CZ297329B6

CZ297329B6 - Analog nativního keratinocytového rustového faktoru kovalentne pripojený k polyethylenglykolu nebo príbuznému vodorozpustnému organickému polymeru, jeho pouzití a in vitro zpusob stimulace produkce nefibroblastových epithelových bunek

Info

Publication number: CZ297329B6
Application number: CZ20023953A
Authority: CZ
Inventors: F. Morris@Charles; C. Kenney@William; Chen@Bao-lu; W. Hsu@Eric
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 2006-11-15
Also published as: ATE237633T1; SI0804479T1; NO971568D0; NO971566D0; PT804479E; BG63167B1; FI971420A; DE69535264D1; EP0804479A1; PL319784A1; FI120040B; EE9700225A; BG101408A; CN1168678A; ES2196082T3; HU226168B1; DK0785948T3; FI971536A; EP0785948A1; BR9509329A

Abstract

Analog nativního keratinocytového rustového faktoru KGF, odpovídající aminokyselinám 32 az 194 SEQ ID NO: 2, poprípade spolu se signální sekvencí, kterým je deltaN23, odpovídající SEQ ID NO: 58, v kterézto sekvenci je pocátecní methioninový zbytek povazován za zbytek v poloze "0" a jedná se o zbytek fakultativní, pricemz tento analog je kovalentnepripojen k polyethylenglykolu nebo príbuznému vodorozpustnému organickému polymeru. Pouzití tohoto analogu pro výrobu léciva pro stimulaci produkce nefibroblastových epithelových bunek u pacienta, který to potrebuje, pricemz tyto bunky jsou zvoleny z adnexálních struktur, jaterních bunek, mukosálního epithelu respiracního traktu nebo tympánových epithelových bunek nebo pro stimulaci produkce takových bunek u pacienta za úcelem prevence nebo lécení stavu zvoleného ze souboru sestávajícího z popálenin a jiných poranení v cásti nebo celé tloustcetkáne, epidermolysis bullosa, alopecie indukovanéchemoterapií, plesatosti muzského typu, progresivní ztráty vlasu u muzu a zen, zaludecních a dvanáctníkových vredu, zánetlivých chorob strev, jako jeCrohnova choroba a vredová kolitida, toxicity spojené s radiacním a chemoterapeutickým osetrením, choroby hyalinní membrány, akutního a chronického poskození plic, cirhózy jater; prudkého selhání jater, akutní virové hepatitidy, toxických napadení jater, abraze rohovky, progresivní choroby dásní a poskození usního bubínku. Zpusob in vitro stimulace produkce techto bunek podáním tohoto analogu.

Description

Analog nativního keratinocytového růstového faktoru kovalentně připojený k polyethylenglykolu nebo příbuznému vodorozpustnému organickému polymeru, jeho použití a in vitro způsob stimulace produkce nefibroblastových epithelových buněk

Oblast techniky

Vynález se týká analogu nativního keratinocytového růstového faktoru, KGF, kovalentně připojeného k polyethylenglykolu nebo příbuznému vodorozpustnému organickému polymeru, jeho použití a in vitro způsobu stimulace produkce nefibroblastových epithelových buněk.

Komplexní proces vytváření a regenerace pletiv je zprostředkován řadou proteinových faktorů, které jsou někdy označované jako faktory růstu měkkých pletiv. Tyto molekuly jsou obecně uvolňovány jedním typem buněk a ovlivňují proliferaci jiných typů buněk. (Rubin et a. (1989), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86:802-806). Některé růstové faktory měkkých pletiv jsou vylučovány specifickými typy buněk a ovlivňují proliferaci, diferenciaci a/nebo zrání cílových buněk při vývoji vícebuněčných organizmů. (Finch et al. (1989), Science, 245: 752-755). Navíc kromě jejich úlohy ve vyvíjejících se organismech jsou některé důležité pro udržení zdravého stavu vyzrálejších systémů. Například u savců je mnoho systémů, kde dochází k rychlé obměně buněk. Takovéto systémy zahrnují kůži a gastrointestinální trakt, které jsou oba tvořeny epiteliálními buňkami.

Do této skupiny růstových faktorů měkkých pletiv patří také rodina fíbroblastových růstových faktorů (FGF).

V současné době je známo osm členů rodiny FGF (fibroblast growth factors), které vykazují příbuznost v primární struktuře: základní fibroblastový růstový faktor (basic fibroblast growth factor), bFGF (Abraham et al., (1986), EMBO J., 5:2523-2528); kyselý fibroblastový růstový faktor (acidic fibroblast growth factor), aFGF (Jaye et al. (1986), Science, 233-541-545); produkt int-2 genu, int-2 (Dickson & Peters (1987), Nátuře, 326:833); hst/kFGF (Delli-Bovi etal. (1987), Cell, 50:729-737 a Yoshida et al. (1987), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84:7305-7309); FGF-5 (Zhan et al. (1988), Mol. Cell. Biol., 8:3487-3495), FGF-6 (Marics et al. (1989), Oncogene, 4:335-340); keratinocytový růstový faktor (keratinocyte growth factor) (Finch et al. (1989) Science, 24:752-755) a hisactophilin (Habazzettl et al. (1992), Nátuře, 359:855-858).

V rodině FGF proteinů je keratinocytový růstový faktor („KGF“) specifickým efektorem proliferace nefibroblastových epiteliálních (zejména keratinocytových) buněk odvozených z mesenchymálních pletiv. Pojem „nativní KGF“ se vztahuje k přírodnímu lidskému (hKGF) nebo rekombinantnímu (rKGF) polypeptidů (se signální sekvencí nebo bez ní), jak je znázorněno sekvencí aminokyselin uvedených v SEQ ID NO:2 nebo v její alelické variantě. [Pokud není uvedeno jinak, číslování aminokyselin pro molekuly popsané v tomto dokumentu bude odpovídat prezentované konečné formě přirozené molekuly (tj. bez signální sekvence), jak je znázorněno aminokyselinami 32-194 SEQ ID NO:2.]

Přirozený KFG může být izolován z přirozených lidských zdrojů (hKGF) nebo produkován technikami rekombinantní DNA (rKGF) (Finch et al. (1989), viz předchozí text; Rubin et al. (1989), viz předchozí text; Ron et al. (1993), The Joumal of Biological Chemistry, 268 (4): 2984-2988 a Yan et al. (1991), In Vitro Cell. Dev. Biol., 27A: 437-438.

Je známé, že přirozený KGF je ve vodném stavu poměrně nestabilní a že podléhá chemické a fyzikální degradaci, mající za následek ztrátu biologické aktivity během zpracování a skladování (Chen et al. (1994), Pharmaceutical Research, 11: 1582-1589). Přirozený KGF je také při zvýšených teplotách náchylný k agregaci a v kyselém prostředí se inaktivuje (Rubin et al. (1989), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86: 802-806). Agregace nativního KGF ve vodných roztocích má za následek inaktivaci proteinu. To je nevýhodné, protože takováto ztráta aktivity činí skladování

-1 CZ 297329 B6 vodných přípravků proteinů nativního KGF po delší časové období nebo manipulaci s proteiny v průběhu dalšího období nepraktickým. Navíc tento fakt způsobuje problémy při přípravě farmaceutických přípravků, protože agregované proteiny působí jako imunogeny (Cleland et al. (1993),

Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 10: 307-377; Robbins et al. (1987), Diabetes, 36:

838-845 a Pinckard et al. (1967), Clin. Exp. Immunol., 2: 331-340).

Přirozený KGF obsahuje pět cysteinových zbytků - konkrétně se jedná o aminokyseliny 1, 15, 40, 102 a 106 (Finch et al. (1989), Science, 24: 752-755). Ačkoliv byl popsán obsah cysteinu v přirozeném KGF, nebyla dosud popsána role, kterou mají cysteinové zbytky na aktivitu (tzn. jejich nezbytnost pro biologickou aktivitu) a terciární strukturu (tzn. náchylnost k tvorbě nežádoucích disulfidových vazeb mezi molekulami nebo uvnitř molekul). Není proto žádný vzor, ze kterého by šlo odvodit, který cysteinový zbytek (jestli vůbec nějaký) je nezbytný, nebo jestli se účastní při tvorbě nežádoucích disulfidových vazeb, které způsobují náchylnost proteinu k nežádoucí agregaci a/nebo nestabilitě.

Pro vylepšení nebo změnu jedné nebo více charakteristik přirozeného KGF se může použít proteinové inženýrství. Pro modifikaci sekvence přirozeného KGF byla použita technologie rekombinantní DNA.

Ron et al. (1993), (J. Biol. Chem., 268(4): 2984-2988) popsali modifikované KGF polypeptidy bez 3, 8, 27, 38 nebo 49 aminokyseliny od N-konce. Peptidy postrádající 3, 8 nebo 27 residuum na N-konci byly plně aktivní, zatímco forma postrádající 27 residuum byla 10-20x méně mitogenní a formy bez aminokyselin 38 nebo 49 neměly mitogenní aktivitu. Stabilita modifikovaných polypeptidů nebyla diskutována nebo jinak popsána.

Publikovaná PCT přihláška WO 90/08771, viz předchozí text popisuje také tvorbu chimérického proteinu, kde zhruba prvních 40 aminokyselin z N-konce konečné formy přirozeného KGF bylo zkombinováno s částí C-konce aFGF (asi 140 aminokyselin). Bylo popsáno působení chiméry na keratinocyty jako u KGF, ale chiméra nebyla citlivá na heparin, což je charakteristická vlastnost aFGF, ale ne KGF. Stabilita chiméry nebyla diskutována nebo jinak popsána.

Literatura tedy nepopisuje modifikovanou KGF molekulu s významně zlepšenou stabilitou v porovnání s přirozenou molekulou KGF. Navíc literatura nepopisuje dostatečné údaje nebo důkazy, které by opravňovaly očekávání, že tvorba molekul KGF s těmito žádoucími vlastnostmi bude úspěšná.

Obecně účinky změny aminokyselin na biologickou aktivitu proteinu budou záviset na řadě faktorů, včetně třírozměrné struktury proteinu a tom, jestli se modifikace dotknou vazebné oblasti pro receptor primární sekvence proteinu. Protože ani třírozměrná struktura ani oblast pro vázání receptorů v primární struktuře přirozeného KGF nebyly publikovány, znalosti v této oblasti neumožňují zevšeobecnění účinku změn aminokyselin přirozeného KGF a dokonce ani vliv modifikace proteinu u lépe charakterizovaných proteinů.

Je známo, že polypeptidy mohou být dále modifikovány, aby obsahovaly přídavné chemické struktury, které nejsou obvyklou součástí proteinů. Modifikací tohoto typu se sleduje zlepšení takových vlastností, jako je rozpustnost, absorpce, biologický poločas rozpadu a podobné vlastnosti proteinu. Struktury mohou případně eliminovat nebo zeslabit jakékoliv nežádoucí vedlejší účinky proteinu. Struktury schopné zprostředkovat takovéto účinky jsou uvedené například v REMINGTONE PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Do molekuly mohou být včleněny kovalentní modifikace reakcí cílového aminokyselinového zbytku peptidu s organickým pozměňovacím činidlem, které je schopné reakce s vybraným postranním řetězcem nebo terminálním zbytkem (T. E. Creghton (1983), PROTEINS: STRUCTURE AND MOLECULE PROPERTIES, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86). Polyethylenglykol („PEG“) je jednou takovou chemickou strukturou, které bylo použito při přípravě terapeutických proteinových produktů. U některých produktů bylo ukázáno, že při-2CZ 297329 B6 pojení polyethylenglykolu je chrání před proteolýzou (Sada et al. (1991), J. Fermentation Bioengineering, 71:137-139); metody pro připojení určitých polyethylenglykolových struktur jsou k dispozici. Viz US Patent 4 179 337, Davis et al., „Non-Imunogenic Polypeptides,“ vydaný 18. prosince 1979 a US Patent 4 002 531, Royer, „Modifying enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Theraby,“ vydaný 11. ledna 1977. Přehled obsahuje práce Abuchowski et al., v Enzymes as Drugs. (Holcerberg and Roberts, (eds.) pp. 367-383 (1981)). Pro připojení molekuly PEG k proteinu byla použita řada metod. Obecně jsou molekuly polyethylenglykolu připojené k proteinu přes reaktivní skupinu nacházející se na proteinu. Vhodné aminoskupiny pro takovéto připojení jsou například na lysinových zbytcích nebo na N-konci. Například Royer (US Pat. 4 002 531, viz výše) použil pro připojení polyethylenglykolových molekul k enzymu redukující alkylaci. Podle EP 0 539 167, publikovaného 28. dubna 1993, Wright, „Peg Imidates and Protein Derivatives Thereof ‘ peptidy a organické sloučeniny s volnou aminoskupinou (či aminoskupinami) jsou modifikovány odvozeninou PEGu nebo příbuzného ve vodě rozpustného organického polymeru. K modifikaci řady lysinových zbytků v proteinech pro připojení PEG molekuly přes reaktivní aminoskupinu se vztahuje US Patent 4 904 584 Shaw, vydaný 27. února 1990.

Cílem tohoto vynálezu je poskytnout polypeptidové molekuly kódující taková analoga, která vykazují zvýšenou stabilitu (například při vystavení působení typickému pH, teplotním a/nebo skladovacím podmínkám) při srovnání s přirozeným KGF.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je analog nativního keratinocytového růstového faktoru KGF, odpovídající aminokyselinám 32 až 194 SEQ ID NO:2, popřípadě spolu se signální sekvencí, kterým je deltaN23, odpovídající SEQ ID NO:58, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v poloze 0 a jedná se o zbytek fakultativní, přičemž tento analog je kovalentně připojen k polyethylenglykolu nebo příbuznému vodorozpustnému organickému polymeru.

Kovalentní připojení výše uvedeného analogu nativního keratinocytového růstového faktoru KGF k polyethylenglykolu nebo příbuznému vodorozpustnému organickému polymeru je považováno za obligatomí znak aspektu vynálezu charakterizovaného v předchozím odstavci. Analogy, které polymerem modifikovány nejsou, nespadají do rozsahu ochrany vymezeného připojeným látkovým nárokem.

Předmětem vynálezu je dále také použití analogu kovalentně připojeného k polyethylenglykolu nebo příbuznému vodorozpustnému organickému polymeru, popsaného výše pro výrobu léčiva pro stimulaci produkce nefibroblastových epithelových buněk u pacienta, který to potřebuje, přičemž nefibroblastové buňky epithelu jsou zvoleny zadnexálních struktur, jatemích buněk, mukosálního epithelu respiračního traktu nebo tympánových epithelových buněk.

Dále je předmětem vynálezu také použití analogu kovalentně připojené k polyethylenglykolu nebo příbuznému vodorozpustnému organickému polymeru popsaného výše pro výrobu léčiva pro stimulaci produkce nefibroblastových epithelových buněk u pacienta za účelem prevence nebo léčení stavu zvoleného ze souboru sestávajícího z popálenin a jiných poranění v části nebo celé tloušťce tkáně, epidermolysis bullosa, alopecie indukované chemotherapií, plešatosti mužského typu, progresivní ztráty vlasů u mužů a žen, žaludečních a dvanáctníkových vředů, zánětlivých chorob střev, jako je Crohnova choroba a vředová kolitida, toxicity spojené s radiačním a chemoterapeutickým ošetřením, choroby hyalinní membrány, akutního a chronického poškození plic, cirrhosy jater; prudkého selhání jater, akutní virové hepatitidy, toxických napadení jater, abraze rohovky, progresivní choroby dásní a poškození ušního bubínku.

Konečně je předmětem vynálezu také in vitro způsob stimulace produkce nefibroblastových epithelových buněk, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje podání účinného množství analogu kovalentně připojeného k polyethylenglykolu nebo příbuznému vodorozpustnému

-3 CZ 297329 B6 organickému polymeru, popsaného výše, nebo farmaceutického prostředku na jeho bázi, přičemž nefibroblastové buňky epithelu jsou zvoleny z adnexálních struktur, jatemích buněk, mukosálního epithelu respiračního traktu nebo tympánových epithelových buněk.

Odpovídající pozice aminokyseliny mezi dvěma sekvencemi aminokyselin může být určena přiřazením dvou sekvencí tak, aby se maximalizovala shoda residuí, včetně posunu amino a/nebo karboxy konce, zavedení potřebných mezer a/nebo odstranění residuí přítomných ve formě insertů u možných kandidátů. Vyhledávání v databázích, analýza sekvence a manipulace se může provést s použitím některého dobře známého algoritmu - programu běžně používaného pro prohledávání na homologie/totožnost v sekvenci, (například Pearson a Lipman (1988), Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444-2448; Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol., 215-403^110; Lipman and Pearson (1985), Science, 222:1435 nebo Deveraux et al. (1984), Nuc. Acids. Res., 12:387-395).

Stringentní podmínky (týkající se hybridizace) se dosáhnou kombinací koncentrace solí, teploty, organických rozpouštědel a ostatních parametrů běžně kontrolovaných v hybridizačních reakcích. Vzorové hybridizační podmínky představuje hybridizace v 4x SSC při 62 až 67 °C, následovaná promýváním v 0,lx SSC při 62 až 67 °C po dobu zhruba jedné hodiny. Jiné vzorové hybridizační podmínky představuje hybridizace v 45 až 55% formamidu, 4x SSC při 40 až 45 °C. [viz T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A laboratory manual); Cold Spring Harbor Laboratory (1982), stránky 387-389],

Proteiny zahrnují variace alel, nebo deleci (delece), substituci (substituce) nebo inzerci (inzerce) aminokyselin, včetně fragmentů, chimérických nebo hybridních molekul přirozeného KGF. Jeden příklad KGF zahrnuje proteiny se změněným nábojem, kde je jeden nebo více aminokyselinových zbytků na pozicích 141-154 nativního KGF (nejlépe residua Arg⁴¹, Gin⁴³, Lys⁵⁵, Lys⁹⁵, Lys¹²⁸, Asn¹³⁷, Gin¹³⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gin¹⁵², Lys¹⁵³ nebo Thr¹⁵⁴) odstraněn nebo vyměněn neutrálním nebo negativně nabitým zbytkem s cílem ovlivnit protein redukováním pozitivního náboje (jak je uvedeno v běžně přístupném U.S.S.N. 08/323, 337, zařazeným 13. října 1994). Příkladem je například R(144)Q, což je KGF mající nahrazený glutamin za arginin na aminokyselinové pozici 144 přirozeného KGF. Jiný příklad KGF představuje proteiny vytvořené substituováním alespoň jedné aminokyseliny s velkým potenciálem tvořit smyčku, nebo alespoň jedné aminokyseliny uvnitř oblasti tvořící smyčku (Asn¹¹⁵ - His¹¹⁶ - Tyr¹¹⁷ - Asn¹¹⁸ - Thr¹¹⁹) u nativního KGF (jak je uvedeno v běžně přístupném U.S.S.N. 08/323, 473, zařazeným 13. října 1994). Konkrétně je to např. H(116)G, KGF s glycinem nahrazeným histidinem na aminokyselinové pozici 116 přirozeného KGF. Další příklad zahrnuje proteiny mající jednu nebo více aminokyselin uvnitř oblasti 123-133 (aminokyseliny 154-164 SEQ ID NO:2) nativního KGF nahrazenou, odstraněnou nebo přidanou; tyto proteiny můžou mít agonistickou nebo antagonistickou aktivitu.

Překvapující bylo zjištění, že když má molekula KGF (tj. rodičovská molekula) cysteinový zbytek odpovídající (jak bylo určeno s použitím technik popsaných výše) Cys¹ a Cys¹⁵přirozeného KGF (cysteinové zbytky 32 a 46 SEQ ID NO:2) modifikován nahrazením odpovídajícího cysteinu, má výsledný analog KGF ve srovnání s rodičovskou molekulou zlepšenou stabilitu. Vynález je navíc přednostně zaměřen na ta analoga, která kromě zlepšené stability vykazují plnou biologickou aktivitu (tj. minimálně značně podobnou vazbu na receptor nebo afinitu k němu) při porovnání s přirozeným KGF.

Dalším aspektem vynálezu je popis purifikovaných a izolovaných molekul nukleových kyselin, kódujících různá biologicky aktivní peptidová analoga KGF. V jednom případě takovéto nukleové kyseliny zahrnují DNA molekuly klonované do biologicky funkčních plasmidů nebo virových vektorů. V jiném případě mohou být konstrukty nukleových kyselin použity pro stabilní transformaci prokaryontních nebo eukaryontních hostitelských buněk. V dalším případě vynález popisuje proces, kde buď prokaryotická (nejlépe E. coli) nebo eukaryotická hostitelská buňka, stabilně transformovaná molekulou nukleové kyseliny, vyrůstá za vhodných nutričních podmínek

-4CZ 297329 B6 způsobem umožňujícím expresi analoga KGF. Po expresi může následovat izolace a purifikace rekombinantního polypeptidu.

Další aspekt vynálezu se zabývá farmaceutickými formami, které zahrnují terapeuticky účinná množství analoga KGF a přijatelného farmaceutického nosiče. Takovéto formy budou užitečné při léčení pacientů postižených epiteliálním onemocněním nebo poškozením.

V tomto duchu se další aspekt vztahuje k metodám stimulace růstu epiteliálních buněk podáváním terapeuticky účinných dávek analoga KGF pacientům. V jednom praktickém případě jsou to nefibroblastové epiteliální buňky, které jsou stimulovány. Takovéto epiteliální buňky zahrnují různé sousední buňky, pankreatické buňky, jatemí buňky a mukózový epitel v respiračním a gastrointestinálním traktu.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje nukleotidové (SEQ ID NO:1) a aminokyselinové (SEQ ID NO:2) sekvence nativního KGF (nukleotidy kódující konečnou formu nativního KGF jsou popsány bázemi 201 až 684 SEQ ID NO:1 a konečná forma KGF je určená aminokyselinovými zbytky 32 až 194 SEQ ID NO:2).

Obrázky 2A, 2B a 2C ukazují mapy plasmidů pCFMl 156, pCFM1656 a pCFM3102.

Obrázek 3 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:3) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:4) sekvenci konstruktu obsaženého v konstruktu RSH-KGF.

Obrázek 4 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:5) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:6) sekvenci konstruktu obsaženého v plasmidů KGF.

Obrázek 5 ukazuje chemicky syntetizované OLIGA (OLIGO č. 6 až OLIGO č. 11; SEQ ID NO: 12-17) použité k náhradě DNA sekvence mezi místy KpnI a EcoRI v konstruktu plasmidů KGF (pozice aminokyselin 46 až 85 v SEQ ID NO:6), aby se vytvořil konstrukt v plasmidů KGF (dsd).

Obrázek 6 ukazuje chemicky syntetizované OLIGA (OLIGO č. 12 až 24; SEQ ID NO: 18-30) použité pro tvorbu KGF (optimalizovaný kodon).

Obrázek 7 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:31) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:32) sekvenci C(1,15)S, analogu KGF se substitucí šeřinu místo cysteinu v pozici aminokyselin 1 až 15 nativního KGF.

Obrázek 8 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:33) a aminokyselinovou (SEQIDNO:34) sekvenci AN3/C(15)S, analogu KGF s delecí prvních třech aminokyselin na N-konci a náhradou šeřinu za cystein na aminokyselinové pozici 15 přirozeného KGF.

Obrázek 9 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:35) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:36) sekvenci AN3/C(15)-, analogu KGF s delecí prvních třech aminokyselin na N-konci a delecí cysteinu na aminokyselinové pozici 15 přirozeného KGF.

Obrázek 10 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:37) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:38) sekvenci AN8/C(15)S, analogu KGF s delecí prvních osmi aminokyselin na N-konci a náhradou šeřinu za cystein na aminokyselinové pozici 15 přirozeného KGF.

-5CZ 297329 B6

Obrázek 11 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:39) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:40) sekvenci AN8/C(15)-, analogu KGF s delecí prvních osmi aminokyselin na N-konci a delecí cysteinu na aminokyselinové pozici 15 přirozeného KGF.

Obrázek 12 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:41) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:42) sekvenci ΔΝ15, analogu KGF s delecí prvních patnácti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 13 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:43) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:44) sekvenci ΔΝ16, analogu KGF s delecí prvních šestnácti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 14 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:45) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:46) sekvenci ΔΝ17, analogu KGF s delecí prvních sedmnácti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 15 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:47) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:48) sekvenci ΔΝ18, analogu KGF s delecí prvních osmnácti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 16 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:49) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:50) sekvenci ΔΝ 19, analogu KGF s delecí prvních devatenácti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 17 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:51) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:52) sekvenci ΔΝ20, analogu KGF s delecí prvních dvaceti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 18 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:53) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:54) sekvenci ΔΝ21, analogu KGF s delecí prvních jednadvaceti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 19 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:55) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:56) sekvenci ΔΝ22, analogu KGF s delecí prvních dvaadvaceti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 20 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:57) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:58) sekvenci ΔΝ23, analogu KGF s delecí prvních třiadvaceti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 21 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:59) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:60) sekvenci ΔΝ24, analogu KGF s delecí prvních čtyřiadvaceti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 22 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:61) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:62) sekvenci C(1,15)S/R(144)E analogu KGF se substitucí šeřinu místo cysteinu v pozicích aminokyselin 1 a 15 a substituci glutamové kyseliny za arginin na aminokyselinové pozici 144 nativního KGF.

Obrázek 23 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:63) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:64) sekvenci C(1,15)S/R(144)Q, analogu KGF se substitucí šeřinu za cystein na pozicích 1 a 15 a substitucí glutaminu za arginin na aminokyselinové pozici 144 nativního KGF.

Obrázek 24 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:65) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:66) sekvenci AN23/R(144)Q, analogu KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a náhradou glutaminu za arginin na aminokyselinové pozici 144 nativního KGF.

-6CZ 297329 B6

Obrázek 25 ukazuje množství zbývajícího rozpustného proteinu, když byl přirozený KGF a

C(l,15) skladován v 20 mM fosforečnanu sodném, 0,15 M NaCl, pH 7,0 při 37 °C po dobu hodin.

Obrázek 26 ukazuje množství zbývajícího rozpustného proteinu, když byl přirozený KGF a C(l, 15)S skladován v 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,0 při 37 °C po dobu 27 hodin.

Obrázek 27 ukazuje množství zbývajícího rozpustného proteinu, když byl přirozený KGF, ΔΝ15 a C(1,15)S skladován v 50 mM NaPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,0 při 37 °C po dobu 27 hodin.

Obrázek 28 ukazuje množství rozpustného proteinu stanoveného pomocí HPLC (size exclusion) v závislosti na čase při 37 °C.

Obrázek 29 ukazuje předpokládanou denaturační teplotu (T_m) jako funkci pH pro přirozený KGF, C( 1,15)S/R( 144)Q a C( 1,15)S/R( 144)E.

Obrázek 30 ukazuje typický tvar průběh mitogenní aktivity C(1,15)S stanovené měřením inkorporace [³H]-thymidinu během syntézy DNA porovnáním se standardní křivkou pro přirozený KGF.

Obrázek 31 ukazuje typický průběh mitogenní aktivity ΔΝ15 stanovené měřením inkorporace [³H]-thymidinu během syntézy DNA porovnáním se standardní křivkou pro přirozený KHF.

Obrázek 32 ukazuje typický průběh mitogenní aktivity ΔΝ23 stanovené měřením inkorporace [³H]-thymidinu během syntézy DNA porovnáním se standardní křivkou pro přirozený KGF.

Obrázek 33 ukazuje typický průběh mitogenní aktivity AN23/R/(144)Q stanovené měřením inkorporace [³H]-thymidinu během syntézy DNA porovnáním se standardní křivkou pro přirozený KGF.

Obrázek 34 ukazuje typický průběh mitogenní aktivity C( 1,15)S/R( 144)Q stanovené měřením inkorporace [³H]-thymidinu během syntézy DNA porovnáním se standardní křivkou pro přirozený KGF.

Obrázek 35 ukazuje typický průběh mitogenní aktivity C( 1,15)S/R( 144)E stanovené měřením inkorporace [³H]-thymidinu během syntézy DNA porovnáním se standardní křivkou pro přirozený KGF.

Obrázek 36 ukazuje vliv C(1,15)S a ΔΝ 23 na chemické vlastnosti séra.

Obrázek 37 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:77) a aminokyselinovou (SEQ ID N:78) sekvenci C( 1,15,40)S, analoga KGF se substitucí šeřinu za cystein na pozicích aminokyselin 1,15 a 40 přirozeného KGF.

Obrázek 38 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:79) a aminokyselinovou (SEQIDN:80) sekvenci C(1,15,102)S, analoga KGF se substitucí šeřinu za cystein na pozicích aminokyselin 1,15 a 102 přirozeného KGF.

Obrázek 39 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:81) a aminokyselinovou (SEQIDN:82) sekvenci C(l, 15,102,106)S, analoga KGF se substitucí šeřinu za cystein na pozicích aminokyselin 1,

15, 102 a 106 přirozeného KGF.

-7CZ 297329 B6

Obrázek 40 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:83) a aminokyselinovou (SEQ ID N:84) sekvenci ΔΝ23/Ν(137)Ε, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí glutamové kyseliny za asparagin na aminokyselinové pozici 137 přirozeného KGF.

Obrázek 41 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:85) a aminokyselinovou (SEQIDN:86) sekvenci ΔΝ23/Κ(139)Ε, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí glutamové kyseliny za lysin na aminokyselinové pozici 139 přirozeného KGF.

Obrázek 42 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:87) a aminokyselinovou (SEQIDN:88) sekvenci AN23/K(139)Q, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí glutamové kyseliny za lysin na aminokyselinové pozici 139 přirozeného KGF.

Obrázek 43 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:89) a aminokyselinovou (SEQIDN:90) sekvenci AN23/R(144)A, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí alaninu za arginin na aminokyselinové pozici 144 přirozeného KGF.

Obrázek 44 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:91) a aminokyselinovou (SEQIDN:92) sekvenci AN23/R(144)E, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí glutamové kyseliny za arginin na aminokyselinové pozici 144 přirozeného KGF.

Obrázek 45 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:93) a aminokyselinovou (SEQIDN:94) sekvenci AN23/R(144)L, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí leucinu za arginin na aminokyselinové pozici 144 přirozeného KGF.

Obrázek 46 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:95) a aminokyselinovou (SEQ IDN:96) sekvenci AN23/R(144)E, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí glutamové kyseliny za lysin na aminokyselinové pozici 147 přirozeného KGF.

Obrázek 47 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:97) a aminokyselinovou (SEQIDN:98) sekvenci AN23/K(147)Q, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí glutaminu za lysin na aminokyselinové pozici 147 přirozeného KGF.

Obrázek 48 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:99) a aminokyselinovou (SEQ ID N: 100) sekvenci ΔΝ23/Κ(1534)Ε, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí glutamové kyseliny za lysin na aminokyselinové pozici 153 přirozeného KGF.

Obrázek 49 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO: 101) a aminokyselinovou (SEQ ID N:102) sekvenci AN23/K(153)Q, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí glutaminu za lysin na aminokyselinové pozici 153 přirozeného KGF.

Obrázek 50 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO: 103) a aminokyselinovou (SEQ ID N: 104) sekvenci AN23/Q(152)E/K(153)E, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí glutamové kyseliny za lysin na aminokyselinové pozici 153 přirozeného KGF.

Obrázek 51 ukazuje vliv ΔΝ23 na diabetes indukovaný streptozotocinem u Sprague-Dawley krys.

Detailní popis vynálezu

V souladu s tímto vynálezem jsou předkládaná nová analoga KGF. Zjistilo se, že čtyři z cysteinových residuí přirozeného KGF (Cys¹ a Cys¹⁵, Cys¹⁰² a Cys¹⁰⁶) se účastní tvorby dvou disulfidových vazeb. Cys⁴⁰ se neúčastní disulfidových vazeb uvnitř molekuly. Proto obsahuje KGF dvě malé disulfidové smyčky oddělené téměř 90 aminokyselinami. Tak je možné určit, který cystei

-8CZ 297329 B6 nový zbytek se účastní na disulfidových vazbách a který je volný pro tvorbu nežádoucích vazeb uvnitř molekuly. Tyto vazby způsobují vytvoření nežádoucí terciární struktury (tj. konformace, která snižuje aktivitu proteinu).

Překvapující bylo zjištění, že modifikace KGF deleci nebo substitucí aminokyselinových zbytků odpovídajících v KGF pozici 1 a 15 (pozice 32 a 46 SEQ ID NO:2) vede ke vzniku analogů KGF s podstatně zlepšenou stabilitou (tj. s menšími problémy způsobenými nesprávným prostorovým uspořádáním, tvorbou disulfidových útvarů a/nebo agregací proteinu). Například analoga KGF budou obecně purifikovány s větším výtěžkem rozpustného proteinu se správnou konfigurací. Navíc jakmile je materiál purifikován, bude odolnější vůči pH, teplotě atd. při porovnání se stabilitou rodičovské molekuly. I když není cílem zabývat se příliš teorií, předpokládá se, že Cys¹a Cys¹⁵ KGF kromě tvorby intramolekulámího disulfidového můstku, existují za určitých podmínek i ve formě volných cysteinů, které jsou schopné tvořit mezimolekulámí disulfidové vazby, vedoucí k nestabilitě proteinu a k tvorbě agregátů. Navíc bylo zjištěno, že delece disulfidové smyčky na N-konci není významná pro vázání receptorů nebo mitogenní aktivitu.

V tomto vynálezu výraz „analog KGF“ nebo „polypeptidový analog KGF“ označuje jakýkoliv popsaný přirozeně nebo uměle se vyskytující polypeptid lišící se strukturou od KGF díky modifikaci peptidové sekvence odpovídající 24 aminokyselinovému N-konci KGF (aminokyseliny 32 až 55 SEQ ID NO:2), kde Cys¹ a Cys¹⁵ v KGF (aminokyseliny 32 až 64 SEQIDNO:2) jsou vyměněny nebo odstraněny. Způsob, kterým jsou cysteiny odstraněny nebo změněny není důležitý a zahrnuje například polypeptidová analoga obsahující deleci a/nebo substituci jedné nebo více aminokyselin. Vynález tedy poskytuje rodinu nových proteinů keratinocytových růstových faktorů. Tato rodina zahrnuje několik skupin proteinů.

Jedna skupina analogů KGF zahrnuje molekuly, ve kterých je cystein na pozicích KGF 1 a 15 nahrazen aminokyselinami, včetně těch, které se v proteinu normálně nevyskytují. Strategie pro tvorbu substitučních analogů zahrnuje místně zaměřenou tvorbu mutací (Ho et al. (1989), Gene, 77:51-59; Innis et al. „PCR Protocols“, Academie Press, lne., San Diego, CA), [analoga KGF zahrnující náhradu aminokyseliny jsou uvedena podle zbytku nacházejícím se na té které pozici v hotovém proteinu (bez signální sekvence) uvedeném v SEQ ID NO:2, následovaném aminokyselinovou pozicí v závorkách a novou aminokyselinou. Například analog zahrnující náhradu cysteinu za serin na aminokyselinové pozici 15 KGF (pozice 46 SEQ ID NO:2) je uváděn jako „C(15)S“.] Cystein je přednostně změněn na neutrální aminokyselinu jako je například glycin, valin, alanin, leucin, izoleucin, tyrosin, fenylalanin, histidin, tryptofan, serin, threonin a methionin (přednostně serinem threoninem a alaninem pro jejich chemickou podobnost s cysteinem). Příklad 1 podrobně popisuje tvorbu C(1,15)S použitím částečné syntézy genu (ve spojení s ostatními rekombinantními technikami) a s následnou expresí konstruktu v stabilně transformovaném bakteriálním hostiteli.

Jiná skupina analogů KGF zahrnuje molekuly které mají cysteiny v pozici 1 a 15 z molekuly KGF odstraněny. K tvorbě takovýchto analogů KGF mohou být použity různé strategie, jako například zkrácení N-konce, místní specifické delece či kombinace obou metod.

Pojem „zkrácení N-konce“ označuje takovou modifikaci KGF, kde jsou N-koncová aminokyselinová residua KGF 1 až 24 (aminokyseliny 32 až 55 SEQ ID NO:2) odstraněna, včetně Cys¹ a Cys¹⁵ [analoga KGF zahrnující zkrácení aminokyselin budou uváděna odstraněným residuem na pozici hotového proteinu (bez signální sekvence) uvedené v SEQ ID NO:2, začínající místem delece a počtem odstraněných residuí. Například analog KGF se zkrácením na N-konci o 24 zbytků (zbytky 1-55 v SEQ ID NO:2) bude označován jako analog „AN24“]. Konkrétně jsou v této skupině analoga ΔΝ23 přirozeného KGF, kde jsou jeden nebo více aminokyselinových zbytků 41-154 [(aminokyseliny 72-185 SEQ ID NO:2), včetně aminokyselinových zbytků 123-133 (aminokyseliny 154-164 SEQ ID NO:2)], odstraněny nebo nahrazeny neutrálními zbytky nebo negativně nabitými zbytky vybranými tak, aby se zmenšil pozitivní náboj. Přednostně se pro modifikaci používají Arg⁴¹, Gin⁴³, Lys⁵⁵, Lys⁹⁵, Lys¹²⁸, Asn¹³⁷, Gin¹³⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷,

-9CZ 297329 B6

Gin¹⁵², Lys¹⁵³ nebo Thr¹⁵⁴, které jsou nahrazené přednostně Gin¹³⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gin¹⁵² nebo Lys¹⁵³, přičemž Arg¹⁴⁴ je nejpreferovanější. V této skupině jsou také zahrnuta ΔΝ23 analoga přirozeného KGF s modifikací uvnitř oblasti vytvářející smyčku Asn”⁵-His”⁶-Tyr¹¹⁷-Asn’^!8Thr¹¹⁹ (aminokyseliny 146-150 SEQ ID NO:2) v přirozeném KGF.

Příklad 1 uvádí podrobnosti o systematickém zkracování N-konce provedeném částečnou syntézou genu ve spojení s ostatními rekombinantními technikami a následující expresi konstruktu ve stabilně transformovaném bakteriálním hostiteli. Příkladem může být zkracování N-konce u ANI5 až ΔΝ24. Navíc příklad 3 uvádí podrobnosti o expresi DNA kódující přirozený KGF a různorodé na N-konci glykosylované izoformy v kultuře savčích buněk a purifikaci zejména glykosylovaných izoforem sN-koncem zkráceným o aminokyseliny 1-23 konečné formy přirozeného KGF.

Naproti tomu místně specifická delece se vztahují na modifikace KGF, kde je odstraněn jeden nebo více aminokyselinových zbytků (například Cys¹ nebo Cys¹⁵). Když je v KGF specificky odstraněn Cys¹ nebo Cys¹⁵, je analog o jednu aminokyselinu kratší než KGF. [Analoga KGF se deleci aminokyseliny jsou uváděna podle zbytku nacházejícího se vdané pozici v hotovém proteinu (bez signální sekvence) uvedeném v SEQ ID NO:2, následovaném pozicí aminokyseliny v závorkách a negativním znaménkem. Například analog v této skupině s deleci cysteinu na pozici 15 KGF (pozice 36 SEQ ID NO:2) je označen jako „C(l 5)—„.] Místně specifické delece mohou být generovány s použitím místně zaměřené mutageneze, jak je to popsáno výše.

Do této skupiny také patří analoga, kde je Cys¹ a Cys¹⁵ KGF odstraněn díky zkrácení nebo deleci. například charakteristická analoga KGF zahrnují zkrácení KGF o první tři aminokyselinové zbytky (Cys-Asn-Asp) nebo zkrácení KGF o osm prvních aminokyselin (Cys-Asn-Asp-MetThr-Pro-Glu-Gln) spojených s deleci cysteinu na aminokyselinové pozici KGF 15 (tato analoga jsou uváděna jako AN3/C(15)~ a AN8/C(15)—). Protože se methioninový zbytek objevuje přirozeně na čtvrté a deváté aminokyselinové pozici v přirozeném KGF, není nutný další Met kodon pro správnou iniciaci translace.

Jiná skupina zahrnuje molekuly u kterých jsou cysteiny na pozicích 1 a 15 KGF nahrazeny díky zkrácení a substitucí. Například charakteristickými analogy KGF jsou AN3/C(15)S a AN8/C(15)S. Takováto analoga zahrnují zkrácení tří prvních koncových aminokyselinových zbytků KGF nebo odstranění prvních osmi koncových amino zbytků KGF společně s náhradou cysteinu na aminokyselinové pozici 15 jinou aminokyselinou, například serinem.

Když jsou analoga KGF tvořena biologicky, tj. jsou produkty exprese v buňkách a ne výsledky syntézy na pevné fázi, proteolytické nebo enzymatické úpravy přirozeně se vyskytujících produktů atd., nukleové kyseliny kódující takovéto polypeptidy se liší v jednom nebo více nukleotidech ve srovnání s přirozenou nukleotidovou sekvencí KGF. Tyto nukleosidy mohou být exprimovány a výsledný polypeptid purifikován jednou z mnoha metod rekombinantní technologie, které jsou odborníkovi známy.

DNA sekvence, kódující celý nebo část analogů KGF, mohou zahrnovat kromě jiných věcí inkorporaci kodonů „preferovaných“ pro expresi ve vybraných hostitelských buňkách (např. „expresní kodony E. coli“); zajišťujících místa pro štěpení restrikčními enzymy; zajišťujících další inicializační, koncové nebo mezilehlé nukleotidové sekvence (např. inicializační methioninový aminokyselinový zbytek pro expresi v buňkách E. coli) pro usnadnění konstrukce snadno exprimovatelných vektorů.

Předkládaný vynález také poskytuje rekombinantní molekuly nebo vektory pro použití v metodách pro expresi polypeptidů. Takovéto vektory se mohou skládat z DNA nebo RNA a mohou být kruhové, lineární, jednopramenné nebo dvoupramenné a mohou se vyskytovat přirozeně, nebo mohou být složeny z řady komponent a vyskytovat se pak přirozeně nebo mohou být syntetické.

-10CZ 297329 B6

Je známo mnoho příkladů takovýchto expresních vektorů. Komponenty vektorů, tj. replikony, selekční geny, zesilovače (enhancers), promotory a podobné komponenty mohou být získány z přírodních zdrojů nebo známými postupy syntetizovány. V každém případě expresní vektory užitečné v tomto vynálezu obsahují alespoň jeden prvek řídící expresi, funkčně spjatý s vloženou molekulou nukleové kyseliny kódující polypeptidový analog KGF. Tyto řídicí elementy jsou odpovědné za regulaci exprese polypeptidu z molekul nukleových kyselin tohoto vynálezu. Užitečné řídicí elementy zahrnují například lac systém, trp systém, operátory a promotory z fága lambda, glykolytický kvasinkový promotor, promotor z kvasinkového genu pro kyselou fosfatázu, kvasinkový faktor pro alfa párování (alpha mating factor) a promotory odvozené z adenovirů, viru Epstein-Barové, polyomy, opičích virů a rozličných retrovirů. Pro účely tohoto vynálezu může být ale použita řada jiných vektorů a řídicích prvků vhodných pro expresi v prokaryontech nebo eukaryontech.

Příklady vhodných prokaryontních klonovacích vektorů zahrnují plasmidy zE. coli (např. pBR322, col El, pUC a F-faktor), přičemž preferovány jsou plasmidy pCFM1156 (ATCC 69702), pCFM1656 (ATCC 69576) a pCFM3102 (popsaný dále v části Příklady). Pro tyto účely může být také použita řada dalších vhodných expresních vektorů, z nichž jsou mnohé známé ze savčí, hmyzí, kvasinkové, houbové nebo bakteriální exprese. Transfekce příslušných hostitelských buněk těmito vektory může vést k expresi polypeptidových analogů KGF.

Hostitelské mikroorganizmy užitečné pro tento vynález můžou být buď prokaryontní nebo eukaryontní. Mezi vhodné prokaryontní hostitele patří E. coli (např. FM5, HB101, PH5oc, DH10 a MC1061), kmeny Pseudomonas, Bacillus a Steptomyces, přičemž preferovaným organizmem je E. coli. Mezi vhodné eukaryontní hostitelské buňky patří kvasnice a jiné houby, hmyzí buňky, rostlinné buňky a živočišné buňky, jako například COS (tj. COS-1 a COS-7) a opičí buněčné linie CV-1, dále 3T3 linie odvozené od Swiss, Balb-c nebo NIH buňky, myší HeLa a L-929 buňky, a křeččí CHO, BHK nebo HaK buňky. V závislosti na použitém hostiteli bude produkovaný rekombinantní polypeptid glykosylovaný savčími nebo jinými eukaryontními uhlovodíky nebo může být neglykosylovaný.

Preferovaná produkční metoda bude záviset na mnoha faktorech a úvahách; optimální produkční postup pro danou situaci bude odborníkům pro minimálních experimentech jasný. Výsledný produkt exprese může být potom purifikován do téměř homogenního stavu s použitím známých technik. Typická purifíkační procedura při produkci v prokaryontních buňkách zahrnuje rozrušení buněčné stěny vysokým tlakem nebo jinými způsoby, centrifugaci nebo filtraci k odstranění buněčných zbytků s následnou iontoměničovou chromatografíí supematantu nebo filtrátu a nakonec hydrofóbní chromatografíí. Jestliže je analog produkován v nerozpustné formě, používá se jiná purifíkační technika skládající se z rozpuštění příslušných částic obsahujících analoga s následnou iontoměničovou chromatografíí, dále rekonformaci proteinu a nakonec chromatografíí využívající hydrofóbní interakce. Vzorové purifíkační techniky jsou uvedeny v běžně přístupném U.S.S.N 08/323, 329, uvedeném 13. října 1994. Obecně U.S.S.N 08/323, 329 ukazuje metodu pro purifíkaci keratinocytových růstových faktorů zahrnující: (a) získání roztoku obsahujícího KGF; (b) navázání KGF z roztoku z části a) na kationtový výměnný nosič; (c) vymytí KGF z kationtového iontového nosiče (d) průchod eluovaného roztoku z (c) vhodnou kolonou s molekulárním sítem nebo provedení hydrofóbní chromatografíe vymytého roztoku z (c); a (e) získání KGF z molekulárního síta nebo po hydrofóbní chromatografii.

Pochopitelně, že u analogů může být provedena rychlá analýza jejich fyzikálních vlastností. Část Příklady, uvádí různé dobře známé zkoušky stability, ačkoliv specifický test pro analoga není kritický. Navíc úroveň biologické aktivity (např. vazba receptoru a/nebo afinita mitogenní buněčně proliferační a/nebo in vivo aktivita) může být také testována s použitím různých zkoušek, z nichž jsou některé popsány v části Příklady. Pro zjištění, jestli analoga KGF vykazují dostatečnou biologickou aktivitu, se může použít řada dobře známých testů. Jeden takovýto test specificky zjišťuje u analogů KGF jejich schopnost kompetičně se vázat na receptor KGF

-11 CZ 297329 B6 (KGFR) s navázaným ¹²⁵I-KGF (Bottaro et al. (1990), J. Biol. Chem., 265:12767-12770; Ron et al. (1993), J. Biol. Chem., 268:2984-2988). Alternativní metoda pro testování interakce KGFR s analogy KGF zahrnuje použití technik jako je analýza biospecifických interakcí v reálném čase (BIA) (Felder et al., (1993), Molecular & Cellular Biology, 13:1449-1455). Navíc mohou být pro testování schopnosti analogů KGF stimulovat syntézu DNA použity mitogenní testy (Rubin et al. (1989), viz předchozí text). Konečně můžou být analoga KGF testována na schopnost stimulovat buněčnou proliferaci pomocí proliferačních testů (Falco et al., 1988), Oncogene, 2:573-578). Použitím jakéhokoliv shora zmíněného testovacího systému můžou být analoga KGF rychle otestována na jejich biologickou aktivitu.

V předkládaném vynálezu je pozornost zaměřena především na analoga, která si zachovávají plnou biologickou aktivitu KGF (tj. minimálně značně podobnou) in vitro nebo in vivo. Příklady KGF analogů s těmito vlastnostmi (jak bylo určeno jedním nebo více výše zmíněnými testy) jsou C(1,15)S, AN3/C(15)S, AN3(C(15>-, AN8/C(15)S, AN8/C(15)-, ANI5, ΔΝ16, ANI7, ΔΝ18, ΔΝ19, ΔΝ20, ΔΝ21, ΔΝ22, ΔΝ23, ΔΝ24 nebo AN23/R(144)Q.

Předkládaný vynález je dále zaměřený na složení jedné dávky účinné látky, která může být bezpečně aplikována orálně nebo neorálně pro léčení chorob u teplokrevných živočichů (jako například člověka). Takováto účinná látka může být ve formě lyofílizovaného nebo jinak dehydratovaného terapeutika nebo diagnostika, které může být rekonstituováno přidáním fyziologicky vhodného rozpouštědla. Tím může být jakékoliv médium, jako je sterilní voda, fyziologický roztok, glukózový roztok, nebo jiný vodný uhlovodík (např. polyoly, jako manitol, xylitol, nebo glycerol), které je schopno rozpustit suchou směs, které je slučitelné s vybraným aplikačním způsobem a které neinterferuje negativně s aktivními principy a použitými rekonstitučními stabilizátory. Ve specifickém případě je předkládaný vynález zaměřen na soupravu pro produkci jednodávkové aplikační jednotky. Souprava obsahuje jednak obal se sušeným proteinem a pak druhý obal, s vodnou složkou, která obsahuje také rekonstituční stabilizátor. Co se týče koncentrace proteinu v roztoku - množství roztoku v každém obalu a obsah obalů (jedná se o vzájemně závislé parametry, které můžou být vhodně upraveny v závislosti na požadované koncentraci aktivní látky v aplikované jednotce dávky) může kolísat v širokém rozsahu, který bude jasný odborníkům.

Podle vynálezu mohou být KGF analoga užitečná jako terapeutické nebo diagnostické látky a nebo jako činidla pro výzkum. Mohou být tedy použita v in vitro a/nebo in vivo diagnostických testech pro kvantifikaci KGF ve vzorcích pletiv nebo orgánů, nebo určení a/nebo izolaci buněk, které produkují KGFR (Bottaro et al. (1990), J. Biol. Chem., 265:12767-12770; Ron et al., (1993), J. Biol. Chem., 268:2984-2988). Při testech pletiv nebo orgánů se zjistí méně radioaktivity ^I25I-KGF analogu vázajícího se na KGFR (při srovnání se standardní vazebnou křivkou analoga ’²⁵I-KGF) a to díky vazbě přirozeného KGF na KGFR. ¹²⁵I-KGF analog může být podobně použit pro detekci přítomnosti KGFR v různých typech buněk.

Tento vynález také předpokládá použití analoga KGF pro tvorbu protilátek proti peptidů - protilátek, které se také váží na přirozená KGF. V tomto případě se jedná o monoklonální nebo polyklonální protilátky, které jsou připraveny proti analogu KGF. Výsledné protilátky váží přednostně přirozený KGF, zejména když je tento protein ve své přírodní (biologicky aktivní) konformaci. Tyto protilátky se můžou použít pro detekci nebo purifíkaci přírodního KGF.

Vynález navíc předpokládá použití analogů KGF pro nalezení molekul vázajících s vysokou nebo nízkou afinitou KGF (využitelných pro terapeutické aplikace) například pro účinné dodání KGF nebo jako inhibitor KGF aktivity. Pro identifikaci takovýchto vazebních molekul za fyziologických podmínek (tj. při 37 °C) je důležitá teplotní stabilita analogů KGF, protože jejich afinita vůči KGF může být silně závislá na teplotě a může se lišit oproti afinitě pozorované při 4 °C.

Pro použití in vivo mohou být KGF analoga doplněna aditivami. Mezi ně patří pufry, nosiče, stabilizátory, excipienty, ochranné látky, látky upravující tonus, antioxidanty atd. (např. látky ovlivňující viskozitu nebo plnidlo). Výběr konkrétních aditiv bude záviset na skladovací formě

-12CZ 297329 B6 (tekutá nebo lyofilizovaná) a způsobu aplikace analoga KGF. Vhodnou formu je možné nalézt v REMINGTONE PHARMACEUTICAL SCIENCES (poslední vydání), Mack Publishing

Company, Easton, PA.

Analoga KGF mohou být aplikována v terapeuticky účinných dávkách na konkrétně poškozená pletiva, nebo při klinicky nedostatečném počtu nefíbroblastových epiteliálních buněk. Oblasti, kde mohou být analoga KGF úspěšně použita zahrnují (ale nejsou omezena pouze na ně):

- stimulace, proliferace a diferenciace adnexálních struktur (adnexal structures), jako jsou například vlasové folikuly, potní žlázy nebo tukové žlázy u pacientů s popáleninami a jinými částečnými nebo vážnými poškozeními

- urychlená reepitelizace lézí způsobených (epidermolysis bullosa), což je defekt v přilnavosti epidermis na vespod ležící kůži (dermis), vedoucí často k otevřeným bolestivým puchýřům, které mohou způsobit vážná onemocnění

- k prevenci vypadávání vlasů způsobeném chemoterapii a k ošetření mužské plešatosti nebo progresivní ztrátě vlasů u mužů i žen

- pro ošetření žaludečních a dvanáctníkových vředů

- pro ošetření zánětlivých střevních onemocnění, jako např. Crohnova choroba (postihující především tenké střevo) a kolitidy vyvolávající vředy (postihující především tlusté střevo)

- prevenci nebo zmírnění toxických vlivů radiačních nebo chemoterapeutických ošetření (tj. předběžné ošetření a/nebo ošetření po vlastním léčení) pro indukci faktorů působících na ochranu buněk nebo regeneraci nebo oboje

- stimulace produkce slizu v celém gastrointestinálním traktu

- indukce proliferace a diferenciace pneumocytů typu II, což může pomoci při léčbě nebo prevenci chorob jako je například „sklovitá“ membrána (hyaline membrane disease), tj. syndrom kojeneckých dýchacích problémů a průduškové a plicní displasie (infant respirátory distress syndrome and bronchopulmonary displasia) u nedonošených dětí

- stimulace proliferace a diferenciace průduškového a/nebo alveolámího epitelu s akutním nebo chronickým poškozením plic nebo insufíciencí díky dýchacím potížím (včetně vysokých hladin kyslíku), rozedmě plic (emphysema) nebo užívání chemoterapeutik poškozujících plíce, traumatům způsobeným respirátorem (ventilátor trauma) nebo jiným činitelům poškozujícím plíce

- zvýšená činnost jater k léčbě nebo prevenci hepatické cirrhosy, akutní selhání jater, škody způsobené akutní virovou hepatitidou a/nebo toxické poškození jater

- indukce regenerace buněk rohovky, například při léčbě odřenin rohovky

- indukce regenerace epiteliálních buněk při léčbě pokračující chorobě dásní (progressive gum disease)

- indukce regenerace bubínkových epiteliálních buněk při léčbě poškození ušního bubínku a léčbě nebo prevenci počátku diabetes mellitus nebo jako doplněk úpravy při transplantaci ostrůvku buněk (an adjunct in the setting of islet cell transplantation).

Pacient, který potřebuje proliferující nefibroblastové epiteliální buňky bude ošetřen účinným množstvím analogu KGF. Pojem „účinné množství“ je takové množství analogu KGF, které je

- 13CZ 297329 B6 nezbytné pro vyvolání požadované odpovědi u ošetřeného pacienta a bude zpravidla určeno ošetřujícím lékařem. Mezi faktory ovlivňující množství aplikovaného analoga KGF bude patřit věk, všeobecný stav pacienta, léčená choroba atd. Typická dávka se bude pohybovat v rozmezí

0,001 mg až 500 mg na 1 kg tělesné hmotnosti.

Analog KGF může být podán teplokrevným živočichům (kam patří i člověk) ne-orálně (tj. IV, IT, IM, SC nebo IP cestou), orálně nebo lokálně. Analog KGF může být použit jednorázově nebo opakovaně v závislosti na nemoci a stavu pacienta. V některých případech může být analog KGF podáván jako adjuvans kjiné léčbě a také v kombinaci s jinými farmaceutickými preparáty.

Následující příklady slouží k lepší ilustraci předkládaného vynálezu. Je jasné, že uvedené postupy mohou být modifikovány bez toho, aby byl ovlivněn „duch vynálezu“.

Příklady provedení vynálezu

Standardní metody používající postupy v následujících příkladech (nebo vhodné alternativní postupy) jsou uvedeny v běžně používaných manuálech pro molekulární biologii, jako například Molecular Cloning, Second Edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) a Current Protocols in Molecular Biology, Ausabel et al., Greene Publishing Associates/Wiley-Interscience, New York (1990).

Příklad 1: Příprava DNA kódující KGF a analoga KGF

Klonování celého genu lidského KGF (kódujícího polypeptid se sekvencí nativního KGF) bylo provedeno jednak polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) s RNA z živočišných buněk a pomocí PCR chemicky syntetizovaných (optimalizovaný kodon E. coli) oligonukleotidů („OLIGA“). Obě procedury jsou popsány dále:

Byla provedena amplifikace s použitím RNA izolovaných z buněk (o kterých víme že produkují polypeptid) pomocí PCR. Nejprve se provede rozrušení buněk z buněčné linie lidských fibroblastů AG1523A (získané od Human Genetic Mutant Cell Culture, Repository Institute For Medical Research, Camden, New Jersey) pomocí guanidin thiokyanátu; pak následuje extrakce (podle metody popsané v práci Chomzynski et al. (1987), Anal. Biochem., 172:156). S použitím standardního protokolu pro reversní transkripci z celkové RNA byla vytvořena cDNA pro KGF. PCR amplifikace (PCR č. 1) genu KGF byla provedena s použitím cDNA KGF jako templátu a primerů OLIGO č. 1 a OLIGO č. 2, které kódují DNA sekvence bezprostředně na 5' a 3' genu KGF [teplotní cyklátor model 9600 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT); 28 cyklů, každý zahrnující denaturaci - jednu minutu při 94 °C, annealing - dvě minuty při 60 °C a elongaci - tři minuty při 72 °C]. Malé alikvótní části produktu první PCR reakce byly potom použity jako templát pro druhou KGF PCR amplifíkaci (PCR č. 2) za podmínek shodných s první reakcí kromě teploty pro annealing, která byla 50 °C. Pro expresní klonování genu KGF byly dále použity primery pro „nested PCR“ generující vhodná restrikční místa na obou koncích genu KGF - k modifikaci KGF DNA produktu z PCR č. 2 byly tak použity OLIGO č. 3 a OLIGO č. 4 (začlenění restrikčních míst pro Mlul a BamHI na 5' a 3' konci genu) [PCR 3; 30 cyklů, každý zahrnující denaturaci jedna minuta při 94 °C, annealing - dvě minuty při 60 °C a elongaci - tři minuty při 72 °C]. Tato DNA byla následovně štěpena restrikčními enzymy Mlul a BamHI, extrahovaná fenolem a precipitována etanolem. Poté byla resuspendována a ligována (s použitím T4 ligázy) do plasmidu pCFM1156 (obrázek 2A), který obsahuje „RHS“ signální sekvenci, čímž vznikl konstrukt RSHKGF (obrázek 3).

Tímto ligačním produktem byly transformovány (podle metody popsané Hanahanem (1983) J. Mol. Biol., 166:557) buňky zE. coli (kmen FM5 - ATCC:53911) a následně vysety na LB médium s kanamycinem při 28 °C. Několik vybraných transformantů bylo dále pěstováno

- 14CZ 297329 B6 v malých tekutých kulturách obsahujících kanamycin v koncentraci 20 pg/ml. Z každé kultury byl izolován RSH-KGF plasmid a jeho DNA byla sekvenována. Vzhledem k vnitřnímu Ndel restrikčnímu místu v genu KGF nebylo možné přímo klonovat nativní sekvenci genu do příslušného expresního vektoru do míst ohraničeních Ndel a BamHI. Toho se dosáhlo trojcestnou ligaci. Plasmid RSH-KGF byl štěpen v jedinečných restrikčních místech BsmI a Sstl a fragment DNA asi 3 kb velký (obsahující 3' konec KGF genu) byl izolován následnou elektroforézou v 1% agarózovém gelu. Další PCR (PCR č. 4) byla provedena za stejných podmínek jako PCR č. 3 s primerem OLIGO č. 5 místo OLIGO č. 3. DNA produkt PCR reakce byl pak štěpen enzymy Ndel a BsmI a pomocí elektroforézy v 4% agaróze byl izolován DNA fragment 311 párů bází dlouhý. Třetí fragment použitý v ligaci byl fragment DNA 1,8 kilobází dlouhý zpCFM1156 vyštěpený s Ndel a Sstl a izolovaný elektroforézou v 1% agarózovém gelu. Po následující ligaci (T4 ligáza), transformaci, selekci na kanamycinu a sekvenování DNA (jak je popsáno výše) byl vybrán klon obsahující konstrukt na obrázku 4 a tento plasmid byl označený jako KGF. Vzhledem k internímu ribosomálnímu vazebnému místu, které vede k tvorbě zkrácených produktů, byla sekvence KGF DNA mezi jedinečnými KpnI a EcoRI místy nahrazena chemicky syntetizovanými OLIGO (OLIGO 6 až OLIGO 11) tak, aby se minimalizovalo použití interního startovacího místa (obrázek 5).

OLIGO#1	(SEQ ID NO:7):	5’
OLIGO#2	(SEQ	ID	NO: 8) :	5'
OLIGO#3	(SEQ	ID	N0:9):	5'
OLIGO#4	(SEQ	ID	NO:10):

-CAATGACCTAGGAGTAACAATCAAC-3'

-AAAACAAACATAAATGCACAAGTCCA-3'

-ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA-3'

5'-ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA-3'

OLIGO#5	(SEQ ID NO:11): 5’-ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA-3'
OLIGO#6	(SEQ ID NO:12): 5'-CTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCC-3’
OLIGO#7	(SEQ ID NO : 13) : 5'-AAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTT-3
OLIGO#8	(SEQ ID NO:14): 5'-GCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTG-3’

OLIGO#9 (SEQ ID NO:15):

5'-TCTTGGGTGCCCTTGACTTTGCCGCGTTTGTCGATACGCAGGTAC-3'

OLIGOttlO (SEQ ID N0:16):

5'-ACAGCAACAGTACGGATTTCCATAATATTGTAGTTGTTTTTCATC-3’

OLIGO#11 (SEQ ID NO:17):

5’-AATTCAGATTCAACACCTTTGATTGCAACGATACCA-3'

OLIGA byla fosforylována T4 polynukleotid kinázou a poté tepelně denaturována. Jednopramenné (ss - single stranded) OLIGA potom byla ponechána vytvořit dvoupramenné (ds) fragmenty DNA pomalým snížením teploty na úroveň laboratoře. Poté byla použita T4 ligáza ke kovalentnímu připojení jak interních OLIGO shodných (sticky) konců tak celého ds OLIGO fragmentu do KGF plasmidu štěpeného enzymy KpnI a EcoRI. Nový plasmid byl označen jako KGF(dsd).

KGF gen s úplně optimalizovaným E. coli kodonem byl vytvořen amplifikací pomocí PCR s chemicky syntetizovanými OLIGO č. 12 až 24.

- 15CZ 297329 B6

OLIGO#12	(SEQ ID N0:18): 5'-AGTTTTGATCTAGAAGGAGG-3'
OLIGO#13	(SEQ ID N0:19): 5'-TCAAAACTGGATCCTATTAA-3¹
OLIGO#14	(SEQ ID N0:20):

5’-AGTTTTGATCTAGAAGGAGGAATAACATATGTGCAACGACATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTGCTCCAGCCCGGAACGT-3'

OLIGO#15

(SEQ ID NO:21):

5’-CACACCCGTAGCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGTGTTCGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAA-3¹

OLIGO#16

(SEQ ID NO:22):

’ -CGTGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTACAACATCATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAA-3

OLIGO#17

(SEQ ID NO:23):

5'-GGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGC GAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAA-3'

OLIGO#18

(SEQ ID NO:24) :

5’-CTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGT-3'

OLIGO#19

(SEQ ID NO:25):

5'-ATCCCGGTTCGTGGT CCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAATAGGATCCAGTTTTGA-3'

OLIGO#20	(SEQ ID NO;26) :5'-TACGGGTGTGACGTTCCGGG-3 ’
OLIGO#21	(SEQ ID NO:27) :5'-CTTTACCACGTTTGTCGATA-3 '
OLIGO#22	(SEQ ID NO:28) :5'-ATTCAACACCTTTGATTGCA-3 '
OLIGO#23	(SEQ ID NO:29):5'-CCAGGATCAGTTCTTTGAAG-3'
OLIGO#24	(SEQ ID NO:30):5'-GAACCGGGATACCTTTCTGG-3'

OLIGA 12 až 24 byla navržena tak, aby celá DNA sekvence kódující nativní KGF byla reprezentována OLIGY z „Watsonova“ nebo „Crickova“ pramene a aby po PCR by poskytla žádanou dvoupramennou DNA sekvenci (obrázek 6) [PCR č. 5, teplotní cyklátor model 9600 (Perkin5 Elmer Cetus); 21 cyklů skládajících se z denaturace - 31 vteřin při 94 °C, annealingu - 31 vteřin při 50 °C a elongace - 73 °C po 31 vteřin; po těchto 21 cyklech byla PCR reakce zakončena závěrečným sedmi minutovým elongačním krokem]. Po PCR amplifikaci byl výsledný DNA fragment štěpen enzymy Xbal a BamHI a fragment 521 bp byl ligován do expresního píasmidu pCFM1156, který byl štěpen stejnými enzymy. PCR č. 5 používala vnější primery to (100 pmolů/100 μΐ rxn) OLIGO č. 12 a OLIGO č. 13 a lul/100 μΐ rxn KGF templátu odvozeného ligací (T4 ligázou) OLIGO č. 14 až 19 (OLIGO č. 15 až 18 byly fosforylovány T4 polynukleotid kinázou) s použitím OLIGO č. 20 až 24 jako pomocný oligonukleotidů (band-aid oligos) pro ligaci (Jayraman et al. (1992), Biotechniques, 12:392). Konečný produkt byl označen jako KGF (optimalizovaný kodon).

Všechna zde popsaná analoga KGF jsou složena zčásti DNA sekvencí nalézajících se vKGF (dsd) nebo KGF (optimalizovaný kodon) nebo z kombinace obou. Tyto sekvence jsou dále modifikované inzercí do vhodných restrikčních míst DNA sekvencí, které kódují specifická

-16CZ 297329 B6 aminokyselinová KGF analoga, s použitím jedné nebo více technik pro syntézu DNA fragmentů popsaných výše. Jakýkoliv analog může být vytvořen v celém svém rozsahu jednou z výše popsaných technik. Obecně se při konstrukci OLIGO používali optimalizované E. coli kodony tam, kde to bylo vhodné, i když přítomnost optimalizovaných E. coli kodonů (v části nebo v celku jakéhokoliv z genů, kde byl tento vliv zjišťován) nezvýšila významně výnos proteinu, který mohl být získán z kultivovaných bakteriálních buněk. Obrázky 7-24 a 37-50 jsou uvedené jako vhodný příklad specifické nukleotidové a aminokyselinové sekvence konstruktu analoga KGF: C(1,15)S, (obrázek 7).

Příklad 2: Produkce v E. coli

Při klonování analogů genu KGF byly použity tři různé expresní plasmidy. Jednalo se o pCFMl 156 (ATCC 69702), pCFM1656 (ATCC 69576) a pCFM3102 (obrázky 2A, 2B a 2C). Piasmid p3102 může být odvozen z plazmidu pCFM1656 sérií místních mutagenezí (změn bází) pomocí PCR s přesahujícími oligo (PCR overlaping oligo mutagenesis). Začíná se na Bglll místě (v plasmidu pCFM1656, 180 pár bází) bezprostředně u 5' replikačního promotoru plasmidu, PcopB, a pokračuje se směrem ke genům replikace plasmidu, přičemž dochází k těmto změnám:

pCFM1656 bp #	bp in pCFM1656	bp changed to in pCFM31O2
# 204	T/A	C/G
# 428	A/T	G/C
# 509	G/C	A/T
# 617	—	insert two G/C bp
# 677	G/C	T/A
# 978	T/A	C/G
# 992	G/C	A/T
# 1002	A/T	C/G
# 1005	C/G	T/A
# 1026	A/T	T/A
# 1045	C/G	T/A
# 1176	G/C	T/A
# 1464	G/C	T/A
# 2026	G/C	bp deletion
# 2186	C/G	T/A
# 2479	A/T	T/A
# 2498-2501	AGTG TCAC	GTCA CAGT
# 2641-2647	TCCGAGC AGGCTCG	bp deletion
# 3441	G/C	A/T
# 3452	G/C	A/T
# 3649	A/T	T/A
# 4556	--	insert bps

(SEQ ID NO:43) 5’-GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG-3¹(SEQ ID NO:44) 5 *-CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC-3¹

Jak je vidět z výše uvedeného, plasmidy pCFM 1156, pCFM 1656 a pCFM3102 jsou si vzájemně velmi podobní a obsahují mnoho stejných restrikčních míst. Plasmidy byly vybrány podle jejich vhodnosti a části vektorové DNA mohou být jednoduše změněny pro potřeby nových konstruktů. Hostitelským organismem použitým pro všechna klonování byla E. coli, kmen FM5

-17CZ 297329 B6 (ATCC: 53911) a transformace byla prováděna podle metody Hanahana (1983, viz předchozí text) nebo elektroelucí s použitím přístroje Gene Pulser transfection apparatus (BioRad

Laboratories, lne., Hercules, CA, USA), podle protokolu dodaného výrobcem.

Nejprve bylo připraveno malé čerstvé inokulum žádaného rekombinantního klonu E. coli, obsahujícího na jednom ze tří pCFM vektorů žádaný konstrukt. Do dvoulitrové lahve obsahující 500 ml Luriova bujónu bylo přeneseno 0,1 ml zmražené zásobní kultury vhodného kmene v glycerolu. Kultura byla třepána při 30 °C po 16 hodin. Poté byla kultura přenesena do 15 1 fermentoru obsahujícího 8 1 sterilního média používaného pro fermentace ve větších objemech (Tsai, etal. (1987), J. Industrial Microbiol., 2:181-187).

Na začátku fermentace bylo dodáváno živné médium Feed #1 (Tsai, et al. (1987), viz předchozí text). V okamžiku, kdy hodnota OD600 dosáhla hodnoty 35, byla rychlým zvýšením teploty kultury na 37 °C indukována exprese žádaného analogu KGF. Při této teplotě se plasmid amplifikuje. Po dvou hodinách při 37 °C byla teplota kultury dále rychle zvýšena na 42 °C, čímž byl denaturován Cl represor. Přidávání Feed 1 bylo přerušeno a místo něj bylo poté přidáváno živné médium Feed 2 v množství 300 ml za hodinu. Feed 2 obsahovalo 175g/l peptonu (trypticase-peptone), 87,5g/l kvasničného extraktu a 250g/l glukosy. Po jedné hodině kultivace při 42 °C byla teplota kultury snížena na 36 °C a tato teplota byla dále udržována po následujících šest hodin.

Fermentor byl poté zastaven a buňky byly koncentrovány centrifugací v plastikových pytlících vložených do jednolitrových centrifugačních kyvet. Médium bylo centrifugováno 60 minut při 400 otáčkách za minutu. Supernatant by poté odebrán a pelet (sedimentované buňky) byl zmražen při -90 °C.

Následujícím způsobem byla purifikována tato analoga KGF (získána expresí v E. Coli): přirozený KGF, C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)E, C(1,15)S/R(144)Q, ΔΝ15, ΔΝ23 a AN23/R(144)Q. Pelet (hustá buněčná suspenze) získaný z vysokohustotní fermentace byl resuspendován pomocí vhodného výkonného (poskytujícího velké střižné síly) mixeru při 4 °C v roztoku 0,2 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5, tak, aby výsledná suspenze byla 10 až 20% (hm./obj.). Resuspendované buňky byly poté lysovány trojitým homogenizováním v homogenizéru (APV Gaulin, lne., Everett, MA, USA). Homogenát vytékající z homogenizátoru byl ochlazován na 4 až 8 °C pomocí vhodného chladicího zařízení. Zbytky buněk byly odstraněny centrifugací lysátu při 4200 otáčkách za minutu, 4 °C, po dobu 30 až 60 minut v centrifuze J-6B (Beckman Instruments, lne., Brea, CA, USA, použitý rotor JS 4.2). Supernatant byl poté opatrně dekantován a nanesen na předem připravenou kolonu (450ml, 5 cm x 23 cm) S-Sepharosy Fast Flow (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA). Kolona byla ekvilibrována roztokem 0,2 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5, při 4 °C. Poté byla kolona promyta 2250 ml (pětinásobný objem kolony) roztoku 0,4 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5, při 4 °C. Purifíkovaný protein byl eluován z kolony 5 1 roztoku 0,5 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5. Absorbance eluátu při 280nm byla kontinuálně zaznamenávána a eluát byl jímán do frakcí o objemu 50 ml. Frakce obsahující eluované látky (identifikované pomocí absorbance při 280 nm) byly dále analyzovány pomocí SDS-PAGE elektroforézy (14% gel). Touto metodou byla potvrzena přítomnost požadovaného proteinu ve frakcích.

Frakce obsahující požadované proteiny byly spojeny a následně k nim byla přidána destilovaná voda v poměru 1:1. Zředěný roztok byl poté nanesen na předem připravenou kolonu (450ml, 5 cm x 23 cm) S-Sepharosy Fast Flow ekvilibrovanou roztokem 0,4 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 6,8, při 4 °C. Kolona byla poté promyta 2250 ml roztoku 0,4 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 6,8. Proteiny byly poté eluovány dvacetinásobným objemem kolony pomocí lineárního gradientu roztoku NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 6,8. Koncentrace NaCl se pohybovala od 0,4 M do 0,6 M. Opět byly jímány 50 ml frakce, při současném měření absorbance eluátu při 280nm. Frakce obsahující purifíkovaný protein (stanoveno pomocí 14% SDS PAGE) byly spojeny a zkoncentro-18CZ 297329 B6 vány filtrací přes membránu (YM-10, 10000 molecular weight cutoff) v 350 ml nádobách za současného míchání (Amicon, lne. Mayberry, MA, USA) na výsledný objem 30-40ml.

Koncentrát byl poté nanesen na předem připravenou kolonu (1300ml, 4,4cm x 85cm) Superdex-75 (Pharmacia) ekvilibrovanou pufrem obsahujícím IX PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Salině, „D-PBS“, bez obsahu vápenatých a hořečnatých iontů) nebo 0,15 M roztokem NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,0. Po nanesení vzorku byly proteiny eluovány z kolony použitím kolonového pufru. Byly jímány desetimililitrové frakce a ty, které obsahovaly požadovaný analog (stanoveno pomocí 14% SDS-PAGE) byly spojeny. Koncentrace proteinů v takto získané frakci byla běžně asi 5 až 10 mg/ml. Pokud není uvedeno jinak byly všechny výše uvedené kroky prováděny při 4 až 8 °C.

Alternativní postup purifikace byl použit v případě přirozeného KGF, C(1,15)S a ΔΝ23. Pokud není uvedeno jinak byly všechny kroky prováděny při 23 ± 5 °C; tuto teplotu měly i veškeré použité roztoky a zařízení.

Po dokončení produkční fáze bakteriální fermentace byla buněčná kultura ochlazena na 4 až 8 °C a buňky byly izolovány centrifugací či jiným podobným způsobem. Na základě očekávaného výtěžku proteinu na jednotku buněčné hmoty a množství požadovaného purifikovaného proteinu bylo přiměřené množství buněčné hmoty resuspendováno v pětinásobku (váhově) slabého pufru (0,2 M NaCl, 20 mM NaPO₄, pH 7,5). Buňky byly resuspendovány na homogenní suspenzi pomocí vysokoobrátkového (high shearing) mixeru. Teplota buněčné suspenze byla během homogenizace udržována na 4 až 8 °C.

Buňky byly poté lysovány tlakem, např. dvojnásobnou homogenizací buněčné suspenze ve vhodně velkém buněčném homogenizátoru. Homogenát byl udržován chladný (5 ± 3 °C). K vyčištění buněčného lysátu byl použit předem připravený „hluboký“ filtr (depth filtr housing, Cuno, lne., Meriden. CT, USA) vybavený filtrem s odpovídající plochou. Filtr byl ekvilibrován přiměřeným množstvím 0,2 M NaCl, připraveného v 20 mM NaPO₄, pH 7,5. Ekvilibrace a promytí bylo prováděno při 5 ± 3 °C. Po vyčištění lysátu filtrací přes vhodně upravený filtr byl tento promyt roztokem 0,2 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5. Filtrát a všechny další promývací roztoky byly jímány do chlazené nádoby odpovídajícího objemu. Všechny operace byly prováděny při teplotě nižší než 10 °C.

Lysát byl dále přečištěn na předem připravené koloně SP-Sepharosy Fast Flow obsahující minimálně 1 ml Sepharosy na 2g buněk. Kolona SP-Sepharosy Fast Flow byla ekvilibrována vychlazeným (5 ± 3 °C) 0,2 M roztokem NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5. Teplota kolony byla udržována na hodnotě nižší než 10 °C. Přečištěný lysát (5 ± 3 °C) byl poté nanesen na kolonu iontoměniče a absorbance eluátu při 280nm byla kontinuálně monitorována. Po nanesení vzorku byla kolona promyta vychlazeným 0,2 M roztokem NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5 a následně ještě promyta 0,3 M roztokem NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5 při teplotě 23 ± 5 °C.

Požadovaný protein byl eluován pomocí lineárního gradientu NaCl o koncentraci 0,2-1 M, připraveného v 20 mM NaPO₄, pH 7,5. Převážná část produktu byla sebrána v několika frakcích na základě měření absorbance při 280nm.

K oxidaci volných SH skupin byl proveden oxidační krok. U proteinů se změněným obsahem cysteinu, (v porovnání s přírodním KGF) bylo přidáno oxidační činidlo (např. cystamin dihydrochlorid, nebo jiné vhodné oxidační činidlo, například cystein, oxidovaný glutathion nebo ionty Cu²⁺) tak, aby výsledná koncentrace byla 1-20 mM a pH bylo upraveno na 7 až 9,5. V případě, že byl použit cystamin dihydrochlorid, bylo pH upraveno na 9,0 ± 0,3. Oxidace byla prováděna při 10 až 30 °C po vhodnou dobu. V případě přírodního KGF byla oxidace provedena přídavkem vhodného množství (NEL^SO^ např. 1-2 M (NH₄)₂SO₄ a pH bylo upraveno na hodnotu 7,5-9,5, přičemž teplota byla udržována na 23 ± 5 °C po přiměřenou dobu.

-19CZ 297329 B6

Po oxidaci bylo pH upraveno na hodnotu pohybující se mezi 6,5 a 9,5. V případě potřeby byl do roztoku přidán pevný (NH4)₂SO₄ tak, aby jeho výsledná koncentrace nepřesáhla 2 M koncentraci.

Roztok byl zbaven pevných částic přečištěním filtrací přes vhodný filtr.

Filtrát - oxidovaný produkt, byl dále dělen pomocí HIC (hydrophobic interaction chromatography). Jako matrice pro HIC byl použit Butyl-650M Toyopearl (Tosohaas, lne., Montgomeryville, PA, USA). Roztok obsahující protein byl nanesen na kolonu, která byla předem ekvilibrována roztokem obsahujícím 2 M (NH4)₂SO₄, 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO₄, pH 7,0. Po nanesení vzorku byla kolona promyta roztokem 2 M (NH₄)₂SO₄, 0,15 M NaCl a 20 mM NaPO₄, pH 7,0. Požadovaný protein byl poté eluován snižujícím se lineárním gradientem 2 až 0 M (NH₄)₂SO₄, který byl rozpuštěn v roztoku 0,15 M NaCl a 20 mM NaPO₄, pH 7,0. V okamžiku, kdy se začal požadovaný protein z kolony vymývat, což bylo indikováno zvyšující se absorbancí eluátu při 280 nm, byly jímány frakce. Část každé frakce byla poté analyzována pomocí SDSPAGE. Frakce obsahující požadovaný protein byly spojeny, dobře promíchány a byl stanoven objem takto získané spojené frakce a koncentrace proteinů v této spojené frakci.

Spojený eluát po HIC, obsahující protein, byl poté zkoncentrován a eluční pufr vyměněn. Běžně byly proteiny zkoncentrovány na 5,0-10,0 mg/ml. Ultrafiltrace byla provedena s použitím ultrafiltračního zařízení vybaveného kazetovým systémem PTGC Pellicon (Millipore, lne., Bedford, MA, USA) s membránami o vhodné velikosti pórů.

Po zkoncentrování byl vzorek diafiltrován proti vhodnému pufru. Vzorek vyšlý z koncentračního kroku byl diafiltrován proti roztoku obsahujícím 0,15 M NaCl a 20 mM NaPO₄, pH 7,0, a to tak dlouho, dokud se nelišila vodivost koncentrátu od vodivosti roztoku 0,15 M NaCl a 20 mM NaPO₄, pH 7,0 o méně než 5%.

Kromě toho byl koncentrovaný a diafiltrovaný vzorek obsahující proteiny přefiltrován přes filtry Posidyne s velikostí pórů 0,1 μπι (Pall, lne., Cortland, NY, USA). Důvodem bylo odstranění vysráženého materiálu a bakteriálních endotoxinů, které se mohou ve vzorku vyskytovat. Po stanovení koncentrace proteinů v roztoku a na základě požadavku na konečnou koncentraci produktu byl roztok zředěn roztokem 0,15 M NaCl a 20 mM fosforečnanu draselného, pH 7.0. Závěrem byla provedena sterilizace filtrací přes 0,22 pm filtr. Konečný produkt byl přenesen do apyrogenní nádoby ke skladování (cca při 5 °C) před dalším zpracováním.

B. Analýza

Analýza byla provedena spoužitím přirozeného KGF, C(1,15)S, C(1,15)S/R( 144)Q, ANI5, ΔΝ23 a AN23/R(144)Q. Všechny tyto látky byly připraveny s použitím E-coli.

Konformační stabilita

Polypeptidy byly porovnávány vzhledem ke své stabilitě během skladování, teplotě „tepelného rozbalení“ (thermal unfolding transition temperatures) T_m a stabilitě v širokém spektru pH.

Stabilita během skladování

Nativní KGF a C(1,15)S byly inkubovány při 37 °C po dobu cca 24 hodin a poté byl stanoven obsah zbylých proteinů. Výsledky jsou shrnuty na obrázcích 24 až 26.

Na obrázku 25 je porovnáván nativní KGF s C(1,15)S při skladování v 20 mM roztoku fosforečnanu sodného, 0,15 M NaCl, pH 7,0 při 37 °C po 27 hodin. C(1,15) vykazuje signifikantní nárůst množství rozpuštěného proteinu relativně vůči nativnímu KGF.

Na obrázku 26 je porovnáván nativní KGF s C(1,15)S při skladování v 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,0 při 37 °C. Opět zde C(1,15)S vykazuje relativně zvýšenou stabilitu vůči nativnímu KGF.

-20CZ 297329 B6

Na obrázku 27 je porovnávána stabilita nativní KGF, ΔΝ15 a C(1,15)S při skladování v PBS a v 50 mM NaPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,0 při 37 °C po 18 hodin. Množství rozpuštěného proteinu je mnohem vyšší v roztoku s vysokým obsahem fosforečnanu než v roztoku PBS (100 versus 65%). ΔΝ15 a také C(1,15)S vykazují jasně zvýšenou stabilitu v porovnání s nativním KGF. ΔΝ15 a C(1,15)S dával také 100% výtěžnost v roztoku s vysokým obsahem fosforečnanů, jak lze očekávat z výsledků s nativním KGF.

Bylo též provedeno jedno předběžné srovnání stability během skladování mezi C(l,15,40)S a C(40)S (který je kódován bázemi 201 až 684 sekvence SEQ ID NO:1, s výjimkou, že Ser⁴⁰ je kódován AGA) a mezi C( 1,15,102) a C( 102)S (který je kódován bázemi 201 až 684 sekvence SEQ ID NO:1, s výjimkou, že Ser¹⁰² je kódován AGG). Výsledky (data nejsou ukázána) naznačují sníženou stabilitu (např. méně rozpustného proteinu po inkubaci při 37 °C). Nicméně množství rozpustného správně sbaleného C(l,15,40)S proteinu, který byl purifikován z média bylo vyšší než množství C(40)S, což předpokládá, že C(1,15,40)S může být ve skutečnosti stabilnější a že výsledky porovnávacího pokusu jsou neprůkazné. Předkládaný vynález zahrnuje přednostně analoga KGF, která mají jiné substituce než substituce na Cys⁴⁰, Cys¹⁰² a Cys¹⁰⁶ a přednostně vylučuj i C( 1,5,40)S, C( 1,15,102)S a C( 1,15,40,104,016).

Schopnost C(1,15)S/R(144)Q a AN23/R(144)Q zamezit agregaci při zvýšené teplotě byla též testována. Vzorek obsahující 0,5 mg/ml proteinu byl připraven v D-PBS. 0,5 ml každého ze vzorků bylo přeneseno do třímililitrových skleněných lahviček typu 1 (type-1 glass vials). Lahvičky byly uzavřeny gumovou zátkou a 13 mm hliníkovým snadno vyjímatelným těsněním (flip-off aluminium seal). Tyto lahvičky byly poté vloženy do inkubátoru s teplotou 37 °C. V předem stanovené časové intervaly byly lahvičky odebrány a vzorky byly analyzovány vzhledem ke ztrátě rozpustných proteinů. Viditelná sraženina byla odstraněna centrifugací 250μ1 každého vzorku přes 0,22 pm filtr Spin-X™ (Costar, Cambridge, MA, USA). Rozpustné proteiny ve z filtrovaném roztoku byly následně analyzovány pomocí HPLC (size exclusion). Množství rozpustného proteinu bylo stanoveno integrací plochy píků na chromatogramu HPLC a vynesením výsledků jako funkce závislosti na době inkubace při 37 °C. Výsledky jsou ukázány na obrázku 27.

Poločasy ztráty rozpustných monomemích proteinů byly odhadnuty z těchto kinetických křivek. Tabulka 1 ukazuje poločasy „rozpadu“ pro zbývající rozpustné KGF při skladování při 37 °C pro tyto proteiny.

Tabulka 1

Poločas rozpadu rozpustných, monomemích proteinů

Protein	tl/2 (dny)
Nativní KGF	0, 6
ΔΝ2 3	1,1
C (1,15)	1,2
C(1,15)S/R(144)Q	13,3
ÚN23/R144Q	22,3
C(1,15)S/R(144)E	38,0

-21 CZ 297329 B6

Jak je vidět zvýše uvedené tabulky 1 a obrázku 28, je nativní KGF agregován nejrychleji s poločasem rozpustnosti 0,6 dne. C(1,15)S/R(144)Q, AN23/R(144)Q a C( 1,15)S/R( 144)E vykazují značný nárůst rozpustného poločasu a to 13,3, 22,3 a 38 dní.

Teplotní rozbalení

Teplotní rozvinutí bylo monitorováno pomocí cirkulámího dichroismu (CD) při 230 nm s použitím spektropolarimetru J-720 (Jasco, lne., Easton, MD, USA) vybaveného teplotním kontrolním systémem typu PTC-343 Peltier. Pro analýzu CD byly jednotlivé vzorky obsahující 0,1 mg/ml polypeptidů, které měly být analyzovány, připraveny v D-PBS (Life Technologies, lne., Grand 10 Island, NY, USA). 2,5 ml každého ze vzorků bylo přeneseno do pravoúhlé křemenné (Suprasil Hereaus Quarzschmelze, GmbH, Hnau, Germany) desetimilimetrové fluorescenční kyvety (Hellma Cells, lne., Jamaica, NY, USA). Kyveta byla vložena do teplotně kontrolovaného systému spektropolarimetru typu Peltier. Teplotní rozvinutí bylo prováděno rychlostí 50 °C za hodinu. Změny v elipticitě byly monitorovány při 230 nm jako indikátoru rozvinutí. Teplota T_m15 byla pro každý vzorek stanovena změřením teploty při které bylo 50% molekul proteinu v roztoku rozvinutých (Biophysical Chemistry, Cantor and Schimmel (eds), W. H. Freeman and Co. San Francisco (1980). Hodnoty Tm každého ze tří proteinů jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

Hodnoty bodů tání (melting temperature)

Protein	Tm (°C)
Nativní KGF	54,0
ΔΝ15	55,0
C(l,15)	55,0
ΔΝ23	56,0
C(l,15)S/Rd44)Q	62,5
AN23/R144Q	63,0
C(1,15)S/R(144)E	63,5

Jak ukazují tyto výsledky, C(1,15)S a ΔΝ15 mají hodnotu Tm o jeden stupeň vyšší v porovnání s nativním KGF. ΔΝ23 má Tm opět o jeden stupeň vyšší. Nicméně substituce R144Q na 25 C( 1,15)S/R( 144)Q či ΔΝ23 přidá zvýšení Tm o více než 6 °C a více než 7 °C v porovnání s nativním KGF. Kromě toho je Tm u C(1,15)S/R(144)E o více než 9 °C vyšší než Tm nativního KGF.

PH

Stabilita v rozmezí pH byla porovnávána u C(1,15)S/R(144)Q a C(1,15)S/R(144)E s nativním pH. Rozdílné pH bylo upravováno v roztocích D-PBS přídavkem koncentrované HCI nebo NaOH. Přibližně 2,35 ml D-PBS s rozdílnou hodnotou pH bylo smícháno s 100 μΐ 2,45 mg/ml proteinu KGF v křemenné kyvety. Tyto vzorky byly teplotně rozvinuty rychlostí 50 °C za hodinu a monitorovány s použitím CD při 230 nm. Obrázek 29 ukazuje T_m jako funkci pH pro nativní

KGF, C(l,15)S/R(144)Q a C(1,15)S/R(144)E. V testovaném rozmezí pH mají C(1,15)S/R( 144)Q a C( 1,15)S/R(144)E vždy vyšší T_m než nativní KGF.

Biologická aktivita in vitro

Mitogenní aktivita C(1,15)S, ΔΝ15, ΔΝ23, AN23/R144Q, C(1,15)S/R(144)Q a C(1,15)S/R40 (144)W byla stanovena in vitro jako funkce koncentrace proteinů a polovičky maximálních

-22CZ 297329 B6 koncentrací. Tato funkce byla stanovena měřením příjmu [³H] thymidinu buňkami Balb/MK (podle metody Rubina et al. (1989, viz předchozí text). Obecně byla koncentrace každého z analogů KGF stanovena s použitím in vitro biologického testu a vztažena vůči známému standardu nativního KGF. Každý analog KGF byl poté zředěn a testován na biologickou aktivitu s použitím Balb/MK biologického testu. Vzorky byly nejdříve naředěny pomocí média složeného z 50% Eagle's MEM média (připraveného na zakázku), 50% F12 taktéž připraveného na zakázku, 5 pg/ml transferrinu, 5 ng/ml seleničitanu sodného, 0,0005% HSA a 0,005% Tween 20. Vzorky KGF byly poté přidány do 96 jamkových destiček Falcon Primeria, v kterých byly již Balb/MK buňky. Bylo měřeno zabudovávání [³H]thymidinu během syntézy DNA. Tato inkorporace byla poté přepočítána na vliv přirozeného KGF porovnáním se standardní křivkou pro přirozený KGF. Výsledky jsou prezentovány na obrázcích 30 až 35. Jak je z těchto obrázků vidět, testovaná analoga KGF popsaná na obrázcích 29 až 34 mají s nativním KGF srovnatelnou aktivitu.

Příklad 3: Produkce v savčích buněčných kulturách.

Tento příklad popisuje expresi, izolaci a charakterizaci dvou biologicky aktivních rekombinantních KGF (rKGF), produkovaných v savčím expresním systému.

Lidský gen pro KGF byl izolován pomocí PCR, amplifikací cDNA získané z buněk normálních kožních lidských fíbroblastů (Clonetec, lne., Palo Alto, CA, USA). cDNA byla připravena pomocí reverzní transkriptázi a poté byla použita PCR k amplifikací genu pro KGF. OLIGO#25 a OLIGO#26 byly použity k amplifikací genu z cDNA a OLIGO#27 a OLIGO#28 byly pomocí druhé PCR amplifikace použity k vnesení restrikčních míst HindlW a BgUl na konce fragmentu, tak jak je vidět na obrázku 1.

OLIGO#25	(SEQ ID NO:69):	5’
OLIGOS26	(SEQ	ID	NO:70):	5'
OLIGO#27	(SEQ	ID	NO : 71) :	5'
OLIGOH28	(SEQ	ID	NO:72) :	5'

-CAATCTACAATTCACAGA-3'

-TTAAGTTATTGCCATAGG-3'

-AACAAAGCTTCTACAATTCACAGATAGGA- 3’ -AACAAGATCTTAAGTTATTGCCATAGG-3'

Následovalo klonování a potvrzení sekvence DNA. Poté byl gen pro KGF použit. Amplifikace byla provedena s použitím OLIGO#29 a OLIGO#30.

OLIGO#29 (SEQ. ID. NO:73):

5' -CGGTCTAGACCACCATGCACAAATGGATACTGACATGG-3'

OLIGOH30 (SEQ. ID. N0:74):

5'-GCCGTCGACCTATTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3 ’

Příměr - OLIGO#29 - (sense primer) obsahoval místo Xbal a Kozákovu translační sekvenci (5-CCACC-3') (consensus Kozák translationn sequence) před startovacím kodonem ATG ve směru k 5' konci. Antisense primer - OLIGO&30 - obsahoval klonovací místo Sall a další sto kodon. Po 18 cyklech amplifikace PCR (30 sekund denaturace při 94 °C, 40 sekund annealing při 55 °C a 40 sekund elongace při 72 °C) byl produkt štěpen Xbal a Sall a ligován se stejně vyštěpenou DNA z pDSRa2 (podle metody Bourdrela et al. (1993), Protein Exp. and Purif, 4:130-140 a Lu et al. (1992), Arch. Biochem. Biophys. 298: 150-158). Výsledkem byl plasmid KGF/pDSRa2, v kterém byl lidský gen pro KGF umístěn mezi časný promotor SV40 a a-FSH polyadenylovou sekvenci. Byly vybrány dva klony a analýzou sekvence DNA se potvrdila konstrukce žádaného vektoru.

-23CZ 297329 B6

Dva mikrogramy DNA KGF/pDSRoc2 byly poté linearizovány s použitím PvmI. CHO buňky (Chinese hamster ovary cells) byly den před použitím vysety v množství 0,8 x 10⁶ buněk na 60 mm petriho misku. Takto připravená vajíčka byla transfekována připravenou DNA s použitím standardní metody vysrážením pomocí vápenatých a fosfátových iontů (Bourdrel et al., viz předchozí text). Po dvou týdnech byly vybrány jednotlivé kolonie a přeneseny na 24 jamkové destičky. Upravená média se po dosažení konfluence považovala za prostá séra a aliquoty byly analyzovány s využitím Western blotů a s použitím polyklonálního králičího antiséra proti lidskému KGF exprimovanému v E-coli.

Western bloty byly provedeny nanesením vzorku na 12,5 % (hm./obj.) SDS polyakrylamidové gely a následnou elektroforézou. Poté následovalo přenesení proteinů pomocí semidry elektroblotovacího zařízení (Hoefer Scientifíc Instruments, San Francisco, CA, USA) na nitrocelulózovou membránu. Přenesení probíhalo jednu hodinu při 400 mA. Jako přenosový pufr byl použit 20 mM Tris, 150 mM glycin a 20% methanol. Nitrocelulózové membrány byly blokovány inkubací v roztoku 10% normálního kozího séra v PBS. Jako primární protilátky bylo použito králičí antisérum připravené proti KGF z E-coli. Pro použití byly protilátky ředěny 1:10000 v normálním kozím séru v PBS a inkubovány 12 hodin při pokojové teplotě s blokovanými nitrocelulózovými membránami. Nenavázané protilátky byly poté odstraněny třemi třicetiminutovými promytími v PBS.

Nitrocelulózové membrány byly poté inkubovány ve 100 ml roztoku 1% normálního kozího séra v PBS obsahujícího sekundární protilátky (Vectastain biotinylované kozí protilátky proti králičímu IgG, Vector Labs, Burlingame, USA). Inkubace probíhala 30 minut při pokojové teplotě. Následovalo trojnásobné desetiminutové promytí v PBS a poté 30 minutová inkubace při pokojové teplotě s 100 ml roztoku 1% normálního kozího séra obsahujícího streptavidin a biotinylovanou peroxidázu, připravenou podle návodu výrobce (Vector Labs). Opět následovalo trojnásobné promytí v PBS. Látky křížově reagující s protilátkami proti KGF byly vizualizovány inkubací membrán ve směsi 60 μΐ 30% (hm./obj.) H₂O₂ ve 100 ml PBS a 50 mg 4-chlomafitolu ve 20 ml methanolu. Reakce byla zastavena po 10 minutách, opláchnutím membrán ve vodě.

Analýza blotů ukázala, že specifické protilátky proti KGF reagují se třemi zřetelně oddělenými proužky proteinů. Dva z nich byly blízko sebe s molekulovou hmotností okolo 25-29 kDa a jeden měl přibližnou molekulovou hmotnost 17 kDa, přičemž předpokládaná molekulová hmotnost konečného proteinu o 163 aminokyselinách byla 18,8 kDa. Několik vysoce exprimovaných klonů sekretujících více než 2,0 mg rKGF na litr (jak bylo možné odhadnout z analýzy Western blotů), bylo dále vyčleněno a přeneseno (podle metody Lu, et al., viz předchozí text) do lahví, kde byly pěstovány tak, aby výsledkem bylo velké množství média bez séra, vhodného k purifikaci KGF pomocí iontoměničové chromatografie s využitím katexu a následně gelové chromatografie podle postupu popsaného dále.

KGF bylo purifikováno ze třech litrů upraveného bezsérového média tak, že médium bylo přímo naneseno na iontoměničovou kolonu (5 x 24 cm) naplněnou 450 ml sulfoethyl SP-Sepharosy Fast Flow (Pharmacia), ekvilibrovanou 20 mM fosforečnanem sodným, pH 7,5. Po promytí kolony pětinásobným objemem kolony roztokem 20 mM fosforečnanu sodného, 0,2M NaCl, pH 7,5 byl rKGF vymyt lineárním gradientem od 0,2 do 1,0 M NaCl rozpuštěného v 20 mM fosforečnanu sodném (pH 7,5). Objem použitého roztoku se rovnal dvacetinásobku objemu kolony. Byly sbírány 50 ml frakce a byla průběžně monitorována absorbance při 280 nm. Protein KGF byl detekován analýzou částí každé frakce pomocí SDS-PAGE, SDS-PAGE byla prováděna s použitím elektroforetického systému (Novex, San Diego, CA, USA) a s použitím předpřipravených 14% Tris-glycin gelů (podle metody Laemliho (1970), Nátuře, 227:680-685). Vzorky byly smíchány s neredukujícím SDS vzorkovým pufrem bez zahřívání před nanášením. Proteiny byly detekovány barvením Coomassie blue nebo barvením stříbrem. Dva píky, které byly eluovány později, obsahovaly proteinové proužky odpovídající molekulové hmotnosti 25-29 kDa a proužek o hmotnosti 17 kDa, kteiý byl detekován Western blotem. Frakce obsahu

-24CZ 297329 B6 jící každý z těchto dvou píku byly separátně koncentrovány na objem menší než 1 ml a poté byly dále děleny gelovou filtrací.

Ke gelové filtraci byly použity kolony Superdexu-75 (HR 10/30, Pharmacia) ekvilibrované PBS o pH 7,2. Kolona byla nekalibrována s použitím následujících známých standardů molekulových vah (BioRad, San Francisco, CA, USA): thyroglobulin (670 kDa), gama-globulin (158 kDa), ovalbumin (44 kDa), myoglobin (17 kDa) a vitamín B-12 (1,4 kDa). Tyto purifikační kroky vedly k přibližně 2000 násobnému obohacení o rKGF, zvláště o 17 kDa a 30kDa proteiny, jak ukázalo barvení stříbrem.

V případě látky s vyšší molekulovou hmotností, byl rKGF eluován jako velký symetrický pík (dle absorbance při 280nm), který byl nazýván KGF-a. Jestliže bylo pomocí SDS-PAGE analyzováno menší množství látek z této frakce (3pg/linii oproti 6pg/linii) objevily se dva proužky s rozdílem molekulových vah cca 1-3kDa. V případě látek s nižší molekulovou váhou, které byly nazývány KGF-b, vedla gelová filtrace k přípravě proteinu majícího předpokládanou pohyblivost. Pro oba typy proteinů (KGF-a i KGF-b) byla celková výtěžnost purifikace asi 30 až 40%.

Dále bylo analyzováno aminokyselinové složení KGF-a i KGF-b. Tyto analýzy byly provedeny na automatickém sekvenátoru (Model 477A nebo 470A, Applied Biosystem. Inc., Foster City, CA, USA) vybaveném on-line PTH aminoanalyzátorem (Model 120A) a systémem sběru dat (Model 900A) (podle metody Lu et al., (1997), J. Biol. Chem., 266: 8102-8107). Edmanovy sekvenční analýzy KGF-a ukázaly N-terminální sekvenci Xi-N-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-AV-X2-X3-S- (SEQ ID NO:75). Minoritní sekvence začínající od třetí N-terminální aminokyseliny - kyseliny aspartamové - byly přítomny v množství 1,6% celkového sekvenovatelného proteinu. XI, X2 a X3 nebyly určeny z důvodů nepřítomnosti PTH (phenylthiohydantoinyl) aminokyselinového signálu během sekvenční analýzy.

Je zajímavé, že analýza sekvence N-terminálového konce KGF-b odhalila sekvenci S-Y-D-YM-E-G-G-D-I-R-V- (SEQ ID NO:76), naznačující, že se jedná o formu KGF zkrácenou na N-terminálovém konci, kde byl KGF proteolyticky rozštěpen v peptidové vazbě Arg²³-Ser²⁴.

K další charakterizaci purifikovaných KGF-a a KGF-b byly proteiny za použití známých technik vystaveny působení glykosidáz (neuraminidáze, O-glycanáze a/nebo N-glykanáze) (Sasaki et al. (1987), J. Biol. Chem, 262:12059-12076; Takuchi et al. (1988), J. Biol. Chem., 263:3657-3663, Zsebo et al. (1990), Cell. 63:195-201). Výsledky ukazují, že KGF-a obsahuje N- a O- vázané cukry, ačkoliv forma KGF-a s nižší molekulovou hmotností obsahuje pravděpodobně pouze N-vázané cukry. Použití glykosidáz nezpůsobilo snížení molekulové hmotnosti u KGF-b, což naznačuje, že molekula není glykosilovaná.

Glykosilace KGF-a byla dále charakterizována pomocí hmotové spektrometrie peptidů vzniklých působením endoproteasy Glu-C. Objasnění cukerné struktury glykopeptidů pomocí metody hmotové spektrometrické analýzy (stepped orifíce method) bylo s úspěchem použito na další proteiny (Huddleston et al. (1993), Anal. Chem., 65: 877-884; Carr et al. (1993). Prot. Sci., 2:183-196). Zdá se, že Thr³² je částečně glykosilovaný, což bylo potvrzením izolací neglykosylovaných peptidů. Podobná hmotová spektrometrická analýza Asn¹⁴ předpokládá mikroheterogenity v glykosilaci s bi, tri a tetra anténními strukturami, s různým stupněm sialylace.

Tabulka 3 shrnuje koncentrace KGF stimulující inkorporaci [³H]thymidinu keratinocytů právě poloviční rychlostí maximální rychlosti (podle metody Rubina et al. (1989, viz předchozí text). Interakce s receptory pro KGF byla stanovena s použitím membránové frakce obsahující receptory pro KGF. Tato frakce byla připravena z myších (Balb/MK) epidermálních keratinocytů (podle postupu popsaného Massaguem (1932), J. Biol. Chem., 258: 13614—13620). Konkrétně byly různé formy KGF zředěny 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, obsahujícím 0,2% hovězího serumalbuminu tak, aby koncentrace KGF byla v rozmezí od 0,8 ng do 100 ng na 50 μΐ. Poté byly jednotlivě inkubovány s membránovou frakcí (75 ng/ml) a KGF získaným z E-coli a značeným

-25CZ 297329 B6 ^I25I (1,5 ng). Experimenty s vazbou na receptor a kompetiční experimenty byly prováděny při 4 °C po dobu 16 hodin. Po této době byly vzorky odebrány, centrifugovány apromyty dvakrát výše uvedeným zřeďovacím pufrem. Účelem tohoto promytí bylo odstranění nenavázaného a nespecificky vázaného značeného KGF. Poté byla ve vzorcích měřena zbylá radioaktivita. Kompetiční křivky pro vazbu mezi KGF a značeným KGF byly vyneseny jako množství nevytěsněného KGF (v procentech) versus koncentrace každého vzorku KGF. Tabulka 3B shrnuje koncentrace KGF (v ng/ml) potřebné k dosažení 60% nevytěsnění proti značenému KGF (připravenému z E-coli).

Tabulka 3A

Koncentrace KGF stimulující inkorporaci [³H] thymidinu do keratinocytů při rychlosti rovnající se polovině rychlosti maximální

Formy	ng/ml
E-coli KGF	10
KGF - a	30
KGF - b	30

Tabulka 3B

Koncentrace KGF potřebné k dosažení 60% nevytěsnění proti značenému KGF získanému z E-coli.

Forma	ng/ml
KGF z E. coli	65,8
KGF-a	93,5
KGF-b	89,1

Jak je vidět v tabulce 3A KGF-a a KGF-b stimulují zabudovávání [³H] thymidinu srovnatelně přičemž koncentrace potřebná k dosažení poloviční rychlosti maximální rychlosti zabudovávání je pro oba analogy cca 30 ng/ml. Znamená to, že zkrácení molekuly nesnižuje její biologickou aktivitu. Tato dvě analoga mají přibližně třikrát nižší aktivitu než KGF získané z E-coli - KGF plné délky. Jak je vidět v tabulce 3B, kompetiční experimenty s použitím radioreceptorového testu ukazují, že KGF získané z E-coli, KGF-a a KGF-b mají podobnou vazebnou aktivitu na receptor.

Příklad 4: Biologický test in vivo KGF polypeptidů produkovaných v savčích buněčných kulturách a buněčných kulturách E. coli.

Bylo ukázáno, že jedna subkutánní dávka KGF vede u myši během čtyřiadvaceti hodin ke zvýšení koncentrace cholesterolu v séru a to v závislosti na velikosti dávky. Také nativní KGF, KGF-a, C(1,15)S, ANI5 a ΔΝ23 zvyšují sérový cholesterol v závislosti na výšce dávky.

Každá testovací skupina obsahovala pět samic Balb/c myší (18-20 gm) získaných zCRL. Proteiny byly naředěny pomocí 0,9% izotonického roztoku tak, aby výsledný injekovaný objem byl 100 μΐ na myš. Každá myš byla ošetřena jednou podkoní injekcí obsahující následující dávky:

-26CZ 297329 B6

Skupina	Injekovaná látka	Velikost dávky (mg/kg)
1	Nativní KGF	0,1
	Nativní KGF	0,25
	Nativní KGF	0,5
	Nativní KGF	1
	Nativní KGF	5
2	C(1,15)S	0,1
	C(1,15)S	0,25
	C(1,15)S	0,5
	C(l, 15) S	1
	C(1,15)S	5
3	ΔΝ15	0,25
	ΔΝ15	0,5
	ΔΝ15	1
	ΔΝ15	5
4	ΔΝ23	0,1
	ΔΝ2 3	0,5
	ΔΝ23	1
	ΔΝ23	5
5	KGF-a	0,01
	KGF-a	0,05
	KGF-a	0,1
	KGF-a	0,5
6	Kontrola (izoton. roztok)	-

Čtyřiadvacet hodin po injekci byly myši usmrceny a vykrváceny propíchnutím srdce. Ve vzorcích krve byl stanoven sérový cholesterol. Jak je vidět z obrázku 35, každý z testovaných analogů KGF měl účinek na zvýšení sérového cholesterolu v závislosti na velikosti dávky. Nebyl 5 nalezen zřejmý rozdíl v bioaktivitě mezi kterýmkoliv z testovaných analogů KGF.

In vivo model diabetů

Chemicky indukované modely diabetes mellitus v různých živočišných druzích byly klasicky používány ke studiu této nemoci a k její ošetření. Streptozotocin indukuje diabetes u myši, krysy, 10 křečka, psa a opice, ačkoliv studie používající krysy a myši jsou nejčastěji (Junod et al., Proč.

Soc. Exp. Pio. Med. 126: 210-205 (1967); Rerup, Phann. Rev. 22:485-518 (1970); Rossini et al., P:N:A:S: 74:2485-2489 (1977); Ar'Rajab and Ahren, Pancreas 8:50-57 (1993). Dávka streptozotocinu (45 až 70 mg/kg) podaná jako jedna podkožní injekce vyvolává u krys stabilní onemocnění. Dávky pod 45 mg/kg vyvolávají přechodný stav, který je vratný. Během jednoho

-27CZ 297329 B6 dne po podání streptozotocinu je indukován hyperglykemický stav. Hladina inzulínu v krvi zůstává v podstatě nezměněna v porovnání s normálními krysami, ale celkový obsah inzulínu a

C-peptidu vpankreasu je velice snížen. Krysy manifestují klasické znaky a symptomy diabetů lidí: zvýšená hladina glukózy v krvi (hyperglykémie), glukóza v moči (glukosurie), zvýšená žíznivost (polydipsie), zvýšená tvorba moči (polyurie), zvýšená chuť k jídlu (hyperphagie).

Studie popisované v tomto vynálezu byly prováděny na modelových krysách Sprague-Dawley s streptozotocinem indukovaným diabetem. Na počátku pokusu byly použity samci krys vážící 200-260 gramů. Diabetes byl indukován jedinou intravenózní injekcí streptozotocinu rozpuštěného v citrátovém pufru (sodná sůl kys. citrónové) (dávka byla 50 mg streptozotocinu na kg tělesné váhy). Zdravé kontrolní krysy byly ošetřeny jednou intravenózní injekcí pufru citrátu sodného jako kontroly. KGF byl podáván denně jako podkožní injekce. Dávka byla 3 nebo 5 mg/kg/den v závislosti na experimentu. V prvním experimentu byla terapie pomocí KGF započata dva dny před indukcí diabetů a pokračovala po indukci až do celkového množství osmi injekcí. Ve druhém a třetím experimentu byla KGF terapie (podávána podkožně) započata jeden den po indukci diabetů streptozotocinem. Ve čtvrtém experimentu byla sedmidenní KGF terapie zahájena sedm dní po aplikaci streptozotocinu a zvířata byla poté sledována dalších 12 týdnů. Ve všech experimentech s výjimkou čtvrtého experimentu byly pro analýzy určeny hladina glukózy v krvi, hladina glukózy v moči a množství moči. Navíc byly v některých experimentech sledovány příjem vody, hladina C-peptidu v moči nebo celkové množství inzulínu nebo C-peptidu v pankreasu. Ve čtvrtém experimentu byla jako jediná hodnota sledována hladina glukózy v krvi. Protože je velká frakce inzulínu odstraněna z krevního oběhu játry je měření koncentrací periferního inzulínu odrazem dějů post-hepatitického metabolismu, spíše než sekrece inzulínu z pankreasu. Proto je měření C-peptidu často děláno a používáno jako periferní markér sekrece inzulínu. C-peptid je produkován při procesu tvorby inzulínu z pro-inzulínu. Inzulín a C-peptid jsou extrahovány játry.

Tato studie se zabývala vlivem rKGF na diabetes indukovaný streptozotocinem u krys Sprague-Dawley. V den 0 byla skupina krys exponována dávce 45 nebo 50 mg/kg streptozotocinu (STZ). Po tomto zákroku byla u krys denně sledována hladina glukózy s cílem stanovit rozsah indukce diabetes. Pátý den byla zvířata ošetřená STZ rozdělena do dvou skupin v závislosti na rozsahu hyperglykemie. Dělicí bod byl stanoven na hladinu glukózy v krvi rovnající se 300 mg/dl. Skupina zvířat nevystavených působení STZ sloužila jako kontrolní. Sedmý den byla deseti zvířatům z každé hyperglykemické skupiny podána dávka ΔΝ23 (3 mg/kg/den) nebo PBS ve formě podkožní injekce. Hladina glukózy byla poté sledována denně, každý druhý den nebo týdně (výsledky jsou zobrazeny na obrázku 51). Je vidět, že u zvířat vystavených působení STZ z obou skupin signifikantně poklesla hladina glukózy po dobu podávání ΔΝ23. Je důležité, že průměrná hladina glukózy poklesla u zvířat, která měla na počátku hladiny glukózy vyšší než 300 mg/dl na stabilní hodnotu okolo 150 mg/dl, kdežto u zvířat, která měla na počátku hladinu glukózy nižší než 300 mg/dl, klesla hladina glukózy pouze přechodně. Je třeba si též všimnout, že denní rozsah není lineární.

Předkládaný vynález byl výše popsán obecně i na konkrétních příkladech. Je zřejmé, že odborníci odhalí další obměny a modifikace výše popsaných postupů.

-28CZ 297329 B6

Seznam sekvencí (1) Základní informace:

(i) Žadatel: Amgen lne.

(ii) Název vynálezu: Analoga keratinocytových růstových faktorů (iii) Počet sekvencí: 104 (iv) Korespondenční adresa:

(A) Adresát: Amgen lne.

(B) Ulice: 1840 Dehavilland Drive (C) Město: Thousand Oaks (D) Stát: Califomia (E) Země: U.S.A.

(F) ZIP: 91320-1789 (v) Forma vhodná pro počítačové zpracování (A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (vi) Současné údaje o žádosti (A) Číslo žádosti: PCT/IB95/00971 (B) Datum registrace: 12. 10. 1995 (C) Klasifikace:

(vii) Předchozí údaje z žádosti (A) Číslo žádosti: 08,487,825 (B) Datum registrace: 7. 6. 1995 (C) Klasifikace:

(vii) Předchozí údaje o žádosti (A) Číslo žádosti: 08/323,475 (B) Datum registrace: 13. 10. 1994 (C) Klasifikace:

(vii) Předchozí údaje o žádosti (A) Číslo žádosti: 08/323,340 (B) Datum registrace: 13. 10. 1994 (C) Klasifikace:

(viii) Právní zástupce/zástupce pro informace (A) Jméno: Zindrick, Thomas D.

(B) Registrační číslo: 32,185 (C) Číslo spisu: A-315

-29CZ 297329 B6

Informace o SEQ ID NO:1:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 862 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

CAATCTACAA	TTCACAGATA	GGAAGAGGTC	AATGACCTAG	GAGTAACAAT	CAACTCAAGA	60
TTCATTTTCA	TTATGTTATT	CATGAACACC	CGGAGCACTA	CACTATAATG	CACAAATGGA	120
TACTGACATG	GATCCTGCCA	ACTTTGCTCT	ACAGATCATG	CTTTCACATT	ATCTGTCTAG	íao
TGGGTACTAT	ATCTTTAGCT	TGCAATGACA	TGACTCCAGA	GCAAATGGCT	ACAAATGTGA	240
ACTGTTCCAG	CCCTGAGCGA	CACACAAGAA	GTIATGATTA	CATGGAAGGA	GGGGAÍATAA	300
GAGTGAGAAG	ACTCTTCTGT	CGAACACAGT	GGTACCTGAG	GATCGATAAA	AGAGGCAAAG	350
TAAAAGGGAC	CCAAGAGATG	AAGAATAATT	ACAATATCAT	GGAAATCAGG	ACAGTGGCAG	420
TTGGAATTGT	GGCAATCAAA	GGGGTGGAAA	GTGAATTCTA	TCTTGCAATG	AACAAGGAAG	480
GAAAACTCTA	TGCAAAGAAA	GAATGCAATG	AAGATTGTAA	CTTCAAAGAA	CTAATTCTGG	540
AAAACCATTA	CAACACATAT	GCATCAGCTA	AATGGACACA	CAACGGAGGG	GAAATGTTTG	600
TTGCCTTAAA	TCAAAAGGGG	ATTCCTGTAA	GAGGAAAAAA	AACGAAGAAA	GAACAAAAAA	660
CAGCCCACTT	TCTTCCTATG	GCAATAACTT	AATTGCATAT	GGTATATAAA	GAACCCAGTT	720
CCAGCAGGGX	GATTTCTTTA	AGTGGACTGT	TTTCTTTCTT	CTCAAAATTT	TCTTTCCTTT	780
TATTTTTTAG	TAATCAAGAA	AGGCTGGAAA	AACTACTGAA	AAACTGATCA	AGCTGGACTT	840
GTGCATTTAT	GTTTGTTTTA	AG				862

(2) Informace o SEQ ID NO:2:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 194 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:2:

-30CZ 297329 B6

Met 1

His Lys Trp

Ile Leu 5

Thr Trp

Ile

Leu 10

Pro Thr Leu Leu

Tyr Arg 15

Ser

Cys

Phe

His

Ile

Cys

Leu

Val

Gly

Thr

Ile

Ser

Leu

Ala

Cys

20

25

30

Asn

Asp

Met

Thr

Pro

Glu

Gin

Met

Ala

Thr

Asn

Val

Asn

Cys

Ser

35

40

45

Pro

Glu

Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly Gly

Asp

Ile

50

55

60

Arg

Val

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

65

70

75

80

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn^-

Asn

Tyr

Asn

85

90

95

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

100

105

110

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

115

120

125

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

130

135

140

Glu

Asn

HiS

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

145

150

155

160

Gly

Glu

Met

Phe

v*l

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

165

170

175

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

180 185 190

Ile Thr (2) Informace o SEQ ID NO:3:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 595 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá io (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:3:

ATCGATTTGA	TTCTAGAAGG	AGGAATAACA	TATGAAAAAG	CGCGCACGTG	CTATCGCCAT	60
TGCTGTGGCT	CTGGCAGGTT	TCGCAACTAG	TGCACACGCG	TGCAATGACA	TGACTCCAGA	120
GCAAATGGCT	ACAAATGTGA	ACTGTTCCAG	CCCTGAGCGA	CACACAAGAA	GTTATGATTA	180
CATGGAAGGA	GGGGATATAA	GAGTGAGAAG	ACTCTTCTGT	CGAACACAGT	GGTACCTGAG	240
GATCGATAAA	AGA.GGCAAAG	TAAAAGGGAC	CCAAGAGATG	AAGAATAATT	ACAATATCAT	300
GGAAATCAGG	ACAGTGGCAG	TTGGAATTGT	GGCAATCAAA	GGGGTGGAAA	GTGAATTCTA	360
TCTTGCAATG	AACAAGGAAG	GAAAACTCTA	TGCAAAGAAA	GAATGCAATG	AAGATTGTAA	420
CTTCAAAGAA	CTAATTCTGG	AAAACCATTA	CAACACATAT	GCATCAGCTA	AATGGACACA	490
CAACGGAGGG	GAAATGTTTG	TTGCCTTAAA	TCAAAAGGGG	ATTCCTGTAA	GAGGAAAAAA	540
AACGAAGAAA	GAACAAAAAA	CAGCCCACTT	TCTTCCTATG	GCAATAACTT	AATAG	595

(2) Informace o SEQ ID NO:4:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 186 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:4:

Met 1

Lys

Arg

Ala S

Arg

Ala

Ile

Ala

Ile 10

Ala

val

Ala

Leu

Ala 15

Gly

Phe

Ala

Thr

Ser

Ala

His

Ala

Cys

Asn

Asp

Met

Thr

Pro

Glu

Gin

Met

20

2 5

30

Ais

Thr

Asn

Val

Asn

Cys

Ser

P ro

Glu

Arg

His

Thr

Axg

Sex

Tyr

35

4 0

45

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

Asp

Ile

Arg

Val

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

50

55

60

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

65

70

75

80

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

85

90

95

val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

100

105

110

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

115

120

125

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

130

135

140

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

145

150

155

160

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

165

170

175

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

íao

185

-32CZ 297329 B6 (2) Informace o SEQ ID NO:5:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 499 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:5:

TATGTGCAAT	GACATGACTC	CAGAGCAAAT	GGCTACAAAT	GTGAACTGTT	CCAGCCCTGA	60
GCGACACACA	AGAAGTTATG	ATTACATGGA	AGGAGGGGAT	ATAAGAGTGA	GAAGACTCTT	120
CTGTCGAACA	CAGTGGTACC	TGAGGATCGA	TAAAAGAGGC	AAAGTAAAAG	GGACCCAAGA	180
GATGAAGAAT	AATTACAATA	TCATGGAAAT	CAGGACAGTG	GCAGTTGGAA	TTGTGGCAAT	240
CAAAGGGGTG	GAAAGTGAAT	TCTATCTTGC	AATGAACAAG	GAAGGAAAAC	TCTATGCAAA	300
gaaagaatgc	AATGAAGATT	GTAACTTCAA	AGAACTAATT	CTGGAAAACC	ATTACAACAC	360
atatgcatca	GCTAAATGGA	CACACAACGG	AGGGGAAATG	TTTGTTGCCT	TAAATCAAAA	420
GGGGATTCCT	GTAAGAGGAA	AAAAAACGAA	GAAAGAACAA	AAAACAGCCC	ACTTTCTTCC	480
TATGGCAATA	ACTTAATAG					499

(2) Informace o SEQ ID NO:6:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 164 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:6:

-33 CZ 297329 B6

Met

Cys

Asn

Asp

Met

Thr

Pro

Glu

Gin

Met

Ala

Thr

Asn

Val

Asn

Cys

1

5

10

15

Ser

Pro

Glu

Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

20

25

30

Asp

Ile

Arg

Val

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

35

40

45

ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

50

55

60

Tyr

Asn

Zle

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

65

70

75

80

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

85

90

95

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

100

105

110

ile

Leu

Glu

Asn

HiS

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

115

120

125

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

130

135

140

Arg

Gly

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

. Pro

145

150

155

160

Met

Ala

Ile

Thr

(2) Informace o SEQ ID NO:7:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 25 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:7:

CAATGACCTA GGAGTAACAA TCAAC (2) Informace o SEQ ID NO:8:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 26 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:8:

AAAACAAACA TAAATGCACA AGTCCA (2) Informace o SEQ ID NO:9:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 26 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:9:

ACAACGCGTG CAATGACATG ACTCCA 25 (2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 31 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

ACAGGATCCT ATTAAGTTAT TGCCATAGGA A (2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 27 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

ACACATATGT GCAATGACAT GACTCCA 27

-35CZ 297329 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 37 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

CTGCGTATCG ACAAACGCGG CAAAGTCAAG GC-CACCC (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 44 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

AAGAGATGAA AAACAACTAC aatattatgg aaatccgtac tgtt (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 37 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:

GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT GAATCTG 37 (2) Informace o SEQ ID NO: 15:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 45 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA

-36CZ 297329 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

TCTTGGGTGC CCTTGACTTT GCCGCGTTTG TCGATACGCA GGTAC (2) Informace o SEQ ID NO: 16:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 45 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

ACAGCAACAG TACGGATTTC CATAATATTG TAGTTGTTTT TCATC (2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 36 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

AATTCAGATT CAACACCTTT GATTGCAACG ATACCA (2) Informace o SEQ ID NO: 18:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

AGTTTTGATC TAGAAGGAGG (2) Informace o SEQ ID NO: 19:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází

-37CZ 297329 B6 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

TCAAAACTGG ATCCTATTAA (2) Informace o SEQ ID NO:20:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 91 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:20:

AGTTTTGATC TAGAAGGAGG AATAACATAT GTGCAACGAC ATGACICCGG AACAGATGGC

TACCAACGTT AACTGCTCCA GCCCGGAACG T (2) Informace o SEQ ID NO:21:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 90 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:21:

CACACCCGTA GCTACGACTA CATGGAAGGT GGTGACATCC GTGTTCGTCG TCTGTTCTGC 60

CG7ACCCAG7 GGTACCTGCG TATCGACAAA 90 (2) Informace o SEQ ID NO:22:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 90 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA

-38CZ 297329 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:22:

CGTGGTAAAG 7TAAAGGTAC CCAGGAAATG AAAAACAACT ACAACATCAT GGAAATCCGT 60

ACTGTTGCTG TTGGTATCGT TGCAATCAAA 90 (2) Informace o SEQ ID NO:23:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 90 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:23:

GGTGTTGAAT CTGAATTCTA CCTGGCAATG AACAAAGAAG GTAAACTGTA CGCAAAAAAA

GAATGCAACG XAGACTGCAA CTTCAAAGAA (2) Informace o SEQ ID NO:24:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 90 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:24:

CTGATCCTGG AAAACCACTA CAACACCTAC GCATCTGCTA AATGGACCCA CAACGGTGGT

GAAATGTTCG TTGCTCTGAA CCAGAAAGGT (2) Informace o SEQ ID NO:25:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 88 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:25:

-39CZ 297329 B6

ATCCCGGTTC GTGGTAAAAA AACCAAAAAA GAACAGAAAA CCGCTCACTT CCTGCCGATG 60

GCAATCACTT AATAGGATCC AGTTTTGA (2) Informace o SEQ ID NO:26:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:26:

TACGGGTGTG ACGTTCCGGG (2) Informace o SEQ ID NO:27:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:27:

CTTTACCACG TTTGTCGATA 20 (2) Informace o SEQ ID NO:28:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:28:

ATTCAACACC TTTGATTGCA (2) Informace o SEQ ID NO:29:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina

-40CZ 297329 B6 (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:29:

CCAGGATCAG TTCTTTGAAG (2) Informace o SEQ ID NO:30:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:30:

GAACCGGGAT ACCTTTCTGG (2) Informace o SEQ ID NO:31:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 495 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:31:

ATGTCTAATG	ATATGACTCC	GGAACAGATG	GCTACCAACG	TTAACTCCTC	CTCCCCGGAA	60
CGTCACACGC	GTTCCTACGA	CTACATGGAA	GGTGGTGACA	TCCGCGTACG	TCGTCTGTTC	120
TGCCGTACCC	AGTGGTACCT	GCGTATCGAC	AAACGCGGCA	AAGTCAAGGG	CACCCAAGAG	180
ATGAAAAACA	ACTACAATAT	TATGGAAATC	CGTACTGTTG	CTGTTGGTAT	CGTTGCAATC	240
AAAGGTGTTG	AATCTGAATT	CTACGTGGCA	ATGAACAAAG	AAGGTAAACT	GTACGCAAAA	300
AAAGAATGCA	ACGAAGACTG	CAACTTCAAA	GAACTGATCC	TGGAAAACCA	CTACAACACC	360
ACGCATCTG	CTAAATGGAC	CCACAACGGT	GGTGAAATGT	TCGTTGCTCT	GAACCAGAAA	420
GGTATCCCGG	TTCGTGGTAA	AAAAACCAAA	AAAGAACAGA	AAACCGCTCA	CTTCCTGCCG	480
ATGGCAATCA	CTTAA					495

-41 CZ 297329 B6 (2) Informace o SEQ ID NO:32:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 164 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:32:

Met 1

Ser Asn

Asp

Met 5

Thr Pro

Glu Gin Met Ala Thr 10

Asn

Val

Asn 15

Ser

Set

Ser

Pro

Glu

Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

20

25

30

Asp

Ile

Arg

Val

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr ‘

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

35

40

45

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

50

55

60

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

ile

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

65

70

75

80

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

85

90

95

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

100

1G5

110

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

115

120

125

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

130

135

140

Arg

Gly

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

145

150

155

160

Met

Ala

Ile

Thr

(2) Informace o SEQ ID NO:33:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 483 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:33:

-42CZ 297329 B6

ATGACTCCGG	AACAGATGGC	TACCAACGTT	AACTCCTCCT	CCCCGGAACG	TCACACGCGT	60
TCCTACGACT	ACATGGAAGG	TGGTGACATC	CGCGTACGTC	GTCTGTTCTG	CCGTACCCAG	120
TGGTACCTGC	GTATCGACAA	ACGCGGCAAA	GTCAAGGGCA	CCCAAGAGAT	GAAAAACAAC	190
TAQAATATTA	TGGAAATCCG	TACTGTTGCT	GTTGGTATCG	TTGCAATCAA	aggtgttgaa	240
TCTGAATTCT	ACCTGGCAAT	GAACAAAGAA	GGTAAAČTGT	ACGCAAAAAA	AGAATGCAAC	300
GAAGAGTGCA	ACTTCAAAGA	ACTGATCCTG	GAAAACCACT	ACAACACCTA	CGCATCTGCT	360
aaatggaccc	ACAACGGTGG	TGAAATGTTC	GTTGCTCTGA	ACCAGAAAGG	TATCCCGGTT	420
CGTGGTAAAA	AAACCAAAAA	AGAACAGAAA	ACCGCTCACT	TCCTGCCGAT	GGCAATCACT	480

TAA

483 (2) Informace o SEQ ID NO:34:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 160 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina ío (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:34:

Het

Thr

Pro

Glu

Gin

Met

Ala

Thr Asn

Val

Asn

Ser

Pro

Glu

1

5

10

15

Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr Met

Glu

Gly

Asp

Ile

Arg

Val

20

25

30

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

35

40

45

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

50

55

60

Glu

11·

Arg

Thr

val

Ala

Val

Gly Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

65

70

75

80

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

85

90

95

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

100

105

110

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

115

120

125

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

130

135

140

Ťhr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

145

150

155

160

(2) Informace o SEQ ID NO:35:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 480 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:35:

atgactccgg	AACAGATGGC	TACCAACGTT	AACTCTTCTC	CTGAACGTCA	TACGCGTTCC	60
TACGACTACA	TGGAAGGTGG	TGACATCCGC	GTACGTCGTC	TGTTCTGCCG	TACCCAGTGG	120
TACCTGCGTA	TCGACAAACG	CGGCAAAGTC	AAGGGCACCC	AAGAGATGAA	AAACAACTAC	180
AATATTATGG	AAATCCGTAC	TGTTGCTGTT	GGTATCGTTG	CAATCAAAGG	TGTTGAATCT	2 40
GAATTCTACC	TGGCAATGAA	CAAAGAAGGT	AAACTGTACG	CAAAAAAAGA	ATGCAACGAA	20C
GACTGCAACT	TCAAAGAACT	GATCCTGGAA	AACCACTACA	ACACCTACGC	ATCTGCTAAA	3 60
TGGACCCACA	ACGGTGGTGA	AATGTTCGTT	GCTCTGAACC	AGAAAGGTAT	CCCGGTTCGT	420
GGTAAAAAAA	CCAAAAAAGA	ACAGAAAACC	GCTCACTTCC	TGCCGATGGC	AATCACTTAA	480

(2) Informace o SEQ ID NO:36:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 159 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:36:

Met

Thr

Pro

Glu

Gin

Met

Ala

Thr Asn

Val

Asn

Ser

Ser Pro

Glu

Arg

1

5

10

15

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met Glu

Gly

Asp

Ile Arg

Val

Arg

20

25

30

-44CZ 297329 B6

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

35

40

45

LyS

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

50

55

60

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

65

70

75

80

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

85

90

95

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

100

105

110

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

115

120

125

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Thr

130

135

140

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

145 150 155 (2) Informace o SEQ ID NO:37:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 486 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá o

(ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:37:

ATGGCTACTA ATGTTAACTC CTCTTCTCCT GAACGTCATA CGCGTTCCTA CGACTACATG 60 GAAGGTGGTG ACATCCGCGT ACGTCGTCTG TTCTGCCGTA CCCAGTGGTA CCTGCGTATC 120 GACAAACGCG GCAAAGTCAA GGGCACCCAA GAGATGAAAA ACAACTACAA TATTATGGAA 180 ATCCGTACTG TTGCTGTTGG TATCGTTGCA ATCAAAGGTG TTGAATCTGA ATTCTACCTG 240 GCAATGAACA AAGAAGGTAA ACTGTACGCA AAAAAAGAAT GCAACGAAGA CTGCAACTTC 300 AAAGAACTGA TCCTGGAAAA CCACTACAAC ACCTACGCAT CTGCTAAATG GACCCACAAC 360 GGTGGTGAAA TGTTCGTTGC TCTGAACCAG AAAGGTATCC CGGTTCGTGG TAAAAAAACC 420 AAAAAAGAAC AGAAAACCGC TCACTTCCTG CCGATGGCAA TCACTTAA ⁴⁶⁸ (2) Informace o SEQ ID NO:38:

(i) Charakteristika sekvence

-45CZ 297329 B6 (A) Délka: 155 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:38:

Met Ala Thr 1

Asn

Val Asn Ser Ser Ser Pro

Glu

Arg His

Thr

Arg 15

Ser

5

10

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

Asp

Tle

Arg

Val

Arg

Leu

Phe

Cys

20

25

30

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Tle

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

35

40

45

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

50

55

60

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Tle

Lys

Gly

val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

65

70

75

30

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

85

90

95

Aap

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Tle

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

100.

105

110

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

115

120

125

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

130

135

140

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Tle

Thr

145 150 155 (2) Informace o SEQ ID NO:39:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 465 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:39:

-46CZ 297329 B6

ATGGCTACTA	ATGTTAACTC	TTCTCCTGAA	CGTCATACGC	GTTCCTACGA	CTACATGGAA	60
GGTGGTGACA	TCCGCGTACG	TCGTCTGTTC	TGCCGTACCC	AGTGGTACCT	GCGTATCGAC	120
AAACGCGGCA	AAGTCAAGGG	CACCCAAGAG	ATGAAAAACA	ACTACAATAT	tatggaaatc	180
CGTACTGTTG	CTGTTGGTAT	CGTTGCAATC	AAAGGTGTTG	AATCTGAA1T	CTACCTGGCA	240
ATGAACAAAG	AAGGTAAACT	GTACGCAAAA	AAAGAATGCA	ACGAAGACTG	CAACTTCAAA	300
GAACTGATCC	TGGAAAACCA	CTACAACACC	TACGCATCTG	CTAAATGGAC	CCACAACGGT	360
GGTGAAATGT	TCGTTGCTCT	GAACCAGAAA	GGTATCCCGG	TTCGTGGTAA	AAAAACCAAA	420
AAAGAACAGA	aaaccgctca	CTTCCTGCCG	ATGGCAATCA	CTTAA		4 6 5

(2) Informace o SEQ ID NO:40:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 154 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá o

(ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ IDNQ:40:

Met Al* Thr 1

Asn

Val Asn Ser Ser Pro Glu

Arg

His Thr

Arg

Ser 15

Tyr

5

10

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

Asp

Ile

Arg

Val

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

20

25

30

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

35

40

45

Gin

Glu

Mat

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

50

55

60

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

65

70

75

80

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

85

90

95

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

100

105

110

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

115

120

125

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

130

135

140

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

145 150

-47CZ 297329 B6 (2) Informace o SEQ ID NO:41:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 450 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:41:

ATGTCTTCTC CTGAACGTCA TACGCGTTCC TACGACTACA TGGAAGGTGG TGACATCCGC	60
GTACGTCGTC TGTTCTGCCG TACCCAGTGG TACCTGCGTA TCGACAAACG CGGCAAAGTC	120
AAGGGCACCC AAGAGATGAA AAACAACTAC AATATTATGG AAATCCGTAC TGTTGCTGTT	180
GGTATCGTTG CAATCAAAGG TGTTGAATCT GAATTCTACC TGGCAATGAA CAAAGAAGGT	240
AAACTGTACG CAAAAAAAGA ATGCAACGAA GACTGCAACT TCAAAGAACT GATCCTGGAA	300
AACCACTACA ACACCTACGC ATCTGCTAAA TGGACCCACA ACGGTGGTGA AATGTTCGTT	360
GCTCTGAACC AGAAAGGTAT CCCGGTTCGT GGTAAAAAAA CCAAAAAAGA ACAGAAAACC	420
GCTCACTTCC TGCCGATGGC AATCACTTAA	450

(2) Informace o SEQ ID NO:42:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 149 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:42:

-48CZ 297329 B6

Met 1

Ser

Ser Pro

Glu Arg His 5

Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly

10

15

Gly

Asp

Ile Arg 20

Val

Arg

Leu

Phe 25

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp 30

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp Lys 35

Arg

Gly

Lys

Val 40

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu 45

Mec

Lys

Asn

Tyr 50

Asn Ile

Met

Glu

Ile 55

Arg

Thr

Val

Ala

Val 60

Gly

Ile

Val

Ala

Ile 65

Lys

Gly val

Glu

Ser 70

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala 75

Met

Asn

Lys

Glu

Gly 80

Lys

Leu

Tyr Ala

Lys 85

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu 90

Asp Cys

Asn

Phe

Lys 95

Glu

Leu

Ile

Leu Glu 100

Asn

His

Tyr

Asn

Thr 105

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys 110

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly 115

Glu

Met

Phe

Val 120

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys 125

Gly

Ile

Pro

Val

Arg Gly Lys 130

Lys

Thr

Lys 135

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr 140

Ala

His

Phe

Leu

Pro Met Ala Ile Thr

145 (2) Informace o SEQ ID NO:43:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 447 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá o

(ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:43:

ATGTCTCCTG	AACGTCATAC	GCGTTCCTAC	GACTACATGG	AAGGTGGTGA	CATCCGCGTA	60
CGTCGTCTGT	TCTGCCGTAC	CCAGTGGTAC	CTGCGTATCG	ACAAACGGGG	CAAAGTCAAG	120
GGCACCCAAG	AGATGAAAAA	CAACTACAAT	ATTATGGAAA	TCCGTACTGT	TGCTGTTGGT	180
ATCGTTGCAA	TCAAAGGTGT	TGAATCTGAA	TTCTACCTGG	CAATGAACAA	AGAAGGTAAA	240
CTGTACGCAA	AAAAAGAATG	CAACGAAGAC	TGCAACTTCA	AAGAACTGAT	CCTGGAAAAC	300
CACTACAACA	CCTACGCATC	TGCTAAATGG	ACCCACAACG	GTGGTGAAAT	GTTCGTTGCT	360
CTGAACCAGA	AAGGTATCGC	GGTTCGTGGT	AAAAAAACCA	AAAAAGAACA	GAAAACCGCT	420
CACTTCCTGC	CGATGGCAAT	CACTTAA				447

-49CZ 297329 B6 (2) Informace o SEQ ID NO:44:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 148 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:44:

Met

Ser

Pro

Glu

Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

ASp

Tyr

Met

Glu

Gly Gly

1

5

10

15

Asp

11·

Arg

Val

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu .

Arg

20

25

30

Ila

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

35

40

45

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

50

55

60

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

65

70

75

80

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

85

90

95

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

100

105

110

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

115

120

125

Arg

Gly

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

130

135

140

Met Ala Ile Thr

L45 (2) Informace o SEQ ID NO:45:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 444 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:45:

-50CZ 297329 B6

ATGCCTGAAC GTCATACGCG TTCCTACGAC TACATGGAAG GTGGTGACAT CCGCGTACGT 60 CGTCTGTTCT GCCGTACCCA GTGGTACCTG cgtatcgaca aacgcggcaa AGTCAAGGGC 120 ACCCAAGAGA 7GAAAAACAA CTACAATATT ATGGAAATCC GTACTGTTGC TGTTGGTATC 180 GTTGCAATCA AAGGTGTTGA ATCTGAATTC TACCTGGCAA TGAACAAAGA AGGTAAACTG 240 TACGCAAAAA AAGAATGCAA CGAAGACTGC AACTTCAAAG AACTGATCCT GGAAAACCAC 300 TACAACACCT ACGCATCTGC TAAATGGACC CACAACGGTG GTGAAATGTT CGTTGCTCTG 350 AACCAGAMU3 GTATCCCGGT TCGTGGTAAA AAAACCAAAA AAGAACAGAA AACCGCTCAC 420 TTCCTGCCGA TGGCAATCAC TTAA 444 (2) Informace o SEQ ID NO:46:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 147 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:46:

Met

Pro

Glu

Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

Asp

1

5

10

15

ile

Arg

Val

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

20

25

30

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

35

40

45

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

ile

Val

Ala

Ile

Lys

50

55

60

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

65

70

75

80

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

as

90

95

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

100

105

110

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

115

120

125

Gly

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

130 135 140

Ala Zle Thr

145

-51 CZ 297329 B6

Met Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile

10 15

Arg

Val

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

20

25

30

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

35

40

45

Ile

Hec

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

50

55

60

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

65

70

75

80

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

85

90

95

Glu

Asn

HiS

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His Asn

Gly

100

105

110

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

A s

Gin

Lys

Gly

ile

Pro

Val Arg

Gly

115

120

125

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro Met

Ala

130

135

140

Ile Thr

145 (2) Informace o SEQ ID NO:49:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 438 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá o

(ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:49:

ATGCGTCATA CGCGTTCCTA CGACTACATG GAAGGTGGTG ACATCCGCGT ACGTCGTCTG	60
TTCTGCCGTA CCCAGTGGTA CCTGCGTATC GACAAACGCG GCAAAGTCAA GGGCACCCAA	120
GAGATGAAAA ACAACTACAA TATTATGGAA ATCCGTACTG TTGCTGTTGG TATCGTTGCA	18 0
ATCAAAGGTG TTGAATCTGA ATTCTACCTG GCAATGAACA AAGAAGGTAA ACTGTACGCA	240
AAAAAAGAAT GCAACGAAGA CTGCAACTTC AAAGAACTGA TCCTGGAAAA CCACTACAAC	300
ACCTACGCAT CTGCTAAATG GACCCACAAC GGTGGTGAAA TGTTCGTTGC TCTGAACCAG	360
AAAGGTATCC CGGTTCGTGG TAAAAAAACC AAAAAAGAAC AGAAAACCGC TCACTTCCTG	420
CCGATGGCAA TCACTTAA	438

-53 CZ 297329 B6 (2) Informace o SEQ ID NO:50:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 145 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NQ:50:

Met

Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

ASp

Tyr

Met

Glu

Gly

Asp

Ile

Arg

1

5

10

15

Val

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

20

25

30

Arg

Gly

Lys

val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ile

35

40

45

Met

Glu

ile

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

50

55

60

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

65

70

75

80

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

95

90

95

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

100

105

110

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

115

120

125

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

130

135

140

Thr

145

(2) Informace o SEQ ID NO:51:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 435 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:51:

-54CZ 297329 B6

ATGCATACTC	GTTCCTACGA	CTACATGGAA	GGTGGTGACA	TCCGCGTACG	TCGTCTGTTC	60
TGCCGTACCC	AGTGGTACCT	GCGTATCGAC	AAACGCGGCA	AAGTCAAGGG	CACCCAAGAG	320
ATGAAAAACA	ACTACAATAT	TATGGAAATC	CGTACTGTTG	CTGTTGGTAT	CGTTGCAATC	180
aaaggtgttg	AATCTGAATT	CTACCTGGCA	ATGAACAAAG	AAGGTAAACT	GTACGCAAAA	240
aaagaatgca	ACGAAGACTG	CAACTTCAAA	GAACTGATCC	TGGAAAACCA	CTACAACACC	300
ťacgcatctg	CTAAATGGAC	CCACAACGGT	GGTGAAATGT	TCGTTGCTCT	GAACCAGAAA	3 6 0
GGTATCCCGG	TTCGTGGTAA	aaaaaccaaa	AAAGAACAGA	AAACCGCTCA	CTTCCTGCCG	420

ATGGCAATCA CTTAA 435 (2) Informace o SEQ ID NO:52:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 144 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:52:

Met

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly ¹

Gly

Asp

lle ,

Arg Val

1

5

10

15

Arg

Leu

Ph·

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

lle

Asp

Lys Arg

20

25

30

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

116 i

Met

35

40

45

Glu

lle

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

lle

Val

Ala

11·

Lys

Gly

Val

Glu

50

55

60

Ser

Glu

Ph·

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

L«u

Tyr

Ala

Lys

65

70

75

80

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

lle

Leu

Glu

Asn

85

90

95

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

100

105

110

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

lle

Pro

Val

. Arg

¹ Gly

Lys

115

120

125

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

' Ala

His

Phe

i Leu

i Pro Met

, Ala lle

. Thr

130 135 140 (2) Informace o SEQ ID NO:53:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 432 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:53:

ATGACTCGTT CCTACGACTA CATGGAAGGT GGTGACATCC GCGTACGTCG TCTGTTCTGC	60
CGTACCCAGT GGTACCTGCG TATCGACAAA CGCGGCAAAG TCAAGGGCAC CCAAGAGATG	120
AAAAACAACT ACAATATTAT GGAAATCCGT ACTGTTGCTG TTGGTATCGT TGCAATCAAA	180
GGTGTTGAAT CTGAATTCTA CCTGGCAATG AACAAAGAAG GTAAACTGTA CGCAAAAAAA	240
GAATGCAACG AAGACTGCAA CTTCAAAGAA CTGATCCTGG AAAACCACTA CAACACCTAC	300
GCATCTGCTA AATGGACCCA CAACGGTGGT GAAATGTTCG TTGCTCTGAA CCAGAAAGGT	360
ATCCCGGTTC GTGGTAAAAA AACCAAAAAA GAACAGAAAA CCGCTCACTT CCTGCCGATG	420
GCAATCACTT AA	432

(2) Informace o SEQ ID NO:54:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 143 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:54:

Met Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg 15 10 15

Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Tle Asp Lys Arg Gly 20 25 30

-56CZ 297329 B6

Lys Val Lys Gly Thr

Gin

Glu Met 40

Lys

Asn Asn Tyr

Asn 45

Ile

Met

Glu

35

ile

Arg

Thr

val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

50

55

60

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

65

70

75

80

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

05

90

95

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly

Glu

Met

100

105

110

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Thr

115

120

125

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

(2) Informace o SEQ ID NO:55:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 429 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQIDNO:55:

ATGCGTTCCT ACGACTACAT GGAAGGTGGT GACATCCGCG TACGTCGTCT GTTCTGCCGT 60 ACCCAGTGGT ACCTGCGTAT CGACAAACGC GGCAAAGTCA AGGGCACCCA AGAGATGAAA 120 AACAACTACA ATATTATGGA AATCCGTACT GTTGCTGTTG GTATCGTTGC AATCAAAGGT 180 GTTGAATCTG AATTCTACCT GGCAATGAAC AAAGAAGGTA XACTGTACGC AAAAAAAGAA 240 TGCAACGAAG ACTGCAACTT CAAAGAACTG ATCCTGGAAA ACCACTACAA CACCTACGCA 300 TCTGCfAAAT GGACCCACAA CGGTGGTGAA ATGTTCG7TG CTCTGAACCA GAAAGGTATC 360 CCGGTTCGTG GTAAAAAAAC CAAAAAAGAA CAGAAAACCG CTCACTTCCT GCCGATGGCA 420 ATCACTTAA 429 (2) Informace o SEQ ID NO:56:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 142 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá

-57CZ 297329 B6 (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:56:

Met Arq Ser 1

Tyr

Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg

5

10

15

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

20

25

30

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

35

40

45

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

50

55

60

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

65

70

75

ao

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

05

90

95

Asn

Thr

Tyr

Al*

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

100

105

110

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Lys

Glu

Gin

Lya

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

(2) Informace o SEQ ID NO:57:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází ίο (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA

J5 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:57:

-58CZ 297329 B6

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC SO CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCG 360 GTTCGTGGTA AAAAAACCAA AAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426 (2) Informace o SEQ ID NO:58:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá o

(ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:58:

Met

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

Asp

Ile

Arg

Val

Arg

Leu

1

5

10

15

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Zla

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Giu

Leu

11«

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

95

9C

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

-59CZ 297329 B6 (2) Informace o SEQ ID NO:59:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 423 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:59:

ATGTACGACT ACATGGAAGG TGGTGACATC CGCGTACGTC GTCTGTTCTG CCGTACCCAG 60 TGGTACCTGC GTATCGACAA ACGCGGCAAA GTCAAGGGCA CCCAAGAGAT GAAAAACAAC 120 TACAATATTA TGGAAATCCG TACTGTTGCT GTTGGTATCG TTGCAATCAA AGGTGTTGAA 130 TCTGAATTCT ACCTGGCAAT GAACAAAGAA GGTAAACTGT ACGCAAAAAA AGAATGCAAC 240 GAAGACTGCA ACTTCAAAGA ACTGATCCTG GAAAACCACT ACAACACCTA CGCATCTGCT 300 AAATGGACCC ACAACGGTGG TGAAATGTTC GTTGCTCTGA ACCAGAAAGG TATCCCGGTT 3 60 CGTGGTAAAA AAACCAAAAA AGAACAGAAA ACCGCTCACT TCCTGCCGAT GGCAATCACT 420 TAA 423 (2) Informace o SEQ ID NO:60:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 140 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:60:

-60CZ 297329 B6

Met Tyr Asp 1

Tyr

Met Glu Gly Gly 5

Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe

10

15

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg Gly

Lys

val

Lys

20

25

30

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

ile

Met

Glu

Ila

Arg

Thr

35

40

45

Val

Ala

Val

Gly

Ile

val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

50

55

60

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

65

70

75

80

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

85

90

95

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

100

105

110

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Thr

Lys

Glu

115

L20

125

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

(2) Informace o SEQ ID NO:61:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 495 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý ίο (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:61:

ATGTCTAATG ATATGACTCC GGAACAGATG GCTACCAACG TTAACTCCTC CTCCCCGGAA60

CGTCACACGC GTTCCTACGA CTACATGGAA GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC120

TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG'-31

ATGAAAAACA ACTACAATAT TATGGAAATC CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC240

-61 CZ 297329 B6

aaaggtgttg	AATCTGAATT	CTATCTTGCA	ATGAACAAGG	AAGGAAAACT	CTATGCAAAG	300
AAAGAATGCA	ATGAAGATTG	TAACTTCAAA	GAACTAATTC	TGGAAAACCA	TTACAACACA	350
TATGCATCTG	CTAAATGGAC	CCACAACGGT	GGTGAAATGT	TCGTTGCTCT	GAACCAGAAA	420
GGTATCCCTG	TTGAAGGTAA	GAAAACCAAG	AAAGAACAGA	AAACCGCTCA	CTTCCTGCCG	480
ATGGCAATCA	CTTAA					495

(2) Informace o SEQ ID NO:62:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 164 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá o

(ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:62:

Met

Ser

Asn

Asp

Met

Thr

Pro

Glu

Gin

Met

Ala

Thr

Asn

Val

Asn

Ser

1

5

10

15

Ser

Pro

Glu

Arg His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

20

25

30

Asp

Ile

Arg

Val

Arg Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

35

40

45

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

50

55

60

Tyr

Asn

iie

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

«5

70

75

80

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

85

90

95

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

ASp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

100

105

110

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

115

120

125

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

130

135

140

Glu

Gly Lys

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

145

150

155

160

Met Ala Ile Thr

-62CZ 297329 B6 (2) Informace o SEQ ID NO:63:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 495 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:63:

ATGTCTAATG	ATATGACTCC	GGAACAGATG	GCTACCAACG	TTAACTCCTC	CTCCCCGGAA	60
CGTCACACGC	GTTCCTACGA	CTACATGGAA	GGTGGTGACA	TCCGCGTACG	TCGTCTGTTC	120
TGCCGTACCC	AGTGGTACCT	GCGTATCGAC	AAACGCGGCA	AAGTCAAGGG	CACCCAAGAG	180
ATGAAAAACA	ACTACAATAT	TATGGAAATC	CGTACTGTTG	CTGTTGGTAT	CGTTGCAATC	240
AAAGGTGTTG	AATCTGAATT	CTATCTTGCA	ATGAACAAGG	AAGGAAAACT	CTATGCAAAG	300
AAAGAATGCA	ATGAAGATTG	TAACTTCAAA	GAACTAATTC	TGGAAAACCA	TTACAACACA	360
TATGCAICTG	CTAAATGGAC	CCACAACGGT	GGTGAAATGT	TCGTTGCTCT	GAACCAGAAA	420
GGTATCCCTG	TTCAAGGTAA	GAAAACCAAG	AAAGAACAGA	AAACCGCTCA	CTTCCTGCCG	490
ATGGCAATCA	CTTAA					495

(2) Informace o SEQ ID NO:64:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 164 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:64:

-63CZ 297329 B6

Met Ser 1

Asn Asp

Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Ser

5

10

15

Ser

Pro

Glu

Arg

HiS

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

20

25

30

Asp

Ile

Arg

Val

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

35

40

45

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

50

55

60

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

val

Ala

Ile

65

70

75

90

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

65

90

95

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

100

105

110

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

115

120

125

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

130

135

140

Gin

Gly

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

HiS

Phe

Leu

Pro

145

150

155

160

Met Ala Ile Thr (2) Informace o SEQ ID NO:65:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:65:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC

SO

CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120

-64CZ 297329 B6

aactacaata	TTATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	CAAAGGTGTT	190
GAATCTGAAT	TCTATCTTGC	AATGAACAAG	GAAGGAAAAC	TCTATGCAAA	GAAAGAATGC	240
AATGAAGATT	GTAACTTCAA	AGAACTAATT	CTGGAAAACC	ATTACAACAC	ATATGCATCT	300
GCTAAATGGA	CCCACAACGG	TGGTGAAATG	TTCGTTGCTC	TGAACCAGAA	AGGTATCCCT	360
GTTCAAGGTA	AGAAAACCAA	GAAAGAACAG	AAAACCGCTC	ACTTCCTGCC	GATGGCAATC	420
ACTTAA						42 6

(2) Informace o SEQ ID NO:66:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:66:

Met 1

Ser Tyr

Asp

Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

5

10

15

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Xle

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Gin

Gly

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

(2) Informace o SEQ ID NO:67:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:67:

GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG (2) Informace o SEQ ID NO:68:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč:misc_feature (různé vlastnosti) (B) Umístění: doplňková (1 ..24) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:68:

CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC 24 (2) Informace o SEQ ID NO:69:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 18 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:69:

CAATCTACAA TTCACAGA (2) Informace o SEQ ID NO:70:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 18 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA

-66CZ 297329 B6 (xi) Popis sekvence: SEQIDNO:70:

TTAAGTTATT GCCATAGG (2) Informace o SEQ ID NO:71:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 29 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:71:

AACAAAGCTT CTACAATTCA CAGATAGGA (2) Informace o SEQ ID NO:72:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 27 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:72:

AACAAGATCT TAAGTTATTG CCATAGG (2) Informace o SEQ ID NO:73:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 38 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:73:

CGGTCTAGAC CACCATGCAC AAATGGATAC TGACATGG (2) Informace o SEQ ID NO:74:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 33 párů bází

-67CZ 297329 B6 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:74:

GCCGTCGACC TATTAAGTTA TTGCCATAGG AAG (2) Informace o SEQ ID NO:75:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 16 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:75:

Xaa Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Xaa Xaa Ser

10 15 (2) Informace o SEQ ID NO:76:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 12 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:76:

Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val 15 10 (2) Informace o SEQ ID NO:77:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 517 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:77:

-68CZ 297329 B6

CTAGAAGGAG GAATAACATA TGTCTAATGA TATGACTCCG GAACAGATGG CTACCAACGT 60

TAACTCCTCC TCCCCGGAAC GTCACACGCG TTCCTACGAC TACATGGAAG GTGGTGACAT120

CCGCGTACGC CGTTTGTTCT CTCGTACCCA GTGGTACCTG CGTATCGACA AACGCGGCAA130

AGTCAAGGGC ACCCAAGAGA TGAAAAACAA CTACAATATT ATGGAAATCC GTACTGTTGC240

TGTTGGTATC GTTGCAATCA AAGGTGTTGA ATCTGAATTC TATCTTGCAA TGAACAAGGA300

AGGAAAACTC TATGCAAAGA AAGAATGCAA TGAAGATTGT AACTTCAAAG AACTAAITCT360

GGAAAACCAT TACAACACAT ATGCATCAGC TAAATGGACA CACAACGGAG GGGAAATGTT420

TGTTGCCTTA AATCAAAAGG GGATTCCTGT AAGAGGAAAA AAAACGAAGA AAGAACAAAA430

AACAGCCCAC TTTCTTCCTA TGGCAATAAC TTAATAG (2) Informace o SEQ ID NO:78:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 164 aminokyselin (B) Typ: aminokyseliny (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá ío (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:78:

-69CZ 297329 B6

Met Ser 1

Asn Asp

Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Ser

5

10

15

Ser

Pro

Glu

Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

20

25

30

Asp

X+e

Arg

Val

Arg

Leu

Phe

Ser

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

35

40

45

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

50

55

60

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

65

70

75

00

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

as

90

95

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

100

105

110

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

115

120

125

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

130

135

140

Arg

Gly Lys

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

145

150

155

160

Met Ala ile Thr (2) Informace o SEQ ID NO:79:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 517 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:79:

-70CZ 297329 B6

CTAGAAGGAG GAATAACATA TGTCTAATGA TATGACTCCG GAACAGATGG CTACCAACGT TAACTCCTCC TCCCCGGAAC GTCACACGCG TTCCTACGAC TACATGGAAG GTGGTGACAT CCGCGTACGT CGTCTGTTCT GCCGTACCCA GTGGTACCTG CGTATCGACA AACGCGGCAA AGTCAAGGGC ACCCAAGAGA TGAAAAACAA CTACAATATT ATGGAAATCC GTACTGTTGC TGTTGGTATC GTTGCAATCA AAGGTGTTGA ATCTGAATTC TACCTGGCTA TGAACAAAGA AGGTAAACTG TACGCTAAAA AAGAATCCAA TGAAGATTGT AACTTCAAAG AACTAATTCT GGAAAACCAT TACAACACAT ATGCATCAGC TAAATGGACA CACAACGGAG GGGAAATGTT TGTTGCCTTA AATCAAAAGG GGATTCCTGT AAGAGGAAAA AAAACGAAGA AAGAACAAAA AACAGCCCAC TTTCTTCCTA TGGCAATAAC TTAATAG (2) Informace o SEQ ID NO:80:

(ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:80:

Met Ser Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Ser

10 15

Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly

25 30

120

180

240

300

360

420

480

517

-71 CZ 297329 B6

A3p Ile Arg 35

Val

Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg

40

45

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

50

55

60

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

65

70

75

80

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

85

90

95

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Ser

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

100

105

110

Ile

Leu

Glu

Asn

HiS

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

115

120

125

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

val

130

135

140

Arg

Gly

Lys

Thr

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

145

150

155

160

Met Ala Ile Thr (2) Informace o SEQ ID NO:81:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 517 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá o

(ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ IDN0:81:

CTAGAAGGAG	GAATAACATA	TGTCTAATGA	TATGACTCCG	GAACAGATGG	CTACCAACGT	60
TAACTCCTCC	TCCCCGGAAC	GTCACACGCG	TTCCTACGAC	TACATGGAAG	GTGGTGACAT	120
CCGCGTACGT	CGTCTGTTCT	GCCGTACCCA	GTGGTACCTG	CGTATCGACA	AACGCGGCAA	180
AGTCAAGGGC	ACCCAAGAGA	TGAAAAACAA	CTACAATATT	ATGGAAA7CC	GIACTGx íGs.	240
TGTTGGTATC	GTTGCAATCA	AAGGTGTTGA	ATCTGAATTC	TACCTGGCTA	TGAACAAAGA	300
aggtaaactg	TACGCTAAAA	AAGAATCCAA	TGAAGATTCT	AACTTCAAAG	AACTAATTCT	360
GG.AAAACCAT	TACAACACAT	ATGCATCAGC	7AAATGGACA	CACAACGGAG	GGGAAATGTT	420
TGTTGCCTTA	AATCAAAAGG	GGATTCCTGT	AAGAGGAAAA	AAAACGAAGA	AAGAACAAAA	4Θ0
AACAGCCCAC	TTTCTTCCTA	TGGCAATAAC	TTAATAG			517

-72CZ 297329 B6 (2) Informace o SEQ ID NO:82:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 164 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:82:

Met 1

Ser Asn

Asp

Met Thr Pro Glu Gin Met

Ala

Thr Asn

Val

Asn Ser 15

5

10

Ser

Ser Pro

Glu 20

Arg

His

Thr

Arg

Ser 25

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu 30

Gly

Asp

Ile Arg 35

Val

Arg

Leu

Phe 40

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp 45

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp Lys 50

Arg

Gly

Lys

Val 55

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu 60

Met

Lys

Asn

Tyr 65

Asn Ile

Met

Glu

Ile 70

Arg

Thr

Val

Ala

Val 75

Gly

Ile

Val

Ala

ile 80

Lys

Gly Val

Glu

Ser 85

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala 90

Met

Asn

Lys

Glu

Gly 95

Lys

Leu

Tyr Ala

Lys 100

Lys

Glu

Ser

Asn

Glu 105

Asp

Ser

Asn

Phe

Lys 110

Glu

Leu

Ile

Leu Glu 115

Asn

His

Tyr

Asn

Thr 120

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys 125

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly 130

Glu

Met

Phe

Val 135

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys 140

Gly

Ile

Pro

Val

Arg 145

Gly Lys

Lys

Thr

Lys 150

Lys

Glu

Glrx

Lys

Thr 155

Ala

HiS

Phe

Leu

Pro 160

Met Ala Ile Thr (2) Informace o SEQ ID NO:83:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA

-73CZ 297329 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:83:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGGAACAGAA AGGTATCCCT 360 GTTCGTGGTA AGAAAÁCCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426 (2) Informace o SEQ ID NO:84:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý ío (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:84:

Met Ser Tyr 1

ASp

Tyr Met Glu Gly Gly Asp

Ile Arg Val Arg Arg 15

Leu

5

10

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Glu

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

HiS

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

-74CZ 297329 B6 (2) Informace o SEQ ID NO:85:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:85:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGGA AGGTATCCCT 360 GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA ^42s (2) Informace o SEQ ID NO:86:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:86:

-75CZ 297329 B6

Met 1

Ser

Tyr

Asp

Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

5

10

15

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg Gly

Lys

val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

Zle

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Tle

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Glu

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly Lys

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130 135 140 (2) Informace o SEQ ID NO:87:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:87:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GAAICTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG ACTTAA

ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC60

AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC120

GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT180

GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC240

CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT300

TTCGTTGCTC TGAACCAGCA AGGTATCCCT360

AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC420

426

-76CZ 297329 B6 (2) Informace o SEQ ID NO:88:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:88:

Met

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

Asp

Ile

Arg

Val

Arg

Leu

1

5

10

15

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Ty 3

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn Glu Asp Cys Asn

Phe

Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn

65

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Gly

ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

(2) Informace o SEQ ID NO:89:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:89:

77CZ 297329 B6

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 160 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT 360 GTTGCTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426 (2) Informace o SEQ ID NO:90:

(ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:90:

Met Ses 1

Tyr

Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp

Xle

Arg Val Arg

Arg 15

Leu

5

10

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ila

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

Xle

Met

Glu

lle

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

lle

Val

Ala

lle

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

lle

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

lle

Pro

Val

Ala

Gly

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Xle

Thr

130

135

140

-78CZ 297329 B6 (2) Informace o SEQ ID NO:91:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:91:

ATGTCCTACG	ACTACATGGA	AGGTGG7GAC	ATCCGCGTAC	GTCGTCTG7T	CTGCCGTACC	60
CAGTGGTACC	TGCGTATCGA	CAAACGCGGC	AAAGTCAAGG	GCACCCAAGA GATGAAAAAC	120
aactacaata	7TATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT	TCTATCTTGC	AATGAACAAG	GAAGGAAAAC	TCTATGCAAA	GAAAGAATGC	240
AATGAAGATT	GTAACTTCAA	AGAACTAATT	CTGGAAAACC	ATTACAACAC	ATATGCATCT	300
GCTAAATGGA	CCCACAACGG	TGGTGAAATG	TTCGTTGCTC	TGAACCAGAA	AGGTATCCCT	360
GTTGAAGGTA	AGAAAACCAA	GAAAGAACAG	aaaaccgctc	ACTTCCTGCC	GATGGCAATC	420
ACTTAA						426

(2) Informace o SEQ ID NO:92:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:92:

-79CZ 297329 B6

Met Ser Tyr Asp 1

Tyr 5

Met Glu Gly

Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

10

15

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ila

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

ASp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

ile

Pro

Val

Glu

Gly

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

11«

Thr

130

135

140

(2) Informace o SEQ ID NO:93:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá ío (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:93:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC

CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC

AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT

GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA

AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC

GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG

GTTCTGGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG

ACTTAA

ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC60

AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC120 gctgttggta TCGTTGCAAT CAAAGGTGTTíao

GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC240

CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT300

TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT360

AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC420

426

-80CZ 297329 B6 (2) Informace o SEQ ID NO:94:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:94:

Met Ser Tyr Asp '

Tyr Met Glu Gly i

Gly

ASp

Ile

Arg ’

Val .

Arg

Leu

1

5

10

15

Phe Cys Arg Thr i

Gin Trp '

Tyr '

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

ile

Arg

35

40

45

Thr

val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Leu

Gly

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

(2) Informace o SEQ ID NO:95:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:95:

-81 CZ 297329 B6

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 130 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATTCCT 360 GTTCGTGGTA AC-GAAACCAA GAAAC-AACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426 (2) Informace o SEQ ID NO:96:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá ío (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:96:

Met Ser Tyr Asp 1

Tyr 5

Met Glu Gly

Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

10

15

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Glu

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

-82CZ 297329 B6 (2) Informace o SEQ ID NO:97:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:97:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC

CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC

AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT

GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA

AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC

GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG

GTTCGTGGTA AGCAAACCAA GAAAGAACAG

ACTTAA

ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC60

AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC120

GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT180

GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC240

CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT300

TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT360

AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC420

426 (2) Informace o SEQ ID NO:98:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:98:

Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg

Val Arg

Arg 15

Leu

1

5

10

Phe

Cye

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

val

Ala

ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

-83CZ 297329 B6

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Gin

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

(2) Informace o SEQ ID NO:99:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:99:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT 360 GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG GAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426 (2) Informace o SEQ ID NO: 100:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 100:

-84CZ 297329 B6

Met Ser 1

Tyr

Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp

Ile

Arg Val Arg

Arg 15

Leu

5

10

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Tle

Pro

Val

Arg

Gly Lys

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Glu

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

(2) Informace o SEQ ID NO: 101:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 101:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTQTT CTGCCGTACC	60
CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC	120
AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC	240
AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT	300
GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT	360
GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG CAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC	420
ACTTAA	426

-85CZ 297329 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 102:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 102:

Met Ser 1

Tyr

Asp Tyr Mat Glu Gly Gly Asp

Ile

Arg Val Arg

Arg Leu 15

5

10

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Glu

Met

Phe

val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

val

Arg

Gly

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Mat

Ala

Ile

Thr

130

13S

140

(2) Informace o SEQ ID NO: 103:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 103:

-86CZ 297329 B6

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC	60
CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC	120
AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC	240
AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT	300
GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT	360
GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAAGAG GAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC	420
ACTTAA	426

(2) Informace o SEQ ID NO: 104:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselina (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 104:

Met Ser Tyr Asp

Tyr Met Glu Gly Gly 5

Asp Ile A-rg Val Arg Arg Leu

15

Phe Cys Arg Thr

Gin Trp Tyr Leu Arg

Ile Asp Lys Arg Gly Lys val

Lys

Gly

Thr 35

Gin

Glu

Met

Lys

Asn 40

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met 45

Glu

Ile

Arg

Thr

Val 50

Ala

Val

Gly

Ile

Val 55

Ala

Ile

Lys

Gly

Val 60

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr 65

Leu

Ala

Met

Asn

Lys 70

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr 75

Ala

Lys

Glu

Cys 80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn 85

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile 90

Leu

Glu

Asn

His

Tyr 95

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser 100

Ala

Lys

Trp

Thr

His 105

Asn

Gly

Glu

Met 110

Phe

Val

Ala

Leu

Asn 115

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro 120

Val

Arg

Gly

Lys

Lys 125

Thr

Lys

Glu

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

140

135

130

-87CZ 297329 B6

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Analog nativního keratinocytového růstového faktoru KGF, odpovídající aminokyselinám 32 až 194 SEQ ID NO:2, popřípadě spolu se signální sekvencí, kterým je deltaN23, odpovídající SEQ ID NO:58, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v poloze 0 a jedná se o zbytek fakultativní, přičemž tento analog je kovalentně připojen k polyethylenglykolu nebo příbuznému vodorozpustnému organickému polymeru.
2. Použití analogu kovalentně připojeného k polyethylenglykolu nebo příbuznému vodorozpustnému organickému polymeru, podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro stimulaci produkce nefibroblastových epithelových buněk u pacienta, který to potřebuje, přičemž nefibroblastové buňky epithelu jsou zvoleny zadnexálních struktur, jatemích buněk, mukosálního epithelu respiračního traktu nebo tympánových epithelových buněk.
3. In vitro způsob stimulace produkce nefibroblastových epithelových buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje podání účinného množství analogu kovalentně připojeného k polyethylenglykolu nebo příbuznému vodorozpustnému organickému polymeru, podle nároku 1, nebo farmaceutického prostředku na jeho bázi, přičemž nefibroblastové buňky epithelu jsou zvoleny z adnexálních struktur, jatemích buněk, mukosálního epithelu respiračního traktu nebo tympánových epithelových buněk.
4. Použití analogu kovalentně připojeného k polyethylenglykolu nebo příbuznému vodorozpustnému organickému polymeru, podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro stimulaci produkce nefibroblastových epithelových buněk u pacienta za účelem prevence nebo léčení stavu zvoleného ze souboru sestávajícího z popálenin a jiných poranění v části nebo celé tloušťce tkáně, epidermolysis bullosa, alopecie indukované chemotherapií, plešatosti mužského typu, progresivní ztráty vlasů u mužů a žen, žaludečních a dvanáctníkových vředů, zánětlivých chorob střev, jako je Crohnova choroba a vředová kolitida, toxicity spojené s radiačním a chemotherapeutickým ošetřením, choroby hyalinní membrány, akutního a chronického poškození plic, cirrhosy jater; prudkého selhání jater, akutní virové hepatitidy, toxických napadení jater, abraze rohovky, progresivní choroby dásní a poškození ušního bubínku.