封于脂质体，微颗粒，微胶囊，重组细胞，其能够表达抗-柄蛋白-4 ADC，受体介导的内吞作用(参见例如，Wu和Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)，构建核酸作为逆转录病毒或其他载体的部分等。给予预防性或治疗性试剂(例如，本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC)或药物组合物的方法包括但不限于，肠胃外给药(例如，皮内，肌肉内，腹膜内，静脉内和皮下)，硬膜外和粘膜(例如，鼻内和口服途径)。在具体实施方式中，鼻内，肌肉内，静脉内或皮下给予预防性或治疗性试剂(例如，本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC)或药物组合物。预防性或治疗性试剂或组合物可以通过任何常规途径给予，例如，通过输注或大剂量注射，通过上皮或粘膜皮肤内衬(例如，口腔粘膜，鼻内粘膜，直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起给药。给药可以是全身给药或局部给药。此外，可以采用肺部给药，例如，通过使用吸入器或喷雾器，并与雾化剂一起配制。参见例如，美国专利号6,019,968，5,985,320，5,985,309，5,934,272，5,874,064，5,855,913，5,290,540和4,880,078；和PCT公开号WO 92/19244，WO 97/32572，WO 97/44013，WO 98/31346和WO 99/66903，其各自通过引用其全部内容纳入本文。
在具体实施方式中，可能需要将本文所提供的预防性或治疗性试剂或药物组合物局部给予需要治疗的区域。这可以下述方式实现，例如但不限于，局部输注，通过局部给药(例如，通过鼻内喷雾)，通过注射，或通过植入物的方式，所述植入物是多孔的，无孔的或凝胶状材料，包括膜，如硅橡胶膜或纤维。在一些实施方式中，当给予本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC时，必需注意要使用抗-柄蛋白-4 ADC将其不会吸收的材料。
在另一实施方式中，本文所提供的预防性或治疗性试剂或组合物可以通过囊泡，特别是脂质体(参见Langer,1990,Science 249:1527-1533；Treat等,述于《感染性疾病和癌症治疗中的脂质体》(Liposomes in the Therapy of Infectious Disease andCancer),Lopez-Berestein和Fidler(编著),Liss,纽约,第353-365页(1989)；Lopez-Berestein,同上,第317-327页；参见同上)递送。
在另一实施方式中，本文是所提供的预防性或治疗性试剂或组合物可以通过控释或缓释系统递送。在一实施方式中，可以使用泵以实现控释或缓释(参见例如，Langer,引用如上；Sefton,1987,Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201-40；Buchwald等,1980,Surgery 88:507-16；和Saudek等,1989,N.Engl.J.Med.321:574-74)。在另一实施方式中，聚合材料可以用于实现控释或缓释预防性或治疗性试剂(例如，本文所述的抗-柄蛋白-4 ADC)或本文所提供的组合物(参见例如《控释的医疗应用》(Medical Applications of ControlledRelease),Langer和Wise(编著),CRC出版社,Boca Raton,Florida(1974)；《控释药物生物利用度：药物产品设计和性能》(Controlled Drug Bioavailability,Drug ProductDesign and Performance),Smolen和Ball(编著),Wiley,New York(1984)；Ranger和Peppas),1983,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；同样参见Levy等,1985,Science 228:190；During等,1989,Ann.Neurol.25:351；Howard等,1989,J.Neurosurg.71:105；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；，美国专利号5912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/15154和PCT公开号WO 99/20253)。用于缓释制剂的聚合物的示例包括但不限于，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸)，聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)，聚(甲基丙烯酸)，聚乙交酯(PLG)，聚酐，聚(N-乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙烯醇)，聚丙烯酰胺，聚(乙二醇)，聚交酯(PLA)，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一实施方式中，用于缓释制剂中的聚合物是惰性的，无可浸出杂质的，储存稳定的，无菌的并且是可生物降解的。在另一实施方式中，控释或缓释系统可以放置在治疗靶标，例如，鼻道或肺附近，因此仅需要该全身剂量的部分(参见例如，Goodson,述于《控释的医疗应用》(Medical Applications of Controlled Release),引用如上,第2卷,115-138(1984))。控释系统述于Langer(1990,Science 249:1527-1533)的综述。本领域普通技术人员已知的任何技术可以用于产生含有一种或多种本文所提供的抗体的缓释制剂。参见例如，美国专利号4,526,938，PCT公开号WO 91/05548，PCT公开号WO 96/20698，Ning等.,1996,“使用缓释凝胶的人结肠癌异种移植物的肿瘤内放射免疫疗法(Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using aSustained-Release Gel),”Radiotherapy&Oncology 39:179-189，Song等.,1995,“抗体介导的肺靶向长循环乳状液(Antibody Mediated Lung Targeting of Long-CirculatingEmulsions),”PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology 50:372-397，Cleek等,1997,“用于心血管应用的bFGF抗体的可生物降解聚合物载体(BiodegradablePolymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application),”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854，和Lam等,1997,“(微囊化重组人源化单克隆抗体用于局部递送)Microencapsulation of Recombinant HumanizedMonoclonal Antibody for Local Delivery,”Proc.Int’l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24:759-760，其各自通过引用其全部内容纳入本文。
在具体实施方式中，其中本文所提供的抗体是编码预防性或治疗性试剂(例如，本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC)的核酸，该核酸可以体内给予以促进其编码的预防性或治疗性试剂的表达，这通过将其作为适当核酸表达载体的部分构建并将其给予以使其成为细胞内的，例如，通过使用逆转录病毒载体(参见例如美国专利号4,980,286)，或者通过直接注射，或者通过使用维颗粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，杜邦公司(Dupont))，或用脂质或细胞表面受体或转染剂涂覆，或与已知入核的同源框样肽(homeobox-like peptide)结合使用(参见例如，Joliot等,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868)等。。或者，核酸可以细胞内导入并纳入宿主细胞DNA用于通过同源性重组表达。
在具体实施方式中，本文所提供的组合物包含本文所述的1、2或更多种抗体。在另一实施方式中，本文所提供的组合物包含本文所提供的1、2或更多种抗体以及除了本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC以外其他的预防性或治疗性试剂。在一实施方式中，已知试剂能够用于或者已经用于或者正在用于预防、控制、治疗和/或改善柄蛋白-4介导的疾病。除了预防性或治疗性试剂，本文所提供的组合物还可包含运载体。
本文所提供的组合物包括批量药物组合物，其能够用于制造可以用于制备单位剂型的药物组合物(例如，适用于给予对象或患者的组合物)。在一实施方式中，本文所提供的组合物是药物组合物。这类组合物包含预防或治疗有效量的一种或多种预防性或治疗性试剂(例如，本文所提供的抗体或其他预防性或治疗性试剂)和药学上可接受的运载体。药物组合物可以配制成适合对象的给药途径。
在具体实施方式中，术语“运载体”指治疗与其一起给予的稀释剂，佐剂(例如，弗氏佐剂(完全或不完全))，赋形剂或载剂。这类药物运载体可以是无菌液体，如水和油，包括来自石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。局部给予该药物组合物时，水是示例性的运载体。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体运载体，特别适用于注射液。合适的药物赋形剂包括，淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物也可含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、稳定释放制剂等的形式。口服制剂可含有标准运载体，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物运载体的示例述于《雷明顿药物科学》(1990)麦克出版公司,宾夕法尼亚州伊斯顿。这类组合物将包含预防或治疗有效量的抗-柄蛋白-4ADC，诸如以纯化的形式，以及合适量的运载体，从而提供用于向患者适当给药的形式。制剂应当适合给药的模式。
在一实施方式中，根据常规程序将组合物配制成适于向人类静脉内给药的药物组合物。静脉内给予的组合物通常是溶于无菌等渗水性缓冲液的溶液。当需要时，组合物可以包括增溶剂和局部麻醉剂诸如利多卡因(lignocamne)，以减轻注射部位的疼痛。然而，这类组合物可以通过除了静脉内给药以外其他的途径给予。
通常，本文所提供的组合物的成分可以单独提供或者也可以以单位剂型混合在一起，例如，密封容器如安瓿或药囊中干燥的冻干粉末或无水浓缩物，指明活性剂的量。通过输液给予该组合物时，可用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶分配该组合物。通过注射给予该组合物时，可提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便在给药前与药物成分混合。
本文所提供的抗体或抗-柄蛋白-4 ADC可以包装于密封容器如安瓿或药囊中，指明抗体或抗-柄蛋白-4 ADC的量。在一实施方式中，抗体或抗-柄蛋白-4 ADC以密封的容器内的干燥的冻干粉末或无水浓缩物提供并可以经重建，例如，用水或盐水，至对于给予对象合适的浓度。在某些实施方式中，抗体或抗-柄蛋白-4 ADC以密封容器内下述单位剂型的干燥的冻干的粉末或无水浓缩物提供：至少0.1mg、至少0.5mg、至少1mg、至少2mg或至少3mg，如至少5mg、至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少30mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至少60mg、至少75mg、至少80mg、至少85mg、至少90mg、至少95mg或至少100mg。冻干的抗-柄蛋白-4 ADC可以2-8℃储存于其原始容器内，而抗-柄蛋白-4 ADC可以在重建后12小时内给予，诸如6小时内，5小时内、3小时内或1小时内。在另一实施方式中，抗体或抗-柄蛋白-4 ADC以密封容器中的液体形式提供，指明抗体或抗-柄蛋白-4 ADC的浓度和量。在某些实施方式中，抗体或抗-柄蛋白-4 ADC的液体形式在密封容器这样提供：至少0.1mg/ml、至少0.5mg/ml或至少1mg/ml，并且如至少5mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少25mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少60mg/ml、至少70mg/ml、至少80mg/ml、至少90mg/ml或至少100mg/ml。
本文所提供的组合物可以配置成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的那些，诸如衍生自盐酸，磷酸，乙酸，草酸，酒石酸等的那些，以及与阳离子形成的那些，诸如衍生自钠，钾，铵，钙，氢氧化铁，异丙胺，三乙胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等的那些。
将在预防、控制、治疗和/或改善柄蛋白-4介导的疾病中有效的本文所提供的预防性或治疗性试剂(例如，本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC)或组合物的量可以通过标准临床技术确定。
相应地，可以将导致下述血清效价的抗-柄蛋白-4 ADC或组合物的剂量给予人用于预防、控制、治疗和/或改善柄蛋白-4介导的疾病：至少0.1μg/ml、至少0.2μg/ml、至少0.4μg/ml、至少0.5μg/ml、至少0.6μg/ml、至少0.8μg/ml、至少1μg/ml、至少1.5μg/ml,such asat least 2μg/ml、至少5μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20μg/ml、至少25μg/ml、至少30μg/ml、至少35μg/ml、至少40μg/ml、至少50μg/ml、至少75μg/ml、至少100μg/ml、至少125μg/ml、至少150μg/ml、至少200μg/ml、至少250μg/ml、至少300μg/ml、至少350μg/ml、至少400μg/ml或至少450μg/ml。此外，可任选地进行体外(in vitro)试验来帮助确定最优的剂量范围。制剂中将采用的精确剂量还将依赖于给药的途径，和柄蛋白-4介导的疾病的严重性，并且应根据医生的判断和每个患者的情况决定。
有效剂量可从体外或动物模型测试系统所得剂量反应曲线外推。
对于本文所提供的抗体，给予患者的剂量通常是0.1mg/kg-100mg/kg患者体重。在一些实施方式中，给予患者的剂量是为约1mg/kg-约75mg/kg患者体重。在一些实施方式中，给予患者的剂量是为约1mg/kg-约20mg/kg患者体重，如1mg/kg-约5mg/kg患者体重。通常，由于对外来抗体的免疫应答，人抗体在人体内具有比来自其他物种的抗体更长的半衰期。因此，较低剂量的人抗体和较低频率的给药常常是可行的。此外，可以通过修饰(例如脂化)增强抗体的摄取和组织穿透从而降低给予本文所提供的抗体的剂量和频率。
在一实施方式中，将大约100mg/kg或更少，大约75mg/kg或更少，大约50mg/kg或更少，大约25mg/kg或更少，大约10mg/kg或更少，大约5mg/kg或更少，大约1mg/kg或更少，大约0.5或更少，或大约0.1mg/kg或更少的抗-柄蛋白-4 ADC给予5次、4次、3次、2次或1次，以控制柄蛋白-4介导的疾病。在一些实施方式中，将文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC给予约1-12次，其中，可以根据医生所确定的需求给予剂量，例如，每周、每双周、每月、每两个月一次、每三个月一次等。在一些实施方式中，较低剂量(例如，1-15mg/kg)可以更频繁地给予(例如，3-6次)。在其他实施方式中，较高剂量(例如，25-100mg/kg)可以较不频繁地给予(例如，1-3次)。然而，对于本领域技术人员而言显而易见的是，其他给药量和时间安排是容易确定的并且在本文所提供的范围内。
在一具体实施方式中，将大约100mg/kg，大约75mg/kg或更少、大约50mg/kg或更少、大约25mg/kg或更少、大约10mg/kg或更少、大约5mg/kg或更少、大约1mg/kg或更少、大约0.5mg/kg或更少、大约0.1mg/kg或更少的抗-柄蛋白-4 ADC的缓释制剂给予对象(如人)以预防、控制、治疗和/或改善柄蛋白-4介导的疾病。在另一具体实施方式中，将不处于缓释制剂中的大约100mg/kg，大约75mg/kg或更少、大约50mg/kg或更少、大约25mg/kg或更少、大约10mg/kg或更少、大约5mg/kg或更少、大约1mg/kg或更少、大约0.5mg/kg或更少或大约0.1mg/kg或更少的柄蛋白-4 ADC的推注给予对象(如人)以预防、控制、治疗和/或改善柄蛋白-4介导的疾病，并在特定时间段后，将处于缓释中的大约100mg/kg，大约75mg/kg或更少、大约50mg/kg或更少、大约25mg/kg或更少、大约10mg/kg或更少、大约5mg/kg或更少、大约1mg/kg或更少、大约0.5mg/kg或更少或大约5mg/kg或更少的本文所提供的抗-柄蛋白-4ADC给予所述对象(例如，鼻内或肌肉内)2、3或4次(如一次)。根据该实施方式，特定时间段可以是1-5天、1周、2周或1个月。
在一些实施方式中，将本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC的单个剂量在为期一年的疗程中以双周(例如，约14天)的间隔给予患者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26次以预防、控制、治疗和/或改善柄蛋白-4介导的疾病，其中剂量选自下组：约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、约100mg/kg或其组合(即，各剂量的每月剂量可能相同也可能不同)。
在另一实施方式中，将本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC的单个剂量在为期一年的疗程中以约每个月(例如，约30天)的间隔给予患者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次以预防、控制、治疗和/或改善柄蛋白-4介导的疾病，其中剂量选自下组：约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、约100mg/kg或其组合(即，各剂量的每月剂量可能相同也可能不同)。
在一实施方式中，将本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC的单个剂量在为期一年的疗程中以约每两个月(例如，约60天)的间隔给予患者2、3、4、5或6次以预防、控制、治疗和/或改善柄蛋白-4介导的疾病，其中剂量选自下组：约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、约100mg/kg或其组合(即，每两个月的剂量各自可能相同也可能不同)。
在一些实施方式中，将本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC的单个剂量在为期一年的疗程中以约每三个月(例如，约120天)的间隔给予患者2、3或4次以预防、控制、治疗和/或改善柄蛋白-4介导的疾病，其中剂量选自下组：约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、约100mg/kg或其组合(即，各每三个月的剂量可能相同也可能不同)。
在某些实施方式中，用于向患者提供本文所述抗-柄蛋白-4 ADC的剂量的给药途径是鼻内、肌肉内、静脉内或其组合，但是也可以接受本文所述的其他途径。各剂量可以或者可以不通过相同的给药途径给予。在一些实施方式中，本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC可以经由多种给药途径与其他剂量的相同或不同的本文所述的抗-柄蛋白-4 ADC同时或依次给予。
在某些实施方式中，将本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC预防性地或治疗性地给予对象。本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC可以预防性地或治疗性地给予对象，从而预防、减轻或改善柄蛋白-4介导的疾病或其症状。
26.基因疗法
在具体实施方式中，将含有编码抗体或其功能性衍生物的序列的核酸给予对象通过基因疗法的方式用于本文所提供的方法，例如，以预防、控制、治疗和/或改善柄蛋白-4介导的疾病、紊乱或病症。这类疗法包括通过向对象给予表达的或可表达的核酸进行。在一实施方式中，核酸产生其编码的抗体，其可以经偶联以产生抗-柄蛋白-4 ADC，并且该抗体或抗-柄蛋白-4 ADC介导预防性或治疗性效果。
可以使用本领域可获得的用于重组基因表达(或基因疗法)的任何方法。示例性的方法如下所述并在实施例部分提供。
对于基因疗法的综述，参见，Goldspiel等,1993,Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu和Wu,1991,Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan,1993,Science 260:926-932；和Morgan和Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217；五月,1993,TIBTECH 11(5):155-215。可以使用的重组DNA技术领域通常所知的方法述于Ausubel等(编著),《新编分子生物学实验指南》,纽约约翰威力公司,纽约(1993)；和Kriegler,《基因转移和表达：实验室手册》(Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual),斯托克顿出版社(StocktonPress)，纽约(1990)。
在具体实施方式中，组合物包含编码本文所提供的抗-柄蛋白-4抗体的核酸，该核酸作为在合适的宿主中表达抗体或嵌合蛋白或重链或轻链或其治疗性或药物部分的表达载体的部分。具体地，这类核酸具有启动子，诸如异源性启动子，其操作性地连接抗-柄蛋白-4抗体编码区，该启动子是诱导型或组成型的，并且任选地，具有组织特异性。在另一具体实施方式中，使用核酸分子，其中抗-柄蛋白-4抗体编码序列和任何其他所需序列侧接这样的区域，所述区域促进位于基因组中所需位点的同源性重组，因此提供了抗-柄蛋白-4ADC编码核酸的染色体内表达(Koller和Smithies,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935；Zijlstra等,1989,Nature 342:435-438)。在一些实施方式中，表达的抗-柄蛋白-4抗体分子包含单链抗体；任选地，核酸序列包含编码抗-柄蛋白-4抗体中重链和轻链或其片段的序列。
将核酸递送到对象中可以是直接的，在这样的情况下，对象直接暴露于核酸或携带核酸的载体，或者可以是间接的，在这样的情况下，首先用核酸体外转化细胞，然后将其移植到对象中。这两种方法分别被称之为体内或离体基因疗法。
在具体实施方式中，直接体内给予核酸序列，其中核酸序列表达以产生编码的产物。这可以通过本领域已知的许多方法中的任一种实现，例如，通过将它们构建为适当核酸表达载体的部分并将载体给予从而使序列变成细胞内的，例如，通过使用缺陷型或减毒逆转录病毒或其他病毒载体(参见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射裸DNA，或通过使用微颗粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，杜邦公司)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂附图，包封于脂质体，微颗粒或微胶囊，或通过将其给予与已知将进入细胞核的肽连接，或通过将其给予与经历受体介导的内吞作用的配体连接(参见例如，Wu和Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)(其可以用于靶向特异性表达受体的细胞类型)等。在另一实施方式中，可以形成核酸-配体复合物，其中配体包含促融合(fusogenic)病毒肽以破坏核内体，允许核酸避免溶酶体降解。在另一实施方式中，通过靶向特定的受体，可以体内靶向核酸用于细胞特异性摄取和表达(参见例如，PCT公开号WO 92/06180；WO 92/22635；WO 92/20316；W093/14188，WO 93/20221)。或者，通过同源性重组，核酸可以细胞内导入并纳入宿主细胞DNA用于表达(Koller和Smithies,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935；和Zijlstra等,1989,Nature 342:435-438)。
在具体实施方式中，使用病毒载体，其包含编码抗-柄蛋白-4抗体的核酸序列。例如，可以使用逆转录病毒(参见，Miller等,1993,Meth.Enzymol.217:581-599)。这些逆转录载体包含对于正确包装病毒基因组并将其整合到宿主细胞DNA中而言必需的组分。待用于基因疗法的编码抗-柄蛋白-4抗体的核酸序列可以克隆到一个或多个载体中，其促进将基因递送到对象中。关于逆转录病毒载体的更多细节示于Boesen等,1994,Biotherapy 6:291-302，其描述了使用逆转录病毒递送mdr 1基因至造血干细胞，从而使得干细胞对化疗更有抗性。阐述在基因疗法中使用逆转录病毒的其他参考文献为：Clowes等,1994,J.Clin.Invest.93:644-651；Klein等,1994,Blood 83:1467-1473；Salmons和Gunzberg,1993,Human Gene Therapy 4:129-141；和Grossman和Wilson,1993,Curr.Opin.inGenetics and Devel.3:110-114。
腺病毒是可以用于重组产生抗体的另一种病毒载体。腺病毒是对于将基因传递至呼吸道上皮细胞的特别有吸引力的载体。腺病毒通常感染呼吸道上皮细胞，在其中导致轻微的疾病。基于腺病毒递送系统的其他靶标是肝脏，中枢神经系统，内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染不分裂细胞的优势。Kozarsky和Wilson,1993,遗传学和发育学当前的观点(Current Opinion in Genetics and Development)3:499-503展示了基于腺病毒的基因疗法的综述。Bout等,1994,人基因疗法(Human Gene Therapy)5:3-10证明了使用腺病毒载体转移基因至恒河猴的呼吸道上皮细胞。在基因疗法中使用腺病毒的其他示例示于Rosenfeld等,1991,Science 252:431-434；Rosenfeld等,1992,Cell 68:143-155；Mastrangeli等,1993,J.Clin.Invest.91:225-234；PCT国际公开W094/12649；和Wang等,1995,Gene Therapy 2:775-783。在以具体实施方式中，使用了腺病毒载体。
还可以利用腺相关病毒(AAV)(Walsh等,1993,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300；和美国专利号5,436,146)。在一具体实施方式中，AAV载体用于表达本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC。在某些实施方式中，AAV包含编码VH结构域的核酸。在其他实施方式中，AAV包含编码VL结构域的核酸。在某些实施方式中，AAV包含编码VH结构域和VL结构域的核酸。在本文所提供的方法的一些实施方式中，给予对象包含编码VH结构域的核酸的AAV以及包含编码VL结构域的核酸的AAV。在其他实施方式中，给予对象包含编码VH结构域和VL结构域的核酸的AAV。在某些实施方式中，VH和VL结构域过表达。
基因疗法的另一种方法涉及通过诸如电穿孔、脂质转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染的方法将基因转移到组织培养物中的细胞。通常，转移的方法包括转移可选择的标志物至细胞。然后将细胞置于选择下，以将已经占据并且正在表达转移的基因的细胞分离。然后将这些细胞递送到对象。
在该实施方式中，在体内给予所得重组细胞前，将核酸导入细胞。这样的导入可以通过本领域已知的任何方法进行，包括但不限于，转染，电穿孔，微注射，经由含有核酸序列的病毒或噬菌体载体的感染，细胞融合，染色体介导的基因转移，微细胞介导的基因转移，原生质球融合等。本领域已知用于将外来基因导入细胞的许多技术(参见例如，Loeffler和Behr,1993,Meth.Enzymol.217:599-618；Cohen等,1993,Meth.Enzymol.217:618-644；Clin.Pharma.Ther.29:69-92(1985))并可以根据本文所提供的方法使用，前提是受体细胞的必需发育和生理学功能不受破坏。该技术应提供核酸向细胞的稳定转移，以使核酸可被细胞表达，如可遗传且可被其细胞后代表达。
所得重组细胞可以通过本领域已知的各种方法给予对象。重组血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)可以静脉内给药。预期使用的细胞数量取决于所需的作用，患者状态等，并且可以由本领域技术人员确定。
出于基因治疗目的可以导入核酸的细胞包括任何所需的可用细胞类型，并且包括但不限于，上皮细胞，内皮细胞，角质形成细胞，成纤维细胞，肌肉细胞，肝细胞；淋巴样和骨髓细胞，如T淋巴细胞，B淋巴细胞，单核细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，巨核细胞，粒细胞；各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如，获自骨髓，脐带血，外周血，胎儿肝脏等。
在具体实施方式中，用于基因疗法的细胞对于对象是自体同源的。
在其中重组细胞用于基因疗法的实施方式中，将编码抗-柄蛋白-4抗体的核酸序列导入细胞，从而使其可以通过细胞或它们的祖细胞表达，并且然后体内给予重组细胞产生治疗效果。在具体实施方式中，使用干细胞或祖细胞。可以体外维持和分离的任何干细胞和/或祖细胞可以潜在地根据本文所提供的实施方式使用(参见例如，PCT公开号WO 94/08598；Stemple和Anderson,1992,Cell 7 1:973-985；Rheinwald,1980,Meth.CellBio.21A:229；和Pittelkow和Scott,1986,Mayo Clinic Proc.61:771)。
在具体实施方式中，出于基因疗法目的待导入的核酸包含诱导型启动子，其操作性地连接编码区，从而可以通过控制适当的转录诱导物的存在有无来控制核酸的表达。
27.编码抗体的多核苷酸
还提供了包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码本文所提供免疫特异性结合柄蛋白-4表位的抗体。本文还提供了这样的多核苷酸，其在高度严格，中度或较低严格杂交条件下(例如，如上所定义)杂交编码本文所提供的经修饰的抗体的多核苷酸。
可以通过本领域已知的任何方法获得多核苷酸，并确定多核苷酸的核苷酸序列。因为本文所提供的某些柄蛋白-4抗体的氨基酸序列是已知的，可以使用本领域所熟知的方法确定编码这些抗体以及这些抗体经修饰形式的核苷酸序列，即将已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子以生成编码该抗体的核酸的方式组装。编码该抗体的这类多核苷酸可以组装自化学合成的寡核苷酸(例如，如Kutmeier等,1994,BioTechniques 17:242所述)，简言之，这涉及合成包含编码抗体、片段或其变体的序列的部分的重叠寡核苷酸，退火并连接这些寡核苷酸，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
或者，编码本文所提供的抗体的多核苷酸可以由来自合适来源的核酸生成(例如，本文所提供的M22-321b41.1杂交瘤，其ATCC访问编号PTA-124245，于2017年6月13日保藏)。如果无法获得含有编码特定抗体的核酸的克隆，但该抗体分子的序列已知，则可通过以下方法由合适来源(例如，抗体cDNA文库，或由表达该抗体的任何组织或细胞如选择表达本文所提供抗体的杂交瘤细胞产生的cDNA文库，或从中分离的核酸，诸如多聚A+RNA)获得编码该免疫球蛋白的核酸：使用可与序列3'和5'端杂交的合成引物进行PCR扩增，或使用对特定基因序列具有特异性的寡核苷酸探针进行克隆以鉴定，例如，cDNA文库中编码抗体的cDNA克隆。然后，可利用本领域熟知的任何方法将PCR产生的扩增核酸克隆到可复制克隆载体中。
在某些实施方式中，本文所提供的核酸分子包含或由下述组成：SEQ ID NO:38(编码VH)和/或SEQ ID NO:37(编码VL)中任一项所述的核酸序列或其组合(例如，编码本文所述抗体的核苷酸序列，诸如全长抗体，抗体的重链和/或轻链，或本文所提供的单链抗体)。
在某些方面中，本文所提供的是多核苷酸，其包含编码免疫特异性结合柄蛋白-4抗原的本文所述抗体的核苷酸序列或其片段(例如，可变轻链区和/或可变重链区)，以及载体，例如，包含这类多核苷酸的载体，用于在宿主细胞中重组表达(例如，大肠杆菌和哺乳动物细胞)。在某些方面中，本文提供了细胞(例如，宿主细胞)。本文还提供了制造本文所述抗体和抗原结合片段的方法。
在某些方面中，本文提供了多核苷酸，其包含编码本文所述抗体的轻链或重链的核苷酸序列。在某些实施方式中，本文提供了多核苷酸，其包含编码本文所述抗体的轻链或重链的核苷酸序列。多核苷酸可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码含有本文所述抗体的CDR和VL FR的轻链(参见例如，分别见于表1-2)。多核苷酸可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码含有本文所述抗体的CDR和VH FR的重链(参见例如，分别见于表1-2)。在具体实施方式中，本文所述多核苷酸编码含氨基酸序列SEQ ID NO:37的VL链区域。在具体实施方式中，本文所述多核苷酸编码含氨基酸序列SEQ ID NO:38的VH链区域。
在特定实施方式中，本文提供了包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码包含3个VL链CDR的抗-柄蛋白-4抗体，例如，包含抗体M22-321b41.1的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(例如参见，表1)。在具体实施方式中，本文提供了包含3个VH链CDR的多核苷酸，例如，包含抗体M22-321b41.1的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(例如参见，表1)。
在特定实施方式中，本文提供了包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码包含VL链区域的抗-柄蛋白-4抗体，例如，包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，包含本文所述的氨基酸序列(例如参见，表1-2)。在具体实施方式中，本文提供了包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码包含VH链区域的抗-柄蛋白-4抗体，例如，包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，包含本文所述的氨基酸序列(例如参见，表1-2)。
在某些实施方式中，本文所述的多核苷酸包含编码本文所提供的抗体的核苷酸序列，所述抗体包含可变轻(VL)链区域，所述VL链区域含有本文所述氨基酸(例如参见，表1)，其中抗体免疫特异性地结合柄蛋白-4多肽。
在某些实施方式中，本文所述的多核苷酸包含编码本文所提供的抗体的核苷酸序列，所述抗体包含可变重(VH)链区域，所述VH链区域含有本文所述氨基酸序列(例如参见，表1)，其中抗体免疫特异性地结合柄蛋白-4多肽。
在某些方面中，多核苷酸包含编码本文所述抗体的核苷酸序列，所述抗体包含VL链区域，所述VL链区域包含具有本文所述氨基酸序列的一个或多个VL FR(例如参见，表2)，其中抗体免疫特异性地结合柄蛋白-4多肽。在某些方面中，多核苷酸包含编码本文所述抗体的核苷酸序列，所述抗体包含VH链区域，所述VH链区域包含具有本文所述氨基酸序列的一个或多个VH FR(例如参见，表2)，其中抗体免疫特异性地结合柄蛋白-4多肽，例如人柄蛋白-4多肽。
在具体实施方式中，本文所提供的多核苷酸包含编码本文所述抗体的核苷酸序列，其包含：是人框架区的框架区(例如，VL结构域和VH结构域的框架区)，其中抗体免疫特异性地结合柄蛋白-4多肽。
在某些实施方式中，本文所提供的多肽包含表3中所述的核苷酸序列，分别编码本文所述抗体M22-321b41.1的VH或VL，其免疫特异性地结合柄蛋白-4多肽。重组产生抗体
重组表达免疫特异性地结合柄蛋白-4抗原的本文所提供的抗体(例如，本文所提供的全长抗体，抗体的重链和/或轻链，或单链抗体)需要构建含有编码该抗体的多核苷酸的表达载体。一旦已经获得编码本文所提供的抗体分子、抗体重链或轻链或其片段(诸如但非必需包含重链和/或轻链可变结构域)的多核苷酸，可以通过重组DNA技术使用本领域所熟知的技术生产用于产生抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含抗体编码核苷序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可利用本领域技术人员熟知的方法构建含有抗体编码序列和合适转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。还提供了可复制载体，其包含操作性连接启动子的编码本文所提供的抗体分子，抗体的重链或轻链，抗体的重链或轻链可变结构域或其片段或重链或轻链CDR的核苷酸序列。这种载体可包含编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见例如，国际公开号WO 86/05807和WO 89/01036；和美国专利号5,122,464)，并且抗体的可变结构域可以克隆到这种载体用于表达完整的重链，完整的轻链，或完整的重链和轻链。
通过常规技术将该表达载体转移到宿主细胞中，然后通过常规技术培养该转染细胞以产生本文所提供的抗体。因此，本文还提供了包含多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸编码操作性连接异源启动子的本文所提供的抗体或其片段，或其重链或轻链，或其片段，或本文所提供的单链抗体。在用于表达双链抗体的某些实施方式中，编码重链和轻链的载体可以在宿主细胞中共表达，用于表达完整的免疫球蛋白分子，如下所详述。
可利用各种宿主-表达载体系统来表达本文所提供的抗体分子(参见例如，美国专利号5,807,715)。这类宿主-表达系统代表可产生并随后纯化感兴趣编码序列的载剂，但也代表用合适的核苷酸编码序列转化或转染时，可原位表达本文所提供的抗体分子的细胞。它们包括但不限于微生物，例如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(如毕赤酵母(Saccharomyces Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒，CaMV，烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者哺乳动物细胞系统(如COS、CHO、BLK、293、NS0和3T3细胞)，其携带含有衍生自哺乳动物细胞基因组启动子(如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒启动子(如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建物。细菌细胞诸如大肠杆菌(Escherichia coli)或真核细胞，特别是对于表达完全重组抗体分子，可以用于表达重组抗体分子。例如，与载体诸如来自人巨细胞病毒的主要中间体早期基因启动子元件相联的哺乳动物细胞诸如中华仓鼠卵巢细胞(CHO)是抗体的高效表达系统(Foecking等,1986,Gene 45:101；和Cockett等,1990,Bio/Technology 8:2)。在一些实施方式中，所述所提供的抗体在CHO细胞中产生。在具体实施方式中，核苷酸序列的表达通过组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调节，所述核苷酸序列编码免疫特异性结合柄蛋白-4抗原的本文所提供的抗体。
在细菌系统中，可根据所表达抗体分子的指定应用对许多表达载体进行有利地选择。例如，在生产大量这类抗体之时，对于生成抗体分子的药物组合物而言，可能希望的是指导高水平表达容易纯化的融合蛋白产物的载体。这类载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等,1983,EMBO 12:1791)，其中抗体编码序列可单独连接到载体内，与lacZ编码区位于同一读框内，以产生融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye,1985,NucleicAcids Res.13:3101-3109；Van Heeke和Schuster,1989,J.Biol.Chem.24:5503-5509)；等。也可采用pGEX载体表达外来多肽作为有谷胱甘肽-5-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这类融合蛋白是可溶的，并可通过吸附和结合于基质谷胱甘肽琼脂糖珠然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而容易地从裂解细胞中纯化。pGEX载体设计成包含凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，从而能从GST部分释放克隆的靶基因产物。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多面体病病毒(AcNPV)用作表达外来基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。抗体编码序列可以单独克隆到病毒的非必需区域(例如，多角体蛋白基因)并置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒被用作表达载体的情况中，感兴趣的抗体编码序列可以连接腺病毒转录/翻译控制复合物，例如，晚期启动子和三部分前导序列。然后可以通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区域(例如，区域E1或E3)将产生这样的重组病毒，其在经感染的宿主中具有活力并且能够表达抗体分子(例如，参见Logan和Shenk,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:355-359)。高效翻译插入的抗体编码序列还可能需要特异性启动信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框处于同一相位以保证整个插入的翻译。这些外源性翻译控制信号和起始密码子可以是各种来源的，为天然或合成的。表达效率可以通过包括合适转录增强子元件、转录终止子等来增强。(参见例如，Bittner等,1987,Methods in Enzymol.153:51-544)。
此外，可选择以所需的特定方式调节插入序列表达、或修饰和加工该基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同宿主细胞对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特定的机制。可选择合适的细胞系或宿主系统，以保证对所表达的外来蛋白进行正确的修饰和加工。为此，可采用具有适当加工初始转录物、对基因产物进行糖基化和磷酸化的细胞机构的真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞可以包括但不限于，CHO，VERY，BHK，Hela，COS，MDCK，293，3T3，W138，BT483，Hs578T，HTB2，BT2O和T47D，NS0(并不内源性地产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)，CRL7O3O和HsS78Bst细胞。在一些实施方式中，本文所提供的完全人、单克隆抗-柄蛋白-4抗体在哺乳动物细胞诸如CHO细胞中产生。
为了长期、高产率地生产重组蛋白，可以利用稳定的表达。例如，可以对稳定表达抗体分子的细胞系进行工程改造。用合适表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择标记来转化宿主细胞，而不是使用含有病毒复制起点的表达载体。导入外来DNA后，可以允许工程改造的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后换到选择性培养基中。重组质粒中的选择标记提供对选择的抗性，使得细胞能够将该质粒稳定整合入染色体，生长形成细胞灶，进而可克隆并扩增成细胞系。该方法可以有利地用于工程改造表达抗体分子的细胞系。这类工程改造的细胞系在筛选和评估与抗体分子直接或间接相互作用的组合物中特别有用。
可采用许多选择系统，包括但不限于，可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等,1977,Cell 11:223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska和Szybalski,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等,1980,Cell 22:8-17)基因。另外，抗代谢物抗性可用作选择以下基因的基础：dhfr，产生甲氨蝶呤抗性(Wigler等,1980,Natl.Acad.Sci.USA 77:357；O’Hare等,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；gpt，产生霉酚酸抗性(Mulligan和Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072)；neo，产生氨基糖苷G-418抗性(Wu和Wu,1991,Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan,1993,Science 260:926-932；和Morgan和Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217；1993年5月,TIB TECH 11(5):l55-2 15)和hygro，产生潮霉素抗(Santerre等,1984,Gene 30:147)。可以常规地使用重组DNA技术领域通常已知的方法以选择所需的重组克隆，并且这类方法述于例如，Ausubel等(编著),《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology),约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons),纽约州(1993)；Kriegler,《基因转移和表达实验室手册》(Gene Transfer and Expression,ALaboratory Manual),斯托克顿出版社(Stockton Press),纽约州(1990)；以及Dracopoli等(编著),《新编人类遗传学实验指南》(Current Protocols in Human Genetics),约翰韦利父子公司,纽约州(1994)的第12和13章；Colberre-Garapin等,1981,J.Mol.Biol.150:1，通过引用将其全文纳入本文。
可通过载体扩增提高抗体分子的表达水平(综述参见Bebbington和Hentschel，在DNA克隆中使用基于基因扩增的载体在哺乳动物细胞中表达克隆的基因(The Use ofVectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes inMammalian Cells in DNA Cloning),第3卷(学术出版社(Academic Press),纽约，1987)。当表达抗体的载体系统中的标记可扩增时，提高宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平会增加标记基因的拷贝数。由于扩增区域与抗体基因相连，所以也会提高抗体的产量(Crouse等,1983,Mol.Cell.Biol.3:257)。
还可以用本文所提供的两种表达载体共转染宿主细胞，第一载体编码重链衍生的多肽而第二载体编码轻链衍生的多肽。两种载体可以包含相同的可选择标志物，其能够均等表达重链和轻链多肽。或者，可以使用单一载体，其编码并且能够表达重链和轻链多肽。在这类情况下，轻链应当置于重链前，以避免过量的无毒性重链(Proudfoot,1986,Nature322:52；和Kohler,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2197-2199)。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。
一旦本文所提供的抗体分子通过重组表达产生，可以通过本领域已知的任何免疫球蛋白分子纯化方法对其进行纯化，例如，通过色谱(如离子交换色谱，亲和性色谱，特别是在蛋白A之后对特定抗原的亲和性色谱，以及大小筛分柱色谱)、离心、差异溶解度或任何其它蛋白质纯化标准技术。此外，本文所提供的抗体可以融合于本文所述的异源性多肽序列或本领域已知促进纯化的其他。
28.诊断试验和检测方法
在一方面中，本公开的抗-柄蛋白-4抗体和其片段能够用于在生物样品中的检测柄蛋白-4存在。这类抗-柄蛋白-4抗体可以包括结合人柄蛋白-4但是不诱导柄蛋白-4信号转导活性的那些。本文所用术语“检测”或“检验”涵盖定量或定性检测，并指使用试验的读出或结果以做出与下述内容相关的测定，样品中柄蛋白存在与否，样品中柄蛋白-4的相对表达水平(例如，相对于一个或多个参照表达，相对于其他样品，或者相对于一个或多个表达尺度)，或者样品中柄蛋白-4的浓度。来自试验的检测读出可以是数值数据，例如，qPCR的结果，免疫试验的结果或者测量的蛋白质浓度；检测读出可以是非数值数据，例如，显微图像中使用抗-柄蛋白-4抗体的细胞或组织染色或者成像流式细胞术中的柄蛋白-4染色；或者检测读出可以是本领域技术人员所熟知可以用作柄蛋白-4表达的代理的任何试验数据，例如，荧光强度，发光强度，比色读数和吸收/发射光谱。试验中的检测读出在本文中称之为试验的信号。
本文所提供的生物样品是具有生物来源的样品或材料。生物样品包括体液，细胞或组织样品。在一些实施方式中，细胞可以是培养的细胞系，工程改造的细胞，获自对象，例如，人对象的细胞的体外或离体培养物，或获自对象的细胞。在其他实施方式中，组织样品可以包括获自对象，包括人对象的体液或组织。在一些实施方式中，组织样品包括来自疑似患病对象的区域的样品。因此组织样品可以是但不限于，分离自生物体诸如哺乳动物，特别是的人的组织，体液，组织部分和/或细胞。在具体实施方式中，将组织样品制备成切片，其已经福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)。细胞、体液和/或组织可以通过本领域技术人员所熟知的方法，例如，活检(包括液体活检)、手术方法、细胞涂片(smear)和静脉切开术获自对象，例如，人对象。
在一方面中，本公开提供了检测生物样品中柄蛋白-4存在的方法。在某些实施方式中，该方法包括将生物样品与抗-柄蛋白-4抗体在允许抗-柄蛋白-4抗体与柄蛋白-4结合的条件下接触，并检测抗-柄蛋白-4抗体和柄蛋白-4之间的结合。
如本领域技术人员所熟知，与生物样品中抗原结合的抗体的量与生物样品中抗原的量相关联。因此，本文所提供的抗-柄蛋白-4抗体与生物样品中柄蛋白-4的结合可以用于测量生物样品中柄蛋白-4的表达水平或量。在一些实施方式中，生物样品中柄蛋白-4的量在抗-柄蛋白-4抗体的线性检测范围中检测。“线性检测范围”指抗原的量或浓度范围，其中结合的抗体与生物样品中抗原的量或浓度线性关联。这类线性范围取决于这样的因素，诸如抗体和抗原之间的亲和力，用于抗体-抗原结合的抗体浓度，以及用于抗体-抗原结合的条件。
用于抗体-抗原结合的抗体浓度可以在滴定实验中评估。在这类滴定实验的一个实施方式中，以两倍、三倍、五倍或十倍连续稀释抗体的浓度，并将连续稀释的抗体各自与具有已知量对应抗原的对照样品结合。在一实施方式中，所需抗体浓度是抗体结合量区分最宽线性检测范围的浓度。
生物样品中柄蛋白-4的表达指给定时间时生物样品中柄蛋白-4的量。测量的柄蛋白-4的表达反映一段时间内生物样品中柄蛋白-4的累积并且可以包括降解或修饰产物，诸如全长柄蛋白-4，柄蛋白-4的片段，和天然修饰的(例如，糖基化的)柄蛋白-4。因为蛋白质翻译自mRNA，生物样品中mRNA的水平可以用作生物样品中柄蛋白-4表达的代理。
本文提供了用于评估来自疑似患有癌症的患者的组织样品中柄蛋白-4表达的方法，其包括：(a)将所述组织样品与如本文所提供的抗体或其抗原结合片段接触；(b)检测所述抗体或其抗原结合片段与所述组织样品的结合；(c)确定组织样品中柄蛋白-4的表达，其中，组织样品中柄蛋白-4的表达水平与柄蛋白-4的参照表达水平比较。
本文还提供了用于评估来自疑似患有癌症的患者的组织样品中柄蛋白-4表达的方法，其包括：(a)用如本文所提供的抗体或其抗原结合片段对组织样品进行IHC试验；(b)确定组织样品中柄蛋白-4的表达，其中，组织样品中柄蛋白-4的表达水平与柄蛋白-4的参照表达水平比较。
本文还提供了评估癌症患者对抗癌治疗剂的响应性的方法，所述方法基于来自所述患者的组织样品中的柄蛋白-4表达，其包括：(a)将所述组织样品与如本文所提供的抗体或其抗原结合片段接触；(b)检测所述抗体或其抗原结合片段与所述组织样品的结合；(c)确定组织样品中柄蛋白-4的表达，其中，组织样品中柄蛋白-4的表达水平与柄蛋白-4的参照表达水平比较；其中，相较于参照增加的柄蛋白-4表达水平是对所述抗癌治疗响应性的指示。
本文还提供了用于评估癌症患者对抗癌治疗剂的响应性的方法，所述方法基于来自所述对象的组织样品中的柄蛋白-4表达，其包括：(a)用如本文所提供的抗体或其抗原结合片段对组织样品进行IHC试验；(b)确定组织样品中柄蛋白-4的表达，其中，组织样品中柄蛋白-4的表达水平与柄蛋白-4的参照表达水平比较，其中，组织样品中相较于参照增加的柄蛋白-4表达水平是对所述抗癌治疗响应性的指示。
本文提供了治疗对象中癌症的方法，其包括(a)使用本文所提供的抗体或其抗原结合片段确定来自对象的组织样品中柄蛋白-4的表达水平，其中组织样品中的柄蛋白-4表达水平高于柄蛋白-4的参照表达水平；(b)向对象给予抗癌治疗剂。
本文提供了治疗对象中癌症的方法，其包括(a)将来自对象的组织样品与本文所提供的抗体或其抗原结合片段接触；(b)使用本文所提供的抗体或其抗原结合片段确定来自对象的组织样品中柄蛋白-4的表达水平，其中组织样品中的柄蛋白-4表达水平高于柄蛋白-4的参照表达水平；(c)向对象给予抗癌治疗剂。
本文提供了治疗对象中癌症的方法，其包括(a)由对象获得组织样品；(b)将来自对象的组织样品与本文所提供的抗体或其抗原结合片段接触；(c)使用本文所提供的抗体或其抗原结合片段确定来自对象的组织样品中柄蛋白-4的表达水平，其中组织样品中的柄蛋白-4表达水平高于柄蛋白-4的参照表达水平；(d)向对象给予抗癌治疗剂。
本文所提供的任何方法中的对象可以是人对象并且可以患有任何癌症，其中可以进行柄蛋白-4表达的确定和/或其中柄蛋白-4表达可以提供诊断、预后或预测价值。示例性的癌症包括急性淋巴细胞白血病；急性淋巴母细胞淋巴瘤；急性淋巴细胞白血病；急性骨髓性白血病；急性髓细胞性白血病(成人/儿童)；肾上腺皮质癌；艾滋病相关的癌症；艾滋病相关淋巴瘤；肛门癌；阑尾癌；星形细胞瘤；非典型的类畸形/类瘤状肿瘤；基底细胞癌；胆管癌，肝外(胆管癌)；膀胱癌；骨骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；脑癌(成人/儿童)；脑肿瘤，小脑星形细胞瘤(成人/儿童)；脑肿瘤，脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤脑肿瘤；脑肿瘤，室管膜瘤；脑肿瘤，髓母细胞瘤；脑肿瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤；脑肿瘤，视觉通路和下丘脑神经胶质瘤；脑干神经胶质瘤；乳腺癌；支气管腺瘤/类癌；支气管肿瘤；伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)；儿童癌症(cancer of childhood)；良性癌胃肠道肿瘤；类癌瘤；成人癌,原发灶未知；未知原发性癌(carcinoma of unknown primary)；中枢神经系统胚胎肿瘤；中枢神经系统淋巴瘤，原发性；宫颈癌；儿童肾上腺皮质癌；儿童癌症；儿童脑星形细胞瘤；儿童脊索瘤；慢性淋巴细胞性白血病；慢性粒细胞性白血病；慢性粒细胞白血病；慢性骨髓增生性疾病；结肠癌；结直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；增生性小圆形细胞瘤；气肿；子宫内膜癌；成室管膜细胞瘤(ependymoblastoma)；室管膜瘤；食道癌；尤因肿瘤家族中的尤因氏肉瘤(ewing's sarcoma)；颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；胆囊癌；胃部(胃)癌；胃类癌；胃肠道类癌肿瘤；胃肠道间质瘤；生殖细胞肿瘤；颅外，性腺外或卵巢妊娠滋养细胞肿瘤；妊娠滋养细胞肿瘤，原发灶未知；胶质瘤；脑干胶质瘤；神经胶质瘤，儿童视觉通路和下丘脑；毛细胞白血病；头颈癌；心脏病；肝细胞(肝)癌；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；下丘脑和视觉通路神经胶质瘤；眼内黑色素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波济肉瘤；肾癌(肾细胞癌)；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌；唇和口腔癌；脂肪肉瘤；肝癌(原发性)；肺癌；淋巴瘤，原发性中枢神经系统；大球蛋白血症，
Figure BDA0002378599980001571
男性乳腺癌；骨/骨肉瘤的恶性纤维组织细胞瘤；成神经管细胞瘤；髓上皮瘤；黑素瘤；黑素瘤，眼内(眼)；默克尔细胞癌；默克尔细胞皮肤癌；间皮瘤；间皮瘤，成人恶性；原发性隐匿性转移性鳞癌；口腔癌；多发性内分泌肿瘤；多发性骨髓瘤/浆细胞瘤；蕈样肉芽肿，骨髓增生异常综合症；骨髓增生异常综合征/骨髓增生性疾病；骨髓性白血病，慢性；髓样白血病，成人急性；髓细胞性白血病，儿童急性；骨髓瘤，多发(骨髓癌)；骨髓增生性疾病，慢性；鼻腔和鼻旁窦癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤，非小细胞肺癌；非霍奇金淋巴瘤；少突胶质细胞瘤；口腔癌(oralcancer)；口腔癌(oral cavity cancer)；口咽癌；骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌(表面上皮间质瘤)；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜能肿瘤；胰腺癌；胰腺癌，胰岛细胞；乳头状瘤病；鼻旁窦和鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；咽癌；嗜铬细胞瘤；松果体星形细胞瘤；松果体生殖瘤；中间分化的松果体实质性肿瘤；松果体皮母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤(supratentorial primitive neuroectodermal tumor)；垂体肿瘤；垂体腺瘤；浆细胞瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；前列腺癌；直肠癌；肾细胞癌(肾脏癌)；肾盂和输尿管，移行细胞癌；涉及15号染色体NUT基因的呼吸道癌；视网膜母细胞；瘤横纹肌肉瘤，儿童；唾液腺癌；肉瘤，尤因家族的肿瘤；塞萨里综合症(Sézary syndrome)；皮肤癌(黑素瘤)；皮肤癌(非黑素瘤)；小细胞肺癌；小肠癌软组织肉瘤；软组织肉瘤；脊髓肿瘤；鳞状细胞癌；鳞状上皮癌伴隐匿性原发性，转移性；胃部(胃)癌；幕上原始神经外胚层肿瘤(supratentorial primitive neuroectodermal tumor)；T细胞淋巴瘤，皮肤性(蕈样肉芽肿(Mycosis Fungoides)和塞萨里综合症)；睾丸癌；咽喉癌；胸腺瘤；胸腺瘤和胸腺癌；甲状腺癌；甲状腺癌，儿童；肾盂和输尿管移行细胞癌；尿道癌；子宫癌，子宫内膜；尿路上皮癌，膀胱癌，输尿管癌，尿道癌，和脐尿管癌症，子宫肉瘤等；阴道癌；外阴癌；威尔姆氏瘤(Wilms Tumor)；和表达柄蛋白-4的其他上皮源性癌症。
在本文所提供的一些实施方式中，对象，例如，人对象疑似患有选自下组的癌症：子宫内膜癌，尿路上皮癌，膀胱癌，输尿管癌，尿道癌，肺癌，卵巢癌，乳腺癌，食道癌，胰腺癌，头颈癌，前列腺癌，阴茎癌，肛门癌，外阴癌，脐尿管癌症和表达柄蛋白-4的其他上皮源性癌症。
本文所用述于“响应性”指细胞或个体或患者或对象响应或具有对抗癌治疗剂的治疗的反应。响应性可以包括对抗癌治疗剂的许多反应，例如但不限于，减少癌细胞增殖或生长，增加癌细胞的细胞死亡，减少癌细胞的数量或肿瘤的大小，降低肿瘤大小的增加速率，阻碍癌症阶段的进展，癌症阶段或肿瘤大小的消退，减少癌症标志物表达，减少癌症转移和/或改善患者预后，诸如恢复患者体重，6个月、1年、2年、3年或5年患者生存率和/或患者的生存时间。在某些实施方式中，可以将响应性测量为不敏感(即，有可能响应)、敏感(有可能响应)和/或不确定。在某些实施方式中，当细胞、组织、患者或对象在其肿瘤或癌性细胞中显示出显著表达柄蛋白-4时，该细胞或组织或个体或患者或对象有可能响应抗癌治疗剂。在某些实施方式中，响应性随着肿瘤或癌性细胞/组织中柄蛋白-4水平的增加而增加。在某些实施方式中，响应性与肿瘤或癌性细胞/组织中柄蛋白-4表达的水平相关联。在某些实施方式中，响应性与肿瘤或癌性细胞/组织中柄蛋白-4表达的水平成正比。在其他实施方式中，细胞、组织、患者或对象对抗癌治疗剂的响应性可以比柄蛋白-4表达阴性细胞多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、750％、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。
本文所用“响应性的指示”指这样的预测结果，即一细胞、组织、人个体或对象中的响应性将比另一细胞、组织、人个体或对象的高。这类预测结果基于某些标准做出。在一些实施方式中，响应性的预测结果基于细胞、组织、肿瘤、人个体或对象中柄蛋白-4的表达水平做出。如上所述，在某些实施方式中，当细胞、组织、患者或对象在其肿瘤或癌性细胞中显示出显著表达柄蛋白-4时，预测细胞或组织或个体或患者或对象更有可能响应抗癌治疗剂。在某些实施方式中，预测响应性随着肿瘤或癌性细胞/组织中柄蛋白-4水平的增加而增加。在某些实施方式中，预测响应性与肿瘤或癌性细胞/组织中柄蛋白-4表达的水平相关联。在某些实施方式中，预测响应性与肿瘤或癌性细胞/组织中柄蛋白-4表达的水平成正比。在其他实施方式中，预测细胞、组织、患者或对象对抗癌治疗剂的响应性比柄蛋白-4表达阴性细胞多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、750％、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。
抗癌治疗剂可以是柄蛋白-4表达可以为其提供诊断、预后或预测价值的任何抗癌治疗剂或任何抗癌疗法。在某些实施方式中，治疗剂是这样的，其靶向柄蛋白-4在其中起作用的生物过程，例如，信号转导途径，新陈代谢途径或蛋白质合成/降解途径。在某些实施方式中，治疗剂是这样的，其靶向柄蛋白-4活性，柄蛋白-4信号转导或柄蛋白-4介导的疾病。在具体实施方式中，治疗剂是抗-柄蛋白-4抗体或抗-柄蛋白-4抗体药物偶联物。
为了确定组织样品中柄蛋白-4的表达，组织样品中的柄蛋白-4的表达水平与柄蛋白-4的参照表达水平进行比较或与之关联。本文所用“参照表达水平”指当其与测试样品中柄蛋白-4表达水平进行比较之时提供关于测试样品中柄蛋白-4表达的相关信息的参照样品中的表达水平。参照表达水平可以是已知的表达水平，例如，柄蛋白-4的量、浓度和/或摩尔量已知的情况下参照样品中的表达。例如，参照表达水平可以是其中细胞已经转染或以其他方式经工程改造以表达已知量的柄蛋白-4的细胞系中的柄蛋白-4表达。在一些实施方式中，参照表达水平可以是这样的细胞中的柄蛋白-4表达，所述细胞中的柄蛋白-4表达已经通过本文所提供的方法或本领域技术人员已知的方法定量，如ELISA，SDS-PAGE，定量免疫沉淀和/或定量western印迹。在其他实施方式中，参照表达水平涉及超过一个参照，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、75、100和更多个参照。在一实施方式中，参照水平具有4个参照：柄蛋白-4表达阴性，弱柄蛋白-4表达，中度柄蛋白-4表达，和高/强柄蛋白-4表达。
或者，参照表达水平可以是其中柄蛋白-4的准确浓度或量未知但是参照样品的状态、活性和/或功能已知的水平。在一些实施方式中，参照表达水平可以是来自疑似患有癌症的同一患者的非癌性细胞的水平。在这类实施方式中，通过将测试样品中的柄蛋白-4表达与参照样品中的柄蛋白-4表达进行比较，可以确定相对于非癌性细胞的柄蛋白-4表达的测试样品中的柄蛋白-4表达(例如，高于，低于或基本上相同)。在其他实施方式中，参照表达水平可以是癌性细胞的水平，其中通过将测试样品中的柄蛋白-4表达与参照样品中的柄蛋白-4表达进行比较，可以确定相对于癌性细胞的柄蛋白-4表达的测试样品中的柄蛋白-4表达(例如，高于，低于或基本上相同)。在其他实施方式中，参照表达水平可以是来自第二对象的细胞的水平，其中通过将测试样品中的柄蛋白-4表达与参照样品中的柄蛋白-4表达进行比较，可以确定相对于来自第二对象的细胞的柄蛋白-4表达的测试样品中的柄蛋白-4表达(例如，高于，低于或基本上相同)。第二对象可以是未患有癌症的正常人对象，患有与疑似患有癌症的患者相同类型癌症的人对象，或者患有与疑似患有癌症的患者不同类型癌症的人对象。
本文所述的参照样品和参照细胞可以是细胞系，获自疑似患有癌症的患者的细胞的体外或离体培养物，获自疑似患有癌症的患者的细胞，获自第二对象的细胞的体外或离体培养物，获自第二对象的细胞。
因此，在本文所提供的一些实施方式中，柄蛋白-4的参照表达水平可以是癌性细胞、所述对象的非癌性细胞、或来自第二对象的非癌性细胞的柄蛋白-4表达水平。
如上所述，在一些实施方式中，可以通过将与样品结合的抗-柄蛋白-4抗体和与阴性和阳性参照结合的抗-柄蛋白-4抗体相关联或比较确定样品中的柄蛋白-4表达，其中，参照中的柄蛋白-4表达水平是已知的。参照柄蛋白-4表达可以是阳性柄蛋白-4对照或者阴性柄蛋白-4对照。本文所用“阳性柄蛋白-4对照”或“阳性对照”指已知将表达显著量柄蛋白-4的细胞、组织、肿瘤、人和/或对象。“阴性柄蛋白-4对照”或“阴性对照”指已知并不表达柄蛋白-4或者低水平柄蛋白-4的细胞和/或组织，因此所述细胞或组织中的柄蛋白-4并非生物学显著的。当(1)本领域技术人员将根据管家基因的蛋白质产物认为柄蛋白-4表达水平低时；(2)低量的柄蛋白-4的存在与否对细胞或组织不产生生物学差异时；和(3)如果将这些非显著量的柄蛋白-4从细胞或组织去除或删除，细胞或组织将与这类去除或删除之前基本上相同的方式继续起作用时，柄蛋白-4水平是生物学不显著的。已知的柄蛋白-4表达可以独立地通过qPCR试验确定。已知的柄蛋白-4表达还可以独立地使用藉由之前已经确定具有柄蛋白-4特异性的抗-柄蛋白-4抗体的任何下述免疫试验确定，(例如，在上述特异性筛选方法中鉴定的柄蛋白-4特异性抗体)。合适的免疫试验包括，例如但不限于，IHC试验，免疫印迹试验，FACS试验或ELISA。在一些实施方式中，阴性对照中的柄蛋白-4 mRNA水平可能并不为零，因为试验的背景噪声或者因为生物学非显著性低水平的剩余柄蛋白-4。阴性柄蛋白-4对照可以被恰当地认为对柄蛋白-4呈阴性，例如，当qPCR试验中的柄蛋白-4 mRNA水平与用一组非特异性引物所检测的mRNA水平基本相似时，或者当柄蛋白-4 mRNA水平就阳性柄蛋白-4对照中柄蛋白-4 mRNA水平而言是生物学非显著性的时。相似地，阴性对照中通过使用另一柄蛋白-4特异性抗体的免疫试验所检测的柄蛋白-4可能并不为零，因为试验的背景噪声或者因为生物学非显著性低水平的剩余柄蛋白-4。背景噪声可以是由于试验试剂而非抗-柄蛋白-4抗体和样品之间的非特异性相互作用所导致的。阴性柄蛋白-4对照可以被恰当地认为对柄蛋白-4呈阴性，例如，当阴性对照中通过抗-柄蛋白-4抗体所检测的柄蛋白-4水平与相同试验中来自同种型对照抗体的检测水平基本上相似时。在一些试验中，背景噪声可以占来自柄蛋白-4表达的检测信号的大量百分比。
此外，本领域技术人员已经在文献中鉴定并公开了阳性和阴性对照，包括阳性和/或阴性组织、细胞(包括例如，细胞系)和病例样品。可以通过搜索数据库容易地鉴定这类文献，如Pubmed(例如，使用搜索述于诸如柄蛋白-4，表达，阳性，阴性和/或分布)，并分析研究热点。
因此，结合没有柄蛋白-4表达的阴性对照细胞的抗体或其抗原结合片段的相对量可以是结合表达柄蛋白-4的样品细胞的抗体或其抗原结合片段的量的约50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.03％、0.01％、0.001％或更少。
因此，在本文所提供的方法的一些实施方式中，柄蛋白-4的参照表达水平是阴性对照中的柄蛋白-4表达水平，其中，阴性对照中的柄蛋白-4表达独立地通过qPCR试验、使用二抗的IHC试验、使用二抗的免疫印迹试验、使用二抗的FACS试验或使用二抗的ELISA确定。
在本文所提供的方法的其他实施方式中，柄蛋白-4的参照表达水平是表达柄蛋白-4的阳性对照细胞中的柄蛋白-4表达水平，其中，阳性对照中的柄蛋白-4表达独立地通过qPCR试验、使用二抗的IHC试验、使用二抗的免疫印迹试验、使用二抗的FACS试验或使用二抗的ELISA确定。
样品中柄蛋白-4的表达水平可以与阳性对照中的表达水平不同。结合组织样品的抗体或其抗原结合片段的相对量可以是与表达柄蛋白-4的阳性对照细胞结合的抗体或其抗原结合片段的量的约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、750％、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、500倍或更多倍。
本领域已知以及本文下文所示例的许多不同的PCR或qPCR方案可以直接应用于或者适用于确定样品或对照中的柄蛋白-4 mRNA水平，其可以用作样品或对照中柄蛋白-4蛋白质表达水平的代理。在一些实施方式中应用或者适用定量PCR(qPCR)(也称之为实时PCR)，因其不仅仅提供定量测量，而且还减少时间和污染。本文所用“定量PCR(或qPCR)”指直接监测PCR扩增过程，因其出现不需要对反应产物进行重复采样。在定量PCR中，可以经由信号转导机制(例如，荧光)监测反应产物，因为它们在信号高于背景水平后但是在反应达到平台期之前生成并被追踪。实现可检测到的荧光或荧光的“阈值”水平所需的循环数量随着PCR过程开始之时可扩增靶标的浓度直接变化，使得信号强度的测量值实时提供样品中靶核酸量的测量值。当应用qPCR确定mRNA表达水平之时，在qPCR分析之前进行逆转录mRNA至DNA的额外步骤。PCR方法的示例可见于文献(Wong等,BioTechniques 39:75-85(2005)；D’haene等,Methods 50:262–270(2010))，通过引用其全部内容纳入本文。PCR试验的示例可以见于美国专利号6,927,024，通过引用其全部内容纳入本文。RT-PCR方法的示例可以见于美国专利号7,122,799，通过引用其全部内容纳入本文。荧光原位PCR的方法述于美国专利号7,186,507，通过引用其全部内容纳入本文。
在一具体实施方式中，可以进行qPCR以确定或测量如下的柄蛋白-4mRNA水平。简言之，确定柄蛋白-4和一个或多个管家基因的重复qPCR反应的平均Ct(循环阈值)值(或在本文中可互换地称之为Cq(定量循环))。然后可以使用下述示例性公式将柄蛋白-4的平均Ct值标准化至管家基因的Ct值：柄蛋白-4-ΔCt＝(柄蛋白-4的平均Ct–管家基因A的平均Ct)。然后可以将相对柄蛋白-4-ΔCt用于确定柄蛋白-4 mRNA的相对水平，例如，通过使用mRNA表达＝2–ΔCt的公式。对于Ct和Cq值的总结，参见MIQE指南(Bustin等,MIQE指南：公开定量实时PCR实验的最低限度信息(The MIQE Guidelines:Minimum Information forPublication of Quantitative Real-Time PCR Experiments),Clinical Chemistry 55:4(2009))。
也可以使用本领域已知用于定量样品中mRNA表达的其他常用方法，包括northern印迹和原位杂交(Parker和Barnes,Methods in Molecular Biology 106:247-283(1999))；RNA酶保护试验(Hod,Biotechniques 13:852-854(1992))；微阵列(Hoheisel等,Nature Reviews Genetics 7:200-210(2006)；Jaluria等,Microbial Cell Factories 6:4(2007))；和聚合酶链式反应(PCR)(Weis等,Trends in Genetics 8:263-264(1992))。或者，mRNA表达的水平可以通过测序技术确定。基于测序的基因表达分析的代表性方法包括：基因表达的系列分析(SAGE)，以及通过大规模平行测序(MPSS)的基因表达分析。
如之前所述，组织样品可以是但不限于，分离自生物体诸如哺乳动物，特别是的人的组织，体液，组织部分和/或细胞。因此，组织样品可以获自对象，包括人对象的各种器官。在一些实施方式中，组织样品获自疑似患有疾病、功能紊乱或病症诸如癌症的器官。在其他实施方式中，组织获自正在进行测试的对象或第二人对象的正常器官。
在本文所提供的方法的某些实施方式中，组织包括来自膀胱，输尿管，乳房，肺，结肠，直肠，卵巢，输卵管，食道，子宫颈，子宫内膜，皮肤，喉，骨髓，唾液腺，肾脏，前列腺，脑，脊髓，胎盘，肾上腺，胰腺，甲状旁腺，垂体，睾丸，甲状腺，脾脏，扁桃体，胸腺，心脏，胃，小肠，肝脏，骨骼肌，周围神经，间皮或眼睛的组织。
与样品结合的抗-柄蛋白-4抗体可以通过本领域已知的各种免疫试验检测，包括IHC方法、免疫印迹试验，FACS试验和ELISA。
柄蛋白-4可以通过各种IHC方法中的抗-柄蛋白-4抗体检测。已经证明组织切片的IHC染色是评估或检测样品中蛋白质存在的可靠方法。IHC技术利用抗体来原位探测并显示细胞抗原，通常通过显色或荧光方法。一抗或抗血清，诸如特异性靶向柄蛋白-4的多克隆抗血清和单克隆抗体，可以用于在IHC试验中检测表达。在一些实施方式中，组织样品与特异性靶标的一抗接触足以发生抗体-靶标结合的一段时间。如之前所详细讨论，可以通过在抗体上直接标记标签来检测抗体，例如，放射性标签，荧光标签，半抗原标签诸如生物素，或酶诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。或者，未标记的一抗与标记的二抗联用，二抗包括对一抗具有特异性的单克隆抗体、抗血清或多克隆抗血清。IHC方案和试剂盒为本领域已知并且市售可得。用于切片制备和IHC处理的自动化系统为市售可得。Leica BOND自动染色机和Leica Bond精细检测系统是这类自动化系统的示例。
在一些实施方式中，使用与标记的二抗联合的未标记的一抗在间接试验中进行IHC试验。间接试验利用两种抗体用于检测组织样品中的靶蛋白，如柄蛋白-4。首先，将未偶联的一抗施用于组织(第一层)，其与组织样品中的靶抗原相互反应。其次，施用酶标记的二抗，其特异性地识别一抗的抗体同种型(第二层)。二抗与一抗相互作用，然后施用底物-发色体(substrate-chromogen)。可以用酶诸如过氧物酶标记第二层抗体，其与发色体3,3’-二氨基联苯胺(DAB)反应，以在反应位点产生棕色沉淀。因为通过信号扩增系统潜在的信号扩增，该方法是灵敏的并且通用的。
在增加检测灵敏度的某些实施方式中，可以使用信号扩增系统。本文所用“信号扩增系统”表示可以用于增加来自检测结合的一抗或二抗的信号的试剂和方法的系统。信号扩增系统增加靶蛋白检测的灵敏度，增加检测的信号，并降低检测下限。存在多种类型的信号检测系统，包括酶标记系统和巨型标记系统(macrolabeling system)。这些系统/方法彼此并不互相排斥并可以组合用于累加效应。
巨标签(Macrolabel)或巨型标记系统是数量从数十个(例如，藻胆蛋白)至数百万个(例如，荧光微球)与常见支架连接或纳入其中的标签的集合。支架可以偶联靶特异性亲和力试剂，诸如抗体，而纳入的标签因此在结合后共同与靶标相关。巨标签中的标签可以是本文所述的任何标签，诸如荧光团、半抗原、酶和/或放射性同位素。在信号扩增系统的一个实施方式中，使用与标记的链聚合物偶联的二抗。聚合物技术利用可以连接1，2，3，4，5，6，7，8，9 10，15，20，25，30，50或更多个二抗分子的HRP酶标记的葡聚糖惰性“脊柱(spine)”分子，从而使系统更加灵敏。
基于酶标记系统的信号扩增系统利用酶的催化活性，诸如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶，以产生靶蛋白或核酸序列的原位高密度标记。在一实施方式中，酪酰胺(tyramide)可以用于增加HRP的信号。在这样的系统中，HRP将标记的酪酰胺衍生物酶促地转化成高活性、短暂的酪酰胺自由基。然后将标记的活性酪酰胺自由基与残基(主要是蛋白质酪氨酸残基的苯酚部分)在HRP-抗体-靶标相互作用位点附近共价偶联，导致位点处标签数量的增加并具有最小扩散相关信号定位损失。因此，信号可以扩增1，2，3，4，5，6，7，8，9、10，15，20，25，30，50，75或100倍。如本领域技术人员所知，酪酰胺上的标签可以是本文所述的任何标签，包括荧光团、酶、半抗原、放射性同位素和/或发光团(photophore)。也可以利用其他基于酶的反应产生信号扩增。例如，酶标记的荧光(ELF)信号扩增可以用于碱性磷酸酶，其中碱性磷酸酶酶促地切割弱蓝色荧光底物(ELF 97)并将其转化成亮黄绿荧光沉淀，展现出异常大的斯托克斯位移(Stokes shift)和出色的光稳定性。基于酪酰胺的信号扩增系统和ELF信号扩增均为市售可得，例如，购自赛默飞世尔科学公司(ThermoFisherScientific)(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆02451)。
因此，在本文所提供的方法的一些实施方式中，使用信号扩增系统检测柄蛋白-4的表达水平。
在一些实施方式中，然后对样品进行复染以识别细胞和亚细胞成分。
在一些实施方式中，还可以用本文所述抗体使用免疫印迹试验检测柄蛋白-4的表达水平。在免疫印迹试验的一些实施方式中，常常(但并非必需)通过电泳分离蛋白质并转移至膜(通常是硝化纤维或PVDF膜)。类似于IHC试验，一抗或抗血清，诸如特异性靶向柄蛋白-4的多克隆抗血清和单克隆抗体，可以用于检测蛋白质表达。在一些实施方式中，膜与特异性靶标的一抗接触足以发生抗体-抗原结合的一段时间，并且结合的抗体可以通过一抗本身上的直接标签检测，例如，放射性标签、荧光标签、半抗原标签如生物素或酶如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。在其他实施方式中，未标记的一抗联合对一抗具有特异性的标记的二抗用于上述间接试验。如本文所述，二抗可以经标记，例如，使用酶或其他可检测的标签，如荧光标签、发光标签、比色标签或放射性同位素。免疫印迹方案和试剂盒为本领域已知并且市售可得。用于免疫印迹的自动化系统，例如，用于Western印迹的iBind Western系统(赛默飞世尔科学公司(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆02451)为市售可得。免疫印迹包括但不限于，Western印迹，细胞内Western印迹和斑点印迹。斑点印迹是一种进化的过程，其中蛋白质样品并不通过电泳分离，而是直接点印于膜上。细胞内Western印迹涉及将细胞接种到微量滴定板，固定/透化细胞，然后如本文所述用最初标记的一抗或未标记的一抗然后用标记的二抗检测。
在一些实施方式中，还可以用本文所述抗体在流式细胞术试验中检测，包括荧光激活的细胞分选(FACS)试验。类似于IHC或免疫印迹试验，一抗或抗血清，诸如特异性靶向柄蛋白-4的多克隆抗血清和单克隆抗体，可以用于在FACS试验中检测蛋白质表达。在一些实施方式中，使用针对靶蛋白具有特异性的一抗对细胞进行足以发生抗体-抗原结合的一段时间的染色，并且结合的抗体可以通过一抗上的直接标签检测，例如，荧光标签或半抗原标签如一抗上的生物素。在其他实施方式中，未标记的一抗联合对一抗具有特异性的荧光标记的二抗用于上述间接试验。FACS提供了用于分选或分析荧光标记的生物细胞的混合物的方法，基于各细胞的特异性光射散和荧光特性，每次一个细胞。因此，流式细胞术检测并报告荧光物标记的抗体的强度，其指示靶蛋白的表达水平。因此，表面蛋白(诸如柄蛋白-4)的表达水平可以使用针对靶蛋白的抗体检测。非荧光的胞质蛋白还可以通过染色透化的细胞观测。用于进行FACS染色和分析的方法为本领域技术人员已知，并且由Teresa S.Hawley和Robert G.Hawley述于《流式细胞术方案》(Flow Cytometry Protocols),Humana出版社(Humana Press),2011(ISBN 1617379506,9781617379505)。
在其他实施方式中，还可以使用免疫试验诸如酶免疫试验(EIA)或ELISA检测柄蛋白-4的表达水平。本领域已知EIA和ELISA试验，例如，用于测试各种组织和样品，包括血液、血浆、血清或骨髓。存在许多可用的ELISA试验，参见例如，美国专利号4,016,043、4,424,279和4,018,653，通过引用其全部内容将其纳入本文,。这些方法包括非竞争类型的单位点和双位点或“夹心”试验，以及传统的竞争性结合试验。这些试验还包括将标记的抗体与靶蛋白直接结合。夹心试验是常用的试验。存在许多夹心试验的变形。例如，在典型的正向试验中，将未标记的抗体固定在固体基质上并使待测试的样品接触结合的分子。在合适的孵育期间后，允许足够的时间以形成抗体-抗原复合物，随后添加使用能够产生可检测信号的报告物分子标记的对抗原特异的二抗并孵育，给予足够的时间以形成另一个抗体-抗原-标记的抗体复合物。洗去任何未反应的材料并通过观察报告物分子产生的信号来确定抗原是否存在。结果可以通过简单观察可见信号来定量，或可通过对比包括已知靶蛋白量的对照样品来定量。
在EIA或ELISA试验的一些实施方式中，酶与二抗偶联。在其他实施方式中，荧光标记的二抗可以用于代替酶标记的二抗以在ELISA试验形式中产生可检测的信号。当用特定波长光照射激活时，荧色物标记的抗体吸收光能，诱导分子激发性状态，然后发射用光学显微镜可视化检测的特征性颜色的光。如同在EIA和ELISA中，允许荧光标记的抗体结合一抗-靶蛋白复合物。洗去未结合试剂后，剩余三元复合物随后暴露在合适波长光下，观察到的荧光指示感兴趣的靶蛋白的存在。免疫荧光和EIA技术都是本领域中非常成熟的且公开于本文。
对于本文所述的免疫试验，可以使用任何数量的酶或非酶标签，只要可以分别检测到酶促活性或非酶标签。酶因此产生可检测的信号，其可以用于检测靶蛋白。特别有用的可检测信号是发光或荧光信号。因此，对于用作标签特别有用的酶包括存在对其的发光或荧光底物的那些。这类发光或荧光底物可以通过酶促反应转化成容易检测的发光或荧光产物，其可以使用显微镜或光谱容易地检测和/或定量。本领域技术人员熟知这类酶，其包括但不限于，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖氧化酶等(参见Hermanson,《生物共轭技术》(Bioconjugate Techniques),学术出版社,圣地亚哥(1996))。具有熟知的发光或荧光底物的其他酶包括各种肽酶，其中可以利用发光或荧光肽底物来检测蛋白质水解切割反应。发光和荧光底物的使用也为细菌诊断所熟知，包括但不限于，使用α-和β-半乳糖苷酶，β-葡糖醛酸糖苷酶，6-磷酸-β-D-半乳糖苷6-磷酸半乳糖苷水解酶，β-葡糖苷酶，α-葡萄糖苷酶，淀粉酶，神经氨酸酶，酯酶，脂肪酶等(Manafi等,Microbiol.Rev.55:335-348(1991))，并且具有已知发光或荧光底物的酶可以容易地经改变用于本发明的方法中。
本领域技术人员已知道并可商购各种发光或荧光底物以产生可检测的信号。可以用于产生可检测信号的示例性底物包括但不限于，3,3'-二氨基联苯胺(DAB)，3,3'-,5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，氯萘酚(4-CN)(4-氯-1-萘酚)，2,2'-叠氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)，邻苯二胺二盐酸盐(OPD)和3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)，针对辣根过氧化物酶；5-溴-4-氯-3-吲哚基-1-磷酸(BCIP)，硝基蓝四唑(NBT)，耐晒红(Fast Red)(Fast RedTR/AS-MX)和对硝基苯基磷酸酯(PNPP)，针对碱性磷酸酶；1-甲基-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷和2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-吡喃半乳糖苷，针对β-半乳糖苷酶；2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-葡萄糖苷，针对β-葡糖苷酶的；等等。示例性的荧光底物包括但不限于，4-(三氟甲基)伞形磷酸基，针对碱性磷酸酶；4-甲基伞形基磷酸双(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)，4-甲基伞形基磷酸双(环己基铵)和4-甲基伞形基磷酸，针对磷酸酶；QuantaBluTM和QuantaRedTM，针对辣根过氧化物酶；4-甲基伞形酮基β-D-吡喃半乳糖苷，荧光素二(β-D-吡喃半乳糖苷)和萘荧光素二-(β-D-吡喃半乳糖苷)，针对β-半乳糖苷酶；3-乙酰伞形酮基β-D-吡喃葡萄糖苷和4-甲基伞形酮基-β-D-吡喃葡萄糖苷，针对β-葡糖苷酶；和4-甲基伞形酮基-α-D-吡喃半乳糖苷，针对α-半乳糖苷酶。用于产生可检测信号的示例性酶和底物还述于例如，美国专利公开号2012/0100540中。各种可检测酶底物，包括发光或荧光底物，为本领域所熟知并可以商购(Pierce公司，伊利诺斯州罗克福德；圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)，德克萨斯州达拉斯；英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德；42生命科学公司(42Life Science)；Biocare公司)。通常，底物转化成产物以形成沉积于靶核酸位点的沉淀。其他示例性底物包括但不限于，HRP-Green(42生命科学公司)，Betazoid DAB，Cardassian DAB，Romulin AEC，Bajoran Purple，Vina Green，Deep Space BlackTM，Warp RedTM，Vulcan Fast Red和Ferangi Blue，来自Biocare公司(加利福尼亚康科德；biocare.net/products/detection/chromogens)。
在免疫试验的一些实施方式中，可检测标签可以直接偶联一抗或二抗，其检测未标记的一抗。本领域技术人员熟知示例性的可检测标签，其包括但不限于发光或荧光标签(参见Hermanson,《生物共轭技术》(Bioconjugate Techniques),学术出版社,圣地亚哥(1996))。能够用作标签的示例性荧光团包括但不限于，若丹明衍生物，例如，四甲基若丹明B，若丹明B，若丹明6G，磺基若丹明B，德克萨斯红(磺基若丹明101)，若丹明110及其衍生物，如四甲基若丹明5-(或6)，丽丝胺(lissamine)若丹明B等；7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)；荧光素及其衍生物；萘，如丹磺酰基(5-二甲基氨基萘-1-磺酰基)；香豆素衍生物，如7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)，7-二乙基氨基-3-[(4'-(碘乙酰基)氨基)苯基]-4-甲基香豆素(DCIA)，Alexa fluor染料(分子探针公司(Molecular Probes))等；4,4-二氟-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-茚并二烯(BODIPYTM)及其衍生物(分子探针公司；俄勒冈州尤金市)；芘和磺化芘，如Cascade BlueTM及其衍生物，包括8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸等；吡啶基恶唑衍生物和达巴氧基衍生物(分子探针公司)；荧光黄(Lucifer Yellow)(3,6-二磺酸-4-氨基-萘二酰亚胺)及其衍生物；CyDyeTM荧光染料(安玛西亚公司(Amersham)/GE医疗生命科学公司(GE Healthcare Life Sciences)；新泽西州皮斯卡塔韦)等。示例性的发光团包括但不限于，酚酞，孔雀石绿，硝基芳族化合物，如硝基苯基，重氮染料，dabsyl(4-二甲基氨基偶氮苯-4'-磺酰基)等。
可以利用本领域技术人员熟知的方法，如显微镜或光谱，显示与结合的一抗或二抗相关的发光或荧光可检测信号。
“确定柄蛋白-4的表达”指在将测试生物样品中的柄蛋白-4的表达置于参照系统(参照比例)中，从而使得熟悉参照系统的技术人员可以告知测试样品中柄蛋白-4相对于已经定位于参照系统中的其他样品的相对表达。因此，这类确定涉及将测试组织样品中的柄蛋白-4表达与柄蛋白-4的参照表达水平进行比较。
在一些实施方式中，参照系统可以是定量系统，其中测试样品中柄蛋白-4的实际摩尔浓度或摩尔量与参照表达水平的摩尔浓度或摩尔量比较。在一些实施方式中，可以使用与摩尔浓度或摩尔量成线性比例的其他替代数值测量值。这些替代数值测量值的示例包括结合抗体的荧光强度测量值，结合抗体的发光强度测量值，结合抗体的放射性测量值和/或结合抗体的比色或发色测量值。
在其他实施方式中，参照系统可以是分类系统。分类系统可以具有至少2个类别和多达3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、75、100或更多个类别。在一些实施方式中，参照系统具有对柄蛋白-4表达呈阳性的(阳性)样品的阳性类别以及对柄蛋白-4表达呈阴性的(阴性)样品的阴性类别。在这样的分类系统中，确定测试样品中柄蛋白-4的表达涉及将测试样品中的柄蛋白-4表达与阳性参照样品的柄蛋白-4表达和/或阴性参照进行比较，并将测试样品置于阳性分类，如果测试样品表达柄蛋白-4的水平与阳性参照相似或更高。在另一实施方式中，分类系统具有3个分类，例如，阴性、中度和高表达类别。在另一实施方式中，分类系统具有4个类别，例如，阴性、低/弱、中/中度和高/强表达类别。在一些方面中，确定测试样品中柄蛋白-4的表达涉及将测试样品中柄蛋白-4的表达与已知类别的柄蛋白-4表达的一个或多个参照进行比较，并根据测试样品对于参照的相对表达将测试样品置于一类别。
在一些实施方式中，参照系统可以是评分系统。评分系统可以与分类系统类似，除了用评分替换分类。例如，阴性和阳性柄蛋白-4表达的2分类系统可以是0和1的评分系统，其中0表示阴性而1表示阳性。在另一实施方式中，3分类系统可以是0、1和2的评分系统，其中1是阴性，1是低/弱表达，而2是中/中度和高/强表达。在另一实施方式中，4分类系统可以是0、1、2和3的评分系统，其中0是阴性，1是低/弱，2是中/中度，而3是高/强表达。类似于分类系统，确定测试样品中柄蛋白-4的表达涉及将测试样品中柄蛋白-4的表达与具有已知评分的柄蛋白-4表达的一个或多个参照进行比较，并根据测试样品对于参照的相对表达为测试样品指定一评分。然而，评分系统可以这样的评分，不连续和离散数字(例如，0、2、4、6、8和10的系统或1、4、6、11、13和19的系统)，具有分数的数字(例如，1、1.5、2、2.5、3、3.5等)，负数，从任何数字开始的数字(例如，1000、2000、3000等)，以及可以用于追踪生物样品中的相对蛋白质表达的数字集合。
在一些实施方式中，参照系统可以是与分类或评分系统关联的细胞百分比。细胞百分比与分类或评分系统的组合提供细胞的更精细的分级。在这类组合系统中，将来自生物样品的各细胞指定或置于分类或评分系统，并确定各分类或评分中测试样品的大致细胞百分比。在一示例中，细胞百分比的测量值可以与阳性和阴性柄蛋白-4表达的2分类系统结合，其中，并不以整体测量样品，而是将其分解成对柄蛋白-4表达呈阳性的细胞百分比以及对柄蛋白-4表达呈阴性的细胞百分比。例如，在阳性和阴性柄蛋白-4表达的2分类系统中，如果置于2分类系统中，测试样品可以对柄蛋白-4表达呈阴性，但是其具有对10％的细胞对柄蛋白-4表达呈阳性，而90％的细胞对柄蛋白-4表达呈阴性。在一实施方式中，参照系统包括与2分类或2评分系统关联的细胞百分比。在一实施方式中，参照系统包括与3分类或3评分系统关联的细胞百分比。在一实施方式中，参照系统包括与4分类或4评分系统关联的细胞百分比。在一实施方式中，参照系统包括与5分类或5评分系统关联的细胞百分比。在一实施方式中，参照系统包括与6分类或6评分系统关联的细胞百分比。在一实施方式中，参照系统包括与7分类或7评分系统关联的细胞百分比。在一实施方式中，参照系统包括与8分类或8评分系统关联的细胞百分比。在一实施方式中，参照系统包括与9分类或9评分系统关联的细胞百分比。在一实施方式中，参照系统包括与10分类或10评分系统关联的细胞百分比。在一实施方式中，参照系统包括与任何分类或任何评分系统关联的细胞百分比。在一实施方式中，参照系统包括与4评分系统关联的细胞百分比，所述4评分系统包括0(对柄蛋白-4呈阴性)、1(低/弱柄蛋白-4表达)、2(中/中度柄蛋白-4表达)和3(高/强柄蛋白-4表达)。
在一些方面中，参照系统可以是柄蛋白-4表达与至少一个参照蛋白的表达的比例。在一些实施方式中，比例可以是柄蛋白-4表达的定量测量值和参照蛋白的定量测量值的比例，其中定量测量值包括本文所述的那些，诸如结合抗体的摩尔浓度，摩尔量，荧光强度测量值，结合抗体的发光强度测量值，结合抗体的放射性测量值和/或结合抗体的比色或发色测量值。在其他实施方式中，比例还可以是指定柄蛋白-4表达和根据本文所提供的任何评分系统的参照蛋白的评分的比值。参照蛋白可以是具有普通细胞功能的蛋白质，诸如肌动蛋白，GAPDH，GDI或通过管家基因所表达的任何蛋白质。例如，如果测试对柄蛋白-4表达具有评分3且对肌动蛋白表达具有评分1，那么可以确定比例为3。
在其他方面中，参照系统可以利用使用所输入的一个或多个分类、评分、比例、百分比和定量测量值的数学函数的结果。在一些实施方式中，数学函数使用这些运算符的复合，加法，乘法或组合来组合各种输入以产生结果，这些结果提供有关样品中柄蛋白-4表达的更详细信息和/或柄蛋白表达量级的更精细分级。在一实施方式中，数学函数基于百分比和4评分系统的组合来计算H评分。例如，通过将具有各柄蛋白-4表达评分(0＝阴性、1＝低/弱、2＝中/中度和3＝高/强)的细胞百分比(0–100)的乘积相加得出H评分。例如：具有10％评分3的细胞、30％评分2的细胞、20％评分1的细胞和40％评分0的细胞的样品将具有这样的H评分：(3×10)+(2×30)+(1×20)+(0×40)＝110。
因此，如本文所提供，柄蛋白-4的表达水平可以这样确定，使用分类系统，评分系统，柄蛋白-4表达与至少一种参照蛋白的表达的比例，所述分类或评分系统中的细胞百分比，柄蛋白-4染色信号的定量测量值或使用上述分类、评分、比例、百分比和定量测量值的一种或多种作为输入的数学函数的结果。
大多数福尔马林固定的组织在免疫组织化学染色之前需要抗原修复过程。固定过程中形成的亚甲基桥交联蛋白质并掩盖抗原的表位。+抗原修复方法破坏这些亚甲基桥并暴露表位，使得抗体结合。在一些实施方式中，通过热诱导的表位修复(HIER)方法修复抗原。在其他实施方式中，通过酶促修复(例如，蛋白质水解消化)方法修复抗原。对于HIER，福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)组织切片可以在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃或130℃加热。FFPE组织切片可以在这些温度中的任意稳定加热5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、150、180、240、300、360、420、480、540、600、660、720、780、840、900、960、1020、1080、1140、1200、1260、1320、1380和1440分钟。任何前述温度和任何前述持续时间的HIER过程可以在具有下述pH的溶液中进行：2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7、7.2、7.4、7.6、7.8、8、8.2、8.4、8.6、8.8、9、9.2、9.4、9.6、9.8、10、10.2、10.4、10.6、10.8、11、11.5或12。在一些实施方式中，HIER可以这样进行，在选自下组的温度：80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃，进行选自下组的持续时间：5、10、15、20、25、30、35、40，以选自下组的pH：8、8.2、8.4、8.6、8.8、9、9.2、9.4、9.6、9.8、10、10.2、10.4。
因此，本文所提供的方法还包括通过热诱导的表位修复(HIER)修复柄蛋白-4的表位。
免疫特异性结合柄蛋白-4抗原的未标记的抗体、标记的抗体和其衍生物和类似物可以用于诊断目的以检测、诊断或监测柄蛋白-4介导的疾病。因此，本文提供了用于检测柄蛋白-4介导的疾病的方法，其包括：(a)使用免疫特异性结合柄蛋白-4抗原的本文所提供的一种或多种抗体测定对象的组织样品或细胞中柄蛋白-4抗原的表达；和(b)将柄蛋白-4抗原的水平与参照水平进行比较，例如，正常组织样品中的水平(例如，来自未患有柄蛋白-4介导的疾病的组织样品，来自疾病发作之前的同一患者的组织样品，来自同一患者组织样品中的正常细胞，或者来自同一患者正常器官的正常组织样品)，其中测定的柄蛋白-4抗原水平相较于柄蛋白-4抗原对照水平升高指示柄蛋白-4介导的疾病。
本文还提供了用于诊断柄蛋白-4介导的疾病的诊断测定，其包括：(a)使用免疫特异性结合柄蛋白-4抗原的本文所提供的一种或多种抗体测定个体的组织样品或细胞中柄蛋白-4抗原的水平；和(b)将柄蛋白-4抗原的水平与参照水平进行比较，例如，正常组织样品中的水平，其中测定的柄蛋白-4抗原水平相较于柄蛋白-4抗原参照水平升高指示柄蛋白-4介导的疾病。在某些实施方式中，本文提供了治疗对象中柄蛋白-4介导的疾病的方法，其包括：(a)使用免疫特异性结合柄蛋白-4抗原的本文所提供的一种或多种抗体测定对象的组织样品或细胞中柄蛋白-4抗原的水平；和(b)将柄蛋白-4抗原的水平与参照水平进行比较，例如，正常组织样品中的水平，其中测定的柄蛋白-4抗原水平相较于柄蛋白-4抗原参照水平升高指示柄蛋白-4介导的疾病。在一些实施方式中，该方法还包括(c)向鉴定患有柄蛋白-4介导的疾病的对象给予有效量的本文所提供的抗体。柄蛋白-4介导的疾病更明确的诊断可以使健康专业人员更早地采取预防措施或积极治疗，从而防止柄蛋白-4介导的疾病的发展或进一步进展。
使用本领域技术人员已知或本文所述的经典免疫组织学方法(例如参见Jalkanen,等,1985,J.Cell.Biol.101:976-985；和Jalkanen等,1987,J.Cell Biol.105:3087-3096)，本文所提供的抗体可以用于测定生物样品中的柄蛋白-4抗原水平。能够用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫试验，如ELISA和放射免疫试验(RIA)。合适的抗体试验标签为本领域所知并且包括酶标签，如葡糖氧化酶；放射性同位素，如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(121In)、锝(99Tc)；发光标签，如鲁米诺；荧光标签，如荧光素和若丹明，和生物素。
本文所提供的一方面是检测和诊断人中柄蛋白-4介导的疾病。在一个实施方式中，诊断包括：a)向对象给予(例如，肠外，皮下或腹腔内)有效量的免疫特异性结合柄蛋白-4抗原的标记的抗体；b)给药后等待一段时间，用于允许标记的抗体在对象中柄蛋白-4抗原表达的位点聚集(并用于使未结合的标记的分子被清除到背景级别)；c)确定背景水平；和d)检测对象中标记的抗体，因此检测到标记的抗体高于背景水平指示对象患有柄蛋白-4介导的疾病。背景水平可以通过各种方法确定，包括将检测到的标记的分子量与之前针对特定系统确定的标准值进行比较。
本领域技术人员将理解的是，对象的大小和所用成像系统将决定产生诊断成像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情况下中，对于人对象，注射的放射性的量的正常范围约为5-20毫居里的99Tc。然后，标记的抗体将在包含特异性蛋白质的细胞的位置累积。体内肿瘤成像述于S.W.Burchiel等.,“放射性标记的抗体和其藕断的免疫药代动力学(Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments).”(《肿瘤成像：癌症的放射化学检测》(Tumor Imaging:The Radiochemical Detection ofCancer)的第13章,S.W.Burchiel and B.A.Rhodes,编著,马森出版有限公司(MassonPublishing Inc.)(1982)。
取决于多个变量，包括使用的标签的类型以及给药的模式，用于允许标记的抗体在对象中的位点聚集并用于使未结合的标记的分子被清除到背景级别的给药后的时间间隔为6-48小时或6-24小时或6-12小时。在另一实施方式中，给药后的时间间隔为5-20天或5-10天。
在一实施方式中，通过重复用于诊断柄蛋白-4介导的疾病的方法进行柄蛋白-4介导的疾病，例如，初始诊断后1个月，初始诊断后6个月，初始诊断后1年等。
标记的分子的存在可以在对象中使用本领域已知用于体内筛选的方法检测。这类方法取决于使用的标签的类型。本领域技术人员能够确定用于检测特定标签的适当方法。可以用于本文所提供的诊断方法的方法和装置包括但不限于，计算机断层扫描(CT)，全身扫描，如正电子发射断层成像(PET)，磁共振成像(MRI)和超声检查。
在具体实施方式中，用放射性同位素标记分子，并在患者中使用辐射响应手术设备检测(Thurston等，美国专利号5,441,050)。在另一实施方式中，用荧光化合物标记分子，并在患者中使用荧光响应扫描设备检测。在另一实施方式中，用正电子发射金属标记分子，并在患者中使用正电子发射断层成像检测。在另一实施方式中，用顺磁性标签标记分子，并在患者中使用磁共振成像(MRI)检测。
29.试剂盒
本文还提供了含有包装成合适包装材料的本文所提供的抗体(例如，抗-柄蛋白-4抗体)或其组合物(例如，药物组合物)的试剂盒。任选地，试剂盒包括标签或包装插入页，包括组件的描述或体外、体内或离体使用本文所组件的说明书。
术语“包装材料”指封闭试剂盒组件的物理结构。包装材料可以保持组件的无菌性，并且可以由常用于这类目的材料制成(例如，纸，波纹纤维，玻璃，塑料，箔，安瓿瓶，药瓶，管等)。
本文所提供的试剂盒可以包括标签或插入物。标签或插入物包括“印刷品”，例如，纸或硬纸板，单独或固定在组件，套件或包装材料(例如，盒)，或附着于，例如，包含组件的安瓿瓶，管或药瓶。标签或插入物可以额外地包括计算机可读介质，如磁盘(例如，硬盘、卡或内存磁盘)，光盘，如CD-或DVD-ROM/RAM，DVD，MP3，磁带或电子存储介质，如RAM和ROM或它们的混合体，如磁/光储存媒体，FLASH介质或内存类型卡。标签或插入物可以包括鉴定制造商信息、批号、制造商位置和日期的信息。
本文所提供的试剂盒可以额外地包括其他组件。试剂盒的各组件可以封装在单独的容器内，并且所有各种容器都可以在一个包装内。可以设计试剂盒用于冷藏。还可以进一步设计试剂盒以包含本文所提供的抗体，或含有编码本文所提供的抗体的核酸的细胞。可以将试剂盒中的细胞保持在适当的储存条件下，直到可以使用为止。附加组件可以包括，例如，阳性或阴性参考样品(例如，来自已知患有柄蛋白-4介导的疾病的患者的组织样品，来自未患有柄蛋白-4介导的疾病的患者的组织样品，来自疾病发作之前同一患者的组织样品，来自患有柄蛋白-4介导的疾病的对象的组织样品中的正常细胞，或来自同一患者正常器官的正常组织样品)，缓冲液，洗涤液，抗体检测试剂和/或信号放大试剂。
本文还提供了免疫特异性结合柄蛋白-4抗原的抗体组。在具体实施方式中，本文提供了这样的抗体组，其对于柄蛋白-4抗原具有不同的结合速率，不同的解离速率，不同的亲和力，和/或对于柄蛋白-4抗原不同的特异性。在某些实施方式中，本文提供的组为约10个抗体，优选约25、约50、约75、约100、约125、约150、约175、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950或约1000个抗体或更多。例如，抗体组可以用于96孔或384孔板，诸如针对试验，如ELISA。
除非另外定义，否则，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但本文描述了合适的方法和材料。
本文引用的所有申请、出版物、专利申请和其他参考文献，GenBank引证号和ATCC引证号都通过引用全文纳入本文。若有抵触，以说明书(包括定义)为准。
如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代对象，除非文本中另有明确说明。因此，例如，述及“肽序列”包括多种这类肽序列等。
本文所用数值在本文件中常以范围形式表示。范围形式的使用仅是为了方便和简洁，并不应被解释为对本发明范围的硬性限制，除非上下文以其他方式明确指出。相应地，范围的使用清楚地包括所有可能的子范围，该范围内所有的个别数值，以及数值或数值范围，包括在这样范围内的整数和值的分数或范围内的整数，除非上下文以其他方式明确指出。无论范围的广度如何，并且在本专利文件的所有上下文中，都适用这种解释。因此，例如，对于90-100％的范围，其包括91-99％、92-98％、93-95％、91-98％、91-97％、91-96％、91-95％、91-94％、91-93％等。对于范围90-100％还包括91％、92％、93％、94％、95％、95％、97％等，以及91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％等，92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％等等。
此外，对于范围1-3、3-5、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-225、225-250，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等。在另一示例中，对于范围25-250、250-500、500-1,000、1,000-2,500、2,500-5,000、5,000-25,000、25,000-50,000，包括这类值内或包括这类值的任何数值或范围，例如，25、26、27、28、29…250、251、252、253、254…500、501、502、503、504…等。
同样如本文所用，在该文件中公开了一系列范围。一系列范围的使用包括上限和下限的组合以提供另一个范围。无论范围的广度如何，并且在本专利文件的所有上下文中，都适用这种解释。因此，例如，对于诸如5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-75、75-100、100-150的一系列的范围，包括诸如5-20、5-30、5-40、5-50、5-75、5-100、5-150，和10-30、10-40、10-50、10-75、10-100、10-150，和20-40、20-50、20-75、20-100、20-150等的范围。
为了简洁起见，本文使用某些缩写。一个示例是代表氨基酸残基的单字母缩写。氨基酸及其相应的三字母和单字母缩写如下：
丙氨酸 Ala (A)
精氨酸 Arg (R)
天冬酰胺 Asn (N)
天冬氨酸 Asp (D)
半胱氨酸 Cys (C)
谷氨酸 Glu (E)
谷氨酰胺 Gln (Q)
甘氨酸 Gly (G)
组氨酸 His (H)
异亮氨酸 Ile (I)
亮氨酸 Leu (L)
赖氨酸 Lys (K)
蛋氨酸 Met (M)
苯丙氨酸 Phe (F)
脯氨酸 Pro (P)
丝氨酸 Ser (S)
苏氨酸 Thr (T)
色氨酸 Trp (W)
酪氨酸 Tyr (Y)
缬氨酸 Val (V)
本发明使用肯定性的语言一般地公开于本文以描述许多实施方式。本发明还特别包括这样的实施方式，其中完全或部分排除了特定对象，诸如物质或材料，方法步骤和条件，方案，过程，试验或分析。因此，虽然本发明在本文中通常并未表达本发明不包括的内容，但是本发明仍然公开了并未明确包括在发明的内容。
描述了本发明的许多实施方式。然而，应理解，可进行各种改进而不背离本发明的精神和范围。因此，下述实施例旨在示例而非限制权利要求中所述的本发明范围。
实施例
出于说明而非限制的方式提供了该部分中的实施例。
实施例1：抗原制备
生成人柄蛋白-4片段，例如，含有人柄蛋白-4(SEQ ID NO:1)氨基酸序列31-346(SEQ ID NO:2)的片段并用作后续免疫活动的抗原。
使用商购可得的pET表达载体产生6×HN-标记的柄蛋白4(aa 31-346)。根据生产商的说明在BL21(DE3)大肠杆菌中进行表达，并使用基于IMAC的纯化(固定的金属亲和力色谱)进行纯化。将纯化的柄蛋白4(aa31-346)用作免疫原。
使用修饰的pTag5/mychis表达载体根据生产商的说明在293FT细胞中生产用于抗体筛选的重组柄蛋白4(aa(1-348)。使用基于标准IMAC的纯化对蛋白质进行纯化。
实施例2：抗体的产生
A.抗体产生和生产
通过使用最初述于Kohler和Milstein,Eur.J.Immunol.6,511(1976)的标准杂交瘤技术用人柄蛋白4蛋白质胞外结构域的细菌产生的重组片段(31-346；SEQ ID NO:2)免疫Balb/C小鼠产生单克隆抗体M22-321b41.1。将杂交瘤M22-321b41亚克隆为M22-321b41.1，其产生特异性地结合人柄蛋白-4蛋白的重组胞外结构域的小鼠IgG2aκ抗体，通过ELISA。此外，证明蛋白A纯化的抗体M22-321b41.1特异性地染色通过IHC测试表达柄蛋白4的组织。
M22-321b41.1杂交瘤细胞然后经生长、扩增和可行地冷冻，长期保存在液氮中。
B.杂交瘤测序
使用RT-PCR对M22-321b41.1杂交瘤抗体重链和轻链基因进行测序。
实施例3：筛选和选择抗体
A.筛选试验(或结合试验)
使用如下所述产生的柄蛋白-4胞外结构域片段(氨基酸残基31-346)进行初级ELISA筛选。
使用大肠杆菌中产生的柄蛋白-4胞外结构域片段(氨基酸残基31-346)，293FT细胞中产生的柄蛋白-4胞外结构域片段(氨基酸残基1-346)，柄蛋白-4-tag5和两个对照蛋白(一个用pET产生，而一个用tag5产生)进行次级ELISA筛选。
B.抗体的选择
如果抗体在重组3T3-柄蛋白-4细胞中显示出染色而在对照中缺少染色，那么初步选择抗体。然后，使用通过qPCR评分确定的已知柄蛋白-4 mRNA表达在阳性或阴性对照组织的组中测试初步选择的抗体。以各种浓度并使用各种抗原修复方案测试抗体。如果抗体在柄蛋白-4-mRNA-阳性组织中产生特异性染色，在柄蛋白-4-mRNA-阴性组织中缺少染色，并且在染色强度、染色细胞的比例和非特异性背景染色方面优于经测试的对照抗-柄蛋白-4抗体，那么选择该抗体。
实施例4：筛选对柄蛋白-4具有特异性的抗体
如上所述产生的抗体经筛选以选择对柄蛋白-4具有特异性的抗体。例如，使用IHC试验进行筛选。简言之，首先在qPCR中测试来自各种来源，例如，膀胱、乳房、卵巢、胰腺、肾脏、皮肤、肺和结肠的人异种移植组织，以确定这些组织中柄蛋白-4表达的水平。
采用实时定量PCR(qPCR)分析确定相对柄蛋白-4 mRAN表达水平。使用Bio-RadCFX384实时PCR检测系统用SsoFast EvaGreen Supermix(伯乐公司(Bio-Rad))和5ng cDNA模板的RNA等同物进行qPCR。使用改良ΔCq方法以下述公式计算相对于GAPDH(管家基因)的表达水平的柄蛋白-4 mRNA表达水平：10,000*2-(Cq柄蛋白-4-CqGAPDH)；柄蛋白-4相对表达相对于GAPDH单位描述。
在柄蛋白-4的qPCR分析中采用的引物包括：191P4D12.1正向引物：5’-GGCTGGAGTTCAATGAGGTTTATTT-3’(SEQ ID NO:41)；和191P4D12.2反向引物：5’-TCCAGCAGATTTCAGACTAAGAAGA-3’(SEQ ID NO:42)。在GAPDH的qPCR分析中采用的引物包括：GAPDH.1正向引物：5’-AGAACATCATCCCTGCCTCTACTG-3’(SEQ ID NO:43)；和GAPDH.2反向引物：5’-AAATGAGCTTGACAAAGTGGTCGT-3’(SEQ ID NO:44)。
使用Bio-Rad iScript Advanced cDNA合成试剂盒由使用TRIzol RNA提取方法分离自组织或细胞系样品的RNA合成用于qPCR的cDAN模板，然后使用Qiagen RNeasy Cleanup试剂盒的进行RNA清除和DNA酶I消化。
示例性的人异种移植组织如表5所示。然后将上述产生的抗-柄蛋白-4抗体用于IHC试验以对具有已知水平的柄蛋白-4表达的组织进行染色。类似于下述实施例5中的详述，进行ICH试验。各种组织中柄蛋白-4的IHC染色与这些组织中的柄蛋白-4 mRNA水平相关联。当抗体产生与柄蛋白-4 mRNA水平相关联的IHC染色信号时，将抗体选为柄蛋白-4特异性抗体，例如，组织中的强染色与柄蛋白-4 mRNA的高水平，组织中的中度IHC染色信号与柄蛋白-4mRNA的中间水平，组织中的低IHC染色信号与低柄蛋白-4 mRNA，和不表达柄蛋白-4mRNA的组织中无IHC染色信号。总之，筛选了至少283个抗体克隆，导致鉴定M22-321b41.1和M22-244b3.1.1.1的柄蛋白-4特异性抗体。
实施例5：功能性试验：异种移植组织的免疫组织化学染色
例如，如本文所述产生、筛选、表达和纯化的抗体在IHC试验中对其对表达柄蛋白-4的人异种移植组织的特异性染色的能力进行进一步评估。
例如，在IHC试验中测试两种抗-柄蛋白-4小鼠单克隆抗体M22-244b3.1.1.1和M22-321b41.1(分别为IgG1和IgG2a同种型)。M22-244b3.1.1.1和M22-321b41.1抗体以1.54mg/mL和1.3mg/mL在磷酸盐缓冲盐水pH 7.4中提供。作为阴性对照，使用来自针对不结合人柄蛋白-4或其他哺乳动物抗原的β-2,6-果聚糖的鼠骨髓瘤(克隆：UPC10，西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，密苏里州圣路易斯)的商购小鼠IgG2a同种型对照。
根据下述示例性方案进行IHC染色。简言之，使用间接IHC技术在IHC试验中检测柄蛋白-4。将样品固定于10％缓冲的中性福尔马林，处加工并包埋在石蜡中，并制备为4μm组织切片。去石蜡和重新水化后，将切片进行抗原修复。柄蛋白-4中的抗原表位是通过例如向水性介质中的组织切片施加热量来修复，通常称为之为热诱导的表位修复(HIER)程序。例如，通过将表位修复2(Epitope Retrieval 2)(ER2，基于EDTA的缓冲液，pH 8.9-9.1)在100℃施加于Leica自动化平台20分钟来修复柄蛋白-4中的抗原表位。然后将抗原修复后的组织切片用小鼠一抗M22-321b41.1、M22-244b3.1.1.1或IgG2a(抗体对照)孵育。洗涤与一抗结合的组织切片并用酶标记的(例如，过氧化物酶标记的)二抗检测。将结合的二抗颜色显影，例如，使用Leica Bond精细检测系统，其可以使用过氧化物酶与发色体3,3’-二氨基联苯胺(DAB)之间的反应以在反应位点产生棕色沉淀。然后将染色组织切片扫描、成像并用光学显微镜评估，例如，使用Aperio ScanScope CS(Aperio，加利福尼亚州维斯塔)。
为了通过抗体染色水平评估组织切片中柄蛋白-4表达的水平，将染色的组织切片根据IHC染色的强度和癌细胞阳性比例评估、评价、分类和记录到不同的类别或评分之中。类别包括强(“3”或者可以与“3+”互换)，中度(“2”或者可以与“2+”互换)和弱(“1”或者可以与“1+”互换)。缺少特异性染色记录为阴性(“0”或者可以与“-”互换)。
使用已知柄蛋白-4 mRNA表达水平，测试来自各种来源，例如，膀胱、乳房、卵巢、胰腺、肾脏、皮肤、肺和结肠的人异种移植癌症组织。使用qPCR首先测试这些示例性人异种移植组织中的柄蛋白-4 mRNA的水平并示于表5。
表5：用于抗体滴定实验的组织
Figure BDA0002378599980001821
Figure BDA0002378599980001831
为了发现抗体的合适染色浓度，使用表5中所列示例性异种移植组织在如上所述的IHC染色试验中将抗体M22-321b41.1和M22-244b3.1.1.1首先以2.5μg/mL、5.0μg/mL和7.5μg/mL滴定。结果示于表6。
表6：M22-321b41.1和M22-244b3.1.1.1滴定结果的总结
Figure BDA0002378599980001832
Figure BDA0002378599980001841
将抗-柄蛋白-4抗体IHC染色的最佳浓度确定为在表达柄蛋白-4 mRNA的组织中观测到抗-柄蛋白-4抗体IHC染色但是未在柄蛋白-4-阴性组织中观测到抗-柄蛋白-4抗体IHC染色之时的浓度。在2.5μg/mL时，M22-321b41.1和M22-244b3.1.1.1抗体两者在对柄蛋白-4mRNA呈阳性的人异种移植组织中显示出阳性染色(图1和图2)并在阴性对照组织中显示出最小的背景染色。表6和表7中的详细染色结果指示2.5μg/mL的浓度是两种抗体的示例性最佳浓度。
表7：M22-321b41.1和M22-244b3.1.1.1滴定的详细染色结果
Figure BDA0002378599980001842
Figure BDA0002378599980001851
Figure BDA0002378599980001861
2.5μg/mL的M22-321b41.1抗体在柄蛋白-4 mRNA-阴性组织AG-K24和MDAMB-231-MFP-XCL中不产生染色(图3和图5)；然而M22-244b3.1.1.1在柄蛋白-4 mRNA-阴性异种移植癌细胞AG-K24(图4)和MDAMB-231-MFP-XCL(图6)中具有非特异性染色。并未在用小鼠IgG2a阴性对照抗体孵育的切片中观察到染色。因此，M22-321b41.1对表达柄蛋白-4mRNA的组织进行特异性地染色，并且对于不表达柄蛋白-4 mRNA的组织，不产生染色或者产生与同种型IgG对照所产生的一样低的染色。
如表8所示，在阳性和阴性对照组织的扩展组中进一步测试M22-321b41.1的特异性。结果证明，2.5μg/mL的抗体对表达柄蛋白-4 mRNA的组织和细胞具有特异性，包括AG-B1，AG-UT5，AG-L16(FIG.8)，AG-Br29，AG-B11(FIG.9)，AG-OV35，AG-Panc3，AG-C16，AG-C6，大鼠1(E)-柄蛋白-4和T47D。结果还证明抗体对不表达柄蛋白-4 mRNA的组织和细胞呈阴性，包括AG-K24(FIG 3)，AG-Mel10，MDA-MB-231-MFPXCL(FIG 5)，AG-Mel5，AG-K31，CALU-1，MDA-MB-231，UG-K3，大鼠1(E)-neo，大鼠1(E)-柄蛋白-1，大鼠1(E)-柄蛋白-2，大鼠1(E)-柄蛋白-3，JMSU-1，Hep3B和ACHN。这些发现证明M22-321b41.1在IHC试验中对柄蛋白-4具有特异性，因为对于本文测试的所有组织和细胞，M22-321b41.1对表达柄蛋白-4 mRNA的组织和细胞有阳性染色，并对于那些不表达柄蛋白-4 mRNA的组织和细胞有阴性染色(表8和表9)。
表8：以2.5μg/mL使用M22-321b41.1的FFPE样品扩展组中柄蛋白-4表达的总结
Figure BDA0002378599980001871
表9：扩展组的M22-244b3.1.1.1染色结果
Figure BDA0002378599980001881
Figure BDA0002378599980001891
如上所述产生并筛选的抗-柄蛋白-4抗体与其他商购的抗-柄蛋白-4抗体在IHC试验中进一步进行比较。例如，获得来自Novus生物公司(Novus Biologicals)(目录号NBP1-82829)的柄蛋白-4/PVRL4抗体(称之为“Novus PVRL4抗体”)——兔多克隆抗-柄蛋白-4抗体，并在IHC中测试其对已经通过qPCR确定柄蛋白-4 mRNA水平的各种异种移植组织中的柄蛋白-4进行特异性染色的能力。在以2μg/ml、1.5μg/ml、1μg/ml和0.5μg/ml滴定NovusPVRL4抗体的实验中，Novus PVRL4抗体产生比M22-244b3.1.1.1.1更弱的特异性柄蛋白-4染色并在不表达柄蛋白-4 mRNA的MDA-MB-231异源物中在所有浓度下产生非特异性染色，如表10所示。因此，Novus PVRL4抗体对柄蛋白-4不具有特异性。
表10：不同浓度的Novus PVRL4抗体的染色结果
Figure BDA0002378599980001901
在IHC实验中针对更宽泛的组织组合进一步测试Novus PVRL4抗体，所述更宽泛的组织组合中柄蛋白-4 mRNA水平已经通过qPCR确定。无论柄蛋白-4 mRNA水平如何，在大多数经测试的异种移植物中观测到背景胞质染色，如表11所示。
表11：更宽泛的异种移植组织组合中Novus PVRL4抗体的染色结果
Figure BDA0002378599980001902
Figure BDA0002378599980001911
因为Novus PVRL4抗体是具有潜在批次间可变性的可耗竭兔多克隆抗体，由赛默飞世尔科技公司获得不同的兔多克隆抗-柄蛋白-4抗体PA5-30837(“Thermo PVRL4抗体”)，对其测试并在IHC实验中在3个不同的异种移植组织中进步比较，所述异种移植组织的柄蛋白-4 mRNA水平已经通过qPCR确定。测试的3个异种移植组织包括：具有478柄蛋白-4 mRNA水平的AG-B1(+)PS26，具有78柄蛋白-4 mRNA水平的AG-OV35P3，和不表达柄蛋白-4 mRNA的AG-Mel5 P17。Thermo PVRL4抗体在AG-B1中产生弱/中度IHC染色并在AG-OV35中产生阴性IHC染色。
因此，Novus PVRL4抗体或Thermo PVRL4抗体两者在IHC实验中对柄蛋白-4不具有与本文所产生且筛选的M22-244b3.1.1.1.1or M22-321b41.1相同的特异性。
同样获得来自R&D系统公司(R&D Systems)两种其他商购抗体(单克隆小鼠抗-柄蛋白-4抗体MAB2659和山羊多克隆抗-柄蛋白-4抗体AF2659)，并在ICH实验中在3种不同的异种移植组织中测试，所述异种移植组织中柄蛋白-4 mRNA水平通过qPCR确定。测试的3个异种移植组织包括具有478柄蛋白-4 mRNA水平的AG-B1(+)PS26，具有78柄蛋白-4 mRNA水平的AG-OV35P3，和没有柄蛋白-4 mRNA的AG-Mel5 P17。当以1μg/ml或5μg/ml使用MAB2659抗体时在AG-B1和AG-OV35的肿瘤外围产生脏点状/胞质样染色。山羊多克隆抗-柄蛋白-4抗体AF2659在5μg/ml下在AG-B1和AG-OV35中产生强膜性染色以及背景基质染色，但在1μg/ml下产生弱染色.因此，以2.5μg/ml在其他组织中进一步评估AF2659抗体。然而，AF2659抗体在不表达柄蛋白-4 mRNA的MDA-MB-231异种移植物中产生背景染色。因此，MAB2659抗体或AF2659抗体不具有与本文所述产生和筛选的M22-321b41.1抗体相同的特异性。
实施例6：功能性试验：原代组织的免疫组织化学染色
例如，如本文实施例中所述产生、筛选、表达和纯化的抗体，例如，抗-柄蛋白-4M22-321b41.1在IHC试验中对其对表达柄蛋白-4的原代人组织的特异性染色的能力进行进一步评估。
例如，使用间接IHC技术进行IHC试验。间接IHC方法利用两种抗体检测组织抗原。首先，将未偶联的一抗施用于组织(第一层)，其与组织抗原反应。其次，施用酶标记的二抗，其直接针对其中一抗已经产生的动物物种的IgG(第二层)。二抗与一抗反应，然后施用底物-发色体。用酶过氧物酶标记第二层抗体，其与发色体3,3’-二氨基联苯胺(DAB)反应，以在反应位点产生棕色沉淀。因为通过与一抗上不同抗原位点的数个二抗反应的潜在的信号扩增，该方法具有灵敏度和通用性。
作为进一步增加测试的灵敏度的示例，使用与标记的链聚合物偶联的二抗。聚合物技术利用连接多达10个二抗分子的HRP酶标记的葡聚糖惰性“脊柱”分子，从而使得系统更加灵敏。
然后，对样品进行复染以识别细胞和亚细胞成分。
6.A.染色过程
根据下述示例性方案进行IHC试验。简言之，将组织样品固定，加工并包埋在石蜡中，并制备为组织切片。将切片在烘箱中以60±5℃孵育1-2小时，从烘箱去除，并允许其在处理前冷却至室温(RT)。在将组织样品常规去石蜡和重新水化后，进行抗原修复以使福尔马林固定后出现的蛋白质交联逆转。通过在蛋白酶溶液中蛋白质水解消化组织或通过向水性介质中的组织切片施加热量(通常称之为HIER过程)实现抗原修复。对于该试验，以100℃使用Leica自动化平台上的表位修复2(ER2，基于EDTA的缓冲液，pH 8.9-9.1)20分钟。
除非另有说明，否则将染色编程为在Leica Bond自动染色机以RT运行。简言之，将以下步骤编程到Leica Bond自动染色机作为染色方案：(1)表位修复2过程(ER2)：20分钟、100℃(Bond表位修复溶液2(Bond Epitope Retrieval Solution 2)(莱卡公司(Leica))，部分#AR9640)；(2)3×Bond洗涤(Bond Wash)：0分钟(Bond洗涤溶液(Bond Wash Solution)(莱卡公司)，部分#AR9590)；(3)标志物：15分钟(用单克隆小鼠抗-柄蛋白-4抗体M22-321b41.1或阴性对照小鼠IgG2a(BD生物科学公司(BD Biosciences))部分#550339染色，于Bond一抗稀释液(Bond Primary Antibody Diluent)(Leica)中，部分#AR9352)；(4)3×Bond洗涤：0分钟(Bond洗涤溶液(莱卡公司)，部分#AR9590)；(5)初免后(Post Primary)：8分钟(兔抗小鼠IgG2a)；(6)3×Boud洗涤：2分钟(Bond溶液(莱卡公司)，部分#AR9590)；(7)聚合物：8分钟(来自Bond聚合物精细检测(莱卡公司)的抗-兔多聚-HRP-IgG，部分#DS9800)；(8)2×Bond洗涤：0分钟、2分钟；(9)1×去离子水：0分钟；(10)过氧化物阻断(Peroxide Block)：5分钟(3-4％过氧化氢)和3×Bond洗涤：0分钟；(11)2×去离子水：0分钟；(12)混合的DAB精细：0分钟(66mM 3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐和≤0.1％过氧化氢，来自Bond聚合物精细检测(莱卡公司)，部分#DS9800)；(13)混合的DAB精细：10分钟(66mM 3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐和≤0.1％过氧化氢，来自Bond聚合物精细检测(莱卡公司)，部分#DS9800)；(14)3×去离子水：0分钟；(15)苏木精：15分钟(<0.1％苏木精，来自Bond聚合物精细检测(莱卡公司)，部分#DS9800)；(16)1×去离子水：0分钟；(17)1×Bond洗涤：0分钟；(18)1×去离子水：0分钟。如过程所指示，将来自BD生物科学公司的阴性试剂对照小鼠IgG2a用于经测试的各样品，以评估非特异性(背景)染色的存在。背景染色的存在也是接受/拒绝特定试验运行的标准。
6.B组织样品
利用阳性和阴性对照样品验证和控制IHC分析的所有步骤。对于该试验，将具有可变柄蛋白-4表达水平的小鼠人肿瘤异种移植用作对照。
福尔马林固定，石蜡包埋的人体组织样品以残留材料获得，来自机构审查委员会批准的来源的手术或尸检，例如政府资源库(例如，合作人体组织网络(Cooperative HumanTissue Network))，学术合作(例如，UCLA，UC欧文分校)和商业来源，包括例如，人正常尿路上皮和移行细胞癌(BL802)和正常(FDA999)组织微阵列(TMA)，美国Biomax。使用实施例6.A中所述方案测试组织样品的柄蛋白-4表达。还测试了4个小鼠人肿瘤移植物，其包括1个对柄蛋白-4表达呈阴性(X14-126)，1个对柄蛋白-4表达弱呈阳性(X14-33)，1个对柄蛋白-4表达呈中度阳性(X14-139)和1个对柄蛋白-4表达呈强阳性(X14-43)。
6.C抗-柄蛋白-4抗体的染色浓度滴定
通过对异种移植组织切片进行滴定分析，例如，使用实施例4和5所述的方法，确定优选一抗效价。进行石蜡包埋样品的滴定分析以确定IHC试验的最佳抗体浓度。为了进行滴定分析，制备实施例5中确定的最佳浓度(2.5μg/ml)的2倍连续稀释物，并用它们匹配的阴性对照组织切片测试。
根据对于石蜡包埋的样品合适的ICH方案，将抗-柄蛋白-4抗体M22-321b41.1及其对应的阴性对照抗体施用于组织切片，如实施例4和5所述。研究病理学家使用光化学显微镜来评估并比较结果。研究病理学家将最佳效价(最佳抗体浓度)确定为产生最高的染色强度而没有显著的背景染色的最低效价(抗体的最低浓度)其。在该实施例中，如表12所示，选择2.5μg/ml的抗体浓度并用于后续IHC试验中。
表12：确定抗-柄蛋白-4抗体M22-321b41.1的最佳抗体浓度。
Figure BDA0002378599980001941
6.D.柄蛋白-4 IHC染色的评估
IHC染色的评估通过通过职业验证的病理学家进行。评估染色强度并报告为0(阴性)、1+(弱)、2+(中度)和3+(强)。评估各强度水平或阳性染色细胞整体的大致细胞染色百分比并报告为0-100％。
为了比较组织中的染色，将柄蛋白-4染色评估的各种参数直接比较或对柄蛋白-4染色的结果进行进一步处理，例如，计算为H-评分，其考虑染色强度以及特定强度范围下染色细胞的百分比。例如，这样计算H-评分，通过将给定染色强度(0-100)下染色细胞的百分比和染色强度(1-3)的乘积加和。例如：具有10％的3+细胞染色、30％的2+细胞染色、20％的1+细胞染色和40％未染色细胞的样品将具有这样的H评分：(3×10)+(2×30)+(1×20)+(0×40)＝110。
变异系数(CV)用于评估H-评分中的运行内变异或精度。试验性能的运行内精度由5个独立的运行确定，利用3个阳性异种移植样品。定性地，3个独立的运行中各测试组织的总体一致染色模式被认为是可接受的运行内精度。如下所示计算CV：
CV＝标准偏差/均值×100
例如，认为小于或等于35％的CV是可接受的。
如表13所示，对于运行内精度评估，染色强度的模式(3+、2+、1+的组合)对于5个重复中的各组织都是一致的。此外，对于所有组织的CV都小于35％，其在示例性的可接受范围内。因此，M22-321b41.1提供了用于在柄蛋白-4 IHC试验中检测柄蛋白-4的精度。
Figure BDA0002378599980001961
Figure BDA0002378599980001971
试验性能的运行间重复性由5个独立的运行确定，利用与精度试验相同的异种移植样品。定性地，5个独立的运行中各测试组织的总体一致染色模式被认为是可接受的运行间精度。如表14所示，对于运行间重复性，染色强度的模式(3+、2+、1+的组合)对于3个重复中的各组织都是一致的。此外，对于所有组织的CV都小于35％，其在示例性的可接受范围内。因此，M22-321b41.1提供了用于在柄蛋白-4 IHC试验中检测柄蛋白-4的重复性。
Figure BDA0002378599980001991
Figure BDA0002378599980002001
6.A至6.D所提供的参数和结果总结于下表15。
表15：示例性参数、结果和其范围
Figure BDA0002378599980002011
6.E柄蛋白-4 IHC染色的灵敏度和特异性
例如，如果柄蛋白-4 IHC试验对表达柄蛋白-4抗原的组织有阳性染色，认为柄蛋白-4 IHC试验是灵敏的。认为柄蛋白-4 IHC试验具有特异性，例如，如果在各种组织类型间观测到不同的染色并且柄蛋白-4 IHC染色与染色的组织中柄蛋白-4抗原的已知表达相关联。因为特异性和灵敏度的评估并不是相互排斥的，试验常常提供关于灵敏度和特异性的信息。
M22-321b41.1的柄蛋白-4 IHC试验的灵敏度和特异性使用TMA确定，所述TMA是60个独特核心的膀胱癌以及20个正常泌尿道上皮组织，4个小鼠人肿瘤异种移植和13个各种癌的人全组织切片(WTS)，包括膀胱、肺和乳腺。IHC试验中M22-321b41.1抗体相对于柄蛋白-4染色的灵敏度和特异性的总结列于下表16和表17。在这些和一些其他示例性试验中，通过其H-评分结果将组织样品分成4个类别之一：高(201-300)、中度(101-200)、低(1-100)、阴性(0)。
表16：组织染色灵敏度的总结
Figure BDA0002378599980002012
Figure BDA0002378599980002021
表17：组织染色特异性的总结
Figure BDA0002378599980002022
在用于评估M22-321b41.1特异性和灵敏度的一些示例性试验中，将分别以2.5μg/ml使用X抗体(已知对柄蛋白-4具有特异性)或抗-柄蛋白-4抗体M22-321b41.1进行染色的13个WTS癌的H-评分进行比较。下表18所示的比较表明通过M22-321b41.1的IHC染色与已知柄蛋白-4表达相一致，如绝大多数情况下通过X抗体染色所示。
表18：M22-321b41.1 IHC染色和X抗体IHC染色之间的关联
Figure BDA0002378599980002031
将来自上表18的结果重分类成阳性和阴性柄蛋白-4染色，以确定X抗体和抗-柄蛋白-4抗体M22-321b41.1阳性染色的关联。如果组织显示出H-评分≥150，那么认为该组织呈阳性。下表19中的全部发现显示X抗体和抗-柄蛋白-4抗体M22-321b41.1之间对阳性染色组织为89％的关联百分比，对阴性染色组织为100％的关联比，以及94％的整体关联比。因此，M22-321b41.1的柄蛋白-4 IHC染色和组织中柄蛋白-4的表达之间存在高度关联。因此，M22-321b41.1的柄蛋白-4 IHC试验是灵敏的且具有特异性。
表19：当阈值是H-评分≥150时的柄蛋白-4X抗体与M22-321b41.1
Figure BDA0002378599980002041
M22-321b41.1的灵敏度和特异性使用包括TMA的较大组织样品集合进一步确定，所述TMA是60个独特核心的膀胱癌以及20个正常泌尿道上皮组织，4个小鼠人肿瘤异种移植和13个各种癌的人全组织切片(WTS)，包括膀胱、肺和乳腺。通过X抗体的IHC试验，总计评估了94个病例，在95％的病例中总体检出了柄蛋白-4(WTS中为82％，而TMA中为98％)。图10和11显示了使用M22-321b41.1的癌的代表性IHC染色。亚细胞定位多数为膜质和胞质，以及被认为是膜质的一些顶点染色。表20中的结果进一步证明了M22-321b41.1的柄蛋白-4 ICH试验的特异性和灵敏度，因为使用M22-321b41.1的肿瘤样品中的阳性染色百分比与X抗体的IHC试验所提供的癌中柄蛋白-4的已知表达相一致。因此，M22-321b41.1的柄蛋白-4 IHC试验是灵敏的且具有特异性。
Figure BDA0002378599980002051
Figure BDA0002378599980002061
Figure BDA0002378599980002071
Figure BDA0002378599980002081
Figure BDA0002378599980002091
Figure BDA0002378599980002101
Figure BDA0002378599980002111
M22-321b41.1特异性和灵敏度由FDA999d中三重复包含的所有33个正常人样品进一步确定。如表21所示，抗-柄蛋白-4抗体M22-321b41.1的IHC染色与文献(Rabet等，2016.)中报道的正常细胞中柄蛋白-4的表达相一致，除了正常的乳腺显示出部分或弱至中度免疫反应性。红细胞以中度至强的强度针对柄蛋白-4染色。鳞状上皮强染色，而基底层呈阴性。
Figure BDA0002378599980002131
Figure BDA0002378599980002141
Figure BDA0002378599980002151
Figure BDA0002378599980002161
Figure BDA0002378599980002171
因此，基于M22-321b41.1的柄蛋白-4表达的IHC试验对柄蛋白-4表达是灵敏的且具有特异性。使用M22-321b41.1的IHC试验显示出良好的精度和再现性。
实施例7：功能性试验：免疫印迹
mAb M22-321b41.1的功能性质和特异性在免疫印迹中进一步评估，例如，在Western印迹。简言之，由各种柄蛋白-4 mRNA阳性和柄蛋白-4 mRNA阴性样品制备的蛋白质裂解物进行SDS-PAGE，转移到硝化纤维素膜上，并用M22-321b41.1探测。将抗-人GAPDH抗体用作加样对照，以确认合适且相等量的所有细胞裂解物在SDS-PAGE中的各凝胶泳道中解析。如图12A所示，在经工程改造以表达柄蛋白-4的柄蛋白-4-mRNA阳性NCI H322M、AG-B1和大鼠1(E)细胞的裂解物中，M22-321b1.1识别并印迹约58-60kDa的特异性条带，与预测的人柄蛋白-4分子量相一致。在AG-B1异种移植样品以及NCIH322M细胞系中观测到较小尺寸的柄蛋白-4裂解产物，与报道的柄蛋白-4脱落相一致(Buchanan等,2017)。并未在柄蛋白-4mRNA阴性MDA-MB-231和大鼠1(E)-Neo细胞中未检测到条带。M22-321b41.1也并未在Western印迹中检测到通过工程改造的大鼠1(E)细胞过表达的柄蛋白-1、柄蛋白-2和柄蛋白-3中的任一种，虽然所有柄蛋白家族成员(柄蛋白1-4)在工程改造的大鼠1(E)细胞中高度表达，如图12B中的FACS所示。因此，M22-321b41.1在免疫印迹试验中特异性地检测柄蛋白-4。
实施例8：表位作图
为了将通过M22-321b41.1抗体识别的柄蛋白-4上的表位作图，克隆柄蛋白-4的各种片段，转染到细胞中，并在细胞中表达。培养表达各种柄蛋白-4片段的细胞并在RIPA缓冲液中裂解。使用BSA标准对RIPA裂解物的总蛋白浓度进行定量并且总计20μg还原的(50mMTCEP)裂解物在1x MES运行缓冲液中4-12％BT 15-泳道凝胶上进行SDS-PAGE，用I-Blot转移到硝酸纤维膜上，用LI-COR封闭缓冲液封闭，用2μg/ml M22-321b41.1抗体在1:1 LI-COR封闭缓冲液中探测。将α-GAPDH抗体的1:10000稀释(鸡pAb，密理博公司(Millipore)用于检测作为加样对照的GAPDH。然后，用IRDye 680(奥德赛公司(Odyssey))偶联山羊-抗-小鼠抗体的1:5000稀释或1:5000驴抗-α-鸡偶联IRDye 800(奥德赛公司)检测与蛋白质条带结合的抗体，并在Odyssey系统中显示。M22-321b41.1抗体识别柄蛋白-4片段V(氨基酸1-150)(图13)。因此，M22-321b41.1抗体识别位于人柄蛋白-4氨基酸残基1-150(SEQ ID NO:45)中的表位。此外，因为M22-321b41.1抗体是针对人柄蛋白-4的氨基酸残基31-346(SEQ ID NO:2)的柄蛋白-4片段生产，如实施例1、2和3所示，M22-321b41.1抗体可以识别位于人柄蛋白-4氨基酸残基31-150(SEQ ID NO:46)中的表位(片段1-150和片段31-346的重叠区域)。
实施例9：柄蛋白-4 IHC试验的诊断和预后用途
首先在正常组织样品中使用M22-321b41.1抗体的IHC染色检验柄蛋白-4表达。在皮肤(表皮，汗腺和毛囊)，膀胱移行上皮，唾液腺(导管)，食道，乳房和胃中检测到可变，但是大多为弱或中度的柄蛋白-4表达。为了将柄蛋白-4表达与各种癌症相关联，然后在各种肿瘤样品中使用M22-321b41.1抗体的IHC染色检验柄蛋白-4表达。柄蛋白-4在膀胱癌中高度表达，而在乳腺、胰腺、肺和卵巢癌组织微阵列(TMA)中更中度表达。使用IHC试验检验柄蛋白-4表达与膀胱癌之间的关联揭示，TMA上83％(524中的434个)的膀胱癌呈阳性且60％被M22-321b41.1 IHC染色强或中度染色。
然后，评估通过M22-321b41.1 IHC染色确定的患者组织中柄蛋白-4表达在预测患者是否会对抗癌疗法(例如，使用与细胞毒性或细胞抑制剂偶联的抗-柄蛋白-4偶联物的抗癌疗法)响应方面的有效性，例如，通过在满足下述标准的患者中测试对癌症疗法的响应：(1)具有经组织学确认为耐药或复发的转移性恶性实体瘤(肉瘤除外)；(2)具有柄蛋白-4表达阳性的肿瘤并具有等于或大于150的柄蛋白-4 IHC H-评分；(3)针对转移性疾病的至少有一种在先化疗方案已经失败(如果考虑尿路上皮癌和膀胱癌对象不适合基于顺铂的化疗，那么不需要在先化疗方案失败)(Galsky等,Journal of Clinical Oncology,第29卷,第17号,2432-2438(2011))；(4)如果最近的全身性治疗是研究性免疫治疗药物，那么已经记录了疾病进展；(5)具有0或1的美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative OncologyGroup，ECOG)表现状态；(7)具有根据RECIST(1.1版本)可测量的疾病(Eisenhauer,等European Journal of Cancer；45(2):228-247(2009))。使用M22-321b41.1抗体的IHC分析检验了总计184个临床试验样品的柄蛋白-4表达；在所检验的184个样本中，180个(98％)临床试验样品的H-评分大于0；而171个(93％)具有中度至高柄蛋白-4表达(H-评分≥150)。总计，44个临床对象匹配纳入标准。这44个患者的肿瘤和/或转移的位点列于表22。
表22：原发性肿瘤和转移的位点
原发性肿瘤的位点 N(％)
膀胱 28(63.6)
肾盂 10(22.7)
输尿管 3(6.8)
膀胱，其他组织学 2(4.5)
其他 1(2.3)
转移的位点 N(％)
内脏 25(56.8)
肝 10(22.7)
肺 20(45.5)
向具有中度至高柄蛋白-4表达(H-评分≥150)的44位患者给予抗癌治疗剂，其包含与微管破坏剂单甲基奥瑞他汀-E(monomethylauristatin-E)偶联的完全人抗-柄蛋白-4抗体(IgG1κ)。所有对象接受单个30分钟IV输注的抗-柄蛋白-4 ADC，每周一次，持续每4周循环中的3周(例如，在第1、8和15天)，直至疾病进展，治疗的不耐受性，研究者决定或撤回同意。给予的剂量包括0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg和1.25mg/kg。研究者根据RECIST 1.1版评估患者的疾病响应，每8周一次(±7天)(RECIST如Eisenhauer,等European Journalof Cancer；45(2):228-247(2009)中所述)。总计36个对象产生可以评估的结果。
抗-柄蛋白-4 ADC在经治疗的患者中产生抗肿瘤活性，所有经治疗的患者均具有表达柄蛋白-4的肿瘤。36位患者中的10位具有部分响应，27.8％的响应率(将部分或完整响应均计为响应)。抗-柄蛋白-4 ADC还在患有肝转移瘤的10个对象中的4个中(40％响应率)以及之前用检查点抑制剂治疗的12位患者中的3位中(25％响应率)产生抗肿瘤活性。
因此，抗-柄蛋白-4 ADC在具有表达柄蛋白-4的肿瘤的患者中产生抗肿瘤活性。
实施例10：柄蛋白-4 IHC试验的诊断和预后用途——不同群组
然后，评估通过M22-321b41.1 IHC染色确定的患者组织中柄蛋白-4表达在预测患者是否会对抗癌疗法(例如，使用与细胞毒性或细胞抑制剂偶联的抗-柄蛋白-4偶联物的抗癌疗法)响应方面的有效性，例如，通过在满足下述标准的不同患者群组中测试对癌症疗法的响应：(1)具有经组织学确认的转移性恶性实体瘤，包括尿路上皮癌；(2)具有柄蛋白-4表达阳性的肿瘤并具有等于或大于150的柄蛋白-4 IHC H-评分；(3)针对转移性疾病和/或尿路上皮癌的一种或多种在先化疗已经失败，不适合基于顺铂的化疗的对象，(Galsky等,Journal of Clinical Oncology,第29卷,第17号,2432-2438(2011))；(4)在研究之前具有关于经免疫检查点抑制剂(CPI)治疗的对象的记录的疾病进展；(5)具有0或1的美国东部肿瘤协作组(ECOG)表现状态；(7)具有根据RECIST(1.1版本)可测量的疾病(Eisenhauer,等European Journal of Cancer；45(2):228-247(2009))。使用M22-321b41.1抗体的IHC分析检验了总计295个临床试验样品的柄蛋白-4表达；在所检验的295个样本中，278个(94％)临床试验样品的H-评分等于或大于1；而245个(83％)具有中度至高柄蛋白-4表达(H-评分≥150)。总计，58个临床对象匹配纳入标准。这58个患者的肿瘤和/或转移的位点列于表23。
表23：原发性肿瘤和转移的位点
Figure BDA0002378599980002211
Figure BDA0002378599980002221
向具有中度至高柄蛋白-4表达(H-评分≥150)的58位患者给予抗癌治疗剂，其包含与微管破坏剂单甲基奥瑞他汀-E(monomethylauristatin-E)偶联的完全人抗-柄蛋白-4抗体(IgG1κ)。所有对象接受单个30分钟IV输注的抗-柄蛋白-4 ADC，每周一次，持续每4周循环中的3周(例如，在第1、8和15天)，直至疾病进展，治疗的不耐受性，研究者决定或撤回同意。给予的剂量包括0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg和1.25mg/kg。研究者根据RECIST 1.1版评估患者的疾病响应，每8周一次(±7天)(RECIST如Eisenhauer,等European Journalof Cancer；45(2):228-247(2009)中所述)。总计49个对象产生可以评估的结果。
抗-柄蛋白-4 ADC在经治疗的患者中产生抗肿瘤活性，所述经治疗的患者均具有表达柄蛋白-4的肿瘤。1为患者具有完整响应且17位患者具有部分响应，产生总计36.7％的响应率(将部分或完整响应均计为响应)。在1.25mg/kg组中，抗-柄蛋白-4 AD在17位经治疗的患者中的10位中产生响应，58.8％的响应率。抗-柄蛋白-4 ADC还在患有肝转移瘤的12个对象中的5个中(41.7％响应率)，之前用检查点抑制剂治疗的16位患者中的6位中(37.5％响应率)和之前用紫杉烷治疗的20位患者中的8位中(40％响应率)产生抗肿瘤活性。
因此，抗-柄蛋白-4 ADC在具有表达柄蛋白-4的肿瘤的患者中产生抗肿瘤活性。
实施例11：抗-柄蛋白-4 ADC的治疗用途
评估本文所提供的抗-柄蛋白-4 ADC在治疗患有各种癌症的患者中的功效，例如，通过将经抗-柄蛋白-4 ADC治疗的患者与经作为安慰剂的抗体同种型治疗的患者的结果进步比较，所述抗-柄蛋白-4 ADC包含人或人源化M22-321b41.1抗体。简言之，将患者随机分配并指定到对照组或治疗组。用抗-柄蛋白-4 ADC以剂量范围注射治疗组中的患者，所述剂量范围根据在动物模型和/或实施例9和10中优化的mg(抗体)/kg(体重)剂量的范围确定。在一段时间内进行依次或多次注射。分析经治疗的患者中的结果并定期比较治疗组和安慰剂组。
当与经安慰剂治疗的患者相比时，经抗-柄蛋白-4 ADC治疗的患者中的结果改善。当与安慰剂治疗比较时，抗-柄蛋白-4 ADC治疗导致6个月、1年、2年、3年或5年时更高的存活率，增加存活期，降低癌症标志物水平，降低平均或中值肿瘤大小，和/或减慢癌症进展。
实施例12：柄蛋白-4 IHC试验的其他诊断和预后用途
评估通过M22-321b41.1 IHC染色确定的患者组织中柄蛋白-4表达在预测患者是否会对抗癌疗法(例如，使用与细胞毒性或细胞抑制剂偶联的抗-柄蛋白-4偶联物的抗癌疗法)响应方面的有效性，例如，通过将患者对癌症治疗的响应与通过使用柄蛋白-4特异性抗体的IHC染色确定的患者癌症组织中的柄蛋白-4表达相关联。简言之，用相同的癌症治疗方案治疗所有患者，并在使用本文所述M22-321b41.1抗体的IHC试验中确定患者患有癌症的组织中的柄蛋白-4表达的水平。根据其癌症组织中的柄蛋白-4表达，将患者分成2、3、4或更多组。例如，4组分层的情况下，在其癌症组织中具有高柄蛋白-4表达的患者分入第一组，具有中度表达的分入第二组，具有低表达的分入第三组，而不具有表达的分入第四组。总结对癌症治疗方案的响应并与各组中患者的柄蛋白-4表达相关联，其通过患者结果反映，诸如各分层组中患者的体重，患者的肿瘤大小，6个月、1年、2年、3年或5年患者存活率或患者的存活时间。关联使用各组的平均值或中值进行，或针对各组中的单个患者进行。
患者癌症组织中的柄蛋白-4表达指示患者如何响应癌症治疗方案，例如，使用与细胞毒性或细胞抑制剂偶联的抗-柄蛋白-4(称之为抗-柄蛋白-4 ADC)的癌症疗法。在其癌症组织中具有较高柄蛋白-4表达的患者相比在其癌症组织中具有较低柄蛋白-4表达的患者对癌症治疗方案更好地响应，具有更高的6个月、1年、2年、3年或5年存活率，和/或存活更长。患者癌症组织中柄蛋白-4表达越高，癌症疗法，例如，抗-柄蛋白-4 ADC治疗对患者越有效。
序列表
<110> 艾更斯司股份有限公司（AGENSYS, INC.）
<120> 柄蛋白-4结合蛋白及其使用方法
<130> 14369-208-228
<140> 待指定
<141> 同时附上
<150> 62/515,454
<151> 2017-06-05
<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 510
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> GenBank登录号NP_112178
<400> 1
Met Pro Leu Ser Leu Gly Ala Glu Met Trp Gly Pro Glu Ala Trp Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Phe Thr Gly Arg Cys Pro Ala Gly
20 25 30
Glu Leu Glu Thr Ser Asp Val Val Thr Val Val Leu Gly Gln Asp Ala
35 40 45
Lys Leu Pro Cys Phe Tyr Arg Gly Asp Ser Gly Glu Gln Val Gly Gln
50 55 60
Val Ala Trp Ala Arg Val Asp Ala Gly Glu Gly Ala Gln Glu Leu Ala
65 70 75 80
Leu Leu His Ser Lys Tyr Gly Leu His Val Ser Pro Ala Tyr Glu Gly
85 90 95
Arg Val Glu Gln Pro Pro Pro Pro Arg Asn Pro Leu Asp Gly Ser Val
100 105 110
Leu Leu Arg Asn Ala Val Gln Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Glu Cys Arg
115 120 125
Val Ser Thr Phe Pro Ala Gly Ser Phe Gln Ala Arg Leu Arg Leu Arg
130 135 140
Val Leu Val Pro Pro Leu Pro Ser Leu Asn Pro Gly Pro Ala Leu Glu
145 150 155 160
Glu Gly Gln Gly Leu Thr Leu Ala Ala Ser Cys Thr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Pro Ala Pro Ser Val Thr Trp Asp Thr Glu Val Lys Gly Thr Thr Ser
180 185 190
Ser Arg Ser Phe Lys His Ser Arg Ser Ala Ala Val Thr Ser Glu Phe
195 200 205
His Leu Val Pro Ser Arg Ser Met Asn Gly Gln Pro Leu Thr Cys Val
210 215 220
Val Ser His Pro Gly Leu Leu Gln Asp Gln Arg Ile Thr His Ile Leu
225 230 235 240
His Val Ser Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Arg Gly Leu Glu Asp Gln
245 250 255
Asn Leu Trp His Ile Gly Arg Glu Gly Ala Met Leu Lys Cys Leu Ser
260 265 270
Glu Gly Gln Pro Pro Pro Ser Tyr Asn Trp Thr Arg Leu Asp Gly Pro
275 280 285
Leu Pro Ser Gly Val Arg Val Asp Gly Asp Thr Leu Gly Phe Pro Pro
290 295 300
Leu Thr Thr Glu His Ser Gly Ile Tyr Val Cys His Val Ser Asn Glu
305 310 315 320
Phe Ser Ser Arg Asp Ser Gln Val Thr Val Asp Val Leu Asp Pro Gln
325 330 335
Glu Asp Ser Gly Lys Gln Val Asp Leu Val Ser Ala Ser Val Val Val
340 345 350
Val Gly Val Ile Ala Ala Leu Leu Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val
355 360 365
Val Leu Met Ser Arg Tyr His Arg Arg Lys Ala Gln Gln Met Thr Gln
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Lys Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Leu Thr Arg Glu Asn Ser Ile Arg Arg
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Leu His Ser His His Thr Asp Pro Arg Ser Gln Pro Glu Glu Ser Val
405 410 415
Gly Leu Arg Ala Glu Gly His Pro Asp Ser Leu Lys Asp Asn Ser Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met Ser Glu Glu Pro Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Thr Leu
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Thr Thr Val Arg Glu Ile Glu Thr Gln Thr Glu Leu Leu Ser Pro Gly
450 455 460
Ser Gly Arg Ala Glu Glu Glu Glu Asp Gln Asp Glu Gly Ile Lys Gln
465 470 475 480
Ala Met Asn His Phe Val Gln Glu Asn Gly Thr Leu Arg Ala Lys Pro
485 490 495
Thr Gly Asn Gly Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Gly His Leu Val
500 505 510
<210> 2
<211> 316
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 2
Ala Gly Glu Leu Glu Thr Ser Asp Val Val Thr Val Val Leu Gly Gln
1 5 10 15
Asp Ala Lys Leu Pro Cys Phe Tyr Arg Gly Asp Ser Gly Glu Gln Val
20 25 30
Gly Gln Val Ala Trp Ala Arg Val Asp Ala Gly Glu Gly Ala Gln Glu
35 40 45
Leu Ala Leu Leu His Ser Lys Tyr Gly Leu His Val Ser Pro Ala Tyr
50 55 60
Glu Gly Arg Val Glu Gln Pro Pro Pro Pro Arg Asn Pro Leu Asp Gly
65 70 75 80
Ser Val Leu Leu Arg Asn Ala Val Gln Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Glu
85 90 95
Cys Arg Val Ser Thr Phe Pro Ala Gly Ser Phe Gln Ala Arg Leu Arg
100 105 110
Leu Arg Val Leu Val Pro Pro Leu Pro Ser Leu Asn Pro Gly Pro Ala
115 120 125
Leu Glu Glu Gly Gln Gly Leu Thr Leu Ala Ala Ser Cys Thr Ala Glu
130 135 140
Gly Ser Pro Ala Pro Ser Val Thr Trp Asp Thr Glu Val Lys Gly Thr
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Thr Ser Ser Arg Ser Phe Lys His Ser Arg Ser Ala Ala Val Thr Ser
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Glu Phe His Leu Val Pro Ser Arg Ser Met Asn Gly Gln Pro Leu Thr
180 185 190
Cys Val Val Ser His Pro Gly Leu Leu Gln Asp Gln Arg Ile Thr His
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Ile Leu His Val Ser Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Arg Gly Leu Glu
210 215 220
Asp Gln Asn Leu Trp His Ile Gly Arg Glu Gly Ala Met Leu Lys Cys
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Leu Ser Glu Gly Gln Pro Pro Pro Ser Tyr Asn Trp Thr Arg Leu Asp
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Gly Pro Leu Pro Ser Gly Val Arg Val Asp Gly Asp Thr Leu Gly Phe
260 265 270
Pro Pro Leu Thr Thr Glu His Ser Gly Ile Tyr Val Cys His Val Ser
275 280 285
Asn Glu Phe Ser Ser Arg Asp Ser Gln Val Thr Val Asp Val Leu Asp
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Pro Gln Glu Asp Ser Gly Lys Gln Val Asp Leu Val
305 310 315
<210> 3
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 3
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
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Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
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35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr His Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 8
Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr
1 5
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 9
Leu Leu Ile Tyr His Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 10
His Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 11
Leu Leu Ile Tyr His Met Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 12
Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Phe Thr
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 13
Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Phe
1 5
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 14
Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met Gln
1 5 10
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 15
Thr Tyr Trp Met Gln
1 5
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 16
Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
1 5
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 17
Thr Thr Tyr Trp Met Gln
1 5
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 18
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln
1 5 10 15
Lys Phe Lys Gly
20
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 19
Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 20
Tyr Pro Gly Asp Gly Asp
1 5
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 21
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg
1 5 10
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 22
Ala Arg Glu Tyr Tyr Gly Leu Asp Tyr
1 5
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 23
Glu Tyr Tyr Gly Leu Asp Tyr
1 5
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 24
Ala Arg Glu Tyr Tyr Gly Leu Asp
1 5
<210> 25
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 25
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 26
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 27
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 27
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 28
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Thr Lys Arg
1 5 10
<210> 29
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 31
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 31
Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Ile Gln
1 5 10 15
Leu Ser Thr Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 32
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 33
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 33
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
1 5 10 15
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
20 25 30
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
35 40 45
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
50 55 60
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Thr
65 70 75 80
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
85
<210> 34
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 34
Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro
1 5 10 15
Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr
20 25 30
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val
35 40 45
Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val
50 55 60
Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg
65 70 75 80
Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn
85 90 95
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp
100 105 110
Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp
115 120 125
Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn
130 135 140
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn
145 150 155 160
Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp
165 170 175
Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro
180 185 190
Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala
195 200 205
Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys
210 215 220
Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile
225 230 235 240
Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn
245 250 255
Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys
260 265 270
Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys
275 280 285
Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe
290 295 300
Ser Arg Thr Pro Gly Lys
305 310
<210> 35
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 35
Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile
20 25 30
Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val
50 55 60
Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln
85 90 95
Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val
115 120 125
Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu
145 150 155 160
Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr
165 170 175
Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr
195 200 205
Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys
210 215 220
Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
225 230
<210> 36
<211> 1533
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> GenBank登录号NM_030916
<400> 36
atgcccctgt ccctgggagc cgagatgtgg gggcctgagg cctggctgct gctgctgcta 60
ctgctggcat catttacagg ccggtgcccc gcgggtgagc tggagacctc agacgtggta 120
actgtggtgc tgggccagga cgcaaaactg ccctgcttct accgagggga ctccggcgag 180
caagtggggc aagtggcatg ggctcgggtg gacgcgggcg aaggcgccca ggaactagcg 240
ctactgcact ccaaatacgg gcttcatgtg agcccggctt acgagggccg cgtggagcag 300
ccgccgcccc cacgcaaccc cctggacggc tcagtgctcc tgcgcaacgc agtgcaggcg 360
gatgagggcg agtacgagtg ccgggtcagc accttccccg ccggcagctt ccaggcgcgg 420
ctgcggctcc gagtgctggt gcctcccctg ccctcactga atcctggtcc agcactagaa 480
gagggccagg gcctgaccct ggcagcctcc tgcacagctg agggcagccc agcccccagc 540
gtgacctggg acacggaggt caaaggcaca acgtccagcc gttccttcaa gcactcccgc 600
tctgctgccg tcacctcaga gttccacttg gtgcctagcc gcagcatgaa tgggcagcca 660
ctgacttgtg tggtgtccca tcctggcctg ctccaggacc aaaggatcac ccacatcctc 720
cacgtgtcct tccttgctga ggcctctgtg aggggccttg aagaccaaaa tctgtggcac 780
attggcagag aaggagctat gctcaagtgc ctgagtgaag ggcagccccc tccctcatac 840
aactggacac ggctggatgg gcctctgccc agtggggtac gagtggatgg ggacactttg 900
ggctttcccc cactgaccac tgagcacagc ggcatctacg tctgccatgt cagcaatgag 960
ttctcctcaa gggattctca ggtcactgtg gatgttcttg acccccagga agactctggg 1020
aagcaggtgg acctagtgtc agcctcggtg gtggtggtgg gtgtgatcgc cgcactcttg 1080
ttctgccttc tggtggtggt ggtggtgctc atgtcccgat accatcggcg caaggcccag 1140
cagatgaccc agaaatatga ggaggagctg accctgacca gggagaactc catccggagg 1200
ctgcattccc atcacacgga ccccaggagc cagccggagg agagtgtagg gctgagagcc 1260
gagggccacc ctgatagtct caaggacaac agtagctgct ctgtgatgag tgaagagccc 1320
gagggccgca gttactccac gctgaccacg gtgagggaga tagaaacaca gactgaactg 1380
ctgtctccag gctctgggcg ggccgaggag gaggaagatc aggatgaagg catcaaacag 1440
gccatgaacc attttgttca ggagaatggg accctacggg ccaagcccac gggcaatggc 1500
atctacatca atgggcgggg acacctggtc tga 1533
<210> 37
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 37
gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtaatg gcatcactta tttgtattgg 120
tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcatatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cactagcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgcg ctcaaaatct agaacttccg 300
ttcacgttcg gaggggggac caagctggaa acaaaacggg ctgatgctgc accaactgta 360
tccatcttcc caccatccag tgagcagtta acatctgga 399
<210> 38
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 38
caggttcagc tccagcagtc tggggctgag ctggcaagac ctggggcttc agtgaaattg 60
tcctgcaagg cttctggcta tacctttact acctactgga tgcagtgggt aaaacagagg 120
cctggacagg gtctggaatg gattgggtct atttatcctg gagatggtga tactaggtac 180
actcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgcagata aatcctccag cacagcctac 240
attcaactca gcaccttggc atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagaatac 300
tacggtcttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcagc caaaacaaca 360
gccccatcgg tctatccact ggcccctgtg tgtggagata caactggc 408
<210> 39
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 39
gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtaatg gcatcactta tttgtattgg 120
tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcatatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cactagcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgcg ctcaaaatct agaacttccg 300
ttcacgttcg gaggggggac caagctggaa acaaaacggg ctgatgctgc accaactgta 360
tccatcttcc caccatccag tgagcagtta acatctggag gtgcctcagt cgtgtgcttc 420
ttgaacaact tctaccccaa agacatcaat gtcaagtgga agattgatgg cagtgaacga 480
caaaatggcg tcctgaacag ttggactgat caggacagca aagacagcac ctacagcatg 540
agcagcaccc tcacgttgac caaggacgag tatgaacgac ataacagcta tacctgtgag 600
gccactcaca agacatcaac ttcacccatt gtcaagacct tcaacaggaa tgagtgt 657
<210> 40
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 40
caggttcagc tccagcagtc tggggctgag ctggcaagac ctggggcttc agtgaaattg 60
tcctgcaagg cttctggcta tacctttact acctactgga tgcagtgggt aaaacagagg 120
cctggacagg gtctggaatg gattgggtct atttatcctg gagatggtga tactaggtac 180
actcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgcagata aatcctccag cacagcctac 240
attcaactca gcaccttggc atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagaatac 300
tacggtcttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcagc caaaacaaca 360
gccccatcgg tctatccact ggcccctgtg tgtggagata caactggctc ctcggtgact 420
ctaggatgcc tggtcaaggg ttatttccct gagccagtga ccttgacctg gaactctgga 480
tccctgtcca gtggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct ctacaccctc 540
agcagctcag tgactgtaac ctcgagcacc tggcccagcc agtccatcac ctgcaatgtg 600
gcccacccgg caagcagcac caaggtggac aagaaaattg agcccagagg gcccacaatc 660
aagccctgtc ctccatgcaa atgcccagca cctaacctct tgggtggacc atccgtcttc 720
atcttccctc caaagatcaa ggatgtactc atgatctccc tgagccccat agtcacatgt 780
gtggtggtgg atgtgagcga ggatgaccca gatgtccaga tcagctggtt tgtgaacaac 840
gtggaagtac acacagctca gacacaaacc catagagagg attacaacag tactctccgg 900
gtggtcagtg ccctccccat ccagcaccag gactggatga gtggcaagga gttcaaatgc 960
aaggtcaaca acaaagacct cccagcgccc atcgagagaa ccatctcaaa acccaaaggg 1020
tcagtaagag ctccacaggt atatgtcttg cctccaccag aagaagagat gactaagaaa 1080
caggtcactc tgacctgcat ggtcacagac ttcatgcctg aagacattta cgtggagtgg 1140
accaacaacg ggaaaacaga gctaaactac aagaacactg aaccagtcct ggactctgat 1200
ggttcttact tcatgtacag caagctgaga gtggaaaaga agaactgggt ggaaagaaat 1260
agctactcct gttcagtggt ccacgagggt ctgcacaatc accacacgac taagagcttc 1320
tcccggactc cgggtaaa 1338
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 41
ggctggagtt caatgaggtt tattt 25
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 42
tccagcagat ttcagactaa gaaga 25
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 43
agaacatcat ccctgcctct actg 24
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 44
aaatgagctt gacaaagtgg tcgt 24
<210> 45
<211> 150
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 45
Met Pro Leu Ser Leu Gly Ala Glu Met Trp Gly Pro Glu Ala Trp Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Phe Thr Gly Arg Cys Pro Ala Gly
20 25 30
Glu Leu Glu Thr Ser Asp Val Val Thr Val Val Leu Gly Gln Asp Ala
35 40 45
Lys Leu Pro Cys Phe Tyr Arg Gly Asp Ser Gly Glu Gln Val Gly Gln
50 55 60
Val Ala Trp Ala Arg Val Asp Ala Gly Glu Gly Ala Gln Glu Leu Ala
65 70 75 80
Leu Leu His Ser Lys Tyr Gly Leu His Val Ser Pro Ala Tyr Glu Gly
85 90 95
Arg Val Glu Gln Pro Pro Pro Pro Arg Asn Pro Leu Asp Gly Ser Val
100 105 110
Leu Leu Arg Asn Ala Val Gln Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Glu Cys Arg
115 120 125
Val Ser Thr Phe Pro Ala Gly Ser Phe Gln Ala Arg Leu Arg Leu Arg
130 135 140
Val Leu Val Pro Pro Leu
145 150
<210> 46
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 46
Ala Gly Glu Leu Glu Thr Ser Asp Val Val Thr Val Val Leu Gly Gln
1 5 10 15
Asp Ala Lys Leu Pro Cys Phe Tyr Arg Gly Asp Ser Gly Glu Gln Val
20 25 30
Gly Gln Val Ala Trp Ala Arg Val Asp Ala Gly Glu Gly Ala Gln Glu
35 40 45
Leu Ala Leu Leu His Ser Lys Tyr Gly Leu His Val Ser Pro Ala Tyr
50 55 60
Glu Gly Arg Val Glu Gln Pro Pro Pro Pro Arg Asn Pro Leu Asp Gly
65 70 75 80
Ser Val Leu Leu Arg Asn Ala Val Gln Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Glu
85 90 95
Cys Arg Val Ser Thr Phe Pro Ala Gly Ser Phe Gln Ala Arg Leu Arg
100 105 110
Leu Arg Val Leu Val Pro Pro Leu
115 120

Claims (96)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其
(a)结合轻链可变区(VL)具有氨基酸序列SEQ ID NO:3且重链可变区(VH)具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的抗体识别的人柄蛋白-4的表位；
或
(b)与VL具有氨基酸序列SEQ ID NO:3且VH具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的抗体竞争结合人柄蛋白-4。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其结合柄蛋白-4，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)轻链可变区(VL)，其包含表1所示的VL互补决定区1(CDR1)、VL CDR2和VL CDR3；和/或
(b)重链可变区(VH)，其包含表1所示的VH互补决定区1(CDR1)、VH CDR2和VH CDR3。
3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)轻链可变区(VL)，其还包含表2所示的VL框架1(FR1)、VL FR2、VL FR3和VL FR4；和/或
(b)重链可变区(VH)，其还包含表2所示的VH框架1(FR1)、VH FR2、VH FR3和VH FR4。
4.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)轻链可变区(VL)，其包含：
(1)具有选自SEQ ID NO:7和8的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有选自SEQ ID NO:9、10和11的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有选自SEQ ID NO:12和13的氨基酸序列的VL CDR3；和
(b)轻链可变区(VH)，其包含：
(1)具有选自SEQ ID NO:14、15、16和17的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有选自SEQ ID NO:18、19、20和21的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有选自SEQ ID NO:22、23和24的氨基酸序列的VH CDR3。
5.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:7、10和12，而所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:15、19和23，其中所述VL和VH CDR序列根据Kabat CDR定义确定。
6.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段具有含氨基酸序列SEQ ID NO:3的VL。
7.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段具有含氨基酸序列SEQ ID NO:4的VH。
8.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段具有：
(a)含氨基酸序列SEQ ID NO:3的VL；和
(b)含氨基酸序列SEQ ID NO:4的VH。
9.如权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含小鼠IgG2 Fc、人IgG1 Fc区或其突变体。
10.如权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段具有含氨基酸序列SEQ ID NO:35的重链Fc区。
11.如权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段还具有含氨基酸序列SEQ ID NO:33的轻链恒定区。
12.如权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段具有：
(a)含氨基酸序列SEQ ID NO:33的轻链恒定区；和
(b)含氨基酸序列SEQ ID NO:35的重链Fc区。
13.如权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段具有含氨基酸序列SEQ ID NO:5的轻链。
14.如权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段具有含氨基酸序列SEQ ID NO:6的重链重链含有。
15.如权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段具有：
(a)含氨基酸序列SEQ ID NO:5的轻链；和
(b)含氨基酸序列SEQ ID NO:6的重链。
16.如权利要求1-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，当与柄蛋白-4结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基31-346中的至少一个，氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基1-150中的至少一个，或氨基酸序列SEQ ID NO:1内残基31-150中的至少一个。
17.如权利要求1-16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合表达柄蛋白-4的细胞。
18.如权利要求17所述的抗体或其抗原结合片段，其中，结合阴性对照的所述抗体或其抗原结合片段的相对量是结合阳性对照的所述抗体或其抗原结合片段的量的约10％、5％、1％、0.5％或更少。
19.如权利要求18所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述阴性或阳性对照中的柄蛋白-4表达独立地通过qPCR试验、使用二抗的免疫组织化学试验、使用二抗的免疫印迹试验、使用二抗的荧光激活的细胞分选(FACS)试验或使用二抗的酶联免疫吸附试验(ELISA)确定。
20.如权利要求18所述的抗体或其抗原结合片段，其中，结合细胞的所述抗体或其抗原结合片段的量通过免疫组织化学试验、免疫印迹试验、荧光激活的细胞分选(FACS)试验或酶联免疫吸附试验(ELISA)确定。
21.如权利要求17-20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述细胞包含来自组织的癌细胞。
22.如权利要求21所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段结合所述癌细胞的水平高于结合参照细胞。
23.如权利要求22所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述参照细胞包含来自同一组织的非癌细胞。
24.如权利要求17-23中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述组织包含来自膀胱，输尿管，乳房，肺，结肠，直肠，卵巢，输卵管，食道，子宫颈，子宫内膜，皮肤，喉，骨髓，唾液腺，肾脏，前列腺，脑，脊髓，胎盘，肾上腺，胰腺，甲状旁腺，垂体，睾丸，甲状腺，脾脏，扁桃体，胸腺，心脏，胃，小肠，肝脏，骨骼肌，周围神经，间皮或眼睛的组织。
25.如权利要求17-24中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段的结合特异性在免疫组织化学试验中确定。
26.如权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段并不特异性地结合柄蛋白-4阴性对照。
27.如权利要求1-26中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体是单克隆抗体。
28.如权利要求1-27中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体是人源化、人或嵌合抗体。
29.如权利要求28所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述人源化抗体是去免疫化抗体或复合人抗体。
30.如权利要求1-29中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、双抗体、三抗体、四抗体或由抗体片段形成的多特异性抗体。
31.如权利要求1-30中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，位于第一残基的谷氨酰胺被焦谷氨酸取代。
32.一种含有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码权利要求1-31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的VH、VL或VH和VL两者。
33.一种含有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码权利要求1-31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重链、轻链或重链和轻链两者。
34.如权利要求32或33所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸操作性地连接启动子。
35.一种包含权利要求32或33所述的多核苷酸的载体。
36.一种包含权利要求32-34中任一项所述的多核苷酸的细胞。
37.一种包含权利要求35所述的载体的细胞。
38.一种产生权利要求1-31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的分离细胞。
39.一种制备特异性结合人柄蛋白-4表位的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括培养权利要求36-38中任一项所述的细胞以表达所述抗体或其抗原结合片段。
40.一种制备特异性结合人柄蛋白-4表位的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括表达权利要求32-34中任一项所述的多核苷酸。
41.一种包含权利要求1-31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的试剂盒。
42.一种用于预测癌症患者对包含权利要求1-31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的抗癌治疗的响应性的试剂盒，其中，如果来自所述患者的癌细胞对柄蛋白-4表达呈阳性，预测所述癌症患者对所述抗癌治疗具有响应性。
43.一种用于预测癌症患者对包含权利要求1-31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的抗癌治疗的响应性的试剂盒，用于确定来自所述癌症患者的组织样品中柄蛋白-4的表达，其中，如果所述组织样品中的柄蛋白-4的表达水平高于柄蛋白-4的参照表达水平，预测所述癌症患者对所述抗癌治疗具有响应性。
44.如权利要求41-43中任一项所述的试剂盒，其还包括信号扩增系统。
45.如权利要求41-44中任一项所述的试剂盒，其还包括参照样品集合。
46.如权利要求41-45中任一项所述的试剂盒，其还包括对照抗体。
47.一种用于评估来自疑似患有癌症的患者的组织样品中柄蛋白-4表达的方法，其包括：
(a)将所述组织样品与权利要求1-31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；
(b)检测所述抗体或其抗原结合片段与所述组织样品的结合；
(c)确定所述组织样品中柄蛋白-4的表达，其中，所述组织样品中的柄蛋白-4的表达水平与柄蛋白-4的参照表达水平进行比较。
48.如权利要求47所述的方法，其中，所述癌症是选自下组的癌症：子宫内膜癌，尿路上皮癌，膀胱癌，输尿管癌，尿道癌，肺癌，卵巢癌，乳腺癌，食道癌，胰腺癌，头颈癌，前列腺癌，阴茎癌，肛门癌，外阴癌，脐尿管癌症和表达柄蛋白-4的其他上皮源性癌症。
49.如权利要求47或48所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的参照表达水平是所述对象的非癌性细胞或来自第二对象的非癌性细胞中的柄蛋白-4表达水平。
50.如权利要求47-49所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的参照表达水平是阴性对照中的柄蛋白-4表达水平，其中，所述阴性对照中的柄蛋白-4表达独立地通过qPCR试验、使用二抗的免疫组织化学试验、使用二抗的免疫印迹试验、使用二抗的荧光激活的细胞分选(FACS)试验或使用二抗的酶联免疫吸附试验(ELISA)确定。
51.如权利要求50所述的方法，其中，结合阴性对照的所述抗体或其抗原结合片段的相对量是结合表达柄蛋白-4的样品细胞的所述抗体或其抗原结合片段的量的约10％、5％、1％或更少。
52.如权利要求47-49所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的参照表达水平是阳性对照中的柄蛋白-4表达水平，其中，所述阳性对照中的柄蛋白-4表达独立地通过qPCR试验、使用二抗的免疫组织化学试验、使用二抗的免疫印迹试验、使用二抗的荧光激活的细胞分选(FACS)试验或使用二抗的酶联免疫吸附试验(ELISA)确定。
53.如权利要求47-52中任一项所述的方法，其中，所述组织包括来自膀胱，输尿管，乳房，肺，结肠，直肠，卵巢，输卵管，食道，子宫颈，子宫内膜，皮肤，喉，骨髓，唾液腺，肾脏，前列腺，脑，脊髓，胎盘，肾上腺，胰腺，甲状旁腺，垂体，睾丸，甲状腺，脾脏，扁桃体，胸腺，心脏，胃，小肠，肝脏，骨骼肌，周围神经，间皮或眼睛的组织。
54.如权利要求47-53中任一项所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的表达水平使用免疫组织化学(IHC)方法、免疫印迹试验、荧光激活的细胞分选(FACS)试验或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。
55.如权利要求54所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的表达水平使用信号扩增系统检测。
56.如权利要求47-55中任一项所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的表达水平使用下述内容确定：分类系统，评分系统，柄蛋白-4表达与至少一种参照蛋白的表达的比例，所述分类或评分系统中的细胞百分比，柄蛋白-4染色信号的定量测量值或使用所述分类、评分、比例、百分比和定量测量值的一种或多种作为输入的数学函数的结果。
57.如权利要求47-56中任一项所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的表达水平基于所述柄蛋白-4表达的H-评分或所述H-评分的分类确定。
58.如权利要求47-57中任一项所述的方法，其还包括在将所述组织样品与所述抗体或其所述抗原结合片段接触之前，通过热诱导的表位修复(HIER)修复柄蛋白-4的表位的步骤。
59.一种用于评估来自疑似患有癌症的患者的组织样品中柄蛋白-4表达的方法，其包括：
(a)在所述组织样品上用权利要求1-31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段进行免疫组织化学试验；
(b)确定所述组织样品中的柄蛋白-4的表达。
60.如权利要求59所述的方法，其中，所述组织样品中柄蛋白-4的表达水平与柄蛋白-4的参照表达水平进行比较。
61.如权利要求59或60所述的方法，其中，所述癌症是选自下组的癌症：子宫内膜癌，尿路上皮癌，膀胱癌，输尿管癌，尿道癌，肺癌，卵巢癌，乳腺癌，食道癌，胰腺癌，头颈癌，前列腺癌，阴茎癌，肛门癌，外阴癌，脐尿管癌症和表达柄蛋白-4的其他上皮源性癌症。
62.如权利要求59-61中任一项所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的参照表达水平是所述对象的非癌性细胞或来自第二对象的非癌性细胞中的柄蛋白-4表达水平。
63.如权利要求59-62所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的参照表达水平是阴性对照中的柄蛋白-4表达水平，其中，所述阴性对照中的柄蛋白-4表达独立地通过qPCR试验、使用二抗的免疫组织化学试验、使用二抗的免疫印迹试验、使用二抗的荧光激活的细胞分选(FACS)试验或使用二抗的酶联免疫吸附试验(ELISA)确定。
64.如权利要求63所述的方法，其中，结合阴性对照的所述抗体或其抗原结合片段的相对量是结合表达柄蛋白-4的样品细胞的所述抗体或其抗原结合片段的量的约10％、5％、1％或更少。
65.如权利要求59-62所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的参照表达水平是阳性对照中的柄蛋白-4表达水平，其中，所述阳性对照中的柄蛋白-4表达独立地通过qPCR试验、使用二抗的免疫组织化学试验、使用二抗的免疫印迹试验、使用二抗的荧光激活的细胞分选(FACS)试验或使用二抗的酶联免疫吸附试验(ELISA)确定。
66.如权利要求59-65中任一项所述的方法，其中，所述组织包括来自膀胱，输尿管，乳房，肺，结肠，直肠，卵巢，输卵管，食道，子宫颈，子宫内膜，皮肤，喉，骨髓，唾液腺，肾脏，前列腺，脑，脊髓，胎盘，肾上腺，胰腺，甲状旁腺，垂体，睾丸，甲状腺，脾脏，扁桃体，胸腺，心脏，胃，小肠，肝脏，骨骼肌，周围神经，间皮或眼睛的组织。
67.如权利要求59-66所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的表达水平使用信号扩增系统检测。
68.如权利要求59-67中任一项所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的表达水平使用下述内容确定：分类系统，评分系统，柄蛋白-4表达与至少一种参照蛋白的表达的比例，所述分类或评分系统中的细胞百分比，柄蛋白-4染色信号的定量测量值或使用所述分类、评分、比例、百分比和定量测量值的一种或多种作为输入的数学函数的结果。
69.如权利要求59-68中任一项所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的表达水平基于所述柄蛋白-4表达的H-评分或所述H-评分的分类确定。
70.如权利要求59-69中任一项所述的方法，其还包括在确定柄蛋白-4的表达水平之前，通过热诱导的表位修复(HIER)修复柄蛋白-4的表位的步骤。
71.一种用于评估癌症患者对抗癌治疗剂的响应性的方法，所述方法基于来自所述患者的组织样品中的柄蛋白-4表达，其包括：
(a)将所述组织样品与权利要求1-31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；
(b)检测所述抗体或其抗原结合片段与所述组织样品的结合；
(c)确定所述组织样品中所述柄蛋白-4的表达水平，其中，所述组织样品中的柄蛋白-4的表达水平与柄蛋白-4的参照表达水平进行比较；
其中，柄蛋白-4的表达水平相较于所述参照的增加指示对所述抗癌治疗的响应性。
72.如权利要求71所述的方法，其中，所述抗癌治疗剂包含抗-柄蛋白-4抗体或抗-柄蛋白-4抗体的抗体药物偶联物。
73.如权利要求71或72所述的方法，其中，所述癌症是选自下组的癌症：子宫内膜癌，尿路上皮癌，膀胱癌，输尿管癌，尿道癌，肺癌，卵巢癌，乳腺癌，食道癌，胰腺癌，头颈癌，前列腺癌，阴茎癌，肛门癌，外阴癌，脐尿管癌症和表达柄蛋白-4的其他上皮源性癌症。
74.如权利要求71-73中任一项所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的参照表达水平是所述对象的非癌性细胞或来自第二对象的非癌性细胞中的柄蛋白-4表达水平。
75.如权利要求71-74所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的参照表达水平是阴性对照中的柄蛋白-4表达水平，其中，所述阴性对照中的柄蛋白-4表达独立地通过qPCR试验、使用二抗的免疫组织化学试验、使用二抗的免疫印迹试验、使用二抗的荧光激活的细胞分选(FACS)试验或使用二抗的酶联免疫吸附试验(ELISA)确定。
76.如权利要求75所述的方法，其中，结合阴性对照的所述抗体或其抗原结合片段的相对量是结合表达柄蛋白-4的样品细胞的所述抗体或其抗原结合片段的量的约10％、5％、1％或更少。
77.如权利要求71-74所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的参照表达水平是阳性对照中的柄蛋白-4表达水平，其中，所述阳性对照中的柄蛋白-4表达独立地通过qPCR试验、使用二抗的免疫组织化学试验、使用二抗的免疫印迹试验、使用二抗的荧光激活的细胞分选(FACS)试验或使用二抗的酶联免疫吸附试验(ELISA)确定。
78.如权利要求71-77中任一项所述的方法，其中，所述组织包括来自膀胱，输尿管，乳房，肺，结肠，直肠，卵巢，输卵管，食道，子宫颈，子宫内膜，皮肤，喉，骨髓，唾液腺，肾脏，前列腺，脑，脊髓，胎盘，肾上腺，胰腺，甲状旁腺，垂体，睾丸，甲状腺，脾脏，扁桃体，胸腺，心脏，胃，小肠，肝脏，骨骼肌，周围神经，间皮或眼睛的组织。
79.如权利要求71-78中任一项所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的表达水平使用免疫组织化学(IHC)方法、免疫印迹试验、荧光激活的细胞分选(FACS)试验或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。
80.如权利要求71-79所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的表达水平使用信号扩增系统检测。
81.如权利要求71-80中任一项所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的表达水平使用下述内容确定：分类系统，评分系统，柄蛋白-4表达与至少一种参照蛋白的表达的比例，所述分类或评分系统中的细胞百分比，柄蛋白-4染色信号的定量测量值或使用所述分类、评分、比例、百分比和定量测量值的一种或多种作为输入的数学函数的结果。
82.如权利要求71-81中任一项所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的表达水平基于所述柄蛋白-4表达的H-评分或所述H-评分的分类确定。
83.如权利要求71-82中任一项所述的方法，其还包括在确定柄蛋白-4的表达水平之前，通过热诱导的表位修复(HIER)修复柄蛋白-4的表位的步骤。
84.一种用于评估癌症患者对抗癌治疗剂的响应性的方法，所述方法基于来自所述患者的组织样品中的柄蛋白-4表达，其包括：
(a)在所述组织样品上用权利要求1-31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段进行免疫组织化学试验；
(b)确定所述组织样品中所述柄蛋白-4的表达水平，其中，所述组织样品中的柄蛋白-4的表达水平与柄蛋白-4的参照表达水平进行比较，其中，所述组织样品中柄蛋白-4的表达水平相较于所述参照的增加指示对所述抗癌治疗的响应性。
85.如权利要求84所述的方法，其中，所述抗癌治疗剂包含抗-柄蛋白-4抗体或抗-柄蛋白-4抗体的抗体药物偶联物。
86.如权利要求84或85所述的方法，其中，所述癌症是选自下组的癌症：子宫内膜癌，尿路上皮癌，膀胱癌，输尿管癌，尿道癌，肺癌，卵巢癌，乳腺癌，食道癌，胰腺癌，头颈癌，前列腺癌，阴茎癌，肛门癌，外阴癌，脐尿管癌症和表达柄蛋白-4的其他上皮源性癌症。
87.如权利要求84-86中任一项所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的参照表达水平是所述对象的非癌性细胞或来自第二对象的非癌性细胞中的柄蛋白-4表达水平。
88.如权利要求84-87所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的参照表达水平是阴性对照中的柄蛋白-4表达水平，其中，所述阴性对照中的柄蛋白-4表达独立地通过qPCR试验、使用二抗的免疫组织化学试验、使用二抗的免疫印迹试验、使用二抗的荧光激活的细胞分选(FACS)试验或使用二抗的酶联免疫吸附试验(ELISA)确定。
89.如权利要求88所述的方法，其中，结合阴性对照的所述抗体或其抗原结合片段的相对量是结合表达柄蛋白-4的样品细胞的所述抗体或其抗原结合片段的量的约10％、5％、1％或更少。
90.如权利要求84-87所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的参照表达水平是阳性对照中的柄蛋白-4表达水平，其中，所述阳性对照中的柄蛋白-4表达独立地通过qPCR试验、使用二抗的免疫组织化学试验、使用二抗的免疫印迹试验、使用二抗的荧光激活的细胞分选(FACS)试验或使用二抗的酶联免疫吸附试验(ELISA)确定。
91.如权利要求84-90中任一项所述的方法，其中，所述组织包括来自膀胱，输尿管，乳房，肺，结肠，直肠，卵巢，输卵管，食道，子宫颈，子宫内膜，皮肤，喉，骨髓，唾液腺，肾脏，前列腺，脑，脊髓，胎盘，肾上腺，胰腺，甲状旁腺，垂体，睾丸，甲状腺，脾脏，扁桃体，胸腺，心脏，胃，小肠，肝脏，骨骼肌，周围神经，间皮或眼睛的组织。
92.如权利要求84-91所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的表达水平使用信号扩增系统检测。
93.如权利要求84-92中任一项所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的表达水平使用下述内容确定：分类系统，评分系统，柄蛋白-4表达与至少一种参照蛋白的表达的比例，所述分类或评分系统中的细胞百分比，柄蛋白-4染色信号的定量测量值或使用所述分类、评分、比例、百分比和定量测量值的一种或多种作为输入的数学函数的结果。
94.如权利要求84-93中任一项所述的方法，其中，所述柄蛋白-4的表达水平基于所述柄蛋白-4表达的H-评分或所述H-评分的分类确定。
95.如权利要求84-94中任一项所述的方法，其还包括在确定柄蛋白-4的表达水平之前，通过热诱导的表位修复(HIER)修复柄蛋白-4的表位的步骤。
96.如权利要求47-95中任一项所述的方法，其中，所述对象是人对象。
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