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Hintergrund
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt
ein Verfahren zur Linderung von Schmerzen und zur Behandlung von
Verhaltens- und Wahrnehmungsstörungen durch
Anwendung einer Myoblastentransfertherapie zur Verfügung, um
eine lang anhaltende, kontinuierliche in vivo-Zuführung von
Peptiden, die analgetische Aktivität haben, zu erhalten.
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Die moderne Analgesie entwickelte
sich mit dem Vorschlag von Pomeranz et al., Exp. Neurol. 54: 172
(1977), dass ein morphinartiges hypophysäres Peptid die Akupunkturanalgesie
vermittelt, deutlich weiter. Es wurde festgestellt, dass Elektroakupunktur bei
anästhesierten
Katzen die Reaktionen in Rückenmarkneutronen
auf schädliche
Stimuli reduziert und die Piepsschwelle bei wachen Mäusen erhöht. Der beobachtete,
längere
Zeitraum involvierte einen hormonellen Mechanismus für die Reaktion.
Eine spinale Transaktion, Dezerebration oder Hypophysektomie eliminierten
diesen Akupunktureffekt und intravenöse Injektionen von Naloxon,
einem Morphinantagonisten, reduzierten sie ebenfalls deutlich.
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Diese Resultate zeigen, dass Elektroakupunktur
sensorische Nerven stimuliert, die die Hypophyse zur Freisetzung
morphinartiger Hormone (Peptide) aktiviert, welche eine verlängerte Verringerung
bei der Übertragung
entlang nozizeptiver Bahnen bewirken. Es wird davon ausgegangen,
dass dieser Mechanismus ein Hauptmediator allgemeiner und lokalisierter
Analgesie ist.
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Morphinartige Peptide wurden identifiziert und
Rezeptoren für
morphinartige Peptide und für
andere Opioidpeptide wurden im Gehirn, im Darm, der Hypophyse, dem
Pankreas und in der Plazenta gefunden. Hughes et al, Nature 258:
577 (1975); Pert et al., Science 179: 1011 (1979). Diese Peptide
sind als β-Endorphine
und Enkephaline bekannt. Cooper et al., THE BIO-CHEMICAL BASIS OF PHARMACOLOGY, 4. Ausg.
(Oxford University Press, New York 1982). Darüber hinaus erzeugt eine Stimulation
von Gehirnneuronen mit einem Opioidpeptid, zum Beispiel Endorphin,
Analgesie. Fields et al., Ann. Rev. Physiol. 40: 217 (1978). Dieser
Effekt kann durch Naloxon umgekehrt werden.
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Opioidpeptide, speziell β-Endorphine,
sind im Wesentlichen Nervenhormone oder Transmitter, die alle Körpergewebe
durch Diffusion erreichen. Das Vorliegen von Endorphinrezeptoren
in verschiedenen Bereichen des Dienzephalons und der Großhirnrinde in
großen
Mengen legt nahe, dass die konjugierten Opioidpeptide in der Analgesie
eine Rolle spielen, die über
die eines einfachen Modulators der Schmerzwahrnehmung hinausgeht.
Covenas et al. Neuropeptides 30: 261 (1996); Bernstein et al., Neurosci.
Lett. 215: 33 (1996); Bianchi et al., Brain Res. Bull. 40: 269 (1996).
Tatsächlich
wurde festgestellt, dass Erhöhungen
der Spiegel an β-Endorphinen
im Liquor cerebrospinalis und Plasma die Verhaltensmuster, die Patienten
zeigen, welche an Stress, psychiatrischen Störungen, Alkoholismus, Drogenabhängigkeit,
Fettsucht und Diabetes leiden, modulieren und optimieren. Ryu et
al., Am. J. Chin. Med. 24: 193 (1996); Odagiri et al., Int. J. Sports
Med. 17: 325 (1996); Dalayeun et al., Biomed. Pharmacother. 47:
311 (1993); Gianoulakis et al, J. Phsychiatry Neuroski. 18: 148 (1993).
Diese Erhöhungen
begünstigen
auch die durch natürliche
Killerzellen vermittelte Zytotoxizität. Jonsdottir et al., Regul.
Pept. 23 : 113 (1996) ; Sacerdote et al., Regul. Pept. 63 : 79 (1996).
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Analgesie wird auch durch Bindung
eines Schmerzmediators, „Substanz
P" genannt, an seinen Rezeptor
beeinträchtigt.
Es gibt viele Ähnlichkeiten zwischen
den Endigungen von Opioidneuronen und den Endigungen von gegenüber der
Substanz P empfindlichen Neuronen. Beispielsweise vermitteln beide
Endigungstypen eine Schmerzempfindung im Rückenmark. Jessel et al., Nature
268 : 549 (1977). Wie zum Beispiel in der japanischen Patentschrift
J 3133998 beschrieben wird, hat sich gezeigt, dass Substanz P-Rezeptoren
als Analgetika wirken, indem sie die Aktivität der Substanz P maskieren.
Gemäß der PCT
Anmeldung WO 92/16547 bindet der NK-1-Rezeptor vorzugsweise Substanz
P und kann zur Behandlung von Schmerzen, Entzündungskrankheiten, psychischen
Krankheiten und Stress eingesetzt werden.
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Patienten, die von Krankheitsbildern
wie Stress, psychosomatischen Störungen,
Alkoholismus, Drogenmissbrauch, Fettsucht und Diabetes geplagt werden,
können
ein gewisses Maß an
Linderung durch einen Spiegel an endogenen Opioidpeptiden in ihrem
Plasma übernormal
erhalten. Eine klinische Linderung der Symptome dieser Krankheitsbilder
waren mit der Bindung von Opioidpeptiden mit ihren Rezeptoren verbunden,
was in direkter Korrelation mit dem Opioidpeptidspiegel im Blut
des Patienten und im Liquor cerebrospinalis steht. Patienten können auch
von erhöhten
Spiegeln an Substanz P-Rezeptoren oder Substanz P-Analoga profitieren.
Siehe WO 92/16547, supra, und PCT-Anmeldung WO 91/02745. Bis heute
war noch keine nachteilige Reaktion mit physiologischen Erhöhungen der
Spiegel an β-Endorphinen,
Enkephalenen oder Substanz P-Rezeptoren im Plasma oder im Liquor
cerebrospinalis bekannt.
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Die Verwendung von Arzneimitteln
zur Erhöhung
der Produktion und/oder Sekretion von Opioidpeptiden kann eine zeitweilige
Linderung liefern, allerdings werden unkontrollierbare Arz neimittelmetabolismus
und eine grobe Dosierung gegebenenfalls die „kranken" Neuronen und ihre Gegenstücke zu sehr
beanspruchen. Darüber
hinaus sind die Nebenwirkungen von Arzneimitteln zahlreich und unerwünscht. Opioidpeptide
selbst und Opioidpeptidrezeptoren wurden als Sedativa und Analgetika
verabreicht, siehe US Patent Nr. 4,123,523, allerdings sind die
Effekte solcher Verabreichungen kurzlebig.
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Xenogene Tumorzellen, die β-Endorphin
sezernieren, wurden in den Liquor cerebrospinalis-Raum im Rückenmark
von Ratten transplantiert, um analgetische Wirkungen zu produzieren.
Saitoh et al., Cell Trans. 4 (Supp. 1): S13–7 (1995). Es wurde beschrieben,
dass die transplantierten Zellen einen Monat überlebten und in vitro-Untersuchungen gaben
an, dass die Zellen β-Endorphin
für einen
Monat sezernieren. AtT-20-Zellen und AtT-20/hENK-Zellen, die β-Endorphin
bzw. Enkephalin sezernieren, wurden in den spinalen subarachnoidalen
Raum von Mäusen
implantiert, um ihre Verwendung in der Schmerztherapie zu untersuchen. Wu
et al., J. Neuroski. 14(8): 4806 (1994); J. Neural Transplant. Plast.
4(1): 15 (1993). Allerdings sind diese Verfahren sehr invasiv und
daher sehr gefährlich, da
sie die Transplantation von Zellen direkt in den Raum des Liquor
cerebrospinalis oder des spinal subarachnoidalen Raums involvieren.
Es wird auch nur eine begrenzte Anzahl von Zellen transplantiert, was
die Menge an Opioidpeptid, die durch diese Verfahren bereitgestellt
wird, begrenzt.
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Daher besteht weiterhin ein Bedarf
für ein Verfahren
mit Langzeitanalgesie durch Zuführung
eines Peptids, das an Opioid-Rezeptoren bindet oder die Bindung
von Substanz P an ihre Rezeptoren in vivo über einen langen Zeitraum stört. Ein
derartiges Verfahren wäre
zur Behandlung chronischer Schmerzen und psychischer Störungen,
die eine abnormale Wahrnehmung umfassen, zum Beispiel Depression, chronisches
Angstsyndrom, Paranoia, Alkoholismus und Drogenmissbrauch, und anderer
Krankheiten, bei denen Opioidneuronen und Substanz P-Endigungen eine Rolle
spielen, nützlich.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Demnach besteht eine Aufgabe der
vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung einer Zusammensetzung
zur Behandlung psychischer Störungen, die
eine abnormale Wahrnehmung umfassen, zum Beispiel Depression, chronisches
Angstsyndrom, Paranoia, Alkoholismus und Drogenmissbrauch, chronische
Schmerzen, und andere Krankheiten, bei denen Opioiodneuronen und
gegenüber
Substanz P empfindlicher Neuronen eine Rolle spielen.
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Zur Lösung dieser und anderer Aufgaben
der Erfindung wird eine Zusammensetzung zur kontinuierlichen Zuführung eines
Peptids in vivo bereitgestellt, wobei das Peptid an Opioid-Rezeptoren bindet oder
die Bindung von Substanz P an ihren Rezeptor beeinträchtigt,
umfassend myogenische Zellen (1) die von einem zu behandelnden Patienten,
einem Verwandten oder von einem anderen Menschen gewonnen wurden,
wobei diese Zellen heterologe DNA enthalten, die das Peptid kodiert,
so dass die myogenischen Zellen das Peptid exprimieren, und einen pharmazeutisch
verträglichen
Träger,
so dass die myogenischen Zellen zu Muskelfasern heranreifen oder
in Fettzellen umgewandelt werden und das Peptid in vivo produziert
wird, wobei das Peptid ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Enkephalinen, β-Endorphinen, α-Endorphin,
Gamma-Endorphin, Delta-Endorphin, Met sup 5, Opioid-Peptiden und
Substanz P-Analoga.
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In einer Ausführungsform werden die myogenischen
Zellen aus der Gruppe bestehend aus Myoblasten, Myotubuli und Muskelzellen
ausgewählt sind.
In einer anderen Ausführungsform
sind die Zellen mit DNA transduziert, welche für Mehrfachkopiensequenzen des
Peptids, getrennt durch Spaltungszellen, kodiert. In einer anderen
Ausführungsform sind
die transduzierten Zellen durch intramuskuläre Injektion in den paraspinalen
Muskel des Patienten zu verabreichen. In noch einer anderen Ausführungsform
ist großes
Chondroitin-6-sulfat-proteoglykan oder Insulin zusammen mit den
transduzierten myogenischen Zellen zu verabreichen. Eine gleichzeitige Verabreichung
eines immunsupprimierenden Mittels kann in einigen Ausführungsformen
ebenfalls durchgeführt
werden.
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Die Erfindung stellt auch die Verwendung von
myogenischen Zellen, die von einem zu behandelten Patienten, von
einem Verwandten oder von einem anderen Menschen gewonnen wurden,
die heterologe DNA enthalten, die eine Peptid kodiert, das an eine
Opioid-Rezeptor bindet oder das die Bindung von Substanz P an ihren
Rezeptor beeinträchtigt,
zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Zuführung des
besagten Peptids in vivo bei einem Menschen zur Behandlung von chronischem Schmerz,
psychiatrischen Zuständen,
die anormaler Wahrnehmung einhergehen wie Depression, chronisches
Angstsyndrom, Paranoia, Alkoholismus und Drogenabhängigkeit,
bereit.
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Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung
zur kontinuierlichen Zuführung
in vivo eines natürlich
auftretenden αnalgetischen
Peptids bereit, umfassend myogenische Zellen mit DNA, die für einen
Promotor für
ein endogenes Strukturgen, welches für das Peptid kodiert, enthält, so dass
die Zellen das Peptid kontinuierlich produzieren können.
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Die Erfindung stellt ferner eine
Zusammensetzung zur kontinuierlichen Zuführung eines Peptids in vivo
bereit, wobei das Peptid an einen Opioid-Rezeptor bindet oder die
Bindung von Substanz P an ihren Rezeptor beeinträchtigt, umfassend myogenische
Zellen, die heterologe DNA enthalten und die das Pep tid exprimieren,
und einen pharmazeutisch verträglichen
Träger.
In einer Ausführungsform
umfasst die heterologe DNA ein Gen, das für das Peptid kodiert, und einen
Promotor. In einer anderen Ausführungsform
umfasst die heterologe DNA einen Promotor für ein endogenes Strukturgen,
das das Peptid kodiert. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung
zusätzlich
großes
Chondroitin-6-sulfat-proteoglykan oder Insulin.
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Weitere Aufgaben und Vorteile der
Erfindung werden zum Teil in der folgenden Beschreibung ausgeführt oder
werden zum Teil aus der Beschreibung deutlich oder können bei
Durchführung
der Erfindung gelernt werden.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Es wurde festgestellt, dass genetisch
transduzierte myogenische Zellen verwendet werden können, um
eine kontinuierliche Langzeitzuführung
eines Peptids mit analgetischer Aktivität bereitzustellen. Dieses Verfahren
ist zur Behandlung chronischer Schmerzen wie auch psychiatrischer
Zustände
(bzw. psychischer Störungen),
die eine abnormale Wahrnehmung beinhalten, zum Beispiel Depression,
chronisches Angstsyndrom, Paranoia, Alkoholismus und Drogenabhängigkeit,
und anderer Krankheiten, bei denen Neuronen, die Opioide binden
und/oder Neuronen, die die Substanz P binden, eine Rolle spielen, einsetzbar.
Solche Krankheitsbilder wurden bisher noch nicht durch eine Langzeitverabreichung
von analgetischem Peptid in vivo behandelt.
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Analgetische Peptide, die für die vorliegende Erfindung
geeignet sind, sind Peptide, die Opioid-Rezeptoren binden oder die
Bindung von Substanz P an ihren Rezeptor stören. Unter diesen Peptiden
sind Opioidpeptide, Polypeptide, die die Substanz P binden, und
Peptide, die Substanz P-Analoga sind. In diesem Kontext bezeichnet
der Ausdruck „Polypeptid,
das die Substanz P bindet" ein
Peptid oder Protein, das Affinität
zur Substanz P hat, zum Beispiel Substanz P-Rezeptorprotein oder
ein Peptid oder ein Peptidanalogon, das von diesem Rezeptor abgeleitet ist
und das die Fähigkeit
beibehält,
Substanz P zu binden. Solche Peptide und Proteine binden die Substanz
P und stören
daher die Bindung der Substanz P an ihren Rezeptor. Der Arzt kann
die Bindung an Substanz P mit einem Assay untersuchen. Substanz P-Analoga
wirken als Analgetika, indem sie die Bindung zwischen Substanz P
und ihrem Rezeptor stören.
Beispielsweise offenbart die PCT-Anmeldung WO 91102745, supra, Analoga,
die die natürliche
Aktivität
der Substanz P nicht aufweisen, aber als kompetitive Inhibitoren
der Substanz P wirken.
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Erfindungsgemäß werden myogenische Zellen
ex vivo transduziert, so dass sie mindestens eins der oben aufgezählten Peptide
entweder in Zellkultur oder nach Differenzierung in vivo exprimieren.
Zellen, die mit einem Gen, das für
ein solches Peptid kodiert, transduziert wurden, werden dem Patienten
beispielsweise durch Injektion in Muskel- oder Fettgewebe des Patienten
verabreicht. Die transduzierten Zellen können überleben und im Empfängergewebe wachsen.
Beispielsweise können
Zellen, die in Muskelgewebe injiziert wurden, Myotubuli bilden und
zu Muskelfasern reifen. Zellen, die in Fettgewebe injiziert wurden,
können überleben
und in Fettzellen umgewandelt werden. Transduzierte Zellen, die
in Badegewebetypen injiziert wurden, können das gewünschte analgetische
Peptid kontinuierlich exprimieren. Das exprimierte Peptid verlässt die
Zelle und wandert durch das Blut in andere Bereiche des Körpers, einschließlich Rückenmark
und Gehirn.
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Myoblastentransfertherapie (MTT)
wurde angewendet, um Muskelschwäche
und -degeneration zu behandeln und ist eine nützliche Technik zur Verabreichung
von Zellen, die ein analgeti sches Peptid exprimieren. Siehe US Patent
Nr. 5,130,141, dessen Inhalt hier durch Bezugnahme als aufgenommen
gilt. Nach diesem Verfahren werden genetisch normale myogenische
Zellen einem myompathischen Muskel des Patienten verabreicht, wodurch
die Muskelfunktion, Bewegungsmuster und Atemfunktion verstärkt werden.
Es hat sich gezeigt, dass die normale Myoblastentransfertherapie
das fehlende Protein Dystrophin für bis zu sechs Jahren in Patienten
mit Duchenne-Muskeldystrophie
produziert. Law et al., Cell Transplantation 6: 95–100 (1997).
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Obgleich früher Myoblastentransferuntersuchungen
den Muskel als aufnehmendes Gewebe verwendeten, können auch
andere Gewebe verwendet werden. Beispielsweise können Myoblasten nach ihrer
Injektion oder chirurgischen Implantation in Fettgewebe wachsen,
wie es von Satoh et al., Transplantation Proceedings 24: 3017–19 (1992)
beschrieben wird.
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Myoblasten wurden mit Genen für Faktor
IX, Erythropoietin (EPO) und humanes Wachstumshormon sowie den Fas-Liganden
transduziert, um die zirkulierenden Level dieser Proteine zu erhöhen. Thompson,
Thromb. and Haemost. 74(1): 45 (1995); Hamamori et al., J. Clin.
Invest. 95: 1808 (1995) und Human Gene Therapy 5: 1349 (1994); Barr
et al., Science 254: 1507 (1991); Dhawan et al., Science 254: 1509
(1991); Lau et al., Science 273: 109 (1996). Der Erfolg dieser Verfahren
war unterschiedlich. Nach Thompson (1995) zum Beispiel legen vorläufige Daten
nahe, dass humane Myoblasten, die aus dem Körper entfernt wurden, weniger
gut in Kultur überlebten
und ihre Fähigkeit,
Faktor IX zu exprimieren, progressiv verloren. Lau et al. (1996)
beschreiben, dass eine Expression des Fas-Liganden lokal war und
nach 80 Tagen aufzuhören
schien. Andererseits berichten Hamamori et al. (1994), dass die
in vivo-Implantation eines stabilen in hoher Konzentration EPO- produzierenden Muskel-Zell-Klons
zu anhaltend hohen Serum-EPO-Spiegeln über drei
Monaten führte;
und Dhawan et al. (1991) stellen fest, dass transduzierte Myoblasten,
nachdem sie zu Myotubuli differenziert waren, fortfuhren, hGH zu
sezernieren, und zwar ohne Unterschied bei den Sekretionsleveln zwischen
Myoblasten und Myotubuli.
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Allerdings wurden transduzierte Myoblasten bisher
noch nicht verwendet, um ein analgetisches Peptid kontinuierlich
in vivo zuzuführen.
Obgleich die Gentherapie als Mittel zur Zuführung von Opioidpeptiden in
vivo untersucht wurde, wurden außerdem die transduzierten Zellen
direkt ins Rückenmark,
in den Raum des Liquor cerebrospinalis oder den spinalen subarachnoiden
Raum injiziert. Saitoh et al., Cell Trans. 4 (Supp. 1) : 513-7 (1995) ; Wu et
al., J. Neurosci., 14(8): 4806 (1994) ; Wu et al., J. Neural Transplant.
Plast. 4(1): 15 (1993). Wie oben diskutiert wurde, sind diese Verfahren
sehr invasiv, es wird nur eine begrenzte Anzahl von Zellen transplantiert
und die transduzierten Zellen exprimierten die Opioidpeptide nur über einen
Monat. Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden dagegen die transduzierten Myoblasten nicht in
das Zentralnervensystem injiziert. Anders als die Kurzzeitexpression
von Opioidpeptiden, die bei herkömmlichen
Gentherapien durchgeführt
wird, liefert die vorliegende Erfindung eine kontinuierliche Langzeitzuführung von
Opioidpeptiden, die zum Beispiel bis zu mindestens sechs Jahren
andauert. Diese Aspekte der vorliegenden Erfindung stellen deutliche
Vorteile dar, die noch nicht erkannt wurden.
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Myogenische Zellen, die für die vorliegende Erfindung
geeignet sind, umfassen Myoblasten, Myotubuli und Muskelfaserzellen.
Nach einer Ausführungsform
der Erfindung sind Myoblasten besonders bevorzugt. Myoblasten sind
einkernige Embryonenmuskelzellen, die zu mehrkernigen Myotubuli
differenzieren. Jeder Nukleus eines Myoblasten enthält über 100.000
Gene, ein schließlich
Gene für
Opioidpeptide, zum Beispiel β-Endorphine
und Enkephaline. Myoblasten teilen sich extensiv, wandern, fusionieren
natürlicherweise
unter Bildung von Syncytia, verlieren MHC-1-Anitgene bald nach Fusion
und bilden etwa 50% des Trockengewichts von Menschen. Myoblasten
sind dahingehend ungewöhnlich,
dass sie zur natürlichen
Zellfusion untereinander und mit reifen Muskelfasern fähig sind.
Als Resultat dieser Fusion überträgt ein transduzierender
Myoblast seinen Kern und daher alle seine Gene auf die Zelle, mit der
er fusioniert, wobei diese eine genetisch normale oder abnormale
Muskelzelle sein kann.
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Myogenische Zellen können von
einem zu behandelnden Patienten, einem Verwandten oder von einem
anderen Menschen oder anderen Tierspender erhalten werden. In einem
typischen Verfahren werden 1 bis 2 Gramm Skelettmuskel von einem Spender
entnommen. Myogenische Zellen können auch
durch Klonierungsverfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt
sind und zum Beispiel im US Patent Nr. 5,130,141 geschrieben werden,
kultiviert oder produziert werden.
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Nach einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform
werden Muskelzellen aus einem humanem Spender oder Tierspender 0
bis 3 Tage vor dem Ernten stimuliert, um einen Vorrat an Satellitenzellen
zu produzieren, welche Myoblastenreserven in reifen Muskeln sind.
Die myogenischen Zellen können
zum Beispiel durch Verletzen der Zellen mit einer Reihe von Nadelsonden
oder durch Beschallung stimuliert werden.
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Nach einer Ausführungsform der Erfindung werden
geerntete Zellen prozessiert, um eine Reinkultur von Myoblasten
zu erhalten. Siehe Law et al. Cell Transplant. 1: 235 (1992); Cell
Transplant. 2: 485 (1993); Muscle and Nerve 11: 525–33 (1988).
Beispielsweise wird eine Muskelbiopsie mit 0,1% Kol lagenase und
0,2% rohem Trypsin in Phosphat gepufferter Salzlösung mit pH 7,3 disoziiert.
Das Gemisch wird 45 Minuten gerührt,
wobei drei Wechsel der Enzymlösung
alternierend mit drei Wechsel eines neutralisierenden Medium, welches
100 Teile Dulbecco's modifiziertes
Eagle-Medium (DNEM, Gibco), enthaltend 0,37% NaHCO3 und
4 mM Glutamin, 10 Teile Pferdeserum und 1% Antibiotikum-Antimykotikum umfasst,
vorgenommen wurden.
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Nach einer Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung werden die geernteten myogenischen zellen ex vivo mit
DNA transduziert, die für
ein Peptid kodiert, welches entweder an einen endorphinen Rezeptor
bindet oder die Bindung von Substanz P an ihren Rezeptor inhibiert.
Peptide, von denen bekannt ist, dass sie geeignete Aktivität in diesem
Zusammenhang haben, sind β-Endorphin, α-Endorphin, Gamma-Endorphin,
Delta-Endorphin,
Met sup 5 (ein Peptid mit fünf
Aminosäureresten
mit endorphinartiger Aktivität),
aktive Endorphinpeptide, die Teile der β-Endorphinsequenz umfassen,
Enkephalin, ein NK-1-Rezeptor,
ein Polypeptid, das Substanz P bindet, oder ein Substanz P-Analogon,
das kompetitiv die Bindung der Substanz P an ihren Rezeptor inhibiert.
Der Ausdruck „Substanz
P-Analogon" bezeichnet ein Peptid,
das die Carboxy-terminale Aminosäuresequenz
aus 5 Aminosäureresten
von Substanz P umfasst (-Phe-Phe-Gly-Leu-Met) und das an den Substanz
P-Rezeptor bindet,
wodurch die Substanz P-Aktivität
inhibiert wird. Siehe Payan, Ann. Rev. Med. 40: 341 (1989), und
PCT-Anmeldung WO 91/03745.
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Zusätzliche Peptide können durch
kinetische Experimente gefunden werden, die zeigen, ob ein gegebenes
Peptid an einen Opioid-Rezeptor bindet oder mit der Bindung zwischen
Substanz P und ihrem Rezeptor konkurriert. Diese Experimente können routinemäßig durchgeführt werden.
Siehe zum Beispiel die PCT-Anmeldung
WO 92/16547.
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DNA-Sequenzen, die für die Erfindung
nützlich
sind, sind bekannt oder können
vom Fachmann aus bekannten Aminosäuresequenzen der Peptide aufgebaut
werden. Beispielsweise offenbart Saitoh et al., Cell Trans. 4 (Supp.
1): 513-7 (1995) eine DNA-Sequenz, die für β-Endorphin kodiert; Wu et al. (1993,
1994), supra, offenbaren Sequenzen für β-Endorphin und Enkephalin; das
US Patent Nr. 4,123,523 offenbart Aminosäuresequenzen von β-Endorphinpeptiden;
die PCT-Anmeldung WO 92/16547 offenbart ein Gen, das für den Substanz P-Rezeptor
NK-1 kodiert; die japanische Patentschrift
JP 3133998 offenbart die Aminosäuresequenz eines
Substanz P-Rezeptors und die PCT-Anmeldung WO 91/02745 offenbart
die Aminosäuresequenzen
verschiedener Substanz P-Analoga, zum Beispiel Deletions- und Additionsmutanten
von Substanz P.
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Nach einer Ausführungsform der Erfindung kodiert
die DNA für
eine Vielzahl von Kopien eines Peptids, das Analgesie erzeugt. In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Peptid ein Opioidpeptid und Regionen der DNA, die für mehrere
Kopien kodieren, werden durch Spaltungsstellen getrennt (siehe PCT-Anmeldung WO 96/17941).
Diese Ausführungsform
kann eine amplifizierte Menge eines natürlich vorkommenden Peptids
liefern.
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Die Transduktion von myogenischen
Zellen mit einer DNA-Sequenz
kann nach bekannten Verfahren durchgeführt werden., zum Beispiel nach
denen, die von Thompson (1995) und Hamamori et al. (1995), supra,
beschrieben werden. Im Allgemeinen wird ein DNA-Konstrukt verwendet,
das einen Promotor stromaufwärts
des Strukturgens, welches das gewünschte Peptid kodiert, ent hält. Geeignete
Promotoren sind zum Beispiel im US Patent 5,618,689 beschrieben.
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Nach einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden die geernteten myogenischen Zellen
ex vivo mit einer DNA transduziert, die einen Promotor enthält, der
an endogenes Gen innerhalb des Kerns einer myogenischen Zellen binden
und damit wirken kann (d.h. die Expression induzieren oder verstärken kann).
In dieser Ausführungsform
werden DNA, die eine regulatorische Sequenz, ein Exon und ein Splicedonor
enthält,
durch homologe Rekombination in das Zellgenom an einer vorher ausgewählten Stelle
in eine Zelle eingeführt.
Die Einführung
dieser DNA führt
zur Produktion einer neuen Transkriptionseinheit, in der die regulatorische
Sequenz Exon und Splicedonorstelle funktionell an das endogene Gen
gebunden sind.
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Auf die Einführung von DNA folgt typischerweise
eine Selektion von Zellen, die einen Promotor in einer gewünschten
Stelle zur Änderung
des gewünschten
Gens aufgenommen haben. Eine anwendbare Selektionsmethodologie wird
zum Beispiel in den US Patenten Nr. 5,641,670 und 5,272,071 beschrieben.
Selektionstechniken werden auch von Mansour et al., Nature 136.
348, 349 (1988) beschrieben. Nach Selektion werden die Zellen, die
das gewünschte
Gen exprimieren, kultiviert und dann in einen Patienten eingeführt.
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Die transduzierten myogenischen Zellen werden
kultiviert, um eine ausreichende Menge an Zellen zur Verabreichung
nach einem einer Vielzahl von Methoden, die auf dem Fachgebiet bekannt
sind, an den Patienten zu produzieren. Siehe zum Beispiel Law et
al. (1988, 1992) supra. Die Menge an Zellen, die kultiviert wird,
wird vom Zustand des Patienten und der Schwere der Krankheit, die
behandelt wird, abhängen.
Beispielsweise können
etwa eine Milliarde bis etwa 100 Milliar den Myoblasten zur Verabreichung
an einen Patienten kultiviert werden. Nach einer Ausführungsform
der Erfindung werden Zellen im oben beschriebenen neutralisierenden
Medium, das mit zwei Teilen Hühnerembryoextrakt
ergänzt
ist, kultiviert. Den Zellen wird alle zwei Tage frisches Wachstumsmedium
zugeführt
und sie werden für
35 bis 40 Tage in 7% CO2 bei 37°C inkubiert.
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Die transduzierten Zellen können dem
Patienten durch intramuskuläre
Injektion verabreicht werden. Law et al., Cell Transplant. 1: 235
(1992); loc. cit. 2: 485 (1993), Law et al. Exp. Neurol., Transplant Proc.
29: 2234 (1997). Die Menge an Opioidpeptiden, die erfindungsgemäß bereitgestellt
wird, kann kontrolliert werden, indem die Anzahl der Muskeln, denen
injiziert wird, und die Anzahl der injizierten Zellen ausgewählt werden.
Die Richtung der Injektion kann kontrolliert werden, indem die Anzahl
der transduzierten Zellen, die an Empfängermuskelfasern abgegeben
wird, optimiert wird. Beispielsweise hat sich gezeigt, dass ein
Injizieren der verabreichten Zellen diagonal durch Muskelfaser die
resultierende Zahl der Muskelfasern, die mit den verabreichten Zellen fusioniert
werden, maximiert.
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Transduzierte Zellen können spezifischen Muskeln
verabreicht werden, die dabei helfen, dass die Zellen zu einer Zielstelle
zwischen Laminae IV und V des Rückenmarks
gelangen. Beispielsweise können
die transduzierten Zellen in paraspinale Muskeln oder Nackenmuskeln,
zum Beispiel den Levator scapulae, injiziert werden. Obgleich transduzierte myogenische
Zellen, die irgendwo im Körper
verabreicht werden, Peptide sezernieren werden, die durch das Blut
wandern und die spinalen Rezeptoren erreichen werden, wird davon
ausgegangen, dass eine gezielte Verabreichung der Zellen an paraspinale
Muskeln oder Nackenmuskeln, die in der Nähe des Rückenmarks sind, dazu führen, dass
mehr Peptide die Rezeptoren schneller erreichen, wodurch die Wirksamkeit
des Verfahrens erhöht
wird.
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Die transduzierten Zellen können auch
durch chirurgische Implantation in den Patienten verabreicht werden.
Die Zellen können
zum Beispiel in Fettgewebe implantiert werden.
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In einer weiteren Ausführungsform
wird dem Patienten auch eine wirksame Menge eines immunsupprimierenden
Mittels gegeben, um die Abstoßung der
transduzierten Zellen zu minimieren. Siehe US Patent Nr. 5,130,141,
und Law et al. (1992, 1993), supra. Beispielsweise kann Cyclosporin
A, ein anderes immunsupprimierendes Mittel, oder es können Kombinationen
von immunsupprimierenden Mitteln nach bekannten Verfahren gegeben
werden. Geeignete Dosierungsformen, Dosierungsmengen und Dosierungspläne sind
auf dem Fachgebiet bekannt. Beispielsweise kann Syclosporin A oral
in einer täglichen Dosis
von etwa 7 mg/kg Körpergewicht
gegeben werden. Ein typischer Dosierungsplan umfasst die Verabreichung
der täglichen
Dosis in zwei aufgeteilten Dosen; das Vollblut des Patienten kann überwacht werden,
damit ein konstanter Level von etwa 250 mg/ml Cyclosporin A aufrecht
erhalten wird.
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Nach einer Ausführungsform der Erfindung kann
die Fusion der transduzierten Myoblasten durch Verabreichung von
großem
Chondroitin-6-sulfat-proteoglycan (LC6SP) erleichtert werden, wie
es in der oben zitierten US-Anmeldung, Serial No. 08/477,377 beschrieben
wird. Eine Verletzung aus der Injektion von Myoblasten in die extrazelluläre Matrix
löst die Freisetzung
von basischem Fibroblastenwachstumsfaktor und großem Chondroitin-6-sulfat-proteoglycan aus.
Diese freigesetzten Moleküle
stimulieren die Myoblastenproliferation. Eine Erhöhung des
Levels an großem
Chondroitin-6-sulfat-proteoglykan an der Injektionsstelle erleichtert
die Myoblastenfusion und -proliferation. Nach einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird großes Chondroitin-6-sulfat-proteoglykan
vorzugsweise mit den transduzierten Myoblasten verabreicht.
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Nach einer Ausführungsform der Erfindung ist
das große
Chondroitin-6-sulfat-proteoglykan untersulfatiert. Siehe Hutchison
et al., Deve1. Biol. 115: 78–83
(1986). Es wird angenommen, dass großes Chondroitin-6-sulfat-proteoglykan
vor der Fusion in einer untersulfatierten Form gebildet wird, aber
nach Fusion höher
sulfatiert wird. Der Ausdruck „untersulfatiertes
großes
Chondroitin-6-sulfat-proteoglykan", wie er hier verwendet wird, bezeichnet
einen Sulfatierungsgrad, der etwa derselbe ist wie der, der bei
natürlich
auftretendem großem
Chondroitin-6-Sulfat-Proteoglykan aus Zellen vor der Fusion beobachtet
wird. Nach diesem Aspekt der Erfindung wird untersulfatiertes großes Chondroitin-6-sulfat-proteoglykan
mit einer Konzentration zwischen etwa 5 μM und etwa 5 mM verabreicht.
Chondroitin-6-sulfat kann zusammen mit den transduzierten Zellen
verabreicht werden oder kann in einer getrennten Formulierung als
getrennte Injektion gegeben werden.
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Insulin kann die Proliferation von
Myoblasten ebenfalls unterstützen
und die Myotubulientwicklung begünstigen.
Nach einer Ausführungsform
der Erfindung wird daher Insulin mit den transduzierten Myozyten
verabreicht. Beispielsweise können
etwa 0,2 mM Insulin entweder als Teil derselben Formulierung wie
die Zellen gegeben werden oder als getrennte Formulierung zum Beispiel
in einer getrennten Injektion gegeben werden.
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Nach einer Ausführungsform der Erfindung werden
unerwünschte
Effekte aus einer Überproduktion
des gewünschten
Peptids mit Agonisten wie zum Beispiel Naloxon oder SP-40,40 reguliert.
Pomeranz et al., Altern. Thor. Health Med. 2: 85 (1996); Choi-Miura
et al., Biol. Pharm. Bull. 16: 228 (1993); Pomeranz et al., Exp.
Neurol. 54: 172 (1977). Wenn zum Beispiel der endogene Level des
Peptids zu hoch wird, kann Naloxon oder SP-40,40 verabreicht werden,
um den Wirkungen des Peptids entgegenzuwirken. Typische Symptome
einer Überproduktion
eines analgetischen Peptids umfassen extreme Schläfrigkeit,
niedrige Atmungsfrequenz, Cyanose, niedrigen Blutdruck, symmetrische
Nadelspitzenpupillen und verringerte Urinbildung. Der übliche Ablauf
einer Naloxonbehandlung umfasst Verabreichung geringer intravenöser oder
intramuskulärer
Dosen von Naloxon (etwa 0.4 mg bis etwa 0.8 mg). Die Symptome verbessern
sich häufig
nach der ersten Dosis, diese kann nach 2 bis 3 Minuten bis zu einer
Gesamtdosis von etwa 10 mg wiederholt werden.
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Wie oben diskutiert wurde, liefert
die Verabreichung von transduzierten myogenischen Zellen gemäß der vorliegenden
Erfindung eine kontinuierliche Langzeitzuführung eines analgetischen Peptids in
vivo. Das Peptid wandert von der Synthesestelle, zum Beispiel aus
Muskel- oder Fettgewebe, und erreicht sensorische Nervenendigungen,
das Rückenmark
und das Gehirn, wo es sich mit Nervenzellrezeptoren unter Erzeugung
von Analgesie kombiniert. Analgesie, die durch das Peptid erzeugt
wird, ist zur Behandlung chronischer Schmerzen und psychiatrischer
Zustände
(psychischer Störungen),
die eine abnormale Wahrnehmung beinhalten, zum Beispiel Depression,
chronisches Angstsyndrom, Paranoia, Alkoholismus und Drogenabhängigkeit,
und anderer Krankheiten, bei denen Opioidneuronen und Substanz P-Endigungen
eine Rolle spielen, nützlich.
Die kontinuierliche Langzeitzuführung
eines analgetischen Peptids in vivo als medizinische Behandlung bietet
eine neue Methodologie zur Behandlung dieser Krankheitsbilder.
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Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung
bereit, die ein analgetisches Peptid herstellt, das an Opioid-Rezeptoren
bindet oder die Bindung von Substanz P an seinen Rezeptor in vivo
stört.
In einer Ausführungsform
umfasst die Zusammensetzung myogenische Zellen, die heterologe DNA
enthalten, welche für
ein analgetisches Peptid kodiert, zusammen mit einem pharmazeutisch
verträglichen Träger oder
mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern.
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Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger umfassen
Verdünnungsmittel,
Lösungsmittel, Puffer
und/oder Konservierungsmittel. Ein Beispiel für einen pharmazeutisch verträglichen
Träger
ist Phosphatpuffer, der NaCl enthält. Andere pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen
wässrige
Lösungen,
nicht toxische Exzipienten, Salze, Konservierungsmittel, Puffer
und dergleichen, wie sie in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 15. Ausgabe,
Easton: Mack Publishing Co., Seiten 1405–1412 und Seiten 1461–1487 (1975)
und THE NATIONAL FORMU-LARY
XIV., 14. Ausg. Washington: American Pharmaceutical Association
(1975) beschrieben wurden. Beispiele für nicht wässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol,
Polyethylenglykol, pflanzliches Öl
und injizierbare organische Ester, wie z. B. Ethyloleat. Wässrige Träger umfassen
Wasser, alkoholische/wässrige
Lösungen,
Kochsalzlösungen, parenterale
Vehikel wie z. B. Natriumchlorid, Ringer's Dextrose, usw. Intravenöse Vehikel
umfassen Flüssigkeits-
und Nährstoff-Ergänzungsmittel.
Konservierungsmittel umfassen antimikrobielle Mittel, Antioxidanzien,
Gelatbildner und Inertgase. Der pH und die genaue Konzentration
der verschiedenen Komponenten der Bindungszusammensetzung werden nach
der Erfahrung des Fachmanns eingestellt. Siehe GOODMAN AND GILMRN`S
THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS (7. Ausgabe).
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Nach einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung
transduzierte myogenische Zellen, großes Chondroitin-6-sulfatproteoglykan
und einen pharmazeutisch verträglichen
Träger.
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Nach einer anderen Ausführungsform
umfasst die Zusammensetzung transduzierte myogenische Zellen, Insulin
und einen pharmazeutisch verträglichen
Träger.
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Die Ausführungsformen der Erfindung
werden durch die folgendenden Beispiele, die Aspekte der Erfindung
detailliert zeigen, näher
erläutert.
Die Beispiele erläutern
spezifische Elemente der Erfindung und sollen den Rahmen derselben
nicht beschränken.
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Beispiel 1.
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Behandlung eines Patienten,
der an Depression leidet, durch Injektion in Muskelgewebe
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Die Skelettmuskeln eines Patienten,
der an einem psychiatrischen Krankheitsbild, einschließlich Depression,
leidet, werden durch zahlreiche Nadelsondierungen stimuliert, um
ein Reservoir an Satellitenmyoblastenzellen zu produzieren. Drei
Tage später
wird der Patient unter Allgemeinnarkose gestellt und es werden 2
g Skelettmuskel aus dem Patienten entnommen. Der entnommene Muskel
wird bearbeitet, um eine Myoblasten-Reinkultur zu erhalten. Der entnommene
Muskel wird von Haut und anderem Gewebe frei geschnitten und die
Zellen werden mit 0,1% Kollagenase und 0,2% rohem Trypsin in Phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
mit pH 7,3 disoziiert. Das Gemisch wird 45 Minuten, mit dreimaligem Wechsel
an Enzymlösung,
die mit dreimaligem Wechsel eines neutralisierenden Mediums, umfassend
100 Teile Dulbecco's
modifiziertes Eagle-Medium (DMEM, Gibco), enthaltend 0,37 NaHCO3 und 4 mM Glutamin; 10 Teile Pferdeserum
und 1% Antibiotikum-Antimykotikum abwechselt, gerührt.
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Diese Myoblasten werden mit DNA,
die ein Gen für
Enkephalin und einen geeigneten Promotor enthält, transduziert. Die transduzierten
Myoblasten werden dann in neutralisierendem Medium, das oben beschrieben
wurde und mit zwei Teilen Hühnerembryonenextrakt
ergänzt
ist, kultiviert. Die Zellen werden alle zwei Tage mit frischem Wachstumsmedium gefüttert und
40 Tage lang in 7% CO2 bei 37°C inkubiert,
bis etwa 2 Milliarden Myoblastenzellen (Nachkommenschaft der transduzierten
myogenischen Zellen) vorliegen.
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Der Patient wird erneut unter Allgemeinnarkose
gestellt und die Nachkommenschaft der transduzierten myogenischen
Zellen werden intramuskulär
in paraspinale Muskeln des Patienten injiziert. Eine Woche danach
sollten sich die Symptome des Patienten zu bessern beginnen.
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Beispiel 2.
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Behandlung eines Patienten,
der an Depression leidet, durch Injektion in Fettgewebe
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Myoblasten werden, wie in Beispiel
1 beschrieben, erhalten und transduziert, um etwa 10 Milliarden
Nachkommen-Myoblastenzellen
zu bilden. Das Brustgewebe des Patienten wird anästhesiert und die Zellen werden
in das anästhesierte
Gewebe injiziert. Innerhalb einer Woche sollten sich die Symptome
des Patienten zu bessern beginnen.
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Beispiel 3.
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Behandlung eines Patienten,
der an Alkoholismus leidet
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Die Skelettmuskeln eines Patienten,
der an Alkoholismus leidet, werden durch Beschallung stimuliert,
um ein Reservoir an Satellitenmyoblastenzellen zu produzieren. Drei
Tage später
wird der Patient unter Allgemeinnarkose gestellt und es werden zwei
Gramm Skelettmuskel vom Patienten entnommen. Der entnommene Muskel
wird verarbeitet, um eine Myoblasten-Reinkultur zu erhalten, wie es in Beispiel
1 oben beschrieben ist.
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Diese Myoblasten werden mit DNA transduziert,
die einen Promotor für
ein endogenes β-Endorphingen
enthält.
Die transduzierten Myoblasten werden dann, wie in Beispiel 1 oben
beschrieben, kultiviert, bis 50 Milliarden Zellen erhalten werden.
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Der Patient wird erneut unter Allgemeinnarkose
gestellt und die Nachkommenschaft der transduzierten myogenischen
Zellen werden in paraspinalen Muskeln des Patienten injiziert.
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Innerhalb einer Woche nach dem Verfahren beginnen
sich die Symptome des Patienten zu bessern.
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Beispiel 4.
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Zusammensetzung
zur Bereitstellung einer kontinuierlichen Langzeitzuführung von
Enkephalin in vivo
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Es wird die folgende Zusammensetzung
bereitgestellt:
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Eine Milliarde myogenische Zellen,
die mit DNA transduziert sind, die für Enkephalin kodiert, und ein
Phosphatpuffer, der NaCl und humanes Serum Albumin enthält, als
pharmazeutisch verträglicher
Träger.
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Beispiel 5.
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Zusammensetzung
zur Bereitstellung einer kontinuierlichen Langzeitzuführung von β-Endorphin
in vivo
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Es wird die folgende Zusammensetzung
bereitgestellt:
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Eine Milliarde myogenische Zellen,
transduziert mit DNA, die für
einen Promotor eines humanen Endorphingens kodiert, und Wasser als
pharmazeutisch verträglicher
Träger.
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Dem Fachmann wird klar sein, dass
an den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
verschiedene Modifikationen und Variationen durchgeführt werden
können.
So ist es beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung die Modifikationen
und Variationen der Erfindung, vorausgesetzt, sie liegen im Rahmen
der beigefügten
Ansprüche und
ihrer Äquivalente,
abdeckt.