CN105940014A - 双特异性构造及其在治疗各种疾病中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及双特异性构造，其特异性地结合至细胞毒性T细胞，并同时结合至携带IL5R的靶细胞，并涉及核酸、载体、宿主细胞、药物组合物、及其生产方法和用途，包括该双特异性构造在治疗炎性和/或自身免疫性疾病和癌症中的用途。

Description

双特异性构造及其在治疗各种疾病中的用途
技术领域
本发明涉及双特异性构造，其特异性地结合至免疫效应细胞，并且同时结合至携带IL5R的靶细胞，并涉及核酸、载体、宿主细胞、药物组合物、及其生产方法和用途，包括该双特异性构造在治疗有嗜酸性细胞和/或嗜碱性细胞参与的疾病中的用途。
背景技术
白介素(IL)-5为同型二聚体糖蛋白，其是细胞因子的造血家族的一部分(Hamelmann等Int Arch Allergy Immunol 1999；120:8-16；Weltman等，Expert OpinInvestig Drugs 2000；9：491-6；Gauvreau等，Clin Exp Allergy 2009；39：1297-306；Kulka等Blood 2005；105:592-9)。IL-5常常通过Th2细胞与IL-3、IL-4和GM-CSF共表达。也通过嗜酸性细胞表达IL-5并且通过免疫组织化学法已经在气喘患者呼吸道的肥大细胞中观察到IL-5。IL-5表达通过一些转录因子包括GATA3而调整。白介素-5参与血液和局部组织嗜酸性细胞以及嗜碱性细胞和肥大细胞的分化、成熟、游走、发育、存活、通行和效应功能。
IL-5与一些变应性疾病包括过敏性鼻炎和哮喘的成因有关联，其中已经观察到诱导痰液、呼吸道组织和循环中的嗜酸性细胞在数量上有大的增长(Shen等，J.Immunol.170(6):3296-305)。鉴于嗜酸性细胞在过敏性哮喘中的高发生率，已经广泛推测到嗜酸性细胞在这种疾病的病理中具有重要的作用(Sanderson等，Blood 79(12):3101-9)
在大多数哺乳动物中发现嗜酸性细胞最终成为分化的粒细胞。在健康宿主内这些细胞的主体作用为通过释放细胞毒性颗粒蛋白来清除结合了抗体的寄生物(Giembycz等，Pharmacol.Rev.51(2)：213-340)。鉴于嗜酸性细胞是主要的IL5Rα表达细胞的事实，这类细胞对IL-5响应则不足为奇。事实上，IL-5是嗜酸性细胞在组织中积累的主要调控者，并能够调节成熟至存活各个阶段中嗜酸性细胞的行为(Lopez等，Exp.Med.163(5)：1085-99)。
IL-5受体(IL5R)由α和βc链组成。α亚单位对IL-5分子特异，而βc亚单位也被白介素-3(IL-3)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)所识别(Milburn等，Nature 1993；363：172-6；Dickason等，Nature 1996；379:652-5；Rossjohn等，Blood 2000；95:2491-8)。Rα亚单位的Asn196残基的糖基化似乎对IL-5的结合必不可少并是IL-5的生物活性所需要的。在I类受体超家族(血细胞生成素受体家族)中特征性地观察到：IL5Rα和βc亚单位都含有细胞外纤连蛋白-III结构域(Bazan等，Proc Natl Acad Sci USA 1990；87:6934-8；Sato等，Curr Opin Cell Biol 1994；6:174-9)。IL5Rα中的三个纤连蛋白-III结构域形成这一理念-“细胞因子识别理念”，其被认为包括可以结合IL-5或拮抗剂的某些氨基酸残基组(Ishino等，Biol Chem 2004；279:9547-56；Ishino等，J Biol Chem 2005；280：22951-61；Ishino等，Biochemistry 2006；45：1106-15)，显示了定制用于治疗性干预的特异性分子的潜力。
IL-5和IL5R驱使变应性和炎症性免疫响应表征许多疾病如哮喘、特应性皮炎、慢性阻塞性肺疾病、嗜酸性细胞性胃肠道疾病、高嗜酸性细胞综合征、变应性肉芽肿性血管炎(Churg-Strauss syndrome)和嗜酸性细胞性鼻息肉。尽管皮质类固醇疗法是这些疾病的主要治疗方法，但大量患者表现出不完全反应并遭受副作用。
肺异常粘膜嗜酸性细胞性炎症被视作哮喘的标志并已被发现与哮喘患者支气管活检中IL-5水平的升高有关联(Hamid等，J Clin Invest 1991；87:1541-6)。小鼠肺部上皮细胞中IL-5的过表达与嗜酸性炎症的加重、呼吸道高响应性(AHR)和粘液高分泌有关(Kowal等，Allergy Asthma Proc2005；26:456-62；Coffman等，Science 1989；245：308-10；Sanderson等，Blood 1992；79：3101-9；Lee等，Exp Med 1997；185：2143-56)。变应原激发下支气管粘膜中的IL-5mRNA上调(Robinson等，J Allergy Clin Immunol 1993；92：313-24)，并且IL-5的浓度与哮喘的临床特征有关(Humbert等，Am J Respir Crit Care Med 1997；156:704-8)。对小鼠的研究已表明了变应性呼吸道炎症模型中IL-5的作用。在吸入变应原的激发下，敏化的IL-5-或IL5Ra-缺乏小鼠不遭受粘膜嗜酸性细胞增多症、AHR和支气管周围纤维化(Foster等，J Exp Med 1996；183：195-201；Tanaka等，Am J Respir Cell MolBiol 2004；31:62-8；Cho等，Clin Investig 2004；113：551-60)。在变应原吸入之前用抑制性抗IL-5mAb治疗的小鼠、豚鼠和非人灵长类动物中得到相似的数据，而在IL-5转基因小鼠中变应原的吸入导致AHR和嗜酸性细胞炎症的显著加重(Tanaka等，Am J Respir Cell MolBiol 2004；31：62-8；Van Oosterhout等，Am Rev Respir Dis 1993；147：548-52；Akutsu等，Immunol Lett 1995；45:109-16；Mauser等，Am J Respir Crit Care Med1995；152:467-72)。另外，对嗜酸性细胞缺乏的小鼠的研究已验明了AHR和组织重构中嗜酸性细胞的作用(Lee等，科学(Science)2004；305:1773-6.Humbles等，科学2004；305:1776-9)，进一步表明了在过敏性粘膜炎症模型中IL-5在统筹嗜酸性细胞及相关影响方面的主要作用。
尽管嗜酸性细胞和嗜碱性细胞在其表面上表达IL5R，它们也起到IL-5的细胞来源的作用。CD34+祖细胞也可以产生IL-5，并且如果这些前体成为嗜酸性细胞或嗜碱性细胞，它们也可以表达IL5R。不表达IL5R的IL-5的其他细胞来源包括Th2细胞、肥大细胞、稳定自然杀伤(NK)T细胞和非B/非T细胞(Sakuishi等，J Immunol 2007；179:3452-62；Wang等，Clin Exp Allergy 2009；39:798-806；Fallon等，Exp Med 2006；203:1105-16；Sehmi等，JClin Investig 1997；100:2466-75；Dubucquio等，J Exp Med 1994；179:703-8；Ying等，AmJ Respir Cell Mol Biol 1995；12:477-87；Phillips等，J Leukoc Biol2003；73:165-71)。嗜酸性细胞主要与变态反应有关，释放白细胞三烯如C4、D4和E4，以及蛋白质如嗜酸性细胞阳离子蛋白(ECP)、嗜酸性细胞衍生的神经毒素(EDN)、嗜酸性细胞过氧化酶和主要碱性蛋白(MBP)以及众多细胞因子和趋化因子如IL-1-IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-16、GM-CSF，调节激活正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)、TGF-a、TGF-b、单核细胞趋化蛋白1和巨噬细胞炎症蛋白1a。
嗜碱性细胞表达一些细胞因子受体如IL2Ra、GM-CSFRa、IL3R、IL4R和IL5R(Valent等，J Allergy Clin Immunol 1994；94:1177-83；Toba等；Cytometry 1999；35:249-59)，并产生IL-4和IL-13(Dahinden等，Int Arch Allergy Immunol 1997；113:134-7)。已观察到嗜碱性细胞中介体(例如白细胞三烯)的扩增性产生伴有IL-5和GM-CSF的引发。白介素-5已被认定为促嗜碱性细胞生成素(basophilopoietin)；细胞因子刺激剂量依赖性增加HL-60细胞的组胺含量并相较于GM-CSF、IL-3或G-CSF产生更高比例的含有嗜碱性细胞的、组胺阳性的、嗜酸性细胞型群体(Denburg等，Blood.1991；77:1462-8)。与其对嗜碱性细胞中组胺含量的直接效应相比，IL-5本身并不影响组胺的释放或脱粒，而是充当这些嗜碱性细胞特征性活动的引子，尤其是在与ATP酶(ATPase)抑制剂如毒胡萝卜素相结合时(Lie等，ClinExp Allergy 2000；30:882-90；Bischoff等，J Exp Med 1990；172:1577-82)。已显示IL-5扩大了从变应性鼻炎患者的嗜碱性细胞的变应原诱导的组胺释放；相较于IL-5这一效应对于IL-3更强。类似地，已发现与IL5R表达水平最高的嗜酸性细胞相比，对于嗜碱性细胞而言，IL-3R的表达比IL5R或GM-CSFR更大(Koval等，Allergy Asthma Proc 2005；26：456-62)。
已知身体健康时，嗜酸性细胞-随后嗜酸性细胞趋化因子1梯度(gradient)-主导地迁移至胃肠道并较小程度上迁移至胸腺、脾、淋巴结和子宫(Kato等，Anat Rec 1998；252:418-25)。在疾病状态下，嗜酸性细胞可迁移至各种器官例如鼻子、肺、食道、心脏和皮肤等。尽管普遍认为嗜酸性细胞的前体成熟和分化主要发生在骨髓中，但有重要的新出现证据证明嗜酸性细胞的分化也发生在呼吸道水平(例如特应性哮喘中的呼吸道)具有变态反应的组织之内(Rosenberg等，J Allergy Clin Immunol 2007；119：1303-10)。
已设计出两种单克隆抗体来抵消IL-5(mepolizumab(Robinson，Expert RevRespir Med.2013；7:13-7)和reslizumab(Walsh,Curr Opin Mol Ther.2009；11:329-36))。两种抗体都表现出降低血液和组织嗜酸性细胞总数的能力。已开发了另一单克隆抗体，benralizumab(MEDI-563；Ghazi等,Expert Opin Biol Ther.2012；12:113-8)用以靶向IL5R并通过抗体依赖性细胞毒素来削弱嗜酸性细胞。三种单克隆抗体全都正在临床评价中。治疗上还使用了反义寡核苷酸技术靶向共同βc IL5R亚单元以抑制IL-5介导效应(TPIASM8)。治疗上也使用了小分子干扰RNA技术以抑制IL-5在动物模型中的表达。由于受损组织中强的嗜酸性细胞炎症，使得这种靶向最常关注在哮喘以及变应性肉芽肿性血管炎，并且已被用于治疗与嗜酸性细胞相关联的肠胃疾病、高嗜酸性细胞综合征(HES)、特应性皮炎(AD)和特发性肺纤维变性。
虽然在一些病情中在降低嗜酸性细胞总数方面IL-5本身的mAb靶向抑制(例如使用mepolizumab和reslizumab时)是有效的，但是临床反应一直以来并不是最理想的并且还未完全搞明白。
两个IL-5封闭抗体reslizumab和mepolizumab以及IL5R靶向抗体benralizumab通过肠道外注射被全身性给药用于哮喘的治疗。三种分子全部显示出几近完全清除掉骨髓和血液中的嗜酸性细胞。然而，它们没有一个能够完全清除肺组织或痰液中的嗜酸性细胞。然而由于嗜酸性细胞前体能够在肺中分化，因此靶向局部位置的嗜酸性细胞和嗜碱性细胞可能是重要的，以使IL-5信号的全身阻断可以不阻止嗜酸性细胞分化，尤其是在IL-5主要由局部T辅助细胞产生的时候。另外，肺残留的嗜酸性细胞已被记载足以用来诱发哮喘的发作。与此一致，还有其他的临床反应(例如减少发作频率和住院率)在全身性给药的抗体情况下不是最理想的。
在IL-5封闭抗体的全身性给药情况下对局部嗜酸性细胞的不完全耗尽存在一些可能性解释。首先，在全身给药之后肺中全长IgG的局部可用性差，由于全身性释放的肺部药物在肺中的可用性通常不高只有靶器官中所释放剂量的2-5％，即使使用小分子药物也一样(Kane等,Drug Targets,2013；12:81-87)。其次，虽然嗜酸性细胞一般需要用于分化、增殖和存活的IL-5信号，仍存在其他因素例如具有至少部分丰余功能的嗜酸性细胞趋化因子，使得即使IL-5阻滞剂的局部浓度将会足以完全抵消IL-5，这也不可能完全抑制嗜酸性细胞的分化和增殖(Foster等,J Exp Med.1996；183:195-201；Nishinakamura等,Blood.1996；88:2458-2464；Foster等,Immunol.Rev.2001；179:173-181)。再次，一定的肺残留嗜酸性细胞完全不依赖IL-5的信号转导(Foster等，J Exp Med.1996；183；195-201；Hogan等,J Immunol.1998；161:1501-1509；Foster等，TRENDS in Molecular Medicine,2002；8:162-167)。
Benralizumab(先前的MEDI-563)是人化抗IL5Ra mAb，其以相当弱的亲和性结合至IL5R(KD～1nM)的α链以阻断IL-5功能并通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性诱发嗜酸性细胞和嗜碱性细胞的凋亡。这可能提供了更有希望的作用机制，由于其直接清除嗜酸性细胞而与来自不同细胞因子的它们可能变化的依存无关。然而，与IL-5封闭抗体mepolizumab和reslizumab相似，benralizumab也是通过肠道外注射而被全身性给药。于是，肺中的局部可用性受全尺寸IgG的不良组织渗透能力的限制，这可能是临床研究中肺部嗜酸性细胞不完全清除的原因。此外，在嗜酸性细胞中IL5R表达水平可能变化，并且有可能benralizumab对IL5R相当弱的亲和性(KD～1nM)结合对NK细胞上CD16相似弱的亲和性(KD～45nM)不足以诱导细胞裂解即使是低IL5R表达的嗜酸性细胞。
为了增加上述生物疗法的局部浓度，局部给药例如吸入，给了高度注目的给药路径。但是，尽管生物药物作为全身性疗法是成功的，仍只有少数蛋白质药物(例如Exubera,Pulmozyme)，而至今还没有已得到认可的抗体或抗体基药物用于经吸入释放。经雾化释放的单克隆抗IgE抗体作为哮喘的治疗已得到临床试验。然而，比之抗IgE的全身性释放，所吸入的抗体无效(Fahy等，Am J Respir Crit Care Med.1990；160:1023-1027)。这一研究的作者提出雾化状全尺寸抗体可能不能够跨越上皮屏障接近血管空间和间质组织以抵消局部IgE。对该失败的可选解释可以是抗体在雾化之后失去其活性，因为在雾化应力下抗体频繁聚集(Mailet等，Pharm res,2008；25:1318-1326)。
有望用于各种癌症疾病的抗体基治疗方法是使用双特异性抗体特异性地溶解靶细胞的免疫效应细胞的重导。双特异性抗体识别靶细胞表面上的特殊抗原，并同时识别免疫效应细胞的活化表面分子，例如自然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T(Tc)细胞，从而杀死靶细胞。
双特异性抗体概念例如用于癌症的治疗，其中使用双特异性抗体结合至癌症细胞上的癌症抗原，并同时结合至存在于例如细胞毒性T细胞上的CD3的ε链。这样的双特异性抗体构造所熟知的例子是“blinatumomab”-以BiTE(双特异性T细胞衔接器)形式的抗体，用于治疗非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)以及急性淋巴细胞白血病(Nagorsen等，Pharmacol Ther.2012；136:334-42)。Blinatumomab由Micromet研发，同时结合至细胞毒性T细胞表面上的CD3以及癌症抗原CD19，从而将这两种细胞联接到一起并活化细胞毒性T细胞以溶解靶癌症细胞。
强效治疗的需要未得到满足的是特异性靶向嗜酸性细胞和嗜碱性细胞、适合于局部施用并具有允许有效组织渗透的分子量。特别是，用于这种治疗的分子要求是稳定的、易于制备的、对给定靶抗原是高度特异性的，并具有低免疫原性。
本发明提供了这一问题的解决方案，即对IL5R具有高亲和性的双特异性构造，其通过兔基因免疫以及对亲和性成熟的记忆性B细胞的筛选而得到，而至今该构造在现有技术中并未实现或被提出。
发明内容
本发明涉及双特异性构造，其特异性地结合至免疫效应细胞，并且同时结合至携带IL5R的靶细胞，其中该双特异性构造能够局部地给药。
因此，在第一方面，本发明涉及双特异性构造，包括至少一个第一结合半体和至少一个第二结合半体，其中所述第一结合半体特异性地结合至存在于细胞毒性效应T(Tc)细胞上的第一抗原，以及所述第二结合半体特异性地结合至存在于靶细胞表面上的IL-5受体(IL5R)，特别地其中所述靶细胞为嗜酸性细胞或嗜碱性细胞，特别地其中所述第二结合半体具有10-10M或更低、特别地低于5x10-11M的解离常数KD。
在第二方面，本发明涉及编码根据本发明的双特异性构造的一种或多种核酸。
在第三方面，本发明涉及包括根据本发明的一种或多种核酸的一种或多种载体。
在第四方面，本发明涉及包括根据本发明的一种或多种载体的一种或多种宿主细胞。
在第五方面，本发明涉及用于制备根据本发明的双特异性构造的方法，包括(i)提供根据本发明的一种或多种核酸，或根据本发明的一种或多种载体，表达所述一种或多种核酸或所述一种或多种载体并从所述表达系统收集所述双特异性构造，或者(ii)提供根据本发明的一种或多种宿主细胞，培养所述一种或多种宿主细胞；并且从细胞培养收集所述双特异性构造。
在第六方面，本发明涉及药物组合物，其包括根据本发明的双特异性构造以及药学上可接受的载体。
在第七方面，本发明涉及根据本发明的双特异性构造、或者根据本发明的药物组合物，其用于治疗嗜酸性细胞和/或嗜碱性细胞重要参与的病迹，特别地变应性或炎症疾病，特别地选自于哮喘、特应性皮炎、慢性阻塞性肺疾病、嗜酸性细胞性胃肠道疾病、高嗜酸性细胞综合征、变应性肉芽肿性血管炎(Churg-Strauss syndrome)和嗜酸性细胞性鼻息肉中的变应性或炎症疾病。
在第八方面，本发明涉及结合至CD3和IL5R的双特异性抗体片段，其具有至少55℃、特别地高于60℃、更特别地高于65℃、最特别地高于70℃的热去折叠(thermalunfolding)的中点。
在第九方面，本发明涉及结合至CD3和IL5R的双特异性抗体片段，当在单纯的盐水缓冲液中以10mg/ml的浓度在37℃培育了28天时，其表现出小于20％、特别地小于15％、更特别地小于12％、更加特别地小于10％并最特别地小于5％的单链双特异抗体(scDb)的单体含量损失。
在第十方面，本发明涉及试剂盒，其包括(i)根据本发明的双特异性构造或药物组合物，以及(ii)以下的一种或多种：(x)雾化器；(y)缓冲液或溶剂，其用于制备待雾化的根据(i)的双特异性构造的悬浮液或溶液；和/或(z)一种或多种助剂和/或工具，其用于制备待雾化的根据(i)的双特异性构造的悬浮液或溶液。
附图说明
图1示出抗CD3x抗IL5R scDb结合至Jurkat T细胞和CHO-IL5R细胞。通过流式细胞术评价以下的结合：A)构造1、B)构造2和C)构造3结合至Jurkat T细胞和CD3阴性Jurkat细胞，以及D)构造1、E)构造2和F)构造3结合至IL5R-CHO细胞以及野生型CHO细胞。构造1、构造2和构造3具有相同的抗IL5R半体和3个不同的抗CD3半体，3个不同的抗CD3半体以不同的亲和性(对于构造1为1.15x 10-8M，对于构造2为2.96x 10-8M，以及对于构造3为1.23x 10-7M)结合至CD3。
图2示出白介素-2分泌物的特异性刺激，通过经scDb交联细胞毒性T细胞与靶细胞。在CHO-IL5R或CHO细胞存在下以渐增的scDb浓度培育CD8+T细胞。培育16小时后通过酶联免疫吸附实验(ELISA)测试培养物上清夜中白介素-2的浓度。
图3示出通过抗CD3x抗IL5R scDb的人IL5R表达CHO细胞的特异性溶解。在CHO-IL5R或CHO细胞存在下以渐增的scDb浓度培育CD8+T细胞。以细胞毒性绿色染料标记靶细胞(CHO-IL5R和CHO)并在培育88小时后通过荧光强度的测定确定细胞溶解。
图4示出0天(灰色)和在37℃培育28天之后(黑色)并且浓度为1和10g/l的构造1、构造2和构造3的标准化SE-HPLC色谱图。主峰对应于scDb单体(*)，除基质峰以外，在更高的保留时间下一些样品显示出小的二聚体峰或肩峰。
图5示出对浓度为1和10g/l在37℃的构造1、构造2和构造3所观察到的单体含量的时间分辨损失。
具体实施方式
本发明提供双特异性抗体片段，用于嗜酸性细胞/嗜碱性细胞重要参与的变应性疾病和其他病情的局部治疗。该双特异性抗体片段结合至嗜酸性细胞/嗜碱性细胞上的IL5R以及结合至抗原，例如，T细胞上的CD3ε通过细胞毒性T细胞诱导嗜酸性细胞的靶向溶解。该抗体片段的小分子量允许向肺组织中的有效渗透。另外该分子的出色稳定性支持其通过雾化剂型的吸入式给药。
由此，在第一方面，本发明涉及双特异性构造，包括至少一个第一结合半体和至少一个第二结合半体，其中所述第一结合半体特异性地结合至存在于细胞毒性效应T(Tc)细胞上的第一抗原，以及所述第二结合半体特异性地结合至存在于靶细胞表面上的IL-5受体(IL5R)，特别地其中所述靶细胞为嗜酸性细胞或嗜碱性细胞，特别地其中所述第二结合半体具有10-10M或更低、特别地低于10-11M的解离常数KD。
在本发明的含义中，术语“构造”是指任意化学实体，只要其表现出所需的结合活性。由此，术语“构造”是广义上的使用并且特定地涵盖了基于蛋白质的分子，包括重组抗体及其片段，该重组抗体及其片段含有一种或多个抗体基(antibody-based)结构域或该结构域的结合片段。具体示例包括但不限于，单克隆嵌合抗体、人源化抗体、单链双特异抗体等。此外，本发明中术语“包括”的使用，例如与术语“构造”的联合使用，涵盖了“包括”和“由…组成”两者的意思。
本文所用的术语“双特异性”意在指示具有两种不同抗原特异性的构造。这意味着双特异性构造能够同时结合至至少一个抗原“A”和至少一个抗原“B”，其中A和B彼此不同。于是，同时具有两种不同抗原特异性时，本发明的双特异性构造并不必须仅具有两种结合半体，每一靶向抗原对应一种，而是还可以包括多于两种的结合半体。此外，本文所用的术语“抗原”是广义上的解释并包括被本发明双特异性构造的结合半体所结合的任意靶半体。
如本发明中所用的术语“特异”或“特异性的(地)”意在表示第一和第二结合半体能够在它们各自的靶分子之间(即，在第一和第二抗原之间)加以区分和/或区分一种或多种参考分子。从而，广义上，“特异性结合”或“特异性的(地)结合”是指第一和第二结合半体在Tc细胞表面上的第一抗原和靶细胞表面上的第二抗原之间和/或在与该第一抗原和/或该第二抗原(即IL5R)相关或不相关的其他靶分子之间加以区分的能力。
如本领域已知的特异性结合半体的结合特异性能够使用，例如表面等离子体共振(SPR)、蛋白免疫印迹法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫分析法(RIA或IRMA)、增强化学发光(ECL)和肽扫描分析法进行确定。
如果使用ELISA试验，能够通过标准显色反应进行计分，例如通过在HRP、H2O2、四甲基联苯胺系统中使用辣根过氧化物酶(HRP)连接的第二抗体。给定波长下反应容器(例如孔(well))中显色的光学密度是对结合特异性的测量。典型的背景信号(阴性反应)可以是大约0.1OD，而阳性反应的典型信号可以是大约1.0OD或更高，产生的信噪比为10:1或更高。典型地，使用约三到五个不相关的生物分子进行结合特异性的确定，例如奶粉、BSA、转铁蛋白等，而非仅使用单一的参考生物分子。
根据本发明，特别地以这样方式设计该双特异性构造使得通过Tc细胞杀死IL5R表达(IL5R-expressing)靶细胞效率高。这种有效杀死一般涉及双特异性构造有效重导Tc细胞溶解IL5R表达靶细胞的能力。本文所用的术语“有效”表示本发明的双特异性构造典型地显示出体外EC50(按实施例中所述的测定)范围为10-10000pg/ml，尤其是3000-7000pg/ml，尤其是5000-6000pg/ml，并能够通过Tc细胞引起约50％的靶细胞重导溶解(redirectedlysis)，以Tc细胞对靶细胞比率为1:1-50:1，尤其是10:1-25:1，更尤其是2:1-10:1。在此上下文中所用的术语“约”和“大约”是指所示值或范围的±10％。
此外，本发明的双特异性构造特别地能够使受刺激的以及(否则)未受刺激的Tc细胞与靶细胞以使靶细胞溶解的方式交联。这提供了优势，即为了双特异性构造发挥其期望的活性要求通过树突状细胞的共同抗原呈现或靶特异性T细胞克隆不产生。事实上，本发明的双特异性构造尤其能够在不存在其他活化信号下重导Tc细胞溶解靶细胞。更尤其是，如果双特异性构造的第一结合半体特异性地结合至CD3，特别是CD3E，为了使重导Tc细胞溶解靶细胞，通过CD28和/或IL-2的信号转导不要求。活化非靶特异性的和/或未受刺激的Tc细胞的巨大潜力被认为是本发明的双特异性构造的重要特征并且确信有助于靶细胞的有效杀死。
在某一实施方式中，所述第一结合半体特异性地结合至选自于CD3和CD28的抗原。
在某一实施方式中，所述第一结合半体特异性地结合至CD3，特别是CD3(CD3E)的ε链，更特别地CD3E的激动表位。
在本发明某一实施方式中，第一结合半体特异性地结合至CD3，更特别地CD3(CD3E)的ε链，并最特别地CD3E的激动表位。如在此所用的术语“激动表位”，是指(a)在本发明的双特异性构造结合时，可选地在同一细胞上的一些双特异性构造结合时，允许所述双特异性构造活化TCR信号转导并引发T细胞活化的表位，和/或(b)当以其自然境况(即被TCR、CD3γ链等包围)存在于Tc细胞之上时，单独由CD3的ε链的氨基酸残基组成并可接近以结合本发明的双特异性构造的表位，和/或(c)在本发明的双特异性构造结合时不引起CD3E相对于CD3γ的空间位置稳定化的表位。
在本发明另一具体实施方式中，第一结合半体不是结合至Tc细胞而是特异性地结合至补体系统(complement system)的组分例如C1q。C1q是C1酶复合物的亚单元，其活化血清补体系统。
在可替代的实施方式中，本发明还考量了第一结合半体的用途，该第一结合半体特异性地结合至Fc受体，特别地结合至Fcγ受体(FcγR)。FcγR可以是自然杀伤(NK)细胞表面上存在的FcγRIII或者存在于巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和/或树突状细胞的表面上的FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB1、FcγRIIB2和FcγRIIIB之一。
在这种实施方式中，第一结合半体特别地为Fc区或其功能性片段。在本文中，“功能性片段”是指抗体Fc区的片段，其仍能够结合至FcR，特别是FcγR，具有允许FcγR承载效应细胞，特别是巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和/或树突状细胞通过细胞毒性溶解或吞噬作用杀死靶细胞的足够的特异性和亲和性。特别是，功能性Fc片段能够竞争性抑制初始的全尺寸Fc部分结合至FcR如活化FcγRI。特别地，功能性Fc片段保留了其至少30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％或95％的对活化FcγR的亲和性。
在本发明的这种实施方式中，Fc区或其功能性片段特别地为增强Fc区或其功能性片段。在此所用的术语“增强Fc区”是指其被修饰以增强Fc受体介导的效应功能，特别是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性反应(ADCC)、补体依赖性细胞毒性反应(CDC)以及抗体介导的吞噬作用的Fc区。这可以由本领域已知的方式实现，例如通过这样的方式改变Fc区使得引起对活化受体(例如自然杀伤(NK)细胞上表达的FcγRIIIA(CD16A))的亲和性增强和/或对抑制性受体的结合力(例如FcγRIIB1/B2(CD32B))降低。
在本发明内的适当变型包括改变糖基化模式，特别是无岩藻糖基化(也称作“去岩藻糖基化”)、突变(点突变、缺失、插入)和与寡肽或多肽融合。已知用于改变糖基化模式的技术包括抗体产生细胞中的异源性β1,4-N-乙酰葡糖胺转移酶III(heterologousβ1,4-N-acetylglucosaminyltransferase III)的过表达(作为Glycart-Roche技术已知)以及抗体产生细胞中编码α-1,6岩藻糖基转移酶(FUT8)的基因敲除(来自Kyowa Hakko Kirin的Potelligent技术)。Fc部分中增强突变的具体示例包括Shields等,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001)中所描述的那些，其整体结合于本文中。
在某一实施方式中，所述构造允许通过Tc细胞有效杀伤所述靶细胞和/或其中所述Tc细胞为受刺激或未受刺激的Tc细胞。
在某一实施方式中，所述第一和第二结合半体相对于彼此以这样的方式排列以使第一结合半体识别第一抗原的分区和第二结合半体识别IL5R的分区相对于双特异性构造的中心以基本相反的方向向外伸出。
第一和第二结合半体结构上并不受限，只要它们特异性地结合至期望的第一和第二抗原。然而，第一和第二结合半体一般由一种或多种寡肽或多肽或其部分组成，或由它们形成。特别地，该第一和第二结合半体为抗体基结合半体，其通常包括至少一种抗体可变结构域或其结合片段。
在本发明的具体实施方式中，第一结合半体和/或第二结合半体为抗体基结合半体，特别是包括重链可变结构域(VH)或其结合片段的抗体基结合半体，更特别是包括重链可变结构域(VH)或其结合片段以及轻链可变结构域(VL)或其结合片段的抗体基结合半体。在此所用的术语“结合片段”是指给定结构域、区或分区的一部分，其(单独的或与其他结构域、区或其分区组合地)仍是功能性的，即能够结合至被双特异性构造识别的第一或第二抗原。
在具体实施方式中，该双特异性构造为抗体形式，其为选自由以下组成的组的抗体形式：单链双价抗体(scDb)、串联scDb(Tandab)、线性二聚scDb(LD-scDb)、环状二聚scDb(CD-scDb)、双特异性T细胞衔接器(BiTE；串联di-scFv)、二硫醚稳定化Fv片段(Brinkmann等,Proc Natl Acad Sci U S A.1993；90:7538-7542)、串联三scFv(tandem tri-scFv)、三价抗体(tri(a)body)、双特异性Fab2、二微型抗体、四价抗体(tetrabody)、scFv-Fc-scFv融合抗体、二双价抗体(di-diabody)、DVD-Ig、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合抗体，例如bsAb(scFv连接至轻链的C端)、Bs1Ab(scFv连接至轻链的N端)、Bs2Ab(scFv连接至重链的N端)、Bs3Ab(scFv连接至重链的C端)、Ts1Ab(scFv连接至轻链和重链两者的N端)、Ts2Ab(dsscFv连接至重链的C端)、和Knob-into-Holes(KiHs)(由KiH技术制备的双特异性IgGs)和DuoBodies(由Duobody技术制备的双特异性IgGs)、VH和VL结构域、每一个融合至KiH或DuoBody两个不同重链的一个C端以使形成一个功能性Fv结构域，特别适合于本文使用为单链双价抗体(scDb)，特别是双特异性单体scDb。对于讨论和介绍各种双特异性构造的综述参考例如：Chan Carter,Nature Reviews Immunology 10(2010)301-316；Schubert等,Antibodies 1(2012)2-18；Byrne等,Trends in Biotechnology 31(2013)621；Metz等,Protein Engineering Design&Selection.2012；25:571-580)。
在本发明某一实施方式中，双特异性构造的第一和第二抗体基结合半体的VH结构域包括兔重链互补决定区(CDR)嫁接至人的重链骨架(FW)区，并且双特异性构造的第一和第二抗体基结合半体的VL结构域包括兔轻链CDR嫁接至人的轻链FW区。
第一抗体基结合半体的重链和轻链CDR特别地源自兔抗体，该兔抗体通过使用人CD3全长、CD28或全长C1q的全长ε链对兔免疫所得到。使用CD3E、CD28或C1q全长链的免疫通过使用编码人CD3E、CD28或C1q全长链的质粒，或可选地使用CD3的ε链的纯化细胞外结构域，或使用CD28的纯化细胞外链，或使用纯化C1q对兔DNA免疫而适当地进行。此外，第二抗体基结合半体的重链和轻链CDR特别地源自于兔抗体，该兔抗体通过使用IL5R的纯化细胞外结构域或者使用表达全长IL5R的质粒对兔免疫而得到。
本发明的双特异性构造能够使用本领域已知的任意便利的抗体制造方法(参考例如Fischer,N.&Leger,O.,Pathobiology 74:3-14(2007)关于双特异性构造的生产；以及Hornig,N.&A.,Methods Mol.Biol.907:713-727,2012关于双特异性双价抗体和串联scFvs)来制备。本发明双特异性构造适合的制备方法的具体例子尤其进一步包括:Genmab(Labrijn等,Proc Natl Acad Sci U S A.2013Mar 26；110(13):5145-50)和Merus(de Kruif等,Biotechnol Bioeng.2010Aug 1；106(5):741-50)技术。包括功能性抗体Fc分区的双特异性抗体的制备方法在本领域中也是已知的(参见，例如Zhu等,CancerLett.86:127-134(1994))；Suresh等,Methods Enzymol.121:210-228(1986))。
这些方法通常包含单克隆抗体的生殖，例如通过使用脾细胞熔融骨髓癌细胞，该脾细胞来自已使用杂交瘤技术采用理想抗原免疫了的小鼠(参见，例如Yokoyama等,Curr.Protoc.Immunol.Chapter 2,Unit2.5,2006)，或通过重组抗体工程(库组克隆技术(repertoire cloning)或噬菌体展示技术/酵母展示技术)(参见，例如Chames&Baty,FEMSMicrobiol.Letters 189:1-8(2000))，并且包含两个不同单克隆抗体的抗原结合结构域或其片段或分区的组合，以使用已知的分子克隆技术提供双特异性构造。
本发明的双特异性构造特别地是人源化的以便减低免疫原性和/或提高稳定性。用于抗体人源化的技术是本领域的已知技术。例如，一种技术是基于将异种基因抗体的互补决定区(CDR)嫁接至人受体骨架的可变轻链VL和可变重链VH(参见，例如Jones等,Nature321:522-525(1986)；和Verhoeyen等,Science 239:1534-1536(1988))。在另一技术中，异种基因抗体的骨架朝人骨架突变。在这两种情况下，抗原结合部分的功能性保留至关重要(Kabat等,J.Immunol.147:1709-1719(1991))。
在具体实施方式中，所述双特异性scDb包括两个可变重链结构域(VH)或其片段以及两个可变轻链结构域(VL)或其片段，通过连接体L1、L2和L3以如下顺序连接：VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VLA,VHA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA,VLA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VHA,VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA,VHB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB,VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB,VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHB或VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB，特别地VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB，其中VLA和VHA结构域共同形成用于第一抗原的抗原结合位点，并且VLB和VHB共同形成用于IL5R的抗原结合位点，特别地其中连接体L1为2-10个氨基酸，特别地3-7个氨基酸，特别地5个氨基酸的肽，特别地为GGGGS肽，连接基L3为1-10个氨基酸，特别地2-7个氨基酸，特别地5个氨基酸的肽，特别地为GGGGS，以及连接体L2为10-40个氨基酸，特别地15-30个氨基酸，特别地20-25个氨基酸，特别地20个氨基酸的肽，特别地为(GGGGS)4。
在具体实施方式中，所述第一抗原为CD3，并且所述VLA和VHA结构域包括CDR区序列ID号：23-28，特别地CDR区序列ID号：29-34或者CDR区序列ID号：35-40，更特别地CDR区序列ID号：41-46，CDR区序列ID号：49-54，或者CDR区序列ID号：57-62，特别地其中所述VLA骨架区为选自序列ID号：3-7、特别地序列ID号：3的骨架区，并且其中所述VHA骨架区为序列ID号：8的骨架区。
在具体实施方式中，所述VLA结构域包括选自序列ID号为47、55和63的序列；并且所述VHA结构域包括选自序列ID号为48、56和64的序列，特别地其中VLA结构域和VHA结构域的组合为选自序列ID号47与序列ID号48、序列ID号55与序列ID号56以及序列ID号63与序列ID号64的组合。
在具体实施方式中，所述VLB和VHB结构域包括序列ID号9-14的CDR区，特别地序列ID号15-20的CDR区，特别地其中所述VLB骨架区为选自序列ID号3-7、特别地序列ID号3的骨架区，并且其中所述VHB骨架区为序列ID号8的骨架区。
在具体实施方式中，所述VLB结构域包括序列ID号21；并且所述VHB结构域包括序列ID号22。
在具体实施方式中，双特异性构造包括：(i)VLA结构域和VHA结构域的组合，该组合为选自序列ID号47与序列ID号48、序列ID号55与序列ID号56以及序列ID号63与序列ID号64的组合，以及(ii)VLB结构域和VHB结构域的组合，该组合为序列ID号21与序列ID号22的组合。
本发明的双特异性构造可以可替代地包括基于非抗体基结合(non-antibodybased binding)结构域的一种或多种结合半体。本发明双特异性构造的合适制备方法的具体示例还尤其包括，DARPin技术(Molecular Partners AG)，adnexin技术(Adnexus)，anticalin技术(Pieris)，以及Fynomer技术(Covagen AG)。
在第二方面，本发明涉及编码根据本发明的双特异性构造的一种或多种核酸。
由此，本发明涉及编码根据本发明的双特异性构造的一个核酸或多个(即多于一个)核酸。如果该双特异性构造是单链构造，例如多肽或蛋白质，则由单一核酸对双特异性构造编码。然而，如果该双特异性构造包括两个或更多个多肽，则本发明的双特异性构造也可以由两个或更多个分离的核酸编码。根据本发明的核酸分子(一个或多个)可以是任意核酸分子，特别地DNA或RNA分子，例如cDNA或mRNA。它们可以是自然出现的分子或通过基因工程或化学合成所制得的分子。它们可以是含有编码或非编码链的单链分子(single-stranded molecule)，或者双链分子(double-stranded molecule)。
本发明的核酸(一个或多个)可以通过本领域技术人员所熟知的任何合适方法所制得。本发明的核酸可以例如通过亚磷酰胺法等合成，或者可以使用特异性引物通过聚合酶链反应(PCR)制得。此外，用于向特定核苷酸序列中引入期望突变的方法例如位点定向诱变技术对于本领域技术人员来说是熟知的。
在第三方面，本发明涉及包括根据本发明的一个或多个核酸的一个或多个载体(vector)。
由此，本发明涉及包括本发明的核酸(一个或多个)的一个载体或多个载体。当包括在载体之内特别是质粒之内时，该核酸(一个或多个)特别地为DNA。本发明中所用的载体的种类不特别限制。例如，该载体可以是自主复制的载体例如质粒，或者可以是当导入宿主细胞时被整合到宿主细胞的基因组内并与染色体一起复制的载体。特别地，本发明中所用的载体是表达载体，特别是表达质粒。在表达载体中，转录所必须的元素例如启动子被有效连接至本发明的DNA核酸(一个或多个)。
在细菌细胞中有效的启动子的示例包括λ噬菌体的PR或PL启动子、大肠杆菌(Escherichia coli)的lac、trp或tac启动子等。哺乳动物启动子的示例包括SV40启动子MT-1(金属硫蛋白基因)启动子、腺病毒2主要晚期启动子等。此外，用于昆虫细胞的示例性启动子包括多角体启动子、P10启动子、杆状病毒(baculovirus)即早期基因1启动子等。而且，酵母宿主细胞的合适启动子包括源自酵母糖酵解系统基因的启动子、TP11启动子等。其他适合于不同表达系统的启动子为本领域已知的启动子
此外，必要时，本发明的DNA可以有效连接至合适的终止子，例如人生长激素终止子或TPI1ADH3真菌宿主终止子。本发明的重组载体可还具有诸如多腺苷酸化信号(例如源自SV40)、转录增强序列(例如SV40增强子)或者转译增强子序列(例如编码腺病毒VA RNA)的元素。
本发明的重组载体还通常具有能使载体在宿主细胞内复制的DNA序列，并且其用于哺乳动物细胞的示例是复制的SV40起点位。此外，本发明的重组载体还可以含有可选标记。可选标记的示例尤其包括耐药性基因例如氨比西林(ampicillin)、卡那激素(kanamycin)、四环素(tetracycline)、氯霉素(chloramphenicol)、新霉素(neomycin)以及匀霉素(hygromycin)。用于将本发明的核酸与启动子以及按需要与其他调节序列如终止子和/或分泌信号序列相连接并将这些插入合适的载体的方法是本领域技术人员所已知的方法。
在第四方面，本发明涉及包括根据本发明的一个或多个载体的一个或多个宿主细胞。
由此，本发明涉及包括根据本发明的载体(一个或多个)的一个宿主细胞或多个不相同的宿主细胞。向其导入了本发明的重组载体的该宿主细胞不特别限制并包括能够表达本发明的载体的任意原核或真核细胞。合适的宿主细胞示例包括细菌(例如，芽孢杆菌、链霉菌(Streptomyces spp.)、以及大肠杆菌(Escherichia coli))、哺乳动物细胞(例如，HEK293，HeLa,COS,BHK,CHL,和CHO细胞)、昆虫细胞(例如，杆状病毒表达系统)、酵母细胞(Saccharomyces spp.或裂殖酵母(Schizosaccharomyces spp.)，特别地酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)和克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri))以及其他真菌细胞(例如，曲霉(Aspergillus)、链孢霉(Neurospora))。特别地，该细胞为细菌细胞，特别是大肠杆菌细胞。
多个多肽链双特异性构造可在单个宿主细胞表达系统中制得，宿主细胞在该系统中产生双特异性构造的各个链并将多肽链组装成多聚体结构以形成双特异性构造，之后从该宿主细胞回收双特异性构造。可选地，所期望的双特异性构造的单独的多肽链可以在单独的表达宿主细胞中制得，分别从各自的宿主细胞回收，然后在本领域已知的允许形成多亚单元双特异性构造的条件下离体混合。
将本发明的载体导入合适的宿主细胞的方法是本领域的已知方法并包括原生质粒法、感受态细胞法(用于细菌宿主细胞)、电穿孔法、磷酸钙法、脂转染法(用于哺乳动物细胞或用于昆虫细胞/杆状病毒体系)、电穿孔法、球形体法以及醋酸锂法(用于酵母和其他真菌宿主细胞)。
在第五方面，本发明涉及用于生产根据本发明的双特异性构造的方法，包括(i)提供根据本发明的一个或多个核酸，或根据本发明的一个或多个载体，表达所述一个或多个核酸或所述一个或多个载体并从所述表达系统收集所述双特异性构造，或者(ii)提供根据本发明的一个或多个宿主细胞，培养所述一个或多个宿主细胞；并且从细胞培养收集所述双特异性构造。
因此，本发明涉及用于生产本发明的双特异性构造的方法，包括提供本发明的一个或多个宿主细胞，培养该一个或多个宿主细胞并从细胞培养收集双特异性构造。在培养步骤中，本发明的宿主细胞(一个或多个)在允许表达本发明的双特异性构造的条件下被培养在合适的培养基中。用于培养细胞的该培养基可以是适合生长宿主细胞的任意常规培养基，例如含有适当营养的基本培养基或复合培养基。可选地，本发明涉及用于制备本发明的双特异性构造的方法，包括提供根据本发明的一个或多个核酸或根据本发明的一个或多个载体，表达所述一个或多个核酸或所述一个或多个载体，特别是在离体转录/转译体系(参见例如，Yin等,MAbs 2012Mar 1；4(2))，并从该表达体系收集所述双特异性构造。
在从细胞培养中收集双特异性构造的步骤中，所制得的双特异性构造通过蛋白分离和纯化的常规方法回收，包括通过离心或过滤来分离宿主细胞与培养基，通过盐例如硫酸铵沉淀上清液或滤液中的蛋白质组分，以及通过各种色谱工序例如离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、亲和色谱法等纯化。在其中双特异性复合体形成不溶性包合体的情况下，例如当使用大肠杆菌(E.colias)宿主细胞时，该包合体可以首先在变性剂中溶解，之后按照本领域已知的工序进行复性(refolding)步骤。
在具体实施方式中，本发明的双特异性构造在大肠杆菌中被表达。在具体实施方式中，双特异性构造特别是从包含体中通过复性以功能性的形式获得。在具体实施方式中，双特异性构造为基于双特异性抗体的构造。
在第六方面，本发明涉及包括根据本发明的双特异性构造以及药学上可接受的载体(carrier)的药物组合物。
因此，本发明涉及包括根据本发明的双特异性构造以及药学上可接受的载体的药物组合物。如本文所用的术语“药学上可接受的”是指这些化合物或物质，其在声音医学判断(sound medical judgment)范围之内适合于与哺乳动物尤其是人的组织接触而没有过多毒性、刺激性、变态反应和其他问题并发症。如本文中所用的术语“载体(carrier)”涉及稀释剂、辅助剂、赋形剂或溶媒，通过其施用活性成分。本文所用的药学上可接受的载体可以是例如，无菌液或分散体。具体载体是那些适合于静脉、皮下或局部给药的那些载体，包括用于肠胃外给药的无菌含水或不含水溶液或悬浮液，如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,20th Edition(2000)所探讨那样。
药物组合物一般包括有效量的本发明的双特异性构造。在本发明中，术语“有效量”是指化合物的量足以对有利或期望的治疗结果有作用。治疗性的有效量可以以一种或多种服法、用法或剂量施用并不意图受限于给药途径或特殊制剂。并且，药物组合物可以包括一种或多种与本发明的双特异性构造共同施用的附加活性物质。另外，药物组合物可以含有一定的附加药学上可接受的物质，例如药学上可接受的赋形剂如增溶剂、表面活性剂、张力改性剂等。
此外，本发明药物组合物的剂型不受特别限制，但特别地为可吸入制剂，例如用于雾化的含水或非水溶液或分散体，或者适用于局部给药的任意其他制剂。另一特别剂型为含有在释控基质中所配制的本发明的双特异性构造的制剂。此外，药物组合物还可以包含在随时间释放该双特异性构造的植入式器件中。
在第七方面，本发明涉及根据本发明的双特异性构造，或根据本发明的药物组合物，其用于治疗嗜酸性细胞和/或嗜碱性细胞重要参与的病迹，特别地变应性或炎性疾病，特别地选自哮喘、特应性皮炎、慢性阻塞性肺疾病、嗜酸性细胞性胃肠道疾病、高嗜酸性细胞综合征、变应性肉芽肿性血管炎(Churg-Strauss syndrome)和嗜酸性细胞性鼻息肉的变应性或炎性疾病。
因此，本发明涉及本发明的双特异性构造在治疗嗜酸性细胞和/或嗜碱性细胞起重要作用的变应性疾病或其他病迹中的用途。特别地，本发明涉及这些疾病的治疗方法，包括向实验对象特别是人患者施用有效量的本发明的双特异性构造。术语“有效量”的含义如上文中所定义的。通常，有效量的本发明的双特异性构造是以上述药物组合物的形式施用。适合的给药途径包括但不限于，局部和肠道外给药，特别是吸入式、皮下注射式、静脉注射式以及脑脊髓液中注射式。给药方案不特别限制并且包括例如每天两次、每天一次、每周一次、两周一次、每月一次、每两月一次、每三个、六个或九个月一次以及每年一次或单次应用给药方案。
变应性和炎性疾病可以是哮喘、特应性皮炎、慢性阻塞性肺疾病、嗜酸性细胞性胃肠道疾病、高嗜酸性细胞综合征、变应性肉芽肿性血管炎(Churg-Strauss syndrome)和嗜酸性细胞性鼻息肉。
在具体实施方式中，所述双特异性构造通过吸入式用在特别是肺的局部应用中。在具体这样的实施方式中，局部应用采用雾化器，产生本发明双特异性构造特别是scDb构造的溶液或悬浮液的气溶胶液滴。
在具体实施方式中，该双特异性构造雾化之后保留的活性在高于雾化前活性的90％，特别地高于95％，更特别地高于98％。最特别地是，该双特异性构造雾化之后保留其全部的活性。
在具体实施方式中，该双特异性构造雾化后的单体含量损失为小于10％、特别地小于5％、特别地小于2％、并且更特别地小于1％。最特别地是，该双特异性构造雾化后没有单体含量损失(即，该双特异性构造保留其单体形式并不形成聚集体)。
在某一实施方式中，该双特异性构造雾化后表现出的降解率为小于5％、特别地小于2％、并且更特别地小于1％。最特别地是，该双特异性构造雾化后没有降解。
在第八方面，本发明涉及结合至CD3和IL5R的双特异性抗体构造，其具有至少55℃，特别是高于60℃，更特别地高于65℃，并最特别地高于70℃的热去折叠的中点。
在具体实施方式中，该双特异性抗体构造包括如上文[0064]至[0069]部分中公开的序列。
在第九方面，本发明涉及结合至CD3和IL5R的双特异性抗体片段，当在简单的盐水缓冲液中以10mg/ml的浓度在37℃培育了28天时，其表现出小于20％，特别地小于15％，更特别地小于12％，更加特别地小于10％并最特别地小于5％的单链双价抗体(scDb)的单体含量损失。
在这一方面的具体实施方式中，该双特异性抗体构造包括如上文[0064]至[0069]部分中公开的序列。
在第十方面，本发明涉及试剂盒，包括(i)根据本发明的双特异性构造或药物组合物，以及(ii)以下的一种或多种：(x)雾化器；(y)用于制备待雾化的根据(i)的双特异性构造的悬浮液或溶液的缓冲液或溶剂；和/或(z)一种或多种助剂和/或工具，用于制备待雾化的根据(i)的双特异性构造的悬浮液或溶液。
实施例
结果：
1.抗CD3x抗IL5R抗体结合至Jurkat T细胞和CHO-IL5R细胞。
Jurkat T细胞和表达IL5R的CHO细胞(CHO-IL5R)用1μg/ml和10μg/ml的scDb培育，如方法部分中所述。测试全部的scDb，检测到对表达CD3ε和IL5R的细胞系的特异性结合但没有检测到对对照细胞(control cell)系的非特异性结合。测试了与本申请中公开的双特异性构造密切相关的三个scDb 1-3，本申请中公开的双特异性构造含有相同的抗IL5R半体而抗CD3半体不同。抗CD3分区以不同的亲和性结合至重叠表位(表1)。对被测试的全部scDb来说，对CHO-IL5R细胞的结合如预期地均相似(图1)。而至Jurkat T细胞的结合随亲和性减小而降低。在最高测试浓度下对于低亲和性的结合剂构造3，没有检测到至Jurkat T细胞的结合(图1)。
2.双特异性抗CD3x IL5R scDb刺激从T细胞的IL-2分泌物的潜力
通过从人血液提纯的细胞毒性T细胞可以通过测量IL-2分泌物(参见方法)来评价结合至靶细胞的scDb诱导T细胞活化的潜力。在效应子：靶细胞的比为10:1、靶表达CHO-IL5R细胞存在下，使用CD8+细胞毒性T细胞培育不同的scDb，并在培育16小时后分析IL-2分泌物。在CHO-IL5R细胞存在下观察到IL-2分泌物的剂量依赖性刺激，而在野生型CHO细胞存在下基本没有观察到IL-2分泌物(参见图2中与本申请中公开的构造密切相关的构造1-3的数据表示)。因此，T细胞活化仅在特异性靶细胞存在下被诱导。而且，诱导IL-2分泌物的潜力与对重组产生的CD3εγ的结合亲和性有关(表1)并且与结合至T细胞的能力有关(图1)。根据亲和性分析，构造1-具有最高亲和性的结合剂，是比构造2更有潜力的IL-2分泌物的诱导剂，而对于低亲和性的scDb构造3没有观察到IL-2分泌物(图2)。
3.由于细胞毒性T细胞的特异性scDb介导的靶细胞溶解
培育88小时之后使用CellToxTM绿细胞毒性实验(参见方法)分析抗CD3x IL5RscDb介导的细胞毒性T细胞对靶细胞的特异性溶解。与T细胞活化的上述结果相似，在CHO-IL5R细胞存在下，对于构造1和构造2观察到剂量依赖性靶细胞溶解，而在野生型CHO细胞存在下没有观察到溶解(参见图3中与本申请中公开的构造密切相关的构造1-3的数据表示)。根据上述结果，高亲和性下scDb对CD3ε的结合显示出比低亲和性scDb更高的溶解潜力。对于低亲和性scDb构造3没有观察到靶细胞溶解。
方法：
用于确定双特异性抗CD3x IL5R scDb的结合动力学的SPR实验
使用MASS-1SPR仪器(Sierra Sensors)通过表面等离子体共振(SPR)测定抗CD3xIL5R scDb的结合亲和性。为了测量对CD3的亲和性，使用标准胺耦合过程在传感器芯片(SPR-2高容量亲和型传感器(Affinity Sensor High Capacity),胺(Amine),SierraSensors)上固定人异质双特异抗体的单链CD3εγ细胞外结构域(内部产生的)。将范围为90-0.1nM的scDb的三倍系列稀释液用3分钟注射至流动细胞并进行从固定在传感器芯片上的CD3εγ的蛋白质解离12分钟。每个注射周期之后，注射10mM甘氨酸-HCl(pH 2.0)两次使表面再生。对于针对IL5R的亲和性测试，通过胺耦合在传感器芯片(SPR-2高容量亲和型传感器(Affinity Sensor High Capacity),胺(Amine),Sierra Sensors)上固定对人IgGs的Fc区特异的抗体。人IL5R-Fc嵌合蛋白(Novus Biologicals)被所固定的抗体捕获。将对IL5R特异性的ScDb的三倍系列稀释液(90nM-0.1nM)注入流动细胞三分钟并且监控解离12分钟。每次注射周期之后，注射10mM甘氨酸-HCl(pH 1.5)三次使表面再生。使用一对一朗缪耳结合模型(one-to-one Langmuir binding model)借助MASS-1分析软件(Analyzer，Sierra Sensors)计算表观解离(kd)和结合(ka)率常数以及表观解离平衡常数(KD)。
特异性抗CD3x IL5R scDb对T细胞的细胞表面上表达的CD3ε和CHO细胞(CHO-IL5R细胞)的表面上表达的IL5R的结合
通过流式细胞术分析scDb对在Jurkat细胞(克隆E6-1,ATCC)，人T细胞系的细胞表面上表达的CD3ε的结合。为验证scDb对Jurkat细胞的细胞表面上存在的未知组分的非特异性结合，采用了Jurkat T细胞系(J.RT3-T3.5,ATCC)的CD3ε缺陷衍生物。使用转基因CHO-IL5R细胞(产自ZHAW)分析scDb对细胞表面上表达的IL5R的结合，并且使用野生型CHO细胞(Invitrogen)作为非特异性结合的对照。使用1μg/mL和10μg/mL的scDb培育两个细胞系1小时，并通过添加RPE标记的蛋白质L(BioVision)检测结合后的scDb，然后使用流动细胞分析仪(FACS aria III,Becton Dickinson)分析。使用对无关靶位特异的scFv作为阴性对照。为了定性评价对Jurkat和CHO-IL5R细胞的结合，对非特异性scFv以及受试scDb两者均测量反应几何平均值处信号强度的平均荧光强度(MFI)。计算在受试抗体和阴性对照抗体之间MFI的差值(ΔMFI)作为结合性测试。此外通过使受试scDb的MFI除以阴性对照scFv的MFI计算标准MFI。
双特异性抗CD3x IL5R scDb对T细胞的活化：IL-2分泌物的诱导
在靶细胞存在下，抗CD3x抗IL5R scDb诱导IL-2在CD8+细胞毒性T细胞中的表达的潜力按如下评价。根据制造商说明通过使用RosetteSepTM人CD8+T细胞富集混合物(T-cellenrichment cocktail)(STEMCELL Technologies)从人血液中新鲜分离细胞毒性T细胞。在96孔微量滴定板中，在存在10倍系列稀释scDb(100nM至0.001nM)并且效应子：靶比值为10:1下，使用CD8+细胞毒性T细胞培育CHO-IL5R细胞(10’000细胞/孔)。为验证T细胞非特异性刺激，使用野生型CHO细胞作为靶细胞。共同培育16个小时之后收集上清液来测试IL-2的释放。使用商购可得的ELISA试剂盒(BioLegend)定量IL-2的释放。使用Pro数据分析软件(分子器件(Molecular Devices))采用四参数逻辑曲线拟合法分析数据，并且从剂量响应曲线推导诱导半最大IL-2分泌物(EC50)所需要的scDb的摩尔浓度。
细胞毒性T细胞对表达CHO细胞的IL5R的scDb介导溶解
为评价双特异性抗CD3x IL5R scDb诱导靶细胞溶解的潜力，使用表达CHO细胞系的转基因IL5R(CHO-IL5R)。使用上述分离的未受刺激的人CD8+T细胞作为效应子细胞。根据制造商说明使用细胞毒性绿染料(Promega)标记靶细胞。通过CellToxTM绿细胞毒性实验(Promega)监控细胞的溶解。该实验测试了由于细胞死亡发生的膜完整性的变化。该实验使用非对称花青染料，该染料被活细胞排外从而优先染色死细胞DNA。当该染料在融合细胞中结合DNA时，它的荧光特性大幅增强。活细胞不产生荧光的明显增强。因此，由于与死细胞DNA的结合相互作用所产生的荧光信号与细胞毒性是成比例的。与上文所述类似，在96孔微量滴定板中，在存在10倍系列稀释scDb(100nM至0.001nM)并且效应子：靶比值为10:1下，使用CD8+细胞毒性T细胞培育被标记的CHO-IL5R细胞(10’000细胞/孔)。为验证不表达靶位的细胞的非特异性溶解，使用已标记的野生型CHO细胞共同培育T细胞。培育88小时之后，使用多模式微板读取仪(FlexStation 3,分子器件(Molecular Devices))分析荧光强度。使用Pro数据分析软件(分子器件(Molecular Devices))采用四参数逻辑曲线拟合法分析数据，并且从剂量响应曲线推导诱导半最大靶细胞溶解(EC50)所需要的scDb的摩尔浓度。
构造的设计和制造
核苷酸序列(参见表4和5)被从头合成并在适应载体中克隆用以表达大肠杆菌，该表达基于pET26b(+)骨架(Novagen)。将表达构造转化至大肠杆菌菌株BL12(DE3)(Novagen)中并在2YT培养基中培养这些细胞(Sambrook,J.,等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual)作为启动培养。在揺瓶中于37℃和200rpm下接种并培育表达培养。一达到1的OD600nm，则通过在0.5mM的最终浓度下加入IPTG，立即诱导蛋白质的表达。过夜表达之后，通过在4000g下离心获得细胞。为制备包含体，在IB重悬缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5,100mM NaCl,5mM EDTA,0.5％Triton X-100)中使细胞团块再次悬浮。向细胞浆中补充1mMDTT、0.1mg/mL溶菌酶、10mM亮抑蛋白酶肽、100μM PMSF和1μM胃蛋白酶抑制剂。置冰上冷却的同时采用3个周期的超声均质使细胞溶解。随后添加0.01mg/mL DNAse，并在室温下培育匀浆液20分钟。4℃和15000g下离心沉积包含体。在IB重悬缓冲液中使IBs再悬浮并在另一离心处理之前超声均质。总计实施最少3个IB重悬缓冲液清洗步骤并随后进行IB洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5，100mM NaCl，5mM EDTA)清洗2次以收获最终IB。
为使蛋白质复性，以每g的湿IB 5mL/g的比率在溶解缓冲液(100mM Tris/HCl pH8.0，6M Gdn-HCl，2mM EDTA)中使分离的IBs再悬浮。室温下培育溶解液30min，以20mM的最终浓度加入DTT并继续培育另一30min。溶解完成之后，采用4℃和21500g下离心10分钟以净化溶液。通过快速稀释至溶解蛋白在复性缓冲液(常用：100mM Tris-HCl pH 8.0,5.0MUrea,5mM半胱氨酸,1mM胱氨酸)中的最终蛋白质浓度为0.3g/L进行复性。复性反应例常培育最少14h。经4℃和8500g下离心10min净化所得蛋白质溶液。通过在Capto L树脂(GEHealthcare)上亲和层析纯化复性后的蛋白质。采用尺寸排除HPLC分析分离后的单体片段，SDS-PAGE用于纯度分析以及UV/Vis光谱法用于蛋白质含量分析。通过渗析缓冲液变为本地缓冲液(Native buffer)(50mM柠檬酸盐-磷酸盐pH 6.4,200mM NaCl)。调节蛋白质浓度至预期值并进行稳定性分析。
热去折叠
基本上按Niesen(Niesen等,Nat Protoc.2(2007)2212-21)所描述地，通过差示扫描荧光(DSF)测定受试构造的热去折叠的转变中点。在qPCR机(例如，MX3005p,安捷伦科技(Agilent Technologies))中进行DSF实验。在缓冲液(柠檬酸盐-磷酸盐pH 6.4,0.25MNaCl)中稀释样品，该缓冲液在总体积25μL中含有5x SYPRO橙的最终浓度。并在温度斜坡25-96℃的程序下分三份测量样品。采集荧光信号并使用GraphPad Prism(GraphPadSoftware Inc.)分析原始数据。表2中显示出使用与本申请所公开的构造密切相关的构造创建的展示数据。
应力稳定性研究
考虑到寡聚，在37℃下储存并经过4周的过程后，采用尺寸排除高性能液相色谱(SE-HPLC)分析蛋白质并采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析降解度。研究之前，浓缩样品至1和10g/L并测定启动时间点。通过在Shodex KW-402.5-4F(ShowaDenko)上分离样品并对所得色谱图求值来对单体含量定量。单体峰面积除以不能归属于样品基质的峰的总面积以计算蛋白质单体的相对百分比。用考马斯(Coomassie)亮蓝染色并采用SDS-PAGE分析法使用Any kD Mini-Protean TGX凝胶(Bio-Rad Laboratories)评估蛋白质的降解。使用装配有微量板(Nanoquant plate)(Tecan Group Ltd.)的Infinityreader M200Pro，采用UV-Vis光谱法在不同的时间点监控蛋白质浓度。表3中显示出使用与本申请所公开的构造密切相关的构造所创建的展示数据。
雾化期间稳定性
基于诸如振动网孔技术、射流雾化或超声波雾化的原理，使用医用雾化器对scDb进行雾化/气溶胶化，该scDb是以范围从0.01至10mg/ml渐增的浓度在水溶液中配制。对从嘴口获得的气溶胶和从器件贮液器收集的制剂残留进行进一步分析以确认它们的完整性和活性。采用SPR和ELISA测量样品的活性，采用SE-HPLC测定物化期间单体含量的损失，并且采用SDS-Page评估降解。
表1:与本申请中所公开的那些构造密切相关的抗CD3x抗IL5R scDbs的药效和生理特性。对阴性对照以及受试scDbs均测量反应几何平均值处的信号强度的平均荧光强度(MFI)以定性检测scDbs对靶细胞的结合。通过使受试scDb的MFI除以阴性对照scFv的MFI计算标准MFI。
抗IL5RxCD3E单链双价抗体
*对阴性对照MFI标准化
乘以校正因子3.1(蛋白质L的新批次)
表2:采用示差扫描荧光法对于本申请所公开的那些构造密切相关的构造测定热去折叠的转变中点
表3：持留28天后应力稳定性期间对于本申请所公开的那些构造密切相关的构造的单体损失
序列
表4：蛋白质序列表
注释:“X(....)”表示具有序列变异性的位置，其中在括号中显示了在给定位置允许的氨基酸残基
实例：“X(A/C)”表示蛋白质序列中允许两个氨基酸A和C的位置。
表5：用于不同scFv构造的可变结构域的组合

Claims (22)

1.双特异性构造，包括至少一个第一结合半体和至少一个第二结合半体，其中所述第一结合半体特异性地结合至存在于细胞毒性效应T(Tc)细胞上的第一抗原，以及所述第二结合半体特异性地结合至存在于靶细胞表面上的IL-5受体(IL5R)，特别地其中所述靶细胞为嗜酸性细胞或嗜碱性细胞，特别地其中所述第二结合半体具有10-10M或更低、特别地低于5×10-11M的平衡解离常数KD。
2.根据权利要求1所述的双特异性构造，其中所述第一结合半体特异性地结合至选自于CD3和CD28的抗原。
3.根据权利要求1或2所述的双特异性构造，其中所述第一结合半体特异性地结合至CD3，特别地结合至CD3(CD3E)的ε链，更特别地结合至CD3E的激动表位。
4.根据权利要求1至3任一项所述的双特异性构造，其中所述构造允许Tc细胞对所述靶细胞的有效杀死和/或其中所述Tc细胞为受刺激或未受刺激的Tc细胞。
5.根据权利要求1-4任一项所述的双特异性构造，其中所述第一结合半体和/或所述第二结合半体为抗体基结合半体，特别地包括重链可变结构域(VH)或其结合片段的抗体基结合半体，更特别地包括重链可变结构域(VH)或其结合片段、以及轻链可变结构域(VL)或其结合片段的抗体基结合半体。
6.根据权利要求5所述的双特异性构造，其为选自于由以下所组成的组的抗体形式：单链双价抗体(scDb)、串联scDb(Tandab)、线性二聚scDb(LD-scDb)、环状二聚scDb(CD-scDb)、双特异性T细胞衔接器(BiTE；串联di-scFv)、二硫醚稳定化Fv片段、串联三scFv、三价抗体、双特异性Fab2、二微型抗体、四价抗体、scFv-Fc-scFv融合抗体,二双价抗体、DVD-Ig、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合抗体，包括bsAb、Bs1Ab、Bs2Ab、Bs3Ab、Ts1Ab、Ts2Ab、和Knob-into-Holes(KiHs)与DuoBodies、VH和VL结构域、每一个融合至KiH或DuoBody的两个不同重链的C端以使形成功能性Fv结构域，特别地单链双价抗体(scDb)，并且更特别地双特异性单体scDb。
7.根据权利要求6所述的双特异性构造，其中所述双特异性scDb包括两个可变重链结构域(VH)或其片段以及两个可变轻链结构域(VL)或其片段，其通过连接体L1、L2和L3以如下顺序连接：VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VLA、VHA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA、VLA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VHA、VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA、VHB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB、VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB、VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHB或VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB，特别地VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB，其中VLA和VHA结构域共同形成用于第一抗原的抗原结合位点，VLB和VHB共同形成用于IL5R的抗原结合位点，特别地其中连接体L1为2-10个氨基酸、特别地5个氨基酸的肽，特别地为GGGGS肽时，连接体L3为1-10个氨基酸、特别地5个氨基酸的肽，特别地为GGGGS，以及连接体L2为10-40个氨基酸、特别地20个氨基酸的肽，特别地为(GGGGS)4。
8.根据权利要求1-7任一项所述的双特异性构造，其中所述第一抗原为CD3，并且其中所述VLA和VHA结构域包括CDR区序列ID号：23-28，特别地CDR区序列ID号：29-34或者CDR区序列ID号：35-40，更特别地CDR区序列ID号：41-46，CDR区序列ID号：49-54，或者CDR区序列ID号：57-62，特别地其中所述VLA骨架区为选自序列ID号：3-7、特别地序列ID号：3的骨架区，并且其中所述VHA骨架区为序列ID号：8的骨架区。
9.根据权利要求6所述的双特异性构造，其中所述VLA结构域包括选自序列ID号：47、55和63的序列；并且所述VHA结构域包括选自序列ID号：48、56和64的序列，特别地其中VLA结构域和VHA结构域的组合选自序列ID号：47与序列ID号：48、序列ID号：55与序列ID号：56以及序列ID号：63与序列ID号：64的组合。
10.根据权利要求1-9任一项所述的双特异性构造，其中所述VLB和VHB结构域包括序列ID号：9-14的CDR区，特别地序列ID号：15-20的CDR区，特别地其中所述VLB骨架区为选自序列ID号：3-7、特别地序列ID号：3的骨架区，并且其中所述VHB骨架区为序列ID号：8的骨架区。
11.根据权利要求10所述的双特异性构造，其中所述VLB结构域包括序列ID号：21；并且所述VHB结构域包括序列ID号：22。
12.根据权利要求7-11任一项所述的双特异性构造，其中VLA结构域和VHA结构域的组合选自序列ID号：47与序列ID号：48、序列ID号：55与序列ID号：56以及序列ID号：63与序列ID号：64的组合，并且其中VLB结构域和VHB结构域的组合为序列ID号：21与序列ID号：22的组合。
13.对根据权利要求1-12任一项所述的双特异性构造进行编码的一个或多个核酸。
14.包括根据权利要求13所述的一个或多个核酸的一个或多个载体。
15.包括根据权利要求14所述的一个或多个载体的一个或多个宿主细胞。
16.一种制备根据权利要求1-12任一项所述的双特异性构造的方法，包括(i)提供权利要求13的一个或多个核酸，或权利要求14的一个或多个载体，表达所述一个或多个核酸或所述一个或多个载体并从所述表达系统收集所述双特异性构造，或者(ii)提供权利要求15的一个或多个宿主细胞，培养所述一个或多个宿主细胞；并且从细胞培养收集所述双特异性构造。
17.药物组合物，其包括权利要求1-12任一项所述的双特异性构造以及药学上可接受的载体。
18.权利要求1-12任一项的双特异性构造，或权利要求17的药物组合物，其用于治疗嗜酸性细胞和/或嗜碱性细胞重要参与的病迹，特别地变应性或炎性疾病，特别地选自哮喘、特应性皮炎、慢性阻塞性肺疾病、嗜酸性细胞性胃肠道疾病、高嗜酸性细胞综合征、变应性肉芽肿性血管炎和嗜酸性细胞性鼻息肉的变应性或炎性疾病。
19.一种用于治疗嗜酸性细胞和/或嗜碱性细胞重要参与的病迹的方法，所述病迹特别地为变应性或炎症性疾病，特别地选自于哮喘、特应性皮炎、慢性阻塞性肺疾病、嗜酸性细胞性胃肠道疾病、高嗜酸性细胞综合征、变应性肉芽肿性血管炎和嗜酸性细胞性鼻息肉的变应性或炎性疾病，该方法包括将根据权利要求1～12任一项所述的双特异性构造、或者根据权利要求17所述的药物组合物给药。
20.结合至CD3和IL5R的双特异性抗体片段，其具有至少55℃、特别地高于60℃、更特别地高于65℃、并最特别地高于70℃的热去折叠的中点。
21.结合至CD3和IL5R的双特异性抗体片段，当在盐水缓冲液中以10mg/ml的浓度在37℃培育了28天时，其表现出小于20％，特别地小于15％，更特别地小于12％，更加特别地小于10％并最特别地小于5％的单链二价抗体(scDb)的单体含量损失。
22.一种试剂盒，包括(i)权利要求1-12任一项的双特异性构造，或权利要求17的药物组合物，以及(ii)以下的一种或多种：(x)雾化器；(y)用于制备待雾化的所述双特异性构造的悬浮液或溶液的缓冲液或溶剂；和/或(z)一种或多种助剂和/或用于制备待雾化的所述双特异性构造的悬浮液或溶液的工具。
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