EA011390B1

EA011390B1 - Мутантные белки (мутеины) фактора роста фибробластов 21

Info

Publication number: EA011390B1
Application number: EA200700533A
Authority: EA
Inventors: Кристофер Карл Фрай; Лихуа Хуан; Радмила Миканович
Original assignee: Эли Лилли Энд Компани
Priority date: 2004-09-02
Filing date: 2005-07-26
Publication date: 2009-02-27
Also published as: US20080103096A1; JP4809352B2; EP1789442B1; JP2008511323A; WO2006028595A3; EP1789442A2; BRPI0514790A; AU2005283025A1; KR100854198B1; EP2161281A1; SI1789442T1; ATE444307T1; ES2332057T3; IL181573A0; PL1789442T3; DE602005016946D1; CA2575753A1; KR20070050454A; AU2005283025B2; PT1789442E

Abstract

Данное изобретение относится к новым мутеинам человеческого фактора роста фибробластов 21 со сниженной способностью к О-гликозилированию при экспрессии в дрожжах в сравнении с человеческим FGF-21 дикого типа. Раскрыты варианты белка и соответствующей кодирующей нуклеиновой кислоты. Изобретение также включает векторы и клетки-хозяева для размножения указанных последовательностей нуклеиновых кислот и получения указанных мутеинов. Кроме того, раскрыты способы лечения диабета 2 типа, ожирения или метаболического синдрома.

Description

Данное изобретение относится к идентификации новых мутантных белков (мутеинов) фактора роста фибробластов 21, которые обладают сниженным О-связанным гликозилированием при экспрессии в дрожжах.

Уровень техники

Факторы роста фибробластов представляют собой полипептиды большого размера, которые широко экспрессируются в растущих и взрослых тканях (Вайб с1 а1., Сапсег Се11к, 3: 239-243, 1991) и играют критическую роль в многочисленных физиологических функциях, включая ангиогенез, митогенез, образование шаблонов, дифференциацию клеток, метаболическое регулирование и восстановление повреждения ткани (МсКеейап е1 а1., Ргод. Ыис1е1с Ас1б Век. Мо1. Βίο1. 59: 135-176, 1998). В соответствии с опубликованными данными, семейство РОР в настоящее время состоит по меньшей мере из двадцати трех членов, от РОР-1 до РОР-23 (Веикк е! а1., Се11 Т1ккие Век. 313: 139-157 (2003)).

Сообщалось, что факторы роста фибробластов 21 (РОР-21) предпочтительно экспрессируются в печени (Νίκΐιίιηιιπι е! а1., ВюсЫтка е! Вюрйукка Ас!а, 1492: 203-206, 2000; \УО 01/36640 и \УО 01/18172) и описаны в качестве средства для лечения ишемического заболевания сосудов, заживления ран и заболеваний, связанных со снижением клеточной функции легких, бронхов или альвеол и множеством других нарушений. Позже было показано, что РОР-21 стимулирует захват глюкозы адипоцитами мыши 3Т3-Б1 после длительной обработки (72 ч) в присутствии и в отсутствие инсулина, а также уменьшает уровень глюкозы, триглицеридов и глюкагона в крови натощак и после приема пищи у мышей оЬ/оЬ и бЬ/бЬ и у крыс ΖΩΕ в возрасте 8 недель зависимым от дозы образом, таким образом, обеспечивая основу для применения РОР-21 в качестве терапии для лечения диабета и ожирения (\УО 03/011213).

Развитие технологии рекомбинантной ДНК делает возможным получение чужеродных продуктов, таких как мутеины РОР-21 в клетках-хозяевах, в которые введены экзогенные последовательности ДНК, кодирующие такие продукты. Преимущество такой технологии состоит в том, что продукты могут быть получены с высокими выходами, в высокоочищенной форме, с низким риском загрязнения, такого как вирусное загрязнение. Такие рекомбинантные технологии широко применяются для получения рекомбинатных белков в прокариотных, а также эукариотических клетках-хозяевах.

Однако получение рекомбинантных продуктов в больших масштабах с помощью таких технологий по-прежнему ограничено из-за проблем с эффективностью экспрессии таких экзогенных последовательностей ДНК, а также из-за нестабильности вектора и внутриклеточного разложения рекомбинантных продуктов клетками-хозяевами, в которых они вырабатываются. Кроме того, рекомбинантные продукты часто отличаются от своих природных аналогов. Например, рекомбинантные продукты, продуцируемые в гетерологичных эукариотических хозяевах, обычно отличаются от их природного аналога по степени гликозилирования. Это может происходить за счет присутствия (по сравнению с отсутствием) любой углеводной структуры, расположения указанной углеводной структуры в продукте, а также природы углевода. Более конкретно, было показано, что рекомбинантные продукты, полученные в дрожжах, часто несут дополнительные неприродные О-гликаны в сравнении с их природным аналогом (Уап беп §!ееп, е! а1., Стй. Ве\зе\\'к шВюсйет. апб Мо1е. Вю1. 33(3): 151-208, 1998).

Данное изобретение решает задачу аномального О-гликозилирования, связанного с полученными в дрожжах рекомбинантными белками, путем обеспечения РОР-21 мутеинов, которые обладают сниженной степенью О-гликозилирования в сравнении с РОР-21 дикого типа при экспрессии в дрожжах. Авторами было обнаружено, что мутеины РОР-21 со сниженным О-гликозилированием могут быть получены в условиях промышленного ферментирования и могут сохранять биологическую активность, необходимую для того, чтобы быть пригодными для лечения пациентов с нарушениями, включающими, но не ограничиваясь ими, диабет II типа, ожирение и метаболический синдром.

Сущность изобретения

В первом варианте осуществления данное изобретение предлагает мутеины человеческого РОР-21 или его биологически активный пептид, который включает замену любой аминокислотой, за исключением 8ет или Т1г для 8ет 167, где нумерация аминокислот основана на 8ЕО Ш NО:1 и где указанный мутеин обладает сниженной способностью к О-гликозилированию при экспрессии в дрожжах в сравнении с человеческим РОР-21 дикого типа.

Второй вариант осуществления данного изобретения предлагает мутеины человеческого РОР-21 или его биологически активный пептид, который включает замену любой аминокислотой, за исключением 8ет или Т1г для 8ет 167, в сочетании с заменой цистеином для двух или более из следующего: аргинин 19, тирозин 20, лейцин 21, тирозин 22, треонин 23, аспартат 24, аспартат 25, аланин 26, глутамин 27, глутамин 28, аланин 31, лейцин 33, изолейцин 35, лейцин 37, валин 41, глицин 42, глицин 43, глутамат 50, глутамин 54, лейцин 58, валин 62, лейцин 66, глицин 67, лизин 69, аргинин 72, фенилаланин 73, глутамин 76, аргинин 77, аспартат 79, глицин 80, аланин 81, лейцин 82, глицин 84, серин 85, пролин 90, аланин 92, серин 94, фенилаланин 95, лейцин 100, аспартат 102, тирозин 104, тирозин 107, серин 10 9, глутамат 110, пролин 115, гистидин 117, лейцин 118, пролин 119, аспарагин 121, лизин 122, серин 123, пролин 124, гистидин 125, аргинин 126, аспартат 127, аланин 129, пролин 130, глицин 132, аланин 134, аргинин 135,

- 1 011390 лейцин 137, пролин 138 или лейцин 139, где нумерация аминокислот основана на 8ЕР ГО N0:1 и где указанный мутеин обладает сниженной способностью к О-гликозилированию при экспрессии в дрожжах в сравнении с человеческим ЕОЕ-21 дикого типа.

Третий вариант осуществления данного изобретения предлагает мутеины человеческого ТОЕ-21 или его биологически активный пептид, который включает замену любой аминокислотой, за исключением 8ег или ТЬг для 8ег 167 в сочетании с заменой заряженной и/или полярной, но незаряженной аминокислотой для одной или нескольких аминокислот в положениях: глицин 42, глутамин 54, аргинин 77, аланин 81, лейцин 86, фенилаланин 88, лизин 122, гистидин 125, аргинин 126, пролин 130, аргинин 131, лейцин 139, аланин 145, лейцин 146, изолейцин 152; аланин 154; глутамин 156, глицин 161, серин 163, глицин 170 или серин 172, где нумерация аминокислот основана на 8ЕО ГО N0:1 и где указанный мутеин обладает сниженной способностью к 0-гликозилированию при экспрессии в дрожжах в сравнении с человеческим ТОТ-21 дикого типа.

Другие варианты осуществления представляют собой полинуклеотиды, кодирующие мутеины по первому, второму и третьему вариантам осуществления, вектор, содержащий указанные полинуклеотиды и клетку-хозяин, несущую указанный вектор. Другой вариант осуществления представляет собой способы получения полипептида, с получением клеток, способных продуцировать указанный полипептид, с получением вектора, содержащего ДНК, кодирующую указанный полипептид.

Еще один вариант осуществления представляет собой способы лечения пациента, имеющего одно или несколько из следующих состояний: ожирение, диабет II типа, инсулинорезистентность, гиперинсулинемию, непереносимость глюкозы, гипергликемию или метаболический синдром, включающие введение указанному пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества мутеина человеческого ЕОЕ-21 по первому, второму или третьему варианту осуществления изобретения.

Подробное описание изобретения

Для целей данного изобретения, как раскрыто и заявлено в данном описании, следующие термины используются в таком значении, как определено ниже.

Человеческий ЕОЕ-21 представляет собой полипептид из 208 аминокислот, содержащий лидерную последовательность, которая состоит из 27 аминокислот. Человеческий ЕОЕ-21 имеет ~79% идентичность аминокислот с мышиным ЕОЕ-21 и ~80% идентичность аминокислот с крысиным ЕОЕ-21. Человеческий ЕОЕ-21 представляет собой предпочтительный шаблон полипептида для мутеинов по данному изобретению, но признано, что специалист в данной области может легко получить мутеины на основе альтернативной последовательности полипептида млекопитающих ЕОЕ-21.

Положения аминокислот в мутеинах по данному изобретению определены на основе зрелого чело-

веческого полипептида ЕОЕ-21, 1

состоящего из 181 аминокислот, как показано ниже (8ЕР ГО N0:1):

10

20

ΗΪ5

Рго

Не

Рго

Азр

Зег

Рго

Ьеи

Ьеи 30

С1п

РНе

СИу

О1п

Уа1

Агд

С1п

Агд

Туг 40

Ьеи

Туг

ТЬг

Азр

А1а

С1п

ТЬг

С1и 50

А1а

ΗΪ8

Ьеи

С1и

Не

Агд

С1и

Азр

СИу

ТЬг 60

Уа!

СИу

А1а

Азр

<31п

Зег

Рго

С1и 70

Зег

Ьеи

С1п

Ьеи

Ьуз

А1а

Ьеи

Ьуз

Рго 80

61у

Уа1

Не

С1п

Не

Ьеи

СИу

Уа1

Ьуз

ТНг 90

8ег

Агд

РЬе

Ьеи

Суз

С1п

Агд

Рго

Азр

С1у 100

А1а

Ьеи

Туг

О1у

Зег

Ьеи

Н18

РЬе

Азр

Рго 110

С1и

А1а

Суз

Зег

РЬе

Агд

С1и

Ьеи

Ьеи 120

С1и

Азр

С1у

Туг

Азп

Уа1

Туг

С1п

Зег

С1и 130

А1а

Н15

О1у

Ьеи

Рго

Ьеи

Н18

Ьеи

Рго

СИу 140

Азл

Ьуз

8ег

Рго

Н18

Агд

Азр

Рго

А1а

Рго 150

Агд

СИу

Рго

А1а

Агд

РЬе

Ьеи

Рго

Ьеи

Рго 160

С1у

Ьеи

Рго

А1а

Ьеи

Рго

С1и

Рго

Рго 170

О1у

Не

Ьеи

А1а

Рго

С1п

Рго

Азр

Уа1 180

СИу

Зег

8ег

Азр

Рго

Ьеи

Зег

Ме(

Уа1

СИу

Рго

Зег

С1п

СИу

Агд

Зег

Рго

Зег

Туг

А1а

Зег

Соответствующая последовательность ДНК, кодирующая зрелый человеческий полипептид ЕОЕ21, состоящий из 181 аминокислоты, представляет собой (8ЕР ГО N0:2):

САССССАТСССТСАСТССАСТССТСТССТССААТТСССС0СССААСТССС6СА6С6СТАССТСТАСА

СА0АТСАТССССАССАСАСАСАА6СССАССТ0САСАТСАСС0А66АТаССАСССТС00С6СС6СТ

ССТСАССАСА0СССС6АААСТСТССТ6СА6СТ0ААА0ССТТ6ААССС600А6ТТАТТСАААТСТТ0

00А0ТСАА0АСАТССА06ТТССТ0Т0ССАСС00ССАСАТС0СССССТ0ТАТС6АТС6СТССАСТТТ

САСССТСАООССТССАССТТСССООАССТОСТТСТГСАОбАСССАТАСААТСТТТАССАОТСССАА

ССССАСС6ССТССС0СТ6САССТаССА6Ц0ААСАА6ТССССАСАССОООАСССТОСАССССОАООА

ССАОСТСОСТТССТ6ССАСТАССАООССТСССССССОСАСТСССООАСССАСССООААТССТООССС

СССА0СССССС0АТ0Т6С0СТССТС00АСССТСТ0А0САТ00ТС06АССТТСССА000СС0АА0СС

ССАОСТАСССТТСС

Аминокислоты идентифицируют с использованием трехбуквенного кода или альтернативно обо- 2 011390 значают с использованием стандартного однобуквенного кода. Мутации обозначают трехбуквенным кодом для исходной аминокислоты, с последующим номером аминокислоты, с последующим трехбуквенным кодом заменяющей аминокислоты. Численные обозначения каждого мутеина основаны на последовательности из 181 аминокислоты зрелого человеческого ЕСЕ-21 дикого типа. Например, замена серина в положении 167 (т.е. 8ег167) неполярной/гидрофобной аминокислотой, аланином (А1а), обозначается как 8ет167А1а или 8167А. Подобным образом, двойная замена лейцина в положении 118 и аланина в положении 134 (Ьеи118, А1а134) серосодержащей аминокислотой, цистеином (Сук) обозначается как Ееи118Сук/А1а134Сук или Ш18С/А134С.

Термин «аминокислота» в данном описании используется в самом широком смысле и включает природные аминокислоты, а также неприродные аминокислоты, включая аналоги и производные аминокислот. Последние включают молекулы, содержащие аминокислотный фрагмент. Специалист в данной области будет понимать, с точки зрения данного широкого определения, что ссылка на аминокислоту в данном описании включает, например, природные протеогенные Ь-аминокислоты; Ό-аминокислоты; химически модифицированные аминокислоты, такие как аналоги и производные аминокислот; природные непротеогенные аминокислоты, такие как норлейцин, β-аланин, орнитин и т.д.; а также химически синтезированные соединения, обладающие свойствами, которые известны из уровня техники как характерные для аминокислот.

Мутеин человеческого ЕСЕ-21 определяется как содержащий человеческий ЕСЕ-21, в котором по меньшей мере одна аминокислота в зрелом белке дикого типа замещена другой аминокислотой. Примеры мутеинов ЕСЕ-21 описаны в патентной заявке США 60/528582, которая включена в качестве ссылки. В целом, мутеин обладает некоторым модифицированным свойством, структурным или функциональным, белка дикого типа. Например, мутеин может обладать усиленной или улучшенной физической стабильностью в концентрированных растворах (например, меньшей степенью гидрофобно опосредованной агрегации) при сохранении благоприятного профиля биологической активности. Мутеин может обладать повышенной совместимостью с фармацевтическими консервантами (например, м-крезол, фенол, бензиловый спирт), таким образом, делая возможным приготовление фармацевтического препарата с консервантами, который сохраняет физико-химические свойства и биологическую активность белка в процессе хранения. Мутеин может обладать сниженной степенью О-гликозилирования при экспрессии в дрожжах. Такое О-гликозилирование может вводить новые иммунологические детерминанты в белок и может, таким образом, быть антигенным при введении людям; может изменять фармакокинетические свойства белка и/или влиять на биологическую активность белка. Соответственно, дрожжи продуцируют мутеины со сниженной степенью О-гликозилирования в сравнении с диким типом ЕСЕ-21, которые являются менее иммуногенными и обладают благоприятным фармакокинетическим профилем, при сохранении биологической активности. В данном описании указанные термины не являются ограничивающими и вполне возможно, что данный мутеин обладает одним или несколькими модифицированными свойствами белка дикого типа.

«Терапевтически эффективное количество» представляет собой минимальное количество активного агента, необходимое для достижения терапевтического эффекта у пациента. Например, «терапевтически эффективное количество» для пациента, который страдает или склонен к возникновению, а также для предупреждения диабета II типа, ожирения или метаболического синдрома представляет собой такое количество, которое вызывает, облегчает или другим способом вызывает улучшение патологических симптомов, прогрессирования заболевания, физиологических состояний, связанных с ними, или устойчивость к упомянутым выше расстройствам. Для целей данного изобретения «субъект» или «пациент» предпочтительно является человеком.

Диабет II типа характеризуется избыточным содержанием глюкозы в крови, несмотря на доступность инсулина, причем уровни глюкозы в кровотоке остаются чрезмерно высокими в результате неадекватного клиренса глюкозы.

Непереносимость глюкозы может быть определена как избыточная чувствительность к глюкозе.

Гипергликемия определяется как избыточный уровень сахара (глюкозы) в крови.

Гипогликемия, которую также называют низким уровнем сахара в крови, возникает, когда уровень глюкозы в крови падает слишком низко для того, чтобы обеспечить достаточно энергии для функционирования организма.

Гиперинсулинемия определяется как уровень инсулина в крови выше нормы.

Инсулинорезистентность определяется как состояние, при котором нормальное количество инсулина приводит к субнормальной (ниже нормы) биологической реакции.

Ожирение, применительно к человеку, может быть определено как масса тела, которая на 20% и больше превышает идеальную массу тела для данной популяции (КН. ХУПйатк. ТехЛоок οί Еибосгшо1оду, 1974, р. 904-916).

Метаболический синдром может быть определен как совокупность по меньшей мере трех из следующих признаков: жировые отложения в области живота - у большинства мужчин, объем талии 40 дюймов или больше; высокий уровень сахара в крови - по меньшей мере 110 миллиграммов на децилитр (мг/дл) натощак; высокий уровень триглицеридов - по меньшей мере 150 мг/дл в кровотоке; низкий уро

- 3 011390 вень липопротеидов высокой плотности (НОЬ) - менее 40 мг/дл; а также артериальное давление 130/85 или выше.

Данное изобретение обеспечивает гликозилированные мутеины, в которых количество и/или вид сайтов гликозилирования изменены в сравнении с природным ЕСЕ-21. Один такой вариант включает мутеины ЕСЕ-21, которые включают меньшее количество О-связанных сайтов гликозилирования. Не существует консенсусной последовательности аминокислот для идентификации сайтов О-связанного гликозилирования, что делает такую идентификацию трудной задачей. В норме О-связанное гликозилирование происходит в боковой цепи остатка серина или треонина. Как только идентифицирован сайт Освязанного гликозилирования, замены аминокислот для удаления данной последовательности могут удалять существующую О-связанную углеводную цепь. Сайты О-связанного гликозилирования, идентифицированные в данном изобретении, включают 8ег163. 8ег164, 8ег167, 8ег172 и 8ег176. Основным сайтом О-гликозилирования является 8ег167. Авторами было обнаружено, что удаление сайта 8ег167 ведет к значительному уменьшению О-гликозилирования экспрессированного дрожжами мутеина. Хотя 8ег167 представляет собой предпочтительный сайт мутации для устранения О-гликозилирования, мутации в других сайтах О-гликозилирования человеческого ЕСЕ-21 (8ег163, 8ег164, 8ег172 и 8ег176) находятся в рамках данного изобретения.

Следовательно, в первом предпочтительном варианте осуществления данное изобретение предлагает мутеины человеческого ЕСЕ-21 или его биологически активный пептид, который включает замену любой аминокислотой, за исключением 8ег или ТЬг для 8ег 167, где нумерация аминокислот основана на 8ЕО ΙΌ N0:1 и где указанный мутеин обладает сниженной способностью к О-гликозилированию при экспрессии в дрожжах в сравнении с человеческим ЕСЕ-21 дикого типа. Предпочтительные мутеины по первому варианту представляют собой 8ег167А1а, 8ег167С1и, 8ег167А§р, 8ег167А§и, 8ег167С1и, 8ег167С1у, 8ег167Уа1, 8ег167Нк, 8ег167Ьу5 и 8ег167Туг.

Второй вариант осуществления данного изобретения предлагает мутеины человеческого ЕСЕ-21 или его биологически активный пептид, который включает замену любой аминокислотой, за исключением 8ег или ТЬг для 8ег167, в сочетании с заменой цистеином для двух или более из следующего: аргинин 19, тирозин 20, лейцин 21, тирозин 22, треонин 23, аспартат 24, аспартат 25, аланин 26, глутамин 27, глутамин 28, аланин 31, лейцин 33, изолейцин 35, лейцин 37, валин 41, глицин 42, глицин 43, глутамат 50, глутамин 54, лейцин 58, валин 62, лейцин 66, глицин 67, лизин 69, аргинин 72, фенилаланин 73, глутамин 76, аргинин 77, аспартат 79, глицин 80, аланин 81, лейцин 82, глицин 84, серин 85, пролин 90, аланин 92, серин 94, фенилаланин 95, лейцин 100, аспартат 102, тирозин 104, тирозин 107, серин 109, глутамат 110, пролин 115, гистидин 117, лейцин 118, пролин 119, аспарагин 121, лизин 122, серин 123, пролин 124, гистидин 125, аргинин 126, аспартат 127, аланин 129, пролин 130, глицин 132, аланин 134, аргинин 135, лейцин 137, пролин 138 или лейцин 139, где нумерация аминокислот основана на 8ЕО ΙΌ N0:1 и где указанный мутеин обладает сниженной способностью к О-гликозилированию при экспрессии в дрожжах в сравнении с человеческим ЕСЕ-21 дикого типа. Предпочтительно, фраза «два или более» означает замещение цистеином для 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 остатков аминокислот в указанных выше положениях. Более предпочтительно, она означает замещение цистеином для 2 или 4 остатков аминокислот в указанных выше положениях.

Специалист в данной области также будет понимать, что природные цистеины, цистеин 75 и цистеин 93, также могут быть использованы как локусы (местоположения) для введения новой дисульфидной связи, которая может обеспечивать улучшенные свойства. Конкретно, предусматривается введение замены цистеином серина 85 или фенилаланина 73, в сочетании с одновременной заменой в положении цистеина 93 или цистеина 75, соответственно, где последние сайты заменены любой другой аминокислотой.

Мутеины ЕСЕ-21 с введенными дисульфидными связями, кроме природной связи в положении Су875-Су§93, описаны в патентной заявке США 60/528582. Наиболее предпочтительные мутеины по второму варианту осуществления представляют собой Ьеи118Су8-А1а134Су5-8ег167А1а; Ьеи21Су8Ьеи33Су5-8ег167А1а; А1а26Су5-Еу5122Су5-8ег167А1а или Ееи21Су8-Ееи33Су8/Ееи118Су5-А1а134Су88ег167А1а.

Третий вариант осуществления данного изобретения предлагает мутеины человеческого ЕСЕ-21 или его биологически активный пептид, который включает замену любой аминокислоты, за исключением 8ег или ТЬг для 8ег 167 в сочетании с заменой заряженной и/или полярной, но незаряженной амино кислотой для одной или более аминокислот в положениях: глицин 42, глутамин 54, аргинин 77, аланин 81, лейцин 86, фенилаланин 88, лизин 122, гистидин 125, аргинин 126, пролин 130, аргинин 131, лейцин 139, аланин 145, лейцин 146, изолейцин 152, аланин 154, глутамин 156, глицин 161, серин 163, глицин 170 или серин 172, где нумерация аминокислот основана на 8ЕО ΙΌ N0:1 и где указанный мутеин обладает сниженной способностью к О-гликозилированию при экспрессии в дрожжах в сравнении с человеческим ЕСЕ-21 дикого типа.

Заряженная аминокислота определяется как положительно или отрицательно заряженная аминокислота. Определение положительно заряженной аминокислоты включает гистидин, лизин, аргинин, а также их не встречающиеся в природе аналоги (например, гамма-аминомасляная кислота, орнитин и т.д.). Определение отрицательно заряженной аминокислоты включает аспартат, глутамат, а также их не

- 4 011390 встречающиеся в природе аналоги (например, аминоадипиновая кислота). Определение полярной, но не заряженной аминокислоты включает серин, треонин, аспарагин, глутамин, а также их не встречающиеся в природе аналоги. Предпочтительные мутеины по третьему варианту осуществления представляют собой

С1п54С1и-Зег167А1а,

Ьеи139О1и-Зег1б7А1а,

Зег167А1а,

Последующие варианты осуществления данного изобретения предлагают мутеины человеческого БОБ-21 или его биологически активный пептид, которые включают комбинацию первого варианта осуществления по данному изобретению, второго варианта осуществления по данному изобретению и третьего варианта осуществления по данному изобретению, где указанные мутеины обладают сниженной способностью к О-гликозилированию при экспрессии в дрожжах в сравнении с человеческим БОБ21 дикого типа.

Хотя варианты осуществления по данному изобретению касаются мутеинов БОБ-21 со сниженной способностью к О-гликозилированию при экспрессии в дрожжах в сравнении с человеческим БОБ-21 дикого типа, сохранение биологической активности мутеинов в сравнении с БОБ-21 дикого типа также представляет собой важный фактор для рассмотрения.

Биологическая активность мутеинов по данному изобретению определяется по способности мутеинов влиять на потребление глюкозы, что демонстрируется анализом ΐπ νΐΐΓΟ на клетках 3Т3-Б1 (пример 2), и/или снижать уровни глюкозы в плазме, а также уровни триглицеридов в плазме, что демонстрируется анализом ΐπ νίνο на мышах оЬ/оЬ (пример 3).

Мутеины БОБ-21, вводимые в соответствии с данным изобретением, могут быть созданы и/или выделены любыми средствами, известными из уровня техники. Наиболее предпочтительным способом получения мутеина является получение с помощью методологий рекомбинантных ДНК, которые хорошо известны специалистам в данной области. Такие способы описаны в Сиггеп! Рго!осо1§ ΐπ Мо1еси1аг Βΐοΐоду (4оКп ^11еу & 8оп§, 1пс.), которая включена в данное описание путем ссылки.

Кроме того, предпочтительные варианты осуществления включают биологически активный пептид, происходящий из мутеина, раскрытого в данном описании, причем такой пептид будет содержать по меньшей мере одну из описанных замен, будет проявлять сниженную способность к Огликозилированию в сравнении с соответствующим немутантным пептидом, и также будет обладать биологической активностью. Такая биологическая активность определяется по способности пептида влиять на потребление глюкозы, что демонстрируется анализом ΐη νΐΐΐΌ на клетках 3Т3-Б1 (пример 2), и/или снижать уровни глюкозы в плазме, а также уровни триглицеридов в плазме, что демонстрируется анализом ΐη νί\·Ό на мышах оЬ/оЬ (пример 3). Пептид может быть получен любыми средствами, известными специалисту в данной области, примеры которых включают, не ограничиваясь ими, ферментативное расщепление, химический синтез или методики рекомбинантной ДНК.

Из уровня техники известно, что фрагменты пептидов некоторых факторов роста фибробластов являются биологически активными. См., например, Ванд е! а1., Ргос. Ыа11. Асаб. 8ст (И8А) 85: 2324-2328 (1988), и I. Се11. Рйу§. 8ирр1. 5: 101-106 (1987). Например, известно, что дипептидилпептидаза IV (ΌΡΡIV) представляет собой протеазу серинового типа, которая принимает участие в инактивации нейропептидов, эндокринных пептидов и цитокинов (Патте е! а1. Сйет. 1ттипо1. 72: 42-56, (1999)). Ν-конец БОБ-21 (НщРгоБеРго) содержит два дипептида, которые потенциально могут быть субстратами для ΌΡΡIV, что приводит к образованию фрагмента БОБ-21, укороченного на Ν-конце (отсечен фрагмент до 4 аминокислот). Неожиданно данный фрагмент дикого типа БОБ-21 продемонстрировал способность сохранять биологическую активность (табл. 1), и таким образом, мутеины по данному изобретению укорочены на Ν-конце (отсечен фрагмент до 4 аминокислот) в сочетании с заменами аминокислот по любому из вариантов осуществления данного изобретения. Кроме того, авторами было обнаружено, что отсечение 5 или более аминокислот на Ν-конце отрицательно влияет на биологическую активность.

Данное изобретение также охватывает полинуклеотиды, кодирующие описанные выше мутеины, которые могут быть в форме РНК или в форме ДНК, причем ДНК включает кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной. Кодирующие последовательности, которые кодируют мутеины по данному изобретению, могут варьировать в результате избыточности или вырожденности генетического кода.

Полинуклеотиды, которые кодируют мутеины по данному изобретению, могут включать следующее: только кодирующая последовательность для мутеина, кодирующая последовательность для мутеина и дополнительная кодирующая последовательность, например, для функционального полипептида, или лидерная или секреторная последовательность или последовательность пробелка; кодирующая последовательность для мутеина и не кодирующая последовательность, например, интроны или не кодирующая последовательность 5' и/или 3' кодирующей последовательности для мутеина. Таким образом, термин «полинуклеотид, кодирующий мутеин» охватывает полинуклеотид, который может включать не только

- 5 011390 кодирующую последовательность для мутеина, но также полинуклеотид, который включает дополнительную кодирующую и/или не кодирующую последовательность.

Данное изобретение дополнительно относится к вариантам описанных полинуклеотидов, которые кодируют фрагменты, аналоги и производные полипептида, содержащие указанные замены. Вариант полинуклеотида может представлять собой встречающийся в природе аллельный вариант человеческой последовательности ЕСЕ-21, не встречающийся в природе вариант или укороченный вариант, как описано выше. Таким образом, данное изобретение также включает полинуклеотиды, кодирующие описанные выше мутеины, а также варианты таких полинуклеотидов, причем варианты кодируют фрагмент, производное или аналог раскрытого мутеина, которые демонстрирует сниженную способность к Огликозилированию в сравнении с соответствующим немутантным фрагментом, производным или аналогом. Такие нуклеотидные варианты включают варианты делеции, варианты замены, укороченные варианты, а также варианты добавления или вставки, до тех пор, пока присутствует по меньшей мере одна из указанных замен аминокислот по первому, второму или третьему варианту осуществления.

Полинуклеотиды по данному изобретению будут экспрессироваться в клетке-хозяине после того, как последовательности будут функционально присоединены к последовательности, контролирующей экспрессию. Такие вектора экспрессии обычно способны к репликации в организмах-хозяевах в виде эписом или в виде интегральной части хромосомной ДНК хозяина. Обычно векторы экспрессии будут содержать маркеры селекции, например, тетрациклин, неомицин и дигидрофолатредуктазу для выявления клеток, трансформированных с помощью желаемых последовательностей ДНК. Предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой грибковую или дрожжевую клетку.

Дрожжевые клетки, которые используются для экспрессии мутеинов по данному изобретению, включают Рю1иа ракЮпк, 8ассйаготусек сегеу1к1ае, 8с1ихокасс11аготусек ротйе и Рю1иа аидик!. Дрожжевые клетки-хозяева содержат подходящие векторы с контролирующими экспрессию последовательностями, такими как промоторы, включая 3-фосфоглицераткиназу или другие гликолитические ферменты и начало репликации, последовательности терминации и т.п., по желанию.

Предпочтительный дрожжевой хозяин по данному изобретению представляет собой Рю1иа ракйэпк, в котором вектор экспрессии интегрирован в хромосомную ДНК хозяина. АкрегдШик шдег, Тпсйобегша гееке1 и 8сЫхорНу11ит соттипе представляют собой примеры грибковых хозяев, хотя другие также могут использоваться, по выбору.

Векторы, содержащие желаемые полинуклеотидные последовательности (например, мутеины ЕСЕ21 и контролирующие экспрессию последовательности), могут быть перенесены в клетку-хозяин с помощью хорошо известных способов, которые варьируют в зависимости от вида клетки-хозяина. Например, трансфекция с хлоридом кальция обычно используется в случае прокариотных клеток, тогда как обработка кальция фосфатом или электропорация могут использоваться в случае других клеток-хозяев.

Могут применяться различные способы очистки белка, и такие способы известны из уровня техники и описаны, например, в ПеШксйег, МеШобк ίη Епхуто1оду 182: 83-9 (1990) и 8сорек, Рго!ет Рипйсайоп: Рппар1ек апб Ргасйсе, 8рппдег-Уег1ад, ΝΥ (1982). Выбранная(ые) стадия(и) очистки будут зависеть, например, от характера способа получения, который используется для мутеинов ЕСЕ-21.

Композиции, содержащие мутеин ЕСЕ-21, должны разрабатываться и вводиться способом, который согласуется с надлежащей медицинской практикой, принимая во внимание клиническое состояние пациента, место доставки композиции мутеина ЕСЕ-21, способ введения, схему введения, а также другие факторы, известные практикующим специалистам. «Терапевтически эффективное количество» мутеина ЕСЕ-21 для целей данного описания, таким образом, определяется указанными соображениями.

Фармацевтические композиции мутеинов ЕСЕ-21 по данному изобретению могут вводиться любым известным из уровня техники способом, который достигает общей поставленной цели в лечении диабета II типа, ожирения или метаболического синдрома. Предпочтительным способом введения является парентеральный, который в данном описании определяется как включающий внутривенную, внутримышечную, внутрибрюшинную, внутригрудинную, подкожную и внутрисуставную инъекцию и инфузию. Вводимые дозы будут зависеть от возраста, состояния здоровья и массы тела реципиента, вида сопутствующего лечения, если оно проводится, частоты введения препарата, а также природы желаемого эффекта. Композиции в рамках изобретения включают все композиции, где присутствует мутеин ЕСЕ-21 в количестве, эффективном для достижения желаемого медицинского эффекта для лечения диабета II типа, ожирения или метаболического синдрома. Поскольку индивидуальные потребности могут варьировать от одного пациента к другому, определение оптимальных интервалов эффективных количеств всех компонентов находится в рамках навыков среднего клинициста.

Мутеины ЕСЕ-21 по данному изобретению могут быть введены в препарат в соответствии с известными способами приготовления полезных с фармацевтической точки зрения композиций. Желаемым препаратом будет такой, который представляет собой стабильный лиофилизированный продукт, который разбавляют соответствующим разбавителем, или водный раствор высокой чистоты, необязательно с фармацевтически приемлемыми носителями, консервантами, вспомогательными веществами или стабилизаторами [Веттд1оп'к Рйагтасеийса1 8аепсек 16Ш ебШоп (1980)]. Мутеины по данному изобретению могут сочетаться с фармацевтически приемлемым буфером, и рН может корректироваться для обеспече

- 6 011390 ния приемлемой стабильности и значения рН, приемлемого для введения. Более того, мутеины по данному изобретению могут быть помещены в контейнер, выбранный из группы, которая состоит из флакона, картриджа, шприц-ручки, шприца, капельницы для внутривенного введения и бутыли для внутривенного введения, где контейнер представляет собой однодозовый контейнер.

Для парентерального введения мутеины БСБ-21 вводят в препараты, обычно путем смешивания одного или более мутеинов с желательной степенью чистоты, в однодозовой инъекционной форме (раствор, суспензия или эмульсия) с фармацевтически приемлемым носителем, т.е. нетоксичным для реципиента, в дозах и концентрациях, которые совместимы с другими ингредиентами препарата. Предпочтительно, может добавляться один или более фармацевтически приемлемых антимикробных агентов. Фенол, м-крезол и бензиловый спирт являются предпочтительными фармацевтически приемлемыми антимикробными агентами.

Необязательно, одна или более фармацевтически приемлемых солей могут добавляться для коррекции ионной силы или тоничности. Одно или более вспомогательных веществ могут добавляться для дальнейшей коррекции изотоничности препарата. Глицерин, хлорид натрия и маннит представляют собой примеры вспомогательных веществ для коррекции изотоничности.

Специалисты в данной области могут легко оптимизировать фармацевтически эффективные дозы и схемы введения лечебных композиций, которые включают мутеин РОР-21, что определяется в соответствии с надлежащей медицинской практикой и клиническим состоянием отдельного пациента. Надлежащая доза мутеина РОР-21 для введения будет приводить к снижению уровней глюкозы и повышению расхода энергии путем более быстрой и более эффективной утилизации глюкозы, и, таким образом, будет полезной для лечения диабета II типа, ожирения и метаболического синдрома.

Кроме того, РОР-21 не вызывает гипогликемии у тощих крыс ΖΌΡ по сравнению с крысами, которым вводили инсулин (\УО 03/011213). Эти данные показывают, что РОР-21 оказывает влияние на уровни глюкозы в плазме инсулинзависимым образом, указывая на то, что мутеины РОР-21 по данному изобретению также могут быть полезными в лечении диабета I типа.

В другом аспекте данного изобретения мутеины человеческого РОР-21, описанные в данном описании, или его биологически активный пептид применяются в качестве лекарственного средства.

Еще в одном аспекте данного изобретения эффективное количество мутеинов РОР-21, описанных в данном описании, или его биологически активного пептида применяются в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики одного или нескольких состояний, выбранных из диабета II типа, ожирения или метаболического синдрома.

После подробного описания данного изобретения его объект будет дополнительно проиллюстрирован путем ссылки на следующие примеры, которые включены в данное описание исключительно для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения изобретения.

Все патенты и публикации, ссылки на которые сделаны в данном описании, таким образом, включены путем ссылки.

Пример 1.

Экспрессия и очистка мутеинов РОР-21 в дрожжах.

Мутеины РОР-21 экспрессируются в дрожжах, таких как Р1сЫа рав1ог18, Р1сЫа теЫапоНса или Бассйаготусез сегеу151ае. Для продуцирования в РюЫа ра81оп8 в коммерчески доступной системе ([пуЦгодсп. СагкЬаб, СА) используют векторы с сильными промоторами АОХ1 (алкогольоксидаза) для осуществления высокого уровня экспрессии рекомбинантных белков.

Альтернативно, для высоких уровней конститутивной экспрессии доступны векторы, в которых используется промотор из гена ОАР (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа). Мультикопийные векторы экспрессии РюЫа позволяют получить штаммы с множественными копиями желаемого гена, интегрированными в геном. Увеличение количества копий желаемого гена в рекомбинантном штамме РюЫа может увеличить уровни экспрессии белка. Еще одной системой экспрессии в дрожжах является Бассйаготусез сегеу181ае. Векторы экспрессии содержат последовательности промотора и энхансера из гена ОАБ1. Промотор ОАБ1 представляет собой один из наиболее широко используемых дрожжевых промоторов благодаря его выраженной транскрипциональной активности при индукции галактозой.

Аналитическое описание (анализ масс-спектра) показывает, что экспрессируемый в РюЫа ра81оп8 РОР-21 укорочен (отсечение четырех аминокислот на Ν-конце дикого типа). При проведении анализа в пробе адипоцитов мышей 3Т3-Ь1 (см. пример 2) этот укороченный вариант РОР-21 стимулирует потребление глюкозы при применении таких же концентраций, как и РОР-21 дикого типа (табл. 1).

Пример 2.

Потребление глюкозы адипоцитами мышей 3Т3-Ь1.

Клетки 3Т3-Ь1 получены от Американской Коллекции Культур Видов (Атепсаи Туре Си11иге Со11ес1юи, АТСС, ВоскуШе, ΜΌ). Клетки культивировали в среде культивирования (ОМ), содержащей 10% обогащенной железом фетальной бычьей сыворотки в модифицированной Дульбекко среде Игла. Для стандартной дифференциации адипоцитов через два дня после достижения слияния клеток (обозначается день 0) клетки подвергали действию дифференцирующей среды (ЭМ), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мкг/мл инсулина, 1 мкМ дексаметазона и 0,5 мкМ изобутилметилксантина, в тече

- 7 011390 ние 48 ч. Клетки содержали в постдифференциальной среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 10 мкг/мл инсулина.

Анализ транспорта глюкозы.

Потребление гексозы, измеренное путем количественного определения аккумуляции 0,1 мМ 2дезокси-Э-[¹⁴С]глюкозы, определяли следующим образом: адипоциты 3Т3-Р1 в 12-луночных планшетах, дважды промытые буфером ККР (136 мМ №С1, 4,7 мМ КС1, 10 мМ ХаРО₄, 0,9 мМ СаС1₂, 0,9 мМ Мд8О₄, рН 7,4), нагретые до 37°С и содержащие 0,2% В8Л, инкубировали в среде Лейбовица Ь-15, содержащей 0,2% В8Л, в течение 2 ч при 37°С в комнатной атмосфере, снова дважды промывали буфером ККР, содержащим 0,2% В8Л, и инкубировали в буфере ККР, содержащем 0,2% В8Л, в отсутствие (только Ме₂8О) или в присутствии вортманнина в течение 30 мин при 37°С в комнатной атмосфере. Затем добавляли инсулин до конечной концентрации 100 нМ в течение 15 мин и потребление 2-дезокси-Э[¹⁴С]глюкозы измеряли в течение последних 4 мин. Неспецифическое потребление, измеренное в присутствии 10 мкМ цитохалазина В, вычитали из всех значений. Концентрацию белка определяли с помощью анализа Пирса бицинхониновой кислоты. Потребление измеряли обычно в трехкратном или четырех кратном повторении для каждого эксперимента.

Активность ΐπ νίίτο нормализовали по активности ΐπ νίίτο РОР-21 дикого типа, которой присвоено значение 1,0, и которая используется в качестве положительного контроля. Активность ΐπ νίίτο мутеинов РОР-21 данного изобретения сравнивается с РОР-21 дикого типа в табл. 1. Как показано в табл. 1, мутеины по данному изобретению в различной степени сохраняют биологическую активность по сравнению с РОР-21 дикого типа.

Таблица 1

Мутеин ЕСЕ-21	Система экспрессии	Активность ϊη νίύΓΟ*
Дикий тип	Е. соМ	ι,ο
ΔΗΡΙΡ укороченный Дикий тип**	Дрожжи	0,9
ΔΗΡΙΡ Ы18С, А134С	Дрожжи	0,2
ΔΗΡΙΡ Ы18С, А134С, 5167А	Дрожжи	0,2

* Активность представляет собой относительное значение на базе активности РОР-21 дикого типа, выработанного Е. сой.

** На Ν-конце отсечены 4 аминокислоты.

Пример 3.

Модель на мышах оЬ/оЬ.

Исследование на модели ожирения с использованием самцов мышей оЬ/оЬ проводили для контроля уровней глюкозы и триглицеридов в плазме крови после лечения РОР-21, в сравнении с контрольными группами растворителя и инсулина. В экспериментальных группах самцам мышей оЬ/оЬ (возраст 7 недель) инъекционно вводили только растворитель (0,9% ΝηΡΊ) или мутеин РОР-21 (0,125 мг/кг) подкожно (0,1 мл, один раз в день) в течение 7 дней. Кровь отбирали с помощью зажима на хвосте в день 7, через час после последней инъекции соединения, и уровни глюкозы в плазме крови измеряли с использованием стандартного протокола. Способность мутеинов РОР-21 снижать уровни глюкозы в плазме в сравнении с контролем (растворитель) показаны в табл. 2. Данные в табл. 2 показывают, что мутеины по данному изобретению снижали уровни глюкозы в плазме крови в сравнении с контролем (растворитель). Способность мутеинов РОР-21 к снижению уровней триглицеридов в сравнении с контролем (растворитель) показаны в табл. 3.

Таблица 2

Мутеин ЕСЕ-21	Уровни глюкозы в плазме как % от контроля
Дикий тип	62%
Ы18С-А134С	70%
Ш18С-А134С-5167А	62%

Таблица 3

Мутеин ЕСЕ-21	Уровни триглицеридов (мг/дл)
Контроль (растворитель)	210
Дикий тип	116***
Ы18С-А134С	137**
Ы18С-А13 4С-5167А	153*

Значение Р против контроля (растворитель): *р<0,05; **р<0,02; ***р<0,001.

- 8 011390

Пример 4.

Фармацевтическая стабильность мутеинов РСР-21.

Стабильность мутеинов РСР-21 по данному изобретению анализировали путем имитации физиологических условий и условий фармацевтического препарата. Для имитации физиологических условий анализировали стабильность мутеина в фосфатном буферном растворе (РВ8) при комнатной температуре (КТ) при концентрации целевого белка 10 мг/мл, рН 7,4. Растворимость/физическая стабильность мутеинов в РВ8 считалась удовлетворительной, если выход белка после приготовления составлял >90% при комнатной температуре, что определяли с помощью хроматографии с разделением по размеру (δΐζθехс1и8юп еНгошаФдгарйу) и/или обращенно-фазовой хроматографии. Как показано в табл. 4 и 5, мутеины по данному изобретению удовлетворяют данным критериям.

Было предположено, что фармацевтический препарат мутеина по данному изобретению, вероятно, будет представлять собой препарат для универсального применения с консервантами, поэтому была проанализирована совместимость с широко используемым консервантом. Для исследования совместимости препарата консервант м-крезол (конечная концентрация 3 мг/мл, обычно достаточная для удовлетворения критериям Европейской Фармакопеи В для эффективности консерванта в условиях нейтральных значений рН) добавляли при комнатной температуре к раствору, содержащему мутеин в концентрации приблизительно 10 мг/мл в РВ8, рН 7,4. Физическую стабильность в присутствии консерванта первоначально оценивали путем определения выхода белка по основному пику на хроматограмме после обращенно-фазовой хроматографии и хроматографии с разделением по размеру при комнатной температуре. Кроме того, степень агрегации, измеренная с помощью ЭБЗ (динамического рассеивания света) при 37°С, показана как средний диаметр частиц в присутствии м-крезола по прохождении 2 ч, в сравнении с РСР-21 дикого типа. Больший размер среднего диаметра соответствует повышенной степени ассоциации и/или агрегации белка. Совместимость с консервантом (как функция среднего диаметра частиц) мутеинов по первому и второму вариантам данного изобретения в сравнении с РСР-21 дикого типа показана в табл. 4. Белок дикого типа экспрессировали в Е. сой, тогда как мутеины экспрессировали в дрожжах (РюЫа разФпз).

Мутеины по данному изобретению, которые являются стабильными в РВЗ и совместимыми с консервантом, сконструированы таким образом, чтобы обладать усиленными или улучшенными фармацевтическими свойствами в сравнении с РСР-21 дикого типа. Как показано в табл. 4, предпочтительные мутеины по данному изобретению, которые обладают усиленными фармацевтическими свойствами по сравнению с РСР-21 дикого типа, представляют собой Б118С-Л134С и Б118С-А134С-3167А.

Таблица 4

Мутеин ЕСЕ-21	Средний диаметр частиц (нм)*
Эксперимент #1
Дикий тип РОЕ-21	1356
Эксперимент #2
Дикий тип ЕСЕ-21	813
Ы18С-А134С	7
Ц118С-А134С-8167А	7

* Средний диаметр частиц представляет раствор белка с целевой концентрацией 10 мг/мл м-крезола с концентрацией 3 мг/мл, после 2 ч инкубирования при 37°С.

Пример 5.

Анализ О-гликозилирования.

Мутеины РСР-21 экспрессировали в РюЫа раз1оп8 и очищали из среды культивирования с помощью ВЭЖХ (АЧех 2695) с использованием колонки 2огЬах, 330-8В С8, 4,6x50 мм, частицы 3,5 мкм при 40°С (подвижная фаза С: 0,1% ТРА в 10% ацетонитрила и 90% Н₂О, Ό: 0,1% ТРА в ацетонитриле).

Уровни О-гликозилирования очищенных мутеинов РСР-21 измеряли с помощью стандартного анализа ЖХ/МС (жидкостная хроматография, масс-спектроскопия. БС/МЗ). Процент О-гликозилирования для типичных представителей мутеинов показан в табл. 5 по сравнению с человеческим РСР-21 дикого типа. Уровни О-гликозилирования предпочтительных мутеинов Б118С-А134С-3167А составляют только 3% по сравнению со значениями >60% для РСР-21 дикого типа или мутеина Б118С-А134С, что четко демонстрирует, что мутеин 3167А значительно снижает уровень О-гликозилирования.

Таблица 5

РОГ-21 Мутеин	% О-гликозилирования
Дикий тип	62%
Ы18С-А134С	63%
Ы18С-А134С-5167А	3%

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Мутеин человеческого ЕОЕ-21, где нумерация аминокислот основана на 8ЕО ΙΌ N0:1, где указанный мутеин представляет собой АН1кРго11еРго/Ееи118Сук/А1а134Сук/8ег167А1а.
2. Способ получения мутеина по п.1, включающий:

(a) трансформирование клетки-хозяина с помощью вектора, содержащего ДНК, кодирующую указанный мутеин;

(b) культивирование указанной клетки-хозяина в среде, подходящей для экспрессии указанного мутеина; и (c) выделение указанного мутеина из среды культивирования.
3. Фармацевтическая композиция, пригодная для лечения пациента, имеющего одно или несколько из следующих состояний: ожирение, диабет ΙΙ типа, инсулинорезистентность, гиперинсулинемию, непереносимость глюкозы, гипергликемию или метаболический синдром, содержащая следующее:

(a) терапевтически эффективное количество мутеина ЕОЕ-21 по п.1 и (b) приемлемый фармацевтический носитель.
4. Мутеин человеческого ЕОЕ-21 или его биологически активный пептид по п.1 для применения в качестве лекарственного средства.
5. Применение мутеина ЕОЕ-21 по п.1 для производства лекарственного средства для лечения пациента, имеющего одно или несколько из следующих состояний: ожирение, диабет ΙΙ типа, инсулинорезистентность, гиперинсулинемию, непереносимость глюкозы, гипергликемию или метаболический синдром.