CN117820475A

CN117820475A - 针对il-17a的新型纳米抗体、药物、制备、方法及应用

Info

Publication number: CN117820475A
Application number: CN202311770901.4A
Authority: CN
Inventors: 刘广洋; 刘拥军; 张晨亮; 李欣; 徐利强; 崔嫄汭
Original assignee: Beijing Beilai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Beilai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-12-21
Filing date: 2023-12-21
Publication date: 2024-04-05

Abstract

本发明提供了针对IL‑17A的新型纳米抗体、药物、制备、方法及应用，属于细胞免疫学技术领域。所述的抗体包括3个互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述的HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和/或；与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3分别至少具有80％的序列相似性的氨基酸序列。所述的抗体与阳性抗体Ixekizumab相比亲和力更高，与Human IL‑17A蛋白有更好的结合活性，并且阻断效果好，稳定性强。

Description

针对IL-17A的新型纳米抗体、药物、制备、方法及应用

技术领域

本发明属于细胞免疫学技术领域，具体涉及针对IL-17A的新型纳米抗体、药物、制备、方法及应用。

背景技术

IL-17家族细胞因子的来源为T细胞，IL-17家族成员包括6个配体和5个受体，所述的6个配体分别为IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F，所述的5个受体分别为IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD和SEF。IL-17是一种引起炎症的细胞因子，主要由活化的T细胞产生，IL-17的主要来源是免疫细胞，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、NTK细胞等。IL-17A与自身免疫性疾病、机械损伤、感染、癌症、肥胖和慢性炎症性疾病有关。IL-17A的合成依赖于产生IL-17A的多种细胞和转录因子，包括CD4+αβTH17细胞和RORγt转录因子。IL-17A通过诱导气道中多种细胞产生促炎细胞因子、趋化因子和抗菌肽介导其免疫调节功能，导致中性粒细胞和巨噬细胞被吸引至炎症部位，从而促进炎症的发展。

当细胞表达IL-17A时，通常会伴随着某些疾病的进行。IL-17A通过多种途径来调控免疫细胞的功能，进而改变疾病的进展，在银屑病的发生过程中，IL-17A参与中性粒细胞的募集，这些细胞聚集后形成微脓肿。现有技术中公开了一种抗IL-17A的单克隆抗体ixekizumab能够使银屑病患者的角质化细胞增殖和增生减少，表皮厚度降低、T细胞和树突细胞对真皮和表皮的浸润以及角质化细胞防御肽的表达有显著性的剂量依赖性降低。研究数据表明，IL-17是银屑病中激活致病炎症的关键细胞因子，用ixekizumab中和IL-17可成为一种治疗银屑病的手段(IL-17A is Essential for Cell Activation andInflammatory Gene Circuits in Psoriasis,J G Krueger,S Fretzin,et al.J AllergyClin Immunol.2012,130(1):145-54)。虽然单抗药物具有较好的治疗效果，但其具有明显的副作用，包括头痛、恶心、甚至更严重的免疫反应等，并且单抗药物的稳定性较差。

单域抗体在哺乳类骆驼科动物的体液免疫系统中发现，由单一的可变区、1个铰链区和2个恒定区(CH2和CH3组成)，分子量约为15kDa。单域抗体具有最小的功能性抗原结合片段，具有与抗原结合的较高的亲和力和高度的稳定性。单域抗体只有重链，单域抗体的制造较为容易，可以低成本的制造大产量，因此，单域抗体在疾病的治疗和诊断中具有较大的价值。

目前，针对IL-17A的抗体药物较少，仍然需要研发新的特异性识别IL-17A的单域抗体。

本发明系发明人针对自主开发的抗IL-17A抗体所提出的专利申请。

除本发明请求保护的抗体外，发明人同时开发出另外8个抗体，基于专利法单一性的相关规定，对9个不同抗体分别请求保护。

发明人还根据这9个抗体开发了12个串联抗体，基于专利法单一性的相关规定，对12个不同的串联抗体分别请求保护。

发明人还根据这12个串联抗体，开发了基因修饰干细胞技术，基于专利法单一性的相关规定，对3个不同的基因修饰干细胞以及3项不同的应用分别请求保护。

为便于理解本发明技术方案，可选地参阅本项目其他系列申请文本。

发明内容

本发明的术语和声明：

1、如本文所用，术语“氨基酸”：包含天然氨基酸、合成氨基酸、以及以类似于天然氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸在本文中可以由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名法委员会(BiochemicalNomenclature Commission)所推荐的单字母符号来提及。

2、如本文所用，术语“抗体”：指特异性结合和识别抗原的包括免疫球蛋白基因的构架区的多肽或其片段。术语抗体的使用意指包含全抗体和其抗原结合片段。术语抗体包含单特异性抗体、双特异性抗体和多特异性抗体，只要其表现所期望的生物活性或功能即可。

3、如本文所用，术语“单克隆抗体”：指从实质上均质抗体的群体获得的抗体，即构成所述群体的个别抗体除了可以少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体针对单一抗原位点具高度特异性。此外，相比于通常包含针对不同决定子(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。修饰语“单克隆”指示如从实质上均质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。

4、如本文所用，术语“单域抗体(VHH)”、“单域抗体”(singledomain antibody,sdAb，或纳米抗体nanobody)具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。

5、如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个肽或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，为了进行比较的目的，这些位置可能会被对齐。当比较序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。

6、如本文所用，术语“表位”指抗体的互补位所结合的抗原上的任何抗原决定簇。抗原决定簇通常包含分子的化学活性表面基团，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性”表位或“构象”表位。

7、如本文所用，术语“氨基酸序列”是指氨基酸相互连接形成肽链(或多肽)的顺序，氨基酸序列只能按照一个方向读取。

8、如本文所用，术语“核酸分子”可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明中的核苷酸分子全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法或人工合成的方法获得。

9、如本文所用，术语“核苷酸序列”是指DNA或RNA中碱基的排列顺序，即在DNA中为A、T、G、C的排列顺序，或者在mRNA中A、U、G、C的排列顺序，也包括rRNA、tRNA、mRNA中碱基的排列顺序。

10、如本文所用，术语“框架区”即骨架区，在免疫球蛋白的H和L链的近N端约有110个氨基酸序列的变化很大，其他部分的氨基酸序列相对恒定，据此可将轻链和重链区分为可变区(V)和恒定区(C)。可变区内包含超变区HVR或称互补决定区CDR与FR骨架区。

11、如本文所用，术语“人源化”抗体是指抗体的可变区(VH或VHH)的Fr区部分，恒定区部分(即CH和CL区)或抗体所有全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体和全人源化抗体等几类。

12、如本文所用，术语“Fc区”是指免疫球蛋白的C端区域，该区域是由重链恒定结构域中仅CH2和CH3组成的功能性结构单元。Fc没有结合抗原的能力，然而其具有半衰期延长的性质，并且具有恒定的氨基酸序列。

13、本文所用的术语“高变区”、“超变区”、“互补决定区”、“HVR”或“CDR”，是指在抗体可变结构域区域中序列上高变和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的区域。通常，天然四链抗体包含六个HVR或CDR：三个存在于VH中(H1、H2、H3)，三个存在于VL中(L1、L2、L3)。基于Chothia定义规则，示例性CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3)位于氨基酸残基L26-L32(L1)、L50-L52(L2)、L91-L96(L3)、H26-H32(H1)、H52-H56(H2)和H96-H101(H3)处(Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。基于Kabat定义规则，示例性CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3)位于氨基酸残基L24-L34(L1)、L50-L56(L2)、L89-L97(L3)、H31-H35(H1)、H50-H65(H2)和H95-H102(H3)处(Kabat等人，Sequences of ProteinsofImmunological Interest,the fifth edtion,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(1991))。基于IMGT定义规则，示例性CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3)位于氨基酸残基L27-L32(L1)、L50-L51(L2)、L89-L97(L3)、H26-H33(H1)、H51-H56(H2)和H93-H102(H3)处(Honjo,T.和Alt,F.W.(1995)Immunoglobulin genes.Academic Press pp.3-443)。本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat定义规则、基于结构环区域位置的Chothia定义规则和基于CDR移植的抗体人源化设计的参考工具(参见J MolBiol.273:927-48,1997)。本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“CDR”及“互补决定区”应理解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。虽然本公开请求保护的范围是基于IMGT定义规则所示出的序列，但是根据其他CDR定义规则所对应的氨基酸序列也应当落在本发明的保护范围中。

14、本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。

15、本文所用的术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项的组合。

16、本文所用的术语“IL-17A”或“白介素-17A”，是指一种细胞因子，属于白细胞介素17家族，由T细胞和其他类型的免疫细胞产生，并在免疫系统中发挥重要作用。IL-17A主要由Th17细胞产生，其他细胞包括CD8+T细胞、γδT细胞、NK细胞及中性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞也表达IL-17A。它主要作用于免疫细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞，诱导炎症反应。在一些实例中，该术语包括变体、同源物、直系同源物和旁系同源物。例如，对人IL-17A特异的抗体可以在某些情况下与另一物种例如猴的IL-17A蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人IL-17A蛋白特异的抗体可以完全地对人IL-17A蛋白特异而不与其他物种或其他类型的蛋白交叉反应，或者可以与一些其他物种而非所有其他物种的IL-17A蛋白交叉反应。

17、本文所用的术语“抗IL-17A(单域或纳米)抗体”或“IL-17A(单域或纳米)抗体”，是指特异性结合IL-17A，并且部分或完全地中和、抑制或削弱IL-17A活性、和/或使IL-17A失活、阻止IL-17A应答或由IL-17A介导的下游通路或其他IL-17A介导的功能的抗体。

18、本文所用的术语“抗体”，是指包含由二硫键(SS)相互连接的重链(H)和轻链(L)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区(本文中缩写为CH)组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区(本文中缩写为VH)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。轻链分为两类分别为kappa型轻链和lambda型轻链(例如本发明中轻链恒定区Cκ/λ表示轻链恒定区为kappa型轻链或者lambda型轻链)。VH区和VL区可以进一步再划分为超变区(也称互补决定区(CDR))，其间插有较保守的构架区或框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。抗体包含单特异性抗体、双特异性抗体和多特异性抗体，只要其表现所期望的生物活性或功能即可。

19、本文所用的术语“活性”、“功能活性”或“生物活性”，或术语“生物性质”或“生物特征”此处可互换使用，包括但不限于表位/抗原亲和力和特异性、在体内或体外中和或拮抗IL-17A活性的能力、IC50、抗体的体内稳定性和抗体的免疫原性质。本领域公知的抗体的其它可鉴定的生物学性质或特征包括，例如，交叉反应性(即通常与靶定肽的非人同源物，或与其它蛋白质或组织的交叉反应性)，和保持哺乳动物细胞中蛋白质高表达水平的能力。使用本领域公知的技术观察、测定或评估前面提及的性质或特征，所述技术包括但不局限于ELISA、FACS或BIACORE等离子体共振分析、不受限制的体外或体内中和测定、受体结合、细胞因子或生长因子的产生和/或分泌、信号转导和不同来源(包括人类、灵长类或任何其它来源)的组织切片的免疫组织化学。

20、本文所用的术语“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由平衡解离常数(KD)代表，平衡解离常数是解离速率常数和结合速率常数(分别是Koff和Kon)的比值。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。用于测量亲和力的一个具体方法是本文中的ForteBio动力学结合测定法。

21、本文所用的术语“高亲和性”或“高亲和力”，对于IgG抗体而言，是指对于抗原的KD为1.0×10^-6M或更低，优选5.0×10-8M或更低，更优选1.0×10^-8M或更低、5.0×10^-9M或更低，更优选1.0×10^-9M或更低。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，IgM亚型的“高亲和性”结合是指KD为10^-6M或更低，优选10^-7M或更低，更优选10^-8M或更低。

22、术语“抗体药物偶联物”是指生物活性化合物片段与抗体或其抗原结合片段部分连接得到的物质。生物活性化合物片段与靶向部分可以通过连接子相连。所述连接子在特定环境(例如胞内低pH值环境)中或特定作用(例如溶酶体蛋白酶的作用)下能够断裂，从而使生物活性化合物片段与靶向部分或抗体或其抗原结合片段分离。所述连接子包含可裂解或不可裂解的单元，例如肽或二硫键。生物活性化合物片段与靶向部分或抗体或其抗原结合片段直接通过共价键相连，所述共价键在特定环境或作用下能够断裂，从而使生物活性化合物片段与抗体或其抗原结合片段部分分离。

23、本文所用的术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其呈单链或双链形式的聚合物。除非明确地限制，否则术语包括具有与参照核酸相似的结合性质并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢的含有已知的天然核苷酸的类似物的核酸(参见，属于Kariko等人的美国专利No.8278036，其公开了尿苷被假尿苷替代的mRNA分子，合成所述mRNA分子的方法以及用于在体内递送治疗性蛋白的方法)。除非另有所指，否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可通过生成其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini,Mol.Cell.Probes 8:9198(1994))。

24、本文所用的术语“分离的核酸”是一种已被鉴定并从其自然环境的组成部分中分离出来的核酸。分离的核酸包括包含在通常包含核酸分子的细胞中的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或不同于其自然染色体位置的染色体位置。

25、本文所用的术语“载体”是指任何重组多核苷酸构建体，该构建体可用于转化的目的(即将异源DNA引入到宿主细胞中)。一种类型的载体为“质粒”，是指环状双链DNA环，可将额外DNA区段连接至该环中。另一类型的载体为病毒载体，其中可将额外DNA区段连接至病毒基因组中。某些载体能够在被引入到的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体)。在引入到宿主细胞中后，其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)整合至宿主细胞的基因组中，且因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够导引被操作性连接的基因的表达。本文将此类载体称为“表达载体”。

26、本文所用的术语“表达载体”是指能够在转化、转染或转导至宿主细胞中时复制及表达目的基因的核酸分子。表达载体包含一或多个表型选择标记及复制起点，以确保维护载体及以在需要的情况下于宿主内提供扩增。

27、本文所用的术语“细胞”、“细胞系”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌等原核细胞，如酵母细胞等的真菌细胞，或者如纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

28、本文所用的术语“药物组合物”通常是指这样的制剂，其以允许活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对将施用所述组合物的对象具有不可接受的毒性的另外的成分。所述组合物是无菌的。

29、术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

30、本文所用的术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。

31、本文所用的术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”，是指本发明的抗IL-17A抗体或其抗原结合片段当单独或与其它治疗药物组合给予细胞、组织或受试者时，有效预防或改善一种或多种疾病或病况的症状或该疾病或病况的发展的量。治疗有效剂量还指足以导致症状改善的抗体或其抗原结合片段的量，例如治疗、治愈、预防或改善相关医学病况或者提高这类病况的治疗、治愈、预防或改善的速度的量。当对个体施用单独给予的活性成分时，治疗有效剂量仅是指该成分。当组合施用时，治疗有效剂量是指引起治疗效果的活性成分的综合量，不论是组合、依次给予还是同时给予。治疗剂的有效量将导致诊断标准或参数提高至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％，最优选至少50％。

32、本文所用的术语“EC50”是指半最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect)，即能引起50％最大效应的浓度。

33、本文所用的术语“癌症”或“肿瘤”，是指描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调控的生理疾患。此定义中包括良性和恶性癌症以及休眠肿瘤或微转移。

34、本文所用的术语“自身免疫性疾病”或“自免疫性疾病”，是指由于某些原因造成免疫系统对自身成分的免疫耐受减低、降低和/或破坏，致使自身抗体和/或致敏淋巴细胞损伤自身器官组织而引起的疾病，具体表现为相应组织器官的功能障碍。

本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种抗体，所述的抗体包括3个互补决定区

HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述的HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和/或；与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3分别至少具有80％的序列相似性的氨基酸序列。

优选地，所述的抗体包括：在SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列上进行修饰、缺失、取代和/或添加中的至少一种方式所得到的氨基酸序列。

进一步地，所述的抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸差异。

SEQ ID NO:1为：GFSIHIYA。

SEQ ID NO:2为：ITRGGVT。

SEQ ID NO:3为：NVGGTNGGY。

第二方面，本发明提供了一种抗体，所述的抗体包含框架区FR，所述的框架区FR包括：SEQ ID NO:4所示的FR1、SEQ ID NO:5所示的FR2、SEQ ID NO:6所示的FR3、SEQ ID NO:7所示的FR4；和/或；与SEQ ID NO:4-7所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性的氨基酸序列。

优选地，所述的抗体的氨基酸序列包含：在SEQ ID NO:4-7所示的氨基酸序列上进行修饰、缺失、取代和/或添加中的至少一种方式所得到的氨基酸序列。

进一步地，所述的抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO:4-7所示的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、

35、36、37或38个氨基酸差异。

具体地，一个或多个氨基酸的取代可以是一个或多个氨基酸的保守性取代。这种保守性取代优选地是以下组(a)到(e)中的一个氨基酸被同组中的另一个氨基酸残基取代的取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性、带负电的残基及其(不带电的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性、带正电的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met、Leu、He、Val和Cys；以及(e)芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。

进一步地，保守性取代如下：Ala到Gly或到Ser；Arg到Lys；Asn到Gln或到His；Asp到Glu；Cys到Ser；Gln到Asn；Glu到Asp；Gly到Ala或到Pro；His到Asn或到Gln；Ile到Leu或到Val；Leu到Ile或到Val；Lys到Arg、到Gln或到Glu；Met到Leu、到Tyr或到Ile；Phe到Met、到Leu或到Tyr；Ser到Thr；Thr到Ser；Trp到Tyr；Tyr到Trp；和/或Phe到Val、到Ile或到Leu。

根据本发明的一些实施方式，所述功能活性变体为与(1)所述的抗IL-17A单域抗体具有相同或相近的亲和力或功能的单域抗体变体(突变体)，例如可以特异性结合IL-17A并阻断IL-17A与其受体结合的变体(突变体)。

SEQ ID NO:4为：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS。

SEQ ID NO:5为：MGWYRQAPGKQRELVAT。

SEQ ID NO:6为：

NNADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPGDTAVYYC。

SEQ ID NO:7为：WGQGTQVTVSS。

第三方面，本发明提供了一种抗体，所述的抗体的氨基酸序列包含第一方面所述的抗体的氨基酸序列和第二方面所述的抗体的氨基酸序列。

第四方面，本发明提供了一种抗体，所述的抗体的氨基酸序列包含：FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4；

所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示或与SEQ IDNO:1-3所示的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个的氨基酸差异的氨基酸序列的功能活性变体；

所述的FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4-7所示或与SEQ IDNO:4-7所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的功能活性变体。

优选地，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

优选地，所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQID NO:5所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示。

优选地，所述的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

SEQ ID NO:8为：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSIHIYAMGWYRQAPGKQRELVA TITRGGVTNNADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPGDTAVYYCNVGGT NGGYWGQGTQVTVSS。

优选地，所述的抗体为单域抗体。

进一步地，所述的抗体为抗IL-17A抗体。

进一步地，所述的抗体包含部分或全部选自人源、鼠源、灵长目动物源或骆驼科动物源的抗体重链框架区或其变体；

优选地，包含部分或全部选自骆驼科动物源的抗体重链框架区或其变体；

更优选地，包含部分或全部选自羊驼源的抗体重链框架区或其变体。

第五方面，本发明提供了一种抗体制剂，所述的抗体制剂包含上述第一方面至第四方面任一方面所述的抗体和药学上可接受的载体。

具体地，所述的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用。

第六方面，本发明提供了一种多克隆抗体，所述的多克隆抗体包含上述第一方面至第四方面任一方面所述的抗体。

第七方面，本发明提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白包含上述第一方面至第四方面任一方面所述的抗体。

优选地，所述的重组蛋白还包含协助其表达和/或分泌，或延长其在体内半衰期的生物活性蛋白或其功能片段；

进一步优选地，所述生物活性蛋白或其功能片段选自免疫球蛋白Fc结构域、血清白蛋白、白蛋白结合多肽、前白蛋白、羧基末端肽、弹性蛋白样多肽、His标签、GST标签、MBP标签、FLAG标签和SUMO标签中的至少一种。

再进一步地，所述生物活性蛋白或其功能片段为人免疫球蛋白Fc结构域，优选为人IgG的Fc结构域，例如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc结构域，更优选为人IgG1的Fc结构域。

根据本发明的一些实施方式，所述的人IgG1 Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

SEQ ID NO:10:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

具体地，编码SEQ ID NO:10的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

SEQ ID NO:11：

GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。

根据本发明的一些实施方式，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换、缺失和插入)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。

根据本发明的一些实施方式，所述重组蛋白可以为单聚体、二聚体或多聚体。

第八方面，本发明提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物包括：上述第一方面至第四方面任一方面所述的抗体、所述的抗体制剂、所述的多克隆抗体或所述的重组蛋白；和与(1)结合的偶联部分。

根据本发明的一些实施方式，所述偶联部分包括可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素和/或酶。

第九方面，本发明提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括上述第一方面至第四方面任一方面所述的抗体、所述的抗体制剂、所述的多克隆抗体或所述的重组蛋白；和装载所述抗体制剂的容器。

优选地，所述的试剂盒还可以包括容器、缓冲液、识别IL-17A蛋白的抗体、检测底物等。

第十方面，本发明提供了一种核酸分子，所述的核酸分子编码上述第一方面至第四方面任一方面所述的抗体、所述的多克隆抗体或所述的重组蛋白。

根据本发明的一些实施方式，所述的核酸可为RNA、DNA或cDNA。

根据本发明的一些实施方式，本发明的核酸也可呈载体形式，可存在于载体中和/或可为载体的一部分，该载体例如质粒、粘端质粒或YAC。载体可为表达载体，该表达载体通常包含至少一种本发明的核酸，其可操作地连接至一个或多个适合的表达调控元件(例如启动子、增强子、终止子等)。

具体地，所述的编码SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的核酸分子的序列如SEQ IDNO:9所示。

SEQ ID NO:9为：

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCGGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTTAGTATCCACATCTATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGCTGGTCGCAACTATTACTAGAGGTGGTGTAACAAATAATGCAGACTCCGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGCGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGGGGACACGGCCGTCTATTACTGTAATGTAGGTGGGACGAACGGGGGCTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。

第十一方面，本发明提供了一种生物学表达载体，所述的生物学表达载体包含所述的核酸分子。

根据本发明的一些实施方式，所述的生物学表达载体可以为真核表达载体或原核表达载体，优选真核表达载体。

优选地，所述真核表达载体选自酵母表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物表达载体；

更优选地，所述哺乳动物表达载体选自逆转录病毒表达载体、慢病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体。

第十二方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含所述的核酸分子和/或所述的生物学表达载体。

优选地，所述的宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。

进一步地，所述的细菌细胞包括革兰氏阴性细菌菌株及革兰氏阳性细菌菌株的细胞。

再进一步地，所述的革兰氏阴性细菌菌株包括大肠杆菌菌株、假单胞菌菌株和变性杆菌菌株。

再进一步地，所述的革兰氏阳性细菌菌株包括链霉菌菌株、芽孢杆菌菌株和葡萄球菌菌株。

进一步地，所述的真菌细胞包括木霉属、脉孢菌属及曲菌属物种的细胞。

进一步地，所述的哺乳动物细胞包括HEK293细胞、HeLa细胞、CHO细胞和COS细胞。

再进一步地，所述的哺乳动物细胞为HEK293细胞。

第十三方面，本发明提供了上述第一方面至第四方面任一方面所述的抗体、所述的抗体制剂、所述的多克隆抗体、所述的重组蛋白、所述的抗体药物偶联物、所述的试剂盒所述的核酸分子、所述的生物学表达载体或所述的宿主细胞的用途，其特征在于：所述的用途选自以下至少一种：

(1)制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物；

(2)制备预防和/或治疗癌症的药物；

(3)制备检测试剂或试剂盒。

具体地，所述自身免疫性疾病包括多发性硬化症、系统性硬皮病、系统性红斑狼疮、皮肌炎、急进性肾小球肾炎、类风湿关节炎、白塞氏病、进行性系统性硬化症、干燥综合征、寻常型白斑病、硬皮病、幼年特发性关节炎、恶性贫血、血管炎、大血管血管炎、艾迪生病、多发性肌炎、卡斯尔曼病、特发性艾迪生病、银屑病关节炎、多灶性运动神经病、成人斯蒂尔病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、结节性动脉周围炎、特发性无精子症、妊娠疱疹、主动脉炎综合征、恶性类风湿关节炎、嗜酸性筋膜炎、自身免疫性视神经病、类天疱疮、桥本病、脊椎关节炎、白斑病、重症肌无力、混合性结缔组织病、巴塞杜病、慢性萎缩性胃炎、抗磷脂抗体综合征、过敏性肉芽肿性血管炎、过敏性血管炎、类风湿性血管炎、Good-pasture综合征、Cogan综合征、ANCA相关性血管炎、线性IgA大疱性皮肤病、RS3PE综合征、颞动脉炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛、慢性盘状红斑狼疮、IgG4相关疾病、格林巴利综合征、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、狼疮性肾炎、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性肾上腺皮质功能减退症、原发性甲状腺功能减退症、I型糖尿病、缓慢进展型I型糖尿病、局灶性硬皮病、银屑病、大疱性类天疱疮、天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、斑秃、视神经脊髓炎、结节病、巨细胞动脉炎、肌萎缩侧索硬化、原田病、习惯性流产、炎症性肠病、乳糜泻、强直性脊柱炎、严重哮喘、慢性荨麻疹移植免疫、家族性地中海热、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、扩张型心肌病、系统性肥大细胞增多症或包涵体肌炎。

具体地，所述的癌症包括食道癌、喉癌、口腔癌、头颈癌、唾液腺癌、视网膜母细胞瘤、肝癌、皮肤癌、肺癌、直肠癌、卵巢癌、肾癌、白血病、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、淋巴瘤、肉瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、胆管癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌症、子宫内膜癌、眼癌、胃癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、呼吸系统癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、慢性成髓细胞性白血病。

第十四方面，本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含：上述第一方面至第四方面任一方面所述的抗体、所述的抗体制剂、所述的多克隆抗体、所述的重组蛋白、所述的抗体药物偶联物、所述的核酸分子、所述的生物学表达载体或所述的宿主细胞；和；优选地，所述的药物组合物还包括至少一种药学上可接受的辅料。

具体地，所述的药学上可接受的辅料选自溶剂、稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、助悬剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂、抗氧化剂中的至少一种。

第十五方面，本发明提供了一种用于非诊断目的的体外检测样品中IL-17A的方法，所述的方法包括以下步骤：

(1)将上述第一方面至第四方面任一方面所述的抗体、所述的抗体制剂、所述的多克隆抗体、所述的重组蛋白、所述的抗体药物偶联物与检测样品结合；

(2)检测抗原-抗体复合物，并进行结果判读。

第十六方面，本发明提供了一种预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，所述的方法包括向受试者施用治疗有效量的上述第一方面至第四方面任一方面所述的抗体、所述的抗体制剂、所述的多克隆抗体、所述的重组蛋白、所述的抗体药物偶联物、所述的核酸分子、所述的生物学表达载体、所述的宿主细胞或所述的药物组合物。

第十七方面，本发明提供了一种预防和/或治疗癌症的方法，所述的方法包括向受试者施用治疗有效量的上述第一方面至第四方面任一方面所述的抗体、所述的抗体制剂、所述的多克隆抗体、所述的重组蛋白所述的抗体药物偶联物、所述的核酸分子、所述的生物学表达载体、所述的宿主细胞或所述的药物组合物。

本发明的有益效果包括：

本发明的单域抗体1-F12与传统的单克隆抗体相比，其亲和力更高，单域抗体1-F12的EC50值为6.528，阳性抗体(Ixekizumab)的EC50＝10.06，单域抗体1-F12与Human IL-17A蛋白有较好的结合活性。

IL-17A单域抗体1-F12具有较好的阻断效果，能够阻断Human IL-17A蛋白激活293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc。

单域抗体1-F12的稳定性较强，Tm＝55.9，Tagg＝80.97。

附图说明

图1为IL-17A重组蛋白SDS-PAGE检测结果图。

图2为采购的IL-17A(Acro)蛋白激活NIH-3T3细胞实验结果图。

图3为重组IL-17A(TEST)蛋白激活NIH-3T3细胞实验结果图。

图4为IL17A与报告基因细胞株的结合实验结果图。

图5为IL17A激活细胞实验结果

图6为2#羊驼的琼脂糖凝胶电泳图。

图7为2#+3#羊驼的琼脂糖凝胶电泳图。

图8为2#羊驼的酵母库流式检测结果图，A：NC组：一抗：不加，二抗：PE-streptavidin；B:原始库实验组：一抗：IL-17A-His-Biotin，二抗：PE-streptavidin，AlexaFluor 647-V5；C：1MACS实验组：一抗：IL-17A-His-Biotin，二抗：PE-streptavidin，AlexaFluor 647-V5；D：2MACS实验组：一抗：IL-17A-His-Biotin，二抗：PE-streptavidin，AlexaFluor 647-V5。

图9为2#+3#羊驼的酵母库流式检测结果图，A：NC组：一抗：不加，二抗：PE-streptavidin；B:原始库实验组：一抗：IL-17A-His-Biotin，二抗：PE-streptavidin，AlexaFluor 647-V5；C：1MACS实验组：一抗：IL-17A-His-Biotin，二抗：PE-streptavidin，AlexaFluor 647-V5；D：2MACS实验组：一抗：IL-17A-His-Biotin，二抗：PE-streptavidin，AlexaFluor 647-V5。

图10为FACS检测2#羊驼的IL17A靶点单克隆与靶点结合。

图11为FACS检测2#+3#羊驼的IL17A靶点单克隆与靶点结合。

图12为抗体纯化SDS-PAGE结果，左侧泳道为marker，右侧泳道为1-F12。

图13为候选抗体ELISA Binding实验结果图。

图14为候选抗体阻断功能实验结果。

图15为单域抗体1-F12的热稳定性检测结果。

图16为阳性对照抗体的热稳定性检测结果。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。

实验试剂：

琼脂(Sigma,CAT#A1296)；蛋白胨(Sigma,CAT#93926)；酵母提取物(OXOID,CAT#:LP0021)；氯化钠(阿拉丁,CAT#:C111533)；氯化钾(阿拉丁,CAT#:P112133)；硫酸镁(国药,CAT#:10013018)；氯化镁(国药,CAT#:10012818)；葡萄糖(生工,CAT#:GT1991)；SfiI(NEB,CAT#:R0123L)；T4 DNA ligase(TaKaRa,CAT#:2011A)；PrimeScript^TMII 1st Strand cDNASynthesis Kit(TaKaRa,CAT#:6210B)；NuHi power mix(新海生物,CAT#:NH9303)；3M醋酸钠(pH5.2-6)(Sigma,CAT#:126-96-5)；DNA片段回收试剂盒(TakaRa,CAT#:9761)；胶回收试剂盒(Qiagen,CAT#:28706)；天根质粒大抽试剂盒(天根,CAT#:DP117)；HRP-Anti-M13(iCarTab)；PE-anti-Human IgG(eBioscience,Cat#:12-4998-82)；PE-Streptavidin(Biolegend,405204)；Rabbit anti-Llama IgG(H+L)Secondary Antibody[HRP](Novus，CAT#NBP1-75095)；SS320感受态(iCarTab)； BL21感受态(Biomed,BC201-02)；pComF噬菌体展示载体(iCarTab)；NHS-biotin(APExBIO,CAT#:A8002)；HRP-Streptavidin(Boster,CAT#:BA1088)；HRP-ProteinA(Boster，BA1080)；ProA Biosensors(Sartorius,CAT#:18-5010)；PBS(Gbico,CAT#14190-250)；DMEM(Gbico,CAT#41965-062)；RPMI1640(Gbico,CAT#61870044)；FBS(VivaCell,CAT#C04001-500)；Genomic DNA PurificationKit(Lifetech，CAT#K0512)；Mouse-IL-17A-His(ACRO，CT8-M5240)；Bright-LiteLuciferase Assay System(Vazyme,CAT#DD1204-01)；NHS-biotin(APExBIO,CAT#:A8002)。

实验耗材：

50mL Falcon离心管(Corning,CAT#352070)；电击杯(Bio-Rad 0.2cm)；RNasefree 1.5mL EP管(QSP,CAT#:509-GRD-Q)；200μL RNase free PCR管(Axygen,PCR-02D-C)；T125摇瓶(Corning,CAT#431143)；15mL Falcon离心管(Corning,CAT#430052)；6孔板(Corning,CAT#3516)；96孔板(Corning,CAT#3365)；96孔黑板(F-BOTTOM(CHIMNEY WELL)BLACK)。

实验设备：

电转仪(Eppendorf Multiporator)；离心机(Thermo FRESCO-17)；恒温培养箱(上海精宏DNP-9052)；恒温震荡培养箱(精骐CO-O6U)；超净工作台(苏净安泰SW-CJ-1FD)；PCR仪(Applied Biosystems ABI2720)；生物安全柜(海尔，HR40-IIA2)；流式细胞仪(ThermoAttune Nxt flow cytometer)；Thermo 3111CO₂培养箱；ForteBio OCTET R2。

下述实施例中筛选、克隆VHH片段、构建纳米抗体所使用的引物均参照以下文献设计：

Maass DR,Sepulveda J,Pernthaner A,Shoemaker CB.Alpaca(Lama pacos)as aconvenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies(VHHs).JImmunol Methods.2007；324(1-2):13-25.

Lin,J,Gu,Y,Xu,Y et al.Characterization and applications of nanobodiesagainst Pseudomonas aeruginosa exotoxin a selected from single alpaca Bcells.Biotechnol Biotechnol Equip 2020；34:1028-37.

Studies on design of singledomain antibodies by AlpacaVHH phagelibrary and high throughput sequencing toconstruct Fab antibody purificationsystem(http:

//hdl.handle.net/10232/00030916)。

实施例1

1、IL-17A(Human)重组蛋白制备

从UniProt数据库中检索Human IL-17A(Q16552-1)序列信息(SEQ ID NO:12)，在C端添加6xHis标签，按照原核密码子优化后进行基因合成并亚克隆至pET28a载体中；经Sanger测序验证无误后，进行质粒抽提。

将重组质粒转化BL21感受态，使用0.5mM IPTG诱导过夜，收集菌液裂解；使用镍柱纯化重组蛋白。

SDS-PAGE检测目标蛋白的纯度，结果如图1所示，IL-17A抗原蛋白经精纯后，纯度大于90％。

SEQ ID NO:12：

MTPGKTSLVSLLLLLSLEAIVKAGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA。

2、阳性对照抗体Ixekizumab制备

(1)基因合成Ixekizumab重链及轻链可变区(重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:13所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示)，将重链可变区亚克隆至pcDNA3.4-hIgG4(IgG4氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示)载体中，轻链可变区亚克隆至pcDNA3.4-hIgKc载体中(IgG KC的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示)；经Sanger测序验证无误后使用质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用。

(2)从冰箱中取出LVTransm转染试剂及重链表达载体与轻链表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入50μg重链表达载体和轻链表达载体，移液枪上下吹打充分混匀后，加入300μLLVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

(3)将上述DNA/LVTransm复合物加入到100mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀，将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱，130RPM继续培养。

(4)连续培养5-7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱子纯化抗体。

SDS-PAGE检测目标抗体蛋白的纯度，纯度>95％。

SEQ ID NO:13:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTDYHIHWVRQAPGQGLEW MGVINPMYGTTDYNQRFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARY DYFTGTGVYWGQGTLVTVSS。

SEQ ID NO:14:

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSRSLVHSRGNTYLHWYLQKPGQSPQ LLIYKVSNRFIGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHLPFTFG QGTKLEIK。

SEQ ID NO:15:

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK。

SEQ ID NO:16：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC。

3、ELISA检测Human IL-17A重组蛋白与对照抗体结合活性

(1)使用无菌CBS稀释IL-17A重组蛋白至终浓度为2μg/mL。取一块新的96孔板，加入100μL/孔4℃包被过夜。

(2)去掉抗原包被液，使用PBST(含0.5％的吐温)洗涤3次。

(3)加入200μL/孔的3％MPBS 37℃封闭2小时。

(4)去掉封闭缓冲液后，使用PBST洗涤孔板3次。

(5)阳性对照抗体Ixekizumab使用PBS稀释至10μg/ml，5倍稀释7个点，按100μL/孔加入酶标板中，室温孵育1小时，对照孔为PBS。

(6)去掉孔内的液体，并使用PBST洗涤3次。

(7)加入二抗HRP-ProteinA(Boster，BA1080)1:10000稀释，按100μL/孔加入酶标板中，室温孵育1小时。

(8)去掉孔内的液体后，使用PBST洗涤孔板3次。

(9)加入100μL/孔TMB显色液。

(10)室温避光孵育15分钟。

(11)加入50μL/孔终止液(2M HCL)。

(12)使用酶标仪读取孔内的OD450值。

IL-17A重组蛋白与阳性抗体结合能力结果如下表所示，从下表中可以看出阳性抗体与IL-17A抗原蛋白结合良好，可以用于免疫。

表1.

4、Human IL-17A重组蛋白活性检测

实验步骤：

(1)从液氮中复苏NIH-3T3细胞，连续传代培养使细胞处于对数生长期，细胞计数后，按照2×10⁵/孔细胞量接种至96孔板。

(2)每孔加入100μl不同浓度的IL-17A(ACRO，Cat#ILA-H5118)以及制备的IL-17A重组蛋白(ACRO的蛋白作为对照)，终浓度分别为0μg/ml，0.00001μg/ml，0.0001μg/ml，0.001μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml。

(3)37℃，5％CO₂培养48小时，培养结束后，轻轻取出96孔板，离心收集培养基上清，使用mouse IL-6ELISA试剂盒检测IL-6的分泌。

(4)采用PRISM GraphPad对数据进行处理，绘制曲线图，并计算EC50值。

实验结果：

结果如图2-图3所示，根据检测结果，IL-17A抗原蛋白具有激活NIH-3T3细胞表达mIL-6的活性，且IL-17A(TEST，下称IL-17A重组蛋白)活性与其浓度正相关，可以用于免疫。

5、IL-17A报告基因细胞株构建

实验步骤：

根据IL-17RA(UniProtKB：Q96F46，SEQ ID NO:17)及IL-17RC(UniProtKB：Q8NAC3，SEQ ID NO:18)的氨基酸序列信息，构建慢病毒表达载体并包装慢病毒，共同感染293细胞，筛选同时过表达这两个受体的重组293细胞，进一步稳转NFKB-Luciferase(氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示)和ACT1基因(核苷酸序列如

SEQ ID NO:21所示)，构建IL-17A报告基因细胞株293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc。加入IL-17A蛋白进行激活，同时加入阳性对照抗体Ixekizumab进行阻断实验的检测，并计算其EC50值，建立靶向IL-17A的候选抗体，体外药效学评价细胞株。

SEQ ID NO:17:

MGAARSPPSAVPGPLLGLLLLLLGVLAPGGASLRLLDHRALVCSQPGLNCTVKNSTCLDDSWIHPRNLTPSSPKDLQIQLHFAHTQQGDLFPVAHIEWTLQTDASILYLEGAELSVLQLNTNERLCVRFEFLSKLRHHHRRWRFTFSHFVVDPDQEYEVTVHHLPKPIPDGDPNHQSKNFLVPDCEHARMKVTTPCMSSGSLWDPNITVETLEAHQLRVSFTLWNESTHYQILLTSFPHMENHSCFEHMHHIPAPRPEEFHQRSNVTLTLRNLKGCCRHQVQIQPFFSSCLNDCLRHSATVSCPEMPDTPEPIPDYMPLWVYWFITGISILLVGSVILLIVCMTWRLAGPGSEKYSDDTKYTDGLPAADLIPPPLKPRKVWIIYSADHPLYVDVVLKFAQFLLTACGTEVALDLLEEQAISEAGVMTWVGRQKQEMVESNSKIIVLCSRGTRAKWQALLGRGAPVRLRCDHGKPVGDLFTAAMNMILPDFKRPACFGTYVVCYFSEVSCDGDVPDLFGAAPRYPLMDRFEEVYFRIQDLEMFQPGRMHRVGELSGDNYLRSPGGRQLRAALDRFRDWQVRCPDWFECENLYSADDQDAPSLDEEVFEEPLLPPGTGIVKRAPLVREPGSQACLAIDPLVGEEGGAAVAKLEPHLQPRGQPAPQPLHTLVLAAEEGALVAAVEPGPLADGAAVRLALAGEGEACPLLGSPGAGRNSVLFLPVDPEDSPLGSSTPMASPDLLPEDVREHLEGLMLSLFEQSLSCQAQGGCSRPAMVLTDPHTPYEEEQRQSVQSDQGYISRSSPQPPEGLTEMEEEEEEEQDPGKPALPLSPEDLESLRSLQRQLLFRQLQKNSGWDTMGSESEGPSA。

SEQ ID NO:18：

MPVPWFLLSLALGRSPVVLSLERLVGPQDATHCSPVSLEPWGDEERLRVQFLAQQSLSLAPVTAATARTALSGLSGADGRREERGRGKSWVCLSLGGSGNTEPQKKGLSCRLWDSDILCLPGDIVPAPGPVLAPTHLQTELVLRCQKETDCDLCLRVAVHLAVHGHWEEPEDEEKFGGAADSGVEEPRNASLQAQVVLSFQAYPTARCVLLEVQVPAALVQFGQSVGSVVYDCFEAALGSEVRIWSYTQPRYEKELNHTQQLPDCRGLEVWNSIPSCWALPWLNVSADGDNVHLVLNVSEEQHFGLSLYWNQVQGPPKPRWHKNLTGPQIITLNHTDLVPCLCIQVWPLEPDSVRTNICPFREDPRAHQNLWQAARLQLLTLQSWLLDAPCSLPAEAALCWRAPGGDPCQPLVPPLSWENVTVDKVLEFPLLKGHPNLCVQVNSSEKLQLQECLWADSLGPLKDDVLLLETRGPQDNRSLCALEPSGCTSLPSKASTRAARLGEYLLQDLQSGQCLQLWDDDLGALWACPMDKYIHKRWALVWLACLLFAAALSLILLLKKDHAKGWLRLLKQDVRSGAAARGRAALLLYSADDSGFERLVGALASALCQLPLRVAVDLWSRRELSAQGPVAWFHAQRRQTLQEGGVVVLLFSPGAVALCSEWLQDGVSGPGAHGPHDAFRASLSCVLPDFLQGRAPGSYVGACFDRLLHPDAVPALFRTVPVFTLPSQLPDFLGALQQPRAPRSGRLQERAEQVSRALQPALDSYFHPPGTPAPGRGVGPGAGPGAGDGT。

SEQ ID NO:19：

MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKIAV。

SEQ ID NO:20:

atggaagatgccaaaaacattaagaagggcccagcgccattctacccactcgaagacgggaccgccggcgagcagctgcacaaagccatgaagcgctacgccctggtgcccggcaccatcgcctttaccgacgcacatatcgaggtggacattacctacgccgagtacttcgagatgagcgttcggctggcagaagctatgaagcgctatgggctgaatacaaaccatcggatcgtggtgtgcagcgagaatagcttgcagttcttcatgcccgtgttgggtgccctgttcatcggtgtggctgtggccccagctaacgacatctacaacgagcgcgagctgctgaacagcatgggcatcagccagcccaccgtcgtattcgtgagcaagaaagggctgcaaaagatcctcaacgtgcaaaagaagctaccgatcatacaaaagatcatcatcatggatagcaagaccgactaccagggcttccaaagcatgtacaccttcgtgacttcccatttgccacccggcttcaacgagtacgacttcgtgcccgagagcttcgaccgggacaaaaccatcgccctgatcatgaacagtagtggcagtaccggattgcccaagggcgtagccctaccgcaccgcaccgcttgtgtccgattcagtcatgcccgcgaccccatcttcggcaaccagatcatccccgacaccgctatcctcagcgtggtgccatttcaccacggcttcggcatgttcaccacgctgggctacttgatctgcggctttcgggtcgtgctcatgtaccgcttcgaggaggagctattcttgcgcagcttgcaagactataagattcaatctgccctgctggtgcccacactatttagcttcttcgctaagagcactctcatcgacaagtacgacctaagcaacttgcacgagatcgccagcggcggggcgccgctcagcaaggaggtaggtgaggccgtggccaaacgcttccacctaccaggcatccgccagggctacggcctgacagaaacaaccagcgccattctgatcacccccgaaggggacgacaagcctggcgcagtaggcaaggtggtgcccttcttcgaggctaaggtggtggacttggacaccggtaagacactgggtgtgaaccagcgcggcgagctgtgcgtccgtggccccatgatcatgagcggctacgttaacaaccccgaggctacaaacgctctcatcgacaaggacggctggctgcacagcggcgacatcgcctactgggacgaggacgagcacttcttcatcgtggaccggctgaagagcctgatcaaatacaagggctaccaggtagccccagccgaactggagagcatcctgctgcaacaccccaacatcttcgacgccggggtcgccggcctgcccgacgacgatgccggcgagctgcccgccgcagtcgtcgtgctggaacacggtaaaaccatgaccgagaaggagatcgtggactatgtggccagccaggttacaaccgccaagaagctgcgcggtggtgttgtgttcgtggacgaggtgcctaaaggactgaccggcaagttggacgcccgcaagatccgcgagattctcattaaggccaagaagggcggcaagatcgccgtg。

SEQ ID NO:21:

ATGCCACCTCAGTTGCAGGAAACTCGGATGAATAGAAGCATCCCCGTGGAAGTGGACGAGAGCGAGCCGTACCCTAGTCAGCTGCTGAAGCCGATCCCTGAGTACTCCCCGGAAGAGGAATCCGAACCACCAGCCCCCAACATTCGCAATATGGCCCCCAATAGCTTGTCCGCACCAACAATGCTGCACAACTCTTCTGGCGACTTCTCTCAGGCCCACTCCACCCTGAAACTGGCGAATCACCAGCGGCCTGTATCCCGGCAGGTGACCTGTCTGAGAACTCAGGTGCTTGAAGACTCCGAGGACTCTTTCTGTAGGCGGCATCCAGGTTTGGGCAAGGCGTTTCCGTCCGGCTGTTCCGCGGTTTCAGAGCCCGCTTCCGAAAGTGTCGTGGGCGCCCTGCCAGCCGAGCACCAGTTCTCCTTCATGGAAAAGCGGAACCAGTGGCTGGTCAGTCAGCTGAGCGCCGCGTCACCTGATACAGGTCACGATTCCGACAAGTCTGACCAGTCTCTGCCCAATGCGTCAGCCGATAGTCTCGGGGGCTCCCAGGAGATGGTGCAGAGACCACAGCCGCACAGAAACCGGGCCGGGCTTGATCTGCCCACCATTGATACAGGCTACGATTCCCAGCCCCAGGACGTCCTTGGCATTCGCCAGCTGGAAAGGCCTCTGCCCTTGACCTCCGTGTGTTACCCCCAGGACCTGCCCCGCCCTTTGAGAAGCCGGGAGTTTCCCCAGTTTGAGCCCCAACGATACCCTGCCTGTGCTCAGATGCTGCCTCCGAACCTGAGCCCACACGCTCCCTGGAACTACCACTATCACTGTCCCGGCAGCCCCGATCACCAGGTGCCTTATGGACACGACTACCCGCGGGCTGCATACCAGCAGGTCATACAGCCTGCCTTGCCGGGTCAGCCGCTGCCCGGAGCTTCTGTGCGCGGCCTGCACCCCGTTCAGAAAGTGATCCTGAACTATCCAAGCCCATGGGACCATGAAGAGAGACCAGCCCAAAGAGATTGCTCTTTTCCTGGGTTGCCTAGACACCAAGACCAGCCTCACCACCAGCCTCCCAATCGGGCAGGCGCCCCAGGCGAAAGTCTCGAGTGCCCCGCCGAACTCAGACCACAGGTCCCTCAGCCCCCTTCCCCCGCGGCAGTACCCAGACCCCCCTCTAACCCACCCGCCCGGGGAACGCTCAAGACTTCAAATCTCCCAGAAGAGCTGCGCAAAGTGTTCATAACCTACAGCATGGACACCGCTATGGAGGTGGTTAAGTTCGTCAACTTCCTGCTGGTCAATGGGTTCCAGACTGCAATCGACATTTTTGAGGATAGAATTCGGGGAATCGACATCATCAAGTGGATGGAGAGATACCTGCGGGATAAGACAGTGATGATTATCGTGGCCATTAGTCCCAAGTACAAGCAAGATGTGGAGGGCGCAGAATCACAGTTGGACGAAGACGAGCACGGACTCCATACAAAATATATCCACAGGATGATGCAGATCGAGTTCATTAAACAAGGCTCCATGAATTTCCGCTTCATACCGGTCCTGTTTCCAAACGCAAAAAAAGAGCATGTACCCACTTGGCTCCAGAATACCCATGTCTACTCCTGGCCCAAGAACAAGAAGAATATCCTGCTGCGCTTGCTCAGAGAAGAAGAGTATGTCGCCCCTCCAAGGGGGCCCCTCCCCACACTCCAAGTAGTGCCACTT。

实验结果：

构建IL-17A报告基因细胞株293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc，并加入IL-17A重组蛋白进行结合，FACS结果发现：构建的IL-17A受体过表达细胞株可以和IL-17A结合，阳性率大于90％(结果如图4所示)。

IL17A激活细胞实验：采用IL-17A重组蛋白激活293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc，结果如图5所示：IL17A重组蛋白可有效激活293F-IL17Ra/IL17Rc-NFκB-Luc报告基因细胞株中荧光素酶表达。

Ixekizumab阻断IL17A功能实验：将阳性对照抗体Ixekizumab与IL-17A重组蛋白一起加入293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc细胞，阳性对照抗体Ixekizumab可抑制IL17A蛋白与其膜受体结合，并抑制胞内NFκB的信号，呈现剂量效应。

6、动物免疫过程

6.1羊驼免疫

使用上述制备的IL-17A重组抗原蛋白对2只羊驼(2#和3#)进行免疫，共进行6次免疫，免疫佐剂为GERBU，免疫间隔为14天，最后两次免疫为弗式完全佐剂。

安排采血如下：

2#羊驼五免后采血100ml，制备cDNA文库，并构建酵母展示库(酵母展示库1)；六免后采血100ml，制备cDNA文库。

3#羊驼，六免后采血100ml，制备cDNA文库，并与2#羊驼六免后采血制备cDNA文库混合，构建酵母展示库(酵母展示库2)。

6.2免疫效价的检测

实验步骤：

从免疫不同次数的羊驼分离血清，进行有限稀释，分别与抗原预包被的96孔板进行ELISA检测，具体步骤如下：

(1)采集5mL外周血，将收集有血液样本的离心管置于37℃培养箱内放置1小时；然后将血液样本转移至4℃过夜；

(2)将收集有血液样本的离心管置于离心机中，5000rpm离心20min；分离上层血清，将血清转移至一个新的无菌离心管中，收集免疫血清。

(3)使用无菌CBS(碳酸盐缓冲液)稀释IL-17A重组蛋白至终浓度为1μg/mL。取一块新的96孔酶标板，加入100μL/孔4℃包被过夜。

(4)去掉抗原包被液，使用PBST(含0.05％的吐温20)洗涤5次。

(5)加入200μL/孔的3％MPBS 37℃封闭2小时；

(6)去掉封闭缓冲液后，使用PBST洗涤孔板5次；

(7)加入100μl梯度稀释的血清(100μL/孔)，室温孵育1小时，对照孔为PBS；

(8)去掉孔内的液体，并使用PBST洗涤5次；

(9)加入100μl HRP anti-Llama IgG(H+L)抗体(1:50000稀释)，室温孵育1小时；

(10)去掉孔内的液体后，使用PBST洗涤孔板5次；

(11)加入100μL/孔TMB显色液；

(12)室温避光孵育10-15分钟；

(13)加入50μL/孔终止液；

(14)使用酶标仪读取孔内的OD450值。

实验结果：检测结果如下表2-表3所示。根据ELISA检测结果，免疫血清与IL17A重组蛋白结合良好，且随着免疫血清的梯度稀释，OD值呈梯度变化。

表2.免疫效价检测结果

表3.免疫效价检测结果

7、抗体酵母文库构建过程

7.1 PBMC分离及VHH抗体片段克隆

实验步骤：

(1)采集100mL外周血抗凝样品，使用淋巴细胞分离液分离PBMC细胞。

(2)提取RNA，使用PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录，制备cDNA。

1)在200μL PCR管中配制下列反应混合液Mix：

表4.

试剂	用量
		Oligo dT Primer(50μM)	8μL
dNTP Mixture(10mM each)	8μL
		总RNA样品	20μg
无RNA酶水	添加至80μL

2)65℃保温5min后，冰上迅速冷却。

3)在上述PCR管中配制下表反应液：

表5.

试剂	用量
		上述变性后的反应液	80μL
5×PrimeScript II Buffer	32μL
		RNase Inhibitor(40Μ/μL)	4μL
PrimeScriptⅡRTase(200Μ/μL)	8μL
		无RNA酶水	36μL

4)吹打混匀后，分装80μL/管，置于PCR仪中42℃、1小时，70℃热失活15分钟，最后将cDNA样品置于冰上或-20℃长期保存。

(3)VHH片段的扩增

1)配置第一轮PCR反应体系(50μL/管)：

表6.

成分	用量
		上游引物(5μM)	2μL
下游引物(10μM)	1μL
		NuHi Power mix(2×)	25μL
cDNA模板	2μL
		无菌水	20μL

2)配置好PCR反应体系后，按照如下程序设置PCR仪：

表7.

3)PCR产物的琼脂糖电泳

使用1％的琼脂糖进行电泳分析PCR产物，分离分子量大小为750bp左右的片段。使用胶回收试剂盒回收PCR产物，并用NanoDrop测定浓度。

4)配置二轮PCR反应体系(50μL/管)

表8.

成分	用量
		2^nd F引物	2μL
2^nd R引物	2μL
		NuHi Power mix(2×)	25μL
一轮PCR回收产物	200ng
		无菌水	补足至50μL

5)配置好PCR反应体系后，按照如下程序设置PCR仪：

表9.

6)二轮PCR产物的琼脂糖电泳分析

使用1％的琼脂糖进行电泳分析PCR产物，分离分子量大小为400bp左右的VHH片段。使用胶回收试剂盒回收VHH PCR产物，并用NanoDrop测定浓度。

实验结果：

采集外周血，提取总的RNA，逆转录为cDNA后，使用单域抗体扩增引物进行三轮PCR，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(结果见图6-图7)：第一轮PCR分别获得1000bp和750bp左右的PCR条带，胶回收750bp的片段作为二轮PCR的模板。第二轮PCR获得400bp左右的条带，为VHH片段，柱回收作为三轮PCR的模板。第三轮PCR获得500bp左右的条带，添加同源臂，后续同源重组入酵母展示载体pDisplay中。

7.2单域抗体酵母展示库的构建

(1)酵母展示载体pDisplay线性化，酶切体系如下：

表10.

1)使用SfiI酶切pDisplay载体，100μL/管分装，50℃酶切过夜。

2)使用1％的琼脂糖凝胶分离pDisplay载体片段，切取5000bp的载体片段进行胶回收，并用NanoDrop测定浓度。

3)将回收的pDisplay酶切产物每个1.5mL离心管分装200μL，加入1/10体积(20μL)3M醋酸钠，1μg/μL糖原(Glycogen)，吹吸混匀，加入880μL无水乙醇，颠倒混匀，置于-80℃。

(2)电转化构建酵母展示库

1)将-80℃冻存的酵母感受态菌株划线到YPD固体培养基平皿上，30℃活化3-5天；

2)接种单菌落酵母感受态到50mL YPD培养基，250rpm、30℃摇培1-2天；

3)制备酵母感受态菌株。将线性化载体片段和PCR产物混合后，加到电击杯中，电击；电击后的酵母感受态转染培养瓶中，220rpm，30℃摇培1h；

4)取20μL重悬液，用SDCAA稀释5000倍，吸取100μL，涂SDCAA平板，培养2-3天，计算库容，其余菌液继续培养24h；

5)保菌：将剩余菌液收集到50mL离心管中，3000g，离心5min，弃去上清，加入10mLSDCAA重悬，用50％甘油：重悬液＝1:1混合，-80℃冻存。

8、酵母展示库淘选

实验步骤：

1)取SDCAA中培养的酵母加入含50mL SGCAA培养基的250mL摇瓶中，30℃，240rpm，摇床培养16h。

2)离心后，弃上清，用1mL 0.5％PBSA重悬，加到1.5mL离心管中，3000g，离心5min，弃上清。用0.5％PBSA再洗一次。

3)将与抗原孵育好的链霉亲和素磁珠，用0.5％PBSA洗两次(每次4℃旋转孵育5分钟)，置于磁力架上，5min，弃去上清。

4)将酵母菌液加到结合了抗原的磁珠中，4℃旋转孵育60分钟，置于磁力架上，15min。

5)弃去酵母菌液留磁珠，用0.5％PBSA洗三次(每次4℃旋转孵育5分钟)。

6)将磁珠用1mL SDCAA培养基重悬，吸取0.5-5μL重悬液到100μLSDCAA培养基中涂板，将重悬液均分成两份，一份加500μL 50％甘油(-80℃保存)；一份加到摇菌管中，补2mLSDCAA培养基，30℃，240rpm，培养16h。

7)将摇菌管中的菌液转到50mL SDCAA培养基中(250mL摇瓶)，30℃，240rpm培养过夜。

8)测量菌液OD600值，根据OD600取一部分菌液离心，用SGCAA重悬，转到50mLSGCAA培养基中，使最终OD600值为1，30℃，240rpm培养过夜，剩余菌液用SDCAA:50％甘油＝1:1重悬，-80℃冻存。

9、酵母单克隆流式检测

分选后酵母菌液涂SDCAA平板，挑取单克隆培养，诱导表达48h后，与Biotin-抗原孵育，二抗使用PE-Streptavidin，孵育完成后进行流式检测。将与目标抗原结合的酵母克隆使用0.2％SDS(95℃孵育10min)裂解，离心，取菌液上清0.5μL作为模板用于PCR扩增送测(剩余菌液-20℃保存)。流式检测结果如图8所示，根据流式检测结果，第二次磁分选后，酵母阳性率为37.9％，阳性克隆显著富集，将分选产物直接涂SDCAA平板，挑选单克隆进行流式检测。

2#+3#羊驼酵母库与Biotin-IL-17A-His蛋白充分结合后，使用链霉亲和素磁珠进行2轮磁分选；将分选的酵母细胞进行培养，诱导表达后进行流式分析。与Biotin-IL-17A-His孵育1h，二抗使用PE Streptavidin，孵育完成后进行流式检测，结果表明(如图9)：经过两轮磁分选后，Biotin-IL-17A-His结合的酵母占比为20.59％，阳性克隆显著富集，将分选产物直接涂SDCAA平板，挑选单克隆进行流式检测。

10、抗体序列鉴定

富集阳性克隆；挑选富集后的单克降，进行Phage ELISA鉴定，并对克隆进行测序分析，获取候选单域抗体的核酸及氨基酸序列信息。如图10-图11所示，随机挑取20个单克隆，进行测序分析，序列差异大，库多样性较好。针对候选的单域抗体CDR区域氨基酸序列信息，采用In silico方法对可能的翻译后修饰位点进行分析。

根据酵母单克隆流式检测结果，选择与IL-17A-His结合的阳性克隆提取基因组DNA，PCR获得抗体序列。根据PCR产物测序结果，挑选差异克隆进行overlap PCR扩增，具体步骤如下：

(1)第一轮PCR：扩增CMV、VHH及FC

1)配置PCR反应体系(50μL体系/反应)

表11.

成分	用量
		上游引物(5μM)	2μL
下游引物(5μM)	2μL
		NuHi Power mix(2×)	25μL
模板(菌液)	1μL
		无菌水	补足至50μL

2)PCR反应程序如下：

95℃，10min；(95℃，15s；56℃，30s；68℃，60s；25个循环)；68℃，10min。

3)取50μL PCR产物，加入1/10体积10×loading buffer，使用1％的琼脂糖进行电泳分析，CMV的条带大小为750bp左右，Fc的条带大小为1400bp左右，VHH的条带大小为500bp左右。

4)从胶上切除目的条带，并纯化PCR产物，并用NanoDrop测定浓度(如浓度过高，可稀释进行后续反应)。

(2)第二轮PCR：Overlap Extension PCR连接CMV、VHH及FC

1)配置PCR反应体系

表12.

成分	用量
		CMV 1st产物	50ng
VHH 1st产物	50ng
		Fc 1st产物	50ng
NuHi Power mix(2×)	25μL
		无菌水	补足至46μL

2)PCR反应程序如下：

95℃，10min；(95℃，15s；60℃，30s；68℃，120s；15个循环)。

3)加入上游引物和下游引物各2μL；

PCR反应程序如下：

95℃，10min；(95℃，15s；60℃，30s；68℃，120s；20个循环)；68℃，10min。

4)使用TakaRa的DNA片段回收试剂盒纯化overlap PCR产物，并用NanoDrop测定浓度，至少需要10μgPCR产物。用于后续细胞转染验证。

5)转染步骤同真核表达载体的转染。

在VHH的N端加上信号肽，C端加上IgG1-FC，PCR产物瞬时转染HEK293细胞；取表达的抗体上清进行ELISA检测：100uL转染上清加入IL-17A重组抗体预包被的96孔板中孵育，采用HRP-Protein A作为二抗进行ELISA检测，结果如表13所示：1-F12与IL-17A-His抗原结合，进行构建真核表达载体。

表13.候选克隆转染上清ELISA Binding实验结果

11、候选单域抗体表达纯化

实验步骤：

1)根据候选抗体的ELISA检测结果，挑选阳性克隆，将获得的VHH抗体序列分别进行基因合成，与human IgG1Fc(SEQ ID NO:10)串联亚克隆至表达载体pcDNA3.4-hIgG1-Fc中。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用。

2)从冰箱中取出LVTransm转染试剂及单链抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入130μg抗体表达载体，移液枪上下吹打充分混匀后，加入400μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

3)将上述DNA/LVTransm复合物加入到30mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱，130rpm培养6-8小时后，加入50mL新鲜的293细胞培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。

4)连续培养7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱子纯化抗体。

Protein A柱子纯化抗体的步骤如下所示：

1)将含有目标抗体的样品加入EP管中，轻轻倒置试管混合。

2)将EP管在室温下混合或在旋转器上孵育，(1-4小时或过夜)，添加100mM PMSF以防止蛋白质降解。

3)使用磁分离架收集磁珠并弃去上清液。

4)向EP管中加入1mL结合/洗涤缓冲液并充分混匀，使用磁力架收集磁珠并弃去上清液，重复洗涤步骤三遍。

5)向EP管中加入500μL洗脱缓冲液，用移液器吹打或者涡旋震荡下迅速重悬，然后在室温下(约25℃)置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转EP管孵育5分钟。

6)使用磁分离架收集磁珠，将含有洗脱抗体的上清液转移到干净的EP管中。

7)重复步骤1)和2)两次。

8)向每500μl洗脱液中加入1/10的中和缓冲液以中和pH，以利于维持抗体的生物活性，避免抗体失活。

9)结合/洗涤缓冲液：1×PBS，pH 7.0。

洗脱缓冲液：(1)0.1M甘氨酸，pH 2-3；(2)0.1M NaAc-HAc，pH 3.6。

中和缓冲液：1M Tris，pH 8.5。

磁珠再生缓冲液：0.1M NaOH。

实验结果如图12所示。

实施例2 ELISA检测重组抗体与靶蛋白的结合

实验步骤：

1)使用无菌CBS稀释重组蛋白至终浓度为2μg/mL。取一块新的96孔酶标板，加入100μL/孔4℃包被过夜。

2)去掉抗原包被液，使用PBST(含0.05％的吐温20)洗涤5次。

3)加入200μL/孔的3％MPBS 37℃封闭2小时；

4)去掉封闭缓冲液后，使用PBST洗涤孔板5次；

5)加入纯化后的单域抗体，起始浓度为10μg/mL，5倍梯度稀释7，结果表明，单域抗体1-F12的EC50值为6.528，阳性抗体(Ixekizumab)的EC50＝10.06，单域抗体1-F12与HumanIL-17A蛋白有较好的结合活性(图13)。各候选抗体EC50见表14。

表14.候选抗体EC50值

抗体编号	1-F12	Ixekizumab
			EC50	6.528	10.06

实施例3 FACS检测IL17A与报告基因细胞株的结合

实验过程：

1)从液氮中复苏293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc细胞株，调整细胞状态至对数生长期；

2)将细胞分别分为若干份，每份细胞的数量为2×10⁵个细胞；

3)将IL17A-His蛋白与靶细胞孵育，充分混匀后，室温孵育1小时；

4)800xg室温离心3分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次；

5)加入二抗APC-His(1:500稀释)，充分混匀后，室温避光孵育30分钟；

6)800xg室温离心3分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次；

7)使用500μL PBS重悬细胞，进行流式分析。

实施例4单域抗体阻断功能实验

实验步骤：

在96孔板中加入梯度稀释的检测抗体(阳性抗体：Ixekizumab；待检测抗体)，按照10倍梯度稀释抗体，连续稀释10个梯度，终浓度依次为100μg/mL，10μg/mL，1μg/mL，0.1μg/mL，0.01μg/mL，0.001μg/mL，0.0001μg/mL，

0.00001μg/mL，0.000001μg/mL，0.0000001μg/mL，0μg/mL，将稀释好的梯度浓度抗体取50μL加入96孔板中，每个梯度2个复孔。然后再向对应孔中，每孔加入50μL 0.4μg/mL的IL-17A蛋白(终浓度为0.1μg/mL)。混匀后，放置37℃培养箱中，孵育1小时。吸取培养至对数生长期的293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc细胞于96孔板中，每孔接种2×10⁴个细胞。共培养18h后，每孔加入20μL Bright-GloTM检测试剂，使用Tecan M1000pro酶标仪检测孔内的荧光素酶活性数值。

实验结果：

结果如图14所示：Ixekizumab阳性对照可以阻断Human IL-17A蛋白激活293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc。待检测抗体中IL-17A单域抗体1-F12能够阻断Human IL-17A蛋白激活293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc，但阻断效果均弱于阳性抗体。

实施例5稳定性实验

通过微量差示扫描荧光技术(nanoDSF)技术检测荧光变化，可在天然条件下检测蛋白热变性和化学变性，精确地确定蛋白50％处于去折叠状态时的温度(Tm)以及开始出现聚集时的温度(Tagg)；热变性Tm值和Tagg越高说明抗体蛋白越稳定。

实验步骤：

取100μL前期项目制备的候选抗体以及Ixekizumab(样本浓度大于200μg/ml)，4℃，12000×g，离心10min后，用毛细管吸取样品，每个样品准备两根毛细管，作为平行对照，按顺序放入对应的卡槽中，确保毛细管吸满样品，无气泡，进行检测分析。

实验结果：

实验结果如图15-图16所示，从图中可以看出单域抗体1-F12的稳定性较强，Tm＝55.9，Tagg＝80.97，阳性对照的Tm＝56.1，Tagg＝61.86。

应用实施例1一种抗体制剂

抗体制剂包含：抗IL-17A抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；缓冲液、表面活性剂、氨基酸、张力剂等。

在本发明的一个实施方案中，所述的抗体制剂的制备包括：称取各物质，加水溶解并混匀，并调节各组分至下述浓度即得：(100-200)mg/ml的抗IL-17A抗体(氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)，(1-10)mM柠檬酸盐缓冲液，(0.1-1％w/v)吐温80，(100-200)mM精氨酸和(1-10)％蔗糖，所述制剂的pH为5.0-8.0。

应用实施例2一种试剂盒

试剂盒包含：抗IL-17A抗体、重组蛋白、抗体制剂和/或多克隆抗体，装载抗体制剂的容器，缓冲液等。

在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒包括：(100-200)mg/ml的抗IL-17A抗体(氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)，pH为5.0-8.0的缓冲液。

应用实施例3抗体药物偶联物

抗体药物偶联物包含：抗IL-17A抗体、重组蛋白、抗体制剂和/或多克隆抗体，药物为生理活性物质(如核酸等)和连接抗体与药物的接头(接头包括马来酰亚胺接头、Val-Cit接头、SS接头及DMSS接头)。

在本发明的一个实施方式，将IL-17A抗体通过SS接头与药物进行连接，添加(100-200)mM水溶液在室温下混匀，终止接头反应，即得抗体药物偶联物。

应用实施例4药物组合物

药物组合物包括抗IL-17A抗体、重组蛋白、抗体制剂、多克隆抗体、核酸分子、生物学表达载体和/或宿主细胞，还包括药学上可接受的辅料。

在本发明的一个实施方式，所述的药物组合物的制备包括：制备浓度为(100-200)mg/ml的抗IL-17A抗体或其抗原结合片段，加入(1-20w/v)的蔗糖、(10-300)mM的组氨酸和(0.1-10)％的吐温80，即得所述药物组合物。最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种抗体，其特征在于：所述的抗体包括3个互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述的HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID

NO:3所示；和/或；与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3分别至少具有80％的序列相似性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述的抗体包括：在SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列上进行修饰、缺失、取代和/或添加中的至少一种方式所得到的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述的抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸差异。

4.一种抗体，其特征在于：所述的抗体包含框架区FR，所述的框架区FR包括：SEQ IDNO:4所示的FR1、SEQ ID NO:5所示的FR2、SEQ ID NO:6所示的FR3、SEQ ID NO:7所示的FR4；和/或；与SEQ ID NO:4-7所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性的氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于：所述的抗体的氨基酸序列包含：

在SEQ ID NO:4-7所示的氨基酸序列上进行修饰、缺失、取代和/或添加中的至少一种方式所得到的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的抗体，其特征在于：所述的抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO:4-7所示的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38个氨基酸差异。

7.一种抗体，其特征在于：所述的抗体的氨基酸序列包含权利要求1-3任意一项所述的抗体的氨基酸序列和权利要求4-6任意一项所述的抗体的氨基酸序列。

8.一种抗体，其特征在于：所述的抗体的氨基酸序列包含：FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4；

所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示或与SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个的氨基酸差异的氨基酸序列的功能活性变体；

所述的FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4-7所示或与SEQ ID NO:4-7所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的功能活性变体。

9.根据权利要求8所述的抗体，其特征在于：所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

10.根据权利要求8或9所述的抗体，其特征在于：所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

11.根据权利要求10所述的抗体，其特征在于：所述的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

12.根据权利要求1-11任一项所述的抗体，其特征在于：所述的抗体为单域抗体。

13.根据权利要求1-12任一项所述的抗体，其特征在于：所述的抗体为抗IL-17A抗体。

14.根据权利要求1-13任一项所述的抗体，其特征在于：包含部分或全部选自人源、鼠源、灵长目动物源或骆驼科动物源的抗体重链框架区或其变体；

15.一种抗体制剂，其特征在于：所述的抗体制剂包含权利要求1-14任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。

16.一种多克隆抗体，其特征在于：包含权利要求1-14任一项所述的抗体。

17.一种重组蛋白，其特征在于：包含权利要求1-14任一项所述的抗体。

18.根据权利要求17所述的重组蛋白，其特征在于：所述的重组蛋白还包含协助其表达和/或分泌，或延长其在体内半衰期的生物活性蛋白或其功能片段；

优选地，所述生物活性蛋白或其功能片段选自免疫球蛋白Fc结构域、血清白蛋白、白蛋白结合多肽、前白蛋白、羧基末端肽、弹性蛋白样多肽、His标签、GST标签、MBP标签、FLAG标签和SUMO标签中的至少一种。

19.根据权利要求18所述的重组蛋白，其特征在于：所述生物活性蛋白或其功能片段为人免疫球蛋白Fc结构域，优选为人IgG的Fc结构域，例如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc结构域，更优选为人IgG1的Fc结构域。

20.一种抗体药物偶联物，其特征在于：所述的抗体药物偶联物包括：权利要求1-14任一项所述的抗体、权利要求15所述的抗体制剂、权利要求16所述的多克隆抗体或权利要求17-19任一项所述的重组蛋白；和与(1)结合的偶联部分。

21.一种试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括权利要求1-14任一项所述的抗体、权利要求15所述的抗体制剂、权利要求16所述的多克隆抗体或权利要求17-19任一项所述的重组蛋白；和装载所述抗体制剂的容器。

22.一种核酸分子，其特征在于：所述的核酸分子编码权利要求1-14任一项所述的抗体、权利要求16所述的多克隆抗体或权利要求17-19任一项所述的重组蛋白。

23.一种生物学表达载体，其特征在于：所述的生物学表达载体包含权利要求22所述的核酸分子。

24.一种宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞包含权利要求22所述的核酸分子和/或权利要求23所述的生物学表达载体。

25.权利要求1-14任一项所述的抗体、权利要求15所述的抗体制剂、权利要求16所述的多克隆抗体、权利要求17-19任一项所述的重组蛋白、权利要求20所述的抗体药物偶联物、权利要求21所述的试剂盒、权利要求22所述的核酸分子、权利要求23所述的生物学表达载体或权利要求24所述的宿主细胞的用途，其特征在于：所述的用途选自以下至少一种：

(1)制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物；

(2)制备预防和/或治疗癌症的药物；

(3)制备检测试剂或试剂盒。

26.根据权利要求25所述的用途，其特征在于：所述自身免疫性疾病包括多发性硬化症、系统性硬皮病、系统性红斑狼疮、皮肌炎、急进性肾小球肾炎、类风湿关节炎、白塞氏病、进行性系统性硬化症、干燥综合征、寻常型白斑病、硬皮病、幼年特发性关节炎、恶性贫血、血管炎、大血管血管炎、艾迪生病、多发性肌炎、卡斯尔曼病、特发性艾迪生病、银屑病关节炎、多灶性运动神经病、成人斯蒂尔病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、结节性动脉周围炎、特发性无精子症、妊娠疱疹、主动脉炎综合征、恶性类风湿关节炎、嗜酸性筋膜炎、自身免疫性视神经病、类天疱疮、桥本病、脊椎关节炎、白斑病、重症肌无力、混合性结缔组织病、巴塞杜病、慢性萎缩性胃炎、抗磷脂抗体综合征、过敏性肉芽肿性血管炎、过敏性血管炎、类风湿性血管炎、Good-pasture综合征、Cogan综合征、ANCA相关性血管炎、线性IgA大疱性皮肤病、RS3PE综合征、颞动脉炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛、慢性盘状红斑狼疮、IgG4相关疾病、格林巴利综合征、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、狼疮性肾炎、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性肾上腺皮质功能减退症、原发性甲状腺功能减退症、I型糖尿病、缓慢进展型I型糖尿病、局灶性硬皮病、银屑病、大疱性类天疱疮、天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、斑秃、视神经脊髓炎、结节病、巨细胞动脉炎、肌萎缩侧索硬化、原田病、习惯性流产、炎症性肠病、乳糜泻、强直性脊柱炎、严重哮喘、慢性荨麻疹移植免疫、家族性地中海热、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、扩张型心肌病、系统性肥大细胞增多症或包涵体肌炎。

27.根据权利要求25或26所述的用途，其特征在于：所述的癌症包括食道癌、喉癌、口腔癌、头颈癌、唾液腺癌、视网膜母细胞瘤、肝癌、皮肤癌、肺癌、直肠癌、卵巢癌、肾癌、白血病、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、淋巴瘤、肉瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、胆管癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌症、子宫内膜癌、眼癌、胃癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、呼吸系统癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、慢性成髓细胞性白血病。

28.一种药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物包含：权利要求1-14任一项所述的抗体、权利要求15所述的抗体制剂、权利要求16所述的多克隆抗体、权利要求17-19任一项所述的重组蛋白、权利要求20所述的抗体药物偶联物、权利要求22所述的核酸分子、权利要求23所述的生物学表达载体或权利要求24所述的宿主细胞；和；优选地，所述的药物组合物还包括至少一种药学上可接受的辅料。

29.一种用于非诊断目的的体外检测样品中IL-17A的方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：

(1)将权利要求1-14任一项所述的抗体、权利要求15所述的抗体制剂、权利要求16所述的多克隆抗体、权利要求17-19任一项所述的重组蛋白、权利要求20所述的抗体药物偶联物与检测样品结合；

(2)检测抗原-抗体复合物，并进行结果判读。

30.一种预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，其特征在于：所述的方法包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1-14任一项所述的抗体、权利要求15所述的抗体制剂、权利要求16所述的多克隆抗体、权利要求17-19任一项所述的重组蛋白、权利要求20所述的抗体药物偶联物、权利要求22所述的核酸分子、权利要求23所述的生物学表达载体、权利要求24所述的宿主细胞或权利要求28所述的药物组合物。

31.一种预防和/或治疗癌症的方法，其特征在于：所述的方法包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1-14任一项所述的抗体、权利要求15所述的抗体制剂、权利要求16所述的多克隆抗体、权利要求17-19任一项所述的重组蛋白、权利要求20所述的抗体药物偶联物、权利要求22所述的核酸分子、权利要求23所述的生物学表达载体、权利要求24所述的宿主细胞或权利要求28所述的药物组合物。