CN116284380A - 白细胞介素2结合分子、其衍生物、试剂盒及其生产方法和用途 - Google Patents

白细胞介素2结合分子、其衍生物、试剂盒及其生产方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了白细胞介素2结合分子，其能够特异性结合白细胞介素2，且包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述的至少一个免疫球蛋白单一可变结构域包含CDR1、CDR2和CDR3；其中CDR1包含与SEQ ID NO:1‑15中任一项中至少90％相同的氨基酸序列，CDR2包含与SEQ ID NO:16‑54中任一项中至少90％相同的氨基酸序列，CDR3包含与SEQ ID NO:55‑84中任一项中至少90％相同的氨基酸序列。本发明还公开了其编码的核酸分子、表达载体、宿主细胞、生产方法，应用其的免疫缀合物、药物组合物、试剂盒，以及其用途。本发明通过筛选得到具有高特异性、高亲和力和高稳定性的白细胞介素2结合分子，以用于治疗、预防和诊断IL2相关疾病。

Description

白细胞介素2结合分子、其衍生物、试剂盒及其生产方法和 用途
本申请是申请日为2021年05月14日、申请号为2021105289658、发明名称为“白细胞介素2结合分子、其衍生物、试剂盒及其生产方法和用途”的专利的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是一种针对白细胞介素2(IL2)的单域抗体。
背景技术
白细胞介素2(interleukin 2，IL2)从被发现迄今已有30余年，但仍然是最受关注和被广泛研究的细胞因子之一。人体内IL2为分子量15.5kDa的糖蛋白，成熟的IL2分子有153个氨基酸肽链N端剪掉20个氨基酸残基的信号肽后剩下的133个氨基酸残基组成，IL2与其他细胞因子在序列上无同源性(T Taniguchi,H Matsui,T Fujita,C Takaoka,NKashima,R Yoshimoto,J Hamuro.Structure and expression of a cloned cDNA forhuman interleukin-2.Nature.1983 Mar 24-30；302(5906):305-10.)。在稳定状态下，IL2主要是由二级淋巴器官里的CD4+T辅助细胞产生，少部分是由CD8+T细胞、NK细胞和NKT细胞产生，抗原刺激能强烈诱导CD4+和CD8+T细胞产生，尽管CD8+T细胞合成IL2能力较弱，而且这些细胞的应答往往需要CD4+T细胞的帮助(参考文献：Thomas R Malek.The biology ofinterleukin-2.Annu Rev Immunol.2008；26:453-79.)。
IL2作为153个氨基酸的前体蛋白合成，前20个氨基末端氨基酸作为疏水分泌信号序列。该蛋白质包含对生物活性至关重要的单个二硫键(连接位置Cys58/105)。
IL2的生物活性由膜受体介导，所述膜受体几乎专门在活化的T细胞上表达，而不在静息T细胞上表达。完整的IL2受体由3个I型穿膜蛋白亚基构成：α、β和γ；较低亲和性的功能性受体可以仅由β和γ受体蛋白组成。静息的B细胞和静息的单核白细胞很少表达该受体。IL2受体(尤其是α亚基)的表达由许多因子调节，例如有IL5、IL6和L2R/p55诱导因子。
小鼠和人IL2都能使同种物种T细胞高效增殖。人IL2对小鼠细胞也有作用，但反之不然。IL2是所有T淋巴细胞亚群的生长因子。它对于T细胞来说，是抗原非特异性的增殖因子，其能诱导静息的细胞中的细胞周期进程并由此使T淋巴细胞克隆扩增。IL2也促进活化的B细胞的增殖和分化。与T细胞的增殖一样，该活性也需要存在其他因子，例如IL4。
IL2通过作用于细胞膜上的IL2R来发挥其生物活性。IL2R是一个复合体，由CD25(IL2Rα链，55kd)、CD122(IL2Rβ链，75kd)和CD132(IL2Rγ链，64kd)组成，只表达α的细胞以低亲和力与IL2结合，且无法进行细胞内信号转导，当α链与β链与γ链共同构成三聚体型IL2R时，可以将IL2R与IL2结合的亲和力提高10～100倍(Kd≈10-11)，β和γ都属于Ⅰ型细胞因子受体家族，γ亚基不单独与IL2结合，但与β亚基结合可构成低亲和力二聚体型IL2R(Kd≈10-9)，共同成为IL2R信号的组成部分。β和γ亚基在它们胞质内的尾部都携带信号序列，其信号转导通过多种细胞内通路，如酪氨酸蛋白激酶-信号转导和转录因子激活通路(JAK/STAT)、磷脂酰肌醇-3激酶B通路(PI3K/Akt)及丝裂原活化蛋白激酶通路(MAPKs)(参考文献：J X Lin,W J Leonard.Signaling from the IL-2 receptor to thenucleus.Cytokine Growth Factor Rev.1997 Dec；8(4):313-32.)。
IL-2作为恶性肿瘤免疫治疗的一部分，在临床上已经被广泛应用30多年，但其作用受到毒性、体内不稳定性以及抑制性Treg细胞而非效应T细胞的优先扩张等因素的限制。在机制上，IL2最初与IL-2Rα结合，导致IL-2的构象改变，从而使其有效地与IL-2Rβ和IL-2Rγ，然后形成高亲和力的受体激活细胞内信号通路。当IL2与中等亲和受体，IL-2Rβ和IL-2Rγ二聚体相互作用时，也可激活细胞内信号通路。IL-2Rα在Treg细胞有广泛的表达，但Treg细胞不具有杀伤作用，导致IL-2被消耗掉，而没有产生很好的细胞杀伤作用。
单结构域抗体(sdAb)是由单个单体可变抗体域组成的抗体。像整个抗体一样，它能够选择性结合特定的抗原。单结构域抗体比由两条蛋白重链和两条轻链组成的常见抗体小得多。第一个单结构域抗体是由骆驼科动物中发现的重链抗体改造而来的(参考文献：Hamers-Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，BendahmanN，Hamers R(1993)Naturally occurring antibodies devoid of lightchains.Nature 363(6428):446–448.)。目前，对单结构域抗体的大多数研究基于重链可变结构域。
单结构域抗体具有许多优点。例如，它们通常表现出高溶解度和稳定性，并且还可以容易地在酵母、植物和哺乳动物细胞中产生(参考文献：HarmsenMM，DeHaardHJ(2007)Properties，production，and applications of camelid single-domain antibodyfragments.Appl Microbiol Biotechnol 77(1):13–22.)。此外，它们具有良好的热稳定性和良好的组织渗透性。而且它们还在生产中具有成本效益。虽然已开发出针对IL2的抗体，但作为治疗剂仍有改善抗IL2抗体的需要。此外，值得注意的是，目前针对IL2的单结构域抗体很少。因此，本领域希望开发新的抗IL2抗体，特别是针对IL2的单结构域抗体。
发明内容
本发明的目的在于利用噬菌体展示技术，通过筛选得到具有高特异性、高亲和力和高稳定性的白细胞介素2结合分子，以用于治疗、预防和诊断IL2相关疾病，本发明的目的还在于提供编码白细胞介素2的核酸分子，表达抗白细胞介素2的表达载体和宿主细胞，以用于生产，便于实现临床应用。本发明采用以下技术方案：
本发明公开了白细胞介素2结合分子，其能够特异性结合白细胞介素2，且包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述的至少一个免疫球蛋白单一可变结构域包含CDR1、CDR2和CDR3；其中CDR1包含与SEQ ID NO:1-15中任一项中至少90％相同的氨基酸序列，CDR2包含与SEQ ID NO:16-54中任一项中至少90％相同的氨基酸序列，CDR3包含与SEQID NO:55-84中任一项中至少90％相同的氨基酸序列。
优选地，所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域包含选自表1的CDR1、CDR2和CDR3。
其中，所述的免疫球蛋白单一可变结构域是VHH，所述的VHH包含与SEQ ID NO:85-138中任一序列具有至少80％序列相同的氨基酸序列。
进一步地，所述的白细胞介素2结合分子，与白细胞介素2结合的KD值小于1×10- 7M。
其中，本发明白细胞介素2结合分子，其为单结构域抗体或嵌合抗体或人源化抗体。所述的单结构域抗体为重链单结构域抗体。所述的VHH来自骆驼科动物，例如羊驼或美洲驼。
其中，所述的VHH与另一分子融合，另一分子包括免疫球蛋白(如IgG)、免疫球蛋白的Fc结构域、免疫球蛋白可变区、荧光蛋白或者具有不同特异性的VHH。
本发明还公开了核酸分子，其编码上述的白细胞介素2结合分子。
本发明还公开了表达载体，包含与表达调控元件可操作地连接的上述的核酸分子。
本发明还公开了宿主细胞，包含上述的核酸分子或上述的表达载体转化，并能够表达所述白细胞介素2结合分子，所述宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
本发明还公开了白细胞介素2结合分子的生产方法，包括：a)在允许上述的白细胞介素2结合分子表达的条件下培养上述的宿主细胞；b)从得自步骤a)的培养物回收由所述宿主细胞表达的白细胞介素2结合分子；c)进一步纯化和/或修饰得自步骤b)的白细胞介素2结合分子。
本发明还公开了免疫缀合物，其包含与治疗性部分缀合的上述的白细胞介素2结合分子。其中，所述治疗性部分包括细胞毒素、生物活性蛋白质或放射性同位素。
本发明还公开了药物组合物，包括上述的免疫缀合物，以及药学上可接受的载体。
本发明还公开了：白细胞介素2结合分子或者免疫缀合物，或者药物组合物在制备预防或治疗增殖性病症药物上的用途。其中，所述的预防或治疗增殖性病症药物为预防或治疗癌症药物或治疗慢性病毒感染药物。
本发明还公开了白细胞介素2结合分子在抑制或阻断CD25与白细胞介素2的结合及相关药物上的用途。
本发明还公开了一种试剂盒，包括容器，所述的容器内设有上述的白细胞介素2结合分子。
本发明得到的白细胞介素2结合分子为针对白细胞介素2(IL2)的纳米抗体，其可以阻断IL2与IL-2Rα的结合，但不影响IL2与IL-2Rβ和IL-2Rγ的结合，具有高特异性、高亲和力和高稳定性。在治疗、预防和诊断IL2相关疾病(例如癌症或慢性病毒感染)中具有重要作用。
附图说明
图1为抗体株ELISA阻断实验测试数据。
图2为IL2的抗体株ELISA亲和实验测试数据。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的描述。
首先对本发明的术语含义进行说明如下：
术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中无论是指重链抗体还是指常规4链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原结合结构域或片段，分别例如VHH结构域或VH/VL结构域)。
术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“单一可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列。
术语(多肽或蛋白的)“结构域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，结构域负责蛋白的单个的功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或结构域的功能。
“免疫球蛋白结构域”是指抗体链(例如常规4链抗体的链或重链抗体的链)的球形区域，或是指基本上由这类球形区域组成的多肽。免疫球蛋白结构域的特征在于其维持抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，其由排列在两个β折叠中任选由保守二硫键稳定的约7个反平行β折叠股的2层夹层组成。
术语“免疫球蛋白可变结构域”是指基本上由本领域及下文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白结构域，其中所述框架区由本领域及下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔开。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变结构域因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。
术语“免疫球蛋白单一可变结构域”是指能够在不与其他免疫球蛋白可变结构域配对的情况下特异性结合抗原表位的免疫球蛋白可变结构域。本发明含义中的免疫球蛋白单一可变结构域的一个实例为“结构域抗体”，例如免疫球蛋白单一可变结构域VH及VL(VH结构域及VL结构域)。免疫球蛋白单一可变结构域的另一实例为如下文定义的骆驼科的“VHH结构域”(或简称为“VHH”)。
“VHH结构域”，亦称为重链单域抗体、VHH、VHH结构域、VHH抗体片段和VHH抗体，是称为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白的可变结构域(Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,BendahmanN,Hamers R.:“Na turally occurring anti bod ies d evoid of lightchains”；Nature363,446-448(1993))。使用术语“VHH结构域”以将所述可变结构域与存在于常规4链抗体中的重链可变结构域(其在本文中称为“VH结构域”)以及存在于常规4链抗体中的轻链可变结构域(其在本文中称为“VL结构域”)进行区分。VHH结构域特异性结合表位而无需其他抗原结合结构域(此与常规4链抗体中的VH或VL结构域相反，在该情况下表位由VL结构域与VH结构域一起识别)。VHH结构域为由单一免疫球蛋白结构域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。
术语“重链单域抗体”、“VHH结构域”、“VHH”、“VHH结构域”、“VHH抗体片段”、“VHH抗体”以及及“结构域”(“Nanobody”为Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商标)可互换使用。
例如Riechmann及Muyldermans,J.Immunol.Methods 231,25-38(1999)的图2中所示，对于骆驼科的VHH结构域所应用的氨基酸残基，根据Kabat等人给出的VH结构域的一般编号法来编号(“Sequence of proteins of immunological interest”,US PublicHealth Services,NIH Bethesda,MD,公开案第91号)。根据该编号法：
-FR1包含在位置1-30处的氨基酸残基，
-CDR1包含在位置31-35处的氨基酸残基，
-FR2包含在位置36-49处的氨基酸，
-CDR2包含在位置50-65处的氨基酸残基，
-FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，
-CDR3包含在位置95-倒数第12个氨基酸残基，且
-FR4包含在位置倒数第11个-末尾最后一个氨基酸残基。
然而应注意，如本领域中对于VH结构域及VHH结构域所公知的，各CDR中的氨基酸残基的总数可能不同，且可能不对应于由Ka bat编号指示的氨基酸残基的总数(即根据Kabat编号的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于Kabat编号所允许数目的氨基酸残基)。这意味着一般而言，根据Kabat的编号可能对应或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。
本领域中已知对VH结构域的氨基酸残基进行编号的替代方法，所述替代方法还可以类似地应用于VHH结构域。然而，除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，将参考如上所述的根据Kabat且适于VHH结构域的编号。
VHH结构域中的氨基酸残基的总数将通常在110至120范围内，常常介于112与115之间。然而应注意较小及较长序列也可适于本文所述的目的。
VHH结构域及含有其的多肽的其他结构特性及功能性质可总结如下：
VHH结构域(其已经天然“设计”以在不存在轻链可变结构域且不与轻链可变结构域相互作用的情况下与抗原功能性结合)可用作单一且相对较小的功能性抗原结合结构单元、结构域或多肽。此区分VHH结构域与常规4链抗体的VH及VL结构域，这些VH及VL结构域自身通常不适于作为单一抗原结合蛋白或免疫球蛋白单一可变结构域进行实际应用，但需要以某种形式或另一形式组合以提供功能性抗原结合单元(如以诸如Fab片段等常规抗体片段的形式；或以由与VL结构域共价连接的VH结构域组成的scFv的形式)。
由于这些独特性质，使用VHH结构域单独或作为较大多肽的一部分提供许多优于使用常规VH及VL结构域、scFv或常规抗体片段(例如Fab-或F(ab’)2-片段)的显著优势：
仅需要单一结构域以高亲和力及高选择性结合抗原，从而使得既不需要存在两个单独结构域，也不需要确保该两个结构域以适当空间构象及构型存在(例如scFv一般需要使用经特别设计的接头)；-VHH结构域可自单一基因表达且不需要翻译后折叠或修饰；-VHH结构域可容易地改造成多价及多特异性格式(格式化)；-VHH结构域高度可溶且无聚集趋势；-VHH结构域对热、pH、蛋白酶及其他变性剂或条件高度稳定，且因此可在制备、储存或运输中不使用冷冻设备，从而达成节约成本、时间及环境；-VHH结构域易于制备且相对廉价，甚至在生产所需的规模上亦如此；-VHH结构域与常规4链抗体及其抗原结合片段相比相对较小(大约15kDa或大小为常规IgG的1/10)，因此相比于常规4链抗体及其抗原结合片段，显示较高的组织渗透性且可以较高剂量给药；-VHH结构域可显示所谓腔结合性质(尤其由于与常规VH结构域相比其延长的CDR3环)，从而可到达常规4链抗体及其抗原结合片段不可到达的靶及表位。
获得结合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已公开于以下文献中：R.van derLinden et al.,Journal of Immunological Methods,240(2000)185–195；Li et al.,JBiol Chem.,287(2012)13713–13721；Deffaretal.,African Journal of BiotechnologyVol.8(12),pp.2645-2652,17June,2009和WO94/04678。
术语“抗体”或“Ab”通常是指表现出所需生物学或结合活性的任何形式的抗体。它包括但不限于人源化抗体、完全人抗体、嵌合抗体和单结构域抗体。抗体可以包含重链和轻链。重链可分为μ、δ、γ、α和ε，它们分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1，CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可以进一步分为由相对保守的区域(称为框架区(FR))间隔开的高变区(称为互补决定区(CDR))。每个VH和VL由以下顺序的3个CDR和4个FR组成：从N端到C端的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。氨基酸在各种区域或结构域中的分布遵循Kabat Sequences of Proteinsof ImmunologicalInterest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987and1991))或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人，(1989)Nature 342:878-883中的定义。抗体可以具有不同的抗体同种型，例如IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
术语“抑制结合”、“阻断结合”或“竞争相同表位”的能力是指抗体抑制两个分子(例如人PD-1和抗-PD-1抗体)的结合至任何可检测的程度的能力。在一些实施方案中，阻断两个分子之间结合的抗体将两个分子之间的结合相互作用抑制至少50％。在一些实施方案中，该抑制可以大于60％，大于70％，大于80％或大于90％。
术语IgG抗体的“高亲和力”是指针对靶抗原具有1×10-7M或更低，更优选5×10-8M或更低，甚至更优选1×10-8M或更低，甚至更优选5×10-9M或更低，和甚至更优选1×10-9M或更低的KD的抗体。
术语“载体”是指可以在其中插入多核苷酸的核酸媒介物。当载体允许插入其中的多核苷酸编码的蛋白质的表达时，该载体称为表达载体。该载体可以通过转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于质粒，噬菌体，粘粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)，细菌人工染色体(BAC)或P1衍生人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，乳头瘤病毒，乳多空病毒(如SV40)。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列，转录起始序列，增强子序列，选择元件和报道基因。另外，载体可以包含复制起点。
术语“宿主细胞”是指可以导入载体的细胞，包括但不限于原核细胞如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，真菌细胞如酵母细胞或曲霉属(Aspergillus)，昆虫细胞如S2果蝇细胞或Sf9，以及动物细胞如成纤维细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞。
术语“T细胞”包括CD4+T细胞，CD8+T细胞，T辅助1型T细胞，T辅助2型T细胞，T辅助17型T细胞和抑制性T细胞。
除此之外的其它术语为本领域人员所了解的通常含义，参考例如标准手册，如Sambrook等人,“Molecular Cloning:ALaboratory Manual”(第2版),第1-3卷,ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)；Lewin,“Genes IV”，Oxford UniversityPress,New York,(1990)；及Roitt等人,“Immunology”(第2版),Gower MedicalPublishing,London,New York(1989)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。
实施例一
本实施例公开了白细胞介素2结合分子，其能够特异性结合白细胞介素2，且包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，至少一个免疫球蛋白单一可变结构域包含CDR1、CDR2和CDR3。其中CDR1包含与SEQ ID NO:1-15中任一项中至少90％相同的氨基酸序列，CDR2包含与SEQ ID NO:16-54中任一项中至少90％相同的氨基酸序列，CDR3包含与SEQ IDNO:55-84中任一项中至少90％相同的氨基酸序列。本实施例中至少一个免疫球蛋白单一可变结构域包含选自以下表1所示的CDR1、CDR2和CDR3。
表1 白细胞介素2结合分子的CDR1、CDR2和CDR3
Figure BDA0003758136970000051
Figure BDA0003758136970000061
Figure BDA0003758136970000071
Figure BDA0003758136970000081
/>
Figure BDA0003758136970000091
其中，免疫球蛋白单一可变结构域是VHH。VHH包含SEQ ID NO:85-138中任一序列具有至少80％序列相同的氨基酸序列，如下表2所示。
表2 抗体株氨基酸
Figure BDA0003758136970000092
/>
Figure BDA0003758136970000101
实施例二
本实施例公开了实施例一的筛选生产过程，并将通过筛选得到的54株抗体进行核苷酸测序，得到核酸序列。
1、材料准备：准备如下表3所示的商业材料。
表3
Figure BDA0003758136970000102
2、免疫接种
为了在骆驼科动物中诱导针对IL2的体液免疫应答，对羊驼以1至3周间隔皮下注射5个剂量的人IL2蛋白。剂量范围是每次注射150ug到500ug。
3、血清效价检测
免疫后，通过ELISA测定抗IL2特异性抗体血清效价。对于ELISA实验，用400ng/孔重组带his标签的人IL2蛋白包被ELISA(NEST,504201)，并在4℃下孵育过夜。封闭和洗涤后，加入系列稀释的免疫前和免疫血清并在室温下孵育2小时，然后在室温下用1:2000稀释的Rabbitanti-VHH(HRP)(Genscript，A01861-200)孵育1小时，洗涤后，加入TMB显色液(索莱宝，PR1200-500ML)，并通过1M H2SO4终止反应。使用酶标仪(Tecan，SPARK 10M)读取460nm处的吸光值，如表4所示。
表4 三只羊驼IL-2血清效价检测ELISA结果
Figure BDA0003758136970000103
Figure BDA0003758136970000111
4、噬菌体文库构建
分别在最后两次注射后的6-7天收集70ml血液样品。使用Ficoll-Paque PLUS(GEHealthcare，17144002)通过密度梯度离心纯化外周血单核细胞(PBMC)，收集到约8x107个PBMC。然后从PBMC中提取总RNA并使用寡聚dT引物和随机6碱基引物，GoScript ReverseTranscription System(Promega,A5001)按照供应商的推荐逆转录成cDNA。
cDNA纯化后用作模板以使用信号肽结构域特异性引物和CH2结构域特异性引物扩增Ig重链编码基因片段库。该扩增产生约900bp(代表常规IgG)和700bp(代表缺少CH1结构域的重链IgG)的PCR片段。然后将两类重链编码基因在琼脂糖凝胶上根据大小分离，并且通过QIAquick Gel Extraction Kit凝胶提取试剂盒(Qiagen，28704)纯化仅编码重链IgG的基因。使用纯化的片段作为模板以使用框架1(FR1)和框4(FR4)特异性引物对扩增VHH库。该扩增程序在FR1的5'末端引入BamH1限制性位点并在FR4的3'末端引入Xho1限制性位点。将约300-400bp的PCR扩增的VHH基因库加载到琼脂糖凝胶上并通过QIAquick GelExtraction Kit凝胶提取试剂盒纯化。然后将纯化的片段用BamHI和XhoI切割并通过1.2XAgencourtAMPure XP beads(Qiagen，28104)纯化回收。将VHH基因片段最终连接到噬菌粒载体pComb中并电转化到大肠杆菌TG1中。转化后，将TG1细胞在2YT培养基中以200rpm振荡培养30min，然后将大肠杆菌TG1铺板于含有补充有100μg/mL Amp的固体TB培养基的平板上，并且在37℃培养过夜。第二天，将菌落刮入补充有1/3(v/v)80％甘油的液体2YT培养基中并储存在-80℃。
5、抗IL2特异性VHH片段的噬菌体展示选择
为了选到能有效结合IL2的VHH片段，采用了蛋白质淘选的方法。
对于蛋白质淘选，首先在4℃下以400rpm振荡过夜将100μg重组his标记的人IL2蛋白分别包被在5ml免疫管(Nunc，Rochester，MN，USA)中。第二天，在洗去未结合的蛋白质后，将管用5％脱脂牛奶在25℃封闭1小时。将来自免疫噬菌体文库的大约1013cfu噬菌体添加到用5％脱脂乳封闭的未包被免疫管中以消耗非特异性结合的噬菌体，然后将处理的噬菌体加入管中，并在25℃下孵育2小时。用PBST充分洗涤后，丢弃非特异性吸附的噬菌体，用0.1M三乙胺洗脱特异性结合的目标噬菌体，然后用1MTris-HCl(pH7.5)中和用于感染指数生长的TG1细胞。
将感染的TG1细胞铺在含有100μg/ml氨苄青霉素的TB琼脂平板上并在37℃培养过夜。第二天，将菌落用3ml 2YT从平板上刮下并通过加入1/3(v/v)80％甘油在-80℃下冷冻。将刮下的细菌文库接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的2YT中，并用辅助噬菌体M13Ko7在含有50μg/ml卡那霉素和1mM IPTG的2YT培养基中感染以用于噬菌体救援，用作下一轮淘选。每轮淘选相应减少包被抗原的量，以增加噬菌体的亲和力，共淘选4轮。
6、CD25阻断实验
将第四轮洗脱的phage感染HB2151细菌，37度振荡孵育1h，然后将菌液稀释后涂在含有100μg/mLAmp的固体TB培养基的平板，37度培养过夜。第二天挑取300个单克隆于培养板中，每孔加入1mlLB/AMP/1％甘油的培养基，37度220rpm培养至OD600为0.5，加入1M IPTG诱导VHH蛋白表达。将诱导后的菌液离心去掉上清，每孔加入500ul TES周质裂解液，混匀后冰上放置30min，离心后取上清进行CD25阻断实验。
将96孔板(Nunc，Rochester，MN，USA)用重组FC标记的人CD25蛋白在4℃包被过夜。封闭和洗涤后，将HB2151裂解液上清液转移新48孔板中，与IL2室温结合1h，然后将上清转移至包被的平板并在室温下孵育1小时。然后洗涤板，随后用小鼠单抗Anti-His tagAntibody(HRP)(Sino Biological，105327-MM02T-H)孵育1小时。洗涤后，加入TMB底物，用2M HCl终止反应。使用酶标仪(Tecan，SPARK10M)读取460nm处的吸光度。加入TMB显色液(索莱宝，PR1200-500ML)，并通过1M H2SO4终止反应。使用酶标仪(Tecan，SPARK 10M)读取460nm处的吸光值。其中，当对CD25阻断的OD值除以空白对照的OD值得比值小于等于0.25时，判断抗体能阻断CD25和IL2的结合。结果显示筛选的800株抗体中，有54株抗体能阻断CD25和IL2的结合，结果如表5和图1所示。
表5 抗体株ELISA阻断实验
Figure BDA0003758136970000121
/>
Figure BDA0003758136970000131
7、ELISA鉴定亲和力
阻断实验筛选后，将具有阻断效果的抗体株进行IL2亲和力的ELISA检测。IL2包被ELISA板，4度过夜孵育。
次日，将包被抗原的ELISA板，用5％milk孵育，室温封闭2h，封闭结束后用washingbuffer清洗2次，然后把具有阻断效果的抗体株上清转移100ul至ELISA板中，室温孵育1h，washing buffer清洗6次。在ELISA板中加入Rabbit anti-VHH(HRP)(Genscript，A01861-200)孵育，孵育结束后，加入TMB显色液(索莱宝，PR1200-500ML)，并通过1M H2SO4终止反应。使用酶标仪(Tecan，SPARK 10M)读取460nm处的吸光值。其中，当对IL2蛋白的OD值除以空白对照OD值的比值大于等于4时，判断抗体能结合IL2蛋白。结果如表6和图2。
表6 IL2的抗体株ELISA亲和实验
Figure BDA0003758136970000141
/>
Figure BDA0003758136970000151
8、测序
通过CD25阻断ELISA实验筛选得到的阳性大肠杆菌克隆送到生工生物工程(上海)股份有限公司，用于VHH基因的核苷酸测序。使用“单域抗体特征序列分析软件”分析测序结果。
本实施例VHH来自羊驼，也可以用美洲驼，宿主细胞是细菌细胞(大肠杆菌E.coli)，其它实施方式中也可以采用真菌细胞(例如酵母)或哺乳动物细胞。VHH可以与免疫球蛋白的Fc结构域或者荧光蛋白或者另一具有不同特异性的VHH融合。
实施例三
本实施例公开了一种免疫缀合物及药物组合物。
免疫缀合物包含治疗性部分及实施例一中的白细胞介素2结合分子。治疗性部分包括细胞毒素、生物活性蛋白质或放射性同位素。治疗性部分与白细胞介素2结合分子相缀合。
药物组合物包含实施例一中的白细胞介素2结合分子或者上述免疫缀合物，以及药学上可接受的载体。
药物组合物为预防或治疗增殖性病症药物，可能响应IL2拮抗剂的病症或病况：如治疗癌症药物，或治疗慢性病毒感染药物，或者在抑制或阻断CD25与白细胞介素2的结合药物。
实施例四
本实施例公开了一种试剂盒，包含容器，所述容器内设有实施例一的白细胞介素2结合分子。采用本实施例试剂盒，可检测病人的IL-2产生或异常表达，以为疾病的早期诊断、预后及疗效观察提供可靠依据。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.白细胞介素2结合分子，其特征在于：其能够特异性结合白细胞介素2，且包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述的免疫球蛋白单一可变结构域是VHH；所述的至少一个免疫球蛋白单一可变结构域包含CDR1、CDR2和CDR3；其中CDR1包含与SEQ ID NO:1-15中任一项中至少90％相同的氨基酸序列，CDR2包含与SEQ ID NO:16-54中任一项中至少90％相同的氨基酸序列，CDR3包含与SEQ ID NO:55-84中任一项中至少90％相同的氨基酸序列；所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3：
(1)SEQ ID:7所示的CDR1，SEQ ID:21所示的CDR2，SEQ ID:59所示的CDR3；
(2)SEQ ID:4所示的CDR1，SEQ ID:18所示的CDR2，SEQ ID:58所示的CDR3；
(3)SEQ ID:13所示的CDR1，SEQ ID:30所示的CDR2，SEQ ID:63所示的CDR3；
(4)SEQ ID:2所示的CDR1，SEQ ID:18所示的CDR2，SEQ ID:55所示的CDR3；
(5)SEQ ID:1所示的CDR1，SEQ ID:18所示的CDR2，SEQ ID:55所示的CDR3；
(6)SEQ ID:7所示的CDR1，SEQ ID:20所示的CDR2，SEQ ID:59所示的CDR3；
(7)SEQ ID:1所示的CDR1，SEQ ID:25所示的CDR2，SEQ ID:55所示的CDR3；
(8)SEQ ID:9所示的CDR1，SEQ ID:33所示的CDR2，SEQ ID:62所示的CDR3；
(9)SEQ ID:1所示的CDR1，SEQ ID:18所示的CDR2，SEQ ID:57所示的CDR3；
(10)SEQ ID:1所示的CDR1，SEQ ID:45所示的CDR2，SEQ ID:68所示的CDR3；
(11)SEQ ID:7所示的CDR1，SEQ ID:20所示的CDR2，SEQ ID:80所示的CDR3；
(12)SEQ ID:2所示的CDR1，SEQ ID:16所示的CDR2，SEQ ID:55所示的CDR3；
(13)SEQ ID:3所示的CDR1，SEQ ID:51所示的CDR2，SEQ ID:56所示的CDR3；
(14)SEQ ID:6所示的CDR1，SEQ ID:23所示的CDR2，SEQ ID:61所示的CDR3；
(15)SEQ ID:2所示的CDR1，SEQ ID:18所示的CDR2，SEQ ID:58所示的CDR3；
(16)SEQ ID:3所示的CDR1，SEQ ID:50所示的CDR2，SEQ ID:56所示的CDR3；
(17)SEQ ID:14所示的CDR1，SEQ ID:41所示的CDR2，SEQ ID:78所示的CDR3；
(18)SEQ ID:2所示的CDR1，SEQ ID:39所示的CDR2，SEQ ID:55所示的CDR3；
(19)SEQ ID:4所示的CDR1，SEQ ID:40所示的CDR2，SEQ ID:58所示的CDR3；
(20)SEQ ID:12所示的CDR1，SEQ ID:34所示的CDR2，SEQ ID:69所示的CDR3；
(21)SEQ ID:4所示的CDR1，SEQ ID:18所示的CDR2，SEQ ID:67所示的CDR3；
(22)SEQ ID:9所示的CDR1，SEQ ID:32所示的CDR2，SEQ ID:62所示的CDR3；
(23)SEQ ID:1所示的CDR1，SEQ ID:35所示的CDR2，SEQ ID:71所示的CDR3；
(24)SEQ ID:1所示的CDR1，SEQ ID:43所示的CDR2，SEQ ID:64所示的CDR3；
(25)SEQ ID:3所示的CDR1，SEQ ID:54所示的CDR2，SEQ ID:56所示的CDR3；
(26)SEQ ID:15所示的CDR1，SEQ ID:37所示的CDR2，SEQ ID:57所示的CDR3；
(27)SEQ ID:3所示的CDR1，SEQ ID:53所示的CDR2，SEQ ID:56所示的CDR3；
(28)SEQ ID:1所示的CDR1，SEQ ID:31所示的CDR2，SEQ ID:65所示的CDR3；
(29)SEQ ID:4所示的CDR1，SEQ ID:27所示的CDR2，SEQ ID:70所示的CDR3；
(30)SEQ ID:2所示的CDR1，SEQ ID:29所示的CDR2，SEQ ID:73所示的CDR3；
(31)SEQ ID:10所示的CDR1，SEQ ID:28所示的CDR2，SEQ ID:66所示的CDR3；
(32)SEQ ID:8所示的CDR1，SEQ ID:42所示的CDR2，SEQ ID:82所示的CDR3；
(33)SEQ ID:8所示的CDR1，SEQ ID:44所示的CDR2，SEQ ID:81所示的CDR3；
(34)SEQ ID:2所示的CDR1，SEQ ID:17所示的CDR2，SEQ ID:57所示的CDR3；
(35)SEQ ID:8所示的CDR1，SEQ ID:46所示的CDR2，SEQ ID:83所示的CDR3；
(36)SEQ ID:1所示的CDR1，SEQ ID:16所示的CDR2，SEQ ID:55所示的CDR3；
(37)SEQ ID:2所示的CDR1，SEQ ID:38所示的CDR2，SEQ ID:76所示的CDR3；
(38)SEQ ID:11所示的CDR1，SEQ ID:21所示的CDR2，SEQ ID:59所示的CDR3；
(39)SEQ ID:6所示的CDR1，SEQ ID:24所示的CDR2，SEQ ID:61所示的CDR3；
(40)SEQ ID:7所示的CDR1，SEQ ID:47所示的CDR2，SEQ ID:84所示的CDR3；
(41)SEQ ID:6所示的CDR1，SEQ ID:22所示的CDR2，SEQ ID:79所示的CDR3；
(42)SEQ ID:3所示的CDR1，SEQ ID:52所示的CDR2，SEQ ID:56所示的CDR3；
(43)SEQ ID:1所示的CDR1，SEQ ID:49所示的CDR2，SEQ ID:55所示的CDR3；
(44)SEQ ID:1所示的CDR1，SEQ ID:19所示的CDR2，SEQ ID:74所示的CDR3；
(45)SEQ ID:2所示的CDR1，SEQ ID:18所示的CDR2，SEQ ID:75所示的CDR3；
(46)SEQ ID:5所示的CDR1，SEQ ID:36所示的CDR2，SEQ ID:55所示的CDR3；
(47)SEQ ID:2所示的CDR1，SEQ ID:18所示的CDR2，SEQ ID:60所示的CDR3；
(48)SEQ ID:4所示的CDR1，SEQ ID:18所示的CDR2，SEQ ID:60所示的CDR3；
(49)SEQ ID:5所示的CDR1，SEQ ID:26所示的CDR2，SEQ ID:77所示的CDR3；
(50)SEQ ID:3所示的CDR1，SEQ ID:48所示的CDR2，SEQ ID:56所示的CDR3；
(51)SEQ ID:1所示的CDR1，SEQ ID:16所示的CDR2，SEQ ID:57所示的CDR3；
(52)SEQ ID:2所示的CDR1，SEQ ID:18所示的CDR2，SEQ ID:72所示的CDR3；
(53)SEQ ID:2所示的CDR1，SEQ ID:17所示的CDR2，SEQ ID:55所示的CDR3；
(54)SEQ ID:1所示的CDR1，SEQ ID:19所示的CDR2，SEQ ID:55所示的CDR3。
2.如权利要求1所述的白细胞介素2结合分子，其特征在于：所述的VHH包含与SEQ IDNO:85-138中任一序列具有至少80％序列相同的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的白细胞介素2结合分子，其中所述VHH与另一分子融合，所述另一分子包括免疫球蛋白、免疫球蛋白的Fc结构域、免疫球蛋白可变区、荧光蛋白或者具有不同特异性的VHH。
4.核酸分子，其编码权利要求1-3中任一项的白细胞介素2结合分子。
5.表达载体，其特征在于：包含与表达调控元件可操作地连接的权利要求4的核酸分子。
6.宿主细胞，其特征在于：包含权利要求4的核酸分子或权利要求5的表达载体，并能够表达所述白细胞介素2结合分子。
7.白细胞介素2结合分子的生产方法，其特征在于，包括：
a)在允许权利要求1-3任一项所述的白细胞介素2结合分子表达的条件下培养权利要求6的宿主细胞；
b)从得自步骤a)的培养物回收由所述宿主细胞表达的白细胞介素2结合分子；
c)进一步纯化和/或修饰得自步骤b)的白细胞介素2结合分子。
8.免疫缀合物，其包含与治疗性部分缀合的权利要求1-3任一项的白细胞介素2结合分子；所述治疗性部分包括细胞毒素、生物活性蛋白质或放射性同位素。
9.药物组合物，其包含权利要求1-3任一项的白细胞介素2结合分子、权利要求4的核酸分子、权利要求5的表达载体、权利要求6的宿主细胞或权利要求8的免疫缀合物，以及药学上可接受的载体。
10.试剂盒，其特征在于：包括容器，所述的容器内设有权利要求1-3任一项所述的白细胞介素2结合分子、权利要求4的核酸分子、权利要求5的表达载体、权利要求6的宿主细胞、权利要求8的免疫缀合物或权利要求9的药物组合物。
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