DE69535264T2

DE69535264T2 - Verfahren zur behandlung von diabetes mittels kgf

Info

Publication number: DE69535264T2
Application number: DE69535264T
Authority: DE
Inventors: Lea Sharon Thousand Oaks AUKERMAN; Francis Glenn Rancho Santa Fe PIERCE
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2015-10-13
Also published as: HUT78050A; HU226168B1; NO971566L; CZ297328B6; ES2273338T3; CZ105097A3; EP0785948B1; AU3707795A; DK0804479T3; BG101392A; FI971420A; WO1996011949A2; NZ505502A; CZ297329B6; EP0785948A1; PT804479E; ATE342278T1; SI0804479T1; CZ98197A3; DE69535264D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Anwendung von Keratinozytenwachstumsfaktor zum Herstellen eines Medikaments, um den Ausbruch von Diabetes mellitus zu behandeln oder zu verhindern.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Beim Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF) handelt es sich um einen für Epithelzellen spezifischen Wachstumsfaktor, der zunächst im konditionierten Medium einer menschlichen embryonalen Lungenfibroblasten-Zelllinie identifiziert wurde (Rubin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 802–806 (1989)). Eine Expression der messenger-RNA für KGF ist in mehreren Stromafibroblasten-Zelllinien, die aus Epithelgewebe in verschiedenen Entwicklungsstadien abgeleitet wurden, nachgewiesen worden. Das Transkript für KGF war auch in RNA offensichtlich, die aus normaler adulter Niere und Organen des Gastrointestinaltrakts extrahiert wurde (Finch et al., Science 245: 752–755 (1989)). Evidenz, dass KGF aus Fibroblasten in Kultur sezerniert und in vivo in der Dermis, aber nicht der Epidermis exprimiert wird, zeigt an, dass KGF ein wichtiger normaler parakriner Effektor der Keratinozytenproliferation sein kann. Untersuchungen haben gezeigt, dass KGF beim Stimulieren der Proliferation primärer oder sekundärer menschlicher Keratinozyten in Gewebekultur so stark wie EGF ist (Marchese et al., J. Cell. Phys. 144, 326–332 (1990)).
Ex-vivo- und in-vivo-Untersuchungen bei normalen adulten Tieren haben gezeigt, dass KGF Veränderungen bei der Haarfollikelmorphogenese, der Hepatozytenproliferation und der Epithelzellproliferation in der Lunge, der Brust, dem Pankreas, dem Magen, dem Dünndarm und dem Dickdarm produziert (Panos et al., J. Clin. Invest. 92: 969–977 (1993); Ulich et al., Am. J. Path. 144; 862–868 (1994); Yi et al., Am. J. Path. 145: 80–85 (1994) und Ulich et al., J. Clin. Invest. 93: 1298–1306 (1994)). Die Rolle von KGF in der embryonalen Entwicklung oder der des Neugeborenen ist nicht im Einzelnen untersucht worden; es ist jedoch dokumentiert worden, dass KGF ein wichtiger Mediator der Samenblasenentwicklung bei der neugeborenen Maus ist (Alarid et al., P. N. A. S. 91: 1074–1078 (1994)).
Die veröffentlichte PCT-Patentanmeldung WO 90/08771 beschreibt die Reinigung von KGF aus dem konditionierten Medium einer menschlichen embryonalen Fibroblastenzelllinie, das partielle Aminosäuresequenzieren des gereinigten KGF, das Klonieren des Gens und die Expression des Gens in Bakterienzellen, um biologisch aktives rekombinantes KGF zu ergeben. Die vorstehende Veröffentlichung offenbart, dass KGF oder KGF-ähnliche Polypeptide als Wundheilungsmittel für Verbrennungswunden oder um transplantiertes Hornhautgewebe zu stimulieren verwendet werden können. Tatsächlich ist demonstriert worden, dass KGF die Re-Epithelisierung erhöht, und es erhöhte die Dicke des Epithels, als rekombinantes KGF auf Wunden topisch angewendet wurde, die im Kaninchenohr oder in Schweinehaut operativ induziert wurden (Pierce et al., J. Exp. Med. 179: 831–840 (1994) und Staiano-Coico of al., J. Exp. Med. 178: 865–878 (1993)).
EP 0303233 offenbart das menschliche Protein reg, das fähig ist, Insulin-produzierende B-Zellen der Pankreasinseln zu regenerieren. British Med. Bull., Vol. 45, (1989), S. 438–452 ist ein Übersichtsartikel über Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs), der unter anderem die Rolle von FGFs bei Diabetes offenbart.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Entdeckung, dass KGF nützlich ist, um die medizinische Störung zu behandeln, die als Diabetes bekannt ist, ist jetzt gemacht worden.
1 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkungen von KGF bei Ratten nach täglicher subkutaner Verabreichung bei einer Dosis von 5 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht (mg/kg) über sieben Tage hinweg darstellt. Streptozotocin (55 mg/kg) wurde zwei Tage nach dem Beginn der KGF-Behandlung einmal intravenös verabreicht. Die mit KGF behandelte Gruppe diabetischer Ratten wird in der rechten Hälfte der Abbildung gezeigt, über der Legende "Strep + KGF". Kontrollgruppen werden links und rechts davon dargestellt: Behandlung über sieben Tage hinweg mit Natriumchloridlösung und ohne Diabetesinduktion ("NaCl"), Behandlung über sieben Tage hinweg mit Natriumchloridlösung vor und nach Streptozotocin-induziertem Diabetes ("Strep") und Behandlung über sieben Tage hinweg mit KGF und ohne Diabetesinduktion ("KGF"). In nicht nüchternem Zustand gemessene Blutglucosespiegel in Milligramm pro Deziliter (mg/dl), die am fünften Tag nach der Diabetesinduktion (d. h. dem siebten Tag, nachdem die Behandlung mit KGF oder Natriumchlorid begonnen wurde) gemessen wurden, werden auf der senkrechten Achse gezeigt. Pro Gruppe gab es vier Ratten.
2 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkung von KGF im gleichen Rattenmodell auf andere physiologische Messungen, die Diabetes betreffen, darstellt. In nüchternem Zustand gemessene Harnglucosespiegel in mg/dl und in nüchternem Zustand gemessene Harnabgabe in Millilitern (ml), die in 24 Stunden am siebten Tag der Behandlung mit KGF oder Natriumchlorid ausgeschieden wurden, werden in der linken beziehungsweise rechten Hälfte auf der senkrechten Achse gezeigt. Die Legenden ("NaCl", "Strep", "Strep + KGF" und "KGF") haben die gleichen Bedeutungen wie in 1. Pro Gruppe gab es vier Ratten.
3 stellt tägliche, in nicht nüchternem Zustand gemessene Blutglucosespiegel in mg/dl im gleichen Rattenmodell für Diabetes über einen Zeitraum von acht Tagen hinweg nach der Diabetesinduktion dar. Einige Tiere wurden mit einer täglichen subkutanen Dosis (3 mg/kg) KGF behandelt, beginnend einen Tag nach der Krankheitsinduktion ("Strep + KGF"), während andere mit Natriumchloridlösung als Kontrolle vor- und nachbehandelt wurden ("Strep + NaCl"). Eine nicht diabetische Gruppe von Tieren, die mit Natriumchlorid behandelt wurden ("NaCl"), diente wieder als zusätzliche Kontrolle. Pro Gruppe gab es sechs Ratten.
4 stellt in nüchternem Zustand gemessene Harnglucosespiegel in mg/dl für das gleiche Rattenmodell über einen Zeitraum von sechs Tagen hinweg nach der Diabetesinduktion dar, in diesem Fall beginnend am zweiten Tag nach der Krankheitsinduktion. Die KGF-Behandlung wurde einen Tag nach der Diabetesinduktion begonnen. Die Symbole des Diagramms bezeichnen die gleichen drei Testgruppen wie in 3. Pro Gruppe gab es sechs Ratten.
5 zeigt die Harnabgabe in Millilitern pro Zeitraum von 24 Stunden von den gleichen Testgruppen wie in den 3 und 4, gemessen an den Tagen 2, 5, 20 und 8 nach der Diabetesinduktion. Die Symbole des Diagramms sind die gleichen wie in den 3 und 4. Pro Gruppe gab es sechs Ratten.
6 zeigt die durchschnittliche Wasseraufnahme für jede Gruppe von Ratten in dem Experiment. Den Ratten wurde Wasser ad libitum gegeben und die Aufnahme wurde als das in 24 Stunden getrunkene Volumen in Millilitern gemessen. Pro Gruppe gab es sechs Ratten.
7 zeigt die Wirkung eines KGF-Analogons auf Streptozotocin-induzierten Diabetes in Sprague-Dawley-Ratten.
8 zeigt die Nukleotid- (SEQ ID NO:1) und Aminosäure- (SEQ ID NO:2) Sequenzen des nativen KGF (die Nukleotide, die die reife Form des nativen KGF kodieren, werden durch die Basen 201 bis 684 von SEQ ID NO:1 dargestellt und die reife Form von KGF wird durch die Aminosäurereste 32 bis 194 von SEQ ID NO:2 dargestellt).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung von nativem KGF oder einem Mutein davon gerichtet, das sich durch die Deletion, Substitution und/oder Insertion von mindestens einer Aminosäure von nativem KGF unterscheidet und im Wesentlichen die Fähigkeit von nativem KGF hat, die Proliferation von Epithelzellen, bei denen es sich nicht um Fibroblasten handelt, zu stimulieren, zum Herstellen eines Medikaments zur Behandlung von Diabetes mellitus.
Die Verwendung der Erfindung kann unter Verwendung jeder Form eines Keratinozytenwachstumsfaktors ausgeführt werden, die, wie vorstehend definiert, einige oder alle biologischen Eigenschaften des natürlich vorkommenden Polypeptids, wie vorstehend definiert, hat. Derartige Formen schließen diejenigen ein, die aus biologischen Flüssigkeiten, Zellen und Gewebe isoliert und gereinigt werden oder die durch chemische Synthese oder durch rekombinante Mittel durch Expression in heterologen Wirtszellen, die mit der kodierenden DNA oder RNA transformiert worden sind, abgeleitet werden. Ein rekombinantes Verfahren zur Herstellung von Keratinozytenwachstumsfaktor wird in dem zuvor erwähnten WO 90/08771 beschrieben. Andere Fachleuten bekannte Verfahren können für den gleichen Zweck angepasst werden.
Zur Veranschaulichung sei gesagt, dass die Nukleotidsequenz, die das KGF-Protein oder ein Teilstück davon kodiert, in einen geeigneten Expressionsvektor, d. h. einen Vektor, der die nötigen Elemente zur Transkription und Translation der eingefügten Protein-kodierenden Sequenz enthält, eingefügt werden kann. Die nötigen Transkriptions- und Translationssignale können auch durch das native KGF-Gen und/oder dessen flankierende Regionen bereitgestellt werden. Eine Vielzahl von Wirts-Vektor-Systemen kann benutzt werden, um die Sequenz, die ein Protein kodiert, zu exprimieren. Diese schließen mit Virus (z. B. Vacciniavirus, Adenovirus, usw.) infizierte Säugerzellsysteme, mit Virus (z. B. Baculovirus) infizierte Insektenzellsysteme, Mikroorganismen wie zum Beispiel Hefevektoren enthaltende Hefe oder mit Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformierte Bakterien ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Expressionselemente dieser Vektoren variieren in ihren Stärken und Spezifitäten. Je nach dem benutzten Wirts-Vektor-System kann jedes beliebige geeignete Transkriptions- und Translationselement verwendet werden.
Jedes der zuvor beschriebenen Verfahren für die Insertion von Nukleotidfragmenten in einen Vektor kann verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die ein chimäres Gen enthalten, das aus geeigneten Transkriptions- und Translationskontrollsignalen und den Protein-kodierenden Sequenzen besteht. Diese Verfahren können in-vitro-Techniken mit rekombinanter DNA und synthetische Techniken und in-vivo-Rekombinationen (genetische Rekombination) einschließen. Die Expression einer das KGF-Protein oder -Peptidfragment kodierenden Nukleinsäuresequenz kann durch eine zweite Nukleinsäuresequenz reguliert werden, so dass das KGF-Protein oder -Peptid in einem Wirt exprimiert wird, der mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist. Zum Beispiel kann die Expression von KGF durch jedes auf dem Fachgebiet bekannte Promotor/Enhancer-Element kontrolliert werden. Promotoren, die verwendet werden können, um die KGF-Expression zu kontrollieren, schließen die Region des SV 40 early-Promotors, den im langen 3'-terminalen Repeat des Rous Sarcoma Virus enthaltenen Promotor, den Promotor der Thymidinkinase von Herpes, die regulatorischen Sequenzen des Metallothioneingens, prokaryotische Expressionsvektoren wie zum Beispiel den β-Lactamase-Promotor oder den tac-Promotor, pflanzliche Expressionsvektoren, die die Promotorregion der Nopalinsynthetase umfassen (Herrera-Estrella et al.) oder den 35S-RNA-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus und den Promotor für das photosynthetische Enzym Ribulosebisphosphatcarboxylase, Promotorelemente aus Hefe oder anderen Pilzen, wie zum Beispiel den Gal-4-Promotor, den ADC (Alkoholdehydrogenase)-Promotor, den PGK (Phosphoglycerinkinase)-Promotor, den Promotor der alkalischen Phosphatase und die folgenden tierischen Trankriptionskontrollregionen, die Gewebespezifität aufweisen und in transgenen Tieren benutzt worden sind: die Kontrollregion des Gens für Elastase I, die in Azinuszellen des Pankreas aktiv ist, die Kontrollregion des Insulingens, die in β-Zellen des Pankreas aktiv ist, die Kontrollregion des Immunglobulingens, die in Lymphoidzellen aktiv ist (Grosschedl et al.), die Kontrollregion des Mäuse-Mamma-Tumorvirus, die in Hoden-, Brust-, Lymphoid- und Mastzellen aktiv ist (Leder et al.), die Kontrollregion des Albumingens, die in der Leber aktiv ist, die Kontrollregion des α-Fetoproteingens, die in der Leber aktiv ist, die Kontrollregion des α-Antitrypsingens, die in der Leber aktiv ist, die Kontrollregion des β-Globingens, die in Knochenmarkszellen aktiv ist, die Kontrollregion des Gens für das basische Myelinprotein, die in Oligodendrozyten im Gehirn aktiv ist, die Kontrollregion des Gens für die leichte Myosinkette-2, die im Skelettmuskel aktiv ist, und die Kontrollregion des Gens für Gonadotropin-releasing-Hormon, die im Hypothalamus aktiv ist, ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Expressionsvektoren, die Inserts des KGF-Gens enthalten, können durch DNA-DNA-Hybridisierung, Anwesenheit oder Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen und Expression eingefügter Sequenzen identifiziert werden, die Fachleuten offensichtlich und bekannt sein werden.
Einige auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können verwendet werden, um das KGF-Gen zu vermehren. Sobald ein geeignetes Wirtssystem und Wachstumsbedingungen etabliert sind, können rekombinante Expressionsvektoren vermehrt und in großen Mengen hergestellt werden.
Zusätzlich kann ein Wirtszell-Stamm gewählt werden, der die Expression der eingefügten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt in der spezifischen erwünschten Weise modifiziert und prozessiert. Die Expression von bestimmten Promotoren aus kann in Anwesenheit bestimmter Induktoren erhöht werden. So kann die Expression des gentechnisch erzeugten KGF-Proteins kontrolliert werden. Darüber hinaus haben unterschiedliche Wirtszellen kennzeichnende und spezifische Mechanismen für die translationale und posttranslationale Prozessierung und Modifikation (zum Beispiel Glykosylierung, γ-Carboxylierung von Glutaminsäureresten, proteolytische Spaltung) von Proteinen. Geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme können gewählt werden, um die erwünschte Modifikation und Prozessierung des exprimierten fremden Proteins sicherzustellen.
Es sollte selbstverständlich sein, dass die Begriffe "Keratinozytenwachstumsfaktor" und "KGF", wie sie in dieser Beschreibung eingesetzt werden, natives KGF und dem KGF analoge Proteine (oder "Muteine"), falls nicht anders angegeben, einschließen und austauschbar bedeuten sollen, die durch eine Peptidsequenz, die im Wesentlichen die gleiche wie die Peptidsequenz des nativen KGF ist, und durch das Beibehalten von einiger oder der gesamten biologischen Aktivität des nativen KGF, besonders der Proliferation von Epithelzellen, bei denen es sich nicht um Fibroblasten handelt (z. B. durch das Aufweisen einer mindestens etwa 500 Mal höheren Stimulierung von BALB/MK-Keratinozytenzellen als der von NIH/3T3-Fibroblasten, und einer mindestens etwa 50 Mal höheren Stimulierung von BALB/MK-Keratinozytenzellen als für BS/589-Epithelzellen oder für CC1208-Epithelzellen, wie durch Einbau von H-Thymidin bestimmt wird), gekennzeichnet sind. Mit "durch eine Peptidsequenz gekennzeichnet, die im Wesentlichen die gleiche wie die Peptidsequenz des nativen KGF ist", ist eine Peptidsequenz gemeint, die durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, die fähig ist, mit den Nukleotiden 201 bis 684 von SEQ ID NO:1 zu hybridisieren, vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen.
Die Bestimmung einer entsprechenden Aminosäureposition zwischen zwei Aminosäuresequenzen kann bestimmt werden, indem die beiden Sequenzen abge glichen werden, um die Übereinstimmungen von Resten zu maximieren, einschließlich des Verschiebens des Amino- und/oder Carboxyterminus, des Einführens von Lücken nach Bedarf und/oder des Deletierens von Resten, die als Inserts in dem Kandidaten vorliegen. Datenbanksuchen, Sequenzanalyse und -manipulationen können unter Verwendung eines der wohlbekannten und routinemäßig verwendeten Programme mit einem Algorithmus zur Sequenzhomologie- bzw. -identitätsabfrage (z. B. Pearson und Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 2444–2448; Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol., 215: 403–410; Lipman und Pearson (1985), Science, 222: 1435 oder Devereux et al. (1984), Nuc. Acids Res., 12: 387–395) durchgeführt werden.
Stringente Bedingungen im Zusammenhang mit Hybridisierung sind stringente kombinierte Bedingungen von Salz, Temperatur, organischen Lösungsmitteln und anderen Parametern, die üblicherweise bei Hybridisierungsreaktionen kontrolliert werden. Beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierung in 4 × SSC bei 62–67 °C, gefolgt von ungefähr einer Stunde langem Spülen in 0,1 × SSC bei 62–67 °C. Alternativ dazu sind beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingungen Hybridisierung in 45–55 % Formamid, 4 × SSC bei 40–45 °C. [Siehe T. Maniatis et. al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual); Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Seiten 387 bis 389].
So schließen die Proteine allelische Variationen oder eine Deletion (Deletionen), eine Substitution (Substitutionen) oder eine Insertion (Insertionen) von Aminosäureresten, einschließlich von Fragmenten, chimären oder Hybridmolekülen des nativen KGF, ein. Ein Beispiel für KGF schließt Proteine ein, bei denen die Cys¹ und Cys¹⁵ entsprechenden Reste ersetzt oder deletiert sind, worauf in Anspruch 5 Bezug genommen wird, wobei das sich ergebende Molekül im Vergleich zu dem Ausgangsmolekül eine verbesserte Stabilität hat. Ein anderes Beispiel für KGF schließt Ladungsänderungs-Polypeptide ein, wobei einer oder mehrere der Aminosäurereste 41–154 des nativen KGF (vorzugsweise die Reste Arg⁴¹, Gln⁴³, Lys⁵⁵, Lys⁹⁵, Lys¹²⁸, Asn¹³⁷, Gln¹³⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gln¹⁵², Lys¹⁵³ oder Thr¹⁵⁴) deletiert oder mit einem neutralen Rest oder einem negativ geladenen Rest, der ausgewählt wird, um ein Protein mit einer verringerten positiven Ladung zu bewirken, substituiert sind. Noch ein weiteres Beispiel für KGF schließt Proteine ein, die durch das Substituieren von mindestens einer Aminosäure mit einem höheren Schleife bildenden Potenzial für mindestens eine Aminosäure innerhalb der Schleife bildenden Region von Asn¹¹⁵-His¹¹⁶-Tyr¹¹⁷-Asn¹¹⁸-Thr¹¹⁹ des nativen KGF erzeugt werden. Ein noch weiteres Beispiel schließt Proteine mit einer oder mehreren Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Additionen innerhalb einer Region von 123–133 (Aminosäuren 154–164 von SEQ ID NO:2) des nativen KGF ein; diese Proteine können eine agonistische oder antagonistische Aktivität haben.
Spezifisch offenbarte Proteine schließen die folgenden KGF-Moleküle ein (auf die durch den Rest verwiesen wird, der an dieser Position im reifen Protein (abzüglich Signalsequenz) gefunden wird, das in SEQ ID NO:2 dargelegt wird, gefolgt von der Aminosäureposition in Klammern und dann entweder dem substituierten Rest oder "-", um eine Deletion zu bezeichnen): C(1,15)S, ΔN15-ΔN24, ΔN3/C(15)S, ΔN3/C(15)-, ΔN8/C(15)S, ΔN8/C(15)-, C(1,15)S/R(144)E, C(1,15)S/R(144)Q, ΔN23/R(144)Q, C(1,15,40)S, C(1,15,102)S, C(1,15,102,106)S, ΔN23/N(137)E, ΔN23/K(139)E, ΔN23/K(139)Q, ΔN23/R(144)A, ΔN23/R(144)E, ΔN23/R(144)L, ΔN23/K(147)E, ΔN23/K(147)Q, ΔN23/K(153)E, ΔN23/K(153)Q, ΔN23/Q(152)E/K(153)E, R(144)Q und H(116)G.
Zur praktischen Anwendung bei einer therapeutischen Behandlung kann KGF zu geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verabreichung auf jede herkömmliche Weise formuliert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf parenterale Abgabe, wie zum Beispiel subkutane, intravenöse oder intramuskuläre Injektion. Diese Standardformulierungen würden am wahrscheinlichsten geeignete Puffersalze, Konservierungsmittel und Stabilisierungsmittel für eine flüssige Formulierung oder geeignete Puffersalze, Stabilisierungsmittel, Konservierungsmittel und Füllmittel enthalten, die für eine lyophilisierte Formulierung üblich sind. Es ist auch möglich, dass KGF in einer Form mit langsamer Freisetzung durch ein intradermales, subkutanes oder intraabdominales Depot verabreicht werden könnte. Diese KGF-Formen mit langsamer Freisetzung können unter Verwendung von Standardverfahren formuliert werden, die von Fachleuten beherrscht werden. Die meisten praktischen Verabreichungsregimes für KGF können vom Patienten zu Hause, unter Verwendung von subkutaner Injektion oder intradermaler Abgabe, oder durch den Arzt, unter Verwendung einer Langzeitformulierung mit langsamer Freisetzung, die subkutan oder in die Bauchhöhle implantiert wird, benutzt werden.
Das Dosierungsregime für KGF kann empirisch durch den Fachmann bestimmt werden. Im Allgemeinen wird erwartet, dass KGF in Mengen zwischen etwa 0,001 und etwa 10 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht (des Patienten) pro Tag, und vorzugsweise zwischen etwa 0,05 und etwa 5 mg/kg/Tag wirksam sein wird. Das therapeutische Regime kann einzelne oder wiederholte Injektionen oder eine langsame, kontinuierlich freigesetzte, niedrige KGF-Dosis einschließen, je nach Art und Schweregrad der Erkrankung bei jedem Patienten. Der therapeutische Verlauf der Behandlung mit KGF muss genügend pankreatische β-Zell-Funktion produzieren, um die Blutglucosespiegel wäh rend verschiedener metabolischer Anforderungen zu normalisieren, aber häufige oder tiefgreifende Hypoglykämie vermeiden. Das Ziel ist, die Inselzellfunktion von Patienten mit diagnostiziertem Diabetes Typ I wiederherzustellen, um die Notwendigkeit konstanter exogener Insulinerfordernisse zu vermeiden. Patienten mit neu diagnostiziertem Diabetes Typ I, bei denen etwas Inselzellfunktion verbleibt, wären Kandidaten für eine KGF-Therapie. KGF könnte verwendet werden, um die Inselfunktion derartiger Patienten aufrechtzuerhalten, um die dauerhafte Manifestation der Erkrankung zu lindern, zu verzögern oder zu umgehen. Man glaubt, dass Diabetes Typ I eine Autoimmunerkrankung ist und eine immunsupprimierende Therapie wird zu seiner Behandlung verwendet. Eine KGF-Therapie in Übereinstimmung mit dieser Erfindung kann in Zusammenhang oder in Kombination mit Immunsuppressiva zur Behandlung der Erkrankung verwendet werden, einschließlich als ein Zusatz im Setting einer Inselzelltransplantation. Die Erfindung wird mit Bezug auf die folgende Anwendung weiter veranschaulicht.
Materialien
Die in den folgenden in-vivo-Untersuchungen verwendeten Testmaterialien waren, wie spezifisch angegeben, KGF mit nativer (natürlich vorkommender) Sequenz, ein KGF-Analogon, bei dem die Cysteinreste an den Positionen 1 und 15 der nativen Aminosäuresequenz unter Verwendung von Standardtechniken der ortsspezifischen Mutagenese durch Serin ersetzt worden waren (d. h. C(1,15)S) und ein KGF-Analogon mit einer Deletion der ersten 23 Aminosäuren des N-Terminus des nativen KGF unter Verwendung von Standardtechniken (d. h. ΔN23). Alle Proteine wurden durch rekombinante Expression in E. coli hergestellt und bis zur Homogenität gereinigt und sie enthielten jeweils einen Methioninrest (Met^–1) am N-Terminus. Jedes Protein wurde als subkutane Formulierung verabreicht. Frühere Experimente demonstrierten, dass diese Proteine in adulten Ratten vergleichbare Aktivitäten hatten, wenn sie systemisch verabreicht wurden. Das KGF mit nativer Sequenz und die Analoga hatten jeweils vergleichbare Aktivitäten in den diabetischen und nicht-diabetischen Ratten, die in den folgenden Untersuchungen verwendet wurden.
In-vivo-Modell für Diabetes
Chemisch induzierte Modelle für Diabetes mellitus in verschiedenen Tierarten sind klassischerweise verwendet worden, um die Erkrankung und ihre Behandlung zu untersuchen. Streptozotocin induziert Diabetes in der Maus, der Ratte, im Hamster, Hund und Affen, obwohl Untersuchungen in Ratten und Mäusen am meisten benutzt werden (Junod et al., Proc. Soc. Exp. Pio. Med. 126: 210–205 (1967); Rerup, Pharm. Rev. 22, 485–518 (1970); Rossini et al., P. N. A. S. 74: 2485–2489 (1977) und Ar'Rajab und Ahren, Pancreas 8: 50–57 (1993)). Bei Ratten induzieren Streptozotocindosen zwischen 45 und 70 mg/kg als einzelne intravenöse Dosis eine stabile Erkrankung. Dosen unter 45 mg/kg induzieren einen transienten Erkrankungszustand, der reversibel ist. Innerhalb eines Tages nach der Streptozotocininjektion wird der hyperglykämische Zustand induziert. Die Blutinsulinspiegel bleiben im Vergleich zu normalen Ratten im Wesentlichen unverändert; der Gesamtgehalt von Insulin und C-Peptid im Pankreas wird jedoch schwerwiegend verringert. Ratten manifestieren die klassischen Anzeichen und Symptome von Diabetes bei Menschen: erhöhte Blutglucosespiegel (Hyperglykämie), Glucose im Harn (Glucosurie), erhöhter Durst (Polydipsie), erhöhte Harnausscheidung (Polyurie), erhöhter Appetit (Hyperphagie).
Die in dieser Offenbarung beschriebenen Untersuchungen wurden mit dem Streptozotocin-induzierten Diabetes-Modell in Sprague-Dawley-Ratten ausgeführt. Männliche Ratten, die zu Beginn der Untersuchung 200–260 Gramm wogen, wurden verwendet. Diabetes wurde durch eine einzelne intravenöse Injektion von Streptozotocin bei 50 mg Streptozotocin in Natriumzitratpuffer pro kg Körpergewicht induziert. Nicht-diabetische Kontrollratten erhielten zu Kontrollzwecken eine einzelne intravenöse Injektion von Natriumzitratpuffer. KGF wurde täglich als subkutane Injektion verabreicht. Die KGF-Dosis war je nach Experiment 3 oder 5 mg/kg/Tag. Im ersten Experiment wurde die KGF-Therapie, zwei Tage bevor Diabetes induziert wurde, begonnen und nach der Diabetesinduktion bis zu insgesamt acht Injektionen fortgesetzt. Im zweiten und dritten Experiment wurde die KGF-Therapie, die subkutan verabreicht wurde, einen Tag nach der Diabetesinduktion mit Streptozotocin begonnen. Im vierten Experiment wurde ein 7-Tage-Verlauf der KGF-Therapie 7 Tage nach der Streptozotocinbehandlung begonnen und die Tiere wurden dann für weitere 12 Wochen verfolgt. Bei allen Experimenten außer dem vierten Experiment wurden Blutglucosespiegel, Harnglucosespiegel und Harnvolumen als Endpunkte für die Analyse verwendet. Zusätzlich wurden Wasseraufnahme, C-Peptid-Spiegel im Harn oder Gesamtgehalt von Insulin und C-Peptid im Pankreas in manchen Experimenten gemessen. Im vierten Experiment war der einzige bewertete Endpunkt die Blutglucose.
Weil ein großer Anteil des Insulins durch die Leber aus dem Kreislauf entfernt wird, reflektiert eine Messung der peripheren Insulinkonzentrationen posthepatische Stoffwechselereignisse anstelle der Insulinsekretion aus dem Pankreas. Deshalb werden oft Messungen von C-Peptid gemacht und als ein peripherer Marker der Insulinsekretion verwendet. C-Peptid wird durch das Prozessieren von Pro-Insulin zu Insulin produziert. Insulin und C-Peptid werden aus den β-Zellen in äquimolaren Mengen sezerniert und nur eine kleine Menge C-Peptid wird durch die Leber extrahiert.
In-vivo-Verabreichung von KGF
Erste Untersuchung: Unter Verwendung des beschriebenen Diabetesmodells wurde die Wirksamkeit von KGF zum Behandeln von Diabetes zunächst unter Verwendung der folgenden vier Gruppen von Testratten ausgewertet:

1. Kontroll- (nicht-diabetische) Ratten, mit subkutan verabreichter Natriumchloridlösung vor- und nachbehandelt, kein Streptozotocin;
2. Ratten, die mit intravenös verabreichten 50 mg/kg Streptozotocin diabetisch gemacht wurden, mit subkutan verabreichter Natriumchloridlösung vor- und nachbehandelt;
3. Ratten, die mit intravenös verabreichten 50 mg/kg Streptozotocin diabetisch gemacht wurden, mit subkutan verabreichtem nativem KGF vor- und nachbehandelt; und
4. Kontrollratten, mit subkutan verabreichtem nativem KGF behandelt, kein Streptozotocin.

Ratten, die in allen vier Gruppen behandelt wurden, wurde entweder natives KGF bei einer Dosis von 5 mg/kg pro Tag oder ein gleiches Volumen Natriumchloridlösung über einen Zeitraum von sieben Tagen hinweg verabreicht. Zwei Tage nach dem Beginn der KGF- oder Natriumchlorid-Verabreichung wurde den Ratten in den Gruppen 2 und 3 eine einzelne Dosis von 55 mg/kg Streptozotocin, intravenös verabreicht, gegeben. Von dieser Dosis ist bekannt, dass sie bei Ratten mäßigen Diabetes verursacht. Alle Ratten wurden auf in nicht nüchternem Zustand gemessene Blutglucosespiegel, Körpergewicht, in nüchternem Zustand gemessene Harnglucosespiegel und Harnabgabe hin überwacht. Sieben Tage nach Verabreichung des Streptozotocin an die Gruppen 2 und 3 (d. h. neun Tage nach Beginn der Untersuchung) wurden die Ratten in allen Gruppen über Nacht nüchtern gehalten, getötet und dann obduziert. Der Pankreas wurde jeweils in Zink- Formalin konserviert, eingebettet und dann für die routinemäßige Histopathologie verarbeitet.
Der im nicht nüchternen Zustand gemessene Blutglucosespiegel am fünften Tag nach Verabreichung von Streptozotocin war in den diabetischen Kontrollratten (Gruppe 2) im Vergleich zu den nicht diabetischen Kontrollratten (Gruppe 1) signifikant erhöht, wie in 1 gesehen wird. Diabetische Ratten, die vor der Streptozotocin-Verabreichung mit KGF vorbehandelt und mit KGF nachbehandelt worden waren (Gruppe 3), hatten einen signifikant niedrigeren im nicht nüchternen Zustand gemessenen Blutglucosespiegel als die nicht mit KGF behandelten diabetischen Kontrollen (Gruppe 2), aber immer noch erhöht relativ zu der nicht diabetischen Kontrollen (Gruppe 1), siehe 1. Der im nüchternen Zustand gemessene Harnglucosespiegel und das Harnvolumen der diabetischen Kontrollratten der Gruppe 2 waren am siebten Tag der Untersuchung (d. h. fünf Tage nach der Injektion von Streptozotocin) signifikant erhöht, wie in 2 gesehen wird. Dieser Zustand ist auf die Zerstörung der Insulin produzierenden β-Zellen in den Pankreasinseln und die schwerwiegende Dysregulierung des Glucosestoffwechsels, die zur Ausscheidung von Glucose im Harn führt, zurückzuführen. Im Gegensatz dazu zeigten die diabetischen Ratten der Gruppe 3, die mit KGF vor- und nachbehandelt wurden, eine signifikant geringere Erhöhung der im nüchternen Zustand gemessenen Harnglucose als die diabetische Kontrolle (Gruppe 2). Die Harnabgabe für die KGF-behandelte Gruppe war auch signifikant geringer als für die diabetische Kontrollgruppe; siehe 2.
Diese Ergebnisse sind konsistent mit der Induktion eines mäßigen Diabetes-Zustandes in der Ratte unter Verwendung von Streptozotocin als dem induzierenden Mittel. Die diabetischen Ratten, die vor der Diabetesinduktion mit KGF behandelt wurden und bei denen KGF nach der Induktion fortgesetzt wurde, zeigten Symptome, die auf eine mildere Form von Diabetes hindeuteten. So kann geschlossen werden, dass die KGF-Therapie entweder die Induktion der Erkrankung teilweise verhinderte oder Insulin produzierende Inselzellen nach einer Streptozotocin-induzierten β-Zell-Zerstörung wiederherstellte. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterschieden, wurde als Nächstes eine nach der Erkrankungsinduktion beginnende KGF-Therapie untersucht.
Zweite Untersuchung: Unter Verwendung des gleichen, zuvor beschriebenen Diabetesmodells wurde die Wirksamkeit von KGF zum Behandeln von Diabetes unter Verwendung der folgenden drei Gruppen von Testratten weiter ausgewertet:

1. Kontrollratten, die mit subkutan verabreichter Natriumchloridlösung behandelt wurden, kein Streptozotocin;
2. Ratten, die mit intravenös verabreichtem Streptozotocin diabetisch gemacht wurden und mit subkutan verabreichter Natriumchloridlösung nachbehandelt wurden; und
3. Ratten, die mit intravenös verabreichtem Streptozotocin diabetisch gemacht wurden, dann mit subkutan verabreichtem C(1,15)S nachbehandelt wurden.

Den Testratten wurde eine Dosis von 3 mg/kg pro Tag oder Natriumchloridlösung über einen Zeitraum von dreizehn Tagen hinweg, beginnend einen Tag nach der Diabetesinduktion, verabreicht. Während des ganzen Testzeitraums wurden der Blutglucosespiegel, Harnglucosespiegel, das Volumen der Harnabgabe und des aufgenommenen Wasser jeweils im nüchternen und nicht nüchternen Zustand überwacht. Die Ratten in den Gruppen 2 und 3 wurden innerhalb von einem Tag nach Verabreichung von Strepto-zotocin diabetisch (3). Die KGF-Therapie begann in Gruppe 3 vierundzwanzig Stunden nach dem Streptozotocin und wurde danach täglich fortgesetzt. Die im nicht nüchternen Zustand gemessene Blutglucose wurde an den Tagen 1, 2, 4, 5 und 8 gemessen. Wie 3 demonstriert, war die KGF-Therapie bei Gruppe 3 in der Lage, den Glucosespiegel im Blutkreislauf bis zum Tag 4 bis in die Nähe von dem der Kontrollratten (Gruppe 1) zu senken, und dies setzte sich bis Tag 8 fort. Die im nicht nüchternen Zustand gemessene Harnausscheidung von Glucose wurde an den Tagen 2, 5 und 8 auch gemessen. 4 demonstriert, dass die KGF-Therapie die Harnglucosespiegel mehr als 8-fach senkte. In ähnlicher Weise wurde auch die Harnabgabe in den KGF-behandelten diabetischen Ratten normalisiert, als sie an den Tagen 5 und 8 gemessen wurde (5). Die Wasseraufnahme in Millilitern pro Zeitraum von vierundzwanzig Stunden erhöhte sich in den KGF-behandelten diabetischen Ratten nicht, während sie es in den diabetischen Ratten, die Natriumchloridlösung als Kontrolle erhielten, tat (6). Die Ratten wurden am Tag 8 über Nacht nüchtern gehalten und die im nüchternen Zustand gemessenen Blutglucosespiegel am Tag 9 waren bei diesen drei Gruppen nicht unterschiedlich. Die im nüchternen Zustand gemessene Wasseraufnahme und Harnausscheidung waren am Tag 9 signifikant geringer bei den KGF-behandelten Ratten im Vergleich zu diabetischen Ratten, was weiterhin auf eine Verbesserung des Erkrankungszustandes hindeutet.
Dritte Untersuchung: Die dritte Untersuchung war eine Wiederholung der zweiten Untersuchung und bestätigte die in den 3–6 vorgelegten Messwerte. Als die Ratten obduziert wurden, wurde in diesem Experiment zusätzlich der ganze Pankreas aus jeder Ratte entfernt und das Insulin und C-Peptid wurde extrahiert und quantifiziert. Die nachstehende Tabelle 1 zeigt die mittlere Menge Insulin oder C-Peptid, die in jeder der drei Testgruppen aus dem Pankreas extrahiert werden konnte. Die KGF- Therapie war in der Lage, den Gesamtgehalt an Insulin und C-Peptid im Pankreas diabetischer Ratten im Vergleich zu diabetischen Ratten, die mit Natriumchloridlösung behandelt wurden, zu erhöhen. TABELLE 1

¹ n = 3–4 Ratten pro Gruppe
² Mittelwert ± Standardfehler

Die vierte Untersuchung untersuchte die Wirkung von KGF auf Streptozotocin-induzierten Diabetes in Sprague-Dawley-Ratten. Am Tag 0 wurden Gruppen von Ratten entweder mit 45 oder 50 mg/kg Streptozotocin (STZ) belastet. Nach diesen Behandlungen wurden im nicht nüchternen Zustand gemessene Blutglucosespiegel täglich überwacht, um den Schweregrad der Inselverletzung zu bewerten. Am Tag 5 wurden die STZ-behandelten Tiere je nach Ausmaß der Hyperglykämie in eine von zwei Gruppen (20/Gruppe) platziert. Der trennende Wert wurde auf einen Blutglucosespiegel von 300 mg/dl festgesetzt. Eine Gruppe von nicht mit STZ behandelten Tieren diente als Kontrolle. Am Tag 7 wurde 10 Tieren jeder hyperglykämischen Gruppe ΔN23 (3 mg/kg/Tag) oder PBS 7 Tage lang durch subkutane Injektion gegeben. Die Blutglucosespiegel wurden dann täglich, jeden zweiten Tag oder wöchentlich überwacht und werden in 7 dargelegt. Man beachte, dass mit STZ behandelte Tiere aus beiden Gruppen, die KGF erhielten, während des Zeitraums der KGF-Dosierung eine signifikante Senkung in der Blutglucose aufwiesen. Wichtigerweise stabilisierte sich der Hauptabfall in der Blutglucose, den die mit STZ behandelten Tiere mitmachten, von der Gruppe, die von einer Blutglucose von <300 mg/dl ausging, bei etwa 150 mg/dl, während der Abfall in der Blutglucose, der in der Gruppe gesehen wurde, die von einer Blutglucose von >300 mg/dl ausging, nur transient war. Man beachte, dass die Tagesskala nichtlinear ist. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung von nativem KGF oder einem Mutein davon, das sich durch die Deletion, Substitution und/oder Insertion von mindestens einer Aminosäure von nativem KGF unterscheidet und im Wesentlichen die Fähigkeit von nativem KGF hat, die Proliferation von Epithelzellen, bei denen es sich nicht um Fibroblasten handelt, zu stimulieren, zum Herstellen eines Medikaments zur Behandlung von Diabetes mellitus.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem nativen KGF oder dem Mutein davon um einen rekombinant hergestellten Keratinozytenwachstumsfaktor handelt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei das native KGF oder das Mutein davon durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, die eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) der DNA-Sequenz, die durch die Basen 201 bis 684 von SEQ ID NO:1 oder ein kodierendes Teilstück davon dargestellt wird; (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die das KGF-Polypeptid von SEQ ID NO:2 kodiert; und (iii) einer Sequenz, die an eine komplementäre Sequenz von (i) oder (ii) hybridisiert.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei das native KGF oder das Mutein davon eine Aminosäuresequenz von reifem Keratinozytenwachstumsfaktor (wie durch die Aminosäurereste 32–194 von SEQ ID NO:2 dargestellt) oder ein Fragment davon oder ein Analogon davon umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei das native KGF oder das Mutein davon aus den Folgenden ausgewählt ist: C(1,15)S, ΔN15, ΔN16, ΔN17, ΔN18, ΔN19, ΔN20, ΔN21, ΔN22, ΔN23, ΔN24, ΔN3/C(15)S, ΔN3/C(15)-, ΔN8/C(15)S, ΔN8/C(15)-, C(1,15)S/R(144)E, C(1,15)S/R(144)Q, ΔN23/R(144)Q, C(1,15,40)S, C(1,15,102)S, C(1,15,102,106)S, ΔN23(137)E, ΔN23/K(139)E, ΔN23/K(139)Q, ΔN23/R(144)A, ΔN23R(144)E, ΔN23/R(144)L, ΔN23/K(147)E, ΔN23/K(147)Q, ΔN23/K(153)E, ΔN23/K(153)Q, ΔN23/Q(152)E/K(153)E, R(144)Q oder H(116)G, wobei jedes Molekül durch Bezug auf den Rest bezeichnet wird, der in reifem Keratinozytenwachstumsfaktor an dieser Position gefunden wird, wie durch die Aminosäurereste 32–194 von SEQ ID NO:2 dargestellt wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei das native KGF oder das Mutein davon in Bakterienzellen rekombinant hergestellt wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das native KGF oder das Mutein davon ein aminoterminales Methionin hat.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei das native KGF oder das Mutein davon in E. coli hergestellt wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das native KGF oder das Mutein davon mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger formuliert wird.
Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger eine Langzeitformulierung mit langsamer Freisetzung ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das native KGF oder das Mutein davon durch parenterale Injektion, wie zum Beispiel subkutane, intravenöse oder intramuskuläre Injektion, zu verabreichen ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das native KGF oder das Mutein davon in einer Menge von 0,001 Milligramm bis 10 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag zu verabreichen ist.
Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei die Menge an nativem KGF oder dem Mutein davon von 0,05 Milligramm bis 5 Milligramm pro Kilogramm pro Tag beträgt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei es sich bei dem Patienten um einen Menschen handelt.