CZ98197A3

CZ98197A3 - Použití KGF nebo jeho analogu pro přípravu léčiva pro léčení cukrovky

Info

Publication number: CZ98197A3
Application number: CZ97981A
Authority: CZ
Inventors: Sharon Lea Aukerman; Glenn Francis Pierce
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 1998-11-11
Also published as: CN1168678A; ES2196082T3; CZ105097A3; EE03975B1; AU3707795A; FI971536L; SK45597A3; BG63167B1; SK284534B6; EE9700081A; DE69530403D1; NZ335109A; NO971568L; FI971420L; JPH10507193A; PT785948E; WO1996011950A1; CA2201940C; SI0804479T1; FI971536A0

Description

• I I »111 ft ·» » • · · » ·· · » ·Φ » · 1 2···»· ·«« « · » « Μ « » t V»· ·»2 2 · 2« «« λ» 1 i>v9íí -n

Použiti KGF nebo jeho analogu pro přípravu léčiva pro léčení cukrovky 1

Oblast techniky

Vynález, se týká podání keratinocytového růstového faktoru při léčení nebo při prevenci cukrovky. 2

Dosavadní stav techniky

Keratinocytový růstový faktor (KGF) je růstovým faktorem specifickým pro buňky epitelu, který byl poprvé identifikován v kondiciovaném médiu fibroblastové buněčné linie plic lidského embrya. Rubin a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:802-806 (1989). Exprese m-RNA pro KGF byla detekována v několika fibroblastových buněčných liniích stromalu, odvozených z epitelových tkání v různých stadiích vývoje. Transkript KGF byl rovněž zjištěn v RNA, extrahované z ledvin normální dospělé osoby a orgánů gastrointestinálního traktu. Finch. a kol., Science 245:752-755 (1989). Důkaz, že je KGF vylučován z j fibroblastů v kultuře a exprimován in vivo v dermu, ale / nikoliv v epidermu naznačuje, že KGF může být důležitým normálním parakrinovým efektorem keratinocytové proli-ferace. Studie ukázaly, že KGF je při stimulaci proliferace primárních a sekundárních lidských keratinocytů v tkáňové kultuře stejně potentní jako EGF. Marchese a kol., J. Cell. Phys. 144:326-332 (1990).

Ex vivo a in vivo studie prováděné na normálních dospělých zvířatech ukázaly, že KGF produkuje změny 2 • · 4 • ·* » · 4 ► I · I »· ·Ι » · · ♦ ► · »· lt* · * • I · é· «· morfogeneze vlasového folikula, proliferaci hepatocytu a proliferaci buněk epitelu v plicích, prsou, slinivce, . žaludku ,.«m tenkém *. a #« t lus tém w-s t ře vu..·.*· Pano s · a^kolv, Jr* Clín v* Invest. 92:969-977 (1993); Ulich a kol., Am. J. Path. 144:862-868 (1994); Yi a kol., Am. J. Path. 145:80-85 (1994); a Ulich a kol., J. Clin. Invest. 93:1298-1306 (1994). Úloha KGF v embryonickém nebo neonatálním vývoji nebyla podrobněji studována, nicméně je zdokumentováno, že4 KGF je důležitým mediátorem vývoje semenného váčku u novorozené myši. Alarid a kol., P. N. A. S. 91:1074-1078 (1994) .

Publikovaná PCT patentová přihláška WO 90/08771 popisuje purifikaci KGF z kondicionovaného média lidské embryonické fibroblastové buněčné linie, částečné aminokyselinové sekvencování purifikovaného KGF, klonování genu a expresi genu v bakteriálních buňkách, poskytující biologicky účinný rekombinantní KGF. Již zmíněná publikace uvádí, že KGF nebo KGF podobné polypeptidy lze použít jako činidla, léčící popáleniny nebo stimulující trans plantovanou korneální tkáň. Skutečně se zjistilo·, že v-případě topické aplikace rekombinantního KGF na rány, způsobené chirurgickým zákrokem na uchu králíka nebo na kůži prasete, zvyšuje reepitelizaci a tloušťku epitelu. Pierce a kol., J. Exp. Med. 178:865-878 (1993).

Podstata vynálezu

Zjistilo se, že KGF je použitelný při léčení onemocnění, známého jako cukrovka. 3 ·· · • O * * ' " · · • M * * · t ·· ·* * « · * t • · · · • · *«« « · • * · · «· I· ·*

Stručný popis obrázků

Obr 1> znázorňuje*sloup’Cbvý“grá'f7^ukazujícímučinky KGF u krys po sedm dní probíhajícím denním subkutánním podávání při dávkování 5 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti (mg/kg). Dva dny po zahájení KGF léčení se po dobu dvou dní podával jednou denně intravenózně streptozotocin (55 mg/kg). Výsledky pro skupinu diabetických krys, ošetřených KGF, jsou znázorněny na pravé, straně obrázku nad legendami „Střep + KGF". Výsledky pro kontrolní skupiny, které se podrobily sedmidennímu ošetření roztokem chloridu sodného bez indukce cukrovky („NaCl"); sedmidennímu ošetření roztokem chloridu sodného před a po indukování cukrovky strepzototocinem („Střep"); a sedmidennímu ošetření KGF bez indukce („KGF") se na obrázku nachází nalevo a napravo od výše uvedené hodnoty. Na vertikální ose jsou vyneseny hodnoty hladiny glukózy v krvi (bez předchozího hladovění) v miligramech na decilitr (mg/dl), měřené pátý den po vyvolání cukrovky (tj. sedmý den potom, co bylo zahájeno ošetřování KGF nebo chloridem sodným). V každé skupině byly čtyři krysy.

Obr. 2 znázorňuje sloupcový graf, ukazující vliv KGF na další fyziologická měření týkající se cukrovky na stejném krysím modelu. Hladiny glukózy na lačno v mg/dl a výdej moči na lačno v mililitrech (ml), vyloučený v průběhu dvaceti čtyř hodin, které se měřily sedmý den léčení pomocí KGF nebo chloridu sodného, jsou vyneseny na vertikální ose, na levé, resp. pravé polovině. Legendy („NaCl", „Střep", „Střep + KGF" a „KGF") mají stejné významy jako na obr.. 1., V každé skupině byly čtyři krysy. 4 Μ · • * . t 9 i é ♦ · · · * · I * • · ·· * · P * * · ·« ·· ♦ » ·

Φ ··· · · • · · ·· M

Obr. 3 znázorňuje denní hladiny glukózy v krvi (bez předcházejícího hladovění v mg/dl na stejném krysím modelu , cukroyky^v^, osmidenní .periodě-po <*» indukci**· cukrovky “Některá"*· zvířata byla ošetřena denní subkutánní dávkou (3 mg/kg) KGF, která se zahájila jeden den po indukování onemocnění („Střep + KGF"), zatímco další byla předem a následně ošetřena roztokem chloridu sodného a použila se pro kontrolní výsledky („Střep + NaCl"). Nediabetická skupina zvířat, ošetřených chloridem sodným („NaCl"), opět sloužila jako další kontrola. V každé skupině bylo šest krys. •v

Obr. 4 znázorňuje hladiny glukózy v moči na lačno, v mg/dl, pro stejný krysí model a pro šestidenní periodu po indukci cukrovky. V tomto případě se začalo druhý den po indukci onemocnění. Léčba pomocí KGF se zahájila jeden den po indukci cukrovky. Grafické symboly označují stejné tři skupiny jako na obr. 3. V každé skupině bylo šest krys.

Obr. 5 znázorňuje výdej moči, v mililitrech za 24 hodin, stejných testovacích skupin jako na obr. 4, měřeno druhý, pátý a osmý den po indukci cukrovky. Grafické symboly jsou stejné jako na obr. 3 a 4. V každé skupině bylo šest krys.

Obr. 6 znázorňuje průměrný příjem vody pro každou skupinu krys v experimentu. Krysám se podávala voda podle chuti a příjem se měřil jako objem v mililitrech, který krysa vypila za 24 hodin. V každé skupině bylo šest krys.

Obr. 7 znázorňuje účinky KGF analogu na cukrovku, indukovanou u Sprague-Dawleyových krys streptozotocinem.

Obr. 8 znázorňuje nukleotidovou (SEQ ID N0:1) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:2) sekvenci přirozeného KGF 5 (nukleotidy, kódující zralou formu přirozeného KGF, jsou popsány bázemi 201 až 684 SEQ ID N0:1 a zralá forma KGF je pops'áha,^pomocí*,l^amiňdkyš,ělihbvýbh""w,zl5yt]cu'w'32',l,<l**raž',,“i"19'4,,*,~ ' SEQ ID NO:2).

Způsob podle vynálezu lze praktikovat za použiti libovolné formy keratinocytového růstového faktoru, který má všechny biologické vlastnosti přirozeně se vyskytujícího polypeptidu nebo alespoň některé z nich. Tyto. formy zahrnují formy, které jsou izolovány a purifikovány z biologických tekutin, buněk a tkání, nebo ty, které jsou odvozeny chemickou syntézou nebo rekombinantním způsobem pomocí exprese v heterologických hostitelských buňkách, které byly transformovány kódující DNA nebo RNA. Rekombinantní způsob produkce keratinocytového růstového faktoru je popsán v již zmíněné WO 90/08771’. Další, odborníkům v daném oboru známé, postupy lze přizpůsobit pro stejné účely.

Nukleotidovbu sekvenci, kódující KGF protein nebo jeho část, lze zavést do příslušného expresivního vektoru, tj. vektoru, který obsahuje nezbytné prvky pro transkripci a translaci vložené proteinové kódující sekvence. Nezbytné transkripční a translační signály lze rovněž podat pomocí přirozeného KGF genu a/nebo jeho lemovacích oblastí. Pro exprimování proteinové kódovací sekvence lze použít celou řadu různých systémů hostitel-vektor. Mezi tyto systémy lze zařadit například savčí buněčné systémy infikované virem (například virem vakcínie, adenovirem atd.); hmyzí buněčné systémy, infikované virem (například bakulovirem), mikroorganizmy jakými jsou kvasinky obsahující kvasinkové vektory nebo bakterie, transformované DNA bakteriofágy, 6 6

v * » * » ψ ·» · * ·♦ • · 0 ·«« · * » · · «· ·♦ ·· plasmidem DNA nebo DNA kosmidu. Expresivní prvky těchto vektorů se vzájemně liší svou délkou a specifičností. V závis losti na použitém_s.yst ému^ho štíte 1 - vekt o r — s e mů ž e použít libovolný z celé řady vhodných transkripčních a translačních prvků.

Pro konstrukci expresních vektorů, obsahujících chimérický gen obsahující příslušný transkripční signál/translační kontrolní signál a proteinové kódovací sekvence, lze použít libovolnou metodu z metod již popsaných pro zavádění nukleotidových fragmentů do vektoru. Tyto metody mohou zahrnovat in vitro rekombinantní DNA techniky a syntetické techniky a rekombinance ín vivo (genetická rekombinance). Expresi nukleokyselinové sekvence kódující KGF protein nebo peptidový fragment lze regulovat druhou nukleotidovou sekvencí tak, že se KGF protein nebo peptid exprimuje v hostiteli, transformovaném rekombinantní DNA molekulou. Expresi KGF lze například regulovat pomocí libovolného, v daném oboru známého, promotorové-ho/zesilovacího prvku. Promotory, které lze použít pro regulaci KGF exprese zahrnují neomezujícím způsobem SV40 brzkou promotorovou oblast, promotor obsahující na konci 3' dlouhou koncovou repetici viru Rousova sarkomu, thymidinkinázový promotor oparu, regulační sekvence metallothioneinového genu, prokariotické expresivní vektory, například β-laktamázový promotor nebo tac promotor, rostlinné expresivní vektory obsahující nopalinsyntetážovou promotorovou oblast, Herrera-Estrella a kol., nebo 35S RNA promotor květákového mozaikového viru a promotor pro ribulózobifosfátkarboxylázu fotosyntetického enzymu, promotorové prvky z kvasinek nebo dalších hub, například Gal 4 promotor, ADC (alkoholdehydrogenázový) promotor, PGK (fosfoglycerolkinázový) promotor,

7 « ♦

» « « « • » t« ♦ · #t alkalinfosfatázový promotor a následující zvířecí transkripční kontrolní oblast, která vykazuje tkáňovou specifičnost·, a^bylawpoužita«U"‘tran,s!genníčh*2vířat:4'génová“",*''ť,‘ kontrolní oblast elastázy I, která se aktivuje v pankreatických acinárních buňkách, kontrolní oblast inzulínového genu, která je aktivována v pankreatických beta buňkách, imunoglobulinová genová kontrolní oblast, která je aktivována v lymfoidních buňkách, Grosschedl a kol., kontrolní oblast viru myšího prsního nádoru, která se aktivuje v testikulárních, prsních, mízních a žirných buňkách, Leder a kol., kontrolní oblast albuminového genu, která je aktivována v játrech, kontrolní oblast alfafetoproteinového genu, která je aktivována v játrech, kontrolní oblast alfa 1-antitrypsinového genu, která je aktivována v játrech, kontrolní oblast beta-globinového genu, která je aktivována v myleoidních buňkách, kontrolní oblast myelinového základního proteinového genu, která je aktivována v oligodendrocytových buňkách mozku, kontrolní oblast myosinového genu s lehkým řetězcem-2, která je aktivována v kosterním svalu a kontrolní oblast gonadotropického genu uvolňujícího hormon, která je aktivována v hypotalamu.

Expresivní vektory, obsahující KGF genové inzerty, lze identifikovat pomocí DNA-DNA hybridizace v přítomnosti nebo za absence „markerových" genových funkcí a exprese vložených sekvencí, které jsou odborníkům v daném oboru dobře známy.

Pro propagaci KGF genu lze použít několik, v daném oboru známých, metod. Po zvolení vhodného hostitelského systému a růstových podmínek lze rekombinantní expresní vektory propagovat a připravovat ve větším množství. 8 • · * «· * » t t · i) t ·1 ··

Kromě toho lze zvolit takový hostitelský buněčný kmen, který bude modulovat expresi vložených sekvenci nebo modifikovat a zpracovávat genový produkte šneci fickvm·, požadovaným způsobem. Expresi z určitých promotorů lze v přítomnosti určitých induktorů zvyšovat. Exprese geneticky produkovaného KGF proteinu může být tedy regulována. Různé hostitelské buňky máji navic charakteristické a specifické mechanizmy translačniho a posttranslačního zpracování a modifikace (například glykosylace, gama karboxylace zbytků glutamové kyseliny, proteolytické štěpení) proteinů. Příslušné buněčné linie nebo hostitelské systémy lze zvolit tak, aby zajistily požadovanou modifikaci a zpracování cizorodého proteinu, který byl exprimován. Mělo by být zřejmé,· že výrazy „keratinocytový růstový faktor" a „KGF", jak jsou použity v tomto popisu, zahrnují zaměnitelně, není-li stanoveno jinak, přirozené KGF a KGF analogové proteiny (nebo „muteiny"), které jsou charakterizovány peptidovou sekvencí, která je v podstatě stejná jako peptidová sekvence přirozeného KGF a zachováním všech biologických aktivit přirozeného KGF nebo alespoň některých z nich, zejména proliferace nefibroblastových epitelových buněk (například vykazují přibližně alespoň SOOkrát vyšší stimulaci BALB/MK keratinocytových buněk než je stimulace NIH/3T3 fibroblastových buněk a přibližně alespoň 50krát vyšší stimulaci BALB/MK keratinocytových buněk než je stimulace BS/589 epitelových buněk nebo CC1208 epitelových buněk, jak vyplývá ze zabudování H-thymidinu)·. Výrazem „charakterizovány peptidovou sekvencí, která je v podstatě stejná jako peptidová sekvence přirozeného KGF" se rozumí peptidová sekvence, která je kódována DNA sekvencí schopnou hybridizovat nukleotidy 201 až 684 SEQ ID NO:l, výhodně za přísných hybridizačních podmínek.

* » ► ♦ »· ř 9 8 ΐ k · · η *· · · 9

Určeni odpovídající aminokyselinové pozice mezi dvěmi aminokyselinovými sekvencemi lze zjistit: zarovnáním dvou ^sekyancl^tak/j, aby*, zbyt k-y - z ahr nu j-í οί-'ρ o sun·* ámi hc- zakončení1* a/nebo karboxylového zakončení maximálně odpovídaly; zavedením mezer podle potřeby a/nebo delečních zbytků, přítomných jako inzerty v kandidátu. Databázový průzkum sekvenční analýzy a manipulace lze provádět za použití některého dobře známého a běžně používaného algoritmického programu skenujícího homologíi/identifikaci (jako například Pearson a Lipman (1988), Proč. Nati. Ácad. Sci. U.S.A. £15:2444 až 2448; Altschul a kol. (1990), J. Mol. Biol., 215:403-410; Lipman a Pearson (1985), Science, 222:1435 nebo Devereux a kol. (1984), Nuc. Acids Res., 12:387-395). Přísnými podmínkami v případě hybridizace budou přísně kombinované parametry, jakými jsou například typ soli, teplota, druh organických rozpouštědel a další parametry, které se zpravidla regulují při hybridizačních reakcích. Příkladem přísných hybridizačních podmínek jsou hybridizace. ve 4 x SSC při 62 až βΤ'Ό a následné promývání v 0,1 x SSC při 62 až 67eC přibližně po dobu jedné hodiny. Alternativně může být příkladnými přísnými hybridizačními podmínkami hybridizace ve 45 až 55% formamidu 4 x SSC při 40 až 45eC. [viz T. Maniatis a kol., Molecular Cloning (A Laboratory Manual); Cold Spring Harbor Laboratory (1982), str. 387 až 389] .

Proteiny tedy zahrnují alelové variace nebo delece, substituce nebo inzerty aminokyselin, zahrnujících fragmenty chimérické nebo hybridní molekuly přirozeného KGF. Jeden příklad KGF zahrnuje proteiny, které mají zbytky odpovídající Cys1 a · Cysi5 SEQ ID NO:2 nahrazeny nebo vynechány, přičemž výsledná molekula má v porovnání s

10 « · ··· * původní molekulou zvýšenou. stabilitu (jak uvádí U.S.S.N. dokument 08/487,825, který byl podán 7. července 1995).

Další príklad,KGF_zahrnujewpolypepfcidv«se-změnou*nábojβΤ"ve"..... kterých je alespoň jeden z aminokyselinových zbytků 41-154 přirozeného KGF (výhodně zbytky Arg41, Gin43, Lys55, Lys95, Lys128, Asn137, Gin138, Lys139, Arg144, Lys147, Gin152, Lys153 nebo Thr154) vynechán nebo substituován neutrálním zbytkem nebo zbytkem se záporným nábojem zvoleným tak, aby byl získán protein s redukovaným kladným nábojem (jak uvádí U.S.S.N. dokument 08/323,337, který byl podán 13. října 1994). Ještě další příklad KGF zahrnuje proteiny generované substitucí alespoň jedné aminokyseliny, která má vyšší potenciál, pokud jde o tvorbu smyčky, namísto alespoň jedné kyseliny v oblasti tvorby smyčky Asn115-His116-Tyr117-Asn118-Thr119 přirozeného KGF (jak uvádí dokument U.S.S.N. 08/323,473, který byl podán 13. října 1994). Ještě další příklad zahrnuje. proteiny, které mají alespoň jednu aminokyselinovou substituci, deleci nebo adici v oblasti aminokyselinových zbytků 123-133 (aminokyseliny 154-164 SEQ ID NO:2) přirozeného KGF; tyto proteiny mohou mít agonistické nebo antagonistické aktivity.

Konkrétně popsané proteiny zahrnují následující KGF molekuly (označené pomocí zbytku, nacházejícího se v této poloze ve zralém proteinu (bez signální sekvence) sekvence SEQ ID NO:2, za tímto zbytkem následuje uvedená aminokyselinová pozice v původním a následně buď v substituovaném zbytku nebo které označuje deleci): 11

Μ ' · * I · · · Φ I I • » * · *· Φ Φ ·· «,Φ « ϊ * » Φ Φ Φ ΦΦΦ * * » f t φ ι * Φ t · «·· · ·· ·· ΦΦ ·· C (1,15) S, ΔΝ15-ΔΝ24, ΔΝ3/0(15)3, ΔΝ3/0(15>-, ΔΝ8/0(15)3, ΔΝ8/0(15) -, Ct 1/.15 )$/R( 144 ).E, C(1.15) S/R (144) Q,.^ ... AN23/R(144)Q, 0(1,15,40)3, C (1,15,102)S, C (1,15,102,106)S, ΔΝ23/Ν(137)E, ΔΝ23/Κ(139)Ε, ΔΝ23/Κ(139)Q, AN23/R(144)A, AN23/R(144)E, AN23/R(144)L, ΔΝ23/Κ{147)Ε, ΔΝ23/Κ(147)Q, ΔΝ23/Κ(153)E, ΔΝ23/Κ(153)Q, ΔΝ23/0(152)E/K(153)E; R(144)Q a H(116)G.

Pro praktickou aplikaci při terapeutickém léčeni lze KGF formulovat do farmaceutických kompozic vhodných pro podání libovolnými běžnými prostředky, například parentenální cestou, zejména pomocí subkutánní, intravenózní nebo intramuskulární injekce. Tyto standardní formulace budou v případe kapalné formulace pravděpodobně zahrnovat vhodné pufrovací soli, konzervační a stabilizační Λ 4" Λ Vi -1 1 -l F7 η «O *N A X Ί η -1 M u í^-L1^±U I ri f •činidla nebo vhodné pufrovací soli, konzervační činidla a plniva typická pro lyofilizované formulace. Rovněž je možné podávat KGF v pozvolna se uvolňující formě intradermálně, subkutánně nebo intraabdominálně. .Tyto pozvolna se uvolňující formy KGF mohou být formulovány za použití standardních metod, které jsou odborníkům v daném oboru známy. Nejpraktičtějšími režimy podání KGF mohou být režimy, při kterých si pacient aplikuje KGF doma pomocí subkutánní injekce nebo intradermální dodávky nebo režim, při kterém lékař implantuje pacientovi dlouhodobě se uvolňující formulaci subkutánně nebo v peritoneální dutině. Dávkovači režim pro KGF může být stanoven praktickým lékařem empiricky. Obecně se předpokládá, že KGF bude účinné v množstvích, pohybujících se v rozmezí přibližně od 0,001 do 10 mg na kilogram tělesné hmotnosti (pacienta) na 12 9 9 999 9 • 0 »9 9 4 «9 • « · 9 · 90 9 9 • · · 9 9 • 99 ·· 99 99 den a výhodně přibližně od 0,05 do 5 mg/kg/den. Terapeutický režim může zahrnovat jedinou injekci nebo množinu^ injekci, nebo ™.pozvolna«,kontinuálně1^s.e«wuvolňující„ nízkou dávku KGF, přičemž volba vhodného terapeutického režimu bude záviset na typu a závážnosti onemocnění v jednotlivém konkrétním příkladu. Terapeutický průběh léčení pomocí KGF musí dostatečně indukovat funkci pankreatických beta buněk, aby došlo k normalizaci hladiny glukózy v krvi během měnících se metabolických požadavků a aby se vyloučil vznik časté nebo hluboké hypoglykemie. Cílem léčení pomocí KGF je doplnit funkci ostrůvkových buněk u pacientů, u kterých byla diagnostikována cukrovka typu I a eliminovat: nutnost trvalého příjmu exogenního inzulínu. Pacienti, u kterých byla nově zjištěna cukrovka typu I a u kterých zůstala funkce ostrůvkových buněk částečně zachována, jsou kandidáty pro KGF terapii. KGF může být použit k zachování ostrůvkove funkce u těchto pacientu tak, ze zmírni, oddálí nebo pozastaví trvalý projev tohoto onemocnění. Předpokládá se, že cukrovka typu I je autoimunitní onemocnění, k jehož léčení se používá imunosupresivní terapie. KGF terapie podle vynálezu může být použita společně nebo v kombinaci s imunosupresivními činidly, určenými pro léčení tohoto onemocnění. Vynález bude dále ilustrován pomocí následující příkladné aplikace, která nikterak neomezuje rozsah vynálezu, který je jednoznačně stanoven uvedenými patentovými nároky.

13 •»» » tM • * * ·* « « ·· I ι « · Ψψ· * * k · * · · · · ·# «· ·· ·· Příklady provedeni vynálezu

ÉMP

Materiály.

Testovacími materiály, použitými v následujících studiích in vivo byly přirozená sekvence KGF, KGF analog v němž byly cysteinové zbytky v pozicích 1 a 15 přirozené aminokyselinové sekvence nahrazeny pomocí standardních technik místně řízené mutageneze serinem (tj. C(1,15)S) a KGF analog, který má deleci prvních 23 aminokyselin N-konce přirozeného KGF, získaný pomocí standardních technik (tj. ΔΝ23). Všechny proteiny byly produkovány rekombinantní expresí v bakteriálním kmeni E. colí a purifikovány do dosažení homogenity, přičemž každý z nich obsahoval, methioninový zbytek (Met-1) na N-konci. Všechny proteiny byly podávány ve formě subkutánní formulace. Dřívější experimenty ukázaly, že tyto proteiny mají v případě., systemického podávání u dospělý krys srovnatelné aktivity.. Přirozená sekvence KGF a všechny analogy měly srovnatelné· aktivity u diabetických a nediabetických krys, které byly použity v následujících studiích.

In vivo model cukrovky

Pro studie onemocnění a jeho léčení se běžně používají chemicky indukované modely cukrovky u různých zvířecích druhů. Ačkoliv streptozotocin indukuje cukrovku u myší, krys, křečků, psů a opic, provádějí se nej častěji používané studie na krysách a myších. Junod a kol., Proč. Soc. Epx. Pio. Med. 126:210-205 (1967); Rerup, Pharm. Rev. 22:485-518 (1970); Rossini a kol., P. N. A. S. 74:2485-2489 (1977); a 14 9 9 14 9 9 • · *· 9 9 9« ΐ ♦ · *· • · · 9 · ··· · 9 9 .9 * * · * 99 *t ·♦ ··

Ar'Rajab a Ahren, Pancreas 8:50-57 (1993). U krys způsobují stabilní onemocnění dávky streptozotocinu, pohybující se v ro zme zí od*»4-5— do —-7 0- mg/-kg·/—-ap 1 i-kované—ve·— f o rmě —-j ed-iné. intravenózní dávky. Dávky nižší než 45 mg/kg indukují přechodný stav, který je zvratný. Jednodenní streptozotocinová injekce indukuje hyperglykemický stav. Hladiny inzulínu v krvi zůstávají v porovnání s normálními krysami v podstatě nezměněny, avšak celkový obsah inzulínu a C-peptidu ve slinivce se několikrát sníží. Krysy vykazují klasické známky a příznaky cukrovky u lidí: zvýšené hladiny glukózy v krvi (hyperglykemie), glukózu v moči {glukozurie}, zvýšenou žíznivost (polydipsie), zvýšené močení (polyurie) a zvýšenou chuť k jídlu (hyperfagie).

Zde popsané studie se prováděly na streptozotocinem indukovaném modelu cukrovky u Sprague-Dawleyových krys. Na počátku studie byli použiti samečci krys, vážící 200 až 260 g. .Cukrovka se u těchto krysích samečků indukovala jedinou intravenózní injekcí streptozotocinu při dávkování 50 mg streptozotocinu v nátriumcitrátovém puřru na kilogram tělesné váhy. Nediabetické kontrolní krysy, kterým se. aplikovala jediná intravenózní injekce nátriumcitrátového pufru, se použily pro kontrolní účely. KGF se podával denně ve formě subkutánní injekce. Dávka KGF představovala 3 nebo 5 mg/kg/den v závislosti na konkrétním experimentu. U prvního experimentu se KGF terapie zahájila dva dny před indukováním cukrovky a pokračovalo se v ní i po indukování cukrovky, takže se aplikovalo celkem osm injekcí. U druhého a třetího experimentu se se subkutánním podáním KGF započalo jeden den po indukci cukrovky streptozotocinem. U čtvrtého experimentu se sedmidenní KGF terapie zahájila 7 dní po aplikaci streptozotocinu a zvířata se následně 15

» ♦ ·* ♦ • * · · i * I · ♦ ·» ·» • «·'

sledovala dalších 12 týdnů. U všech experimentů, s výjimkou čtvrtého experiméntu, se jako koncové body pro analýzu 'použily 'úrovně1· glukózy'*iv*-krv-i;>*»úrovEěwg-l-ukózy»*i v-* moči-·* a, objem moči. U některých experimentů se rovněž měřil příjem vody, hladiny C-peptidu v moči nebo celkový obsah pankreatického inzulínu a C-peptidu: U čtvrtého experimentu se jako koncový bod stanovil pouze obsah glukózy v krvi.

Vzhledem k tomu, že velký podíl inzulínu je odstraňován z oběhu játry, měření koncentrací periferního inzulínu odráží posthepatické metabolické příhody spíše, než měření inzulínové sekrece ze slinivky. Často se tedy provádí měření C-peptidu a používá se jako periferní označení inzulínové sekrece. C-peptid se produkuje při zpracování proinzulinu na inzulín. Inzulín a C-peptid se vylučují z beta buněk v ekvimolárních množstvích, a pouze malé množství C-peptidu je odstraňováno játry..

In vívo podání KGF První studie

Za použití výše uvedeného modelu cukrovky se nejprve hodnotila účinnost KGF při léčení cukrovky u následujících čtyř skupin krys: 1. kontrolní (nediabetické) krysy ošetřené předběžně a následně subkutánně, podaným roztokem chloridu sodného, který neobsahoval streptozotocin; 2. krysy, u kterých byla cukrovka vyvolána intravenózním podáním 50 rug/kg strepťozotocinu, které byly před a po 16 16 4 ♦ * 4 4 · • 44 · • 4 44 • 94 I · 4 · · • 4 4· 4 I ·· » · 4 4 4 4 4 ·· «i· aplikaci streptozotocinu ošetřeny subkutánně podaným roztokem chloridu sodného; 3. krysy, u kterých byla cukrovka vyvolána intravenózním podáním 50 mg/kg streptozotocinu, které byly před a po aplikaci streptozotocinu ošetřeny subkutánně podaným přirozeným KGF; a 4. kontrolní krysy, ošetřené subkutánně podaným přirozeným KGF bez aplikace streptozotocinu.

Krysám ze všech čtyř testovaných skupin se podal buď přirozený KGF v dávce 5 kg/kg na den nebo stejný objem roztoku chloridu sodného v průběhu sedmi dní. Dva dny po zahájeni KGF léčby nebo po aplikaci chloridu sodného se krysám druhé a třetí skupiny intravenózně podala dávka 55 mg/kg streptozotocinu. Je známo, že tato dávka způsobuje u krys mírnou cukrovku. U všech krys se sledovala hladina glukózy v krvi (bez předchozího hladovění), tělesná hmotnost, hladina glukózy v moči a výdej moči (na lačnoO. Sedm dní po podání streptozotocinu krysám druhé a třetí skupiny (tj. devět dní po zahájení studie) se krysy všech skupin nechaly přes noc vyhladovět, utratily se a následně pitvaly. Ve všech případech se slinivka konzervovala ve formalínu zinečnatém, uložila a následně zpracovala běžnými histopatologickými způsoby. U diabetických kontrolních krys (druhá skupina) se pátý den po aplikaci streptozotocinu podstatně zvýšila hladina glukózy v krvi (u nehladovějících krys), v porovnání s nediabetickými kontrolními krysami, (první skupina), viz obr. 1. Diabetické krysy, které se před a po podáni streptozotocinu ošetřily KGF (třetí skupina), měly podstatně nižší hladinu glukózy v krvi (nehladovějící) než 17

t é ·» ·#· · I • · I M 4* diabetické kontrolní krysy, které nebyly ošetřeny KGF (druhá skupina), ale stále ještě zvýšenou v porovnání s nediabeóickými—kontrolními—krysami—(první—skupina )'>*"»viz.« obr. 1. Sedmý den studie (tj. pět dní po injektování streptozotocinu) byly hladina glukózy v moči (na lačno) a objem moči druhé skupiny diabetických kontrolních krys značně zvýšeny, viz obr. 2. Tento stav je dán destrukcí beta buněk produkujících inzulin v pankreatických ostrůvcích a vážným narušením metabolizmu glukózy, což má za následek vylučování glukózy v krvi. Na druhé straně diabetické krysy (třetí skupina), které se před a po aplikaci streptozotocinu ošetřily KGF, vykazovaly podstatně nižší zvýšení hladiny glukózy v moči (na lačno) než diabetické kontrolní krysy (druhá skupina). Výdej moči v případě KGF ošetřené skupiny byl rovněž podstatně nižší než v případe diabetické kontrolní skupiny, viz obr. 2.

Tyto výsledky odpovídají indukci mírného stavu cukrovky u krys, vyvolaného streptozotocinem, jako indukčním činidlem. Tyto diabetické krysy, které byly ošetřeny KGF před indukováním cukrovky a u kterých se v. aplikaci KGF pokračovalo rovněž po této indukci, vykazovaly příznaky, které jsou charakteristické pro mírnější formu cukrovky. Z těchto pozorování tedy vyplývá, že KGF léčba buď částečně zabraňuje indukci cukrovky nebo po destrukci beta buněk, způsobené streptozotocinem, obnovuje pankreatické ostrůvky produkující inzulin. Aby se rozlišilo, zda jde o prevenci indukce onemocnění nebo o regeneraci, provedly se další studie, při kterých se léčebná terapie KGF zahájila až po indukování onemocnění. 18 • · »·· · • Μ * · · t · · · ··· · · • · · « » · Μ «I ·· ··

Druhá studie: Účinnost KGFTpři ""léčení cukrovky""se^ďále"hodnoťiiá^há" stejných modelech cukrovky jako v případě první studie a za použití následujících tří skupin krys: 1. krysy, kterým se subkutánně aplikoval roztok chloridu sodného, bez streptozotocinu; 2. krysy, u kterých byla cukrovka vyvolána intravenózním podáním streptozotocinu, a které se následně ošetřily subkutánně podaným roztokem chloridu sodného; a 3. krysy, u kterých byla cukrovka vyvolána intravenózním podáním streptozotocinu, a které se následně ošetřily subkutánně podaným roztokem C(1,15)S.

Testovaným krysám se třináct dní podával roztok chloridu sodného v dávkách 3 mg/kg na den, přičemž s podáváním se začalo jeden den po indukování cukrovky. Po celou testovanou periodu se u krys (v sytém stavu a na lačno) sledovaly následující parametry: hladina glukózy -v krví, hladina glukózy v moči a objem vyloučené moči a vypité vody. Krysy druhé a třetí skupiny se staly během dne, kdy jim byl podán streptozotocin, diabetickými (obr. 3) . KGF léčba začala u třetí skupiny krys dvacet čtyři hodin po aplikaci streptozotocinu, načež pokračovala v každodenním režimu. První, druhý, čtvrtý, pátý a osmý den se měřila hladina glukózy v krvi (bez předchozího hladovění) . Jak ukazuje obr. 3, KGF terapie u krys třetí skupiny umožnila čtvrtý den snížit hladinu glukózy cirkulující v krvi téměř na hladinu glukózy, cirkulující v krvi kontrolovaných krys (první skupina) a toto snižovaní pokračovalo až do osmého dne. Druhý, pátý a osmý den se rovněž měřila glukóza, vyloučená moči (bez předchozího hladovění). Obr. 4 ukazuje, že KGF terapie snížila hladinu glukózy Ί'V" m&čir-více" než^osmkrátr-Podobně-tomu-bylo · u* výdej e moči diabetických krys léčených pomocí KGF, který se rovněž normalizoval, jak ukázala měření, prováděná pátý a osmý den (obr. 5) . Příjem vody, v milimetrech na 24 hodin,, se u diabetických krys léčených pomocí KGF nezvýšil jako v případě kontrolních diabetických krys, kterým se podával roztok chloridu sodného (obr. 6). Krysy se nechaly osmý den přes noc hladovět a devátý den se zvířatům (na lačno) změřila hladina glukózy v krvi. Mezi třemi testovanými skupinami nebyl zjištěn žádný rozdíl. Příjem vody a výdej moči (na lačno) byl devátý den u diabetických krys, léčených KGF, podstatně nižší než u diabetických krys, což se dále odráží na zmírnění cukrovkového stavu'. Třetí studie: Třetí studie byla opakováním druhé studie a potvrdila data, uvedená na obr. 3 až 6. V rámci této studie se krysám v rámci pitvy vyjmula slinivka a použila se pro extrakci a kvantifikaci inzulínu a C-peptidu. Níže uvedená tabulka 1 ukazuje průměrné množství inzulínu nebo C-peptidu, extrahovatelného ze slinivky krys všech tří testovaných studií. KGF léčba umožnila snížit celkový obsah inzulínu a C-peptidu ve slinivce diabetických krys, v porovnání s diabetickými krysami, ošetřenými roztokem chloridu sodného. 20 ·« * · f i·· · ··* • · · ·«.·♦·· * • · I · · · · ó *· ·· ·· TABULKA 1 ~ČeIkový‘paňk:reat ický "obsah :

Skupina1 Inzulín (u.q) C-peptid (μπιοΐγ) kontrolní 83,7 ± 6,72 3,5 ±'0,1 diabetická plus NaCl 6,4 ± 3,3 0,4 ± 0,1 léčba diabetická plus 18,9 ±7,4 1,0 ± 0,3 . KGF léčba 1 n= tři až čtyři krysy ve skupině 2 Průměr ± S.E. Čtvrtá studie: Cílem této studie bylo zjistit vliv KGF na cukrovku indukovanou streptozotocinem u Sprague-Dawleyových krys. V nultý den se testované skupiny krys exponovaly bud 45 nebo 50 mg/kg streptozotocinu (STZ). Po této aplikaci se denně monitorovala hladina glukózy v krvi (bez předchozího hladovění), aby se zjistila závažnost poškození pankreatických ostrůvků. Pátý den se zvířata ošetřená STZ umístila do jedné ze dvou skupin (20 zvířat/skupina) v závislosti na hodnotě hyperglykemie. Dělící hodnotou byla hladina glukózy v krvi 300 mg/dl. Skupina zvířat neošetřených STZ sloužila jako kontrolní skupina. Sedmý den se začalo deseti zvířatům z každé hyperglykemické skupiny aplikovat subkutánní injekcí AN23 (3 mg/kg/den) nebo PBS. Hladiny glukózy v krvi se následně monitorovaly denně, 21 * ♦ každý druhý den nebo týdně a získané hodnoty ukazuje obr. 7. Je třeba zmínit, že u zvířat z obou skupin ošetřených^ŠTZ^a přij íma"jící'ch**iKGF*^"došlo,"k ••podstatnému· poklesu glukózy v krvi během KGF dávkovači periody. Důležité je, že průměrný pokles glukózy v krvi, který se projevil u zviřat ošetřených STZ, při dávkách nižších néž 300 mg/dl, se stabilizoval přibližně při 150 mg/dl, zatímco pokles glukózy v krvi, jehož počátek byl patrný při příjmu dávky vyšší než 300 mg/dl, byl pouze přechodný. Je třeba uvést, že denní měřítko není lineární.

Claims

221H11-W-V<? ΊΓΚ TETT Ď”~É N*A 1. Použití keratinocytového růstového faktoru nebo jeho analogu pro přípravu léčiva pro léčení cukrovky u savců.
2. Použití podle nároku 1, vyznačené tím, že savcem je člověk.
3. Použití podle nároku 1, vyznačené tím, c (1 .1 R ΐ ,ς v y, — f — — f — T------X. ¢.4- rVTTt"? ^ -¾ Vř+* Λ V» ca Zt: jvt;j.ctL· lu v y j-uKIDI 5“ S: ΔΝ23.
4. Použití podle nároku 1, vyznačené tím, že se podává ve formě farmaceutické kompozice obsahující farmaceuticky přijatelný nosič.
5. Použití podle nároku-4, vyznačené tím, že se farmaceutická kompozice podává pomocí parenterální injekce.
6. Použití podle nároku 1, vyznačené tím, že se použije přibližně 0,001 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti7den;<,,"""> ---v ................................. ί i m··.. **»mm
7. Použití podle nároku 6, vyznačené tím, že se použije , přibližně 0,05 až 5 mg/kg tělesné hmotnosti/den. Zastupuje: