EA011390B1 - Мутантные белки (мутеины) фактора роста фибробластов 21 - Google Patents
Мутантные белки (мутеины) фактора роста фибробластов 21 Download PDFInfo
- Publication number
- EA011390B1 EA011390B1 EA200700533A EA200700533A EA011390B1 EA 011390 B1 EA011390 B1 EA 011390B1 EA 200700533 A EA200700533 A EA 200700533A EA 200700533 A EA200700533 A EA 200700533A EA 011390 B1 EA011390 B1 EA 011390B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- mutein
- muteins
- type
- human
- amino acid
- Prior art date
Links
- 102000003973 Fibroblast growth factor 21 Human genes 0.000 title description 2
- 108090000376 Fibroblast growth factor 21 Proteins 0.000 title description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 52
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 27
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 208000002705 Glucose Intolerance Diseases 0.000 claims description 4
- 206010018429 Glucose tolerance impaired Diseases 0.000 claims description 4
- 206010060378 Hyperinsulinaemia Diseases 0.000 claims description 4
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 claims description 4
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 claims description 4
- 230000003451 hyperinsulinaemic effect Effects 0.000 claims description 4
- 201000008980 hyperinsulinism Diseases 0.000 claims description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 abstract description 28
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 abstract description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 15
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 2
- 101000846529 Homo sapiens Fibroblast growth factor 21 Proteins 0.000 abstract 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract 2
- 102000056713 human FGF21 Human genes 0.000 abstract 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 55
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 52
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 26
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 20
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 20
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 20
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 19
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 18
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 18
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 17
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 14
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 13
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 13
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 13
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 11
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 11
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 11
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 10
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 10
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 10
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 9
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 5
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 3 Isobutyl 1 methylxanthine Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(CC(C)C)C2=C1N=CN2 APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000016622 Dipeptidyl Peptidase 4 Human genes 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 101150025129 POP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 239000006160 differential media Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 230000006377 glucose transport Effects 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037219 healthy weight Effects 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002614 leucines Chemical group 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 101150001396 oar gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008020 pharmaceutical preservative Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000007261 regionalization Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
- A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Obesity (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Данное изобретение относится к новым мутеинам человеческого фактора роста фибробластов 21 со сниженной способностью к О-гликозилированию при экспрессии в дрожжах в сравнении с человеческим FGF-21 дикого типа. Раскрыты варианты белка и соответствующей кодирующей нуклеиновой кислоты. Изобретение также включает векторы и клетки-хозяева для размножения указанных последовательностей нуклеиновых кислот и получения указанных мутеинов. Кроме того, раскрыты способы лечения диабета 2 типа, ожирения или метаболического синдрома.
Description
Данное изобретение относится к идентификации новых мутантных белков (мутеинов) фактора роста фибробластов 21, которые обладают сниженным О-связанным гликозилированием при экспрессии в дрожжах.
Уровень техники
Факторы роста фибробластов представляют собой полипептиды большого размера, которые широко экспрессируются в растущих и взрослых тканях (Вайб с1 а1., Сапсег Се11к, 3: 239-243, 1991) и играют критическую роль в многочисленных физиологических функциях, включая ангиогенез, митогенез, образование шаблонов, дифференциацию клеток, метаболическое регулирование и восстановление повреждения ткани (МсКеейап е1 а1., Ргод. Ыис1е1с Ас1б Век. Мо1. Βίο1. 59: 135-176, 1998). В соответствии с опубликованными данными, семейство РОР в настоящее время состоит по меньшей мере из двадцати трех членов, от РОР-1 до РОР-23 (Веикк е! а1., Се11 Т1ккие Век. 313: 139-157 (2003)).
Сообщалось, что факторы роста фибробластов 21 (РОР-21) предпочтительно экспрессируются в печени (Νίκΐιίιηιιπι е! а1., ВюсЫтка е! Вюрйукка Ас!а, 1492: 203-206, 2000; \УО 01/36640 и \УО 01/18172) и описаны в качестве средства для лечения ишемического заболевания сосудов, заживления ран и заболеваний, связанных со снижением клеточной функции легких, бронхов или альвеол и множеством других нарушений. Позже было показано, что РОР-21 стимулирует захват глюкозы адипоцитами мыши 3Т3-Б1 после длительной обработки (72 ч) в присутствии и в отсутствие инсулина, а также уменьшает уровень глюкозы, триглицеридов и глюкагона в крови натощак и после приема пищи у мышей оЬ/оЬ и бЬ/бЬ и у крыс ΖΩΕ в возрасте 8 недель зависимым от дозы образом, таким образом, обеспечивая основу для применения РОР-21 в качестве терапии для лечения диабета и ожирения (\УО 03/011213).
Развитие технологии рекомбинантной ДНК делает возможным получение чужеродных продуктов, таких как мутеины РОР-21 в клетках-хозяевах, в которые введены экзогенные последовательности ДНК, кодирующие такие продукты. Преимущество такой технологии состоит в том, что продукты могут быть получены с высокими выходами, в высокоочищенной форме, с низким риском загрязнения, такого как вирусное загрязнение. Такие рекомбинантные технологии широко применяются для получения рекомбинатных белков в прокариотных, а также эукариотических клетках-хозяевах.
Однако получение рекомбинантных продуктов в больших масштабах с помощью таких технологий по-прежнему ограничено из-за проблем с эффективностью экспрессии таких экзогенных последовательностей ДНК, а также из-за нестабильности вектора и внутриклеточного разложения рекомбинантных продуктов клетками-хозяевами, в которых они вырабатываются. Кроме того, рекомбинантные продукты часто отличаются от своих природных аналогов. Например, рекомбинантные продукты, продуцируемые в гетерологичных эукариотических хозяевах, обычно отличаются от их природного аналога по степени гликозилирования. Это может происходить за счет присутствия (по сравнению с отсутствием) любой углеводной структуры, расположения указанной углеводной структуры в продукте, а также природы углевода. Более конкретно, было показано, что рекомбинантные продукты, полученные в дрожжах, часто несут дополнительные неприродные О-гликаны в сравнении с их природным аналогом (Уап беп §!ееп, е! а1., Стй. Ве\зе\\'к шВюсйет. апб Мо1е. Вю1. 33(3): 151-208, 1998).
Данное изобретение решает задачу аномального О-гликозилирования, связанного с полученными в дрожжах рекомбинантными белками, путем обеспечения РОР-21 мутеинов, которые обладают сниженной степенью О-гликозилирования в сравнении с РОР-21 дикого типа при экспрессии в дрожжах. Авторами было обнаружено, что мутеины РОР-21 со сниженным О-гликозилированием могут быть получены в условиях промышленного ферментирования и могут сохранять биологическую активность, необходимую для того, чтобы быть пригодными для лечения пациентов с нарушениями, включающими, но не ограничиваясь ими, диабет II типа, ожирение и метаболический синдром.
Сущность изобретения
В первом варианте осуществления данное изобретение предлагает мутеины человеческого РОР-21 или его биологически активный пептид, который включает замену любой аминокислотой, за исключением 8ет или Т1г для 8ет 167, где нумерация аминокислот основана на 8ЕО Ш NО:1 и где указанный мутеин обладает сниженной способностью к О-гликозилированию при экспрессии в дрожжах в сравнении с человеческим РОР-21 дикого типа.
Второй вариант осуществления данного изобретения предлагает мутеины человеческого РОР-21 или его биологически активный пептид, который включает замену любой аминокислотой, за исключением 8ет или Т1г для 8ет 167, в сочетании с заменой цистеином для двух или более из следующего: аргинин 19, тирозин 20, лейцин 21, тирозин 22, треонин 23, аспартат 24, аспартат 25, аланин 26, глутамин 27, глутамин 28, аланин 31, лейцин 33, изолейцин 35, лейцин 37, валин 41, глицин 42, глицин 43, глутамат 50, глутамин 54, лейцин 58, валин 62, лейцин 66, глицин 67, лизин 69, аргинин 72, фенилаланин 73, глутамин 76, аргинин 77, аспартат 79, глицин 80, аланин 81, лейцин 82, глицин 84, серин 85, пролин 90, аланин 92, серин 94, фенилаланин 95, лейцин 100, аспартат 102, тирозин 104, тирозин 107, серин 10 9, глутамат 110, пролин 115, гистидин 117, лейцин 118, пролин 119, аспарагин 121, лизин 122, серин 123, пролин 124, гистидин 125, аргинин 126, аспартат 127, аланин 129, пролин 130, глицин 132, аланин 134, аргинин 135,
- 1 011390 лейцин 137, пролин 138 или лейцин 139, где нумерация аминокислот основана на 8ЕР ГО N0:1 и где указанный мутеин обладает сниженной способностью к О-гликозилированию при экспрессии в дрожжах в сравнении с человеческим ЕОЕ-21 дикого типа.
Третий вариант осуществления данного изобретения предлагает мутеины человеческого ТОЕ-21 или его биологически активный пептид, который включает замену любой аминокислотой, за исключением 8ег или ТЬг для 8ег 167 в сочетании с заменой заряженной и/или полярной, но незаряженной аминокислотой для одной или нескольких аминокислот в положениях: глицин 42, глутамин 54, аргинин 77, аланин 81, лейцин 86, фенилаланин 88, лизин 122, гистидин 125, аргинин 126, пролин 130, аргинин 131, лейцин 139, аланин 145, лейцин 146, изолейцин 152; аланин 154; глутамин 156, глицин 161, серин 163, глицин 170 или серин 172, где нумерация аминокислот основана на 8ЕО ГО N0:1 и где указанный мутеин обладает сниженной способностью к 0-гликозилированию при экспрессии в дрожжах в сравнении с человеческим ТОТ-21 дикого типа.
Другие варианты осуществления представляют собой полинуклеотиды, кодирующие мутеины по первому, второму и третьему вариантам осуществления, вектор, содержащий указанные полинуклеотиды и клетку-хозяин, несущую указанный вектор. Другой вариант осуществления представляет собой способы получения полипептида, с получением клеток, способных продуцировать указанный полипептид, с получением вектора, содержащего ДНК, кодирующую указанный полипептид.
Еще один вариант осуществления представляет собой способы лечения пациента, имеющего одно или несколько из следующих состояний: ожирение, диабет II типа, инсулинорезистентность, гиперинсулинемию, непереносимость глюкозы, гипергликемию или метаболический синдром, включающие введение указанному пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества мутеина человеческого ЕОЕ-21 по первому, второму или третьему варианту осуществления изобретения.
Подробное описание изобретения
Для целей данного изобретения, как раскрыто и заявлено в данном описании, следующие термины используются в таком значении, как определено ниже.
Человеческий ЕОЕ-21 представляет собой полипептид из 208 аминокислот, содержащий лидерную последовательность, которая состоит из 27 аминокислот. Человеческий ЕОЕ-21 имеет ~79% идентичность аминокислот с мышиным ЕОЕ-21 и ~80% идентичность аминокислот с крысиным ЕОЕ-21. Человеческий ЕОЕ-21 представляет собой предпочтительный шаблон полипептида для мутеинов по данному изобретению, но признано, что специалист в данной области может легко получить мутеины на основе альтернативной последовательности полипептида млекопитающих ЕОЕ-21.
Положения аминокислот в мутеинах по данному изобретению определены на основе зрелого чело-
веческого полипептида ЕОЕ-21, 1 | состоящего из 181 аминокислот, как показано ниже (8ЕР ГО N0:1): | ||||||||||||||||||
10 | 20 | ||||||||||||||||||
ΗΪ5 | Рго | Не | Рго | Азр | Зег | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи 30 | С1п | РНе | СИу | СИу | О1п | Уа1 | Агд | С1п | Агд | Туг 40 |
Ьеи | Туг | ТЬг | Азр | Азр | А1а | С1п | С1п | ТЬг | С1и 50 | А1а | ΗΪ8 | Ьеи | С1и | Не | Агд | С1и | Азр | СИу | ТЬг 60 |
Уа! | СИу | СИу | А1а | А1а | Азр | <31п | Зег | Рго | С1и 70 | Зег | Ьеи | Ьеи | С1п | Ьеи | Ьуз | А1а | Ьеи | Ьуз | Рго 80 |
61у | Уа1 | Не | С1п | Не | Ьеи | СИу | Уа1 | Ьуз | ТНг 90 | 8ег | Агд | РЬе | Ьеи | Суз | С1п | Агд | Рго | Азр | С1у 100 |
А1а | Ьеи | Туг | О1у | Зег | Ьеи | Н18 | РЬе | Азр | Рго 110 | С1и | А1а | Суз | Зег | РЬе | Агд | С1и | Ьеи | Ьеи | Ьеи 120 |
С1и | Азр | С1у | Туг | Азп | Уа1 | Туг | С1п | Зег | С1и 130 | А1а | Н15 | О1у | Ьеи | Рго | Ьеи | Н18 | Ьеи | Рго | СИу 140 |
Азл | Ьуз | 8ег | Рго | Н18 | Агд | Азр | Рго | А1а | Рго 150 | Агд | СИу | Рго | А1а | Агд | РЬе | Ьеи | Рго | Ьеи | Рго 160 |
С1у | Ьеи | Рго | Рго | А1а | Ьеи | Рго | С1и | Рго | Рго 170 | О1у | Не | Ьеи | А1а | Рго | С1п | Рго | Рго | Азр | Уа1 180 |
СИу | Зег | 8ег | Азр | Рго | Ьеи | Зег | Ме( | Уа1 | СИу | Рго | Зег | С1п | СИу | Агд | Зег | Рго | Зег | Туг | А1а |
Зег
Соответствующая последовательность ДНК, кодирующая зрелый человеческий полипептид ЕОЕ21, состоящий из 181 аминокислоты, представляет собой (8ЕР ГО N0:2):
САССССАТСССТСАСТССАСТССТСТССТССААТТСССС0СССААСТССС6СА6С6СТАССТСТАСА
СА0АТСАТССССАССАСАСАСАА6СССАССТ0САСАТСАСС0А66АТаССАСССТС00С6СС6СТ
ССТСАССАСА0СССС6АААСТСТССТ6СА6СТ0ААА0ССТТ6ААССС600А6ТТАТТСАААТСТТ0
00А0ТСАА0АСАТССА06ТТССТ0Т0ССАСС00ССАСАТС0СССССТ0ТАТС6АТС6СТССАСТТТ
САСССТСАООССТССАССТТСССООАССТОСТТСТГСАОбАСССАТАСААТСТТТАССАОТСССАА
ССССАСС6ССТССС0СТ6САССТаССА6Ц0ААСАА6ТССССАСАССОООАСССТОСАССССОАООА
ССАОСТСОСТТССТ6ССАСТАССАООССТСССССССОСАСТСССООАСССАСССООААТССТООССС
СССА0СССССС0АТ0Т6С0СТССТС00АСССТСТ0А0САТ00ТС06АССТТСССА000СС0АА0СС
ССАОСТАСССТТСС
Аминокислоты идентифицируют с использованием трехбуквенного кода или альтернативно обо- 2 011390 значают с использованием стандартного однобуквенного кода. Мутации обозначают трехбуквенным кодом для исходной аминокислоты, с последующим номером аминокислоты, с последующим трехбуквенным кодом заменяющей аминокислоты. Численные обозначения каждого мутеина основаны на последовательности из 181 аминокислоты зрелого человеческого ЕСЕ-21 дикого типа. Например, замена серина в положении 167 (т.е. 8ег167) неполярной/гидрофобной аминокислотой, аланином (А1а), обозначается как 8ет167А1а или 8167А. Подобным образом, двойная замена лейцина в положении 118 и аланина в положении 134 (Ьеи118, А1а134) серосодержащей аминокислотой, цистеином (Сук) обозначается как Ееи118Сук/А1а134Сук или Ш18С/А134С.
Термин «аминокислота» в данном описании используется в самом широком смысле и включает природные аминокислоты, а также неприродные аминокислоты, включая аналоги и производные аминокислот. Последние включают молекулы, содержащие аминокислотный фрагмент. Специалист в данной области будет понимать, с точки зрения данного широкого определения, что ссылка на аминокислоту в данном описании включает, например, природные протеогенные Ь-аминокислоты; Ό-аминокислоты; химически модифицированные аминокислоты, такие как аналоги и производные аминокислот; природные непротеогенные аминокислоты, такие как норлейцин, β-аланин, орнитин и т.д.; а также химически синтезированные соединения, обладающие свойствами, которые известны из уровня техники как характерные для аминокислот.
Мутеин человеческого ЕСЕ-21 определяется как содержащий человеческий ЕСЕ-21, в котором по меньшей мере одна аминокислота в зрелом белке дикого типа замещена другой аминокислотой. Примеры мутеинов ЕСЕ-21 описаны в патентной заявке США 60/528582, которая включена в качестве ссылки. В целом, мутеин обладает некоторым модифицированным свойством, структурным или функциональным, белка дикого типа. Например, мутеин может обладать усиленной или улучшенной физической стабильностью в концентрированных растворах (например, меньшей степенью гидрофобно опосредованной агрегации) при сохранении благоприятного профиля биологической активности. Мутеин может обладать повышенной совместимостью с фармацевтическими консервантами (например, м-крезол, фенол, бензиловый спирт), таким образом, делая возможным приготовление фармацевтического препарата с консервантами, который сохраняет физико-химические свойства и биологическую активность белка в процессе хранения. Мутеин может обладать сниженной степенью О-гликозилирования при экспрессии в дрожжах. Такое О-гликозилирование может вводить новые иммунологические детерминанты в белок и может, таким образом, быть антигенным при введении людям; может изменять фармакокинетические свойства белка и/или влиять на биологическую активность белка. Соответственно, дрожжи продуцируют мутеины со сниженной степенью О-гликозилирования в сравнении с диким типом ЕСЕ-21, которые являются менее иммуногенными и обладают благоприятным фармакокинетическим профилем, при сохранении биологической активности. В данном описании указанные термины не являются ограничивающими и вполне возможно, что данный мутеин обладает одним или несколькими модифицированными свойствами белка дикого типа.
«Терапевтически эффективное количество» представляет собой минимальное количество активного агента, необходимое для достижения терапевтического эффекта у пациента. Например, «терапевтически эффективное количество» для пациента, который страдает или склонен к возникновению, а также для предупреждения диабета II типа, ожирения или метаболического синдрома представляет собой такое количество, которое вызывает, облегчает или другим способом вызывает улучшение патологических симптомов, прогрессирования заболевания, физиологических состояний, связанных с ними, или устойчивость к упомянутым выше расстройствам. Для целей данного изобретения «субъект» или «пациент» предпочтительно является человеком.
Диабет II типа характеризуется избыточным содержанием глюкозы в крови, несмотря на доступность инсулина, причем уровни глюкозы в кровотоке остаются чрезмерно высокими в результате неадекватного клиренса глюкозы.
Непереносимость глюкозы может быть определена как избыточная чувствительность к глюкозе.
Гипергликемия определяется как избыточный уровень сахара (глюкозы) в крови.
Гипогликемия, которую также называют низким уровнем сахара в крови, возникает, когда уровень глюкозы в крови падает слишком низко для того, чтобы обеспечить достаточно энергии для функционирования организма.
Гиперинсулинемия определяется как уровень инсулина в крови выше нормы.
Инсулинорезистентность определяется как состояние, при котором нормальное количество инсулина приводит к субнормальной (ниже нормы) биологической реакции.
Ожирение, применительно к человеку, может быть определено как масса тела, которая на 20% и больше превышает идеальную массу тела для данной популяции (КН. ХУПйатк. ТехЛоок οί Еибосгшо1оду, 1974, р. 904-916).
Метаболический синдром может быть определен как совокупность по меньшей мере трех из следующих признаков: жировые отложения в области живота - у большинства мужчин, объем талии 40 дюймов или больше; высокий уровень сахара в крови - по меньшей мере 110 миллиграммов на децилитр (мг/дл) натощак; высокий уровень триглицеридов - по меньшей мере 150 мг/дл в кровотоке; низкий уро
- 3 011390 вень липопротеидов высокой плотности (НОЬ) - менее 40 мг/дл; а также артериальное давление 130/85 или выше.
Данное изобретение обеспечивает гликозилированные мутеины, в которых количество и/или вид сайтов гликозилирования изменены в сравнении с природным ЕСЕ-21. Один такой вариант включает мутеины ЕСЕ-21, которые включают меньшее количество О-связанных сайтов гликозилирования. Не существует консенсусной последовательности аминокислот для идентификации сайтов О-связанного гликозилирования, что делает такую идентификацию трудной задачей. В норме О-связанное гликозилирование происходит в боковой цепи остатка серина или треонина. Как только идентифицирован сайт Освязанного гликозилирования, замены аминокислот для удаления данной последовательности могут удалять существующую О-связанную углеводную цепь. Сайты О-связанного гликозилирования, идентифицированные в данном изобретении, включают 8ег163. 8ег164, 8ег167, 8ег172 и 8ег176. Основным сайтом О-гликозилирования является 8ег167. Авторами было обнаружено, что удаление сайта 8ег167 ведет к значительному уменьшению О-гликозилирования экспрессированного дрожжами мутеина. Хотя 8ег167 представляет собой предпочтительный сайт мутации для устранения О-гликозилирования, мутации в других сайтах О-гликозилирования человеческого ЕСЕ-21 (8ег163, 8ег164, 8ег172 и 8ег176) находятся в рамках данного изобретения.
Следовательно, в первом предпочтительном варианте осуществления данное изобретение предлагает мутеины человеческого ЕСЕ-21 или его биологически активный пептид, который включает замену любой аминокислотой, за исключением 8ег или ТЬг для 8ег 167, где нумерация аминокислот основана на 8ЕО ΙΌ N0:1 и где указанный мутеин обладает сниженной способностью к О-гликозилированию при экспрессии в дрожжах в сравнении с человеческим ЕСЕ-21 дикого типа. Предпочтительные мутеины по первому варианту представляют собой 8ег167А1а, 8ег167С1и, 8ег167А§р, 8ег167А§и, 8ег167С1и, 8ег167С1у, 8ег167Уа1, 8ег167Нк, 8ег167Ьу5 и 8ег167Туг.
Второй вариант осуществления данного изобретения предлагает мутеины человеческого ЕСЕ-21 или его биологически активный пептид, который включает замену любой аминокислотой, за исключением 8ег или ТЬг для 8ег167, в сочетании с заменой цистеином для двух или более из следующего: аргинин 19, тирозин 20, лейцин 21, тирозин 22, треонин 23, аспартат 24, аспартат 25, аланин 26, глутамин 27, глутамин 28, аланин 31, лейцин 33, изолейцин 35, лейцин 37, валин 41, глицин 42, глицин 43, глутамат 50, глутамин 54, лейцин 58, валин 62, лейцин 66, глицин 67, лизин 69, аргинин 72, фенилаланин 73, глутамин 76, аргинин 77, аспартат 79, глицин 80, аланин 81, лейцин 82, глицин 84, серин 85, пролин 90, аланин 92, серин 94, фенилаланин 95, лейцин 100, аспартат 102, тирозин 104, тирозин 107, серин 109, глутамат 110, пролин 115, гистидин 117, лейцин 118, пролин 119, аспарагин 121, лизин 122, серин 123, пролин 124, гистидин 125, аргинин 126, аспартат 127, аланин 129, пролин 130, глицин 132, аланин 134, аргинин 135, лейцин 137, пролин 138 или лейцин 139, где нумерация аминокислот основана на 8ЕО ΙΌ N0:1 и где указанный мутеин обладает сниженной способностью к О-гликозилированию при экспрессии в дрожжах в сравнении с человеческим ЕСЕ-21 дикого типа. Предпочтительно, фраза «два или более» означает замещение цистеином для 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 остатков аминокислот в указанных выше положениях. Более предпочтительно, она означает замещение цистеином для 2 или 4 остатков аминокислот в указанных выше положениях.
Специалист в данной области также будет понимать, что природные цистеины, цистеин 75 и цистеин 93, также могут быть использованы как локусы (местоположения) для введения новой дисульфидной связи, которая может обеспечивать улучшенные свойства. Конкретно, предусматривается введение замены цистеином серина 85 или фенилаланина 73, в сочетании с одновременной заменой в положении цистеина 93 или цистеина 75, соответственно, где последние сайты заменены любой другой аминокислотой.
Мутеины ЕСЕ-21 с введенными дисульфидными связями, кроме природной связи в положении Су875-Су§93, описаны в патентной заявке США 60/528582. Наиболее предпочтительные мутеины по второму варианту осуществления представляют собой Ьеи118Су8-А1а134Су5-8ег167А1а; Ьеи21Су8Ьеи33Су5-8ег167А1а; А1а26Су5-Еу5122Су5-8ег167А1а или Ееи21Су8-Ееи33Су8/Ееи118Су5-А1а134Су88ег167А1а.
Третий вариант осуществления данного изобретения предлагает мутеины человеческого ЕСЕ-21 или его биологически активный пептид, который включает замену любой аминокислоты, за исключением 8ег или ТЬг для 8ег 167 в сочетании с заменой заряженной и/или полярной, но незаряженной амино кислотой для одной или более аминокислот в положениях: глицин 42, глутамин 54, аргинин 77, аланин 81, лейцин 86, фенилаланин 88, лизин 122, гистидин 125, аргинин 126, пролин 130, аргинин 131, лейцин 139, аланин 145, лейцин 146, изолейцин 152, аланин 154, глутамин 156, глицин 161, серин 163, глицин 170 или серин 172, где нумерация аминокислот основана на 8ЕО ΙΌ N0:1 и где указанный мутеин обладает сниженной способностью к О-гликозилированию при экспрессии в дрожжах в сравнении с человеческим ЕСЕ-21 дикого типа.
Заряженная аминокислота определяется как положительно или отрицательно заряженная аминокислота. Определение положительно заряженной аминокислоты включает гистидин, лизин, аргинин, а также их не встречающиеся в природе аналоги (например, гамма-аминомасляная кислота, орнитин и т.д.). Определение отрицательно заряженной аминокислоты включает аспартат, глутамат, а также их не
- 4 011390 встречающиеся в природе аналоги (например, аминоадипиновая кислота). Определение полярной, но не заряженной аминокислоты включает серин, треонин, аспарагин, глутамин, а также их не встречающиеся в природе аналоги. Предпочтительные мутеины по третьему варианту осуществления представляют собой
С1п54С1и-Зег167А1а,
Ьеи139О1и-Зег1б7А1а,
Зег167А1а,
Последующие варианты осуществления данного изобретения предлагают мутеины человеческого БОБ-21 или его биологически активный пептид, которые включают комбинацию первого варианта осуществления по данному изобретению, второго варианта осуществления по данному изобретению и третьего варианта осуществления по данному изобретению, где указанные мутеины обладают сниженной способностью к О-гликозилированию при экспрессии в дрожжах в сравнении с человеческим БОБ21 дикого типа.
Хотя варианты осуществления по данному изобретению касаются мутеинов БОБ-21 со сниженной способностью к О-гликозилированию при экспрессии в дрожжах в сравнении с человеческим БОБ-21 дикого типа, сохранение биологической активности мутеинов в сравнении с БОБ-21 дикого типа также представляет собой важный фактор для рассмотрения.
Биологическая активность мутеинов по данному изобретению определяется по способности мутеинов влиять на потребление глюкозы, что демонстрируется анализом ΐπ νΐΐΓΟ на клетках 3Т3-Б1 (пример 2), и/или снижать уровни глюкозы в плазме, а также уровни триглицеридов в плазме, что демонстрируется анализом ΐπ νίνο на мышах оЬ/оЬ (пример 3).
Мутеины БОБ-21, вводимые в соответствии с данным изобретением, могут быть созданы и/или выделены любыми средствами, известными из уровня техники. Наиболее предпочтительным способом получения мутеина является получение с помощью методологий рекомбинантных ДНК, которые хорошо известны специалистам в данной области. Такие способы описаны в Сиггеп! Рго!осо1§ ΐπ Мо1еси1аг Βΐοΐоду (4оКп ^11еу & 8оп§, 1пс.), которая включена в данное описание путем ссылки.
Кроме того, предпочтительные варианты осуществления включают биологически активный пептид, происходящий из мутеина, раскрытого в данном описании, причем такой пептид будет содержать по меньшей мере одну из описанных замен, будет проявлять сниженную способность к Огликозилированию в сравнении с соответствующим немутантным пептидом, и также будет обладать биологической активностью. Такая биологическая активность определяется по способности пептида влиять на потребление глюкозы, что демонстрируется анализом ΐη νΐΐΐΌ на клетках 3Т3-Б1 (пример 2), и/или снижать уровни глюкозы в плазме, а также уровни триглицеридов в плазме, что демонстрируется анализом ΐη νί\·Ό на мышах оЬ/оЬ (пример 3). Пептид может быть получен любыми средствами, известными специалисту в данной области, примеры которых включают, не ограничиваясь ими, ферментативное расщепление, химический синтез или методики рекомбинантной ДНК.
Из уровня техники известно, что фрагменты пептидов некоторых факторов роста фибробластов являются биологически активными. См., например, Ванд е! а1., Ргос. Ыа11. Асаб. 8ст (И8А) 85: 2324-2328 (1988), и I. Се11. Рйу§. 8ирр1. 5: 101-106 (1987). Например, известно, что дипептидилпептидаза IV (ΌΡΡIV) представляет собой протеазу серинового типа, которая принимает участие в инактивации нейропептидов, эндокринных пептидов и цитокинов (Патте е! а1. Сйет. 1ттипо1. 72: 42-56, (1999)). Ν-конец БОБ-21 (НщРгоБеРго) содержит два дипептида, которые потенциально могут быть субстратами для ΌΡΡIV, что приводит к образованию фрагмента БОБ-21, укороченного на Ν-конце (отсечен фрагмент до 4 аминокислот). Неожиданно данный фрагмент дикого типа БОБ-21 продемонстрировал способность сохранять биологическую активность (табл. 1), и таким образом, мутеины по данному изобретению укорочены на Ν-конце (отсечен фрагмент до 4 аминокислот) в сочетании с заменами аминокислот по любому из вариантов осуществления данного изобретения. Кроме того, авторами было обнаружено, что отсечение 5 или более аминокислот на Ν-конце отрицательно влияет на биологическую активность.
Данное изобретение также охватывает полинуклеотиды, кодирующие описанные выше мутеины, которые могут быть в форме РНК или в форме ДНК, причем ДНК включает кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной. Кодирующие последовательности, которые кодируют мутеины по данному изобретению, могут варьировать в результате избыточности или вырожденности генетического кода.
Полинуклеотиды, которые кодируют мутеины по данному изобретению, могут включать следующее: только кодирующая последовательность для мутеина, кодирующая последовательность для мутеина и дополнительная кодирующая последовательность, например, для функционального полипептида, или лидерная или секреторная последовательность или последовательность пробелка; кодирующая последовательность для мутеина и не кодирующая последовательность, например, интроны или не кодирующая последовательность 5' и/или 3' кодирующей последовательности для мутеина. Таким образом, термин «полинуклеотид, кодирующий мутеин» охватывает полинуклеотид, который может включать не только
- 5 011390 кодирующую последовательность для мутеина, но также полинуклеотид, который включает дополнительную кодирующую и/или не кодирующую последовательность.
Данное изобретение дополнительно относится к вариантам описанных полинуклеотидов, которые кодируют фрагменты, аналоги и производные полипептида, содержащие указанные замены. Вариант полинуклеотида может представлять собой встречающийся в природе аллельный вариант человеческой последовательности ЕСЕ-21, не встречающийся в природе вариант или укороченный вариант, как описано выше. Таким образом, данное изобретение также включает полинуклеотиды, кодирующие описанные выше мутеины, а также варианты таких полинуклеотидов, причем варианты кодируют фрагмент, производное или аналог раскрытого мутеина, которые демонстрирует сниженную способность к Огликозилированию в сравнении с соответствующим немутантным фрагментом, производным или аналогом. Такие нуклеотидные варианты включают варианты делеции, варианты замены, укороченные варианты, а также варианты добавления или вставки, до тех пор, пока присутствует по меньшей мере одна из указанных замен аминокислот по первому, второму или третьему варианту осуществления.
Полинуклеотиды по данному изобретению будут экспрессироваться в клетке-хозяине после того, как последовательности будут функционально присоединены к последовательности, контролирующей экспрессию. Такие вектора экспрессии обычно способны к репликации в организмах-хозяевах в виде эписом или в виде интегральной части хромосомной ДНК хозяина. Обычно векторы экспрессии будут содержать маркеры селекции, например, тетрациклин, неомицин и дигидрофолатредуктазу для выявления клеток, трансформированных с помощью желаемых последовательностей ДНК. Предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой грибковую или дрожжевую клетку.
Дрожжевые клетки, которые используются для экспрессии мутеинов по данному изобретению, включают Рю1иа ракЮпк, 8ассйаготусек сегеу1к1ае, 8с1ихокасс11аготусек ротйе и Рю1иа аидик!. Дрожжевые клетки-хозяева содержат подходящие векторы с контролирующими экспрессию последовательностями, такими как промоторы, включая 3-фосфоглицераткиназу или другие гликолитические ферменты и начало репликации, последовательности терминации и т.п., по желанию.
Предпочтительный дрожжевой хозяин по данному изобретению представляет собой Рю1иа ракйэпк, в котором вектор экспрессии интегрирован в хромосомную ДНК хозяина. АкрегдШик шдег, Тпсйобегша гееке1 и 8сЫхорНу11ит соттипе представляют собой примеры грибковых хозяев, хотя другие также могут использоваться, по выбору.
Векторы, содержащие желаемые полинуклеотидные последовательности (например, мутеины ЕСЕ21 и контролирующие экспрессию последовательности), могут быть перенесены в клетку-хозяин с помощью хорошо известных способов, которые варьируют в зависимости от вида клетки-хозяина. Например, трансфекция с хлоридом кальция обычно используется в случае прокариотных клеток, тогда как обработка кальция фосфатом или электропорация могут использоваться в случае других клеток-хозяев.
Могут применяться различные способы очистки белка, и такие способы известны из уровня техники и описаны, например, в ПеШксйег, МеШобк ίη Епхуто1оду 182: 83-9 (1990) и 8сорек, Рго!ет Рипйсайоп: Рппар1ек апб Ргасйсе, 8рппдег-Уег1ад, ΝΥ (1982). Выбранная(ые) стадия(и) очистки будут зависеть, например, от характера способа получения, который используется для мутеинов ЕСЕ-21.
Композиции, содержащие мутеин ЕСЕ-21, должны разрабатываться и вводиться способом, который согласуется с надлежащей медицинской практикой, принимая во внимание клиническое состояние пациента, место доставки композиции мутеина ЕСЕ-21, способ введения, схему введения, а также другие факторы, известные практикующим специалистам. «Терапевтически эффективное количество» мутеина ЕСЕ-21 для целей данного описания, таким образом, определяется указанными соображениями.
Фармацевтические композиции мутеинов ЕСЕ-21 по данному изобретению могут вводиться любым известным из уровня техники способом, который достигает общей поставленной цели в лечении диабета II типа, ожирения или метаболического синдрома. Предпочтительным способом введения является парентеральный, который в данном описании определяется как включающий внутривенную, внутримышечную, внутрибрюшинную, внутригрудинную, подкожную и внутрисуставную инъекцию и инфузию. Вводимые дозы будут зависеть от возраста, состояния здоровья и массы тела реципиента, вида сопутствующего лечения, если оно проводится, частоты введения препарата, а также природы желаемого эффекта. Композиции в рамках изобретения включают все композиции, где присутствует мутеин ЕСЕ-21 в количестве, эффективном для достижения желаемого медицинского эффекта для лечения диабета II типа, ожирения или метаболического синдрома. Поскольку индивидуальные потребности могут варьировать от одного пациента к другому, определение оптимальных интервалов эффективных количеств всех компонентов находится в рамках навыков среднего клинициста.
Мутеины ЕСЕ-21 по данному изобретению могут быть введены в препарат в соответствии с известными способами приготовления полезных с фармацевтической точки зрения композиций. Желаемым препаратом будет такой, который представляет собой стабильный лиофилизированный продукт, который разбавляют соответствующим разбавителем, или водный раствор высокой чистоты, необязательно с фармацевтически приемлемыми носителями, консервантами, вспомогательными веществами или стабилизаторами [Веттд1оп'к Рйагтасеийса1 8аепсек 16Ш ебШоп (1980)]. Мутеины по данному изобретению могут сочетаться с фармацевтически приемлемым буфером, и рН может корректироваться для обеспече
- 6 011390 ния приемлемой стабильности и значения рН, приемлемого для введения. Более того, мутеины по данному изобретению могут быть помещены в контейнер, выбранный из группы, которая состоит из флакона, картриджа, шприц-ручки, шприца, капельницы для внутривенного введения и бутыли для внутривенного введения, где контейнер представляет собой однодозовый контейнер.
Для парентерального введения мутеины БСБ-21 вводят в препараты, обычно путем смешивания одного или более мутеинов с желательной степенью чистоты, в однодозовой инъекционной форме (раствор, суспензия или эмульсия) с фармацевтически приемлемым носителем, т.е. нетоксичным для реципиента, в дозах и концентрациях, которые совместимы с другими ингредиентами препарата. Предпочтительно, может добавляться один или более фармацевтически приемлемых антимикробных агентов. Фенол, м-крезол и бензиловый спирт являются предпочтительными фармацевтически приемлемыми антимикробными агентами.
Необязательно, одна или более фармацевтически приемлемых солей могут добавляться для коррекции ионной силы или тоничности. Одно или более вспомогательных веществ могут добавляться для дальнейшей коррекции изотоничности препарата. Глицерин, хлорид натрия и маннит представляют собой примеры вспомогательных веществ для коррекции изотоничности.
Специалисты в данной области могут легко оптимизировать фармацевтически эффективные дозы и схемы введения лечебных композиций, которые включают мутеин РОР-21, что определяется в соответствии с надлежащей медицинской практикой и клиническим состоянием отдельного пациента. Надлежащая доза мутеина РОР-21 для введения будет приводить к снижению уровней глюкозы и повышению расхода энергии путем более быстрой и более эффективной утилизации глюкозы, и, таким образом, будет полезной для лечения диабета II типа, ожирения и метаболического синдрома.
Кроме того, РОР-21 не вызывает гипогликемии у тощих крыс ΖΌΡ по сравнению с крысами, которым вводили инсулин (\УО 03/011213). Эти данные показывают, что РОР-21 оказывает влияние на уровни глюкозы в плазме инсулинзависимым образом, указывая на то, что мутеины РОР-21 по данному изобретению также могут быть полезными в лечении диабета I типа.
В другом аспекте данного изобретения мутеины человеческого РОР-21, описанные в данном описании, или его биологически активный пептид применяются в качестве лекарственного средства.
Еще в одном аспекте данного изобретения эффективное количество мутеинов РОР-21, описанных в данном описании, или его биологически активного пептида применяются в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики одного или нескольких состояний, выбранных из диабета II типа, ожирения или метаболического синдрома.
После подробного описания данного изобретения его объект будет дополнительно проиллюстрирован путем ссылки на следующие примеры, которые включены в данное описание исключительно для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения изобретения.
Все патенты и публикации, ссылки на которые сделаны в данном описании, таким образом, включены путем ссылки.
Пример 1.
Экспрессия и очистка мутеинов РОР-21 в дрожжах.
Мутеины РОР-21 экспрессируются в дрожжах, таких как Р1сЫа рав1ог18, Р1сЫа теЫапоНса или Бассйаготусез сегеу151ае. Для продуцирования в РюЫа ра81оп8 в коммерчески доступной системе ([пуЦгодсп. СагкЬаб, СА) используют векторы с сильными промоторами АОХ1 (алкогольоксидаза) для осуществления высокого уровня экспрессии рекомбинантных белков.
Альтернативно, для высоких уровней конститутивной экспрессии доступны векторы, в которых используется промотор из гена ОАР (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа). Мультикопийные векторы экспрессии РюЫа позволяют получить штаммы с множественными копиями желаемого гена, интегрированными в геном. Увеличение количества копий желаемого гена в рекомбинантном штамме РюЫа может увеличить уровни экспрессии белка. Еще одной системой экспрессии в дрожжах является Бассйаготусез сегеу181ае. Векторы экспрессии содержат последовательности промотора и энхансера из гена ОАБ1. Промотор ОАБ1 представляет собой один из наиболее широко используемых дрожжевых промоторов благодаря его выраженной транскрипциональной активности при индукции галактозой.
Аналитическое описание (анализ масс-спектра) показывает, что экспрессируемый в РюЫа ра81оп8 РОР-21 укорочен (отсечение четырех аминокислот на Ν-конце дикого типа). При проведении анализа в пробе адипоцитов мышей 3Т3-Ь1 (см. пример 2) этот укороченный вариант РОР-21 стимулирует потребление глюкозы при применении таких же концентраций, как и РОР-21 дикого типа (табл. 1).
Пример 2.
Потребление глюкозы адипоцитами мышей 3Т3-Ь1.
Клетки 3Т3-Ь1 получены от Американской Коллекции Культур Видов (Атепсаи Туре Си11иге Со11ес1юи, АТСС, ВоскуШе, ΜΌ). Клетки культивировали в среде культивирования (ОМ), содержащей 10% обогащенной железом фетальной бычьей сыворотки в модифицированной Дульбекко среде Игла. Для стандартной дифференциации адипоцитов через два дня после достижения слияния клеток (обозначается день 0) клетки подвергали действию дифференцирующей среды (ЭМ), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мкг/мл инсулина, 1 мкМ дексаметазона и 0,5 мкМ изобутилметилксантина, в тече
- 7 011390 ние 48 ч. Клетки содержали в постдифференциальной среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 10 мкг/мл инсулина.
Анализ транспорта глюкозы.
Потребление гексозы, измеренное путем количественного определения аккумуляции 0,1 мМ 2дезокси-Э-[14С]глюкозы, определяли следующим образом: адипоциты 3Т3-Р1 в 12-луночных планшетах, дважды промытые буфером ККР (136 мМ №С1, 4,7 мМ КС1, 10 мМ ХаРО4, 0,9 мМ СаС12, 0,9 мМ Мд8О4, рН 7,4), нагретые до 37°С и содержащие 0,2% В8Л, инкубировали в среде Лейбовица Ь-15, содержащей 0,2% В8Л, в течение 2 ч при 37°С в комнатной атмосфере, снова дважды промывали буфером ККР, содержащим 0,2% В8Л, и инкубировали в буфере ККР, содержащем 0,2% В8Л, в отсутствие (только Ме28О) или в присутствии вортманнина в течение 30 мин при 37°С в комнатной атмосфере. Затем добавляли инсулин до конечной концентрации 100 нМ в течение 15 мин и потребление 2-дезокси-Э[14С]глюкозы измеряли в течение последних 4 мин. Неспецифическое потребление, измеренное в присутствии 10 мкМ цитохалазина В, вычитали из всех значений. Концентрацию белка определяли с помощью анализа Пирса бицинхониновой кислоты. Потребление измеряли обычно в трехкратном или четырех кратном повторении для каждого эксперимента.
Активность ΐπ νίίτο нормализовали по активности ΐπ νίίτο РОР-21 дикого типа, которой присвоено значение 1,0, и которая используется в качестве положительного контроля. Активность ΐπ νίίτο мутеинов РОР-21 данного изобретения сравнивается с РОР-21 дикого типа в табл. 1. Как показано в табл. 1, мутеины по данному изобретению в различной степени сохраняют биологическую активность по сравнению с РОР-21 дикого типа.
Таблица 1
Мутеин ЕСЕ-21 | Система экспрессии | Активность ϊη νίύΓΟ* |
Дикий тип | Е. соМ | ι,ο |
ΔΗΡΙΡ укороченный Дикий тип** | Дрожжи | 0,9 |
ΔΗΡΙΡ Ы18С, А134С | Дрожжи | 0,2 |
ΔΗΡΙΡ Ы18С, А134С, 5167А | Дрожжи | 0,2 |
* Активность представляет собой относительное значение на базе активности РОР-21 дикого типа, выработанного Е. сой.
** На Ν-конце отсечены 4 аминокислоты.
Пример 3.
Модель на мышах оЬ/оЬ.
Исследование на модели ожирения с использованием самцов мышей оЬ/оЬ проводили для контроля уровней глюкозы и триглицеридов в плазме крови после лечения РОР-21, в сравнении с контрольными группами растворителя и инсулина. В экспериментальных группах самцам мышей оЬ/оЬ (возраст 7 недель) инъекционно вводили только растворитель (0,9% ΝηΡΊ) или мутеин РОР-21 (0,125 мг/кг) подкожно (0,1 мл, один раз в день) в течение 7 дней. Кровь отбирали с помощью зажима на хвосте в день 7, через час после последней инъекции соединения, и уровни глюкозы в плазме крови измеряли с использованием стандартного протокола. Способность мутеинов РОР-21 снижать уровни глюкозы в плазме в сравнении с контролем (растворитель) показаны в табл. 2. Данные в табл. 2 показывают, что мутеины по данному изобретению снижали уровни глюкозы в плазме крови в сравнении с контролем (растворитель). Способность мутеинов РОР-21 к снижению уровней триглицеридов в сравнении с контролем (растворитель) показаны в табл. 3.
Таблица 2
Мутеин ЕСЕ-21 | Уровни глюкозы в плазме как % от контроля |
Дикий тип | 62% |
Ы18С-А134С | 70% |
Ш18С-А134С-5167А | 62% |
Таблица 3
Мутеин ЕСЕ-21 | Уровни триглицеридов (мг/дл) |
Контроль (растворитель) | 210 |
Дикий тип | 116*** |
Ы18С-А134С | 137** |
Ы18С-А13 4С-5167А | 153* |
Значение Р против контроля (растворитель): *р<0,05; **р<0,02; ***р<0,001.
- 8 011390
Пример 4.
Фармацевтическая стабильность мутеинов РСР-21.
Стабильность мутеинов РСР-21 по данному изобретению анализировали путем имитации физиологических условий и условий фармацевтического препарата. Для имитации физиологических условий анализировали стабильность мутеина в фосфатном буферном растворе (РВ8) при комнатной температуре (КТ) при концентрации целевого белка 10 мг/мл, рН 7,4. Растворимость/физическая стабильность мутеинов в РВ8 считалась удовлетворительной, если выход белка после приготовления составлял >90% при комнатной температуре, что определяли с помощью хроматографии с разделением по размеру (δΐζθехс1и8юп еНгошаФдгарйу) и/или обращенно-фазовой хроматографии. Как показано в табл. 4 и 5, мутеины по данному изобретению удовлетворяют данным критериям.
Было предположено, что фармацевтический препарат мутеина по данному изобретению, вероятно, будет представлять собой препарат для универсального применения с консервантами, поэтому была проанализирована совместимость с широко используемым консервантом. Для исследования совместимости препарата консервант м-крезол (конечная концентрация 3 мг/мл, обычно достаточная для удовлетворения критериям Европейской Фармакопеи В для эффективности консерванта в условиях нейтральных значений рН) добавляли при комнатной температуре к раствору, содержащему мутеин в концентрации приблизительно 10 мг/мл в РВ8, рН 7,4. Физическую стабильность в присутствии консерванта первоначально оценивали путем определения выхода белка по основному пику на хроматограмме после обращенно-фазовой хроматографии и хроматографии с разделением по размеру при комнатной температуре. Кроме того, степень агрегации, измеренная с помощью ЭБЗ (динамического рассеивания света) при 37°С, показана как средний диаметр частиц в присутствии м-крезола по прохождении 2 ч, в сравнении с РСР-21 дикого типа. Больший размер среднего диаметра соответствует повышенной степени ассоциации и/или агрегации белка. Совместимость с консервантом (как функция среднего диаметра частиц) мутеинов по первому и второму вариантам данного изобретения в сравнении с РСР-21 дикого типа показана в табл. 4. Белок дикого типа экспрессировали в Е. сой, тогда как мутеины экспрессировали в дрожжах (РюЫа разФпз).
Мутеины по данному изобретению, которые являются стабильными в РВЗ и совместимыми с консервантом, сконструированы таким образом, чтобы обладать усиленными или улучшенными фармацевтическими свойствами в сравнении с РСР-21 дикого типа. Как показано в табл. 4, предпочтительные мутеины по данному изобретению, которые обладают усиленными фармацевтическими свойствами по сравнению с РСР-21 дикого типа, представляют собой Б118С-Л134С и Б118С-А134С-3167А.
Таблица 4
Мутеин ЕСЕ-21 | Средний диаметр частиц (нм)* |
Эксперимент #1 | |
Дикий тип РОЕ-21 | 1356 |
Эксперимент #2 | |
Дикий тип ЕСЕ-21 | 813 |
Ы18С-А134С | 7 |
Ц118С-А134С-8167А | 7 |
* Средний диаметр частиц представляет раствор белка с целевой концентрацией 10 мг/мл м-крезола с концентрацией 3 мг/мл, после 2 ч инкубирования при 37°С.
Пример 5.
Анализ О-гликозилирования.
Мутеины РСР-21 экспрессировали в РюЫа раз1оп8 и очищали из среды культивирования с помощью ВЭЖХ (АЧех 2695) с использованием колонки 2огЬах, 330-8В С8, 4,6x50 мм, частицы 3,5 мкм при 40°С (подвижная фаза С: 0,1% ТРА в 10% ацетонитрила и 90% Н2О, Ό: 0,1% ТРА в ацетонитриле).
Уровни О-гликозилирования очищенных мутеинов РСР-21 измеряли с помощью стандартного анализа ЖХ/МС (жидкостная хроматография, масс-спектроскопия. БС/МЗ). Процент О-гликозилирования для типичных представителей мутеинов показан в табл. 5 по сравнению с человеческим РСР-21 дикого типа. Уровни О-гликозилирования предпочтительных мутеинов Б118С-А134С-3167А составляют только 3% по сравнению со значениями >60% для РСР-21 дикого типа или мутеина Б118С-А134С, что четко демонстрирует, что мутеин 3167А значительно снижает уровень О-гликозилирования.
Таблица 5
РОГ-21 Мутеин | % О-гликозилирования |
Дикий тип | 62% |
Ы18С-А134С | 63% |
Ы18С-А134С-5167А | 3% |
Claims (5)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Мутеин человеческого ЕОЕ-21, где нумерация аминокислот основана на 8ЕО ΙΌ N0:1, где указанный мутеин представляет собой АН1кРго11еРго/Ееи118Сук/А1а134Сук/8ег167А1а.
- 2. Способ получения мутеина по п.1, включающий:(a) трансформирование клетки-хозяина с помощью вектора, содержащего ДНК, кодирующую указанный мутеин;(b) культивирование указанной клетки-хозяина в среде, подходящей для экспрессии указанного мутеина; и (c) выделение указанного мутеина из среды культивирования.
- 3. Фармацевтическая композиция, пригодная для лечения пациента, имеющего одно или несколько из следующих состояний: ожирение, диабет ΙΙ типа, инсулинорезистентность, гиперинсулинемию, непереносимость глюкозы, гипергликемию или метаболический синдром, содержащая следующее:(a) терапевтически эффективное количество мутеина ЕОЕ-21 по п.1 и (b) приемлемый фармацевтический носитель.
- 4. Мутеин человеческого ЕОЕ-21 или его биологически активный пептид по п.1 для применения в качестве лекарственного средства.
- 5. Применение мутеина ЕОЕ-21 по п.1 для производства лекарственного средства для лечения пациента, имеющего одно или несколько из следующих состояний: ожирение, диабет ΙΙ типа, инсулинорезистентность, гиперинсулинемию, непереносимость глюкозы, гипергликемию или метаболический синдром.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US60680504P | 2004-09-02 | 2004-09-02 | |
PCT/US2005/026398 WO2006028595A2 (en) | 2004-09-02 | 2005-07-26 | Muteins of fibroblast growth factor 21 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA200700533A1 EA200700533A1 (ru) | 2007-08-31 |
EA011390B1 true EA011390B1 (ru) | 2009-02-27 |
Family
ID=36036790
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200700533A EA011390B1 (ru) | 2004-09-02 | 2005-07-26 | Мутантные белки (мутеины) фактора роста фибробластов 21 |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7582607B2 (ru) |
EP (2) | EP2161281A1 (ru) |
JP (1) | JP4809352B2 (ru) |
KR (1) | KR100854198B1 (ru) |
CN (1) | CN101010338B (ru) |
AT (1) | ATE444307T1 (ru) |
AU (1) | AU2005283025B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0514790A (ru) |
CA (1) | CA2575753A1 (ru) |
DE (1) | DE602005016946D1 (ru) |
DK (1) | DK1789442T3 (ru) |
EA (1) | EA011390B1 (ru) |
ES (1) | ES2332057T3 (ru) |
HR (1) | HRP20090597T1 (ru) |
IL (1) | IL181573A0 (ru) |
MX (1) | MX2007002616A (ru) |
NO (1) | NO20071327L (ru) |
PL (1) | PL1789442T3 (ru) |
PT (1) | PT1789442E (ru) |
SI (1) | SI1789442T1 (ru) |
WO (1) | WO2006028595A2 (ru) |
Families Citing this family (78)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7459540B1 (en) | 1999-09-07 | 2008-12-02 | Amgen Inc. | Fibroblast growth factor-like polypeptides |
US8981061B2 (en) | 2001-03-20 | 2015-03-17 | Novo Nordisk A/S | Receptor TREM (triggering receptor expressed on myeloid cells) and uses thereof |
US9453251B2 (en) | 2002-10-08 | 2016-09-27 | Pfenex Inc. | Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens |
EP2412816B1 (en) | 2004-07-26 | 2014-12-03 | Pfenex Inc. | Process for improved protein expression by strain engineering |
GB0426146D0 (en) | 2004-11-29 | 2004-12-29 | Bioxell Spa | Therapeutic peptides and method |
WO2008121563A2 (en) | 2007-03-30 | 2008-10-09 | Ambrx, Inc. | Modified fgf-21 polypeptides and their uses |
US9580719B2 (en) | 2007-04-27 | 2017-02-28 | Pfenex, Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
EP2142651B1 (en) | 2007-04-27 | 2013-05-22 | Pfenex Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
WO2009020802A2 (en) | 2007-08-03 | 2009-02-12 | Eli Lilly And Company | Treatment for obesity |
JOP20190083A1 (ar) | 2008-06-04 | 2017-06-16 | Amgen Inc | بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها |
SG195542A1 (en) | 2008-10-10 | 2013-12-30 | Amgen Inc | Fgf21 mutants and uses thereof |
RU2525393C2 (ru) | 2009-01-23 | 2014-08-10 | Ново Нордиск А/С | Производные fgf21 со связующим альбумина а-в-с-d-e- и их применение |
US9120871B2 (en) | 2009-01-23 | 2015-09-01 | Novo Nordisk A/S | Process for preparing FGF21 with low degree of O-glycosylation |
CA2760674A1 (en) * | 2009-05-05 | 2010-11-11 | Amgen Inc. | Fgf21 mutants and uses thereof |
TWI560197B (en) | 2009-05-05 | 2016-12-01 | Amgen Inc | Fgf21 mutants and uses thereof |
WO2011154349A2 (en) | 2010-06-08 | 2011-12-15 | Novo Nordisk A/S | Fgf21 analogues and derivatives |
WO2010148142A1 (en) | 2009-06-17 | 2010-12-23 | Amgen Inc. | Chimeric fgf19 polypeptides and uses thereof |
CN101993485B (zh) | 2009-08-20 | 2013-04-17 | 重庆富进生物医药有限公司 | 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途 |
CA2782814A1 (en) * | 2009-12-02 | 2011-06-09 | Amgen Inc. | Binding proteins that bind to human fgfr1c, human .beta.-klotho and both human fgfr1c and human .beta.-klotho |
UA109888C2 (uk) * | 2009-12-07 | 2015-10-26 | ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ | |
EP2460527A1 (en) | 2010-01-21 | 2012-06-06 | Sanofi | Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome |
CN102791730A (zh) * | 2010-01-22 | 2012-11-21 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 低度o-糖基化的fgf21的制备方法 |
AU2011239689A1 (en) | 2010-04-15 | 2012-11-08 | Amgen Inc. | Human FGF receptor and beta-Klotho binding proteins |
US20130116171A1 (en) | 2010-04-16 | 2013-05-09 | Salk Institute For Biological Studies | Methods for treating metabolic disorders using fgf |
JP6069198B2 (ja) | 2010-07-20 | 2017-02-01 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | N末端が修飾されたfgf21化合物 |
MX2013005075A (es) | 2010-11-05 | 2013-05-28 | Pfizer | Compuestos antidiabeticos. |
US9023791B2 (en) * | 2010-11-19 | 2015-05-05 | Novartis Ag | Fibroblast growth factor 21 mutations |
CN113683705A (zh) | 2011-07-01 | 2021-11-23 | 恩格姆生物制药公司 | 用于代谢病症和疾病治疗的组合物、应用和方法 |
EP2548570A1 (en) | 2011-07-19 | 2013-01-23 | Sanofi | Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome |
US9006400B2 (en) * | 2011-09-26 | 2015-04-14 | Novartis Ag | Fibroblast growth factor-21-Fc fusion proteins |
AR087973A1 (es) | 2011-10-04 | 2014-04-30 | Lilly Co Eli | Variantes del factor 21 del crecimiento de fibroblastos |
BR112014014898A2 (pt) | 2011-12-22 | 2020-10-27 | Pfizer Inc. | processo para purificar uma amostra de anticorpo h38c2, ou variante do mesmo, e composição compreendendo o referido h38c2 |
US9550830B2 (en) | 2012-02-15 | 2017-01-24 | Novo Nordisk A/S | Antibodies that bind and block triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1) |
US9000127B2 (en) | 2012-02-15 | 2015-04-07 | Novo Nordisk A/S | Antibodies that bind and block triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1) |
EP2814842B1 (en) | 2012-02-15 | 2018-08-22 | Novo Nordisk A/S | Antibodies that bind peptidoglycan recognition protein 1 |
US9475856B2 (en) | 2012-03-02 | 2016-10-25 | New York University | Chimeric FGF21 proteins with enhanced binding affinity for β-klotho for the treatment of type II diabetes, obesity, and related metabolic disorders |
US9474785B2 (en) | 2012-06-07 | 2016-10-25 | New York University | Chimeric fibroblast growth factor 19 proteins and methods of use |
US9464126B2 (en) | 2012-06-07 | 2016-10-11 | New York University | Chimeric fibroblast growth factor 21 proteins and methods of use |
US9657075B2 (en) | 2012-06-07 | 2017-05-23 | New York University | Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use |
EA201492064A1 (ru) | 2012-06-11 | 2015-02-27 | Эли Лилли Энд Компани | Варианты фактора роста фибробластов 21 |
CA2892152A1 (en) | 2012-11-28 | 2014-06-05 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for treatment of metabolic disorders and diseases |
US9290557B2 (en) | 2012-11-28 | 2016-03-22 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides |
CN108888757A (zh) | 2012-12-27 | 2018-11-27 | 恩格姆生物制药公司 | 用于调节胆汁酸体内稳态及治疗胆汁酸紊乱和疾病的方法 |
US9273107B2 (en) | 2012-12-27 | 2016-03-01 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases |
US9550820B2 (en) | 2013-02-22 | 2017-01-24 | New York University | Chimeric fibroblast growth factor 23/fibroblast growth factor 19 proteins and methods of use |
JP6621752B2 (ja) | 2013-10-21 | 2019-12-18 | ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ | 変異した線維芽細胞増殖因子(fgf)1および使用方法 |
WO2015061331A1 (en) | 2013-10-21 | 2015-04-30 | Salk Institute For Biological Studies | Chimeric fibroblast growth factor (fgf) 2/fgf1 peptides and methods of use |
CN105828878A (zh) | 2013-10-28 | 2016-08-03 | 恩格姆生物制药公司 | 癌症模型及相关方法 |
SG11201606018UA (en) | 2014-01-24 | 2016-08-30 | Ngm Biopharmaceuticals Inc | Binding proteins and methods of use thereof |
WO2015183890A2 (en) | 2014-05-28 | 2015-12-03 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the treatment of metabolic disorders and diseases |
WO2015195509A2 (en) | 2014-06-16 | 2015-12-23 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases |
SG11201700250WA (en) | 2014-07-17 | 2017-02-27 | Novo Nordisk As | Site directed mutagenesis of trem-1 antibodies for decreasing viscosity |
US10517929B2 (en) | 2014-10-23 | 2019-12-31 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Pharmaceutical compositions comprising FGF19 variants |
MX2017004947A (es) | 2014-10-24 | 2017-06-29 | Bristol Myers Squibb Co | Polipeptidos del factor de crecimiento de fibroblastos 2 (fgf-21) modificados y usos de los mismos. |
WO2016073855A1 (en) | 2014-11-07 | 2016-05-12 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders |
TWI681966B (zh) | 2014-12-23 | 2020-01-11 | 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 | Fgf21衍生物及其用途 |
WO2016187558A2 (en) | 2015-05-20 | 2016-11-24 | University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Method to improve neurologic outcomes in temperature managed patients |
WO2017019957A2 (en) | 2015-07-29 | 2017-02-02 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Binding proteins and methods of use thereof |
JP2018535964A (ja) | 2015-10-30 | 2018-12-06 | ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ | 線維芽細胞増殖因子(fgf)1アナログによるステロイド誘導性高血糖の処置 |
CA3003616C (en) | 2015-11-09 | 2020-07-28 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods for treatment of bile acid-related disorders |
TW201731867A (zh) | 2015-12-02 | 2017-09-16 | 賽諾菲公司 | Fgf21變異體 |
EP3502143A4 (en) | 2016-08-19 | 2020-07-15 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | BINDING PEPTIDE FOR THE CONSTRUCTION OF A FUSION PROTEIN |
CN106317226B (zh) | 2016-08-19 | 2017-09-05 | 安源医药科技(上海)有限公司 | 用于构建融合蛋白的连接肽 |
CN106279437B (zh) | 2016-08-19 | 2017-10-31 | 安源医药科技(上海)有限公司 | 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 |
WO2018039557A1 (en) | 2016-08-26 | 2018-03-01 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods of treating fibroblast growth factor 19-mediated cancers and tumors |
WO2019051073A1 (en) | 2017-09-08 | 2019-03-14 | Bristol-Myers Squibb Company | MODIFIED FIBROBLAST GROWTH FACTOR 21 (FGF-21) FOR USE IN NON-ALCOHOLIC STÉATOHÉPATITE (NASH) TREATMENT METHODS |
WO2019119673A1 (zh) | 2017-12-19 | 2019-06-27 | 北京吉源生物科技有限公司 | 一种双基因修饰的干细胞及其用途 |
AU2019218147B2 (en) * | 2018-02-08 | 2023-06-08 | Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. | FGF21 variant, fusion protein and application thereof |
JP2021519594A (ja) | 2018-04-02 | 2021-08-12 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーBristol−Myers Squibb Company | 抗trem−1抗体およびその使用 |
CN114903978A (zh) | 2018-07-03 | 2022-08-16 | 百时美施贵宝公司 | Fgf-21配制品 |
US11542309B2 (en) | 2019-07-31 | 2023-01-03 | Salk Institute For Biological Studies | Fibroblast growth factor 1 (FGF1) mutant proteins that selectively activate FGFR1B to reduce blood glucose |
US20220380426A1 (en) * | 2019-11-12 | 2022-12-01 | Technische Universitat Mu | Homogeneous muteins of the human il-27 alpha-subunit |
CN115243725A (zh) | 2020-01-08 | 2022-10-25 | 百时美施贵宝公司 | Fgf-21缀合物配制品 |
WO2021139744A1 (en) | 2020-01-11 | 2021-07-15 | Beijing Ql Biopharmaceutical Co., Ltd. | Conjugates of fusion proteins of glp-1 and fgf21 |
US11981718B2 (en) | 2020-05-27 | 2024-05-14 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation |
JP2023538533A (ja) | 2020-08-07 | 2023-09-08 | ブリストル-マイヤーズ スクイブ カンパニー | 線維症の処置のための、ccr2/5拮抗剤と組み合わせたfgf21 |
US20240123031A1 (en) | 2020-11-25 | 2024-04-18 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of treating liver diseases |
CN113633756A (zh) * | 2021-06-17 | 2021-11-12 | 温州医科大学 | Fgf21温敏缓释载体和基因修饰方法以及其制备方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994026873A1 (en) * | 1993-05-07 | 1994-11-24 | Pharmacia Ab | Yeast strain and methods for expressing heterologous proteins in yeast |
WO1996005224A1 (en) * | 1994-08-12 | 1996-02-22 | Washington University | Single-chain forms of the glycoprotein hormone quartet |
WO2001036640A2 (en) * | 1999-11-18 | 2001-05-25 | Chiron Corporation | Human fgf-21 gene and gene expression products |
WO2003011213A2 (en) * | 2001-07-30 | 2003-02-13 | Eli Lilly And Company | Method for treating diabetes and obesity |
WO2005113606A2 (en) * | 2004-05-13 | 2005-12-01 | Eli Lilly And Company | Fgf-21 fusion proteins |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4334615B2 (ja) * | 1994-08-12 | 2009-09-30 | ワシントン・ユニバーシティ | 糖タンパク質ホルモンカルテットの一本鎖形態 |
US7459540B1 (en) | 1999-09-07 | 2008-12-02 | Amgen Inc. | Fibroblast growth factor-like polypeptides |
AU7368100A (en) | 1999-09-10 | 2001-04-10 | Curagen Corporation | Fibroblast growth factor polypeptide and nucleic acids encoding same |
US6716626B1 (en) | 1999-11-18 | 2004-04-06 | Chiron Corporation | Human FGF-21 nucleic acids |
AU1628101A (en) | 1999-11-22 | 2001-06-04 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Jaffa, a novel fibroblast growth factor family member and uses therefor |
CA2468610A1 (en) | 2002-01-15 | 2003-07-24 | Eli Lilly And Company | Method for reducing morbidity and mortality in critically ill patients |
EP2270163A1 (en) * | 2003-12-10 | 2011-01-05 | Eli Lilly and Company | Muteins of fibroblast growth factor 21 |
-
2005
- 2005-07-26 ES ES05775749T patent/ES2332057T3/es active Active
- 2005-07-26 SI SI200530852T patent/SI1789442T1/sl unknown
- 2005-07-26 EA EA200700533A patent/EA011390B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-07-26 US US11/574,332 patent/US7582607B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-07-26 EP EP08162741A patent/EP2161281A1/en not_active Withdrawn
- 2005-07-26 MX MX2007002616A patent/MX2007002616A/es active IP Right Grant
- 2005-07-26 CA CA002575753A patent/CA2575753A1/en not_active Abandoned
- 2005-07-26 PL PL05775749T patent/PL1789442T3/pl unknown
- 2005-07-26 KR KR1020077004881A patent/KR100854198B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2005-07-26 CN CN2005800294803A patent/CN101010338B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-07-26 JP JP2007529870A patent/JP4809352B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-07-26 DK DK05775749T patent/DK1789442T3/da active
- 2005-07-26 DE DE602005016946T patent/DE602005016946D1/de active Active
- 2005-07-26 PT PT05775749T patent/PT1789442E/pt unknown
- 2005-07-26 WO PCT/US2005/026398 patent/WO2006028595A2/en active Application Filing
- 2005-07-26 AT AT05775749T patent/ATE444307T1/de active
- 2005-07-26 EP EP05775749A patent/EP1789442B1/en active Active
- 2005-07-26 BR BRPI0514790-5A patent/BRPI0514790A/pt not_active IP Right Cessation
- 2005-07-26 AU AU2005283025A patent/AU2005283025B2/en not_active Ceased
-
2007
- 2007-02-26 IL IL181573A patent/IL181573A0/en unknown
- 2007-03-12 NO NO20071327A patent/NO20071327L/no not_active Application Discontinuation
-
2009
- 2009-11-06 HR HR20090597T patent/HRP20090597T1/hr unknown
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994026873A1 (en) * | 1993-05-07 | 1994-11-24 | Pharmacia Ab | Yeast strain and methods for expressing heterologous proteins in yeast |
WO1996005224A1 (en) * | 1994-08-12 | 1996-02-22 | Washington University | Single-chain forms of the glycoprotein hormone quartet |
WO2001036640A2 (en) * | 1999-11-18 | 2001-05-25 | Chiron Corporation | Human fgf-21 gene and gene expression products |
WO2003011213A2 (en) * | 2001-07-30 | 2003-02-13 | Eli Lilly And Company | Method for treating diabetes and obesity |
WO2005113606A2 (en) * | 2004-05-13 | 2005-12-01 | Eli Lilly And Company | Fgf-21 fusion proteins |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
HANSEN J. E. ET AL.: "NETOGLYC: PREDICTION OF MUCIN TYPE O-GLYCOSYLATION SITES BASED ON SEQUENCE CONTEXT AND SURFACE ACCESSIBILITY", GLYCOCONJUGATE JOURNAL, LUND, SE, vol. 15, no. 2, 1998, pages 115-130, XP001024941, ISSN: 0282-0080, the whole document * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20080103096A1 (en) | 2008-05-01 |
JP4809352B2 (ja) | 2011-11-09 |
EP1789442B1 (en) | 2009-09-30 |
JP2008511323A (ja) | 2008-04-17 |
WO2006028595A3 (en) | 2007-01-18 |
EP1789442A2 (en) | 2007-05-30 |
BRPI0514790A (pt) | 2008-06-24 |
AU2005283025A1 (en) | 2006-03-16 |
KR100854198B1 (ko) | 2008-08-26 |
EP2161281A1 (en) | 2010-03-10 |
SI1789442T1 (sl) | 2010-01-29 |
ATE444307T1 (de) | 2009-10-15 |
ES2332057T3 (es) | 2010-01-25 |
IL181573A0 (en) | 2007-07-04 |
PL1789442T3 (pl) | 2010-02-26 |
DE602005016946D1 (de) | 2009-11-12 |
CA2575753A1 (en) | 2006-03-16 |
KR20070050454A (ko) | 2007-05-15 |
AU2005283025B2 (en) | 2011-06-30 |
PT1789442E (pt) | 2009-11-11 |
CN101010338B (zh) | 2011-06-15 |
DK1789442T3 (da) | 2009-11-16 |
MX2007002616A (es) | 2007-05-16 |
EA200700533A1 (ru) | 2007-08-31 |
WO2006028595A2 (en) | 2006-03-16 |
HRP20090597T1 (hr) | 2009-12-31 |
NO20071327L (no) | 2007-05-29 |
CN101010338A (zh) | 2007-08-01 |
US7582607B2 (en) | 2009-09-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EA011390B1 (ru) | Мутантные белки (мутеины) фактора роста фибробластов 21 | |
US7655627B2 (en) | Muteins of fibroblast growth factor 21 | |
US7622445B2 (en) | Muteins of fibroblast growth factor 21 | |
US7576190B2 (en) | FGF-21 fusion proteins | |
JP4477013B2 (ja) | 線維芽細胞成長因子21の突然変異タンパク質 | |
FR2795734A1 (fr) | Conjugues d'erythropoietine,compositons les comprenant et procede pour leur preparation | |
KR20150008137A (ko) | 지속성 옥신토모둘린 변이체 및 이의 생산 방법 | |
KR20150110486A (ko) | 생식샘자극 호르몬 카복시 말단 펩타이드들과 부착하여 폴리펩타이드들의 유체역학적 부피를 증가시키는 방법 | |
HU228478B1 (en) | Erythropoietin conjugates with polyethylenglycol | |
CZ98197A3 (cs) | Použití KGF nebo jeho analogu pro přípravu léčiva pro léčení cukrovky | |
TWI777407B (zh) | 長效型多肽及其生產和給藥的方法 | |
US20190284252A1 (en) | Engineered fgf1 and fgf2 compositions and methods of use thereof | |
AU2019367647A1 (en) | Compositions and methods for biodegrading alcohol | |
CN115916244A (zh) | 用于治疗戊二酸尿症的组合物及其给药方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM BY KZ KG MD TM |
|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AZ TJ RU |