ES2690786T3 - Anticuerpos que se unen a la proteína 1 de reconocimiento de peptidoglicano - Google Patents

Anticuerpos que se unen a la proteína 1 de reconocimiento de peptidoglicano Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión al antígeno del mismo que es capaz de unirse específicamente a PGLYRP1 y reducir la actividad de TREM-1 mediada por PGLYRP1.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos que se unen a la proteína 1 de reconocimiento de peptidoglicano Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la inmunología. Más particularmente, la presente invención se refiere a un método para la identificación del ligando que puede estimular el receptor de activación expresado en células mieloides (TREM-1), así como a anticuerpos que se unen al ligando de TREM-1. Dichos anticuerpos son capaces de modular la activación de las células mieloides y, por lo tanto, las respuestas inflamatorias.
Antecedentes
La proteína 1 de reconocimiento de peptidoglicano (también conocida como PGLYRP1, PGRP-S, TNFSF3L, PGRP, TAG7 y PGRPS) se expresa en neutrófilos y se libera después de su activación. PGLYRP1 es muy abundante en tejido enfermo y se ha demostrado que juega un papel importante en la eliminación de infecciones bacterianas por el sistema inmunitario innato. La familia de las proteínas PGLYRP (PGLYRP1, PGLYRP2, PGLYRP3, PGLYRP4) interactúan con los peptidoglicanos bacterianos (PGN), pero existen diferencias importantes en los sitios de unión a los PGN de las proteínas. PGLYRP1 tiene un surco adicional que se postula que constituye un sitio de unión para un efector desconocido o una proteína de señalización (J. Mol. Biol. 347:683-691 (2005)). PGLYRP1 es una proteína altamente conservada, de 196 aminoácidos de longitud que consiste en un péptido señal y un dominio de unión a peptidoglicano.
La identificación de un mecanismo de señalización mediado por PGLYRP1 es importante para comprender y, de este modo, manipular la función de esta proteína en diversas enfermedades infecciosas e inflamatorias.
Asimismo, TREM-1 tiene efectos bien descritos en la modulación inmunitaria pero, hasta ahora, el mecanismo que conduce a la función inmunitaria mediada por TREM-1 no se ha comprendido. TREM-1 es un receptor expresado en células mieloides, como monocitos, macrófagos y neutrófilos. Es una proteína transmembrana que consiste en 234 aminoácidos, que incluyen un solo dominio de inmunoglobulina extracelular y una cola citoplásmica corta. TREM-1 no tiene un motivo de señalización aparente pero, cuando se activa, forma dímeros/multímeros e interviene en la señalización al asociarse con la proteína adaptadora de señalización que contiene ITAM, DAP12. La señalización aguas abajo puede incluir la fosforilación de Syk y Zap70. La señalización aguas abajo puede incluir la activación de NFAT, ELK, factor de transcripción NK-kappaB. Cuando se activa TREM-1, desencadena la liberación de citocinas proinflamatorias, como TNF-a (TNF-alfa), IL-8 y proteína quimiotáctica de monocitos 1, de las células mieloides.
TREM-1 está regulado positivamente en pacientes con sepsis, artritis reumatoide (AR) y enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y cada vez hay más pruebas que respaldan la teoría de que TREM-1 contribuye al desarrollo y la progresión de las enfermedades inflamatorias. El bloqueo de la señalización de TREM-1 ha demostrado además tener actividad terapéutica en modelos in vivo de ratón de AR y EII.
El modo de acción de la activación de TREM-1 ha permanecido esquivo debido a que el ligando que activa TREM-1 no se conoce en la técnica. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de un medio para identificar el ligando de TREM-1. Existe una necesidad en la técnica de un método para identificar una molécula, tal como un anticuerpo, que sea capaz de reducir, bloquear o interferir con la interacción de TREM-1 con su ligando. Existe una necesidad en la técnica de una molécula, tal como un anticuerpo, que sea capaz de unirse al ligando de TREM-1 y así reducir, bloquear o interferir con la estimulación de TREM-1 por su ligando. Existe una necesidad en la técnica de una molécula, tal como un anticuerpo, que sea capaz de unirse al ligando de TREM-1. Existe una necesidad en la técnica de una molécula, tal como un anticuerpo, que sea capaz de unirse al ligando de TREM-1 y de este modo bloquear la activación y señalización de TREM-1. Existe una necesidad en la técnica de una molécula, tal como un anticuerpo, que sea capaz de unirse al ligando de TREM-1 y así reducir o bloquear la liberación de citocinas de una célula mieloide que expresa TREM-1.
En la presente memoria se divulga un método y ensayo para identificar el ligando y las moléculas de TREM-1, tales como anticuerpos, que sean capaces de unirse al ligando de TREM-1. En la presente memoria se describen anticuerpos que pueden influir en la activación de TREM-1. Por lo tanto, los anticuerpos divulgados en la presente memoria son adecuados para su uso como productos farmacéuticos. Los anticuerpos que se unen al ligando de TREM-1 y que reducen o bloquean la interacción de TREM-1 con su ligando pueden tener un impacto sustancial en la calidad de vida de individuos con enfermedades inflamatorias crónicas tales como artritis reumatoide, artritis psoriásica y enfermedades inflamatorias del intestino. Osanai et al. divulgan anticuerpos policlonales capaces de unirse a PGLYRP1 (Infection and Immunity, 2010, volumen 79, N.° 2, páginas 858-866). El alcance de la presente invención está definido por las reivindicaciones y cualquier información que no se encuentre dentro de las reivindicaciones se proporciona solo a título informativo.
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Sumario
La invención se refiere a un método para identificar un ligando de TREM-1 y moléculas, tales como anticuerpos, que se unen al ligando de TREM-1, identificado en la presente memoria como PGLYRP1. La invención también se refiere a anticuerpos anti-PGLYRP1 que pueden identificarse por medio del método inventado. Por lo tanto, la invención se refiere a anticuerpos anti-PGLYRP1 que son capaces de modificar la activación de TREM-1 por PGLYRP1, tales como anticuerpos anti-PGLYRP1 que son capaces de reducir la actividad de TREM-1 (señalización y/o activación) por PGLYRP1. Los anticuerpos que reducen la actividad de TREM-1 se pueden usar para el tratamiento de la inflamación.
El método para identificar un ligando de TREM-1 comprende (a) cultivar una célula que expresa TREM-1, una proteína de señalización para TREM-1 y una construcción indicadora que se activa mediante dicha proteína de señalización; (b) detectar, preferiblemente cuantificar, la actividad de dicha célula que expresa TREM-1 cuando se pone en contacto con una célula, un compuesto o un fluido, tal como un fluido biológico o un tejido, que desencadena la activación de TREM-1; (c) poner en contacto el cultivo de (b) con un componente activador de TREM-1; (d) aislar el componente que se une a TREM-1 y (e) caracterizar el componente aislado. El ligando de TREM-1, identificado por medio de la presente invención como PGLYRP1, puede usarse para modificar la actividad de TREM-1.
El método para identificar una molécula que se une específicamente a PGLYRP1 y que modifica la actividad celular mediada por TREM-1, comprende: (a) cultivar la célula de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-18; (b) detectar, preferiblemente cuantificar, la actividad de dicha célula que expresa TREM-1 cuando se pone en contacto con PGLYRP1 y, opcionalmente, un agente de multimerización tal como PGN; (c) poner en contacto el cultivo de (b) con una molécula que se une específicamente a PGLYRP1; y (d) detectar, preferiblemente cuantificar, que la actividad de dicha célula que expresa TREM-1 es menor o mayor que su actividad medida en (b).
El método para identificar un anticuerpo anti-PGLYRP1 que modifica la actividad celular mediada por TREM-1 comprende: (a) cultivar una célula que expresa TREM-1, una proteína de señalización para TREM-1 y una construcción indicadora que se activa mediante dicha proteína señalizadora; (b) detectar, preferiblemente cuantificar, la actividad de dicha célula que expresa TREM-1 cuando se pone en contacto con PGLYRP1 y, opcionalmente, en combinación con un agente multimerizante tal como PGN; (c) poner en contacto el cultivo de (b) con un anticuerpo que se une a PGLYRP1; y (d) detectar, preferiblemente cuantificar, que la actividad de dicha célula que expresa TREM-1 es menor o mayor que su actividad medida en (b).
Un método para identificar un anticuerpo anti-PGLYRP1 que disminuye la actividad celular mediada por TREM-1 comprende: (a) cultivar una célula tal como un linfocito T que expresa TREM-1, una proteína señalizadora tal como DAP12 y un gen indicador tal como luciferasa o beta- galactosidasa; (b) incubar dicha célula con un neutrófilo activado y, opcionalmente, en combinación con un agente multimerizante tal como PGN (c) detectar, preferiblemente cuantificar, la luminiscencia de dicha célula; (d) poner en contacto el cultivo de la célula y el neutrófilo activado con un anticuerpo anti-PGLYRP1; y (e) detectar, preferiblemente cuantificar, que la luminiscencia de dicha celda es menor que la actividad medida en (c).
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra que los neutrófilos activan la línea celular indicadora BWZ-TREM-1. La línea celular indicadora BWZ expresa TREM-1 humano y media la activación de un gen indicador de beta (p)-galactosidasa unido a NFAT que puede cuantificarse mediante luminiscencia usando el kit Beta-Glo Assay System de Promega, Dinamarca. La figura ilustra la activación de la línea celular indicadora cuando se cultiva con neutrófilos en presencia de cócteles de citocinas que contienen TNF-alfa (a), IL-6, IFN-gamma (y) y GM-CSF o “cócteles” de activación de receptor tipo Toll (TLR) (mezcla de TLRL y TLR2 (tlrl-kit2hm, Invivogen, Sigma- Aldrich, Dinamarca), así como en presencia de componentes separados de estas mezclas de activación.
La Figura 2 muestra la tinción con citometría de flujo de neutrófilos estimulados por PGN con una proteína recombinante tetrámero de TREM-1. La proteína de control no se une (Fig. 2A), mientras que un tetrámero de TREM-1 (SEQ ID NO: 2) se une a un subconjunto de neutrófilos activados con PGN (Fig. 2B), y esto puede ser competido por otra proteína TREM-1 (Fig. 2D) pero no por una proteína de control (Fig. 2C), lo que confirma la especificidad de la interacción.
La Figura 3: PGLYRP1 se identifica por inmunoprecipitation (IP)/espectroscopia de masas (MS) con TREM-1. El TREM-Fc soluble se incubó con neutrófilos activados con PGN, se reticuló, se inmunoprecipitó seguido de lavado, digestión con tripsina y espectroscopía de masas. La inmunoprecipitación de las proteínas de unión a TREM-1 dio como resultado 3 proteínas específicas, 73 proteínas se superponen con la proteína de control, y 72 fueron precipitadas por la proteína de control sola (fondo). La tabla muestra los resultados de la inmunoprecipitación específica de TREM-1 y la posterior espectroscopía de masas.
La Figura 4 muestra que TREM-1 soluble se une a PGLYRP1. Se muestra tanto mediante tinción con citometría de flujo con TREM-1 en transfectantes HEK293 que expresan PGLYRP1 recombinante (figura 4A) como mediante análisis de Biacore y ForteBio de la interacción entre PGLYRP1 y un tetrámero de TREM-1 (SEQ ID NO: 2). El PGLYRP1 humano soluble se unió a TREM-1 humano inmovilizado en presencia y ausencia de 10
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|jg/ml de solución soluble de peptidoglicano de E. coli (un PGN) (Fig. 4B). El propio PGN se unió también al PGLYRP1 humano inmovilizado (Fig. 4C), y el TREM-1 humano soluble se unió al PGLYRP1 inmovilizado antes y después de que la superficie de PGLYRP1 se expusiera y se uniera a PGN (Fig. 4D).
La Figura 5 muestra la activación de una línea celular indicadora de TREM-1 por PGLYRP1 recombinante.
La estimulación de una línea celular indicadora de TREM-1 con PGLYRP1 recombinante (N.° de catálogo 2590- PG-050R&D Systems Minneapolois MN, EE. UU.), así como PGLYRP1 generado internamente (SEQ ID NO: 1) conduce a una respuesta dependiente de la dosis en la presencia de PGN (Fig. 5A). Esta respuesta inducida por PGLYRP1 puede bloquearse específicamente por la proteína de fusión TREM-1-Fc (Fig. 5B) validando una señal específica de TREM-1.
La Figura 6 muestra que los anticuerpos monoclonales anti-PGLYRP1 pueden bloquear la respuesta de TREM-1 en el ensayo indicador estimulado con neutrófilos activados con PGN. Ejemplos de sobrenadantes de clones de hibridoma de anticuerpo seleccionados en varias placas por su capacidad para bloquear la señal de activación. Algunos anticuerpos (los que están debajo de la línea discontinua, como F10, F95) pueden bloquear esta señal. Los puntos negros representan el control del isotipo en cada placa (Fig. 6A). La Fig. 6B muestra la prueba de otra fusión que da lugar a 2 anticuerpos anti-PGLYRP1 de bloqueo adicionales M-hPGRPS-2F5 y - 2F7. El ensayo de los mAbs anti-PGLYRP1 comercializados muestra que no pueden bloquear esta señal incluso en dosis altas, mientras que el anticuerpo policlonal pAb anti-PGLYRP1 comercializado (AF2590, R&D Systems Minneapolois MN, EE. UU.) sí puede. La Fig. 6C muestra una comparación del mAb anti-PGLYRP1 188C424 comercializado por Thermo Scientific (Thermo Scientific, Waltham MA, EE.UU.) con un control de isotipo (MAB002) y el anticuerpo policlonal pAb anti-PGLYRP1 (AF2590). La Fig. 6D muestra una comparación del mAb anti-PGLYRP1 comercializado 4H230 (US Biological, Salem MA, EE. UU.) con un control de isotipo (MAB002) y el anticuerpo policlonal pAb anti-PGLYRP1 (AF2590). La Fig. 6E muestra una comparación del mAb anti- PGLYRP1 9A319 comercializado (US Biological, Salem MA, EE. UU.) con un control de isotipo (MAB002) y el anticuerpo policlonal pAb anti-PGLYRP1 (AF2590); la Fig. 6F muestra una comparación del mAb anti-PGLYRP1 6D653 comercializado (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA, EE. UU.) con un control de isotipo (MAB002) y el anticuerpo policlonal pAb anti-PGLYRP1 (AF2590). La ligera disminución de actividad observada para el mAb SC 6D653 parece deberse a la formulación que contiene azida ya que una señal independiente de PGLYRP1 que desencadena TREM-1 con 1 jg/ml de mAb anti-TREM-1 unido a placa muestra el mismo fenómeno (Fig. 6G).
La Figura 7 muestra que el ligando de TREM-1 presente en el líquido sinovial de AR humana puede estimular TREM-1.
La Figura 7 muestra que el mAb anti-TREM-1 agonista unido a placa (R&D MAB1278, Minneapolis, MN, EE. UU.) estimula TREM-1 (asterisco) y que una muestra de líquido sinovial de AR a la que se ha añadido PGN mostraba actividad de ligando hTREM-1 que puede neutralizarse mediante un anticuerpo policlonal anti- PGLYRP1 (AF2590), lo que indica que la actividad de TREM-1 depende de PGLYRP1.
La Figura 8 muestra la estructura general de la construcción PGLYPR1 Tipo II. IC representa el dominio intracelular, TM el dominio transmembrana, ambos son originarios de la secuencia de la proteína MDL-1, en combinación con el dominio EC (extracelular) de hPGLYRP1.
Breve descripción de las secuencias
La SEQ ID NO: 1 representa la secuencia de aminoácidos de la secuencia peptídica de hPGLYRP1 madura y de longitud completa.
La SEQ ID NO: 2 representa una secuencia de proteína recombinante que contiene los siguientes elementos: ECD de TREM-1 humano, péptido enlazador, ECD de TREM-1 humano, Fc de IgG1 de alotipo humano con 7 mutaciones que difieren del tipo silvestre. (L15A, L16E, G18A, A111S, P112S, D137E, L139M).
La SEQ ID NO: 3 representa un alotipo humano de Fc de IgG1 con 5 mutaciones que difieren del tipo silvestre: L15A, L16E, G18A, A111S, P112S.
SEQ ID NO: 4 representa una secuencia de proteína recombinante que contiene los siguientes elementos del extremo N al C: etiqueta 6xHIS, dos copias del dominio de proteína de unión a estreptavidina (SBP), enlazador GS, C terminal de la proteína oligomérica del cartílago (COMP), enlazador GS, hDCIR-ECD.
SEQ ID NO: 5 representa una secuencia de proteína recombinante que contiene los siguientes elementos: hTREM-1-ECD, enlazador GS, C terminal de proteína oligomérica de cartílago (COMP), enlazador GS, dos copias del dominio de proteína de unión a estreptavidina (SBP), etiqueta 6xHIS.
La SEQ ID NO: 6 representa una secuencia de proteína recombinante que contiene los siguientes elementos en orden desde el extremo N al C, ECD CD83 humano, péptido enlazador G4Sx3, ECD CD83 humano, mutante Fc de IgG1 de alotipo humano.
La SEQ ID NO: 7 representa la secuencia del ADNc que codifica PGLYRP1 humano de longitud completa con la secuencia de señal GPI C terminal. Esta secuencia se clonó en pcDNA3.1zeo (+) (Invitrogen: V860-20, Carlsbad, CA, EE. UU.) mediante sitios de restricción EcoR1 y Xho1.
La SEQ ID NO: 8 representa ECD hTREM-1 maduro de longitud completa (aa 21-200).
La SEQ ID NO: 9 representa el ADNc para una secuencia de los dominios extracelulares en tándem con el líder CD33 mediante un enlazador G4Sx3. Un ADNc sintético con un sitio de restricción EcoRI 5', una secuencia Kozak de GCCACC, la secuencia líder CD33 seguida del dominio extracelular de TREM-1 humano (aa17-200) con un sitio de restricción Kpnl interespaciado y un espaciador glicina-glicina-glicina-serina repetido tres veces (G4Sx3) seguido de una copia adicional del dominio extracelular de TREM-1 humano (aa17-200) y un sitio Apa1
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para permitir la clonación.
La SEQ ID NO: 10 representa el pentámero hTREM-COMP-SBP38x2-6HIS. El sitio EcoRI y el sitio Kozakare 5' y BamH1 son 3' de oRf.
La SEQ ID NO: 11 representa el tetrámero hCD83 clonado en el vector pJSV002-hFc6mut con el sitio EcoR1 y Apa1.EcoR1 y el sitio Kozakare 5' y Apa1 es 3' de ORF.
La SEQ ID NO: 12 representa el pentámero 6HIS-SBP38x2-COMP-hDCIR. Sitio EcoR1 y Kozak 5' y BamH1 3' de ORF.
La SEQ ID NO: 13 representa la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (1F36, mAb 0182).
La SEQ ID NO: 14 representa la secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (1F36, mAb 0182).
La SEQ ID NO: 15 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (1F36, mAb 0182).
La SEQ ID NO: 16 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (1F36, mAb 0182).
La SEQ ID NO: 17 representa la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (1F10).
La SEQ ID NO: 18 representa la secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (1F10).
La SEQ ID NO: 19 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (1F10).
La SEQ ID NO: 20 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (1F10).
La SEQ ID NO: 21 representa la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (1F105, mAb 0184).
La SEQ ID NO: 22 representa la secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (1F105, mAb 0184).
La SEQ ID NO: 23 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (1F105, mAb 0184).
La SEQ ID NO: 24 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (1F105, mAb 0184).
La SEQ ID NO: 25 representa la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (1F95).
La SEQ ID NO: 26 representa la secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (1F95).
La SEQ ID NO: 27 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (1F95).
La SEQ ID NO: 28 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (1F95).
La SEQ ID NO: 29 representa la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (2F5).
La SEQ ID NO: 30 representa la secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (2F5).
La SEQ ID NO: 31 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (2F5).
La SEQ ID NO: 32 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (2F5).
La SEQ ID NO: 33 representa la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (2F7).
La SEQ ID NO: 34 representa la secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (2F7).
La SEQ ID NO: 35 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (2F7).
La SEQ ID NO: 36 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable de un anticuerpo monoclonal anti-PGLYRP1 (2F7).
La SEQ ID NO: 37 representa la secuencia de aminoácidos de PGLYRP1 Tipo II 1.0.
La SEQ ID NO: 38 representa la secuencia de aminoácidos de PGLYRP1 Tipo II 2.0.
La SEQ ID NO: 39 representa la secuencia de aminoácidos de una etiqueta de epítopo.
La SEQ ID NO: 40 representa la secuencia de aminoácidos de PGLYRP2 humano de longitud completa.
La SEQ ID NO: 41 representa la secuencia de aminoácidos de PGLYRP3 humano de longitud completa.
La SEQ ID NO: 42 representa la secuencia de aminoácidos de PGLYRP4 humano de longitud completa.
La SEQ ID NO: 43 representa la secuencia de ácido nucleico de hCD33-hTrem1 ECD (aa17-200)-Fc6mut.
La SEQ ID NO: 44 representa la secuencia de aminoácidos de hCD33-hTrem1 ECD (aa17-200)-Fc6mut.
La SEQ ID NO: 45 representa la secuencia de ácido nucleico de hCD33-hTremL1 ECD (aa16-162)-Fc6mut.
La SEQ ID NO: 46 representa la secuencia de aminoácidos de hCD33-hTremL1 ECD (aa16-162)-Fc6mut.
La SEQ ID NO: 47 representa la secuencia de ácido nucleico de hCD33-hTremL2 EcD (aa19-268)-Fc6mut.
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SEQ ID NO: 48 representa la secuencia de aminoácidos de hCD33-hTremL2 ECD (aa19-268)-Fc6mut
SEQ ID NO: 49 representa la secuencia de ácido nucleico del dímero hCD33-hTREM2-Fc6mut
La SEQ ID NO: 50 representa la secuencia de aminoácidos del dímero hCD33-hTREM2-Fc6mut.
La SEQ ID NO: 51 representa la secuencia de ácido nucleico de un cebador.
La SEQ ID NO: 52 representa la secuencia de ácido nucleico de un cebador.
La SEQ ID NO: 53 representa la secuencia de aminoácidos de hCD33.
Descripción
La invención se refiere a un método para la identificación de moléculas tales como anticuerpos que son capaces de unirse específicamente al compañero de señalización de TREM-1, identificado aquí como PGLYRP1, e influir sobre la unión de PGLYRP1 con su compañero de señalización, TREM-1. PGLYRP1 puede usarse para modificar la actividad de TREM-1. Por consiguiente, la invención se refiere a moléculas, tales como anticuerpos, que influyen en las respuestas inflamatorias que están mediadas por PGLYRP1. Se han creado e identificado anticuerpos que son capaces de unirse a PGLYRP1 y que influyen en la activación y señalización de TREM-1.
Un método o ensayo para la identificación del ligando de TREM-1 y para la identificación de moléculas, tales como anticuerpos, que son capaces de unirse específicamente a PGLYRP1 y reducir o bloquear la activación de PGLYRP1 de TREM-1 se puede crear de la siguiente manera:
Una primera célula o población de primeras células se transfecta con genes que codifican TREM-1 o fragmentos de los mismos, una proteína de señalización y una construcción indicadora. La célula puede ser de origen hematopoyético, tal como una célula mieloide, puede ser un linfocito T o puede ser cualquier otro tipo de célula que sea capaz de transfectarse y expresar tales moléculas. La proteína de señalización puede ser cualquier proteína que sea capaz de transmitir o transferir una señal, directa o indirectamente, desde TREM-1 a la construcción indicadora y puede incluir DAP10, DAP12, TCR zeta, Fc gammaRIII, un receptor de Fc o cualquier otra proteína que sea capaz de transmitir o transferir una señal desde TREM-1 a la construcción indicadora. En otra alternativa, la proteína de señalización puede ser una molécula quimera TREM-1/de señalización. La construcción indicadora comprende un factor de transcripción y un gen indicador, que a su vez codifica una proteína indicadora que produce una señal detectable, tal como una señal cuantificable. El factor de transcripción puede ser NFAT o NFkB o cualquier otro factor de transcripción adecuado conocido en la técnica. El gen indicador puede codificar beta (p)-galactosidasa, luciferasa, proteína fluorescente verde (GFP), cloranfenicol transferasa o cualquier otra proteína indicadora capaz de producir una señal detectable. Una línea celular adecuada que puede usarse para este bioensayo es el linfocito T BWZ.36/hTREM-1:DAP12: NFAT-LacZ (en la presente memoria también identificado como la “célula indicadora BWZ/hTREM-1”), cuya creación se describe en detalle en los ejemplos. Cuando se activa, la célula indicadora BWZ/hTREM-1 produce beta (p)-galactosidasa, cuya producción puede medirse usando equipos o kits conocidos en la técnica, tales como Beta Glow™ (Promega E4720, Madison, WI, EE. UU.) .
La primera célula o población de primeras células puede activarse mediante incubación con PGLYRP1 y, opcionalmente, un agente de multimerización. El agente de multimerización opcional actúa como andamio para PGLYRP1 y puede ser peptidoglicano (PGN), trampas extracelulares de neutrófilos (NET), ácido hialurónico, una estructura de proteoglicanos como versicano, agrecano, decorina o fibrina, o cualquier otra estructura o molécula de matriz natural que sea capaz de multimerizar o presentar PGLYRP1. La primera célula se puede activar mediante incubación con una o más segundas células que expresan PGLYRP1 en su superficie, o intracelularmente. Un ejemplo de expresión intracelular puede ser el almacenamiento de PGLYRP1 en gránulos secretores. Por lo tanto, la segunda célula puede ser cualquier célula (o población de células) que expresa o está transfectada con un gen que codifica PGLYRP1 y que expresa PGLYRP1 en su superficie. Dicha segunda célula puede ser una célula procariota o eucariota, tal como una célula de mamífero, tal como una célula CHO, una célula BHK o una célula HEK. La segunda célula también puede ser un neutrófilo activado. Los neutrófilos se pueden obtener a partir de la sangre o tejido completo de un individuo y se pueden usar a granel o como neutrófilos purificados. Cualquier agente que imita la activación bacteriana de los neutrófilos, como el peptidoglicano (PGN) de la pared celular de una bacteria, como PGN-SA, PGN-EB, PGN-EC, PGN-BS (InVivogen, tlrl-pgnsa, SanDiego, CA), se puede usar para activar un neutrófilo.
La actividad de la primera célula o población de primeras células es detectada y, preferiblemente, medida.
El cultivo de la primera célula y la o las segundas células que expresan PGLYRP1 y/o el cultivo de la primera célula incubada con PGLYRP1 y, opcionalmente, un agente de multimerización tal como PGN, se ponen en contacto con un anticuerpo contra PGLYRP1. La actividad de la primera célula o población de primeras células se detecta, y preferiblemente se mide.
De esta forma, se pueden identificar los anticuerpos que son capaces de unirse al ligando de TREM-1, PGLYRP1, y que influyen en la interacción de PGLYRP1 con TREM-1. Los anticuerpos anti-PGLYRP1 que causan un aumento en la actividad de la primera célula mejoran la interacción de PGLYRP1 con TREM-1 y se identifican en la presente memoria como “anticuerpos estimulantes de PGLYRP1”. Los anticuerpos anti-PGLYRP1 que causan una disminución en la actividad de la primera célula reducen, interfieren o bloquean la interacción de PGLYRP1 con TREM-1 y se identifican en la presente memoria como “anticuerpos inhibidores de PGLYRP1”. Los anticuerpos
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inhibidores de PGLYRP1 reducen o bloquean la activación y señalización de TREM-1.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para caracterizar la función de anticuerpos anti-PGLYRP1. Los anticuerpos capaces de unirse específicamente a PGLYRP1 y que tienen algún efecto sobre la activación de TREM-1 y señalización aguas abajo se denominan en la presente memoria “anticuerpos anti-PGLYRP1 funcionales”. En consecuencia, el término “anticuerpos anti-PGLYRP1 funcionales” pretende abarcar tanto anticuerpos anti- PGLYRP1 como anticuerpos anti- PGLYRP1 inhibidores.
Además, la presente invención se refiere a anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a PGLYRP1 y reducir, interferir o bloquear su interacción con TREM-1, reduciendo por lo tanto la activación de TREM-1 y la señalización aguas abajo. Los anticuerpos de la invención pueden tener una función inmunorreguladora, reduciendo la producción de citocinas de células mieloides que expresan TREM-1. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden reducir o prevenir la liberación de TNF-alfa (a), IL-1beta (b), IL-6, IFN-gamma (y), MIP-1beta (b), MCP-1, IL - 8 y/o GM-CSF de células mieloides tales como macrófagos y/o neutrófilos y/o células mieloides en tejido enfermo tal como tejido sinovial. Los anticuerpos de la invención pueden ser capaces de regular negativamente las respuestas de neutrófilos.
Los anticuerpos anti-PGLYRP1 de acuerdo con la invención pueden reducir o bloquear la activación de TREM-1 por medio de uno o una combinación de varios mecanismos diferentes, que afectan a TREM-1 directa o indirectamente. Los anticuerpos de la invención pueden evitar que PGLYRP1 cree un complejo funcional con TREM-1.
Los anticuerpos de la invención pueden bloquear la función de PGLYRP1 reduciendo o bloqueando la activación de TREM-1 y la señalización aguas abajo.
La presente invención también se refiere a anticuerpos anti-PGLYRP1 inhibidores que pueden identificarse por otros medios además del método divulgado aquí.
Los anticuerpos de la invención pueden ser capaces de unirse tanto a PGLYRP1 humano como a PGLYRP1 de una especie distinta de un ser humano. El término “PGLYRP1”, como se usa en la presente memoria, abarca cualquier forma de PGLYRP1 de origen natural de cualquier organismo adecuado, como una especie de invertebrado o una especie de vertebrado. PGLYRP1 para su uso como se describe en la presente memoria puede ser PGLYRP1 de vertebrado, tal como PGLYRP1 de mamífero, tal como PGLYRP1 de un primate (tal como un ser humano, un chimpancé, un mono cinomolgo o un mono rhesus); un roedor (como un ratón o una rata), un lagomorfo (como un conejo) o un artiodáctilo (como una vaca, oveja, cerdo o camello), entre otros. Preferiblemente, el PGLYRP1 es PGLYRP1 humano (SEQ ID NO: 1). El PGLYRP1 puede ser una forma madura de PGLYRP1 tal como una proteína PGLYRP1 que se ha sometido a un procesamiento postraduccional dentro de una célula adecuada. Dicha proteína PGLYRP1 madura puede, por ejemplo, estar glicosilada. El PGLYRP1 puede ser una proteína PGLYRP1 de longitud completa. El PGLYRP1 puede ser una variante de corte y empalme.
Los anticuerpos de la invención también pueden ser capaces de unirse específicamente a variantes de PGLYRP1 tales como la SEQ ID NO: 37 (PGLYRP1Tipo II 1.0) y/o la SEQ ID NO: 38 (PGLYRP1 Tipo II 1.0).
Los anticuerpos de la invención pueden ser capaces de influir, tal como inhibir/reducir/bloquear, la actividad (señalización y/o activación) tanto de TREM-1 humano como de TREM-1 de otra especie que no sea un ser humano. El término “TREM-1”, tal como se usa en la presente memoria, abarca de este modo cualquier forma de TREM-1 de origen natural que pueda derivarse de cualquier organismo adecuado. Por ejemplo, TREM-1 para su uso como se describe en la presente memoria puede ser TREM-1 de vertebrado, tal como TREM-1 de mamífero, tal como TREM-1 de un primate (tal como un ser humano, un chimpancé, un mono cinomolgo o un mono rhesus); un roedor (como un ratón o una rata), un lagomorfo (como un conejo) o un artiodáctilo (como una vaca, oveja, cerdo o camello), entre otros. Preferiblemente, el TREM-1 es TREM-1 humano. El TREM-1 puede ser una forma madura de TREM-1 tal como una proteína TREM-1 que se ha sometido a un procesamiento postraduccional dentro de una célula adecuada. Dicha proteína TREM-1 madura puede, por ejemplo, estar glicosilada. El TREM-1 puede ser una proteína TREM-1 de longitud completa. El TREM-1 puede ser una variante de corte y empalme.
El término “anticuerpo” en la presente memoria se refiere a una proteína, derivada de una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal, que es capaz de unirse específicamente a PGLYRP1 o una porción de la misma. El término incluye anticuerpos de longitud completa de cualquier isotipo (es decir, IgA, IgE, IgG, IgM y/o IgY) y cualquier cadena simple o fragmento del mismo. Un anticuerpo que se une específicamente a PGLYRP1, o una porción del mismo, puede unirse exclusivamente a PGLYRP1, o una porción del mismo, o puede unirse a un número limitado de antígenos homólogos, o porciones de los mismos.
Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos monoclonales, en el sentido de que pueden derivarse directa o indirectamente de un solo clon de un linfocito B. Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo monoclonal, con la condición de que no sea 188C424 (Thermo Scientific), 4H230 o 9A319 (US Biological) o Clon 6D653 (Santa Cruz Biotechnology).
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Los anticuerpos de la presente invención se pueden aislar. El término “anticuerpo aislado” se refiere a un anticuerpo que se ha separado y/o recuperado de otro/u otros componentes de su entorno natural y/o purificado a partir de una mezcla de componentes en su entorno natural.
Los anticuerpos pueden expresarse de forma recombinante en células procariotas, células eucariotas o un sistema acelular derivado de extractos celulares. La célula procariota puede ser E. coli. La célula eucariota puede ser una levadura, un insecto o un mamífero, como una célula derivada de un organismo que es un primate (como un ser humano, un chimpancé, un mono cinomolgo o un mono rhesus), un roedor (como un ratón o una rata), un lagomorfo (como un conejo) o un artiodáctilo (como una vaca, oveja, cerdo o camello). Todas las líneas de inmunización adecuadas incluyen, entre otras, células HEK293, células CHO y células HELA. Los anticuerpos anti-PGLYRP1 también se pueden producir por medio de otros métodos conocidos por los expertos en la materia, tales como una presentación en fagos o una presentación en levadura. Los anticuerpos de la invención pueden obtenerse in vivo inmunizando un mamífero adecuado con PGLYRP1, una célula que expresa PGLYRP1 o una combinación de ambos.
Los anticuerpos anti-PGLYRP1 se pueden producir, cribar y purificar usando, por ejemplo, los métodos descritos en los Ejemplos. En resumen, cualquier ratón adecuado, incluyendo un ratón con PGLYRP1 desactivado o un ratón con TREM-1 desactivado, puede inmunizarse con PGLYRP1, una célula que expresa PGLYRP1 o una combinación de ambos. El cribado primario de los sobrenadantes de hibridomas se puede realizar usando ELISA directo o FMAT y el cribado secundario se puede realizar usando citometría de flujo. Los sobrenadantes de hibridoma positivos, así como los anticuerpos purificados, se pueden cribar después para unirse a, por ejemplo, PGLYRP1 de longitud completa. Los sobrenadantes de hibridomas positivos o los anticuerpos purificados se pueden analizar a continuación para determinar su capacidad para reducir o bloquear la estimulación con PGLYRP1 de las células que llevan TREM-1. El método de la presente invención se puede usar para este propósito.
Los anticuerpos de longitud completa de la invención pueden comprender al menos cuatro cadenas polipeptídicas: es decir, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) que están interconectadas por enlaces disulfuro. Una subclase de inmunoglobulina de particular interés farmacéutico es la familia de la IgG, que se puede subdividir en isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Las moléculas IgG están compuestas por dos cadenas pesadas, interconectadas por dos o más enlaces disulfuro, y dos cadenas ligeras, cada una unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro. Una cadena pesada puede comprender una región variable de la cadena pesada (VH) y hasta tres regiones constantes de la cadena pesada (CH): CH1, CH2 y CH3. Una cadena ligera puede comprender una región variable de la cadena ligera (VL) y una región constante de la cadena ligera (CL). Las regiones Vh y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Las regiones VH y VL están generalmente compuestas por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, cDr3, FR4. Las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera forman un dominio [de unión] que es capaz de interactuar con un antígeno (PGLYRP1), mientras que la región constante de un anticuerpo puede mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedador, incluyendo, pero sin limitarse a varias células del sistema inmunitario (células efectoras), receptores de Fc y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico.
Los ejemplos de fragmentos de unión al antígeno incluyen Fab, Fab', F (ab)2, F(ab')2, F(ab)S, Fv (generalmente los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo), Fv monocatenario (scFv; véase, p. Bird et al., Science 1988; 242: 42S-426; y Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883), dsFv, Fd (generalmente el dominio VH y CHI) y dAb (generalmente un dominio VH); los dominios VH, VL, VhH y V-NAR; moléculas monovalentes que comprenden una sola cadena VH y una sola cadena VL; minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y cuerpos kappa (véase, p.ej., III et al., Protein Eng 1997; 10: 949-57); IgG de camello; IgNAR; así como una o más CDR aisladas o un parátopo funcional, donde las CDR aisladas o los restos o polipéptidos de unión al antígeno se pueden asociar o unir entre sí para formar un fragmento de anticuerpo funcional. Se han descrito o revisado diversos tipos de fragmentos de anticuerpos en, por ejemplo, Holliger y Hudson, Nat Biotechnol 2005; 2S: 1126-1136; el documento WO2005040219 y las Solicitudes de patente publicadas de los Estados Unidos 20050238646 y 20020161201.
Ciertos fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos pueden ser adecuados en el contexto de la presente invención, ya que se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. La expresión “fragmento de unión al antígeno” de un anticuerpo se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno, tal como PGLYRP1 humano o PGLYRP1 de otra especie, como se describe en la presente memoria. Los ejemplos de fragmentos de unión al antígeno incluyen Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)S, Fv (generalmente los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo), Fv monocatenario (scFv; véase, p.ej., Bird et al., Science 1988; 242:42S-426; y Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883), dsFv, Fd (generalmente el dominio VH y CHI) y dAb (generalmente un dominio VH); los dominios VH, VL, VhH y V-NAR; moléculas monovalentes que comprenden una sola cadena VH y una sola cadena VL; minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y cuerpos kappa (véase, p.ej., III et al., Protein Eng 1997; 10: 949-57); IgG de camello; IgNAR; así como una o más CDR aisladas o un parátopo funcional, donde las CDR aisladas o los restos o polipéptidos de unión al antígeno se pueden asociar o unir entre sí para formar un fragmento de anticuerpo funcional. Se han descrito o revisado diversos tipos de fragmentos
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de anticuerpos en, por ejemplo, Holliger y Hudson, Nat Biotechnol 2005; 2S:1126-1136; el documento WO2005040219 y las Solicitudes de patente publicadas de los Estados Unidos 20050238646 y 20020161201. Estos fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y los fragmentos pueden cribarse según su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.
Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. La expresión “anticuerpo humano”, como se usa en la presente memoria, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las que al menos una porción de una región marco y/o al menos una porción de una región CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. (Por ejemplo, un anticuerpo humano puede tener regiones variables en las que las regiones marco y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana). Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también deriva de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (p.ej., mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo).
Dicho anticuerpo humano puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Dicho anticuerpo monoclonal humano puede producirse por un hibridoma que incluye un linfocito B obtenido de un animal transgénico no humano, p.ej., un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada.
Los anticuerpos humanos se pueden aislar a partir de bibliotecas de secuencias construidas sobre selecciones de secuencias de línea germinal humana, diversificadas adicionalmente con diversidad de secuencia natural y sintética.
Los anticuerpos humanos pueden prepararse por inmunización in vitro de linfocitos humanos seguido de transformación de los linfocitos con el virus de Epstein-Barr.
La expresión “derivado de anticuerpo humano” se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, tal como un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.
La expresión “anticuerpo humanizado”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo quimérico humano/no humano que contiene una o más secuencias (regiones CDR) derivadas de una inmunoglobulina no humana. Un anticuerpo humanizado es, por tanto, una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que al menos los restos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como un ratón, rata, conejo o primate no humano, que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de FR de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los restos no humanos correspondientes. Un ejemplo de tal modificación es la introducción de una o más mutaciones llamadas retromutaciones.
Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá al menos un dominio, generalmente dos variables, en el que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y en las que todos o sustancialmente todos los restos FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede, opcionalmente, comprender también al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), generalmente la de una inmunoglobulina humana.
La expresión “derivado de anticuerpo humanizado” se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humanizado, tal como un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.
La expresión “anticuerpo quimérico”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo cuyos genes de la cadena ligera y pesada se han construido, generalmente mediante ingeniería genética, a partir de genes de la región constante y variable de la inmunoglobulina que proceden de diferentes especies. Por ejemplo, los segmentos variables de los genes de un anticuerpo monoclonal de ratón se pueden unir a segmentos constantes humanos.
La región cristalizable del fragmento (“región FcTdominio Fc”) de un anticuerpo es la región N-terminal de un anticuerpo, que comprende los dominios constantes CH2 y CH3. El dominio Fc puede interactuar con los receptores de la superficie celular llamados receptores Fc, así como algunas proteínas del sistema del complemento. La región Fc permite que los anticuerpos interactúen con el sistema inmunitario. En un aspecto de la invención, los anticuerpos pueden diseñarse para incluir modificaciones dentro de la región Fc, generalmente para alterar una o más de sus propiedades funcionales, tales como la semivida en suero, fijación del complemento, unión al receptor Fc, estabilidad proteica y/o citotoxicidad celular dependiente del antígeno, o falta de ella, entre otros. Además, un anticuerpo de la invención puede modificarse químicamente (por ejemplo, uno o más restos químicos se pueden unir al anticuerpo) o modificarse para alterar su glucosilación, nuevamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Preferiblemente, un dominio Fc modificado comprende una o más, y quizás todas las siguientes mutaciones que darán como resultado una afinidad disminuida para ciertos receptores de Fc (L234A, L235E y G237A) y en una fijación de complemento mediada por C1q reducida (A330S y P331S), respectivamente
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(numeración de restos según el índice de la UE).
El isotipo de un anticuerpo de la invención puede ser una IgG, tal como IgG1, tal como IgG2, tal como IgG4. Si se desea, la clase de un anticuerpo puede “cambiarse” por técnicas conocidas. Por ejemplo, un anticuerpo que se produjo originalmente como una molécula de IgM se puede cambiar de clase a un anticuerpo IgG. Las técnicas de intercambio de clases también se pueden usar para convertir una subclase IgG en otra, por ejemplo: de IgG1 a IgG2 o IgG4; de IgG2 a IgG1 o IgG4; o de IgG4 a IgG1 o IgG2. También se puede llevar a cabo la ingeniería de anticuerpos para generar moléculas quiméricas de la región constante, mediante la combinación de regiones de diferentes subclases de IgG.
En una realización, la región bisagra de CH1 se modifica de manera que el número de restos de cisteína en la región bisagra se altera, por ejemplo, aumenta o disminuye. Este enfoque se describe adicionalmente, por ejemplo, en la solicitud de patente US-5.677.425 de Bodmer et al.
La región constante puede modificarse adicionalmente para estabilizar el anticuerpo, por ejemplo, para reducir el riesgo de que un anticuerpo bivalente se separe en dos fragmentos monovalentes de VH-VL. Por ejemplo, en una región constante de IgG4, el resto S241 puede mutarse a un resto de prolina (P) para permitir la formación completa del puente de disulfuro en la bisagra (véase, p.ej., Angal et al., Mol lmmunol. 199S; 30:105-8).
Los anticuerpos o fragmentos de los mismos también pueden definirse en términos de sus regiones determinantes de la complementariedad (CDR). El término “región determinante de la complementariedad” o “región hipervariable”, cuando se usa en la presente memoria, se refiere a las regiones de un anticuerpo en las que están situados los restos de aminoácidos implicados en la unión al antígeno. Las CDR generalmente están compuestas por restos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; (Kabat et al. (1991) Secuencias de proteínas de interés inmunológico, quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., Publicación NIH N.° 913242) y/o aquellos restos de un “bucle hipervariable” (restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53 -55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196:901-917). Generalmente, la numeración de los restos de aminoácidos en esta región se realiza mediante el método descrito en Kabat et al., supra. Frases tales como “posición de Kabat”, “resto de Kabat” y “de acuerdo con Kabat” en la presente memoria se refieren a este sistema de numeración de los dominios variables de la cadena pesada o los dominios variables de la cadena ligera. Usando el sistema de numeración de Kabat, la secuencia de aminoácidos lineal real de un péptido puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento o inserción en un marco (FR) o CDR del dominio variable. Por ejemplo, el dominio variable de una cadena pesada puede incluir inserciones de aminoácidos (resto 52a, 52b y 52c de acuerdo con Kabat) después del resto 52 de CDR H2 y restos insertados (p.ej. restos 82a, 82b y 82c, etc., de acuerdo con Kabat) después del resto FR de la cadena pesada 82. La numeración de los restos de Kabat puede determinarse para un anticuerpo dado por alineamiento en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat “estándar”.
El término restos de la “región marco” o “FR” se refiere a aquellos restos de aminoácidos VH o VL que no están dentro de las CDR, como se define en la presente memoria.
Un anticuerpo de la invención puede comprender una región CDR de uno o más de los anticuerpos específicos divulgados en la presente memoria, tal como una región CDR de las SEQ ID NOs: 15, 16, 19, 20, 23, 24, 27, 28, 31, 32, 35 o 36.
El anticuerpo 1F36 tiene una cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera como se muestra en SEQ ID NO: 16. Un anticuerpo de la invención puede comprender esta secuencia variable de la cadena pesada y/o esta secuencia variable de la cadena ligera. El anticuerpo 1F36 tiene las secuencias de CDR mostradas en los aminoácidos 31 a 35, 50 a 66 y 98 a 108 de SEQ ID NO: 15 y los aminoácidos 24 a 34, 51 a 56 y 89 a 97 de SEQ ID NO: 16. Un anticuerpo de la invención puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o las 6 de estas secuencias de CDR.
Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede comprender: una secuencia CDRH1 que corresponde a los restos de aminoácidos 31 a 35 (SYWMN) de SEQ ID NO: 15, en la que uno de estos restos de aminoácidos puede estar sustituido por un resto de aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRH2 que corresponde a los aminoácidos 50 a 66 (MIHPSDSETRLNQKFKD) de SEQ ID NO: 15, en la que uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un resto de aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRH3 que corresponde a los restos de aminoácidos 98 a 108 (DYSDYDGFAY)) de SEQ ID NO: 15, en la que uno, dos o tres de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente.
Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede comprender: una secuencia CDRL1 que corresponde a los restos de aminoácidos 24 a 34 (RASQSISDYLH) de SEQ ID NO: 16, en la que uno, dos o tres de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRL2 que corresponde a los restos de aminoácidos 51 a 56 (ASQSIS) de SEQ ID NO: 16, en la que uno o dos de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRL3 que corresponde a los restos de
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aminoácidos 89 a 97 (QNGHSFPLT) de SEQ ID NO: 16, en la que uno o dos de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos con un aminoácido diferente.
El anticuerpo 1F10 tiene una cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 19 y una cadena ligera como se muestra en la SEQ ID NO: 20. Un anticuerpo de la invención puede comprender esta secuencia variable de la cadena pesada y/o esta secuencia variable de la cadena ligera. El anticuerpo 1F10 tiene las secuencias CDR mostradas en los aminoácidos 31 a 35, 50 a 66 y 99 a 109 de SEQ ID NO: 19 y los aminoácidos 24 a 33, 49 a 55 y 88 a 96 de SEQ ID NO: 20. El anticuerpo de la invención puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o las 6 de estas secuencias CDR.
Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede comprender: una secuencia CDRH1 que corresponde a los restos de aminoácidos 31 a 35 (DYNMY) de SEQ ID NO: 19, en la que uno de estos restos de aminoácidos puede estar sustituido con un resto de aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRH2 que corresponde a los aminoácidos 50 a 66 (YIDPYNGDTSYNQKFKG) de SEQ ID NO: 19, en la que uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un resto de aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRH3 que corresponde a los restos de aminoácidos 99 a 109 (GDYGNPFYLDY) de SEQ ID NO: 19, en la que uno, dos o tres de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente.
Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede comprender una secuencia CDRL1 que corresponde a los restos de aminoácidos 24 a 33 (SVSSSVNYMY) de SEQ ID NO: 20, en la que uno, dos o tres de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRL2 que corresponde a los restos de aminoácidos 49 a 55 (DTSKLPS) de SEQ ID NO: 20, en la que uno o dos de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRL3 que corresponde a los restos de aminoácidos 88 a 96 (QQWTSNPPT) de SEQ ID NO: 20, en la que uno o dos de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos con un aminoácido diferente.
El anticuerpo 1F105 tiene una cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 23 y una cadena ligera como se muestra en la SEQ ID NO: 24. Un anticuerpo de la invención puede comprender esta secuencia variable de la cadena pesada y/o esta secuencia variable de la cadena ligera. El anticuerpo 1F105 tiene las secuencias CDR mostradas en los aminoácidos 31 a 35, 50 a 66 y 99 a 108 de SEQ ID NO: 23 y los aminoácidos 24 a 33, 49 a 55 y 88 a 96 de SEQ ID NO: 24. El anticuerpo de la invención puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o las 6 de estas secuencias CDR.
Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede comprender: una secuencia CDRH1 que corresponde a los restos de aminoácidos 31 a 35 (DTYIH) de SEQ ID NO: 23, en la que uno de estos restos de aminoácidos puede estar sustituido por un resto de aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRH2 que corresponde a los aminoácidos 50 a 66 (RIDPANDDTKYDPNFQG) de SEQ ID NO: 23, en la que uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un resto de aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRH3 que corresponde a los restos de aminoácidos 99 a 108 (SDNSDSWFAY) de SEQ ID NO: 23, en la que uno, dos o tres de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente.
Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede comprender: una secuencia CDRL1 que corresponde a los restos de aminoácidos 24 a 33 (SVSSSVNFMN) de SEQ ID NO: 24, en la que uno, dos o tres de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRL2 que corresponde a los restos de aminoácidos 49 a 55 (DTSKLAP) de SEQ ID NO: 24, en la que uno o dos de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRL3 que corresponde a los restos de aminoácidos 88 a 96 (HQWSSYSLT) de SEQ ID NO: 24, en la que uno o dos de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos con un aminoácido diferente.
El anticuerpo 1F95 tiene una cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 27 y una cadena ligera como se muestra en la SEQ ID NO: 28. Un anticuerpo de la invención puede comprender esta secuencia variable de la cadena pesada y/o esta secuencia variable de la cadena ligera. El anticuerpo 1F95 tiene las secuencias CDR mostradas en los aminoácidos 31 a 35, 50 a 66 y 99 a 106 de SEQ ID NO: 27 y los aminoácidos 24 a 33, 49 a 54 y 87 a 95 de SEQ ID NO: 28. Un anticuerpo de la invención puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o las 6 de estas secuencias CDR.
Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede comprender: una secuencia CDRH1 que corresponde a los restos de aminoácidos 31 a 35 (DYNMH) de la SEQ ID NO: 27, en la que uno de estos restos de aminoácidos puede estar sustituido con un resto de aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRH2 que corresponde a los aminoácidos 50 a 66 (YVDPYDGGTSSNQKFKG) de SEQ ID NO: 27, en la que uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un resto de aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRH3 que corresponde a los restos de aminoácidos 99 a 106 (EVPYYFDY) de SEQ ID NO: 27, en la que uno, dos o tres de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente.
Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede comprender: una secuencia CDRL1 que corresponde a los restos de aminoácidos 24 a 33 (VASSSVTYMY) de SEQ ID NO: 28, en la que uno, dos o tres de estos restos de
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aminoácidos pueden estar sustituidos con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRL2 que corresponde a los restos de aminoácidos 49 a 54 (THPLAS) de SEQ ID NO: 28, en la que uno o dos de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRL3 que corresponde a los restos de aminoácidos 87 a 95 (PHWNTNPPT) de SEQ ID NO: 28, en la que uno o dos de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos con un aminoácido diferente.
El anticuerpo 2F5 tiene una cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 31 y una cadena ligera como se muestra en la SEQ ID NO: 32. Un anticuerpo de la invención puede comprender esta secuencia variable de la cadena pesada y/o esta secuencia variable de la cadena ligera. El anticuerpo 2F5 tiene las secuencias CDR mostradas en los aminoácidos 31 a 35, 50 a 66 y 99 a 109 de SEQ ID NO: 31 y los aminoácidos 24 a 33, 49 a 55 y
88 a 96 de SEQ ID NO: 32. Un anticuerpo de la invención puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o las 6 secuencias CDR.
Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede comprender: una secuencia CDRH1 que corresponde a los restos de aminoácidos 31 a 35 (DYYMY) de SEQ ID NO: 31, en la que uno de estos restos de aminoácidos puede estar sustituido por un resto de aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRH2 que corresponde a los aminoácidos 50 a 66 (AISDDSTYTYYPDSVKG) de SEQ ID NO: 31, en la que uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un resto de aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRH3 que corresponde a los restos de aminoácidos 99 a 109 (GGYGNLYAMDY) de SEQ ID NO: 31, en la que uno, dos o tres de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente.
Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede comprender: una secuencia CDRL1 que corresponde a los restos de aminoácidos 24 a 35 (TASSSVSSSYlH) de SEQ ID NO: 32, en la que uno, dos o tres de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRL2 que corresponde a los restos de aminoácidos 51-57 (STSNLAS) de SEQ ID NO: 32, en la que uno o dos de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRL3 que corresponde a los restos de aminoácidos 90-98 (HQYHRSPFT) de SEQ ID NO: 32, en la que uno o dos de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos con un aminoácido diferente.
El anticuerpo 2F7 tiene una cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 35 y una cadena ligera como se muestra en la SEQ ID NO: 36. Un anticuerpo de la invención puede comprender esta secuencia variable de la cadena pesada y/o esta secuencia variable de la cadena ligera. El anticuerpo 2F5 tiene las secuencias CDR mostradas en los aminoácidos 31 a 35, 50 a 66 y 99 a 109 de SEQ ID NO: 35 y los aminoácidos 24 a 34, 50 a 56 y
89 a 96 de SEQ ID NO: 36. El anticuerpo de la invención puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o las 6 secuencias CDR.
Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede comprender: una secuencia CDRH1 que corresponde a los restos de aminoácidos 31 a 35 (NYVMH) de SEQ ID NO: 35, en la que uno de estos restos de aminoácidos puede estar sustituido por un resto de aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRH2 que corresponde a los aminoácidos 50 a 66 (WINPFNDGTNYNENFKN) de SEQ ID NO: 35, en la que uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un resto de aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRH3 que corresponde a los restos de aminoácidos 99 a 109 (SGFITTLIEDY) de SEQ ID NO: 35, en la que uno, dos o tres de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente.
Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede comprender: una secuencia CDRL1 que corresponde a los restos de aminoácidos 24 a 34 (KASESVGSFVS) de SEQ ID NO: 36, en la que uno, dos o tres de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRL2 que corresponde a los restos de aminoácidos 50 a 56 (GASNRYT) de SEQ ID NO: 36, en la que uno o dos de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDRL3 que corresponde a los restos de aminoácidos 89 a 96 (GQYYTHPT) de SEQ ID NO: 36, en la que uno o dos de estos restos de aminoácidos pueden estar sustituidos con un aminoácido diferente.
El término “antígeno” (Ag) se refiere a la entidad molecular utilizada para inmunizar un vertebrado inmunocompetente para producir el anticuerpo (Ab) que reconoce el Ag. En la presente memoria, Ag se denomina de manera más amplia y generalmente pretende incluir moléculas diana que son específicamente reconocidas por el Ab, incluyendo así fragmentos o imitaciones de la molécula utilizada en el proceso de inmunización, u otro proceso, p.ej., presentación en fago, utilizada para generar el Ab.
El término “epítopo”, como se usa en la presente memoria, se define en el contexto de una interacción molecular entre un “polipéptido de unión al antígeno”, tal como un anticuerpo (Ab), y su correspondiente antígeno (Ag). Generalmente, “epítopo” se refiere al área o región de un Ag al que se une específicamente el antígeno, es decir, el área o región que entra en contacto físico con el Ab. El contacto físico se puede definir usando varios criterios (por ejemplo, un límite de distancia de 2-6Á, como 3Á, como 4Á, como 5Á, o accesibilidad del disolvente) para los átomos de las moléculas de Ab y Ag. Un epítopo de proteína puede comprender restos de aminoácidos en el Ag que están directamente implicados en la unión a un Ab (también llamado el componente inmunodominante del epítopo) y otros restos de aminoácidos, que no están directamente implicados en la unión, tales como restos de aminoácidos de los Ag que están efectivamente bloqueados por el Ab, es decir, restos de aminoácidos dentro de la “superficie excluida del disolvente” y/o la “huella” del Ab.
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El término epítopo en la presente memoria comprende ambos tipos de región de unión en cualquier región particular de PGLYRP1 que se une específicamente a un anticuerpo anti-PGLYRP1. PGLYRP1 puede comprender varios epítopos diferentes, que pueden incluir, sin limitación, epítopos conformacionales que consisten en uno o más aminoácidos no contiguos localizados cerca uno del otro en la conformación de PGLYRP1 madura y epítopos postraduccionales que consisten, ya sea en su totalidad o en parte, en las estructuras moleculares unidas covalentemente a PGLYRP1, como los grupos carbohidratos. PGLYRP1 también puede comprender epítopos lineales.
El epítopo para un par de anticuerpo (Ab)/antígeno (Ag) dado se puede describir y caracterizar a diferentes niveles de detalle usando varios métodos de cartografía de epítopos experimentales y computacionales. Los métodos experimentales incluyen mutagénesis, cristalografía de rayos X, espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN), espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HX-MS) y diversos métodos de unión competitiva; métodos que son conocidos en la técnica. Como cada método se basa en un principio único, la descripción de un epítopo está íntimamente ligada al método por el que se ha determinado. Por lo tanto, dependiendo del método de cartografía de epítopos empleado, el epítopo para un par Ab/Ag dado se puede describir de manera diferente.
En su nivel más detallado, el epítopo para la interacción entre el Ag y el Ab se puede describir mediante las coordenadas espaciales que definen los contactos atómicos presentes en la interacción Ag-Ab, así como la información acerca de sus contribuciones relativas a la termodinámica de la unión. En un nivel menos detallado, el epítopo se puede caracterizar por las coordenadas espaciales que definen los contactos atómicos entre Ag y Ab. A un nivel incluso menos detallado, el epítopo se puede caracterizar por los restos de aminoácidos que comprende como se define por un criterio específico tal como la distancia o la accesibilidad del disolvente de los átomos en el complejo Ab:Ag. A un nivel menos detallado, el epítopo se puede caracterizar mediante la función, p.ej., por unión competitiva con otros Abs. El epítopo también puede definirse más genéricamente como que comprende restos de aminoácidos para los cuales la sustitución por otro aminoácido alterará las características de la interacción entre Ab y Ag.
En el contexto de una estructura cristalina derivada de rayos X definida por coordenadas espaciales de un complejo entre un Ab, p.ej., un fragmento Fab, y su Ag, el término epítopo en la presente memoria, a menos que se especifique o contradiga por el contexto, está específicamente definido como restos de PGLYRP1 caracterizados por tener un átomo pesado (es decir, un átomo distinto de hidrógeno) a una distancia de, por ejemplo, 2-6 Á, como 3 Á, como 4 Á, como 5 Á de un átomo pesado en el Ab.
Partiendo del hecho de que las descripciones y definiciones de epítopos, dependientes del método de cartografía del epítopo utilizado, se obtienen con diferentes niveles de detalle, se deduce que la comparación de epítopos para diferentes Ab en el mismo Ag puede realizarse de manera similar con diferentes niveles de detalle.
Los epítopos descritos a nivel de aminoácidos, p.ej., determinados a partir de una estructura de rayos X, se dice que son idénticos si contienen el mismo conjunto de restos de aminoácidos. Se dice que los epítopos se solapan si los epítopos comparten al menos un aminoácido. Se dice que los epítopos están separados (únicos) si los epítopos no comparten restos de aminoácidos.
La definición del término “parátopo” se deriva de la definición anterior de “epítopo” invirtiendo la perspectiva. Así, el término “parátopo” se refiere al área o región del Ab al que se une específicamente a un Ag, es decir, donde establece el contacto físico con el Ag.
En el contexto de una estructura cristalina derivada de rayos X, definida por coordenadas espaciales de un complejo entre un Ab, tal como un fragmento Fab y su Ag, el término parátopo en la presente memoria, a menos que el contexto especifique o contradiga lo contrario, está definido específicamente como residuos de Ag caracterizados por tener un átomo pesado (es decir, un átomo que no es hidrógeno) a una distancia de 4 Á de un átomo pesado en el PGLYRP1.
El epítopo y el parátopo para un par determinado de anticuerpo (Ab)/antígeno (Ag) se pueden identificar mediante métodos de rutina. Por ejemplo, la ubicación general de un epítopo se puede determinar evaluando la capacidad de un anticuerpo para unirse a diferentes fragmentos o polipéptidos PGLYRP1 variantes. Los aminoácidos específicos dentro de PGLYRP1 que entran en contacto con un anticuerpo (epítopo) y los aminoácidos específicos en un anticuerpo que entran en contacto con PGLYRP1 (parátopo) también se pueden determinar usando métodos de rutina. Por ejemplo, el anticuerpo y la molécula diana se pueden combinar y el complejo Ab:Ag se puede cristalizar. La estructura cristalina del complejo puede determinarse y usarse para identificar sitios específicos de interacción entre el anticuerpo y su diana.
Los anticuerpos que se unen al mismo antígeno se pueden caracterizar con respecto a su capacidad para unirse simultáneamente a su antígeno común y se pueden someter a “unión competitiva”/”agrupamiento”. En el presente contexto, el término “agrupamiento” se refiere a un método de agrupación de anticuerpos que se unen al mismo antígeno. El “agrupamiento” de anticuerpos puede basarse en la competición de unión de dos anticuerpos a su
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antígeno común en ensayos basados en técnicas convencionales tales como resonancia de plasmón superficial (SPR), ELISA o citometría de flujo.
Una “familia” de un anticuerpo se define usando un anticuerpo de referencia. Si un segundo anticuerpo es incapaz de unirse a un antígeno al mismo tiempo que el anticuerpo de referencia, se dice que el segundo anticuerpo pertenece a la misma “familia” que el anticuerpo de referencia. En este caso, la referencia y el segundo anticuerpo se unen competitivamente a la misma parte de un antígeno y se denominan “anticuerpos competidores”. Si un segundo anticuerpo es capaz de unirse a un antígeno al mismo tiempo que el anticuerpo de referencia, se dice que el segundo anticuerpo pertenece a una “familia” diferente. En este caso, el antígeno de referencia y el segundo anticuerpo no se unen competitivamente a la misma parte de un antígeno y se denominan “anticuerpos no competitivos”.
El “agrupamiento” de anticuerpos no proporciona información directa sobre el epítopo. Los anticuerpos competitivos, es decir, los anticuerpos pertenecientes a la misma “familia” pueden tener epítopos idénticos, epítopos solapantes o incluso epítopos separados. Este último es el caso cuando el anticuerpo de referencia unido a este epítopo en el antígeno ocupa el espacio requerido para que el anticuerpo secundario entre en contacto con un epítopo en el antígeno (“impedimento estérico”). Los anticuerpos no competitivos generalmente tienen epítopos separados.
Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede ser capaz de competir con 1F10 por la unión a PGLYRP1. Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede ser capaz de competir con 1F36/mAb 0182 por la unión a PGLYRP1. Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede ser capaz de competir con 1F95 por la unión a PGLYRP1. Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede ser capaz de competir con 1F105/mAb 0184 por la unión a PGLYRP1. Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede ser capaz de competir con 2F5 por la unión a PGLYRP1. Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede ser capaz de competir con 2F7 por la unión a PGLYRP1. Por lo tanto, un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede pertenecer a la misma familia que uno o más de estos anticuerpos.
La expresión “afinidad de unión” en la presente memoria se refiere a una medición de la potencia de una interacción no covalente entre dos moléculas, p.ej., un anticuerpo, o fragmento del mismo, y un antígeno. La expresión “afinidad de unión” se usa para describir interacciones monovalentes (actividad intrínseca).
La afinidad de unión entre dos moléculas, p.ej., un anticuerpo, o fragmento del mismo, y un antígeno, a través de una interacción monovalente puede cuantificarse determinando la constante de disociación en equilibrio (KD). A su vez, Kd puede determinarse mediante la medición de la cinética de formación de complejo y la disociación, p.ej., por el método SPR. Las constantes de velocidad correspondientes a la asociación y la disociación de un complejo monovalente se conocen como la constante de velocidad de asociación ka (o kon) y la constante de velocidad de disociación kd (o koff), respectivamente. Kd está relacionada con ka y kd a través de la ecuación Kd = kd/ka.
Siguiendo la definición anterior, las afinidades de unión asociadas con diferentes interacciones moleculares, tales como la comparación de la afinidad de unión de diferentes anticuerpos para un antígeno dado, se pueden comparar mediante la comparación de los valores Kd para los complejos anticuerpo/antígeno individuales.
Un anticuerpo anti-PGLYRP1 de la invención puede tener una KD para su diana (PGLYRP1) de 1 x 10"6 M o menos,
7 1 o 1 9 1 10 ' ' 11 12
1 x 10" M o menos, 1 x 10" M o menos, o 1 x 10" M o menos, o 1 x 10" M o menos, 1 x 10" M o menos, 1 x 10"
M o menos o 1 x 10"13 M o menos.
Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede competir con otra molécula, tal como un ligando o receptor de origen natural u otro anticuerpo, para unirse a PGLYRP1. Por lo tanto, un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede unirse a PGLYRP1 con una mayor afinidad que la de otra molécula también capaz de unirse a PGLYRP1. La capacidad de un anticuerpo para competir con un ligando/receptor natural por la unión a un antígeno puede evaluarse determinando y comparando el valor KD para las interacciones de interés, como una interacción específica entre un anticuerpo y un antígeno, con la del valor KD de una interacción que no es de interés.
La expresión “especificidad de unión” en la presente memoria se refiere a la interacción de una molécula tal como un anticuerpo, o fragmento de la misma, con un único antígeno exclusivo, o con un número limitado de antígenos (o epítopos) altamente homólogos. Los anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a PGLYRP1 no son capaces de unirse a moléculas diferentes. Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden no ser capaces de unirse a miembros de la familia PGLYRP humano tales como PGLYRP2, PGLYRP3 y PGLYRP4. Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden no ser capaces de unirse a miembros de la familia PGLYRP humano tales como PGLYRP2 humano, PGLYRP3 humano y pGlYRP4 humano.
La especificidad de una interacción y el valor de una constante de unión en equilibrio pueden determinarse directamente por métodos bien conocidos. Los ensayos estándar para evaluar la capacidad de los ligandos (tales como anticuerpos) para unir sus dianas son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ELISA, transferencias Western, RIA y análisis de citometría de flujo. La cinética de unión y la afinidad de unión del anticuerpo también puede evaluarse mediante ensayos estándar conocidos en la técnica, tales como SPR.
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Se puede llevar a cabo un ensayo de unión competitiva en el que la unión del anticuerpo a la diana se compara con la unión de la diana por otro ligando de esa diana, tal como otro anticuerpo.
En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones y formulaciones que comprenden moléculas de la invención, tales como los anticuerpos anti-PGLYRP1, polinucleótidos, vectores y células descritos en la presente memoria. Por ejemplo, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos anti-PGLYRP1 de la invención, formulados junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Por consiguiente, un objetivo de la invención es proporcionar una formulación farmacéutica que comprenda dicho anticuerpo anti-PGLYRP1 que esté presente en una concentración de 0,25 mg/ml a 250 mg/ml, y en el que dicha formulación tenga un pH de 2,0 a 10,0. La formulación puede comprender además uno o más de un sistema tampón, un conservante, un agente de tonicidad, un agente quelante, un estabilizador o un tensioactivo, así como diversas combinaciones de los mismos. El uso de conservantes, agentes isotónicos, agentes quelantes, estabilizantes y tensioactivos en composiciones farmacéuticas es bien conocido por la persona experta. Cabe hacer referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, 1995.
En una realización, la formulación farmacéutica es una formulación acuosa. Dicha formulación es generalmente una solución o una suspensión, pero también puede incluir coloides, dispersiones, emulsiones y materiales de múltiples fases. La expresión “formulación acuosa” se define como una formulación que comprende al menos 50 % p/p de agua. Asimismo, la expresión “solución acuosa” se define como una solución que comprende al menos 50 % p/p de agua, y la expresión “suspensión acuosa” se define como una suspensión que comprende al menos 50 % p/p de agua.
En otra realización, la formulación farmacéutica es una formulación liofilizada, a la que el médico o el paciente añade disolventes y/o diluyentes antes del uso.
En un aspecto adicional, la formulación farmacéutica comprende una solución acuosa de dicho anticuerpo y un tampón, en el que el anticuerpo está presente en una concentración de 1 mg/ml o superior, y en el que dicha formulación tiene un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0.
Los anticuerpos anti-PGLYRP1 de la presente invención y las composiciones farmacéuticas que comprenden tales anticuerpos se pueden usar para el tratamiento de enfermedades inflamatorias tales como las siguientes: enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn (EC), colitis ulcerosa (CU), síndrome del intestino irritable, artritis reumatoide (AR), psoriasis, artritis psoriásica, lupus eritematoso sistémico (LES), nefritis lúpica, diabetes tipo I, enfermedad de Grave, esclerosis múltiple (EM), miocarditis autoinmunitaria, enfermedad de Kawasaki, cardiopatía coronaria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad pulmonar intersticial, tiroiditis autoinmunitaria, esclerodermia, esclerosis sistémica, artrosis, dermatitis atópica, vitíligo, enfermedad de injerto contra huésped, síndrome de Sjogrens, nefritis autoinmunitaria, síndrome de Goodpasture, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, alergia, asma y otras enfermedades autoinmunitarias que son el resultado de una inflamación aguda o crónica. Los anticuerpos anti-PGLYRP1 de la presente invención y las composiciones farmacéuticas que comprenden tales anticuerpos se pueden usar para el tratamiento de la enfermedad cardiovascular, el ictus, la lesión por reperfusión de isquemia, la neumonía, la sepsis y el cáncer.
Los anticuerpos anti-PGLYRP1 de la invención son adecuados para su uso en el tratamiento de individuos con enfermedad inflamatoria intestinal. La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una enfermedad que puede afectar cualquier parte del tracto gastrointestinal desde la boca hasta el ano, causando una amplia variedad de síntomas. La EII causa principalmente dolor abdominal, diarrea (que puede ser sanguinolenta), vómitos o pérdida de peso, pero también puede causar complicaciones fuera del tracto gastrointestinal, como erupciones cutáneas, artritis, inflamación de los ojos, fatiga y falta de concentración. Los pacientes con EII pueden dividirse en dos clases principales, aquellos con colitis ulcerosa (CU) y aquellos con enfermedad de Crohn (EC). Aunque la EC generalmente afecta al íleon y al colon, puede afectar a cualquier región del intestino, pero a menudo es discontinua (áreas focalizadas de enfermedad diseminadas por todo el intestino), la CU siempre afecta al recto (colon) y es más continua. En la EC, la inflamación es transmural, lo que produce abscesos, fístulas y estenosis, mientras que en la CU, la inflamación generalmente se limita a la mucosa. No se conoce una cura farmacéutica o quirúrgica para la enfermedad de Crohn, mientras que algunos pacientes con CU pueden curarse mediante la extirpación quirúrgica del colon. Las opciones de tratamiento se limitan a controlar los síntomas, mantener la remisión y prevenir la recaída. La eficacia en la enfermedad inflamatoria intestinal en la clínica se puede medir como una reducción en la puntuación del Índice de actividad de la enfermedad de Crohn (CDAI) para la EC, que es una escala de puntuación basada en pruebas de laboratorio y un cuestionario de calidad de vida. En modelos animales, la eficacia se mide principalmente por el aumento de peso y también por un Índice de actividad de la enfermedad (DAI), que es una combinación de consistencia de las heces, peso y sangre en las heces.
Los anticuerpos anti-PGLYRP1 de la invención son adecuados para su uso en el tratamiento de individuos con artritis reumatoide. La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad sistémica que afecta a casi todo el cuerpo y es una de las formas más comunes de artritis. Se caracteriza por la inflamación de la articulación, que causa dolor, rigidez, calor, enrojecimiento e hinchazón. Esta inflamación es una consecuencia de las células inflamatorias que
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invaden las articulaciones, y estas células inflamatorias liberan enzimas que pueden digerir el hueso y el cartílago. Como resultado, esta inflamación puede provocar daños severos en los huesos y cartílagos y deterioro de las articulaciones y dolor severo, entre otros efectos fisiológicos. La articulación afectada puede perder su forma y alineación, lo que produce dolor y pérdida de movimiento.
Existen varios modelos animales para la artritis reumatoide conocidos en la técnica. Por ejemplo, en el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA), los ratones desarrollan una artritis inflamatoria que se parece a la artritis reumatoide humana. Dado que la CIA comparte características inmunológicas y patológicas similares con la AR, esto lo convierte en un modelo adecuado para detectar posibles compuestos antiinflamatorios humanos. La eficacia en este modelo se mide por la disminución de la inflamación articular. La eficacia en la AR en la clínica se mide por la capacidad de reducir los síntomas en pacientes que se mide como una combinación de inflamación de las articulaciones, velocidad de sedimentación globular, niveles de proteína C reactiva y niveles de factores séricos, como anticuerpos anti-proteínas citrulinadas.
Los anticuerpos anti-PGLYRP1 de la invención son adecuados para su uso en el tratamiento de individuos con psoriasis. La psoriasis es un trastorno inflamatorio de la piel mediado por linfocitos T que puede causar incomodidad considerable. Es una enfermedad para la que actualmente no existe cura y afecta a personas de todas las edades. Aunque las personas con psoriasis leve a menudo pueden controlar su enfermedad con agentes tópicos, más de un millón de pacientes en todo el mundo requieren tratamientos con luz ultravioleta o terapia inmunosupresora sistémica. Desafortunadamente, los inconvenientes y riesgos de la radiación ultravioleta y las toxicidades de muchas terapias limitan su uso a largo plazo. Además, los pacientes generalmente tienen recurrencia de la psoriasis, y en algunos casos se recuperan poco después de suspender la terapia inmunosupresora. Un modelo de psoriasis desarrollado recientemente basado en la transferencia de linfocitos T CD4 + imita muchos aspectos de la psoriasis humana y, por lo tanto, se puede utilizar para identificar compuestos adecuados para su uso en el tratamiento de la psoriasis (Davenport et al., Internat. Immunopharmacol 2:653-672, 2002). La eficacia en este modelo se mide por la reducción en la patología cutánea usando un sistema de puntuación. Del mismo modo, la eficacia en pacientes se mide por una disminución en la patología de la piel.
Los anticuerpos anti-PGLYRP1 de la invención son adecuados para su uso en el tratamiento de individuos con artritis psoriásica. La artritis psoriásica (AP) es un tipo de artritis inflamatoria que se produce en un subgrupo de pacientes con psoriasis. En estos pacientes, la patología/síntomas de la piel se acompañan de inflamación de las articulaciones, similar a la observada en la artritis reumatoide. Presenta áreas irregulares, elevadas y rojas de inflamación de la piel con descamación. La psoriasis a menudo afecta las puntas de los codos y las rodillas, el cuero cabelludo, el ombligo y alrededor de las áreas genitales o el ano. Aproximadamente el 10 % de los pacientes con psoriasis también desarrollan una inflamación asociada de sus articulaciones.
El término “tratamiento”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la terapia médica de cualquier sujeto humano u otro animal que lo necesite. Se espera que dicho sujeto haya sido examinado físicamente por un médico o veterinario que haya dado un diagnóstico tentativo o definitivo que indique que el uso de dicho tratamiento es beneficioso para la salud de dicho sujeto humano u otro animal. El momento y el propósito de dicho tratamiento pueden variar de un individuo a otro, de acuerdo con muchos factores, como el estado actual de la salud del sujeto. Por lo tanto, dicho tratamiento puede ser profiláctico, paliativo, sintomático y/o curativo.
En términos de la presente invención, los tratamientos profilácticos, paliativos, sintomáticos y/o curativos pueden representar aspectos separados de la invención.
Un anticuerpo de la invención se puede administrar por vía parenteral, tal como por vía intravenosa, tal como por vía intramuscular, tal como por vía subcutánea. En otra alternativa, un anticuerpo de la invención se puede administrar a través de una vía no parenteral, tal como peroral o tópica. Un anticuerpo de la invención puede administrarse profilácticamente. Un anticuerpo de la invención puede administrarse terapéuticamente (a demanda).
Ejemplos
Ejemplo 1: Generación de una línea celular estable BWZ.36 TREM-1 humano:DAP12
La línea celular BWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ (en lo sucesivo también denominada “célula indicadora BWZ/hTREM-1”) se derivó de linfocitos T BW5147 (línea celular de linfoma de timo de Mus musculus, ATCC TIB-47, LGC Standards, Middelsex, RU) y contiene una construcción indicadora LacZ regulada por cuatro copias del elemento promotor NFAT (ver Karttunen, J. y Shastri, N. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3972-3976 y Fiering, S., Northrop, J. P., Nolan, G. P., Matilla, P., Crabtree, G. R. y Herzenberg, L. A. (1990) Genes Dev. 4, 1823-1834). El vector TREM/DAP12/pMX-IRES (que codifica 786 pb de TREM-1 de un sitio Smal a un sitio BamHI usando ADNc de TREM-1 (Gene Bank Ref. ID: NM_018643.2, Sino Biological Inc., Beijing, China) como molde y oligo 5 'TAGTAGGGATCCGCTGGTGCACAGGAAGG (SEQ ID NO: 51) y 5'
TAGTAGGCGGCCGCTTCGTGGGCCTAGGGTAC (sEq ID NO: 52) como cebadores clonados en el vector pIREShyg GenBank N.° de acceso U89672 (N.° Cat. 6061-1, Clontech Laboratories, CA, EE.UU.) se transfectó en la línea celular de empaquetamiento PLAT-E (proporcionado por W. Yokoyama, Universidad de Washington,
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alternativamente, N.° Cat. RV-101, Cell Biolabslnc, Bio-Mediator KY, Vantaa, Finlandia) usando reactivo de transfección Superfect (N.° Cat. 301305, Qiagen Nordic, Dinamarca). Los sobrenadantes PLAT-E que contienen partículas virales TREM/DAP12/pMX-IRES se usaron para infectar células BWZ.36 de la siguiente manera: 2x105 células BWZ.36 se cultivaron en placas de 6 pocillos y el medio se reemplazó con 1,5 ml de sobrenadante que contenía las partículas víricas + 8 mg/ml de polibreno. Después de 6-8 horas, se añadieron 1,5 ml de medio normal a la placa y las células se incubaron durante 24 horas adicionales. Las líneas celulares BWZ.36 que expresan establemente TREM-1 se tiñeron con anticuerpo monoclonal anti-TREM-1 (clon 21C7; Bouchon et al, 2000, J. Immunol vol. 164 página 4991-4995) y se aislaron por clasificación de células.
Ejemplo 2: Creación de un bioensayo para la identificación de células que expresan un ligando para TREM-1
Se generó una línea celular indicadora de TREM-1 transfectando la línea celular portadora de NFAT-lacZ BWZ.36 (Sanderson S, Int. Immun. 1994) con hTREM-1 y DAP12 como se describe en el Ejemplo 1. Esta línea celular BWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ (en la presente memoria también denominada célula indicadora BWZ/hTREM-1) es altamente sensible a la reticulación mediada por anticuerpo de TREM-1, dando ~ 40 veces de inducción de la producción de LacZ inducida por NFAT cuando se estimula con 1-10 pg/ml de anticuerpo anti-TREM- 1 comercializado unido a la placa, en comparación con el control del isotipo. La producción de LacZ inducida por NFAT en las células indicadoras se puede analizar usando un kit basado en luminiscencia, Beta Glow™ (Promega E4720, Madison, WI). Las placas se recubrieron con isotipo control o anticuerpo anti-TREM-1 MAB1278 (Conc 3 pg/ml en PBS, 100 pl/pocillo) (R&D Systems, Minneapolis, EE. UU.) a 4 °C durante 16 horas o durante 2 horas a 37 °C, 5 % de CO2 y las células indicadoras BWZ/hTREM-1 se separaron añadiendo 10 ml de Versene (número de catálogo 15040, Gibco, Carlsbad CA, EE. UU.), se centrifugaron a 400 g durante 5 min y se lavaron en PBS y medio (RPMI-1640 sin fenol rojo; número de catálogo 11835, Gibco, Carlsbad CA, EE. UU.) antes de añadir a las placas recubiertas (1 x 106 células/ml, 4x104 células/pocillo) a un volumen total de 100 pl y se incubaron durante la noche (16-20 horas) a 37 °C, 5 % de CO2.
Estas células sensibles a TREM-1 se usaron para identificar células que expresan el ligando de TREM-1. Una de esas células resultó ser neutrófilos de la sangre completa. Los neutrófilos de donantes sanos se purificaron mediante sedimentación de Ficoll y dextrano y se estimularon con PGN (InVivogen, tlrl-pgnsa, San Diego, CA, EE. UU.) durante la noche. Brevemente, las células indicadoras BWZ/hTREM-1 se añadieron a los cultivos de neutrófilos activados en una relación 1:3 de células indicadoras:neutrófilos. El ensayo se realizó en placas de cultivo celular negras revestidas con poli-D-lisina (N.° 356640 de BD Biosciences, San Jose, CA, EE. UU.). La activación de TREM- 1 se leyó después de 24 horas de cultivo usando el reactivo BetaGlo (E4720 de Promega, Madison, WI, EE. UU.) y la luminiscencia se midió usando un contador de luminiscencia TopCount de Perkin Elmer.
Los neutrófilos estimulados in vitro poseían un ligando que podía inducir la señalización de TREM-1, y los neutrófilos de la sangre completa de donantes sanos se purificaron mediante sedimentación de dextrano y se estimularon durante la noche con múltiples reactivos. El único reactivo que fue capaz de estimular una señal sensible a TREM-1 de neutrófilos fue PGN-SA (Invivogen, tlrl-pgnsa, San Diego, CA, EE. UU.) que imita la activación bacteriana de las células. Estos neutrófilos activados se usaron luego para estimular la línea celular indicadora BWZ/hTREM-1, cocultivando las células. Brevemente, las células indicadoras BWZ/hTREM-1 se añadieron a los cultivos de neutrófilos activados en una relación 1:3 de células indicadoras:neutrófilos. El ensayo se realizó en placas de cultivo celular negras recubiertas con poli-D-lisina (N.° Cat. 356640 BD Biosciences, San Jose, CA, EE. UU.). La activación de TREM-1 se leyó después de 24 horas de cultivo usando el reactivo BetaGlo (N.° Cat. E4720, Promega, Madison, WI, EE. UU.) y se midió la luminiscencia usando un contador de luminiscencia TopCount de (Perkin Elmer, Waltham MA, EE. UU.). Como se muestra en la Fig. 1, se observó una inducción significativa de la actividad indicadora en células BWZ/hTREM-1 cocultivadas con los neutrófilos estimulados por PGN. Esta inducción fue altamente dependiente de la activación de neutrófilos. No se observó respuesta con neutrófilos en reposo (neutrófilos barra 2). Del mismo modo, no se observó respuesta cuando se estimularon las células indicadoras BWZ/hTREM-1 con PGN- SA en el cóctel de TLRL en ausencia de neutrófilos (barra 1 TLRL), demostrando que la respuesta no es simplemente un efecto directo de PGN en células BWZ/hTREM-1. La activación de neutrófilos con cócteles de citocina (barra 3 + 4 neutrófilos + citocinas) tampoco proporcionó la señal de activación de TREM-1 correcta.
Ejemplo 3: Unión de TREM-1 soluble a neutrófilos activados por PGN
Los neutrófilos estimulados por PGN pudieron inducir la activación de TREM-1, lo que indica la presencia de un factor estimulante de TREM-1 en los cultivos de neutrófilos estimulados por PGN. Con el fin de confirmar la presencia de una proteína que interacciona con TREM-1 en los neutrófilos, los neutrófilos estimulados con PGN se tiñeron con una proteína TREM-1-tetramérica recombinante y se analizaron mediante citometría de flujo. Brevemente, se aislaron granulocitos a partir de sangre humana completa obtenida de Astarte Biologics (Redmond, WA, EE. UU.) mediante un método de sedimentación Ficoll-dextrano. La sangre se estratificó en un gradiente de FicollPaque (17-0840-03, GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.) con una proporción de 3 partes de Ficoll y 4 partes de sangre en un tubo de 50 ml, luego se centrifugó a 400xg durante 30 minutos a 22 °C sin limitación. La banda intermedia de PBMC se eliminó suavemente mediante aspiración. Los granulocitos estratificados en el concentrado de hematíes se aspiraron y se transfirieron a un tubo de polipropileno de 50 ml. Los granulocitos y los hematíes contaminantes se diluyeron hasta 40 ml con 1x PBS y seguidamente se añadieron 10 ml de DEXTRAN
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Los granulocitos aislados se cultivaron a una densidad de 3,8 E6/ml en RPMI/FBS 10 % + 10 gg/ml de PGN-SA (InvivoGen tlrl-pgnsa, San Diego, CA, EE. UU.) durante 7 días. Las células se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en PBS/FBS 2 % para la tinción. Los granulocitos resuspendidos se cultivaron en una placa de 96 pocillos (fondo redondo) a una densidad de 100.000/pocillo en presencia o ausencia de 2 gg/ml de sonda, con o sin 100 gg/ml (50X) de una proteína competidora específica o irrelevante. Las células se incubaron con sonda/competidor durante 1 hora a 4 °C en un volumen de 50 gl/pocillo. Al final de la incubación, se añadieron 150 gl/pocillo de PBS/FBS 2 % y las células se sedimentaron. Las células sedimentadas se resuspendieron en 50 gl/pocillo de conjugado anti hFc F(ab')2/PE de cabra (Jackson ImmunoResearch 109-116-098, West Grove, PA, EE. uU.) y se incubaron a 4 °C durante 30 minutos. Se añadieron 150 gl/pocillo de PBS/FBS 2 % y las células se sedimentaron. Las células sedimentadas se lavaron adicionalmente en 200 gl/pocillo de PBS/FBS 2 % y se sedimentaron. Las células lavadas se resuspendieron en 100 gl/pocillo de fijador (1:1 PBS: Cytofix. 554655, BD Biosciences, San Jose, CA, EE. UU.) y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 100 gl/pocillo de PBS/FBS 2 % a las células fijadas, luego se sedimentaron las células. Las células teñidas/fijadas se resuspendieron en 100 gl/pocillo de PBS/fBs 2 % para el análisis citométrico de flujo en un citómetro de flujo LSR II. (BD Biosciences, San Jose, CA, EE. UU.).
Fc mut
hTREM-1tet/Fc mut
Conjunto de sondas:
5,36 mg/ml SEQ ID NO: 3
1,07 mg/ml SEQ ID NO: 2
Competidores de hTREM-1 tet/Fc mut:
50X DCIR COMP 0,3 mg/ml SEQ ID NO: 4
50X TREM COMP 1,14 mg/ml SEQ ID NO: 5
Se crearon histogramas a partir de los datos citométricos de flujo. La fluorescencia de fondo del conjugado anti hFc/PE de cabra se mostró en cada histograma como el fondo y se designó como “PE”. Se dibujó un marcador idéntico en cada histograma para designar el porcentaje de células que se unen al anticuerpo conjugado anti hFc/PE de cabra secundario. La proteína Fc mut de control negativo mostró un 2 % de células de unión positiva, que era idéntica a la fluorescencia de fondo observada con el conjugado anti hFc/PE de cabra solo (Fig. 2A). Cuando las células se tiñeron con 2 gg/ml de tetrámero de hTREM-1, fueron 39 % positivas (Fig. 2B). Cuando la unión del tetrámero de TREM-1 se realizó en el contexto de 100 gg/ml de proteína DCIR COMP, las células tenían un 41 % de positivos que confirmaban que DCIR COMP no competía por la unión con el tetrámero TREM-1 (Fig. 2C). Cuando la unión del tetrámero de TREM-1 se realizó en presencia de 100 gg/ml de TREM-1 COMP, las células fueron 10 % positivas, lo que demuestra que la proteína TREM COMP compitió con el tetrámero TREM-1 para unirse a las células (Fig. 2D).
Ejemplo 4: identificación de PGLYRP1 como un ligando de TREM-1 expresado en neutrófilos
PGLYRP1 se identificó como un ligando de TREM-1 mediante el uso de inmunoprecipitación acoplada con espectroscopía de masas (IP-MS). Se usó tetrámero de TREM-1 soluble como molécula de “cebo” de afinidad para identificar un ligando. Brevemente, se incubaron tetrámero de TREM-1-Fc (SEQ ID NO: 2) y por separado CD83-Fc (SEQ ID NO: 5) a concentraciones finales de 100 gg/ml con 270 millones de neutrófilos humanos, purificados por sedimentación con dextrano como se ha descrito anteriormente, en 1 ml de PBS a 4 °C, 90 minutos con agitación suave. Después de la granulación, las células se resuspendieron en 1 ml de tampón PBS con la inclusión del reticulante 3,3'-Ditiobis [sulfosuccinimidilpropionato] (DTSSP) (Thermo Scientific: 21578, Rockford, IL, EE. UU.), a una concentración de 2 mM y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3X con 1 ml de PBS seguido de lisis en 1 ml de tampón RIPA (Thermo Scientific, 89901, Rockford, IL, EE.UU.). El lisado se centrifugó a 15.000 X g durante 10 minutos a 4 °C para eliminar los materiales insolubles. Las proteínas del neutrófilo reticuladas con sondas acopladas a Fc se inmunoprecipitaron del sobrenadante usando perlas de Protein A Mag Sepharose™ (GE Healthcare Life Sciences, 28-9670-56, Piscataway, NJ, EE. UU.). Brevemente, se lavó primero 50 gl de cuentas con 200 gl de PBS, luego se resuspendieron en 1 ml de lisado celular, se incubaron 60 minutos a 4 °C, se capturaron magnéticamente, y se lavaron secuencialmente 2X con 200 gl de tampón RIPA luego 3X con 200 gl de PBS. Al eliminar el PBS de la captura magnética final, las proteínas se eluyeron de las perlas magnéticas usando 200 gl de tampón que contenía urea 8 M, Tris 100 mM (pH 8,0) y TCEP 15 mM (Thermo Scientific, 77720, Rockford, IL, EE. UU.) y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos, las perlas se
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capturaron y el sobrenadante se transfirió a un filtro MicroconUltracel YM-30 (Millipore, 42410, Billerica, MA, EE. UU.). Las muestras se centrifugaron a 14.000 xg, 20 °C, 30-60 minutos hasta que no quedó líquido en la parte superior del membrana filtrante. Las proteínas retenidas se alquilaron luego con 100 pl de IAA 50 mM (yodoacetamida) en urea 8 M durante 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. El filtro se lavó 2X con 100 pl de NH4HCO3 50 mM y luego se transfirieron a un nuevo tubo de recolección. Se añadió 1 pg de tripsina (N.° Cat. V5111, Promega, Madison WI, EE. UU.) en 60 pl de NH4HCO3 50 mM seguido de incubación a 37 °C durante la noche. La digestión tríptica se recogió mediante centrifugación a 14,000 xg durante 30 minutos, seguido de lavado del filtro con 50 pl de NH4HCO3 50 mM. Se analizaron 10 pl de la digestión por LC/MS/MS usando un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap-XL (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Los datos se buscaron en la base de datos humana IPI (v3.81) utilizando el motor SEQUEST-Sorcerer (versión 4.0.4) (SageN, Milpitas, CA, EE. UU.) y luego se procesaron con Scaffold 3 (Proteome Software, Portland, OR, EE. UU.) para filtrar las ID de proteínas con una tasa de descubrimiento falso del 1 %. Después de la resta de control negativo, se encontró que PGLYRP1 es una proteína de alta confianza específicamente asociada con el tetrámero de hTREM-1. La inmunoprecipitación en los neutrófilos mostró que de las 148 proteínas identificadas, 72 proteínas fueron inmunoprecipitadas por la construcción de control (CD83) sola, 73 de las proteínas eran idénticas para TREM-1 y CD83, mientras que solo tres eran específicas de TREM-1 (Fig. 3). El experimento se repitió posteriormente utilizando neutrófilos de un donante diferente y PGLYRP1 se identificó de nuevo como que interactúa específicamente con hTREM-1.
Ejemplo 5: Purificación de PGLYRP1 humano expresado a partir de HEK293 6E
Se construyó una secuencia de proteína recombinante fusionando la secuencia del péptido señal de CD33 humano (SEQ ID NO: 53) con la secuencia codificante de PGLYRP1 madura humana (SEQ ID NO: 1). El marco de lectura abierto resultante se clonó en el vector pcDNA3.1/Zeo (+) (Life Technologies, Carlsbad CA, EE. UU.) después de un promotor de CMV. La construcción pcDNA3.1-hPGLYRP1 se transfectó a continuación en células HEK293 6E con 293fectinTM (Life Technologies, Carlsbad CA, EE. UU.) siguiendo el protocolo del proveedor. Cinco días después de la transfección, el sobrenadante del cultivo que contenía PGLYRP1 humano secretada se recogió mediante centrifugación (15.000 rpmX 20 min, 4 °C) y luego se eliminó por filtración con membrana de nitrato de celulosa de 0,22 pm. El sobrenadante depurado se diluyó primero 10 veces en citrato sódico 20 mM pH 5,0 y luego se aplicó a una columna Hitrap SP HP 5ml (17-1151-01 GE Healthcare, Uppsala, Suecia), seguido de un lavado de volumen de 5 columnas con citrato sódico 20 mM pH5.0. El PGLYRP1 humano unido se eluyó a continuación con un gradiente lineal de 0 ~ 100 % de citrato sódico 20 mM, pH 5,0, NaCl 1 M en 30 volúmenes de columna. Las fracciones que contienen dímeros y formas monómeras de PGLYRP1 humano se agruparon por separado y se concentraron a menos de 4 ml por unidades centrífugas en un Amicon Ultra-15 (UFC800324, MwCo de 3.000 kDa, Millipore, Hellerup, Dinamarca). El dímero y las mezclas de monómeros se pulieron adicionalmente y se cambiaron por tampón a solución salina tamponada con fosfato (PBS) mediante una columna Hiload 26/60 Superdex 75 318 ml (17-1070-01GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Después de la concentración, las concentraciones finales de proteína se determinaron midiendo la absorbancia a 280 nm con un espectrómetro UV NANODROP. La pureza de la proteína se evaluó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE).
Ejemplo 6: Replegamiento y purificación de PGLYRP1 humano expresado a partir de E. coli
El PGLYRP1 humano se expresó como cuerpos de inclusión en células de Escherichia coli BL21 (DE3). Las bacterias se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 500 mM, EDTA 5 mM, Triton X-100 0,5 % y se rompieron mediante sonicación. El sedimento insoluble se lavó tres veces con Tris 50 mM, pH 8,0, TritonX-100 1 %, urea 2 M y una vez con Tris 50 mM pH 8,0, luego se solubilizó en clorhidrato de guanidina 50 mM, pH 7,4, DTT 1 mM ( concentración de proteína final 20 mg/ml). Para el plegamiento in vitro, los cuerpos de inclusión de PGLYRP1 humano solubilizados se diluyeron en Tris 50 mM, pH 8,0, EDTA 2 mM, cisteamina 5 mM, cistamida 0,5 mM, arginina 0,4 M (concentración final de proteína 1 mg/ml). Después de una noche a 4 °C, la mezcla de plegamiento se aclaró por centrifugación/filtración y luego se diluyó 12 veces en MES 10 mM a pH 3,5 para disminuir la conductividad y el pH (pH final ~ 5,8, conductividad ~ 6 mS/cm). La mezcla de plegamiento diluida se aplicó a continuación a una columna Hitrap SP HP de 5 ml (17-1151-01 GE Healthcare, Uppsala, Suecia), seguido de un lavado de 5 volúmenes de columna con MES 50 mM, pH 5,8. El PGLYRP1 humano unido se eluyó luego con un gradiente lineal de 0 ~ 60 % de MES 50 mM, pH 5,8, NaCl 1 M en 20 volúmenes de columna. Las fracciones que contenían PGLYRP1 humano replegada se juntaron y concentraron a menos de 4 ml por unidades centrífugas con un Amicon Ultra-15 (UFC800324, MWCO 3.000 kDa, Millipore, Hellerup, Dinamarca). A continuación, se utilizó una columna Hiload 26/60 Superdex 75 3 de 18ml ((17-1070-01GE Healthcare, Uppsala, Suecia) para pulir y cambiar el tampón de las proteínas a solución salina tamponada con fosfato (PBS). La mayoría de las proteínas PGLYRP1 humanas replegadas estaban en forma de monómero. Después de concentrar, la concentración de proteína final se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm con un espectrómetro de UV NANODROP. La pureza de la proteína se evaluó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE).
Ejemplo 7: Inmunización de ratones e identificación de mAb
Se usó PGLYRP1 humano purificado para inmunizar ratones con el fin de generar anticuerpos. Brevemente, los ratones se inmunizaron 3 veces con 20 pg de PGLYRP1 recombinante por inmunización. La primera inmunización
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fue subcutánea utilizando Adyuvante de Freund Completo (N.° Cat. 3018, Statens Serum Institut, Copenhague, Dinamarca). Las siguientes dos inmunizaciones fueron intraperitoneales usando Adyuvante de Freund Incompleto (N.° Cat. 3016, Statens Serum Institut, Copenhague, Dinamarca). Diez días después de la última inmunización, se extrajo sangre de la mejilla y se analizaron los sueros frente a PGLYRP1 en un ELISA directo.
Ejemplo 8: Unión de TREM-1 soluble a PGLYRP1
Un método común para validar una nueva interacción proteína-proteína es mediante la reconstitución de la interacción utilizando reactivos recombinantes. Para este fin, se expresó PGLYRP1 humano recombinante con un epítopo C-terminal que señaliza la adición postraduccional de una estructura de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Las proteínas que contienen estructuras GPI terminal se dirigen para su expresión en la membrana plasmática. Esta técnica comúnmente aplicada permite que las proteínas que de otro modo son solubles se muestren y prueben para la unión mediante técnicas de citometría de flujo. En la Fig. 4a, las células HEK-2936E se transfectaron con pCDNA 3.1/zeo(+) hPGLYRP1-GPI (SEQ ID NO: 7). Se diluyeron 3 gg de DNA en 100 gl de Optimem (N.° Cat. 31985062, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.). Se añadieron 4 gl de 293fectina (N.° Cat. 51-0031, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) a 100 gl de Optimem (N.° Cat. 31985062, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) y se incubaron a 22 °C durante 5 minutos. La mezcla de DNA/Optimem y la mezcla 293fectin/Optimem se combinaron y se incubaron durante 20 minutos adicionales a temperatura ambiente. Las células HEK-2936E se diluyeron hasta 3 ml a 1e6/ml en medio Freestyle (N.° Cat. 12338, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) y se sembraron en placas en una placa de 6 pocillos (N.° Cat. 35-3046, Biosciences San Jose, CA, EE. UU.) y luego se añadió la mezcla de ADN/293fectina gota a gota a las células. Las células se incubaron durante 48 horas a 37 °C con agitación. Se diluyó 1 gg/ml de TREM-1 humano-G4Sx3-TREM-1/Fc6mut humano (SEQ ID NO: 2) en PBS/FBS 2 % y se añadieron 50 gl de sonda a 80.000 células HEK293-6E transfectadas en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (N.° Cat. 3799, Costar, Lowell, MA, EE.UU.). Las células se incubaron a 4 °C durante 1 h seguido de 2x lavados con 200gl de PBS/FBS 2 %. Se añadieron 50 gl de anti-Fc humano de cabra-PE 1 gg/ml (N.° Cat. 109-116098, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE. UU.) y se incubó durante una hora adicional seguido de 2x lavados con PBS/FBS 2 %. Las células se fijaron durante 5 min en BDCytofix diluido con PBS 1:1 (N.° Cat. 554655, BD Biosciences, San Jose, CA, EE. UU.) y se incubaron durante 5 min seguido de un lavado con 200 gl de PBS/FBS 2 %. Las células se resuspendieron en 100 gl de PBS/FBS 2 % antes de analizarse en un FACS LSRII (BD Biosciences, San Jose, CA). Los resultados de este experimento se muestran en la Fig. 4a donde las células no teñidas se muestran mediante una línea negra continua (G03). La tinción de TREM-1-G4Sx3-TREM-1/Fc6mut de las células transfectadas simuladas se muestra con líneas discontinuas, y no muestra unión con respecto a las células no teñidas. Finalmente, las células transfectadas con PGLYRP1 humano-GPI se unen fuertemente a TREM-1- G4Sx3-TREM-1/Fc6mut que se muestra con la línea punteada. La cuantificación de la unión se expresa como intensidad fluorescente media, MFI.
Además de la citometría de flujo, las interacciones proteína-proteína también se evalúan comúnmente midiendo la resonancia de plasmón superficial (SPR). Se utilizó un instrumento BiacoreT200 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.) para analizar la interacción entre TREM-1 humano y PGLYRP1 humano y también entre PGLYRP1 humano y peptidoglicano de E. coli sonicado, soluble (N.° Cat. tlrl-ksspgn, lnvivogen, San Diego, CA, EE. UU.). Todos los ensayos se realizaron a 25 °C a caudales de 20-30 gl/minuto en tampón de análisis 1X HBS-P (N.° Cat. BR-1006-71, GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.).
En la Fig. 4B, 4641.1 RU de tetrámero de TREM-1 humano (SEQ ID NO: 2) se acopló con amina a un chip Biacore CM5 (N.° Cat. BR-1005-30, BR-1000-50, GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) siguiendo los métodos recomendados por el fabricante. PGLYRP1 (N.° Cat. 2590-PG, R&D Systems, Minneapolis, EE.UU.) se diluyó a 150 nM en tampón de análisis 1X HBS-P (N.° Cat. BR-1006-71, GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.) en la presencia o ausencia de 10 gg/ml de peptidoglicano de E. coli soluble (N.° Cat. tlrl-ksspgn, Invivogen, San Diego, CA, EE. UU.) e inyectó sobre la superficie TREM-1. Los datos son la referencia sustraída frente a una superficie de referencia activada y bloqueada (con etanolamina). Aunque PGLYRP1 se une a TREM-1 tanto en presencia como en ausencia de PGN, parece haber un efecto de avidez significativo cuando PGLYRP1 está reticulado por PGN.
En la Fig. 4C, 274.8 RU del dímero de PGLYRP1 (SEQ ID NO: 1) se acoplaron con amina a un chip Biacore CM5 (N.° Cat. BR-1005-30, BR-1000-50, GE Healthcare, Piscataway, nJ). Se diluyó peptidoglicano de E. coli soluble (N.° Cat. tlrl-ksspgn, Invivogen, San Diego, CA, EE. UU.) a 10 gg/ml en tampón de análisis 1X HBS-P (N° de catálogo BR-1006-71, GE Healthcare, Piscataway, NJ , EE. UU.) y se inyectó sobre la superficie PGLYRP1. Los datos son la referencia sustraída frente a una superficie de referencia activada y bloqueada (con etanolamina).
En la Fig. 4D, se usó el mismo chip que en la Fig. 4C, (274.8 RU del dímero de PGLYRP1, (SEQ ID NO: 1). El dímero de TREM-1 (SEQ ID NO: 8) se diluyó a 150 nM en tampón de análisis 1X HBS-P (BR-1006-71, GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.) y se inyectó tanto antes como después de inyecciones repetidas de peptidoglicano (representado en la Fig. B). Los datos son la referencia sustraída frente a una superficie de referencia activada y bloqueada (con etanolamina) y también se resta la señal de una inyección de tampón en blanco. TREM-1 muestra una unión clara a PGLYRP1 inmovilizado. El dímero de TREM-1 soluble se une de manera similar a PGLYRP1 inmovilizado solo o a PGLYRP1 que se ha cargado con PGN. El receptor TREM-1 inmovilizado en superficie por PGLYRP1 soluble y PGN consiste en una afinidad modesta por el complejo PGLYRP1:TREM-1
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potenciado por un efecto de avidez del PGLYRP1 altamente reticulado.
Ejemplo 9: Activación de la respuesta de TREM-1 por PGLYRP1 recombinante
Para probar si PGLYRP1 recombinante puede activar una respuesta de TREM-1, la línea celular indicadora BWZ/hTREM-1 se sembró en placas negras de 96 pocillos y se estimuló con PGLYRP1 humano recombinante (N.° Cat. 2590-PG-050, R&D Systems: Minneapolis , MN) en presencia o ausencia de 10 pg/ml de PGN. La activación de TREM-1 se leyó después de 24 horas de cultivo usando el reactivo BetaGlo (N.° Cat. E4720, PromegaMadison, WI, EE. UU.) y la luminiscencia se midió usando un contador de luminiscencia TopCount de Perkin Elmer. Como se muestra en la Fig. 5a, la estimulación de la línea celular indicadora TREM-1 con PGLYRP1 indujo una activación dependiente de la dosis de TREM-1 en presencia de PGN. Se probaron varios PGN diferentes, incluido PGN-EC (de E. coli), PGN-SA (de S. aureus) y PGN-BS (de B. subtilis) (Invivogen, San Diego, CA, EE. UU.), y todos fueron capaces de facilitar la respuesta de TREM-1 inducida por PGLYRP1.
La respuesta inducida por PGLYRP1 recombinante podría inhibirse mediante la adición de una proteína de fusión TREM-1-Fc recombinante (SEQ ID NO: 2) (Figura 5b) o mediante la adición de anticuerpo policlonal anti-PGLYRP1 (N° de catálogo AF- 2590, R&D Systems: Minneapolis, MN, EE. UU.) confirmando que PGLYRP1 es el ligando TREM-1 y que TREM-1 soluble y anti-PGLYRP1 son potencialmente útiles como antagonistas de TREM-1.
Ejemplo 10: Liberación de TNFalfa de los macrófagos M1 estimulados por PGLYRP1
Los monocitos se diferenciaron en macrófagos M1 y se estimularon con el complejo PGLYRP1 dando como resultado la liberación de TNFalfa en dos donantes diferentes.
Los expertos en la materia reconocerán el valor de establecer una colección de células primarias como banco congelado de donantes múltiples, proporcionando así una replicación conveniente de los experimentos. Los macrófagos derivados in vitro se produjeron a partir de monocitos de sangre periférica de la siguiente manera. Se aislaron monocitos enriquecidos negativamente a partir de un “leukopak” de sangre periférica obtenido de Research Blood Components (Brighton, MA, EE. UU.) utilizando un kit Rosette Sep (N.° Cat. 15068 Stem Cell Technologies, Vancouver BC, Canadá) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los monocitos aislados se suspendieron en DMSO/FBS 10 %, se enfriaron gradualmente alícuotas de 50e6 células/m3 a -80 °C. Para producir macrófagos, uno o más viales congelados de monocitos se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37 °C, se diluyeron a 10 ml con medio de crecimiento [RPMI 1640 (N.° Cat. 72400-047, Life Technologies, Carlsbad CA, EE. uU.)] con FBS 10 % (N.° Cat. 03-600-511, ThemoFisher, Waltham MA, EE.UU.) y se centrifugó durante 5 minutos a 250 g. Las células se suspendieron en 2e6 células/ml en medio de crecimiento suplementado con 50 ng/ml de MCSF humano (N.° Cat. PHC9501, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.), se colocaron en placas de cultivo tisular de tipo Petri tratadas con cultivo de tejido y en una incubadora humidificada programada para mantener una atmósfera “hipóxica” de CO2 al 5 %, 2 % de O2. El tercer día de cultivo, las células se alimentaron con la adición de un volumen igual de medio de crecimiento suplementado con 50 ng/ml de MCSF humano. Después de 6 días en cultivo, los monocitos se habían diferenciado en macrófagos M0. Las células M0 se diferenciaron adicionalmente cambiando los medios a medio de crecimiento suplementado con 50 ng/ml de IFNg humano (N.° Cat., PHC4031, Life Technologies, Carlsbad CA, EE. UU.) para macrófagos M1 o 40 ng/ml de IL-4 humana (N.° Cat. PHC0045, Life Technologies, Carlsbad CA, EE. UU.) para macrófagos M2 y se devolvieron a la incubadora durante 22 horas adicionales. En el séptimo día, los macrófagos se diferenciaron adecuadamente para usarlos en un bioensayo. Brevemente, los macrófagos se recuperaron de las placas Petri mediante lavado con 1X PBS, seguido de EDTA 5 mM en PBS. Las placas se devolvieron luego a 37 °C durante 30 minutos y las células se “lavaron a presión” de la placa usando una jeringa de 10 ml y una aguja 22G. Las células se diluyeron en medio de crecimiento, se centrifugaron a 250 g durante 5 minutos, después de lo cual el sedimento celular se suspendió hasta una concentración final de 1e6/ml.
Se usaron células macrófago preparadas como antes en bioensayos en los que se midieron las citocinas tales como TNF-alfa producidas en respuesta a la estimulación de las células con ligando de TREM-1 en los medios acondicionados mediante ELISA. Dicho bioensayo se utilizó adicionalmente para medir el bloqueo de la estimulación del ligando TREM-1 por anticuerpos específicos de TREM-1. Se prepararon controles negativos o de ligando de TREM a 4X concentraciones en medio de crecimiento y se añadieron 50 microlitros/pocillo a placas de microtitulación de 96 pocillos. Las concentraciones finales de ligando de TREM-1 consistieron en 7,5 ng/ml de PGLYRP1 humano recombinante (generado como se describe en el ejemplo 5) y 3 pg/ml de PGN-BS (N.° Cat., Tlrl- pgnbs, Invivogen, SanDiego CA, EE. UU.). Las células se cultivaron en condiciones hipóxicas humidificadas como se describió anteriormente durante 22 horas, después de lo cual se recogió el medio acondicionado y se midieron los niveles de TNF-alfa mediante ELISA, siguiendo las instrucciones del fabricante (N.° Cat. DY210, R&D Systems, Minneapolis MN, EE. UU.).
Donante 1 Donante 2
TNF-a pg/ml TNF-a, pg/ml
Macrófagos M1 con:
Promedio DE Promedio DE
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30
35
40
45
Sin adición
0 0 22 1
0,4 pg/ml PGN-BS
357 153 764 139
2,0 pg/ml PGN-BS
3086 151 5792 226
5 pg/ml PGLYRP1 + 0,4 pg/ml PGN-BS
7502 384 7819 945
5 pg/ml PGLYRP1 + 2 pg/ml PGN-BS
31440 1030 40418 1633
Este ejemplo muestra que el ligando de TREM-1 PGLYRP1 puede aumentar aún más la liberación de TNFa desde los macrófagos de dos donantes diferentes.
Ejemplo 11: Liberación de citocina de células de tejido sinovial de pacientes con AR después de la estimulación con PGLYRP1.
Se obtuvieron muestras de tejido sinovial de pacientes con AR durante la artroplastia de rodilla. Se aisló una suspensión única de células de tejido sinovial mediante digestión a través de 4 mg/ml de colagenasa (N.° Cat. 11088793001, Roche, Mannheim, Alemania) y 0,1 mg/ml de ADNasa (N.° Cat. 11284932001, Roche, Mannheim, Alemania). durante 1 hora a 37 grados.
Las células de tejido sinovial a 1x105/pocillo en medio de cultivo RPMI (N.° Cat. R0883, Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.) + 10 % FCS (N.° Cat. S0115, BioChrom AG, Grand Island, NY 14072, EE.UU.) se estimularon con 4 pg/ml de PGLYRP1 y 1 pg/ml de PGN-ECNDi (N.° Cat. Tlrl-kipgn, Invivogen, San Diego, CA 92121, EE. UU.). Después de 24 h de incubación, los sobrenadantes celulares se recogieron y las citocinas se midieron mediante ELISA (TNFa (N.° Cat. DY210, R&D Systems, Minneapolis, MN55413 EE. UU.), IL-1 b (N.° Cat. 88-7010-88, eBioscience, San Diego CA USA), GM-CSF (N.° Cat. 88-7339-88, eBioscience, San Diego CA USA) o Flowcytomix (TNFa, IL-1b, MIP- 1b, MCP-1, IL-6, y IL-8 (N.° Cat. BMS, eBioscience, San Diego CA EE. UU.). Las citocinas se secretaron a partir de las células del tejido sinovial tras la estimulación con el ligando de TREM-1.
Citocina (pg/ml)
PGN PGN+PGLYRP1
TNFalfa
623,69 1444,59
IL-1beta
2419,42 3772,74
GM-CSF
181,91 615,91
MIP-1beta
2457,955 4394,725
MCP-1
273,055 471,26
IL-6
2056,94 4189,355
IL-8
2574,56 5509,195
Este ejemplo muestra que las células del tejido sinovial de pacientes con artritis reumatoide responderán a la estimulación por el ligando de TREM-1 PGLYRP1 secretando numerosas citocinas.
Ejemplo 12: identificación de mAb anti-PGLYRP1 que inhiben la activación de TREM-1
Con el fin de identificar anticuerpos monoclonales anti-PGLYRP1 que puedan bloquear las respuestas de TREM-1, se inmunizaron ratones wtbalb/c con PGLYRP1 humano recombinante. El cribado primario se realizó mediante ELISA directo de la proteína PGLYRP1, y todos los sobrenadantes de hibridoma específicos de PGLYRP1 se analizaron posteriormente en el ensayo de células indicadoras BWZ/hTREM-1 para identificar anticuerpos monoclonales anti-PGLYRP1 capaces de inhibir la activación de TREM-1 inducida por neutrófilos estimulados con PGN, como se describe en el ejemplo 1. El bioensayo se realizó de la siguiente manera: se sembraron 40.000 células hTREM-1/BWZ.36/pocillo en una placa de 96 pocillos negra de fondo transparente en presencia de 75 ng/ml de PGLYRP1 (SEQ ID NO : 1) con 2,5 pg/ml de PGN-ECndi (N.° Cat. tlrl-kipgn, lnvivogen San Diego, CA, EE. UU.) para proporcionar una señal positiva submáxima, o alternativamente en presencia de un nivel submáximo (1 pg/ml) de anticuerpo monoclonal anti-TREM-1 adsorbido en plástico (N.° Cat. MAB1278 R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) para proporcionar una señal positiva. Los anticuerpos de prueba se titularon en el ensayo comenzando a 10 pg/ml, con 5 diluciones en serie de dos veces. El ensayo se incubó durante la noche a 37 °C, y se desarrolló con Beta Glo (N.° Cat. E4740, Promega Madison, WI, eE. UU.), según el protocolo Beta Glo, y se registró la luminiscencia. Los datos se representaron gráficamente mostrando las unidades luminiscentes relativas de Beta Glo frente a la concentración de anticuerpo de prueba. Se analizó en cada placa de ensayo el control negativo no neutralizante mlgG1 (N.° Cat. MAB002, R&D Systems Minneapolis, MN, EUA) y el anticuerpo policlonal anti- hPGLYRP1 de cabra positivo neutralizante (N.° Cat. AF2590, R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA). Como se muestra en la Fig. 6a, F10, F14, F29, F36, F38, F77, F95 y F105 se identificaron como capaces de bloquear la respuesta de TREM-1 a PGLYRP1. La Fig. 6B muestra otros sobrenadantes de hibridoma de anticuerpo anti- PGLYRP1 capaces de bloquear la señal dependiente de TREM-1. M-hPGRPS-2F5 (SEQ ID NOs: 31-32 y -2F7 (SEQ ID NOs: 35-36) son bloqueadores muy eficientes. Por el contrario, el ensayo de anticuerpos monoclonales
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anti-PGLYRPI comercializados en el mismo protocolo de ensayo junto con el control positivo policlonal de cabra de anti-PGLYRPI (N.° Cat. AF2590, R&D Systems Minneapolis, MN, EUA) mostró que ninguno de estos podía bloquear la activación de TREM-1 (Fig. 6C). Los anticuerpos anti- PGLYRP1 probados incluyen: 188C424 de Thermo Scientific (6D), mAb 4H230 y 9A319 de US Biological (Fig. 6D, 6E); ninguno de ellos bloquear la estimulación con PGLYRP1 del bioensayo TREM-1. Se observó que el clon 6D653 de Santa Cruz Biotechnology (Fig. 6F y 6G) bloqueaba el ensayo de forma no específica basado en la observación de que el Mab bloqueaba tanto PGLYRP1 (6F) como la estimulación anti-TREM-1 (6G) mientras que el anticuerpo policlonal anti-PGLYRP1 control positivo solo bloqueaba la activación mediada por PGLYRP1. Este bloqueo inespecífico puede deberse a toxicidad de azida en el bioensayo.
En conclusión, se han identificado anticuerpos monoclonales anti-PGLYRP1 que no solo se unen a PGLYRP1 sino que también neutralizan su actividad de señalización de TREM-1. El método utilizado para identificar estas moléculas proporciona una ventaja única sobre los métodos de rutina utilizados para identificar anticuerpos anti- PGLYRP1, evidenciado por la falta de los anticuerpos comerciales disponibles para neutralizar PGLYRP1.
Ejemplo 13: Los anticuerpos anti-PGLYRPI bloquean una señal específica de TREM-1
Los clones de hibridoma de PGLYRP1 se secuenciaron y se expresaron mediante recombinación como un anticuerpo hlgG4. Dos de estos, mAb0182 (de 1F36) (SEQ ID 15 y 16) y mAb 0184 (de 1F105) (SEQ ID 23 y 24), se volvieron a analizar en el ensayo de células indicadoras BWZ/hTREM-1 como se describe en el ejemplo 13. Estos anticuerpos anti-PGLYRP1 bloquean la respuesta de TREM-1 en el ensayo de células indicadoras BWZ/hTREM-1 de una manera dependiente de la dosis.
Respuesta de BWZ.36/hTREM-1, Beta Glo RLU
Anticuerpo
Isotipo 182 184
ug/ml
Promedio DE Promedio DE Promedio DE
0
74636 10004 74636 10004 74636 10004
0,16
70289 13018 81858 3336 60738 5449
0,31
68555 5585 73382 650 59830 2837
0,63
68105 11547 73831 7818 51198 397
1,25
71797 8545 63280 1663 46447 708
2,5
69207 5004 51675 1270 42062 1953
5
76951 901 33641 842 36194 1461
10
83930 8962 20655 1080 25239 407
20
74555 511 11852 464 21333 115
40
72296 8228 7696 306 15693 1861
Este ejemplo muestra que, en comparación con los anticuerpos comercializados contra PGLYRP1 mostrados en la figura 6C-G, los anticuerpos anti-PGLYRP1 divulgados en la presente memoria son capaces de bloquear la señal específica de TREM-1 en el ensayo de células indicadoras BWZ/hTREM-1.
Ejemplo 14: Liberación de TNF-alfa de macrófagos M2 estimulados por PGLYRP1
Los monocitos se diferenciaron en macrófagos M2 y se estimularon con el complejo PGLYRP1. Los anticuerpos (10 pg/ml) mAb-0182 y -0184 dirigidos contra PGLYRP1 son capaces de disminuir la liberación de TNF-alfa. Los macrófagos M2 se diferenciaron como se describe en el Ejemplo 10. Los anticuerpos a ensayar se prepararon en concentraciones de 4X en medio de crecimiento y se añadieron 50 microlitros/pocillo. La etapa final para iniciar el bioensayo fue la adición de 100 microlitros/pocillo de células macrófago M2 preparadas como se describió anteriormente. Los anticuerpos monoclonales PGLYRP1 (mAb 0182 y mAb 0184) se ensayaron para determinar la actividad neutralizante en macrófagos M2. Los pocillos de ensayo duplicados (a menos que se indique lo contrario) se analizaron en las siguientes condiciones: sin estimulación adicional, 7,5 ng/ml de PGLYRP1 solamente, 3 ng/ml de PGN-BS (N.° Cat. Tlrl-pgnbs, lnvivogen San Diego, CA, EE. UU.) solo (sextuplicados), PGLYRP1 con PGN-BS (sextuplicados) y PGLYRP1 con PGN-BS en presencia de anticuerpos anti-PGLYRP1 o anticuerpo de control de isotipo hlgG4 valorado en concentraciones entre 40 pg/ml y 0,31 pg/ml en diluciones de 2 veces.
Donante 1 Donante 2
TNF-a, pg/ml TNF-a, pg/ml
Macrófagos M2 con:
Promedio DE Promedio DE
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Sin adición
108 42 68 16
PGLYRP1
167 98 89 33
PGN
424 105 635 156
PGLYRP1+PGN
1660 198 2168 210
PGLYRP1 +PGN+isotipo
1726 182 2483 251
PGLYRP1+PGN+mAb 0182
1322 173 2014 107
PGLYRP1+PGN+mAb 0184
1207 168 1948 173
Este ejemplo ilustra que el ligando de TREM-1 PGLYRP1 puede aumentar aún más la liberación de TNFa a partir de macrófagos M2 de dos donantes diferentes y que los anticuerpos divulgados en la presente memoria pueden disminuir dicha liberación de TNFa. Por lo tanto, estos anticuerpos anti-PGLYRP1 son potencialmente útiles como antagonistas de TREM-1.
Ejemplo 15: El estudio de las interacciones de unión entre las moléculas relacionadas con TREM-1 y PGLYRP1 confirma la especificidad.
Habiendo identificado a TREM-1 como capaz de unirse a PGLYRP1 y activar TREM-1 en presencia de PGN, nos propusimos determinar si TREM-1 se podía unir o no a los otros miembros de la familia PGLYRP. PGLYRP1 se ancló artificialmente en la membrana celular por adición, en el extremo N-terminal, de un dominio intracelular (IC) y transmembrana (TM) derivado del receptor MDL-1 de tipo II. Las últimas construcciones se denominaron PGLYRP1 Tipo II (Fig. 9a). En el Tipo II 1.0 (SEQ ID NO: 37), el aminoácido cargado del receptor de MDL-1 TM nativo se mantiene, y la expresión eficiente de esta proteína, depende de la coexpresión de DAP12. En la construcción de PGLYRP1 de Tipo II 2.0 (SEQ ID NO: 38), el resto TM cargado se ha sustituido con un aminoácido neutro (lisina a leucina), lo que permite que la proteína se exprese independientemente de, por ejemplo, DAP12 y se añadió una etiqueta de epítopo DYkDdDdK (SEQ ID NO: 39). Se sintetizaron los ADNc de longitud completa de HPGLYRP2 (SEQ ID NO: 40), hPGLYRP3 (SEQ ID NO: 41) y hPGLYRP4 (SEQ ID NO: 42)), como proteínas ancladas a la membrana usando la fusión N terminal del extremo MDL1 N de Tipo ll 2.0 como se utilizó antes para PGLYRP1. Los ADNc se subclonaron en un vector plasmídico de expresión pTT5 modificado (Zhang J et al. Protein Expression and Purification, vol. 65, Número 1, mayo de 2009, pp 77-8), y se transfectaron como se describe en el ejemplo 8 en células HEK293-6E junto con un control negativo de vector vacío (Simulado). Las células se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la unión tanto superficial como intracelular de las siguientes sondas: anti- PGLYRP1 humano de cabra (PGRPS) (N.° Cat. AF2590, R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.); Mab anti- PGLYRP2 humano (PGRP-L) (N.° Cat. MAB0755, Abnova, Walnut, CA, EE. UU.); Mab anti-PGLYRP3 humano (PGRP-1a) (N.° Cat. MAB0068, Abnova, Walnut, CA, EE. UU.); Mab anti-PGLYRP3 humano (PGRP-1a) (N.° Cat. Ab13901, Abcam, Cambridge MA, EE. UU.); anti-PGLYRP3 humano de conejo (PGRP-1a) (N.° Cat. 18082-1-AP, Protein Tech, Chicago IL, EE. UU.), anti-PGLYRP4 humano de cabra-biotina (PGRP-1b) (N.° Cat. BAF3018, R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.); anti-PGLYRP1 de ratón de cabra (PGRPS) (N.° Cat. AF2696, R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.); dímero de huTREM-1.Fc (C0099); dímero huTREML1.Fc (C0246); dímero de huTREML2.Fc (C0247); dímero de huTREM2.Fc (C0248). El protocolo de unión se realizó de la siguiente manera, usando tampón Cytofix/perm (N.° Cat. 51.2090KZ, BD Biosciences, San Jose CA, EE. UU.) para tinción intracelular o FBS 2 %/PBS para tinción superficial: los sedimentos celulares se resuspendieron en una placa de fondo redondo de 96 pocillos (para comenzar con: 160.000 células/pocillo) con 200 pl de tampón Cycytofix/Perm durante 15 minutos a 22 °C, lavaron dos veces con 200 pl de tampón PermWash 1x (diluido 10x en DiH2O), se tiñeron con 50 pl de sonda diluida a 5 pg/ml en 1x tampón PermWash, se incubaron durante 1 hora a 4 °C, las células se lavaron con 200 pl 1x tampón PermWash, se añadió una sonda secundaria en 50 pl de tampón PermWash 1x, las células se incubaron a 4 °C durante 30 minutos, se lavaron dos veces con 200 pl 1x de tampón PermWash, los sedimentos se resuspendieron en 50 pl de CytoFix (BD: 554655, San Jose, CA) diluido en PBS 1:1, se incubaron durante 5 minutos a 22 °C, se añadieron 150 pl de PBS/FBS 2 %, se centrifugaron durante 5 minutos a 300 g, se lavaron 1x con 200 pl de PBS/FBS 2 % y se resuspendieron en 100 pl de PBS/FBS 2 %. La unión se analizó usando FACS en LSRII (bD, San Jose, CA, EE. UU.).
Como se resume en la tabla siguiente, la sonda TREM-1 se unió exclusivamente a hPGLYRP1 y no se detectó unión de ningún miembro de la familia hTREM a PGLYRP2, PGLYRP3 o PGLYRP4.
Simulado PGLYRP1 Tipo II PGLYRP2 Tipo II PGLYRP3 Tipo II PGLYRP4 Tipo II PGLYRP 3+4 Tipo II muPGLYRP1 Tipo II
anti huPGLYRP1 (R&D, AF2590)
- + + + + - - + + + + + + +
anti
- - + + + + - - - n/d
huPGLYRP2 (Abnova, MAB07755)
anti huPGLYRP3 (Abnova, MAB0068)
- - - - - - n/d
anti huPGLYRP3 (Abcam, ab13901)
- - - - - - n/d
anti huPGLYRP3 (Proteintech, 18082-1-AP)
- - - - - - n/d
anti huPGLYRP4 (R&D, BAF3018)
- + + + + - - + + + + + + + + n/d
anti muPGLYRP1 (R&D, AF2696)
- + + + + n/d n/d n/d n/d + + + +
huTrem1.Fc (C0099)
- + + + + - - - - -
huTremL1.Fc (C0246)
- - - - - - -
huTremL2.Fc (C0247)
- - - - - - n/d
huTrem2.Fc (C0248)
- - - - - - n/d
PGLYRP1, PGLYRP2, PGLYRP3 y PGLYRP4 anclados a la membrana humana se expresaron transitoriamente en HEK293 y se analizaron con receptores y anticuerpos solubles tanto internos como comerciales con el fin de identificar nuevas interacciones entre los miembros de la familia. Las puntuaciones de la unión se expresaron como 5 “n/d”, “-”, “+” o “++++”. Las puntuaciones son una relación entre la intensidad fluorescente media (MFI) de la tinción
de la sonda respecto a la tinción de control negativo; “-” es igual a una proporción de <1, “++++” representa una puntuación de> 30 y “++” representa aproximadamente 10-15, “+” representa 2-5 con una diferencia estadísticamente significativa (p <0,05). Los expertos en la materia pueden caracterizar esta puntuación como negativa, brillante o tenue, respectivamente.
10
TREM-1 solo se une a PGLYRP1 y ninguno de los otros miembros de PGLYRP, y viceversa: PGLYRP1 solo interactúa con TREM-1 y ninguno de los otros miembros de TREM.
Ejemplo 16: El ligando de TREM-1 está presente en muestras de líquido sinovia! de AR
15
La artritis reumatoide se caracteriza por una inflamación de las articulaciones metacarpofalángicas (MCF) en la que los granulocitos activados desempeñan un papel importante. PGYLRP1 se ensayó mediante ELISA y se probó en el ensayo de células indicadoras BWZ/hTREM-1 del líquido sinovial extraído de las articulaciones MCF de 9 pacientes con Ar. El líquido sinovial de origen comercial (Asterand, Detroit MI, EE. UU.) se descongeló y se diluyó en serie en 20 tampón ELISA y se analizó en un ensayo PGLYRP1 siguiendo las directrices del fabricante (Promega, Madison WI, EE. UU.). Cuatro de 9 pacientes mostraron niveles elevados de PGLYRP1:
Donante de LS de AR
PGLYRP1, ng/ml
Promedio DE
1
14 5
2
8 1
3
213 44
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
4
229 58
5
135 49
6
47 4
7
39 13
8
116 33
9
32 1
Las muestras de líquido sinovia! de AR se analizaron posteriormente para determinar la actividad del ligando TREM en el ensayo del indicador BWZ como se describe en el ejemplo 2. Brevemente, el líquido sinovial se descongeló, se agitó vorticialmente y se diluyó en serie, se ensayó por duplicado +/- 10 pg/ml de PGNECndi (Invivogen, SanDiego, CA, EE. UU.) con la adición del anticuerpo policlonal anti-PGLYRPI (N.° Cat. AF2590, Promega, Madison. WI, EE. UU.) o un control policlonal negativo. Los anticuerpos monoclonales anti-TREM-1 y de isotipo (R&D Systems, Minneapolis MN, EE. UU.) adheridos a plástico sirvieron como controles positivos y negativos, respectivamente. La Fig. 8 ilustra un ejemplo de cómo el líquido sinovial de un paciente con artritis reumatoide puede desencadenar el ensayo de células indicadoras BWZ/hTREM-1 de una manera dependiente de PGLYRP1.
Ejemplo 17: Ensamblaje de vectores de expresión de mamíferos útiles en la identificación y caracterización de la interacción PGLYRP1: TREM 1
A. ) Construcción de pJSV002 hTREM-1-G4Sx3-hTREM-1/Fc6mut (SEQ ID NO: 9)
Se construyó una versión deficiente de unión de receptor de Fc de IgG1 humana eliminando los primeros 215 aminoácidos de la IgG1 humana que comprenden el dominio variable y constante 1 (CH1) y realizando las siguientes sustituciones de aminoácidos dentro de la bisagra, dominios constante 2 y constante 3: E216G, C220S, L234A, L235E, G237A, A330S, P331S). A esta construcción se le dio el nombre de Fc6mut ya que se hicieron seis mutaciones para modular la unión a los receptores de Fc mientras que un 7a mutación (E216G) se incorporó para crear un sitio de clonación de restricción aApal. Estas mutaciones se incorporaron en pJSV002 (pTT5 modificado, Zhang J et al. Protein Expression and Purification, vol. 65, Número 1, mayo de 2009, pp 77-8) lo que permite la clonación de dominios extracelulares de los receptores 5' de Fc6mut como fragmentos EcoRI/Apal. Se sintetizó un ADNc con un sitio de restricción EcoRI 5', una secuencia Kozak de GCCACC, la secuencia líder CD33 seguida por el dominio extracelular de TREM-1 humano (aa17 -200) con un sitio de restricción Kpnl interespaciado y un espaciador glicina-glicina-glicina-serina espaciador repetido tres veces (G4Sx3) seguido de una copia adicional del dominio extracelular de TREM-1 humano (aa17-200) y un sitio Apa1 para permitir la clonación aguas arriba del Fc6mut. Este ADN sintetizado se cortó con EcoRI y ApaI y se ligó en pJSV002 Fc6mut que también se había preparado con una digestión con EcoRI/Apal. Esta ligación se sometió a electroporación en E. coli DH10B y se sembró en placas de agar con ampicilina. Los clones individuales se cultivaron durante la noche en 2 ml de cultivo de LB + ampicilina y se realizaron minipreps seguido de selección de restricción con EcoRI/Apal para encontrar clones con la inserción de 1219 pares de bases apropiadas. Se secuenciaron los clones correctos, y se seleccionó uno de los clones correctos (N.° 519) para la preparación de ADN adicional en una preparación grande.
B. ) Construcción de hTREM-1-COMP-SBP38x2-6His (SEQ ID NO: 10)
Para crear una molécula pentamérica TREM ECD, se creó una etiqueta de epítopo C terminal en el vector de expresión pJSV002. Se fusionó un ADNc sintético que codifica el extremo 3' de la proteína oligomérica del cartílago (COMP) con dos copias del dominio de proteína de unión a estreptavidina (PAS) mediante un dominio 6xHis C- terminal, incorporado en pJSV002 de manera que los dominios extracelulares de los receptores pudieran clonarse en 5' a partir de este fragmento, como un fragmento EcoRI/KpnI. Posteriormente se sintetizó ahTREMcDNA que contenía un sitio de restricción EcoRI seguido por la secuencia Kozak GCCACC y el dominio extracelular de TREM- 1 humano con un sitio Kpnl C-terminal. Este fragmento EcoRI/KpnI se ligó en el vector pJSV002 COMP-SBP38x2- 6His descrito anteriormente. Esta ligación se sometió a electroporación en E. Coli DH10B (Life Technolohies, Carlsbad, CA, EE. UU.) y se sembraron en placas de agar con ampicilina. Los clones individuales se cultivaron durante la noche en 2 ml de cultivo de LB + ampicilina y se realizaron minipreps seguido de selección de restricción con EcoRI/KpnI para encontrar clones con la inserción de 616 pb apropiada. Se secuenciaron los clones correctos, y se seleccionó uno de los clones correctos, N.° 525, para la preparación de ADN adicional mediante una preparación grande. El ADNc de longitud completa se enumera como SEQ ID NO: 10.
C. ) Construcción de pJSV002 hCD83-G4Sx3-hCD83/Fc6mut (SEQ ID NO: 11)
Se ha demostrado previamente que el tetrámero hCD83 tiene una unión baja por análisis FACS cuando se prueba contra una amplia gama de líneas celulares y, por lo tanto, es un excelente control negativo para el experimento IPMS descrito en el ejemplo 3. Para crear esta molécula, se sintetizó un ADNc con el sitio de restricción EcoRI 5', una secuencia Kozak GCCACC, la secuencia líder CD33 seguida por el dominio extracelular de CD83 humano con un sitio de restricción Kpnl interespaciado y el espaciador glicina-glicina-glicina-serina repetido tres veces (G4Sx3)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
seguido de una copia adicional del dominio extracelular de CD83 humano. Este ADNc se clonó aguas arriba del hFc6mut en el vector de expresión pJSV002 previamente descrito. La proteína madura resultante se enumera como SEQ ID NO: 6 y la secuencia de ADNc en el dominio extracelular CD83 en tándem entre EcoR1 y Apa1 se muestra como SEQ ID NO: 11.
D. ) Construcción de pJSV002 NCOMP-hDCIR (SEQ ID NO: 12)
Como un control negativo para el pentámero hTREM-1-COMP utilizado en el ejemplo 5, se utilizó hDCIR-COMP. Se creó un plásmido de expresión basado en pJSV002 con los siguientes elementos: etiqueta 6xHIS seguida de dos copias del dominio de proteína de unión a estreptavidina (PAS) fusionado al extremo 3' de la proteína oligomérica del cartílago (COMP) de manera que los dominios extracelulares de los receptores tipo 2 puedan clonarse en 3' de este fragmento como fragmentos BgIII/BamHI y expresarse como receptores pentaméricos solubles. Un fragmento de PCR se amplificó a partir de un molde de ADNc sintético para generar un fragmento de ADN con extremos BgIII y BamHI en los extremos 5' y 3' respectivamente. Este fragmento se cortó con enzimas de restricción BgIII y BamHI, seguido de purificación en banda. El fragmento resultante se ligó en pJSV002 NCOMP que se había cortado previamente con BgIII y BamHI. La ligación se sometió a electroporación en E. coli DH10B y se sembraron en placas sobre agar con selección de ampicilina. Se recogieron clones, se realizaron minipreps y se cribaron con EcoRI y BamHI y se secuenciaron los clones con la inserción de 1.137 kB adecuada. El ADNc que codifica el marco de lectura abierto completo que incluye la secuencia NCOMP-SBP y DCIR se denomina SEQ ID NO: 12 y codifica la secuencia peptídica madura previamente referida SEQ ID NO: 4.
E. ) Construcción del dímero pNNC649-hTREM1-hFc6mut
El dímero TREM1-Fc se usó en el Ejemplo 14 para confirmar la unión a PGLYRP1 y someter a prueba a otros miembros de la familia PGLYRP. El plásmido basado en ATPT5 (Zhang J et al., Protein Expression and Purification, vol. 65, número 1, mayo de 2009, págs. 77-8) pNNC649 se utilizó para permitir la clonación de dominios extracelulares de receptores en marco y 5' de Fc6mut. Para expresar hTREM1-Fc6mut, se sintetizó un ADNc con un sitio de restricción EcoRI 5', una secuencia Kozak GCCACC y una secuencia líder hCD33 seguida por el dominio extracelular de TREM-1 humano (aa17-200) seguido de un sitio Kpn1. El ADNc se clonó en pNNC549 usando técnicas de enzimas de restricción y ADN ligasa familiares para los expertos en la materia. El ADNc que codifica el marco de lectura abierto completo que incluye líder CD33, ECT hTREM1 y la secuencia Fc6mut se designa SEQ ID NO: 43 y codifica la secuencia del péptido maduro de SEQ ID NO: 44.
F. ) Construcción del dímero pNNC649-hTREML1-Fc6mut
Se creó un ADNc sintético con un sitio de restricción EcoRI 5', una secuencia Kozak GCCACC y una secuencia líder hCD33 seguida por el dominio extracelular de TREML1 humano (aa16-162) seguido de un sitio Kpn1. Este ADNc se clonó en el vector pNNC549 previamente descrito usando enzima de restricción y técnicas de ADN ligasa familiares para los expertos en la materia. El ADNc que codifica el marco de lectura abierto completo que incluye el líder CD33, hTREML1 ECD y la secuencia Fc6mut se designa SEQ ID NO: 45 y codifica la secuencia del péptido maduro de SEQ ID NO: 46.
G. ) Construcción del dímero pNNC649-hTREML2-Fc6mut
Se creó un ADNc sintético con un sitio de restricción EcoRI 5', una secuencia Kozak GCCACC y una secuencia líder hCD33 seguida por el dominio extracelular de TREML2 humano (aa19-268) seguido de un sitio Kpn1. Este ADNc se clonó en el vector pNNC549 previamente descrito usando enzima de restricción y técnicas de ADN ligasa familiares para los expertos en la materia. El ADNc que codifica el marco de lectura abierto completo que incluye el líder CD33, hTREML2 ECD y la secuencia Fc6mut se denomina SEQ ID NO: 47 y codifica la secuencia del péptido maduro SEQ ID NO: 48.
H. ) Construcción del dímero pNNC649-hTREM2-Fc6mut
Se creó un ADNc sintético con un sitio de restricción EcoRI 5', una secuencia Kozak GCCACC y una secuencia líder hCD33 seguida por el dominio extracelular de TREM2 humano (aa19-174) seguido de un sitio Kpn1. Este ADNc se clonó en el vector pNNC549 descrito previamente usando enzima de restricción y técnicas de ADN ligasa familiares para los expertos en la materia. El ADNc que codifica el marco de lectura abierto completo que incluye líder CD33, hTREM2 ECD y la secuencia Fc6mut se designa SEQ ID NO: 49 y codifica la secuencia del péptido maduro SEQ ID NO: 50.
Ejemplo 18: Un PGLYRP1 multimerizado activa TREM-1
Se identificó una contraestructura o ligando para TREM-1 mediante análisis de unión y proteómica IP/MS. La identidad del ligando, PGLYRP1 (o PGRP-S) se validó posteriormente mediante bloqueo específico.
Curiosamente, aunque se puede demostrar la unión del PGLYRP1 soluble al TREM-1, la activación del TREM-1 por
5
10
15
20
25
30
35
40
PGLYRP1 requiere la presencia concurrente de un agente de andamiaje tal como trampas extracelulares de neutrófilos (NET) o PGN.
Para probar si tal alternativa, y los formatos multimerizados de PGLYRP1 podrían unir y/o activar TREM-1, se diseñó y expresó una proteína PGLYRP1 asociada a células. Se probaron dos construcciones PGLYRP1 conceptualmente distintas. En una, se añadió un motivo de secuencia de anclaje GPI al extremo C-terminal de PGLYRP1. En otra, PGLYRP1 se ancló artificialmente en la membrana celular mediante la adición, en el extremo N terminal, de un dominio intracelular (IC) y transmembrana (TM) derivado del receptor de MDL-1 tipo II. Las últimas construcciones se denominaron PGLYRP1 Tipo II (Fig. 9a). En el Tipo II 1.0 (SEQ ID NO: 37), el aminoácido cargado del receptor de MDL-1 TM nativo se mantiene, y la expresión eficiente de esta proteína, depende de la coexpresión de DAP12. En la construcción de PGLYRP1 Tipo II 2.0 (SEQ ID NO: 38), el resto de TM cargado se ha sustituido con un aminoácido neutro (lisina por leucina), que permite la expresión de la proteína independientemente de, por ejemplo. DAP12. Los ADNc que codifican estas construcciones se expresaron transitoriamente en células HEK293 6E, las células se recogieron el día dos después de la transfección y se analizaron en cuanto a su capacidad para estimular la línea celular indicadora BWZ/hTREM1. Los transfectantes PGLYRP1 Tipo II se co-incubaron con células indicadoras BWZ/hTREM1 en ausencia de PGN. La activación de TREM1 se leyó después de 18 horas usando el reactivo BetaGlo (N.° Cat. E4720, Promega, Madison. WI, EE. UU.). Los transfectantes que expresan PGLYRP1 Tipo II indujeron la activación de TREM-1 en ausencia de PGN, a un nivel 24 veces mayor que el que se observa con las células de control transfectadas con el vector de expresión vacío. Por el contrario, el PGLYRP1 anclado a GPI, inmovilizado a través del extremo C de PGLYRP1, no mediaba ninguna activación de TREM-1. La expresión de la proteína PGLYRP1 unida a la membrana e inmovilizada en la superficie celular se determinó mediante citometría de flujo usando un anticuerpo policlonal anti-PGLYRP1 (AF2590). Se demostró que ambas proteínas, PGLYRP1 Tipo II y GPI-PGLYRP1, realmente se expresan en la superficie celular.
Construcción
Factor de actividad
C-GPI PGLYRP1
2,0 ± 0,4 (n=3)
PGLYRP1 Tipo II 1.0
24 ± 3,3 (n=3)
La tabla anterior muestra que PGLYRP1 unido a la superficie de la membrana celular a través de un anclaje GPI C- terminal no es tan potente para inducir actividad TREM-1 como una proteína PGLYRP1 Tipo II unida a la membrana celular a través de la parte N-terminal. Esto ilustra la importancia de una parte C-terminal de PGLYRP1 libre para poder estimular TREM-1.
También se demostró que la activación de PGLYRP1 Tipo II se inhibía específicamente por el anticuerpo anti- PGLYRP1. La adición del anticuerpo policlonal anti-PGLYRP1 (N.° Cat. AF2590, R&D Systems, Minneapolis MN, EE. UU.) a alta concentración (1 gg/100 gl de volumen de ensayo) era capaz de inhibir totalmente esta actividad inducida por PGLYRP1.
Condición
Actividad
PGLYRP1 Tipo II 1.0
100 %
PGLYRP1 Tipo II 1.0 + IsoAb
98 %
PGLYRP1 Tipo II 1.0 + AF2590
9,7 %
Las secuencias en el dominio C-terminal de PGLYRP1 parecen ser cruciales para la capacidad de activar el receptor TREM-1. Se ha visto por lo tanto que varias construcciones, que comparten una característica común, la modificación en el extremo C terminal de PGLYRP1, no median la activación de la actividad del indicador TREM1/BWZ, mientras que las construcciones correspondientes, que en cambio se han modificado en el extremo N terminal, muestra actividad.
Construcción
Actividad
PGLYRP1 Nativo
+ + +
PGLYRP1 N-Flag
+ + +
PGLYRP1 C-Flag
-
PGLYRP1 N-Fc
+ + +
PGLYRP1 C-Fc
(+)
Type II 1.0 PGLYRP1
+ + +
PGLYRP1 C-GPI
(+)
Esto indica la importancia de una parte C-terminal de PGLYRP1 libre para poder estimular TREM-1.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Interpretación y perspectivas biológicas
La capacidad de activar el receptor TREM-1 utilizando el ligando PGLYRP1 nativo en presencia de PGN o, bien, las variantes nuevas de PGLYRP1 que se ha demostrado que superan la necesidad de PGN, demuestra claramente que el PGN no es un requisito absoluto de co-factor para la activación de TREM-1. La característica común de los diversos formatos moleculares de PGLYRP1 que se demostró que confieren activación de TREM-1 independiente de PGN parece ser un formato de alta densidad que conduce a la hipótesis de que el papel predominante de PGN, cuando actúa como cofactor para el ligando nativo, es proporcionar un andamio para la multimerización. In vivo, dicho andamio podría ser proporcionado por trampas extracelulares de neutrófilos (NET) (Blood 2005, 106: 2551-58) u otras estructuras de matriz de origen natural, tales como ácido hialurónico, estructuras de proteoglicanos, tales como versicano, agrecano, decorina o fibrina, todos los cuales pueden multimerizar o de otro modo presentar PGLYRP1.
Estos hallazgos sugieren que la modificación de la parte C-terminal de PGLYRP1 reduce la activación de TREM-1, lo que a su vez indica que el bloqueo de la parte C-terminal de PGLYRP1 con un agente, como un anticuerpo dirigido contra la parte C-terminal de PGLYRP1, disminuiría la interacción con TREM-1 y por lo tanto la estimulación TREM-1.
Ejemplo 19: PGLYRP1 Tipo II es capaz de inducir la liberación de TNFalfa en células de tejido sinovial de pacientes con artritis reumatoide.
Se obtuvieron muestras de tejido sinovial de pacientes con AR durante la artroplastia de rodilla. Se aisló una suspensión única de células de tejido sinovial mediante digestión con 4 mg/ml de colagenasa (N.° Cat. 11088793001, Roche, Mannheim, Alemania) y 0,1 mg/ml de ADNasa (N.° Cat. 11284932001, Roche, Mannheim, Alemania). durante 1 hora a 37 grados. Las células de tejido sinovial (1x105/pocillo en medio de cultivo RPMI (N.° Cat. 22400105, Life Technologies, Carlsbad CA, EE. UU.) + FCS 10 % (N.° Cat. S0115, BioChrom AG, Berlín, Alemania) se cocultivaron con varias dosis de células HEK transfectadas transitoriamente con PGLYRP1 Tipo II en condiciones hipóxicas. Después de 24 h de incubación, se recogieron los sobrenadantes celulares y se midieron las citocinas mediante TNFa eLiSA (N.° Cat. DY210, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA).
Liberación de TNF-a (pg/ml)
PGLYRP1 Tipo II (transfectado con HEK)/Control HEK
1x105 3x104 1x104 3x103 1x103 0
IgG4+Tipo II
121,17 114,08 95,02 54,56 57,87 33,47
IgG4+Control
55,65 63,73 57,99 33,78 36,40 36,32
Este ejemplo muestra que el ligando de TREM-1 puede inducir TNF-alfa de una manera dependiente de la dosis en células de tejido sinovial de pacientes con artritis reumatoide.
Ejemplo 20: los anticuerpos anti-PGLYRP1 bloquean la señal mediada por TREM-1 en neutrófilos y disminuyen la liberación de IL-8
Habiendo demostrado que los neutrófilos pueden liberar PGLYRP1 y que los neutrófilos también expresan el receptor TREM-1, probamos si el PGLYRP1 derivado de neutrófilos puede estimular a los neutrófilos de forma autocrina. Los neutrófilos aislados se estimularon con PGN-SA (N.° Cat. Tlrl-pgnsa, Invivogen, SanDiego CA, EE. UU.), y se midió la liberación de IL-8 en el medio de cultivo. Un anticuerpo anti-PGLYRP1, mAb 0184, fue capaz de disminuir la liberación de IL-8 inducida por PGN-SA. Los neutrófilos se aislaron a partir de sangre completa de donantes sanos humanos como se describe en el ejemplo 3 y se resuspendieron en RPMI/SFB 10 %. Las células se sembraron en placas a 1,5x106 células/ml y se analizaron por triplicado los pocillos de prueba en las siguientes condiciones: sin estimulación adicional, 10 pg/ml de PGN-SA solamente o 10 pg/ml de PGN-SA en presencia de anticuerpo anti-PGLYRP1 o anticuerpo de control de isotipo hlgG4 a 4 pg/ml. Las muestras se cultivaron durante 24 horas a 37 °C, incubadora con 5 % de CO2. Los sobrenadantes se recogieron a continuación y se analizaron para determinar la IL-8 usando el conjunto Bioplex Pro Human Cytokine IL-8 (N.° Cat. 171-B5008M, BioRad, Hercules CA, EE. UU.).
Neutrófilos estimulados con
IL-8, pg/ml
Promedio
DE
Sin adición
PGN-SA
1158 341
PGN-SA + control de isotipo
1195 144
PGN-SA + mAb 0184
449 50
5
10
15
20
25
Este ejemplo ilustra que la liberación de IL-8 a partir de neutrófilos inducida por estimulación con la PGN-SA derivado de bacterias puede reducirse mediante el anticuerpo anti-PGLYRP1. El ligando de TREM-1 PGLYRP1 es, por lo tanto, un estimulante autocrino de neutrófilos, y el anticuerpo anti-PGLYRP1 divulgado en la presente memoria es potencialmente útil en la disminución de las respuestas de neutrófilos.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Novo Nordisk A/S
<120> Anticuerpos que se unen a la proteína de reconocimiento de peptidoglicano <130> 8498 <160> 53
<170> Patentln versión 3.5
<210> 1 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 1
5
10
Gln Glu Thr Glu Asp Pro Ala Cys Cys Ser Pro lie Val Pro 15 10
Glu Trp Lys Ala Leu Ala Ser Glu Cys Ala Gln His Leu Ser
20 25 30
Leu Arg Tyr Val Val Val Ser His Thr Ala Gly Ser Ser Cys 35 40 45
Pro Ala Ser Cys Gln Gln Gln Ala Arg Asn Val Gln His Tyr 50 55 60
Lys Thr Leu Gly Trp Cys Asp Val Gly Tyr Asn Phe Leu lie 65 70 75
Asp Gly Leu Val Tyr Glu Gly Arq Gly Trp Asn Phe Thr Gly
85 90
Ser Gly His Leu Trp Asn Pro Met Ser lie Gly lie Ser Phe 100 105 110
Asn Tyr Met Asp Arg Val Pro Thr Pro Gln Ala lie Arg Ala
115 120 125
Gly Leu Leu Ala Cys Gly Val Ala Gln Gly Ala Leu Arg Ser 130 135 140
Val Leu Lys Gly His Arg Asp Val Gln Arg Thr Leu Ser Pro 145 150 155
Gln Leu Tyr His Leu lie Gln Asn Trp Pro His Tyr Arg Ser 165 170 175
<210>2 <211> 617 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> TREM ECD+Fc6mut
<400>2
Arg Asn 15
Leu Pro
Asn Thr His Met
Gly Glu
80
Ala His 95
Met Gly Ala Gln Asn Tyr
Gly Asn
160
Pro

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    1. Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión al antígeno del mismo que es capaz de unirse específicamente a PGLYRP1 y reducir la actividad de TREM-1 mediada por PGLYRP1.
  2. 2. El anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que es capaz de unirse específicamente a la SEQ ID NO: 37 (PGLYRP1 Tipo II 1.0) y/o a la SEQ ID NO: 38 (PGLYRP1 Tipo II 2.0).
  3. 3. El anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que es capaz de competir con:
    (i) un anticuerpo que tiene una cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 19 y una cadena ligera como se muestra en SEQ ID NO: 20;
    (ii) un anticuerpo que tiene una cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera como se muestra en SeQ ID NO: 16;
    (iii) un anticuerpo que tiene una cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 27 y una cadena ligera como se muestra en SeQ ID NO: 28;
    (iv) un anticuerpo que tiene una cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 23 y una cadena ligera como se muestra en SEQ ID NO: 24;
    (v) un anticuerpo que tiene una cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 31 y una cadena ligera como se muestra en SeQ ID NO: 32 y/o
    (vi) un anticuerpo que tiene una cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 35 y una cadena ligera como se muestra en la SEQ ID NO: 36 para la unión a PGLYRP1.
  4. 4. El anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende:
    (i) una secuencia CDRH1 correspondiente a los restos de aminoácidos 31 a 35 (SYWMN) de SEQ ID NO: 15, en la que uno de dichos restos de aminoácidos es opcionalmente un resto de aminoácido diferente;
    (ii) una secuencia CDRH2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 66 (MIHPSDSETRLNQKFKD) de SEQ ID NO:
    15, en la que uno, dos o tres de dichos aminoácidos son opcionalmente un resto de aminoácido diferente;
    (iii) una secuencia CDRH3 correspondiente a los restos de aminoácidos 98 a 108 (DYSDYDGFAY)) de SEQ ID NO: 15, en la que uno, dos o tres de dichos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente;
    (iv) una secuencia CDRL1 correspondiente a los restos de aminoácidos 24 a 34 (RASQSISDYLH) de SEQ ID NO: 16, en la que uno, dos o tres de dichos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente;
    (v) una secuencia CDRL2 correspondiente a los restos de aminoácidos 51 a 56 (ASQSIS) de SEQ ID NO: 16, en la que uno o dos de dichos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente; y
    (vi) una secuencia CDRL3 correspondiente a los restos de aminoácidos 89 a 97 (QNGHSFPLT) de SEQ ID NO:
    16, en la que uno o dos de dichos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente.
  5. 5. El anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende:
    (i) una secuencia CDRH1 correspondiente a los restos de aminoácidos 31 a 35 (DYNMY) de SEQ ID NO: 19, en la que uno de dichos restos de aminoácidos es opcionalmente un resto de aminoácido diferente;
    (ii) una secuencia CDRH2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 66 (YIDPYNGDTSYNQKFKG) de SEQ ID NO:
    19, en la que uno, dos o tres de dichos aminoácidos son opcionalmente un resto de aminoácido diferente;
    (iii) una secuencia CDRH3 correspondiente a los restos de aminoácido 99 a 109 (GDYGNPFYLDY) de SEQ ID NO: 19, en la que uno, dos o tres de dichos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente;
    (iv) una secuencia CDRL1 correspondiente a los restos de aminoácidos 24 a 33 (SVSSSVNYMY) de SEQ ID NO:
    20, en la que uno, dos o tres de dichos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente:
    (v) una secuencia CDRL2 correspondiente a los restos de aminoácidos 49 a 55 (DTSKLPS) de la SEQ ID NO: 20, en la que uno o dos de dichos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente; y
    (vi) una secuencia CDRL3 correspondiente a los restos de aminoácidos 88 a 96 (QQWTSNPPT) de SEQ ID NO: 20, en la que uno o dos de dichos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente.
  6. 6. El anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende:
    (i) una secuencia CDRH1 correspondiente a los restos de aminoácidos 31 a 35 (DTYIH) de SEQ ID NO: 23, en la que uno de dichos restos de aminoácidos es opcionalmente un resto de aminoácido diferente;
    (ii) una secuencia CDRH2 de los aminoácidos 50 a 66 (RIDPANDDTKYDPNFQG) de SEQ ID NO: 23, en la que uno, dos o tres de dichos aminoácidos son opcionalmente un resto de aminoácido diferente;
    (iii) una secuencia CDRH3 de los restos de aminoácidos 99 a 108 (SDNSDSWFAY) de SEQ ID NO: 23, en la que uno, dos o tres de dichos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente;
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    (iv) una secuencia CDRL1 correspondiente a los restos de aminoácidos 24 a 33 (SVSSSVNFMN) de SEQ ID NO: 24, en la que uno, dos o tres de dichos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente;
    (v) una secuencia CDRL2 correspondiente a los restos de aminoácidos 49 a 55 (DTSKLAP) de SEQ ID NO: 24, en la que uno o dos de dichos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente; y
    (vi) una secuencia CDRL3 correspondiente a los restos de aminoácido 88 a 96 (HQWSSYSLT) de SEQ ID NO: 24, en la que uno o dos de dichos restos de aminoácido son opcionalmente un aminoácido diferente.
  7. 7. El anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende:
    (i) una secuencia CDRH1 correspondiente a los restos de aminoácidos 31 a 35 (DYNMH) de SEQ ID NO: 27, en la que uno de dichos restos de aminoácidos es opcionalmente un resto de aminoácido diferente;
    (ii) una secuencia CDRH2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 66 (YVDPYDGGTSSNQKFKG) de SEQ ID NO: 27, en la que uno, dos o tres de dichos aminoácidos son opcionalmente un resto de aminoácido diferente;
    (iii) una secuencia CDRH3 correspondiente a los restos de aminoácidos 99 a 106 (EVPYYFDY) de SEQ ID NO:
    27, en la que uno, dos o tres de dichos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente;
    (iv) una secuencia CDRL1 correspondiente a los restos de aminoácidos 24 a 33 (VASSSVTYMY) de SEQ ID NO:
    28, en la que uno, dos o tres de dichos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente;
    (v) una secuencia CDRL2 correspondiente a los restos de aminoácidos 49 a 54 (THPLAS) de la SEQ ID NO: 28, en la que uno o dos de dichos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente; y
    (vi) una secuencia CDRL3 correspondiente a los restos de aminoácidos 87 a 95 (PHWNTNPPT) de SEQ ID NO: 28, en la que uno o dos de dichos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente.
  8. 8. El anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende:
    (i) una secuencia CDRH1 que corresponde a los restos de aminoácidos 31 a 35 (DYYMY) de SEQ ID NO: 31, en la que uno de estos restos de aminoácidos es opcionalmente un resto de aminoácido diferente;
    (ii) una secuencia CDRH2 que corresponde a los aminoácidos 50 a 66 (AISDDSTYTYYPDSVKG) de SEQ ID NO: 31, en la que uno, dos o tres de estos aminoácidos son opcionalmente un resto de aminoácido diferente;
    (iii) una secuencia CDRH3 que corresponde a los restos de aminoácidos 99 a 109 (GGYGNLYAMDY) de SEQ ID NO: 31, en la que uno, dos o tres de estos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente;
    (iv) una secuencia CDRL1 que corresponde a los restos de aminoácidos 24 a 35 (TASSSVSSSYLH) de SEQ ID NO: 32, en la que uno, dos o tres de estos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente;
    (v) una secuencia CDRL2 que corresponde a los restos de aminoácidos 51-57 (STSNLAS) de SEQ ID NO: 32, en la que uno o dos de estos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente; y
    (vi) una secuencia CDRL3 que corresponde a los restos de aminoácidos 90-98 (HQYHRSPFT) de SEQ ID NO: 32, en la que uno o dos de estos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente.
  9. 9. El anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende:
    (i) una secuencia CDRH1 que corresponde a los restos de aminoácidos 31 a 35 (NYVMH) de SEQ ID NO: 35, en la que uno de estos restos de aminoácidos es opcionalmente un resto de aminoácido diferente;
    (ii) una secuencia CDRH2 que corresponde a los aminoácidos 50 a 66 (WINPFNDGTNYNENFKN) de SEQ ID NO: 35, en la que uno, dos o tres de estos aminoácidos son opcionalmente un resto de aminoácido diferente;
    (iii) una secuencia CDRH3 que corresponde a los restos de aminoácidos 99 a 109 (SGFITTLIEDY) de SEQ ID NO: 35, en la que uno, dos o tres de estos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente;
    (iv) una secuencia CDRL1 que corresponde a los restos de aminoácidos 24 a 34 (KASESVGSFVS) de SEQ ID NO: 36, en la que uno, dos o tres de estos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente;
    (v) una secuencia CDRL2 que corresponde a los restos de aminoácidos 50 a 56 (GASNRYT) de SEQ ID NO: 36, en la que uno o dos de estos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente; y
    (vi) una secuencia CDRL3 que corresponde a los restos de aminoácidos 89 a 96 (GQYYTHPT) de SEQ ID NO: 36, en la que uno o dos de estos restos de aminoácidos son opcionalmente un aminoácido diferente.
  10. 10. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  11. 11. El anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10, para su uso como medicamento.
  12. 12. El anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10, para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmunitaria que tienen como resultado
    inflamación aguda o crónica, en una sujeto que lo necesita.
  13. 13. El anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo para su uso o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la enfermedad inflamatoria o la enfermedad autoinmunitaria se
    5 seleccionan del grupo que consiste en: enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome del intestino irritable, artritis reumatoide, psoriasis, artritis psoriásica, lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, diabetes tipo I, enfermedad de Grave, esclerosis múltiple, miocarditis autoinmunitaria, enfermedad de Kawasaki, arteriopatía coronaria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad pulmonar intersticial, tiroiditis autoinmunitaria, esclerodermia, esclerosis sistémica, artrosis, dermatitis atópica, vitíligo, enfermedad de 10 injerto contra huésped, síndrome de Sjogrens, nefritis autoinmunitaria, síndrome de Goodpasture, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, alergia y asma.
  14. 14. Un método para producir un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende expresar mediante recombinación el anticuerpo o el
    15 fragmento del mismo en una célula procariota o eucariota.
    imagen1
    FIg. 1
    Luminiscencia
    X10E06
    TLRL
    neutrofilos
    neutrofilos + citocinasl -
    neutrofilos + citocinas2
    neutrofilos + TLRL
    neutrofilos + poli l:C
    neutrofilos + LPS
    neutrofilos + PGN
    neutrofilos + mezcla de TLR2 Y/yZ/y/////^
    neutrofilos + Pam3CSK4
    neutrofilos + HKLM -
    neutrofilos + LM-MS -
    neutrofilos + PG-LPS -
    neutrofilos + LTA
    neutrofilos + PGN
    <
    CM
    d)
    imagen2
    Histograma %.df M 0 3 células
    seleccio
    nadas
    1 2
    2 2
    LO
    CT)
    Fig. 2B
    imagen3
    Histograma 0/0 de ^ o células
    seleccionadas
    2
    39
    co
    CT)
    Fig. 20
    imagen4
    Histograma 0/0 de ^ o células
    seleccionadas
    1 2
    2 41
    CT)
    o
    CM
    d>
    imagen5
    Histograma
    % de
    N.°
    células
    seleccio
    nadas
    1
    2
    2
    10
    00
    CT)
    Fig.3
    Proteínas identificadas
    Símbolos del gen Número de depósito
    Isoforma 1 del receptor desencadenante expresado en células mieloides 1
    Tremí IPI00427321
    Proteína de reconocimiento de peptidoglicano 1
    PGLYRP1 IPI00021085
    Isoforma 3 de la proteína tirosina fosfatasa no receptor tipo 6
    PTPN6 IPI00183Q46
    CD83/Neutrófilo Treml/Neutrófilo
    CT>
    CT)
    imagen6
    <
    ■<fr
    Ó)
    /
    h
    J\
    s
    Nombre de la muestra
    Media
    No teñida
    Trem-tet/Fe, transí, simuladas
    transí, con PGLYRP
    Respuesta (RU)
    Fig. 4B
    imagen7
    imagen8
    imagen9
    imagen10
    imagen11
    Fig. 5B
    Ensayo del indicador hTREM-1/BWZ.36
    TREM ECD + 0,2 ug/mf PGLYRP-1
    2000u0n
    + PGLYRP-1 solo
    Fusión TREM-1/Fc
    D 150000
    lOuuuO
    Cü 50000
    0,01
    IDO
    ug/ml
    106
    placa 1-sobrenadantes - placa 2-sobrenadantes - placa 3-sobrenadantes - placa 4-sobrenadantes - placa 5-sobrenadantes ■ placa 6-sobrenadantes - placa 7-sobrenadantes -
    placa 8-sobrenadantes -
    1,0x1006
    o F105
    o
    x
    o
    o
    O
    TI
    O
    <0
    OI
    o*
    TT
    Ca>
    imagen12
    cq'
    O
    >
    107
    B-galactosidasa
    & & a*
    o o o o
    £f!3 m
    M -h PGR PS-2 F2 M-h PGR PS-2 F3 M-h PGR PS-2 F4 P-h PGR PS-2 F5 M-h PGR PS-2 F6 m -h PGR PS-2 F7 Medio Sin estim.
    Estim. con PGN-SA
    imagen13
    <Q
    O)
    W
    imagen14
    imagen15
    imagen16
    imagen17
    pgfyrp-1/pgn
    1OUOQOn
    Sü t-Dc
    - : • 2
    - 2 y
    as 50000 ■
    V-rr.Tf
    ÍAb , ug/ml
    imagen18
    1 ug/ml de Mab anti-TRE 1 unido a la placa
    QQQQQ-i
    X-I
    D 150000
    0 100000
    m 50000-
    AbJ, ug/ml
    imagen19
    Fluido sinovial de AR
    250000
    Sin adición
    2Q0Q0Ü-1-*
    6000-r
    + PGN-ECna
    +PGM + AF2590
    -A
    mlgGl
    . -
    anti TREM
    2010-
    % SF
    imagen20
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