JP2016539632A - 二重特異性構築物と種々の疾患の治療におけるその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞障害性Ｔ細胞と、同時にＩＬ−５Ｒ担持標的細胞に特異的に結合する二重特異性構築物、並びに核酸、ベクター、宿主細胞、医薬組成物、及びそれらの製造方法及び使用に関し、炎症及び／又は自己免疫疾患及び癌の治療における当該二重特異性構築物の使用を含む。

Description

本発明は、免疫エフェクター細胞に特異的に結合し、同時にＩＬ５Ｒ担持標的細胞に特異的に結合する二重特異性構築物と、並びに核酸と、ベクターと、宿主細胞と、医薬組成物と、及び好酸球及び／又は好塩基球が関与する疾患の治療における前記二重特異性構築物の使用を含むこれらの使用と、に関する。

インターロイキン（ＩＬ）−５は、サイトカインの造血ファミリーの一部であるホモ二量体糖タンパク質である（Hamelmann et al Int Arch Allergy Immunol 1999; 120: 8-16; Weltman et al, Expert Opin Investig Drugs 2000; 9: 491-6; Gauvreau et al, Clin Exp Allergy 2009; 39: 1297-306; Kulka et al Blood 2005; 105: 592-9）。ＩＬ−５はＴｈ２細胞により、しばしばＩＬ−３、ＩＬ−４、及びＧＭ−ＣＳＦと同時に発現される。ＩＬ−５はまた好酸球により発現され、免疫組織化学法により喘息気道の肥満細胞で観察されている。 ＩＬ−５の発現は、ＧＡＴＡ３を含むいくつかの転写因子によって調節されている。インターロイキン５は、好塩基球や肥満細胞に加えて、血液及び局所的組織好酸球の分化、成熟、遊走、成長、生存、移動、及びエフェクター機能に関与している。

ＩＬ−５は、アレルギー性鼻炎及び喘息を含むいくつかのアレルギー性??疾患の原因に関連しており、循環流、気道組織、及び誘発痰中の好酸球の数の大幅な増加が観察されている（Shen et al, J. Immunol. 170 (6): 3296-305）。アレルギー性喘息における好酸球の高い存在率を考えると、好酸球はこの疾患の病理において重要な役割を有することが広く推測されている（Sanderson et al, Blood 79 (12): 3101-9）。

好酸球はほとんどの哺乳類に存在する最終分化顆粒球である。健康な宿主においてこの細胞の主要な役割は、細胞傷害性顆粒タンパク質の放出を介する、抗体に結合した寄生体の排除である（Giembycz et al, Pharmacol. Rev. 51 (2): 213-340）。好酸球が主要なＩＬ５Ｒα発現細胞であるという事実を考えると、この細胞型がＩＬ−５に応答することは驚くべきことではない。実際ＩＬ−５は、組織中の好酸球蓄積の主要な調節因子であり、成熟から生存へのすべての段階で好酸球の挙動を調節し得る（Lopez et al, Exp. Med. 163 (5): 1085-99）。

ＩＬ−５受容体（ＩＬ５Ｒ）はα鎖とβｃ鎖から構成されている。αサブユニットはＩＬ−５分子に特異的であり、βｃサブユニットはまたインターロイキン−３（ＩＬ−３）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）により認識される（Milburn et al, Nature 1993; 363: 172-6; Dickason et al, Nature 1996; 379: 652-5; Rossjohn et al, Blood 2000; 95: 2491-8）。ＲαサブユニットのＡｓｎ１９６残基のグリコシル化は、ＩＬ−５の結合に必須であると思われ、ＩＬ−５の生物活性に必要である。ＩＬ５Ｒαとβｃサブユニットの両方とも細胞外フィブロネクチン−ＩＩＩドメインを含有し、これはクラスＩ受容体スーパーファミリー（ヘモポエチン受容体ファミリー）内で特徴的に保存されている（Bazan et al, Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 6934-8; Sato et al, Curr Opin Cell Biol 1994; 6: 174-9）。ＩＬ５Ｒα中の３つのフィブロネクチン−ＩＩＩドメインは、「サイトカイン認識モチーフ」と呼ばれるモチーフを形成し、これは、ＩＬ−５又はアンタゴニストに結合することができるいくつかの群のアミノ酸残基の特定の基を含むと考えられ（Ishino et al, Biol Chem 2004; 279: 9547-56; Ishino et al, J Biol Chem 2005; 280: 22951-61 ; Ishino et al, Biochemistry 2006; 45: 1106-15）、治療的介入のために特定の分子を調整する能力を示唆している。

ＩＬ−５及びＩＬ５Ｒは、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患、好酸球性胃腸疾患、過好酸球症候群、チャーグ・ストラウス症候群、及び好酸球性鼻ポリープのような多数の疾患を特徴付ける、アレルギー性及び炎症性免疫応答を駆動する。コルチコステロイド治療はこれらの疾患の１次治療法であるが、かなりの数の患者は不完全な反応を示し副作用を悩んでいる。

肺の異常な粘膜好酸球性炎症は喘息の特徴であると考えられ、喘息患者の気管支生検におけるＩＬ−５のレベルの上昇と関連することが見出されている（Hamid et al, J Clin Invest 1991 ; 87:1541-6）。マウスの肺上皮におけるＩＬ−５の過剰発現は、好酸球性炎症、気道過敏（ＡＨＲ）、及び粘液過剰分泌の上昇に関連している（Kowal et al, Allergy Asthma Proc 2005; 26: 456-62; Coffman et al, Science 1989; 245: 308-10; Sanderson et al, Blood 1992; 79: 3101-9; Lee et al, Exp Med 1997; 185: 2143-56）。ＩＬ−５ ｍＲＮＡはアレルゲン抗原刺激の時に気管支粘膜でアップレギュレートされ（Robinson et al, J Allergy Clin Immunol 1993;92: 313-24）、ＩＬ−５の濃度は喘息の臨床的特徴と相関している（Humbert et al, Am J Respir Crit Care Med 1997; 156: 704-8）。マウスによる研究は、アレルギー性気道炎症のモデルにおいてＩＬ−５の役割を証明した。感作されたＩＬ−５又はＩＬ５Ｒａ欠損マウスは、吸入アレルゲンによる抗原刺激挑時に、粘膜好酸球、ＡＨＲ、及び気管支周囲線維症から保護される（Foster et al, J Exp Med 1996; 183: 195-201 ; Tanaka et al, Am J Respir Cell Mol Biol 2004; 31 : 62-8; Cho et al, Clin Investig 2004; 113: 551-60）。同様のデータが、アレルゲン吸入の前に中和性抗ＩＬ−５ ｍＡｂで処理したマウス、モルモット、及び非ヒト霊長類で得られたが、ＩＬ−５トランスジェニックマウスにおけるアレルゲン吸入は、好酸球性炎症及びＡＨＲの顕著な上昇をもたらした（Tanaka et al, Am J Respir Cell Mol Biol 2004; 31 :62-8; Van Oosterhout et al, Am Rev Respir Dis 1993; 147: 548-52; Akutsu et al, Immunol Lett 1995; 45: 109-16; Mauser et al, Am J Respir Crit Care Med 1995; 152: 467-72）。さらに好酸球欠損マウスによる研究は、組織リモデリング及びＡＨＲにおける好酸球の役割を特定し（Lee et al, Science 2004; 305: 1773-6. Humbles et al, Science 2004; 305: 1776-9）、アレルギー性粘膜炎症のモデルにおける好酸球増加と関連する結果の統合における、ＩＬ−５の主要な役割をさらに支持している。

好酸球と好塩基球は、その表面にＩＬ５Ｒを発現するが、これらはまた、ＩＬ−５の細胞供給源としても機能する。ＣＤ３４＋前駆細胞もまたＩＬ−５を生成し、この前駆細胞が好酸球又は好塩基球になった場合、これもまたＩＬ５Ｒを発現することができる。ＩＬ５Ｒを発現しないＩＬ−５の他の細胞供給源は、Ｔｈ２細胞、肥満細胞、不変ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、及び非Ｂ／非Ｔ細胞が挙げられる（Sakuishi et al, J Immunol 2007; 179: 3452-62; Wang et al, Clin Exp Allergy 2009; 39:798-806; Fallon et al, Exp Med 2006; 203: 1105-16; Sehmi et al, J Clin Investig 1997; 100: 2466-75; Dubucquio et al, J Exp Med 1994; 179: 703-8; Ying et al, Am J Respir Cell Mol Biol 1995; 12: 477-87; Phillips et al, J Leukoc Biol 2003; 73: 165-71）。好酸球は主にアレルギー反応と関連し、Ｃ４、Ｄ４、及びＥ４などのロイコトリエン並びに好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）、好酸球由来神経毒（ＥＤＮ）、好酸球ペルオキシダーゼ、及び主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）などのタンパク質、及びＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６、ＧＭ−ＣＳＦなどの多数のサイトカインやケモカイン、正常T細胞に発現する遺伝子産物（ＲＡＮＴＥＳ）、ＴＧＦ−ａ、ＴＧＦ−ｂ、単球走化性タンパク質１、マクロファージ炎症性タンパク質１ａを放出する。

好塩基球は、ＩＬ２Ｒａ、ＧＭ−ＣＳＦＲａ、ＩＬ３Ｒ、ＩＬ４Ｒ、及びＩＬ５Ｒなどの多くのサイトカイン受容体を発現し（Valent et al, J Allergy Clin Immunol 1994; 94: 1177- 83; Toba et al; Cytometry 1999; 35: 249-59）、ＩＬ−４及びＩＬ−１３を産生する（Dahinden et al, Int Arch Allergy Immunol 1997; 113: 134-7）。ＩＬ−５及びＧＭ−ＣＳＦプライミングを用いて、好塩基球中のメディエーターの（例えば、ロイコトリエンなど）の産生の増強が観察されている。インターロイキン５はバソフィロポエチン（basophilopoietin）として同定されている；このサイトカインは、ＨＬ−６０細胞のヒスタミン含量の用量依存性増加を刺激し、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、又はＧ−ＣＳＦと比較して、より高比率の好塩基球含有、ヒスタミン陽性の好酸球型のコロニーを生成した（Denburg et al, Blood.1991 ; 77:1462-8）。好塩基球中のヒスタミン含量に対する直接効果とは対照的に、ＩＬ−５はヒスタミン放出又は脱顆粒自体に影響を与えまず、むしろ、特にタプシガルギン（thapsigargin）などのＡＴＰａｓｅ阻害剤と組合せた時、これらの好塩基球特徴的イベントのプライマーとして機能する（Lie et al, Clin Exp Allergy 2000; 30: 882-90; Bischoff et al, J Exp Med 1990; 172: 1577-82）。ＩＬ−５は、アレルギー性鼻炎患者の好塩基球からのアレルゲン誘発性ヒスタミン放出を増幅することが示されている；この作用は、ＩＬ−５よりもＩＬ−３で比較的大きかった。同様に、最高レベルのＩＬ５Ｒを発現した好酸球と比較して、ＩＬ５Ｒ又はＧＭ−ＣＳＦＲのいずれよりも、ＩＬ−３Ｒのより大きな発現が好塩基球上で見いだされた（Koval et al, Allergy Asthma Proc 2005; 26: 456-62）。

健康状態では、好酸球は、エオタキシン−１勾配に従って、主に消化管に移行し、より少ない程度に胸腺、脾臓、リンパ節、及び子宮にに移行することは知られている（Kato et al, Anat Rec 1998; 252: 418-25）。疾患状態では、好酸球は、特に鼻、肺、食道、心臓、及び皮膚のような種々の器官に移行することがある。好酸球前駆細胞の成熟と分化が主に骨髄で発生するという一般的な考えにもかかわらず、好酸球の分化はまた、アトピー性喘息における気道などの、気道レベルでアレルギー反応を有する組織内で起きるという多くのデータが出てきている（Rosenberg et al, J Allergy Clin Immunol 2007; 119: 1303-10）。

ＩＬ−５を中和するために２つのモノクローナル抗体が設計されている［メポリズマブ（mepolizumab）（Robinson, Expert Rev Respir Med. 2013; 7:13-7）及びレスリズマブ（reslizumab）（Walsh, Curr Opin Mol Ther. 2009; 11: 329-36）］。いずれの抗体も、血液及び組織好酸球の数を減少させる能力を証明した。１つの追加のモノクローナル抗体、ベンラリズマブ（benralizumab）（MEDI-563; Ghazi et al, Expert Opin Biol Ther. 2012; 12: 113-8）が、ＩＬ５Ｒを標的とし、抗体依存性細胞傷害を介して好酸球増加を低減させるために開発された。すべての３つのモノクローナル抗体は臨床評価中である。ＩＬ−５により仲介される作用（ＴＰＩ ＡＳＭ８）を阻害するために、共通のβｃ ＩＬ５Ｒサブユニットを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド技術が治療的に使用されている。小干渉ＲＮＡ技術も、動物モデルにおいてＩＬ−５の発現を阻害するために治療的に使用されている。このような標的化は、患部組織の強い好酸球性炎症のために、喘息並びにチャーグ・ストラウス症候群に最も一般的に注目しており、そしてまた、好酸球関連消化管疾患、超好酸球増多症候群（ＨＥＳ）、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）、及び特発性肺線維症を治療するために使用されている。

ＩＬ−５自体のｍＡｂ標的化阻害（例えば、メポリズマブ及びレスリズマブを用いる）は、いくつかの疾患状態で好酸球数を減少させるのに有効であるが、臨床反応は一貫して最適ではなく、完全には理解されていない。

２つのＩＬ−５阻止抗体（レスリズマブ及びメポリズマブ）並びにＩＬ５Ｒ標的化抗体（ベンラリズマブ）は、喘息の治療のために非経口的注射により全身投与される。３つのすべての分子は、骨髄及び血液中の好酸球のほぼ完全な除去を示した。しかし、これらのいずれも、肺組織又は痰中の好酸球を完全に除去することができなかった。しかし、好酸球前駆体は肺で分化することができ、従って、特にＩＬ−５は主に局所的Ｔヘルパー細胞により産生され、ＩＬ−５シグナル伝達の全身性遮断が好酸球の分化を妨害しないため、局所部位で好酸球及び好塩基球を標的化することが非常に重要かも知れない。さらに、肺に常在する好酸球は、喘息増悪を誘発するのに十分であることが記載されている。これに伴って、全身投与された抗体では、他の臨床応答（例えば、増悪の頻度と入院率の低減）も最適ではなかった。

ＩＬ−５阻止抗体の全身投与時の局所的好酸球の不完全な枯渇について、いくつかの説明が可能である。まず、全身的に送達される肺の薬剤の肺における利用率が、一般に、たとえ小分子薬剤を用いても標的組織中の送達された用量のわずかに２〜５％と低いため、全身投与後の肺における完全長ＩｇＧの局所的利用率が低い（Kane et al., Drug Targets, 2013; 12: 81-87）。第２に、好酸球は一般に分化、増殖、及び生存のためにＩＬ−５シグナルを必要とするが、少なくとも部分的に重複する機能を有するエオタキシンのような他の要因が存在し、従ってＩＬ−５ブロッカーの局所濃度がＩＬ−５を完全に中和するのに充分であっても、これは好酸球の分化と増殖を完全に阻害しないことがある（Foster et al., J Exp Med.1996; 183: 195-201 ; Nishinakamura et al., Blood.1996; 88: 2458-2464; Foster et al., Immunol. Rev.2001 ; 179: 173-181）。第３に、いくつかの肺常在好酸球は、ＩＬ−５シグナル伝達からは完全に独立している（Foster et al., J Exp Med. 1996; 183; 195-201 ; Hogan et al., J Immunol. 1998; 161: 1501-1509; Foster et al., TRENDS in Molecular Medicine, 2002; 8: 162-167）。

ベンラリズマブ（かってはＭＥＤＩ−５６３）はヒト化抗ＩＬ５Ｒａ ｍＡｂであり、これは、弱い親和性（ＫＤ約１ｎＭ）でＩＬ５Ｒのアルファ鎖に結合し、ＩＬ−５機能を阻止し、抗体依存性細胞障害を介して好酸球及び好塩基球のアポトーシスを誘導する。これは、種々のサイトカインへの依存性の変動に無関係に好酸球を直接排除するため、より有望な作用機序となり得る。しかし、ＩＬ−５ブロッキング抗体メポリズマブ及びレスリズマブと同様に、ベンラリズマブは非経口注射により全身投与される。このように、肺における局所的利用率は、フルサイズのＩｇＧの低い組織浸透能力によって制限され、これが臨床研究における肺好酸球の不完全な除去の原因かもしれない。さらに、好酸球中のＩＬ５Ｒ発現レベルは変動することがあり、これは、ＩＬ５Ｒに対するベンラリズマブの比較的弱い親和性（ＫＤ約１ｎＭ）がＮＫ細胞上のＣＤ１６に対する同様に弱い親和性（ＫＤ約４５ｎＭ）と組み合わさって、低いＩＬ５Ｒ発現で好酸球中の溶解を誘導するのにも不十分である可能性がある。

上記バイオ治療薬の局所濃度を増加させるために、吸入のような局所投与は極めて魅力的な投与経路を提供する。しかし、全身療法としての生物学的薬剤の成功にもかかわらず、吸入による投与のために承認されているのは、これまでわずか数個のタンパク質薬剤（例えばエクスベラ（Exubera）、プルモザイム（Pulmozyme））であり、抗体又は抗体ベースの薬物は承認されていない。噴霧により投与されるモノクローナル抗ＩｇＥ抗体は、喘息の治療薬として臨床的に試験されていた。しかし抗ＩｇＥの全身投与とは対照的に、吸入された抗体は有効ではなかった（Fahy et al. Am J Respir Crit Care Med.1990; 160: 1023-1027）。この研究の著者らは、噴霧されたフルサイズの抗体が、局所的ＩｇＥを中和するために、上皮バリア血管領域を横断して血管スペース及び間質組織にアクセスし、そして局所的ＩｇＥを中和することができないことを示唆している。この不成功の別の説明は、噴霧のストレス時に抗体が頻繁に凝集するため、抗体が噴霧後にその活性を保持できなかったということであろう（Mailet et al, Pharm res, 2008; 25: 1318-1326）。

様々な癌疾患の抗体ベースの治療のための有望な手法は、二重特異性抗体を用いて特異的に標的細胞を溶解するように免疫エフェクター細胞の方向を変えることである。この二重特異性抗体は、標的細胞の表面上の特定の抗原を、及び同時にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は細胞傷害性Ｔ（Ｔｃ）細胞などの免疫エフェクター細胞の活性化表面分子を認識して、標的細胞を死滅させる。

二重特異性抗体の概念は、例えば癌細胞上の癌抗原及び同時に例えば細胞障害性Ｔｃ上に提示されているＣＤ３のイプシロン鎖に結合する二重特異的抗体が使用される癌治療で使用される。このような二重特異性抗体構築物のよく知られた例は、非ホジキンリンパ腫及び急性リンパ芽球性白血病の治療のための、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ）形式の抗体である「ブリナツモマブ（blinatumomab）」である（Nagorsen et al, Pharmacol Ther. 2012; 136: 334-42）。ブリナツモマブは、Micrometによって開発され、癌抗原ＣＤ１９並びに細胞傷害性Ｔ細胞の表面上のＣＤ３に同時に結合し、こうしてこれらの２つの細胞型を一緒に結合し、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化して標的癌細胞を溶解する。

好酸球及び好塩基球を特異的に標的とし、局所適用に適し、効率的な組織浸透を可能にする分子量を有する、強力な治療薬に対する満たされていないニーズがある。特に、安定であり、製造が容易であり、特定の標的抗原に対する特異性が高く、低い免疫原性を有する、そのような治療に使用される分子が要求される。

本発明、すなわちウサギの遺伝子免疫と親和性成熟したメモリーＢ細胞のスクリーニングによって得られたＩＬ５Ｒに対する親和性が高い二重特異的構築物、により提供されるこの問題の解決策は、これまでに先行技術により達成も示唆もされていない。

本発明は、免疫エフェクター細胞に特異的に結合し、同時にＩＬ５Ｒ担持標的細胞に特異的に結合する二重特異性構築物であって、局所投与することができる、前記二重特異性構築物に関する。

すなわち第一の態様において、本発明は、少なくとも１つの第１結合部分と少なくとも１つの第２結合部分とを含む二重特異性構築物であって、前記第１結合部分が、細胞傷害性エフェクターＴ（Ｔｃ）細胞上に存在する第一の抗原に特異的に結合し、前記第２結合部分が、標的細胞の表面に存在するＩＬ−５受容体（ＩＬ５Ｒ）に特異的に結合し、特に前記標的細胞が好酸球又は好塩基球細胞であり、特に前記第２結合部分が、１０^-10Ｍ以下、特に５×１０^-11Ｍ未満の平衡解離定数Ｋ_Dを有する、二重特異性構築物に関する。

第２の態様において本発明は、本発明に係る前記二重特異性構築物をコードする１つの若しくは複数の核酸に関する。

第３の態様において本発明は、本発明に係る前記１つの若しくは複数の核酸を含む１つの若しくは複数のベクターに関する。

第４の態様において本発明は、本発明に係る前記１つの若しくは複数のベクターを含む１つの若しくは複数の宿主細胞に関する。

第５の態様において本発明は、本発明に係る前記二重特異性構築物を産生するための方法であって、（ｉ）本発明に係る１つの若しくは複数の核酸、又は本発明に係る１つの若しくは複数のベクターを提供し、前記１つの若しくは複数の核酸、又は前記１つの若しくは複数のベクターを発現させ、発現系から前記二重特異性構築物を収集する工程、又は（ｉｉ）本発明に係る１つの若しくは複数の宿主細胞を提供し、前記１つの若しくは複数の宿主細胞を培養し、そして細胞培養物から前記二重特異性構築物を収集する工程、を含む方法に関する。

第６の態様において本発明は、本発明に係る前記二重特異性構築物と、医薬的に許容し得る担体と、を含む医薬組成物に関する。

第７の態様において本発明は、本発明に係る二重特異性構築物、又は本発明に係る前記医薬組成物であって、好酸球及び／又は好塩基球が決定的に重要に関与する適応症、特にアレルギー性又は炎症性疾患、特に喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患、好酸球性胃腸疾患、過好酸球症候群、チャーグ・ストラウス症候群、及び好酸球性鼻ポリープ症から選択されるアレルギー性又は炎症性疾患、の治療に使用される、前記二重特異性構築物又は前記医薬組成物に関する。

第８の態様において本発明は、ＣＤ３及びＩＬ５Ｒに結合する、少なくとも５５℃、詳しくは６０℃超、さらに詳しくは６５℃超、最も詳しくは７０℃超の熱展開の中点を有する二重特異性抗体断片に関する。

第９の態様において本発明は、単純な食塩水緩衝液中で１０ｍｇ／ｍｌの濃度で３７℃で２８日間インキュベートした時、１本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）のモノマー含量が、２０％未満、詳しくは１５％未満、さらに詳しくは１２％未満、さらに詳しくは１０％未満、最も詳しくは５％未満の消失を示す、ＣＤ３及びＩＬ５Ｒに結合する二重特異性抗体断片に関する。

第１０の態様において本発明は、（ｉ）本発明に係る二重特異性構築物又は医薬組成物と、（ｉｉ）１種以上の（ｘ）ネブライザー；（ｙ）噴霧すべき（ｉ）の二重特異性構築物の懸濁液又は溶液を調製するための緩衝液又は溶媒；及び／又は（ｚ）噴霧すべき（ｉ）の二重特異性構築物の懸濁液又は溶液を調製するための１種以上の補助試薬及び／又は手段と、を含むキットに関する。

図１は、ジャーカット（Jurkat）Ｔ細胞及びＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞への抗ＣＤ３×抗ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂの結合を示す。ジャーカットＴ細胞及びＣＤ３陰性ジャーカット細胞への、Ａ）構築物１、Ｂ）構築物２、及びＣ）構築物３の結合、及びＩＬ５Ｒ−ＣＨＯ細胞並びに野生型ＣＨＯ細胞への、Ｄ）構築物１、Ｅ）構築物２、及びＦ）構築物３の結合は、フローサイトメトリーにより評価された。構築物１、構築物２、及び構築物３は同じ抗ＩＬ５Ｒ部分を有するが、異なる親和性（構築物１について１．１５×１０^-8Ｍ、構築物２について２．９６×１０^-8Ｍ、及び構築物３について１．２３×１０^-7Ｍ）でＣＤ３に結合する３つの異なる抗ＣＤ３部分を有する。 図１は、ジャーカット（Jurkat）Ｔ細胞及びＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞への抗ＣＤ３×抗ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂの結合を示す。ジャーカットＴ細胞及びＣＤ３陰性ジャーカット細胞への、Ａ）構築物１、Ｂ）構築物２、及びＣ）構築物３の結合、及びＩＬ５Ｒ−ＣＨＯ細胞並びに野生型ＣＨＯ細胞への、Ｄ）構築物１、Ｅ）構築物２、及びＦ）構築物３の結合は、フローサイトメトリーにより評価された。構築物１、構築物２、及び構築物３は同じ抗ＩＬ５Ｒ部分を有するが、異なる親和性（構築物１について１．１５×１０^-8Ｍ、構築物２について２．９６×１０^-8Ｍ、及び構築物３について１．２３×１０^-7Ｍ）でＣＤ３に結合する３つの異なる抗ＣＤ３部分を有する。

図２は、ｓｃＤｂによる細胞障害性Ｔ細胞と標的細胞との架橋による、インターロイキン−２分泌の特異的刺激を示す。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ又はＣＨＯ細胞の存在下で、増加する濃度のｓｃＤｂとインキュベートされた。１８時間インキュベーション後に、培養上清中のインターロイキン−２濃度が、ＥＬＩＳＡにより測定された。

図３は、抗ＣＤ３×抗ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂによるヒトＩＬ５Ｒ発現ＣＨＯ細胞の特異的溶解を示す。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ又はＣＨＯ細胞の存在下で、増加する濃度のｓｃＤｂとインキュベートされた。標的細胞（ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ及びＣＨＯ）はcell tox green dyeで標識され、８８時間インキュベーション後、蛍光強度の測定することにより、細胞溶解が測定された。

図４は、１ｇ／ｌ及び１０ｇ／ｌの構築物１、構築物２、及び構築物３の、０日目（灰色）と３７℃で２８日間インキュベーション後（黒）の、標準化したＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。主ピークはｓｃＤｂモノマー（^*）に対応する。高保持時間におけるマトリックスピークに加えて、一部の試料は小さい二量体ピーク又はショルダーを示す。

図５は、１ｇ／ｌ及び１０ｇ／ｌの構築物１、構築物２、及び構築物３について３７℃で観察されるモノマー含量の時間分解的消失を示す。

本発明は、好酸球／好塩基球の非常に重要な関与を有するアレルギー性疾患及び他の適応症の局所治療法のための二重特異性抗体断片を提供する。好酸球／好塩基球上のＩＬ５Ｒへの、及び例えばＴ細胞上のＣＤ３Ｅなどの抗原への、二重特異性抗体断片の結合は、細胞障害性Ｔ細胞による好酸球の標的化溶解を誘導する。抗体断片の低分子量は、肺組織への効率的浸透を可能にする。さらにこの分子の顕著な安定性は、噴霧製剤の吸入による投与を支持する。

すなわち第1の態様において本発明は、少なくとも１つの第１結合部分と少なくとも１つの第２結合部分とを含む二重特異性構築物であって、前記第１結合部分が、細胞傷害性エフェクターＴ（Ｔｃ）細胞上に存在する第一の抗原に特異的に結合し、前記第２結合部分が、標的細胞の表面に存在するＩＬ−５受容体（ＩＬ５Ｒ）に特異的に結合し、特に前記標的細胞が好酸球又は好塩基球細胞であり、特に前記第２結合部分が、１０^-10Ｍ以下、特に５×１０^-11Ｍ未満の平衡解離定数Ｋ_Dを有する、二重特異性構築物に関する。

本発明の意味内で用語「構築物」は、所望の結合活性を示す限り任意の化学的実体を指す。従って用語「構築物」は最も広い意味で用いられ、特に、１つ以上の抗体ベースのドメイン又はその結合断片を含む組換え抗体及びその断片を含む、タンパク質ベースの分子をカバーする。具体的な例としては、特に限定されないが、モノクローナルキメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖ダイアボディなどが挙げられる。さらに例えば用語「構築物」とともに本発明で使用される用語「含む」は、「含む」及び「からなる」の両方を包含する。

本明細書において用語「二重特異性」は、２つの異なる抗原特異性を有する構築物を指すことを意図する。これは、二重特異性構築物が少なくとも１種の抗原「Ａ」と少なくとも１種の抗原「Ｂ」」（ＡとＢは同じではない）に同時に結合することができることを意味する。すなわち、本発明の二重特異性構築物は２つの異なる抗原特異性を有するが、必ずしも２つのみの結合部分（各標的化抗原について１つ）のみを有するのではなく、３つ以上の結合部分を含むこともできる。さらに本明細書において用語「抗原」は広義に理解され、本発明の二重特異性構築物の結合部分により結合される任意の標的部分を含む。

本明細書において用語「特異的」又は「特異的に」は、第１及び第２結合部分が、それらの各標的分子（すなわち、第１及び第２の抗原）、及び／又は１種以上の参照分子を区別することができることを意味することが意図される。すなわち、その最も広い意味で「特異的結合」又は「特異的に結合する」は、Ｔｃ細胞の表面の第１の抗原と、標的細胞の表面の第２の抗原とを区別するか、及び／又は第１の抗原及び／又は第２の抗原（すなわちＩＬ５Ｒ）に関連するか又は関連しない他の標的分子間を区別する、第１及び第２結合部分の能力を指す。

特異的結合部分の結合特異性は、当該分野で公知のように、例えば表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ又はＩＲＭＡ）、増強化学発光（ＥＣＬ）、及びペプチドスキャン分析を使用して測定することができる。

ＥＬＩＳＡアッセイを使用する場合、スコア化は、標準発色水素を用いて、例えばＨＲＰ、Ｈ２０２、テトラメチルベンジジン系で西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が結合した第２抗体を使用して行うことができる。所定の波長での反応容器（例えば、ウェル）中の発色の光学濃度は、結合特異性の尺度である。典型的なバックグランドシグナル（陰性反応）は約１．０ ＯＤであり、一方、陽性反応の典型的なシグナルは約１．０ ＯＤ以上とすることができ、１０：１以上のシグナル対ノイズ比が得られる。典型的には、結合特異性の測定は、単一の基準生体分子を使用するよりも、例えば、粉乳、ＢＳＡ、トランスフェリン等の約３〜５個の関連の無い生体分子のセットを用いて行われる。

本発明において二重特異性構築物は、特にＴｃ細胞によるＩＬ５Ｒ発現標的細胞の死滅が極めて効率的であるように設計される。このような効率的死滅は、一般にＩＬ５Ｒ発現標的細胞を溶解するようにＴｃ細胞を有効に方向変えする二重特異性構築物の能力を含む。本明細書において用語「効率的」は、本発明の二重特異性構築物が、典型的には１０〜１０，０００ｐｇ／ｍｌ、詳しくは３，０００〜７，０００ｐｇ／ｍｌ、詳しくは５，０００〜６０００ｐｇ／ｍｌの範囲のインビトロＥＣ₅₀（実施例に記載のように測定される）を示し、Ｔｃ細胞対標的細胞の比率が１：１〜５０：１、詳しくは１０：１〜２５：１、さらに詳しくは２：１〜１０：１の比率で、Ｔｃ細胞を介して標的細胞の約５０％の方向変え溶解を誘導することができることを意味する。上記した及び以後の本明細書において、用語「約（about）」及び「約（approximaely）」は、記載された値又は範囲の±１０％を指す。

さらに、本発明の二重特異性構築物は、特に標的細胞が溶解されるような方法で、刺激されたＴｃ細胞並びに（そうでない場合）刺激されていないＴｃ細胞と標的細胞を架橋させることができる。これは、二重特異性構築物がその所望の活性を示すために、樹状細胞による標的特異的Ｔ細胞クローンの生成又は共通抗原提示が必要とされないという利点を与える。実際、本発明の二重特異性構築物は、他の活性化シグナルの非存在下で、特に標的細胞を溶解するようにＴｃ細胞を方向変えすることができる。さらに詳しくは、二重特異性構築物の第１結合部分がＣＤ３、特にＣＤ３Ｅに特異的に結合する場合、標的細胞を溶解するようにＴｃ細胞を方向変えするために、ＣＤ２８及び／又はＩＬ−２を介するシグナル伝達は必要とされない。非標的特異的及び／又は非刺激Ｔｃ細胞を活性化する高い能力は、本発明の二重特異性構築物の重要な特性であると考えられ、標的細胞の効率的死滅に寄与すると考えられる。

具体的な実施態様において、前記第１結合部分は、ＣＤ３及びＣＤ２８から選択される抗原に特異的に結合する。

具体的な実施態様において、前記第１結合部分は、ＣＤ３に、詳しくはＣＤ３のイプシロン鎖（ＣＤ３Ｅ）に、さらに詳しくはＣＤ３Ｅのアゴニストエピトープに特異的に結合する。

本発明の具体的な実施態様において、前記第１結合部分は、ＣＤ３に、より詳しくはＣＤ３のイプシロン鎖（ＣＤ３Ｅ）に、最も詳しくはＣＤ３Ｅのアゴニストエピトープに特異的に結合する。本明細書において用語「アゴニストエピトープ」は、（ａ）本発明の二重特異性構築物の結合により、任意に同じ細胞上でいくつかの二重特異性構築物の結合により、二重特異性構築物がＴＣＲシグナル伝達を活性化しＴ細胞活性化を誘導することを可能にするエピトープ、及び／又は（ｂ）ＣＤ３のイプシロン鎖のアミノ酸残基からのみなるエピトープで、天然の状況でＴｃ細胞上に提示される（すなわち、ＴＣＲ、ＣＤ３γ鎖などにより囲まれている）時、本発明の二重特異性構築物による結合のためにアクセスすることができるエピトープ、及び／又は（ｃ）本発明の二重特異性構築物の結合により、ＣＤ３γと比較してＣＤ３Ｅの空間的位置の安定化につながらないエピトープ、を意味する。

本発明の別の具体的な実施態様において、Ｔｃ細胞の結合の代わりに、第１結合部分は、補体系の部分、例えばＣ１ｑに特異的に結合する。Ｃ１ｑは、血清補体系を活性化するＣ１酵素複合体のサブユニットである。

別の実施態様において本発明はまた、Ｆｃ受容体、具体的にはＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に特異的に結合する第１結合部分の使用を企図する。ＦｃγＲは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面に存在するＦｃγＲIII、又はマクロファージ、単球、好中球、及び/又は樹状細胞の表面に存在するＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIＡ、ＦｃγＲIIＢ１、ＦｃγＲIIＢ２、及びＦｃγＲIIIＢの１つでもよい。

このような実施態様において、第１結合部分は特にＦｃ領域又はその機能性断片である。本文脈において「機能性断片」は、充分な特異性と親和性で、ＦｃＲ特にＦｃγＲに結合して、ＦｃγＲ担持エフェクター細胞、具体的にはマクロファージ、単球、好中球、及び／又は樹状細胞が、細胞障害性溶解により又は食作用により標的細胞を死滅させることを可能にすることができる、抗体Ｆｃ領域の断片を指す。特に機能性Ｆｃ断片は、活性化ＦｃγＲＩなどのＦｃＲへの元々の完全長Ｆｃ部分の結合を競合的に阻害することができる。特に機能性Ｆｃ断片は、活性化ＦｃγＲへのその親和性の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％を保持する。

かかる本発明の実施態様内で、Ｆｃ領域又はその機能性断片は、特に強化されたＦｃ領域又はその機能性断片である。本明細書において用語「強化されたＦｃ領域」は、Ｆｃ受容体仲介エフェクター機能、特に抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、及び抗体仲介食作用を強化するように修飾されたＦｃ領域を指す。これは当該分野で公知のように行うことができ、例えば活性化受容体（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現されるＦｃγＲIIIＡ（ＣＤ１６Ａ））に対する親和性の上昇、及び／又は阻害性受容体（例えば、ＦｃγＲIIＢ１／Ｂ２（ＣＤ３２Ｂ））に対する結合の低下をもたらすように、Ｆｃ領域を改変することにより達成することができる。

本発明内の適切な改変は、グリコシル化パターン、特に非フコシル化（afucosylation）（「脱フコシル化（defucosylation）とも呼ばれる）、突然変異（点突然変異、欠失、挿入）、及びオリゴペプチド又はポリペプチドとの融合体を、改変させることを含む。グリコシル化パターンを改変するための公知の方法は、抗体産生細胞中の異種β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIIの過剰発現（Glycart-Roche技術として知られている）、及び抗体産生細胞中のα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）をコードする遺伝子のノックアウト（協和発酵キリン（Kyowa Hakko Kirin）のPotelligent技術）を含む。Ｆｃ部分の変異を増強する具体的な例としては、Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)（これは参照のためその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されたものが挙げられる。

具体的な実施態様において、前記構築物は、Ｔｃ細胞による前記標的細胞の効率的死滅を可能にし、及び／又は前記Ｔｃ細胞は、刺激されたか又は刺激されていないＴｃ細胞である。

具体的な実施態様において、前記第１結合部分の第１の抗原を認識する部分と、前記第２結合部分のＩＬ５Ｒを認識する部分とが、二重特異性構築物の中心に対して、基本的に反対の方向で外に突き出すような方法で、前記第１の結合部分と第２結合部分は互いに配置される。

前記第１及び第２結合部分は、所望の第１及び第２の抗原に特異的に結合する限り、構造は限定されない。しかし、第１及び第２結合部分は一般に、１種以上のオリゴペプチド若しくはポリペプチド又はこれらの部分からなるか、又はこれらから構成される。具体的には、第１及び第２結合部分は抗体ベースの結合部分であり、これは典型的には、少なくとも１種の抗体可変ドメイン又はその結合断片を含む。

本発明の具体的な実施態様において、第１結合部分及び／又は第２結合部分は、抗体ベースの結合部分、詳しくは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）又はその結合断片を含む抗体ベースの結合部分、さらに詳しくは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）又はその結合断片及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）又はその結合断片を含む抗体ベースの結合部分である。本明細書において用語「結合断片」は、（単独で、又は別のドメイン、領域、又はその一部と組合せて）まだ機能的である、すなわち二重特異性構築物により認識される第１又は第２の抗原に結合することができるあるドメイン、領域、又は部分の一部を指す。

具体的な実施態様において、二重特異性構築物は、１本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、直鎖の二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ−ｓｃＤｂ）、環状二量体ｓｃＤｂ（ＣＤ−ｓｃＤｂ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（engager）（ＢｉＴＥ；タンデムｄｉ−ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（Brinkmann et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1993; 90: 7538-7542）、タンデムトリ−ｓｃＦｖ、トリ（ａ）ボディ、二重特異性Ｆａｂ２、ジ−ミニ抗体、テトラボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ融合体、ジ−ダイアボディ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２−Ｆｃ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体、例えばｂｓＡｂ（軽鎖のＣ末端に結合したｓｃＦｖ）、ＢｓｌＡｂ（軽鎖のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ２Ａｂ（重鎖のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｂｓ３Ａｂ（重鎖のＣ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｔｓ１Ａｂ（重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に結合したｓｃＦｖ）、Ｔｓ２Ａｂ（重鎖のＣ末端に結合したｄｓｓｃＦｖ）、及びＫｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓ（ＫｉＨｓ）（ＫｉＨ技術により調製された二重特異性ＩｇＧ）、及びＤｕｏＢｏｄｉｅｓ（Ｄｕｏｂｏｄｙ技術により調製された二重特異性ＩｇＧ）、ＶＨ及びＶＬドメイン（１つの機能性Ｆｖドメインが形成されるように、この各々がＫｉＨ又はＤｕｏＢｏｄｙの２つの異なる重鎖の１つのＣ末端に融合している）、からなる群から選択される抗体様式である。本明細書での使用に特に適しているのは、１本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、特に二重特異性モノマー性ｓｃＤｂである。様々な二重特異性構築物を議論し提示している総説については、例えば Chan Carter, Nature Reviews Immunology 10 (2010) 301-316; Schubert et al., Antibodies 1 (2012) 2-18; Byrne et al., Trends in Biotechnology 31 (2013) 621 ; Metz et al., Protein Engineering Design & Selection.2012;25:571-580) を参照されたい。

本発明の具体的な実施態様において、二重特異性構築物の第１及び第２の抗体ベースの結合部分のＶＨドメインは、ヒト重鎖フレームワーク（ＦＷ）領域に移植されたウサギ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、二重特異性構築物の第１及び第２の抗体ベースの結合部分のＶＬドメインは、ヒト軽鎖ＦＷ領域に移植されたウサギ軽鎖ＣＤＲを含む。

第１の抗体ベースの結合部分の重鎖及び軽鎖ＣＤＲは、特にウサギを、ヒトＣＤ３の完全長イプシロン鎖、完全長ＣＤ２８、又は完全長Ｃ１ｑで免疫することにより得られるウサギ抗体から誘導される。ＣＤ３Ｅ、ＣＤ２８、又はＣ１ｑの完全長鎖による免疫は、ウサギを、ヒトＣＤ３Ｅ、ＣＤ２８、又はＣ１ｑの完全長鎖をコードするプラスミドを用いて、又はＣＤ３のイプシロン鎖の精製された細胞外ドメインを用いて、又はＣＤ２８の精製された細胞外鎖を用いて、又は精製されたＣ１ｑを用いて、ＤＮＡ免疫することにより適切に行われる。さらに、第２の抗体ベースの結合部分の重鎖及び軽鎖ＣＤＲは、特にウサギを、ＩＬ５Ｒの精製された細胞外ドメインを用いて、又は完全長ＩＬ５Ｒを発現するプラスミドを用いて免疫することにより得られるウサギ抗体から誘導される。

本発明の二重特異性構築物は、当該分野で公知の任意の便利な抗体製造方を使用して製造することができる（例えば、二重特異性構築物の製造については Fischer, N. & Leger, O., Pathobiology 74:3-14 (2007) を；二重特異性ダイアボディ及びタンデムｓｃＦｖについては、及び Hornig, N. & Farber-Schwarz, A., Methods Mol. Biol. 907:713-727, 2012 with regard to bispecific diabodies and tandem scFvsを参照）。本発明の二重特異性構築物の調製のための適切な方法の具体例は、特にＧｅｎｍａｂ（Labrijn et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 26;110(13):5145-50）及びＭｅｒｕｓ（de Kruif et al., Biotechnol Bioeng. 2010 Aug 1 ;106(5):741-50）技術を含む。機能性抗体Ｆｃ部分を含む二重特異性抗体の製造法は、当該分野で公知である（例えば、Zhu et al., Cancer Lett. 86:127-134 (1994)); Suresh et al., Methods Enzymol. 121 :210-228 (1986)を参照）。

これらの方法は典型的には、例えば所望の抗原で免疫されたマウスからの脾細胞を用いて、ミエローマ細胞をハイブリドーマ法（例えば、Yokoyama et al., Curr. Protoc. Immunol. Chapter 2, Unit 2.5, 2006を参照）を使用して、又は組換え抗体工学的作成法（レパートリークローニング又はファージ表示／酵母表示）（例えば、Chames & Baty, FEMS Microbiol. Letters 189:1-8 (2000)を参照）を用いて融合することにより、及び２つの異なるモノクローナル抗体の抗原結合ドメイン又はその断片若しくは部分を組合せて、公知の分子クローニング法を使用して二重特異性構築物を与えることによる、モノクローナル抗体の生成を含む。

本発明の二重特異性構築物は、特に免疫原性を低下させるために、及び／又は安定性を改良するためにヒト化される。抗体のヒト化技術は、当該分野で公知である。例えば１つの技術は、ヒトアクセプターフレームワークの可変軽鎖ＶＬ及び可変重鎖ＶＨへの、異種抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）の移植に基づく（例えば、Jones et al., Nature 321 :522-525 (1986); and Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)を参照）。別の技術では、異種抗体のフレームワークは、ヒトフレームワークに向けて変異される。両方の場合に、抗体結合部分の機能性の保持が必須である（Kabat et al., J. Immunol. 147:1709-1719 (1991)）。

具体的な実施態様において、前記二重特異性ｓｃＤｂは、リンカーＬ１、Ｌ２、及びＬ３により、Ｖ_HＡ−Ｌ１−Ｖ_LＢ−Ｌ２−Ｖ_HＢ−Ｌ３−Ｖ_LＡ、Ｖ_HＡ−Ｌ１−Ｖ_HＢ−Ｌ２−Ｖ_LＢ−Ｌ３−Ｖ_LＡ、Ｖ_LＡ−Ｌ１−Ｖ_LＢ−Ｌ２−Ｖ_HＢ−Ｌ３−Ｖ_HＡ、Ｖ_LＡ−Ｌ１−Ｖ_HＢ−Ｌ２−Ｖ_LＢ−Ｌ３−Ｖ_HＡ、Ｖ_HＢ−Ｌ１−Ｖ_LＡ−Ｌ２−Ｖ_HＡ−Ｌ３−Ｖ_LＢ、Ｖ_HＢ−Ｌ１−Ｖ_HＡ−Ｌ２−Ｖ_LＡ−Ｌ３−Ｖ_LＢ、Ｖ_LＢ−Ｌ１−Ｖ_LＡ−Ｌ２−Ｖ_HＡ−Ｌ３−Ｖ_HＢ、又はＶ_LＢ−Ｌ１−Ｖ_HＡ−Ｌ２−Ｖ_LＡ−Ｌ３−Ｖ_HＢの順で、特にＶ_LＢ−Ｌ１−Ｖ_HＡ−Ｌ２−Ｖ_LＡ−Ｌ３−Ｖ_HＢにより連結された、２つの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）又はその断片、及び２つの可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）又はその断片を含み、ここで、Ｖ_LＡ及びＶ_HＡドメインは共同して第１の抗原の抗原結合部位を形成し、Ｖ_LＢ及びＶ_HＢはドメインは共同してＩＬ５Ｒの抗原結合部位を形成し、特にここで、リンカーＬ１は、２〜１０アミノ酸、詳しくは３〜７アミノ酸、詳しくは５アミノ酸のペプチド、詳しくはＧＧＧＧＳであり、リンカーＬ３は、１〜１０アミノ酸、詳しくは２〜７アミノ酸、詳しくは５アミノ酸のペプチド、詳しくはＧＧＧＧＳであり、リンカーＬ２は、１０〜４０アミノ酸、詳しくはこの１５〜３０アミノ酸、詳しくは２０〜２５アミノ酸、詳しくは２０アミノ酸のペプチド、詳しくは（ＧＧＧＧＳ）₄である。

具体的な実施態様において、前記第１の抗原はＣＤ３であり、Ｖ_LＡ及びＶ_HＡドメインは、ＣＤＲ領域である配列番号２３〜２８、詳しくはＣＤＲ領域である配列番号２９〜３４、又はＣＤＲ領域である配列番号３５〜４０、さらに詳しくはＣＤＲ領域である配列番号４１〜４６、ＣＤＲ領域である配列番号４９〜５４、又はＣＤＲ領域である配列番号５７〜６２を含み、詳しくはＶ_LＡフレームワーク領域は、配列番号３〜７から選択されるフレームワーク領域、詳しくは配列番号３のフレームワーク領域であり、Ｖ_HＡフレームワーク領域は配列番号８のフレームワーク領域である。

具体的な実施態様において、Ｖ_LＡドメインは、配列番号４７、５５、及び６３から選択される配列を含み；Ｖ_HＡドメインは、配列番号４８、５６、及び６４から選択される配列を含み、特にここで、Ｖ_LＡドメインとＶ_HＡドメインの組合せは、配列番号４７と配列番号４８、配列番号５５と配列番号５６、及び配列番号６３と配列番号６４、の組合せから選択される。

具体的な実施態様において、Ｖ_LＢ及びＶ_HＢドメインは、ＣＤＲ領域である配列番号９〜１４、詳しくはＣＤＲ領域である配列番号１５〜２０を含み、詳しくはここで、Ｖ_LＢフレームワーク領域は、配列番号３〜７から選択されるフレームワーク領域、詳しくは配列番号３のフレームワーク領域であり、ここで、Ｖ_HＢフレームワーク領域は配列番号８のフレームワーク領域である。

具体的な実施態様において、Ｖ_LＢドメインは配列番号２１を含み、Ｖ_HＢドメインは配列番号２２を含む。

具体的な実施態様において、二重特異性構築物は、（ｉ）配列番号４７と配列番号４８、配列番号５５と配列番号５６、及び配列番号６３と配列番号６４の組合せから選択される、Ｖ_LＡドメインとＶ_HＡドメインの組合せ、及び（ｉｉ）配列番号２１と配列番号２２の組合せであるＶ_LＢドメインとＶ_HＢドメインの組合せ、を含む。

あるいは本発明の二重特異性構築物は、非抗体ベースの結合ドメインに基づく１種以上の結合部分を含むことができる。本発明の二重特異性構築物の適切な調製方法の具体例は、特にＤＡＲＰｉｎ技術（Molecular Partners AG）、アドネクシン技術（Adnexus）、アンチカリン技術（Pieris）、及びフィノマー（Fynomer）技術（Covagen AG）をさらに含む。

第２の態様において本発明は、本発明に係る二重特異性構築物をコードする１つの若しくは複数の核酸に関する。

すなわち本発明は、本発明の二重特異性構築物をコードする１つの又は複数（すなわち２種以上）の核酸に関する。二重特異性構築物が１本鎖構築物、例えばポリペプチド又はタンパク質である場合、単一の核酸が二重特異性構築物をコードする。しかし、二重特異性構築物が２種以上のポリペプチドを含む場合、本発明の二重特異性構築物はまた、２種以上の別々の核酸によりコードされてもよい。本発明に係る核酸分子は、任意の核酸分子、特にＤＮＡ又はＲＮＡ分子、例えばｃＤＮＡ又はｍＲＮＡでもよい。これらは、天然に存在する分子でも、又は遺伝子操作若しくは化学合成により製造してもよい。これらは、コード鎖又は非コード鎖を含有する１本鎖分子、又は２本鎖分子でもよい。

本発明の核酸は、当業者に公知の任意の適切な方法により製造することができる。本発明の核酸は、例えばホスホラミダイト法などにより合成されるか、又は特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成することができる。さらに、所望の変異を特定のヌクレオチド配列に導入するための方法、例えば部位特異的突然変異誘発法は、当業者に公知である。

第３の態様において本発明は、本発明に係る１つの若しくは複数の核酸を含む１つの若しくは複数のベクターに関する。

すなわち本発明は、本発明の核酸を含む１つ又は複数のベクターに関する。ベクターに、特にプラスミドに含まれる時、核酸は特にＤＮＡである。本発明で使用されるベクターのタイプは、特に限定されない。例えばベクターは、プラスミドのような自律的に複製するベクターでも、又は宿主細胞に導入された時、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、染色体と共に複製されるベクターでもよい。、特に、本発明において使用されるベクターは発現ベクター、特に発現プラスミドである。発現ベクターにおいて、転写に必要な要素、例えばプロモーターは、本発明のＤＮＡ核酸に機能できる形で連結している。

細菌細胞中で機能できるプロモーターの例は、ファージλのＰＲ若しくはＰＬプロモーター、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ、又はｔａｃプロモーターなどが挙げられる。哺乳動物プロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、アデノウイルス２主要後期プロモーターなどが挙げられる。さらに、昆虫細胞で使用されるプロモーター例には、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、バキュロウイルス即時早期遺伝子１プロモーターなどが挙げられる。さらに、酵母宿主細胞用の適切なプロモーターは、酵母解糖系遺伝子から誘導されるプロモーター、ＴＰ１１プロモーターなどが挙げられる。異なる発現系に適した他のプロモーターは、当該分野で公知である。

さらに、必要であれば、本発明のＤＮＡは、適切なターミネーター、例えばヒト成長ホルモンターミネーター又はＴＰ１１ ＡＤＨ３真菌宿主ターミネーターに機能できる形で結合していてもよい。本発明の組換えベクターはまた、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０由来）、転写エンハンサー配列（例えば、ＳＶ４０エンハンサー）、又は翻訳エンハンサー配列（例えば、コーディングアデノウイルスＶＡ ＲＮＡ）などの要素を有することができる。

本発明の組換えベクターはまた、典型的にはベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列が与えられ、哺乳類細胞についてその例は、ＳＶ４０複製開始点である。さらに本発明の組換えベクターはまた、選択マーカーを含んでよい。選択マーカーの例には、特にアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、及びヒグロマイシンなどの薬剤耐性遺伝子がある。本発明の核酸をプロモーター及び必要に応じて他の制御配列、例えばターミネーター及び／又は分泌シグナル配列に連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は、当業者に公知である。

第４の態様において本発明は、本発明に係る１つの若しくは複数のベクターを含む１つの若しくは複数の宿主細胞に関する。

すなわち本発明は、本発明のベクターを含む、１つの宿主細胞又は同じではない複数の宿主細胞に関する。その中に本発明の組換えベクターが導入される宿主細胞は特に限定されず、本発明のベクターを発現できる任意の原核生物又は真核生物細胞がある。適切な宿主細胞の例には、細菌（例えば、バチルス属、ストレプトミセス属、及び大腸菌）、哺乳類細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＣＨＬ、及びＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系）、酵母細胞（サッカロミセス（Saccharomyces）属又はシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、特にサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、及びサッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri））、及び他の真菌細胞（中例えば、アスペルギルス（Aspergillus）、ノイロスポラ（Neurospora））が挙げられる。特に細胞は、細菌細胞、具体的には大腸菌細胞細胞である。

複数ポリペプチド鎖二重特異性構築物は、単一の宿主細胞発現系で作成することができ、ここで、宿主細胞は二重特異性構築物の各鎖を産生し、ポリペプチド鎖をマルチマー構造に組み立てて二重特異性構築物を形成し、次に宿主細胞から二重特異性構築物が回収される。あるいは所望の二重特異性構築物の別々のポリペプチド鎖は、別々の発現宿主細胞中で作成され、各宿主細胞から別々に回収され、次に、当該分野で公知のマルチサブユニット二重特異性構築物の生成を可能にする条件下でインビトロで混合される。

本発明のベクターを適切な宿主細胞中に導入する方法は当該分野で公知であり、プロトプラスト法、コンピタント細胞法（細菌宿主細胞用）、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポフェクション（哺乳類細胞用又は昆虫細胞／バキュロウイルス系）、電気穿孔法、スフェロプラスト法、及び酢酸リチウム法（酵母及び他の真菌宿主細胞用）が挙げられる。

第５の態様において本発明は、本発明に係る二重特異性構築物を製造するための方法であって、（ｉ）本発明に係る１つの若しくは複数の核酸、又は本発明に係る１つの若しくは複数のベクターを提供し、前記１つの若しくは複数の核酸、又は前記１つの若しくは複数のベクターを発現させ、発現系から前記二重特異性構築物を収集する工程、又は（ｉｉ）本発明に係る１つの若しくは複数の宿主細胞を提供し、前記１つの若しくは複数の宿主細胞を培養し、そして細胞培養物から前記二重特異性構築物を収集する工程、を含む方法に関する。

すなわち本発明は、本発明の二重特異性構築物を製造するための方法であって、本発明の１つの若しくは複数の宿主細胞を提供する工程と、前記１つの若しくは複数の宿主細胞を培養する工程と、細胞培養物から前記二重特異性構築物を収集する工程とを含む方法に関する。培養工程では、本発明の宿主細胞は、適切な培養培地中で、本発明の二重特異性構築物の発現を可能にする条件下で培養される。これらの細胞を培養するために使用される培地は、宿主細胞を増殖させるのに適した任意の通常の培地、例えば最小培地又は適切な補助物を含む複合培地でもよい。あるいは本発明は、本発明の二重特異性構築物を製造するための方法であって、本発明に係る１つの若しくは複数の核酸又は本発明に係る１つの若しくは複数のベクターを提供する工程と、前記１つの若しくは複数の核酸又は前記１つの若しくは複数のベクターを、特にインビトロ転写／翻訳系で発現させる工程（例えば、Yin et al., MAbs 2012 Mar 1 ;4(2)を参照）と、及び前記発現系から二重特異性構築物を収集する工程とを含む方法に関する。

細胞培養物から二重特異性構築物を収集する工程において、製造された二重特異性構築物は、遠心分離又は濾過により培地から宿主細胞を分離し、塩（例えば硫酸アンモニウム）を用いて上清又は濾液のタンパク質成分を沈降させ、及びイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどの種々のクロマトグラフィー法による精製により、タンパク質を単離し精製する従来法により回収される。二重特異性構築物が封入体を形成する場合、例えば大腸菌を宿主細胞として使用する時、封入体はまず変性剤中で可溶化され、次に当該分野で公知の方法に従って再折り畳み工程により回収される。

具体的な実施態様において、本発明の二重特異性構築物は大腸菌中で発現される。具体的な実施態様において、二重特異性構築物は、特に封入体から再折り畳みすることにより機能的形態で得られる。具体的な実施態様において、二重特異性構築物は二重特異性抗体ベースの構築物である。

第６の態様において本発明は、本発明に係る二重特異性構築物と医薬的に許容し得る担体とを含む医薬組成物に関する。

すなわち本発明は、本発明の二重特異性構築物と医薬的に許容し得る担体とを含む医薬組成物に関する。本明細書において用語「医薬的に許容し得る」とは、適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、及び他の問題の合併症の無い、哺乳動物、特にヒトの組織と接触するのに適した化合物又は物質を意味する。本明細書で使用される用語「担体」は、それにより活性成分が投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルに関する。本明細書において使用される医薬的に許容し得る担体は、無菌の液体又は分散液であることができる。具体的な担体は、静脈内、皮下、又は局所投与に適したものであり、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (2000) で議論されているような、非経口投与のための無菌の水性及び非水性の溶液又は懸濁液がある。

前記医薬組成物は一般に、有効量の本発明の二重特異性構築物を含む。本発明内で用語「有効量」は、有効な又は所望の治療結果を示すのに充分な化合物の量を指す。治療有効量は、１回以上の投与、適用、又は投与量で投与することができ、特定の製剤又は投与経路に限定されることを意図しない。また本医薬組成物は、本発明の二重特異性構築物と同時投与される１種以上の追加の活性物質を含んでよい。さらに本医薬組成物は、追加の医薬的に許容し得る物質、例えば可溶化剤、界面活性剤、張性調節剤などの薬剤学的に許容される賦形剤を含んでよい。

さらに本発明の医薬組成物の剤型は特に限定されないが、具体的には吸入製剤、例えば水性若しくは非水性溶液、又は噴霧用分散物、又は局所投与に適した任意の他の製剤である。他の具体的な剤型は、制御放出マトリックス中で調製された本発明の二重特異性構築物を含む製剤である。さらに本医薬組成物はまた、時間をかけて二重特異性構築物を放出する埋め込み可能な器具内に含まれていてもよい。

第７の態様において本発明は、好酸球及び／又は好塩基球が極めて重要に関与する適応症、特にアレルギー性又は炎症性疾患、詳しくは喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患、好酸球性胃腸疾患、過好酸球症候群、チャーグ・ストラウス症候群、及び好酸球性鼻ポリープ症から選択されるアレルギー性又は炎症性疾患の治療に使用される、本発明に係る二重特異性構築物、又は本発明に係る医薬組成物に関する。

すなわち本発明は、好酸球及び／又は好塩基球が非常に重要な役割を果たすアレルギー性疾患又は他の適応症の治療における、本発明の二重特異性構築物の使用に関する。具体的には本発明は、かかる疾患の治療法であって、被験体、特にヒト被験体に、本発明の二重特異性構築物の有効量を投与することを含む方法に関する。用語「有効量」の意味は、上記で定義されたものである。典型的には本発明の二重特異性構築物の有効量は、上記医薬組成物の形態で投与される。適切な投与経路は、特に限定されないが、局所投与及び非経口投与、特に吸入、皮下注射、静脈内注射、及び髄液への注入が挙げられる。この投与処方は特に限定されず、例えば１日に２回、毎日、毎週、２週間置き、毎月、１ヵ月おきに１回、３ヵ月、６ヵ月、又は９ヵ月毎に１回、及び年に１回、又は単回適用投与スキームがある。

アレルギー性疾患及び炎症性疾患は、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患、好酸球性胃腸疾患、過好酸球症候群、チャーグ・ストラウス症候群、及び好酸球性鼻ポリープ症であってもよい。

具体的な実施態様において、前記二重特異性構築物は、詳しくは吸入による肺への局所適用に使用される。このような具体的な実施態様において、局所適用は噴霧器を使用し、これは、本発明の二重特異性構築物、特にｓｃＤｂ構築物の溶液又は懸濁液のエアロゾル液滴を生成する。

具体的な実施態様において、二重特異性構築物は噴霧後に、噴霧前の活性の９０％超、詳しくは９５％超、より詳しくは９８％超の残存活性を有している。最も詳しくは、二重特異性構築物は噴霧後に、その完全な活性を維持している。

具体的な実施態様において、二重特異性構築物は噴霧後に、１０％未満、詳しくは５％未満、詳しくは２％未満、より詳しくは１％未満のモノマー含量の消失を示す。最も詳しくは、二重特異性構築物は、噴霧後のモノマー含量の消失が無い（すなわち、二重特異性構築物は、そのモノマー形態を維持し、凝集体を形成しない）。

具体的な実施態様において、二重特異性構築物は噴霧後に、５％未満、詳しくは２％未満、より詳しくは１％未満の分解を示す。最も詳しくは二重特異性構築物は、噴霧後に分解を示さない。

第８の態様において本発明は、ＣＤ３及びＩＬ５Ｒに結合する、少なくとも５５℃、詳しくは６０℃超、さらに詳しくは６５℃超、最も詳しくは７０℃超の熱展開の中点を有する、二重特異性抗体構築物に関する。

具体的な実施態様において、二重特異性抗体構築物は、上記段落［００６４］〜［００６９］欄に開示された配列を含む。

第９の態様において本発明は、単純な食塩水緩衝液中で１０ｍｇ／ｍｌの濃度で３７℃で２８日間インキュベートした時、１本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）のモノマー含量が、２０％未満、詳しくは１５％未満、さらに詳しくは１２％未満、さらに詳しくは１０％未満、最も詳しくは５％未満の消失を示す、ＣＤ３及びＩＬ５Ｒに結合する二重特異性抗体断片に関する。

かかる態様の具体的な実施態様において、二重特異性抗体構築物は、上記［００６４］〜［００６９］欄に開示された配列を含む。

第１０の態様において本発明は、（ｉ）本発明に係る二重特異性構築物又は医薬組成物と、（ｉｉ）１種以上の（ｘ）ネブライザー；（ｙ）噴霧すべき（ｉ）の二重特異性構築物の懸濁液又は溶液を調製するための緩衝液又は溶媒；及び／又は（ｚ）噴霧すべき（ｉ）の二重特異性構築物の懸濁液又は溶液を調製するための１種以上の補助試薬及び／又は手段と、を含むキットに関する。

結果
１．ジャーカットＴ細胞及びＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞への抗ＣＤ３×抗ＩＬ５Ｒ抗体の結合
方法欄に記載されrるように、ジャーカットＴ細胞及びＩＬ５Ｒ発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ）は、１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌのｓｃＤｂとインキュベートされる。試験されるすべてのｓｃＤｂについて、ＣＤ３ε及びＩＬ５Ｒ発現細胞株への特異的結合が検出されるが、対照細胞株への非特異的結合は検出されない。同じ抗ＩＬ５Ｒ部分を含有するが抗ＣＤ３部分は異なる本出願に開示された二重特異性構築物と密接に相関する、３つのｓｃＤｂ １〜３が試験された。抗ＣＤ３部分は、異なる親和性で重複するエピトープに結合する（表１）。予測されるように、ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞への結合は、試験したすべてのｓｃＤｂについて同様であった（図１）。これに対して、ジャーカットＴ細胞への結合は、親和性の低下とともに低下した。低親和性構築物３については、試験した最大濃度で、ジャーカットＴ細胞への結合は検出されなかった（図１）。

２．Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌を刺激する二重特異性抗ＣＤ３×ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂの能力
標的細胞に結合したｓｃＤｂがＴ細胞活性化を誘導する能力は、ヒト血液から精製された細胞障害性Ｔ細胞によるＩＬ−２分泌の測定（方法を参照）により評価することができる。標的を発現するＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞の存在下で、エフェクター：標的細胞比が１０：１で、異なるｓｃＤｂはＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞とインキュベートされ、１６時間インキュベーション後、ＩＬ−２分泌が分析される。ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞の存在下で、ＩＬ−２分泌の用量依存性刺激が観察されるが、野生型ＣＨＯ細胞の存在下ではＩＬ−２分泌は観察されなかった（本出願で図２に開示された構築物と密接に相関した構築物１〜３についての代表的データを参照）。従って、Ｔ細胞活性化は特異的標的細胞の存在下でのみ誘導される。さらに、ＩＬ−２分泌を誘導する能力は、組換え産生されたＣＤ３εγ（表１）に対する結合親和性及びＴ細胞に結合する能力に相関する（図１）。親和性の分析に一致して、最も高い親和性を有する結合剤である構築物１は、構築物２より強力なＩＬ−２分泌のインデューサーであり、低親和性ｓｃＤｂである構築物３ではＩＬ−２分泌は観察されない（図２）。

３．細胞障害性Ｔ細胞による特異的ｓｃＤｂに仲介される標的細胞溶解
抗ＣＤ３×ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂにより仲介される細胞障害性Ｔ細胞による標的細胞の特異的溶解は、８８時間のインキュベーション後、CellTox（登録商標）green細胞障害性アッセイ（方法を参照）を用いて分析される。Ｔ細胞活性化について上記した結果と同様に、構築物１と構築物２について、ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞の存在下で、用量依存性の標的細胞溶解が観察され、野生型ＣＨＯ細胞の存在下では溶解は観察されない（本出願で図３に開示された構築物と密接に相関した構築物１〜３についての代表的データを参照）。上記結果に一致して、ＣＤ３εへの高親和性を有するｓｃＤｂの結合は、より低い親和性のｓｃＤｂと比較して、より強力な溶解を示す。低親和性ｓｃＤｂである構築物３については、標的細胞溶解は観察されない。

方法：
二重特異性抗ＣＤ３×ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂの結合動力学の測定のためのＳＰＲアッセイ
抗ＣＤ３×ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂの結合親和性は、ＭＡＳＳ−１ ＳＰＲ機器（Sierra Sensors）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される。ＣＤ３への親和性測定のために、ヒトヘテロ二量体の単鎖ＣＤ３εγ細胞外ドメイン（社内で産生される）は、標準的なアミンカップリング操作を使用してセンサーチップ（SPR-2 Affinity Sensor High Capacity, Amine, Sierra Sensors）上に固定化される。ｓｃＤｂの９０〜０．１ｎＭの範囲の連続３倍希釈物を、フローセル中に３分間注射し、センサーチップ上に固定化されたＣＤ３εγからのタンパク質の解離を１２分間進行させる。各注入サイクルの後、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）の２回の注入により表面を再生させる。ＩＬ５Ｒに対する親和性測定のために、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に特異的な抗体が、アミンカップリングによりセンサーチップ（SPR-2 Affinity Sensor High Capacity, Amine, Sierra Sensors）上に固定化される。ヒトＩＬ５Ｒ−Ｆｃキメラタンパク質（Novus Biologicals）は、固定化された抗体により捕捉される。ＩＬ５Ｒに特異的なｓｃＤｂの連続３倍希釈物（９０ｎＭ〜０．１ｎＭ）を３分間フローセルに注入し、解離を１２分間追跡する。各注入サイクルの後、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）の３回の注入により表面を再生させる。見かけの解離（ＫＤ）及び会合（Ｋａ）速度定数及び見かけの解離平衡定数（Ｋ_D）が、１対１ラングミュア結合モデルを使用してＭＡＳＳ−１解析ソフトウェア（Analyzer, Sierra Sensors）を使用して計算される。

Ｔ細胞の細胞表面に発現されたＣＤ３εへの及びＣＨＯ細胞の表面に発現されたＩＬ５Ｒ（ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞）への二重特異性抗ＣＤ３×ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂの結合
ヒトＴ細胞株であるジャーカット細胞（クローンＥ６−１、ＡＴＣＣ）の細胞表面に発現されたＣＤ３εへのｓｃＤｂの結合は、フローサイトメトリーにより分析される。ジャーカットＴ細胞の表面に提示された未知の成分へのｓｃＤｂの非特異的結合を評価するために、ジャーカットＴ細胞株のＣＤ３ε欠損誘導体（Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５、ＡＴＣＣ）を使用した。細胞表面に発現されたＩＬ５ＲへのｓｃＤｂの結合は、トランスジェニックＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞（ZHAWで作成される）を使用して分析され、非特異結合の対照として野生型ＣＨＯ細胞（Invitrogen）が使用される。両方の細胞株を１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌのｓｃＤｂと１時間インキュベートし、結合したｓｃＤｂをＲＰＥ標識タンパク質Ｌ（BIoVision）の添加により検出し、次にフローサイトメーター（FACS aria III, Becton Dickinson）により分析される。陰性対照として、無関係の標的に特異的なｓｃＦｖが使用される。ジャーカット細胞及びＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞への結合の定性的評価のために、非特異的ｓｃＦｖ並びに試験ｓｃＤｂの両方について、幾何平均でシグナル強度を反映する平均蛍光強度（ＭＦＩ）が測定される。試験抗体と陰性対照抗体との間のＭＦＩの差（ΔＭＦＩ）が、結合の尺度として計算される。さらに、試験ｓｃＤｂのＭＦＩを陰性対照ｓｃＦｖのＭＦＩで割ることにより、標準化されたＭＦＩが計算される。

二重特異性抗ＣＤ３×ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂによるＴ細胞活性化：ＩＬ−２分泌の誘導
標的細胞の存在下で、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞中でＩＬ−２発現を誘導する抗ＣＤ３×抗ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂの能力は、以下のように評価される。細胞障害性Ｔ細胞は、製造業者の説明書に従って、RosetteSep（登録商標）ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞濃縮カクテル（STEMCELL Technologies）を使用して、ヒト血液から新たに単離される。ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞（１０，０００細胞／ウェル）は、９６ウェルマイクロタイタープレート中でＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞と、エフェクター：標的比１０：１で、連続１０倍希釈ｓｃＤｂ（１００ｎＭ〜０．００１ｎＭ）の存在下でインキュベートされる。Ｔ細胞の非特異的刺激を評価するために、野生型ＣＨＯ細胞が標的細胞として使用される。１６時間の同時インキュベーション後、上清を収集してＩＬ−２放出を測定する。ＩＬ−２放出は、市販のＥＬＩＳＡキット（BioLegend）を使用して定量される。データは、４パラメータロジスティック曲線フィットを使用して、SoftMax（登録商標）Proデータ解析ソフトウェア（Molecular Devices）を使用して解析され、用量応答曲線から半最大ＩＬ−２分泌を誘導するのに必要なｓｃＤｂのモル濃度が得られる。

細胞障害性Ｔ細胞によるＩＬ５Ｒ発現ＣＨＯ細胞のｓｃＤｂ仲介溶解
標的細胞溶解を誘導する二重特異性抗ＣＤ３×ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂの能力の評価のために、トランスジェニックＩＬ５Ｒ発現ＣＨＯ細胞株が使用される（ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ）。上記のように単離された非刺激ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞は、エフェクター細胞として使用される。標的細胞は、製造業者の説明書に従ってcell tox green dye（Promega）を用いて標識される。細胞溶解は、CellTox（登録商標）green細胞障害性アッセイ（Promega）により追跡される。このアッセイは、細胞死滅の結果として起きる膜の完全性の変化を測定する。このアッセイは、生存細胞から排除されるが、死滅細胞ＤＮＡを優先的に染色する非対称シアニン色素を使用する。色素が減弱細胞中のＤＮＡに結合すると、蛍光特性が実質的に増強される。生存細胞は蛍光を大きく上昇させない。従って、死滅細胞ＤＮＡとの結合相互作用により生成された蛍光シグナルは、細胞障害性に比例する。上記したものと同様に、標識されたＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞（１０，０００細胞／ウェル）は、９６ウェルマイクロタイタープレート中でＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞と、エフェクター：標的比１０：１で、連続１０倍希釈ｓｃＤｂ（１００ｎＭ〜０．００１ｎＭ）の存在下でインキュベートされる。標的を発現しない細胞の非特異的溶解を評価するために、Ｔ細胞は標識された野生型ＣＨＯ細胞と同時インキュベートされる。８８時間のインキュベーション後、マルチモードのマイクロプレートリーダー（FlexStation 3, Molecular Devices）を使用して蛍光強度が分析される。データは、４パラメータロジスティック曲線フィットを使用してSoftMax（登録商標）Proデータ解析ソフトウェア（Molecular Devices）を使用して解析され、用量応答曲線から半最大標的細胞溶解（ＥＣ₅₀）を誘導するのに必要なｓｃＤｂのモル濃度が得られる。

構築物の設計と製造
ヌクレオチド配列（表４及び表５を参照）をデノボ合成し、ｐＥＴ２６ｂ（＋）骨格に基づく大腸菌発現のための改変ベクター（Novagen）中にクローン化した。発現構築物を大腸菌ＢＬ１２（ＤＥ３）株（Novagen）中に形質転換し、出発培地として２ＹＴ培地（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual)）中で細胞が培養される。発現培養物を接種し、振盪フラスコ中で３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートする。ＯＤ６００ｎｍ＝１が達成されると、最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧの添加によりタンパク質発現が誘導される。一晩発現後、４０００ｇで遠心分離することにより細胞が採取される。封入体の調製のために、細胞ペレットをＩＢ再懸濁緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣＩ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％トリトン−Ｘ１００）に再懸濁する。細胞スラリーに、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、１０ｍＭロイペプチン、１００μΜ ＰＭＳＦ、及び１μＭペプスタチンが補足される。氷上で冷却しながら３サイクルの超音波ホモジナイズ化により、細胞が溶解される。次に０．０１mg／mlのＤＮＡｓｅを加え、ホモジネートを室温で２０分間インキュベートする。封入体は１５，０００ｇで４℃で遠心分離することにより沈降される。ＩＢはＩＢ再懸濁緩衝液に再懸濁され、超音波処理によりホモジナイズされた後、再度遠心分離される。ＩＢ再懸濁緩衝液を用いて全部で少なくとも３回の洗浄工程を行い、次にＩＢ洗浄緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣＩ，５ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて２回洗浄を行って、最終ＩＢを得る。

タンパク質再折り畳みのために、単離されたＩＢは、可溶化緩衝液（１００ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６Ｍ Ｇｄｎ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）に、湿潤ＩＢ １ｇ当たり５ｍｌの比率で再懸濁される。ＤＴＴが最終濃度２０ｍＭで添加されるまで、３０分間インキュベートして可溶化を行い、インキュベーションをさらに３０分間続ける。可溶化が終了後、２１，５００ｇで４℃で１０分間遠心分離することにより、溶液を除去する。再折り畳み緩衝液（典型的には、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５．０Ｍ尿素、５ｍＭシステイン、１ｍＭシスチン）中で可溶化タンパク質の最終タンパク質濃度０．３ｇ／Ｌで迅速希釈して、再折り畳みを行う。再折り畳み反応物は、ルーチンに少なくとも１４時間インキュベートされる。生じたタンパク質溶液は、８，５００ｇで４℃で１０分間遠心分離することにより除去される。再折り畳みされたタンパク質は、Capto L樹脂（GE Healthcare）上の親和性クロマトグラフィーにより精製される。単離されたモノマー画分は、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度が分析され、ＵＶ／ＶＩｓ分光分析法によりタンパク質含量が分析される。緩衝液は、透析により本来の緩衝液（５０ｍＭクエン酸−リン酸、ｐＨ６．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ）に交換される。タンパク質濃度は、目的の値に調整され、安定性分析が行われる。

熱展開
試験構築物の熱展開の移行の中点は、基本的にNiesen（Niesen et al., Nat Protoc. 2 (2007) 2212-21）により記載されているように、示差走査蛍光光度法（ＤＳＦ）により測定される。 ＤＳＦアッセイはｑＰＣＲ装置（例えばMX3005p、Agilent Technologies）で行われる。試料は、全量２５μｌ中の５×ＳＹＰＲＯオレンジの最終濃度を含む緩衝液（クエン酸−リン酸、ｐＨ６．４、０．２５Ｍ ＮａＣｌ）で希釈される。試料は三重測定され、２５℃〜９６℃の温度勾配がプログラムされる。蛍光シグナルが取得され、生データは、GraphPad Prism（GraphPad Software Inc.）を用いて解析される。本出願に開示されたものに密接に相関する構築物を用いて作成された代表的データが表２に示される。

ストレス安定性試験
タンパク質は、４週間にわたって３７℃の保存で、オリゴマー化についてサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により、分解についてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析される。この試験前に、試料は１ｇ／Ｌ及び１０ｇ／Ｌに濃縮され、出発時点が測定される。モノマー含量は、Shodex KW-402.5-4F（Showa Denko）上で試料を分離し、生じるクロマトグラムの評価により定量される。タンパク質モノマーの相対的割合の算出のために、モノマーのピーク面積を、試料マトリックスに帰すことができないピークの総面積で割る。タンパク質分解は、Any kD Mini-Protean TGXゲル（Bio-Rad Laboratories）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により評価され、クマシーブリリアントブルーを用いて染色される。タンパク質濃度は、Nanoquant プレート（Tecan Group Ltd.）を取り付けたInfinity reader M200 Proを用いてＵＶ−Ｖｉｓ分光分析法により、異なる時点に追跡される。本出願に開示されたものに密接に相関する構築物を用いて作成された代表的データが表３に示される。

噴霧中の安定性
水溶液中で０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌの増加する濃度で調製されたｓｃＤｂは、振動メッシュ技術、ジェット噴霧、又は超音波噴霧などの原理に基づく医療用噴霧器を用いて、噴霧/エアロゾル化に供される。装置のマウスピースから採取されたエアロゾルと液体リザーバから収集されたと調製残留物は、それらの完全性及び活性を確認するためにさらなる分析に供される。試料の活性を測定するためにＳＰＲ及びＥＬＩＳＡが使用され、噴霧中のモノマー含量の消失を測定するためにＳＥ−ＨＰＬＣが使用され、そして分解はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価される。

Claims (22)

1. 少なくとも１の第１結合部分と少なくとも１の第２結合部分とを含む二重特異性構築物であって、前記第１結合部分が、細胞傷害性エフェクターＴ（Ｔｃ）細胞上に存在する第一の抗原に特異的に結合し、前記第２結合部分が、標的細胞の表面に存在するＩＬ−５受容体（ＩＬ５Ｒ）に特異的に結合し、特に前記標的細胞が好酸球又は好塩基球細胞であり、特に前記第２結合部分が、１０^-10Ｍ以下、特に５×１０^-11Ｍ未満の平衡解離定数Ｋ_Dを有する、上記二重特異性構築物。
2. 前記第１結合部分が、ＣＤ３及びＣＤ２８から選択される抗原に特異的に結合する、請求項１に記載の二重特異性構築物。
3. 前記第１結合部分が、ＣＤ３に、詳しくはＣＤ３のイプシロン鎖（ＣＤ３Ｅ）に、さらに詳しくはＣＤ３Ｅのアゴニストエピトープに特異的に結合する、請求項１又は２に記載の二重特異性構築物。
4. 前記構築物が、Ｔｃ細胞による前記標的細胞の効率的死滅を可能にし、及び／又は前記Ｔｃ細胞が、刺激されたか又は刺激されていないＴｃ細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二重特異性構築物。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の二重特異性構築物であって、前記第１結合部分及び／又は第２結合部分が、抗体ベースの結合部分、詳しくは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）又はその結合断片を含む抗体ベースの結合部分、さらに詳しくは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）又はその結合断片及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）又はその結合断片を含む抗体ベースの結合部分である、上記二重特異性構築物。
6. 請求項５に記載の二重特異性構築物であって、二重特異性構築物は、１本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、直鎖の二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ−ｓｃＤｂ）、環状二量体ｓｃＤｂ（ＣＤ−ｓｃＤｂ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（engager）（ＢｉＴＥ；タンデムｄｉ−ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片、タンデムトリ−ｓｃＦｖ、トリ（ａ）ボディ、二重特異性Ｆａｂ₂、ジ−ミニ抗体、テトラボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ融合体、ジ−ダイアボディ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２−Ｆｃ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体、例えばｂｓＡｂ、ＢｓｌＡｂ、Ｂｓ２Ａｂ、Ｂｓ３Ａｂ、Ｔｓ１Ａｂ、Ｔｓ２Ａｂ、及びＫｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓ（ＫｉＨｓ）及びＤｕｏＢｏｄｉｅｓ、ＶＨ及びＶＬドメイン（１つの機能性Ｆｖドメインが形成されるように、この各々がＫｉＨ又はＤｕｏＢｏｄｙの２つの異なる重鎖のＣ末端に融合している）からなる群から選択される抗体様式、詳しくは１本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、さらに詳しくは二重特異性モノマーｓｃＤｂである、上記二重特異性構築物。
7. 請求項６に記載の二重特異性構築物であって、前記二重特異性ｓｃＤｂが、リンカーＬ１、Ｌ２、及びＬ３により、Ｖ_HＡ−Ｌ１−Ｖ_LＢ−Ｌ２−Ｖ_HＢ−Ｌ３−Ｖ_LＡ、Ｖ_HＡ−Ｌ１−Ｖ_HＢ−Ｌ２−Ｖ_LＢ−Ｌ３−Ｖ_LＡ、Ｖ_LＡ−Ｌ１−Ｖ_LＢ−Ｌ２−Ｖ_HＢ−Ｌ３−Ｖ_HＡ、Ｖ_LＡ−Ｌ１−Ｖ_HＢ−Ｌ２−Ｖ_LＢ−Ｌ３−Ｖ_HＡ、Ｖ_HＢ−Ｌ１−Ｖ_LＡ−Ｌ２−Ｖ_HＡ−Ｌ３−Ｖ_LＢ、Ｖ_HＢ−Ｌ１−Ｖ_HＡ−Ｌ２−Ｖ_LＡ−Ｌ３−Ｖ_LＢ、Ｖ_LＢ−Ｌ１−Ｖ_LＡ−Ｌ２−Ｖ_HＡ−Ｌ３−Ｖ_HＢ、又はＶ_LＢ−Ｌ１−Ｖ_HＡ−Ｌ２−Ｖ_LＡ−Ｌ３−Ｖ_HＢの順で、特にＶ_LＢ−Ｌ１−Ｖ_HＡ−Ｌ２−Ｖ_LＡ−Ｌ３−Ｖ_HＢにより連結された、２つの可変重鎖ドメイン（Ｖ_H）又はその断片、及び２つの可変軽鎖ドメイン（Ｖ_L）又はその断片を含み、ここで、Ｖ_LＡ及びＶ_HＡドメインは共同して第１の抗原の抗原結合部位を形成し、Ｖ_LＢ及びＶ_HＢはドメインは共同してＩＬ５Ｒの抗原結合部位を形成し、特にここで、リンカーＬ１は、２〜１０アミノ酸、詳しくは５アミノ酸のペプチド、詳しくはＧＧＧＧＳであり、リンカーＬ３は、１〜１０アミノ酸、詳しくは５アミノ酸のペプチド、詳しくはＧＧＧＧＳであり、リンカーＬ２は、１０〜４０アミノ酸、詳しくは２０アミノ酸のペプチド、詳しくは（ＧＧＧＧＳ）₄である、上記二重特異性構築物。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の二重特異性構築物であって、前記第１の抗原がＣＤ３であり、Ｖ_LＡ及びＶ_HＡドメインが、ＣＤＲ領域である配列番号２３〜２８、詳しくはＣＤＲ領域である配列番号２９〜３４、又はＣＤＲ領域である配列番号３５〜４０、さらに詳しくはＣＤＲ領域である配列番号４１〜４６、ＣＤＲ領域である配列番号４９〜５４、又はＣＤＲ領域である配列番号５７〜６２を含み、詳しくはＶ_LＡフレームワーク領域は、配列番号３〜７から選択されるフレームワーク領域、詳しくは配列番号３のフレームワーク領域であり、Ｖ_HＡフレームワーク領域は配列番号８のフレームワーク領域である、上記二重特異性構築物。
9. 請求項６に記載の二重特異性構築物であって、Ｖ_LＡドメインは、配列番号４７、５５、及び６３から選択される配列を含み；Ｖ_HＡドメインは、配列番号４８、５６、及び６４から選択される配列を含み、特にここで、Ｖ_LＡドメインとＶ_HＡドメインの組合せは、配列番号４７と配列番号４８、配列番号５５と配列番号５６、及び配列番号６３と配列番号６４、の組合せから選択される、上記二重特異性構築物。
10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の二重特異性構築物であって、Ｖ_LＢ及びＶ_HＢドメインは、ＣＤＲ領域である配列番号９〜１４、詳しくはＣＤＲ領域である配列番号１５〜２０を含み、詳しくはここで、Ｖ_LＢフレームワーク領域は、配列番号３〜７から選択されるフレームワーク領域、詳しくは配列番号３のフレームワーク領域であり、ここで、Ｖ_HＢフレームワーク領域は配列番号８のフレームワーク領域である、上記二重特異性構築物。
11. Ｖ_LＢドメインは配列番号２１を含み、Ｖ_HＢドメインは配列番号２２を含む、請求項１０に記載の二重特異性構築物。
12. １本鎖末端VII 〜１１のいずれか１項に記載の二重特異性構築物であって、Ｖ_LＡドメインとＶ_HＡドメインの組合せは、配列番号４７と配列番号４８、配列番号５５と配列番号５６、及び配列番号６３と配列番号６４の組合せから選択され、ここでＶ_LＢドメインとＶ_HＢドメインの組合せは、配列番号２１と配列番号２２の組合せである、上記二重特異性構築物。
13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二重特異性構築物をコードする１つの若しくは複数の核酸。
14. 請求項１３に記載の１つの若しくは複数の核酸を含む１つの若しくは複数のベクター。
15. 請求項１４に記載の１つの若しくは複数のベクターを含む１つの若しくは複数の宿主細胞。
16. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二重特異性構築物を製造するための方法であって、（ｉ）請求項１３に記載の１つの若しくは複数の核酸、又は請求項１４に記載の１つの若しくは複数のベクターを提供し、前記１つの若しくは複数の核酸、又は前記１つの若しくは複数のベクターを発現させ、発現系から前記二重特異性構築物を収集する工程、又は（ｉｉ）請求項１５に記載の１つの若しくは複数の宿主細胞を提供し、前記１つの若しくは複数の宿主細胞を培養し、そして細胞培養物から前記二重特異性構築物を収集する工程、を含む上記方法。
17. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二重特異性構築物と医薬的に許容し得る担体とを含む医薬組成物。
18. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二重特異性構築物、又は請求項１７に記載の医薬組成物であって、好酸球及び／又は好塩基球が極めて重要に関与する適応症、特にアレルギー性又は炎症性疾患、詳しくは喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患、好酸球性胃腸疾患、過好酸球症候群、チャーグ・ストラウス症候群、及び好酸球性鼻ポリープ症から選択されるアレルギー性又は炎症性疾患の治療に使用される、上記二重特異性構築物、又は上記医薬組成物。
19. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二重特異性構築物、又は請求項１７に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、好酸球及び／又は好塩基球が極めて重要に関与する適応症、特にアレルギー性又は炎症性疾患、詳しくは喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患、好酸球性胃腸疾患、過好酸球症候群、チャーグ・ストラウス症候群、及び好酸球性鼻ポリープ症から選択されるアレルギー性又は炎症性疾患の治療方法。
20. ＣＤ３及びＩＬ５Ｒに結合する、少なくとも５５℃、詳しくは６０℃超、さらに詳しくは６５℃超、最も詳しくは７０℃超の熱展開の中点を有する二重特異性抗体断片。
21. 食塩水緩衝液中で１０ｍｇ／ｍｌの濃度で３７℃で２８日間インキュベートした時、１本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）のモノマー含量が、２０％未満、詳しくは１５％未満、さらに詳しくは１２％未満、さらに詳しくは１０％未満、最も詳しくは５％未満の消失を示す、ＣＤ３及びＩＬ５Ｒに結合する二重特異性抗体断片。
22. （ｉ）請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二重特異性構築物、又は請求項１７に記載の医薬組成物と、（ｉｉ）１種以上の（ｘ）ネブライザー；（ｙ）噴霧すべき前記二重特異性構築物の懸濁液又は溶液を調製するための緩衝液又は溶媒；及び／又は（ｚ）噴霧すべき前記二重特異性構築物の懸濁液又は溶液を調製するための１種以上の補助試薬及び／又は手段と、を含むキット。

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