CN117986367B - 靶点为Nectin-4的抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种靶点为Nectin‑4的抗体及其应用，其抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的互补决定区CDR‑H3包含根据SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区CDR‑L3包含根据SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。本发明提供的抗体序列靶点为Nectin‑4，可以作为Nectin‑4表达异常或过量、失控的癌症的抗体药物开发的候选序列。
Description
技术领域
本发明属于细胞免疫学与生物技术领域，具体涉及靶点为Nectin-4的抗体及其应用，尤其是单B细胞抗体及其应用。
背景技术
Nectin-4为脊髓灰质炎病毒受体相关-4（PVRL-4）编码蛋白，其是一种不依赖Ca2+的免疫球蛋白样蛋白。Nectin-4与其他连接蛋白例如Nectin-1，Nectin-2和Nectin-3共同作用以参与细胞-细胞粘附。与其他Nectin相比，Nectin-4在人胚胎和胎盘组织中特异性富集，成年后表达显著下降。近年来，研究发现，在乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中，Nectin-4尤其过表达并作为肿瘤相关诱导剂。在一些类型的癌症中，Nectin-4的过表达与肿瘤进展的各个方面有关，如增殖、血管生成、上皮向间质转化、转移、DNA修复、肿瘤复发、预后不良等（Subhajit et al.,2021）。
Nectin-4属于I型跨膜蛋白，具有2种剪切变异体。包括Nectin-4在内的Nectin家族膜蛋白均具有以下特点：1）由三个保守的Ig样环（一个IGV环，两个IGC环）组成的胞外结构区；2）一个跨膜结构域；3）含有afadin（粘附连接蛋白）结合基序的细胞质结构域。Nectin胞外区通过反式相互作用以同嗜性和异嗜性的方式相互作用介导细胞间的相互连接。它们还与其他Ig样分子发生异嗜性相互作用，表现出调节免疫系统等多种生物学功能。Nectin胞质域与afadin结合，并与细胞骨架中的肌动蛋白建立相互作用。关于连接蛋白的上述分子结构，也有少数例外。Nectin-1γ不具有跨膜结构域和细胞质结构域，被认为是一种分泌蛋白。Nectin-1β和Nectin-3γ在膜内区中不具有afadin结合基序。其余的连接蛋白具有Glu/AlaX-Tyr-Val基序，与afadin的PDZ结构域结合（Takahashi et al.,1999;Takai etal.,2008a,b;Samanta and Almo,2015）。研究表明，生长因子受体与Nectin IgV和IgC环的相互作用可能调节细胞的生长、迁移和凋亡（Bojesen et al.,2012）。
具体来说，Nectin-4是一个55.5kDa的蛋白，由510个氨基酸组成，具有Nectin家族典型的3个结构域结构。在其N端还含有一个信号肽。Nectin-4与afadin通过C端保守的Gly-His-Leu-Val基序相互作用。PVRL-4基因包含9个外显子。外显子1、2和3分别编码信号肽、V-type1和C2-type1 loops。外显子4和5编码C2-type2 loop。跨膜区由第6外显子编码，第7、8、9外显子编码胞质区。
Nectin-4在实体瘤中，可通过激活P13K/Akt通路促进肿瘤的增殖和迁移（akai etal.,2008a,b）。Nectin-4具有两个有趣的特性：一方面，作为介导麻疹病毒进入细胞的细胞表面受体，Nectin-4具有可诱导且高效的内化作用，可以介导抗体药物高效内吞；另一方面，Nectin-4在成年人健康组织中表达有限，却在恶性肿瘤细胞中过度表达，这种差异性表达模式可以实现药物的靶向治疗，将不良事件的风险降到最低。鉴于以上特征，Nectin-4成为了靶向治疗的诱导靶标，其巨大的临床潜力也在其靶向ADC（抗体偶联药物）开发过程中得以证实。
抗体发现是生物制药领域和诊断试剂行业比较重要的研发项目，目前常见的抗体发现技术主要包括：杂交瘤技术、噬菌体展示技术和单B细胞抗体筛选技术。
根据研究应用，可以随机或抗原选择性地从外周血或淋巴组织（如骨髓、脾脏）中分离单B细胞。对于B细胞分离，目前单B细胞分选方式有流式细胞分选法、磁珠细胞分选法、显微操作法、激光显微切割法以及微流控分选法。其中流式细胞荧光分选技术（Fluorescence activated Cell Sorting，FACS）是目前一种成熟、有效的单细胞分选方法。
现在FDA已经批准针对Nectin-4 靶点的药物enfortumab vedotin，该药物适应症是尿路上皮癌，并证明了该靶点具有良好的成药性。基于靶点Nectin-4良好的成药性，利用优化的单B细胞抗体发现平台，发现该靶点的一些新的抗体序列，用于下一步的成药性分析，是本发明亟待解决的技术问题。
发明内容
第一方面，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的互补决定区CDR-H3包含根据SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19任一项所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区CDR-L3包含根据SEQ IDNO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20任一项所示的氨基酸序列。
较佳地，所述抗体或抗原结合片段包含：所述重链可变区的互补决定区CDR-H3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区CDR-L3包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或者
所述重链可变区的互补决定区CDR-H3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区CDR-L3包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；或者
所述重链可变区的互补决定区CDR-H3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区CDR-L3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；或者
所述重链可变区的互补决定区CDR-H3包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区CDR-L3包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；或者
所述重链可变区的互补决定区CDR-H3包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区CDR-L3包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；或者
所述重链可变区的互补决定区CDR-H3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区CDR-L3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；或者
所述重链可变区的互补决定区CDR-H3包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区CDR-L3包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；或者
所述重链可变区的互补决定区CDR-H3包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区CDR-L3包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；或者
所述重链可变区的互补决定区CDR-H3包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区CDR-L3包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；或者
所述重链可变区的互补决定区CDR-H3包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的互补决定区CDR-L3包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
较佳地，所述重链可变区包含互补决定区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H1包含根据SEQ ID NO:40、43、46、49、52、55、58、61、64、67所示的氨基酸序列，CDR-H2包含根据SEQ ID NO:41、44、47、50、53、56、59、62、65、68所示的氨基酸序列，CDR-H3包含根据SEQ IDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1包含根据SEQ ID NO:42、45、48、51、54、57、60、63、66、69所示的氨基酸序列，CDR-L2包含AAS氨基酸序列、YTS氨基酸序列、WAS氨基酸序列、DTS氨基酸序列、TTS氨基酸序列、SSS氨基酸序列、AAS氨基酸序列、SIS氨基酸序列，CDR-L3包含根据SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20所示的氨基酸序列。
较佳地，所述重链可变区包含SEQ ID NO:40所示的CDR-H1、SEQ ID NO:41所示的CDR-H2和SEQ ID NO:1所示的CDR-H3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:42所示的CDR-L1、AAS氨基酸序列的CDR-L2和SEQ ID NO:2所示的CDR-L3；或者
所述重链可变区包含SEQ ID NO:43所示的CDR-H1、SEQ ID NO:44所示的CDR-H2和SEQ ID NO:3所示的CDR-H3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:45所示的CDR-L1、YTS氨基酸序列的CDR-L2和SEQ ID NO:4所示的CDR-L3；或者
所述重链可变区包含SEQ ID NO:46所示的CDR-H1、SEQ ID NO:47所示的CDR-H2和SEQ ID NO:5所示的CDR-H3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:48所示的CDR-L1、WAS氨基酸序列的CDR-L2和SEQ ID NO:6所示的CDR-L3；或者
所述重链可变区包含SEQ ID NO:49所示的CDR-H1、SEQ ID NO:50所示的CDR-H2和SEQ ID NO:7所示的CDR-H3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:51所示的CDR-L1、DTS氨基酸序列的CDR-L2和SEQ ID NO:8所示的CDR-L3；或者
所述重链可变区包含SEQ ID NO:52所示的CDR-H1、SEQ ID NO:53所示的CDR-H2和SEQ ID NO:9所示的CDR-H3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:54所示的CDR-L1、YTS氨基酸序列的CDR-L2和SEQ ID NO:10所示的CDR-L3；或者
所述重链可变区包含SEQ ID NO:55所示的CDR-H1、SEQ ID NO:56所示的CDR-H2和SEQ ID NO:11所示的CDR-H3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:57所示的CDR-L1、TTS氨基酸序列的CDR-L2和SEQ ID NO:12所示的CDR-L3；或者
所述重链可变区包含SEQ ID NO:58所示的CDR-H1、SEQ ID NO:59所示的CDR-H2和SEQ ID NO:13所示的CDR-H3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:60所示的CDR-L1、DTS氨基酸序列的CDR-L2和SEQ ID NO:14所示的CDR-L3；或者
所述重链可变区包含SEQ ID NO:61所示的CDR-H1、SEQ ID NO:62所示的CDR-H2和SEQ ID NO:15所示的CDR-H3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:63所示的CDR-L1、SSS氨基酸序列的CDR-L2和SEQ ID NO:16所示的CDR-L3；或者
所述重链可变区包含SEQ ID NO:64所示的CDR-H1、SEQ ID NO:65所示的CDR-H2和SEQ ID NO:17所示的CDR-H3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:66所示的CDR-L1、AAS氨基酸序列的CDR-L2和SEQ ID NO:18所示的CDR-L3；
所述重链可变区包含SEQ ID NO:67所示的CDR-H1、SEQ ID NO:68所示的CDR-H2和SEQ ID NO:19所示的CDR-H3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:69所示的CDR-L1、SIS氨基酸序列的CDR-L2和SEQ ID NO:20所示的CDR-L3。
较佳地，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO: 21、23、25、27、29、31、33、34、36、38任一项所示的氨基酸序列或与其同源性为至少85%、至少90%、至少95%或至少99%的氨基酸序列，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO: 22、24、26、28、30、32、28、35、37、39任一项所示的氨基酸序列或与其同源性为至少85%、至少90%、至少95%或至少99%的氨基酸序列。
较佳地，所述抗体或抗原结合片段包含：所述重链可变区包含根据SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；或者
所述重链可变区包含根据SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；或者
所述重链可变区包含根据SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；或者
所述重链可变区包含根据SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列；或者
所述重链可变区包含根据SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列；或者
所述重链可变区包含根据SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据SEQ ID NQ:32所示的氨基酸序列；或者
所述重链可变区包含根据SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列；或者
所述重链可变区包含根据SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；或者
所述重链可变区包含根据SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；或者
所述重链可变区包含根据SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含根据SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
较佳地，所述抗体或抗原结合片段的靶点为Nectin-4。
较佳地，所述抗体为单B细胞抗体。
第二方面，本发明提供上述任一项所述的抗体或抗原结合片段用于制备预防和/或治疗癌症和/或炎性疾病的药物的用途。
较佳地，所述癌症是与Nectin-4表达异常、过量、失控相关的癌症。
第三方面，本发明提供一种核酸，其编码上述任一项所述的抗体或抗原结合片段中的一种或多种。
第四方面，本发明提供一种载体，所述载体包含根据所述核酸。
第五方面，本发明提供一种药物组合物，其包含根据上述任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明提供的抗体序列靶点为Nectin-4，可以作为Nectin-4表达异常或过量、失控的癌症的抗体药物开发的候选序列。 而且，本发明利用重链及轻链可变区天然配对的优势，更有利于取得亲和力及特异性俱佳的抗体序列，增加后续抗体药物开发的成功率。
附图说明
图1是免疫小鼠血清ELISA效价检测结果；
图2和图3是第一次Nectin-4免疫实验的小鼠单B细胞流式分选结果；其中，图2的所有事件调节电压、圈门确定了需要分析的细胞群，A确定了细胞去粘连，B选定了CD19阳性的活细胞，C选择了CD19阳性同时IgG阳性的细胞；其中，图3示出单B细胞配色分选方案细节，D选择IgG阳性同时IgD和IgM阴性的细胞，E选择两个不同配色的抗原阳性的细胞；
图4是第一次Nectin-4免疫实验的小鼠 Top20 CDR3氨基酸序列，具体为第一次Nectin-4免疫实验的单B细胞BCR文库测序CDR3表达频率T0P20的氨基酸编号；
图5和图6是第二次Nectin-4免疫实验的小鼠单B细胞流式分选结果；其中，图5的所有事件调节电压、圈门确定了需要分析的细胞群，A确定了细胞去粘连，B选定了CD19阳性的活细胞，C选择了CD19阳性同时IgG阳性的细胞；其中，图6示出单B细胞配色分选方案细节，D选择IgG阳性同时IgD和IgM阴性的细胞，E选择两个不同配色的抗原阳性的细胞；
图7是第二次Nectin-4免疫实验的小鼠 Top20 CDR3氨基酸序列，具体为第二次Nectin-4免疫实验的单B细胞BCR文库测序CDR3表达频率T0P20的氨基酸编号；
图8、图9、图10是流式细胞仪检测CHO表达纯化后抗体在T47D细胞上的结合数据；其中图8为enfortumab T47D细胞流式结合结果；图9为5个抗体T47D细胞流式结合结果；图10为5个抗体T47D细胞流式结合结果。
具体实施方式
通过实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。若无特殊说明，以下实施例中采用的相关材料、试剂、制备方法等为本领域抗体制备的常规选择，相关材料、试剂的使用方法为生产厂家建议的使用方法。
通常，单B细胞cDNA合成是在用于细胞沉积和细胞裂解的设备（例如96孔板、纳米孔芯片等）中进行的，这确保了方便处理大量样品并将交叉污染的风险降至最低。单B细胞抗体筛选的原理是每个B细胞只含有一对功能性的重链和轻链，每个B细胞具有只产生一种特异性抗体的特性，所以可以直接从单个B细胞中扩增出抗体基因获得单抗。
全长Ig可变区基因转录物通过巢氏PCR进行扩增，其中RT-PCR产物可作为第一轮PCR的样品进行进一步反应。无论使用何种Ig可变区基因扩增策略，编码抗体特异性的单B细胞Ig可变区基因转录信息随后通过测序得到。然后利用各种数据库，如NCBI的IgBLAST、IMGT，可以很容易地识别和分析重排的V、D和J基因片段是否存在突变、插入和缺失。这种方法保留了重链和轻链可变区的天然配对，具有氨基酸多样性好、效率高、全天然源性的特点，也成为了目前快速开发针对抗病毒感染性疾病抗体的重要策略。
本发明采用流式细胞术对Nectin-4蛋白阳性IgG+的B细胞进行分选，采用BD公司的BDRhapsody成品试剂盒构建了记忆B细胞的BCR文库构建，具有时间短、速度快、通量高以及重链及轻链可变区天然配对的优势，有利于取得亲和力及特异性俱佳的抗体序列，增加后续抗体药物开发的成功率。故此本发明为从单个B细胞中构建互补DNA（cDNA）为同时分析表达的IgH和IgL链基因提供了一种正确的方法。
SEQ ID NO:40、41、1、42、2、21、22分别对应Cell ID 168266的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L3、IGH、IGK。
SEQ ID NO:43、44、3、45、4、23、24分别对应Cell ID 25400的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L3、IGH、IGK。
SEQ ID NO:46、47、5、48、6、25、26分别对应Cell ID 15431的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L3、IGH、IGK。
SEQ ID NO:49、50、7、51、8、27、28分别对应Cell ID 476983的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L3、IGH、IGK。
SEQ ID NO:52、53、9、54、10、29、30分别对应Cell ID 468180的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L3、IGH、IGK。
SEQ ID NO:55、56、11、57、12、31、32分别对应Cell ID 740014的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L3、IGH、IGK。
SEQ ID NO:58、59、13、60、14、33、28分别对应Cell ID 316125的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L3、IGH、IGK。
SEQ ID NO:61、62、15、63、16、34、35分别对应Cell ID 606808的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L3、IGH、IGK。
SEQ ID NO:64、65、17、66、18、36、37分别对应Cell ID 168266的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L3、IGH、IGK。
SEQ ID NO:67、68、19、69、20、38、39分别对应Cell ID 149043的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L3、IGH、IGK。
表1 氨基酸序列
以下结合具体试验示例性说明本发明抗体序列（抗Nectin-4抗体序列）的筛选与制备。
靶点为Nectin-4的单B细胞抗体筛选
表2 实验材料
表3 实验仪器
从义翘神州采购的人源真核Nectin-4蛋白，分别使用PE / R-Phycoerythrin偶联试剂盒（abcam，货号：ab102918）、FITC荧光偶联试剂盒(Fast)（abcam，货号：ab188285）进行荧光标记，操作步骤按照试剂盒说明书进行，获得Ag-FITC和Ag-PE。
动物免疫
分别取6只6周龄的雌性BALB/c小鼠，采用人源真核蛋白对小鼠进行免疫。人源真核Nectin-4蛋白免疫小鼠的剂量为50μg/只。首次免疫时，向人源真核Nectin-4蛋白中加入等体积的弗氏完全佐剂制成乳浊物，然后经过皮下及腹腔注射免疫小鼠。2周后进行第二次免疫时，向人源真核Nectin-4蛋白中加入等体积的弗氏不完全佐剂制成乳浊物，然后经过皮下及腹腔注射免疫小鼠。每间隔2周免疫一次。终免于流式分选前3天进行，剂量50μg/只，将人源真核Nectin-4蛋白采用PBS缓冲液进行稀释成1.2 ml（每只0.2ml），然后经过腹腔注射免疫小鼠。二免开始，免疫后1周，对小鼠断尾取血，用于小鼠血清ELISA效价检测。终免后3天，对小鼠摘眼球取血，用于后期检测分析；并断颈处死小鼠，采集脾脏。
小鼠血清ELISA效价检测
1）包被：将人源真核Nectin-4蛋白以pH7.2的10mM PBS溶液溶解，以该溶液稀释后包被，包被浓度为1.0ug/mL，包被体积：100uL/孔，4℃包被过夜；
2）洗涤：使用PBST溶液洗涤，300uL/孔，洗涤3次；
3）封闭：使用质量浓度5%脱脂奶粉或2-5%BSA的溶液进行封闭，200uL/孔，封闭条件：37℃ 2h；
4）洗涤：使用PBST溶液洗涤，300uL/孔，洗涤1次；
5）一抗：二免，三免，四免、五免小鼠血清，起始稀释比例为体积比1:1000，3倍梯度稀释，7个梯度，最后一孔加入免疫前采集的血清（体积比1:1000）作为阴性对照，100uL/孔，37℃孵育 1h；
6）洗涤：使用PBST溶液洗涤，300uL/孔，洗涤3次；
7）二抗：Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) (体积比1：10000)，100uL/孔，37℃孵育 1h；
8）洗涤：使用PBST溶液洗涤，300uL/孔，洗涤3次；
9）显色：显色剂TMB，100uL/孔，显色条件：37℃避光孵育5min；
10）终止：终止液2M H2SO4，50uL/孔。
从图1可以看出，经过5次免疫后，小鼠血清均得到很大提高。
小鼠脾细胞悬液制备及染色
选取ELISA效价高的BALB/c小鼠，配置细胞保存液，使用DPBS溶液，加入质量浓度2%的FBS溶液进行配置。共需要配置50mL。
小鼠摘除眼球放血，用1.5ml离心管收集，做好标记，然后断颈处死，使用眼科剪刀和镊子把脾脏取出，放入无菌的培养皿的70um过滤器中，添加3ml的PBS，使用5ml或是10ml注射器内芯，研磨脾脏，成糊状，用1ml PBS洗脱注射器内芯粘连的细胞悬液，加入5-10 mlPBS制成细胞悬液。离心管收集血液静置后离心，保留血清作为阳性对照，-20℃保存。
再将细胞悬液用70 um 的细胞筛进行过滤，滤液进行离心，4℃，1000rpm，离心5min。倒掉上清，收集的细胞加入6ml的红细胞裂解液，缓慢把细胞吹匀，室温静置裂解5min(根据细胞裂解情况，可延长裂解时间，直至离心后最上层细胞颜色偏白无红色出现)，然后加入6ml的PBS溶液终止反应。反应液在4℃，1000rpm离心5min，弃去上清，用2ml的DPBS+2%FBS重悬细胞。放置冰上待用。
免疫小鼠单B细胞分选（流式细胞分选）与分离
使用补偿微球（Thermo，货号：01-3333-42）进行流式细胞仪的调补偿，进行补偿参数设置。
按照B细胞的配色和分选方案进行B细胞分选。
表4 B细胞配色和分选方案
在上述表格配色方案中，CD19（APC-Cy7）+表示选取的为细胞悬液中的B细胞，IgG（APC）+表示选取的B细胞中只选取BCR为IgG亚型的B细胞，IgD（AF700）和IgM（Percp-Cy5.5）-表示不选取选取BCR为IgD、IgM亚型的B细胞，Nectin-4蛋白（FITC、PE）+表示只选取特异性识别Nectin-4蛋白的B细胞。
从图2和图3的流式细胞分析分选结果可以看出，可以分选到Nectin-4蛋白+的特异性的B细胞。
从图5和图6的流式细胞分析分选结果可以看出，可以分选到Nectin-4蛋白+的特异性的B细胞。
文库构建与氨基酸捕获（测序）
使用下述试剂盒构建单B细胞文库：BD Rhapsody Cartridge Kit，BDRhapsodyTMEnhanced Cartridge Reagent Kit，BD RhapsodyTMBCR Amplication Kit，BDRhapsodyTMWTA Amplication Kit，BD RhapsodyTM cDNA Kit。按照试剂盒的说明书进行标准化操作，进行RNA提取、反转录，构建文库。
使用IlluminaNovaSeq平台采用PE150测序模式对构建完成的文库进行测序。
抗体序列分析
根据测序结果选取CDR3重复数（Frequency）在TOP20的VDJ（抗体的可变区序列是由V基因、D基因、J基因组成的，故称为VDJ序列。选取出来的TOP20的VDJ序列共40个抗体序列，通过NCBI和IMGT数据库，利用Frequency、SHM、Isotype进行比对分析。比对分析结果参见图4和图7。其中，图4是第一次Nectin-4免疫实验的小鼠 Top20 CDR3氨基酸序列，具体为第一次Nectin-4免疫实验的单B细胞BCR文库测序CDR3表达频率T0P20的氨基酸编号；图7是第二次Nectin-4免疫实验的小鼠 Top20 CDR3氨基酸序列，具体为第二次Nectin-4免疫实验的单B细胞BCR文库测序CDR3表达频率T0P20的氨基酸编号。根据图4和图7确定出同源性低、Freq高的抗体可变区序列，并进行下一步的实验验证。
抗体表达验证
把筛选出来的10个抗体可变区包括轻重链序列共20个序列，使用小鼠IgG1的亚型恒定区，整合入3.4表达载体中，使用CHO-S细胞将重链和轻链载体瞬时共转染到CHO-S细胞（Life technologies）中，在32℃的5%CO2环境中孵育7天，然后通过离心收集上清液。
收集的表达上清进一步用Protein A sepharose柱纯化。抗体用25 mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 2.5）洗脱，立即用Tris缓冲液中和，然后用Amicon ultra 50 kDa离心过滤器（Millipore, Billerica, MA）交换缓冲液并浓缩抗体，使用BCA法测定抗体浓度。
纯化抗体与靶标蛋白（Nectin-4）的结合通过ELISA测定。用1μg/mL的真核表达的人源Necting-4蛋白包被96孔酶标板，用5%脱脂奶粉在PBS缓冲液中封闭酶标板，将抗体从1μg/mL开始成倍稀释，最后用Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠Fc片段特异性抗体（Jackson Immunoresearch）以1:10000稀释加入板中，使用TMB显色，加入2M H2SO4每孔50 uL进行终止，然后在全波长酶标仪MULTISKAN Sky（Thermo）上在450nm处读取，结果见表5。
其中：Cell ID 2531762的VH区包含根据SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，VL区包含根据SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；Cell ID 25400的VH区包含根据SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，VL区包含根据SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；Cell ID 15431的VH区包含根据SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，VL区包含根据SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；Cell ID 476983的VH区包含根据SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，VL区包含根据SEQ IDNO:28所示的氨基酸序列；Cell ID 468180的VH区包含根据SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，VL区包含根据SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列；Cell ID 740014的VH区包含根据SEQID NO:31所示的氨基酸序列，VL区包含根据SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；Cell ID316125的VH区包含根据SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，VL区包含根据SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列；Cell ID 606808的VH区包含根据SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，VL区包含根据SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列；Cell ID 168266的VH区包含根据SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，VL区包含根据SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列；Cell ID 149043的VH区包含根据SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，VL区包含根据SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。
表5 ELISA检测CHO表达纯化后抗体效价数据
注：NaN（加横线）表示读数超过仪器检测上限，＞4。
可以看出，筛选出来的10个抗体可变区不同的抗体，均能和人源Nectin-4蛋白结合反应，149043抗体初期设计作为阴性对照，但也和人源Nectin-4蛋白结合反应，至少同等浓度下比其他抗体OD值偏低，说明该抗体的亲和力比其他抗体亲和力弱，具体亲和力常数的比较需要后期进行亲和力测定验证。
流式细胞仪检测结合实验
将T47D细胞作为靶细胞进行常规培养，待生长至对数生长期时，使用0.25%的EDTA-Trysin把T47D从细胞瓶中消化下来，离心，然后细胞计数。按照2E5（2×105）/孔的细胞量，取所需细胞量铺入96孔V孔板中，每孔200ul。纯化的表达抗体作为一抗，按照一定的浓度加入铺好的V孔板中，与靶细胞结合，4℃反应1h后，使用PBS洗涤，然后加入抗鼠IgG（Fc）-PE二抗，工作浓度1ug/ml。4℃反应1h后，使用PBS洗涤，然后上流式细胞仪进行检测。在IMGT网站上查找针对Nectin-4靶点的上市药物enfortumab vedotin（FDA approvalDecember 18, 2019），其中抗体enfortumab的相关序列在CHO-S细胞上表达并纯化，作为抗体表达验证实验的阳性对照。
从图8、图9和图10看出，Cell ID为168266抗体和阳性对照抗体enfortumab的EC50最为接近。
Claims (5)
1. 一种抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含互补决定区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H1为根据SEQ ID NO: 64所示的氨基酸序列，CDR-H2为根据SEQ ID NO: 65所示的氨基酸序列，CDR-H3为根据SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1为根据SEQ ID NO: 66所示的氨基酸序列，CDR-L2为AAS氨基酸序列，CDR-L3为根据SEQ IDNO: 18所示的氨基酸序列；所述抗体或抗原结合片段的靶点为Nectin-4。
2. 根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述重链可变区为根据SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述轻链可变区为根据SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
3.一种核酸，其编码根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段。
4.一种载体，所述载体包含根据权利要求3所述的核酸。
5.一种药物组合物，其包含根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段。
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