CN115768798A - 条件活性抗粘附分子-4(nectin-4)抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供特异性结合到粘附分子‑4蛋白质的具有重链可变区及/或轻链可变区的分离多肽，以及结合到粘附分子‑4蛋白质的含有所述重链可变区及/或所述轻链可变区的抗体及抗体片段。还提供包括所述多肽及含有所述多肽的抗体及抗体片段的药物组合物及试剂盒。

Description

条件活性抗粘附分子-4(NECTIN-4)抗体
技术领域
本发明涉及抗粘附分子-4抗体、抗粘附分子-4抗体片段、抗粘附分子-4多特异性抗体、此类抗体及抗体片段的免疫结合物及这些抗体、抗体片段、多特异性抗体及免疫结合物于药物组合物以及诊断及治疗方法中的用途。
背景技术
粘附分子-4为包括四个成员的属于粘附分子蛋白质家族的表面分子。粘附分子为在各种生物过程中起重要作用的细胞粘附分子，所述生物过程例如上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞及神经元细胞在发育及成人寿命期间的极性、增殖、分化及迁移。粘附分子涉及人类的若干病理性过程。粘附分子为脊髓灰质炎、单纯性疱疹及麻疹病毒的主要受体。编码粘附分子-1(PVRL1)或粘附分子-4(PVRL4)的基因的突变引起与其它异常相关的外胚层发育异常症候群。粘附分子-4是在胎儿发育期间表达。在成人组织中，其表达比其它家族成员的表达更受限。
粘附分子-4为各别30％、49％及86％的乳癌、卵巢癌及肺癌中的肿瘤相关抗原。粘附分子-4通常与侵袭性肿瘤相关。在乳房肿瘤中，粘附分子-4主要表达于三阴性癌瘤中。在患有这些癌症的患者的血清中，可溶性形式的粘附分子-4的检测与不良预后相关。血清粘附分子-4的含量在转移性进展期间增加且在治疗之后减少。这些结果表明粘附分子-4可为用于治疗癌症的可靠靶标。
因此，若干抗粘附分子-4抗体在现有技术中已有描述。特定地说，恩诺单抗维多汀(Enfortumab Vedotin)(ASG-22ME)为靶向粘附分子-4的抗体-药物结合物(ADC)且当前用于治疗患有物理肿瘤的患者的临床研究中。
本发明旨在提供具有减少或最小的副作用的抗粘附分子-4抗体或抗体片段，其适于治疗及诊断使用，尤其是癌症的诊断及治疗。这些抗粘附分子-4抗体或抗体片段中的一些在肿瘤微环境中与粘附分子-4的结合或结合亲和力可高于与非肿瘤微环境中存在的粘附分子-4的结合或结合亲和力。这些抗粘附分子-4抗体或抗体片段通常具有至少与已知抗粘附分子-4抗体相当的功效。另外，相较于所属领域中已知的与正常组织(例如非肿瘤微环境)中的粘附分子-4具有相对较低结合亲和力的单克隆抗粘附分子-4抗体，本发明抗粘附分子-4抗体或抗体片段可展现减少的副作用。这些优势可提供对肿瘤中表达的粘附分子-4的更具选择性靶向，且由于所述抗体针对肿瘤微环境中存在的粘附分子-4具有选择性，故可允许使用较高剂量的这些抗粘附分子-4抗体或抗体片段，由此可实现更有效的治疗性治疗而不会相应地增加不良副作用。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种特异性结合到粘附分子-4的分离多肽。所述多肽包括重链可变区，所述重链可变区包含三个具有序列H1、H2及H3的互补决定区(CDR)，其中：
H1序列为GFTFSSYNX1N(SEQ ID NO:1)；
H2序列为YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:2)；及
H3序列为AYYYGX2DX3(SEQ ID NO:3)；
其中X1为M或D；X2为M或D；X3为V或K，限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ IDNO:18及31的组合。(以下称“段落A”)
在另一方面中，本发明包含由上述分离多肽中的任一者与包括轻链可变区的分离多肽的组合形成的产物，所述轻链可变区包含三个具有序列L1、L2、及L3的CDR，其中：
L1序列为X4ASQGISGWX5A(SEQ ID NO:4)；
L2序列为AASTLQS(SEQ ID NO:5)；及
L3序列为QQANSX6PX7T(SEQ ID NO:6)，
其中X4为R或H；X5为L或E；X6为F或E；且X7为P或D，且限制条件为X1、X2、X3、X4、X5、X6及X7不能同时分别为M、M、V、R、L、F及P。
在另一方面，本发明提供特异性结合到粘附分子-4，或尤其人类粘附分子-4蛋白质的包括重链可变区及轻链可变区的分离多肽，其中重链可变区包含三个具有序列H1、H2、及H3的互补决定区，其中：
H1序列为GFTFSSYNX1N(SEQ ID NO:1)；
H2序列为YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:2)；及
H3序列为AYYYGX2DX3(SEQ ID NO:3)；
其中X1为M或D；X2为M或D；X3为V或K；且
轻链可变区包含三个具有序列L1、L2及L3的互补决定区，其中：
L1序列为X4ASQGISGWX5A(SEQ ID NO:4)；
L2序列为AASTLQS(SEQ ID NO:5)；及
L3序列为QQANSX6PX7T(SEQ ID NO:6)，
其中X4为R或H；X5为L或E；X6为F或E；且X7为P或D；且限制条件为X1、X2、X3、X4、X5、X6及X7不能同时分别为M、M、V、R、L、F及P，限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ ID NO:18及31的组合。(以下称“段落B”)
在以上段落A到段落B中的前述实施例中的每一者中，H1序列可选自GFTFSSYNMN(SEQ ID NO:7)及GFTFSSYNDN(SEQ ID NO:8)。H3序列可选自AYYYGMDV(SEQ ID NO:9)、AYYYGDDV(SEQ ID NO:10)及AYYYGMDK(SEQ ID NO:11)。(以下称“段落C”)
在以上段落A到段落C的前述实施例中的每一者中，L1序列可选自RASQGISGWLA(SEQ ID NO:12)、RASQGISGWEA(SEQ ID NO:13)及HASQGISGWLA(SEQ ID NO:14)。L3序列可选自QQANSFPPT(SEQ ID NO:15)、QQANSEPPT(SEQ ID NO:16)及QQANSFPDT(SEQ ID NO:17)。(以下称“段落D”)
在以上段落A到段落D的前述实施例中的每一者中，分离多肽可包括重链可变区，所述重链可变区具有选自SEQ ID NO:18到30的序列。(以下称“段落E”)
在以上段落A到段落E的前述实施例中的每一者中，分离多肽可包括轻链可变区，所述轻链可变区具有选自SEQ ID NO:31到43的序列。
在另一实施例中，本发明的分离多肽包括具有选自以下的任一序列对的重链可变区及轻链可变区：SEQ ID NO:19及32、SEQ ID NO:20及33、SEQ ID NO:21及34、SEQ ID NO:22及35、SEQ ID NO:23及36、SEQ ID NO:24及37、SEQ ID NO:25及38、SEQ ID NO:26及39、SEQ ID NO:27及40、SEQ ID NO:28及41，及SEQ ID NO:29及42。
在另一实施例中，本发明的分离多肽包括重链可变区及轻链可变区，各区独立地与选自SEQ ID NO:18到30中的一者与SEQ ID NO:31到43中的一者的氨基酸序列的组合具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性；限制条件为重链及轻链可变区不为SEQID NO:18及31的组合；且所述分离多肽特异性结合到人类粘附分子-4蛋白质。
在另一实施例中，本发明的分离多肽包括重链可变区及轻链可变区，各区独立地与各别地选自以下的氨基酸序列对具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性：SEQ ID NO:19及32、SEQ ID NO:20及33、SEQ ID NO:21及34、SEQ ID NO:22及35、SEQ IDNO:23及36、SEQ ID NO:24及37、SEQ ID NO:25及38、SEQ ID NO:26及39、SEQ ID NO:27及40、SEQ ID NO:28及41，及SEQ ID NO:29及42；限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ IDNO:18及31的组合且所述分离多肽特异性结合到人类粘附分子-4蛋白质。(以下称“段落F”)
在段落A到段落F的前述实施例中的每一者中，分离多肽可为特异性结合到粘附分子-4，或尤其人类粘附分子-4蛋白质的抗体或抗体片段。
在又一方面，分离多肽为多特异性的且特异性地结合到粘附分子-4，或尤其人类粘附分子-4蛋白质及CD3，且分离多肽包括重链可变区及轻链可变区，其中重链可变区包含三个具有序列H1、H2、及H3的互补决定区，其中：
H1序列是选自SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8，
H2序列为SEQ ID NO:2，及
H3序列是选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11；且
轻链可变区包含三个具有序列L1、L2及L3的互补决定区，其中：
L1序列为X4ASQGISGWX5A(SEQ ID NO:4)；
L2序列为AASTLQS(SEQ ID NO:5)；及
L3序列为QQANSX6PX7T(SEQ ID NO:6)，
其中X4为R或H；X5为L或E；X6为F或E；且X7为P或D，且限制条件为X1、X2、X3、X4、X5、X6及X7不能同时分别为M、M、V、R、L、F及P，及
六个抗CD3互补决定区L4、L5、L6、L7、L8及L9，其中：
L4序列为GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:44)，
L5序列为RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:45)，
L6序列为HX11NFX12NSX13VSWFX14Y(SEQ ID NO:46)，
L7序列为RSSTGAVTTSNYX15N(SEQ ID NO:47)，
L8序列为GTNKRAP(SEQ ID NO:48)，及
L9序列为ALWYSNLWV(SEQ ID NO:49)，
其中X11为G或S，X12为G或P，X13为Y或K，X14为A或Q且X15为A或D。(以下称“段落G”)
在段落G的具有九个CDR的分离多肽的另一个方面，L6序列是选自SEQ ID NO:50到53中的任一者，且L7序列是选自SEQ ID NO:54及55。(以下称为“段落H”)
在一优选方面，段落G到段落H的具有九个CDR的分离多肽包括重链可变区，所述重链可变区包含三个互补决定区H1、H2及H3，其中：
H1序列是选自SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8，
H2序列为SEQ ID NO:2，及
H3序列是选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11；且
轻链可变区包含三个具有序列L1、L2及L3的互补决定区，其中：
L1序列是选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14，
L2序列为SEQ ID NO:5，
L3序列是选自SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17，及
六个抗CD3互补决定区L4、L5、L6、L7、L8及L9，其中：
L4序列为GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:44)，
L5序列为RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:45)，
L6序列是选自HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:50)、HSNFGNSKVSWFAY(SEQ ID NO:51)、HGNFPNSKVSWFQY(SEQ ID NO:52)及HSNFGNSKVSWFAY(SEQ ID NO:53)，
L7序列是选自RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:54)及RSSTGAVTTSNYDN(SEQ ID NO:55)，
L8序列为GTNKRAP(SEQ ID NO:48)，及
L9序列为ALWYSNLWV(SEQ ID NO:49)。(以下称“段落I”)
在另一优选方面，段落G到段落I的具有九个CDR的分离多肽包括重链可变区，所述重链可变区包含三个互补决定区H1、H2及H3，其中：
H1序列为SEQ ID NO:7，
H2序列为SEQ ID NO:2，及
H3序列是选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11；且
轻链可变区包含三个具有序列L1、L2及L3的互补决定区，其中：
L1序列是选自SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13，
L2序列为SEQ ID NO:5，
L3序列为SEQ ID NO:15，及六个抗-CD3互补决定区L4、L5、L6、L7、L8及L9，其中：
L4序列为GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:44)，
L5序列为RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:45)，
L6序列是选自HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:50)、HSNFGNSKVSWFAY(SEQ ID NO:51)、HGNFPNSKVSWFQY(SEQ ID NO:52)及HSNFGNSKVSWFAY(SEQ ID NO:53)，
L7序列是选自RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:54)及RSSTGAVTTSNYDN(SEQ ID NO:55)，
L8序列为GTNKRAP(SEQ ID NO:48)，及
L9序列为ALWYSNLWV(SEQ ID NO:49)。(以下称“段落J”)
在段落G到段落J的前述实施例中的每一者中，分离多肽可包括重链可变区，所述重链可变区具有选自SEQ ID NO:18、25、27及29的序列。(以下称“段落K”)
在段落G到段落K的前述实施例中的每一者中，分离多肽可包括轻链可变区，所述轻链可变区具有选自SEQ ID NO:56到60的序列，限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ IDNO:18及56的组合。
分离多肽可包括具有选自SEQ ID NO:18、25、27及29的序列的重链可变区及具有选自SEQ ID NO:56到60的序列的轻链可变区，限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ IDNO:18及56的组合。
分离多肽可包括具有选自以下的任一序列对的重链可变区及轻链可变区：SEQ IDNO:25及SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:59，及SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:60。
在另一实施例中，本发明的分离多肽包括重链可变区及轻链可变区，各区独立地与选自SEQ ID NO:18、25、27及29中的一者与SEQ ID NO:56到60中的一者的氨基酸序列的组合具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性；限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ ID NO:18及56的组合；且所述分离多肽特异性结合到人类粘附分子-4蛋白质。
在另一实施例中，本发明的分离多肽包括重链可变区及轻链可变区，各区独立地与选自以下的氨基酸序列对具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性：SEQ IDNO:25及57、SEQ ID NO:27及58、SEQ ID NO:29及59、SEQ ID NO:29及60；且所述分离多肽特异性结合到人类粘附分子-4蛋白质。(以下称“段落L”)
在段落G到段落L的前述实施例中的每一者中，分离多肽可为特异性结合到粘附分子-4，尤其人类粘附分子-4蛋白质的多特异性抗体或抗体片段。(以下称“段落M”)
在段落G到段落M的一优选方面，分离多肽可为特异性结合到粘附分子-4及CD3，尤其人类粘附分子-4蛋白质及CD3的双特异性抗体或抗体片段。(以下称“段落N”)
在段落A到段落N的前述实施例中的每一者中，分离多肽或抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的条件值下与粘附分子-4蛋白质，尤其人类粘附分子-4蛋白质的结合亲和力可高于在非肿瘤微环境中存在的相同条件的不同值下的结合亲和力。在一个实施例中，条件为pH。(以下称“段落O”)
在段落A到段落O的前述实施例中的每一者中，与亲本多肽、抗体或抗体片段在pH6.0下的抗原结合活性相比，分离多肽或抗体或抗体片段在pH 6.0下可具有至少70％的相同抗原结合活性，且与亲本多肽或分离多肽或抗体或抗体片段在pH 7.4下的抗原结合活性相比，多肽或抗体或抗体片段在pH 7.4下可具有小于50％、或小于40％、或小于30％、或小于20％或小于10％的相同抗原结合活性。抗原结合活性可为与粘附分子-4蛋白质的结合。(以下称“段落P”)
在段落A到段落P的前述实施例中，分离多肽、抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的pH下与粘附分子-4蛋白质，尤其人类粘附分子-4蛋白质的结合亲和力可高于在非肿瘤微环境中存在的pH下的结合亲和力。肿瘤微环境中的pH可在5.0到6.8的范围内且非肿瘤微环境中的pH可在7.0到7.6的范围内。
在前述实施例中的每一者中，分离多肽或抗体或抗体片段的抗原结合活性可通过ELISA分析测量。
在又一方面，本发明提供一种免疫结合物，其包含上文所述的本发明的抗体或抗体片段中的任一者。在免疫结合物中，抗体或抗体片段可与选自化学治疗剂、放射性原子、细胞生长抑制剂及细胞毒性剂的药剂结合。
在又一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含上文所述的本发明的分离多肽、抗体或抗体片段，或免疫结合物中的任一者以及药学上可接受的载剂。
单剂量的药物组合物可包含量为约135mg、235mg、335mg、435mg、535mg、635mg、735mg、835mg、935mg、1035mg、1135mg、1235mg或1387mg的分离多肽、抗体、抗体片段或免疫结合物。
单剂量的药物组合物可包含量在135到235mg、235到335mg、335到435mg、435到535mg、535到635mg、635到735mg、735到835mg、835到935mg、935到1035mg、1035到1135mg、1135到1235mg或1235到1387mg范围内的分离多肽、抗体或抗体片段，或免疫结合物。
前述药物组合物中的每一者可进一步包含免疫检查点抑制剂分子。免疫检查点抑制剂分子可为针对免疫检查点的抗体或抗体片段。免疫检查点可选自LAG3、TIM3、TIGIT、VISTA、BTLA、OX40、CD40、4-1BB、CTLA4、PD-1、PD-L1、GITR、B7-H3、B7-H4、KIR、A2aR、CD27、CD70、DR3及ICOS，或免疫检查点可为CTLA4、PD-1或PD-L1。
前述药物组合物中的每一者可进一步包含针对选自以下的抗原的抗体或抗体片段：PD1、PD-L1、CTLA4、AXL、ROR2、CD3、HER2、B7-H3、ROR1、SFRP4及WNT蛋白质。WNT蛋白质可选自WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11及WNT16。
在又一方面，本发明提供一种用于诊断或治疗的试剂盒，其包含上文所描述的本发明的分离多肽、抗体或抗体片段、免疫结合物或药物组合物中的任一者。
附图说明
图1展示与连接子有效负载结合的本发明的示范性条件活性抗粘附分子-4抗体(下文中“CAB ADC”)与人类粘附分子-4在pH 6.0下的结合活性，如通过酶联免疫吸附分析(ELISA)所测量。在所述图中，BM(基准(benchmark))为与连接子有效负载结合的野生型抗体(下文“WT ADC”)。
图2展示本发明的示范性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与人类粘附分子-4在pH 7.4下的结合活性，如通过ELISA所测量。
图3展示本发明的其它示范性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与人类粘附分子-4在pH 6.0下的结合活性，如通过ELISA所测量。
图4展示本发明的其它示范性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与人类粘附分子-4在pH 7.4下的结合活性，如通过ELISA所测量。
图5展示本发明的示范性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与食蟹猕猴粘附分子-4在pH 6.0下的结合活性，如通过ELISA所测量。
图6展示本发明的其它示范性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与食蟹猕猴粘附分子-4在pH 7.4下的结合活性，如通过ELISA所测量。
图7展示本发明的示范性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与人类粘附分子-4在pH范围滴定下的结合活性，如通过ELISA所测量。
图8展示本发明的其它示范性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与人类粘附分子-4在pH范围滴定下的结合活性，如通过ELISA所测量。
图9展示本发明的示范性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与表达人类粘附分子-4的HEK293细胞在pH 6.0下的结合活性，如通过荧光活化细胞分选(FACS)所测量。
图10展示本发明的示范性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与表达人类粘附分子-4的HEK293细胞在pH 7.4下的结合活性，如通过FACS所测量。
图11展示本发明的示范性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与表达食蟹猕猴粘附分子-4的HEK293细胞在pH 6.0下的结合活性，如通过FACS所测量。
图12展示本发明的示范性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与表达食蟹猕猴粘附分子-4的HEK293细胞在pH 7.4下的结合活性，如通过FACS所测量。
图13展示本发明的示范性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与表达人类粘附分子-4的T47D细胞在pH 6.0下的结合活性，如通过FACS所测量。
图14展示本发明的示范性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与表达人类粘附分子-4的T47D细胞在pH 7.4下的结合活性，如通过FACS所测量。
图15展示本发明的其它示范性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与表达人类粘附分子-4的HEK293细胞在pH 6.0下的结合活性，如通过FACS所测量。
图16展示本发明的其它示范性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与表达人类粘附分子-4的HEK293细胞在pH 7.4下的结合活性，如通过FACS所测量。
图17展示本发明的其它示范性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与表达食蟹猕猴粘附分子-4的HEK293细胞在pH 6.0下的结合活性，如通过FACS所测量。
图18展示本发明的其它示范性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与表达食蟹猕猴粘附分子-4的HEK293细胞在pH 7.4下的结合活性，如通过FACS所测量。
图19展示本发明的其它示范性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与表达人类粘附分子-4的T47D细胞在pH 6.0下的结合活性，如通过FACS所测量。
图20展示本发明的其它示范性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与表达人类粘附分子-4的T47D细胞在pH 7.4下的结合活性，如通过FACS所测量。
图21展示条件活性抗粘附分子-4抗体BAP143-00-01、条件活性抗粘附分子-4 CABADC及WT ADC在pH 6.0及pH 7.4下针对表达人类粘附分子-4的HEK293细胞的细胞杀灭活性。
图22展示条件活性抗粘附分子-4抗体BAP143-00-02、条件活性抗粘附分子-4 CABADC及WT ADC在pH 6.0及pH 7.4下针对表达人类粘附分子-4的HEK293细胞的细胞杀灭活性。
图23展示条件活性抗粘附分子-4抗体BAP143-00-03、条件活性抗粘附分子-4 CABADC及WT ADC在pH 6.0及pH 7.4下针对表达人类粘附分子-4的HEK293细胞的细胞杀灭活性。
图24展示条件活性抗粘附分子-4抗体BAP143-00-04、条件活性抗粘附分子-4 CABADC及WT ADC在pH 6.0及pH 7.4下针对表达人类粘附分子-4的HEK293细胞的细胞杀灭活性。
图25展示条件活性抗粘附分子-4抗体BAP143-00-05、条件活性抗粘附分子-4 CABADC及WT ADC在pH 6.0及pH 7.4下针对表达人类粘附分子-4的HEK293细胞的细胞杀灭活性。
图26展示条件活性抗粘附分子-4抗体BAP143-00-06、条件活性抗粘附分子-4 CABADC及WT ADC在pH 6.0及pH 7.4下针对表达人类粘附分子-4的HEK293细胞的细胞杀灭活性。
图27展示本发明的代表性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC在pH 6.0下针对表达人类粘附分子-4的HEK293细胞的细胞杀灭活性。
图28展示本发明的代表性条件活性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC在pH 7.4下针对表达人类粘附分子-4的HEK293细胞的细胞杀灭活性。
图29展示用本发明的代表性CAB ADC及本发明的WT ADC治疗的XXT47D异种移植小鼠的肿瘤体积效应。
图30展示本发明的代表性条件活性抗粘附分子-4抗体的重链及轻链可变区及基准野生型抗体的重链及轻链可变区的蛋白质序列。
图31展示肿瘤组织及下游路径中的粘附分子-4。参见赛西C.(Sethy C.)等人，《癌症研究与临床肿瘤学杂志(J.Cancer Res.Clin.Oncol.)》,146(1)：245-259(2020)。
图32A到32C展示如通过ELISA所测量，肿瘤微环境pH中的CAB粘附分子-4×CABCD3亲和力相较于生理pH的较高结合活性(图32A)，CAB粘附分子-4×CAB CD3及WT粘附分子-4×WT CD3于pH范围6.0到7.4中的差异性结合亲和力(图32B)，及CAB粘附分子4×CABCD3相较于同型×WT CD3及WT粘附分子-6×WT CD3的活体内功效(图32C)。
图33A到33B展示本发明的代表性条件活性抗粘附分子-4×CD3双特异性抗体的重链及轻链可变区及野生型抗体的重链及轻链可变区的蛋白质序列。抗体的重链及轻链为：BA-150-19-01-01-BF1-VH(SEQ ID NO:18)、BA-150-30-33-16-BF11-VH(SEQ ID NO:25)、BA-150-30-33-16-BF19-VH(SEQ ID NO:27)、BA-150-30-03-12-BF11-VH(SEQ ID NO:29)及BA-150-30-03-12-BF19-VH(SEQ ID NO:29)；BA-150-19-01-01-BF1-LC(SEQ ID NO:56)、BA-150-30-33-16-BF11-LC(SEQ ID NO:57)、BA-150-30-33-16-BF19-LC(SEQ ID NO:58)、BA-150-30-03-12-BF11-LC(SEQ ID NO:59)及BA-150-30-03-12-BF19-LC(SEQ ID NO:60)。
具体实施方式
定义
为有助于理解本文提供的实例，某些频繁出现的术语在本文中加以定义。
结合所测量的量，如本文所用的术语“约”是指所属领域的技术人员所预期使测量及操作与测量的目的及所用测量设备的精确度在所关心的量上相匹配的测量量的正常变化。除非另外指明，否则“约”是指所提供的值的+/-10％的变化。
如本文所用，术语“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合搭配物(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对(例如，抗体与抗原)成员之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其搭配物Y的亲和力通常可由解离常量(Kd)表示。可通过所属领域中已知的常用方法(包含本文所描述的那些方法)来测量亲和力。用于测量结合亲和力的特定说明性及示范性实施例描述于下文中。
如本文所用，术语“亲和力成熟”抗体是指相较于在一或多个重链或轻链可变区不具有一或多个改变的亲本抗体，在一或多个重链或轻链可变区中具有此类改变的抗体，此类改变使抗体对抗原的亲和力改进。
如本文所使用，术语“氨基酸”是指含有氨基(--NH2)及羧基(--COOH)的任何有机化合物；其优选地呈游离基团形式或者在缩合之后作为肽键的一部分。“二十个形成天然编码的多肽的α氨基酸”在所属领域中已有所理解且是指：丙氨酸(ala或A)、精氨酸(arg或R)、天冬酰胺(asn或N)、天冬氨酸(asp或D)、半胱氨酸(cys或C)、谷氨酸(glu或E)、谷氨酰胺(gin或Q)、甘氨酸(gly或G)、组氨酸(his或H)、异白氨酸(ile或I)、白氨酸(leu或L)、赖氨酸(lys或K)、甲硫氨酸(met或M)、苯丙氨酸(phe或F)、脯氨酸(pro或P)、丝氨酸(ser或S)、苏氨酸(thr或T)、色氨酸(tip或W)、酪氨酸(tyr或Y)及缬氨酸(val或V)。
如本文所使用，术语“抗体”是指能够结合于抗原的表位的完整免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的片段，例如Fab、Fab'、(Fab′)2、Fv及SCA片段。可使用所属领域中熟知的方法(参见例如哈洛(Harlow)及莱恩(Lane)，同上)制得这些抗体片段，其保留一定选择性结合到其所源自抗体的抗原(例如多肽抗原)的能力，且如下进一步描述这些抗体片段。抗体可用于通过免疫亲和色谱法分离制备量的抗原。此类抗体的各种其它用途是诊断及/或分级疾病(例如瘤形成)且用于治疗疾病的治疗性应用，所述疾病为例如：瘤形成、自体免疫性疾病、AIDS、心血管疾病、感染及其类似疾病。嵌合抗体、人类样抗体、人类化抗体或全人类抗体尤其适用于向人类患者投予。
Fab片段由抗体分子的单价抗原结合片段组成，且可通过用番木瓜蛋白酶消化全抗体分子，产生由完整轻链及一部分重链组成的片段来制造。
抗体分子的Fab′片段可通过用胃蛋白酶处理全抗体分子，随后还原，产生由完整轻链及一部分重链组成的分子而获得。每个以此方式处理的抗体分子获得两个Fab'片段。
抗体的(Fab')2片段可由用胃蛋白酶处理整个抗体分子，不进行后续还原来获得。(Fab′)2片段是两个Fab′片段的二聚体，通过两个二硫键结合在一起。
Fv片段定义为含有轻链可变区及重链可变区且表达为两条链的经基因工程改造的片段。
如本文所使用，术语“抗体片段”是指除完整抗体外的分子，其包括完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的实例包含(但不限于)Fv、Fab、Fab′、Fab'-SH、F(ab')2；双功能抗体；直链抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所使用，术语“抗粘附分子-4抗体”、“粘附分子-4抗体”及“结合到粘附分子-4的抗体”是指能够以足够亲和力结合粘附分子-4的抗体，使得抗体适用作靶向粘附分子-4的诊断剂及/或治疗剂。在一个实施例中，抗粘附分子-4抗体与无关非粘附分子-4蛋白的结合程度小于抗体与粘附分子-4的结合的约10％，如例如通过放射免疫分析(RIA)所测量。在某些实施例中，结合到粘附分子-4的抗体的解离常数≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM或≦0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M到10-13M，例如10-9M到10-13M)。在某些实施例中，抗粘附分子-4抗体结合到在来自不同物种的粘附分子-4(例如粘附分子-4的细胞外域)中保守的粘附分子-4的表位。
术语“粘附分子-4”具有其于所属领域中的通用含义且包含人类粘附分子-4，尤其人类粘附分子-4的天然序列多肽、异构体、嵌合多肽、所有同源物、片段及前体。天然粘附分子-4的氨基酸序列包含NCBI参考序列：NP_112178.2。
如本文所使用，术语“结合”是指抗体的可变区或Fv与抗原的相互作用，其中所述相互作用视抗原上特定结构(例如抗原决定子或表位)的存在而定。举例来说，抗体可变区或Fv识别且结合到特定蛋白质结构而非一般蛋白质。如本文所使用，术语“特异性结合(specifically binding/binding specifically)”意谓抗体可变区或Fv与特定抗原以比与其它蛋白质更频繁、更快速、更大的持续时间及/或更大的亲和力结合或缔合。举例来说，抗体可变区或Fv与其抗原以比其结合于其它抗原更大的亲和力、亲合力(avidity)、更容易地及/或以更大的持续时间特异性结合。对于另一实例，抗体可变区或Fv与细胞表面蛋白质(抗原)以比其结合于相关蛋白质或其它细胞表面蛋白质或通常通过多反应性天然抗体(即通过已知结合人类中天然发现的多种抗原的天然产生的抗体)识别的抗原大体上更大的亲和力结合。然而，“特异性结合”不一定需要排他性结合或不可检测地结合另一抗原，这为术语“选择性结合”的含义。在一个实例中，抗体可变区或Fv(或其它结合区)结合于抗原的“特异性结合”意谓抗体可变区或Fv与所述抗原以l00 nM或更小，例如50nM或更小，例如20nM或更小，例如15nM或更小，或10nΜ或更小，或5nM或更小，2nM或更小，或1nM或更小的平衡常数(KD)结合。
如本文所使用，术语“癌症”及“癌性”是指或描述哺乳动物中通常特征为不受调控的细胞生长/增殖的生理病状。癌症的实例包含(但不限于)黑素瘤、癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤及白血病。这类癌症的更特定实例包含鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰脏癌、神经胶母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝肿瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病及其它淋巴增殖病症，及各种类型的头颈癌。
如本文所使用，术语“细胞增殖性病症”及“增殖性病症”是指与异常一定程度的细胞增殖相关的病症。在一个实施例中，细胞增殖性病症为癌症。
如本文所使用，术语“化学治疗剂”是指可用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包含烷基化剂，例如噻替派(thiotepa)及环磷酰胺
Figure BDA0004004183260000141
磺酸烷酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；乙烯亚胺及甲基三聚氰胺，包含六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺及三羟甲基三聚氰胺；多聚乙酰(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)，
Figure BDA0004004183260000142
β-拉帕醌(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱(colchicines)；桦木酸(betulinicacid)；喜树碱(包含合成性类似物拓朴替康(topotecan)
Figure BDA0004004183260000143
CPT-11(伊立替康，
Figure BDA0004004183260000144
)、乙酰基喜树碱、东莨菪素(scopolectin)及9-氨基喜树碱)；苔藓虫素(bryostatin)；海洋抑素(callystatin)；CC-1065(包含其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)及比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸；替尼泊甙(teniposide)；念珠藻环肽(特别是克瑞托欣(cryptophycin)1及克瑞托欣8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包含合成类似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；盘克斯塔叮(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、甲基二(氯乙基)胺、甲基二(氯乙基)胺氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、新氮芥、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素γ1I及卡奇霉素ΩI1(参见例如尼古劳(Nicolaou)等人，《应用化学国际英文版(Angew.Chem.Intl.Ed.Engl.)》，33：183-186(1994))；CDP323(一种口服α-4整合素抑制剂)；达内霉素(dynemicin)，包含达内霉素A；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团及相关色素蛋白烯二炔抗生素发色团)，阿克拉霉素(aclacinomysin)、放射菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycini)、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正白氨酸、小红莓(包含
Figure BDA0004004183260000151
吗啉基-小红莓、氰基吗啉基-小红莓、2-吡咯啉基-小红莓、小红莓HCl脂质体注入
Figure BDA0004004183260000152
脂质小红莓TLC D-99
Figure BDA0004004183260000153
聚乙二醇化脂质小红莓
Figure BDA0004004183260000154
及去氧小红莓)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾达霉素(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(例如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泼非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、奎那霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如甲氨喋呤(methotrexate)、吉西他滨(gemcitabine)
Figure BDA0004004183260000155
喃氟啶(tegafur)
Figure BDA0004004183260000161
卡培他滨(capecitabine)
Figure BDA0004004183260000162
埃坡霉素(epothilone)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如迪莫林(denopterin)、甲氨喋呤、蝶罗呤(pteropterin)及曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤及硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双去氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)及氟尿苷；雄激素,例如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；贝斯布西(bestrabucil)；比山群(bisantrene)；艾达曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾福米辛(elformithine)；依利醋铵(elliptiniumacetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；磨菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；类美登素(maytansinoid)，例如美登素(maytansine)及安丝菌素(ansamitocin)；丙脒腙；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比达摩(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure BDA0004004183260000163
多糖复合物(俄勒冈州尤金的JHS天然产品公司(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.))；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2'-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)(尤其T-2毒素、黏液霉素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)
Figure BDA0004004183260000164
达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；噻替派；紫杉醇(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)
Figure BDA0004004183260000165
太平洋紫杉醇的白蛋白工程改造的纳米粒子调配物(ABRAXANETM)及多烯紫杉醇(docetaxel)
Figure BDA0004004183260000166
苯丁酸氮芥；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂试剂，例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)(例如
Figure BDA0004004183260000167
)及卡铂(carboplatin)；长春花(vincas)，其防止微管蛋白聚合形成微管，包含长春碱(vinblastine)
Figure BDA0004004183260000168
长春新碱(vincristine)
Figure BDA0004004183260000169
长春地辛(vindesine)
Figure BDA0004004183260000171
及长春瑞宾(vinorelbine)
Figure BDA0004004183260000172
依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；甲酰四氢叶酸(leucovorin)；诺凡特龙(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine)
Figure BDA0004004183260000173
类视黄素，例如视黄酸，包含贝瑟罗汀(bexarotene)
Figure BDA0004004183260000174
双膦酸盐，例如氯屈膦酸盐(clodronate)(例如，
Figure BDA0004004183260000175
或
Figure BDA0004004183260000176
)、依替膦酸盐(etidronate)
Figure BDA0004004183260000177
NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)
Figure BDA0004004183260000178
阿仑膦酸盐(alendronate)
Figure BDA0004004183260000179
帕米膦酸盐(pamidronate)
Figure BDA00040041832600001710
替鲁膦酸盐(tiludronate)
Figure BDA00040041832600001711
或利塞膦酸盐(risedronate)
Figure BDA00040041832600001712
曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特定地说抑制基因在涉及异常细胞增殖的信号传导路径中的表达的那些，所述基因例如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，例如
Figure BDA00040041832600001713
疫苗及基因疗法疫苗，例如
Figure BDA00040041832600001714
疫苗、
Figure BDA00040041832600001715
疫苗及
Figure BDA00040041832600001716
疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如，
Figure BDA00040041832600001717
)；rmRH(例如，
Figure BDA00040041832600001718
)；BAY439006(索拉非尼(sorafenib)；Bayer)；SU-11248(舒尼替尼(sunitinib)，
Figure BDA00040041832600001719
Pfizer)；哌立福新(perifosine)、COX-2抑制剂(例如，塞内昔布(celecoxib)或依他昔布(etoricoxib))、蛋白酶体抑制剂(例如，PS341)；硼替佐米(bortezomib)
Figure BDA00040041832600001720
CCI-779；替吡法尼(tipifarnib)(R11577)；索拉非尼(orafenib)、ABT510；Bcl-2抑制剂，例如奥利默森钠(oblimersen sodium)
Figure BDA00040041832600001721
匹蒽醌(pixantrone)；EGFR抑制剂(参见以下定义)；酪氨酸激酶抑制剂(参见以下定义)；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，例如雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus)，
Figure BDA00040041832600001722
)；法呢基转移酶抑制剂，例如洛那法尼(lonafarnib)SCH6636，SARASARTM)；及以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及以上两者或更多者的组合，例如CHOP，即环磷酰胺、小红莓、长春新碱及泼尼松龙(prednisolone)的组合疗法的缩写；及FOLFOX，即使用奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU及甲酰四氢叶酸组合的治疗方案的缩写。
如本文所定义的化学治疗剂包含用来调节、减轻、阻断或抑制可促进癌症生长的激素作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”。其本身可为激素，包含(但不限于)：具有混合促效剂/拮抗剂分布的抗雌激素，包含他莫昔芬(tamoxifen)
Figure BDA0004004183260000181
4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)
Figure BDA0004004183260000182
艾多昔芬(idoxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、雷诺昔酚(raloxifene)
Figure BDA0004004183260000183
曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)及选择性雌激素受体调节剂(SERM),例如SERM3；不具有促效剂性质的纯抗雌激素，例如氟维司群(fulvestrant)
Figure BDA0004004183260000184
及EM800(此药剂可阻断雌激素受体(ER)二聚合、抑制DNA结合、增加ER转化及/或抑制ER含量)、芳香酶抑制剂，包含类固醇芳香酶抑制剂，例如福美司坦(formestane)及依西美坦(exemestane)
Figure BDA0004004183260000185
及非类固醇芳香酶抑制剂，例如阿那曲唑(anastrazole)
Figure BDA0004004183260000186
来曲唑(letrozole)
Figure BDA0004004183260000187
及氨鲁米特，及其它芳香酶抑制剂，包含伏罗唑(vorozole)
Figure BDA0004004183260000188
乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)
Figure BDA0004004183260000189
法屈唑(fadrozole)及4(5)-咪唑；黄体激素释放激素促效剂，包含亮丙立德(leuprolide)(
Figure BDA00040041832600001810
及
Figure BDA00040041832600001811
)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)及曲特瑞林(tripterelin)；性类固醇，包含助孕素，例如乙酸甲地孕酮及乙酸甲羟孕酮、雌激素，例如己烯雌酚及普雷马林(premarin)、及雄性激素/类视黄素，例如氟甲睾酮、所有反式视黄酸及非瑞替尼(fenretinide)；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮；雌激素受体下调剂(ERD)；抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁胺(nilutamide)及比卡鲁胺(bicalutamide)；及以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及以上两者或更多者的组合。
如本文所使用，术语“嵌合”抗体是指重链及/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而所述重链及/或轻链的其余部分来源于不同来源或物种的抗体。
如本文所使用，术语“条件活性抗体”是指在肿瘤微环境中的条件下比在非肿瘤微环境中的条件下更具活性的抗粘附分子-4抗体。肿瘤微环境中的条件包含相较于非肿瘤微环境更低的pH值、更高的乳酸酯及丙酮酸酯浓度、低氧、更低的葡萄糖浓度及略高的温度。举例来说，条件活性抗体在正常体温下几乎无活性，但在肿瘤微环境中的较高温度下具有活性。在又一方面，条件活性抗体在正常氧化血液中具较低活性，但在肿瘤中存在的氧化不佳的环境下更具活性。在又一方面，条件活性抗体在正常生理pH 7.0到7.6中具较低活性，但在肿瘤微环境中存在的酸性pH 5.0到6.8或6.0到6.8下更具活性。在肿瘤微环境中存在所属领域的技术人员所已知的其它条件，其也可用作使抗粘附分子-4抗体与粘附分子-4具有不同结合亲和力的本发明的条件。
如本文所使用，术语“细胞生长抑制剂”是指在活体外或活体内阻滞细胞生长的化合物或组合物。因此，细胞生长抑制剂可为显着降低S期细胞百分比的药剂。细胞生长抑制剂的其它实例包含通过诱导G0/G1停滞或M期停滞阻断细胞周期进程的药剂。人类化抗Her2抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)
Figure BDA0004004183260000191
为诱导G0/G1停滞的细胞生长抑制剂的实例。经典M期阻断剂包含长春花(vincas)(长春新碱及长春花碱(vinblastine))、紫杉烷(taxane)及II型拓扑异构酶抑制剂，例如小红莓、表柔比星、道诺霉素、依托泊苷及博莱霉素。停滞G1的某些药剂也会使S期停滞，例如DNA烷基化剂，例如他莫西芬、普赖松(prednisone)、达卡巴嗪、甲氮芥、顺铂、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶及ara-C。其它信息可见于门德尔松(Mendelsohn)及伊斯雷尔(Israel)编,《癌症的分子基础(The Molecular Basis ofCancer)》,第1章,标题为“细胞循环调节、致癌基因与抗肿瘤药物(Cell cycleregulation,oncogenes,and antineoplastic drugs)”,穆拉卡米(Murakami)等人(W.B.桑德(W.B.Saunders),Philadelphia,1995),例如第13页。紫杉烷(太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇)皆为来源于紫杉树的抗癌药物。来源于欧洲紫杉的多烯紫杉醇(
Figure BDA0004004183260000192
Rhone-Poulenc Rorer)为太平洋紫杉醇(
Figure BDA0004004183260000193
Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇促进微管自微管蛋白二聚体组装且通过防止解聚合稳定微管，其致使抑制细胞中的有丝分裂。
如本文中所使用，术语“细胞毒性剂”是指抑制或妨碍细胞功能及/或引起细胞死亡或损坏的物质。细胞毒素剂包含(但不限于)放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨喋呤、阿德力霉素(adriamicin)、长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、小红莓、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、道诺霉素或其它插入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，例如溶核酶；抗生素；毒素，例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，包含其片段及/或变体；以及下文所公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
如本文所使用，术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包括连接到同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)。通过使用过短以使得同一链上的两个域之间不能配对的连接子，迫使所述域与另一条链的互补域配对，且产生两个抗原结合位点。
如本文所使用，术语“可检测标记”是指通过物理或化学方式进行直接或间接检测或测量指示样品中抗原的存在的任何物质。适用的可检测标记的代表性实例包含(但不限于)以下：可基于吸光度、荧光、反射率、光散射、磷光或发光特性直接或间接地检测的分子或离子；可通过其放射特性检测的分子或离子；可通过其核磁共振或顺磁特性检测的分子或离子。可基于吸光度或荧光间接检测的分子组中包含例如各种酶，所述酶致使适当受质例如由非光吸收转化为光吸收分子或由非荧光转化为荧光分子。
如本文中所使用，术语“诊断”是指确定个体对疾病或病症的易感性、确定个体目前是否患有疾病或病症、患有疾病或病症的个体的预后(例如鉴别转移前或转移性癌状态、癌症的分级或癌症对疗法的反应)及治疗计量(therametrics)(例如监测个体的状况以提供关于治疗效果或功效的信息)。在一些实施例中，本发明的诊断方法尤其适用于检测早期癌症。
如本文所使用，术语“诊断剂”是指可直接或间接检测且用于诊断目的的分子。诊断剂可向个体或样品投予。可提供诊断剂本身或可与例如条件活性抗体的媒剂结合。
如本文所使用，术语“效应功能”是指可归因于抗体的Fc区的所述生物活性，其因抗体同型而异。抗体效应功能的实例包含：C1q结合及补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；及B细胞活化。
如本文所使用，术语药剂(例如药物调配物)的“有效量”是指在所需剂量及时段下有效获得所需治疗性或预防性结果的量。
如本文所使用，术语“Fc区”用以定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C端区。所述术语包含原生序列Fc区及变异Fc区。在一个实施例中，人类IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸到重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另外说明，否则Fc区或恒定区氨基酸残基的编号是依据EU编号系统，也称为EU索引，如卡巴特(Kabat)等人,《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)》,第5版，马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院公共卫生服务部(Public Health Service，National Institutes of Health,Bethesda,Md.),1991中所述。
如本文所使用，术语“构架”或“FR”是指除互补决定区(重链中的CDR或H1-3及轻链中的L1-3)残基外的可变域残基。可变域的FR一般由四个FR域组成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，在VH(或VL)中，CDR及FR序列通常依以下序列呈现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”是指包括抗原结合可变区(VH或VL)以及轻链恒定域(CL)及重链恒定域CH1、CH2及CH3的抗体。恒定域可为天然序列恒定域(例如人类天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。视其重链的恒定域的氨基酸序列而定，全长抗体可归属于不同“类别”。存在五种主要类别的全长抗体：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且这些类别中的数个类别可进一步分成“子类”(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同类别抗体的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ及μ。不同类别的免疫球蛋白的次单元结构及三维构形为熟知的。
如本文所使用，术语“功能保守性变体”是指蛋白质或酶中的给定氨基酸残基已变化，但不改变多肽的总体构形及功能，包含(但不限于)用具有类似特性(例如极性、氢键结可能性、酸性、碱性、疏水性、芳香族基团及类似特性)的氨基酸替换氨基酸。除指示为保守氨基酸外的氨基酸的蛋白质可不同，以使得如根据比对方案通过例如聚集法(ClusterMethod)所测定，具有类似功能的任何两种蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似性百分比可变化且可为例如70％到99％，其中相似性是基于MEGALIGN算法。“功能保守性变体”还包含如通过BLAST或FASTA算法所测定，具有至少60％氨基酸一致性，优选地至少75％、更优选地至少85％、又优选地至少90％且甚至更优选地至少95％氨基酸一致性且具有与其相比较的天然或亲本蛋白质相同或大体上类似的特性或功能的多肽。
如本文所使用，术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”及“宿主细胞培养物”可互换使用且是指已引入外源核酸的细胞，包含此类细胞的后代。宿主细胞包含“转型体”及“转型细胞”，其包含初代转型细胞及来源于其的后代(不考虑继代次数)。后代的核酸含量与母细胞可能不完全相同，但可能含有突变。本文包含针对原始转型细胞筛选或选择具有相同功能或生物活性的突变型子代。
如本文所使用，术语“人类抗体”为具有如下氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人类或人类细胞所产生的抗体或源自使用人类抗体谱系或其它人类抗体编码序列的非人类来源的抗体的氨基酸序列。人类抗体的此定义特定地排除包括非人类抗原结合残基的人类化抗体。
如本文所使用，术语“人类化”抗体是指包括来自非人类CDR的氨基酸残基及来自人类FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施例中，人类化抗体将包括至少一个且通常两个可变域的大体上全部，其中全部或大体上全部CDR均对应于非人类抗体的CDR，且全部或大体上全部FR皆对应于人类抗体的FR。人类化抗体任选地可包括来源于人类抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如，非人类抗体)的“人类化形式”是指已经历人类化的抗体。
如本文所使用，术语“免疫结合物”为结合于一或多个异源分子的抗体，所述(等)分子包含(但不限于)细胞毒性剂。
如本文所使用，术语“个人(individual)”或“个体(subject)”是指哺乳动物。哺乳动物包含(但不限于)家养动物(例如牛、羊、猫、狗及马)、灵长类动物(例如人类及非人类灵长类动物，例如猴)、兔及啮齿动物(例如小鼠及大鼠)。在某些实施例中，个人或个体为人类。
如本文所使用，术语“抑制细胞生长或增殖”意谓使细胞的生长或增殖减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，且包含诱导细胞死亡。
如本文所使用，术语“分离的”抗体是已自其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施例中，将抗体纯化至如通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如离子交换或逆相高效液相色谱法(HPLC))测定纯度大于95％或99％。用于评估抗体纯度的方法的综述参见例如弗莱特曼(Flatman)等人，色谱法杂志B(J.Chromatogr.B),第848卷，第79到87页，2007。
如本文所使用，术语“编码抗粘附分子-4抗体的分离核酸”是指编码抗体重链及轻链(或其片段)的一或多个核酸分子，包含单一载体或独立载体中的此类核酸分子及存在于宿主细胞中的一或多个位置处的此类核酸分子。
如本文中所使用，术语“癌转移”是指所有涉及粘附分子-4的过程，其支持癌细胞从原发性肿瘤扩散，穿透到淋巴管及/或血管中，经由血流循环及在体内其它地方的正常组织中的远端灶中生长(癌转移)。特定地说，其是指构成癌转移基础且由粘附分子-4刺激或介导的肿瘤细胞的细胞事件，例如增殖、迁移、固着非依赖性、细胞凋亡的逃避或血管生成因子的分泌。
如本文中所使用，术语“微环境”意谓组织、器官或身体的任何部分或区域，其与组织的其它区域、身体的器官或其它区域具有持久或暂时物理或化学差异。如本文所使用，对于肿瘤，术语“肿瘤微环境”是指肿瘤存在的环境，其为肿瘤内的非细胞区域及刚好处于肿瘤组织外的区域，但并不涉及癌细胞本身的细胞内隔室。肿瘤及肿瘤微环境密切相关且不断相互作用。肿瘤可改变其微环境，且微环境可影响肿瘤生长及扩散方式。通常，肿瘤微环境具有介于5.0到6.8范围内，或介于5.8到6.8范围内，或介于6.2到6.8范围内的低pH。在另一方面，标准生理pH介于7.0到7.6范围内。亦已知肿瘤微环境具有相较于血浆较低浓度的葡萄糖及其它养分，但具有较高浓度的乳酸。此外，肿瘤微环境可具有高于正常生理温度0.3℃到1℃的温度。肿瘤微环境已论述于吉利斯(Gillies)等人,“肿瘤微环境的MRI(MRIof the Tumor Microenvironment)”,《磁共振成像杂志(Journal of Magnetic ResonanceImaging)》,第16卷,第430到450页,2002中，其以全文引用的方式并入本文中。术语“非肿瘤微环境”是指除肿瘤外的部位的微环境。
如本文所使用，术语“单克隆抗体”是指从大体上均质抗体的群体获得的抗体，即除可能变异抗体(例如含有天然产生的突变或在制造单克隆抗体制剂期间出现的变异抗体，此类变体通常以较小量存在)以外，构成所述群体的个别抗体为相同的及/或结合相同表位。相比于典型地包含针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂的各单克隆抗体是针对抗原上的单一决定子。因此，修饰语“单克隆”指示抗体的特征为从大体上均质的抗体群体获得，且不应解释为需要通过任何特定方法产生所述抗体。举例来说，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制得，包含(但不限于)融合瘤方法、重组DNA方法、噬菌体呈现方法及利用含有所有或部分人类免疫球蛋白基因座的转殖基因动物的方法、本文所描述的制造单克隆抗体的此类方法及其它示范性方法。
如本文所使用，术语“裸抗体”是指不结合于异源部分(例如细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可存在于药物调配物中。
如本文所使用，术语“药品说明书”用以指通常包含于治疗性产品的商业包装中的说明书，其含有关于与使用此类治疗性产品有关的适应症、用法、剂量、投予、组合疗法、禁忌症及/或警告的信息。
如本文所使用，术语相对于参考多肽序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”定义为在比对序列且引入间隔(必要时)以获得最大序列一致性百分比之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比，且不将任何保守取代视为序列一致性的一部分。出于测定氨基酸序列一致性百分比的目的的比对可以所属领域中的技能范围内的各种方式达成，例如使用公开可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。所属领域的技术人员可以确定适用于比对序列的参数，包含在所比较序列的全长内达成最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程式ALIGN-2产生氨基酸序列一致性％值。ALIGN-2序列比较计算机程式由基因泰克公司(Genentech,Inc.)设计，且原始程式码已随用户文件一起提交于华盛顿哥伦比亚特区20559的美国版权局(U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559)，其以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程式可公开购自加利福尼亚州旧金山南部的基因泰克公司(Genentech,Inc.,South San Francisco,California)或可自原始程式码编译。ALIGN-2程式经编译可用于UNIX操作系统，包含数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程式设定且不变化。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情形下，既定氨基酸序列A相对于、与或针对既定氨基酸序列B的氨基酸序列一致性％(或者其可表述为，既定氨基酸序列A具有或包括相对于、与或针对既定氨基酸序列B的一定氨基酸序列一致性％)如下计算：
100×分数X/Y
其中X为在A与B的程式比对中通过序列比对程式ALIGN-2评为一致匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y为B中的氨基酸残基总数目。应了解，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的氨基酸序列一致性％与B相对于A的氨基酸序列一致性％不相等。除非另外特定陈述，否则本文所使用的所有氨基酸序列一致性％值如刚刚前段中所描述使用ALIGN-2计算机程式获得。
如本文所使用，术语“药物调配物”是指所呈形式允许其中所含活性成分的生物活性有效发挥，且不含对调配物将投予的个体具有不可接受毒性的其它组分的制剂。
如本文所使用，术语“药学上可接受的载剂”是指药物调配物中除活性成分外的对个体无毒的成分。药学上可接受的载剂包含(但不限于)缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
本文所使用，术语“纯化”及“分离”是指根据本发明的抗体或核苷酸序列，所指分子在大体上不存在其它同型生物大分子下存在。如本文所使用，术语“纯化”优选地意谓存在至少75重量％、更优选地至少85重量％、又更优选地至少95重量％、且最优选地至少98重量％的相同类型的生物大分子。编码特定多肽的“经分离”核酸分子是指大体上不含其它不编码多肽的核酸分子的核酸分子；然而，所述分子可包含并不有害地影响组合物的基本特征的一些额外碱基或部分。
如本文中所使用，术语“重组抗体”是指由包括编码抗体的核酸的重组宿主细胞表达的抗体(例如嵌合、人类化或人类抗体或其抗原结合片段)。制造重组抗体的“宿主细胞”的实例包含：(1)哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)、COS、骨髓瘤细胞(包含Y0及NS0细胞)、幼仓鼠肾(BHK)细胞、Hela细胞及Vero细胞；(2)昆虫细胞，例如sf9、sf21及Tn5；(3)植物细胞，例如属于烟草属的植物(例如烟草(Nicotiana tabacum))；(4)酵母细胞，例如属于酵母属(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))或曲霉菌属(例如黑曲霉(Aspergillus niger))的酵母细胞；(5)细菌细胞，例如埃希氏杆菌细胞(Escherichia.coli)或枯草杆菌细胞(Bacillus subtilis)等。
如本文中所使用，术语“单链Fv”(“scFv”)为共价连接的VH::VL杂二聚体，其通常由基因融合体表达，所述基因融合体包含由肽编码连接子连接的VH及VL编码基因。“dsFv”是通过二硫键稳定的VH::VL杂二聚体。二价及多价抗体片段可通过单价scFvs的结合自发形成，或可通过肽连接子(例如二价sc(Fv)2)偶联单价scFvs来产生。
术语本发明抗体的“治疗有效量”意谓足以按适用于任何医学治疗的合理的效益/风险比率治疗所述癌症的抗体的量。然而，应了解，本发明的抗体及组合物的每日总用量将由主治医师在正确医学判断范围内来决定。任何特定患者的特定治疗有效剂量水准将视多种因素而定，所述因素包含所治疗的病症及所述病症的严重度；所采用的特异性抗体的活性；所采用的特定组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别及饮食；所采用的投予时间、投予途径及特异性抗体的排泄速率；治疗持续时间；与所采用的特异性抗体组合或同时使用的药物；及医学领域中熟知的类似因素。举例来说，所属领域中熟知以低于实现所需治疗效应所要的水准开始给予组合物，且逐渐增加剂量直到实现所需效应。
如本文所使用，术语“治疗(treatment/treat/treating)是指试图改变所治疗的个体的天然病程的临床干预，且可为实现预防或在临床病理学病程期间进行。所需治疗作用包含(但不限于)预防疾病发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理性后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病病况及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的抗体用于延迟疾病发展或减慢疾病进展。
如本文所使用，术语“肿瘤”是指所有瘤性细胞生长及增殖(无论恶性或良性)，及所有癌前及癌细胞以及组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”及“肿瘤”不为互相排斥的，如本文中所提及。
如本文所使用，术语“可变区”或“可变域”是指涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链域。天然抗体的重链及轻链可变域(分别为VH及VL)一般具有类似结构，且各个域包括四个保守构架区(FR)及三个互补决定区(CDR)。(参见例如金特(Kindt)等人，《库比免疫学(Kuby Immunology)》，第6版，W.H.弗里曼有限公司(W.H.Freeman and Co.)，第91页(2007))。单一VH或VL域可足以赋予抗原结合专一性。此外，结合特定抗原的抗体可使用来从结合所述抗原的抗体的VH或VL域分别筛选互补VL或VH域的库来分离。参见例如波特兰(Portolano)等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，第150卷，第880到887页，1993；克拉克森(Clarkson)等人，《自然(Nature)》，第352卷，第624到628页,1991。
如本文所使用，术语“载体”是指能够传播到其所连接的另一个核酸的核酸分子。所述术语包含呈自我复制核酸结构的载体以及并入其已引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够导引可操作地连接其的核酸的表达。这类载体在本文中称为“表达载体”。
详细说明
本申请要求2020年6月18日提交的美国临时申请第63/040,894号及2021年3月25日申请的美国临时申请第63/166,062号的优先权，其中的每一者的全部内容以引用的方式并入本文中。
出于说明的目的，通过参考各种示范性实施例来描述本发明的原理。尽管在本文中具体描述本发明的某些实施例，但所属领域的一般技术人员将易于认识到相同原理同样适用于且可用于其它系统及方法中。在详细解释本发明所公开的实施例之前，应了解，本发明不将其应用限制于所显示的任何特定实施例的细节。另外，本文所使用的术语是出于描述而非限制的目的。此外，尽管参考以一定次序呈现于本文中的步骤来描述某些方法，但在许多情况下，可按可为所属领域的技术人员所理解的任何次序进行这些步骤；因此，新颖方法不限于本文中所公开的特定步骤排列。
须注意，除非上下文另外明确指示，否则如本文及所附权利要求书中所使用，单数形式“一(a/an)”及“所述(the)”包含多个(种)指示物。此外，术语“一(a或an)”、“一或多个(种)”及“至少一个(种)”在本文中可互换使用。术语“包括”、“包含”、“具有”及“构建自”也可互换使用。
除非另外规定，否则说明书及权利要求书所使用的表示成分的数量、例如分子量、百分比、比率、反应条件等等的特性的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰，无论所述术语“约”是否存在。因此，除非有相反指示，否则说明书及权利要求书中所阐述的数值参数为近似值，其可视本发明设法获得的所需特性而变化。至少，且不试图将均等论的应用限于权利要求书的范围，各数值参数至少应根据所报导的有效数字的个数且通过应用普通舍入技术来解释。尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围及参数为近似值，但尽可能精确地报告特定实例中所阐述的数值。然而，任何数值均固有地含有因其对应测试测量值中发现的标准差所必然引起的某些错误。
应理解，本文所公开的每一组分、化合物、取代基或参数均应解释为单独或与本文所公开的每一其它组分、化合物、取代基或参数中的一者或多者组合使用而进行公开。
还应理解，本文所公开的各组分、化合物、取代基或参数的各量/值或量/值的范围应解释为同样与针对本文公开的任何其它组分、化合物、取代基或参数所公开的各量/值或量/值的范围组合进行公开，且因此，任何两种或更多种本文所公开的组分、化合物、取代基或参数的量/值或量/值的范围的组合同样出于本说明书的目的彼此组合进行公开。
应进一步了解，本文公开的各范围的各下限应解释为与本文针对相同组分、化合物、取代基或参数所公开的各范围的各上限的组合进行公开。因此，两个范围的公开内容应解释为通过组合各范围的各下限与各范围的各上限所衍生的四个范围的公开内容。因此，三个范围的公开内容应解释为通过组合各范围的各下限与各范围的各上限所衍生的九个范围的公开内容等。此外，本说明书或实例中所公开的组分、化合物、取代基或参数的特定量/值应解释为一个范围的下限或上限的公开内容，且因此，可与一个范围的任何其它下限或上限或本申请中其它地方所公开的相同组分、化合物、取代基或参数的特定量/值组合，以形成所述组分、化合物、取代基或参数的范围。
A.经分离的抗粘附分子-4多肽
在一个方面，本发明提供一种分离多肽，其包括特异性结合到粘附分子-4，或尤其人类粘附分子-4蛋白质的重链可变区。重链可变区包含三个具有序列H1、H2及H3的互补决定区(CDR)，其中：
H1序列为GFTFSSYNX1N(SEQ ID NO:1)；
H2序列为YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:2)；及
H3序列为AYYYGX2DX3(SEQ ID NO:3)；
其中X1为M或D；X2为M或D；X3为V或K，限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ IDNO:18及31的组合。
H1序列可选自GFTFSSYNMN(SEQ ID NO:7)及GFTFSSYNDN(SEQ ID NO:8)。H3序列可选自AYYYGMDV(SEQ ID NO:9)、AYYYGDDV(SEQ ID NO:10)及AYYYGMDK(SEQ ID NO:11)。
在另一方面，本发明提供一种分离多肽，其包括特异性结合到人类粘附分子-4的轻链可变区。轻链可变区包含三个具有序列L1、L2及L3的互补决定区，其中：
L1序列为X4ASQGISGWX5A(SEQ ID NO:4)；
L2序列为AASTLQS(SEQ ID NO:5)；及
L3序列为QQANSX6PX7T(SEQ ID NO:6)，
其中X4为R或H；X5为L或E；X6为F或E；且X7为P或D，限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ ID NO:18及31的组合。
L1序列可选自RASQGISGWLA(SEQ ID NO:12)、RASQGISGWEA(SEQ ID NO:13)及HASQGISGWLA(SEQ ID NO:14)。L3序列可选自QQANSFPPT(SEQ ID NO:15)、QQANSEPPT(SEQID NO:16)及QQANSFPDT(SEQ ID NO:17)。
在另一方面，本发明提供特异性结合到粘附分子-4，或尤其人类粘附分子-4蛋白质的包括重链可变区及轻链可变区的分离多肽，其中重链可变区包含三个具有序列H1、H2、及H3的互补决定区，其中：
H1序列为GFTFSSYNX1N(SEQ ID NO:1)；
H2序列为YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:2)；及
H3序列为AYYYGX2DX3(SEQ ID NO:3)；
其中X1为M或D；X2为M或D；X3为V或K；且
轻链可变区包含三个具有序列L1、L2及L3的互补决定区，其中：
L1序列为X4ASQGISGWX5A(SEQ ID NO:4)；
L2序列为AASTLQS(SEQ ID NO:5)；及
L3序列为QQANSX6PX7T(SEQ ID NO:6)，
其中X4为R或H；X5为L或E；X6为F或E；且X7为P或D；且限制条件为X1、X2、X3、X4、X5、X6及X7不能同时分别为M、M、V、R、L、F及P，限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ ID NO:18及31的组合。
示范性抗粘附分子-4分离多肽
Figure BDA0004004183260000291
Figure BDA0004004183260000301
分离多肽可包含具有选自SEQ ID NO:18到30的序列的重链可变区，限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ ID NO:18及31的组合。
分离多肽可包含具有选自SEQ ID NO:31到43的轻链可变区，限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ ID NO:18及31的组合。
示范性抗粘附分子-4分离多肽
Figure BDA0004004183260000302
Figure BDA0004004183260000311
Figure BDA0004004183260000321
Figure BDA0004004183260000331
Figure BDA0004004183260000341
Figure BDA0004004183260000351
Figure BDA0004004183260000361
在一优选实施例中，本发明的分离多肽包括具有选自以下的任一序列对的重链可变区及轻链可变区：SEQ ID NO:19及32、SEQ ID NO:20及33、SEQ ID NO:21及34、SEQ IDNO:22及35、SEQ ID NO:23及36、SEQ ID NO:24及37、SEQ ID NO:25及38、SEQ ID NO:26及39、SEQ ID NO:27及40、SEQ ID NO:28及41，以及SEQ ID NO:29及42。
在另一方面，本发明的分离多肽包括重链可变区及轻链可变区，各区独立地与选自SEQ ID NO:18到30中的一者与SEQ ID NO:31到43中的一者的氨基酸序列的组合具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性；限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ IDNO:18及31的组合，且所述分离多肽特异性结合到人类粘附分子-4蛋白质。
在又一方面，本发明的分离多肽包括重链可变区及轻链可变区，各区独立地与选自以下的氨基酸序列对具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性：SEQ ID NO:19及32、SEQ ID NO:20及33、SEQ ID NO:21及34、SEQ ID NO:22及35、SEQ ID NO:23及36、SEQID NO:24及37、SEQ ID NO:25及38、SEQ ID NO:26及39、SEQ ID NO:27及40、SEQ ID NO:28及41，限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ ID NO:18及31的组合且分别为SEQ ID NO:29及42；且所述分离多肽特异性结合到人类粘附分子-4蛋白质。
在又一方面，本发明的分离多肽特异性结合到粘附分子-4，或尤其人类粘附分子-4蛋白质及CD3，且包括重链可变区及轻链可变区，其中重链可变区包含三个具有序列H1、H2、及H3的互补决定区，其中：
H1序列是选自SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8，
H2序列为SEQ ID NO:2，及
H3序列选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11；且
轻链可变区包含三个具有序列L1、L2及L3的互补决定区，其中：
L1序列为X4ASQGISGWX5A(SEQ ID NO:4)；
L2序列为AASTLQS(SEQ ID NO:5)；及
L3序列为QQANSX6PX7T(SEQ ID NO:6)，
其中X4为R或H；X5为L或E；X6为F或E；且X7为P或D，且限制条件为X1、X2、X3、X4、X5、X6及X7不能同时分别为M、M、V、R、L、F及P，及
六个抗CD3互补决定区L4、L5、L6、L7、L8及L9，其中：
L4序列为GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:44)，
L5序列为RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:45)，
L6序列为HX11NFX12NSX13VSWFX14Y(SEQ ID NO:46)，
L7序列为RSSTGAVTTSNYX15N(SEQ ID NO:47)，
L8序列为GTNKRAP(SEQ ID NO:48)，及
L9序列为ALWYSNLWV(SEQ ID NO:49)，
其中X11为G或S，X12为G或P，X13为Y或K，X14为A或Q且X15为A或D。
在具有九个CDR的分离多肽的另一方面，L6序列是选自SEQ ID NO:50到53中的任一者，且L7序列是选自SEQ ID NO:54及55。
在一优选方面，分离多肽特异性结合到粘附分子-4及CD3且包括重链可变区及轻链可变区，其中重链可变区包含三个互补决定区H1、H2及H3，其中：
H1序列是选自SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8，
H2序列是选自SEQ ID NO:2，及
H3序列是选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11；且
轻链可变区包含三个具有序列L1、L2及L3的互补决定区，其中：
L1序列是选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14，
L2序列为SEQ ID NO:5，
L3序列是选自SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17，及六个抗CD3互补决定区L4、L5、L6、L7、L8及L9，其中：
L4序列为GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:44)，
L5序列为RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:45)，
L6序列是选自HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:50)、HSNFGNSKVSWFAY(SEQ ID NO:51)、HGNFPNSKVSWFQY(SEQ ID NO:52)及HSNFGNSKVSWFAY(SEQ ID NO:53)，
L7序列是选自RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:54)及RSSTGAVTTSNYDN(SEQ ID NO:55)，
L8序列为GTNKRAP(SEQ ID NO:48)，及
L9序列为ALWYSNLWV(SEQ ID NO:49)。
在另一优选方面，分离多肽特异性结合到粘附分子-4及CD3且包括重链可变区及轻链可变区，其中重链可变区包含三个互补决定区H1、H2及H3，其中：
H1序列是选自SEQ ID NO:7，
H2序列是选自SEQ ID NO:2，及
H3序列是选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11，且轻链可变区包含三个互补决定区L1、L2及L3，其中
L1序列选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14，
L2序列为SEQ ID NO:5，
L3序列为SEQ ID NO:15，及
六个抗CD3互补决定区L4、L5、L6、L7、L8及L9，其中：
L4序列为GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:44)，
L5序列为RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:45)，
L6序列选自HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:50)、HSNFGNSKVSWFAY(SEQ ID NO:51)、HGNFPNSKVSWFQY(SEQ ID NO:52)及HSNFGNSKVSWFAY(SEQ ID NO:53)，
L7序列是选自RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:54)及RSSTGAVTTSNYDN(SEQ ID NO:55)，
L8序列为GTNKRAP(SEQ ID NO:48)，及
L9序列为ALWYSNLWV(SEQ ID NO:49)。
具有九个CDR的示范性抗粘附分子-4分离多肽
上文所列的具有H1、H2、H3、L1、L2及L3序列的“示范性抗粘附分子-4分离多肽”中的每一者可进一步包含下文阐述的L4、L5、L6、L7、L8及L9的组合中的任一者。
Figure BDA0004004183260000381
Figure BDA0004004183260000391
在前述方面中的每一者中，患有九个CDR的分离多肽包括具有选自SEQ ID NO:18、25、27及29的序列的重链可变区。
在前述方面中的每一者中，具有九个CDR的分离多肽包括具有选自SEQ ID NO:56到60的序列的轻链可变区。
在某些方面，具有九个CDR的分离多肽包括SEQ ID NO:18、25、27及29中的任一者的重链可变序列及SEQ ID NO:56到60中的任一者的轻链可变序列。
示范性抗粘附分子-4分离多肽
Figure BDA0004004183260000392
Figure BDA0004004183260000401
在某些优选方面，本发明的具有九个CDR的分离多肽包括具有选自以下的任一序列对的重链可变区及轻链可变区：SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:27及SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:59，以及SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:60。
在另一方面，本发明的具有九个CDR的分离多肽包括重链可变区及轻链可变区，各区独立地与选自SEQ ID NO:18、25、27及29中的一者与SEQ ID NO:56到60中的一者的氨基酸序列的组合具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性；限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ ID NO:18及56的组合；且所述分离多肽特异性结合到人类粘附分子-4蛋白质。
在本发明的另一方面，具有九个CDR的分离多肽包括重链可变区及轻链可变区，各区独立地与选从以下的氨基酸序列对具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性：SEQ ID NO:25及57、SEQ ID NO:27及58、SEQ ID NO:29及59、SEQ ID NO:29及60；且所述分离多肽特异性结合到人类粘附分子-4蛋白质。
在前述方面中的每一者中，特异性结合到粘附分子-4，或尤其人类粘附分子-4蛋白质及CD3的本发明的分离多肽也可包括上文所描述的特异性结合粘附分子-4的序列，及任何已知CD3抗体的单链可变片段(scFv)。在本发明的这方面，独立于条件活性粘附分子-4结合，分离多肽结合CD3。举例来说，在一个实施例中，特异性结合到粘附分子-4，或尤其人类粘附分子-4蛋白质及CD3的本发明的分离多肽包括重链可变区及轻链可变区，其中重链可变区包含三个具有序列H1、H2、及H3的互补决定区，其中：
H1序列是选自SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8，
H2序列为SEQ ID NO:2，及
H3序列选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11；且
轻链可变区包含三个具有序列L1、L2及L3的互补决定区，其中：
L1序列为X4ASQGISGWX5A(SEQ ID NO:4)；
L2序列为AASTLQS(SEQ ID NO:5)；及
L3序列为QQANSX6PX7T(SEQ ID NO:6)，
其中X4为R或H；X5为L或E；X6为F或E；且X7为P或D；且限制条件为X1、X2、X3、X4、X5、X6及X7不能同时分别为M、M、V、R、L、F及P，且scFv包括任何已知CD3抗体的六个抗-CD3互补决定区。
本发明的重链可变区及轻链可变区是各自使用美国专利第8,709,755号及第8,859,467号中所公开的方法从亲本抗体获得。产生重链可变区及轻链可变区的此方法以及美国专利第8,709,755号及第8,859,467号中所公开的产生抗体及抗体片段的方法是以引用的方式并入本文中。
B.抗粘附分子-4抗体
分离多肽可为抗体或抗体片段。包含这些重链可变区及轻链可变区的抗体及抗体片段可特异性结合到粘附分子-4，或尤其人类粘附分子-4。已发现包括这些重链可变区中的一者及这些轻链可变区中的一者的组合的抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的pH(例如，pH 5.0到6.8，优选地，pH 6.0到6.8)下与粘附分子-4的结合高于在非肿瘤微环境中的pH(例如，pH 7.0到7.6)下的结合。因此，抗粘附分子-4抗体或抗体片段在肿瘤微环境中与粘附分子-4的结合高于其在典型正常组织微环境中与粘附分子-4的结合。在一个方面，通过亲和力测量结合。
在本文所描述的分离多肽、抗体及抗体片段的实施例中的任一者中，相较于条件活性分离多肽、抗体或抗体片段所来源的亲本或野生型多肽、抗体或抗体片段在正常生理条件下的活性，所述条件活性分离多肽、抗体或抗体片段在正常生理条件(例如非肿瘤微环境)下可具较低活性或几乎无活性且在异常条件(例如肿瘤微环境)下具更高活性。因此，相较于本发明的分离多肽、抗粘附分子-4抗体或抗粘附分子-4抗体片段所来源的亲本或野生型多肽、抗体或抗体片段，本发明的分离多肽、抗粘附分子-4抗体或抗粘附分子-4抗体片段在正常生理条件(例如非肿瘤微环境)下可具有与粘附分子-4的较低结合。举例来说，条件活性分离多肽、抗粘附分子-4抗体或抗粘附分子-4抗体片段在pH 7.0到7.6下可具有相较于亲本或野生型多肽、抗体或抗体片段较低的活性或几乎无活性，但在较低pH 5.0到6.8下相较于亲本或野生型多肽、抗体或抗体片段具有活性。在一些情况下，相较于亲本或野生型多肽、抗体或抗体片段，条件活性分离多肽、抗体或抗体片段在正常生理条件(例如非肿瘤微环境)下为可逆或不可逆失活。
因此，预期相对于非条件活性抗粘附分子-4抗体，本发明的抗粘附分子-4抗体或抗体片段因其在正常组织微环境中与粘附分子-4的结合较低而展现减少的副作用。另外预期本发明的抗粘附分子-4抗体或抗体片段具有与所属领域中已知的单克隆抗粘附分子-4抗体相当的功效。此特征组合因副作用较少而允许使用较高剂量的这些抗粘附分子-4抗体或抗体片段，由此可提供更有效的疗法选项。
本发明提供特异性结合到粘附分子-4，或尤其人类粘附分子-4蛋白质的抗体或抗体片段，其包括包含三个具有序列H1、H2及H3的互补决定区(CDR)的重链可变区，其中：
H1序列为GFTFSSYNX1N(SEQ ID NO:1)；
H2序列为YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:2)；及
H3序列为AYYYGX2DX3(SEQ ID NO:3)；
其中X1为M或D；X2为M或D；X3为V或K，限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ IDNO:18及31的组合。
H1序列可选自GFTFSSYNMN(SEQ ID NO:7)及GFTFSSYNDN(SEQ ID NO:8)。H3序列可选自AYYYGMDV(SEQ ID NO:9)、AYYYGDDV(SEQ ID NO:10)及AYYYGMDK(SEQ ID NO:11)。
在另一方面，本发明提供一种抗体或抗体片段，其包括特异性结合到人类粘附分子-4的轻链可变区。轻链可变区包含三个具有序列L1、L2及L3的互补决定区，其中：
L1序列为X4ASQGISGWX5A(SEQ ID NO:4)；
L2序列为AASTLQS(SEQ ID NO:5)；及
L3序列为QQANSX6PX7T(SEQ ID NO:6)，
其中X4为R或H；X5为L或E；X6为F或E；且X7为P或D，限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ ID NO:18及31的组合。
L1序列可选自RASQGISGWLA(SEQ ID NO:12)、RASQGISGWEA(SEQ ID NO:13)及HASQGISGWLA(SEQ ID NO:14)。L3序列可选自QQANSFPPT(SEQ ID NO:15)、QQANSEPPT(SEQID NO:16)及QQANSFPDT(SEQ ID NO:17)。
在一更特定方面，本发明提供一种抗体或抗体片段，其包括重链可变区及轻链可变区，其中重链可变区包含三个具有序列H1、H2及H3的互补决定区，其中：
H1序列为GFTFSSYNX1N(SEQ ID NO:1)；
H2序列为YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:2)；及
H3序列为AYYYGX2DX3(SEQ ID NO:3)；
其中X1为M或D；X2为M或D；X3为V或K；且轻链可变区包含三个具有序列L1、L2及L3的互补决定区，其中：
L1序列为X4ASQGISGWX5A(SEQ ID NO:4)；
L2序列为AASTLQS(SEQ ID NO:5)；及
L3序列为QQANSX6PX7T(SEQ ID NO:6)，
其中X4为R或H；X5为L或E；X6为F或E；且X7为P或D；且限制条件为X1、X2、X3、X4、X5、X6及X7不能同时分别为M、M、V、R、L、F及P，限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ ID NO:18及31的组合。
重链可变区可具有选从SEQ ID NO:18到30的序列，限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ ID NO:18及31的组合。
轻链可变区可具有选自SEQ ID NO:31到43的序列，限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ ID NO:18及31的组合。
示范性抗粘附分子-4抗体
在某些实施例中，本发明的抗粘附分子-4抗体及抗体片段包含H1、H2、H3、L1、L2及L3 CDR的组合或上文针对分离多肽所阐述的重链可变区(选自SEQ ID NO:18到30)及轻链可变区(选自SEQ ID NO:31到43)的组合。本发明的优选粘附分子-4抗体及抗体片段为包含上文针对分离多肽所阐述的这些重链及轻链可变区的优选组合的那些粘附分子-4抗体及抗体片段。举例来说，本发明的优选抗体或抗体片段包括具有选自以下的任一序列对的重链可变区及轻链可变区：SEQ ID NO:32及19、SEQ ID NO:33及20、SEQ ID NO:34及21、SEQID NO:35及22、SEQ ID NO:36及23、SEQ ID NO:37及24、SEQ ID NO:38及25、SEQ ID NO:39及26、SEQ ID NO:40及27、SEQ ID NO:41及28以及SEQ ID NO:42及29。
本发明的抗体或抗体片段可包括重链可变区及轻链可变区，各区独立地与选自SEQ ID NO:18到30中的一者与SEQ ID NO:31到43中的一者的氨基酸序列的组合具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性；限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ ID NO:18及31的组合；且所述抗体或抗体片段特异性结合到人类粘附分子-4蛋白质。
本发明的抗体或抗体片段可包括重链可变区及轻链可变区，各区独立地与选自以下的氨基酸序列对具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性：各别地SEQ ID NO:32及19、SEQ ID NO:33及20、SEQ ID NO:34及21、SEQ ID NO:35及22、SEQ ID NO:36及23、SEQ ID NO:37及24、SEQ ID NO:38及25、SEQ ID NO:39及26、SEQ ID NO:40及27、SEQ IDNO:41及28以及SEQ ID NO:42及29；限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ ID NO:18及31的组合且所述抗体或抗体片段特异性结合到人类粘附分子-4蛋白质。
在另一方面，本发明的抗体或抗体片段多特异性特异性结合到粘附分子-4，或尤其人类粘附分子-4蛋白质及CD3且包括重链可变区及轻链可变区，其中重链可变区包含三个具有序列H1、H2、及H3的互补决定区，其中：
H1序列是选自SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8，
H2序列为SEQ ID NO:2，及
H3序列是选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11；且
轻链可变区包含三个具有序列L1、L2及L3的互补决定区，其中：
L1序列为X4ASQGISGWX5A(SEQ ID NO:4)；
L2序列为AASTLQS(SEQ ID NO:5)；及
L3序列为QQANSX6PX7T(SEQ ID NO:6)，
其中X4为R或H；X5为L或E；X6为F或E；且X7为P或D，且限制条件为X1、X2、X3、X4、X5、X6及X7不能同时分别为M、M、V、R、L、F及P，及
六个抗CD3互补决定区L4、L5、L6、L7、L8及L9，其中：
L4序列为GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:44)，
L5序列为RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:45)，
L6序列为HX11NFX12NSX13VSWFX14Y(SEQ ID NO:46)，
L7序列为RSSTGAVTTSNYX15N(SEQ ID NO:47)，
L8序列为GTNKRAP(SEQ ID NO:48)，及
L9序列为ALWYSNLWV(SEQ ID NO:49)，
其中X11为G或S，X12为G或P，X13为Y或K，X14为A或Q且X15为A或D。
在本发明的多特异性抗体或抗体片段的另一方面，L6序列为SEQ ID NO:50到53中的任一者，且L7序列是选自SEQ ID NO:54及55。
示范性双特异性抗粘附分子-4×CD3抗体
在某些实施例中，本发明的双特异性抗粘附分子-4×CD3抗体及抗体片段包含H1、H2、H3、L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8及L9 CDR的组合或上文针对分离多肽所阐述的重链可变区(选自SEQ ID NO:18、25、27及29)及轻链可变区(选自SEQ ID NO:56到60)的组合，限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ ID NO:18及56的组合。本发明的优选抗粘附分子-4抗体及抗体片段为包含上文针对分离多肽所阐述的这些重链及轻链可变区的优选组合的那些抗粘附分子-4抗体及抗体片段。
在另一方面，多特异性抗体或抗体片段特异性结合到粘附分子-4，或尤其人类粘附分子-4蛋白质及CD3且包括重链可变区及轻链可变区，其中重链可变区包含三个互补决定区H1、H2、及H3，其中：
H1序列是选自SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8，
H2序列是选自SEQ ID NO:2，及
H3序列是选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11，且轻链可变区包含三个互补决定区L1、L2及L3，其中：
L1序列是选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14，
L2序列为SEQ ID NO:5，
L3序列是选自SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17，及六个抗CD3互补决定区L4、L5、L6、L7、L8及L9，其中：
L4序列为GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:44)，
L5序列为RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:45)，
L6序列是选自HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:50)、HSNFGNSKVSWFAY(SEQ ID NO:51)、HGNFPNSKVSWFQY(SEQ ID NO:52)及HSNFGNSKVSWFAY(SEQ ID NO:53)，
L7序列是选自RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:54)及RSSTGAVTTSNYDN(SEQ ID NO:55)，
L8序列为GTNKRAP(SEQ ID NO:48)，及
L9序列为ALWYSNLWV(SEQ ID NO:49)，限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ IDNO:18及56的组合。
在另一优选方面，本发明的多特异性抗体或抗体片段特异性结合到粘附分子-4，或尤其人类粘附分子-4蛋白质及CD3且包括重链可变区及轻链可变区，其中重链可变区包含三个互补决定区H1、H2、及H3，其中：
H1序列是选自SEQ ID NO:7，
H2序列是选自SEQ ID NO:2，及
H3序列是选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11，且轻链可变区包含三个互补决定区L1、L2及L3，其中：
L1序列是选自SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13，
L2序列为SEQ ID NO:5，
L3序列为SEQ ID NO:15，及
六个抗CD3互补决定区L4、L5、L6、L7、L8及L9，其中：
L4序列为GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:44)，
L5序列为RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:45)，
L6序列是选自HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:50)、HSNFGNSKVSWFAY(SEQ ID NO:51)、HGNFPNSKVSWFQY(SEQ ID NO:52)及HSNFGNSKVSWFAY(SEQ ID NO:53)，
L7序列是选自RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:54)及RSSTGAVTTSNYDN(SEQ ID NO:55)，
L8序列为GTNKRAP(SEQ ID NO:48)，及
L9序列为ALWYSNLWV(SEQ ID NO:49)，限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ IDNO:18及56的组合。
在前述实施例中的每一者中，本发明的多特异性抗体或抗体片段可包括具有选自SEQ ID NO:18、25、27及29的序列的重链可变区。
在前述实施例中的每一者中，本发明的多特异性抗体或抗体片段可包括具有选自SEQ ID NO:56到60的序列的轻链可变区。
在某些实施例中，本发明的多特异性抗体或抗体片段抗体片段包括具有SEQ IDNO:18、25、27及29中的任一者的序列的重链可变区，及具有SEQ ID NO:56到60中的任一者的序列的轻链可变区，限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ ID NO:18及56的组合。
在某些实施例中，本发明的多特异性抗体或抗体片段包括具有选自以下的任一序列对的重链可变区及轻链可变区：SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:27及SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:59，以及SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:60。
在另一实施例中，本发明的多特异性抗体或抗体片段包括重链可变区及轻链可变区，各区独立地与选自SEQ ID NO:18、25、27及29中的一者与SEQ ID NO:56到60中的一者的氨基酸序列的组合具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性；限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ ID NO:18及56的组合；且所述抗体或抗体片段特异性结合到人类粘附分子-4蛋白质。
在另一实施例中，本发明的多特异性抗体或抗体片段包括重链可变区及轻链可变区，各区独立地与选自以下的氨基酸序列对具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性：SEQ ID NO:25及57、SEQ ID NO:27及58、SEQ ID NO:29及59、SEQ ID NO:29及60；限制条件为重链及轻链可变区不为SEQ ID NO:18及56的组合且所述抗体或抗体片段特异性结合到人类粘附分子-4蛋白质。
在其它实施例中，重链及轻链可变区的除互补决定区外的氨基酸序列可如本申请中关于提供这些变体所论述，根据取代、插入及缺失的原理而突变。在又其它实施例中，恒定区可经修饰以提供这些变体。在又其它实施例中，重链及轻链可变区的除互补决定区外的氨基酸序列及恒定区两者可经修饰以提供这些变体。
在得到这些变体时，通过如本文所述的方法引导。重链及轻链可变区的变体可通过将适当修饰引入编码重链及轻链可变区的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。这类修饰包含例如重链及轻链可变区的氨基酸序列中残基的缺失、及/或插入、及/或取代。可进行缺失、插入及取代的任何组合以获得本发明的抗体或抗体片段，限制条件为其具有所需特征，例如与人类粘附分子-4抗原结合及/或条件活性。
取代、插入及缺失变体
在某些实施例中，提供具有一或多个氨基酸取代的抗体或抗体片段变体。用于取代型突变诱发的相关位点包含CDR及构架区(FR)。保守性取代展示于表1中的“保守性取代”的标题下。更实质性变化提供于表1中“示范性取代”的标题下，且如下文关于氨基酸侧链类别进一步描述。氨基酸取代可引入到相关抗体或抗体片段中且针对所需活性，例如保留/改进的抗原结合或降低的免疫原性来筛检产物。
表1：氨基酸取代
Figure BDA0004004183260000471
Figure BDA0004004183260000481
氨基酸可根据共有侧链特性来进行分组：
(1)疏水性：正白氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将引起这些类别中的一者的成员换成另一个类别。
一种类型的取代型变体涉及取代亲本抗体(例如人类化抗体或人类抗体)的一或多个互补决定区残基。一般来说，选用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体将在某些生物特性方面具有修饰(例如改进)(例如亲和力提高、免疫原性降低)及/或将大体上保留亲本抗体的某些生物特性。示范性取代型变体为亲和力成熟抗体，其可例如使用基于噬菌体呈现的亲和力成熟技术(例如本文所描述的技术)便利地产生。简单地说，使一或多个CDR残基突变且在噬菌体上呈现变异抗体且针对特定生物活性(例如结合亲和力)筛检。
改变(例如取代)可于CDR中进行以例如改进抗体亲和力。这类改变可于CDR“热点”(即由在体细胞成熟过程中经历高频率突变的密码子编码的残基)(参见例如乔杜里(Chowdhury)，《分子生物学方法(Methods Mol.Biol)》.第207卷，第179到196页，2008)及/或SDR(a-CDR)中进行，其中测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构筑二级库及从二级库再选择达成的亲和力成熟已描述于例如胡根邦(Hoogenboom)等人，《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》，第178卷，第1到37页，2001中。在亲和力成熟的一些实施例中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸引导的突变诱发)中的任一者将多样性引入到所选用于成熟的可变基因中。随后产生二级库。随后筛选所述库以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一方法涉及CDR导引途径，其中将若干CDR残基(例如一次4到6个残基)随机分组。涉及抗原结合的CDR残基可例如使用丙氨酸扫描突变诱发或模型化来特定鉴别。常常尤其以CDR-H3及CDR-L3为靶标。
在某些实施例中，取代、插入或缺失可发生在一或多个CDR内，只要这类改变不大体上降低抗体或抗体片段结合抗原的能力即可。举例来说，不大体上降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文所提供的保守性取代)可在CDR中进行。这类改变可在CDR“热点”或SDR外。在上文所提供的变体VH及VL序列的某些实施例中，各CDR未改变或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
如康宁汉姆(Cunningham)及威尔斯(Wells)，《科学(Science)》，第244卷，第1081到1085页，1989所描述，适用于鉴别可针对突变诱发进行靶向的抗体残基或区的方法称为“丙氨酸扫描突变诱发”。在此方法中，鉴别出一个残基或一组靶残基(例如带电荷残基，例如arg、asp、his、lys及glu)且将其置换为中性或带负电氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)以确定抗体或抗体片段与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展现功能敏感性的氨基酸位置处引入其它取代。或者或另外，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴别抗体或抗体片段与抗原之间的接触点。这类接触残基及邻近残基可作为取代候选物的靶标或排除在取代候选物之外。可筛选变体以确定其是否含有所需特性。
氨基酸序列插入包含长度在一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽范围内的氨基末端及/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包含具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体的其它插入变体包含抗体N末端或C末端与延长抗体血清半衰期的酶(例如针对ADEPT)或多肽的融合物。
考虑本文所述的抗体的一或多个氨基酸序列修饰。举例来说，可能需要改进抗体的结合亲和力及/或其它生物特性。已知当人类化抗体通过仅将源从非人类动物的抗体的VH及VL中的CDR简单移植于人类抗体的VH及VL的FR中来制造时，抗原结合活性相较于源自非人类动物的原始抗体降低。认为非人类抗体的VH及VL的若干氨基酸残基不仅在CDR中而且在FR中与抗原结合活性直接或间接相关。因此，用源自人类抗体的VH及VL的FR的不同氨基酸残基取代这些氨基酸残基将降低结合活性。为解决所述问题，在移植人类CDR的抗体中，试图鉴别人类抗体的VH及VL的FR的氨基酸序列中的与结合于抗体直接相关，或与CDR的氨基酸残基相互作用，或维持抗体的三维结构及与结合于抗原直接相关的氨基酸残基。降低的抗原结合活性可通过用源自非人类动物的原始抗体的氨基酸残基替换鉴别的氨基酸而增加。
修饰及变化可于本发明抗体的结构中及于编码其的DNA序列中进行，且仍可获得编码具有所需特征的抗体的功能分子。
在氨基序列中进行所述变化时，可考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在对蛋白质赋予相互作用生物功能上的重要性为所属领域中一般所理解。公认氨基酸的相对亲水性促成所得蛋白质的二级结构，所述二级结构又界定蛋白质与其它分子(例如酶、受质、受体、DNA、抗体、抗原及其类似物)的相互作用。各氨基酸已基于其疏水性及电荷特征而被指定亲水指数：异白氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；白氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；及精氨酸(-4.5)。
本发明的另一目的也涵盖本发明抗体的功能保守性变体。
两个氨基酸序列在相对于较短序列的全长，大于80％、优选大于85％、优选大于90％的氨基酸一致，或大于约90％、优选大于95％类似(功能相同)时为“大体上同源的”或“大体上类似的”。优选地，类似或同源序列通过使用例如GCG(遗传学计算机组(GeneticsComputer Group)，GCG软件包的程序手册(Program Manual for the GCG Package)，第7版，威斯康星州麦迪逊(Madison,Wis.))堆积程式或例如BLAST、FASTA等序列比较算法中的任一者比对来鉴别。
举例来说，某些氨基酸可经蛋白质结构中的其它氨基酸取代而不会显着损失活性。因为蛋白质的相互作用能力及性质限定蛋白质生物功能活性，所以某些氨基酸取代可在蛋白质序列中进行，且当然在其DNA编码序列中进行，同时仍获得具有类似特性的蛋白质。因此，预期可在本发明的抗体或抗体片段的序列或编码所述抗体或抗体片段的相应DNA序列中进行各种变化而不会显着损失其生物活性。
所属领域中已知某些氨基酸可经具有类似亲水指数或评分的其它氨基酸取代，而仍产生具有类似生物活性的蛋白质，即仍获得生物学功能上等效的蛋白质。
如上文所概述，氨基酸取代因此一般是基于氨基酸侧链取代基的相对类似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小及其类似形式。考虑多种前述特征的示范性取代为所属领域的技术人员所熟知，且包含：精氨酸及赖氨酸；谷氨酸及天冬氨酸；丝氨酸及苏氨酸；谷氨酰胺及天冬酰胺；以及缬氨酸、白氨酸及异白氨酸。
糖基化变体
在某些实施例中，本文所提供的抗粘附分子-4抗体或抗体片段经改变以增加或减小所述抗体或抗体片段糖基化的程度。向抗体中添加糖基化位点或使抗体缺失糖基化位点可通过改变氨基酸序列以便产生或去除一或多个糖基化位点来便利地实现。
在抗体包括Fc区的情况下，可改变连接于其上的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的原生抗体通常包括分支链双触角寡糖，其通常通过N键连接到Fc区的CH2域的Asn297。参见例如赖特(Wright)等人，TIBTECH，第15卷，第26到32页，1997。寡糖可包含各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及连接到双触寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的海藻糖。在一些实施例中，可对本发明抗体中的寡糖进行修饰以便产生具有某些改进特性的抗体变体。
在一个实施例中，提供无岩藻糖连接(直接或间接)到Fc区的碳水化合物结构的抗体变体。举例来说，这类抗体中的岩藻糖量可为1％到80％、1％到65％、5％到65％，或20％到40％。岩藻糖的量是通过计算糖链内Asn297处的岩藻糖的平均量来确定，此平均量是相对于如通过MALDI-TOF质谱法所测量的连接到Asn 297的所有糖结构(例如复合、杂合及高甘露糖结构)的总和而言，如例如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约位置297(Fc区残基的EU编号)处的天冬酰胺残基；然而，归因于抗体的较小序列变化，Asn297亦可位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，即位置294与300之间。此类海藻糖基化变体可具有改进的ADCC功能。参见例如美国专利公开第US 2003/0157108号(普雷斯塔，L.(Presta,L.))；第US 2004/0093621号(日本协和发酵工业株式会社(Kyowa Hakko KogyoCo.,Ltd))。关于“去岩藻糖基化”或“缺乏岩藻糖”的抗体变体的公开的实例包含：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；冈崎(Okazaki)等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，第336卷，第1239到1249页，2004；大野(Yamane-Ohnuki)等人，《生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.)》，第87卷，第614到622页，2004。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包含缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(里普卡(Ripka)等人,《生化与生物物理集刊(Arch.Biochem.Biophys)》.第249卷，第533到545页，1986；美国专利申请第US 2003/0157108 A号；及WO 2004/056312 A1，尤其实例11)，及基因剔除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8基因剔除CHO细胞(参见例如大野(Yamane-Ohnuki)等人,《生物技术与生物工程》，第87卷，第614到622页，2004；神田(Kanda,Y.)等人，《生物技术与生物工程》，第94卷，第680到688页，2006；及WO2003/085107)。
抗体变体进一步具备平分寡糖，例如其中连接于抗体的Fc区的双触角寡糖通过GlcNAc平分。这类抗体变体可具有减少的海藻糖基化及/或经改进的ADCC功能。这类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878；美国专利第6,602,684号；及US2005/0123546中。还提供寡糖中的至少一个半乳糖残基与Fc区连接的抗体变体。这类抗体变体可具有经改进的CDC功能。所述抗体变体描述于例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；及WO 1999/22764中。
Fc区变体
在某些实施例中，可将一或多个氨基酸修饰引入本文中所提供的抗粘附分子-4抗体或抗体片段的Fc区中，借此产生Fc区变体。Fc区变体可包括人类Fc区序列(例如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一或多个氨基酸位置处包括氨基酸修饰(例如取代)。
在某些实施例中，本发明涵盖具有一些而非所有效应功能的抗体变体，由此使得所述抗体成为对于其中活体内抗体半衰期到关重要，而某些效应功能(例如ADCC)为不必要或有害的应用的合乎需要的候选物。可进行活体外及/或活体内细胞毒性分析以确认CDC及/或ADCC活性的降低/消耗。举例来说，可进行Fc受体(FcR)结合分析以确保抗体不具有FcγR结合能力(因此可能不具有ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于调节ADCC的初级细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核球表达FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血细胞上的FcR表达概述于拉维奇(Ravetch)及基内特(Kinet),《免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol.)》，第9卷，第457到492页，1991的第464页的表3中。评估相关分子的ADCC活性的活体外分析的非限制性实例描述于美国专利第5,500,362号(还参见例如赫尔斯特仑(Hellstrom)等人，《美国科学院院报(Proc.Nat′l Acad.Sci.USA)》，第83卷,第7059到7063页,1986)及赫尔斯特仑，I(Hellstrom,I)等人，《美国科学院院报》,第82卷,第1499到1502页,1985；美国专利第5,821,337号(还参见布吕格曼(Bruggemann)等人，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》，第166卷,第1351到1361页,1987)中。替代地，可采用非放射性分析方法(参见例如用于流式细胞测量术的ACTITM非放射性细胞毒性分析(加利福尼亚州山景城的细胞技术有限公司(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA))；及CytoTox
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非放射性细胞毒性分析(威斯康星州麦迪逊的普罗麦格公司(Promega,Madison,WI)))。适用于这类分析的效应细胞包含周边血液单核细胞(PBMC)及自然杀手(NK)细胞。可替代地或另外，可例如在动物模型中，例如克莱因斯(Clynes)等人，《美国科学院院报》，第95卷，第652到656页，1998中所公开的动物模型中活体内评定相关分子的ADCC活性。也可进行C1q结合分析以确认抗体不能结合C1q且因此不具有CDC活性。参见例如WO2006/029879及WO 2005/100402中的C1q及C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可进行CDC分析(参见例如加扎诺-桑托罗(Gazzano-Santoro)等人，《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》,第202卷，第163到171页，1996；格瑞克，M.S.(Cragg,M.S.)等人，《血液(Blood)》,第101卷，第1045到1052页，2003；及格瑞克，M.S.(Cragg,M.S.)及M.J.格莱尼(M.J.Glennie)，《血液》，第103卷，第2738到2743页，2004)。也可使用所属领域中已知的方法(参见例如佩特科娃，S.B.(Petkova,S.B.)等人，《国际免疫学(Int'l.Immunol.)》，第18卷，第1759到1769页，2006)进行FcRn结合及活体内清除率/半衰期测定。
具有降低的效应功能的抗体或抗体片段的变体包含取代Fc区残基238、265、269、270、297、327及329中的一或多者的变体(美国专利第6,737,056号)。此类Fc突变体包含具有氨基酸位置265、269、270、297及327中的两者或更多者处的取代的Fc突变体，包含残基265及297取代为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利第7,332,581号)。
描述具有提高或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见例如，美国专利第6,737,056号；WO 2004/056312及希尔兹(Shields)等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》，第9卷，第6591到6604页，2001)。
在某些实施例中，抗体变体包括Fc区，其具有改进ADCC的一或多个氨基酸取代，例如Fc区的位置298、333及/或334(残基的EU编号)的取代。
在一些实施例中，在Fc区中进行使C1q结合及/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即，改善或减弱)的改变，例如美国专利第6,194,551号、WO 99/51642及爱德斯杰(Idusogie)等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，第164卷，第4178到4184页，2000中所描述。
延长半衰期且提高与负责将母体IgG转移到胎儿的新生儿Fc受体(FcRn)(盖耶(Guyer)等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，第117卷，第587到593页，1976及吉姆(Kim)等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，第24卷，第249页，1994)的结合的抗体描述于US2005/0014934中。那些抗体包括其中具有一或多个取代的Fc区，所述一或多个取代改进Fc区与FcRn的结合。这类Fc变体包含在以下Fc区残基中的一或多者处具有取代的所述变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc区残基434的取代(美国专利第7,371,826号)。关于Fc区变体的其它实例，还参见邓肯(Duncan)及温特(Winter)，《自然(Nature)》，第322卷，第738到740页，1988；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；及WO 94/29351。
经半胱氨酸工程改造的抗体变体
在某些实施例中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“thioMAb”，其中抗粘附分子-4抗体或抗体片段的一或多个残基经半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，经取代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基进而定位于抗体的可接近位点且可用于使抗体与其它部分(例如药物部分或连接子-药物部分)结合以产生如本文中进一步描述的免疫结合物。在某些实施例中，以下残基中的任一者或多者可经半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(Eu编号)；及重链Fc区的5400(Eu编号)。可如例如美国专利第7,521,541号中所述产生经半胱氨酸工程改造的抗体。
抗体衍生物
在某些实施例中，本文中所提供的抗粘附分子-4抗体或抗体片段可进一步经修饰以含有所属领域中已知且可易于获得的额外非蛋白质部分。适用于抗体或抗体片段衍生作用的部分包含(但不限于)水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包含(但不限于)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三恶烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)及聚葡萄糖或聚(正乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其于水中的稳定性而可在制造中具有优势。聚合物可具有任何分子量，且可为分支链或未分支的。连接于抗体或抗体片段的聚合物数目可为变化的，且如果连接超过一个聚合物，那么其可为相同或不同分子。一般来说，用于衍生作用的聚合物的数目及/或类型可基于包含(但不限于)待改进抗体或抗体片段的特殊特性或功能，衍生物是否将用于指定条件下的疗法等考虑因素来确定。
在另一个实施例中，提供可通过辐射暴露选择加热的抗体或抗体片段与非蛋白质部分的结合物。在一个实施例中，非蛋白质部分为碳纳米管(凯姆(Kam)等人，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，第102卷，第11600到11605页，2005)。辐射可具有任何波长，且包含(但不限于)不损害普通细胞但将非蛋白质部分加热到杀死抗体-非蛋白质部分近侧的细胞的温度的波长。
本发明的抗粘附分子-4抗体或抗体片段或其变体在肿瘤微环境中的条件下对粘附分子-4蛋白质的结合亲和力高于在非肿瘤微环境中的条件下的结合亲和力。在一个实施例中，肿瘤微环境中的条件及非肿瘤微环境中的条件均为pH值。因此，本发明的抗粘附分子-4抗体或抗体片段可在约5.0到6.8的pH下选择性结合到粘附分子-4，但将在正常非肿瘤微环境中遇到的约7.0到7.6的pH下具有与粘附分子-4的较低结合亲和力。如以下实例中所示，本发明的示范性抗粘附分子-4抗体或抗体片段在pH6.0下与粘附分子-4的结合亲和力高于在pH 7.4下的结合亲和力。
在某些实施例中，本发明的抗粘附分子-4抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的条件下与粘附分子-4的解离常数(Kd)为约≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM或≦0.001nM(例如，10-8M或更小，或10-8M到10-13M，或10-9M到10-13M)。在一个实施例中，所述抗体或抗体片段在非肿瘤微环境中的条件下与粘附分子-4的Kd与在肿瘤微环境中的相同条件下的Kd的比率为至少约1.5:1、至少约2:1、至少约3:1、至少约4:1、至少约5:1、至少约6:1、至少约7:1、至少约8:1、至少约9:1、至少约10:1、至少约20:1、至少约30:1、至少约50:1、至少约70:1或至少约100:1。
在另一实施例中，所述抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的条件下与粘附分子-4的结合活性与在非肿瘤微环境中的相同条件下的结合活性的比率为至少约1.5:1、至少约2:1、至少约3:1、至少约4:1、至少约5:1、至少约6:1、至少约7:1、至少约8:1、至少约9:1、至少约10:1、至少约20:1、至少约30:1、至少约50:1、至少约70:1或至少约100:1。
在一个实施例中，Kd是通过放射性标记的抗原结合分析(RIA)测量，所述分析利用相关抗体的Fab型式及其抗原使用以下分析进行。Fab对抗原的溶液结合亲和力通过以下来测量：在未标记抗原的一系列滴定物存在下用最低浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，随后用经抗Fab抗体涂布的培养板捕捉结合抗原(参见例如，陈(Chen)等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，293:865-881(1999))。为确定分析条件，将
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多孔板(Thermo Scientific)用含5μg/ml捕捉抗Fab抗体(Cappel Labs)的50mM碳酸钠(pH 9.6)涂布隔夜，且随后在室温(约23℃)下用含2％(w/v)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水(PBS)阻断二到五小时。在无吸附剂板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]抗原与相关Fab的连续稀释液混合(例如与普雷斯塔(Presta)等人，《癌症研究(Cancer Res.)》，57:4593-4599(1997))中的抗VEGF抗体Fab-12的评估一致)。随后将相关Fab培育隔夜；然而，培育可持续较长时间段(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，在室温下将混合物转移到捕捉培养板中以用于培育(例如持续一小时)。随后去除溶液且用含0.1％聚山梨醇酯20
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的PBS洗涤板八次。当板已经干燥时，添加150微升/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；帕卡德公司(Packard))，且在TOPCOUNTTMγ计数器(帕卡德公司)上对板计数十分钟。选择提供小于或等于20％最大结合的各Fab的浓度以用于竞争性结合分析。
根据另一实施例，Kd是使用表面等离子共振分析，使用
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或
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(新泽西州皮斯卡塔韦的BIAcore有限公司(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.))在25℃下利用约10个反应单位(RU)的固定抗原CM5芯片来测量。简单地说，根据供应商说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感应器芯片(CM5，BIAcore有限公司)。用10mM乙酸钠(pH4.8)将抗原稀释到5μg/ml(约0.2μM)，随后在5微升/分钟的流动速率下注射以获得大约10个反应单位(RU)的偶合蛋白质。在注入抗原后，注入1M乙醇胺以阻断未反应的基团。关于动力学测量，在25℃下以约25μl/min的流动速率注射Fab于含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释液(0.78nM到500nM)。使用简单的一对一朗格缪尔结合模型(one-to-one Langmuir binding model)(
Figure BDA0004004183260000565
评估软件3.2版)通过同时拟合缔合及解离感测图谱来计算缔合速率(kon)及解离速率(koff)。平衡解离常量(Kd)按比率koff/kon来计算。参见例如陈(Chen)等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离子体子共振分析，缔合速率(on-rate)超过106M-1s-1，那么可通过使用荧光淬灭技术测定缔合速率，所述荧光淬灭技术在存在如(例如)具有搅拌式光析槽的停流装备型分光光度计(Aviv仪器(Aviv Instruments))或8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(美国热电公司(ThermoSpectronic))的光谱仪中所测量的渐增浓度的抗原的情况下，在25℃下测量含20nM抗抗原抗体(Fab形式)的PBS(pH 7.2)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或降低。
本发明的抗粘附分子-4抗体可为嵌合抗体、人类化抗体或人类抗体。在一个实施例中，采用抗粘附分子-4抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、Fab′-SH、scFv、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体或F(ab')2片段及由抗体片段形成的多特异性抗体。在另一实施例中，抗体为全长抗体，例如完整IgG抗体或如本文中所定义的其它抗体类别或同型。关于某些抗体片段的综述，参见哈德森(Hudson)等人，《自然医学(Nat.Med.)》，第9卷,第129到134页,2003。关于scFv片段的综述，参见例如普拉克松(Pluckthun)，《单克隆抗体的药物学(ThePharmacology of Monoclonal Antibodies)》，第113卷，罗森堡(Rosenburg)及摩尔(Moore)编,(纽约的施普林格公司(Springer-Verlag,New York))，第269到315页(1994)；亦参见WO93/16185；及美国专利第5,571,894号及第5,587,458号。关于包括救助受体结合表位残基且具有延长的活体内半衰期的Fab及F(ab′)2片段的论述，参见美国专利第5,869,046号。
本发明的双功能抗体可为二价的或双特异性的。关于双功能抗体的实例，参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；哈德森(Hudson)等人，《自然医学》，9:129-134(2003)；及霍林格(Hollinger)等人，《美国科学院院报》，第90卷，第6444到6448页，1993。三功能抗体及四功能抗体的实例亦描述于哈德森(Hudson)等人，《自然医学》，第9卷，第129到134页,2003中。
在一些实施例中，本发明包括有包括抗体的所有或一部分重链可变域或所有或一部分轻链可变域的单域抗体片段。在某些实施例中，单域抗体为人类单域抗体(马萨诸塞州沃尔瑟姆的Domantis公司(Domantis,Inc.,Waltham,MA)；参见(例如)美国专利第6,248,516B1号)。
抗体片段可通过各种技术制得，包含(但不限于)蛋白分解消化完整抗体以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生，如本文所描述。
在一些实施例中，本发明的抗粘附分子-4抗体可为嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利第4,816,567号；及莫里森(Morrison)等人，《美国科学院院报》，第81卷,第6851到6855页,1984)中。在一个实例中，嵌合抗体包括非人类可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人类灵长类动物(例如猴)的可变区)及人类恒定区。在另一实例中，嵌合抗体为“类别转换”抗体，其中相对于亲本抗体的类别或子类，所述抗体的类别或子类已有所变化。嵌合抗体包含其抗原结合片段。
在某些实施例中，本发明的嵌合抗体为人类化抗体。通常，对非人类抗体进行人类化以降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人类抗体的特异性及亲和力。一般来说，人类化抗体包括一或多个可变域，其中CDR(或其部分)源自非人类抗体，且FR(或其部分)源自人类抗体序列。人类化抗体可任选地还包括人类恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人类化抗体中的一些FR残基经来自非人类抗体(例如，CDR残基所来源的抗体)的对应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人类化抗体及其制造方法综述于例如阿尔玛格罗(Almagro)及弗兰松(Fransson)，《生物科学前言(Front.Biosci.)》,第13卷，第1619到1633页，2008中，且进一步描述于例如赖克曼(Riechmann)等人，《自然》，第332卷，第323到329页，1988；昆娜(Queen)等人，《美国科学院院报》，第86卷，第10029到10033页，1989；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号及第7,087,409号；卡什米里(Kashmiri)等人，《方法(Methods)》,第36卷，第25到34页，2005(描述SDR(a-CDR)移植)；帕德兰(Padlan)，《分子免疫学(Mol.Immunol.)》,第28卷，第489到498页，1991(描述“表面重塑”)；德拉卡(Dall'Acqua)等人，《方法(Methods)》,第36卷，第43到60页，2005(描述“FR改组”)；及奥斯伯恩(Osbourn)等人，《方法(Methods)》,第36卷，第61到68页，2005及克利姆卡(Klimka)等人，《英国癌症杂志(Br.J.Cancer)》,第83卷，第252到260页，2000(描述FR改组的“导引选择”途径)中。
可用于人类化的人类构架区包含(但不限于)：使用“最优拟合(best-fit)”方法选择的构架区(参见例如西姆斯(Sims)等人，《免疫学杂志》，第151卷，第2296页，1993)；来源于具有轻链或重链可变区的特定子组的人类抗体的共同序列的构架区(参见例如卡特Carter等人，《美国科学院院报》,第89卷，第4285页，1992；及普雷斯塔(Presta)等人，《免疫学杂志》,第151卷，第2623页，1993)；人类成熟(体细胞突变)构架区或人类生殖系构架区(参见例如阿尔玛格罗(Almagro)及弗兰松(Fransson)，《生物科学前言(Front.Biosci.)》，第13卷，第1619到1633页，2008)；及来源于筛选FR库的构架区(参见例如巴卡(Baca)等人，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》，第272卷，第10678到10684页，1997及罗索基(Rosok)等人，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》，第271卷，第22611到22618页，1996)。
A.多特异性抗体及抗体片段
本发明提供多特异性抗粘附分子-4抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体为对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施例中，结合特异性之一是针对粘附分子-4且另一者是针对其它抗原。在某些实施例中，双特异性条件活性抗体可结合到粘附分子-4的两个不同表位。多特异性抗体结合到至少粘附分子-4及另一抗原，其中在第一生理条件下的活性、亲和力及/或亲合力大于在第二生理条件下的活性、亲和力及/或亲合力。双特异性抗体亦可用于将细胞毒性剂定位到表达粘附分子-4的细胞。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段。
在一些实施例中，第一生理条件为异常条件且第二生理条件为正常生理条件。举例来说，异常条件可为肿瘤微环境中的条件。本发明的多特异性抗体可称为条件活性多特异性抗体。
在一些实施例中，条件活性多特异性抗体在正常生理条件下在与其靶抗原或表位中的一者或两者的结合方面几乎失活但在异常条件下具有活性，任选地活性水准高于条件活性多特异性抗体在正常生理条件下的活性或其所来源的亲本抗体在正常生理条件下的活性。在另一实施例中，条件活性多特异性抗体在pH 7.0到7.6下具有较低活性或几乎无活性，但在较低pH 5.0到6.8下具有活性。在一些情况下，条件活性多特异性抗体在正常生理条件下为可逆或不可逆失活。在另一实例中，条件活性多特异性抗体可在肿瘤微环境中发现的较低pH环境下更具活性。条件活性多特异性抗体可用作药物、治疗剂或诊断剂。
在一些实施例中，相较于条件活性多特异性抗体或抗体片段所来源的亲本或野生型抗体或抗体片段在正常生理条件下的活性，条件活性多特异性抗体或抗体片段在正常生理条件(例如非肿瘤微环境)下具有较低活性或几乎失活但在异常条件(例如肿瘤微环境)下具有活性。因此，相比于本发明的抗粘附分子-4多特异性抗体或抗体片段所来源的亲本或野生型抗体或抗体片段，本发明的抗粘附分子-4多特异性抗体或抗体片段在正常生理条件(例如非肿瘤微环境)下可具有与粘附分子-4的较低结合。举例来说，相较于亲本或野生型抗体或抗体片段，条件活性多特异性抗体或抗体片段在pH7.0到7.6下具有较低活性或几乎失活，但相较于亲本或野生型抗体或抗体片段，在较低pH 5.0到6.8下具有活性。在一些情况下，相较于亲本或野生型抗体或抗体片段，条件活性多特异性抗体或抗体片段在正常生理条件(例如非肿瘤微环境)下为可逆或不可逆失活。
用于制造多特异性抗体的技术包含(但不限于)重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见米尔斯坦(Milstein)及奎洛(Cuello)，《自然》，第305卷，第537到540页，1983)，WO 93/08829，及特劳内特(Traunecker)等人，《EMBO杂志(EMBOJ.)》，第10卷，第3655到3659页，1991)，及“杵-臼结构(knob-in-hole)”工程改造(参见例如美国专利第5,731,168号)。多特异性抗体亦可通过以下来制备：用于制备抗体Fc-杂二聚分子的工程化静电导向效应(WO 2009/089004A1)；使两种或更多种抗体或片段交联(参见例如美国专利第4,676,980号及布伦兰(Brennan)等人，《科学(Science)》,第229卷，第81到83页，1985)；使用白氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如科斯特尼(Kostelny)等人，《免疫学杂志》,第148卷，第1547到1553页，1992)；使用用于制备双特异性抗体片段的“双功能抗体”技术(参见例如霍利格(Hollinger)等人，《美国科学院院报》,第90卷，第6444到6448页，1993)；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如格鲁伯(Gruber)等人，《免疫学杂志》第152卷，第5368到5374页，1994)；及如例如塔特(Tutt)等人，《免疫学杂志》，第147卷，第60到69页，1991中所述制备三特异性抗体。
本文亦包含具有三个或更多个功能抗原结合位点的经工程改造的抗体，包含“章鱼抗体(Octopus antibodies)”(参见例如US 2006/0025576A1)。
本发明的抗粘附分子-4抗体或抗体片段可使用重组方法及组合物制造，其详细描述于US 2016/0017040中。
本发明的抗粘附分子-4抗体或抗体片段的物理/化学特性及/或生物活性可通过所属领域中已知的各种分析来测试及测量。一些这些分析描述于美国专利第8,853,369号中。
B.免疫结合物
在另一方面，本发明还提供免疫结合物，其包括如本文所描述的与一或多种细胞毒性剂，例如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)及放射性同位素结合的分离多肽或抗粘附分子-4抗体或抗体片段。
在一个实施例中，免疫结合物为其中抗体或抗体片段结合到一或多种药物的抗体-药物结合物(ADC)，所述药物包含(但不限于)类美登素(maytansinoid)(参见美国专利第5,208,020号、第5,416,064号及欧洲专利EP 0 425 235 B1)；奥瑞他汀，例如单甲基奥瑞他汀药物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(参见美国专利第5,635,483号及第5,780,588号及第7,498,298号)；海兔毒素(dolastatin)；卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号及第5,877,296号；希曼(Hinman)等人，《癌症研究》，第53卷，第3336到3342页,1993；及洛德(Lode)等人，《癌症研究》，第58卷，第2925到2928页,1998)；蒽环霉素，例如柔红霉素或小红霉(参见克拉茨(Kratz)等人，《现代药物化学(CurrentMed.Chem.)》,第13卷，第477到523页,2006；杰弗里(Jeffrey)等人，《生物有机与药物化学快报(Bioorganic&Med，Chem.Letters)》，第16卷，第358到362页，2006；托尔戈夫(Torgov)等人，《结合物化学(Bioconj.Chem.)》，第16卷，第717到721页，2005；纳吉(Nagy)等人，《美国科学院院报》，第97卷，第829到834页，2000；杜博奇克(Dubowchik)等人，《生物有机与药物化学快报》，第12卷，第1529到1532页，2002；金(King)等人，《药物化学杂志(J.Med.Chem.)》,第45卷，第4336到4343页，2002；及美国专利第6,630,579号)；甲氨喋呤；长春地辛；紫杉烷，例如多烯紫杉醇、太平洋紫杉醇、拉洛他赛(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)及奥他赛(ortataxel)；单端孢霉烯族毒素；及CC1065。
在另一实施例中，免疫结合物包括结合于酶促活性毒素或其片段的如本文所述的抗体或抗体片段，所述酶促活性毒素或其片段包含(但不限于)白喉A链(diphtheria Achain)、白喉毒素(diphtheria toxin)的非结合活性片段、外毒素A链(来从绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链(ricin A chain)、相思子毒素A链(abrin Achain)、莫迪素A链(modeccin A chain)、α-帚曲菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、康乃馨(dianthin)蛋白、洋商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树素(gelonin)、有丝分裂素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)及单端孢霉烯族毒素。
在另一实施例中，免疫结合物包括结合于放射性原子的如本文所述的抗体或抗体片段以形成放射性结合物。多种放射性同位素可用于制造放射性结合物。实例包含At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu的放射性同位素。当放射性结合物用于检测时，其可包括用于闪烁摄影研究的放射性原子，例如tc99m或I123；或用于核磁共振(NMR)成像(又称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，例如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰及铁。
在一些实施例中，免疫结合物包括放射性试剂，其可选自α发射体、β发射体及γ发射体。α发射体的实例为211At、210Bi、212Bi、211Bi、223Ra、224Ra、225Ac及227Th。β发射体的实例为67Cu、90Y、131I、153Sm、l66Ho及186Re。γ发射体的实例为60Co、137Ce、55Fe、54Mg、203Hg及133Ba。
可使用多种双官能蛋白质偶合剂制得抗体/抗体片段与细胞毒性剂的结合物，所述双官能蛋白质偶合剂是例如N-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、酰亚胺酯的双官能衍生物(例如己二酰亚胺酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(例如辛二酸二丁二酰亚胺酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)及双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。举例来说，蓖麻毒素免疫毒素可如维泰塔(Vitetta)等人，《科学》，第238卷,第1098页,1987中所描述来制备。碳14标记的1-异硫氰基苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为用于使放射性核苷酸与抗体结合的示范性螯合剂。参见WO 94/11026。连接子可为在细胞中促进细胞毒性药物释放的“可裂解连接子”。举例来说，可使用酸不稳定性连接子、肽酶敏感性连接子、光不稳定性连接子、二甲基连接子或含二硫键的连接子(查理(Chari)等人，《癌症研究》,第52卷,第127到131页,1992；美国专利第5,208,020号)。
本文的免疫结合物明确涵盖(但不限于)用交联试剂制备的结合物，所述交联试剂包含(但不限于)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB，及SVSB(丁二酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，所述交联试剂可购得(例如购自美国伊利诺伊州罗克福德市的皮尔斯生物技术有限公司(Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A))。
ADC的示范性实施例包含靶向肿瘤细胞的抗体或抗体片段(Ab)、药物部分(D)及将Ab连接到D的连接子部分(L)。在一些实施例中，抗体经由一或多个氨基酸残基，例如赖氨酸及/或半胱氨酸附接于连接子部分(L)。
示范性ADC具有式I：Ab-(L-D)p，其中p为1到约20。在一些实施例中，可结合到抗体的药物部分的数量受游离半胱氨酸残基的数量限制。在一些实施例中，游离半胱氨酸残基通过本文所描述的方法引入抗体氨基酸序列中。示范性式I的ADC包含(但不限于)具有1、2、3或4个经工程改造的半胱氨酸氨基酸的抗体(利昂(Lyon)等人，《酶学方法(Methods inEnzym.)》,第502卷，第123到138页，2012)。在一些实施例中，一或多个游离半胱氨酸残基不使用工程改造已存在于抗体中，在此情况下现有游离半胱氨酸残基可用于将抗体结合于药物。在一些实施例中，抗体在抗体结合前暴露于还原条件以产生一或多个游离半胱氨酸残基。
连接子用于使一部分结合于抗体以形成免疫结合物，例如ADC。适合连接子描述于WO 2017/180842中。
一些可结合到抗体的药物部分描述于WO 2017/180842中。
药物部分还包含具有核分解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸内切酶)。
在某些实施例中，免疫结合物可包括高度放射性原子。多种放射性同位素可用于产生放射性结合抗体。实例包含At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu的放射性同位素。在一些实施例中，当免疫结合物用于检测时，其可包括用于闪烁摄影研究的放射性原子，例如Tc99或I123；或用于核磁共振(NMR)成像(亦称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，例如锆-89、碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。锆-89可与各种金属螯合剂错合且与抗体结合，例如用于PET成像(WO 2011/056983)。
放射性标记或其它标记可以已知方式并入免疫结合物中。举例来说，肽可使用包括例如一或多个氟-19原子代替一或多个氢的适合氨基酸前体来生物合成或化学合成。在一些实施例中，例如Tc99、I123、Re186、Re188及In111的标记可经由抗体中的半胱氨酸残基附接。在一些实施例中，钇-90可经由抗体的赖氨酸残基附接。在一些实施例中，IODOGEN方法(弗雷克(Fraker)等人，《生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)》,第80卷，第49-到57页，1978)可用于并入碘-123。“免疫闪烁摄影中的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy)”(沙塔尔(Chatal)，CRC出版社(CRCPress)1989)描述某些其它方法。
在某些实施例中，免疫结合物可包括结合于前药活化酶的抗体。在一些此类实施例中，前药活化酶使前药(例如肽基化学治疗剂，参见WO 81/01145)转化为活性药物，例如抗癌药物。在一些实施例中，此类免疫结合物适用于抗体依赖性酶介导之前药疗法(“ADEPT”)。可结合到抗体的酶包含(但不限于)碱性磷酸酶，其可用于将含磷酸酯的前药转化为游离药物；芳基硫酸酯酶，其可用于将含硫酸酯的前药转化为游离药物；胞嘧啶脱氨酶，其可用于将无毒5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，例如沙雷菌属(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶及组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B及L)，其可用于将含肽前药转化为游离药物；D-丙氨酰基羧肽酶，其可用于转化含有D-氨基酸取代基的前药；碳水化合物裂解酶，例如β-半乳糖苷酶及神经氨酸酶，其可用于将糖基化前药转化为游离药物；β-内酰胺酶，其可用于将经β-内酰胺衍生化的药物转化为游离药物；以及青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶及青霉素G酰胺酶，其可用于将胺氮分别经苯氧基乙酰基或苯乙酰基衍生化的药物转化为游离药物。在一些实施例中，酶可通过所属领域中熟知的重组DNA技术共价结合于抗体。参见例如纽伯格(Neuberger)等人，《自然》，第312卷，第604到608页，1984。
结合物中的载药量由p表示，p为每一抗体的药物部分的平均数量。载药量可在每个抗体1到20个药物部分的范围内。本发明的结合物可具有在1到20个范围内的药物部分。在由结合反应制备结合物时，每个抗体的药物部分的平均数目可通过例如质谱分析、ELISA分析及HPLC的常规方式表征。
对于一些抗体-药物结合物(ADC)，载药量可受抗体上连接位点的数量限制。举例来说，在连接为胱氨酸硫醇的情况下，如在以上某些示范性实施例中，抗体可仅具有一个或若干个半胱氨酸硫醇基，或可仅具有一个或若干个可连接连接子的足够反应性硫醇基。在某些实施例中，较高载药量(例如p>5)可造成某些抗体-药物结合物的凝聚、不可溶性、毒性或细胞渗透性丧失。在某些实施例中，ADC的平均载药量在1到约8个；或约2到约6个；或约3到约5个的范围内。实际上，某些ADC已展示药物部分/抗体的最优比率可低于8，且可为约2到约5(美国专利第7,498,298号)。
在某些实施例中，在结合反应期间使少于理论最大值的药物部分结合于抗体。抗体可含有例如不与药物-连接子中间物或连接子试剂反应的赖氨酸残基，如下文所论述。一般来说，抗体不含许多可连接到药物部分的游离及反应性半胱氨酸硫醇基。实际上，抗体中的大多数半胱氨酸硫醇基残基以二硫桥键形式存在。在某些实施例中，抗体可用例如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)的还原剂在部分或完全还原条件下还原，产生反应性半胱氨酸硫醇基。在某些实施例中，抗体经历变性条件，以显出反应性亲核基团，例如赖氨酸或半胱氨酸。
ADC的负载(药物/抗体比率)可以不同方式控制，且例如通过如下来控制：(i)限制药物-连接子中间物或连接子试剂相对于抗体的摩尔过量；(ii)限制结合反应时间或温度；及(iii)针对半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原条件。
C.用于诊断及检测的方法及组合物
在某些实施例中，本文所提供的分离多肽或抗粘附分子-4抗体或抗体片段中的任一者可用于定量或定性地检测生物样品中粘附分子-4的存在。在某些实施例中，生物样品包括细胞或组织，例如乳房、胰腺、食道、肺及/或大脑细胞或组织。
本发明的另一方面涉及如本文所描述的本发明的分离多肽或抗粘附分子-4抗体或抗体片段，其用于诊断及/或监测其中体内的至少一个部位中的粘附分子-4表达量相对于正常生理水准增加或减少的癌症或另一种疾病。
在一优选实施例中，本发明的分离多肽或抗体或抗体片段可用例如荧光分子、放射性分子或上述在所属领域中已知的任何其它标记的可检测分子或物质标记。举例来说，本发明的抗体或抗体片段可用放射性分子标记。举例来说，适合放射性分子包含(但不限于)用于闪烁摄影研究的放射性原子，例如123I、124I、111In、186Re及188Re。本发明的抗体或抗体片段亦可用用于核磁共振(NMR)成像的自旋标记来标记，例如碘-123、碘-131、铟-Ill、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。在投予抗体后，检测患者体内放射性标记抗体的分布。可使用任何适合的已知方法。一些非限制性实例包含，计算机断层扫描(CT)、正电子发射断层摄影(PET)、磁共振成像(MRI)、荧光、化学发光及超声波扫描。
如本文所描述的本发明的分离多肽或抗体或抗体片段可适用于诊断及分级与粘附分子-4过度表达相关的癌症及疾病。与粘附分子-4过度表达相关的癌症可包含鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰脏癌、胶细胞肿瘤(例如神经胶母细胞瘤及神经纤维瘤)、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝肿瘤、乳癌、结肠癌、黑素瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer/renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肉瘤、血液癌(白血病)、星形细胞瘤及各种类型的头颈癌或其它粘附分子-4表达或过度表达型过度增殖性疾病。
如本文所描述的本发明的分离多肽或抗体或抗体片段可适用于诊断粘附分子-4表达增加或减少的除癌症以外的疾病。可溶性或细胞粘附分子-4形式均可用于此类诊断。通常，此类诊断性方法涉及使用获自患者的生物样品。生物样品涵盖从个体获得的可用于诊断或监测分析的多种样品类型。生物样品包含(但不限于)血液及生物学来源的其它液体样品、实体组织样品(例如活检样本)或组织培养基或来源于其的细胞及其子代。举例来说，生物样品包含获自由怀疑患有与粘附分子-4过度表达相关的癌症的个体收集的组织样品的细胞，且在优选实施例中，获自神经胶质瘤、胃、肺、胰脏、乳房、前列腺、肾、肝脏及子宫内膜。生物样品涵盖临床样品、培养物中的细胞、细胞上清液、细胞溶胞物、血清、血浆、生物流体及组织样品。
在一特定实施例中，本发明为一种诊断个体的与粘附分子-4过度表达相关的癌症的方法，其通过使用本发明抗体检测来自所述个体的细胞上的粘附分子-4而实现。详言的，所述方法可包含以下步骤：
1)使个体的生物样品与根据本发明的抗体或抗体片段在适用于抗体或抗体片段的条件下接触以与生物样品中表达粘附分子-4的细胞形成复合物；及
2)检测及/或定量所述复合物，由此所述复合物的检测指示与粘附分子-4过度表达相关的癌症。
为监测癌症的进展，可在不同时间重复根据本发明的方法以确定结合于样品的抗体是否增加或减少，由此可确定癌症是否发展、消退或稳定。
在一特定实施例中，本发明为一种诊断与粘附分子-4的表达或过度表达相关的疾病的方法。此类疾病的实例可包含人类免疫病症，血栓性疾病(血栓形成及动脉粥样硬化血栓形成)及心血管病。
在一个实施例中，提供一种用于诊断或检测方法的抗粘附分子-4抗体或抗体片段。在另一方面，提供一种检测生物样品中粘附分子-4的存在的方法。在另一方面，提供一种定量生物样品中粘附分子-4的量的方法。在某些实施例中，所述方法包括使生物样品与如本文所述的抗粘附分子-4抗体或抗体片段在容许抗粘附分子-4抗体或抗体片段与粘附分子-4结合的条件下接触，及检测抗粘附分子-4抗体或抗体片段与粘附分子-4之间是否形成复合物。此类方法可在活体外或活体内进行。在一个实施例中，使用抗粘附分子-4抗体或抗体片段以选择符合治疗的个体。在一些实施例中，疗法将包含向个体投予抗粘附分子-4抗体或抗体片段。
在某些实施例中，提供经标记抗粘附分子-4抗体或抗体片段。标记包含(但不限于)直接检测的标记或部分(例如荧光、发色、电子致密、化学发光及放射性标记)，以及例如经由酶反应或分子相互作用间接检测的部分(例如酶或配体)。示范性标记包含(但不限于)放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I；荧光团，例如稀土螯合物或荧光素及其衍生物；如果丹明(rhodamine)及其衍生物；丹酰基(dansyl)；伞酮(umbelliferone)；荧光素酶，例如萤火虫荧光素酶及细菌荧光素酶(美国专利第4,737,456号)；荧光素；2,3-二氢呔嗪二酮；辣根过氧化酶(HRP)；碱性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶菌酶；糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氢酶；杂环氧化酶，例如尿酸酶及黄嘌呤氧化酶，其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶(例如HRP、乳过氧化酶或微过氧化酶)偶合；生物素/抗生素蛋白；自旋标记；噬菌体标记；稳定自由基及其类似物。
D.药物调配物
如本文所描述的分离多肽或抗粘附分子-4抗体或抗体片段具有细胞杀灭活性。此细胞杀灭活性延伸到多种不同类型的细胞系。此外，本发明的这些分离多肽或抗体或抗体片段一旦与细胞毒性剂结合则可减小肿瘤尺寸且可展现降低的毒性。因此，分离多肽、抗粘附分子-4抗体、其片段或免疫结合物可适用于治疗与粘附分子-4表达相关的增殖性疾病。分离多肽、抗体、片段或免疫结合物可单独或与任何适合的药剂或其它常规治疗组合使用。
分离多肽或抗粘附分子-4抗体或抗体片段可用于治疗与粘附分子-4表达、过度表达或活化相关的疾病。除对粘附分子-4表达的要求外对可治疗的癌症或组织的类型无特定限制。实例包含鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰脏癌、胶细胞肿瘤(例如神经胶母细胞瘤及神经纤维瘤)、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝肿瘤、乳癌、结肠癌、黑素瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer/renalcancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肉瘤、血液癌(白血病)、星形细胞瘤及各种类型的头颈癌。更优选的癌症为神经胶质瘤、胃癌、肺癌、胰脏癌、乳癌、前列腺癌、肾癌、肝癌及子宫内膜癌。
如本文所描述的分离多肽或抗粘附分子-4抗体或抗体片段为先天性免疫反应的潜在活化剂且因此可用于治疗人类免疫病症，例如败血症。举例来说，本发明的抗粘附分子-4抗体或抗体片段亦可作为佐剂用于免疫接种，例如用于疫苗，且用作抵抗例如细菌、病毒及寄生虫的抗感染药剂。
分离多肽或抗粘附分子-4抗体或抗体片段可用于保护免遭、预防或治疗血栓性疾病，例如静脉及动脉血栓形成及动脉粥样硬化血栓形成。举例来说，抗粘附分子-4抗体或抗体片段亦可用以保护免遭、预防或治疗心血管病以及预防或抑制例如拉沙热病(Lassa)及埃博拉(Ebola)病毒的病毒的侵入及治疗病毒感染。
在本文所述的治疗方法的各个实施例中，分离多肽、抗粘附分子-4抗体、抗体片段或抗粘附分子-4抗体或抗体片段免疫结合物可以与管理寻求治疗的疾病或病症相关的常规方法一致的方式递送。根据本发明，在足以预防或治疗疾病或病症的一段时间及条件下向需要此类治疗的个体投予有效量的抗体、抗体片段或免疫结合物。因此，本发明的一方面涉及一种用于治疗与粘附分子-4的表达相关的疾病的方法，其包括向有需要的个体投予治疗有效量的本发明的抗体、抗体片段或免疫结合物。
对于投药，可将抗粘附分子-4抗体、抗体片段或免疫结合物调配为药物组合物形式。本发明的包含分离多肽、抗粘附分子-4抗体、抗体片段或免疫结合物的药物组合物可根据用于制备药物组合物的已知方法来调配。在此类方法中，通常将治疗性分子与含有药学上可接受的载剂的混合物、溶液或组合物组合。
药学上可接受的载剂为接受患者可耐受的物质。无菌磷酸盐缓冲生理盐水为药学上可接受的载剂的一个实例。其它合适的药学上可接受的载剂为熟习所属领域者所熟知。(参见例如詹纳罗(Gennaro)(编)，《雷明顿的药物科学(Remington's PharmaceuticalSciences)》(麦克出版公司(Mack Publishing Company),第19版.1995))。调配物可进一步包含一或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、防止小瓶表面上的蛋白损失的白蛋白等。
药物组合物的形式、投予途径、剂量及方案当然地视待治疗的病状、疾病的严重程度、患者的年龄、体重及性别等而定。所属领域的技术人员可考虑这些考虑因素以调配适合的药物组合物。本发明的药物组合物可经调配用于局部、经口、非经肠、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下或眼内投予及类似投予方式。
优选地，药物组合物含有能够注射的调配物在药学上可接受的媒剂。这些媒剂尤其可为等张的无菌生理盐水溶液(磷酸单钠或二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁及其类似物或此类盐的混合物)，或干燥，尤其冷冻干燥的组合物，其在添加例如灭菌水或生理盐水时，使得可复原成可注射溶液。
在一些实施例中，存在张力剂，有时称为“稳定剂”以调节或维持组合物中液体的张力。当与大型带电生物分子(例如蛋白质及抗体)一起使用时，其通常称为“稳定剂”，因为其可与氨基酸侧链的带电基团相互作用，借此减小分子间及分子内相互作用的可能性。张力剂可以药物组合物的0.1重量％到25重量％，优选1重量％到5重量％的任何量存在。优选张力剂包含多羟基糖醇，优选地三元醇或高级糖醇，例如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇。
额外赋形剂包含可充当以下中的一或多者的试剂：(1)增积剂，(2)溶解增强剂，(3)稳定剂，及(4)防止变性或黏着于容器壁的试剂。此类赋形剂可包含：多羟基糖醇(上文所列举)；氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、白氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸及苏氨酸等；有机糖或糖醇，例如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌肉肌糖(myoinisitose)、肌肉肌醇(myoinisitol)、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(例如肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，例如脲、麸胱甘肽、硫辛酸、巯乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油及硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，例如人类血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如木糖、甘露糖、果糖及葡萄糖；双糖(例如乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖，例如棉子糖；及多糖，例如糊精或葡聚糖。
可采用非离子表面活性剂或清洁剂(又称为“润湿剂”)以有助于溶解治疗剂以及保护治疗蛋白以抵抗搅动诱导的聚集，由此也可使得调配物暴露于剪切表面应力而不会致使活性治疗蛋白或抗体变性。非离子表面活性剂可按约0.05mg/ml到约1.0mg/ml，优选约0.07mg/ml到约0.2mg/ml的浓度范围存在。
适合的非离子表面活性剂包含聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、聚氧化物(polyoxamer)(184、188等)、
Figure BDA0004004183260000692
多元醇、
Figure BDA0004004183260000691
聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(
Figure BDA0004004183260000693
等)、聚桂醇400、聚乙二醇40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50及60、甘油单硬脂酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素及羧基甲基纤维素。可使用的阴离子性洗涤剂包含月桂基硫酸钠、二辛基磺基丁二酸钠及二辛基磺酸钠。阳离子性洗涤剂包含苯扎氯铵或苄索氯铵。
用于投予的剂量可随各种参数而调适，且特定地说随所用投予模式、相关病理学或者所需治疗持续时间而调适。为制备药物组合物，可将有效量的抗体或抗体片段溶解或分散于药学上可接受的载剂或水性介质中。
适用于可注射使用的药物形式可包含无菌水溶液或分散液；调配物，包含芝麻油、花生油或水性丙二醇；及用于无菌可注射溶液或分散液的临时制备的无菌粉末。在所有情况下，形式必须为无菌的，且必须在易于注射性存在的程度上为流体。其在制造及存储条件下必须稳定，且必须保护其免遭例如细菌及真菌的微生物的污染作用。
呈游离碱或药理学上可接受的盐形式的活性化合物的溶液可于水中适当地与表面活性剂混合来制备。亦可在甘油、液态聚乙二醇及其混合物中及在油中制备分散液。在一般存储及使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
抗粘附分子-4抗体或抗体片段可调配成呈中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包含酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)且其由无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸及类似者)形成。用游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因(procaine)及类似碱。
载剂亦可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液体聚乙二醇及其类似物)、其适合的混合物及植物油的溶剂或分散介质。举例来说，可通过使用包衣(例如卵磷脂)、通过维持就分散液而言所需粒径及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。微生物作用的预防可通过各种抗细菌剂及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及其类似物来实现。在许多情况下，优选包含等张剂，例如糖或氯化钠。可通过在组合物中使用延缓吸收剂(例如，单硬脂酸铝及明胶)来延长可注射组合物的吸收。
无菌可注射溶液是通过如下制备：将所要量的活性化合物视需要与上文列举的其它成分中的一或多者一起并入适当溶剂中，随后过滤灭菌。一般来说，通过将各种灭菌活性成分并入含有碱性分散介质及来自上文列举的那些成分的所需其它成分的无菌媒剂中来制备分散液。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，优选制备方法为真空干燥及冷冻干燥技术，由其先前无菌过滤溶液产生活性成分加任何额外所需成分的粉末。
亦涵盖制备更多或高浓度的用于直接注射的溶液，其中设想使用二甲亚砜(DMSO)作为溶剂产生极快渗透，递送高浓度的活性剂到小肿瘤区域中。
在配制时，溶液将以与剂量调配物相容的方式且以例如治疗有效的量施用。调配物易于以各种剂型，例如上文所描述的可注射溶液的类型投予，但亦可采用药物释放胶囊及其类似者。
对于以水溶液形式非经肠投予，例如，所述溶液必要时应经适当缓冲且先用足够的生理盐水或葡萄糖使液体稀释剂具有等张性。这些特定水溶液尤其适于静脉内、肌肉内、皮下及腹膜内投予。在此方面，根据本发明，可采用的无菌水性介质将为所属领域的技术人员已知的。举例来说，单次剂量可溶解于1ml等张NaCl溶液中，且添加到1000ml皮下灌注流体，或在建议的输注位点注射，(参见例如“雷明顿的药物科学”，第15版，第1035到1038页及第1570到1580页)。视所治疗个体的病状而定，将必然产生一些剂量变化。在任何事件中，负责投予的人员将确定个别个体的适当剂量。
抗体或抗体片段可调配于治疗性混合物内以每剂量递送约0.0001到10.0毫克，或约0.001到5毫克，或约0.001到1毫克，或约0.001到0.1毫克，或约0.1到1.0或甚至约10毫克。亦可以所选时间间隔投予多个剂量。
除经调配用于非经肠投予(例如静脉内或肌肉内注射)的化合物以外，其它药学上可接受的形式包含例如锭剂或用于经口投予的其它固体；延时释放胶囊；及目前所用的任何其它形式。
在某些实施例中，涵盖使用脂质体及/或纳米粒子将抗体或抗体片段引入到宿主细胞中。脂质体及/或纳米粒子的形式及用途为所属领域的技术人员所已知。
纳米胶囊可一般以稳定及可复制方式裹住化合物。为避免由细胞内聚合物过载引起的副作用，此类超细粒子(尺寸为约0.1μm)一般使用能够在活体内降解的聚合物设计。涵盖满足这些要求的生物可降解氰基丙烯酸聚烷酯纳米粒子以用于本发明，且这类颗粒可易于制得。
脂质体由磷脂形成，磷脂分散于水性介质中且自发形成多层同心双层小泡(亦称为多层小泡(MLV))。MLV一般具有25nm到4μm的直径。MLV的音波处理使得形成直径在200到500埃范围内且在核心含有水溶液的小单层小泡(SUV)。脂质体的物理特征视pH值、离子强度及二价阳离子的存在而定。
如本文所描述的含有抗粘附分子-4抗体或抗体片段的药物调配物是通过将具有所要纯度的所述抗体或抗体片段与一或多种任选的药学上可接受的载剂混合(《雷明顿的药物科学》，第16版,Osol,A.编(1980))，以冻干调配物或水溶液形式来制备。药学上可接受的载剂在所采用的剂量及浓度下一般对接受者无毒性，且包含但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸及甲硫氨酸；保存剂(例如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁基或苯甲醇；对羟苯甲酸烷酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖，及其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相对离子，例如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；及/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。
本文中的示范性药学上可接受的载剂进一步包含间质药物分散剂，例如可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人类可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(
Figure BDA0004004183260000721
，百特国际有限公司(Baxter International,Inc.))。某些示范性sHASEGP及使用方法，包含rHuPH20，描述于美国专利公开第2005/0260186号及第2006/0104968号中。在一个方面，sHASEGP与一或多种其它葡萄糖氨聚糖酶(例如软骨素酶)组合。
示范性冻干抗体调配物描述于美国专利第6,267,958号中。水性抗体调配物包含美国专利第6,171,586号及WO 2006/044908中所描述的那些调配物，后一调配物包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
视所治疗的特定适应症所的需要，本文中的调配物亦可含有多于一种活性成分。优选地，可将不会彼此不利影响的具有互补活性的成分组合成单一调配物。举例来说，除本发明的抗粘附分子-4抗体、抗体片段或免疫结合物以外，可能还需要提供EGFR拮抗剂(例如埃罗替尼(erlotinib))、抗血管生成剂(例如VEGF拮抗剂，其可为抗VEGF抗体)或化学治疗剂(例如紫杉醇或铂药剂)。这类活性成分宜以有效达成预期目的的量组合存在。
在一个实施例中，本发明的抗粘附分子-4抗体、抗体片段或免疫结合物与针对选自以下的抗原的另一抗体或抗体片段组合于调配物中：CTLA4、PD1、PD-L1、AXL、ROR2、CD3、HER2、B7-H3、ROR1、SFRP4及WNT蛋白质，所述WNT蛋白质包含WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16。组合可呈两种各别分子形式：本发明的抗粘附分子-4抗体、抗体片段或免疫结合物及另一抗体或抗体片段。替代地，组合亦可为具有与粘附分子-4及其它抗原的结合亲和力的单分子形式，由此形成多特异性(例如，双特异性)抗体。
可将活性成分包封于例如通过凝聚技术或通过界面聚合反应制备的微胶囊中。举例来说，于胶态药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子及纳米胶囊)或巨乳液中可采用分别羟基甲基纤维素或明胶微胶囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。所述技术公开于《雷明顿的药物科学》，第16版,Osol,A.编(1980)中。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包含含有抗体或抗体片段的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品形式，例如膜或微胶囊。
用于活体内投药的调配物通常为无菌的。无菌性可容易地通过例如经由无菌过滤膜过滤来实现。
E.治疗方法及组合物
本文中所提供的分离多肽、抗粘附分子-4抗体或抗体片段或免疫结合物中的任一者可用于如下文所描述的治疗方法中。在一个方面，提供一种用作药剂的抗粘附分子-4抗体或抗体片段。在其它方面，提供一种抗粘附分子-4抗体或抗体片段，其用于治疗癌症(例如乳癌、非小细胞肺癌、胰脏癌、脑癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、白血病、子宫内膜癌、结肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、骨肉瘤及/或黑素瘤)。在某些实施例中，提供一种用于治疗方法的抗粘附分子-4抗体或抗体片段。在某些实施例中，本发明提供用于治疗患有癌症的个体的方法的抗粘附分子-4抗体或抗体片段，其包括向个体投予有效量的抗粘附分子-4抗体或抗体片段。在某些实施例中，本发明提供一种抗粘附分子-4抗体或抗体片段，其用于治疗患有免疫病症(例如自体免疫病症)、心血管病症(例如动脉粥样硬化、高血压、血栓形成)、传染病(例如埃博拉病毒、马堡病毒(Marburg virus))或糖尿病的个体的方法中，所述方法包括向个体投予有效量的抗粘附分子-4抗体或抗体片段。在一个此类实施例中，所述方法进一步包括向个体投予有效量的至少一种例如如下文所描述的其它治疗剂。在其它实施例中，本发明提供一种抗粘附分子-4抗体或抗体片段，其用于抑制血管生成、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制发炎性细胞介素分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)及/或抑制肿瘤基质功能。
在某些实施例中，本发明提供一种抗粘附分子-4抗体或抗体片段，其用于个体中抑制血管生成、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制发炎性细胞介素分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)及/或抑制肿瘤基质功能的方法中，包括向个体投予有效的抗粘附分子-4抗体或抗体片段以抑制血管生成、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制发炎性细胞介素分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管发展(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)及/或抑制肿瘤基质功能。根据以上实施例中的任一者的“个体”优选为人类。
在另一方面，本发明提供抗粘附分子-4抗体或抗体片段的用途，其用于制造或制备药剂。在一个实施例中，所述药剂用于治疗癌症(在一些实施例中，乳癌、非小细胞肺癌、胰脏癌、脑癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、白血病、子宫内膜癌、结肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、骨肉瘤及/或黑素瘤)。在另一实施例中，所述药剂用于治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的个体投予有效量的药剂。在另一实施例中，所述药剂用于治疗免疫病症(例如自体免疫病症)、心血管病症(例如动脉粥样硬化、高血压、血栓形成)、传染病(例如埃博拉病毒、马堡病毒)或糖尿病的方法中，所述方法包括向个体投予有效量的抗粘附分子-4抗体或抗体片段。在一个此类实施例中，所述方法进一步包括向个体投予有效量的至少一种例如如下文所描述的其它治疗剂。在另一实施例中，所述药剂用于抑制血管生成、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制发炎性细胞介素分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管(例如瘤内血管或肿瘤相关血管)及/或抑制肿瘤基质功能。在另一实施例中，所述药剂用于个体中抑制血管生成、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制发炎性细胞介素分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)及/或抑制肿瘤基质功能的方法中，所述方法包括向个体投予有效量的药剂以抑制血管生成、抑制细胞增殖、促进免疫功能、诱导发炎性细胞介素分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管发展(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)及/或抑制肿瘤基质功能。根据任一以上实施例的“个体”可为人类。
在另一方面，本发明提供用于治疗癌症的方法。在一个实施例中，所述方法包括向患有此类癌症的个体投予有效量的抗粘附分子-4抗体或抗体片段。在一个此类实施例中，所述方法进一步包括向个体投予有效量的至少一种如下文所描述的额外治疗剂。根据任一以上实施例的“个体”可为人类。
在另一方面，本发明提供一种治疗免疫病症(例如自体免疫病症)、心血管病症(例如动脉粥样硬化、高血压、血栓形成)、传染病(例如埃博拉病毒、马堡病毒)或糖尿病的方法。在一个此类实施例中，所述方法进一步包括向个体投予有效量的至少一种如下文所描述的额外治疗剂。根据任一以上实施例的“个体”可为人类。
在另一方面中，本发明提供一种在个体中抑制血管生成、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制发炎性细胞介素分泌(例如来从肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)及/或抑制肿瘤基质功能的方法。在一个实施例中，所述方法包括向个体投予有效量的抗粘附分子-4抗体或抗体片段以抑制血管生成、抑制细胞增殖、促进免疫功能、诱导发炎性细胞介素分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管发展(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)及/或抑制肿瘤基质功能。在一个实施例中，“个体”为人类。
在另一方面，本发明提供包括本文所提供的抗粘附分子-4抗体或抗体片段中的任一者的药物调配物，其例如用于任一以上治疗方法中。在一个实施例中，药物调配物包括本文所提供的抗粘附分子-4抗体或抗体片段中的任一者及药学上可接受的载剂。在另一实施例中，药物调配物包括本文所提供的抗粘附分子-4抗体或抗体片段中的任一者及例如如下文所描述的至少一种额外治疗剂。
在上文所述的各治疗中，本发明的抗体或抗体片段可单独、以免疫结合物形式或与其它药剂组合用于治疗中。举例来说，本发明的抗体可与至少一种额外治疗剂共投予。在某些实施例中，其它治疗剂为抗血管生成剂。在某些实施例中，其它治疗剂为VEGF拮抗剂(在一些实施例中，为抗-VEGF抗体，例如贝伐单抗(bevacizumab))。在某些实施例中，其它治疗剂为EGFR拮抗剂(在一些实施例中，为埃罗替尼)。在某些实施例中，其它治疗剂为化学治疗剂及/或细胞生长抑制剂。在某些实施例中，其它治疗剂为紫杉醇(例如太平洋紫杉醇)及/或铂药剂(例如卡铂)。在某些实施例中，其它治疗剂为增强患者的免疫性或免疫系统的药剂。
上述这类组合疗法涵盖组合投予(其中两种或更多种治疗剂包含于相同或各别调配物中)及各别投予，在此情况下，抗体或抗体片段的投予可在其它治疗剂及/或佐剂投予之前、同时及/或之后进行。抗体或抗体片段亦可与辐射疗法组合使用。
抗粘附分子-4抗体或抗体片段可以符合良好医学实务的方式调配、给药及投予。在此情形下，考虑因素包含所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个别患者的临床病状、病症的病因、药剂递送部位、投予方法、投予时程及医学从业者已知的其它因素。抗体或抗体片段无需但任选地与一或多种当前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起调配。此类其它药剂的有效量视存在于调配物中的抗体或抗体片段的量、病症或治疗的类型及如上文所述的其它因素而定。这些药剂通常是以相同剂量且以如本文所描述的投予途径使用，或以约1到99％的本文所描述的剂量，或以凭经验/在临床上确定适当的任何剂量及任何途径使用。
为预防或治疗疾病，抗体或抗体片段(当单独或与一或多种其它额外治疗剂组合使用时)的适当剂量将取决于待治疗的疾病的类型、抗体或抗体片段的类型、疾病的严重程度及病程、抗体或抗体片段是出于预防性抑或治疗性目的投予、先前疗法、患者的临床病史及对抗体或抗体片段的反应，以及主治医师的判断。一次性或历经一系列治疗向患者适当地投予抗体或抗体片段。取决于疾病的类型及严重程度，每千克患者体重约1μg的抗体或抗体片段到每千克患者体重40mg抗体或抗体片段可作为初始候选剂量以例如通过一或多次分别投予或通过连续输注向患者投予。取决于上文所提及的因素，一种典型日剂量可在每千克患者体重约1μg抗体或抗体片段到每千克患者体重100mg抗体或抗体片段或更多的范围内。经历数日或更长时间重复投药时，视病状而定，治疗一般持续到疾病症状发生所需抑制为止。此类剂量可间歇地投予，例如每周或每三周投予(例如以使得患者接受约二到约二十次剂量，或例如约六次剂量的抗体或抗体片段)。最初可投予较高起始剂量，随后可投予一或多种较低剂量。然而，其它给药方案可为适用的。此疗法的进程容易通过常规技术及分析来监视。
可投予以预防或治疗个体疾病的本发明的抗粘附分子-4抗体或抗体片段的特定剂量可为每千克患者体重约0.3、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6、4.2、4.8、5.4、6.0、6.6、7.2、7.8、8.4、9.0、9.6或10.2mg的抗体或抗体片段。在某些实施例中，剂量可在每千克患者体重0.3到2.4、2.4到4.2、4.2到6.0、6.0到7.8、7.8到10.2、10.2到12、12到14、14到16、16到18或18到20mg的抗体或抗体片段的范围内。如果以双特异性抗体形式、与另一免疫检查点抑制剂或另一抗体或抗体片段组合或以免疫结合物形式投予，那么抗体或抗体片段的剂量仍相同。另外，具有抗粘附分子-4活性的多肽将以与所述抗体或抗体片段相同的量投予。
单次剂量的本发明的药物调配物可含有以下量的本发明的抗粘附分子-4抗体或抗体片段：约13,600mg中有约45μg抗体或抗体片段，或约5440mg中有约45μg的抗体或抗体片段。在一些实施例中，单次剂量的本发明的药物调配物可含有135mg到1,387mg的本发明的抗粘附分子-4抗体或抗体片段量，或例如135、235、335、435、535、635、735、835、935、1035、1135、1235、1387mg的量。在某些实施例中，单次剂量的药物调配物中的本发明的抗粘附分子-4抗体或抗体片段的量是介于135到235、235到335、335到435、435到535、535到635、635到735、735到835、835到935、935到1035、1035到1135、1135到1235、1235到1387mg的范围内。如果以双特异性抗体形式、与另一免疫检查点抑制剂组合或以免疫结合物形式、或与如本文所公开的抗另一抗原的另一抗体或抗体片段组合投予，那么单次剂量的药物调配物中抗体或抗体片段的量仍相同。另外，在单次剂量的药物调配物中将包含与所述抗体或抗体片段相同量的具有抗粘附分子-4活性的多肽。
在一个实例中，抗粘附分子-4抗体或抗体片段可与免疫检查点抑制剂分子结合或可与免疫检查点抑制剂形成双特异性抗体的一部分。
组合可为以单独的分子形式或以双特异性抗体形式投予的本申请中所公开的抗粘附分子-4抗体或抗体片段及免疫检查点抑制剂分子。此类双特异性抗体对粘附分子-4具有结合活性，且对另一免疫检查点具有第二结合活性。
免疫检查点可选自CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、VISTA、BTLA、OX40、CD40、4-1BB、PD-1、PD-L1及GITR(扎哈维(Zahavi)及韦纳(Weiner)，《分子科学国际版杂志(InternationalJournal of Molecular Sciences)》,第20卷,158,2019)。额外免疫检查点包含B7-H3、B7-H4、KIR、A2aR、CD27、CD70、DR3及ICOS(曼尼(Manni)等人，《用于癌症治疗的免疫检查点阻断及其与小分子抑制剂的组合(Immune checkpoint blockade and its combinationtherapy with small-molecule inhibitors for cancer treatment)》,Bbacan,https://doi.org/10.1016/j.bbcan.2018.12.002,2018)。
免疫检查点优选为CTLA4、PD-1或PD-L1。
应了解，以上调配物或治疗方法中的任一者可使用代替抗粘附分子-4抗体或除抗粘附分子-4抗体以外的本发明的抗体片段或免疫结合物来进行。
增强宿主的免疫功能以对抗肿瘤是日益关注的主题。常规方法包含(i)APC增强，例如(a)注射到编码外来MHC同种异体抗原的DNA的肿瘤中，或(b)用增加肿瘤的免疫抗原识别概率的基因转染活检肿瘤细胞(例如免疫刺激细胞介素、GM-CSF、共刺激分子B7.1、B7.2)，(iii)授受性细胞免疫治疗，或用活化肿瘤特异性T细胞处理。授受性细胞免疫治疗包含分离肿瘤浸润性宿主T-淋巴细胞，例如经由通过IL-2或肿瘤或两者刺激来活体外扩增群体。另外，功能异常的经分离T细胞亦可通过活体外施用本发明的抗-PD-L1抗体来活化。接着可将共同活化的T细胞重新投予宿主。这些方法中的一或多者可与投予本发明的抗体、抗体片段或免疫结合物组合使用。
癌症的传统疗法包含以下：(i)辐射疗法(例如放射线疗法、X射线疗法、辐照)或使用电离辐射以杀死癌细胞且使肿瘤收缩。辐射疗法可经由外部光束放射线疗法(EBRT)外部施与或经由近接疗法内部施与；(ii)化学疗法或应用一般影响细胞快速分化的细胞毒性药物；(iii)靶向疗法或特定地影响失调的癌细胞蛋白质的药剂(例如酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)；单克隆抗体、光动力疗法)；(iv)免疫疗法，或增强宿主的免疫反应(例如疫苗)；(v)激素疗法，或阻断激素(例如当肿瘤为激素敏感时)，(vi)血管生成抑制剂，或阻断血管形成及生长，及(vii)缓解性护理，或针对改进护理质量以减轻疼痛、恶心、呕吐、腹泻及出血的治疗。例如吗啡碱(morphine)及氧可酮(oxycodone)的止痛药、例如昂丹司琼(ondansetron)及阿匹坦(aprepitant)的镇吐药可允许更具侵袭性的治疗方案。
在癌症的治疗中，可在投予抗粘附分子-4抗体或抗体片段之前、之后或同时进行治疗癌症免疫性的上述常规治疗中的任一者。另外，抗粘附分子-4抗体或抗体片段可在例如投予肿瘤结合抗体(例如单克隆抗体、毒素结合单克隆抗体)及/或投予化学治疗剂的常规癌症治疗之前、之后或同时投予。
F.制品及试剂盒
在本发明的另一方面，提供一种制品，其包括如本文所描述的分离多肽、抗粘附分子-4抗体或抗体片段或免疫结合物及适用于治疗、预防及/或诊断上述病症的其它材料。制品包括容器及容器上或容器随附的标记或药品说明书。适合的容器包含例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由各种材料形成，例如玻璃或塑料。容器容纳单独或与有效治疗、预防及/或诊断病状的另一组合物组合的组合物，且可具有无菌接取口(例如容器可为具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为本发明的抗体或抗体片段。标记或药品说明书指示组合物用于治疗所选病状。此外，制品可包括(a)内含组合物的第一容器，其中所述组合物包括抗体或抗体片段；及(b)内含组合物的第二容器，其中所述组合物包括另一细胞毒性剂或其它治疗剂。本发明的此实施例中的制品可进一步包括指示组合物可用于治疗特定病状的药品说明书。可替代地或另外，制品可进一步包括第二(或第三)容器，其包括药学上可接受的缓冲剂，例如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲生理盐水、林格氏溶液(Ringer′s solution)及右旋糖溶液。其可进一步包含就商业及用户观点而言所期望的其它材料，包含其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针及注射器。
应了解，以上制品中的任一者可包含代替抗粘附分子-4抗体或抗体片段或除抗粘附分子-4抗体或抗体片段以外的本发明的免疫结合物。
最后，本发明还提供包括至少一种本发明的抗体或抗体片段的试剂盒。含有本发明的多肽、抗体或抗体片段或抗体药物结合物的试剂盒可用于检测粘附分子-4表达(增加或减少)或用于治疗或诊断分析。本发明的试剂盒可含有偶合到固体支撑物(例如组织培养板或珠粒(例如琼脂糖珠粒))的抗体。可提供含有抗体的试剂盒用于例如在ELISA或蛋白质印迹法中活体外检测及定量粘附分子-4。此类适用于检测的抗体可具有标记，例如荧光或放射性标记。
所述试剂盒进一步含有关于其用途的说明书。在一些实施例中，说明书包括美国食品及药物管理局针对活体外诊断试剂盒所要求的说明书。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括根据样品中存在或不存在粘附分子-4而诊断所述样品中存在或不存在脑脊髓液的说明书。在一些实施例中，所述试剂盒包括一或多种抗体或抗体片段。在其它实施例中，所述试剂盒进一步包括一或多种酶、酶抑制剂或酶活化剂。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括一或多种色谱化合物。在其它实施例中，所述试剂盒进一步包括一或多种用以制备光谱分析用样品的化合物。在其它实施例中，所述试剂盒进一步包括比较参考物质以根据指示剂的强度、色谱或其它物理属性解释粘附分子-4的存在或不存在。
以下实例对于本发明的抗粘附分子-4抗体是说明性而非限制性的。本领域中通常遇到且对于所属领域的技术人员而言明显的多种条件及参数的其它合适修改及调适均在本发明的范围内。
实例
以下抗粘附分子-4抗体以与连接子有效负载的结合物形式用于本发明的实例中：
Figure BDA0004004183260000791
Figure BDA0004004183260000801
实例1：抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与人类粘附分子-4的结合活性
通过ELISA于补充有碳酸氢钠的磷酸盐缓冲盐水(PSB)中，使用BM(基准)抗体作为对照来测量抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与人类粘附分子-4的结合活性。抗粘附分子-4CAB ADC及WT ADC在pH 6.0及pH 7.4下与人类粘附分子-4的结合的EC50值概述于表1(图1及2)中。
表1
Figure BDA0004004183260000802
实例2：抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与人类粘附分子-4的结合活性
通过ELISA来类似地测量更多条件活性抗粘附分子-4抗体与人类粘附分子-4的结合活性。参见图3到4。抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC在pH 6.0及pH 7.4下与人类粘附分子-4的结合的EC50值概述于表2中。(图3及4)。
表2
Figure BDA0004004183260000803
实例3：抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与食蟹猕猴粘附分子-4的结合活性
通过ELISA来类似地测量抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与食蟹猕猴(cyno)粘附分子-4的结合活性。参见图5到6。抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC在pH 6.0及pH 7.4下与食蟹猕猴粘附分子-4的结合的EC50值概述于表3中。
表3
Figure BDA0004004183260000811
实例4：抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与人类粘附分子-4的结合活性
通过ELISA来类似地测量抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与人类粘附分子-4在pH范围滴定下的结合活性。参见图7。抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与人类粘附分子-4的pH反曲点概述于表4中。
表4
Figure BDA0004004183260000812
实例5：抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与人类粘附分子-4的结合活性
通过ELISA来类似地测量抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与人类粘附分子-4在pH范围滴定下的结合活性。参见图8。抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与人类粘附分子-4的pH反曲点概述于表5中。
表5
Figure BDA0004004183260000813
实例6：通过FACS测量抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC的结合活性
使用表达人类粘附分子-4的HEK293细胞进行FACS分析。抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC亦始终展示在pH 6.0下与表达人类粘附分子-4的HEK293细胞的结合活性高于pH7.4下的结合活性。参见图9及图10。示范性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与表达人类粘附分子-4的HEK293细胞的结合的EC50值概述于表6中。
表6
Figure BDA0004004183260000821
实例7：通过FACS测量抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC的结合活性
通过FACS在pH 6.0及pH 7.4下测量抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与表达食蟹猕猴粘附分子-4的HEK293细胞的结合活性。条件活性抗体始终展示在pH 6.0下与食蟹猕猴粘附分子-4细胞的结合活性高于pH 7.4下的结合活性。参见图11及图12。抗粘附分子-4CAB ADC及WT ADC与表达食蟹猕猴粘附分子-4的食蟹猕猴粘附分子-4细胞的结合的EC50值概述于表7中。
表7
Figure BDA0004004183260000822
实例8：通过FACS测量抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC的结合活性
通过FACS在pH 6.0及pH 7.4下测量抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与表达人类粘附分子-4的T47D细胞的结合活性。条件活性抗体始终展示在pH 6.0下与T47D细胞的结合活性高于pH 7.4下的结合活性。参见图13及14。抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与T47D细胞的结合的EC50值概述于表8中。
表8
Figure BDA0004004183260000823
实例9：通过FACS测量抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC的结合活性
使用表达人类粘附分子-4的HEK293细胞进行FACS分析。抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC亦始终展示在pH 6.0下与表达人类粘附分子-4的HEK293细胞的结合活性高于pH7.4下的结合活性。参见图15及16。示范性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与表达人类粘附分子-4的HEK293细胞的结合的EC50值概述于表9中。
表9
Figure BDA0004004183260000831
实例10：通过FACS测量抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC的结合活性
通过FACS在pH 6.0及pH 7.4下测量其它示范性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与表达食蟹猕猴粘附分子-4的HEK293细胞的结合活性。条件活性抗体始终展示在pH 6.0下与食蟹猕猴粘附分子-4细胞的结合活性高于pH 7.4下的结合活性。参见图17及18。抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与表达食蟹猕猴粘附分子-4的食蟹猕猴粘附分子-4细胞的结合的EC50值概述于表10中。
表10
Figure BDA0004004183260000832
实例11：通过FACS测量抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC的结合活性
通过FACS在pH 6.0及pH 7.4下测量其它示范性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC与表达人类粘附分子-4的T47D细胞的结合活性。条件活性抗体始终展示在pH6.0下与T47D细胞的结合活性高于pH 7.4下的结合活性。参见图19及20。抗粘附分子-4 CAB ADC及WTADC与T47D细胞的结合的EC50值概述于表11中。
表11
Figure BDA0004004183260000833
实例12：表达人类粘附分子-4的HEK293细胞的活体外细胞杀灭
使用表达人类粘附分子-4的HEK293细胞在6.0及7.4的pH值下类似地分析表达人类粘附分子-4的HEK293细胞的活体外细胞杀灭。通过抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC对HEK293细胞的活体外杀灭展示于图21到26中。通过抗粘附分子-4CAB ADC及WT ADC对HEK293细胞的细胞杀灭的EC50值展示于表12中。
表12
Figure BDA0004004183260000841
实例13：表达人类粘附分子-4的HEK293细胞的活体外细胞杀灭
使用表达人类粘附分子-4的HEK293细胞在6.0及7.4的pH值下类似地分析表达人类粘附分子-4的HEK293细胞的活体外细胞杀灭。通过其它示范性抗粘附分子-4CAB ADC及WT ADC对HEK293细胞的活体外杀灭展示于图27到28中。
实例14：代表性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC在皮下T47D CDX模型中的功效的活体内测试
1.研究目标及法规符合性
此项目的目标为评估代表性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC在治疗BALB/c裸鼠的皮下T47D乳癌CDX模型中的活体内抗肿瘤功效。LP1表示专有的连接子有效负载。
2.缩写
Figure BDA0004004183260000842
3.实验设计
表1-1.实验设计的说明
Figure BDA0004004183260000851
注意：
a.N：每组的动物数量。
b.剂量体积：给药体积调至每克体重10μl。
c.B12为同型对照
4.材料
4.1动物及饲养条件
4.1.1.动物
物种：小家鼠
品系：BALB/c裸
年龄：6到8周
性别：雌性
体重：18到22g
动物数量：63只小鼠加备用小鼠
动物供应商：上海灵畅生物技术有限公司(Shanghai Lingchang BiologicalTechnology Co.,LTD)。
质量证书编号：20180003002490
4.1.2.饲养条件
在恒定温度及湿度下，将小鼠放在个别通风笼中，各笼4或3只动物。
·温度：20-26℃。
·湿度：40-70％。
笼子：由聚碳酸酯制成。尺寸为300mm×200mm×180mm。寝具材料为玉米芯，其每周更换两次。
饮食：在整个研究期间，动物自由获取辐射灭菌的干燥颗粒食物。
水：动物自由获取无菌饮用水。
笼标识：各笼的标识标签含有以下信息：动物数目、性别、品系、接收日期、治疗、研究编号、组号及治疗起始日期。
动物标识：通过耳部标签标记动物。
5.实验方法及程序
5.1细胞培养
针对此项目，将使用由T47D肿瘤细胞(ATCC，弗吉尼亚州玛纳萨斯(Manassas，VA)，目录号
Figure BDA0004004183260000861
HTB-133TM )活体内继代两次所产生的T47D细胞。在37℃及含5％CO2的空气下，将T47D细胞以单层培养物形式活体外保持在补充有0.2单位/毫升牛胰岛素、10％热灭活胎牛血清、100U/ml青霉素(penicillin)及100μg/ml链霉素(streptomycin)的RPMI-1640培养基中。通过胰蛋白酶-EDTA处理将肿瘤细胞常规地进行每周两次继代培养。收集在指数生长期中生长的细胞且计数以用于肿瘤接种。
5.2肿瘤接种及动物分组
在右侧腹上用含xxT47D肿瘤细胞(10×106+基质胶)的0.2ml PBS进行皮下细胞接种以用于肿瘤产生之前3天，用0.18mg 17-β-雌二醇团粒对各小鼠进行接种。治疗在肿瘤接种之后第6天，当平均肿瘤大小达到约152mm3时开始。使用基于Excel的分层及随机化程式，根据肿瘤体积将动物分配成数组。各组由7只携带肿瘤的小鼠组成。根据表1-1中所示的实验设计，投予测试物。
测试物制备
表2-1.测试物制备的说明
Figure BDA0004004183260000871
注意：测试物调配物是在每次给药前制备。
5.3观测
研究中与动物处理、照护及治疗相关的所有程序均根据WuXi AppTec的机构动物照护及使用委员会(IACUC)批准的指导原则，遵循实验动物管理认证协会(AAALAC)的指导执行。在常规监测时，每天检查动物的治疗对肿瘤生长及正常行为的任何影响，例如活动能力、食物及水摄入(仅通过观察)、体重增加/减轻(每周测量两次)、眼睛/毛发缠结及方案中陈述的任何其它异常影响。记录发病率/死亡率及其它不良的观测事件。
5.4肿瘤测量及终点
主要终点是评估肿瘤生长是否可延缓。肿瘤大小是每周两次使用卡尺以两个维度测量并使用下式计算：V＝0.5a×b2，其中a及b分别为肿瘤的长径及短径。随后使用肿瘤大小来计算T/C值。T/C值(以百分比为单位)为抗肿瘤有效性的指示；T及C分别为治疗组及对照组在给定日的平均体积。
使用下式计算各治疗组的TGI：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100；Ti是治疗组在给定日的平均肿瘤体积，T0是治疗组在第0天的平均肿瘤体积，Vi是媒剂对照组在与Ti同一天的平均肿瘤体积，且V0是媒剂组在第0天的平均肿瘤体积。
通过用指定日的肿瘤体积除以其在第0天的体积，计算个别RTV(相对肿瘤体积)。个别地计算各小鼠的RTV值，接着使用所述值计算一个组的平均RTV。
5.5采样
分别在第一次给药后24小时及96小时(刚好在第2次给药前)从每组3只小鼠采集约50μL血清。
5.6统计分析
计算各组在不同时间点的平均肿瘤体积及SEM(表3-1)。针对在开始治疗之后第28天获得的数据进行各组间肿瘤体积差异的统计分析。
执行单因素变异数分析(One-way ANOVA)以比较各组的平均肿瘤体积及RTV。获得显着的F-统计数据且用盖姆斯-豪威尔检验(Games-Howell test)进行各组之间的比较。使用
Figure BDA0004004183260000883
SPSS
Figure BDA0004004183260000882
软件(17.0版)分析所有数据。将p<0.05视为在统计学上显着的。
6.结果
6.1肿瘤体积
不同组的平均肿瘤体积展示于表3-1中
表3-1.肿瘤体积
Figure BDA0004004183260000881
注意：
a.平均值±SEM
b.G1：媒剂，G2：B12-LP1(3mg/kg)，G3：BAP-143-00-00-LP1(3mg/kg)，G4：BAP-143-00-01-LP1(3mg/kg)，G5：BAP-143-00-02-LP1(3mg/kg)，G6：BAP-143-00-03-LP1(3mg/kg)，G7：BAP-143-00-04-LP1(3mg/kg)，G8：BAP-143-00-05-LP1(3mg/kg)，G9：BAP-143-00-06-LP1(3mg/kg)。
6.2肿瘤生长抑制分析
表4-1肿瘤生长抑制(基于第28天数据)
Figure BDA0004004183260000891
注意：
a.平均值±SEM。
b.基于肿瘤大小计算p值。
c.基于RTV计算p值。
6.3肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线展示于图29中。展现的数据为平均值±SEM。
7.总结及论述
在此研究中，使用xxT47D人类乳房异种移植模型评估本发明的代表性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC的治疗功效。不同组在处理之后的肿瘤体积展示于表3-1、表4-2及图29中。媒剂组的平均肿瘤体积在处理开始后第28天达到1,059mm3(RTV＝7.2±0.7)。
测试物BAP-143-00-00-LP1、BAP-143-00-01-LP1、BAP-143-00-02-LP1、BAP-143-00-03-LP1、BAP-143-00-04-LP1、BAP-143-00-05-LP1及BAP-143-00-06-LP1在3mg/kg剂量下展现极佳的抗肿瘤活性，其中全部TGI％均大于98％(p值＝0)。且所有这些处理显着地延缓肿瘤生长(第28天的RTV为0.0到1.2，p值＝0.001)。其中，BAP-143-00-04展示相对较低的功效(TGI＝98.71％，RTV＝1.2±0.3)。
B12-LP1在当前方案下并未显着地影响肿瘤生长(TGI＝33％，p值＝0.813)。在此研究期间，出于未知原因，3mg/kg BAP-143-00-04-LP1组中的小鼠#18964在第18天死亡且3mg/kg BAP-143-00-06-LP1组中的小鼠#18946在第4天死亡。其它小鼠并未出现明显地患病。因此，未观测到与投予本发明的示范性抗粘附分子-4 CAB ADC及WT ADC相关的明显毒性。
实例9：通过SPR分析测量条件活性抗粘附分子4抗体的结合活性
使用SPR2/4仪器(Sierra Sensors,Hamburg,Germany)及扁平胺传感器芯片，通过表面等离子体子共振测量抗粘附分子4抗体的结合动力学。SPR传感器含有四个流通槽(FC1到FC4)，其各自可个别或以群组加以处理。将人类粘附分子4-His固定于FC2中，且将食蟹猕猴粘附分子4-mFc固定于FC4中。FC1及FC3中未固定蛋白质，其分别用作FC2及FC4的对照表面。
所有注射均在25℃下以25μL/min的流动速率进行。用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)及N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(200mM/50mM)活化传感器表面480秒。注射人类粘附分子4-His(2μg/mL于10mM NaAc中，pH 4.5)480秒且通过注射1M乙醇胺盐酸盐480秒使表面失活。除了将食蟹猕猴粘附分子4稀释到具有pH 5.0的10mM NaAc缓冲液中的外，使用如针对人类粘附分子4-His所描述的相同条件固定食蟹猕猴粘附分子4。使用相同条件但在不注射蛋白质的情况下将对照表面活化及去活化。使用PBST缓冲液(含0.05％TWEEN20TM的PBS pH7.4)作为表面制备的操作缓冲液。在注射分析物之前，将操作溶液转变成含30mM碳酸氢钠的PBST并如图中所指示调整pH。仪器在注射第一分析物之前用操作溶液平衡一小时。
将相应操作溶液(34.25nM、13.70nM、6.85nM、3.42nM、1.37nM及0.0nM)中稀释的100μL分析物注射于流通槽1及2或3及4上。测量解离速率360秒。在每个循环的相互作用分析之后，通过注射6μL的10mM甘氨酸(pH 2.0)使芯片表面再生。使用无固定的蛋白质的流通槽1及3作为对照表面用于参考减除。
另外，自每次操作减去仅用缓冲液作为分析物(0nM分析物)的数据。用所提供的分析软件分析仪R2(Sierra Sensors)，使用1:1结合模型拟合经双重减除的数据。使用150kDa的分子量计算分析物的摩尔浓度。使用如针对食蟹猕猴粘附分子4所描述的相同条件将大鼠粘附分子4-His固定于FC3中。
通过SPR分析测量条件活性抗粘附分子4抗体与人类粘附分子4、食蟹猕猴粘附分子4及大鼠粘附分子4，以及条件活性抗粘附分子4抗体与人类粘附分子4及食蟹猕猴粘附分子4在pH 6.0、pH 6.5及pH 7.4下的结合活性。结果分别展示于以下表13-1到表13-3及表14-1到表14-2中。
表13-1
Figure BDA0004004183260000911
表13-2
Figure BDA0004004183260000912
表13-3
Figure BDA0004004183260000913
表14-1
Figure BDA0004004183260000921
表14-2
Figure BDA0004004183260000922
实例中所使用的方法
实例1至3的ELISA分析使用以下方案进行：
1)用100μL于碳酸盐-碳酸氢盐涂布缓冲液中的1μg/mL重组人类粘附分子4抗原或食蟹猕猴粘附分子4抗原涂布ELISA板。
2)用密封膜覆盖板且在4℃下培育隔夜。
3)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
4)通过将200μL的pH 6.0或pH 7.4ELISA培育缓冲液施配到各孔中，将孔洗涤两次，且完全抽吸出内含物。
5)将200μL的pH 6.0或pH 7.4ELISA培育缓冲液添加到各孔中。用密封膜覆盖并在室温下将板放置于设定为50rpm的板振荡器上，保持60分钟。
6)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
7)以3000ng/mL开始，在pH 6.0或pH 7.4ELISA培育缓冲液中以3倍稀释对测试物进行连续稀释。
8)将每孔100μL经稀释的测试物添加到板中
9)用密封膜覆盖并在室温下将板放置于设定为50rpm的板振荡器上，保持60分钟。
10)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
11)通过将200μL的pH 6.0或pH 7.4ELISA洗涤缓冲液施配到各孔中，将孔洗涤三次，且完全抽吸出内含物。
12)在pH 6.0或pH 7.4ELISA培育缓冲液中以1:2500稀释HRP二级抗体。
13)将100μL在pH 6.0或pH 7.4ELISA培育缓冲液中稀释的HRP二级抗体添加到各孔中
14)用密封膜覆盖并在室温下将板放置于设定为50rpm的板振荡器上，保持60分钟。
15)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
16)通过将200μL的pH 6.0或pH 7.4ELISA洗涤缓冲液施配到各孔中，将孔洗涤三次，且完全抽吸出内含物。
17)将每孔50μL TMB受质溶液施配到各板的所有孔中。在室温下培育约2分钟15秒或2分钟。
18)将每孔50μL的1N HCl添加到各板的所有孔中。在450nm下，使用PerkinElmerEnSpire 2300多标记读取器读取板。
实例4至5的ELISA分析使用以下方案进行：
1)用100μL于碳酸盐-碳酸氢盐涂布缓冲液中的1μg/mL重组人类粘附分子4抗原涂布ELISA板
2)用密封膜覆盖板且在4℃下培育隔夜
3)倾析板且将剩余液体轻敲于一叠纸巾上
4)通过将200μL的不同pH培育缓冲液施配到各孔中，将孔洗涤两次，且完全抽吸出内含物
5)将200μL不同pH培育缓冲液(pH 5.5、6.0、6.2、6.5、6.7、7.0及7.4)添加到各孔中。用密封膜覆盖并在室温下将板放置于板振荡器(设定为200rpm)上，保持60分钟
6)倾析板且将剩余液体轻敲于一叠纸巾上
7)在不同pH培育缓冲液(pH 5.5、6.0、6.2、6.5、6.7、7.0及7.4)中将测试物连续稀释到30ng/mL
8)将每孔100μL经稀释的测试物添加到板中
9)用密封膜覆盖并在室温下将板放置于板振荡器(设定为200rpm)上，保持60分钟。
10)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
11)通过将200μL不同pH洗涤缓冲液(pH 5.5、6.0、6.2、6.5、6.7、7.0及7.4)施配到各孔中，将孔洗涤三次，且完全抽吸出内含物
12)在不同pH培育缓冲液(pH 5.5、6.0、6.2、6.5、6.7、7.0及7.4)中以1:2500稀释HRP二级抗体
13)将100μL在不同pH培育缓冲液(pH 5.5、6.0、6.2、6.5、6.7、7.0及7.4)中稀释的HRP二级抗体添加到各孔中。
14)用密封膜覆盖并在室温下将板放置于板振荡器(设定为200rpm)上，保持60分钟。
15)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
16)通过将200μL不同pH洗涤缓冲液(pH 5.5、6.0、6.2、6.5、6.7、7.0及7.4)施配到各孔中，将孔洗涤三次，且完全抽吸出内含物
17)将每孔50μL TMB受质溶液施配到各板的所有孔中。在室温下培育3分钟。
18)将每孔50μL 1N HCl添加到各板的所有孔中。在450nm下读取板。使用SoftmaxPro软件(Molecular Devices)相对于缓冲液的pH绘制不同pH值下的平均OD值(来从2个复本)。使用所述软件中构建的4参数模型进行曲线拟合。pH曲线的反曲点(50％结合活性)等于拟合方程的参数C。pH 6.0下的结合活性设定为100％。
实例6至11的荧光活化细胞分选(FACS)分析是使用以下方案进行。
1)将3×106个细胞接种于T-75烧瓶中且根据供应商的说明书培养。
2)在FACS分析当天，去除且丢弃培养基。
3)用PBS溶液简单冲洗细胞层。
4)将1.5mL Detachin溶液添加到各T-75烧瓶中。静置直到细胞层分散。
5)添加4.5mL用于相应细胞系的培养基且通过轻柔地用移液管移取使细胞再悬浮。
6)使细胞汇集且将细胞悬浮液转移到50mL锥形管中。
7)通过用锥虫蓝染色对细胞计数，之后在4℃下以1500rpm离心5分钟。
8)用PBS洗涤细胞一次
9)使细胞再悬浮于pH 6.0或pH 7.4FACS缓冲液中达到3.5×106个细胞/毫升。
10)将于100μL的pH 6.0或pH 7.4FACS缓冲液中的3.5×105个细胞等分于96孔U形底板中。
11)将细胞短暂离心且丢弃缓冲液。
12)以30μg/mL开始，在pH 6.0或pH 7.4FACS缓冲液中以3倍稀释对测试物进行连续稀释。
13)将100微升/孔的稀释的测试物添加到细胞中，轻轻地充分混合且于冰上在振荡(200rpm)下培育一小时。
14)在4℃下，以1500rpm将细胞离心5分钟。用150μL的pH 6.0或pH 7.4洗涤缓冲液洗涤细胞两次。
15)用pH 6.0或pH 7.4FACS缓冲液稀释山羊抗人类IgG AF488抗体1:300。
16)将100μL来自以上步骤的经稀释的抗体添加到细胞中且于冰上避光振荡(200rpm)培育45分钟。
17)细胞集结成团且用150μL的pH 6.0或pH 7.4洗涤缓冲液洗涤三次。
18)细胞在室温下用稀释于1×PBS中的4％ PFA固定10分钟，随后用1×PBS洗涤细胞。
19)使细胞再悬浮于100μL的1×PBS中。
20)通过NovoCyte流式细胞仪，使用Ex488 nm/Em530 nm分析细胞。对于每个数据点，收集至少5,000个单个细胞。
21)使用GraphPad Prism软件7.03版绘制AF488于细胞单峰中的MFI。
实例12至13所使用的方案
1.1细胞培养
将HEK293-huNectin4保持于稳定的细胞系培养基(MEM+10％胎牛血清(FBS)+1mg/mL G418)中。细胞通常每周继代培养两次。在指数生长期中收集细胞且计数以进行板接种。
1.2调配物
1)以50μg/mL开始，在pH 6.0或pH 7.4分析培养基中进行10×测试物ADC或B12同型ADC原料的5倍连续稀释
2)使板离心且平缓地去除培养基，随后添加90μL pH分析培养基，之后添加ADC
3)将10μL连续稀释的10×ADC或B12样品原料添加到包括3000个细胞的孔(最终起始浓度为5μg/mL)中
4)在37℃下在5％ CO2培育箱中培育经处理的细胞72小时
1.4细胞效价-GLO发光细胞活力分析
1)解冻CellTiter-Glo缓冲液且在使用之前平衡至室温
2)在使用之前将冻干的CellTiter-Glo受质平衡至室温
3)将CellTiter-Glo缓冲液的全部液体体积转移到包括CellTiter-Glo受质的琥珀色瓶中以重建冻干酶/受质混合物。此形成CellTiter-Glo反应剂
4)通过平缓地涡旋进行混合以获得均质溶液
5)将板及其内含物平衡到室温
6)将70μL CellTiter-Glo反应剂添加于各孔中。在定轨振荡器上以100rpm混合内含物2分钟以诱导细胞溶解
5)使板在室温下培育10分钟以使发光讯号稳定
6)在SpectraMax i3X板读取器上记录发光
1.4数据分析
以浓度反应发光信号绘制不同剂量的测试抗体的抑制且计算IC50。用GraphpadPrism软件解释数据。
实例15-靶向粘附分子-4的条件活性双特异性抗体
粘附分子-4为用于癌症诊断的预测性标记且可为用于研发靶向疗法的标靶。其在若干类型的原发性肿瘤的癌转移及血管生成中可发挥机制性作用。一般来说，粘附分子-4为腺癌的标靶。粘附分子-4表达与肿瘤级别及与肿瘤进展相关的阶段具有显着相关性(参见图31)。
产生与健康组织(正常碱性微环境)中的CD3及靶抗原具有极少甚至无结合的双特异性抗体。然而，在反映肿瘤微环境的酸性条件(较高糖分解)下，抗体与其靶分子的结合较强。这些分子证实重组TAA/CD3及TAA/CD3表达细胞在酸性条件下的结合，所述酸性条件存在于肿瘤微环境中，但不存在于正常组织中。
研发靶向公认肿瘤相关的抗原粘附分子-4的双重CAB(CAB TAA×CAB CD3)双特异性抗体。这些双特异性抗体针对靶标阳性人类肿瘤异种移植物具有活性。重要的是，在用这些CAB双特异性抗体治疗后观测到完全肿瘤消退。可逆CAB双特异性产生由于其它形式(包含前药)的治疗指数。
实例16-靶向粘附分子-4的条件活性双特异性抗体(CAB粘附分子-4×CAB CD3)
CAB粘附分子-4×CAB CD3双特异性抗体在肿瘤微环境pH下展示与重组人类粘附分子-4ECD及CD3ε/δ杂二聚体蛋白(如野生型(WT)粘附分子-4×WT CD3)的高亲和力，但在生理pH下展示较低亲和力(图32A)。pH亲和力ELISA应用人类CD3作为捕获抗原，人类粘附分子-4-mFc作为检测，随后应用抗小鼠IgG HRP结合抗体。CAB粘附分子-4×CAB CD3在肿瘤微环境pH下展示较高亲和力，但在生理pH下展示较低结合。
CAB粘附分子-4×CAB CD3 pH概况展示与人类CD3及人类B7H3的亲和力在酸性肿瘤微环境pH 6.0到6.5下较高且在生理pH(7.4)下较低(图32B)。CAB粘附分子-4×CAB CD3在pH范围6.0到7.4内显示与作为捕获抗原的人类CD3、作为检测的人类粘附分子-4-mFc，随后与抗小鼠IgG HRP结合抗体的差异性结合。WT粘附分子-4×WT CD3的亲和力结合保持在类似水准下。
以2.5mg/kg BIW×4给药的CAB粘附分子-4×CAB CD3产生与NCI-H358 MiXeno模型中相同剂量的WT粘附分子-4×WT CD3类似的肿瘤消退(图32C)。活体内功效研究展示以2.5mg/kg BIW×4给药的CAB粘附分子-4×CAB CD3在NCI-H358 MiXeno模型中显示与WT粘附分子-4×WT CD3相当的肿瘤消退。
构建与粘附分子-4及CD3结合的双特异性抗体(图33A到图33C)，所述双特异性抗体包含如下表中所示的重链及轻链。
Figure BDA0004004183260000971
Figure BDA0004004183260000981
抗体的重链及轻链为：BA-150-19-01-01-BF1-VH(SEQ ID NO:18)、BA-150-30-33-16-BF11-VH(SEQ ID NO:25)、BA-150-30-33-16-BF19-VH(SEQ ID NO:27)、BA-150-30-03-12-BF11-VH(SEQ ID NO:29)及BA-150-30-03-12-BF19-VH(SEQ ID NO:29)；BA-150-19-01-01-BF1-LC(SEQ ID NO:56)、BA-150-30-33-16-BF11-LC(SEQ ID NO:57)、BA-150-30-33-16-BF19-LC(SEQ ID NO:58)、BA-150-30-03-12-BF11-LC(SEQ ID NO:59)及BA-150-30-03-12-BF19-LC(SEQ ID NO:60)。
C.结论
CAB B7H3×CAB CD3及CAB粘附分子-4×CAB CD3双特异性抗体在肿瘤条件下具有比正常条件下提高的结合。pH概况ELISA证实了在pH范围6.0到7.4内的差异性亲和力。
CAB B7H3×CAB CD3及CAB粘附分子-4×CAB CD3双特异性抗体在癌细胞系衍生的MiXeno模型中具有与非CAB基准抗体相比类似的活体内功效。
本发明经由扩宽治疗指数来转变双特异性实体肿瘤疗法。
用于通过ELISA测量CAB粘附分子-4×CAB CD3双特异性抗体的差异性亲和力结合的方案
1.1测试物
WT粘附分子-4×WT CD3(BA-150-19-01-01-BF1，基准)
CAB粘附分子-4×CAB CD3(BA-150-30-03-12-BF19)
1.2调配物
首先将测试物在pH 6.0或7.4ELISA培育缓冲液中稀释到3000ng/mL。随后将3000ng/mL测试物在pH 6.0或pH 7.4ELISA培育缓冲液中进行3倍连续稀释。
1.3 pH亲和力ELISA分析
1)用100μL于碳酸盐-碳酸氢盐涂布缓冲液中的0.5μg/mL重组人类CD3抗原涂布ELISA板。
2)用密封膜覆盖板且在4℃下培育隔夜。
3)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
4)通过将200μL的pH 6.0或pH 7.4ELISA培育缓冲液施配到各孔中，将孔洗涤两次，且完全抽吸出内含物。
5)将200μL的pH 6.0或pH 7.4ELISA培育缓冲液添加到各孔中。用密封膜覆盖并在室温下将板放置于设定为50rpm的板振荡器上，保持60分钟。
6)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
7)以3000ng/mL开始，在pH 6.0或pH 7.4ELISA培育缓冲液中以3倍稀释对测试物进行连续稀释。
8)将每孔100μL经稀释的测试物添加到板中
9)用密封膜覆盖并在室温下将板放置于设定为50rpm的板振荡器上，保持60分钟。
10)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
11)通过将200μL的pH 6.0或pH 7.4ELISA洗涤缓冲液施配到各孔中，将孔洗涤三次，且完全抽吸出内含物。
12)在pH 6.0或pH 7.4ELISA培育缓冲液中以1:2500稀释HRP二级抗体。
13)将100μL在pH 6.0或pH 7.4ELISA培育缓冲液中稀释的HRP二级抗体添加到各孔中
14)用密封膜覆盖并在室温下将板放置于设定为50rpm的板振荡器上，保持60分钟。
15)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
16)通过将200μL的pH 6.0或pH 7.4ELISA洗涤缓冲液施配到各孔中，将孔洗涤三次，且完全抽吸出内含物。
17)将每孔50μL TMB受质溶液施配到各板的所有孔中。在室温下培育约5分钟。
18)将每孔50μL 1N HCl添加到板的所有孔中。使用PerkinElmer EnSpire 2300多标记读取器在450nm下读取板。
用于测量CAB粘附分子-4×CAB CD3的pH范围结合亲和力的方案
2.1测试物
WT粘附分子-4×WT CD3(BA-150-19-01-01-BF1，基准)
CAB粘附分子-4×CAB CD3(BA-150-30-03-12-BF19)
2.2调配物
将测试物在pH 6.0到pH 7.4的不同pH ELISA培育缓冲液范围中稀释到100ng/mL。
2.3 pH亲和力ELISA分析
1)用100μL于碳酸盐-碳酸氢盐涂布缓冲液中的0.5μg/mL重组人类CD3抗原涂布ELISA板。
2)用密封膜覆盖板且在4℃下培育隔夜。
3)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
4)通过将200μL的不同pH培育缓冲液施配到各孔中，将孔洗涤两次，且完全抽吸出内含物。
5)将200μL不同pH培育缓冲液(pH 6.0、6.2、6.5、6.7、7.0及7.4)添加到各孔中。用密封膜覆盖并在室温下将板放置于板振荡器(设定为200rpm)上，保持60分钟。
6)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
7)在不同pH培育缓冲液(pH 6.0、6.2、6.5、6.7、7.0及7.4)中将测试物连续稀释到100ng/mL。
8)将每孔100μL经稀释的测试物添加到板中。
9)用密封膜覆盖并在室温下将板放置于板振荡器(设定为200rpm)上，保持60分钟。
10)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
11)通过将200μL不同pH洗涤缓冲液(pH 6.0、6.2、6.5、6.7、7.0及7.4)施配到各孔中，将孔洗涤三次，且完全抽吸出内含物。
12)在不同pH培育缓冲液(pH 6.0、6.2、6.5、6.7、7.0及7.4)中以1:2500稀释HRP二级抗体。
13)将100μL在不同pH培育缓冲液(pH 6.0、6.2、6.5、6.7、7.0及7.4)中稀释的HRP二级抗体添加到各孔中。
14)用密封膜覆盖并在室温下将板放置于板振荡器(设定为200rpm)上，保持60分钟。
15)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
16)通过将200μL不同pH洗涤缓冲液(pH 6.0、6.2、6.5、6.7、7.0及7.4)施配到各孔中，将孔洗涤三次，且完全抽吸出内含物。
17)将每孔50μL TMB受质溶液施配到各板的所有孔中。在室温下培育约4分钟。
18)将每孔50μL的1N HCl添加到各板的所有孔中。在450nm下，使用PerkinElmerEnSpire 2300多标记读取器读取板。
用于CAB粘附分子4×CAB CD3的活体内功效方案
3.1测试物
媒剂(PBS缓冲液)
B12×WT CD3(BA-150-HEL-BF1，同型)
WT粘附分子-4×WT CD3(BA-150-19-01-01-BF1，基准)
CAB粘附分子-4×CAB CD3(BA-150-30-03-12-BF19)
3.2活体内功效研究
各小鼠在右前腹侧区经皮下接种NCI-H358肿瘤细胞(2×106)，且次日静脉内接种人类PBMC(10×106)。当平均肿瘤大小达到120mm3时，将小鼠随机分配到不同研究组(8只小鼠/组)。以2.5mg/kg BIW×4周给予测试物，且每周监测肿瘤大小以及体重两次。
然而，应了解，尽管已于先前描述中连同本发明的结构及功能的细节一起阐述本发明的许多特征及优势，但本发明仅为示范性的，且可详细地作出改变，尤其关于本发明的原理内的部分的形状、大小及布置，其最大程度地通过表述所附权利要求书的术语的广泛一般含义所指示。
本文中提及的所有文献均以全文引用的方式并入本文中，或者提供其特定依赖的本发明。本申请人并不打算将任何所公开的实施例均贡献于公众，且在一定程度上任何所公开的修改或变化在字面上均不属于权利要求书的范围内，但其在等同原则下视为其一部分。
序列表
<110> 生物蛋白有限公司(BioAtla, INC.)
<120> 条件活性抗粘附分子-4 (NECTIN-4)抗体
<130> KHP222111893.9
<150> US 63/040,894
<151> 2020-06-18
<150> US 63/166,062
<151> 2021-03-25
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC CDR1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X可为M或D
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asn Xaa Asn
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC CDR2
<400> 2
Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC CDR3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X可为M或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X可为V或K
<400> 3
Ala Tyr Tyr Tyr Gly Xaa Asp Xaa
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC CDR1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X可为R或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X可为L或E
<400> 4
Xaa Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp Xaa Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC CDR2
<400> 5
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC CDR3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X可为F或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X可为P或D
<400> 6
Gln Gln Ala Asn Ser Xaa Pro Xaa Thr
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC CDR1
<400> 7
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asn Met Asn
1 5 10
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC CDR1
<400> 8
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asn Asp Asn
1 5 10
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC CDR3
<400> 9
Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC CDR3
<400> 10
Ala Tyr Tyr Tyr Gly Asp Asp Val
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC CDR3
<400> 11
Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Lys
1 5
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC CDR1
<400> 12
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC CDR1
<400> 13
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp Glu Ala
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC CDR1
<400> 14
His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC CDR3
<400> 15
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro Thr
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC CDR3
<400> 16
Gln Gln Ala Asn Ser Glu Pro Pro Thr
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC CDR3
<400> 17
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Asp Thr
1 5
<210> 18
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC可变区
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC可变区
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC可变区
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC可变区
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC可变区
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Asp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC可变区
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Glu Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC可变区
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Tyr Tyr Gly Asp Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC可变区
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Tyr Tyr Gly Asp Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC可变区
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC可变区
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Tyr Tyr Gly Asp Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC可变区
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC可变区
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC可变区
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Tyr Tyr Gly Asp Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp
20 25 30
Glu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Glu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Asp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 35
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp
20 25 30
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35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp
20 25 30
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35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 39
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Glu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 40
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp
20 25 30
Glu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Asp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp
20 25 30
Glu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 44
Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 45
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 45
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> Variant
<222> (2)..(2)
<223> X为G或S
<220>
<221> Variant
<222> (5)..(5)
<223> X为G或P
<220>
<221> Variant
<222> (8)..(8)
<223> X为Y或K
<220>
<221> Variant
<222> (13)..(13)
<223> X为A或Q
<400> 46
His Xaa Asn Phe Xaa Asn Ser Xaa Val Ser Trp Phe Xaa Tyr
1 5 10
<210> 47
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> Variant
<222> (13)..(13)
<223> X为A或D
<400> 47
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Xaa Asn
1 5 10
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 48
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 49
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 50
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 50
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 51
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 51
His Ser Asn Phe Gly Asn Ser Lys Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 52
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 52
His Gly Asn Phe Pro Asn Ser Lys Val Ser Trp Phe Gln Tyr
1 5 10
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 53
His Ser Asn Phe Gly Asn Ser Lys Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 54
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 54
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 55
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 55
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Asp Asn
1 5 10
<210> 56
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Gln Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Arg Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln
210 215 220
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
225 230 235 240
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn
245 250 255
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile
260 265 270
Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
275 280 285
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
290 295 300
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
305 310 315 320
Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp
325 330 335
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro
355 360 365
Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser
370 375 380
Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln
385 390 395 400
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg
405 410 415
Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys
420 425 430
Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
435 440 445
Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr
450 455 460
Lys Leu Thr Val Leu Ser Arg
465 470
<210> 57
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 57
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp
20 25 30
Glu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Gln Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Arg Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln
210 215 220
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
225 230 235 240
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn
245 250 255
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile
260 265 270
Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
275 280 285
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
290 295 300
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
305 310 315 320
Arg His Ser Asn Phe Gly Asn Ser Lys Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp
325 330 335
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro
355 360 365
Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser
370 375 380
Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Asp Asn Trp Val Gln Gln
385 390 395 400
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg
405 410 415
Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys
420 425 430
Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
435 440 445
Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr
450 455 460
Lys Leu Thr Val Leu Ser Arg
465 470
<210> 58
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp
20 25 30
Glu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Gln Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Arg Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln
210 215 220
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
225 230 235 240
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn
245 250 255
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile
260 265 270
Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
275 280 285
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
290 295 300
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
305 310 315 320
Arg His Gly Asn Phe Pro Asn Ser Lys Val Ser Trp Phe Gln Tyr Trp
325 330 335
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro
355 360 365
Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser
370 375 380
Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Asp Asn Trp Val Gln Gln
385 390 395 400
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg
405 410 415
Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys
420 425 430
Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
435 440 445
Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr
450 455 460
Lys Leu Thr Val Leu Ser Arg
465 470
<210> 59
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp
20 25 30
Glu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Gln Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Arg Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln
210 215 220
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
225 230 235 240
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn
245 250 255
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile
260 265 270
Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
275 280 285
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
290 295 300
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
305 310 315 320
Arg His Ser Asn Phe Pro Asn Ser Lys Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp
325 330 335
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro
355 360 365
Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser
370 375 380
Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Asp Asn Trp Val Gln Gln
385 390 395 400
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg
405 410 415
Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys
420 425 430
Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
435 440 445
Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr
450 455 460
Lys Leu Thr Val Leu Ser Arg
465 470
<210> 60
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp
20 25 30
Glu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Gln Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Arg Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln
210 215 220
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
225 230 235 240
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn
245 250 255
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile
260 265 270
Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
275 280 285
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
290 295 300
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
305 310 315 320
Arg His Gly Asn Phe Pro Asn Ser Lys Val Ser Trp Phe Gln Tyr Trp
325 330 335
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro
355 360 365
Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser
370 375 380
Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Asp Asn Trp Val Gln Gln
385 390 395 400
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg
405 410 415
Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys
420 425 430
Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
435 440 445
Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr
450 455 460
Lys Leu Thr Val Leu Ser Arg
465 470

Claims (47)

1.一种特异性结合到粘附分子-4的分离多肽，其包括：重链可变区，所述重链可变区包含三个具有序列H1、H2及H3的互补决定区CDR，其中：
所述H1序列为GFTFSSYNX1N(SEQ ID NO:1)；
所述H2序列为ISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:2)；及
所述H3序列为AYYYGX2DX3(SEQ ID NO:3)；
其中X1为M或D；X2为M或D；X3为V或K，限制条件为所述重链可变区及轻链可变区不为SEQID NO:18及31或SEQ ID NO:18及56组合；及轻链可变区，所述轻链可变区包含三个具有序列L1、L2及L3的CDR，其中：
所述L1序列为X4ASQGISGWX5A(SEQ ID NO:4)；
所述L2序列为AASTLQS(SEQ ID NO:5)；及
所述L3序列为QQANSX6PX7T(SEQ ID NO:6)，
其中X4为R或H；X5为L或E；X6为F或E；且X7为P或D，且限制条件为X1、X2、X3、X4、X5、X6及X7不能同时分别为M、M、V、R、L、F及P。
2.根据权利要求1所述的分离多肽，其进一步包括六个抗-CD3互补决定区L4、L5、L6、L7、L8及L9，其中：
所述L4序列为GFTFNTYAMN(SEQ ID NO:44)，
所述L5序列为RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:45)，
所述L6序列为HX11NFX12NSX13VSWFX14Y(SEQ ID NO:46)，
所述L7序列为RSSTGAVTTSNYX15N(SEQ ID NO:47)，
所述L8序列为GTNKRAP(SEQ ID NO:48)，及
所述L9序列为ALWYSNLWV(SEQ ID NO:49)，
其中X11为G或S，X12为G或P，X13为Y或K，X14为A或Q且X15为A或D。
3.根据权利要求1到2中任一权利要求所述的分离多肽，其中所述H1序列是选自GFTFSSYNMN(SEQ ID NO:7)及GFTFSSYNDN(SEQ ID NO:8)。
4.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的分离多肽，其中所述H3序列是选自AYYYGMDV(SEQ ID NO:9)、AYYYGDDV(SEQ ID NO:10)及AYYYGMDK(SEQ ID NO:11)。
5.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的分离多肽，其中
所述L1序列是选自RASQGISGWLA(SEQ ID NO:12)、RASQGISGWEA(SEQ ID NO:13)及HASQGISGWLA(SEQ ID NO:14)。
6.根据权利要求1所述的分离多肽，其中所述L3序列是选自QQANSFPPT(SEQ ID NO:15)、QQANSEPPT(SEQ ID NO:16)及QQANSFPDT(SEQ ID NO:17)。
7.根据权利要求2及3到6中任一权利要求所述的分离多肽，其中所述L6序列是选自HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:50)、HSNFGNSKVSWFAY(SEQ ID NO:51)、HGNFPNSKVSWFQY(SEQID NO:52)及HSNFGNSKVSWFAY(SEQ ID NO:53)。
8.根据权利要求2及3到7中任一权利要求所述的分离多肽，当根据权利要求2时，其中所述L7序列是选自RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:54)及RSSTGAVTTSNYDN(SEQ ID NO:55)。
9.根据权利要求1所述的分离多肽，其中所述重链可变区具有选自SEQ ID NO:18到30的序列。
10.根据权利要求1所述的分离多肽，其中所述轻链可变区具有选自SEQ ID NO:31到43的序列。
11.根据权利要求1所述的分离多肽，其包括具有选自以下的任一序列对的重链可变区及轻链可变区：SEQ ID NO:32及19、SEQ ID NO:33及20、SEQ ID NO:34及21、SEQ ID NO:35及22、SEQ ID NO:36及23、SEQ ID NO:37及24、SEQ ID NO:38及25、SEQ ID NO:39及26、SEQID NO:40及27、SEQ ID NO:41及28，及SEQ ID NO:42及29。
12.根据权利要求1所述的分离多肽，其包括重链可变区及轻链可变区，所述区各自独立地与选自SEQ ID NO:18到30中的一者与SEQ ID NO:31到43中的一者的氨基酸序列的组合具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性；限制条件为所述重链可变区及轻链可变区不为SEQ ID NO:18及31的组合；且其中所述分离多肽特异性结合到人类粘附分子-4蛋白质。
13.根据权利要求2所述的分离多肽，其包括重链可变区及轻链可变区，所述区各自独立地与各别地选自以下的氨基酸序列对具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性：SEQ ID NO:32及19、SEQ ID NO:33及20、SEQ ID NO:34及21、SEQ ID NO:35及22、SEQ IDNO:36及23、SEQ ID NO:37及24、SEQ ID NO:38及25、SEQ ID NO:39及26、SEQ ID NO:40及27、SEQ ID NO:41及28，及SEQ ID NO:42及29；且所述分离多肽特异性结合到人类粘附分子-4蛋白质。
14.根据权利要求2所述的分离多肽，其中所述重链可变区具有选自SEQ ID NO:18、25、27及29的序列。
15.根据权利要求2所述的分离多肽，其中所述轻链可变区具有选自SEQ ID NO:56到60的序列。
16.根据权利要求2所述的分离多肽，其包括具有选自以下的任一序列对的重链可变区及轻链可变区：SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:59，及SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:60。
17.根据权利要求2所述的分离多肽，其包括重链可变区及轻链可变区，所述区各自独立地与选自SEQ ID NO:18、25、27及29中的一者与SEQ ID NO:56到60中的一者的氨基酸序列的组合具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性，且其中所述分离多肽特异性结合到人类粘附分子-4蛋白质。
18.根据权利要求2所述的分离多肽，其包括重链可变区及轻链可变区，所述区各自独立地与选自以下的氨基酸序列对具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性：SEQID NO:25及SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:59，及SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:60；且其中所述分离多肽特异性结合到人类粘附分子-4蛋白质。
19.一种抗体或抗体片段，其包括根据权利要求1到18中任一权利要求所述的分离多肽。
20.根据权利要求19所述的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的条件值下与粘附分子-4蛋白质的结合亲和力高于在非肿瘤微环境中存在的相同条件的不同值下的结合亲和力。
21.根据权利要求20所述的抗体或抗体片段，其中所述条件为pH。
22.根据权利要求21所述的抗体或抗体片段，其中所述肿瘤微环境中的pH在5.0到6.8的范围内且所述非肿瘤微环境中的pH在7.0到7.6的范围内。
23.根据权利要求19所述的抗体或抗体片段，相比于亲本抗体或抗体片段在pH6.0下的抗原结合活性，其在pH 6.0下具有至少70％的相同抗原结合活性。
24.根据权利要求19所述的抗体或抗体片段，相比于亲本抗体或抗体片段在pH7.4下的抗原结合活性，其在pH 7.4下具有小于50％、或小于40％、或小于30％、或小于20％或小于10％的相同抗原结合活性。
25.根据权利要求23到24中任一权利要求所述的抗体或抗体片段，其中所述抗原结合活性为与粘附分子-4蛋白质的结合。
26.根据权利要求23到25中任一权利要求所述的抗体或抗体片段，其中所述抗原结合活性是通过ELISA分析测量。
27.根据权利要求19到26中任一权利要求所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的条件值下与所述粘附分子-4蛋白质的结合活性与在非肿瘤微环境中的相同条件的不同值下与所述粘附分子-4蛋白质的结合活性的比率为至少约1.5:1、至少约2:1、至少约3:1、至少约4:1、至少约5:1、至少约6:1、至少约7:1、至少约8:1、至少约9:1、至少约10:1、至少约20:1、至少约30:1、至少约50:1、至少约70:1或至少约100:1。
28.根据权利要求19到27中任一权利要求所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体为多特异性抗体或抗体片段。
29.根据权利要求19到28中任一权利要求所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体为双特异性抗体或抗体片段。
30.一种免疫结合物，其包括根据权利要求19到29中任一权利要求所述的抗体或抗体片段。
31.根据权利要求30所述的免疫结合物，其中所述免疫结合物包括至少一种选自化学治疗剂、放射性原子、细胞生长抑制剂及细胞毒性剂的药剂。
32.根据权利要求31所述的免疫结合物，其包括至少两种所述药剂。
33.根据权利要求31到32中任一权利要求所述的免疫结合物，其中所述至少一种药剂为放射性药剂。
34.根据权利要求33所述的免疫结合物，其中所述放射性药剂是选自α发射体、β发射体及γ发射体。
35.根据权利要求31到33中任一权利要求所述的免疫结合物，其中所述抗体或抗体片段及所述至少一种药剂共价键结到连接分子。
36.根据权利要求31到32中任一权利要求所述的免疫结合物，其中所述至少一种药剂是选自类美登素、奥瑞他汀、海兔毒素、卡奇霉素、吡咯并苯并二氮呯及蒽环霉素。
37.一种药物组合物，其包括：
根据权利要求1到18中任一权利要求所述的多肽、根据权利要求19到29中任一权利要求所述的抗体或抗体片段，或根据权利要求30到36中任一权利要求所述的免疫结合物；及
药学上可接受的载剂。
38.根据权利要求37所述的药物组合物，其包括量为约135mg、235mg、335mg、435mg、535mg、635mg、735mg、835mg、935mg、1035mg、1135mg、1235mg或1387mg的所述多肽、所述抗体或抗体片段或所述免疫结合物。
39.根据权利要求37所述的药物组合物，其包括量在135到235mg、235到335mg、335到435mg、435到535mg、535到635mg、635到735mg、735到835mg、835到935mg、935到1035mg、1035到1135mg、1135到1235mg或1235到1387mg范围内的所述多肽、所述抗体或抗体片段或所述免疫结合物。
40.根据权利要求37到39中任一权利要求所述的药物组合物，其进一步包括免疫检查点抑制剂分子。
41.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂分子是针对免疫检查点的抗体或抗体片段。
42.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述免疫检查点是选自CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、VISTA、BTLA、OX40、CD40、4-1BB、PD-1、PD-L1、GITR、B7-H3、B7-H4、KIR、A2aR、CD27、CD70、DR3及ICOS。
43.根据权利要求42所述的药物组合物，其中所述免疫检查点为CTLA4、PD-1或PD-L1。
44.根据权利要求40到43中任一权利要求所述的药物组合物，其进一步包括针对选自以下的抗原的抗体或抗体片段：CTLA4、PD1、PD-L1、AXL、ROR2、CD3、HER2、B7-H3、ROR1、SFRP4及WNT蛋白质。
45.一种治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的患者投与根据权利要求1到18中任一权利要求所述的多肽、根据权利要求19到29中任一权利要求所述的抗体或抗体片段、根据权利要求30到36中任一权利要求所述的免疫结合物或根据权利要求37到44中任一权利要求所述的药物组合物的步骤。
46.一种根据权利要求1到18中任一权利要求所述的多肽、根据权利要求19到29中任一权利要求所述的抗体或抗体片段、根据权利要求30到36中任一权利要求所述的免疫结合物或根据权利要求37到44中任一权利要求所述的药物组合物的用途，其用于治疗癌症。
47.一种用于诊断或治疗的试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求1到18中任一权利要求所述的多肽、根据权利要求19到29中任一权利要求所述的抗体或抗体片段或根据权利要求30到36中任一权利要求所述的免疫结合物或根据权利要求37到44中任一权利要求所述的药物组合物，及使用所述抗体或抗体片段、所述免疫结合物及/或所述药物组合物进行诊断或治疗的说明书。
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