NO318761B1 - Polypeptidanalog til nativ keratinocyttvekstfaktor kalt "KGF", farmasoytisk formulering, rekombinant nukleinsyremolekyl, biologisk funksjonell vektor, prokaryot eller eukaryot vertscelle, fremgangsmate for fremstilling av en analog av KGF, anvendelse av en effektiv mengde av analogen av KGF i folge oppfinnelsen, eller deltaN23 for fremstilling av et medikament for stimulering av produksjon av ikke-fibroblastepitelceller, in vitro fremgangsmate for stimulering av produksjon av ikke-fibroblastepitelceller samt sett. - Google Patents
Polypeptidanalog til nativ keratinocyttvekstfaktor kalt "KGF", farmasoytisk formulering, rekombinant nukleinsyremolekyl, biologisk funksjonell vektor, prokaryot eller eukaryot vertscelle, fremgangsmate for fremstilling av en analog av KGF, anvendelse av en effektiv mengde av analogen av KGF i folge oppfinnelsen, eller deltaN23 for fremstilling av et medikament for stimulering av produksjon av ikke-fibroblastepitelceller, in vitro fremgangsmate for stimulering av produksjon av ikke-fibroblastepitelceller samt sett. Download PDFInfo
- Publication number
- NO318761B1 NO318761B1 NO19971568A NO971568A NO318761B1 NO 318761 B1 NO318761 B1 NO 318761B1 NO 19971568 A NO19971568 A NO 19971568A NO 971568 A NO971568 A NO 971568A NO 318761 B1 NO318761 B1 NO 318761B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- kgf
- amino acid
- analogue
- acid position
- epithelial cells
- Prior art date
Links
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 title claims abstract description 335
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 title claims abstract description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims description 63
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 36
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 34
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 title claims description 33
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 title claims description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 17
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 title claims description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 119
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 109
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 52
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 51
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 32
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 25
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 17
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 16
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 15
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 13
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 13
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Chemical group OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 12
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 10
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 9
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 claims description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 7
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 claims description 6
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 6
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 6
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 6
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 claims description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- 208000032571 Infant acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 206010028974 Neonatal respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 201000002652 newborn respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 208000007788 Acute Liver Failure Diseases 0.000 claims description 3
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014989 Epidermolysis bullosa Diseases 0.000 claims description 3
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000203 Hyaline Membrane Disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical group C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Chemical group CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010068168 androgenetic alopecia Diseases 0.000 claims description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 3
- 208000022605 chemotherapy-induced alopecia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 claims description 3
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000024693 gingival disease Diseases 0.000 claims description 3
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 claims description 3
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 claims description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 3
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 claims description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 3
- 210000003454 tympanic membrane Anatomy 0.000 claims description 3
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010010984 Corneal abrasion Diseases 0.000 claims description 2
- 208000028006 Corneal injury Diseases 0.000 claims description 2
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical group CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 claims description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims description 2
- 231100000516 lung damage Toxicity 0.000 claims description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 claims 2
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 claims 1
- 208000008469 Peptic Ulcer Diseases 0.000 claims 1
- 206010069351 acute lung injury Diseases 0.000 claims 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims 1
- 210000005095 gastrointestinal system Anatomy 0.000 claims 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 claims 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 claims 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 abstract description 15
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 2
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 301
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 93
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 81
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 79
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 57
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 55
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 40
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 40
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 30
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 26
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 23
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 17
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 16
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 14
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 14
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 14
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 14
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 13
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 10
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 10
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 9
- 108010029560 keratinocyte growth factor receptor Proteins 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 8
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 8
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 8
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 8
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 7
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 7
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 7
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 7
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 4
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 4
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical group NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 101100446506 Mus musculus Fgf3 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- -1 fragments Chemical class 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003345 hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 2
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 2
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 description 2
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 2
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- NGDIAZZSCVVCEW-UHFFFAOYSA-M sodium;butyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCOS([O-])(=O)=O NGDIAZZSCVVCEW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100512078 Caenorhabditis elegans lys-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- DEVDFMRWZASYOF-ZLUOBGJFSA-N Cys-Asn-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DEVDFMRWZASYOF-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 1
- 241000272184 Falconiformes Species 0.000 description 1
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000380 Fibroblast growth factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 102100028073 Fibroblast growth factor 5 Human genes 0.000 description 1
- 108090000382 Fibroblast growth factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 102100028075 Fibroblast growth factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 206010018473 Glycosuria Diseases 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 206010020710 Hyperphagia Diseases 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101100446513 Mus musculus Fgf4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100030856 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 240000004760 Pimpinella anisum Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 208000037062 Polyps Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000004880 Polyuria Diseases 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 206010043458 Thirst Diseases 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710201961 Virion infectivity factor Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002821 alveolar epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002588 alveolar type II cell Anatomy 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 206010006475 bronchopulmonary dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000003822 cell turnover Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 230000008556 epithelial cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000035780 glucosuria Effects 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 108010085617 glycopeptide alpha-N-acetylgalactosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 102000057239 human FGF7 Human genes 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 206010021654 increased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000027939 micturition Effects 0.000 description 1
- 230000003843 mucus production Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 235000020925 non fasting Nutrition 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 206010036067 polydipsia Diseases 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000001732 sebaceous gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 210000000106 sweat gland Anatomy 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000004034 viscosity adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 239000013585 weight reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/16—Otologicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
- A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Obesity (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
O ppfinnelsens område
Foreliggende oppfinnelse omfatter polypeptidanalog til nativ keratinocytvekstfaktor kalt "KGF", farmasøytisk formulering, rekombinant nukleinsyremolekyl, biologisk funksjonell vektor, prokaryot eller eukaryot vertscelle, fremgangsmåte for fremstilling av en analog av KGF, anvendelse av en effektiv mengde av analogen av KGF ifølge oppfinnelsen, eller AN23 for fremstilling av et medikament for stimulering av produksjon av ikke-fibroblastepitelceller, in vifrø-fremgangsmåte for stimulering av produksjon av ikke-fibroblasepitelceller samt sett.
O ppfinnelsens bakgrunn
Den kompliserte prosess som vevsdannelse og -regenerering utgjør, formidles av en rekke proteinfaktorer som i blant betegnes mykvevsvekstfaktorer. Disse molekyler frigjøres generelt av én celletype og virker ved å påvirke proliferasjon av andre celletyper. (Rubin et al. (1989), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 56:802-806). Noen mykvevsvekstfaktorer utskilles av spesielle celletyper og påvirker proliferasjon, differensiering og/eller modning av påvirkbare celler under utviklingen av flere-cellulære organismer (Finch et al., (1989), Science, 245:752-755). I tillegg til deres roller i organismer under utvikling har noen betydning for vedvarende helse og vedlikehold av mer modne systemer. Hos pattedyr foreligger f.eks. mange systemer hvor hurtig celleomsetning forekommer. Slike systemer omfatter hud og mage-tarmkanalen som begge består av epitelceller. Omfattet i denne gruppen av mykvevsvekstfaktorer er en proteinfamilie betegnet fibroblastvekstfaktorer (FGF).
Man kjenner i dag 8 FGF-familiemedlemmer med beslektede primærstrukturer: basisk fibroblastvekstfaktor, bFGF (Abraham et al. (1986), EMBO J., 5:2523-2528); sur fibroblastvekstfaktor, aFGF (Jaye et al. (1986), Science, 233:541-545); int-2-genproduktet, int-2 (Dickson & Peters (1987), Nature, 326:833); hst/kFGF (Delli-Bovi et al. (1987), Cell, 50:729-737) og Yoshida et al. (1987), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, £4:7305-7309); FGF-5 (Zhan et al. (1988), Mol. Cell. Biol., 5:3487-3495); FGF-6 (Maries et al. (1989), Oncogene, 4:335-340); keratinocyttvekstfaktor (Finch et al. (1989), Science, 24:752-755); og hisactofilin (Habazzettl et al. (1992), Nature, 359:855-858).
Blant FGF-proteinfamilien er keratinocyttvekstfaktor ("KGF") en enestående formidler av proliferasjon av ikke-fibroblast-epitelceller (særlig keratinocytter) avledet fra mesenkymvev. Begrepet "nativ KGF" viser til et naturlig forekommende, humant (hKGF) eller rekombinant (rKGF) polypeptid (med eller uten signalsekvens) i samsvar med aminosyresekvensen vist i SEKV.ID NR. 2 eller en allelisk variant av denne. [Dersom ikke annet er angitt, tilsvarer nummerering av aminosyrer for molekyler beskrevet heri, den vist for den modne form av det native molekyl (dvs. uten signalsekvensen), tilsvarende aminosyrene 32 til 194 i SEKV.ID NR. 2].
Nativ KGF kan isoleres fra vanlige, humane kilder (hKGF) eller fremstilles ved rekombinant DNA-teknikker (rKGF) (Finch et al. (1989), supra; Rubin et al. (1989), supra; Ron et al. (1993), The Journal of Biological Chemistry, 2(55^:2984-2988; og Yan et al. (1991), In Vitro Cell. Dev. Biol., 27^:437-438).
Det er kjent at nativ KGF er relativt ustabil i vandig tilstand og at den gjennomgår kjemisk og fysisk degradering, noe som medfører tap av biologisk aktivitet under fremstilling og lagring (Chen et al. (1994), Pharmaceutical Research, 77:1582-1589). Nativ KGF har også en tendens til å aggregere ved forhøyet temperatur og vil inaktiveres under sure betingelser (Rubin et al. (1989), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 56:802-806). Aggregering av nativ KGF i vandig løsning fører også til inaktivert protein. Dette er en ulempe da tap av aktivitet gjør det upraktisk å lagre vandige utforminger av native KGF-proteiner over lange tidsrom, eller å tilføre proteinet over lengre tidsrom. Dette er videre et spesielt problem ved fremstilling av farmasøytiske preparater da aggregerte proteiner kan være immunogene (Cleland et al.
(1993), Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 70:307-377; Robbins et al.
(1987), Diabetes, 36:838-845; og Pinckard et al. (1967), Clin. Exp. Immunol., 2:331-340).
Nativ KGF inneholder fem cysteinrester, nemlig aminosyrene 1,15,40, 102 og 106 (Finch et al. (1989), Science, 24:752-755). Selv om cysteininnholdet i nativ KGF er beskrevet, foreligger ingen rapporter vedrørende rollene til cysteinrestene med hensyn til aktivitet (f.eks. hvorvidt de er essensielle for biologisk aktivitet) og tertiærstruktur (f.eks. tilbøyelighet til å danne uønskede, intermolekylære eller intramolekylære disulfidbindinger). Således forteller teknikkens stand intet om hvilke cysteinrester, om noen, som er essensielle eller som deltar i uønsket dannelse av disulfidbindinger, og således gjør proteinet utsatt for aggregering og/eller ustabilitet.
I forsøk på å forbedre eller på annen måte endre én eller flere av egen-skapene til nativ KGF, kan proteinutforming benyttes. Rekombinant DNA-teknologi er blitt benyttet til å endre sekvensen til nativ KGF.
Ron et al. (1993), J. Biol. Chem., 268( 4):2984-2988, beskrev modifiserte KGF-polypeptider med 3, 8,27, 38 eller 49 aminosyrer fjernet fra den N-terminale ende. Polypeptidene som manglet 3, 8 eller 27 N-terminale aminosyrerester, hadde fortsatt evnen til å binde heparin, mens de andre hadde mistet denne. Videre ble polypeptidene som manglet 3 og 8 aminosyrerester, rapportert å være fullt aktive, mens formen som manglet 27 aminosyrerester, var 10-20 ganger mindre mitogen, mens formene som manglet 38 eller 49 aminosyrer, ikke hadde mitogen aktivitet. Stabiliteten av de modifiserte KGF-polypeptider ble ikke diskutert eller beskrevet på
annen måte.
Den publiserte PCT-søknad nr. 90/08771, supra, rapporterte også om fremstilling av et kimært protein hvor tilnærmet de første 40 N-terminale aminosyrer i den modne form av nativ KGF var kombinert med den C-terminale del (tilnærmet 140 aminosyrer) fra aFGF. Det kimære protein ble rapportert å ha keratinocytter som målceller, på samme måte som KGF, men det manglet følsomhet overfor heparin, en egenskap som er karakteristisk for aFGF, men ikke KGF. Stabiliteten av det kimære protein ble ikke diskutert eller beskrevet på annen måte.
WO 9501434 gjør kjent et trunkert KGF-fragment som består av en del av full-lengde KGF163. L.A. Bare et al., Biochemical and Biophysical Research Communi-cations, bind 205, nr 1, 1994 gjør kjent at hKGF inneholder fem cysteiner i posisjonene 1,15,40,102 og 106.
Fra U.S. Patentskrift nr. 4 959 314 er det kjent at cycteinresidier kan ha stor betydning på aktiviteten og stabiliteten av peptidforbindelser på grunn av deres sensitivitet overfor oksidasjon eller reduksjon, noe som kan resultere i inter- eller interamolylære bindinger eller tap av dem.
EP 320148 gjør kjent en analog av FGF som er forskjellig fra naturlig forekommende FGF ved at minst én av cysteinresidiene er substituert.
Litteraturen beskriver således ikke et modifisert KGF-molekyl med vesentlig forbedret stabilitet sammenlignet med nativ KGF. Videre beskriver litteraturen ikke tilstrekkelige kunnskaper eller bevis for å gi berettiget håp om vellyk-ket fremstilling av KGF-molekyler med slike ønskelige egenskaper.
Generelt vil virkningene på biologisk aktivitet av enhver aminosyre-endring i et protein variere med en rekke faktorer, heriblant proteinets tredimensjonale struktur og hvorvidt endringene gjøres i det reseptorbindende område i proteinets primærsekvens. Da hverken tredimensjonal struktur eller reseptorbindende område i primærstrukturen til nativ KGF er publisert, tillater teknikkens stand ingen generalisering vedrørende virkningene av aminosyreendringer i nativ KGF, basert på virkningene av aminosyreendringer i vanlig kategoriserte proteiner.
Det er et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe polypeptid-molekyler som koder for analoger som viser forbedret stabilitet (f.eks. når de utsettes for pH-verdier, temperaturer og/eller andre betingelser som er typiske for lagring), sammenlignet med nativ KGF.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en polypeptidanalog til nativ keratinocytvekstfaktor kalt "KGF", kjennetegnet ved at nativ KCJF tilsvarer følgende sekvens:
med eller uten en signalsekvens, hvori analogen omfatter aminosyresekvensen til KGF, omfattende en delesjon, substitusjon og/eller insersjon av én eller flere av aminosyrene 1-24, hvorved cysteinresten i aminosyreposisjon 1 og cysteinresten i aminosyreposisjon 15 er seg enten deletert eller substituert med en annen arninosyre, eventuelt som videre
har en N-terminal metioninrest og/eller videre omfatter en ladningsendringssubstitusjon i en aminosyreposisjon utvalgt fra Arg (41), Glu (43), Lys (55), Lys (95), Asn (137), Gin
(138), Lys (139), Arg (144), Lys (147), Gin (152), Lys (153), eller Thr (154) eller med hensyn til A23-KGF har en ladningsendringsmodifikasjon i His (116) eller i tilfelle av nativ KGF med både Cys (l)og Cys (15) substituert med Ser, eventuelt også med Cys (40) eller Cys (102) eller både Cys (102) og Cys (106) substituert med Ser med det forbehold at analogen ikke er keratinocyttvekstfaktorproteinet omfattende aminosyrene 24-163.
I forbindelse med foreliggende oppfinnelse omfatter begrepet "KGF" nativ KGF og proteiner som særpreges ved en peptidsekvens som i det vesentlige er den samme som peptidsekvensen til nativ KGF hvor cysteinrestene som tilsvarer Cys<1> og Cys<15> i nativ KGF (Cys<32> og Cys<46> i SEKV.ID NR. 2), er beholdt, og som besitter alle eller noen av de biologiske aktiviteter til nativ KGF, særlig ikke-fibroblast-epitelcelle-proliferasjon. Med henvisning til figurene 4, 7 - 24 og 37 - 50 og den spesifikke aminosyreposisjonen, skal det første metionin i sekvensen være rest nr. "0". Ved "karakterisert ved en peptidsekvens som i det vesentlige er den samme som peptidsekvensen til nativ KGF" menes en peptidsekvens som kodes av en DNA-sekvens som kan hybridisere til nukleotidene 201 til 684 i SEKV.ID NR. 1, fortrinnsvis under stringente hybridiseringsbetingelser.
For å finne tilsvarende aminosyreposisjoner i to aminosyresekvenser kan man oppstille de to sekvenser slik at antallet identiske aminosyrerester maksimaliser-es, eventuelt ved å forskyve amino- og/eller karboksylenden, innføre gap etter behov og/eller delere aminosyrerester som foreligger som innskudd i kandidatsekvensen. Databasesøk, sekvensanalyse og sekvensmanipuleringer kan utføres ved å benytte et av de velkjente og vanlig benyttede programmer med algoritmer for søk etter sekvens-homologiAidentitet (f.eks. Pearson og Lipman (1988), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 55:2444-2448; Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol., 275:403-410; Lipman og Pearson
(1985), Science, 222:1435 eller Devereux et al. (1984), Nuc. Acids Res., 72:387-395).
Stringente betingelser i forbindelse med hybridisering vil si stringente kombinasjoner av saltkonsentrasjon, temperatur, konsentrasjon av organiske løsemid-ler og andre parametrer som vanligvis kontrolleres i hybridiseringsreaksjoner. Et eksempel på stringente hybridiseringsbetingelser er hybridisering i 4 X SSC ved 62-67 °C, etterfulgt av vask i 0,1 X SSC ved 62-67 °C i tilnærmet 1 time. Et annet eksempel på stringente hybridiseringsbetingelser er hybridisering i 45-55% formamid, 4 X SSC ved 40-45 °C. [Se T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual); Cold Spring Harbor Laboratory (1982), s. 387 til 389].
Proteinene omfatter således alleliske varianter eller delesjon(er), substitusjon(er) eller insersjon(er) av aminosyrer, heriblant fragmenter, kimære molekyler eller hybridmolekyler av nativ KGF. Ett eksempel på KGF omfatter polypeptider med ladningsendring hvori én eller flere av aminosyrerestene 41-154 i nativ KGF (fortrinnsvis aminosyrerestene Arg<41>, Gin<43>, Lys<55>, Lys<95>, Lys<128>, Asn137, Gin<138>, Lys13<9>, Arg<144>, Lys<147>, Gin<152>, Lys<153> eller Thr<154>) er delert eller erstattet med en nøytral aminosyrerest eller en negativt ladet aminosyrerest utvalgt for å gi et protein med redusert, positiv ladning (ifølge den offentlig tilgjengelige U.S.S.N. 08/323 337, innlevert 13. oktober 1994), spesielt R(144)Q, en KGF hvor arginin i aminosyreposisjon 144 i nativ KGF er erstattet med glutamin. Et annet eksempel på KGF omfatter proteiner dannet ved å erstatte minst én aminosyre i et løkkedannende område bestående av Asn,,<5->His<n6->Tyr<117->Asn,,<8->Thr<119> i nativ KGF med en aminosyre med høyere løkkedannende potensial (ifølge den offentlig tilgjengelige U.S.S.N. 08/323 473, innlevert 13. oktober 1994), spesielt H(l 16)G, en KGF hvor histidin i aminosyreposisjon 116 i nativ KGF er erstattet med glysin. Nok et eksempel omfatter proteiner med én eller flere aminosyresubstitusjoner, -delesjoner eller -addisjoner i området 123-133 i nativ KGF (aminosyrene 154-164 i SEKV.ID NR. 2); disse proteiner kan ha agonist-eller antagonistaktivitet.
Overraskende nok har det blitt oppdaget at når et KGF-molekyl (dvs. et utgangsmolekyl) som besitter (som bestemt ved å benytte teknikker beskrevet ovenfor) cysteinrestene som tilsvarer Cys<1> og Cys<15> i nativ KGF (cysteinrestene 32 og 46 i SEKV.ID NR. 2) modifiseres ved at cysteinene erstattes med andre aminosyrer, vil den resulterende KGF-analog ha forbedret stabilitet sammenlignet med utgangsmolekylet. Oppfinnelsen er fortrinnsvis rettet mot de analoger som i tillegg til forbedret stabilitet også viser full, biologisk aktivitet (dvs. i det minste tilnærmet lik reseptorbinding eller affinitet) sammenlignet med nativ KGF.
Ved en annen side av foreliggende oppfinnelse beskrives rensede og isolerte nukleinsyremolekyler som koder for de forskjellige biologisk aktive polypeptidanaloger av KGF.
I én utførelse omfatter oppfinnelsen rekombinant nukleinsyremolekyl, kjennetegnet ved at den koder for en analog ifølge oppfinnelsen.
I en annen utførelse omfatter oppfinnelsen biologisk funksjonell vektor, kjennetegnet ved at den omfatter et nukleinsyremolekyl ifølge oppfinnelsen.
I nok en utførelse omfatter oppfinnelsen prokaryot eller eukaryot vertscelle, kjennetegnet ved at den inneholder et nukleinsyremolekyl ifølge oppfinnelsen.
Oppfinnelsen omfatter også fremgangsmåte for fremstilling av en analog av KGF, kjennetegnet ved at den omfatter dyrking under egnede næringsbetingelser av en vertscelle ifølge oppfinnelsen på en måte som tillater ekspresjon av analogen kodet av denne og isolering av analogen fremstilt på denne måte.
Videre omfatter oppfinnelsen anvendelse av en effektiv mengde av analogen av
KGF ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for stimulering av ikke-fibroblastepitelceller.
Oppfinnelsen omfatter også in v/Yrø-fremgangsmåte for stimulering av produksjon av ikke-fibroblastepitelceller, kjennetegnet ved at den omfattter administrering av en effektiv mengde av en analog av KGF ifølge oppfinnelsen, eller et farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen.
Også omfattet av oppfinnelsen er anvendelse av en effektiv mengde av AN23 for fremstilling av et medikament for stimulering av produksjon av ikke-fibroblastepitelceller hos en pasient med behov for dette, hvori ikke-fibroblastepitelcellene er utvalgt fra adnexale strukturer, leverceller, slimhinneepitel i luftveiene eller tympaniske epitelceller.
I tråd med dette gjelder en annen side ved oppfinnelsen en in vftro-fremgangsmåte for stimulering av produksjon av ikke-fibroblastepitelceller, kjennetegnet ved at den omfatter administrering av en effektiv mengde av AN23 eller et farmasøytisk preparat derav, hvori ikke-fibroblastepitelcellene er utvalgt fra adneksale strukturer, lever celler, slimhinneepitel i luftveiene eller tympaniske epitelceller.
Kort beskrivelse av figurene
Figur IA og IB viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 1) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 2) til nativ KGF (nukleotidene som koder for den modne form av nativ KGF, er gitt ved basene 201 til 684 i SEKV.ID NR. 1, og den modne form av KGF er gitt ved aminosyrerestene 32 til 194 i SEKV.ID NR. 2). Figurene 2A, 2B og 2C viser plasmidkart av pCFMl 156, pCFM1656, hhv.
pCFM3102. Figur 3 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 3) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 4) av konstruksjonen RSH-KGF. Figur 4 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 5) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 6) til konstruksjonen som inngår i plasmid KGF. Figur 5 viser de kjemisk syntetiserte oligonukleotider (OLIGO nr. 6 til OLIGO nr. 11, SEKV.ID NR. 12-17) benyttet til å erstatte DNA-sekvensen mellom et Kpril-sete og et £cøRI-sete (fra aminosyreposisjon 46 til 85 i SEKV.ID NR. 6) i konstruksjonen som inngår i plasmid KGF, for fremstilling av konstruksjonen i plasmid KGF(dsd). Figur 6 viser de kjemisk syntetiserte oligonukleotider (OLIGO nr. 12 til OLIGO nr. 24, SEKV.ID NR. 18-30) benyttet for fremstilling av KGF (kodonoptimalisert). Figur 7 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 31) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 32) til C(1,15)S, en KGF-analog hvor cystein i aminosyreposisjonene
1 og 15 i nativ KGF er erstattet med serin.
Figur 8 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 33) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 34) til AN3/C(15)S, en KGF-analog hvor de tre første N-terminale aminosyrer er delert og cystein i aminosyreposisjon 15 i nativ KGF er erstattet med serin. Figur 9 viser nukleotidsekvens (SEKV.ID NR. 35) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 36) til AN3/C( 15)-, en KGF-analog hvor de tre første N-terminale aminosyrer og cystein i aminosyreposisjon 15 i nativ KGF er delert. Figur 10 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 37) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 38) til AN8/C(15)S, en KGF-analog hvor de 8 første N-terminale aminosyrer er delert, og cystein i aminosyreposisjon 15 i nativ KGF er erstattet med serin. Figur 11 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 39) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 40) til AN8/c<15)-, en KGF-analog hvor de 8 første N-terminale aminosyrer og cystein i aminosyreposisjon 15 i nativ KGF er delert. Figur 12 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 41) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 42) til AN15, en KGF-analog hvor de 15 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert. Figur 13 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 43) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 44) til AN16, en KGF-analog hvor de 16 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert. Figur 14 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 45) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 46) til AN 17, en KGF-analog hvor de 17 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert. Figur 15 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 47) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 48) til AN18, en KGF-analog hvor de 18 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert. Figur 16 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 49) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 50) til AN19, en KGF-analog hvor de 19 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert. Figur 17 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 51) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 52) til AN20, en KGF-analog hvor de 20 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert. Figur 18 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 53) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 54) til AN21, en KGF-analog hvor de 21 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert. Figur 19 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 55) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 56) til AN22, en KGF-analog hvor de 22 første N-terminale
aminosyrer i nativ KGF er delert.
Figur 20 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 57) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 58) til AN23, en KGF-analog hvor de 23 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert. Figur 21 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 59) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 60) til AN24, en KGF-analog hvor de 24 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert. Figur 22 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 61) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 62) til C(1,15)S/R(144)E, en KGF-analog hvor cystein i aminosyreposisjon 1 og 15 i nativ KGF er erstattet med serin, og arginin i aminosyreposisjon 144 i nativ KGF er erstattet med glutaminsyre. Figur 23 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 63) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 64) til C(1,15)S/R(144)Q, en KGF-analog hvor cystein i aminosyreposisjonene 1 og 15 i nativ KGF er erstattet med serin, og arginin i aminosyreposisjon 144 i nativ KGF er erstattet med glutamin. Figur 24 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 65) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 66) til AN23/R(144)Q, en KGF-analog hvor de 23 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert og hvor arginin i aminosyreposisjon 144 er erstattet med glutamin. Figur 25 viser mengden gjenværende, løselig protein etter lagring av nativ KGF og C(1,15)S i 20 mM Na-fosfat, 0,15 M NaCl, pH 7,0 ved 37 °C i 27 timer. Figur 26 viser mengden gjenværende, løselig protein etter lagring av nativ KGF, AN15 og C(1,15)S i 50 mM NaP04,0,15 M NaCl, pH 7,0 ved 37 °C i 27 timer. Figur 27 viser mengden løselig protein av nativ KGF, C(l ,15)S, C(1,15)S/R(144)E og C(1,15)S/R(144)Q, bestemt ved størrelseseksklusjons-HPLC som funksjon av inkuberingstid ved 37 °C. Figur 28 viser den beregnede smeltetemperatur (Tm) som funksjon av pH for nativ KGF, C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)Q og C(1,15)S/R(144)E. Figur 29 viser en typisk profil for mitogen aktivitet av C(l, 15)S bestemt ved å måle inkorporering av [ H]-tymidin under DNA-syntese og sammenligning med en nativ KGF-standardkurve. Figur 30 viser en typisk profil for mitogen aktivitet av AN15 bestemt ved å måle inkorporering av [ H]-tymidin under DNA-syntese og sammenligning med en nativ KGF-standardkurve. Figur 31 viser en typisk profil for mitogen aktivitet av AN23 bestemt ved å måle inkorporering av [<3>H]-tymidin under DNA-syntese og sammenligning med en nativ KGF-standardkurve. Figur 32 viser en typisk profil for mitogen aktivitet av AN23/R(144)Q bestemt ved å måle inkorporering av [ H]-tymidin under DNA-syntese og sammenligning med en nativ KGF-standardkurve. Figur 33 viser en typisk profil for mitogen aktivitet av C(1,15)S/R(144)Q bestemt ved å måle inkorporering av [<3>H]-tymidin under DNA-syntese og sammenligning med en nativ KGF-standardkurve. Figur 34 viser en typisk profil for mitogen aktivitet av C(1,15)S/R(144)E bestemt ved å måle inkorporering av [<3>H]-tymidin under DNA-syntese og sammenligning med en nativ KGF-standardkurve. Figur 35 viser virkningene av nativ KGF, KGF-a, AN15 C(1,15)S og AN23 på kolesterol i serum. Figur 36 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 77) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 78) til C(1,15,40)S, en KGF-analog hvor cystein i aminosyreposisjonene 1,15 og 40 i nativ KGF er erstattet med serin. Figur 37 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 79) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 80) til C(1,15,102)S, en KGF-analog hvor cystein i aminosyreposisjonene 1,15 og 102 i nativ KGF er erstattet med serin. Figur 38 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 81) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 82) til C(1,15,102,106)S, en KGF-analog hvor cystein i aminosyreposisjonene 1,15,102 og 106 i nativ KGF er erstattet med serin. Figur 39 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 83) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 84) til AN23/N(137)E, en KGF-analog hvor de 23 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert, og asparagin i aminosyreposisjon 137 er erstattet med glutaminsyre. Figur 40 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 85) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 86) til AN23/K(139)E, en KGF-analog hvor de 23 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert, og lysin i aminosyreposisjon 139 er erstattet med glutaminsyre. Figur 41 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 87) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 88) til AN23/K(139)Q, en KGF-analog hvor de 23 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert, og lysin i aminosyreposisjon 139 er erstattet med glutamin. Figur 42 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 89) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 90) til AN23/R(144)A, en KGF-analog hvor de 23 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert, og arginin i aminosyreposisjon 144 er erstattet med alanin. Figur 43 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 91) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 92) til AN23/R(144)E, en KGF-analog hvor de 23 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert, og arginin i aminosyreposisjon 144 er
erstattet med glutaminsyre.
Figur 44 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 93) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 94) til AN23/R(144)L, en KGF-analog hvor de 23 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert, og arginin i aminosyreposisjon 144 er erstattet med leucin. Figur 45 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 95) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 96) til AN23/K(147)E, en KGF-analog hvor de 23 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert, og lysin i aminosyreposisjon 147 er erstattet med glutaminsyre. Figur 46 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 97) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR, 98) til AN23/K(147)Q, en KGF-analog hvor de 23 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert, og lysin i aminosyreposisjon 147 er erstattet med glutamin. Figur 47 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 99) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 100) til AN23/K(153)E, en KGF-analog hvor de 23 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert, og lysin i aminosyreposisjon 153 er erstattet med glutaminsyre. Figur 48 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 101) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 102) til AN23/K(153)Q, en KGF-analog hvor de 23 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert, og lysin i aminosyreposisjon 153 er erstattet med glutamin. Figur 49 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID NR. 103) og aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 104) til AN23/Q(152)E/K(153)E, en KGF-analog hvor de 23 første N-terminale aminosyrer i nativ KGF er delert, glutamin i aminosyreposisjon 152 i nativ KGF er erstattet med glutaminsyre, og lysin i aminosyreposisjon 153 i nativ KGF er erstattet med glutaminsyre. Figur 50 viser virkningen av AN23 på streptozotocin-indusert diabetes hos Sprague-Dawley-rotter.
Detaljert beskrivelse
I samsvar med foreliggende oppfinnelse tilveiebringes nye KGF-analoger. Det er nå fastslått at fire av cysteinrestene i nativ KGF (Cys<1> og Cys15, hhv. Cys<102> og Cys<106>) deltar i dannelse av to disulfidbroer. Cys<40> deltar ikke i intramolekylær disulfiddannelse. Således inneholder KGF to små disulfidløkker atskilt av nesten 90 aminosyrer. I utgangspunktet vil fastslåelse av hvilke cysteinrester som deltar i disulfidbroene, antyde hvilke cysteiner som er frie til å danne uønskede, intermolekylære kryssbindinger eller intramolekylære bindinger som forårsaker proteinet til å innta en uønsket tertiærstruktur (f.eks. en konformasjon som reduserer
proteinets aktivitet).
Overraskende nok viser det seg at modifisering av en KGF ved å delere cysteinrestene tilsvarende posisjonene 1 og 15 i KGF (posisjonene 32 og 46 i SEKV.ID NR. 2) eller å erstatte dem med andre aminosyrerester, gir en KGF-analog med vesentlig forbedret stabilitet (dvs. reduserte problemer forårsaket av ukorrekt folding, dannelse av intermolekylære disulfidbroer og/eller proteinaggregering). For eksempel vil KGF-analogene generelt kunne renses i høyere utbytte av løselig, korrekt foldet protein. Videre vil materialet når det først er renset, være mer stabilt overfor pH, temperatur osv., sammenlignet med stabiliteten av utgangsmolekylet. Selv om hypotesen ikke må betraktes som bindende, antas det at Cys<1> og Cys<15> i KGF i tillegg til å danne en intramolekylær disulfidbro og en N-terminal disulfidløkke, under visse betingelser også foreligger som frie cysteiner som kan danne intermolekylære disulfidbroer, noe som fører til ustabilt protein og proteinaggregering. Videre er det vist at delesjon av den N-terminale disulfidløkke ikke har betydning for reseptorbinding eller mitogen aktivitet.
Som benyttet i foreliggende oppfinnelse, betyr en "KGF-analog" ethvert av de beskrevne polypeptider, naturlig forekommende eller ikke, som avviker i struktur fra en KGF ved at det inneholder endringer i peptidsekvensen som tilsvarer de 24 N-terminale aminosyrer i KGF (aminosyrene 32 til 55 i SEKV.ID NR. 2), hvori Cys<1> og Cys<15> i KGF (aminosyrene 32 og 46 i SEKV.ID NR. 2) er erstattet med andre eller delert. Måten som disse cysteiner er erstattet eller delert på, har ingen betydning og omfatter f.eks. polypeptidanaloger som inneholder én eller flere aminosyre-delesjoner og/eller substitusjoner. Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen en familie med nye keratinocyttvekstfaktorproteiner. Denne familie omfatter flere proteingrupper.
Én gruppe KGF-analoger omfatter molekyler i hvilke cysteinene i posisjonene 1 og 15 i en KGF er erstattet med aminosyrer, heriblant aminosyrer som ikke forekommer naturlig i proteiner. Strategier for fremstilling av substitusjonsana-logene omfatter setestyrt mutagenese (Ho et al. (1989), Gene, 77:51-59; Innis et al. "PRC Protocols", Academic Press, Inc., San Diego, CA). [KGF-analoger som omfatter en aminosyresubstitusjon, betegnes ved aminosyreresten som finnes i denne posi-sjon i det modne protein (minus signalsekvens) vist i SEKV.ID NR. 2, etterfulgt av aminosyreposisjonen i parentes og den nye aminosyre. For eksempel betegnes en analog som inneholder en cystein-til-seirnsubstitusjon i aminosyreposisjon 15 i KGF (posisjon 46 i SEKV.ID NR. 2) som "C(15)S"]. Cysteinet endres fortrinnsvis til en nøytral aminosyre som glysin, valin, alanin, leucin, isoleucin, tyrosin, fenylalanin, histidin, tryptofan, serin, treonin og metionin, med serin, treonin og alanin som de mest foretrukne på grunn av deres kjemiske likhet med cystein. Eksempel 1 gir detaljer for fremstilling av C(l,l 5)S ved å benytte partiell gensyntese (forbundet med
andre rekombinantteknikker) fulgt av rekombinant ekspresjon i en stabilt transformert bakterievert.
En annen gruppe av KGF-analoger omfatter molekyler hvor cystein i posisjonene 1 og 15 er delert. Forskjellige strategier kan benyttes for utvikling av slike KGF-analoger, f.eks. N-terminal forkortelse og setespesifikke delesjoner, eller en kombinasjon av begge.
En "N-terminal forkortelse" viser til en KGF-modifikasjon hvori 1 til 24 N-terminale aminosyrerester i KGF (aminosyrene 32 til 55 i SEKV.ID NR. 2), heriblant Cys<1> og Cys<15>, er delert. [KGF-analoger som inneholder en aminosyre-forkortelse, vil betegnes ved aminosyreresten delert i den gitte posisjon i det modne protein (minus signalsekvens) som vist i SEKV.ID NR. 2, med start i delesjonssetet og antall delerte aminosyrerester. For eksempel vil en KGF-analog som omfatter en N-terminal forkortelse på 24 aminosyrerester i KGF (aminosyrerestene 1-55 i SEKV.ID NR. 2), betegnes som en "AN24"-analog]. Spesielt inkludert i denne gruppe er AN23-analoger av nativ KGF hvor én eller flere av aminosyrerestene 41-154 (aminosyrene 72-185 i SEKV.ID NR. 2), spesielt inkludert aminosyrerestene 123-133 (aminosyrene 154-164 i SEKV.ID NR. 2), er delert eller erstattet med en nøytral eller negativt ladet aminosyrerest utvalgt for å gi et protein med redusert, positiv ladning. Foretrukne aminosyrerester for modifisering er Arg<41>, Gin<43>, Lys<55>, Lys<95>, Lys<128>, Asn<137>, Gin<138>, Lys139, Arg<144>, Lys<147>, Gin152, Lys<153> eller Thr<154>, med Gin<138>, Lys139, Arg<144>, Lys147, Gin<152> eller Lys1<53> som spesielt foretrukne, og Arg som den mest foretrukne. Også omfattet i denne gruppe er AN23-analoger av nativ KGF med løkkedannende modifikasjoner i et løkkedannende område bestående av Asn115-His<116->Tyr,<l7->Asn<118->Thr<119> (aminosyrene 146-150 i SEKV.ID NR. 2), fortrinnsvis omfattende en ladningsendringsmodifisering av aminosyrerest 116, mer foretrukket innføring av Gly i posisjon 116. Videre innbefattet i denne gruppe er AN23-analoger av nativ KGF med én eller flere aminosyresubstitusjoner, -delesjoner eller -addisjoner innen et område bestående av posisjon 123-133 i nativ KGF (aminosyrene 154-164 i SEKV.ID NR. 2).
Eksempel 1 gir detaljer for fremstilling av systematiske, N-terminale forkortelser oppnådd ved å benytte partiell gensyntese forbundet med andre rekombinante teknikker, fulgt av rekombinant ekspresjon i en stabilt transformert bakterievert. Eksempler på slike N-terminale forkortelser omfatter AN 15 til AN24. Videre gir eksempel 3 detaljer vedrørende ekspresjon i dyrkede pattedyrceller av DNA som koder for nativ KGF og heterogene isoformer glykosylert i den N-terminale ende, og rensing av fortrinnsvis en glykosylert isoform med en N-terminal forkortelse av aminosyrene 1-23 i den modne form av nativ KGF.
I motsetning til dette viser en setespesifikk delesjon til en KGF-modifikasjon hvori én eller flere aminosyrerester (f.eks. Cys<1> eller Cys<15>) er fjernet. Når Cys<1> eller Cys<15> i <K>GF er spesifikt delert, vil analogen være én aminosyre kortere enn KGF. [KGF-analoger som inneholder en aminosyredelesjon, betegnes ved aminosyreresten som finnes i den gitte posisjon i det modne protein (minus signalsekvensen) beskrevet i SEKV.ID NR. 2, etterfulgt av den gitte aminosyreposisjon i parentes, og et minustegn. For eksempel vil en analog innen denne gruppe som inneholder en delesjon av cystein i posisjon 15 i KGF (posisjon 36 i SEKV.ID NR. 2), betegnes som
"C(15)-"]. De setespesifikke delesjoner kan fremstilles ved å benytte setestyrt mutagenese som beskrevet ovenfor.
Også innbefattet i denne gruppe er analoger hvor Cys<1> og Cys<15> i KGF er fjernet ved forkortelse og delesjon. For eksempel omfatter representative KGF-analoger fjerning av de tre første N-terminale aminosyrerester (Cys-Asn-Asp) i KGF eller fjerning av de åtte første aminosyrer (Cys-Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln) i KGF, koblet med delesjon av cystein i aminosyreposisjon 15 i KGF (disse analoger betegnes som AN3/C(15)- hhv. AN8/C(15)-). Da en metioninrest forekommer naturlig i fjerde og niende aminosyreposisjon i nativ KGF, kreves intet ytterligere Met-kodon for å gi korrekt translasjonsinitiering.
Nok en gruppe omfatter molekyler hvor cystein i posisjon 1 og 15 i KGF er erstattet ved forkortelse og substitusjon. Representative KGF-analoger er f.eks. AN3/C(15)S og AN8/C(15)S. Slike analoger omfatter fjerning av de tre første N-terminale aminosyrerester i KGF eller delesjon av de åtte første N-terminale aminosyrerester i KGF, koblet med substitusjon av cystein i aminosyreposisjon 15 med en annen aminosyre, f.eks. serin.
Når KGF-analogene fremstilles biologisk, dvs. at de er produkter av cellulær ekspresjon snarere enn produkter av fastfase-syntese, proteolytisk eller enzymatisk derivatisering av naturlig forekommende produkter osv., vil nukleinsyrene som koder for disse polypeptider, avvike i ett eller flere nukleotider, sammenlignet med den native KGF-nukleotidsekvens. Slike polynukleotider kan uttrykkes, og det resulterende polypeptid renses ved en rekke fremgangsmåter innen rekombinant teknologi som er velkjent blant fagfolk.
DNA-sekvenser som koder for fullstendige KGF-analoger eller deler av dem, kan blant annet omfatte innføring av kodoner som er "foretrukne" for ekspresjon i utvalgte vertsceller (f.eks. " E. co/i-ekspresjonskodoner"), innføring av seter for kløyving med restriksjonsenzymer, og innføring av ytterligere nukleotidsekvenser i endene eller i mellomliggende områder (f.eks. en initiell metionin-aminosyrerest for ekspresjon i E. co//-celler) for å lette konstruksjonen av lett uttrykkbare vektorer.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også rekombinante molekyler eller vektorer for bruk i fremgangsmåten for ekspresjon av polypeptidene. Slike vektorer kan bestå av DNA eller RNA og kan være sirkulære, lineære, enkelttrådede eller dobbelttrådede av natur, og kan være naturlig forekommende eller sammensatt av en rekke bestanddeler, enten naturlig forekommende eller syntetiske.
Mange eksempler på slike ekspresjonsvektorer er kjent. Bestanddelene i vektorene, f.eks. replikoner, seleksjonsgener, enhancere, promotere og lignende, kan erholdes fra naturlige kilder eller identifiseres ved kjente fremgangsmåter. Iallfall vil ekspresjonsvektorer som er anvendbare i foreliggende oppfinnelse, inneholde minst ett ekspresjonskontrollelement funksjonelt koblet til det innsatte nukleinsyremolekyl som koder for KGF-polypeptidanalogen. Dette kontrollelement er ansvarlig for regulering av polypepudekspre-sjon fra nukleinsyremolekylene ifølge oppfinnelsen. Anvendbare kontrollelementer omfatter f.eks. /ac-systemet, f/p-systemet, operatorer og promotere fra bakteriofag \ en glykolytisk gjærpromoter, en promoter fra sur fosfatasegenet i gjær, en alfa-krysningsfaktor fra gjær, og promotere avledet fra adenovirus, Epstein-Barr-virus, polyomavirus og apevirus, så vel som promotere fra forskjellige retrovirus. En rekke andre vektorer og kontrollelementer egnet for prokaryot eller eukaryot ekspresjon, er imidlertid kjent innen faget og kan benyttes ved utførelse av foreliggende oppfinnelse.
Eksempler på egnede, prokaryote kloningsvektorer kan omfatte plasmider fra E. coli (f.eks. pBR322, col El, pUC og F-faktoren), hvor de foretrukne plasmider er pCFMl 156 (ATCC 69702), pCFM1656 (ATCC 69576) og pCFM3102 (beskrevet i eksempeldelen nedenfor). Andre passende ekspresjonsvektorer av hvilke flere typer er kjent innen faget, for ekspresjon i pattedyrceller, insektsceller, gjær-celler, soppceller og bakterieceller, kan også benyttes for dette formål. Transfeksjon av disse vektorer inn i passende vertsceller kan føre til ekspresjon av KGF-analogpolypeptidene.
Anvendbare vertsmikroorganismer i foreliggende oppfinnelse kan være enten prokaryote eller eukaryote. Egnede, prokaryote verter omfatter forskjellige stammer av E. coli (f.eks. FM5, HB101, DH5o; DH10 og MC1061), Pseudomonas, Bacillus og Streptomyces hvor E. coli er foretrukket. Egnede eukaryote vertsceller omfatter gjær og annen sopp, insektsceller, planteceller og dyreceller som COS (f.eks. COS-1 og COS-7) og CV-1-apecelIelinjer, 3T3-linjer avledet fra Swiss, Balb-c eller NIH-celler, HeLa og L-929 museceller, og CHO-, BHK- eller HaK-hamsterceller. Avhengig av den benyttede vert, vil rekombinante proteiner fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, være glykosylert med marnmalske eller andre eukaryote karbohydrater, eller de kan være ikke-glykosylert.
Den foretrukne fremstillingsfremgangsmåte vil variere avhengig av mange faktorer og betraktninger; den optimale fremstillingsfremgangsmåte for en gitt situasjon vil være åpenbar for fagfolk gjennom minimal eksperimentering. Det resulterende ekspresjonsprodukt kan så renses til nær homogenitet ved bruk av fremgangsmåter kjent innen faget. En typisk rensingsfremgangsmåte for produksjon i prokaryote celler omfatter oppbrekking av celleveggen ved høyt trykk eller andre midler, sentrifugering eller filtrering for å fjerne cellerester, etterfulgt av ione-bytterkromatografi av supernatant eller filtrat, og, endelig, hydrofob interaksjonskromatografi. Dersom analogen uttrykkes i uløselig form, omfatter en annen rensingsteknikk først solubilisering av inklusjonslegemene som inneholder analogene, etterfulgt av ionebytterkromatografl og gjenfolding av proteinet, og, endelig, hydrofob interaksjonskromatografi. Eksempler på rensingsteknikker gis i den offentlig tilgjengelige U.S.S.N. 08/323 339, innlevert 13. oktober 1994. Generelt beskriver U.S.S.N. 08/323 339 en fremgangsmåte for rensing av en keratinocyttvekstfaktor som omfatter: (a) erholdelse av en løsning som inneholder KGF, (b) binding av KGF fra løsningen ifølge del (a) til en kationbytterresin, (c) eluering av KGF i en eluatløsning fra kationbytterresinet, (d) enten å la eluatløsningen fra del (c) passere gjennom en passende molekylvektseksklusjonsmatriks eller å utføre hydrofob interaksjonskromatografi på eluatløsningen fra del (c), og (e) gjenvinning av KGF fra molekyl-vektseksklusjonsmatriksen eller den hydrofobe interaksjonskromatografi.
Naturligvis kan analogene hurtig analyseres for å fastslå deres fysikalske egenskaper. Eksemplene beskriver forskjellige velkjente stabilitetsanalyser selv om den spesifikke analyse som benyttes for å teste analogen, ikke er kritisk. Videre kan også nivået av biologisk aktivitet (f.eks. reseptorbinding og/eller -affinitet, mitogen aktivitet, celleproliferativ aktivitet og/eller in vivo-aktivitet) analyseres ved en rekke analysemetoder av hvilke noen beskrives i eksemplene. Flere analysemetoder er velkjente og kan benyttes for hurtig analyse av KGF-analogene for å fastslå hvorvidt de beskytter tilfredsstillende biologisk aktivitet. En slik fremgangsmåte analyserer spesifikt KGF-analogene med hensyn til evne til å bindes til KGF-reseptoren (KGFR) ved å konkurrere med 12<5>I-KGF-binding (Bottaro et al. (1990), J. Biol. Chem., 265:12767-12770; Ron et al. (1993), J. Biol. Chem., 265:2984-2988). En alternativ fremgangsmåte for analyse av KGFR/KGF-analoginteraksjoner omfatter bruk av teknikker som sanntidsanalyse av biospesifikke interaksjoner (BIA) (Felder et al.
(1993), Molecular Cellular Biology, 75:1449-1455). I tillegg kan en mitogen analyse benyttes for å måle evnen til KGF-analogene til å stimulere DNA-syntese (Rubin et al.
(1989), supra). Endelig kan celleproliferasjonsanalyser benyttes for å analysere KGF-analogenes evne til å stimulere celleproliferasjon (Falco et al. (1988), Oncogene, 2:573-578). Ved bruk av hvilke som helst av analysesystemene beskrevet ovenfor, kan KGF-analoger hurtig analyseres med hensyn til biologisk aktivitet.
I en foretrukket utførelse er foreliggende oppfinnelse rettet mot KGF-analoger som har beholdt den fulle (dvs. i det minste vesentlig lik) in vitro- eller in v/vo-biologiske aktivitet som nativ KGF. Eksempler på KGF-analoger med disse egenskaper, bestemt ved én eller flere av analysemetodene ovenfor, er C(1,15)S, AN3/C(15)S, AN3/C(15>, AN8/C(15)S, AN8/C(15>, AN15, AN16, AN17, AN18, AN19, AN20, AN21, AN22, AN23, AN24 eller AN23/R(144)Q.
KGF-analogene kan ytterligere modifiseres slik at de inneholder ytterligere kjemiske rester som ikke normalt inngår i peptidet. Slike derivatiserte rester kan forbedre løseligheten, absorpsjonen, biologisk halveringstid og lignende for KGF-analogen. Restene kan alternativt elimineres eller svekke eventuelle uønskede bivirkninger ved proteinet og lignende. Rester som kan gi slike virkninger, er f.eks. beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. utg., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Kovalente modifikasjoner kan innføres i molekylet ved å la gitte aminosyrerester i peptidet reagere med et organisk derivatiseirngsmiddel som kan reagere med utvalgte sidekjeder eller aminosyrerester i endene av molekylet (T.E. Creighton (1983); Proteins: Structure and Molecule Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, s. 79-86). Polyetylenglykol ("PEG") er én slik kjemisk rest som er blitt benyttet til fremstilling av terapeutiske proteinprodukter. For noen proteiner har tilkobling av polyetylenglykol vist seg å beskytte mot proteolyse, Sada et al. (1991), J. Fermentation Bioengineering, 77:137-139, og fremgangsmåter for tilkobling av visse polyetylenglykolrester er tilgjengelige. Se US patentskrift nr. 4 179 337, Davis et al., "Non-Immunogenic Polypeptides", tildelt 18. desember 1979, og US patentskrift nr. 4 002 531, Royer, "Modifying enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby", tildelt 11. januar 1977. For en oversiktsartikkel, se Abuchowski et al., i Enzymes as Drugs. (Holcerberg og Roberts, (red.), s. 367-383 (1981)). For polyetylenglykol er en rekke midler blitt benyttet for tilkobling av polyetylenglykolmolekyler til proteinet. Generelt kobles polyetylenglykolmolekyler til proteinet via en reaktiv gruppe i proteinet. Aminogrupper som dem i lysinrester eller i den N-terminale ende, er velegnede for slik tilkobling. I f.eks. Royer (US patentskrift nr. 4 002 531, ovenfor) hevdes at reduktiv alkylering ble benyttet for tilkobling av polyetylenglykolmolekyler til et enzym. EP 0 539 167, publisert 28. april 1993, Wright, "Peg Imidates and Protein Derivates Thereof', opplyser at peptider og organiske forbindelser med fri aminogruppe(r) modifiseres med et imidatderivat av PEG eller beslektede, vann-løselige, organiske polymerer. US patentskrift nr. 4 904 584, Shaw, tildelt 27. februar 1990, gjelder modifisering av antallet lysinrester i proteiner for tilkobling av polyetylenglykolmolekyler via reaktive amingrupper.
I nok en utførelse er foreliggende oppfinnelse rettet mot en endose-tilføringsenhet av et medisinsk preparat som trygt kan tilføres parenteralt eller oralt for behandling av en sykdom hos et varmblodig dyr (f.eks. et menneske). Et slikt medisinsk preparat kan foreligge som et frysetørket eller på annet vis dehydrert terapeutisk eller diagnostisk middel som kan rekonstitueres ved tilsetning av et fysiologisk aksepterbart løsemiddel. Løsemidlet kan være ethvert medium, f.eks. sterilt vann, en fysiologisk saltløsning, en glukoseløsning eller andre vandige karbohydrater (f.eks. polyoler som mannitol, xylitol eller glyserol) som er i stand til å oppløse det tørkede preparat, som er kompatibelt med den valgte tilførselsvei, og som ikke interfererer på negativ måte med den aktive bestanddel og de benyttede rekonstitusjonsstabilisatorer. I en spesifikk utførelse er foreliggende oppfinnelse rettet mot et sett for fremstilling av endose-tilføringsenheten. Settet inneholder både en første beholder med et tørket protein og en andre beholder med et vandig preparat som inneholder en rekonstitusjonsstabilisator. Når det gjelder konsentrasjonen av proteinet i løsningen, volumet av løsning som tilføres hver beholder og beholdernes kapasitet (parametrer som avhenger av hverandre og som kan modifiseres etter behov, avhengig av den ønskede konsentrasjon av aktiv bestanddel i sluttdoseenheten), kan disse variere innen vide grenser velkjente blant erfarne fagfolk.
KGF-analoger ifølge oppfinnelsen kan være anvendbare som terapeutiske og diagnostiske midler og som forskningsreagenser. Således kan KGF-analogene benyttes i diagnostiske in vitro- og/eller in vivo-analyser for kvantitering av mengden KGF i et vev eller en organprøve, eller for å måle og/eller isolere celler som uttrykker KGFR (Bottaro et al. (1990), J. Biol. Chem., 2(55:12767-12770; Ron et al. (1993), J. Biol. Chem., 265:2984-2988). I analyser av vev eller organer vil det være mindre binding av radioaktivitet fra ,<25>I-KGF-analog til KGFR, sammenlignet med en standardisert bindingskurve for ,<25>I-KGF-analog, grunnet binding av umerket, nativ KGF til KGFR. På tilsvarende måte kan anvendelsen av <125>I-KGF-analog benyttes for å påvise nærvær av KGFR i forskjellige celletyper.
For benyttelse in vivo kan KGF-analogene være utformet med tilsetningsstoffer. Slike tilsetningsstoffer omfatter buffere, bærerstoffer, stabilisatorer, eksipienser, konserveringsmidler, ionestyrkeregulerende midler, antioksidanter og lignende (f.eks. viskositetsjusterende midler eller fyllstoffer). Valg av spesifikke tilsetningsstoffer vil avhenge av lagringsformen (dvs. flytende eller frysetørket) og tilførselsveiene for KGF-analogen. Egnede oppskrifter kjent innen faget, kan finnes i Remington's Pharmaceutical Sciences (siste utgave), Mack Publishing Company, Easton, PA.
KGF-analogene kan tilføres i terapeutisk effektive mengder til vev som spesifikt er vist å ha skadde eller et klinisk utilstrekkelig antall ikke-fibroblast-epitelceller. Områder i hvilke KGF-analoger kan tilføres med hell, omfatter, men er ikke begrenset til: stimulering, proliferering og differensiering av adnexale strukturer som hårfollikler, svette-kjertler og talgkjertler hos pasienter med brannskader og andre skader i deler av eller hele epitelet, akselerert reepitelisering av lesjoner forårsaket av epidermolysis bullosa, som er en defekt i adherens av epidermis til den underliggende dermis, noe som fører til hyppige, åpne, smertefulle blemmer som kan forårsake alvorlig sykdom, forebyggelse av kjemoterapiindusert alopesi og behandling av skallethet hos menn, eller progressivt tap av hår hos menn og kvinner, behandling av magesår og sår på tolvfingertarmen, behandling av inflammatoriske tarmsykdommer som Crohns sykdom (som i første rekke påvirker tynntarmen) og ulcerøs kolitt (som i første rekke påvirker tykktarmen), forebyggelse eller reduksjon av tarmtoksisitet ved stråle- og kjemoterapibehandling via behandling (f.eks. forbehandling og/eller etter-behandling) for induksjon av en cytobeskyttende virkning eller regenerering eller begge deler, stimulering av mucusproduksjon i mage-tarmkanalen, induksjon av proliferasjon og differensiering av type II-pneumocytter, noe som kan hjelpe til å behandle eller forebygge sykdommer som hyalinmembransykdom (dvs. "infant respiratory distress syndrome" og bronkopulmonal dysplasi) hos for tidlig fødte barn, stimulering av proliferasjon og differensiering av bronkiolært og/eller alveolært epitel ved akutt eller kronisk lungeskade eller -svekkelse grunnet inhaleringsskader (heriblant høye oksygennivåer), emfysem, anvendelse av lungeskadende kjemoterapeutika, ventilatortraume eller andre lungeskadende omstendigheter, forbedret leverfunksjon for behandling eller forebyggelse av hepatisk cirrhose, fulminant leversvikt, skade forårsaket av akutt, viral hepatitt og/eller toksiske skader på leveren, induksjon av celleregenerering i cornea, f.eks. ved behandling av korneal abrasjon, induksjon av epitelcelleregenerering for behandling av "progressive gum disease", induksjon av regenerering av tympaniske epitelceller forbehandling av trommehinneskade og behandling eller hindret begynnelse av diabetes mellitus, eller som supplement i forbindelse med transplantasjon av Langerhansøyceller.
En pasient med behov for proliferasjon av ikke-fibroblast-epitelceller vil tilføres en effektiv mengde av en KGF-analog. En "effektiv mengde" er den mengde av KGF-analogen som kreves for å utløse den ønskede respons hos pasienten som behandles, og vil således generelt fastsettes av den behandlende lege. Faktorer som påvirker mengden av KGF-analog som tilføres, vil omfatte pasientens alder og generelle tilstand, sykdommen som behandles osv. Typiske doser vil variere fra 0,001 mg/kg kroppsvekt til 500 mg/kg kroppsvekt.
KGF-analogen kan trygt tilføres parenteralt (f.eks. intravenøst, intratora-kalt, intramuskulært, subkutant eller intraperitonealt), oralt eller topisk til varmblodige dyr (f.eks. mennesker). KGF-analogen kan benyttes én gang eller tilføres gjentatte ganger, avhengig av sykdommen og pasientens tilstand. I noen tilfeller kan KGF-analogen tilføres som et supplement til annen terapi og også sammen med andre farmasøytiske preparater.
Eksempler
Gjengse metoder for mange av fremgangsmåtene beskrevet i de påfølgende eksempler, eller egnede, alternative fremgangsmåter, foreligger i allment aksepterte manualer for molekylær biologi som f.eks. Molecular Cloning, 2. utg., Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) og Current Protocols in Molecular Biology, Ausabel et al., Greene Publishing Associates/Wiley Interscience, New York (1990).
Eksempel 1
Fremstilling av DNA som koder for KGF og KGF- analoger
Kloning av fullengde, humant KGF-gen (som koder for et polypeptid med sekvensen til nativ KGF) ble utført både ved polymerasekjedereaksjonen (PCR) på RNA fra en dyrecelle og ved PCR av kjemisk syntetiserte (med E. cø/i-optimaliserte kodoner) oligonukleotider ("OLIGO-er"). Begge fremgangsmåter beskrives nedenfor: PCR-amplifisering med RNA isolert fra celler som vites å produsere polypeptidet, ble utført. Først ble celler fra en human fibroblastcellelinje AG1523A (erholdt fra Human Genetic Mutant Cell Culture Repository Institute for Medical Research, Camden, New Jersey) åpnet med guanidiniumtiocyanat, fulgt av ekstraksjon (ifølge fremgangsmåten til Chomyzinski et al. (1987), Anal. Biochem., 772:156). Ved brak av en gjengs reverstranskriptaseprotokoll for total-RNA ble KGF-cDNA dannet. PCR (PCR nr. l)-amplifisering av KGF-genet ble utført med KGF-cDNA som templat og primerne OLIGO nr. 1 og OLIGO nr. 2 som koder for DNA-sekvenser umiddelbart 5' og 3' for KGF-genet [programmerbar varmeblokk, modell 9600 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT), 28 sykluser hvor hver syklus består av 1 minutt ved 94 °C for denaturering, 2 minutter ved 60 °C for hybridisering av primere og 3 minutter ved 72 °C for primerforlengelse]. En liten porsjon av PCR nr. 1-produktet ble så benyttet som templat i en ny KGF-PCR (PCR nr. 2)-amplifisering med syklusbetingelser som beskrevet ovenfor, bortsett fra at temperaturen for hybridisering av primere var 50 °C. For ekspresjonskloning av KGF-genet ble interne PCR-primere benyttet for å danne passende restriksjonsseter i hver ende av KGF-genet. OLIGO nr. 3 og OLIGO nr. 4 ble benyttet for å modifisere KGF-DNA-produktet fra PCR nr. 2 slik at det inneholdt restriksjonsseter for MM og BamHI i 5', hhv. 3' endene av genet [PCR nr. 3,30 sykluser, hver syklus bestående av 1 minutt ved 94 °C for denaturering, 2 minutter ved 60 °C for hybridisering av primere og 3 minutter ved 72 °C for primerforlengelse]. Dette DNA ble så kuttet med Mlul og 5am#/fenolelcstrahert og utfelt med etanol. Det ble så resuspendert og ligert (med T4-ligase) inn i et pCFMl 156-plasmid (figur 2A) som inneholdt en "RSH"-signaIsekvens slik at konstruksjonen RSH-KGF ble dannet
(figur 3).
Ligeringsproduktene ble transformert (ifølge fremgangsmåten til Hanahan (1983), J. Mol. Biol., 166:551) inn i E. coli stamme FM5 (ATCC: 53911) og utsådd på skåler med LB+kanamycin ved 28 °C. Flere transformanter ble utvalgt og dyrket i små, flytende kulturer med 20 jig/ml kanamycin. RSH-KGF-plasmidet ble isolert fra cellene fra hver kultur og sekvensert. Grunnet et internt Ndel- sete i KGF-genet, var det ikke mulig å klone den native gensekvens inn i den ønskede ekspresjonsvektor direkte ved å benytte Ndel- og BamHI- setet på hver side av genet. Dette ble oppnådd ved en treveis ligering. Plasmid RSH-KGF ble kuttet i unike restriksjonsseter med Bsml og Sstl, og et DNA-fragment på -3 kbp (som inneholdt den 3' ende av KGF-genet) ble isolert etter elektroforese i en 1% agarosegel. En PCR (PCR nr. 4) ble utført som beskrevet for PCR nr. 3, bortsett fra at OLIGO nr. 5 ble benyttet istedenfor OLIGO nr. 3. PCR-DNA-produktet ble så kuttet med Ndel og Bsml, og et DNA-fragment på 311 bp ble isolert etter elektroforese i en 4% agarosegel. Den tredje del til ligeringen er et DNA-fragment på 1,8 kbp fra pCFM1156 kuttet med Ndel og Sstl isolert etter elektroforese i en 1% agarosegel. Etter ligering (T4-ligase), transformering, kanamycinseleksjon og DNA-sekvensering som beskrevet ovenfor, ble en klon som inneholdt konstruksjonen i figur 4, plukket, og plasmidet ble betegnet KGF. Grunnet et internt ribosombindingssete som ga forkortede produkter, ble KGF-DNA-sekvensen mellom de unike Kpnl- og EcoRI-seter erstattet med kjemisk syntetiserte oligoer (OLIGO nr. 6 til OLIGO nr. 11) for å gi minimal bruk av det interne startsete (figur 5).
OLIGO-ene ble fosforylert med T4-polynukleotidkinase og deretter varmedenaturert. De enkelttrådede (ss) OLIGO-er fikk så danne et ds-DNA-fragment ved at temperaturen langsomt ble redusert til romtemperatur. T4-ligase ble så benyttet for kovalent sammenkobling av både de interne, klebrige OLIGO-ender og hele det dobbelttrådede OLIGO-fragment til KGF-plasmidet kuttet med Kpnl og EcoRI. Det nye plasmid ble betegnet KGF (dsd).
Et fullstendig E. co/i-kodonoptimalisert KGF-gen ble konstruert ved PCR-amplifisering av de kjemisk syntetiserte OLIGO-er nr. 12 til 24.
OLIGO nr. 12 til 24 ble utformet slik at den fullstendige DNA-sekvens som koder for nativ KGF, var representert ved OLIGO-er fra enten "Watson"- eller "Crick"-tråden og ved PCR-amplifisering ville gi den ønskede, dobbelttrådede DNA-sekvens (figur 6) [PCR nr. 5, programmerbar varmeblokk, modell 9600, (Perkin-Elmer Cetus), 21 sykluser hvor hver syklus består av 31 sekunder ved 94 °C for denaturering, 31 sekunder ved 50 °C for hybridisering av primere og 31 sekunder ved 73 °C for elongering; etter de 21 sykluser ble PCR-reaksjonen avsluttet med et avsluttende forlengelsestrinn på 7 minutter]. Etter PCR-amplifisering ble DNA-fragmentet kuttet med Xbal og BamHI, og fragmentet på 521 bp ble ligert inn i ekspresjonsplasmidet pCFMl 156 kuttet med de samme enzymer. PCR nr. 5 benyttet de utenforliggende primere (100 pmol/100 fil reaksjonsblanding) OLIGO nr. 12 og OLIGO nr. 13, og 1 ptl/100 /il reaksjonsblanding av et KGF-templat fremstilt ved ligering (med T4-ligase) av OLIGO nr. 14 til OLIGO nr. 19 (OLIGO nr. 15 til OLIGO nr. 18 ble fosforylert med T4-polynukleotidkinase) med OLIGO nr. 20 til OLIGO nr. 24 som "bandasje"-oligoer (Jayaraman et al. (1992), Biotechniques, 72:392) for ligeringen. Den endelige konstruksjon ble betegnet KGF (kodonoptimalisert).
Alle KGF-analoger som beskrives heri, består delvis av DNA-sekvenser som finnes i KGF (dsd) eller KGF (kodonoptimalisert), eller en kombinasjon av disse to. Sekvensene er ytterligere modifisert ved innsetting i egnede restriksjonsseter av DNA-sekvenser som koder for aminosyrer i den gitte KGF-analog, ved å benytte én eller flere av teknikkene beskrevet ovenfor for DNA-fragmentsyntese. Enhver av analogene kan fremstilles fullstendig ved teknikkene beskrevet ovenfor. Som del av den generelle OLIGO-design ble imidlertid optimaliserte E. cø/z-kodoner benyttet hvor ønskelig, selv om forekomst av E. cø/i-optimaliserte kodoner i deler av de under-søkte gener eller i hele genet ikke førte til signifikant høyere utbytte av protein som kunne erholdes fra dyrkede bakterieceller. Figurene 7 til 24 og 37 til 50 beskriver eksempler på nukleotid- og aminosyresekvenser for spesielle KGF-analogkonstruksjoner: C(1,15)S (figur 7); AN3/C(15)S (figur 8); AN3/C(15)- (figur 9); AN8/C(15)S (figur 10); AN8/C(15)- (figur 11); AN15 (figur 12); AN16 (figur 13); AN17 (figur 14); AN18 (figur 15); AN 19 (figur 16); AN20 (figur 17); AN21 (figur 18); AN22 (figur 19); AN23 (figur 20); AN24 (figur 21); C(1,15)S/R(144)E (figur 22); C(1,15)S/R(144)Q (figur 23); AN23/R(144)Q (figur 24); C(1,15,40)S (figur 36); C(1,15,102)S (figur 37); C(1,15,102,106)S (figur 38); AN23/N(137)E (figur 39); AN23/K(139)E (figur 40); AN23/K(139)Q (figur 41); AN23/R(144)A (figur 42); AN23/R(144)E (figur 43); AN23/R(144)L (figur 44); AN23/K(147)E (figur 45); AN23/K(147)Q (figur 46); AN23/K(153)E (figur 47); AN23/K(153)Q (figur 48) og AN23/Q(152)E/K(153)E (figur 49). Alle KGF-analogkonstruksjonene som beskrives heri, ble bekreftet ved
DNA-
sekvensering.
Eksempel 2
Produksjon i E . coli
A. Ekspresjon av KGF-analoger
Tre forskjellige ekspresjonsplasmider ble benyttet ved kloning av KGF-analoggenene. Disse var pCFMl 156 (ATCC nr. 69702), pCFM1656 (ATCC nr. 69576) og pCFM3102 (hhv. figurene 2A, 2B og 2C). Plasmid p3102 kan avledes fra plasmid pCFM1656 ved å utføre en serie setestyrte baseendringer ved mutagenese utført ved PCR med overlappende oligoer. I rekkefølge fra Bglll- sctet (pCFM1656-plasmid bp nr. 180) umiddelbart 5' for plasmidreplikasjonspromoteren, PcopBi mot plasmidreplikasjonsgenene, er baseparendringene som følger:
Som vist ovenfor, er pCFMl 156, pCFM1656 og pCFM3102 svært like hverandre og inneholder mange av de samme restriksjonsseter. Disse plasmider ble valgt fordi de er hendige og tillater lett utbytting av vektor-DNA-komponenter for fremstilling av nye konstruksjoner. Verten som ble benyttet i kloningen, var E. coli stamme FM5 (ATCC: 53911), og transformasjonene ble utført (ifølge fremgangsmåten til Hanahan (1983), supra) eller ved elektroeluering med et "Gene Pulser" transfeksjonsapparat (BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA) ifølge produsentens instruksjoner.
Først ble et lite, nydyrket inokulum av den ønskede, rekombinante E. cø//-klon som inneholdt den ønskede konstruksjon i én av de tre pCFM-vektorer, startet ved å overføre 0,1 ml av en nedfrosset glyserollagerkultur av den ønskede stamme til en 2-liters flaske med 500 ml Luria-brygg. Kulturen ble ristet ved 30 °C i 16 timer, hvoretter den ble overført til en 15-liters fermentor med 8 1 sterilt vertsmedium (Tsai et al. (1987), J. Industrial Microbiol., 2:181-187).
Vertsfermentering med "mating" starter med tilførsel av Feed nr. 1-medium (Tsai et al. (1987), supra). Da OD600 nådde 35, ble ekspresjon av den ønskede KGF-analog indusert ved hurtig å øke dyrkningstemperaturen til 37 °C i 2 timer og så til 42 °C for å denaturere Cl-repressoren. Tilførsel av Feed 1 ble stoppet til fordel for Feed 2 med en opprinnelig tilføringshastighet på 300 ml/time. Feed 2 inneholdt 175 g/l tryptikase-pepton, 87,5 g/l gjærekstrakt og 260 g/l glukose. Etter 1 time ved 42 °C ble dyrkningstemperaturen redusert til 36 °C, og denne temperatur ble beholdt i ytterligere 6 timer.
Fermenteringen ble så stoppet og cellene høstet ved sentrifugering i plastposer plassert i 1-liters sentrifugeflasker. Cellene ble nedsentrifugert ved 400 rpm i 60 minutter, hvoretter supernatantene ble fjernet og cellemassen nedfrosset ved - 90 °C.
Etter ekspresjon av de forskjellige KGF-analoger i E. coli ble nativ KGF-, C(1,15)S-, C(1,15)S/R(144)E-, C(1,15)S/R(144)Q-, AN15-, AN23- og AN23/R(144)Q-proteiner renset ved å benytte følgende fremgangsmåte. Cellemasse fra en fermentering til høy celletetthet ble suspendert ved 4 °C i 0,2 M NaCl, 20 mM NaP04, pH 7,5 som en 10-20% løsning (vekt/vol) ved å benytte en blandemaskin med høye skjærkrefter. De suspenderte celler ble så lysert ved å la løsningen passere gjennom en homogenisator (APV Gaulin, Inc., Everett, MA) tre ganger. Utrennende homogenat ble nedkjølt til 4-8 °C ved bruk av en egnet varmebytter. Cellerester ble så fjernet ved å sentrifugere lysatet i en "J-6B"-sentrifuge (Beckman Instruments, Inc., Brea, CA) utstyrt med en JS 4.2-rotor ved 4 200 rpm i 30-60 minutter ved 4 °C. Supernatantene ble så forsiktig avhelt og påsatt en tidligere fremstilt 450 ml (5 cm x 23 cm) kolonne med "S-Sepharose Fast Flow"-resin (Pharmacia, Piscataway, NJ) ekvilibrert med 0,2 M NaCl, 20 mM NaP04, pH 7,5, ved 4 °C. Deretter ble kolonnen vasket med fem kolonnevolumer (2 250 ml) 0,4 M NaCl, 20 mM NaP04, pH 7,5 ved 4 °C. Det ønskede protein ble eluert ved å vaske kolonnen med 5 10,5 M NaCl, 20 mM NaP04, pH 7,5. Fraksjoner på 50 ml ble oppsamlet, og A280 av eluatet ble fulgt kontinuerlig. Fraksjoner som inneholdt eluert materiale ifølge A2go, ble så analysert ved SDS-PAGE i 14% geler for å bekrefte nærvær av det ønskede polypeptid.
Fraksjonene som inneholdt interessante proteiner, ble så slått sammen og tilsatt et likt volum destillert vann. Den fortynnede prøve ble så påsatt en allerede fremstilt 450 ml (5 cm x 23 cm) kolonne med "S-Sepharose Fast Flow" ekvilibrert med 0,4 M NaCl, 20 mM NaP04, pH 6,8, ved 4 °C. Kolonnen ble vasket med 2 250 ml 0,4 M NaCl, 20 mM NaP04, pH 6,8, og proteinet eluert med en lineær gradient på 20 kolonnevolumer fra 0,4 M NaCl, 20 mM NaP04, pH 6,8 til 0,6 M NaCl, 20 mM NaP04, pH 6,8. Igjen ble fraksjoner på 50 ml oppsamlet under kontinuerlig måling av A280 i eluatet. Fraksjonene som inneholdt proteinet (bestemt ved 14% SDS-PAGE), ble så slått sammen og konsentrert gjennom en YM-10-membran (avkutting på molekylvekt 10 000) i en rørecelle på 350 ml (Amicon, Inc., Mayberry, MA) til et volum på 30-40 ml.
Konsentratet ble så påsatt en tidligere oppsatt 1 300 ml (4,4 cm x 85 cm) kolonne med "Superdex-75"-resin (Pharmacia) ekvilibrert med kolonnebuffer som består av IX PBS (Dulbeccos fosfatbufrede saltvann, "D-PBS", kalsium- og magnesiumfri) eller 0,15 M NaCl, 20 mM NaP04, pH 7,0. Etter at prøven var gått inn i søylen, ble proteinet eluert fra gelfiltreringsmatriksen med kolonnebuffer. Deretter ble fraksjoner på 10 ml oppsamlet, og de som inneholdt analogen (bestemt ved 14% SDS-PAGE), ble slått sammen. Proteinkonsentrasjonen var typisk tilnærmet 5-10 mg/ml i den resulterende løsning. Alle fremgangsmåtene ovenfor ble utført ved 4-8 °C dersom ikke annet er angitt.
En alternativ fremgangsmåte for rensing ble benyttet til rensing av nativ KGF, C(1,15)S og AN23. Fremgangsmåten omfatter følgende trinn, og dersom ikke annet er angitt, ble alle fremgangsmåter, løsninger og materialer utført ved 23 ± 5 °C.
Etter avslutning av produksjonsfasen i en bakteriefermentering ble cellekulturen avkjølt til 4-8 °C og cellene høstet ved sentrifugering eller en tilsvarende prosess. Basert på det forventede utbytte av protein pr. enhetsvekt av cellemasse og den ønskede mengde renset protein, ble en passende mengde cellemasse suspendert i en mild bufferløsning av 20 mM NaP04, 0,2 M NaCl, pH 7,5, som veide tilnærmet fem ganger så mye som cellemassen som skulle suspenderes. Cellene ble finfordelt til en homogen løsning ved å benytte en blander med høy skjærkraft. Temperaturen i cellemassedispersjonen ble opprettholdt ved 4-8 °C under homogeniseringen.
Cellene ble så lysert med trykk, f.eks. ved å la cellemassedispersjonen passere to ganger gjennom en cellehomogenisator av passende størrelse. Homogenatet ble holdt avkjølt ved 5 ± 3 °C. For å klare cellelysatet ble et tidligere forberedt dybdefilterhus (Cuno, Inc., Meriden, CT) utstyrt med et filter med en passende filteroverflate, ekvilibrert med et passende volum på 0,2 M NaCl, 20 mM NaP04, pH 7,5, benyttet. Ekvilibrering og klaring ble utført ved 5 ± 3 °C. Før klaringen ble en passende mengde av et egnet filterhjelpemateriale benyttet til å belegge filteret og å blandes med cellelysatet, hvoretter lysatet ble klaret ved å la løsningen passere gjennom filterapparatet. Filteret ble vasket med 0,2 M NaCl, 20 mM NaP04, pH 7,5. Filtratet og påfølgende vaskeløsning ble oppsamlet i en avkjølt beholder med egnet kapasitet og ble hele tiden holdt ved en temperatur lavere enn 10 °C.
Etter klaring ble lysatet påsatt en tidligere fremstilt kolonne med "SP-Sepharose Fast Flow" med minst 1 ml resin pr. 2 g cellemasse. Kolonnen med "SP-Sepharose Fast Flow" var ekvilibrert med kald (5 ± 3 °C), 0,2 M NaCl, 20 mM NaP04, pH 7,5. Kolonnetemperaturen ble holdt lavere enn 10 °C. Det klarede lysat (5 ± 3 °C) ble så påsatt ionebytterkolonnen mens absorbansen ved 280 nm (A28o) av eluatet ble fulgt kontinuerlig. Etter påsetting av prøven ble kolonnen vasket med kald 0,2 M NaCl, 20 mM NaP04, pH 7,5, fulgt av vask med 0,3 M NaCl, 20 mM NaP04, pH 7,5 ved 23 ± 5 °C.
For eluering av det ønskede protein ble en lineær gradient fra 0,2-1 M NaCl, 20 mM NaPC>4, pH 7,5, benyttet. Råproduktet ble oppsamlet i flere fraksjoner basert på A2g0 i eluatet. Etter eluering ble disse fraksjoner slått sammen og volumet notert.
For å oksidere frie sulfhydrylgrupper ble et oksida-sjonstrinn utført. For proteiner med endret cysteinmønster sammenlignet med nativ KGF, ble et oksidasjonsmiddel (f.eks. cystamin-dihydroklorid eller et annet egnet oksidasjonsmiddel, f.eks. cystin, oksidert glutation eller divalent kobber) tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1-20 mM, og pH ble justert til 7-9,5, hvor en pH på 9,0 ± 0,3 ble foretrukket dersom cystamindihydroklorid ble benyttet. Oksidasjonen ble utført ved 10-30 °C i et passende tidsrom. For det native KGF-protein ble oksidasjon oppnådd ved å tilsette en passende mengde (NH4)2S04 f.eks. 1-2 M (NH4)2S04, justere pH til 7,5 ± 0,5 og holde temperaturen ved 23 ± 5 °C i et passende tidsrom.
Etter oksidasjonen ble løsningens pH justert til mellom 6,5 og 9,5. Om nødvendig, ble fast (NH4)2S04 tilsatt løsningen til en sluttkonsentrasjon på 2 M. For fjerning av fast materiale ble løsningen passert gjennom egnede klaringsfiltere.
Det filtrerte, oksiderte produkt ble så renset ved hydrofob interaksjonskromatografi (HIC). HIC-matriksen var "Butyl-650M Toyopearl"-resin (Tosohaas, Inc., Montgomeryville, PA). Den proteinholdige løsning ble påsatt kolonnen som på forhånd var ekvilibrert med 2 M (NKOSO* 0,15 M NaCl, 20 mM NaP04, pH 7,0. Etter påsetting av prøven ble kolonnen vasket med 2 M (1^)2804,0,15 M NaCl, 20 mM NaP04, pH 7,0. Det ønskede protein ble så eluert med en nedadgående, lineær (NH4)2S04-gradient fra 2-0 M i 0,15 M NaCl, 20 mM NaP04, pH 7,0. Når det ønskede protein begynte å elueres, vist ved økt A28o i eluatet, ble fraksjoner oppsamlet. Uttak fra hver fraksjon ble så analysert ved SDS-PAGE. Fraksjoner som inneholdt det ønskede protein ble så slått sammen, blandet grundig, og volumet av de sammenslåtte fraksjoner bestemt, likeså konsentrasjonen av proteinet i løsningen.
Det sammenslåtte, proteinholdige HIC-eluat ble så konsentrert og elueringsbufferen utbyttet. Typisk ble proteiner konsentrert til 5,0-10,0 mg/ml. Ultrafiltrering ble utført med et ultrafiltreringssystem utstyrt med et "PTGC Pellicon"-kassettsystem (Millipore, Inc., Bedford, MA) med en membran med egnet avkuttings-størrelse.
Etter konsentrasjon ble prøven diafiltrert mot en passende buffer. Gjenværende materiale fra konsentrasjonstrinnet ble diafiltrert mot 0,15 M NaCl, 20 mM NaP04, pH 7,0, til ledningsevnen i løsningen lå innen 5% av ledningsevnen til løsningen med 0,15 M NaCl, 20 mM NaP04, pH 7,0.
For å fjerne utfelt materiale og bakterieendotoksin som kunne foreligge, ble den konsentrerte, diafiltrerte, proteinholdige prøve i tillegg passert gjennom et 0,1 fim "Posidyne"-filter (Pall, Inc., Cortland, NY). Etter bestemmelse av løsningens proteinkonsentrasjon, og basert på den ønskede konsentrasjon av det endelige produkt, ble løsningen fortynnet med 0,15 M NaCl, 20 mM natriumfosfat, pH 7,0, til den ønskede sluttkonsentrasjon. En endelig aseptisk filtrering gjennom et 0,22 fim filter ble så utført mens sluttproduktet ble overført til en pyrogenfri beholder for lagring (ved tilnærmet 5 °C) for videre utforming.
B. Analyse
Analyse ble utført med E. cø/7-avledet, nativ KGF; C(1,15)S; C(1,15)S/R(144)Q; AN15; AN23 og AN23/R(144)Q.
Konformasionsstabilitet
Polypeptidene ble sammenlignet med hensyn til lagringsstabilitet, transisjonstemperatur for termisk utfolding (Tm) og stabilitet innen et bredt pH-område.
Lagringsstabilitet
Figur 25 sammenligner nativ KGF og C(1,15)S ved lagring i 20 mM NaP04,0,15 M NaCl, pH 7,0 ved 37 °C i 27 timer. C(1,15)S viste signifikant økning i mengden løselig protein sammenlignet med nativ KGF. Figur 26 sammenligner stabiliteten av nativ KGF, AN 15 (data ikke vist) og C(1,15)S i PBS og i 50 mM NaP04,0,15 M NaCl, pH 7,0, ved lagring ved 37 °C i 18 timer. Gjenvinning av løselig protein er mye høyere ved høy fosfatkonsentrasjon enn i PBS. Både AN15 og C(1,15)S viste signifikant høyere stabilitet sammenlignet med nativ KGF. AN15 og C(1,15)S ga også tilnærmet 100% gjenvinning ved høy fosfatkonsentrasjon som forventet fra resultatet med nativ KGF.
Et enkelt, innledende, sammenlignende eksempel på lagringsstabilitet ble imidlertid utført mellom C(1,15,40)S og C(40)S (som kodes av basene 201 til 684 i SEKV.ID NR. 1, bortsett fra at Ser<40> kodes av AGA), og mellom C(l,15,102) og C(102)S (som kodes av basene 201 til 684 i SEKV.ID NR. 1, bortsett fra at Ser<102 >kodes av AGG). Resultatene (ikke vist) antydet redusert stabilitet (dvs. mindre løselig protein etter lagring ved 37 °C). Mengden løselig, korrekt foldet C(l,15,40)S-protein som ble renset fra dyrkningsmediet, var imidlertid større enn mengden av C(40)S, noe som tyder på at C(1,15,40)S faktisk kan være mer stabilt, og at resultatene fra det sammenlignende eksempel ikke er overbevisende. Foreliggende oppfinnelse innbefatter fortrinnsvis en KGF-analog med andre substitusjoner enn dem ved Cys<40>, Cys102, Cys<106> og utelukker mer foretrukket C(1,15,40)S, C(1,15,102)S og C(l,15,40,102,106).
Evnen til nativ KGF, C(1,15)S, AN23, C(1,15)S/R (144)E, C(1,15)S/R(144)Q og AN23/R(144)Q når det gjelder å hindre aggregering ved forhøyede temperaturer, ble også undersøkt. Prøver som inneholdt 0,5 mg/ml protein, ble fremstilt i D-PBS. 0,5 ml av hver prøve ble overført til glassampuller på 3 ml av type 1. Ampullene ble forseglet med gummikorker, og 13 mm aluminiumssegl ble krympet på. Disse ampuller ble så plassert i en inkubator ved 37 °C. Med på forhånd bestemte mellomrom ble ampuller tatt ut og analysert for tap av løselig protein. Synlige utfellinger ble fjernet ved å sentrifugere 250 fil av hver prøve gjennom en 0,22 Hm "Spin-X"-filtreringsenhet (Costar, Cambridge, MA). Løselig protein i de filtrerte løsninger ble deretter analysert ved størrelseseksklusjons-HPLC. Mengden løselig protein ble bestemt ved å integrere HPLC-topparealet og fremstille resultatet som en funksjon av inkubasjonstid ved 37 °C. Resultatene for nativ KGF, C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)E og C(1,15)S/R(144)Q (data for AN23 og AN23/R(144Q) er ikke vist) er vist i figur 27.
Halveringstiden for tap av løselig, monomert protein ble så beregnet fra disse kinetikkurver. Tabell 1 viser halveringstiden for gjenværende, løselig KGF ved lagring ved 37 °C for disse proteiner.
Som vist i tabell 1 ovenfor og i figur 27, aggregerte nativ KGF raskest med en løselighets-halveringstid på 0,6 dager. C(1,15)S/R(144)Q, AN23/R(144)Q og C(1,15)S/R(144)E viste vesentlige økninger i løselighets/halveringstid på hhv. 13,3, 22,3 og 38 dager.
Termisk utfalding
Termisk utfolding ble målt ved sirkulær dikroisme (CD) ved 230 nm med et "J-720"-spektropolarimeter (Jasco, Inc., Easton, MD) utstyrt med et PTC-343-temperaturkontrollsystem av Peltier-type. For CD-analyse ble prøver som inneholdt 0,1 mg/ml av polypeptidet som skulle analyseres, fremstilt i D-PBS (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY). For hver prøve ble tilnærmet 2,5 ml overført til en rektangulær "Suprasir-fluorescenskyvette (Hellma Cells, Inc., Jamaica, NY) av kvarts (Heraeus Quarzschmelze, GmbH, Hanau, Tyskland) med 10 mm lysvei. Kyvetten ble så plassert i temperaturkontrollsystemet av Peltier-type i spektro-polarimeteret. Termisk utfolding ble utført med en temperaturendring på 50 °C/time. Endringer i elliptisitet ble målt ved 230 nm som mål på utfolding. Tm for hver prøve ble beregnet ved å identifisere en temperatur hvor 50% av proteinmolekylene i løsningen var utfoldet (Biophysical Chemistry, Cantor og Schimmel (red.), W.H. Freeman and Co., San Francisco (1980). Beregnet Tm for hvert av de tre proteiner er angitt i tabell 2.
Som disse resultater viser, har C(1,15)S og AN 15 en Tm-verdi som er
1 °C høyere enn nativ KGF. AN23 har ytterligere en grads økning i Tm. Innføring av R144Q til C(1,15)S/R(144)Q eller AN23 gir imidlertid mer enn 6 °C økning i Tm og mer enn 7 °C sammenlignet med nativ KGF. Videre er C(l,l 5)S/R(144)E mer enn 9 °C høyere enn for nativ KGF.
m
Syrestabiliteten av C(1,15)S/R(144)Q og C(1,15)S/R(144)E ble også sammenlignet med den til nativ KGF ved å justere D-PBS til forskjellige pH-verdier ved tilsetning av konsentrert HC1 eller NaOH. Tilnærmet 2,35 ml D-PBS ved forskjellige pH-verdier ble blandet med 100 pil KGF-protein (2,45 mg/ml) i en kvartskyvette. Disse prøver ble termisk utfoldet ved en temperaturøkning på 50 <0>C/time og fulgt ved CD ved 230 nm. Figur 28 viser Tm som funksjon av pH for nativ KGF, C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)Q og C(1,15)S/R(144)E. I det analyserte pH-område har C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)Q og C(1,15)S/R(144)E alltid høyere Tm enn nativ KGF.
Biologisk aktivitet in vitro
Mitogen aktivitet in vitro av C(1,15)S, AN15, AN23, AN23/R(144)Q, C(1,15)S/R(144)Q og C(1,15)S/R(144)E ble også målt som funksjon av proteinkonsentrasjon, og konsentrasjoner som ga halv maksimal aktivitet ble beregnet ved å måle [<3>H]-tymidinopptak i Balb/MK-celler (ifølge fremgangsmåtene til Rubin et al.
(1989), supra). Generelt ble konsentrasjonen av hver av KGF-analogene relativt til en kjent standard med nativ KGF, bestemt ved å benytte en in vifrø-biologisk analyse.
Hver KGF-analog ble så fortynnet og analysert med hensyn til biologisk aktivitet med
en Balb/MK mitogen analyse. Prøvene ble først fortynnet i et bioanalysemedium som besto av 50% hjemmelaget Eagles MEM, 50% hjemmelaget F12, 5 /tg/ml transferrin, 5 ng/ml natriumselenitt, 0,0005% HSA og 0,005% "Tween 20". KGF-prøvene ble så overført til Falcon Primeria 96-brønners plater med utsådde Balb/MK-celler. Inkorporering av [<3>H]-tymidin under DNA-syntese ble målt og overført til tilsatt konsentrasjon av nativ KGF ved å sammenligne med en standardkurve for nativ KGF. Resultatene er vist i figurene 29 til 34. Som figurene viser, har de analyserte KGF-analoger ifølge figurene 28 til 33 en aktivitet som tilsvarer den til nativ KGF.
Eksempel 3
Produksjon i kulturer av pattedyrceller
Dette eksempel beskriver ekspresjon, isolering og karakterisering av to biologisk aktive, rekombinante KGF- (rKGF-) former produsert i et pattedyrekspre-sjonssystem.
Det humane KGF-gen ble isolert ved PCR-amplifisering av cDNA
fremstilt fra normale, humane fibroblastceller fra hud (Clonetec, Inc., San Diego, CA). Etter fremstilling av cDNA ved reverstranskriptase ble PCR benyttet til amplifisering
av KGF-genet. OLIGO nr. 25 og OLIGO nr. 26 ble benyttet til amplifisering av genet
ut fra cDNA, og OLIGO nr. 27 og OLIGO nr. 28 ble benyttet til innføring av Hindlll-og /ig/II-restriksjonsseter ved endene av fragmentet ved en ny PCR-amplifisering, som beskrevet i figur IA og IB.
OLIGO nr. 25 (SEKV.ID NR. 69): 5'-CAATCTACAATTCACAGA-3'
OLIGO nr. 26 (SEKV.IDNR. 70): 5-TTAAGTTATTGCCATAGG-3'
OLIGO nr. 27 (SEKV.ID NR. 71):
5'-AACAAAGCrTCTACAATTCACAGATAGGA-3r
OLIGO nr. 28 (SEKV.ID NR. 72):
5'-AACAAGATCTTAAGTTATTGCCATAGG-3'
Etter kloning og bekreftelse av DNA-sekvensen ble KGF-gen-DNA benyttet. Amplifisering ble oppnådd med OLIGO nr. 29 og OLIGO nr. 30.
OLIGO nr. 29 (SEKV.ID NR. 73):
5-CGGTCTAGACCACCATGCACAAATGGATACTGACATGG-3'
OLIGO nr. 30 (SEKV.ID NR. 74):
5^GCCGTCGACCTATTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3'
"Sense"-primeren, OLIGO nr. 29, inneholdt et Xbal- sete og en konsensus Kozak-translasjonssekvens (5-CCACC-3') oppstrøms for startkodonet, ATG. "Antisense"-primeren, OLIGO nr. 30, inneholdt et Safl-kloningssete og et ekstra stoppkodon. Etter 18 sykluser med PCR-amplifisering (30 sekunder denaturering ved 94 °C, 40 sekunder hybridisering av primere ved 55 °C og 40 sekunder primerforlengelse ved 72 °C) ble produktet kuttet med Xbal og Sali og ligert til pDSRc£-DNA kuttet på tilsvarende vis (ifølge fremgangsmåtene til Bourdrel et al. (1993), Protein Exp. & Purif., 4:130-140 og Lu et al. (1992), Arch. Biochem. Biophys., 298:150-158). Dette ga plasmid KGF/pDSRo2 som plasserte det humane KGF-gen mellom den tidlige promoter fra SV40 og polyadenyleringssekvensene fra o>FSH. To kloner ble plukket, og DNA-sekvensanalyse bekreftet konstruksjon av den ønskede vektor. 2 fig KGF/pDSRc2-DNA ble så linearisert med Pvul. "Chinese hamster ovary" (CHO)-celler, utsådd dagen før med 0,8 x IO<6> celler/60 mm dyrkningsskål, ble så transfektert med det behandlede DNA ved en gjengs kalsiumfosfatpresipiterings-fremgangsmåte (Bourdrel et al., supra). To uker senere ble enkeltkolonier plukket og overført til 24-brønners plater. Det kondisjonerte medium ble betraktet som serumfritt når cellene nådde konfluens, og aliquoter av dette ble analysert ved Western-blotting med et polyklonalt antiserum fra kanin som reagerte med human KGF uttrykt i E. coli.
Western-blots ble utført ved å fraksjonere prøvene ved elektroforese i 12,5% (vekt/volum) SDS-rx)lyakrylamidgeler, fulgt av elektroblotting i 1 time ved 400 mA til nitrocellulosemembraner med et apparat for halvtørr overføring (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA). 20 mM Tris, 150 mM glysin, 20% metanol fungerte som overføringsbuffer. Nitrocellulosearkene ble blokkert ved inkubering med 10% normalt geiteserum i PBS. Antiserum fra kanin rettet mot E. coli-avledet KGF, ble benyttet som primærantistoff. For bruk ble det fortynnet 1/10 000 i 1% normalt geiteserum i PBS og inkubert med de blokkerte nitrocellulosearkene i 12 timer ved romtemperatur, hvoretter overskudd av antistoff ble fjernet ved tre gangers vask i 30 minutter i PBS. Nitrocellulosemembranene ble så inkubert med 100 ml 1% normalt geiteserum i PBS tilsatt "Vectastain" biotinylert anti-kanin-IgG fra geit (sekundærantistoff, Vector Labs, Burlingame, CA) i 30 minutter ved romtemperatur. Etter tre gangers vask i 10 minutter i PBS ble en inkubasjon ved romtemperatur i 30 minutter utført i 100 ml løsning av 1% normalt geiteserum tilsatt streptavidin og biotinylert peroksidase, fremstilt ifølge produsentens retningslinjer (Vector Labs). Etter tre gangers vask i PBS ble materiale som kryssreagerte med KGF, visualisert ved inkubering i en blanding av 60 /il 30% (vekt/volum) H202 i 100 ml PBS og 50 mg 4-klornaftol i 20 ml metanol. Reaksjonen ble stoppet ved å vaske med vann etter 10 minutter.
Analyse av blottene viste at det KGF-spesifikke antistoff reagerte med tre distinkte proteinbånd, hvorav to var nært beslektet med molekylvekter på tilnærmet 25-29 kDa og ett hadde en beregnet molekylvekt på tilnærmet 17 kDa, sammenlignet med den forventede molekylvekt på tilnærmet 18,8 for det modne protein på 163 aminosyrer. I tillegg ble flere kloner med høy ekspresjon som utskilte mer enn 2,0 mg rKGF pr. liter, anslått ved Western-analyse, utvalgt og ekspandert i rulleflasker (ifølge fremgangsmåten til Lu et al., supra) for fremstilling av store volumer serumfritt, kondisjonert medium for rensing av KGF ved kationbytterkromatografi og gelfiltrering, som beskrevet nedenfor.
KGF fra 3 1 serumfritt, kondisjonert medium ble renset ved å sette mediet direkte på en kationbytterkolonne (5 x 24 cm) pakket med 450 ml "S-Sepharose Fast Flow" (Pharmacia) preekvilibrert med 20 mM natriumfosfat, pH 7,5. Etter vask med 5 kolonnevolumer 20 mM natriumfosfat, 0,2 M NaCl, pH 7,5, ble rKGF eluert ved å benytte en lineær gradient på 20 kolonnevolumer fra 0,2 til 1,0 M NaCl i 20 mM natriumfosfat, pH 7,5. Fraksjoner på 50 ml ble oppsamlet under kontinuerlig måling av A280. KGF-protein ble påvist ved å analysere uttak fra hver fraksjon ved SDS-PAGE. SDS-PAGE ble utført i et elektroforesesystem (Novex, San Diego, CA) med ferdigstøpte 14% Tris-glysingeler (ifølge fremgangsmåten til Laemmli (1970), Nature 227:680-685). Prøvene ble blandet med ikke-reduserende SDS-prøvebuffer uten oppvarming før påsetting på gelen. Proteinene ble påvist enten ved farging med Coomassie-blått eller ved sølvfarging. To topper som eluerte sent, viste seg å inneholde proteinbånd som tilsvarte båndene på 25-29 kDa og 17 kDa som var påvist ved Western-blotting. Fraksjonene som inneholdt disse topper, ble konsentrert hver for seg til et volum på mindre enn 1,0 ml og fraksjonert ved gelfiltrering.
Til gelfiltreringen ble det benyttet kolonner med "Superdex-75"-resin (HR 10/30, Pharmacia) preekvilibrert med PBS, pH 7,2, og kalibrert med følgende standarder med kjent molekylvekt (BioRad, San Francisco, CA): tyroglobulin (670 kDa), g-globulin (158 kDa), ovalbumin (44 kDa), myoglobin (17 kDa) og vitamin B-12 (1,4 kDa). Disse rensingstrinn førte til tilnærmet 2 000 gangers rensing av rKGF omfattende materiale på 17 kDa og 30 kDa beregnet ved sølvfarging.
For materialet med den høyeste molekylvekt eluerte rKGF som en symmetrisk hovedtopp (vist ved A280) som ble betegnet KGF-a. Ved SDS-PAGE-analyse av en mindre mengde av dette stoff, 3 /ig/brønn sammenlignet med 6 /ig/brønn, ble to bånd med molekylvektsforskjell på 1-2 kDa fraksjonert. For materialet med den laveste molekylvekt, betegnet KGF-b, førte gelfiltrering til et proteinpreparat med den forventede mobilitet. For både KGF-a og KGF-b var totalutbyttet etter rensing tilnærmet 30-40%.
Aminosyresekvensene for KGF-a og KGF-b ble også analysert. Disse analyser ble utført i et automatisk sekvenseringsinstrument (modell 477A eller 470A, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) utstyrt med en modell 120A direktekoblet PTH-aminosyreanalysator og et modell 900A dataoppsamlingssystem (ifølge fremgangsmåten til Lu et al. (1991), J. Biol. Chem., 255:8102-8107). Edman-sekvensanalyse av KGF-a viste en N-terminal hovedsekvens bestående av X|-N-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-N-V-X2-X2-S- [SEKV.ID NR. 75]. En mindre komponent hvor sekvensen startet fra den tredje N-terminale aminosyre, asparaginsyre, forelå også som 1,6% av den totale mengde sekvenserbart protein. X], X2 og X3 kunne ikke bestemmes grunnet fravær av fenyltiohydantoinyl (PHT)-aminosyresignaler under sekvensanalysen. En N-terminal aminosyresekvens for KGF utledet fra cDNA-sekvensen, viser at Xi og X3 er Cys-rester, og X2 er asparagin. Fravær av Xi og X3 antyder at disse cysteiner kan danne disulfidbroer. Basert på konsensussekvensen for N-koblet glykosylering, Asn-X-Ser, viser fravær av den forventede Asn-rest tilsvarende X2, at dette er et mulig sete for N-koblet glykosylering.
Interessant nok viste N-terminal sekvensanalyse av KGF-b en N-terminal aminosyresekvens bestående av S-Y-D-Y-M-E-G-G-D-I-R-V- (SEKV.ID NR. 76), noe som viser at dette er en N-terminalt forkortet form av KGF som er proteolytisk kløyvet ved Arg^-Ser^-peptidbindingen.
For videre karakterisering av renset KGF-a og KGF-b ble proteinet behandlet med glykosidaser (neuraminidase, O-glykanase og/eller N-glykanase) ved kjente teknikker (Sasaki et al. (1987), J. Biol. Chem., 252:12059-12076; Takeuchi et al. (1988), J. Biol. Chem., 255:3657-3663; Zsebo et al. (1990), Cell, 55:195-201). Disse resultater viser at KGF-a inneholder N- og O-koblede karbohydrater selv om KGF-a-formen med den laveste molekylvekt trolig kun inneholder N-koblet sukker. Glykosidasebehandling førte ikke til molekylvektsreduksjon for KGF-b, noe som tyder på at molekylet ikke er glykosylert.
Glykosyleringsmønsteret for KGF-a ble videre karakterisert ved massespektroskopi av peptidene dannet med endoproteinase Glu-C beskrevet ovenfor. Utledning av karbohydratstruktur for glykopeptider ved massespektrometrisk analyse ved "stepped orifice"-metoden har med hell blitt benyttet på andre proteiner (Huddleston et al. (1993), Anal. Chem., 55:877-884; Carr et al. (1993), Prot. Sei., 2:183-196). Som bekreftet ved isolering av et ikke-glykosylert peptid, synes Thr<22> å være delvis glykosylert. Lignende massespektrometrisk analyse av Asn<14> antyder mikroheterogenitet med hensyn til glykosylering, med bi-, tri- og tetra-antenne-strukturer med varierende sialyleirngsgrad.
Tabell 3A oppsummerer KGF-konsentrasjonen som stimulerer [<3>H]-tymidininkorporering i keratinocytter til halv maksimal hastighet (ifølge fremgangsmåten til Rubin et al. (1989), supra). Interaksjon med KGF-reseptoren ble undersøkt ved å benytte isolerte KGF-reseptor-membranpreparater fremstilt fra epidermkeratino-cytter fra Balb/MK-mus (ved fremgangsmåten beskrevet av Massague (1983), J. Biol. Chem., 255:13614-13620). Nærmere bestemt ble forskjellige KGF-former fortynnet med 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, tilsatt 0,2% bovint serumalbumin, slik at konsentrasjonen lå i området fra 0,8 ng til 100 ng pr. 50 /il. Løsningene ble inkubert med membranpreparatet (75 ng/ml) og I-merket, E. co/i-avledet KGF (1,5 ng). Eksperimenter med reseptorbinding og konkurranse ble utført ved 4 °C i 16 timer, hvoretter prøvene ble sentrifugert og vasket to ganger med fortynningsbufferen beskrevet ovenfor, for å fjerne ubundet og uspesifikt bundet, merket KGF. Gjenværende radioaktivitet i prøvene ble så målt. Konkurransekurver for reseptorbinding mellom KGF-prøver og merket KGF ble oppsatt ved grafisk fremstilling av prosent utkonkurrering mot konsentrasjon for hver KGF-prøve. Tabell 3B oppsummerer KGF-konsentrasjonen som trengtes for å oppnå 60% utkonkurrering av merket E. coli-avledet KGF, uttrykt som ng/ml.
Som vist i tabell 3A, stimulerer KGF-a og KGF-b [<3>H]-tymidinin-korporering i tilsvarende grad, med halv maksimal hastighet av tilnærmet 30 ng/ml av hver analog. Forkortelsen fører således ikke til redusert biologisk aktivitet i molekylet. Imidlertid har de to analoger tilnærmet tre ganger lavere aktivitet enn E. cø//-avledet KGF av full lengde. Som vist i tabell 3B, antyder konkurranseeksperimenter med reseptorbinding av radioaktivt merket ligand at E. co/i-avledet KGF, KGF-a og KGF-b har tilsvarende reseptorbindingsaktivitet.
Eksempel 4
Biologisk analyse in vivo av KGF- polypeptider fremstilt i E . coli og i kultur av pattedyrceller
En enkelt, subkutan dose av KGF er vist å føre til en doseavhengig økning i serumkolesterol hos mus i løpet av 24 timer. Nativ KGF, KGF-a, C(1,15)S, ANIS og AN23 ble også analysert med hensyn til evne til å øke serumkolesterolnivået
på doseavhengig måte.
Hver behandlingsgruppe inneholdt fem Balb/c-hunnmus (18-20 g) erholdt fra CRL. Proteinet ble fortynnet med 0,9% saltvann til et endelig injeksjonsvolum på 100 /d/mus. Hver mus ble tilført en enkelt, subkutan injeksjon med følgende doser:
24 timer etter injeksjon ble musene avlivet og blodet tappet ved
hjertepunktur. Blodprøvene ble prosessert for bestemmelse av serumkolesterol.
Som vist i figur 35, førte hver av de analyserte KGF-analoger til forhøyet serumkolesterol på en doseavhengig måte. Videre var det ingen åpenbar forskjell i bioaktivitet mellom de analyserte KGF-analoger.
In vEvo- modell for diabetes
Kjemisk induserte diabetes mellitus-modeller i forskjellige dyrearter benyttes klassisk for undersøkelse av sykdommen og behandling av den. Streptozotocin induserer diabetes hos mus, rotte, hamster, hund og ape, selv om undersøkelser hos rotte og mus er mest vanlig benyttet. Junod et al., Proe. Soc. Exp. Pio. Med. 725:210-205 (1967); Rerup, Pharm. Rev. 22:485-518 (1970); Rossini et al., P.N.A.S. 74:2485-2489 (1977) og Ar"Rajab og Ahren, Pancreas 5:50-57 (1993). Hos rotter induserer streptozotocindoser fra 45 til 70 mg/kg som en enkelt intravenøs dose stabil sykdom. Doser lavere enn 45 mg/kg induserer en forbigående sykdomstilstand som er reversibel. I løpet av én dag etter streptozotocininjeksjon induseres den hyperglykemiske tilstand. Insulinnivået i blod forblir i det vesentlige uendret sammenlignet med normale rotter, men imidlertid reduseres totalinnholdet av insulin og C-peptid i bukspyttkjertelen drastisk. Rotter viser de klassiske tegn og symptomer på diabetes hos mennesker: økt nivå av blodglukose (hyperglykemi), glukose i urin (glukosuri), forhøyet tørst (polydipsi), økt urinering (polyuri), forhøyet appetitt (hype-rfagi).
Undersøkelsene beskrevet i foreliggende søknad, ble utført med den streptozotocinduserte diabetesmodell i Sprague-Dawley-rotter. Hannrotter på 200 til 260 g ved undersøkelsens start ble benyttet. Diabetes ble indusert ved en enkelt intra-venøs streptozotocininjeksjon med 50 mg streptozotocin i natriumsitratbuffer pr. kg kroppsvekt. Ikke-diabetiske kontrollrotter fikk en enkelt intravenøs injeksjon av natriumsitratbuffer som kontroll. KGF ble tilført daglig som en subkutan injeksjon. KGF-dosen var 3 eller 5 mg/kg/dag avhengig av eksperimentet. I det første eksperiment ble KGF-terapi innledet to dager før diabetes, ble indusert og fortsatte etter diabetesinduksjon med i alt 8 injeksjoner. I det andre og tredje eksperiment ble KGF-terapi tilført subkutant, innledet én dag etter induksjon av diabetes med streptozotocin. I det fjerde eksperiment ble et 7-dagers forløp med KGF-terapi innledet 7 dager etter streptozotocinbehandling, og dyrene ble så fulgt i ytterligere 12 uker. I alle eksperimenter unntatt det fjerde ble nivåer av glukose i blod og urin og urinvolum benyttet som analysepunkter. I tillegg ble vanninntak, nivå av C-peptid i urin eller totalirmhold av insulin og C-peptid i bukspyttkjertel målt i noen eksperimenter. I det fjerde eksperiment ble kun blodglukose målt. Da en stor fraksjon av insulinet fjernes fra sirkulasjonen av leveren, vil måling av perifere insulin-konsentrasjoner reflektere posthepatisk metabolisme snarere enn insulinsekresjon fra bukspyttkjertelen. Derfor måles ofte C-peptid og benyttes som perifer markør for insulinsekresjon. C-peptid produseres ved prosessering av proinsulin til insulin. Insulin og C-peptid utskilles fra beta-cellene i ekvimolare mengder, og kun en liten mengde C-peptid ekstraheres av leveren.
Disse eksperimenter undersøkte virkningen av rKGF på streptozotocin-indusert diabetes i Sprague-Dawley-rotter. På dag 0 ble rottegruppene behandlet med enten 45 eller 50 mg/kg streptozotocin (STZ). Etter behandling ble ikke-fastende blod-glukosenivåer målt daglig for å anslå graden av skade i Langerhansøyer. På dag 5 ble STZ-behandlede dyr plassert i én av to grupper (20/gruppe) avhengig av graden av hyperglykemi. Delepunktet ble satt ved et blodglukosenivå på 300 mg/dl. En gruppe med ikke-STZ-behandlede dyr fungerte som kontroll. På dag 7 ble 10 dyr fra hver hyperglykemiske gruppe gitt AN23 (3 mg/kg/dag) eller PBS ved subkutan injeksjon i 7 dager. Blodglukosenivået ble så målt daglig, annenhver dag eller ukentlig, og er gitt i figur 50. Bemerk at STZ-behandlede dyr fra begge grupper som ble gitt AN23, hadde signifikante reduksjoner i blodglukose i løpet av AN23-doseirngsperioden. Det er viktig å merke seg at gjennomsnittlig reduksjon i blodglukose hos de STZ-behandlede dyr fra gruppen med <300 mg/dl blodglukose stabiliserte seg ved tilnærmet 150 mg/dl, mens reduksjonen i blodglukose hos gruppen med >300 mg/dl blodglukose kun var forbigående. Bemerk at tidsskalaen er ikke-lineær.
Claims (39)
1. Polypeptidanalog til nativ keratinocytvekstfaktor kalt "KGF",
karakterisert ved at nativ KGF tilsvarer følgende sekvens:
med eller uten en signalsekvens, hvori analogen omfatter aminosyresekvensen til KGF,
omfattende en delesjon, substitusjon og/eller insersjon av én eller flere av aminosyrene 1-24, hvorved cysteinresten i aminosyreposisjon 1 og cysteinresten i aminosyreposisjon 15 er seg enten deletert eller substituert med en annen aminosyre, eventuelt som videre har en N-terminal metioninrest og/eller videre omfatter en ladningsendringssubstitusjon i en aminosyreposisjon utvalgt fra Arg (41), Glu (43), Lys (55), Lys (95), Asn (137), Gin (138), Lys (139), Arg (144), Lys (147), Gin (152), Lys (153), eller Thr (154) eller med hensyn til A23-KGF har en ladningsendringsmodifikasjon i His (116) eller i tilfelle av nativ KGF med både Cys (l)og Cys (15) substituert med Ser, eventuelt også med Cys (40) eller Cys (102) eller både Cys (102) og Cys (106) substituert med Ser med det forbehold at analogen ikke er keratinocyttvekstfaktorproteinet omfattende aminosyrene 24-163.
2. Analog ifølge krav 1,
karakterisert ved at cysteinresten i aminosyreposisjon 1 og cysteinresten i aminosyreposisjon 15 er fjernet.
3. Analog ifølge krav 1,
karakterisert ved at aminosyrene 1-24 er fjernet.
4. Analog ifølge krav 1,
karakterisert ved at cysteinresten i aminosyreposisjon 1 er fjernet og at cysteinresten i aminosyreposisjon 15 er substituert med en annen aminosyre.
5. Analog ifølge krav 1,
karakterisert ved at minst én aminosyre blant aminosyrene 1-24 er fjernet og cysteinresten i aminosyreposisjon 15 er substituert med en annen aminosyre.
6. Analog ifølge krav 1,
karakterisert ved at cysteinresten i aminosyreposisjon 1 og cysteinresten i aminosyreposisjon 15 er substituert med en annen aminosyre.
7. Analog ifølge ethvert av kravene 4 til 6,
karakterisert ved at aminosyreresten utvalgt fra alanin, leucin eller serin er substituert med en cysteinrest.
8. Analog ifølge krav 7,
karakterisert ved at en serinrest er substituert med en cysteinrest.
9. Analog ifølge ethvert av kravene 1 til 8,
karakterisert ved at den omfatter en ladningsendringssubstitusjon i en aminosyreposisjon utvalgt fra argininresten i aminosyreposisjon 41, glutaminresten i aminosyreposisjon 43, lysinresten i aminosyreposisjon 55, lysinresten i aminosyreposisjon 95, asparaginresten i aminosyreposisjon 137, glutaminresten i aminosyreposisjon 138, lysinresten i aminosyreposisjon 139, argininresten i aminosyreposisjon 144, lysinresten i aminosyreposisjon 147, glutaminresten i aminosyreposisjon 152, lysinresten i aminosyreposisjon 153 eller treoninresten i aminosyreposisjon 154.
10. Analog ifølge ethvert av kravene 1 til 9,
karakterisert ved at den omfatter en ladningsendringsmodifikasjon i histidinresten i aminosyreposisjon 116.
11. Analog ifølge krav 10,
karakterisert ved at histidinresten er byttet ut med en glysinrest.
12. Analog ifølge ethvert av kravene 9 til 11,
karakterisert ved at aminosyrene 1-24 er fjernet.
13. Analog ifølge krav 1,
karakterisert ved at analogen er C(1,15)S; C(1,15,40)S; C(1,15,102)S; C(1,15,102,106)S; AN15; AN16; AN17; AN18; AN19; AN20; AN21; AN22; AN24; AN3/C(15)S; AN3/C(15)-; AN8/C(15)S; AN8/C(15)- og AN23/H(116)G, som tilsvarer aminosyrene 23-163, der histidinresten i aminosyreposisjon 116 er substituert med en glycin.
14. Analog ifølge krav 13,
karakterisert ved at nevnte analog er AN16.
15. Analog ifølge ethvert av kravene 1 til 14,
karakterisert ved at analogen har en signalsekvens eller en aminoterminal-metionirest.
16. Analog ifølge krav 15,
karakterisert ved at signalsekvensen er aminosyrene 1-31 i fig. 1.
17. Analog ifølge ethvert av kravene 1-6,
karakterisert ved at analogen er kovalent bundet til polyetylenglykol eller beslektede, vannoppløselige, organiske polymerer.
18. Analog ifølge krav 17,
karakterisert ved at analogen er bundet til polyetylenglykol.
19. Analog ifølge krav 1,
karakterisert ved at analogen er er AN23 kovalent bundet til polyetylenglykol eller beslektede, vannoppløselige, organiske polymerer.
20. Analog ifølge krav 19,
karakterisert ved at analogen er bundet til polyetylenglykol.
21. Analog ifølge ethvert av kravene 1 til 20,
karakterisert ved at analogen er lyofllisert.
22. Farmasøytisk formulering,
karakterisert ved at den omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en analog av KGF ifølge ethvert av kravene 1 til 21 og en farmasøytisk akseptabel bærer.
23. Rekombinant nukleinsyremolekyl,
karakterisert ved at den koder for en analog ifølge ethvert av kravene 1 til 16.
24. Biologisk funksjonell vektor,
karakterisert ved at den omfatter et nukleinsyremolekyl ifølge krav 23.
25. Prokaryot eller eukaryot vertscelle,
karakterisert ved at den inneholder et nukleinsyremolekyl ifølge krav 23 eller en biologisk, funksjonell vektor ifølge krav 24.
26. Prokaryot vertscelle ifølge krav 25,
karakterisert ved at den er E. coli.
27. Eukaryot vertscelle ifølge krav 25,
karakterisert ved at den er en pattedyrcelle, fortrinnsvis en ovariecelle fra kinesisk hamster.
28. Fremgangsmåte for fremstilling av en analog av KGF,
karakterisert ved at den omfatter dyrkning under egnede næringsbetingelser av en vertscelle ifølge ethvert av kravene 25-27 på en måte som tillater ekspresjon av analogen kodet av denne og isolering av analogen fremstilt på denne måte.
29. Anvendelse av en effektiv mengde av analogen av KGF ifølge ethvert av kravene 1 til 21 for fremstilling av et medikament for stimulering av produksjon av ikke-fibroblastepitelceller.
30. Anvendelse ifølge krav 29,
karakterisert ved at ikke-fibroblastepitelcellene er utvalgt fra adnexale strukturer, leverceller, mukosal epitel i luftrøret og fordøyelseskanalen, korneale celler eller tympaniske epitelceller.
31. Anvendelse av en effektiv mengde av analogen til KGF ifølge ethvert av kravene 1 til 21 for fremstilling av et medikament for stimulering av produksjon av ikke-fibroblastepitelceller hos en pasient for forebyggelse eller behandling av en tilstand, hvori tilstanden er utvalgt fra brannskader og andre skader i deler av, eller hele, epitelet, epidermolysis bullosa, kjemoterapiindusert alopesi, skallethet hos menn, progressivt tap av hår hos menn og kvinner, magesår og sår i tolvfingertarmen, inflammatoriske tarmsykdommer som Crohns sykdom og ulcerøs kollitt, tarmtoksisitet ved stråle- og kjemoterapibehandlingsregimer, hyalinmembransykdom, akutt eller kronisk lungeskade, hepatisk cirrhose, fulminant leversvikt, akutt viral hepatitt, toksiske skader på leveren, korneal abrasjon, "progressive gum disease" eller trommehinneskade.
32. In viYro-fremgangsmåte for stimulering av produksjon av ikke-fibroblastepitelceller,
karakterisert ved at den omfatter administrering av en effektiv mengde av en analog av KGF, ifølge ethvert av kravene 1 til 21, eller et farmasøytisk preparat ifølge krav 22.
33. Anvendelse ifølge krav 29,
karakterisert ved at ikke-fibroblastepitelcellene stimuleres hos en pasient med behov for dette.
34. Fremgangsmåte ifølge krav 32,
karakterisert ved at ikke-fibroblastepitelcellene er utvalgt fra adnexale strukturer, leverceller, slimhinneepitel i luftveiene og mage-tarmsystemet, korneale celler eller tympaniske epitelceller.
35. Anvendelse av en effektiv mengde av AN23 for fremstilling av et medikament for stimulering av produksjon av ikke-fibroblastepitelceller hos en pasient med behov for dette, hvori ikke-fibroblastepitelcellene er utvalgt fra adnexale strukturer, leverceller, slimhinneepitel i luftveiene eller tympaniske epitelceller.
36. In vi/rø-fremgangsmåte for stimulering av produksjon av ikke-fibroblastepitelceller,
karakterisert ved at den omfatter administrering av en effektiv mengde av AN23 eller et farmasøytisk preparat derav, hvori ikke-fibroblastepitelcellene er utvalgt fra adneksale strukturer, lever celler, slimhinneepitel i luftveiene eller tympaniske epitelceller.
37. Anvendelse av en effektiv mengde av AN23 for fremstilling av et medikament for stimulering av produksjon av ikke-fibroblastepitelceller hos en pasient for forebyggelse eller behandling av en tilstand, hvori tilstanden er utvalgt fra brannskader og andre skader i deler av, eller hele epitelet, epidermolysis bullosa, kjemoterapiindusert alopesi, skallethet hos menn, progressivt tap av hår hos menn og kvinner, magesår og sår på tolvfingertarmen, inflammatoriske tarmsykdommer som Chrohns sykdom og ulcerøs kolitt, tarmtoksisitet ved stråle- og kjemoterapibehandlingsregimer, hyalin membran-sykdom, akutt eller kronisk lungeskade, hepatisk cirrhose, fulminant leversvikt, akutt, viral hepatitt, toksiske skader på leveren, "progressive gum disease" eller trommehinneskade.
38. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 29,30,31,33,35 og 37, hvori analogen av KGF administreres via IV-, IT-, IM-, SC- eller IP-administrasjonsveier.
39. Sett,
karakterisert ved at det omfatter en analog av KGF ifølge ethvert av kravene 1 til 21, eller en farmasøytisk formulering ifølge krav 22.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US32334094A | 1994-10-13 | 1994-10-13 | |
US32347594A | 1994-10-13 | 1994-10-13 | |
US48782595A | 1995-06-07 | 1995-06-07 | |
PCT/IB1995/000971 WO1996011949A2 (en) | 1994-10-13 | 1995-10-12 | Analogs of keratinocyte growth factor |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO971568D0 NO971568D0 (no) | 1997-04-04 |
NO971568L NO971568L (no) | 1997-06-12 |
NO318761B1 true NO318761B1 (no) | 2005-05-02 |
Family
ID=27406268
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO971566A NO971566L (no) | 1994-10-13 | 1997-04-04 | Fremgangsmåte for behandling av diabetes mellitus ved anvendelse av KGF |
NO19971568A NO318761B1 (no) | 1994-10-13 | 1997-04-04 | Polypeptidanalog til nativ keratinocyttvekstfaktor kalt "KGF", farmasoytisk formulering, rekombinant nukleinsyremolekyl, biologisk funksjonell vektor, prokaryot eller eukaryot vertscelle, fremgangsmate for fremstilling av en analog av KGF, anvendelse av en effektiv mengde av analogen av KGF i folge oppfinnelsen, eller deltaN23 for fremstilling av et medikament for stimulering av produksjon av ikke-fibroblastepitelceller, in vitro fremgangsmate for stimulering av produksjon av ikke-fibroblastepitelceller samt sett. |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO971566A NO971566L (no) | 1994-10-13 | 1997-04-04 | Fremgangsmåte for behandling av diabetes mellitus ved anvendelse av KGF |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP0804479B1 (no) |
JP (2) | JP4216329B2 (no) |
KR (1) | KR100278597B1 (no) |
CN (1) | CN1168678A (no) |
AT (2) | ATE342278T1 (no) |
AU (1) | AU3707795A (no) |
BG (2) | BG101392A (no) |
BR (2) | BR9509269A (no) |
CA (2) | CA2201940C (no) |
CZ (3) | CZ98197A3 (no) |
DE (2) | DE69535264T2 (no) |
DK (2) | DK0804479T3 (no) |
EE (2) | EE9700225A (no) |
ES (2) | ES2196082T3 (no) |
FI (2) | FI971420A0 (no) |
HU (2) | HU226168B1 (no) |
NO (2) | NO971566L (no) |
NZ (2) | NZ505502A (no) |
PL (2) | PL182888B1 (no) |
PT (2) | PT804479E (no) |
SI (2) | SI0804479T1 (no) |
SK (2) | SK284534B6 (no) |
WO (2) | WO1996011949A2 (no) |
Families Citing this family (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69033668T2 (de) | 1989-01-31 | 2001-04-12 | Jeffrey S Rubin | Dns kodierend für einen für epithelzellen spezifischen wachstumsfaktor |
DE69434053T2 (de) | 1993-06-29 | 2006-02-23 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Verkürzter keratinocytenwachstumsfaktor(kgf)mit erhöhter biologischer aktivität |
US7084119B2 (en) | 1993-06-29 | 2006-08-01 | Chiron Corporation | Truncated keratinocyte growth factor (KGF) having increased biological activity |
CN1161380C (zh) * | 1994-10-13 | 2004-08-11 | 安姆根有限公司 | 角化细胞生长因子的纯化方法 |
US6077692A (en) | 1995-02-14 | 2000-06-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 |
US6693077B1 (en) | 1995-02-14 | 2004-02-17 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 |
US7232667B2 (en) | 1995-02-14 | 2007-06-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 polynucleotides |
EP0822943B9 (en) * | 1995-04-27 | 2007-02-28 | Coöperatie Cosun U.A. | Inulin derivatives |
US6743422B1 (en) | 1996-10-15 | 2004-06-01 | Amgen, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 products |
EP0935652B1 (en) * | 1996-10-15 | 2004-03-31 | Amgen Inc. | Keratinocyte growth factor-2 products |
SI0935652T1 (en) * | 1996-10-15 | 2004-06-30 | Amgen Inc. | Keratinocyte growth factor-2 products |
US7153943B2 (en) | 1997-07-14 | 2006-12-26 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof |
US7495087B2 (en) | 1997-07-14 | 2009-02-24 | Bolder Biotechnology, Inc. | Cysteine muteins in the C-D loop of human interleukin-11 |
US20080076706A1 (en) | 1997-07-14 | 2008-03-27 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of Growth Hormone and Related Proteins, and Methods of Use Thereof |
DE69838552T2 (de) | 1997-07-14 | 2008-05-21 | Bolder Biotechnology, Inc., Louisville | Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine |
US6869927B1 (en) | 1997-12-22 | 2005-03-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 formulations |
CA2316015A1 (en) | 1997-12-22 | 1999-07-01 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 formulations |
US6242666B1 (en) | 1998-12-16 | 2001-06-05 | The Scripps Research Institute | Animal model for identifying a common stem/progenitor to liver cells and pancreatic cells |
ATE526401T1 (de) * | 1999-01-14 | 2011-10-15 | Bolder Biotechnology Inc | Verfahren zur herstellung von proteinen mit freien cysteinresten |
US8288126B2 (en) | 1999-01-14 | 2012-10-16 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
US6248725B1 (en) | 1999-02-23 | 2001-06-19 | Amgen, Inc. | Combinations and methods for promoting in vivo liver cell proliferation and enhancing in vivo liver-directed gene transduction |
WO2002062842A1 (en) * | 2001-02-06 | 2002-08-15 | Merck Patent Gmbh | Modified keratinocyte growth factor (kgf) with reduced immunogenicity |
MXPA04001526A (es) | 2001-08-21 | 2004-05-31 | Chiron Corp | Composiciones de polipetidos kgf. |
AU2007214362B2 (en) * | 2001-08-21 | 2009-11-26 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | KGF polypeptide compositions |
SI1827483T1 (sl) | 2004-12-15 | 2014-11-28 | Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) | Terapevtske formulacije keratinocitnega rastnega faktorja |
CN102242124B (zh) * | 2010-05-10 | 2013-05-22 | 齐鲁制药有限公司 | 改造的角化细胞生长因子基因及其在酵母中的表达 |
KR102440312B1 (ko) * | 2020-08-28 | 2022-09-05 | 한국해양과학기술원 | 온도안정성을 향상시킨 fgf7 폴리펩타이드 및 그 용도 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4959314A (en) * | 1984-11-09 | 1990-09-25 | Cetus Corporation | Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins |
JPH01137994A (ja) * | 1987-08-10 | 1989-05-30 | Shionogi & Co Ltd | reg蛋白質 |
WO1990000877A1 (en) * | 1988-07-27 | 1990-02-08 | Marjan International Pty Ltd | Carpet stretcher |
DE69033668T2 (de) * | 1989-01-31 | 2001-04-12 | Jeffrey S Rubin | Dns kodierend für einen für epithelzellen spezifischen wachstumsfaktor |
JP3303211B2 (ja) * | 1991-04-26 | 2002-07-15 | 武田薬品工業株式会社 | bFGFムテインおよびその製造法 |
CN1064710C (zh) * | 1993-03-26 | 2001-04-18 | 安姆根有限公司 | 角质细胞生长因子的治疗应用 |
US5348563A (en) * | 1993-06-29 | 1994-09-20 | Honeywell Inc. | Air purifying apparatus |
DE69434053T2 (de) * | 1993-06-29 | 2006-02-23 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Verkürzter keratinocytenwachstumsfaktor(kgf)mit erhöhter biologischer aktivität |
GB9315501D0 (en) * | 1993-07-27 | 1993-09-08 | Ici Plc | Surfactant compositions |
WO1995003831A1 (en) * | 1993-08-02 | 1995-02-09 | Prizm Pharmaceuticals, Inc. | Monogenous preparations of cytotoxic conjugates |
-
1995
- 1995-10-12 SI SI9530728T patent/SI0804479T1/sl unknown
- 1995-10-12 DK DK95934808T patent/DK0804479T3/da active
- 1995-10-12 PT PT95934808T patent/PT804479E/pt unknown
- 1995-10-12 SK SK455-97A patent/SK284534B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1995-10-12 JP JP51307796A patent/JP4216329B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-10-12 WO PCT/IB1995/000971 patent/WO1996011949A2/en active IP Right Grant
- 1995-10-12 AT AT95934808T patent/ATE342278T1/de active
- 1995-10-12 BR BR9509269A patent/BR9509269A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-10-12 CN CN95196410A patent/CN1168678A/zh active Pending
- 1995-10-12 BR BR9509329A patent/BR9509329A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-10-12 WO PCT/IB1995/000992 patent/WO1996011950A1/en active IP Right Grant
- 1995-10-12 HU HU9901255A patent/HU226168B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-10-12 SK SK431-97A patent/SK43197A3/sk unknown
- 1995-10-12 DE DE69535264T patent/DE69535264T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 AT AT95934793T patent/ATE237633T1/de active
- 1995-10-12 ES ES95934793T patent/ES2196082T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 NZ NZ505502A patent/NZ505502A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-10-12 DK DK95934793T patent/DK0785948T3/da active
- 1995-10-12 HU HU9901071A patent/HUT78050A/hu unknown
- 1995-10-12 SI SI9530654T patent/SI0785948T1/xx unknown
- 1995-10-12 EP EP95934808A patent/EP0804479B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 EP EP95934793A patent/EP0785948B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 EE EE9700225A patent/EE9700225A/xx unknown
- 1995-10-12 KR KR1019970702343A patent/KR100278597B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-10-12 CA CA002201940A patent/CA2201940C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-10-12 CZ CZ97981A patent/CZ98197A3/cs unknown
- 1995-10-12 EE EE9700081A patent/EE03975B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-10-12 AU AU37077/95A patent/AU3707795A/en not_active Abandoned
- 1995-10-12 CZ CZ0105097A patent/CZ297328B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-10-12 JP JP51307696A patent/JP4426646B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-10-12 PL PL95319784A patent/PL182888B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-10-12 ES ES95934808T patent/ES2273338T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 CA CA002202075A patent/CA2202075C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-10-12 PL PL95320484A patent/PL320484A1/xx unknown
- 1995-10-12 DE DE69530403T patent/DE69530403T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 PT PT95934793T patent/PT785948E/pt unknown
- 1995-10-12 CZ CZ20023953A patent/CZ297329B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-04-04 NO NO971566A patent/NO971566L/no unknown
- 1997-04-04 FI FI971420A patent/FI971420A0/fi unknown
- 1997-04-04 NO NO19971568A patent/NO318761B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-04-07 BG BG101392A patent/BG101392A/xx unknown
- 1997-04-11 BG BG101408A patent/BG63167B1/bg unknown
- 1997-04-11 FI FI971536A patent/FI120040B/fi not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-04-09 NZ NZ335109A patent/NZ335109A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO318761B1 (no) | Polypeptidanalog til nativ keratinocyttvekstfaktor kalt "KGF", farmasoytisk formulering, rekombinant nukleinsyremolekyl, biologisk funksjonell vektor, prokaryot eller eukaryot vertscelle, fremgangsmate for fremstilling av en analog av KGF, anvendelse av en effektiv mengde av analogen av KGF i folge oppfinnelsen, eller deltaN23 for fremstilling av et medikament for stimulering av produksjon av ikke-fibroblastepitelceller, in vitro fremgangsmate for stimulering av produksjon av ikke-fibroblastepitelceller samt sett. | |
EP2859014B1 (en) | Fibroblast growth factor 21 variants | |
US20070265200A1 (en) | Glycol Linked Fgf-21 Compounds | |
JP2007020575A (ja) | ケラチノサイト増殖因子アナログ | |
WO1993003757A1 (en) | Muteins of epidermal growth factor exhibiting enhanced binding at low ph | |
EP1334981B1 (en) | Method for purifying keratinocyte growth factors | |
CA2201944C (en) | Analogs of keratinocyte growth factor having enhanced temperature stability | |
AU2003234066A1 (en) | Muteins of placental growth factor type 1, preparation method and application thereof | |
AU745815B2 (en) | Analogs of keratinocyte growth factor, nucleic acids encoding such analogs, processes of making and methods of using | |
RU2198180C2 (ru) | Аналог природного фактора роста кератиноцитов (варианты), фармацевтическая композиция, рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая аналог, экспрессионный вектор, штамм e.coli, трансформированный вектором, способ получения аналога и способ стимулирования образования нефибробластных эпителиальных клеток | |
AU5068502A (en) | Analogs of keratinocyte growth factor | |
AU709362C (en) | Method for purifying keratinocyte growth factors | |
PL184188B1 (pl) | Sposób stymulacji produkcji niefibroblastowych komórek nabłonkowych | |
MXPA97002475A (en) | Analogues of the fibroblast acid growth factor that have stability and biological acticity improves |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |