CN115702167A - 条件性活性抗cd46抗体、抗体片段、其免疫结合物及其用途 - Google Patents

条件性活性抗cd46抗体、抗体片段、其免疫结合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供具有重链可变区及/或轻链可变区并特异性结合于CD46蛋白质的经分离多肽，以及含有所述重链可变区及/或所述轻链可变区并结合于CD46蛋白质的抗体及抗体片段。还提供了包括所述多肽及含有所述多肽的抗体及抗体片段的免疫结合物、医药组合物及试剂盒。

Description

条件性活性抗CD46抗体、抗体片段、其免疫结合物及其用途
对相关申请案的交叉参考
本申请案要求保护2020年6月18日申请的美国临时申请案第63/040,913号的优先权，所述临时申请案的全部揭示内容特别以引用的方式并入本文中。
以引用的方式并入ASCII文本序列表中的材料
在此提交为命名为“BIAT-1032WO_ST25”的文本文件的序列表，其创建于2021年5月25日，大小为13,000个字节，特此以全文引用的方式并入。
技术领域
本发明涉及抗CD46抗体、抗体片段及此类抗体及抗体片段的免疫结合物，以及所述抗体、抗体片段及免疫结合物在诊断及治疗方法中的用途。
背景技术
CD46为膜辅因子蛋白或MCP。其为I型跨膜蛋白，其经广泛表达，但由于替代性外显子剪接及糖基化而具有多种同功异型物。近来，卡罗西(Karosi)等人，喉镜(Laryngoscope)118:1669-1676(2008年9月)报导检测到分子的十四种同功异型物。mRNA从位于染色体1q32处的单个基因转录且经历广泛替代性剪接以产生编码各种蛋白质同功异型物的多个转录物。在包括所述基因的14个外显子中，似乎外显子1至6在所有CD46蛋白质同功异型物中是保守的，而外显子7至9编码以不同方式利用的富含丝氨酸-苏氨酸-脯氨酸(“STP”)的区域，从而导致蛋白质同功异型物中的高变化性。外显子11及12编码CD46跨膜区，而外显子13及14编码蛋白质的胞质尾区。
最长mRNA转录物变异体A(NM_002389)含有来自基因的所有十四个外显子的序列。据信外显子7、8、9及13的可变剪接产生大部分CD46的十四个同功异型物，其中为66及56kDa的主要观测到的蛋白质同功异型物是由外显子8的替代纳入或排除而产生。外显子13的替代纳入/排除引起分子的胞质尾区的经编码序列的变化，表明这些变化可影响次细胞迁移、稳定性及蛋白质的信号传导特性。
如卡罗西等人所阐述，CD46 mRNA同功异型物D包括CD46基因的外显子1-6、8-12及14(等效于编码蛋白质NP_722548的序列NM_153826)，同功异型物F包括外显子1-6、9-12及14(等效于编码NP_758863的序列NM_172353)，且同功异型物J包括外显子1-6、8、10-12及14(等效于编码NP_758866的序列NM_172356)。更具体地，CD46分子包括四个N端短共同重复(SCR)模块(“寿司(Sushi)”域：1-3、2-4键联拓扑中4个半胱氨酸)，其中这些SCR域是由基因的前六个外显子编码。SCR2、3及4模块具有C3b/C4b结合及调控活性(下文论述)，而SCR1模块及SCR4远端的序列对于补体调控功能来说并非必需的。由可替代地使用的外显子7至9以及外显子10编码的近膜端胞外序列在很大程度上经糖基化，主要经由O连接的碳水化合物糖基化。
出于本发明的目的，除非另外上下文规定，否则术语“CD46”应保持表示如上文刚刚阐述的任何蛋白质，包含任何剪接变异体或其免疫反应性片段以及编码此类蛋白质、剪接变异体或片段的任何核酸序列。
多种生物功能已归因于CD46，其中许多涉及免疫系统的调节。CD46的一个主要免疫调节功能涉及调节补体蛋白质以保护宿主细胞免受作为高级真核生物的先天性免疫反应的一部分的补体蛋白质损伤。具体地，CD46是用于补体蛋白C3b及C4b的因子I介导的蛋白水解裂解的辅因子。CD46已显示为会活化C3转化酶，即将C3b裂解为非活性片段且由此保护免于不当补体活化的分子。(还参见：利泽夫斯基及阿特金森，人类基因组学，补体调节因子CD46：基因变异体及疾病相关性(2015)9:7(Liszewski and Atkinson Human Genomics,Complement regulator CD46:genetic variants and disease associations(2015)9:7))
除了其在先天性免疫中的作用以外，CD46还调节后天性免疫反应。经由CD46信号传导引起T细胞增生，且分化为特定类别的调节T细胞，称为Tr1，其特征为产生大量IL-10，一种消炎细胞因子。另外，因为精子表达高含量的CD46，所以已表明，CD46可能在精子与卵母细胞融合时参与繁殖。CD46似乎还高度表达于胎板中且可帮助保护胎儿免于母亲的免疫排斥。
CD46还展示为广泛表达于除红血球之外的大部分正常人类细胞上。举例来说，存在关于CD46在上皮细胞中的强力表达、在淋巴球及内皮中的适度表达及在诸如破骨细胞、骨细胞、间隙细胞及肌肉细胞的其它细胞中的微弱表达的报导。由于其广泛表达，许多人类病原体已进化出利用CD46作为受体或辅受体以结合至细胞作为感染前驱体的策略。这些病原体包含人类疱疹病毒6、麻疹病毒、某种血清型腺病毒及来自共生细菌的奈瑟菌属家族的病原性物种。认为某些反转录病毒通过在其表面上承载CD46模拟物逃避补体介导的免疫性(施托贝尔(Stoiber)等人，分子免疫学(Molecular Immunology)2005；萨伊富丁(Saifuddin)等人，普通病毒学期刊(J Gen Virol),1997)。
除了其在正常细胞上的存在以外，CD46表达量在某些癌症中可能增加。举例来说，已在以下中报导较高CD46表达：乳癌(索尔斯坦松(Thorsteinsson)等人，APMIS 106:869-78(1998)；霍夫曼(Hofman)等人，乳癌研究与治疗(Breast Cancer Res.Treat.)32:213-9(1994))；结肠癌/结肠直肠癌(安德鲁(Andrew)等人，癌症研究(Cancer Res.)50:5225-30(1990)；柯瑞兹(Koretz)等人，英国癌症杂志(Br.J.Cancer)68:926-31(1993)；朱莉娅(Juhl)等人，外科肿瘤学杂志(J.Surg.Oncol.)64:222-30(1997)；博格斯(Bjorge)等人，癌症免疫学与免疫治疗(Cancer Immunol.Immunother.)42:185-92(1996))；肺癌(凡萨诺(Varsano)等人，临床与实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)113:173-82(1998)；凡萨诺等人，美国呼吸细胞核生物学杂志(Am.J.Respir.Cell.Mol.Bioi.)19:522-9(1998))；卵巢癌(博格斯等人，国际癌症期刊(Int.J.Cancer)70:14-25(1997))；肾癌(勃洛克(Blok)等人，实验室研究(Lab.Invest.)80:335-44(2000)；戈特(Gorter)等人，实验室研究74:1039-49(1996))；胰脏癌(朱莉娅等人，外科肿瘤学杂志64:222-30(1997))；及前列腺癌(贾维斯(Jarvis)等人，过敏及临床免疫学期刊(J.Allergy Clin.Immunol)99(第I期，第2部分):S215(1997)；刘(Liu),癌症研究60:3429-3434(2000))；还参见WO 02/18948及WO 01/88537。
本发明旨在提供具有减少或最小的副作用的抗CD46抗体或抗体片段，其适于治疗及诊断使用，尤其是癌症的诊断及治疗。与对存在于非肿瘤微环境中的CD46的结合活性或结合亲和力相比，这些抗CD46抗体或抗体片段中的一些可对肿瘤微环境中的CD46具有更高结合活性或结合亲和力。这些抗CD46抗体或抗体片段通常具有至少与已知抗CD46抗体相当的功效。另外，与本领域中已知的单克隆抗CD46抗体相比，本发明的抗CD46抗体或抗体片段可展现降低的副作用，因为具有对正常组织中存在的非肿瘤微环境中的CD46相对较低的结合活性或结合亲和力。这些优势可提供对肿瘤中表达的CD46的更具选择性靶向，且由于所述抗体针对肿瘤微环境中存在的CD46具有选择性，所以可允许使用较高剂量的这些抗CD46抗体或抗体片段，由此可实现更有效的治疗性治疗而不会使不良副作用相应地增加。
发明内容
在一个方面中，本发明提供特异性结合于人类CD46的经分离多肽。经分离多肽包括轻链可变区，所述轻链可变区具有三个具有序列L1、L2及L3的互补决定区(CDR)，其中：
所述L1序列为RAX1QX2IX3NYLN(SEQ ID NO:1)，
所述L2序列为YTSSLX4X5(SEQ ID NO:2)，
所述L3序列为QQYIKLPWT(SEQ ID NO:3)；及
重链可变区，所述重链可变区具有三个具有序列H1、H2及H3的互补决定区(CDR)，其中
所述H1序列为GGSVSSYDIS(SEQ ID NO:8)；
所述H2序列为VIWTDGGTNYNSAFMS(SEQ ID NO:9)；及
所述H3序列为VYDGYPWFAY(SEQ ID NO:10)；
其中X1为S或L；X2为G或W；X3为S或A；X4为H或F，X5为S或E；其限制条件为X1、X2、X3、X4及X5不能同时分别为S、G、S、H及S。
以上多肽可具有选自氨基酸序列RASQGISNYLN(SEQ ID NO:5)、RASQWISNYLN(SEQID NO:12)、RASQGIANYLN(SEQ ID NO:15)及RALQGISNYLN(SEQ ID NO:22)的L1序列。以上多肽可具有选自氨基酸序列YTSSLHS(SEQ ID NO:6)、YTSSLFS(SEQ ID NO:17)及YTSSLHE(SEQID NO:19)的L2序列。在每一前述实施例中，L1及L2序列中的一者必须不为SEQ ID NO:5的野生型L1序列及SEQ ID NO:6的野生型L2序列。
在一个实施例中，以上多肽包括具有以下氨基酸序列的一组6个CDR：
SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10。
在另一实施例中，本发明的经分离多肽包括轻链可变区及重链可变区，各轻链可变区及重链可变区独立地与一对分别选自以下的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性：SEQ ID NO:11及13、SEQ ID NO:14及13、SEQ ID NO:16及13、SEQID NO:18及13、SEQ ID NO:20及13，或SEQ ID NO:21及13；且所述经分离多肽特异性结合于人类CD46蛋白质。
在另一个实施例中，本发明涉及一种具有选自SEQ ID NO:11、13、14、16、18、20及21的氨基酸序列的经分离多肽。
在另一个实施例中，本发明的经分离多肽包括具有选自以下的一对序列的轻链可变区及重链可变区：SEQ ID NO:11及13、SEQ ID NO:14及13、SEQ ID NO:16及13、SEQ IDNO:18及13、SEQ ID NO:20及13及SEQ ID NO:21及13。
在另一实施例中，本发明涉及一种经分离的抗体或其片段，其包括轻链可变区，所述轻链可变区具有三个具有序列L1、L2及L3的互补决定区(CDR)，其中
所述L1序列为RAX1QX2IX3NYLN(SEQ ID NO:1)，
所述L2序列为YTSSLX4X5(SEQ ID NO:2)，
所述L3序列为QQYIKLPWT(SEQ ID NO:3)；及
重链可变区，所述重链可变区具有三个具有序列H1、H2及H3的互补决定区(CDR)，其中
所述H1序列为GGSVSSYDIS(SEQ ID NO:8)；
所述H2序列为VIWTDGGTNYNSAFMS(SEQ ID NO:9)；及
所述H3序列为VYDGYPWFAY(SEQ ID NO:10)；
其中X1为S或L；X2为G或W；X3为S或A；X4为H或F，X5为S或E；其限制条件为X1、X2、X3、X4及X5不能同时分别为S、G、S、H及S。
在一个实施例中，以上抗体或抗体片段可具有选自氨基酸序列RASQGISNYLN(SEQID NO:5)、RASQWISNYLN(SEQ ID NO:12)、RASQGIANYLN(SEQ ID NO:15)及RALQGISNYLN(SEQID NO:22)的L1序列。以上抗体或抗体片段可具有选自氨基酸序列YTSSLHS(SEQ ID NO:6)、YTSSLFS(SEQ ID NO:17)及YTSSLHE(SEQ ID NO:19)的L2序列。在抗体或抗体片段的每一前述实施例中，L1及L2序列中的一者必须不为SEQ ID NO:5的野生型L1序列及SEQ ID NO:6的野生型L2序列。
在另一实施例中，抗体或抗体片段可包括选自以下6个CDR集合的一组6个CDR：
SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10。
在一个实施例中，本发明的抗体或抗体片段可包括轻链可变区及重链可变区，各区独立地与一对分别选自以下的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性：SEQ ID NO:11及13、SEQ ID NO:14及13、SEQ ID NO:16及13、SEQ ID NO:18及13、SEQ ID NO:20及13，或SEQ ID NO:21及13；且所述抗体或抗体片段特异性结合于人类CD46蛋白质。
在一个实施例中，本发明的抗体或抗体片段可包括具有选自以下的一对序列的轻链可变区及重链可变区：SEQ ID NO:11及13、SEQ ID NO:14及13、SEQ ID NO:16及13、SEQID NO:18及13、SEQ ID NO:20及13或SEQ ID NO:21及13。
在一个实施例中，本发明的抗体或抗体片段与上文所描述的抗体或抗体片段中的任一者竞争结合至人类CD46。
在每一先前实施例中，与非肿瘤微环境中出现的相同条件的不同值相比，抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的条件值下可具有较高的与CD46蛋白质的结合活性。在一个实施例中，条件为pH。在一个实施例中，结合活性通过结合亲和力测量。
在每一先前实施例中，与亲本多肽、抗体或抗体片段在pH 6.0下的抗原结合活性相比，经分离多肽、抗体或抗体片段在pH 6.0下可具有至少70％的相同抗原结合活性，且与亲本多肽、抗体或抗体片段在pH 7.4下的抗原结合活性相比，多肽、抗体或抗体片段在pH7.4下可具有小于50％、或小于40％、或小于30％、或小于20％或小于10％的相同抗原结合活性。抗原结合活性可为与CD46蛋白质的结合。
在每一先前实施例中，抗原结合活性可通过ELISA分析测量。
在又一方面中，本发明提供一种免疫结合物，其包含上文所述的本发明的抗体或抗体片段中的任一者。在免疫结合物中，抗体或抗体片段可与选自化学治疗剂、放射性原子、细胞生长抑制剂及细胞毒性剂的药剂结合。
在又一方面中，本发明提供一种医药组合物，其包含上文所述的本发明的多肽、抗体或抗体片段，或免疫结合物中的任一者以及药学上可接受的载剂。
单剂量的医药组合物可包含量为约135mg、235mg、335mg、435mg、535mg、635mg、735mg、835mg、935mg、1035mg、1135mg、1235mg或1387mg的多肽、抗体或抗体片段、或免疫结合物。
单剂量的医药组合物可包含量在135至235mg、235至335mg、335至435mg、435至535mg、535至635mg、635至735mg、735至835mg、835至935mg、935至1035mg、1035至1135mg、1135至1235mg或1235至1387mg范围内的多肽、抗体或抗体片段、或免疫结合物。
前述医药组合物中的每一者可进一步包含免疫检查点抑制剂分子。所述免疫检查点抑制剂分子可为针对免疫检查点的抗体或抗体片段。免疫检查点可选自LAG3、TIM3、TIGIT、VISTA、BTLA、OX40、CD40、4-1BB、CTLA4、PD-1、PD-L1、GITR、B7-H3、B7-H4、KIR、A2aR、CD27、CD70、DR3及ICOS，或免疫检查点可为CTLA4、PD-1或PD-L1。
前述医药组合物中的每一者可进一步包含针对选自以下的抗原的抗体或抗体片段：PD1、PD-L1、CTLA4、AXL、ROR2、CD3、HER2、B7-H3、ROR1、SFRP4及WNT蛋白质。WNT蛋白质可选自WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11及WNT16。
在又一方面中，本发明提供一种用于诊断或治疗的试剂盒，其包含上文所述的本发明的多肽、抗体或抗体片段、免疫结合物或医药组合物中的任一者。
附图说明
图1展示与连接子有效负载结合的本发明的示范性条件性活性抗CD46抗体(下文称为“CAB ADC”)与人类CD46在pH 6.0下的结合活性，如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量。在图1中，BA-133-00-01为与连接子有效负载结合的基准(BM)野生型抗体(下文称为“WT ADC”)。
图2展示图1中所测试的本发明的示范性抗CD46 CAB ADC及WT ADC与人类CD46在pH 7.4下的结合活性，如通过ELISA所测量。
图3展示本发明的示范性抗CD46 CAB ADC及WT ADC与猕猴CD46在pH6.0下的结合活性，如通过ELISA所测量。
图4展示图3中所测试的本发明的示范性抗CD46 CAB ADC及WT ADC与猕猴CD46在pH 7.4下的结合活性，如通过ELISA所测量。
图5展示本发明的示范性抗CD46 CAB ADC及WT ADC与人类CD46在pH滴定下的结合活性，如通过ELISA所测量。
图6展示本发明的示范性抗CD46 CAB ADC及WT ADC与表达人类CD46的HEK 293细胞在pH 6.0下的结合活性，如通过荧光活化细胞分选(FACS)所测量。
图7展示本发明的示范性抗CD46 CAB ADC及WT ADC与表达人类CD46的HEK 293细胞在pH 7.4下的结合活性，如通过FACS所测量。
图8展示本发明的示范性抗CD46 CAB ADC及WT ADC与表达CD46的Colo205细胞在pH 6.0下的结合活性，如通过FACS所测量。
图9展示本发明的示范性抗CD46 CAB ADC及WT ADC与表达CD46的Colo205细胞在pH 7.4下的结合活性，如通过FACS所测量。
图10展示本发明的示范性抗CD46 CAB ADC及WT ADC与表达猕猴CD46的HEK 293细胞在pH 6.0下的结合活性，如通过FACS所测量。
图11展示本发明的示范性抗CD46 CAB ADC及WT ADC与表达猕猴CD46的HEK 293细胞在pH 7.4下的结合活性，如通过FACS所测量。
图12展示本发明的示范性抗CD46 CAB ADC及WT ADC针对表达人类CD46的HEK 293细胞在pH 6.0下的细胞杀灭活性。
图13展示本发明的示范性抗CD46 CAB ADC及WT ADC针对表达人类CD46的HEK 293细胞在pH 7.4下的细胞杀灭活性。
图14展示本发明的示范性抗CD46 CAB ADC及WT ADC针对表达人类CD46的Colo205细胞在pH 6.0下的细胞杀灭活性。
图15展示本发明的示范性抗CD46 CAB ADC及WT ADC针对表达人类CD46的Colo205细胞在pH 7.4下的细胞杀灭活性。
图16展示对于用本发明的示范性抗CD46 CAB ADC及WT ADC治疗的肿瘤异种移植小鼠的肿瘤体积的影响。
图17展示本发明的代表性条件性活性抗体的蛋白质序列。
具体实施方式
定义
为有助于理解本文提供的实例，某些频繁出现的术语在本文中加以定义。
结合所测量数量，如本文所用的术语“约”是指所属领域的技术人员所预期使测量及操作与测量的目的及所用测量设备的精确度在所关心的量上相匹配的测量数量的正常变化。除非另外指明，否则“约”是指所提供的值的+/-10％的变化。
如本文所用，术语“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合搭配物(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对(例如，抗体与抗原)成员之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其搭配物Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。可通过本领域中已知的常用方法(包含本文所描述的那些方法)来测量亲和力。用于测量结合亲和力的特定说明性及示范性实施例描述于下文中。
如本文所使用，术语“亲和力成熟”抗体是指相较于在一或多个重链或轻链可变区不具有一或多个改变的亲本抗体，在一或多个重链或轻链可变区中具有此类改变的抗体，此类改变使抗体对抗原的亲和力得以改进。
如本文所使用，术语“氨基酸”是指含有氨基(--NH2)及羧基(--COOH)的任何有机化合物；其优选地呈自由基团形式或者在缩合之后作为肽键的一部分。“二十个形成天然编码的多肽的α氨基酸”在本领域中已有所理解且是指：丙氨酸(ala或A)、精氨酸(arg或R)、天冬酰胺(asn或N)、天冬氨酸(asp或D)、半胱氨酸(cys或C)、谷氨酸(glu或E)、谷酰氨酸(gin或Q)、甘氨酸(gly或G)、组氨酸(his或H)、异亮氨酸(ile或I)、亮氨酸(leu或L)、赖氨酸(lys或K)、甲硫氨酸(met或M)、苯丙氨酸(phe或F)、脯氨酸(pro或P)、丝氨酸(ser或S)、苏氨酸(thr或T)、色氨酸(tip或W)、酪氨酸(tyr或Y)及缬氨酸(val或V)。
如本文所使用，术语“抗体”是指能够结合于抗原的抗原决定基的完整免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子片段，诸如Fab、Fab'、(Fab')2、Fv及SCA片段。可使用本领域中熟知的方法(参见例如哈洛(Harlow)及莱恩(Lane)，同上)制得这些抗体片段，其保留一定选择性结合至其所源自抗体的抗原(例如多肽抗原)的能力，且如下进一步描述这些抗体片段。抗体可用于通过免疫亲和色谱法分离制备量的抗原。此类抗体的各种其它用途是诊断及/或分级疾病(例如赘瘤形成)且用于治疗疾病的治疗性应用，所述疾病诸如：赘瘤形成、自体免疫性疾病、AIDS、心血管疾病、感染及其类似疾病。嵌合抗体、人类样抗体、人源化抗体或全人类抗体尤其适用于向人类患者投与。
Fab片段由抗体分子的单价抗原结合片段组成，且可通过用番木瓜蛋白酶消化全抗体分子得到由完整轻链及一部分重链组成的片段而产生。
可通过用胃蛋白酶处理全抗体分子，随后还原得到由完整轻链及一部分重链组成的分子而获得抗体分子的Fab'片段。每个以此方式处理的抗体分子获得两个Fab'片段。
可在无后续还原的情况下通过用胃蛋白酶处理全抗体分子获得抗体的(Fab')2片段。(Fab')2片段是通过两个二硫键保持在一起的两个Fab'片段的二聚体。
Fv片段定义为含有轻链可变区及重链可变区且表达为两条链的经基因工程改造的片段。
如本文所用，术语“抗体片段”是指除完整抗体外的分子，其包括完整抗体的一部分，且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包含(但不限于)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双功能抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，术语“抗CD46抗体”、“CD46抗体”及“结合于CD46的抗体”是指能够以足够亲和力结合CD46的抗体，使得抗体适用作靶向CD46的诊断剂及/或治疗剂。在一个实施例中，抗CD46抗体与不相关、非CD46蛋白质的结合的程度小于抗体与CD46的结合的约10％，如例如通过放射免疫分析法(RIA)所测量。在某些实施例中，结合于CD46的抗体的解离常数(Kd)≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM或≦0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些实施例中，抗CD46抗体结合于在来自不同物种的CD46(例如CD46的细胞外域)中保守的CD46的抗原决定基。
如本文所用，术语“结合”是指抗体的可变区或Fv与抗原的相互作用，其中所述相互作用视抗原上特定结构(例如抗原决定子或抗原决定基)的存在而定。举例来说，抗体可变区或Fv识别且结合于特定蛋白质结构而非一般蛋白质。如本文所用，术语“特异性结合(specifically binding/binding specifically)”表示抗体可变区或Fv与特定抗原以比与其它蛋白质更频繁、更快速、更大的持续时间及/或更大的亲和力结合或缔合。举例来说，抗体可变区或Fv与其抗原以比其结合于其它抗原更大的亲和力、亲合力、更容易地及/或以更大的持续时间特异性结合。对于另一实例，抗体可变区或Fv与细胞表面蛋白质(抗原)以比其结合于相关蛋白质或其它细胞表面蛋白质或通常通过多反应性天然抗体(即通过已知结合人类中天然发现的多种抗原的天然产生的抗体)识别的抗原基本上更大的亲和力结合。然而，“特异性结合”不一定需要排它性结合或不可检测地结合另一抗原，此为术语“选择性结合”的含义。在一个实例中，抗体可变区或Fv(或其它结合区)结合于抗原的“特异性结合”表示抗体可变区或Fv与抗原以l00 nM或更小，诸如50nM或更小，例如20nM或更小，诸如15nM或更小，或10nΜ或更小，或5nM或更小，2nM或更小，或1nM或更小的平衡常数(KD)结合。
如本文所用，术语“癌症”及“癌性”是指或描述哺乳动物中通常特征为不受调控的细胞生长/增生的生理病状。癌症的实例包含(但不限于)癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏(Hodgkin's)淋巴瘤及非霍奇金氏(non-Hodgkin's)淋巴瘤)、胚细胞瘤、肉瘤及白血病。此类癌症的更特定实例包含鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰脏癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝肿瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病及其它淋巴增生病症，及各种类型的头颈癌。
如本文所使用，术语“细胞增生性病症”及“增生性病症”是指与某种程度的异常细胞增生相关的病症。在一个实施例中，细胞增生性病症为癌症。
如本文所使用，术语“化学治疗剂”是指可用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包含烷基化剂，诸如噻替派(thiotepa)及环磷酰胺
Figure BDA0004002311330000121
磺酸烷基酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，诸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；乙烯亚胺及甲基三聚氰胺，包含六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺及三羟甲基三聚氰胺；多聚乙酰(尤其是布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)，
Figure BDA0004002311330000131
)；β-拉帕醌(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱(colchicines)；桦木酸(betulinic acid)；喜树碱(包含合成性类似物拓朴替康(topotecan)
Figure BDA0004002311330000132
CPT-11(伊立替康(irinotecan)，
Figure BDA0004002311330000133
)、乙酰基喜树碱、东莨菪素(scopolectin)及9-氨基喜树碱)；苔藓虫素(bryostatin)；海洋抑素(callystatin)；CC-1065(包含其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)及比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸；替尼泊甙(teniposide)；念珠藻环肽(特别是克瑞托欣(cryptophycin)1及克瑞托欣8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包含合成类似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；板克斯塔叮(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、甲基二(氯乙基)胺、甲基二(氯乙基)胺氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、新氮芥、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基尿素，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯尿素菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡奇霉素γ1I及卡奇霉素ωI1(参见例如尼科拉乌(Nicolaou)等人，应用化学国际版(英语)(Angew.Chem.Intl.Ed.Engl.),33:183-186(1994))；CDP323、口服α-4整合素抑制剂；达内霉素(dynemicin)，包含达内霉素A；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白(neocarzinostatin)发色团及相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-侧氧基-L-正亮氨酸、小红莓(doxorubicin)(包含
Figure BDA0004002311330000134
N-吗啉基-小红莓、氰基-(N-吗啉基)-小红莓、2-吡咯啉基-小红莓、盐酸小红莓脂质体注射液
Figure BDA0004002311330000135
脂质体小红莓TLC D-99
Figure BDA0004002311330000137
聚乙二醇化脂质体小红莓
Figure BDA0004002311330000136
及去氧小红莓)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)(诸如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非罗霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链尿素菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨喋呤(methotrexate)、吉西他滨(gemcitabine)
Figure BDA0004002311330000141
替加氟(tegafur)
Figure BDA0004002311330000143
卡培他滨(capecitabine)
Figure BDA0004002311330000142
埃坡霉素(epothilone)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如迪诺特宁(denopterin)、甲氨喋呤、蝶罗呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉宾(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、氮杂胞苷(azacitidine)、6-硫唑尿素嘧啶(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)，雄激素，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺，诸如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；贝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾达曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾福米辛(elfomithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基尿素(hydroxyurea)；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；类美登素(诸如美登素及安丝菌素(ansamitocin))；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure BDA0004002311330000144
多糖错合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2′,2′-三氯三乙胺；新月毒素(trichothecene)(尤其是T-2毒素、弗纳库林A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；尿烷(urethan)；长春地辛(vindesine)
Figure BDA0004002311330000145
Figure BDA0004002311330000151
达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；噻替派；紫杉醇(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)
Figure BDA0004002311330000152
太平洋紫杉醇的经白蛋白工程改造的纳米粒子调配物(ABRAXANETM)及多烯紫杉醇(docetaxel)
Figure BDA0004002311330000153
苯丁酸氮芥；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂药剂，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)(例如
Figure BDA00040023113300001527
)及卡铂(carboplatin)；长春花(vincas)，其防止微管蛋白聚合形成微管，包含长春花碱(vinblastine)
Figure BDA0004002311330000154
长春新碱(vincristine)
Figure BDA0004002311330000156
长春地辛
Figure BDA0004002311330000155
及长春瑞宾(vinorelbine)
Figure BDA0004002311330000157
依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；甲酰四氢叶酸(leucovorin)；诺凡特龙(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine)
Figure BDA0004002311330000158
类视黄素，诸如视黄酸，包含贝瑟罗汀(bexarotene)
Figure BDA0004002311330000159
双膦酸盐，诸如氯屈膦酸盐(例如
Figure BDA00040023113300001510
或
Figure BDA00040023113300001511
)、依替膦酸盐(etidronate)
Figure BDA00040023113300001512
NE-58095、唑来膦酸(zoledronic acid)/唑来膦酸盐(zoledronate)
Figure BDA00040023113300001513
阿仑膦酸盐(alendronate)
Figure BDA00040023113300001514
帕米膦酸盐(pamidronate)
Figure BDA00040023113300001515
替鲁膦酸盐(tiludronate)
Figure BDA00040023113300001516
或利塞膦酸盐(risedronate)
Figure BDA00040023113300001517
曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制异常细胞增生中所涉及的信号传导路径中基因的表达的反义寡核苷酸，诸如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如
Figure BDA00040023113300001518
疫苗及基因疗法疫苗，例如
Figure BDA00040023113300001519
疫苗、
Figure BDA00040023113300001520
疫苗及
Figure BDA00040023113300001521
疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如
Figure BDA00040023113300001522
)；rmRH(例如
Figure BDA00040023113300001523
)；BAY439006(索拉非尼(sorafenib)；Bayer)；SU-11248(舒尼替尼(sunitinib)，
Figure BDA00040023113300001524
Pfizer)；哌立福新(perifosine)、COX-2抑制剂(例如塞内昔布(celecoxib)或依他昔布(etoricoxib))、蛋白酶体抑制剂(例如PS341)；硼替佐米(bortezomib)
Figure BDA00040023113300001525
CCI-779；替吡法尼(tipifarnib)(R11577)；奥拉非尼(orafenib)、ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如奥利默森钠(oblimersen sodium)
Figure BDA00040023113300001526
匹蒽醌(pixantrone)；EGFR抑制剂(参见以下定义)；酪氨酸激酶抑制剂(参见以下定义)；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，诸如雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus)，
Figure BDA0004002311330000161
)；法呢基转移酶抑制剂，诸如洛那法尼(lonafarnib)(SCH 6636、SARASARTM)；以及上述任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两者或更多者的组合，诸如CHOP，即环磷酰胺、小红莓、长春新碱及泼尼松龙(prednisolone)的组合疗法的缩写；以及FOLFOX，即利用奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU及甲酰四氢叶酸(leucovorin)的组合的治疗方案的缩写。
如本文所定义的化学治疗剂包含用来调节、减轻、阻断或抑制可促进癌症生长的激素作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”。其本身可为激素，包含(但不限于)：具有混合促效剂/拮抗剂型态的抗雌激素，包含他莫昔芬(tamoxifen)
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4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)
Figure BDA0004002311330000163
艾多昔芬(idoxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、雷诺昔酚(raloxifene)
Figure BDA0004002311330000164
曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛西芬(keoxifene)及选择性雌激素受体调节剂(SERM)(诸如SERM3)；不具有促效剂特性的纯抗雌激素，诸如氟维司群(fulvestrant)
Figure BDA0004002311330000165
及EM800(此类药剂可阻断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、增加ER转换及/或抑制ER含量)；芳香酶抑制剂，包含类固醇芳香酶抑制剂，诸如福美司坦(formestane)及依西美坦(exemestane)
Figure BDA0004002311330000166
及非类固醇芳香酶抑制剂，诸如阿那曲唑(anastrazole)
Figure BDA0004002311330000167
来曲唑(letrozole)
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及胺鲁米特，及其它芳香酶抑制剂，包含伏罗唑(vorozole)
Figure BDA00040023113300001610
乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)
Figure BDA0004002311330000169
法屈唑(fadrozole)及4(5)-咪唑；黄体激素释放激素促效剂，包含亮丙立德(leuprolide)(
Figure BDA00040023113300001611
及
Figure BDA00040023113300001612
)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)及曲特瑞林(tripterelin)；性类固醇，包含助孕素(诸如乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)及乙酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate))、雌激素(诸如己烯雌酚(diethylstilbestrol)及普雷马林(premarin))及雄激素/类视黄素(诸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、所有反式视黄酸及非瑞替尼(fenretinide))；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮；雌激素受体下调剂(ERD)；抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁胺(nilutamide)及比卡鲁胺(bicalutamide)；以及上述任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两者或更多者的组合。
如本文所用，术语“嵌合”抗体是指重链及/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而所述重链及/或轻链的其余部分来源于不同来源或物种的抗体。
如本文所用，术语“条件性活性抗体”是指在肿瘤微环境中的条件下比在非肿瘤微环境中的条件下更具活性的抗CD46抗体。肿瘤微环境中的条件包含与非肿瘤微环境相比更低的pH值、更高的乳酸酯及丙酮酸酯浓度、低氧、更低的葡萄糖浓度及略更高的温度。举例来说，条件性活性抗体在正常体温下几乎无活性，但在肿瘤微环境中在较高温度下具有活性。在又一方面中，条件性活性抗体在正常氧化血液中具较低活性，但在肿瘤中存在的氧化不佳的环境下更具活性。在又一方面中，条件性活性抗体在正常生理pH 7.2-7.8中具较低活性，但在肿瘤微环境中存在的酸性pH 5.8-7.0或6.0-6.8下更具活性。在肿瘤微环境中存在所属领域的技术人员已知的其它条件，其还可在本发明中用作使抗CD46抗体具有不同的对CD46的结合亲和力的条件。
如本文所用，术语“细胞生长抑制剂”是指在活体外或活体内停滞细胞生长的化合物或组合物。因此，细胞生长抑制剂可为显着降低S期细胞百分比的药剂。细胞生长抑制剂的其它实例包含通过诱导G0/G1停滞或M期停滞阻断细胞周期进程的药剂。人源化抗Her2抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)
Figure BDA0004002311330000171
为诱导G0/G1停滞的细胞生长抑制剂的实例。经典M期阻断剂包含长春花(长春新碱及长春花碱)、紫杉烷及拓扑异构酶II抑制剂，诸如小红莓、表柔比星、道诺霉素、依托泊苷及博莱霉素。停滞G1的某些药剂还会使S期停滞，例如DNA烷基化剂，诸如他莫西芬、强的松(prednisone)、达卡巴嗪、甲氮芥、顺铂、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶及ara-C。其它信息可见于门德尔松(Mendelsohn)及伊斯雷尔(Israel)编,癌症的分子基础(The Molecular Basis of Cancer),第1章,标题为“细胞周期调节、致癌基因及按肿瘤药物(Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs)”,穆拉卡米(Murakami)等人(费城桑德斯出版社(W.B.Saunders,Philadelphia),1995),例如第13页。紫杉烷(太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇)皆为来源于紫杉树的抗癌药物。来源于欧洲紫杉的多烯紫杉醇(
Figure BDA0004002311330000173
Rhone-Poulenc Rorer)为太平洋紫杉醇(
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百时美施贵宝(Bristol-Myers Squibb))的半合成类似物。太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇促进微管从微管蛋白二聚体组装且通过防止解聚合稳定微管，其致使抑制细胞中的有丝分裂。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指抑制或妨碍细胞功能及/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包含(但不限于)放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨喋呤、阿德力霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)、小红莓、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、道诺霉素或其它插入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如核分解酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，包含其片段及/或变异体；以及以下所揭示的各种抗肿瘤或抗癌剂。
如本文所用，术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包括连接至同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)。通过使用过短以使得同一链上的两个域之间不能配对的连接子，迫使所述域与另一条链的互补域配对，且产生两个抗原结合位点。
如本文所使、用，术语“可检测标记”是指通过物理或化学方式进行直接或间接检测或测量指示样本中抗原的存在的任何物质。适用的可检测标记的代表性实例包含(但不限于)以下：可基于吸光度、荧光、反射率、光散射、磷光或发光特性直接或间接检测的分子或离子；可通过其放射特性检测的分子或离子；可通过其核磁共振或顺磁特性检测的分子或离子。可基于吸光度或荧光间接检测的分子组中包含例如各种酶，所述酶致使适当底物例如由非光吸收转化为光吸收分子或由非荧光转化为荧光分子。
如本文所用，术语“诊断”是指确定受试者对疾病或病症的易感性、确定受试者目前是否患有疾病或病症、患有疾病或病症的受试者的预后(例如鉴别癌的转移前或转移状态、癌症的分级或癌症对疗法的反应)及治疗计量(therametrics)(例如监测受试者的状况以提供关于治疗效果或功效的信息)。在一些实施例中，本发明的诊断方法尤其适用于检测早期癌症。
如本文所用，术语“诊断剂”是指可直接或间接检测且用于诊断目的的分子。诊断剂可向受试者或样本投与。可提供诊断剂本身或可与诸如条件性活性抗体的媒剂结合。
如本文所用，术语“效应功能”是指可归因于抗体的Fc区的所述生物活性，其因抗体同型而异。抗体效应功能的实例包含：C1q结合及补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；及B细胞活化。
如本文所用，术语药剂(例如医药调配物)的“有效量”是指在所需剂量及时段下有效获得所需治疗性或预防性结果的量。
如本文所用，术语“Fc区”用以定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C端区。所述术语包含天然序列Fc区及变异Fc区。在一个实施例中，人类IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另外说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，还称为EU索引，如卡巴特(Kabat)等人，相关免疫学的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第5版.马里兰州贝塞斯达美国国立卫生院公共卫生署(PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.),1991中所描述。
如本文所用，术语“构架”或“FR”是指除互补决定区(重链中的CDR或H1-3及轻链中的L1-3)残基外的可变域残基。可变域的FR通常由四个FR域组成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，在VH(或VL)中，CDR及FR序列通常依以下序列呈现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”是指包括抗原结合可变区(VH或VL)以及轻链恒定域(CL)及重链恒定域CH1、CH2及CH3的抗体。恒定域可为天然序列恒定域(例如人类天然序列恒定域)或其氨基酸序列变异体。视其重链的恒定域的氨基酸序列而定，全长抗体可归属于不同“类别”。全长抗体有五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且这些类别中有数种可进一步分成“亚类”(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgA2。对应于不同类别抗体的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ及μ。不同类别的免疫球蛋白的次单元结构及三维配置为熟知的。
如本文所用，术语“功能保守性变异体”是指蛋白质或酶中的给定氨基酸残基已变化，但不改变多肽的总体构形及功能，包含(但不限于)用具有类似特性(诸如极性、氢键结可能性、酸性、碱性、疏水性、芳香族基团及类似特性)的氨基酸替换氨基酸。除指示为保守氨基酸外的氨基酸的蛋白质可不同，以使得如根据比对流程(诸如通过丛集法(ClusterMethod))所测定，具有类似功能的两种蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似性百分比可为例如70％至99％且可在其间变化，其中相似性是基于MEGALIGN算法。“功能保守性变异体”还包含如通过BLAST或FASTA算法所测定，具有至少60％、优选地至少75％、更优选地至少85％、又优选地至少90％且甚至更优选地至少95％氨基酸一致性且具有与其相比较的天然或亲本蛋白质相同或基本上类似的特性或功能的多肽。
如本文所用，术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”及“宿主细胞培养物”可互换使用且是指已引入外源核酸的细胞，包含此类细胞的后代。宿主细胞包含“转型体”及“经转型细胞”，其包含初级经转型细胞及自其衍生的后代而不考虑继代次数。后代的核酸含量与母细胞可能不完全相同，但可能含有突变。本文包含针对原始转型细胞筛选或选择具有相同功能或生物活性的突变型后代。
如本文所用，术语“人类抗体”是具有如下氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人类或人类细胞所产生的抗体或源自利用人类抗体谱系或其它人类抗体编码序列的非人类来源的抗体的氨基酸序列。人类抗体的此定义特定排除包括非人类抗原结合残基的人源化抗体。
如本文所用，术语“人源化”抗体是指包括来自非人类CDR的氨基酸残基及来自人类FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施例中，人源化抗体将包括至少一个且通常两个可变域中的基本上全部，其中全部或基本上全部CDR对应于非人类抗体的CDR，且全部或基本上全部FR对应于人类抗体的FR。人源化抗体任选地可包括来源于人类抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如，非人类抗体)的“人源化形式”是指已经历人源化的抗体。
如本文所用，术语“免疫结合物”是结合于一或多个异源分子的抗体，所述(所述)分子包含(但不限于)细胞毒性剂。
如本文所用，术语“个体(individual)”或“受试者(subject)”是指哺乳动物。哺乳动物包含(但不限于)家养动物(例如牛、羊、猫、狗及马)、灵长类动物(例如人类及非人类灵长类动物，诸如猴)、兔及啮齿动物(例如小鼠及大鼠)。在某些实施例中，所述个体或受试者为人类。
如本文所用，术语“抑制细胞生长或增生”表示使细胞的生长或增生减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，且包含诱导细胞死亡。
如本文所用，术语“经分离”抗体是已从其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施例中，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度，所述纯度是通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如离子交换或逆相高效液相色谱(HPLC))测定。用于评估抗体纯度的方法的综述参见例如弗莱特曼(Flatman)等人，色谱法期刊B(J.Chromatogr.B)，第848卷，第79-87页,2007。
如本文所用，术语“编码抗CD46抗体的经分离核酸”是指编码抗体重链及轻链(或其片段)的一或多个核酸分子，包含单一载体或独立载体中的此类核酸分子及存在于宿主细胞中的一或多个位置处的此类核酸分子。
如本文所用，术语“转移”是指所有涉及CD46的过程，其支持癌细胞从原发性肿瘤扩散，穿透至淋巴管及/或血管中，经由血流循环及在体内其它地方的正常组织中的远端灶中生长(癌转移)。确切地说，其是指构成癌转移基础且由CD46刺激或介导的肿瘤细胞的细胞事件，诸如增生、迁移、固着非依赖性、细胞凋亡的逃避或血管生成因子的分泌。
如本文所用，术语“微环境”表示组织或身体的任何部分或区，其与组织的其它区或身体的其它区具有持久或暂时物理或化学差异。如本文所用，对于肿瘤，术语“肿瘤微环境”是指肿瘤存在的环境，其是肿瘤内的非细胞区域及刚好处于肿瘤组织外的区域，但并不涉及癌细胞本身的细胞内隔室。肿瘤及肿瘤微环境密切相关且不断相互作用。肿瘤可改变其微环境，且微环境可影响肿瘤生长及扩散方式。通常，肿瘤微环境具有在5.0至7.0范围内、或5.0至6.8范围内、或5.8至6.8范围内、或6.2至6.8范围内的低pH。另一方面，正常生理pH在7.2至7.8的范围内。还已知肿瘤微环境具有与血浆相比较低浓度的葡萄糖及其它养分，但具有较高浓度的乳酸。此外，肿瘤微环境可具有高于正常生理温度0.3℃至1℃的温度。肿瘤微环境已论述于吉利斯(Gillies)等人,“肿瘤微环境的MRI(MRI of the TumorMicroenvironment)”,磁共振成像杂志(Journal of Magnetic Resonance Imaging)，第16卷，第430-450页，2002中，其以全文引用的方式并入本文中。术语“非肿瘤微环境”是指除肿瘤外的部位的微环境。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即除可能的变异抗体(例如含有天然产生的突变或在制造单克隆抗体制剂期间出现，此类变异体通常以较小量存在)以外，构成所述群体的个别抗体相同及/或结合相同抗原决定基。相比于通常包含针对不同决定子(抗原决定基)的不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂的各单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。因此，修饰语“单克隆”指示抗体的特征为从基本上均质的抗体群体获得，且不应解释为需要通过任何特定方法产生所述抗体。举例来说，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制得，包含(但不限于)融合瘤方法、重组型DNA方法、噬菌体呈现方法及利用含有所有或部分人类免疫球蛋白基因座的转殖基因动物的方法、本文所描述的制得单克隆抗体的此类方法及其它示范性方法。
如本文所用，术语“裸抗体”是指不结合于异源部分(例如细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可存在于医药调配物中。
如本文所用，术语“药品说明书”用以指通常包含于治疗性产品的商业包装中的说明书，其含有关于与使用此类治疗性产品有关的适应症、用法、剂量、投与、组合疗法、禁忌症及/或警告的信息。
如本文所用，相对于参考多肽序列的术语“氨基酸序列一致性百分比(％)”定义为在比对序列且必要时引入间隙以达成最大序列一致性百分比之后，且在不将任何保守性取代视为序列一致性的一部分的情况下，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比。出于测定氨基酸序列一致性百分比的目的的比对可以所属领域的技能范围内的各种方式达成，例如使用公开可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。所属领域的技术人员可确定适用于比对序列的参数，包含在所比较序列的全长内达成最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，氨基酸序列一致性％值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克(Genentech,Inc.)编写，且原始代码已随用户文件一起提交于美国版权局(U.S.CopyrightOffice),华盛顿哥伦比亚特区(Washington D.C.),20559，其在美国版权局注册于美国版权注册号TXU510087下。ALIGN-2程序可公开购自加利福尼亚南旧金山基因泰克(Genentech,Inc.,South San Francisco,California)或可从原始代码编译。ALIGN-2程序应经编译用于UNIX操作系统，包含数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设置且不变化。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情形下，既定氨基酸序列A相对于、与或针对既定氨基酸序列B的氨基酸序列一致性％(或者其可表述为，既定氨基酸序列A具有或包括相对于、与或针对既定氨基酸序列B的一定氨基酸序列一致性％)如下计算：
100乘以分率X/Y
其中X为在A与B的比对程序中通过序列比对程序ALIGN-2评为一致匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y为B中的氨基酸残基的总数目。应了解，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的氨基酸序列一致性％与B相对于A的氨基酸序列一致性％不相等。除非另外特定陈述，否则本文所使用的所有氨基酸序列一致性％值如刚刚前段中所描述使用ALIGN-2计算机程序获得。
如本文所用，术语“医药调配物”是指所呈形式允许其中所含活性成分的生物活性有效发挥，且不含对调配物将投与的受试者具有不可接受毒性的其它组分的制剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指医药调配物中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载剂包含(但不限于)缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
本文所用的术语“经纯化”及“经分离”是指根据本发明的抗体或核苷酸序列，所指分子在基本上不存在其它同型生物大分子下存在。如本文所用，术语“经纯化”优选地表示存在至少75重量％、更优选地至少85重量％、又更优选地至少95重量％、且最佳地至少98重量％的同型生物大分子。编码特定多肽的“经分离”的核酸分子是指基本上不含其它不编码多肽的核酸分子的核酸分子；然而，所述分子可包含并不有害地影响组合物的基本特征的一些额外碱基或部分。
如本文所用，术语“重组抗体”是指由包括编码抗体的核酸的重组宿主细胞表示的抗体(例如嵌合、人源化或人类抗体或其抗原结合片段)。制造重组抗体的“宿主细胞”的实例包含：(1)哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)、COS、骨髓瘤细胞(包含Y0及NS0细胞)、幼仓鼠肾(BHK)细胞、Hela细胞及Vero细胞；(2)昆虫细胞，例如sf9、sf21及Tn5；(3)植物细胞，例如属于烟草属的植物(例如烟草(Nicotiana tabacum))；(4)酵母细胞，例如属于酵母属(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))或曲霉菌属(例如黑曲霉(Aspergillusniger))的酵母细胞；(5)细菌细胞，例如大肠杆菌细胞(Escherichia.coli cell)或枯草杆菌细胞(Bacillus subtilis cell)等。
如本文所用，术语“单链Fv”(“scFv”)是共价连接的VH::VL杂二聚体，其通常由基因融合体表达，所述基因融合体包含由肽编码连接子连接的VH及VL编码基因。“dsFv”是通过二硫键稳定的VH::VL杂二聚体。二价及多价抗体片段可通过单价scFv的缔合自发形成，或可通过肽连接子(诸如二价sc(Fv)2)偶联单价scFv来产生。
术语本发明抗体的“治疗有效量”表示足以按适用于任何医学治疗的合理的效益/风险比率治疗所述癌症的抗体的量。然而，应理解，本发明的抗体及组合物的每日总用量将由主治医师在合理医学判断范围内决定。任何特定患者的特定治疗有效剂量水准将视多种因素而定，所述因素包含所治疗的病症及所述病症的严重程度；所采用的特异性抗体的活性；所采用的特定组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别及饮食；所采用的特异性抗体的投与时间、投与途径及排泄速率；治疗持续时间；与所采用的特异性抗体组合或同时使用的药物；及医学领域中熟知的类似因素。举例来说，在所属领域的技能范围内，以低于达成期望的治疗效果所需的水准开始给药组合物，且逐渐增加剂量直到达成期望效果。
如本文所用，术语“治疗(treatment/treat/treating)”是指试图改变所治疗的个体的天然病程的临床干预，且可为实现预防或在临床病理学病程期间进行。所需治疗效果包含(但不限于)预防疾病发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理性后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病病况及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明抗体用于延迟疾病发展或减慢疾病进展。
如本文所用，术语“肿瘤”是指所有瘤性细胞生长及增生(无论恶性或良性)，及所有癌前及癌细胞以及组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增生性病症”、“增生性病症”及“肿瘤”不为互相排斥的，如本文中所提及。
如本文所用，术语“可变区”或“可变域”是指涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链域。天然抗体的重链及轻链可变域(分别为VH及VL)一般具有类似结构，其中各个域包括四个保守构架区(FR)及三个互补决定区(CDR)。(参见例如肯特(Kindt)等人，库贝免疫学(Kuby Immunology)，第6版，W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Co.)，第91页(2007))。单一VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可使用来自结合抗原的抗体的VH域或VL域分别筛选互补VL域或VH域的库来分离。参见例如波特兰(Portolano)等人，免疫学杂志(J.Immunol.),第150卷，第880-887页，1993；克莱森(Clarkson)等人，自然(Nature)，第352卷，第624-628页，1991。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播至其所连接的另一个核酸的核酸分子。所述术语包含呈自我复制核酸结构的载体以及并入其已引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够引导其以操作方式连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
出于说明的目的，通过参考各种示范性实施例来描述本发明的原理。尽管在本文中具体描述本发明的某些实施例，但所属领域的一般技术人员将易于认识到相同原理同样适用于且可用于其它系统及方法中。在详细解释本发明所揭示的实施例之前，应了解，本发明不将其应用限制于所显示的任何特定实施例的细节。另外，本文所用的术语是出于描述而非限制的目的。此外，尽管参考以一定次序呈现于本文中的步骤来描述某些方法，但在许多情况下，可按可为所属领域的技术人员理解的任何次序进行这些步骤；新颖方法因此不限于本文中所揭示的特定步骤排列。
必须注意，除非上下文另外明确说明，否则如本文及随附权利要求书所用的单数形式“一(a/an)”及“所述(the)”包含多个参考物。此外，术语“一(a或an)”、“一或多个”及“至少一个”在本文中可互换使用。术语“包括”、“包含”、“具有”及“构建自”还可互换使用。
除非另外规定，否则说明书及权利要求书所使用的表示成分的数量、诸如分子量、百分比、比率、反应条件等等的特性的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰，无论所述术语“约”是否存在。因此，除非有相反指示，否则说明书及权利要求书中所阐述的数值参数为近似值，其可视本发明设法获得的所需特性而变化。至少，且不试图将均等论的应用限于权利要求书的范围，各数值参数至少应根据所报导的有效数字的个数且通过应用普通舍入技术来解释。尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围及参数为近似值，但尽可能精确地报导特定实例中所阐述的数值。然而，任何数值均固有地含有因其各别测试测量值中发现的标准差所必然引起的某些错误。
应理解，本文所揭示的各组分、化合物、取代基或参数均应解释为单独或与本文所揭示的每一其它组分、化合物、取代基或参数中的一或多者组合使用而进行揭示。
还应理解，本文所揭示的各组分、化合物、取代基或参数的各量/值或量/值的范围应解释为还与针对本文揭示的任何其它组分、化合物、取代基或参数所揭示的各量/值或量/值的范围组合进行揭示，且因此，两种或更多种本文所揭示的组分、化合物、取代基或参数的量/值或量/值的范围的任何组合还出于本说明书的目的彼此组合进行揭示。
应进一步了解，本文揭示的各范围的各下限解释为与本文针对相同组分、化合物、取代基或参数所揭示的各范围的各上限的组合进行揭示。因此，两个范围的揭示内容应解释为通过组合各范围的各下限与各范围的各上限所衍生的四个范围的揭示内容。因此，三个范围的揭示内容应解释为通过组合各范围的各下限与各范围的各上限所衍生的九个范围的揭示内容等。此外，本说明书或实例中所揭示的组分、化合物、取代基或参数的特定量/值应解释为一个范围的下限或上限的揭示内容，且因此，可与一个范围的任何其它下限或上限或本申请案中其它地方所揭示的相同组分、化合物、取代基或参数的特定量/值组合，以形成所述组分、化合物、取代基或参数的范围。
抗CD46抗体
本发明的重链可变区及轻链可变区是各自使用美国专利第8,709,755号及第8,859,467号中所揭示的方法自亲本抗体获得。产生重链可变区及轻链可变区的此方法以及美国专利第8,709,755号及第8,859,467号中所揭示的产生抗体及抗体片段的方法以引用的方式并入本文中。
在一个方面中，本发明提供特异性结合于人类CD46的经分离多肽。经分离多肽包括轻链可变区，所述轻链可变区具有三个具有序列L1、L2及L3的互补决定区(CDR)，其中：
所述L1序列为RAX1QX2IX3NYLN(SEQ ID NO:1)，
所述L2序列为YTSSLX4X5(SEQ ID NO:2)，
所述L3序列为QQYIKLPWT(SEQ ID NO:3)；及
重链可变区，所述重链可变区具有三个具有序列H1、H2及H3的互补决定区(CDR)，其中
所述H1序列为GGSVSSYDIS(SEQ ID NO:8)；
所述H2序列为VIWTDGGTNYNSAFMS(SEQ ID NO:9)；及
所述H3序列为VYDGYPWFAY(SEQ ID NO:10)；
其中X1为S或L；X2为G或W；X3为S或A；X4为H或F，X5为S或E；其限制条件为X1、X2、X3、X4及X5不能同时分别为S、G、S、H及S。
以上多肽可具有选自氨基酸序列RASQGISNYLN(SEQ ID NO:5)、RASQWISNYLN(SEQID NO:12)、RASQGIANYLN(SEQ ID NO:15)及RALQGISNYLN(SEQ ID NO:22)的L1序列。以上多肽可具有选自氨基酸序列YTSSLHS(SEQ ID NO:6)、YTSSLFS(SEQ ID NO:17)及YTSSLHE(SEQID NO:19)的L2序列。在每一前述实施例中，L1及L2序列中的一者必须不为SEQ ID NO:5的野生型L1序列及SEQ ID NO:6的野生型L2序列。
在一个实施例中，以上多肽包括具有以下氨基酸序列的一组6个CDR：
SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10。
在另一实施例中，本发明的经分离多肽包括轻链可变区及重链可变区，各轻链可变区及重链可变区独立地与一对分别选自以下的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性：SEQ ID NO:11及13、SEQ ID NO:14及13、SEQ ID NO:16及13、SEQID NO:18及13、SEQ ID NO:20及13，或SEQ ID NO:21及13；且所述经分离多肽特异性结合于人类CD46蛋白质。
在另一个实施例中，本发明涉及一种具有选自SEQ ID NO:11、13、14、16、18、20及21的氨基酸序列的经分离多肽。
在另一个实施例中，本发明的经分离多肽包括具有选自以下的一对序列的轻链可变区及重链可变区：SEQ ID NO:11及13、SEQ ID NO:14及13、SEQ ID NO:16及13、SEQ IDNO:18及13、SEQ ID NO:20及13，及SEQ ID NO:21及13。
在另一实施例中，本发明涉及一种经分离的抗体或其片段，其包括轻链可变区，所述轻链可变区具有三个具有序列L1、L2及L3的互补决定区(CDR)，其中
所述L1序列为RAX1QX2IX3NYLN(SEQ ID NO:1)，
所述L2序列为YTSSLX4X5(SEQ ID NO:2)，
所述L3序列为QQYIKLPWT(SEQ ID NO:3)；及
重链可变区，所述重链可变区具有三个具有序列H1、H2及H3的互补决定区(CDR)，其中
所述H1序列为GGSVSSYDIS(SEQ ID NO:8)；
所述H2序列为VIWTDGGTNYNSAFMS(SEQ ID NO:9)；及
所述H3序列为VYDGYPWFAY(SEQ ID NO:10)；
其中X1为S或L；X2为G或W；X3为S或A；X4为H或F，X5为S或E；其限制条件为X1、X2、X3、X4及X5不能同时分别为S、G、S、H及S。
在一个实施例中，以上抗体或抗体片段可具有选自氨基酸序列RASQGISNYLN(SEQID NO:5)、RASQWISNYLN(SEQ ID NO:12)、RASQGIANYLN(SEQ ID NO:15)及RALQGISNYLN(SEQID NO:22)的L1序列。以上抗体或抗体片段可具有选自氨基酸序列YTSSLHS(SEQ ID NO:6)、YTSSLFS(SEQ ID NO:17)及YTSSLHE(SEQ ID NO:19)的L2序列。在抗体或抗体片段的每一前述实施例中，L1及L2序列中的一者必须不为SEQ ID NO:5的野生型L1序列及SEQ ID NO:6的野生型L2序列。
在另一实施例中，抗体或抗体片段可包括选自以下6个CDR集合的一组6个CDR：
SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；或
SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10。
在一个实施例中，本发明的抗体或抗体片段可包括轻链可变区及重链可变区，各区独立地与一对分别选自以下的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性：SEQ ID NO:11及13、SEQ ID NO:14及13、SEQ ID NO:16及13、SEQ ID NO:18及13、SEQ ID NO:20及13，或SEQ ID NO:21及13；且所述抗体或抗体片段特异性结合于人类CD46蛋白质。
在一个实施例中，本发明的抗体或抗体片段可包括具有选自以下的一对序列的轻链可变区及重链可变区：SEQ ID NO:11及13、SEQ ID NO:14及13、SEQ ID NO:16及13、SEQID NO:18及13、SEQ ID NO:20及13或SEQ ID NO:21及13。
在一个实施例中，本发明的抗体或抗体片段与上文所描述的抗体或抗体片段中的任一者竞争结合至人类CD46。
在每一前述实施例中，与非肿瘤微环境中出现的相同条件的不同值相比，抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的条件值下与CD46蛋白质的结合活性可能较高。在一个实施例中，条件为pH。在一个实施例中，结合活性通过结合亲和力测定。
在每一先前实施例中，与亲本多肽、抗体或抗体片段在pH 6.0下的抗原结合活性相比，经分离多肽、抗体或抗体片段在pH 6.0下可具有至少70％的相同抗原结合活性，且与亲本多肽、抗体或抗体片段在pH 7.4下的抗原结合活性相比，多肽、抗体或抗体片段在pH7.4下可具有小于50％、或小于40％、或小于30％、或小于20％或小于10％的相同抗原结合活性。抗原结合活性可为与CD46蛋白质的结合。
在每一先前实施例中，抗原结合活性可通过ELISA分析测量。
包含这些重链可变区及轻链可变区的抗体及抗体片段可特异性结合于CD46，尤其人类CD46。已发现，包括这些重链可变区中的一者与这些轻链可变区中的一者的组合的抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的pH(例如pH 6.0-6.8)下与CD46的结合活性高于在非肿瘤微环境中的pH(例如pH 7.0-7.6)下的结合活性。因此，本发明的抗CD46抗体或抗体片段在肿瘤微环境中与CD46的结合活性高于其在典型正常组织(非肿瘤)微环境中与CD46的结合活性。
因此，预期相对于非条件性活性抗CD46抗体，本发明的抗CD46抗体或抗体片段因其在诸如非肿瘤微环境的正常组织中与CD46的结合减少而展现减少的副作用。还预期本发明的抗CD46抗体或抗体片段具有与本领域中已知的单克隆抗CD46抗体相当的功效。此特征组合因副作用较少而允许使用较高剂量的这些抗CD46抗体或抗体片段，由此可提供更有效的疗法选项。
在其它实施例中，互补决定区外部的重链及轻链可变区的氨基酸序列可根据取代、插入及缺失原理突变，如本申请案中所论述，以提供这些变异体。在又其它实施例中，恒定区可经修饰以提供这些变异体。在又其它实施例中，互补决定区外部的重链及轻链可变区的氨基酸序列及恒定区两者可经修饰以提供这些变异体。
在得到这些变异体时，通过如本文所描述的方法引导。重链及轻链可变区的变异体可通过将适当修饰引入编码重链及轻链可变区的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。此类修饰包含例如重链及轻链可变区的氨基酸序列中残基的缺失、及/或插入、及/或取代。可进行缺失、插入及取代的任何组合以获得本发明的抗体或抗体片段，其限制条件为其具有预期特征，例如与人类CD46的抗原结合及/或条件性活性。
取代、插入及缺失变异体
在某些实施例中，提供具有一或多个氨基酸取代的抗体或抗体片段变异体。用于取代型突变诱发的相关位点包含CDR及构架区(FR)。保守取代展示于表1中“保守取代”的标题下。更实质性变化提供于表1中“示范性取代”的标题下，且如下文关于氨基酸侧链类别进一步描述。氨基酸取代可引入至相关抗体或抗体片段中且针对所需活性(例如保留/改进的抗原结合或降低的免疫原性)来筛选产物。
表1：氨基酸取代
Figure BDA0004002311330000311
氨基酸可根据共有侧链特性来进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将引起这些类别中的一者的成员换成另一个类别。
一种类型的取代型变异体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体或人类抗体)的一或多个互补决定区残基。一般来说，选用于进一步研究的所得变异体相对于亲本抗体将在某些生物特性方面具有修饰(例如改善)(例如亲和力提高、免疫原性降低)及/或将基本上保留亲本抗体的某些生物特性。一种示范性取代型变体为亲和力成熟抗体，其可例如使用基于噬菌体呈现的亲和力成熟技术(诸如本文所描述的技术)便利地产生。简言的，使一或多个CDR残基突变，且在噬菌体上呈现变异抗体并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可在CDR中进行改变(例如取代)以例如改进抗体亲和力。此类改变可在CDR“热点(hotspot)”中，即，由在体细胞成熟过程期间经历高频率突变的密码子编码的残基(参见例如乔杜里(Chowdhury),分子生物学方法(Methods Mol.Biol).第207卷,第179-196页,2008)及/或SDR(a-CDR)中进行，并测试所得变异VH或VL的结合亲和力。通过构建二级集合库及从集合库再选择达成的亲和力成熟已描述于例如胡根博(Hoogenboom)等人,分子生物学方法，第178卷，第1-37页，2001)中。在亲和力成熟的一些实施例中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸引导的突变诱发)中的任一者，将多样性引入至所选用于成熟的可变基因中。随后产生二级集合库。随后筛选所述集合库以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变异体。引入多样性的另一方法涉及CDR引导方法，其中将若干CDR残基(例如一次4至6个残基)随机分组。参与抗原结合的CDR残基可例如使用丙氨酸筛选突变诱发或模型化来进行特异性鉴别。尤其常常以CDR-H3及CDR-L3为目标。
在某些实施例中，取代、插入或缺失可发生在一或多个CDR内，只要此类改变不基本上降低抗体或抗体片段结合抗原的能力即可。举例来说，可在CDR中进行基本上不降低结合活性或结合亲和力的保守性改变(例如，如本文所提供的保守性取代)。此类改变可位于CDR“热点”或SDR的外部。在上文所提供的变异VH及VL序列的某些实施例中，各CDR未改变或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
一种适用于鉴别可作为突变诱发目标的抗体的残基或区域的方法称作“丙氨酸筛选突变诱发”，如通过坎宁安(Cunningham)及韦尔斯(Wells),科学(Science)，第244卷，第1081-1085页，1989所描述。在此方法中，鉴别出残基或目标残基群组(例如带电荷残基，诸如arg、asp、his、lys及glu)且将其置换为中性或带负电氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)以确定抗体或抗体片段与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展现功能敏感性的氨基酸位置处引入其它取代。或者或另外，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴别抗体或抗体片段与抗原之间的接触点。此类接触残基及邻近残基可作为取代候选物的目标或排除在取代候选物之外。可筛选变异体以确定其是否含有所需特性。
氨基酸序列插入包含长度在一个残基至含有一百个或超过一百个残基的多肽范围内的氨基末端及/或羧基末端融合，以及单一或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包含具有N末端甲硫胺酰基残基的抗体。抗体的其它插入变异体包含抗体的N端或C端与酶(例如对于ADEPT来说)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
考虑本文所述的抗体的氨基酸序列修饰。举例来说，可能需要提高抗体的结合、活性、亲和力及/或其它生物特性。已知在通过简单地仅接枝来源于非人类动物的抗体的VH及VL中的CDR于人类抗体的VH及VL的FR中产生人源化抗体时，抗原结合活性相比来源于非人类动物的原始抗体降低。认为非人类抗体的VH及VL的若干氨基酸残基不仅在CDR中而且在FR中与抗原结合活性直接或间接相关。因此，用源自人类抗体的VH及VL的FR的不同氨基酸残基取代这些氨基酸残基将降低结合活性。为解决所述问题，在接枝人类CDR的抗体中，试图鉴别人类抗体的VH及VL的FR的氨基酸序列中的与结合于抗体直接相关，或与CDR的氨基酸残基相互作用，或维持抗体的三维结构及与结合于抗原直接相关的氨基酸残基。降低的抗原结合活性可通过用源自非人类动物的原始抗体的氨基酸残基替换鉴别的氨基酸而增加。
修饰及变化可于本发明抗体的结构中及于编码其的DNA序列中进行，且仍可获得具有所需特征的编码抗体的功能分子。
在氨基序列中进行所述变化时，可考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在对蛋白赋予相互作用生物功能上的重要性为本领域中一般所理解。公认氨基酸的相对亲水性促成所得蛋白质的二级结构，所述二级结构又限定蛋白质与其它分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原及其类似物)的相互作用。各氨基酸已基于其疏水性及电荷特征而分配亲水指数，这些氨基酸为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷酰氨酸(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；及精氨酸(-4.5)。
本发明的另一目的还涵盖本发明抗体的功能保守性变异体。
当在较短序列的整个长度上大于80％、优选地大于85％、优选地大于90％的氨基酸一致，或大于约90％、优选地大于95％类似(功能相同)时，两个氨基酸序列是“基本上同源的”或“基本上类似的”。优选地，通过使用例如GCG(遗传学计算机组(Genetics ComputerGroup)，GCG包的程序手册(Program Manual for the GCG Package)，第7版，美国威斯康辛州麦迪逊)堆积程序或诸如BLAST、FASTA等序列比较算法中的任一者比对来鉴别类似或同源序列。
举例来说，某些氨基酸可经蛋白质结构中的其它氨基酸取代而不会显着损失活性。因为蛋白质的相互作用能力及性质限定蛋白质生物功能活性，所以某些氨基酸取代可在蛋白质序列中进行，且当然在其DNA编码序列中进行，同时仍获得具有类似特性的蛋白质。因此，预期可在本发明的抗体或抗体片段的序列或编码所述抗体或抗体片段的相应DNA序列中进行各种变化而不会显着损失其生物活性。
本领域中已知某些氨基酸可经具有类似亲水指数或评分的其它氨基酸取代，且仍产生具有类似生物活性的蛋白质，即，仍获得生物功能等效的蛋白质。
如上文所概述，氨基酸取代因此一般是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小及其类似者。考虑多种前述特征的示范性取代为所属领域的技术人员所熟知，且包含：精氨酸及赖氨酸；谷氨酸及天冬氨酸；丝氨酸及苏氨酸；谷酰氨酸及天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸。
糖基化变异体
在某些实施例中，本文所提供的抗CD46抗体或抗体片段改变以增加或减小所述抗体或抗体片段糖基化的程度。向抗体中添加糖基化位点或使抗体缺失糖基化位点可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一或多个糖基化位点来便利地实现。
在抗体包括Fc区的情况下，可改变与其连接于的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包括支链双触角寡糖，其通常通过N键连接至Fc区的CH2域的Asn297。参见例如莱特(Wright)等人,TIBTECH,第15卷，第26-32页，1997。寡糖可包含各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及连接至双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可对本发明抗体中的寡糖进行修饰以便产生具有某些改进特性的抗体变异体。
在一个实施例中，提供具有缺乏连接(直接或间接)至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变异体。举例来说，此类抗体中岩藻糖的量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％，或20％至40％。岩藻糖的量是通过计算糖链内Asn297处的岩藻糖相对于如通过MALDI-TOF质谱测量的连接至Asn297的所有糖结构(例如复合、杂交及高甘露糖结构)的总和的平均量来测定，如例如WO 2008/077546中所描述。Asn297是指位于Fc区中的约位置297(Fc区残基的Eu编号)处的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297还可位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，即在位置294与300之间。此类岩藻糖基化变异体可具有改进的ADCC功能。参见例如美国专利公开案第US 2003/0157108号(普雷斯塔L(Presta,L.))；第US 2004/0093621号(日本协和发酵工业株式会社(Kyowa Hakko KogyoCo.,Ltd))。关于“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”的抗体变异体的公开案的实例包含：US2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US 2002/0164328；US2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；冈崎慎司(Okazaki)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),第336卷，第1239-1249页,2004；大贯山根实知琉(Yamane-Ohnuki)等人，生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.),第87卷，第614-622页，2004。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包含缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(里普卡(Ripka)等人，生物化学与生物物理学集刊(Arch.Biochem.Biophys.),第249卷，第533-545页，1986；美国专利申请案第US2003/0157108 A号；及WO 2004/056312A1，尤其是实例11)，及基因剔除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8基因剔除的CHO细胞(参见例如大贯山根实知琉等人，生物技术与生物工程，第87卷，第614-622页，2004；康达Y(Kanda,Y.)等人，生物技术与生物工程，第94卷，第680-688页，2006；及WO2003/085107)。
抗体变异体进一步具备平分寡糖，例如其中连接于抗体的Fc区的双触角寡糖通过GlcNAc平分。此类抗体变异体可具有减少的岩藻糖基化及/或经改进的ADCC功能。此类抗体变异体的实例描述于例如WO 2003/011878；美国专利第6,602,684号；及US 2005/0123546中。还提供寡糖中的至少一个半乳糖残基与Fc区连接的抗体变异体。此类抗体变异体可具有经改进的CDC功能。所述抗体变异体描述于例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；及WO1999/22764中。
Fc区变异体
在某些实施例中，可将一或多个氨基酸修饰引入至本文所提供的抗CD46抗体或抗体片段的Fc区中，由此产生Fc区变异体。Fc区变异体可包括人类Fc区序列(例如，人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其包括在一或多个氨基酸位置处的氨基酸修饰(例如，取代)。
在某些实施例中，本发明涵盖具有一些而非所有效应功能的抗体变异体，由此使得所述抗体成为对于其中活体内抗体半衰期至关重要，而某些效应功能(诸如ADCC)为不必要或有害的应用合乎需要的候选物。可进行活体外及/或活体内细胞毒性分析以确认CDC及/或ADCC活性的降低/消耗。举例来说，可进行Fc受体(FcR)结合分析以确保抗体不具有FcγR结合能力(因此可能不具有ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于调节ADCC的初级细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血细胞上的FcR表达概述于拉维奇(Ravetch)及基内特(Kinet)，免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)第9卷，第457-492页，1991的第464页的表3中。评估相关分子的ADCC活性的活体外分析的非限制性实例描述于美国专利第5,500,362号(还参见例如赫尔斯特仑(Hellstrom)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Nat'l Acad.Sci.USA)，第83卷，第7059-7063页，1986)及赫尔斯特仑I等人，美国国家科学院院刊，第82卷，第1499-1502页，1985；美国专利第5,821,337号(还参见布鲁格曼(Bruggemann)等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)，第166卷，第1351-1361页，1987)中。或者，可采用非放射性分析方法(参见例如用于流式细胞测量术的ACTITM非放射性细胞毒性分析(加利福尼亚州山景城的细胞科技公司(CellTechnology,Inc.MountainView,Calif.))；及CytoTox
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非放射性细胞毒性分析(威斯康辛州麦迪逊的普洛麦格(Promega,Madison,Wis.))。适用于此类分析的效应细胞包含外周血液单核细胞(PBMC)及自然杀手(NK)细胞。或者或另外，可在活体内，例如在动物模型(诸如克莱恩斯(Clynes)等人，美国国家科学院院刊，第95卷，第652-656页，1998中所揭示的动物模型)中评估相关分子的ADCC活性。还可进行C1q结合分析以确认抗体不能结合C1q且因此不具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879及WO2005/100402中的C1q及C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可进行CDC分析(参见例如加扎诺桑托罗(Gazzano-Santoro)等人,免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)，第202卷，第163-171页，1996；克拉格MS(Cragg,M.S.)等人，血液(Blood)，第101卷，第1045-1052页，2003；及克拉格MS及葛兰妮MJ(M.J.Glennie),血液,第103卷，第2738-2743页，2004)。还可使用本领域中已知的方法(参见例如佩特科娃SB(Petkova,S.B.)等人，国际免疫学(Int'l.Immunol.)，第18卷，第1759-1769页，2006)进行FcRn结合及活体内清除率/半衰期测定。
具有降低的效应功能的抗体或抗体片段的变异体包含具有Fc区残基238、265、269、270、297、327及329中的一或多者的取代的变异体(美国专利第6,737,056号)。此类Fc突变体包含具有氨基酸位置265、269、270、297及327中的两者或更多者处的取代的Fc突变体，包含残基265及297取代为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利第7,332,581号)。
描述具有提高或降低的与FcR的结合的某些抗体变异体。(参见例如美国专利第6,737,056号；WO 2004/056312及雪德丝(Shields)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，第9卷，第6591-6604页，2001)。
在某些实施例中，抗体变异体包括Fc区，其具有改进ADCC的一或多个氨基酸取代，例如Fc区的位置298、333及/或334(残基的EU编号)的取代。
在一些实施例中，在Fc区中进行使C1q结合及/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即，改善或减弱)的改变，例如美国专利第6,194,551号、WO 99/51642及艾都索杰(Idusogie)等人，免疫学杂志，第164卷，第4178-4184页，2000中所描述。
半衰期增加且与负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿Fc受体(FcRn)(盖耶(Guyer)等人，免疫学杂志，第117卷，第587-593页，1976及金姆(Kim)等人，免疫学杂志，第24页，第249页，1994)的结合改进的抗体描述于US2005/0014934中。那些抗体包括其中具有一或多个取代的Fc区，所述一或多个取代改进Fc区与FcRn的结合。此类Fc变异体包含在以下Fc区残基中的一或多个处具有取代的Fc变异体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如在Fc区残基434处具有取代的Fc变异体(美国专利第7,371,826号)。关于Fc区变异体的其它实例，还参见邓肯(Duncan)及温特(Winter)，自然，第322卷，第738-740页，1988；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；及WO 94/29351。
经半胱氨酸工程改造的抗体变异体
在某些实施例中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“thioMAb”，其中抗CD46抗体或抗体片段的一或多个残基经半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，经取代的残基存在于抗体的可近接位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基进而定位于抗体的可近接位点且可用于使抗体与其它部分(诸如药物部分或连接子-药物部分)结合以产生如本文中进一步描述的免疫结合物。在某些实施例中，以下残基中的任一或多者可经半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(Eu编号)；及重链Fc区的5400(Eu编号)。经半胱氨酸工程改造的抗体可如例如美国专利第7,521,541号中所述产生。
抗体衍生物
在某些实施例中，本文所提供的抗CD46抗体或抗体片段可进一步修饰成含有所属领域中已知且易于获得的另外非蛋白质部分。适用于抗体或抗体片段衍生作用的部分包含(但不限于)水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包含(但不限于)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其于水中的稳定性而可在制造中具有优势。聚合物可具有任何分子量，且可为支链或非支链的。连接于抗体或抗体片段的聚合物数目可为变化的，及若连接超过一个聚合物，则其可为相同或不同分子。一般来说，用于衍生作用的聚合物的数目及/或类型可基于包含(但不限于)待改进的抗体或抗体片段的特定特性或功能、衍生物是否将用于限定条件下的疗法等考虑因素来确定。
在另一实施例中，提供可通过辐射曝露选择加热的抗体或抗体片段与非蛋白质部分的结合物。在一个实施例中，非蛋白质部分为碳纳米管(金(Kam)等人，美国国家科学院院刊，第102卷，第11600-11605页，2005)。辐射可具有任何波长，且包含(但不限于)不损害普通细胞但将非蛋白质部分加热至杀死抗体-非蛋白质部分近侧的细胞的温度的波长。
本发明的抗CD46抗体或抗体片段或其变异体在肿瘤微环境中的条件下与CD46的结合活性或结合亲和力高于在非肿瘤微环境中的条件下的结合活性或结合亲和力。在一个实施例中，肿瘤微环境中的条件及非肿瘤微环境中的条件均为pH。因此，本发明的抗CD46抗体或抗体片段可在约5.0至6.8的pH下选择性结合于CD46，但将在正常非肿瘤微环境中遇到的约7.2至7.8的pH下具有较低与CD46的结合活性或结合亲和力。如实例3及6中所示，抗CD46抗体或抗体片段在pH 6.0下与CD46的结合活性或结合亲和力高于在pH 7.4下的结合活性或结合亲和力。
在某些实施例中，本发明的抗CD46抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的条件下对CD46的解离常数(Kd)为约≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM或≦0.001nM(例如10-8M或更小、10-8M至10-13M、10-9M至10-13M)。在一个实施例中，抗体或抗体片段在非肿瘤微环境中的条件下对CD46的Kd与在肿瘤微环境中的相同条件下的Kd的比率为至少约1.5:1、至少约2:1、至少约3:1、至少约4:1、至少约5:1、至少约6:1、至少约7:1、至少约8:1、至少约9:1、至少约10:1、至少约20:1、至少约30:1、至少约50:1、至少约70:1或至少约100:1。
在另一实施例中，抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的条件下对CD46的结合活性与在非肿瘤微环境中的相同条件下的结合活性的比率为至少约1.5:1、至少约2:1、至少约3:1、至少约4:1、至少约5:1、至少约6:1、至少约7:1、至少约8:1、至少约9:1、至少约10:1、至少约20:1、至少约30:1、至少约50:1、至少约70:1或至少约100:1。
在一个实施例中，Kd是通过放射性标记的抗原结合分析(RIA)测量，所述分析是以相关抗体的Fab型式及其抗原使用以下分析进行。Fab对抗原的溶液结合亲和力是通过以下来测量：在未标记抗原的滴定系列存在下使Fab与最低浓度的(125I)标记抗原相平衡，随后用经抗Fab抗体涂布的培养板捕捉结合抗原(参见例如，陈(Chen)等人，分子生物学杂志293:865-881(1999))。为确立分析条件，将
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多孔板(赛默科技(ThermoScientific))用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉抗Fab抗体(卡佩拉实验室(CappelLabs))涂布隔夜，且随后在室温(约23℃)下用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白封闭两小时至五小时。在无吸附剂培养板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]抗原与相关Fab的连续稀释液混合(例如与普雷斯塔等人，癌症研究57:4593-4599(1997)中对抗VEGF抗体Fab-12的评估一致)。接着将相关Fab培育隔夜；然而，培育可持续较长时间段(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，在室温下将混合物转移至捕捉培养板中以用于培育(例如持续一小时)。随后移除溶液且用含0.1％聚山梨醇酯20(TWEEN-
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)的PBS洗涤培养板八次。当培养板干燥时，添加150微升/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；帕卡德(Packard))，且在TOPCOUNTTMγ计数器(帕卡德)上对培养板计数十分钟。选择提供小于或等于20％最大结合的各Fab的浓度以用于竞争性结合分析。
根据另一实施例，Kd是使用表面等离子体共振分析，在25℃下使用具有约10个反应单位(RU)的固定抗原CM5芯片的
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-2000或
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-3000(纽泽西州皮斯卡特维的BIAcore公司)测量。简单来说，根据供应商说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE公司)。用10mM乙酸钠将抗原(pH 4.8)稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后在5微升/分钟的流动速率下注射以获得大约10个反应单位(RU)的偶合蛋白质。在注入抗原后，注入1M乙醇胺以阻断未反应的基团。关于动力学测量，在25℃下以大约25μl/min的流动速率注射Fab于含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。缔合速率(kon)及解离速率(koff)是使用简单的一比一朗格缪尔结合模型(one-to-one Langmuir binding model；3.2版
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评价软件)，通过同时拟合缔合及解离感测图谱来计算。平衡解离常数(Kd)是按比率koff/kon来计算。参见例如陈等人，分子生物学杂志293:865-881(1999)。若通过上述表面等离子体共振分析得到的结合速率超过106M-1s-1，则可通过使用荧光淬灭技术测定结合速率，所述技术测量PBS(pH 7.2)中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃下、在浓度递增的抗原存在下的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少，如用光谱仪(诸如具有搅拌式比色管的止流装备型分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))所测量。
本发明的抗CD46抗体可为嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。在一个实施例中，采用抗CD46抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、scFv、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体或F(ab')2片段及由抗体片段形成的多特异性抗体。在另一实施例中，抗体为全长抗体，例如完整IgG抗体或如本文所定义的其它抗体类别或同型。关于某些抗体片段的综述，参见哈德森(Hudson)等人，自然医学(Nat.Med.)，第9卷，第129-134页，2003。关于scFv片段的综述，参见例如普鲁克森(Pluckthün),在单克隆抗体的药理学(The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies)中,第113卷,罗森堡(Rosenburg)及穆尔(Moore)编，(纽约斯普格林出版社(Springer-Verlag,New York)),第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；及美国专利第5,571,894号及第5,587,458号。关于包括救助受体结合抗原决定基残基且具有增加的活体内半衰期的Fab及F(ab')2片段的论述，参见美国专利第5,869,046号。
本发明的双功能抗体可为二价的或双特异性的。关于双功能抗体的实例，参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；哈德森等人，自然医学,9:129-134(2003)；及霍林杰等人，美国国家科学院院刊，第90卷，第6444至6448页，1993。三功能抗体及四功能抗体的实例还描述于哈德森等人，自然医学，第9卷，第129-134页,2003中。
在一些实施例中，本发明包括单域抗体片段，其包括抗体的重链可变域的全部或一部分或轻链可变域的全部或一部分。在某些实施例中，单域抗体为人类单域抗体(马萨诸塞州沃尔瑟姆的Domantis公司；参见例如美国专利第6,248,516B1号)。
抗体片段可通过各种技术制得，包含(但不限于)蛋白分解消化完整抗体以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)制造，如本文所描述。
在一些实施例中，本发明的抗CD46抗体可为嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利第4,816,567号；及莫里森(Morrison)等人，美国国家科学院院刊，第81卷，第6851至6855页，1984)中。在一个实例中，嵌合抗体包括非人类可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人类灵长类动物(诸如猴)的可变区)及人类恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中相对于亲本抗体的类别或子类，所述抗体的类别或子类已有所变化。嵌合抗体包含其抗原结合片段。
在某些实施例中，本发明的嵌合抗体为人源化抗体。通常，对此类非人类抗体进行人源化以降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人类抗体的特异性及亲和力。一般来说，人源化抗体包括一或多个可变域，其中CDR(或其部分)源自非人类抗体，且FR(或其部分)源自人类抗体序列。人源化抗体可任选地还包括人类恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基经来自非人类抗体(例如，CDR残基所来源的抗体)的对应残基取代，例如用以恢复或改进抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制造方法评述于例如阿尔马格罗(Almagro)及弗兰森(Fransson),生物科学前沿(Front.Biosci.),第13卷，第1619-1633页，2008中，且进一步描述于以下中：例如里希曼(Riechmann)等人，自然，第332卷，第323-329页，1988；奎因(Queen)等人，美国国家科学院院刊，第86卷，第10029-10033页，1989；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号及第7,087,409号；卡什米里(Kashmiri)等人,方法(Methods)，第36卷，第25-34页，2005(描述SDR(a-CDR)接枝)；帕德兰(Padlan)，分子免疫学，第28卷，第489-498页，1991(描述“表面重塑”)；达尔阿夸(Dall'Acqua)等人，方法，第36卷，第43-60页，2005(描述“FR改组”)；及奥斯本(Osbourn)等人，方法，第36卷，第61-68页，2005及克利马(Klimka)等人，英国癌症杂志，第83卷，第252-260页，2000(描述FR改组的“导引选择”方法)。
可用于人源化的人类构架区包含(但不限于)：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的构架区(参见例如米姆斯(Sims)等人，免疫学杂志，第151卷，第2296页，1993)；来源于具有轻链或重链可变区的特定子组的人类抗体的共同序列的构架区(参见例如卡特(Carter)等人，美国国家科学院院刊，第89卷，第4285页，1992；及普雷斯塔等人，免疫学杂志，第151卷，第2623页，1993)；人类成熟(体细胞突变)构架区或人类生殖系构架区(参见例如阿尔马格罗及弗兰森，生物科学前沿，第13卷，第1619至1633页，2008)；及来源于筛选FR库的构架区(参见例如巴卡(Baca)等人，生物化学杂志，第272卷，第10678至10684页，1997及罗索克(Rosok)等人，生物化学杂志第271卷，第22611至22618页，1996)。
在一些实施例中，本发明的抗CD46抗体为多特异性的，例如双特异性抗体。多特异性抗体为对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施例中，结合特异性之一是针对CD46且另一者是针对另一抗原。在某些实施例中，双特异性抗体可结合于CD46的两个不同抗原决定基。双特异性抗体还可用于使细胞毒性剂定位于表达CD46的细胞上。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段。
用于制造多特异性抗体的技术包含(但不限于)重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见米尔斯泰因(Milstein)及切洛(Cuello)，自然，第305卷，第537至540页，1983)，WO 93/08829，及特劳内克(Traunecker)等人，欧洲分子生物学学会会刊(EMBO J.)，第10卷，第3655至3659页，1991)，及“杵-臼结构(knob-in-hole)”工程改造(参见例如美国专利案第5,731,168号)。多特异性抗体还可通过以下制备：工程改造静电导向效应以制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；使两个或更多个抗体或片段交联(参见例如美国专利第4,676,980号及布伦南(Brennan)等人，科学，第229卷，第81-83页，1985)；使用亮氨酸拉链制造双特异性抗体(参见例如科斯特尼(Kostelny)等人，免疫学杂志，第148卷，第1547-1553页，1992)；使用“双功能抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如霍林格(Hollinger)等人，美国国家科学院院刊，第90卷，第6444-6448页，1993)；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如格鲁伯(Gruber)等人，免疫学杂志，第152卷，第5368-5374页，1994)；以及如例如塔特(Tutt)等人，免疫学杂志，第147卷，第60-69页，1991中所述制备三特异性抗体。
本文还包含具有三个或更多个功能性抗原结合位点的经工程改造的抗体，包含“章鱼抗体(Octopus antibody)”(参见例如US 2006/0025576A1)。
本发明的抗CD46抗体或抗体片段可使用重组方法及组合物制造，其详细描述于US2016/0017040中。
本发明的抗CD46抗体或抗体片段的物理/化学特性及/或生物活性可通过所属领域中已知的各种分析进行测试及测量。一些这些分析描述于美国专利第8,853,369号中。
B.免疫结合物
在另一方面中，本发明还提供免疫结合物，其包括与一或多种细胞毒性剂结合的抗CD46抗体或抗体片段，所述细胞毒性剂为诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素、酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。
在一个实施例中，免疫结合物为抗体-药物结合物(ADC)，其中抗体或抗体片段与一或多种药物结合，所述药物包含(但不限于)类美登素(参见美国专利第5,208,020号、第5,416,064号及欧洲专利EP 0 425 235 B1)；奥瑞他汀(auristatin)，诸如单甲基阿瑞他汀药物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(参见美国专利第5,635,483号及第5,780,588号，以及第7,498,298号)；海兔毒素；卡奇霉素或其衍生物(参见美国专利第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号及第5,877,296号)；辛曼(Hinman)等人，癌症研究，第53卷，第3336-3342页，1993；及洛德(Lode)等人，癌症研究，第58卷，第2925-2928页，1998)；蒽环霉素，诸如柔红霉素或小红莓(参见克拉茨(Kratz)等人，当今医药化学(Current Med.Chem.)，第13卷，第477-523页，2006；杰弗里(Jeffrey)等人，生物有机化学与医药化学通讯(Bioorganic&Med.Chem.Letters)，第16卷，第358-362页，2006；托尔戈夫(Torgov)等人，生物共轭化学(Bioconj.Chem.)，第16卷，第717-721页，2005；纳吉(Nagy)等人，美国国家科学院院刊，第97卷，第829-834页，2000；迪布维奇(Dubowchik)等人，生物有机化学与医药化学通讯，第12卷，第1529-1532页，2002；金(King)等人，药物化学杂志(J.Med.Chem.)，第45卷，第4336-4343页，2002；及美国专利第6,630,579号)；甲氨喋呤；长春地辛；紫杉烷，诸如多烯紫杉醇、太平洋紫杉醇、拉洛他赛(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)及奥他赛(ortataxel)；新月毒素；及CC1065。
在另一实施例中，免疫结合物包括与酶活性毒素或其片段结合的如本文所描述的抗体或抗体片段，所述酶活性毒素或其片段包含(但不限于)白喉A链(diphtheria Achain)、白喉毒素(diphtheria toxin)的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链(ricin A chain)、相思子毒素A链(abrin Achain)、莫迪素A链(modeccin A chain)、α-帚曲菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleuritesfordii)蛋白质、康乃馨(dianthin)蛋白质、洋商陆(Phytolaca americana)蛋白质(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树素(gelonin)、有丝分裂素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)及单端孢霉烯类毒素(tricothecene)。
在另一实施例中，免疫结合物包括与放射性原子结合以形成放射性结合物的如本文所描述的抗体或抗体片段。多种放射性同位素可用于制造放射性结合物。实例包含At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu的放射性同位素。当放射性结合物用于检测时，其可包括用于闪烁摄影研究的放射性原子，例如tc99m或I123；或用于核磁共振(NMR)成像(又称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰及铁。
在一些实施例中，免疫结合物包括放射性试剂，其可选自α发射体、β发射体及γ发射体。α发射体的实例为211At、210Bi、212Bi、211Bi、223Ra、224Ra、225Ac及227Th。β发射体的实例为67Cu、90Y、131I、153Sm、l66Ho及186Re。γ发射体的实例为60Co、137Ce、55Fe、54Mg、203Hg及133Ba。
可使用多种双官能蛋白质偶合剂制得抗体/抗体片段与细胞毒性剂的结合物，所述双官能蛋白质偶合剂为诸如N-丁二酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二酰亚氨基-4-(N-顺丁烯二酰亚氨基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、酰亚胺酯的双官能衍生物(诸如二亚胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(诸如辛二酸二丁二酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)及双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。举例来说，蓖麻毒素免疫毒素可如维特塔(Vitetta)等人，科学，第238卷，第1098页，1987中所描述来制备。碳14标记的1-异硫氰基苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为用于使放射性核苷酸与抗体结合的示范性螯合剂。参见WO 94/11026。连接子可为在细胞中促进细胞毒性药物释放的“可裂解连接子”。举例来说，可使用酸不稳定性连接子、肽酶敏感性连接子、光不稳定性连接子、二甲基连接子或含二硫键的连接子(沙里(Chari)等人，癌症研究，第52卷，第127至131页，1992；美国专利第5,208,020号)。
本文的免疫结合物明确涵盖(但不限于)用交联试剂制备的结合物，所述交联试剂包含(但不限于)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB，及SVSB(丁二酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，所述交联试剂可购得(例如购自美国伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A))。
ADC的示范性实施例包含靶向肿瘤细胞的抗体或抗体片段(Ab)、药物部分(D)及将Ab连接至D的连接子部分(L)。在一些实施例中，抗体经由一或多个氨基酸残基(诸如赖氨酸及/或半胱氨酸)连接于连接子部分(L)。
示范性ADC具有式I：Ab-(L-D)p，其中p为1至约20。在一些实施例中，可结合至抗体的药物部分的数目受自由半胱氨酸残基的数目限制。在一些实施例中，自由半胱氨酸残基是通过本文所描述的方法引入抗体氨基酸序列中。示范性式I的ADC包含(但不限于)具有1、2、3或4个经工程改造的半胱氨酸氨基酸的抗体(莱昂(Lyon)等人，酶学方法(Methods inEnzym.)，第502卷，第123至138页，2012)。在一些实施例中，一或多个自由半胱氨酸残基不使用工程改造已存在于抗体中，在此情况下现有自由半胱氨酸残基可用于将抗体结合于药物。在一些实施例中，抗体在抗体结合前暴露于还原条件以产生一或多个自由半胱氨酸残基。
连接子用于使部分结合于抗体以形成免疫结合物，诸如ADC。适合连接子描述于WO2017/180842中。
可结合至抗体的一些药物部分描述于WO 2017/180842中。
药物部分还包含具有核分解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸内切酶)。
在某些实施例中，免疫结合物可包括高度放射性原子。多种放射性同位素可用于产生放射性结合抗体。实例包含At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu的放射性同位素。在一些实施例中，当免疫结合物用于检测时，其可包括用于闪烁摄影研究的放射性原子，例如Tc99或I123；或用于核磁共振(NMR)成像(还称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，诸如锆-89、碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。锆-89可与各种金属螯合剂错合且与抗体结合，例如用于PET成像(WO 2011/056983)。
放射性标记或其它标记可以已知方式并入免疫结合物中。举例来说，肽可使用包括例如一或多个氟-19原子代替一或多个氢的适合氨基酸前驱物生物合成或化学合成。在一些实施例中，诸如Tc99、I123、Re186、Re188及In111的标记可经由抗体中的半胱氨酸残基连接。在一些实施例中，钇-90可经由抗体的赖氨酸残基附接。在一些实施例中，IODOGEN方法(弗雷克(Fraker)等人,生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，第80卷，第49-57页，1978)可用于并入碘-123。“免疫闪烁法中的单克隆抗体(MonoclonalAntibodies in Immunoscintigraphy)”(沙塔尔(Chatal),CRC出版社1989)描述某些其它方法。
在某些实施例中，免疫结合物可包括结合于前药活化酶的抗体。在一些此类实施例中，前药活化酶使前药(例如肽基化学治疗剂，参见WO 81/01145)转化为活性药物，诸如抗癌药物。在一些实施例中，此类免疫结合物适用于抗体依赖性酶介导的前药疗法(“ADEPT”)。可结合于抗体的酶包含(但不限于)碱性磷酸酶，其适用于将含磷酸酯基的前药转化为自由药物；芳基硫酸酯酶，其适用于将含硫酸酯基的前药转化为自由药物；胞嘧啶脱胺酶，其适用于将无毒5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，诸如沙雷菌属蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶及组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B及L)，其适用于将含肽前药转化为自由药物；D-丙胺酰基羧肽酶，其适用于转化含有D-氨基酸取代基的前药；碳水化合物裂解酶，诸如β-半乳糖苷酶及神经氨酸苷酶，其适用于将糖基化前药转化为自由药物；β-内酰胺酶，其适用于将经β-内酰胺衍生的药物转化为自由药物；以及青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶及青霉素G酰胺酶，其适用于将分别在胺氮处经苯氧基乙酰基或苯乙基衍生的药物转化为自由药物。在一些实施例中，酶可通过所属领域中熟知的重组DNA技术共价结合于抗体。参见例如纽伯格(Neuberger)等人，自然，第312卷，第604-608页，1984。
结合物中的载药量由p表示，p为每一抗体的药物部分的平均数目。载药量可在每个抗体1至20个药物部分的范围内。本发明的结合物可具有在1至20个范围内的药物部分。在由结合反应制备结合物中所使用的每个抗体的药物部分的平均数目可通过诸如质谱法、ELISA分析及HPLC的常规方式表征。
对于一些抗体-药物结合物(ADC)，载药量可受抗体上连接位点的数目限制。举例来说，在连接为半胱氨酸硫醇的情况下，如在以上某些示范性实施例中，抗体可仅具有一个或若干个半胱氨酸硫醇基，或可仅具有一个或若干个可连接连接子的足够反应性硫醇基。在某些实施例中，较高载药量(例如p>5)可造成某些抗体-药物结合物的凝聚、不可溶性、毒性或细胞渗透性丧失。在某些实施例中，ADC的平均载药量在1至约8个；或约2至约6个；或约3至约5个的范围内。实际上，某些ADC已展示药物部分/抗体的最佳比率可低于8，且可为约2至约5(美国专利第7,498,298号)。
在某些实施例中，在结合反应期间使少于理论最大值的药物部分结合于抗体。抗体可含有例如不与药物-连接子中间物或连接子试剂反应的赖氨酸残基，如下文所论述。一般来说，抗体不含许多可连接至药物部分的自由及反应性半胱氨酸硫醇基。实际上，抗体中的大多数半胱氨酸硫醇基残基以二硫桥键形式存在。在某些实施例中，抗体可用诸如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)的还原剂在部分或完全还原条件下还原，产生反应性半胱氨酸硫醇基。在某些实施例中，抗体经历变性条件，以显出反应性亲核基团，诸如赖氨酸或半胱氨酸。
ADC的负载(药物/抗体比率)可以不同方式控制，且例如通过如下来控制：(i)限制药物-连接子中间物或连接子试剂相对于抗体的摩尔过量；(ii)限制结合反应时间或温度；及(iii)针对半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原条件。
C.用于诊断及检测的方法及组合物
在某些实施例中，本文所提供的抗CD46抗体或抗体片段中的任一者可用于定量或定性地检测生物样本中CD46的存在。在某些实施例中，生物样本包括细胞或组织，诸如乳房、胰脏、食道、肺及/或大脑细胞或组织。
本发明的另一方面涉及本发明的抗CD46抗体或抗体片段，其用于诊断及/或监测在体内至少一个位置处CD46表达量从正常生理水准增加或减少的癌症或另一疾病。
在一优选实施例中，本发明的抗体或抗体片段可用诸如荧光分子、放射性分子或上述在本领域中已知的任何其它标记的可检测分子或物质标记。举例来说，本发明的抗体或抗体片段可用放射性分子标记。举例来说，适合放射性分子包含(但不限于)用于闪烁摄影研究的放射性原子，诸如123I、124I、111In、186Re及188Re。本发明的抗体或抗体片段还可用用于核磁共振(NMR)成像的自旋标记来标记，诸如碘-123、碘-131、铟-Ill、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。在投与抗体后，检测患者内放射性标记抗体的分布。可使用任何适合的已知方法。一些非限制性实例包含计算机断层扫描(CT)、正电子发射断层摄影(PET)、磁共振成像(MRI)、荧光、化学发光及超声波扫描。
本发明的抗体或抗体片段可适用于诊断及分级与CD46过度表达相关的癌症及疾病。与CD46过度表达相关的癌症可包含鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰脏癌、胶细胞肿瘤(诸如成胶质细胞瘤及神经纤维瘤)、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝肿瘤、乳癌、结肠癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer/renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、肉瘤、血液癌(白血病)、星形细胞瘤及各种类型的头颈癌或其它CD46表达或过度表达型过度增生性疾病。
本发明的抗体或抗体片段可用于诊断除癌症外的CD46表达增加或减少的疾病。可溶性或细胞CD46形式均可以用于此类诊断。通常，此类诊断性方法涉及使用获自患者的生物样本。生物样本涵盖自受试者获得的可用于诊断或监测分析的多种样本类型。生物样本包含(但不限于)血液及生物学来源的其它液体样本、实体组织样本(诸如活检样品)或组织培养基或来源于其的细胞及其后代。举例来说，生物样本包含获自由怀疑患有与CD46过度表达相关的癌症的个体收集的组织样本的细胞，且在优选实施例中，获自神经胶质瘤、胃、肺、胰脏、乳房、前列腺、肾、肝脏及子宫内膜。生物样本涵盖临床样本、培养基中的细胞、细胞上清液、细胞溶胞物、血清、血浆、生物流体及组织样本。
在一特定实施例中，本发明是一种诊断受试者的与CD46过度表达相关的癌症的方法，其是通过使用本发明的抗体检测来自所述受试者的细胞上的CD46而进行。确切地说，所述方法可包含以下步骤：
1)使受试者的生物样本与根据本发明的抗体或抗体片段在适用于抗体或抗体片段的条件下接触，以与生物样本中表达CD46的细胞形成复合物；及
(b)检测及/或定量所述复合物，由此所述复合物的检测指示与CD46过度表达相关的癌症。
为监测癌症的进展，可在不同时间重复根据本发明的方法以确定结合于样本的抗体是否增加或减少，由此可判定癌症是否发展、消退或稳定。
在一特定实施例中，本发明是一种诊断与CD46的表达或过度表达相关的疾病的方法。此类疾病的实例可包含癌症、人类免疫病症、血栓性疾病(血栓形成及动脉粥样硬化血栓形成)及心血管疾病。
在一个实施例中，提供一种用于诊断或检测方法的抗CD46抗体或抗体片段。在另一方面中，提供一种检测生物样本中CD46的存在的方法。在另一方面中，提供一种定量生物样本中的CD46的量的方法。在某些实施例中，所述方法包括使生物样本与如本文所描述的抗CD46抗体或抗体片段在容许抗CD46抗体或抗体片段与CD46结合的条件下接触，及检测抗CD46抗体或抗体片段与CD46之间是否形成复合物。此类方法可在活体外或活体内进行。在一个实施例中，使用抗CD46抗体或抗体片段来选择适合进行治疗的受试者。在一些实施例中，所述疗法将包含向所述受试者投与抗CD46抗体或抗体片段。
在某些实施例中，提供经标记的抗CD46抗体或抗体片段。标记包含(但不限于)直接检测的标记或部分(诸如荧光、发色、电子致密、化学发光及放射性标记)，以及例如经由酶反应或分子相互作用间接检测的部分(诸如酶或配位体)。示范性标记包含(但不限于)放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I；荧光团，诸如稀土螯合剂或荧光素及其衍生物；若丹明(rhodamine)及其衍生物；丹酰基；伞酮；荧光素酶，例如萤火虫荧光素酶及细菌荧光素酶(美国专利第4,737,456号)；荧光素；2,3-二氢呔嗪二酮；辣根过氧化酶(HRP)；碱性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶菌酶；糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；杂环氧化酶，诸如尿酸酶及黄嘌呤氧化酶，其与采用过氧化氢氧化染料前驱物的酶，诸如HRP、乳过氧化酶或微过氧化酶相结合；生物素/抗生物素蛋白；自旋标记；噬菌体标记；稳定自由基；及类似物。
D.医药调配物
抗CD46抗体或抗体片段具有细胞杀灭活性。此细胞杀灭活性延伸至多种不同类型的细胞系。此外，这些抗体或抗体片段，一旦结合于细胞毒性剂，即可减小肿瘤尺寸且可展现毒性降低。因此，抗CD46抗体、其片段或免疫结合物可适用于治疗与CD46表达相关的增生性疾病。抗体、片段或免疫结合物可单独或与任何适合的药剂或其它常规治疗组合使用。
抗CD46抗体或抗体片段可用于治疗与CD46表达、过度表达或活化相关的疾病。除对CD46表达的要求外对可治疗的癌症或组织的类型无特定限制。实例包含鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰脏癌、胶细胞肿瘤(诸如成胶质细胞瘤及神经纤维瘤)、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝肿瘤、乳癌、结肠癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer/renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肉瘤、血液癌(白血病)、星形细胞瘤及各种类型的头颈癌。更优选癌症为神经胶质瘤、胃癌、肺癌、胰脏癌、乳癌、前列腺癌、肾癌、肝癌及子宫内膜癌。
抗CD46抗体或抗体片段是先天性免疫反应的潜在活化剂，且因此可用于治疗人类免疫病症，诸如败血症。本发明的抗CD46抗体或抗体片段还可作为佐剂用于免疫接种，诸如用于疫苗，且用作抵抗例如细菌、病毒及寄生虫的抗感染药剂。
抗CD46抗体或抗体片段可用于防止、预防或治疗血栓性疾病，诸如静脉及动脉血栓形成及动脉粥样硬化血栓形成。抗CD46抗体或抗体片段还可用以防止、预防或治疗心血管疾病以及预防或抑制诸如拉沙热病(Lassa)及埃博拉(Ebola)病毒的病毒的侵入及治疗病毒感染。
在本文所描述的治疗方法的各个实施例中，抗CD46抗体、抗体片段或抗CD46抗体或抗体片段免疫结合物可以与管理寻求治疗的疾病或病症相关的常规方法一致的方式递送。根据本文的揭示内容，在足以预防或治疗疾病或病症的一段时间及条件下向需要此类治疗的受试者投与有效量的抗体、抗体片段或免疫结合物。因此，本发明的一方面涉及一种治疗与CD46表达相关的疾病的方法，其包括向有需要的受试者投与治疗有效量的本发明的抗体、抗体片段或免疫结合物。
为了投与，可将抗CD46抗体、抗体片段或免疫结合物调配为医药组合物。包含抗CD46抗体、抗体片段或免疫结合物的医药组合物可根据制备医药组合物的已知方法调配。在此类方法中，通常将治疗性分子与含有药学上可接受的载剂的混合物、溶液或组合物组合。
药学上可接受的载剂是接受患者可耐受的物质。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上可接受的载剂的一个实例。其它适合的药学上可接受的载剂为所属领域的技术人员所熟知。(参见例如真罗纳(Gennaro)(等人)，雷明顿药物科学(Remington's PharmaceuticalSciences)(马克出版公司(Mack Publishing Company),第19版，1995))。调配物可进一步包含一或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、防止小瓶表面上的蛋白损失的白蛋白等。
医药组合物的形式、投与途径、剂量及方案自然视待治疗的病状、疾病的严重程度、患者的年龄、体重及性别等而定。所属领域的技术人员可考虑这些考虑因素以调配适合的医药组合物。本发明的医药组合物可经调配用于局部、经口、肠胃外、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下或眼内投与及其类似投与方式。
优选地，医药组合物含有用于能够注射的调配物的药学上可接受的媒剂。这些媒剂尤其可为等张的无菌盐水溶液(磷酸单钠或二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁及其类似物或此类盐的混合物)，或干燥，尤其冷冻干燥的组合物，其在添加例如灭菌水或生理盐水时，使得可复原成可注射溶液。
在一些实施例中，存在张力剂，有时称为“稳定剂”以调节或维持组合物中液体的张力。当与大型带电生物分子(诸如蛋白质及抗体)一起使用时，其通常称为“稳定剂”，因为其可与氨基酸侧链的带电基团相互作用，由此减小分子间及分子内相互作用的可能性。张力剂可以医药组合物的0.1重量％至25重量％，优选地1重量％至5重量％的任何量存在。优选的张力剂包含多羟基糖醇，优选地包含三元醇或高级糖醇，诸如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇。
另外的赋形剂包含可充当以下中的一或多者的试剂：(1)增积剂，(2)溶解增强剂，(3)稳定剂，及(4)防止变性或黏着于容器壁的试剂。此类赋形剂可包含：多羟基糖醇(上文所列举)；氨基酸，诸如丙氨酸、甘氨酸、谷酰氨酸、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，诸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌肉肌糖(myoinisitose)、肌肉肌醇(myoinisitol)、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(例如肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油及硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，诸如人类血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；双糖(例如乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖，诸如棉子糖；及多糖，诸如糊精或聚葡萄糖。
可采用非离子型表面活性剂或清洁剂(还称为“润湿剂”)以有助于溶解治疗剂以及保护治疗蛋白以抵抗搅动诱导的聚集，由此还可使得调配物暴露于剪切表面应力而不会导致活性治疗蛋白或抗体变性。非离子表面活性剂可按约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，优选地约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的浓度范围存在。
适合的非离子表面活性剂包含聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、聚氧化物(polyoxamer)(184、188等)、
Figure BDA0004002311330000521
多元醇、
Figure BDA0004002311330000522
聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(
Figure BDA0004002311330000523
-20、
Figure BDA0004002311330000524
-80等)、聚桂醇400、聚乙二醇40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50及60、甘油单硬脂酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素及羧甲基纤维素。可使用的阴离子性清洁剂包含月桂基硫酸钠、二辛基磺基丁二酸钠及二辛基磺酸钠。阳离子性清洁剂包含苯扎氯铵或苄索氯铵。
用于投与的剂量可随各种参数而调适，且确切地说随所用投与模式、相关病理学或者所需治疗持续时间而调适。为制备医药组合物，可将有效量的抗体或抗体片段溶解或分散于药学上可接受的载剂或水性介质中。
适用于可注射使用的医药形式包含无菌水溶液或分散液；调配物，包含芝麻油、花生油或水性丙二醇；及用于无菌可注射溶液或分散液的临时制备的无菌粉末。在所有情况下，形式必须为无菌的，且必须在易于注射性存在的程度上为流体。其在制造及存储条件下必须稳定，且必须保护其免遭诸如细菌及真菌的微生物的污染作用。
呈自由碱或药理学上可接受的盐形式的活性化合物的溶液可于水中适当地与表面活性剂混合来制备。还可在甘油、液态聚乙二醇及其混合物中及在油中制备分散液。在一般存储及使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
抗CD46抗体或抗体片段可呈中性或盐形式调配成组合物。药学上可接受的盐包含酸加成盐(由蛋白质的自由氨基形成)且其由无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸及类似者)形成。用自由羧基形成的盐还可衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；及有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因(procaine)及其类似碱。
载剂还可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液态聚乙二醇及其类似物)、其适合的混合物及植物油的溶剂或分散介质。举例来说，可通过使用包衣(诸如卵磷脂)、通过维持就分散液来说所需粒度及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。微生物作用的预防可通过各种抗细菌剂及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及其类似物来实现。在许多情况下，将优选地包含等张剂，例如糖或氯化钠。可通过在组合物中使用吸收延缓剂(例如，单硬脂酸铝及明胶)来延长可注射组合物的吸收。
无菌可注射溶液如下制备：将所要量的活性化合物视需要与上文列举的其它成分中的一或多者一起并入适当溶剂中，随后过滤灭菌。一般来说，通过将各种灭菌活性成分并入含有碱性分散介质及来自上文列举的那些成分的所需其它成分的无菌媒剂中来制备分散液。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，优选的制备方法为真空干燥及冷冻干燥技术，由其先前无菌过滤溶液产生活性成分加任何另外所需成分的粉末。
还考虑制备更多或高浓度的用于直接注射的溶液，其中设想使用二甲亚砜(DMSO)作为溶剂产生极快渗透，递送高浓度的活性剂至小肿瘤区域中。
在调配时，将以与剂量调配相容的方式且以治疗有效的量投与溶液。调配物易于以各种剂型，诸如上文所描述的可注射溶液的类型投与，但还可采用药物释放胶囊及其类似者。
对于以水溶液形式肠胃外投与，例如，所述溶液必要时应经适当缓冲且先用足够盐水或葡萄糖使液体稀释剂具有等张性。这些特定水溶液尤其适于静脉内、肌肉内、皮下及腹膜内投与。在此方面，根据本发明，可采用的无菌水性介质将为所属领域的技术人员已知的。举例来说，单次剂量可溶解于1ml等张NaCl溶液中，且添加至1000ml皮下灌注流体，或在建议的输注位点注射，(参见例如“雷明顿药物科学”，第15版，第1035至1038页及第1570至1580页)。视所治疗受试者的病状而定，将必然产生一些剂量变化。在任何事件中，负责投与的人员将判定个别受试者的适当剂量。
抗体或抗体片段可调配于治疗性混合物内以每剂量递送约0.0001至10.0毫克，或约0.001至5毫克，或约0.001至1毫克，或约0.001至0.1毫克，或约0.1至1.0或甚至约10毫克。还可以所选时间间隔投与多个剂量。
除经调配用于肠胃外投与(诸如静脉内或肌肉内注射)的化合物以外，其它药学上可接受的形式包含例如片剂或用于经口投与的其它固体；延时释放胶囊；及目前所用的任何其它形式。
在某些实施例中，考虑使用脂质体及/或纳米粒子将抗体或抗体片段引入至宿主细胞中。脂质体及/或纳米粒子的形式及用途为所属领域的技术人员已知。
纳米胶囊可一般以稳定及可复制方式裹住化合物。为避免由细胞内聚合物过载引起的副作用，此类超细粒子(尺寸为约0.1μm)一般使用能够在活体内降解的聚合物设计。涵盖满足这些要求的生物可降解氰基丙烯酸聚烷基酯纳米粒子以用于本发明，且此类粒子可易于制得。
脂质体由磷脂形成，磷脂分散于水性介质中且自发形成多层同心双层小泡(还称为多层小泡(MLV))。MLV一般具有25nm至4μm的直径。MLV的声波处理使得形成直径在200至
Figure BDA0004002311330000541
范围内且在核心含有水溶液的小单层小泡(SUV)。脂质体的物理特征视pH值、离子强度及二价阳离子的存在而定。
含有如本文所描述的抗CD46抗体或抗体片段的医药调配物通过将具有所需纯度的此类抗体或抗体片段与一或多种任选的药学上可接受的载剂混合来制备(雷明顿药物科学第16版，奥索·亚瑟(Osol,A.)编(1980))，呈冻干调配物或水溶液形式。药学上可接受的载剂在所采用的剂量及浓度下一般对接受者无毒性，且包含但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷酰氨酸、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖，及其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相对离子，诸如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；及/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。
本文中的示范性药学上可接受的载剂进一步包含间质药物分散剂，诸如可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人类可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(
Figure BDA0004002311330000551
百特国际医疗公司(Baxter International,Inc.))。某些示范性sHASEGP(包含rHuPH20)及使用方法描述于美国专利公开案第2005/0260186号及第2006/0104968号中。在一个方面中，sHASEGP与一或多种另外的葡萄糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。
示范性冻干抗体调配物描述于美国专利第6,267,958号中。水性抗体调配物包含美国专利第6,171,586号及WO 2006/044908中所描述的那些调配物，后者的调配物包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
视所治疗的特定适应症的需要，本文中的调配物还可含有一种以上活性成分。优选地，可将不会不利地影响彼此的具有互补活性的成分组合成单一调配物。举例来说，除本发明的抗CTLA4抗体、抗体片段或免疫结合物以外，可能还需要提供EGFR拮抗剂(诸如埃罗替尼(erlotinib))、抗血管生成剂(诸如VEGF拮抗剂，其可为抗VEGF抗体)或化学治疗剂(诸如紫杉醇或铂制剂)。此类活性成分宜以有效达成预期目的的量组合存在。
在一个实施例中，本发明的抗CD46抗体、抗体片段或免疫结合物与针对选自以下的抗原的另一抗体或抗体片段组合于调配物中：CTLA4、PD1、PD-L1、AXL、ROR2、CD3、HER2、B7-H3、ROR1、SFRP4及WNT蛋白质，所述WNT蛋白质包含WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16。所述组合可呈两个独立分子的形式：本发明的抗CD46抗体、抗体片段或免疫结合物及另一种抗体或抗体片段。或者，所述组合还可为具有与CD46及其它抗原的结合活性或结合亲和力的单一分子形式，由此形成多特异性(例如双特异性)抗体。
可将活性成分包封于例如通过凝聚技术或通过界面聚合反应制备的微胶囊中。举例来说，于胶态药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子及纳米胶囊)或巨乳液中可分别采用羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。所述技术揭示于雷明顿药物科学第16版，奥索·亚瑟编(1980)中。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包含含有抗体或抗体片段的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形制品形式，例如薄膜或微胶囊。
用于活体内投与的调配物通常为无菌的。无菌性可容易地通过例如经由无菌过滤膜过滤来实现。
E.治疗方法及组合物
本文所提供的抗CD46抗体或抗体片段中的任一者均可用于治疗方法中。在一个方面中，提供一种用作药剂的抗CD46抗体或抗体片段。在其它方面中，提供一种抗CD46抗体或抗体片段，其用于治疗癌症(例如乳癌、非小细胞肺癌、胰脏癌、脑癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、白血病、子宫内膜癌、结肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、骨肉瘤及/或黑色素瘤)。在某些实施例中，提供一种用于治疗方法的抗CD46抗体或抗体片段。在某些实施例中，本发明提供一种抗CD46抗体或抗体片段，其用于治疗患有癌症的个体的方法中，所述方法包括向所述个体投与有效量的抗CD46抗体或抗体片段。在某些实施例中，本发明提供一种抗CD46抗体或抗体片段，其用于治疗患有免疫病症(例如自体免疫病症)、心血管病症(例如动脉粥样硬化、高血压、血栓形成)、传染病(例如埃博拉病毒、马堡病毒(Marburg virus))或糖尿病的个体的方法中，所述方法包括向所述个体投与有效量的抗CD46抗体或抗体片段。在一个此类实施例中，所述方法进一步包括向所述个体投与有效量的至少一种例如如下文所描述的另外的治疗剂。在其它实施例中，本发明提供一种抗CD46抗体或抗体片段，其用于抑制血管生成、抑制细胞增生、抑制免疫功能、抑制发炎性细胞因子分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)及/或抑制肿瘤基质功能。
在某些实施例中，本发明提供一种抗CD46抗体或抗体片段，其用于个体中抑制血管生成、抑制细胞增生、抑制免疫功能、抑制发炎性细胞因子分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)及/或抑制肿瘤基质功能的方法中，所述方法包括向所述个体投与有效的抗CD46抗体或抗体片段以抑制血管生成、抑制细胞增生、抑制免疫功能、抑制发炎性细胞因子分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管发展(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)及/或抑制肿瘤基质功能。根据任一以上实施例的“个体”优选地为人类。
在另一个方面中，本发明提供抗CD46抗体或抗体片段在制造或制备药剂中的用途。在一个实施例中，所述药剂用于治疗癌症(在一些实施例中，乳癌、非小细胞肺癌、胰脏癌、脑癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、白血病、子宫内膜癌、结肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、骨肉瘤及/或黑色素瘤)。在另一实施例中，药剂用于治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的个体投与有效量的药剂。在另一实施例中，所述药剂用于治疗免疫病症(例如自体免疫病症)、心血管病症(例如动脉粥样硬化、高血压、血栓形成)、传染病(例如埃博拉病毒、马堡病毒)或糖尿病的方法中，所述方法包括向个体投与有效量的抗CD46抗体或抗体片段。在一个此类实施例中，所述方法进一步包括向个体投与有效量的至少一种例如如下文所描述的另外的治疗剂。在另一实施例中，所述药剂用于抑制血管生成、抑制细胞增生、抑制免疫功能、抑制发炎性细胞因子分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管(例如瘤内血管或肿瘤相关血管)及/或抑制肿瘤基质功能。在另一实施例中，所述药剂用于个体中抑制血管生成、抑制细胞增生、抑制免疫功能、抑制发炎性细胞因子分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)及/或抑制肿瘤基质功能的方法中，所述方法包括向个体投与有效量的药剂以抑制血管生成、抑制细胞增生、促进免疫功能、诱导发炎性细胞因子分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管发展(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)及/或抑制肿瘤基质功能。根据任一以上实施例的“个体”可为人类。
在另一方面中，本发明提供用于治疗癌症的方法。在一个实施例中，所述方法包括向患有此类癌症的个体投与有效量的抗CD46抗体或抗体片段。在一个此类实施例中，所述方法进一步包括向个体投与有效量的至少一种如下文所描述的另外治疗剂。根据任一以上实施例的“个体”可为人类。
在另一方面中，本发明提供一种治疗免疫病症(例如自体免疫病症)、心血管病症(例如动脉粥样硬化、高血压、血栓形成)、传染病(例如埃博拉病毒、马堡病毒)或糖尿病的方法。在一个此类实施例中，所述方法进一步包括向个体投与有效量的至少一种如下文所描述的另外治疗剂。根据任一以上实施例的“个体”可为人类。
在另一方面中，本发明提供一种在个体中抑制血管生成、抑制细胞增生、抑制免疫功能、抑制发炎性细胞因子分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)及/或抑制肿瘤基质功能的方法。在一个实施例中，所述方法包括向个体投与有效量的抗CD46抗体或抗体片段以抑制血管生成、抑制细胞增生、促进免疫功能、诱导发炎性细胞因子分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管发展(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)及/或抑制肿瘤基质功能。在一个实施例中，“个体”为人类。
在另一方面中，本发明提供包括本文所提供的抗CD46抗体或抗体片段中的任一者的医药调配物，其例如用于任一上述治疗方法中。在一个实施例中，医药调配物包括本文所提供的抗CD46抗体或抗体片段中的任一者及药学上可接受的载剂。在另一实施例中，医药调配物包括本文所提供的抗CD46抗体或抗体片段中的任一者及至少一种(例如)如下文所描述的另外的治疗剂。
在每一上文所描述的治疗中，本发明的抗体或抗体片段可单独、以免疫结合物形式或与其它药剂组合用于治疗中。举例来说，本发明的抗体可与至少一种另外的治疗剂共投与。在某些实施例中，另外的治疗剂为抗血管生成剂。在某些实施例中，另外的治疗剂为VEGF拮抗剂(在一些实施例中，为抗-VEGF抗体，例如贝伐单抗(bevacizumab))。在某些实施例中，另外的治疗剂为EGFR拮抗剂(在一些实施例中，为埃罗替尼)。在某些实施例中，其它治疗剂为化学治疗剂及/或细胞生长抑制剂。在某些实施例中，其它治疗剂为紫杉醇(例如太平洋紫杉醇)及/或铂药剂(例如卡铂)。在某些实施例中，另外的治疗剂是增强患者的免疫性或免疫系统的药剂。
上述此类组合疗法涵盖组合投与(其中两种或更多种治疗剂包含于相同或各别调配物中)及分开投与，在此情况下，抗体或抗体片段的投与可在另外的治疗剂及/或佐剂投与之前、同时及/或之后进行。抗体或抗体片段还可与辐射疗法组合使用。
抗CD46抗体或抗体片段可以符合良好医学实务的方式调配、给药及投与。在此情形下，考虑因素包含所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个别患者的临床病状、病症的病因、药剂递送部位、投与方法、投与时程及医学从业者已知的其它因素。抗体或抗体片段无需但任选地与一或多种当前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起调配。此类其它药剂的有效量视存在于调配物中的抗体或抗体片段的量、病症或治疗的类型及如上文所论述的其它因素而定。其一般是以相同剂量且以如本文所描述的投与途径使用，或以约1至99％的本文所描述的剂量，或以凭经验/在临床上确定适当的任何剂量及任何途径使用。
为预防或治疗疾病，抗体或抗体片段(当单独或与一或多种另外的治疗剂组合使用时)的适当剂量将取决于待治疗的疾病的类型、抗体或抗体片段的类型、疾病的严重程度及病程、抗体或抗体片段是出于预防性或治疗性目的投与、先前疗法、患者的临床病史及对抗体或抗体片段的反应、以及主治医师的判断。一次性或历经一系列治疗向患者适当地投与抗体或抗体片段。取决于疾病的类型及严重程度，每公斤患者体重约1μg的抗体或抗体片段至每公斤患者体重40mg抗体或抗体片段可作为初始候选剂量以例如通过一或多次分开投与或通过连续输注向患者投与。取决于上文所提及的因素，一种典型日剂量可在每公斤患者体重约1μg抗体或抗体片段至每公斤患者体重100mg抗体或抗体片段或更多的范围内。经历数日或更长时间重复投与时，视病状而定，治疗一般持续至疾病症状发生所需抑制为止。此类剂量可间歇地投与，例如每周或每三周投与(例如以使得患者接受约二至约二十次剂量，或例如约六次剂量的抗体或抗体片段)。最初可投与较高起始剂量，随后可投与一或多种较低剂量。然而，其它给药方案可为适用的。此疗法的进程容易通过常规技术及分析来监视。
可投与以预防或治疗受试者的疾病的本发明的抗CD46抗体或抗体片段的特定剂量可为每公斤患者体重约0.3、0.6、1.2、18、2.4、3.0、3.6、4.2、4.8、5.4、6.0、6.6、7.2、7.8、8.4、9.0、9.6或10.2mg的抗体或抗体片段。在某些实施例中，剂量可在每公斤患者体重0.3至2.4、2.4至4.2、4.2至6.0、6.0至7.8、7.8至10.2、10.2至12、12至14、14至16、16至18或18至20mg的抗体或抗体片段的范围内。若以双特异性抗体形式、与另一免疫检查点抑制剂或另一抗体或抗体片段组合或以免疫结合物形式投与，则抗体或抗体片段的剂量仍相同。另外，具有抗CD46活性的多肽将以与所述抗体或抗体片段相同的量投与。
单次剂量的本发明的医药调配物可含有以下量的本发明的抗CD46抗体或抗体片段：约13,600mg中有约45μg抗体或抗体片段，或约5440mg中有约45μg的抗体或抗体片段。在一些实施例中，单次剂量的本发明的医药调配物可含有以下量的本发明的抗CD46抗体或抗体片段：135mg至1,387mg，或所述量诸如为135、235、335、435、535、635、735、835、935、1035、1135、1235、1387mg。在某些实施例中，单次剂量的医药调配物中本发明的抗CD46抗体或抗体片段的量在135至235、235至335、335至435、435至535、535至635、635至735、735至835、835至935、935至1035、1035至1135、1135至1235、1235至1387mg范围内。若以双特异性抗体形式、与另一免疫检查点抑制剂组合或以免疫结合物形式、或与如本文所揭示的抵抗另一抗原的另一抗体或抗体片段组合投与，则单次剂量的医药调配物中抗体或抗体片段的量仍相同。另外，在单次剂量的医药调配物中将包含与所述抗体或抗体片段相同量的具有抗CD46活性的多肽。
在一个实例中，抗CD46抗体或抗体片段可与免疫检查点抑制剂分子结合或可与免疫检查点抑制剂形成双特异性抗体的一部分。
组合可为以分开的分子形式或以双特异性抗体形式投与的本申请案中所揭示的抗CD46抗体或抗体片段及免疫检查点抑制剂分子。此类双特异性抗体对CD46具有结合活性，且对免疫检查点具有第二结合活性。
免疫检查点可选自CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、VISTA、BTLA、OX40、CD40、4-1BB、PD-1、PD-L1及GITR(扎哈尔(Zahavi)及韦纳(Weiner)，国际分子科学杂志(InternationalJournal of Molecular Sciences)，第20卷,158,2019)。另外的免疫检查点包含B7-H3、B7-H4、KIR、A2aR、CD27、CD70、DR3及ICOS(曼尼(Manni)等人，免疫检查点阻断及其与小分子抑制剂用于癌症治疗的组合疗法(Immune checkpoint blockade and its combinationtherapy with small-molecule inhibitors for cancer treatment),Bbacan,https://doi.org/10.1016/j.bbcan.2018.12.002,2018)。
所述免疫检查点优选地为CTLA4、PD-1或PD-L1。
应了解，替代或除抗CD46抗体以外，可使用本发明的抗体片段或免疫结合物进行任何以上调配或治疗方法。
增强宿主的免疫功能以对抗肿瘤是日益关注的主题。常规方法包含(i)APC增强，诸如(a)注射至编码外来MHC同种异体抗原的DNA的肿瘤中，或(b)用增加肿瘤的免疫抗原识别概率的基因转染活检肿瘤细胞(例如免疫刺激细胞因子、GM-CSF、共刺激分子B7.1、B7.2)，(iii)过继性细胞免疫治疗，或用活化肿瘤特异性T细胞处理。过继性细胞免疫治疗包含分离肿瘤浸润性宿主T-淋巴球，诸如经由通过IL-2或肿瘤或两者刺激来活体外扩增群体。另外，功能异常的分离的T细胞还可通过活体外投与本发明的抗-PD-L1抗体来活化。接着可将共同活化的T细胞重新投与宿主。这些方法中的一或多者可与投与本发明的抗体、抗体片段或免疫结合物组合使用。
传统癌症疗法包含以下：(i)辐射疗法(例如放射线疗法、X射线疗法、照射)或使用电离辐射来杀死癌细胞及收缩肿瘤。放射疗法可经由外射柱放射疗法(EBRT)外部投与或经由近接疗法内部投与；(ii)化学疗法或细胞毒性药物的应用，其一般影响快速分裂细胞、(iii)靶向疗法或具体影响癌细胞的蛋白质失调的药剂(例如酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)；单克隆抗体、光动力疗法)；(iv)免疫疗法或增强宿主的免疫反应(例如疫苗)；(v)激素疗法或激素阻断(例如，当肿瘤对激素敏感时)，(vi)血管生成抑制剂或阻断血管形成及生长，及(vii)针对改进照护品质以减少疼痛、恶心、呕吐、腹泻及出血的缓解性疗护或治疗。诸如吗啡碱(morphine)及氧可酮(oxycodone)的止痛药、诸如昂丹司琼(ondansetron)及阿匹坦(aprepitant)的镇吐药可允许更具侵袭性的治疗方案。
在癌症的治疗中，可在投与抗CD46抗体或抗体片段之前、之后或同时进行治疗癌症免疫性的上述常规治疗中的任一者。另外，抗CD46抗体或抗体片段可在诸如投与肿瘤结合抗体(例如单克隆抗体、毒素结合单克隆抗体)及/或投与化学治疗剂的常规癌症治疗之前、之后或同时投与。
F.制品及试剂盒
在本发明的另一个方面中，提供一种制品，其含有抗CD46抗体或抗体片段及适用于治疗、预防及/或诊断上文所述病症的其它材料。制品包括容器及容器上或容器随附的标签或药品说明书。适合的容器包含例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由各种材料形成，诸如玻璃或塑胶。容器容纳单独或与有效治疗、预防及/或诊断病状的另一组合物组合的组合物，且可具有无菌接取口(例如容器可为具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体或抗体片段。标签或药品说明书指示组合物用于治疗所选病状。此外，制品可包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包括抗体或抗体片段；及(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包括另一细胞毒性或其它治疗剂。本发明的此实施例中的制品可进一步包括指示组合物可用于治疗特定病状的药品说明书。或者或另外，制品可进一步包括第二(或第三)容器，其包括药学上可接受的缓冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可进一步包含就商业及用户观点来说所期望的其它材料，包含其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针及注射器。
应了解，代替或除抗CD46抗体或抗体片段之外，上述制品中的任一者可包含本发明的免疫结合物。
最后，本发明还提供包括至少一种本发明的抗体或抗体片段的试剂盒。含有本发明的多肽、抗体或抗体片段或抗体药物结合物的试剂盒可用于检测CD46表达(增加或减少)或用于治疗或诊断分析。本发明的试剂盒可含有偶合至固体支撑物(例如组织培养板或珠粒(例如琼脂糖珠粒))的抗体。可提供含有抗体的试剂盒用于例如在ELISA或蛋白质印迹法中活体外检测及定量CD46。此类适用于检测的抗体可具有标记，诸如荧光或放射性标记。
所述试剂盒进一步含有关于其用途的说明书。在一些实施例中，说明书包括美国食品与药物管理局对于活体外诊断试剂盒所要求的说明书。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括基于样本中存在或不存在CD46而诊断所述样本中存在或不存在脑脊髓液的说明书。在一些实施例中，所述试剂盒包括一或多种抗体或抗体片段。在其它实施例中，所述试剂盒进一步包括一或多种酶、酶抑制剂或酶活化剂。在一些实施例中，所述试剂盒包括一或多种色谱化合物。在其它实施例中，所述试剂盒进一步包括一或多种用以制备光谱分析用样本的化合物。在其它实施例中，所述试剂盒进一步包括比较参考物质以根据指示剂的强度、色谱或其它物理属性解释CD46的存在或不存在。
以下实例对于本发明的抗CD46抗体是说明性而非限制性的。所属领域中通常遇到且对于所属领域的技术人员明显的多种条件及参数的其它适合修改及改编均在本发明的范围内。
实例
已在工作实例中测试具有以下6个CDR集合的本发明的抗体或抗体片段：
SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；
SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10；及
SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:10。
抗体 轻链Vk 重链Vh
基准(BM)BA-133-00-01 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:7
BA-133-04-01 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:13
BA-133-04-02 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:13
BA-133-04-03 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:13
BA-133-04-04 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:13
BAP133-2-03-03-SL SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:13
BAP133-2-02-12 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:13
实例1：条件性活性抗CD46抗体与huCD46的结合活性
通过ELISA，使用BM(基准)抗体作为对照来测量条件性活性抗CD46抗体与人类CD46的结合活性。在pH 6.0及pH 7.4下结合于人类CD46的条件性活性抗CD46抗体的EC50值概述于表1中且结合活性展示于图1至2中。
表1
Figure BDA0004002311330000631
表2
Figure BDA0004002311330000632
表3
Figure BDA0004002311330000633
表4
Figure BDA0004002311330000641
实例2：条件性活性抗CD46抗体与猕猴CD46的结合活性
条件性活性抗CD46抗体与猕猴CD46的结合活性是通过ELISA测量且展示于图3至4。条件性活性抗CD46抗体在pH 6.0及pH 7.4下与猕猴CD46的结合的EC50值概述于表2中。
实例3：条件性活性抗CD46抗体与人类CD46的结合活性
条件性活性抗CD46抗体在pH滴定下与人类CD46的结合活性是类似地通过ELISA测量。参见图5。条件性活性抗CD46抗体相对于人类CD46的pH拐点概述于表3中。
实例4：通过FACS测量的条件性活性抗CD46抗体的结合活性
使用表达人类CD46的293细胞进行FACS分析。条件性活性抗CD46抗体始终展示在pH 6.0下与表达人类CD46的293细胞的结合活性高于pH 7.4下的结合活性。参见图6至7。人源化条件性活性抗CD46抗体结合于表达人类CD46的293细胞的EC50值概述于表4中。
实例5：通过FACS测量的条件性活性抗CD46抗体的结合活性
通过FACS测量条件性活性抗CD46抗体在pH 6.0及pH 7.4下与表达CD46的Colo205细胞的结合活性。条件性活性抗CD46抗体始终展示在pH 6.0下与Colo205细胞的结合活性高于pH 7.4下的结合活性。参见图8至9。条件性活性抗CD46抗体结合于表达CD46的Colo205细胞的EC50值概述于表5中。
表5
Figure BDA0004002311330000642
表6
Figure BDA0004002311330000651
表7
IC50(ng/mL) BM(基准) BA133-04-04 BAP133-2-03-03-SL
pH6.0 15.75 13.71 20.64
pH7.4 23.56 39.94 90.36
比率(pH7.4/pH6.0) 1.50 2.91 4.38
表8
IC50(ng/mL) BM(基准) BA133-04-04 BAP 133-2-03-03-SL
pH6.0 4 91 6.584 33.32
pH7.4 11.64 56.04 253.3
比率(pH7.4/pH6.0) 2.37 8.51 7.60
还使用表达猕猴CD46的293细胞进行类似FACS分析。条件性活性抗CD46抗体还始终展示在pH 6.0下与表达猕猴CD46的293细胞的结合高于pH 7.4下的结合。参见图10至11。条件性活性抗CD46抗体结合于表达猕猴CD46的293细胞的EC50值概述于表6中。
实例6：表达人类CD46的293细胞的活体外细胞杀灭。
使用表达人类CD46的293细胞在6.0及7.4的pH值下分析表达人类CD46的293细胞的活体外细胞杀灭。条件性活性抗CD46抗体对293细胞的活体外杀灭展示于图12至13中。条件性活性抗CD46抗体对293细胞的细胞杀灭的IC50值展示于表7中。
实例7：条件性活性抗CD46抗体抑制表达CD46的Colo205细胞的细胞毒性
条件性活性抗体是用于治疗在6.0的肿瘤微环境pH及7.4的正常生理pH下表达CD46的Colo205细胞。条件性活性抗体在肿瘤微环境pH下诱发比在正常生理pH下更高的抑制率(IR％)。参见图14至15。IC50值提供于下表8中。
实例8：条件性活性抗体在皮下Colo 205CDX模型中的活体内功效测试
此研究的目标为评估测试物品在雌性BALB/c裸小鼠的皮下Colo 205人类结肠直肠癌异种移植模型中的活体内抗肿瘤功效。
缩写
Figure BDA0004002311330000661
实验设计
表1-1.实验设计的描述
Figure BDA0004002311330000662
注：
a.N：每组的动物数目。
b.剂量体积：给药体积调至每克体重10μL。
实验方法及程序
细胞培养
在37℃及含5％ CO2的空气下，将Colo 205肿瘤细胞(ATCC,维吉尼亚州马纳萨斯(Manassas,VA)，目录号
Figure BDA0004002311330000663
CCL-222TM)以单层培养物形式活体外保持在补充有10％热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中。通过胰蛋白酶-EDTA处理将肿瘤细胞常规地每周两次继代培养。收集在指数生长期中生长的细胞。且计数以用于肿瘤接种。
肿瘤接种及动物分组
对各小鼠在右侧腹皮下接种0.2mL PBS中的Colo 205肿瘤细胞(5×106)以用于肿瘤发育。治疗在肿瘤接种之后第11天，当平均肿瘤大小达到约204mm3时开始。使用基于Excel的分层随机化程序，根据肿瘤体积，将动物分配成数组。各组由8只荷瘤小鼠组成。根据表1-1中所示的实验设计，投与测试物。
测试物制备
表2-1.测试物制备的描述
Figure BDA0004002311330000671
注：在每次给药前准备测试物调配。
观测结果
研究中与动物处理、照护及治疗相关的所有程序均根据WuXi AppTec的机构动物照护及使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准的指导原则，遵循实验动物管理认证协会(AAALAC)的指导执行。在常规监测时，每天检查动物的肿瘤生长及治疗对正常行为的任何影响，诸如活动能力、食物及水消费(仅通过观察)、体重增加/减轻(每周两次测量体重)、眼睛/毛发缠结及方案中陈述的任何其它异常影响。死亡及观察到的临床症状是基于各亚组内动物的数目记录的。
肿瘤测量及指标
主要指标是评估肿瘤生长是否可延缓。肿瘤大小是每周两次使用卡尺以两个维度测量并使用下式计算：V＝0.5a×b2，其中a及b分别为肿瘤的长径及短径。接着使用肿瘤大小计算T/C值、TGI值及RTV值。
T/C值(以百分比为单位)为抗肿瘤有效性的指示；T及C分别为在既定日的经治疗组及对照组的平均体积。
使用下式计算各治疗组的TGI：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100；Ti为治疗组在给定日的平均肿瘤体积，T0为治疗组在第0天的平均肿瘤体积，Vi为媒剂对照组或同型组在与Ti同一天的平均肿瘤体积，且V0为媒剂组或同型组在第0天的平均肿瘤体积。
通过将指定日的肿瘤体积除以其在第0天的体积，计算个别RTV(相对肿瘤体积)。个别地计算各小鼠的RTV值，接着使用所述值计算一组的平均RTV。
采样
分别在第一次给药后24小时及96小时(刚好在第2次给药前)从每组3只小鼠采集50至60μL血清。
统计分析
计算各组在不同时间点的平均肿瘤体积及SEM(表3-1)。对在开始治疗之后第25天获得的数据进行媒剂组与测试物组之间的肿瘤体积差异的统计分析，其为所有组仍具有所有小鼠的最后一天。同时，对在治疗开始之后第32天获得的数据进行同型组与其它测试物组之间的肿瘤体积差异的统计分析，其为所有测试物组仍具有所有小鼠的最后一天。
执行单因素变异数分析(One-way ANOVA)以比较各组的平均肿瘤体积及RTV。获得显着的F-统计数据并用盖姆斯-豪威尔检验(Games-Howell test)进行各组之间的比较。使用
Figure BDA0004002311330000681
SPSS
Figure BDA0004002311330000682
软件(17.0版)分析所有数据。将p值<0.05视为在统计学上显着的。
肿瘤体积
不同组的平均肿瘤体积展示于表3-1中。
表3-1.肿瘤体积
Figure BDA0004002311330000691
注：
a.平均值±SEM
b.G1:媒剂，G2:BAP133-LP1或BA-133-00-01(BM)(3mg/kg)，G3:BA-133-04-01LP1(3mg/kg)，G4:BA-133-04-02LP1(3mg/kg)。G5:BA-133-04-03LP1(3mg/kg)，G6:BA-133-04-04LP1(3mg/kg)，G7:BAP133-2-03-03-SL-LP1(3mg/kg)，G8:BAP133-2-02-12LP-1(3mg/kg)，G9:B12-LP1(3mg/kg)。
c.当肿瘤体积达到2,000mm3时，在PG-D25上安乐死第1组的小鼠#34329。当平均肿瘤体积达到1,500mm3时，在PG-D32上安乐死G1及G9中的所有小鼠。
肿瘤生长抑制分析
表3-2与媒剂组相比的肿瘤生长抑制(基于第25天数据)
Figure BDA0004002311330000692
注：
a.平均值±SEM.
b.通过将经治疗组的组平均肿瘤体积除以媒剂对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
c.基于肿瘤大小计算p值。
d.基于RTV计算p值。
表3-3与同型组相比的肿瘤生长抑制(基于第32天数据)
Figure BDA0004002311330000701
注：
a.平均值±SEM.
b.通过将经治疗组的组平均肿瘤体积除以媒剂对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
c.基于肿瘤大小计算p值。
d.基于RTV计算p值。
肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线展示于图16中。在图16中，所呈现的数据为平均值±SEM。
总结及论述
在此研究中，使用Colo205人类结肠直肠异种移植模型评估条件性活性抗体的治疗功效。不同组在治疗后的不同时间点的肿瘤大小展示于表3-1、表3-2及图16中。在治疗开始之后第25天，媒剂组的平均肿瘤大小达到1,288mm3(RTV＝6.43±0.69)。将媒剂组及同型组中的所有小鼠在PG-D32安乐死。其它组的观测结果延长直到第4次给药后4周。
所有测试物展示显着抗肿瘤活性(TGI>93％，p值<0.002，PG-D25)。3mg/kg剂量下的测试物BAP133-LP1或BA133-00-01(BM)及BA-133-04-04LP1展现显着抗肿瘤活性，使得大部分经治疗小鼠达到完全缓解。使用测试材料BA-133-04-01LP1、BA-133-04-02LP1、BA-133-04-03LP1、BAP133-2-02-12LP-1观测到明显肿瘤体积减小，但接着发现这些组中的若干小鼠在最后一剂后10天之后再生长肿瘤。BAP133-2-02-12LP-1治疗在研究开始时延缓肿瘤生长，但在给药悬浮液之后数天内肿瘤生长速度逆转。(图16)。
当与媒剂治疗相比时，同型治疗(B12-LP1)几乎未产生功效(T/C＝84.86％，TGI＝17.99％，p值＝0.954，PG-D25)。
在整个治疗及观测期内，未观测到严重体重减轻或死亡/发病事件。因此，未观测到与使用指定给药方案的测试物的投与相关的明显毒性。
实例9：通过SPR分析测量的条件性活性抗CD46抗体的结合活性
在SPR2/4仪器(Sierra Sensors,Hamburg,Germany)及扁平胺传感器芯片上，通过表面等离子体共振测量抗CD46抗体的结合动力学。SPR传感器含有四个流通槽(FC1-FC4)，其各可个别或以群组形式加以处理。huCD46-His固定于FC2中，且猕猴CD46-His固定于FC4中。FC1及FC3中未固定蛋白质，其分别用作FC2及FC4的对照表面。
所有注射均在25℃下以25μL/min的流动速率进行。用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(200mM/50mM)活化传感器表面480秒。注射CD46-His(2μg/mL于10mM NaAc中，pH5.0)480秒且通过注射1M乙醇胺HCl 480秒使表面失活。除了将猕猴CD46-His稀释至pH4.5的10mM NaAc缓冲液中之外，使用如针对huCD46-His所描述的相同条件固定猕猴CD46-His。使用相同条件但在不注射蛋白质的情况下将对照表面活化及灭活。使用PBST缓冲液(含0.05％ TWEEN20TM的PBS pH7.4)作为用于表面制备的操作缓冲液。在注射分析物之前，将操作溶液转变成含30mM碳酸氢钠的PBST并如图中所指示调整pH。仪器在注射第一分析物之前用操作缓冲液平衡一小时。
将相应操作溶液(34.25nM、13.70nM、6.85nM、3.42nM、1.37nM及0.0nM)中稀释的100μL分析物注射于流通槽1及2或3及4上。测量解离速率360秒。在每个循环的相互作用之后，通过注射6μL的10mM甘氨酸(pH 2.0)使芯片表面再生。使用无固定的蛋白质的流通槽1及3作为对照表面用于参考减除。
另外，从每次操作减去仅用缓冲液作为分析物(0nM分析物)的数据。用所提供的分析软件分析仪R2(Sierra Sensors)，使用1:1结合模型拟合经双重减除的数据。使用200kDa的分子量计算分析物的摩尔浓度。
条件性活性抗CD46抗体在pH 6.0、pH 6.5及pH 7.4下与人类CD46及猕猴CD46的结合活性是通过SPR分析测量且分别展示于下表9及表10中。
表9
Figure BDA0004002311330000721
表10
Figure BDA0004002311330000722
各实例的实验方案
实例1及2
缩写
C 摄氏度
ECD 细胞外域
ELISA 酶联免疫吸附测定
g 克
HCl 盐酸
hr 小时
HRP 辣根过氧化酶
huCD46 人类CD46细胞外域
cynoCD46 猕猴CD46细胞外域
min 分钟
mL 毫升
NA 不适用
ng 纳克
nm 纳米
OD 光学密度
PBS 磷酸盐缓冲盐水
rpm 转/分钟
SD 标准差
TMB 3,3',5,5'-四甲基联苯胺
μg 微克
μL 微升
测试物
基准(BM)
CPE命中BA133-04-01
CPE命中BA133-04-02
CPE命中BA133-04-03
CPE命中BA133-04-04
CPE命中BAP133-2-03-03-SL
CPE命中BAP133-2-02-12
B12(同型对照)
调配物
首先将测试物在pH 6.0或7.4ELISA培育缓冲液中稀释至300ng/mL。随后将3000ng/mL测试物在pH 6.0或pH 7.4ELISA培育缓冲液中进行3倍连续稀释。
PH亲和ELISA分析
1)用100μL于碳酸盐-碳酸氢盐涂布缓冲液中的1μg/mL重组人类CD46抗原或猕猴CD46抗原涂布ELISA板。
2)用密封膜覆盖板且在4℃下培育隔夜。
3)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
4)通过将200μL的pH 6.0或pH 7.4ELISA培育缓冲液施配至各孔中，将孔洗涤两次，且完全抽吸出内含物。
5)将200μL的pH 6.0或pH 7.4ELISA培育缓冲液添加至各孔中。用密封膜覆盖并在室温下将板置放于设置为50rpm的板振荡器上，持续60分钟。
6)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
7)以3000ng/mL开始，在pH 6.0或pH 7.4ELISA培育缓冲液中以3倍稀释对测试物进行连续稀释。
8)将每孔100μL经稀释的测试物添加至板中
9)用密封膜覆盖并在室温下将板置放于设置为50rpm的板振荡器上，持续60分钟。
10)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
11)通过将200μL的pH 6.0或pH 7.4ELISA洗涤缓冲液施配至各孔中，将孔洗涤三次，且完全抽吸出内含物。
12)在pH 6.0或pH 7.4ELISA培育缓冲液中以1:2500稀释HRP二级抗体。
13)将100μL在pH 6.0或pH 7.4ELISA培育缓冲液中稀释的HRP二级抗体添加至各孔中
14)用密封膜覆盖并在室温下将板置放于设置为50rpm的板振荡器上，持续60分钟。
15)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
16)通过将200μL的pH 6.0或pH 7.4ELISA洗涤缓冲液施配至各孔中，将孔洗涤三次，且完全抽吸出内含物。
17)将每孔50μL TMB底物溶液施配至各板的所有孔中。在室温下培育约2分钟15秒或2分钟。
18)将每孔50μL的1N HCl添加至各板的所有孔中。在450nm下，使用PerkinElmerEnSpire 2300多标记读取器读取板。
实例3
缩写
C 摄氏度
ECD 细胞外域
ELISA 酶联免疫吸附测定
g 克
HCl 盐酸
hr 小时
HRP 辣根过氧化酶
huCD46 人类CD46细胞外域
min 分钟
mL 毫升
NA 不适用
ng 纳克
nm 纳米
OD 光学密度
PBS 磷酸盐缓冲盐水
rpm 转/分钟
TMB 3,3',5,5'-四甲基联苯胺
μg 微克
μL 微升
测试物
基准(BM)
CPE命中BA133-04-01
CPE命中BA133-04-02
CPE命中BA133-04-03
CPE命中BA133-04-04
CPE命中BAP133-2-03-03-SL
CPE命中BAP133-2-02-12
B12同型对照
调配物
将测试物在pH 5.5至pH 7.4的不同pH ELISA培育缓冲液范围中稀释至10ng/mL。
PH范围ELISA分析
1)用100μL于碳酸盐-碳酸氢盐涂布缓冲液中的1μg/mL重组人类CD46抗原涂布ELISA板。
2)用密封膜覆盖板且在4℃下培育隔夜
3)将板倾析且将剩余液体轻敲于一叠纸巾上
4)通过将200μL的不同pH的培育缓冲液施配至各孔中，将孔洗涤两次，且完全抽吸出内含物
5)将200μL不同pH的培育缓冲液(pH 5.5、6.0、6.2、6.5、6.7、7.0及7.4)添加至各孔中。用密封膜覆盖并在室温下将板置放于板振荡器(设置为200rpm)上，持续60分钟
6)将板倾析且将剩余液体轻敲于一叠纸巾上
7)在不同pH的培育缓冲液(pH 5.5、6.0、6.2、6.5、6.7、7.0及7.4)中将测试物质连续稀释至30ng/mL
8)将每孔100μL经稀释的测试物质添加至板中
9)用密封膜覆盖并在室温下将板置放于板振荡器(设置为200rpm)上，持续60分钟。
10)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
11)通过将200μL不同pH的洗涤缓冲液(pH 5.5、6.0、6.2、6.5、6.7、7.0及7.4)施配至各孔中，将孔洗涤三次，且完全抽吸出内含物
12)在不同pH的培育缓冲液(pH 5.5、6.0、6.2、6.5、6.7、7.0及7.4)中以1:2500稀释HRP二级抗体
13)将100μL在不同pH的培育缓冲液(pH 5.5、6.0、6.2、6.5、6.7、7.0及7.4)中稀释的HRP二级抗体添加至各孔中。
14)用密封膜覆盖并在室温下将板置放于板振荡器(设置为200rpm)上，持续60分钟。
15)倾析板且将剩余液体轻敲出于一叠纸巾上。
16)通过将200μL不同pH的洗涤缓冲液(pH 5.5、6.0、6.2、6.5、6.7、7.0及7.4)施配至各孔中，将孔洗涤三次，且完全抽吸出内含物
17)将每孔50μL TMB底物溶液施配至各板的所有孔中。在室温下培育3分钟。
18)将每孔50μL的1N HCl添加至各板的所有孔中。在450nm下，使用PerkinElmerEnSpire 2300多标记读取器读取板。
实例4及5
缩写
AF488 Alexa Fluor 488
℃ 摄氏度
ECD 细胞外域
FACS 荧光活化细胞分选
FBS 胎牛血清
g 克
huCD46 人类CD46细胞外域
cynoCD46 猕猴CD46细胞外域
HCl 盐酸
hr 小时
MFI 中值荧光强度
min 分钟
mL 毫升
NA 不适用
ng 纳克
PBS 磷酸盐缓冲盐水
PFA 多聚甲醛
rpm 转/分钟
R.T. 室温
SD 标准差
μg 微克
μL 微升
测试物
基准(BM)
CPE命中BA133-04-01
CPE命中BA133-04-02
CPE命中BA133-04-03
CPE命中BA133-04-04
CPE命中BAP133-2-03-03-SL
CPE命中BAP133-2-02-12
B12同型对照
调配物
测试物首先在pH 6.0或pH 7.4FACS缓冲液中稀释至30μg/mL，接着在pH6.0或pH7.4FACS缓冲液中进行3倍连续稀释。
细胞培养
将293-huCD46及293-猕猴CD46细胞保持于稳定的细胞系培养基(MEM+10％ FBS+1mg/mL G418)中。将表达CD46的Colo205细胞(ATCC，目录号CCL222)保持于colo205培养基(RPMI1640+10％ FBS)中。细胞通常每周继代培养两次。在指数生长期中收集细胞且计数以进行平板接种。
使用测试抗体进行的细胞染色
1)将3×106个细胞接种于T-75烧瓶中且根据供应商的说明书培养。
2)在FACS分析当天，移除且丢弃培养基。
3)用PBS溶液简单冲洗细胞层。
4)添加1.5mL Detachin溶液至每个T-75烧瓶中。等待直到细胞层已分散为止。
5)添加4.5mL用于相应细胞系的培养基并通过轻柔地用移液管移取使细胞再悬浮。
6)使细胞汇集且将细胞悬浮液转移至50mL锥形管中。
7)通过用锥虫蓝染色对细胞计数，之后在4℃下以1500rpm离心5min。
8)用PBS洗涤细胞一次
9)使细胞再悬浮于pH 6.0或pH 7.4FACS缓冲液中达到3.5×106个细胞/毫升。
10)将于100μL的pH 6.0或pH 7.4FACS缓冲液中的3.5×105个细胞等分于96孔U形底板中。
11)将细胞短暂离心且丢弃缓冲液。
12)以30ng/mL开始，在pH 6.0或pH 7.4FACS缓冲液中以3倍稀释对测试物进行连续稀释。
13)将每孔100μL的经稀释测试物添加至细胞中，轻轻地充分混合且于冰上在振荡(200rpm)下培育一小时。
14)在4℃下，以1500rpm将细胞离心5min。用150μL的pH 6.0或pH 7.4洗涤缓冲液洗涤细胞两次。
15)用pH 6.0或pH 7.4FACS缓冲液稀释山羊抗人类IgG AF488抗体1:300。
16)将100μL来自以上步骤的经稀释的抗体添加至细胞中且于冰上避光振荡(200rpm)培育45分钟。
17)细胞集结成团且用150μL的pH 6.0或pH 7.4洗涤缓冲液洗涤三次。
18)将细胞在室温下用稀释于1×PBS中的4％ PFA固定10min，随后用1×PBS洗涤细胞。
19)使细胞再悬浮于100μL的1×PBS中。
20)通过NovoCyte流式细胞仪，使用Ex488nm/Em530nm分析细胞。对于每个数据点，收集至少5,000个单线细胞。
FACS数据分析
使用GraphPad Prism软件7.03版绘制AF488于细胞单峰中的MFI。
实例6及7
缩写
℃ 摄氏度
ADC 抗体-药物结合物
Cyno 猕猴
DMEM 达尔伯克氏改进伊格尔培养基
FBS 胎牛血清
HCl 盐酸
hr 小时
huCD46 人类CD46细胞外域
IC50 50％有效抑制浓度
log 对数
MEM 最低限度必需培养基
min 分钟
mL 毫升
NA 不适用
NaOH 氢氧化钠
NEAA 非必需氨基酸
ng 纳克
PBS 磷酸盐缓冲盐水
PE 藻红素
RLU 相对发光单元
rpm 转/分钟
SD 标准差
μg 微克
μL 微升
测试物ADC
基准
CPE命中BA133-04-04
CPE命中BAP133-2-03-03-SL
B12同型对照
细胞培养
将293-huCD46细胞保持于稳定的细胞系培养基(MEM+10％ FBS+1mg/mL G418)中。将表达CD46的Colo205细胞(ATCC，目录号CCL222)保持于colo205培养基(RPMI1640+10％FBS)中。细胞通常每周继代培养两次。在指数生长期中收集细胞且计数以进行平板接种。
调配物
1)以50μg/mL开始，在pH 6.0或pH 7.4分析培养基中进行10×测试物ADC或B12同型ADC储备物的5倍连续稀释
2)使板离心且平缓地移除培养基，随后添加90μL pH分析培养基，之后添加ADC
3)将10μL连续稀释的10×ADC或B12样本储备物添加至含有3000个细胞的孔(最终起始浓度为5μg/mL)中
4)在37℃下在5％ CO2培育箱中培育经处理的细胞72小时
CELLTITER-GLO发光细胞活力分析
1)解冻CellTiter-Glo缓冲液且在使用之前平衡至室温
2)在使用之前将冻干的CellTiter-Glo底物平衡至室温
3)将CellTiter-Glo缓冲液的全部液体体积转移至含有CellTiter-Glo底物的琥珀色瓶中以重建冻干酶/底物混合物。如此形成CellTiter-Glo试剂
4)通过平缓地涡旋进行混合以获得均质溶液
5)将底物及其内含物平衡至室温
6)将70μL CellTiter-Glo试剂添加于各孔中。在定轨振荡器上以100rpm混合内含物2分钟以诱导细胞溶解
5)使板在室温下培育10分钟以使发光信号稳定
6)在SpectraMax i3X板读取器上记录发光
数据分析
以浓度反应发光信号绘制不同剂量的测试抗体的抑制且计算IC50。通过GraphpadPrism软件解释数据。
然而，应了解，尽管已于先前描述中连同本发明的结构及功能的细节一起阐述本发明的许多特征及优势，但本发明仅为示范性的，且可详细地作出改变，尤其关于本发明的原理内的部分的形状、大小及布置，其最大程度地通过术语的广泛一般含义所指示，在所述术语中表达所附权利要求书。
本文中提及的所有文献均以全文引用的方式并入本文中，或者提供其特定依赖的本发明。本申请人并不希望将任何所揭示的实施例均贡献于公众，且达到任何所揭示的修饰或变化字面上均不属于权利要求书的范围内，但其在等同原则下视为其一部分的程度。
本发明的多肽(包含抗体)序列
Figure BDA0004002311330000821
Figure BDA0004002311330000831
序列表
<110> 生物蛋白有限公司(BioAtla, INC.)
<120> 条件性活性抗CD46抗体、抗体片段、其免疫结合物及其用途
<130> KHP222111985.1
<150> US 63/040,913
<151> 2020-06-18
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC CDR1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X可为S或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X可为G或W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X可为S或A
<400> 1
Arg Ala Xaa Gln Xaa Ile Xaa Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC CDR2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X可为H或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X可为S或E
<400> 2
Tyr Thr Ser Ser Leu Xaa Xaa
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC CDR3
<400> 3
Gln Gln Tyr Ile Lys Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC CDR1
<400> 5
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC CDR2
<400> 6
Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser
1 5
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC可变区
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Tyr Asp Gly Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC CDR1
<400> 8
Gly Gly Ser Val Ser Ser Tyr Asp Ile Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC CDR2
<400> 9
Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met Ser
1 5 10 15
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC CDR3
<400> 10
Val Tyr Asp Gly Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 11
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC CDR1
<400> 12
Arg Ala Ser Gln Trp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 13
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列HC可变区
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Glu
85 90 95
Arg Val Tyr Asp Gly Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 14
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ala Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC CDR1
<400> 15
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ala Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 16
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC CDR2
<400> 17
Tyr Thr Ser Ser Leu Phe Ser
1 5
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 18
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Glu Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC CDR2
<400> 19
Tyr Thr Ser Ser Leu His Glu
1 5
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 20
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC可变区
<400> 21
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Leu Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列LC CDR1
<400> 22
Arg Ala Leu Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10

Claims (35)

1.一种经分离多肽，其包括：轻链可变区，所述轻链可变区具有三个具有序列L1、L2及L3的互补决定区CDR，其中
所述L1序列为RAX1QX2IX3NYLN(SEQ ID NO:1)，
所述L2序列为YTSSLX4X5(SEQ ID NO:2)，
所述L3序列为QQYIKLPWT(SEQ ID NO:3)；及
重链可变区，所述重链可变区具有三个具有序列H1、H2及H3的互补决定区CDR，其中
所述H1序列为GGSVSSYDIS(SEQ ID NO:8)；
所述H2序列为VIWTDGGTNYNSAFMS(SEQ ID NO:9)；及
所述H3序列为VYDGYPWFAY(SEQ ID NO:10)；
其中X1为S或L；X2为G或W；X3为S或A；X4为H或F，X5为S或E；其限制条件为X1、X2、X3、X4及X5不能同时分别为S、G、S、H及S。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述L1序列选自RASQWISNYLN(SEQ ID NO:12)、RASQGIANYLN(SEQ ID NO:15)及RALQGISNYLN(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述L2序列选自YTSSLFS(SEQ ID NO:17)及YTSSLHE(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的多肽，其包括选自以下6个CDR集合的一组6个CDR，
SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10；
SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10；
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10；
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10；及
SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10。
5.一种经分离多肽，其包括轻链可变区及重链可变区，每一所述轻链可变区及每一所述重链可变区独立地与选自以下的一对氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性：SEQ ID NO:11及13、SEQ ID NO:14及13、SEQ ID NO:16及13、SEQ ID NO:18及13、SEQ ID NO:20及13，及SEQ ID NO:21及13；且所述经分离多肽特异性结合于人类CD46蛋白质。
6.根据权利要求5所述的经分离多肽，其包括具有选自以下的一对序列的轻链可变区及重链可变区：SEQ ID NO:11及13、SEQ ID NO:14及13、SEQ ID NO:16及13、SEQ ID NO:18及13、SEQ ID NO:20及13或SEQ ID NO:21及13。
7.一种经分离的抗体或抗体片段，其包括轻链可变区，所述轻链可变区具有三个具有序列L1、L2及L3的互补决定区CDR，其中
所述L1序列为RAX1QX2IX3NYLN(SEQ ID NO:1)，
所述L2序列为YTSSLX4X5(SEQ ID NO:2)，
所述L3序列为QQYIKLPWT(SEQ ID NO:3)；及
重链可变区，所述重链可变区具有三个具有序列H1、H2及H3的互补决定区CDR，其中
所述H1序列为GGSVSSYDIS(SEQ ID NO:8)；
所述H2序列为VIWTDGGTNYNSAFMS(SEQ ID NO:9)；及
所述H3序列为VYDGYPWFAY(SEQ ID NO:10)；
其中X1为S或L；X2为G或W；X3为S或A；X4为H或F，X5为S或E；其限制条件为X1、X2、X3、X4及X5不能同时分别为S、G、S、H及S。
8.根据权利要求7所述的抗体或抗体片段，其中所述L1序列选自RASQWISNYLN(SEQ IDNO:12)、RASQGIANYLN(SEQ ID NO:15)及RALQGISNYLN(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列。
9.根据权利要求7所述的抗体或抗体片段，其中所述L2序列选自YTSSLFS(SEQ ID NO:17)及YTSSLHE(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列。
10.根据权利要求7所述的抗体或抗体片段，其包括选自以下6个CDR集合的一组6个CDR，
SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10；
SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10；
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10；
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10；及
SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10。
11.根据权利要求7所述的抗体或抗体片段，其包括轻链可变区及重链可变区，每一所述轻链可变区及每一所述重链可变区独立地与选自以下的一对氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性：SEQ ID NO:11及13、SEQ ID NO:14及13、SEQ ID NO:16及13、SEQ ID NO:18及13、SEQ ID NO:20及13，及SEQ ID NO:21及13；且所述抗体或抗体片段特异性结合于人类CD46蛋白质。
12.根据权利要求7所述的抗体或抗体片段，其包括具有选自以下的一对序列的轻链可变区及重链可变区：SEQ ID NO:11及13、SEQ ID NO:14及13、SEQ ID NO:16及13、SEQ IDNO:18及13、SEQ ID NO:20及13及SEQ ID NO:21及13。
13.一种经分离的抗体或抗体片段，其与根据权利要求7至12中任一权利要求6所述的抗体或抗体片段竞争结合至人类CD46。
14.根据权利要求7至13中任一权利要求所述的抗体或抗体片段，其中与非肿瘤微环境中出现的相同条件的不同值相比，所述抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的条件值下对CD46蛋白质具有更高结合活性。
15.根据权利要求14所述的抗体或抗体片段，其中所述条件为pH。
16.根据权利要求15所述的抗体或抗体片段，其中所述肿瘤微环境中的pH在5.0至6.8的范围内且所述非肿瘤微环境中的pH在7.0至7.6的范围内。
17.根据权利要求7至16中任一权利要求所述的抗体或抗体片段，其中该抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的条件值下与人类CD46蛋白质的结合活性与在非肿瘤微环境中的相同条件的不同值下与所述CD46蛋白质的结合活性的比率为至少约1.5:1、至少约2:1、至少约3:1、至少约4:1、至少约5:1、至少约6:1、至少约7:1、至少约8:1、至少约9:1、至少约10:1、至少约20:1、至少约30:1、至少约50:1、至少约70:1或至少约100:1。
18.一种免疫结合物，其包括根据权利要求7至17中任一权利要求所述的抗体或抗体片段。
19.根据权利要求18所述的免疫结合物，其中所述免疫结合物包括至少一种选自化学治疗剂、放射性原子、细胞生长抑制剂及细胞毒性剂的药剂。
20.根据权利要求19所述的免疫结合物，其包括至少两种所述药剂。
21.根据权利要求18至20中任一权利要求所述的免疫结合物，其中所述至少一种药剂为放射性药剂。
22.根据权利要求21所述的免疫结合物，其中所述放射性药剂选自α发射体、β发射体及γ发射体。
23.根据权利要求18至22中任一权利要求所述的免疫结合物，其中所述抗体或抗体片段及所述至少一种药剂共价键结至连接分子。
24.根据权利要求18至23中任一权利要求所述的免疫结合物，其中所述至少一种药剂选自类美登素、奥瑞他汀、海兔毒素、卡奇霉素、吡咯并苯并二氮呯及蒽环霉素。
25.一种医药组合物，其包括根据权利要求1至6中任一权利要求所述的多肽、根据权利要求7至17中任一权利要求所述的抗体或抗体片段、或根据权利要求18至24中任一权利要求所述的免疫结合物，以及药学上可接受的载剂。
26.根据权利要求25所述的医药组合物，其进一步包括张力剂。
27.一种根据权利要求25至26中任一权利要求所述的医药组合物的单次剂量，其包括以下量的所述多肽、所述抗体或抗体片段或所述免疫结合物：约135mg、235mg、335mg、435mg、535mg、635mg、735mg、835mg、935mg、1035mg、1135mg、1235mg或1387mg。
28.一种根据权利要求25至26中任一权利要求所述的医药组合物的单次剂量，其包括在以下范围内的量的所述多肽、所述抗体或抗体片段或所述免疫结合物：135至235mg、235至335mg、335至435mg、435至535mg、535至635mg、635至735mg、735至835mg、835至935mg、935至1035mg、1035至1135mg、1135至1235mg或1235至1387mg。
29.根据权利要求25至26中任一权利要求所述的医药组合物，其进一步包括免疫检查点抑制剂分子。
30.根据权利要求29所述的医药组合物，其中所述免疫检查点抑制剂分子是针对免疫检查点的抗体或抗体片段。
31.根据权利要求30所述的医药组合物，其中所述免疫检查点选自CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、VISTA、BTLA、OX40、CD40、4-1BB、PD-1、PD-L1、GITR、B7-H3、B7-H4、KIR、A2aR、CD27、CD70、DR3及ICOS。
32.根据权利要求30所述的医药组合物，其中所述免疫检查点为CTLA4、PD-1或PD-L1。
33.根据权利要求29至32中任一权利要求所述的医药组合物，其进一步包括针对选自以下的抗原的抗体或抗体片段：CTLA4、PD1、PD-L1、AXL、ROR2、CD3、HER2、B7-H3、ROR1、SFRP4及WNT蛋白质。
34.一种治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的患者投与根据权利要求1至6中任一权利要求所述的多肽、根据权利要求7至17中任一权利要求所述的抗体或抗体片段、根据权利要求18至24中任一权利要求所述的免疫结合物、或根据权利要求25至33中任一权利要求所述的医药组合物的步骤。
35.一种用于诊断或治疗的试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求1至6中任一权利要求所述的多肽、根据权利要求7至17中任一权利要求所述的抗体或抗体片段或根据权利要求18至24中任一权利要求所述的免疫结合物或根据权利要求25至33中任一权利要求所述的医药组合物，及使用所述抗体或抗体片段、所述免疫结合物及/或所述医药组合物进行诊断或治疗的说明书。
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