CZ105097A3

CZ105097A3 - Analoga keratinocytových růstových faktorů

Info

Publication number: CZ105097A3
Application number: CZ971050A
Authority: CZ
Inventors: Charles F. Morris; William C. Kenney; Bao-Lu Chen; Eric W. Hsu
Original assignee: Amgen Inc. Amgen Center
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 1998-10-14
Also published as: BG101392A; NO971568D0; EE9700225A; CZ297328B6; DE69535264T2; SK43197A3; NZ335109A; NO971566L; DE69530403D1; DK0804479T3; SK284534B6; KR100278597B1; AU3707795A; CZ98197A3; CA2201940C; FI971420A7; EP0804479B1; NO971568L; DE69530403T2; BG63167B1

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se vztahuje k technikám rekombinantní DNA a proteinového inženýrství. Metody rekombinantní DNA byly konkrétně použity pro tvorbu peptidových analogů keratinocytových růstových faktorů (KGF), účinného mitógenu nefibroblastového epiteliálního *------tůstu-buňky-;—analoga—v-y-kazu-j-í—ve-s-rovnán-í— s—rod-ičov-s-kou—KGF———----—·——-zlepšenou stabilitu.

í

J «:

i, ΐ

v i

Dosavadní stav techniky j

Komplexní proces vytváření a regenerace pletiv je zprostředkován řadou proteinových faktorů, které jsou někdy označované jako faktory růstu měkkých pletiv. Tyto· molekuly jsou obecně uvolňovány jedním typem buněk a ovlivňují proliferaci jiných typů buněk. (Rubin et a. (1989), Proč. Nati. Acad. Sci. USA,

86:802—806). Některé růstové faktory měkkých pletiv jsou vylučovány specifickými typy buněk a ovlivňují proliferaci, diferenciaci a/nebo zrání cílových buněk při vývoji vícebuněčných organismů.

(Finch et al. (1989), Science, 245: 752-755). Navíc kromě jejich >

úlohy ve vyvíjejících še organismech jsou některé důležité pro udržení zdravého stavu vyzrálejších systémů. Například u savců je ;

mnoho systémů, kde dochází k rychlé obměně buněk. Takovéto systémy zahrnují kůži a gastrointestinální trakt, které jsou oba tvořeny epiteliálními buňkami.

Do této skupiny růstových faktorů měkkých pletiv patří také rodina fibroblastových růstových faktorů (FGF).

V současné době je známo osm členů rodiny FGF (fibroblast growth factors), které vykazují příbuznost v primární struktuře:

základní fibroblastový růstový faktor (basic fibroblast growth factor),. bFGF (Abraham et al. (1986), EMBO J., 5:2523-2528); kyselý fibroblastový růstový faktor (acidic fibroblast growth factor),

aFGF (Jaye et al·. (1986), Science, 233:541-545); produkt int-2 genu, int-2 (Dickson & Peters (1987), Nátuře, 326:833); hst/kFGF {Delli-Bóvi et al. (1987), Cell, 50:729-737 a Yoshida et al.

(1987), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84:7305-7309); FGF-5 (Zhan et al. (1988), Mol. Cell. Biol., 8:3487-3495), FGF-6 (Marics et al. (1989), Oncogene, 4:335-340); keratinocytový růstový faktor (keratinocyte growth factor) (Finch et al. (1989) Science, 24:752755) a hisactophilin (Habazzettl et al. (1992), Nátuře, 359:8558-58T:...................................

V rodině FGF proteinů je keratinocytový růstový faktor („KGF) specifickým efektorem proliferace nefibroblastových epiteliálnich (zejména keratinocytových) buněk odvozených z mesenchymálnich pletiv. Pojem „nativní KGF se vztahuje k přírodnímu lidskému (hKGF) nebo rekombinantnímu (rKGF) polypeptidů (se signální sekvencí nebo bez ní), jak je znázorněno sekvencí aminokyselin uvedených'v SEQ ID NO:2 nebo v její aieiické variantě. [Pokud nenř uvedeno jinak, číslování aminokyselin pro molekuly popsané v tomto: dokumentu bude odpovídat prezentované konečné formě přirozené molekuly (tj. bez signální sekvence), jak je znázorněno aminokyselinami 32-194 SEQ ID NO:2.]

Přirozený KGF může být izolován z přirozených lidských zdrojů (hKGF) nebo produkován technikami rekombinantní DNA (rKGF) (Finch et al. (1989), viz předchozí text; Rubin et al. (1989), viz předchozí text; Ron et al. (1993), The Journal of Biological Chemistry, 268 (4): 2984-2988 a Yan et al. ¢1991), In Vitro Cell. Dev, Biol., 27A: 437-438.

Je známé, že přirozený KGF je ve vodném stavu poměrně nestabilní a že podléhá chemické a fyzikální degradaci, mající za následek ztrátu biologické aktivity během zpracování a skladování (Chen et al. (1994), Pharmaceutical Research, 11: 1582-1589). Přirozený KGF je také při zvýšených teplotách náchylný k agregaci a v kyselém prostředí se inaktivuje (Rubin et al. (1989), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86: 802-806). Agregace nativního KGF ve vodných roztocích má za následek inaktivaci proteinu. To je nevýhodné, protože takováto ztráta aktivity činí skladování vodných přípravků proteinů nativního KGF po delší časové období nebo manipulaci s proteiny v průběhu delšího období nepraktickým. Navíc tento fakt způsobuje problémy při přípravě farmaceutických přípravků, protože agregované proteiny působí jako imunogeny (Cleland et al. (1993), Crit Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 10: 307-377; Robbins et al. (1987), Diabetes, 36: 838-845 a Pinckard et al. (1967), Clin. Exp. Immunol., 2: 331-340).

Přirozený KGF obsahuje pět cysteinových zbytků - konkrétně se jedná- o-am-i-nok-yse-l-i-n-y—1-,—1-5-,-40-,-10-2— a—1-06—-(-F-ineh—et— a-1-—(-1- 9 8-9-)-,—— Science, 24: 752-755)'. Ačkoliv byl popsán obsah cysteinu v přirozeném KGF, nebyla dosud popsána role, kterou mají cysteinové zbytky na aktivitu (tzn. jejich nezbytnost pro biologickou aktivitu) a terciární strukturu (tzn. náchylnost k tvorbě nežádoucích disulfidových vazeb mezi molekulami nebo uvnitř molekul). Není proto žádný vzor, ze kterého by šlo odvodit, který cysteinový zbytek (jestli.vůbec nějaký) je nezbytný,nebo jestli se účastní při tvorbě nežádoucích disulfidových vazeb, které způsobují náchylnost proteinu k nežádoucí agregaci a/nebo nestabilitě.

Pro vylepšení nebo změnu jedné nebo více charakteristik přirozeného KGF se může použít proteinové inženýrství. Pro modifikaci sekvence přirozeného KGF byla použita technologie rekombinantní DNA.

Ron et al. (1993), (J. Biol. Chem., 268 (4): 2984-2988) popsali modifikované KGF polypeptidy bez 3, 8, 27, 38 nebo 49 aminokyseliny od N-konce. Peptidy postrádající 3, 8 nebo 27 residuum na N-konci byly plně aktivní, zatímco forma postrádající 27 residuum byla 1020x méně mitogenní a formy bez aminokyselin 38 nebo 49 neměly mitogenní aktivitu. Stabilita modifikovaných polypeptidů nebyla diskutována nebo jinak popsána.

Publikovaná PCT aplikace no. 90/08771, viz předchozí text popisuje také tvorbu chimérického proteinu, kde zhruba prvních 40 aminokyselin z N-konce konečné formy přirozeného KGF bylo zkombinováno s částí C-konce aFGF(asi 140 aminokyselin). Bylo popsáno působení chiméry na keratinocyty jako u KGF, ale chiméra nebyla citlivá na heparin, což je charakteristická vlastnost aFGF, • t • · ·· ·· · · · · ale ne KGF. Stabilita chiméry nebyla diskutována nebo jinak popsána.

Literatura tedy nepopisuje modifikovanou KGF molekulu s významně zlepšenou stabilitou v porovnání s přirozenou molekulou .KGF. Navíc literatura nepopisuje dostatečné údaje nebo důkazy, které by opravňovaly očekávání, že tvorba molekul KGF s těmito žádoucími vlastnostmi bude úspěšná.

Obecně účinky změny aminokyselin na biologickou aktivitu —_r_-pro.teinu-budo.u_zá.v.ise.t^na_řadě-faktor.ů.,-jřče-tně—třírozměrné^-.-struktury proteinu a tom, jestli se modifikace dotknou vazebné oblasti pro receptor primární sekvence proteinu. Protože ani třírozměrná struktura ani oblast pro vázání receptorů v primární struktuře přirozeného KGF nebyly publikovány, znalosti v této oblasti neumožňují zevšeobecnění účinku změn aminokyselin přirozeného KGF a dokonce ani vliv modifikace proteinu u lépe charakterizovaných proteinů.

Cílem, tohoto vynálezu je poskytnout polypeptidové molekuly kódující taková analoga, která vykazují zvýšenou stabilitu (například při vystavení působení typickému pH, teplotním a/nebo skladovácím podmínkám) při srovnání s přirozeným KGF.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje nová biologicky aktivní peptidová analoga KGF. Pro účely tohoto vynálezu zahrnuje termín „KGF přirozený KGF a proteiny charakterizované peptidovou sekvencí v podstatě shodnou s přirozeným KGF, které si zachovávají cysteinová residua odpovídající Cys¹ a Cys¹⁵ přirozeného KGF (Cys¹² a Cys⁶⁴ SEQ ID NO:2) a které si zachovávají biologickou aktivitu přirozeného KGF, zejména vliv na proliferaci nefibroblastových epiteliálních buněk. Výrazem „charakterizované peptidovou sekvencí v podstatě shodnou s přirozeným KGF se myslí peptidová sekvence, která je kódovaná DNA sekvencí schopnou hybridizace k nukleotidům 201 až 684 SEQ ID NO:1, zejména za stringentních hybridizačních podmínek.

Odpovídající pozice aminokyseliny mezi dvěmi sekvencemi aminokyselin může být určena přiřazením dvou sekvencí tak, aby se maximalizovala shoda residuí, včetně posunu amino a/nebo karboxy konce, zavedení potřebných mezer a/nebo odstranění residuí .přítomných ve formě insertů u možných kandidátů. Vyhledávání v databázích, analýza sekvence a manipulace se může provést s použitím některého dobře známého algoritmu - programu běžně používaného pro prohledávání na homologie/totožnost v sekvenci.

——(např-í-k-l-ad—Pear-sen—a—L-i-pman— (-198-8-)-7-P-roc—Na-t-1-—Acad-—Sci-—U—S—A-.-_ř— 85:2444-2448; Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol., 215:403-410; Lípman and Pearson (1985), Science, 222:1435 nebo Devereux et al. (1984), Nuc. Acids Res., 12:387-395).

Stringentní podmínky (týkající se hybridizace) se dosáhnou kombinací koncentrace solí, teploty, organických rozpouštědel a ostatních parametrů běžně kontrolovaných v hybridizačních reakcích.

Vzorové hybridizační podmínky představuje hybridizace v 4x SSC při 62-67 °C, následovaná promýváním v 0,lx SSC při 62-67 °C pó dobu zhruba jedné hodiny. Jiné vzorové hybridizační podmínky představuje hybridizace v 45-55% formamidu, 4x SSC při 40-45 °C. [viz T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A laboratory manual); Cold Spring Harbor Laboratory (1982), stránky 387 - 389].

Proteiny zahrnují variace alel, nebo deleci (delece), substituci (substituce) nebo inzerci (inzerce) aminokyselin, včetně fragmentů, chimérických nebo hybridních molekul přirozeného KGF. Jeden příklad KGF zahrnuje proteiny se změněným nábojem, kde je jeden nebo více aminokyselinových zbytků na pozicích 141-154 nativního KGF (nejlépe residua Arg⁴¹, Gin⁴³, Lys⁵⁵, Lys⁹⁵, Lys¹²⁸, Asn¹³⁷, Gin¹³³, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴,' Lys¹⁴⁷, Gin¹⁵², Lys¹⁵³ nebo Thr¹⁵⁴) odstraněn nebo vyměněn neutrálním nebo negativně nabitým zbytkem s cílem ovlivnit protein redukováním pozitivního náboje (jak je uvedeno v běžně přístupném U.S.S.N. 08/323, 337, zařazeným 13. října 1994).Příkladem je například R(144)Q, což je KGF mající nahrazený glutamin za arginin na aminokyselinové pozici 144 přirozeného KGF. Jiný příklad KGF představuje proteiny vytvořené substituováním alespoň jedné aminokyseliny s velkým potenciálem

tvořit smyčku, nebo alespoň jedné aminokyseliny uvnitř oblasti tvořící smyčku (Asn¹¹⁵ - His¹¹⁶ - Tyr¹¹¹ - Asn¹¹⁸ - Thr¹¹⁹) u nativního KGF (jak je uvedeno v běžně přístupném U.S.S.N. 08/323, 473, zařazeným 13. října 1994). Konkrétně je to např. H(116)G, KGF s . glycinem nahrazeným histidinem na aminokyselinové pozici 116 přirozeného KGF. Další příklad zahrnuje proteiny mající jednu nebo více aminokyselin uvnitř oblasti 123-133 (aminokyseliny 154-164 SEQ ID NO: 2) nativního KGF nahrazenou, odstraněnou nebo přidanou; tyto

-pr-ofee-i-ny-^mů-žo-u—m-í-fe—agon-i-s-t-ic-kou- nebo^antagon-i-st-i-ekou-a-k-t-i-vi-t-Uí— Překvapující bylo zjištění, že když má molekula KGF (t.j.

rodičovská molekula) cysteinový zbytek odpovídající (jak bylo určeno s použitím technik popsaných výše) Cys¹ a Cys¹⁵ přirozeného KGF (cysteinové zbytky 32 a 46 SEQ ID NO:2) modifikován nahrazením odpovídajícího cysteinu, má výsledný analog KGF ve srovnání s rodičovskou molekulou zlepšenou stabilitu. Vynález je navíc přednostně zaměřen na ta analoga, která kromě zlepšené stability vykazují plnou biologickou aktivitu (t.j. minimálně značně podobnou vazbu na receptor nebo afinitu k němu) při porovnání s přirozeným KGF.

Dalším aspektem vynálezu je popis purifikovaných a isolovaných molekul nukleových kyselin, kódujících různá biologicky aktivní peptidová analoga KGF. V jednom případě takovéto nukleové kyseliny zahrnují DNA molekuly klonované do biologicky funkčních plasmidu nebo virových vektorů. V jiném případě mohou být konstrukty nukleových kyselin použity pro stabilní transformaci prokaryontních nebo eukaryontních hostitelských buněk. V dalším případě vynález popisuje proces, kde buď prokaryotická (nejlépe E. coli) nebo eukaryotická hostitelská buňka, stabilně transformovaná molekulou nukleové kyseliny, vyrůstá za vhodných nutričních podmínek způsobem umožňujícím expresi analoga KGF. Po expresi může následovat isolace a purifikace rekombinantního polypeptidu.

Další aspekt vynálezu se zabývá farmaceutickými formami, které zahrnují terapeuticky účinná množství analoga KGF a přijatelného farmaceutického nosiče. Takovéto formy budou užitečné při léčení pacientů postižených epiteliálním onemocněním nebo poškozením;

.6 • · a· · • · · aa* a a a a a a a · · aa ·« aa aa

V tomto duchu se další aspekt vztahuje k metodám stimulace růstu epiteliálních buněk podáváním terapeuticky účinných dávek . analoga KGF pacientům. V jednom praktickém případě jsou to nefibroblastové epiteliální buňky, které jsou stimulovány. Takovéto epiteliální buňky zahrnují různé sousední buňky, pankreatické buňky, jaterní buňky a mukózový epitel v respiračním a gastrointestinálním traktu.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje nukleotidové {SEQ ID NO:1) a aminokyselinové (SEQ ID NO:2) sekvence nativního KGF (nukleotidy kódující konečnou formu nativního KGF jsou popsány bázemi 201 až 684 SEQ ID NO:1 a konečná forma KGF je určená aminokyselinovými zbytky 32 až 194 SEQ IDNO:2).

Obrázky 2A, 2B a 2C ukazují mapy plasmidů pCFM1156, pCFMl6S6 a pCFM3102.

Obrázek 3 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:3) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:4) sekvenci konstruktu obsaženého v konstruktu RSH-KGF.

Obrázek 4 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:5) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:6) sekvenci konstruktu obsaženého v plasmidu KGF.

Obrázek 5 ukazuje chemicky syntetizované OLIGA (OLIGO č.6 až OLIGO č. 11; SEQ ID NO:12-17) použité k náhradě DNA sekvence mezi místy KpnI a EcoRI v konstruktu plasmidu KGF (pozice aminokyselin 46 až 85 v SEQ ID No:6), aby se vytvořil konstrukt v plasmidů KGF (dsd).

Obrázek 6 ukazuje chemicky syntetizované OLIGA (OLIGO č. 12 až 24; SEQ ID NO:18-30) použité pro tvorbu KGF (optimalizovaný kodon).

Obrázek 7 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:31) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:32) sekvenci C(1,15)S, analogu KGF se substitucí šeřinu místo cysteinu v pozici aminokyselin 1 a 15 nativního KGF.

• 9 9 9 « 9 9 • 9 99 99 ··

9 »

9«

Obrázek 8 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:33) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:34) sekvenci AN3/C(15)S, analogu KGF s delecí prvních třech aminokyselin na N-konci a náhradou šeřinu za cystein na aminokyselinové pozici 15 přirozeného KGF.

Obrázek 9 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:35) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:36) sekvenci ÁN3/C(15)-, analogu KGF s delecí prvních třech aminokyselin na N-konci a delecí cysteinu na aminokyselinové pozici 15 přirozeného KGF.

~ —Obrázek^lO—ukazujre-nukleOťxďúvdtr^íSEQ^-lD^_NOT37j a¹ ™ aminokyselinovou (SEQ ID ŇO:38) sekvenci AN8/C(15)S, analogu KGF s delecí prvních osmi aminokyselin na N-konci a náhradou šeřinu za cystein na aminokyselinové pozici 15 přirozeného KGF.

Obrázek 11 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:39) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:40) sekvenci ÁN8/C(15)-, analogu KGF s delecí prvních osmi aminokyselin na N-konci a delecí cysteinu na aminokyselinové pozicí 15 přirozeného KGF.

Obrázek 12 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:41) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:42) sekvenci ΔΝ15, analogu KGF s delecí prvních patnácti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 13 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:43) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:44) sekvenci ΔΝ16, analogu KGF s delecí prvních šestnáctí aminokyselin na N-kohčí přirozeného KGF.

Obrázek 14 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:45) a aminokyselinovou (SEQ ID NO: 46) sekvenci ΔΝ17, analogu KGF s delecí prvních sedmnácti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 15 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:47) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:48) sekvenci ΔΝ18, analogu KGF s delecí prvních osmnácti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 16 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:49) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:50) sekvenci ΔΝ19, analogu KGF s delecí prvních devatenácti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 17 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:51) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:52) sekvenci ΔΝ20, analogu KGF s delecí prvních dvaceti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

v « V w w * * · * · '·»»· * · ·· · · »· · v · · · · · · φ · · ·«· · · * · · · · · * « « · · ·· ·· »· ·» ··

Obrázek 18 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:53) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:54) sekvenci ΔΝ21, analogu KGF s deleci prvních jednadvaceti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 19 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:55) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:56) sekvenci ΔΝ22, analogu KGF s deleci prvních dvaadvaceti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 20 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:57) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:58) sekvenci ΔΝ23, analogu KGF s deleci ¹ prvnfčln^třiaaVačěti^aminokýšeTih na N-konci^přirozenéhoKGF.

Obrázek 21 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:59) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:60) sekvenci ΔΝ24, analogu KGF s deleci prvních čtyřiadvaceti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 22 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:61) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:62) sekvenci C(1,15)S/R(144)E analogu KGF se substitucí šeřinu místo cysteinu v pozicích aminokyselin 1 a 15 á substituci glutamové kyseliny za arginin na aminokyselinové pozici 144 nativního KGF.

Obrázek 23 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:63) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:64) sekvenci C(1,15)S/R(144)Q, analogu KGF se substitucí šeřinu za cystein na pozicích 1 a 15 a substitucí glutaminu za arginin na aminokyselinové pozici 144 nativního KGF.

Obrázek 24 ukazuje nukleotidovou· (SEQ -ID NO: 65) a. aminokyselinovou (SEQ ID NO:66) sekvenci AN23/R(144)Q, analogu KGF s deleci prvních 23 aminokyselin na N-konci a náhradou glutaminu za arginin na aminokyselinové pozici 144 nativního KGF.

Obrázek 25 ukazuje množství zbývajícího rozpustného proteinu, když byl přirozený KGF a C{1,15) skladován v 20 mM fosforečnanu sodném, 0,15 M NaCl, pH 7,0 při 37 °C po dobu 27 hodin.

Obrázek 26 ukazuje množství zbývajícího rozpustného proteinu, když byl přirozený KGF a C(1,15)S skladován v 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO₄, 0,15' M NaCl, pH 7,0 při 37 °C po dobu 27 hodin.

Obrázek 27 ukazuje množství zbývajícího rozpustného proteinu, když byl přirozený KGF, ΔΝ15 a C(1,15)S skladován v 50 mM NaPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,0'při 37 °C po dobu 27 hodin.

- „ w ▼ » v V « « « ® i v * vv · · ·· * · · *·· · · ·· ·«· * * *·«» ·»·« ··· ·· »« ·· ·· «· ··

Obrázek 28 ukazuje množství rozpustného proteinu stanoveného pomocí HPLC (size exclusion) v závislosti na čase při 37 °C.

Obrázek 29 ukazuje předpokládanou denaturační teplotu (Tm) jako funkci pH pro přirozený KGF, C(1,15) S/R(144)Q a C(1,15)S/R(144)E.

Obrázek 30 ukazuje typický tvar průběh mitogenní aktivity C( 1,15)3 stanovené měřením inkorporace [³H]-thymidinu během syntézy DNA porovnáním se standardní křivkou.pro přirozený KGF.

, .Obrazek...3.1.._ukazu-j.e_ty.pický-prďiběh-mi-togenní -aktivity-ÁNt5——™ stanovené měřením inkorporace [³HJ-thymidinu během syntézy DNA porovnáním se standardní křivkou pro přirozený KGF.

Obrázek 32 ukazuje typický průběh mitogenní aktivity ΔΝ23 stanovené měřením inkorporace [³H]-thymidinu během syntézy DNA porovnáním se standardní křivkou pro přirozený KGF.

Obrázek 33 ukazuje typický průběh mitogenní aktivity AN23/R(144)Q stanovené měřením inkorporace [³H]-thymidinu během syntézy DNA porovnáním se standardní křivkou pro přirozený KGF.

Obrázek 34 ukazuje typický průběh mitogenní aktivity Cί1,15) S/R(i44)Q stanovené měřením.inkorporace [³H]-thymidinu během syntézy DNA porovnáním se standardní křivkou pro přirozený KGF.

Obrázek 35 ukazuje typický průběh mitogenní aktivity C (1,15) S/R(144) E stanovené měřením inkorporace. _[³H]-thymidinu během syntézy DNA porovnáním se standardní' křivkou pro přirozený KGF.

Obrázek 36 ukazuje vliv C (1,15)3 a ΔΝ23 na chemické vlastnosti séra.

Obrázek 37 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:77) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:78) sekvenci C(l,15,40)3, analoga KGF se substitucí serinU za cystein na pozicích aminokyselin 1, 15 a 40 přirozeného KGF.

Obrázek 38 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:79) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:80) sekvenci C(l,15,102)S, analoga KGF se substitucí šeřinu za cystein na pozicích aminokyselin 1, 15 a

102 přirozeného KGF.

¢- « »» 5 5 ii Φ © β© • · · · t · · · · · ©a© © · ♦ * · · · · · ♦ · * · ·· «« ·· ·© ©· ··

Obrázek 39 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:81) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:82) sekvenci C(1,15,102,106)S, analoga KGF se substitucí šeřinu za cystein na pozicích aminokyselin 1, 15, 102 a 106 přirozeného KGF.

Obrázek 40 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:83) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:84) sekvenci ΔΝ23/Ν(137)E, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí glutamové kyseliny za asparagin na aminokyselinové pozici 137 přirozeného KGF. __ , ... „ .. ______________________—·. - - ~ - - — Obrázek 41 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:85) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:86) sekvenci ΔΝ23/Κ(139)E, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí glutamové kyseliny za lysin na aminokyselinové pozici 139 přirozeného KGF.

Obrázek 42 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:87) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:88) sekvenci ΔΝ23/Κ(139) Q, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí glutamové kyseliny za lysin na aminokyselinové pozici 139 přirozeného KGF..

Obrázek 43 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:89) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:90) sekvenci AN23/R(144)A, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí alaninu za arginin na aminokyselinové pozici 144 přirozeného KGF.

Obrázek 44 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO.:91) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:92) sekvenci AN23/R(144)E, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí .glutamové kyseliny za arginin na aminokyselinové pozici 144 přirozeného KGF.

Obrázek 45 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:93) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:94) sekvenci AN23/R(144)L, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí leucinu za arginin na aminokyselinové pozici 144 přirozeného KGF.

Obrázek 46 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:95) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:96) sekvenci AN23/R(144)E, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí glutamové kyseliny za lysin na aminokyselinové pozici 147 přirozeného KGF.

• · · * · « · · ··· ·· ·· ·· ·· ·· ··

Obrázek 47 ukazuje nukleotidovou {SEQ ID NO:97) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:98) sekvenci ÁN23/K(147)Q, analoga KGF s deleci prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí glutaminu za lysin na aminokyselinové pozici 147 přirozeného KGF.

Obrázek 48 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:99) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:100) sekvenci ΔΝ23/Κ(153)E, analoga KGF s deleci prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí glutamové kyseliny za lysin na aminokyselinové pozici 153 přirozeného KGF. ___,_Obr.ázek, 4 9-.uka.zuj-e-nuk-leot-idovou-(-SEQ-íD-NO rlOlj — a~ — —— aminokyselinovou (SEQ ID'NO:102) sekvenci ΔΝ23/Κ(153) Q, analoga KGF s deleci prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí glutaminu za lysin na aminokyselinové pozici 153 přirozeného KGF.

Obrázek 50 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:103) a aminokyselinovou (SEQ ID NO: 104) sekvenci ÚN23/Q(152) E./K(153) E, analoga KGF s deleci prvních 23 aminokyselin na N-konci a substitucí glutamové kyseliny za glutamin na aminokyselinové pozici 152 přirozeného KGF a glutamové kyseliny za lysin na aminokyselinové pozici 153 přirozeného KGF.

Obrázek 51 ukazuje vliv ΔΝ23 na diabetes indukovaný streptozotocinem u Sprague-Dawley krys.

Detailní popis vynálezu

V souladu s tímto vynálezem jsou předkládaná nová analoga KGF. Zjistilo se, že čtyři z cysteinových residuí přirozeného KGF (Cys¹ ; Cys¹⁵, Cys¹⁰² a Cys¹⁰⁶) se účastní tvorby dvou disulfidových vazeb. Cys⁴⁰ se neúčastní disulfidových vazeb uvnitř molekuly. Proto obsahuje KGF dvě malé disulfidové smyčky oddělené téměř 90 aminokyselinami. Tak je možné určit, který cysteinový zbytek se účastní na disulfidových vazbách a který je volný pro tvorbu nežádoucích vazeb uvnitř molekuly. Tyto vazby způsobují vytvoření nežádoucí terciární struktury (t.j. konformace, která snižuje aktivitu proteinu).

• · • « · * · · I ·· *· • · ♦ • · · ► ·· ··· · • ·

Překvapující bylo zjištění, že modifikace KGF delecí nebo substitucí aminokyselinových zbytků odpovídajících v KGF pozici 1 a 15 (pozice 32 a 46 SEQ ID NO:2) vede ke vzniku analogů KGF s podstatně zlepšenou stabilitou (t.j. s menšími problémy způsobenými nesprávným prostorovým uspořádáním, tvorbou disulfidových útvarů a/nebo agregací proteinu). Například analoga KGF budou obecně purifikovány s větším výtěžkem rozpustného proteinu se správnou konfigurací. Navíc jakmile je materiál purifikován, bude odolnější jvů,či~pH₇_teplptě, a t d.._.p.ři _porovnánÍ....Se._ stabilitou rodičovské molekuly. I když není cílem-zabývat se příliš teorií, předpokládá se, že Cys¹ a Cys¹⁵ KGF kromě tvorby intramolekulárního disulfidového můstku, existují za určitých podmínek' i ve formě volných cysteinů, které jsou schopné tvořit mezimoíekulárni disulfidové vazby, vedoucí k nestabilitě proteinu a k tvorbě agregátů. Navíc bylo zjištěno, že delece disulfidové smyčky na N-konci není významná pro vázání receptoru nebo mitogenní aktivitu.

V tomto vynálezu výraz „analog KGF nebo „polypeptidový analog KGF označuje jakýkoliv popsaný přirozeně nebo uměle se vyskytující polypeptid lišící se strukturou od KGF díky modifikaci peptidové sekvence odpovídající 24 aminokyselinovému N-konci KGF (aminokyseliny 32 až 55 SEQ ID NO;2), kde Cys¹ a Cys¹⁵ v KGF (aminokyseliny 3'2 áž '64 SEQ ID NQ:2j jsou vyměněny nebo odstraněny. Způsob, kterým jsou cysteiny odstraněny nebo změněny není důležitý a zahrnuje například polypeptidová analoga obsahující deleci a/nebo substituci jedné nebo více aminokyselin. Vynález tedy poskytuje rodinu nových proteinů keratinocytových růstových faktorů. Tato rodina zahrnuje několik skupin proteinů.

Jedna skupina analogů KGF zahrnuje molekuly, ve kterých je cystein na pozicích KGF 1 a 15 nahrazen aminokyselinami, včetně těch, které se v proteinu normálně nevyskytují. Strategie pro tvorbu substitučních analogů zahrnuje místně zaměřenou tvorbu mutací (Ho-et al. (1989), Gene, 77:51-59; Innis et al. „PCR Protocols, Academie Press, lne., San Diego, CA), [analoga KGF zahrnující náhradu aminokyseliny jsou uvedena podle zbytku .13 • · · · · » · · »·» ·« ·* ♦· ♦* ·· ·Φ nacházejícím se na té které pozici v hotovém proteinu (bez signální sekvence} uvedeném v SEQ ID N0:2, následovaném aminokyselinovou pozicí v závorkách a novou aminokyselinou. Například analog zahrnující náhradu cysteinu za serin na aminokyselinové pozici 15 KGF (pozice 46 SEQ ID NO:2) je uváděn jako „C(15)S.] Cystein je přednostně změněn na neutrální aminokyselinu jako je například glycin, valin, alanin, leucin, isoleucin, tyrosin, fenylalanin, histidin, tryptofan, serin, threonin a methionin (přednostně serinem threoninem a alaninem.p.ro.. jejich „chemickou -podobnost----—s cysteinem). Příklad 1 podrobně popisuje tvorbu C(1,15)S použitím částečné syntézy genu (ve spojení s ostatními rekombinantními technikami) a s následnou expresí konstruktu v stabilně transformovaném bakteriálním hostiteli.

Jiná skupina analogů KGF zahrnuje molekuly které mají cysteiny v pozici 1 a 15 z molekuly KGF odstraněny. K tvorbě takovýchto analogů KGF mohou být použity různé strategie, jako například zkrácení N-konce, místní specifické delece či kombinace obou metod.

Pojem „zkrácení N-konce označuje takovou modifikaci KGF, kde jsou N-konco'vá aminokyselinová residua KGF 1 až 24 (aminokyseliny 32 až 55 SEQ ID NO:2) odstraněna, včetně Cys¹ a Cys¹⁵ [analoga KGF zahrnující zkrácení aminokyselin budou uváděna odstraněným residuem na pozicí hotového proteinu (bez signální sekvence) uvedené v SEQ ID NO:2/ začínající místem delece a počtem odstraněných residuí. Například analog KGF se zkrácením na N-konci o 24 zbytků (zbytky 155 v SEQ ID N0:2) bude označován jako analog „ΔΝ24]. Konkrétně jsou v této skupině analoga ΔΝ23 přirozeného KGF, kde jsou jeden nebo více aminokyselinových zbytků 41-154 [(aminokyseliny 72-185 SEQ ID N0:2), včetně aminokyselinových zbytků 123-133 (aminokyseliny 154-164 SEQ ID N0:2)], odstraněny nebo nahrazeny neutrálními zbytky nebo negativně nabitými zbytky vybranými tak, aby se zmenšil positivní náboj. Přednostně se pro modifikaci používají Arg⁴¹, Gin⁴³, Lys⁶⁵, Lys⁹⁵, Lys¹²⁸, Asn¹³⁷, Gin¹³⁸, Lys¹³⁹,

Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gin¹⁵², Lys¹⁵³ nebo Thr¹⁵⁴, které jsou nahrazené přednostně Gin¹³⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gin¹⁵² nebo Lys¹⁵³, přičemž Arg¹⁴⁴ je nejpreferovanější. V této skupině jsou také ·· ** « · · ♦ ·· ** » zahrnuta ΔΝ23 analoga přirozeného KGF s modifikací uvnitř oblasti vytvářející smyčku Asn¹¹⁵-His¹¹⁶-Tyr¹¹⁷-Asn¹¹⁸-Thr¹¹⁹ (aminokyseliny 146150 SEQ ID NO:2) v přirozeném KGF.

Příklad 1 uvádí podrobnosti o systematickém zkracování N-konce provedeném částečnou syntézou genu ve spojení s ostatními rekombinantními technikami á následující expresi konstruktu ve stabilně transformovaném bakteriálním hostiteli. Příkladem může být zkracování N-konce u ΔΝ15 až ΔΝ24. Navíc příklad 3 uvádí podrobnost i,.XK.expr.es.i._DNA,kóduj-íc-í--při-ro-zený- KGF-a-různorodé-n-a^N=·— konci glykosylované izoformy v kultuře savčích buněk a purifikaci zejména glykosylovaných izoforem s N-koncem zkráceným o aminokyseliny 1-23 konečné formy přirozeného KGF.

Naproti tomu místně specifické delece se vztahují na modifikace KGF, kde je odstraněn jeden.nebo více aminokyselinových zbytků (například Cys¹ nebo Cys¹⁵) . Když je v KGF specificky odstraněn Cys¹ nebo Cys¹⁵, je analog o jednu aminokyselinu kratší než KGF. [Analoga KGF s delecí aminokyseliny jsou uváděna podle zbytku nacházejícího se v dané pozici v hotovém proteinu (bez signální sekvence) uvedeném v SEQ ID NO:2, následovaném pozicí aminokyseliny v závorkách a negativním znaménkem. Například analog v této skupině s delecí cysteinu na pozici 15 KGF (pozice 36 SEQ ID N0:2) je označen jako „C(15)~.] Místně specifické delece mohou být generovány s použitím místně zaměřené mutageneze, jak je to popsáno výše.

Do této skupiny také patří analoga, kde je Cys¹ a Cys¹⁵ KGF odstraněn díky zkrácení nebo deleci. Například charakteristická analoga KGF zahrnují zkrácení KGF o první tři aminokyselinové zbytky (Cys-Asn-Asp) nebo zkrácení KGF o osm prvních aminokyselin (Cys-Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln) spojených s delecí cysteinu na aminokyselinové pozici KGF 15 (tato analoga jsou uváděna jako AN3/C(15)- a AN8/C(15)-). Protože se methioninový zbytek objevuje přirozeně na čtvrté a deváté aminokyselinové pozici v přirozeném KGF, není nutný další Met kodon pro správnou iniciaci translace.

Jiná skupina zahrnuje molekuly u kterých jsou cysteiny na pozicích 1 a 15 KGF nahrazeny díky zkrácení a substituci. Například • · · · · · · · «*· ·· »* ·· ·« ·♦ charakteristickými analogy KGF jsou AN3/C(15)S a ÁN8/C(15)S. Takováto analoga zahrnují zkrácení tří prvních koncových aminokyselinových zbytků KGF nebo odstranění prvních osmi koncových amino zbytků KGF společně s náhradou cysteinu na aminokyselinové pozici 15 jinou aminokyselinou, například serinem.

Když jsou analoga KGF tvořena biologicky, t j . jsou produkty exprese v buňkách a ne výsledky syntézy na pevné fázi, proteolytické nebo enzymatické úpravy přirozeně se vyskytujících produktů atd.^nukleovéJíyseliny kódující. takovéto..polypeptidy-se.^· liší v jednom nebo více nukleotidech ve srovnání s přirozenou nukleotidovou sekvencí KGF. Tyto nukleotidy mohou být exprimovány a výsledný polypeptid purifikován jednou z mnoha metod rekombinantní technologie, které jsou odborníkům známy.

DNA sekvence, kódující celý nebo část analogů KGF, mohou zahrnovat kromě jiných věcí inkorporaci kodonu „preferovaných pro expresi ve vybraných hostitelských buňkách (např. „expresní kodony E. coli); zajišťujících místa pro štěpení restrikčními enzymy; zajišťujících další inicializační, koncové nebo mezilehlé nukleotidové sekvence (např. inicializační methioninový aminokyselinový zbytek pro expresi v buňkách E. coli} pro usnadnění konstrukce snadno exprimovatelných vektorů.

Předkládaný vynález také poskytuje rekombinantní molekuly nebo vektory pro použití v metodách pro expresi polypeptidu. Takovéto vektory se mohou skládat z DNA nebo RNA a mohou být kruhové, lineární, jednopramenné nebo dvoupramenné a mohou se vyskytovat přirozeně, nebo mohou být složeny z řady komponent a vyskytovat se pak přirozeně nebo mohou být syntetické.

Je známo mnoho příkladů takovýchto expresních vektorů. Komponenty vektorů, tj. replikony, selekční geny, zesilovače (enhancers) , promotory a podobné komponenty mohou být získány z přírodních zdrojů nebo známými postupy syntetizovány. V každém případě expresní vektory užitečné v tomto vynálezu obsahují alespoň jeden prvek řídící expresi, funkčně spjatý s vloženou molekulou nukleové kyseliny kódující polypeptidový analog KGF. Tyto řídící elementy jsou odpovědné za regulaci exprese polypeptidu z molekul r ϊ ΐ - 3 - - »β · 9 »» • · · · ♦ · · · · * «»· · * a*·· · · · · · · · ·· ·· 4» »· ·« ·* nukleových kyselin tohoto vynálezu. Užitečné řídící elementy zahrnují například lac systém, trp systém, operátory a promotory z fága lambda, glykolytický kvasinkový promotor, promotor z kvasinkového genu pro kyselou fosfatázu, kvasinkový faktor pro alfa párování (alpha mating factor) a promotory odvozené z adenovirů, viru Epstein-Barové, polyomy, opičích virů a rozličných retrovirů. Pro účely tohoto vynálezu může být ale použita řada jiných vektorů a řídících prvků vhodných pro expresi v prokaryontech nebo eukaryontech. ,,,...........____________ . ____

Příklady vhodných prokaryontních klonovacích vektorů zahrnují plasmidy z E. coli (např. pBR322, col El, pUC a F-faktor), přičemž preferovány jsou plasmidy pCFM1156 (ATCC 69702), pCFMl656 (ATCC 69576) a pCFM3102 (popsaný dále v části Příklady). Pro tyto účely může být také použita řada dalších vhodných expresních vektorů, z nichž jsou mnohé známé ze savčí, hmyzí, kvasinkové, houbové nebo bakteriální exprese. Transfekce příslušných hostitelských buněk těmito vektory může vést k .expresi polypeptidových analogů KGF.

Hostitelské mikroorganismy užitečné pro tento vynález můžou být bud prokaryontni nebo eukaryontní. Mezi vhodné prokaryontní hostitele patří E. coli (např. FM5, HB101, DH5a, DH10 a MC1061), kmeny Pseudomonas, Bacillus a Streptomyces, přičemž preferovaným organismem je E.coli. Mezi vhodné eukaryontní hostitelské buňky patří kvasnice a jiné houby, hmyzí buňky, rostlinné buňky a živočišné buňky, jako například COS (tj. COS-1 a COS-7) a opičí buněčné linie CV-1, dále 3T3 linie odvozené od Swiss, Balb-c nebo NIH buňky, myší HeLa a L-929 buňky, a křeččí CHO, BHK nebo HaK buňky. V závislosti na použitém hostiteli bude produkovaný rekombinantní polypeptid glykosylovaný savčími nebo jinými eukaryontními uhlovodíky nebo může být neglykosylovaný.

Preferovaná produkční metoda bude záviset na mnoha faktorech a úvahách; optimální produkční postup pro danou situaci bude odborníkům po minimálních experimentech jasný. Výsledný produkt exprese může být potom purifikován do téměř homogenního stavu s použitím známých technik. Typická purifikační procedura při produkci v prokaryontních buňkách zahrnuje rozrušení buněčné stěny a λ « »· * - 5 * • · · » * · * · 0 0 M* · 0 • 0 · · 0 · 0 · 0 0«

00 ·♦ 0· «· ·· vysokým tlakem nebo jinými způsoby, centrifugaci nebo filtraci k odstranění buněčných zbytků s následnou iontoměničovou chromatografii supernatantu nebo filtrátu a nakonec hydrofobní chromatografii. Jestliže je analog produkován v nerozpustné formě, používá se jiná purifikační technika skládající se z rozpuštění příslušných částic obsahujících analoga s následnou iontoměničovou chromatografii, dále rekonformaci proteinu a nakonec chromatografii využívající hydrofobní interakce. Vzorové purifikační techniky jsou uvedeny v běžně přístupném U. S.S.N 08 /323329, „ uvedeném.. 1.3., říj na.., 1994. Obecně U.S.S.N 08/323, 329 ukazuje metodu pro purifikaci keratinocytových růstových faktorů zahrnující: (a) získání roztoku obsahujícího KGF; (b) navázání KGF z roztoku z části a) na kationtový výměnný nosič; (c) vymytí KGF z kationtového iontového nosiče (d) průchod eluovaného roztoku z (c) vhodnou kolonou s molekulárním sítem nebo provedeni hydrofobní chromatografie vymytého roztoku z (c); a (e) získáni KGF z molekulárního síta nebo po hydrofobní chromatografii.

Pochopitelně, že u analogů může být provedena rychlá analýza jejich fyzikálních vlastností. Část Příklady, uvádí různé dobře známé zkoušky stability, ačkoliv specifický test pro analoga není kritický. Navíc úroveň biologické aktivity (např. vazba receptoru a/nebo afinita, mitogenní buněčně proliferační a/nebo in vivo aktivita) může být také testována s použitím různých zkoušek, z nichž jsou některé popsány v části Příklady. Pro zjištění, jestli analoga KGF vykazují dostatečnou biologickou aktivitu, se může použít řada dobře známých testů. Jeden takovýto test specificky zjišťuje u analogů KGF jejich schopnost kompetičně se vázat na receptor KGF (KGFR) s navázaným ¹²⁵I-KGF (Bottaro et al. (1990), J. Biol. Chem., 265:12767-12770; Ron et al. (1993), J. Biol. Chem., 268:2984-2988).. Alternativní metoda pro testování interakce KGFR s analogy KGF zahrnuje použití technik jako je analýza biospecifických interakcí v reálném čase (BIA) (Felder et al.

(1993), Molecular & Cellular Biology, 13:1449-1455). Navíc mohou být pro testování schopnosti analogů KGF stimulovat syntézu DNA použity mitogenní testy (Rubin et al. (1989), viz předchozí text).

• o

Konečně můžou být analoga KGF testována na schopnost stimulovat buněčnou proliferaci pomocí proliferačních testů (Falco et al. (1988), Oncogene, 2:573-578). Použitím jakéhokoliv shora zmíněného testovacího systému můžou být analoga KGF rychle otestována na jejich biologickou aktivitu.

V předkládaném vynálezu je pozornost zaměřena především na analoga, která si zachovávají plnou biologickou aktivitu KGF { tj. minimálně značně podobnou) in vitro nebo in vivo. Příklady KGF analogů s těmito vlastnostmi (jak bylo určeno jedním nebo více výše zmíněnými testy) jsou Č(1,15)S, AN3/C(15)S, ÁN3/C(15)-, ŮN8/C{15)S, ÁN8/C(15)-, ΔΝ15, ΔΝ16, ΔΝ17, ΔΝ18, ΔΝ19, ΔΝ20, ΔΝ21, ΔΝ22, ΔΝ23, ΔΝ24 nebo AN23/R(144)Q.

Analoga KGF mohou být dále modifikována, aby obsahovala dodatečné chemické struktury, které nejsou normálně částí peptidů. Takovéto odvozené struktury mohou zlepšit rozpustnost, absorpci, biologický poločas rozpadu, a podobné vlastnosti analoga KGF. Struktury mohou případně eliminovat nebo zeslabit jakékoliv nežádoucí vedlejší účinky proteinu. Struktury schopné zprostředkovat takovéto účinky jsou uvedené například v REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Do molekuly mohou být včleněny kovalentní modifikace reakcí cílového aminokyselinového zbytku peptidů s organickým pozměňovacím činidlem, které je schopné reakce s vybraným postraním řetězcem nebo terminálním zbytkem (T.E.Creghton (1983), PROTEINS: STRUCTURE AND MOLECULE PROPERTIES, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.7986). Polyetylenglykol (PEG) je jednou takovou chemickou strukturou, které bylo použito při přípravě terapeutických proteinových produktů. U některých produktů bylo ukázáno, že připojení polyetylenglykolu je chrání před proteolýzou (Sada et al. (1991), J. Fermentation Bioengineering, 71:137-139); metody pro připojení určitých polyetyienglykolových struktur jsou k dispozici. Viz U.S. Patent No. 4,179,337, Davis et al., „Non-Imunogenic Polypeptides, vydané 18. prosince 1979 a U.S. Patent No.

4,002,531, Royer,. „Modifying enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby, vydané 11. ledna 1977. Přehled obsahuje a »»

práce Abuchowski et al., v Enzymes as Drugs. (Holcerberg and Roberts, (eds.) pp. 367-383 (1981)). Pro připojení molekuly PEG k proteinu byla použita řada metod. Obecně jsou molekuly polyetylenglykolu připojené k proteinu přes reaktivní skupinu nacházející se na proteinu. Vhodné aminoskupiny pro takovéto připojení jsou například na lysinových zbytcích nebo na N-konci. Například Royer (U.S. Pat. No. 4,002,531, viz výše) použil pro připojení polyetylenglykolových molekul k enzymu redukující alkylaci. Podle EP 0 539 167, publikovaného 28. dubna 1993, Wright, „Peg Imidates and Protein Derivatives Thereof peptidy a organické sloučeniny s volnou aminoskupinou (či aminoskupinámi) jsou modifikovány odvozeninou PEGu nebo příbuzného ve vodě rozpustného organického polymeru. K modifikaci řady lysinových zbytků v proteinech pro připojení PEG molekuly přes reaktivní aminoskupinu se vztahuje U.S. Patent No. 4,904,584 Shaw, vydaný 27. února 1990..

Předkládaný vynález je dále zaměřený na složení jedné dávky účinné látky, která'může být.bezpečně aplikována orálně nebo neorálně pro léčení chorob u teplokrevných živočichů (jako například člověka). Takováto účinná látka může být ve formě lyofilizovaného nebo jinak dehydratovaného terapeutika nebo diagnostika, které může být rekonstituováno přidáním fyziologicky vhodného rozpouštědla.

Tím může být jakékoliv médium, jako je sterilní voda, fyziologický roztok, glukozový roztok, nebo jiný vodný uhlovodík (např. pólýoly, jako manitol, xylitol, nebo glycerol), které je schopno rozpustit suchou směs, které je slučitelné s vybraným aplikačním způsobem a které neinterferuje negativně s aktivními principy a použitými rekonstitučními stabilizátory. Ve specifickém případě je předkládaný vynález zaměřen na soupravu pro produkci jednoóávkové aplikační jednotky. Souprava obsahuje jednak obal se sušeným proteinem a pak druhý obal, s vodnou složkou, která obsahuje také rekonstituční stabilizátor. Co se týče koncentrace proteinu v roztoku - množství roztoku v každém obalu a obsah obalů (jedná se o vzájemně závislé parametry, které můžou být vhodně upraveny v závislosti na požadované koncentraci aktivní látky v aplikované • · 0 · jednotce dávky) může kolísat v širokém rozsahu, který bude jasný odborníkům.'

Podle vynálezu mohou být KGF analoga užitečná jako terapeutické nebo diagnostické látky a nebo jako činidla pro výzkum. Mohou být tedy použita v in vitro a/nebo in vivo diagnostických testech pro kvantifikaci KGF ve vzorcích pletiv nebo orgánů, nebo určení a/nebo izolaci buněk, které produkují KGFR (Bottaro et al. (1990), J. Biol. Chem., 265:12767-12770; Ron et al. (1993), J. Biol. Chem., 268:2984-2988). Pří testech pletiv nebo orgánů se zjistí méně radioaktivity ¹²⁵I-KGF analogu vázajícího se na KGFR (pří srovnání se standardní vazebnou křivkou analoga ¹²⁵IKGF) a to díky vazbě přirozeného KGF na KGFR. ¹²⁵I-KGF analog může být podobně použit pro detekci přítomnosti KGFR v různých typech buněk.

Tento vynález také předpokládá použití analoga KGF pro tvorbu protilátek proti peptidu - protilátek, které se také váží na přirozená KGF. V tomto případě se jedná o monoklonální nebo polyklonální protilátky, které jsou připraveny proti analogu KGF. Výsledné protilátky váží přednostně přirozený KGF, zejména když je tento protein ve své přírodní (biologicky aktivní) konformaci. Tyto protilátky se můžou použít pro detekci nebo purifikací přírodního KGF.

Vynález navíc předpokládá použití analogů KGF pro nalezení molekul vázajících s vysokou nebo nízkou afinitou KGF (využitelných, pro terapeutické aplikace) například pro účinné dodání KGF nebo jako inhibitor KGF aktivity. Pro identifikaci takovýchto vazebních molekul za fyziologických podmínek (tj. při 37 °C) je důležitá teplotní stabilita analogů KGF, protože jejich afinita vůči KGF může být silně závislá na teplotě a může se lišit oproti afinitě pozorované při 4 °C.

Pro použití in vivo mohou být KGF analoga doplněna aditivami. Mezi ně patři pufry, nosiče, stabilizátory, excipienty, ochranné látky, látky upravující tonus, antioxidanty atd. (např. látky ovlivňující viskozitu nebo plnidlo). Výběr konkrétních aditiv bude záviset na skladovací formě (tekutá nebo lyofilizovaná) a způsobu ♦ * · ’ r - r • · ·· v * ♦♦ * · · · « a a a « a · a a · ··· · · v a a a · · a a a a · aplikace analoga KGF. Vhodnou formu je možné nalézt v REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (poslední vydání), Mack Publishing Company, Easton, PA.

Analoga KGF mohou být aplikována v terapeuticky účinných dávkách na konkrétně poškozená pletiva, nebo při klinicky nedostatečném počtu nefibroblastových epiteliálních buněk. Oblasti, kde mohou být analoga KGF úspěšně použita zahrnují (ale nejsou omezena pouze na ně):

- stimulace, proliferace a diferenciace ačnexálních struktur (adnexal structures), jako jsou například vlasové folikuly, potní žlázy nebo tukové žlázy u pacientů s popáleninami a jinými částečnými nebo vážnými poškozeními

- urychlená reepitelizace lézí způsobených (epidermolysis bullosa),. což je defekt v přilnavosti epidermis na vespod ležící kůži (dermis) vedoucí často k otevřeným bolestivým puchýřům, které mohou způsobit vážná onemocnění

- k prevenci vypadávání vlasů způsobeném chemoterapii a k ošetření’ mužské plešatosti nebo progresivní ztrátě vlasů u mužů i žen

- pro ošetření žaludečních a dvanáctníkových vředů

- pro ošetření zánětlivých střevních onemocnění, jako např.

Crohnova choroba (postihující především tenké střevo) a kolitidy vyvolávající vředy (postihující především tlusté střevo)

- prevenci nebo zmírnění toxických vlivů radiačních nebo chemoterapeutických ošetření (tj. předběžné ošetření a/nebo ošetření po vlastním léčení) pro indukci faktorů působících na ochranu buněk nebo regeneraci nebo oboje

- stimulace produkce slizu v celém gastrointestinálním traktu

- indukce proliferace a diferenciace pneumocytů typu II, což může pomoci při léčbě nebo prevenci chorob jako je například „sklovitá membrána (hyaline membrane disease), tj. syndrom kojeneckých dýchacích problémů a průduškové a plicní displasie (infant respirátory distress syndrome and bronchopulmonary displasia) u nedonošených dětí

- stimulace proliferace a diferenciace průduškového a/nebo alveolárního epitelu s akutním nebo chronickým poškozením plic nebo • » • · ·» • · φ φ « · φ » • · · φ · · · φ* ··* φ · φ««· φφφφ · · · ·· ·« »· ·Φ φ« φφ insuficiencí díky dýchacím potížím (včetně vysokých hladin kyslíku), rozedmě plic (emphysema) nebo užívání chemoterapeutik poškozujících plíce, traumatům způsobeným respirátorem (ventilátor trauma) nebo jiným činitelům poškozující plíce

- zvýšená činnost jater k léčbě nebo prevenci hepatické cirrhosy, akutní selhání jater, škody způsobené akutní virovou hepatitidou a/nebo toxické poškození jater

- indukce regenerace buněk rohovky, například při léčbě odřenin rohovky

- indukce regenerace epiteliálních buněk při léčbě pokračující chorobě dásní (Progressive gum disease)

- indukce regenerace bubínkových epiteliálních buněk při léčbě poškození ušního bubínku a léčbě nebo prevenci počátku diabetes mellitus nebo jako doplněk úpravy při transplantaci ostrůvku buněk (an adjunct in the setting of islet cell transplantatlon)^:

Pacient, který potřebuje proliferující nefibroblastové epiteliální buňky bude ošetřen účinným množstvím analogu KGF. Pojem „účinné množství je takové množství analogu KGF, které je nezbytné pro vyvolání požadované odpovědi u ošetřeného pacienta a bude zpravidla určeno ošetřujícím lékařem. Mezi faktory ovlivňující množství aplikovaného analoga KGF bude patřit věk, všeobecný stav pacienta, léčená choroba atd. Typická dávka se bude pohybovat v rozmezí 0,001 mg až 500 mg na 1 kg tělesné hmotnosti.

Analog KGF může být podán teplokrevným živočichům (kam patří i člověk) ne-orálně (tj. IV, IT, IM, SC nebo IP cestou), orálně nebo lokálně. Analog KGF může být použit jednorázově nebo opakovaně v závislosti na nemoci a stavu pacienta. V některých případech může být analog KGF podáván jako adjuvaňs k jiné léčbě a také v kombinaci s jinými farmaceutickými preparáty.

Následující příklady slouží k lepší ilustraci předkládaného vynálezu. Je jasné, že uvedené postupy mohou být modifikovány bez toho, aby byl ovlivněn „duch vynálezu.

« · * · · ·

Příklady provedení vynálezu

Standardní metody používající postupy v následujících příkladech (nebo vhodné alternativní postupy) jsou uvedeny v běžně používaných manuálech pro molekulární biologii, jako například Molecular Cloning, Second Edition, Sambrook et al., Cold Spring · Barbor Laboratory Press (1987) a Cuřrent Protocols in Molecular Biology, Ausabel et al., Greene Publishing Associates/WileyInterscience, New York (1990).

Příklad 1: Příprava DNA kódující KGF a analoga KGF

Klonování celého genu lidského KGF (kódujícího polypeptid se sekvencí nativního KGF) bylo provedeno jednak polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) s RNA z živočišných buněk a pomocí PCR chemicky syntetizovaných (optimalizovaný kodon E. coli) oligonukleotidů („OLIGA). Obě procedury jsou popsány dále:

Byla provedena amplifikace s použitím,-RNA izolovaných z buněk (o kterých víme že produkují polypeptid) pomocí PCR. Nejprve se provede rozrušení buněk z buněčné linie lidských fibroblastů AG1523A (získané od Human Genetic Mutant Cell Culture, Repository; Institute For Medical Research, Camden, New Jersey) pomocí guanidin thiokyanátu; pak následuje extrakce (podle metody popsané v práci Chomzynski et al. (1987), Anal. Biochem., 172:156). S použitím standardního protokolu pro reversní transkripci z celkové RNA byla vytvořena cDNA pro KGF, PCR amplifikace (PCR č.l) genu KGF byla provedena s použitím cDNA KGF jako templátu a primerů OLIGO č, 1 a OLIGO č. 2, které kódují DNA sekvence bezprostředně na 5' a 3' genu KGF [teplotní cyklátor model 9600 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk,

CT) ; 28 cyklů, každý zahrnující denaturaci - jednu minutu při 94 °C, annealing - dvě minuty při 60 °C a elongaci - tři minuty při 72 °C] . Malé alikvotní části produktu první PCR reakce byly potom použity jako templát pro druhou KGF PCR amplifikaci (PCR č. 2) za podmínek shodných s první reakcí kromě teploty pro annealing, která byla 50°C. Pro expresní klonováni genu KGF byly dále použity • *

primery pro „nested PCR generující vhodná restrikční místa na obou koncích genu KGF - k modifikaci KGF DNA produktu z PCR č. 2 byly tak použity OLIGO č. 3a OLIGO č. 4 (začlenění restrikčních míst pro Mlul a'BamHI na 5' a 3' konci genu) [PCR 3; 30 cyklů, každý zahrnující denaturaci - jedna minuta při 94°C, annealing - dvě minuty při 60.°C a elongaci - tři minuty při 72 °C]. Tato DNA byla následovně štěpena restrikčními enzymy Mlul a BamHI, extrahovaná fenolem a precipitována etanolem.Poté byla resuspendována a ligována (s použitím T4 ligázy) do plasmidu pCFM1156 (obrázek 2A), který obsahuje „RSH signální sekvenci, čímž vznikl konstrukt RSHKGF (obrázek 3}.

Tímto ligačním produktem byly transformovány (podle metody popsané Hanahanem (1983) J. Mol. Biol., 166:557) buňky E. coli (kmen FM5 - ATCC:53911) a následně vysety na LB médium s kanamycinern při 28 °C. Několik vybraných transformantů bylo dále pěstováno v malých tekutých kulturách obsahujících kanamycin v koncentraci 20 pg/ml. 2 každé kultury byl isolován RSH-KGF plasmid a jeho DNA byla sekvenována. Vzhledem k vnitřnímu Ndel restrikčnímu místu v genu KGF nebylo možné přímo klonovat nativní sekvenci genu do příslušného expresního vektoru do míst ohraničeních Ndel a BamHI. Toho se dosáhlo trojcestnou ligací. Plasmid RSH-KGF byl štěpen v jedinečných restrikčních místech BsmI a Sstl a fragment DNA asi 3 kb velký (obsahující 3' konec KGF genu) byl izolován následnou elektroforézou v 1% agarózovém gelu. Další PCR (PCR č. 4) byla provedena za stejných podmínek jako PCR č. 3 s primerem OLIGO č’. 5 místo OLIGO č. 3. DNA produkt PCR reakce byl pak štěpen enzymy Ndel a BsmI a pomocí elektroforézy ve 4% agaróze byl izolován DNA fragment 311 párů bází dlouhý. Třetí fragment použitý v ligaci byl fragment DNA 1,8 kilobází dlouhý z pCFMH56 vyštěpený s Ndel a Sstl a izolovaný elektroforézou v 1% agarózovém gelu. Po následující ligaci (T4 ligáza), transformaci, selekci na kanamycinu a sekvenování DNA (jak je popsáno výše) byl vybrán klon obsahující konstrukt na obrázku 4 a tento plasmid byl označený jako KGF. Vzhledem k internímu ribosomálnímu vazebnému místu, které vede k tvorbě zkrácených produktů, byla sekvence KGF DNA mezi * » · ·«·· · « v * « · · ·· * · ·· v ··· * · « · » · ·· « · ««· « · *««· · · ♦ φ ««* • · ·· o «* ·· · · jedinečnými KpnI a EcoRl místy nahrazena chemicky syntetizovanými OLIGO (OLIGO 6 až OLIGO 11) tak, aby se minimalizovalo použití interního startovacího místa (obrázek 5).

OLIGO#1 (SEQ ID N0:7): 5'-CAATGACCTAGGAGTAACAATCAAC-3’

0LIG0#2 (SEQ ID NO:8): 5'-AAAACAAACATAAATGCACAAGTCCA-3’

OLIGO#3 (SEQIDN0:9): 5’-ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA-3'

OLIGO#4 (SEQ ID NO:10):

5'-ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA-3'

OLIGO#5 (SEQ ID NO:11):

5'-ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA-3'

OLIGO#6 (SEQ ID NO:12):

5'-CTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCC-3’

OLIGO#7 (SEQ ID NO:13):

5'-AAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTT-3' OLIGO#8 (SEQ ID NO:14):

5'-GCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTG-3'

OLIGO#9 (SEQ ID NO:15):

5'-TCTTGGGTGCCCTTGACTTTGCCGCGTTTGTCGATACGCAGGTAC-3' OLIGO#10 (SEQ ID NO:16):

5'-ACAGCáACAGTACGGATTTCCATAATATTGTAGTTGTTTTTCATC-3’ OLIGO#11 (SEQ ID NO:17):

5'-AATTCAGATTCAACACCTTTGATTGCAACGATACCA-3¹

OLIGA byla fosforylována T4 polynukleotid kinázou a poté tepelně denaturována. Jednopramenné (ss - single stranded) OLIGA potom byla ponechána vytvořit dvoupramenné (ds) fragmenty DNA pomalým snížením teploty na úroveň laboratoře. Poté byla použita T4 ligáza ke kovalentnímu připojení jak interních OLIGO shodných (sticky) konců tak celého ds OLIGO fragmentu do KGF plasmidu štěpeného enzymy KpnI a EcoRl. Nový plasmid byl označen jako KGF(dsd).

KGF gen s úplně optimalizovaným E. coli kodonem byl vytvořen amplifikaeí pomocí PCR s chemicky syntetizovanými OLIGO č. 12 až 24.

• · * • · ·♦· • · « • · « «· ·· • ’ « v v v « • ·· « · · · • · · * «»« · · • * » · · · ♦ ♦ ·· ·» ·*

0LIG0#12 (SEQ ID NO:18): 5¹-AGTTTTGATCTAGAAGGAGG-3’

OLIGO#13 (SEQ ID NO:19): 5'-TCAAAACTGGATCCTATTAA-3'

OLIGOU4 (SEQ ID NO:20) :

5'-AGTTTTGATCTAGAAGGAGGAATAACATATGTGCAACGACATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTGCTCCAGCCCGGAACGT-3’

0LIG0#15 (SEQ ID NO:21):

5'-CACACCCGTAGCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGTGTTCGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAA-3'

0LIG0#16 (SEQ ID NO:22):

5’-CGTGGTÁAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTACAACATCATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAA-3'

OLIGOU7 (SEQ ID N0:23):

5'-GGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGC GAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAA-3'

0LIG0#18 (SEQ ID N0:24):

5'-CTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGT-3'

OLIGO#19 (SEQ ID N0:25):

5'-ATCCCGGTTCGTGGT ' CCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAATAGGATCCAGTTTTGA-3'

OLIGO#20 (SEQ ID NO:26):5'-TACGGGTGTGACGTTCCGGG-3’ OLIGO#21 (SEQ ID NO:27) :5'-CTTTACCACGTTTGTCGATA-3 ' OLIGO#22 (SEQ ID NO:28):5'-ATTCAACACCTTTGATTGCA-3' OLIGO#23 (SEQ ID NO:29) :5'-CCAGGATCAGTTCTTTGAAG-3' OLIGOK24 (SEQ ID NO:30):5'-GAACCGGGATACCTTTCTGG-3'

OLIGA 12 až 24 byla navržena tak, aby celá DNA sekvence kódující nativní KGE byla representována OLIGY z „Watsonova nebo „Crickova pramene a aby po PCR by poskytla žádanou dvoupramenou DNA sekvenci (obrázek 6) [PCR č. 5, teplotní cyklátor model 9600 (Perkin-Elmer Cetus); 21 cyklů skládajících se z denaturace - 31 vteřin při 94 °C, annealingu - 31 vteřin při 50 °C a elongace - 73 °C po 31 vteřin; po těchto 21 cyklech byla PCR reakce zakončena závěrečným sedmi minutovým elongačním krokem]. Po PCR amplifikaci byl výsledný DNA fragment štěpen enzymy Xbal a BamHI a fragment 521 bp byl « » » » » ·««« • · ··· · i ·· · · 99 • 9 9 9 9 · · · · · · · · · · • * · » · · · « · · · ·· ·· ·· ·· ·· ·· ligován do expresního plasmidu pCFM1156, který byl štěpen stejnými enzymy. PCR č. 5 používala vnější primery (100 pmolú/100 μΐ rxn) OLIGO č. 12 a OLIGO č. 13 a lul/100 μΐ rxn KGF templátu odvozeného ligací (T4 ligázou) OLIGO č. 14 až 19 (OLIGO Č. 15 až 18 byly fosforylovány T4 polynukleotid kinázou) s použitím OLIGO č. 20 až 24 jako pomocných oligonukleotidů (band-aid oligos) pro ligaci (Jayraman et al. (1992), Biotechniques, 12:392). Konečný produkt byl označená jako KGF(optimalizovaný kodon).

Všechna zde popsaná analoga KGF jsou složena z částí DNA sekvencí nalézajících se v KGF (dsd) nebo KGF (optimalizovaný kodon) nebo z kombinace obou. Tyto sekvence jsou dále modifikované inzercí do vhodných restrikčních míst DNA sekvencí, které kódují specifická aminokyselinová KGF analoga, s použitím jedné nebo více technik pro syntézu DNA fragmentů popsaných výše. Jakýkoliv analog může být vytvořen v celé svém rozsahu jednou z výše popsaných technik. Obecně se při konstrukci OLIGO používali optimalizované £'. coli kodony tam, kde to bylo vhodné, i když přítomnost optimalizovaných E. coli kodonů (v části nebo v celku jakéhokoliv z genů, kde byl tento vliv zjišťován) nezvýšila významně výnos proteinu, který mohl být získán z kultivovaných bakteriálních buněk. Obrázky 7-24 a 37-50 jsou uvedené jako vhodný příklad specifické nukleotidové a aminokyselinové sekvence konstruktu analoga KGF: C(1,15)S, (obrázek 7).

Příklad 2: Produkce v E. coli

Při klonování analogů genu KGF byly použity tři různé expresní plasmidy. Jednalo se o pCFM1156 (ATCČ 69702), pCFMl656 (ATCC 69576) a pCFM3102 (obrázky 2A, 2B a 2C). Plasmid p3102 může být odvozen z plazmidu pCFM1656 sérií místních mutagenezí (změn bází) pomocí PCR s přesahujícími oligo (PCR overlaping oligo mutagenesis).

Začíná se na BglII místě (v plasmidu pCFM1656, 180 pár bází) bezprostředně u 5' replikačního promotoru plasmidu, PcopB, a • · · » · ·»· • * · • * · »* ·· * t ♦ · · • · v* • · • * ♦ · · ·

Β · · · • · * « * • · ·

99 pokračuje se směrem ke genům replikace plasmidu, přičemž dochází k těmto změnám:

PCFM1656 bp #	bp in pCFMl656	bp changed to in pCFM31O2
# 204	T/A	C/G
# 428	A/T	G/C
# 509	G/C	A/T
# 617	—	insert two G/C bp
# 677	G/C	T/A
# 978	T/A	C/G
# 992	* G/C	A/T
# 1002	A/T	C/G
# 1005	Č/G	T/A
# 1026	A/T	T/A
# 1045	C/G	T/A
# 1176	G/C	T/A
# 1464	G/C	T/A
# 2026	G/C	bp deletion
# 2186	C/G	T/A
# 2479	A/T	T/A
# 2498-2501	AGTG TCAC	GTCA CAGT
# 2641-2647	TCCGAGC AGGCTCG	bp deletion
# 3441	G/C	A/T
# 3452	G/C	A/T
# 3649	A/T	T/A
# 45-56	—	insert bps
(SEQ ID	NO:43) 5’-GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG-3'
(SEQ ID	NO:4 4) 5’-CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC-3'

Jak je vidět z výše uvedeného, plasmidy pCFM1156, pCFMl656 a pCFM3102 jsou si vzájemně velmi podobní a obsahují mnoho stejných restrikčních míst. Plasmidy byly vybrány podle jejich vhodnosti a části vektorové DNA mohou být jednoduše změněny pro potřeby nových konstruktů. Hostitelským organismem použitým pro všechna klonování byla E. coli, kmen FM5 {ATCC: 53911) a transformace byla prováděna podle metody Hanahana (1983, viz předchozí text) nebo elektroelucí s použitím přístroje Gene Pulser transfection apparatus (BioRad • · 000 · · 00 0 ♦ 00 0 «0 0 0 ® 00 00 000 « 0 0000 0000 000 00 00 * 00 00 00

Laboratories, lne., Hercules, CA, USA), podle protokolu dodaného výrobcem.

Nejprve bylo připraveno malé čerstvé inokulum žádaného rekombinantního klonu E.coli, obsahujícího na jednom ze tří pCFM vektorů žádaný konstrukt. Do dvoulitrové lahve obsahující 500ml Luriova bujónu bylo přeneseno 0,1 ml- zmražené zásobní kultury vhodného kmene v glycerolu. Kultura byla třepána při 30°C po 16 hodin. Poté byla kultura přenesena do 15 1 fermentoru obsahujícího 8 1 sterilního media používaného pro fermentace ve větších objemech (Tsai, et al.(1987), J.Industrial Microbiol·., 2:181-187).

Na začátku fermentace bylo dodáváno živné, medium Feed #1 (Tsai, et al. (1987), víz předchozí text). V okamžiku, kdy hodnota OĎ600 dosáhla hodnoty 35, byla rychlým zvýšením teploty kultury na 37°C indukována exprese žádaného analogu KGF. Při této teplotě se plasmid amplífikuje. Po dvou hodinách při 37°C byla teplota kultury dále rychle zvýšena na 42°C, čímž byl denaturován Cl represor. Přidávání Feed 1 bylo přerušeno a místo něj bylo poté přidáváno živné medium Feed 2 v množství 300 ml za hodinu. Feed 2 obsahovalo 175g/l peptonu (trypticase-peptone), 87,5g/l kvasničného extraktu a 260g/l glukosy. Po jedné hodině kultivace při 42°C byla teplota kultury snížena na 36°C a tato teplota byla dále udržována po následujících šest hodin.

Fermentor byl poté zastaven a buňky byly koncentrovány centrifugaci v plastikových pytlících vložených do jednolitrových centrifugačních kyvet. Medium bylo centrifugováno 60 minut při 400 otáčkách za minutu. Supernatant byl poté odebrán a pelet (sedimentované buňky) byl zmražen při -90°C.

Následujícím způsobem byla purifikována tato analoga KGF (získána expresí v E. Coli)·. přirozený KGF, C(1,15)S,

C(1,15)S/R(144)E, C(1,15)S/R(144)Q, ΔΝ15, ΔΝ23 a áN23/R(144)Q.

Pelet (hustá buněčná suspenze)získaný z vysokohustotní fermentace byl resuspendován pomocí vhodného výkonného (poskytujícího velké střižné síly) mixeru při 4°C v roztoku 0,2 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH

7,5 tak, aby výsledná suspenze byla 10-20% (hm./obj.).

e ···· · · ·· φ · φφ • · ♦ · » · φ · «· φφ· φ * φ φ φ φ ··· φ φ φφ» ·φ φφ φφ »φ φφ

Resuspendované buňky byly poté lysovány trojitým homogenizováním v homogenizéru (APV Gaulin, lne., Everett, MA, USA). Homogenát vytékající z homogenizátoru byl ochlazován na 4-8°C pomocí vhodného chladícího zařízení. Zbytky buněk byly odstraněny centrifugací lysátu při 4200 otáčkách za minutu, 4°C, po dobu 30-60 minut v centrifuze J-6B (Beckman Instruments, lne., Brea, CA, USA, použitý rotor JS 4.2). Supernatant byl poté opatrně dekantován a nanesen na předem připravenou kolonu (450ml, 5 cm x 23 cm) SSepharosy Fast Flow (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA). Kolona byla ekvilibrována roztokem 0,2 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5, při 4°C. Poté byla kolona promyta 2250 ml (pětinásobný objem kolony) roztoku 0,4 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5, p^ři 4°C. Purifikovaný protein byl eluován z kolony 5 1 roztoku 0,5 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5. Absorbaňce eluátu při 280nm byla kontinuálně zaznamenávána a eluát byl jímán do frakcí o objemu 50 ml. Frakce obsahující'eluované látky (identifikované pomocí absorbaňce při 280nm) byly dále analyzovány pomocí SDS-PAGE elektroforézy (14% gel). Touto metodou byla potvrzena přítomnost požadovaného proteinu ve frakcích.

Frakce obsahující požadované proteiny byly spojeny a následně k nim byla přidána destilovaná voda v poměru 1:1. Zředěný roztok byl poté nanesen na předem připravenou kolonu (450ml, 5 cm x 23 cm) S-Sepharosy Fast Flow ekvilibrovanou roztokem .0,4 M NaCl v 20 mM. NaPO₄, pH 6,8, při 4°C. Kolona byla poté promyta 2250 ml roztoku 0,4 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 6,8. Proteiny byly poté eluovány dvacetinásobným objemem kolony pomocí lineárního gradientu roztoku NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 6,8. Koncentrace NaCl se pohybovala od 0,4 M do 0,6 M. Opět byly jímány 50 ml frakce, při současném měření absorbaňce eluátu při 280nm. Frakce obsahující purifikovaný protein (stanoveno pomocí 14% SDS PAGE) byly spojeny a zkoncentrovány filtrací přes membránu (YM-10, 10000 molecular weight cutoff) v 350 ml nádobách za současného míchání (Amicon, lne. Mayberry, MA, USA) na výsledný objem 30-40ml.

Koncentrát byl poté nanesen na předem připravenou kolonu (1300ml, 4,4cm x 85cm) Superdex-75 (Pharmacia) ekvilibrovanou » · · · · . · ··' · · ·· • · · · ·* · · · · ♦ · ··· · · • · e * · · » · · · ι« ·· ·· ·· ·· ·· pufrem obsahujícím IX PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Salině, „D-pbs, bez obsahu vápenatých a hořečnatých iontů) nebo 0,15 M roztokem NaCl v 20 mM NaPO^, pH 7,0. Po nanesení vzorku byly proteiny eluovány z kolony použitím kolonového pufru. Byly jímány desetimililitrové frakce a ty, které obsahovaly požadovaný analog (stanoveno pomocí 14¾ SDS-PAGE) byly spojeny. Koncentrace proteinů v takto získané frakci byla běžně asi 5-10 mg/ml. Pokud není uvedeno jinak byly všechny výše uvedené kroky prováděny při 4°-8°C.

Alternativní postup purifikace byl použit v případě přirozeného KGF, C (1,15)S a ΔΝ23. Pokud není uvedeno jinak byly všechny kroky prováděny při 23 ± 5°C; tuto teplotu měly i veškeré použité roztoky a zařízení.

Po dokončení produkční fáze bakteriální fermentace byla buněčná kultura ochlazena na 4-8°C a buňky byly izolovány centrifugací či jiným podobným způsobem. Na základě očekávaného výtěžku proteinu na jednotku buněčné hmoty a množství požadovaného purifikovaného proteinu bylo přiměřené množství buněčné hmoty resuspendováno v pětinásobku (váhově) slabého pufru (0,2 M NaCl, 20 mM NaPO₄, pH 7,5). Buňky byly resuspendovány na homogenní suspenzi pomocí vysokoobrátkového (high shearing) mixeru. Teplota buněčné suspenze byla během homogenizace udržována na 4-8°C.

Buňky byly poté lysovány tlakem, např. dvojnásobnou homogenizací buněčné suspenze ve vhodně velkém buněčném ' homogenizátoru. Homogenát byl udržován chladný (5 ± 3°C).

K vyčištění buněčného lysátu byl použit předem připravený „hluboký filtr (depth filtr housing, Cuno,lne.,Meriden. CT, USA) vybavený filtrem s odpovídající plochou. Filtr byl ekvilibrován přiměřeným množstvím 0,2 M NaCl, připraveného v 20 mM NaPO₄, pH 7,5.

Ekvilibrace a promytí bylo prováděno při 5 ± 3°C. Po vyčištění lysátu filtrací přes vhodně upravený filtr byl tento promyt roztokem 0,2 M NaCl. v 20 mM NaPO₄, pH 7,5. Filtrát a všechny další promývací roztoky byly jímány do chlazené nádoby odpovídajícího objemu. Všechny operace byly prováděny při teplotě nižší než 10°C.

• « ·Β· · · *Β Β V Β* « ·Β · » · · * · · ··*· · «·Β· «··« » · Β ·· ·· ·· ·« »Β ·»

Lysát byl dále přečištěn na předem připravené koloně SPSepharosy Fast Flow obsahující minimálně 1 ml Sepharosy na 2g buněk. Kolona SP-Sepharosy Fast Flow byla ekvilibrována vychlazeným (5 ± 3°C) 0,2 M roztokem NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5. Teplota kolony byla udržována na hodnotě nižší než 10°C. Přečištěný lysát (5 ± 3°C) byl poté nanesen na kolonu iontoměniče a absorbance eluátu při 280nm byla kontinuálně monitorována. Po nanesení vzorku byla kolona promyta vychlazeným 0,2 M roztokem NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5 a následně ještě promyta 0,3 M roztokem NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5 při teplotě 23 + 5°C.

Požadovaný protein byl eluován pomocí lineárního gradientu NaCl o koncentraci 0,2-1 M, připraveného v 20 mM NaPO₄, pH 7,5. Převážná část produktu byla sebrána v několika frakcích na základě měření absorbance při 280nm.

K oxidaci volných SH skupin byl proveden oxidační krok. U proteinů se změněným obsahem cysteinu, (v porovnání s přírodním KGF) bylo přidáno oxidační činidlo (např. cystamin dihydrochlorid, nebo jiné vhodné oxidační činidlo, například cystein, oxidovaný glutathion nebo ionty Cu²⁺) tak, aby výsledná koncentrace byla 120 mM a pH bylo upraveno na 7-9,5. V případě, že byl použit cystamin dihydrochlorid, bylo pH upraveno na 9,0 ± 0,3. Oxidace byla prováděna při 10-30°C po vhodnou dobu. V případě přírodního KFG byla oxidace provedena přídavkem vhodného množství (NH₄)₂SO₄, např. 1-2 M (NH₄)₂SO₄ a pH bylo upraveno na hodnotu 7,5-9,5 , přičemž teplota byla udržována na 23 ± 5°C po přiměřenou dobu.

Po oxidaci bylo pH upraveno na hodnotu pohybující se mezi 6,5 a 9,5. V případě potřeby byl do roztoku přidán pevný (NH₄)₂SO₄ tak, aby jeho výsledné koncentrace nepřesáhla 2 M koncentraci. Roztok byl zbaven pevných částic přečištěním filtrací přes vhodný filtr.

Filtrát - oxidovaný produkt, byl dále dělen pomocí HIC (hydrophobíc interaction chromatography). Jako matrice pro HIC byl použit Butyl-650M Toyopearl (Tosohaas, lne., Montgomeryville, PA, USA). Roztok obsahující protein byl· nanesen na kolonu, která byla předem ekvilibrována roztokem obsahujícím 2 M' (NH₄)₂SO₄, 0,15 M • · ··· · · «β · ο «· • · · · · · · · · « ·« · « 9 « « 9 · · * · · · I · ·· ·· ·· *· ··

NaCl, 20 mM NaP0₄, pH 7,0. Po nanesení vzorku byla kolona promyta roztokem 2 M (ΝΗ₄)₂3Ο₄, 0,15 M NaCl a 20 mM NaPO₄, pH 7,0. Požadovaný protein byl poté eluován snižujícím se lineárním gradientem 2 až-0 M (NH₄)₂SO₄, který byl rozpuštěn v roztoku 0,15 M NaCl a 20 mM NaPO₄, pH 7,0. V okamžiku, kdy se začal požadovaný protein z kolony vymývat,, což bylo indikováno zvyšující se absorbancí eluátu při 280 nm, byly jímány frakce. Část každé frakce byla poté analyzována pomocí SDS-PAGE. Frakce obsahující požadovaný protein byly spojeny, dobře promíchány a byl stanoven objem takto získané spojené frakce a koncentrace proteinů v této spojené frakci.

Spojený eluát po NIC, obsahující protein, byl poté zkoncentrován a eluční pufr vyměněn. Běžně byly proteiny zkoncentrovány na 5,0-10,0 mg/ml. Ultrafiltrace byla provedena s použitím ultrafiltračního zařízení vybaveného kazetovým systémem PTGC Pellicon (Millipore·, Inc., Bedford, MA, USA) s membránami o vhodné velikosti pórů.

Po zkoncentrován! byl vzorek diafiltrován proti vhodnému pufru. Vzorek vyšlý z koncentračního kroku byl diafiltrován proti roztoku obsahujícím 0,15 M NaCl a 20 mM NaPO₄, pH 7,0, a to tak dlouho, dokud se nelišila vodivost koncentrátu od vodivosti roztoku 0,15 M NaCl a 20 mM NaPO₄, pH 7,0 o méně než 5%.

Kromě toho byl koncentrovaný a diafiltrovaný vzorek obsahující proteiny přefiltrován přes filtry Posidyne s velikostí pórů 0,.l μπι (Pall, IncCortland, NY, USA). Důvodem bylo odstranění vysráženého materiálu a bakteriálních éndotoxinů, které se mohou ve vzorku vyskytovat. Po stanovení koncentrace proteinů v roztoku a na základě požadavku na konečnou koncentraci produktu byl roztok . zředěn roztokem 0,15 M NaCl a 20 mM fosforečnanu draselného, pH 7.0. Závěrem byla provedena sterilizace filtrací přes 0,22 gm filtr. Konečný produkt byl přenesen do apyrogenní nádoby ke skladování(cca při 5^aC) před dalším zpracování.

B. Analýza • 00· • ·· t » »e • 0 · 0 • t 00 · · 0 00 00

Analýza byla provedena s použitím přirozeného KGF, C(1,15)3, C(1,15)S/R(144)Q, ΔΝ15, ΔΝ23 a AN23/R(144)Q. Všechny tyto látky byly připraveny s použitím E-coli.

Konformačnní stabilita

Polypeptidy byly porovnávány vzhledem ke své stabilitě během skladování, teplotě „tepelného rozbalení (thermal unfolding transition temperatures) T_m a stabilitě v širokém spektru pH.

Stabilita během skladování

Nativní KGF a C (1,15)3 byly inkubovány při 37°C po dobu cca 24 hodin a'poté byl stanoven obsah zbylých proteinů. Výsledky jsou shrnuty na obrázcích 24 až 26.

Na obrázku 25 je porovnáván nativní KGF s C(1,15)3 při skladování v 20 mM roztoku fosforečnanu sodného, 0,15 M NaCl, pH 7,0'při 37°C po 27 hodin. C(l,15) vykazuje signifikantní nárůst množství rozpuštěného proteinu relativně vůči nativnímu KGF.

Na obrázku 26 je porovnáván nativní KGF s C(Í,15)S při skladování v 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,0 při 37’C. Opět zde C(l,15)S vykazuje relativně zvýšenou stabilitu vůči nativnímu KGF.

Na obrázku 27 je porovnávána stabilita nativní KGF, ΔΝ15 a C(1,15)S při skladování v PBS a v 50 mM NaPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,0 při 37°C po 18 hodin. Množství rozpuštěného proteinu je mnohem vyšší v roztoku s vysokým obsahem fosforečnanu než v roztoku PBS (100 versus 65%). ΔΝ15 a také C(1,15)S vykazují jasně zvýšenou stabilitu v porovnání s nativním KGF. ΔΝ15 a C(1,15)S dával také 100% výtěžnost v roztoku s vysokým obsahem fosforečnanů jak lze očekávat z výsledků s nativním KGF.

Bylo též provedeno jedno předběžné srovnání stability během skladování mezi C (1,15,40)S a C(40)S (který je kódován bázemi 201 až 684 sekvence SEQ ID NO:1, s výjimkou, že Ser^í0 je kódován AGA) a • *· • « · « • » e • 4 ··

mezi C(l,Ϊ5,102) a C(102)S (který je kódován bázemi 201 až 684 sekvence SEQ ID N0:l, s výjimkou, že Ser¹⁰² je kódován AGG).

Výsledky (data nejsou ukázána) naznačují sníženou stabilitu (např. méně rozpustného proteinu po inkubaci při 37°C). Nicméně množství rozpustného správně sbaleného C(1,15,40)S proteinu, který byl purifikován z média bylo vyšší než množství C(40)S, což předpokládá, Že C(1,15,40)S může být ve skutečnosti stabilnější a že výsledky porovnávacího pokusu jsou neprůkazné. Předkládaný vynález zahrnuje přednostně analoga KGF, která mají jiné substituce než substituce na Cys⁴⁰, Cys¹⁰² a Cys¹⁰⁶ a přednostně vylučují C(l,5,40)S, C (1,15,10 2) S a C(1,15, 40,102,016).

Schopnost C (1,15)S/R(144)Q a ŮN23/R(144)Q zamezit agregaci při zvýšené teplotě byla též testována. Vzorek obsahující 0,5 mg/ml proteinu byl připraven v D-PBS. 0,5 ml každého ve vzorků bylo přeneseno do třímililitrových skleněných lahviček typu 1 (type-1 glass vials). Lahvičky byly uzavřeny gumovou zátkou a 13 mm hliníkovým snadno vyjímatelným těsněním (flip-off aluminium seal).Tyto lahvičky byly poté vloženy do inkubátoru s teplotou 37°C. V předem stanovené časové intervaly byly lahvičky odebrány a vzorky byly analyzovány vzhledem ke ztrátě rozpustných proteinů. Viditelná sraženina byla odstraněna centrifugací 250μ1 každého vzorku přes 0,22 μιη filtr Spin-X™ (Costar, Cambridge, MA, USA). Rozpustné proteiny ve z filtrovaném roztoku byly následně analyzovány pomocí HPLC(size exclusion). Množství rozpustného proteinu bylo stanoveno integrací plochy píku na chromatogramu HPLC a vynesením výsledků jako funkce závislosti na době inkubace při 37°C. Výsledky jsou ukázány na obrázku 27.

Poločasy ztráty rozpustných monomerních proteinů byly odhadnuty z těchto kinetických křivek. Tabulka 1 ukazuje poločasy „rozpadu pro zbývající rozpustné KGF při skladování při 37°C pro tyto proteiny.

Tabulka 1

Poločas rozpadu rozpustných, monomerních proteinů • ♦ ·Φ· · · ·· · · ·· • · φ · φ · · φ φ · ·ΦΦ φ ·

ΦΦ·· φ φ * φ φ φ φ • Φ ·· ·· φφ «φ ··

Protein	tl/2 (dny)
Nativní KGF	0,6
ΔΝ2 3	1,1
C(l,15)	1,2
C(1,15)S/R(144)Q	13,3
AN23/R144Q	22,3
C(1,15)S/R(144)E	38,0

Jak je vidět z výše uvedené tabulky 1 a obrázku 28, je nativní KGF agregován nejrychieji s poločasem rozpustnosti 0,6 dne.

C(1,15)S/R(144)Q, AN23/R(144)Q a C (1,15)S/R(144)E vykazují značný nárůst rozpustného poločasu a to 13,3, 22,3 a 38 dní.

Teplotní rozbalení

Teplotní rozvinutí bylo monitorováno pomocí cirkulárního dichroismu (CD) při 230 nm s použitím spektropolarimetru J-720 (Jasco, lne., Easton, MD, USA) vybaveného teplotním kontrolním systémem typu PTC-343 Peltier. Pro analýzu CD byly jednotlivé vzorky obsahující 0,1 mg/ml polypeptídu, které měly být analyzovány, připraveny v D-PBS (Life Technologies, lne., Grand Island, NY, USA). 2,5 ml každého ze vzorků bylo přeneseno do pravoúhlé křemenné (Suprasil - Heraeus Quarzschmelze, GmbH, Hnau, Germany) desetimilimetrové fluorescenční kyvety (Hellma Cells, lne., Jamaica, NY, USA). Kyveta byla vložena do teplotně kontrolovaného systému spektropolarimetru typu Peltier. Teplotní rozvinutí bylo prováděno rychlostí 50°C za hodinu. Změny v elipticitě byly monitorovány při 230 nm jako indikátoru rozvinutí. Teplota T_m byla pro každý vzorek stanovena změřením teploty při které bylo 50% molekul proteinu v roztoku rozvinutých (Biophysical Chemistry, Cantor and Schimmel (eds), W.H.Freeman and Co. San Francisco (1980). Hodnoty Tm každého ze tří proteinů jsou uvedeny v tabulce 2.

• · ·φ • ·· a · ·

Tabulka 2

Hodnoty bodů tání (melting temperature)

Protein	Tm (°C)
Nativní KGF	54,0
ΔΝ15	55,0
C(1,15)	55,0
ΔΝ23	56,0
C(1, 15)S/R(144)Q	62,5
AN23/R144Q	63,0
C(1,15)S/R(144)E	63,5

Jak ukazují tyto výsledky, C(1,15)S a ΔΝ15 mají hodnotu Tm o jeden stupeň vyšší v porovnání s nativním KGF. ΔΝ23 má Tm opět o jeden stupeň vyšší. Nicméně substituce R144Q na C (1,15)S/R(144}Q či ΔΝ23 přidá zvýšení Tm o více než 6°C a více než 7°C v porovnání s nativním KGF. Kromě toho je Tm u C (1,15) S/R (144) E o více než 9°C vyšší než Tm nativního KGF.

pH

Stabilita v rozmezí pH byla porovnávána u C(1,15)S/R(144)Q a C(1,15}S/R(144)E s nativním pH. Rozdílné pH bylo upravováno v roztocích D-PBS přídavkem koncentrované HCl nebo NaOH. Přibližně 2,35 ml D-PBS s rozdílnou hodnotou pH bylo smícháno s 100 μΐ 2,45 mg/ml proteinu KGF v křemenné kyvety. Tyto vzorky byly teplotně rozvinuty rychlostí 50° za hodinu a monitorovány s použitím CD při 230 nm. Obrázek 29 ukazuje T_m jako funkci pH pro nativní KGF,

C(l,15)S/R(144)Q a C(1,15)S/R(144)E. V testovaném rozmezí pH mají C(1,15)S/R(144)Q a C(1,15)S/R(144)E vždy vyšší T_m než nativní KGF.

Biologická aktivita in vitro * «·« e · « · ·

Mitogenní aktivita C(1,15)3, ΔΝ15, ΔΝ23, AN23/R144Q,

C(1,15)S/R(144)Q a C(1,15)S/R(144)E byla stanovena in vitro jako funkce koncentrace proteinů a polovičky maximálních koncentrací. Tato funkce byla stanovena měřením příjmu [³H] thymidinu buňkami Balb/MK (podle metody Rubina et al. (1989, viz předchozí text). Obecně byla koncentrace každého z analogů KGF stanovena s použitím in vitro biologického testu a vztažena vůči známému standardu nativního KGF. Každý analog KGF byl poté zředěn a testován na biologickou aktivitu s použitím Balb/MK biologického testu. Vzorky byly nejdříve naředěny pomocí media složeného z 50% Eagle's MEM média (připraveného na zakázku), 50% F12 taktéž připraveného na zakázku, 5 gg/ml transferrinu, 5 ng/ml seleničitanu sodného,

0,0005% HSA a 0,005% Tween 20. Vzorky KGF byly poté přidány do 96 jamkových destiček Falcon Primeria, v kterých byly již Balb/MK buňky. Bylo měřeno zabudovávání [³H] thymidinu během syntézy DNA. Tato inkorporace byla poté přepočítána na vliv přirozeného KGF porovnáním se standardní křivkou pro přirozený KGF. Výsledky jsou presentovány na obrázcích 30 až 35. Jak je z těchto obrázků vidět, testovaná analoga KGF popsaná na obrázcích 29 až 34 mají s nativním KGF srovnatelnou aktivitu.

Příklad 3: Produkce v savčích buněčných kulturách.

Tento příklad popisuje expresi, izolaci a charakterizaci dvou biologicky aktivních rekombinantních KGF (rKGF), produkovaných v savčím expresním systému.

Lidský gen pro KGF byl izolován pomocí PCR, amplifikaci cDNA získané z buněk normálních kožních lidských fibroblastů (Clonetec, lne;, Palo Alto, CA, USA). cDNA byla připravena pomoci reverzní transkriptázi a poté byla použita PCR k amplifikaci genu pro KGF. OLIGO#25 a OLIGO#26' byly použity k amplifikaci genu z cDNA a OLIGO#27 a OLIGO#28 byly pomocí druhé PCR amplifikace použity k vnesení restrikčních míst HindlII a Bglll na konce fragmentu, tak jak je vidět na obrázku 1.

« ·· • · · • · ·

OLIGO#25 (SEQ ID N0:69): 5'-CAATCTACAATTCACAGA-3'

OLIGO#26 (SEQ ID NO:70): 5’-TTAAGTTATTGCCATAGG-3'

OLIGO#27 (SEQ ID NO:71): 5'-AACAAAGCTTCTACAATTCACAGATAGGA-3'

OLIGO#28 (SEQ ID N0:72): 5'-AACAAGATCTTAAGTTATTGCCATAGG-3'

Následovalo klonování a potvrzení sekvence DNA. Poté byl gen pro KGF použit. Amplifikace byla provedena s použitím OLIGO#29 a OLIGO#30.

OLIGO#29 (SEQ. ID. N0:73) :

5'-CGGTCTAGACCACCATGCACAAATGGATACTGACÁTGG-3'

OLIGO#30 (SEQ. ID. N0:74):

5¹ -gccgtcgacctatt’aagttattgccatággaag-3 ’

Primer - OLIGO#29 - (sense primer) obsahoval místo Xbal a Kozákovu translační sekvenci (5'-CCACC-3')(consensus Kozák translationn sequence) před startovacím kodonem ATG ve směru k 5' konci. Antisence primer - OLIGO#3Q - obsahoval klonovací místo Sáli a další stop kodon. Po 18 cyklech amplif ikace PC.R (30 sekund denaturace při 94°C, 40 sekund annealing při 55°C a 40 sekund elongace při 72°C) byl produkt štěpen Xbal a Sáli a ligován se stejně vyštěpenoii DNA žpDSRa2 (podle metody Bourdrela et al.

(1993), Protein Exp. and Purif, 4:130-140 a Lu et al. (1992),

Arch.Biochem.Biophys.298: 150-158). Výsledkem byl plasmid KGF/pDSRa2, v kterém byl lidský gen pro KGF umístěn mezi časný promotor SV40 a α-FSH polyačenylovou sekvenci. Byly vybrány dva klony a analýzou sekvence DNA se potvrdila konstrukce žádaného vektoru.

Dva mikrogramy DNA KGF/pDSRa2 byly poté linearizóvány s použitím Pvul. CHO buňky (Chinese hamster ovary cells) byly den před použitím vysety v množství 0,8 x 10⁶ buněk na 60 mm petriho misku. Takto připravená vajíčka byla transfekována připravenou DNA s použitím standardní metody vysrážením pomocí vápenatých a fosfátových iontů (Bourdrel et al., viz předchozí text). Po dvou φ ··· • *· «·« ···· · * · • · ·· ·· ·» ·· *· týdnech byly vybrány jednotlivé kolonie a přeneseny na 24 jamkové destičky. Upravená média se po dosažení konfluence považovala za prostá séra a aliquoty byly analyzovány s využitím Western blotů a s použitím polyklonálního králičího antisera proti lidskému KGF exprimovanému v E-coli.

Western bloty byly provedeny nanesením vzorku na 12,5 % (hm./obj.) SDS polyakrylamidové gely a následnou elektroforézou. Poté následovalo přeneseni proteinů pomocí semidry elektroblotovacího zařízení (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA, USA) na nitrocelulózovou membránu. Přenesení probíhalo jednu hodinu při 400 mA. Jako přenosový pufr byl použit 20 mM Tris, 150 mM glycin a 20% metanol. Nitrocelulózové membrány byly blokovány inkubací v roztoku 10% normálního kozího sera v PBS. Jako primární protilátky bylo použito králičí antiserum připravené proti KGF z E-coli. Pro použití byly protilátky ředěny 1:10000 v normálním kozím séru v PBS a inkubovány 12 hodin při pokojové teplotě s blokovanými nitrocelulózovými membránami. Nenavázané protilátky byly poté odstraněny třemi třicetiminutovými promytími v PBS.

Nitrocelulózové membrány byly poté inkubovány ve 100 ml roztoku 1% normálního kozího séra v PBS obsahujícího sekundární protilátky (Vectastain bíotinylované kozí protilátky proti králičímu IgG, Véctor Labs, Burlingame,USA). Inkubace probíhala 30 minut při pokojové teplotě. Následovalo trojnásobné desetiminutové promytí v PBS a poté 30 minutová inkubace při pokojové teplotě s 100 ral roztoku 1% normálního kozího séra obsahujícího streptavidin a biotinylovanou peroxidázu, připravenou podle návodu výrobce (Vector Labs). Opět následovalo trojnásobné promytí v PBS. Látky křížově reagující s protilátkami proti KGF byly vizualizovány inkubací membrán ve směsi 60 μΐ 30% (hm./obj.) H2O2 ve 100 ml PBS a 50 mg 4-chlornaftolu ve 20 ml metanolu. Reakce byla zastavena po 10 minutách opláchnutím membrán ve vodě.

Analýza blotů ukázala, že specifické protilátky proti KGF reagují se třemi zřetelně oddělenými proužky proteinů. Dva z nich byly blízko sebe s molekulovou hmotností okolo 25-29 kDa a jeden • · · · * » · · · · · «· ·· *· ♦ · ·· měl přibližnou molekulovou hmotnost 17 kDa, přičemž předpokládaná molekulová hmotnost konečného proteinu o 163 aminokyselinách byla 18,8 kDa. Několik vysoce exprimovaných klonů sekretujících více než 2,0 mg rKGF na litr (jak bylo možné odhadnout z analýzy Western blotů), bylo dále vyčleněno a přeneseno (podle metody Lu, et al., viz předchozí text) do lahví, kde byly pěstovány tak, aby výsledkem bylo velké množství média bez séra, vhodného k purifikaci KGF pomocí iontoměníčové chromatografie s využitím katexu a následně gelové chromatografie podle postupu popsaného dále.

KGF bylo purifikováno ze třech litrů upraveného bezsérového média tak, že medium bylo přímo naneseno na iontoměničovou kolonu (5 x 24 cm) naplněnou 450 ml sulfoetyl SP-Sepharosy Fast Flow (Pharmacia), ekvilibrovanou 20 mM fosforečnanem sodným, pH 7,5. Po promytí kolony pětinásobným objemem kolony .roztokem 20 mM fosforečnanu sodného, 0,2M NaCl, pH 7,5 byl rKGF vymyt lineárním gradientem od 0,2 do 1,0 M NaCl rozpuštěného v 20 mM fosforečnanu sodném (pH 7,5). Objem použitého roztoku se rovnal dvacetinásobku objemu kolony. Byly sbírány 50 ml frakce a byla průběžně monitorována absorbance při 280 nm. Protein KGF byl detekován . analýzou části každé frakce pomocí SDS-PAGE. SDS-PAGE byla prováděna s použitím elektroforetického systému (Novex, San Diego·, CA, USA) a s použitím předpřipravených 14% Tris-glycin gelů (podle metody Laemliho (1970), Nátuře, 227:680-685). Vzorky byly smíchány s neredukujícím SDS vzorkovým pufrem bez zahřívání před nanášením. Proteiny byly detekovány barvením Coomassie blue nebo barvením stříbrem. Dva píky, které byly eluovány později, obsahovaly proteinové proužky odpovídající molekulové hmotnosti 25-29 kDa a proužek o hmotnosti 17 kDa, který byl detekován Western blotem. Frakce obsahující každý z .těchto dvou píků byly separátně koncentrovány na objem menší než 1 ml a poté byly dále děleny gelovou filtrací.

Ke gelové filtraci byly použity kolony Superdexu-75 (HR 10/30, Pharmacia) ekvilibrované PBS o pH 7,2. Kolona byla nakalibrována s použitím.následujících známých standardů molekulových vah (BioRad, San Francisco, CA, USA): thyroglobulin (670 kDa), gama42 φ · • ♦·* • · » • φφ globulin (158 kDa), ovalbumin (44 kDa), myoglobin (17 kDa) a vitamín B-12 (1,4 kDa). Tyto purifikační kroky vedly k přibližně 2000 násobnému obohacení o rKGF, zvláště o 17 kDa a 30kDa proteiny, jak ukázalo barvení stříbrem.

V případě látky s vyšší molekulovou hmotností, byl rKGF eluován jako velký symetrický pík (dle absorbaňce při 280nm), který byl· nazýván KGF-a. Jestliže bylo pomocí SDS-PAGE analyzováno menší množství látek z této frakce (3gg/linii oproti 6pg/linii) objevily se dva proužky s rozdílem molekulových vah cca l-2kDa. V případě látek s nižší molekulovou váhou, které byly nazývány KGF-b, vedla gelová filtrace k přípravě proteinu majícího předpokládanou pohyblivost. Pro oba typy proteinů (KGF-a i KGF-b) byla celková výtěžnost purifikace asi 30-40%.

Dále bylo analyzováno aminokyselinové složení KGF-a i KGF-b. Tyto analýzy byly provedeny na automatickém sekvenátoru (Model 477A nebo 470A, Applied Biosystm. Inc., Foster City, CA, USA) vybaveném on-iine PŤH aminoanalyzátorem (Model 120A) a systémem sběru dat (Model 900A)(podle metody Lu et al., (1997), J.Biol Chem., 266: 8102-8107) . Edmanovy sekvenacní analýzy KGF-a ukázaly N-terminální sekvenci Xx-N-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-A-V-Xz-Xa-S- (SEQ ID NO: 75). Minoritní sekvence začínající od třetí N-terminální aminokyseliny kyseliny aspartamoyé - byly přítomny v množství 1,6% celkového sekvenovatelného proteinu. XI, X2 a X3 nebyly určeny z důvodů nepřítomnosti PTH (phenylthiohydantoinyl) aminokyselinového signálu během sekvenční analýzy.

Je, zajímavé, že analýza sekvence N-terminálového konce KGF-b odhalila sekvenci S-Y-D-Y-M-E-G-G-D-I-R-V- (SEQ ID NO:76), naznačující, že se jedná o formu KGF zkrácenou na N-terminálovém konci, kde byl KGF proteolyticky rozštěpen v peptidové vazbě Arg²³Ser^2í.

K další charakterizaci purifikovaných KGF-a a KGF-b byly proteiny za použití známých technik vystaveny působení glykosidáz (neuraminidáze, O-glycanáze a/nebo N-glykanáze)(Sasaki et al.

(1987), J.Biol.Chem, 262:12059-120.76; Takuchi et al. (1988),

J.Biol.Chem., 263:3657-3663, Zsebo et al. (1990), Cell, 63:19543 • · ♦ ♦ « • 0 0«· 0 0

0 0*

201). Výsledky ukazují, že KGF-a obsahuje N- a O- vázané cukry, ačkoliv forma KGF-a s nižší molekulovou hmotnosti obsahuje pravděpodobně pouze N- vázané cukry. Použití glykosidáz nezpůsobilo snížení molekulové hmotnosti u KGF-b, což naznačuje, že molekula není glykosilovaná.

Glykosilace KGF-a byla dále charakterizována pomocí hmotové spektrometrie peptidů vzniklých působením endoproteasy Glu-C. Objasněni cukerné struktury glykopeptidů pomocí metody hmotové spektrometrické analýzy (stepped orifice method) bylo s úspěchem použito na další proteiny (Huddleston et <31.(1993), Anal. Chem.,65: 877-884; Carr et al. ¢1993), Prot. Sci2:183-196). Zdá se, že Thr^zzje částečně glykosilovaný, což bylo potvrzením izolací neglycosylovaných peptidů. Podobná hmotová spektrometrické analýza Asn¹⁴ předpokládá mikroheterogennity v glykosilaci s bi, tri a tetra anténními strukturami, s různým stupněm sialylace.

Tabulka 3 shrnuje koncentrace KGF stimulující inkorporaci [³H] thymidinu keratinocytů právě poloviční rychlostí maximální rychlosti (podle metody Rubina et al. (1989,. viz předchozí text). Interakce s receptory pro KGF byla stanovena s použitím membránové frakce obsahující receptory pro KGF. Tato- frakce byla připravena z myších (Balb/MK) epidermálních keratinocytů (podle postupu popsaného Massaguem (19932), J. Biol. Chem., 258: 13614-13620). Konkrétně byly různé formy KGF zředěny 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, obsahujícím 0,2% hovězího serumalbuminu tak, aby koncentrace KGF byla v rozmezí od 0,8 ng do 100 ng na 50 μΐ. Poté byly jednotlivě inkubovány s membránovou frakcí (75 ng/ml) a KGF získaným z E~coli a značeným ¹²⁵I (1,5 ng) . Experimenty s vazbou na receptor a kompetiční experimenty byly prováděny při 4°C po dobu 16 hodin. Po této době byly vzorky odebrány, centrifugovány a promyty dvakrát výše uvedeným zřeďovacím pufrem. Účelem tohoto promytí bylo odstranění nenavázaného a nespecificky vázaného značeného KGF. Poté byla ve vzorcích měřena zbylá radioaktivita. Kompetiční křivky pro vazbu mezi KGF a značeným KGF byly vyneseny jako množství nevytěsněného KGF (v procentech) versus koncentrace každého vzorku. KGF. Tabulka 3B shrnuje koncentrace KGF (v ng/ml) potřebné

k dosažení 60% nevytěsnění proti značenému KGF (připravenému z Ecoli) .

Tabulka 3A

Koncentrace KGF stimulující inkorporaci [³H] thymidinu do keratinocytů při rychlosti rovnající se polovině rychlosti maximální

Formy	ng/ml
E-coli KGF	10
KGF - a	'30
KGF - b	30

Tabulka 3B

Koncentrace KGF potřebné k dosažení60% nevytěsnění proti značenému KGF získanému z E-coli.

Forma	ng /ml
KGF z E. coli	65,8
KGF-a	93,5
KGF-b	89,1

Jak je vidět v tabulce 3A KGF-a a KGF-b stimulují zabudovávání [³H] thymidinu srovnatelně přičemž koncentrace potřebná k dosažení poloviční rychlosti maximální rychlostí zabudovávání je pro oba analogy cca 30 ng/ml. Znamená to, že zkrácení molekuly nesnižuje její biologickou aktivitu. Tato dvě analoga mají přibližně třikrát nižší aktivitu než KGF získané z E-coli - KGF plné délky. Jak je vidět v tabulce 3B, kompetiční experimenty s použitím radioreceptorového testu ukazují, že KGF získané z E-coli, KGF-a a KGF-b mají podobou vazebnou aktivitu na receptor.

β · • ·

Příklad 4: Biologický test in vivo KGF polypeptidu produkovaných v savčích buněčných kulturách a buněčných kulturách E. coli

Bylo ukázáno, že jedna subkutánní dávka KGF vede u myši běhen čtyřiadvaceti hodin ke zvýšení koncentrace cholesterolu v seru a to v závislosti na velikosti dávky. Také nativní KGF, KGF-a, C(1,15)S, ΔΝ15 a ΔΝ23 zvyšují sérový cholesterol v závislosti na výšce dávky.

Každá testovací skupina obsahovala pět samic Balb/c myší (1820 gm) získaných z CRL. Proteiny byly naředěn pomocí 0,9% izotonického roztoku tak, aby výsledný injekovaný objem byl 100 μΐ na myš. Každá myš byla ošetřena jednou podkožní injekcí obsahující následující dávky:

·*· · · · · ·*«* • »··· · · «· · · ·· • · ··· * * · · ··♦ · · « * · · · · ♦ · ··· ·« ·♦ *· *« ·· ··

Skupina	Injekovaná látka	Velikost dávky (mg/kg)
1	Nativní KGF	0,1
	Nativní KGF	0,25
	Nativní KGF	0,5
	Nativní KGF	1
	Nativní KGF	5
2	C(1,15)S	0,1
	C (1,15) S	0,25
	C (1,15) S	0,5
	C(1,15)S	1
	C (1,15) S	5
3	ΔΝ15	0,25
	ΔΝ15	0,5
	ΔΝ15	1
	ΔΝ15	5
4	ΔΝ23	0,1
	ΔΝ23	0,5
	ΔΝ23	1
	ΔΝ2 3 .i	5
5	KGF-a	0,01
	KGF-a	0,05
	KGF-a	0,1
	KGF-a	0,5
6	Kontrola (izoton. roztok)	-

Čtyřiadvacet hodin po injekci byly myši usmrceny a vykrváceny propíchnutím srdce. Ve vzorcích krve byl stanoven sérový

Φ Φ Φ Β φ φ Φ Φ Φ Φ Φ

ΦΦΒΒΦ · φ φφ Φ Φ ΦΦ φ · · · · Φ φφ ΦΦ ΦΦΦ Φ Φ • * Φ Φ ΦφφΦ ΦΦΦ

ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ · φφ ΦΦ cholesterol. Jak je vidět z obrázku 35, každý z testovaných analogů KGF měl účinek na zvýšení sérového cholesterolu v závislosti na velikosti dávky. Nebyl nalezen zřejmý rozdíl v bioaktivitě mezi kterýmkoliv z testovaných analogů KGF.

In vivo model diabetů

Chemicky indukované modely diabetes mellitus v různých živočišných druzích byly klasicky používány ke· studiu této nemoci a k její ošetření. Streptozotocin indukuje diabetes u myši, krysy, křečka, psa a opice, ačkoliv studie používající krysy a myši jsou nejčastější (Junod et al., Proč. Soc. Exp. Pio. Med. 126: 210-205 (1967};Rerup, Pharm. Rev. 22:485-518 (1970); Róssini et al.,

P:N:A:S: 74:2485-2489 (1977); Ar'Rajab and Ahren, Pancreas 8:50-57 (1993). Dávka streptozotocinu (45 až 70 mg/kg) podaná jako jedna podkožní injekce· vyvolává u krys stabilní onemocnění. Dávky pod 45 mg/kg vyvolávají přechodný stav, který je vratný. Během jednoho dne po podání streptozotocinu je indukován hyperglykemický stav.

Hladina inzulínu v krvi zůstává v podstatě nezměněna v porovnání s normálními krysami, ale celkový obsah inzulínu a C-peptidu v pankreasu je velice snížen. Krysy manifestují klasické znaky a symptomy diabetů lidí: zvýšená hladina glukózy v krvi (hyperglykémie), glukóza v moči (glukosurie), zvýšená žíznivost (polydipsie), zvýšená tvorba moči (polyurie), zvýšená chuť k jídlu (hyperphagie).

Studie popisované v tomto vynálezu byly prováděny na modelových krysách Sprague-Dawley s streptozotocinem indukovaným diabetem. Na počátku pokusu byly použity samci krys vážící 200-260 gramů. Diabetes byl indukován jedinou intravenózní injekcí streptozotocinu rozpuštěného v citrátovém pufru (sodná sůl kys. citrónové)(dávka byla 50 mg streptozotocinu na kg tělesné váhy). Zdravé kontrolní krysy byly ošetřeny jednou intravenózní injekcí pufru citrátu sodného jako kontroly. KGF byl podáván denně jako podkožní injekce. Dávka byla 3 nebo 5 mg/kg/den v závislosti na

48, • · · 0 · · * 0 0 0» * 0 000 0 0 00 · 0 00 • 0 0 · · ♦' « 0 0 · ·«· 0 0

0000 0000 000

00 00 00 00 00 experimentu. V prvním experimentu byla terapie pomocí KGF započata dva dny před indukcí diabetů a pokračovala po indukci až do celkového množství osmi injekcí. Ve druhém a třetím experimentu byla KGF terapie (podávána podkožně) započata jeden den po indukči diabetů streptozotocinem. Ve čtvrtém experimentu byla sedmídenní KGF terapie zahájena sedm.dní po aplikaci streptozotocinu a zvířata byla poté sledována dalších 12 týdnů. Ve všech experimentech s výjimkou čtvrtého experimentu byly pro analýzy určeny hladina glukózy v krvi, hladina glukózy v moči a množství moči. Navíc byly v některých experimentech sledovány příjem vody, hladina C-peptidu v moči nebo celkové množství inzulínu nebo C-peptidu v pankreasu.

Ve .čtvrtém experimentu byla jako jediná hodnota sledována hladina glukózy v krvi. Protože je velká frakce inzulínu odstraněna z krevního oběhu játry je měření koncentrací periferního inzulínu odrazem dějů post-hepatitického metabolismu, spíše než sekrece insulinu z pankreasu. Proto je měření C-peptidu často děláno a používáno jako periferní markér sekrece inzulínu. C-peptid je produkován při procesu tvorby inzulínu z pro-inzulínu. Inzulín a Cpeptid jsou extrahovány játry:

Tato studie se zabývala vlivem rKGF na diabetes indukovaný streptozotocinem u krys Sprague-Dawley. V den 0 byla skupina krys: exponována dávce 45 nebo 50 mg/kg streptozotocinu (STZ) Pó tomto zákroku byla u krys denně sledována hladina glukózy s cílem stanovit rozsah indukce diabetes. Pátý den byla zvířata ošetřená STZ rozdělena do dvou skupin v závislosti na rozsahu hyperglykemie. Dělící bod byl stanoven na hladinu glukózy v krvi rovnající se 300 mg/dl. Skupina zvířat nevystavených působení STZ sloužila jako kontrolní. Sedmý den byla deseti zvířatům z každé hyperglykemické skupiny podána dávka ΔΝ23 (3 mg/kg/den) nebo PBS ve formě podkožní injekce. Hladina glukózy byla poté sledována denně, každý druhý.den nebo týdně (výsledky jsou zobrazeny na obrázku 51) : Je vidět, že u zvířat vystavených působení STZ z obou skupin signifikantně poklesla hladina glukózy po dobu podávání ΔΝ23. Je důležité, že průměrná hladina glukózy poklesla u zvířat, která měla na počátku hladinu glukózy vyšší než 300 mg/dl na stabilní hodnotu okolo 150 • 0 · 0 » » *

0··· · 0 «0

0 · · · · 0 0 · • · ·' · 0 · « 0 • · 0 » «V «0 • 0 0 · • 0 00 ·«· · · ·· ·' »0 00 mg/dl, kdežto u zvířat, která měla na počátku hladinu glukózy nižší než 300 mg/dl, klesla hladina glukózy pouze přechodně. Je třeba si též všimnout, že denní rozsah není lineární.

Předkládaný vynález byl výše popsán obecně i na konkrétních příkladech. Je zřejmé, že odborníci odhalí další obměny a modifikace výše popsaných postupů.

« · * • · ·*» • · » ♦ ♦ ·· «••v · · · t • · ·· · · ·· • ·· » · · · · · • · · · · · · ·· ·· ·· ·»

Claims

00 (2)Informace o SEQ ID NO:73: (i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 38 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců:' neznámý mm»mmmmmoÍ ů) Topologie:» neznámá· (ii)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:73: CGGTCTAGAC CACCATGCAC AAATGGATAC'TGACATGG (2)Informace o SEQ ID NO:74: (i] Charakteristika sekvence (A) Délka: 33 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá. (ii) Typ molekuly: cDNA (xiíPopis sekvence: SEQ ID «0:74: GCCGTCGACC TATTAAGTTA TTGCCATAGG AAG (2)Informace o SEQ ID NO:75: (i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 16 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii)Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:75: Xaa Aan Aap Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Aan Val Xaa Xaa Ser 1 5 10 15 ΜΗ • · « · • * · » •» »* » · ·· • · « · « • · · · *· *· • « * · »·* « * • · » (2)Informace ο SEQ ID NO:76: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 12 aminokyselin (B) Typ: amimokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:76: Ser Tyr Aap Tyr Met Glu Gly Gly Aap Ile Arg Val 1 5 10 (2)informace o SEQ ID NO:77: ' (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 517 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis1 sekvence: SEQ ID NO:77: CTAGAAGGAG GAATAACATA TGTCTAATGA TATGACTCCG GAACAGATGG CTACCAACGT 60 120 TAACTCCTCC TCCCCGGAAC GTCACACGCG TTCCTACGAC TACATGGAAG GTGGTGACAT CCGCGTACGC CGTTTGTTCT CTCGTACCCA GTGGTACCTG CGTATCGACA AACGCGGCAA 180 AGTCAAGGGC ACCCAAGAGA TGAAAAACAA CTACAATATT ATGGAAATCC GTACTGTTGC 240 __TGTT.GGTATC. GTTGCAATCA - . AAGGTGTTGA . ATCTGAATTC. T ATCTTGCAA- TGAACAAGGA— „300 AGGAAAACTC TATGCAAAGA 1 AAGAATGCAA TGAAGATTGT AACTTCAAAG AACTAATTCT 360 GGAAAACCAT TACAACACAT ATGCATCAGC TAAATGGACA CACAACGGAG GGGAAATGTT 420 TGTTGCCTTA AATCAAAAGG GGATTCCTGT AAGAGGAAAA AAAACGAAGA AAGAACAAAA 430 AACAGCCCAC TTTCTTCCTA TGGCAATAAC TTAATAG 517 «44 • 4 4 4 • · 4 4 4 ·« 44 000 ·: * ··· » · 0 0 0 0 0« • 00 0 0ι0 · · # 0000 0 •·»»·0·· ·00 · ·· *· 0· 00 0· (2)Informace ο SEQ ID NO:67: (í)Charakteristika sekvence (A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý d ) Topologie:,, neznámá «μ·»* (ii)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:67: GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG (2)Informace o SEQ ID NO:68: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (ix)Vlastnosti: (A) Jméno/klíč:misc_feature (různé vlastnosti) (B) Umístěni; doplňková (1.,24) (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:68: CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC 24 (2)Informace o SEQ ID NO:69: (i) Charakteristika sekvence · (A) Délka: 18 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:69: CAATCTACAA TTCACAGA L3 ·.;♦··· « * bb Β » * Β > Β Β Β Β 1 · ♦ . · Β Β Β Β Β « « • Β ΒΒ ΒΒ ΒΒ « Β Β Β • ΒΒΒ ΒΒΒ · · Β Β Β ΒΒ ΒΒ (2)Informace ο SEQ ID ΝΟ:70: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 18 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina' (C) Počet řetězců: neznámý .Li.·... · - '.ί'1 (D)Topologie:·neznámá·'’ (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:70: TTAAGTTATT gccatagg (2)Informace o SEQ ID NO:71: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 29 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:71: AACAAAGCTT.CTACAATTCA CAGATAGGA (2)Informace o SEQ ID NO:72: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 27 párů bází(B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie neznámá . .. .. ------— . — — - ' · 1 (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence; SEQ ID NO:72: AACAAGATCT ŤAAGTTATTG CCATAGG • « «·« * I * ·· • 0 0 0 0 0 0 0 4 « • « · 0 0 0' 0' · *0 ·0 00 »0 » · 00 ·0·0 · • 0 0 00·· · · · 0 · · · Thr Tyr Ala ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly.Glu Met Phe Val 100 105 110 Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr.Lys Lys 115 120 125 Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 130 135 140 (2)Informace o SEQ ID NO:59: (i)Charakteristika sekvence. (A) Délka: 423 párů bází, (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ÍÍ)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:59: ATGTACGACT ACATGGAAGG TGGTGACATC CGCGTACGTC GTCTGTTCTG CČGTACCCAG 50 TGGTACCTGC GTATCGACAA ACGCGGCAAA GTCAAGGGCA CCCAAGAGAT GAAAAACAAC 120 i7«0^0 · ntm* 1Λ TGGAAATCCG TACTGTTGCT GťťGGŤAtCG TTGCAATCAA AGGTGTTGAA 130 TCTGAATTCT ACCTGGCAAT GAACAAAGAA GGTAAACTGT ACGCAAAAAA AGAATGCAAC 2401 GAAGACTGCA ACTTCAAAGA ACTGATCCTG GAAAACCACT ACAACACCTA CGGATCTGCT 300 AAATGGACCC ACAACGGTGG TGAAATGTTC GTTGCTCTGA ACCAGAAAGG TATCCCGGTT 360 CGTGGTAAAA AAACCAAAAA AGAACAGAAA ACCGCTCACT TCCTGCCGAT GGCAATCACT 420 TAA 423 — ~ -(2j Informace©‘SEO“IDNO: 60 :' '..... (i) Charakteristika· sekvence (A) Délka: 140 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein • 00 0 » » » · · · ’ « 00·· · 0·· . · *0* 0« · · · * · · · · * * · 00« • 0 0> {Íi)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:43: ATGTCTCCTG AACGTCATAC GCGTTCCTAC GACTACATGG AAGGTGGTGA CATCCGCGTA 60 ^CGTCGTCTGT* TCTGCCGTAC, CCAGTGGTAC - CTGCGTATCG1ACAAACGCGG^CAAAGTČAAG fío* GGCACCCAAG AGATGAAAAA CAACTACAAT ATTATGGAAA TCCGTACTGT TGCTGTTGGT 180 ATCGTTGCAA TCAAAGGTGT TGAATCTGAA TTCTACCTGG CAATGAACAA AGAAGGTAAA 240 CTGTACGCAA AAAAAGAATG CAACGAAGAC TGCAACTTCA AAGAACTGAT CCTGGAAAAC 300 CACTACAACA CCTACGCATC TGCTAAATGG ACCCACAACG GTGGTGAAAT GTTCGTTGCT 350 CTGAACCAGA AAGGTATCCC GGTTCGTGGT AAAAAAACCA AAAAAGAACA GAAAACCGCT 420 CACTTCCTGC CGATGGCAAT CACTTAA 447 (2)Informace o SEQ ID NO:44: (i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 148 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý * (D) Topologie: neznámá (ÍÍ)Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO.:44.: Met Sé* Pro Glu Arg Hia Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly 0000 0000 000 00 0« 0« «0 0· ·· GAAAGAATGC AATGAAGATT GTAACTTCAA AGAACTAATT CTGGAAAACC ATTACAACAC 360 1 atatgcatca GCTAAATGGA cacacaacgg AGGGGAAATG TTTGTTGCCT TAAATCAAAA 420 GGGGATTCCT GTAAGAGGAA AAAAAACGAA GAAAGfcACAA AAAACAGCCC ACTTTCTTCC 490 w-^TATGGCAATArACTTAATAG-**-*-*- - w ......................... 111 '499 J (2)Informace o SEQ ID NO:6: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 164 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein ;xi)Po pis sekv ence : SEI 2 ID NO: 1 5: Mat Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Cys 1 5 10 15 Sec Sec Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly 20 25 30 Asp Ile Acg Val Acg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg 35 40 45 Ile Asp Lys Acg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn .50 55 60 Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala val Gly Ile Val Ala Ile 65 70 75 90 Lys Gly Val Glu Sec Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys 95 90 95 Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lysj31u Leu 100' 105 110 Ile Leu Glu Asn His Tyc Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His 115 120 125 Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val 130 135 140 Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu GLn Lys Thr Ala His Phe Leu Pro 14S 150 155 160- Met Ala Ile Thr • φ φ ·* φ φφφ · φφφ φ φφ ΦΦΦ φφ φφ φφφ· φ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ φφφ φφ φφ φφ φφ ΦΦΦΦ (2)Informace ο SEQ ID Ν0:7: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka': 25 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý ' i»............( D) Topologie: neznámá^ uj. j-i --. ..τ i. (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:7: CAATGACCTA GGAGTAACAA TCAAC 25 (2)Informace o SEQ ID NO:8: (i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 26 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ií)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:8: AAAACAAACA TAAATGCACA AGTCCA 2g (2)Informace o SEQ ID NO:9: . (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 26 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý . (D)£opologieneznámá, „ ... —. . . .. , — (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID N0:9: ACAACGCGTG CAATGACATG ACTCCA 25 • 0 0 0 0 0 · · «· ·« »0 (2)Informace o SEQ ID NO:10: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 31 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina i_. .innii >iiiííii.ih..i· (C) Počet „řetězců:«neznámý nw* «*- - i m (D)Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:10: ACAGGATCCT ATTAAGTTAT TGCCATAGGA A 3l (2)Informace o SEQ ID NO:11: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 27 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:11: ACACATATGT GCAATGACAT GACTCCA 27 (2)Informace o SEQ ID NO:12: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 37 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina <C)Počet řetězců: neznámý (D)Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:12: CTGCGTATCG ACAAACGCGG CAAAGTCAAG GGCACCC 37 *·» ·· * • ·· φ φ ·« φ φφ · φ φ φ · φ · φφ φ φ < • · · φ φ φ · φ φ · φφ * φφ φφ · · φ (2)Informace ο SEQ ID Ν0:13: (i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 44 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý '' - (D) Topologie :-;neznámá’' (ii)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:13: AAGAGATGAA AAACAACTAC AATATTATGG AAATCCGTAC TGTT (2)Informace o SEQ ID NO:14: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 37 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:14: GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT GAATCTG 37 (2)Informace o SEQ ID NO:15: (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 45 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý . (D).Topologie :_neznámá......··. ........ ........ .................. (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:15: TCTTGGGTGC CCTTGACTTT GCCGCGTTTG TCGATACGCA GGTAC 45 v · » 000« 0 0 0 0 0 ««* • 00 0·· 00 «0 ··0 * 00 · 0 Informace o SEQ ID NO:I: [i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 862 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý . . . Dh Topologie : t neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:1: CAATCTACÁA TTCACAGATA GGAAGAGGTC AATGACCTAG GAGTAACAAT CAACTCAAGA 60 TTCATTTTCA ttatgttatt CATGAACACC CGGAGCACTA CACTATAATG CACAAATGGA 120 TACTGACATG GATCCTGCCA ACTTTGCTCT ACAGATCATG CTTTCACATT ATCTGTCTAG 180 TGGGTACTAT ATCTTTAGCT TGCAATGACA TGACTCCAGA GCAAATGGCT ACAAATGTGA 240 ACTGTTCCAG CCCTGAGCGA CACACAAGAA GTTATGATTA CATGGAAGGA GGGGATATAA 300 GAGTGAGAAG ACTCTTCTGT CGAACACAGT GGTACCTGAG GATCGATAAA AGAGGCAAAG 360 TAAAAGGGAC CCAAGAGATG AAGAATAATT ACAATATCAT GGAAATCAGG ACAGTGGCAG 420 TTGGAATTGT GGCAATCAAA GGGGTGGAAA GTGAATTCTA TCTTGCAATG AACAAGGAAG 480 GAAAACTCTA TGCAAAGAAA GAATGGAATG AAGATTGTAA CTTCAAAGAA CTAATTCTGG 540 AAAACCATTA CAACACATAT GCATCAGCTA AA7GGACACA CAACGGAGGG GAAATGTTTG 600 TTGCCTTAAA TCAAAAGGGG ATTCCTGTAA GAGGAAAAAA AACGAAGAAA GAACAAAAAA 660 CAGCCCACTT TCTTCCTATG GCAATAACTT AATTGCATAT GGTATATAAA GAACCCAGTT 720 CCAGCAGGGA GATTTCTTTA AGTGGACTGT TTTCTTTCTT CTCAAAATTT tctttccttt 780 TATTTTTTAG TAATCAAGAA AGGCTGGAAA AACTACTGAA AAACTGATCA AGCTGGACTT 840 GTGCATTTAT GTTTGTTTTA AG 862 PATENTOVÉ NÁROKY

1.5 10 15

Sec Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyc Met Glu Gly Gly 20 25 30

1. Polypeptidový analog KGF mající až prvních 24 aminokyselin na N-konci modifikovaných a v kterém jsou cysteinová rezidua korespondující s pozicemi 1 a 15 KGF (pozice aminokyselin 32 a 46 SEQ ID NO:2, (Cys¹ a Cys¹⁵, v tomto pořadí)) odstraněna nebo nahrazena jinou aminokyselinou.

(2)Informace o SEQ ID NO:104:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselina (B) Typ: aminokyselina (C)Počet řetězců: neznámý (D)Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: -protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:104:

Met Ser Tyt Asp Tyt Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Atg Leu . 5 10 15 .

Phe Cys Arg The Glh Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val

(2)Informace o SEQ ID NO:101:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý {D)Topologie: neznámá (ii)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:101:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC

0 0« * 00 0 * · 0· 00 0000 0000 *000 00 (2)Informace o SEQ ID NO:103:

(i)Charakteristika sekvence(A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý ^111Γ' ''-·^(D)-Topologie:neznámá^{* 1}·¹·¹¹ «'(ii)Typ-molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:103:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT 360 GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAAGAG GAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426

(2)Informace o SEQ ID NO:97:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA • φ φφφ * * · · · ·♦ • · I · φ φ φ φ φ · φφ· φ ⁴ φφ«Φ ΦΦΦΦ Φφ4 (xi.) Popis sekvence: SEQ ID NO:97:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC

CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC

AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT

AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC

GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT * l IHSW

GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA

AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC

GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG

GTTCGTGGTA AGCAAACCAA GAAAGAACAG

ACTTAA (2)Informace o SEQ ID NO:98:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 amiokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein

GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC

CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT

TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT

AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC

120

180

240

300

360

420

426 (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:98:

Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu 1 5 10 15 phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys val 20 25 30 Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Týr Asn Ile Met Glu Ile Arg 35 40 45 Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe 50 55 60 Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys 65 70 75 30

• ·· • · · • · ·

Aan Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn 85 90 95

Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val 100 105 no

Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Gin Thr Lys Lys 115 120 125

Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala ile Thr 130 135 140 (2)Informace o SEQ ID NO:99:

(i) Charakteristika sekvence (A)Délka: 426 párů bázi (B}Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence:

ATGTCCTACG ACTACATGGA

CAGTGGTACC TGCGTATCGA

AACTACAATA TTATGGAAAT

GAATCTGAAT TCTACCTGGC

AACGAAGACT GCAACTTCAA

GCTAAATGGA CCCACAACGG

GTTCGTGGTA AGAAAACCAA

ACTTAA '

SEQ ID NO:99:

AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC

CAAACGCGGC AAAGTCAAGG

CCGTACTGTT GCTGTTGGTA

AATGAACAAA GAAGGTAAAC

AGAACTGATC CTGGAAAACC

TGGTGAAATG TTCGTTGCTC

GAAAGAACAG GAAACCGCTC

GTCGTCTGTT CTGCCGTACC

GCACCCAAGA GAŤGaAAAaC

TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT

TGTACGCAAA AAAAGAATGC

ACTACAACAC CTACGCATCT

TGAACCAGAA AGGTATCCCT

ACTTCCTGCC GATGGCAATC

A

130

240

300

360

420

426 (2)Informace o SEQ ID NO:100:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (DjTopologie: neznámá . . · · *· · · ·· • :: · * · · · ·* ···» · ··· ·. »·· »·· ·* ·· ·« ·« ·· <* (ii)Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:lOO:

Met Ser Tyr Aap Tyr Met Glu Gly Gly Aap Ile Arg Val Arg Arg Leu 1 5 10 15

Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val 20 25 30 Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg 35 40 45 Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe 50 55 60 Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys 65 70 75 80 Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn 95 90 95 Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val 100 105 110 Ala Leu Asn. Gin Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys 115 120 125 Glu Gin Glu Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr e rt UM 1 oc X^*7 1 4rt X 1 M

(2)Informace o SEQ ID NO:96:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina

......mi nu (Cj Počet _u řetězců: „ ne známý^^. _ _v ....... ...... _fL _ .....

(D)Topologie: neznámá (iÍ)Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:96:

Met Ser Tyr Asp 1 Tyr 5 Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu 10 15 Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val 20 25 30 Lys Gly f Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg 35 40 45 Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe 50 55 60 Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys 65 70 75 80 Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn- 85 90 95 Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val 100 105 110 Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Glu Thr Lys Lys 115 120 125 Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 130 135 140

(2)Informace ο SEQ ID ΝΟ:95:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:95:

ATGŤCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC

CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC

AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGŤGTT

GAATČTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC

AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT

GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATTCCT

GTTCGTGGTA AGGAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC

ACTTAA

120

ISO

240

300

360

420

426.

v v « • 4 4*4

(2)Informace o SEQ ID NO:91:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina

-'—“--je) póčět^řěťě zců f ne známý^{1 1} , ^{1 1} ^Γ1' ’ —— (D)Topologie: neznámá {ii)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ IDNO:91:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGaT CTGCCGTACC

0

CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCÁAGG GČACCCAAGA GATGAAAAAC • ··

AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 gaatctgaat TCTATCTTGC AATGAACAAG GAAGGAAAAC TCTATGCAAA GAAAGAATGC 240

AATGAAGATT GTAACTTCAA AGAACTAATT CTGGAAAACC ATTACAACAC ATATGCATCT 300 ^.......^.... .....”wMMHHMna*M|DiMaMpnwwtaMmwamil»

OCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT 360

GTTGAAGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420

ACTTAA 426 (2)Informace o SEQ ID NO:92:

(i)Charakteristika sekvence (AíDélka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (0}Topologie: neznámá (i'i)Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:92:

Met Ser Tyr Asp 4 X Tyr c w Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu 10 15 Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val 20 25 30 Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Mét Glu Ile Arg ³⁵ 40 45 Thr Val Ala Val Gly Zle Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe 50 55 60 Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys 65 70 75 80 Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn HiS Tyr Asn 35 90 95 Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe val • 100 105 110 Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Glu Gly Lys Lys Thr Lys Lys 115 120 125 Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Fro Met Ala Ile Thr 130 135 * 140

v v v « · ··· • * · • * · « « ·· • « · · * · · · *· ♦ · • · ·» «·· · « • · · ·· ·· (2)Informace o SEQ ID NQ:93:

(i)Charakteristika sekvence {A)Délka: 426 párů bázi (B)Typ: nukleová kyselina

,.......... (C)Počet řetězců: neznámý

-'» wihi uw -»*· j-.: ·.» ~_>r (D)Topologie: neznámá (ii)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:93:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60

CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120

AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 130

GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240

AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300

GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT 360

GTTCTGGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420

ACTTAA 426 (2)Informace o SEQ ID NO:94:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:94:

Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

(2)Informace o SEQ ID NO:85:

(i) Charakteristika sekvence (A)Délka: 426 párů bázi {B)Typ: nukleová kyselina (C)Počet řetězců: neznámý {D)Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:85:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 50

CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 “ AACT ACAAT A“ TTATGGAAAT' CCGTACTGTT ’ GCTGTTGGTA’ TCGTTGCAAT⁼ CAAAGGTGTT ““ 13 0

GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240

AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300

GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGGA AGGTATCCCT .360

GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420

ACTTAA 425 • · • ··· • · · · « » » • · «· · · ·· _v · · · · · · e · · « · « * ···· · · ·« *· ·· ·· ·· ·· (2)Informace ó SEQ ID NO:86:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý w*·—»··*! .....'_Ί^--'Ιί-ιι·. ' II >'. >1 - n. DMI. i m I lili >11»......II·»»· (D) Topologie: neznámá (ii)Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:86:

Met 1 Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu 5 ¹⁰ 15 Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val 20 25 30 Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg 35 40 45 Thr Val Ala Val Gly Zle Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe 50 55 60 Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys 65 70 75 80 Asn Glu ASp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn 85 90 95 Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val 100 105 110 Ala Leu Asn Gin Glu Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys 115 120 125 Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr

130 135 140 (2)Informace o SEQ ID NO:87:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců:' neznámý (D) Topologie: neznámá >

(ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:87:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60

CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCCGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 ’ ....................... * —· » *'»«> - W , j. *. -- - - ,

AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180

GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240

AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300

GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGCA AGGTATCCCT 360

GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420

ACTTAA '426 (2)Informace o SEQ ID NO:88:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:88.:

Met Sec Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu 1 Phe Cys Arg 5 Thr Gin 20 Trp 10 15 Tyr Leu Arg 25 Ile Asp Lys Arg Gly 30 Lys Val Lys Gly Thr 35 Gin Glu Met Lys Asn 40 Asn Tyr Asn 11« Met 45 Glu 11« Arg Thr val 50 Ala Val Gly Ile Val 55 Ala Ile Lys Gly Val 60 Glu Ser Glu Phe Tyr 65 Leu Ala Met Asn Lys 70 Glu Gly Lys Leu Tyr 75 Ala Lys Lys Glu Cys 80

• «

Φ#·

Asn Glu Asp ‘Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn 85 90 95

Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val 100 105 HO

........ «'li™·...................1,1.1.,,--...-,............ .....-, ,,.... _|r__;.._L _ . . . ... .

Ala Leu Asn Gin Gin Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys 115 120 125

Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 130 135 140 (2)Informace o SEQ ID NO:89:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:89:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT

GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC

AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT GTTGCTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC

... ACTTAA .... .. , , ,60

120

180

240

300

360

420

426 (2)Informace o SEQ ID NO:90:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců:'neznámý (Ď)Topologie: neznámá (ii)Typ molekuly: protein

(xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:90: Gly Asp 10 Ile*Árg 'Val* ‘Arg’ ^rArg' 15 Met Set Tyr Asp Tyr Meť GÍťC-lý 1 5 Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Zle Asp Lys Arg Gly Lys Val 20 25 30 Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg 35 40 45 Thr Val Ala Val Gly Zle Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe 50 55 60 Tyr Leu Ala Met Asn Lys Gíu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys 65 70 75 80 Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn 85 90 95 Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val 100 105 110 Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Ala Gly Lys Lys Thr Lys Lys 115 120 125 Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 130 135 140

(2)Informace o SEQ ID NO:63:

{í)Charakterístika sekvence (A) Délka: 495 párů bázi ' (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:63:

ATGTCTAATG ATATGACTCC GGAACAGATG GCTACCAACG TTAACTCCTC CTCCCCGGAA 60

CGTCACACGC GTTCCTACGA CTACATGGAA GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC 120

TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG 180

ATGAAAAACA ACTACAATAT TATGGAAATC CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC 240

AAAGGTGTTG AATCTGAATT CTATCTTGCA ATGAACAAGG AAGGAAAACT CTATGCAAAG 300

AAAGAATGCA ATGAAGATTG TAACTTCAAA GAACTAATTC TGGAAAACCA TTACAACACA 360'

TATGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGČTCT GAACCAGAAA 420

GGTATCCCTG TTCAAGGTAA GAAAACCAAG AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG 480

ATGGCAATCA CTTAA 495 (2)’Informace’o“SEQ“ ID“ NO: 64Ϊ ' ''' ¹ (i) Charakteristika sekvence (A)Délka: 164 aminokyselin (8)Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein • « «·« · · ·« · · ·» • «· · « · · · « · ee· · · • λ · · e * · · · · · ·· ·· »· ·· ·· ·» (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:64:

Met Ser 1 Asn Asp Met 5 Arg Thr Pro Glu Gin Met ¹⁰ Tyr Ala Thr Asn Val Asn Ser 15 Ser Ser Pro¹* Glu 20 His Thr ’ Arg Ser 25 Asp Tyr Met Glu 30 Gly Gly Asp Ile Arg val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg 35 40 - 45 Ile Asp Lys Arg' Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn 50 55 60 Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala ile 65 70 75 80 Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lya Glu Gly Lys 85 90 95 Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu 100 105 110 Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His 115 120 125 Asn Gly Gly Glu Met Phe val Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val 130 135 140 Gin Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr' Ala His Phe Leu Pro 145 150 155 160

Met Ala Ile Thr (2)Informace o SEQ ID NO:65:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleové kyselina

....(o počet řetězcůne známý ' (D)Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:65:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC

CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC

120 • · 99 • 99 • 9 999 • 9 9 9 * 9 · 9 · 9 999 9 9 •99« 9 9 9 · 999 • 9 99 99 99 99 ··

AACTACAATA TTATGGÁAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 190

GAATCTGAAT TCTATCTTGC AATGAACAAG GAAGGAAAAC TCTATGCAAÁ GAAAGAATGC 240

AATGAAGATT GTAACTTCAA AGAACTAATT CTGGAAAACC ATTACAACAC ATATGCATCT 300

GGTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT 360

GTTCAAGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420

ACTTAA 426 (2)Informace o SEQ ID NO:66:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii)Typ molekuly: protein

Met Ser 1 Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu 5 10 15 Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val 20 *· 30 Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg 35 40 45 Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala ile Lys Gly val Glu Ser Glu Phe 50 55 60 Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys 65 70 75 80 Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn 35 90 . 95 Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val 100 105 110 Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Gin Gly Lys Lys Thr Lys Lys 115 120 125 Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 130 135 140

(2)Informace o SEQ ID NO:48:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 146 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:48:

Met Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile 1 5 10 15

Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp 20 25 30 Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn 35 40 45 ile Met Glu 11· Arg Thr Val Ala val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly 50 55 60 Val Glu Sec Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr 65 70 75 80

- — Ala-Ly3'Ly3Glu'Cy3-A3n’Glu'A3pCys~AsnPhe'Ly3'Glu'Leu“Il9~Leu 35 90 95

Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly 100 105 110

Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly 115 120 125 · · ·

Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala 130 135 140.

Ile Thr ——P — I »#* 11*1 * *>·Ι ' (2)Informace o SEQ ID NO:49:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 438 párů bází (B) Typ: -nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:49:

ATGCGTCATA CGCGTTCCTA CGACTACATG GAAGGTGGTG ACATCCGCGT ACGTCGTCTG 60

TTCTGCCGTA CCCAGTGGTÁ CCTGCGTATC GACAAACGCG GCAAAGTCAA GGGCACCCAA 120

GAGATGAAAA ACAACTACAA TATTATGGAA ATCCGTACTG TTGCTGTTGG TATCGTTGCA 190

ATCAAAGGTG TTGAATCTGA ATTCTACCTG GCAATGAACA AAGAAGGTAA ACTGTACGCA 240

AAAAAAGAAT GCAACGAAGA CTGCAACTTC AAAGAACTGA TCCTGGAAAA CCACTACAAC 300

ACCTACGCAT CTGCTAAATG GACCCACAAC GGTGGTGAAA TGTTCGTTGC TCTGAACCAG 360

AAAGGTATCC CGGTTCGTGG TAAAAAAACC AAAAAAGAAC AGAAAACCGC TCACTTCCTG 420

CCGATGGCAA TCACTTAA 438 (2)Informace o SEQ ID NO:50:

{ i) Ch ar ak t er i s t ika~ s e kve _nce ' (A) Délka: 145 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii)Typ molekuly: protein

(xi)Popis Met Arg His 1 e sekvence: SEQ ID NO: • · • * e : 50: Tyr • ¹ e Met 10 » · ·· Glu e · e « Gly • · Gly » « · »a Asp Ile Arg 15 Thr Arg 5 Ser Tyr Asp Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys 20 25 30 Arg Gly Lys vsi Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile 35 40 45 Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val 50 55 60 Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala 65 70 75 30 Bys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu 85 90 95 Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Set Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly 100 105 110 Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys 115 120 125 Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile 130 135 140

Thr

145 (2)Informace o SEQ ID NO:51:

(i) Charakteristika sekvence

..(A).Délka: 435 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:51:

ATGCATACTC GTTCCTACGA CTACATGGAA GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC 60

TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG 120

ATGAAAAACA ACTACAATAT TATGGAAATC CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC 180 * e e e * ě · e · ě e e e e é * e e e e e · · · ·« ee ·· ·· e* **

AAAGGTGTTG AATCTGAATT CTACCTGGCA ATGAACAAAG AAGGTAAACT GTACGCAAAA

AAAGAATGCA ACGAAGACTG CAACTTCAAA GAACTGATCC TGGAAAACCA CTACAACACC

TACGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA

GGTATCCCGG TTCGTGGTAA AAAAACCAAA AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG ATGGCAATCA*CTTAA** ' ' ....... ’ ' ' ........-,

240

300

360

420

435 (2)Informace o SEQ ID NO:52:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 144 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá {ii)Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NQ:52:

Met His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val 1 5 10 . 15 Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg 20 25 30 Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn ile Met 35 40 45 Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu 50 55 60 Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys 65 70 75 80 Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn 85 90 95 His Tyr Asn Thr -Jy_r Ala Ser Ala .Lys, „Trp „Thr. .His, Asn .Gly, Gly, „Glu 100 105 110 Met Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro val Arg Gly Lys Lys 115 120 125 Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr

130 135 140

(2)Informace o SEQ ID NO:43:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 447 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá t ·

(2)Informace o SEQ ID NO:40:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 154 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii)Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:40:

Met Ala The Asn Val Asn Sec Sec 1 5

Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp ile 20 Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp 35 40 Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn 50 55

Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr 10 15

Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg 25 30..........

Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly The 45

Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala «« · ·· · »·*· • · ··· · · ·· · · *· • · · · · · ·· ·· ··· · • · · ···· · · ·

Val Gly Ile Val Ala ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala £5 70 75 80 Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp • Phe -Lys- 85 Ile¹ 90 95 «cys^Asn Glu- ^jLeu' •Leu' ^rGlu Asn His Tyr¹ ^rAsn Thr Tyr Ala 100 105 110 Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn 115 120 125 Gin Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys 130 135, 140 Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr

145 150 (2)Informace o SEQ ID NÓ:41:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 450 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:41:

ATGTCT.TCTC CTGAACGTCA .TACGCGTTCC TACGAG-TAGA TGGAAGGTGG TGACATCCGC 60

GTACGTCGTC TGTTCTGCCG TACCCAGTGG TACCTGCGTA TCGACAAACG CGGCAAAGTC 120

AAGGGCACCC AAGAGATGAA AAACAACTAC AATATTATGG AAATCCGTAC TGTTGCTGTT 130

GGTATCGTTG CAATCAAAGG TGTTGAATCT GAATTCTACC TGGCAATGAA CAAAGAAGGT 240

AAACTGTACG CAAAAAAAGA ATGCAACGAA GACTGCAACT TCAAAGAACT GATCCTGGAA 3j30^

AACCACTACA ACACCTACGC ATCTGCTAAA TGGACCCACA ACGGTGGTGA AATGTTCGTT 360

GCTCTGAACC AGAAAGGTAT CCCGGTTCGT GGTAAAAAAA CCAAAAAAGA ACAGAAAACC 420

GCTCACTTCC TGCCGATGGC AATCACTTAA 450 v v v 9 » 9 9 9 ♦ * » • * 9 ·· 9 9 9 9 · ·· * 9 9 9 9 9 9 · 9 9 ··· * · * 9 9 « 9 9 9 · * ·

(2) Informace .o SEQ ID NO: 34:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 160 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Ťyp molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:34:

Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Ser Set Ser Pro Glu 1 5 10 15 Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg val 20 25 30 Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg 35 40 45 Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met 50 55 '60 Glu Ile Arg Thr val Ala val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu 65 70 75 90 Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys 95 90 95 Lys Glu Cys Asn Glu _Asp_Cya, .Asn .Phe, .Lya, .Glu .Leu .ile. .Leu .Glu Asn. 100 105 110 His Tyr Asn Thr Tyr Ala Set Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu 115 120 125 Met Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys 130 135 140 Ťhr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr

145 150 155 ISO φφφ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ φ ΦΦΦΦ φ φφφ φ φφφ φ * · φφφ « · φφ φφφ · φ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ φφφ (2)Informace ο SEQ ID ΝΟ:35:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 490 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý

.............i i in »wiin (D)Topologie:neznámá**’*^- (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:35:

ATGACTCCGG AACAGATGGC TACCAACGTT -AACTCTTCTC CTGAACGTCA TACGCGTTCC 60

TACGACTACA TGGAAGGTGG TGACATCCGC GTACGTCGTC TGTTCTGCCG TACCCAGTGG 120

TACCTGCGTA TCGACAAACG CGGCAAAGTC AAGGGCACCC AAGAGATGAA AAACAACTAC 180

AATATTATGG AAATCCGTAC TGTTGCTGTT GGTATCGTTG CAATCAAAGG TGTTGAATCT 240

GAATTCTACC TGGCAATGAA CAAAGAAGGT AAACTGTACG CAAAAAAAGA ATGCAACGAA 300

GACTGCAACT TCAAAGAACT GATCCTGGAA AACCACTACA ACACCTACGC ATCTGCTAAA 3S0

TGGACCCACA ACGGTGGTGA AATGTTCGTT GCTCTGAACC AGAAAGGTAT CCCGGTTCGT 420

GGTAAAAAAA CCAAAAAAGA ACAGAAAACC GCTCACTTCC TGCCGATGGC AATCACTTAA 430 (2)Informace o SEQ ID NQ;36:

(i) Charakteristika sekvence (A) Dél-ka·: 15-9 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:36:

Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Aan Val Asn Ser Ser Pro Glu Arg 15 10 15

His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ila Arg val Arg 20 ’ 25 30 φ φ φ«

« φ Φ * φ φ Φ * φ · · Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile A3p Lys Arg Gly 35 40 45 Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu ⁵⁰ 55 60 lid Arg Tnr val ,Ala val , Gly.» Ile «Val· > Aia-ue -Lys' Gly‘Val Glu S e r 65 70 75 80 Glu Phe Tyr Leu Ala.Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys 85 90 95. Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His 100 105 110 Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met 115 120 • 125 Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr 130 135 140 Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr

145 150 155 (2)Informace ο SEQ ID ΝΟ:37:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 4 68· párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (íi)^:Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:37:

ATGGCTACTA ATGTTAACTC CTCTTCTCCT GAACGŤCATA CGCGTTCCTA CGACTACATG 60

GAAGGTGGTG ACATCCGCGT ACGTCGTCTG TTCTGCCGTA CCCAGTGGTA CCTGCGTATC 120 , ._ .... ..... ............ ¹ ' . I .......η I I I ‘GACAAAČGCG GCAAAGTCAA GGGCACCCAA GAGATGAAAA ACAACTACAA TATTATGGAA 130

ATCCGTACTG TTGCTGTTGG TATCGTTGCA ATCAAAGGTG TTGAATCTGA ATTCTACCTG 240

GCAATGAACA AAGAAGGTAA ACTGTACGCA AAAAAAGAAT GCAACGAAGA CTGCAACTTC 30.0

AAAGAACTGA TCCTGGAAAA CCACTACAAC ACCTACGCAT CTGCTAAATG GACCCACAAC 360

GGTGGTGAAA TGTTCGTTGC TCTGAACCAG AAAGGTATCC CGGTTCGTGG TAAAAAAACC 420

AAAAAAGAAC AGAAAACCGC TCACTTCCTG CCGATGGCAA TCACTTAA 4 63 (2)Informace o SEQ ID NO:38:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 155 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý ^{11 1,11} .......... '** (D) Topologie':'·' neznámá^* (ii) Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:38:

Met Ala Thr Asn Val Asn Ser Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser 1 5 10 15 Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys 20 25 30 Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly 35 40 45 Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val 50 55 60 Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu 65 70 75 ao Ala Ua* * A « -». rvJU ♦ — U>f9 vxu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu 85 90 95 Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr íop. 105 110 Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu 115 120 125 Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin 130 135 140 Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr

145 ....... .—₁₅₀————₁₅₅ (2)Informace o SEQ ID NO:39:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 465 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý k ♦ · 4 *· «· (D)Topologie: neznámá (ii)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:39:

ATGGCTACTA»ATGTTAACTC TTCTCCTGAA*CGTCATACGC

GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC TGCCGTACCC

AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG ATGAAAAACA

CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC AAAGGTGTTG

ATGAACAAAG AAGGTAAACT GTACGCAAAA AAAGAATGCA

GAACTGATCC TGGAAAACCA CTACAACACC TACGCATCTG

GGTGAAATGT TCQTTGCTCT GAACCAGAAA GGTATCCCGG

AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG ATGGCAATCA

GTTCCTACGA CTACATGGAA 60 AGTGGTACCT GCGTATCGAC 120 ACTACAATAT TATGGAAATC 180 AATCTGAATT CTACCTGGCA 240 ACGAAGACTG CAACTTCAAA 300 CTAAATGGAC CCACAACGGT 360 TTCGTGGTAA AAAAACCAAA 420 CTTAA 465

« · · • « · ·· ·· • · (2)Informace o SEQ ID NO:16;

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka; 45 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý

.....«ii i ii in iiiiiiii»i»w· -( D) Topologie Í-heznámá-“* w»·^·*· - (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:16:

acagcaacag tacggatttc CATAATATTG TAGTTGTTTT TCATC 45 (2)Informace o SEQ ID NO:17;

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 36 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:17:

AATTCAGATT CAACACCTTT GATTGCAACG ATACCA (2)Informace o SEQ ID NO:16:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D)Topologie: neznámá (ii)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID N0:18:

AGTTTTGATC 7AGAAGGAGG • * * • · ··· • · · ♦ • * ♦ * • * · · ·«·« 9 9 9 9

(2)Informace o SEQ ID NO:3:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 595 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá • **♦ (ii)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID N0:3:

ATCGATTTGA TTCTAGAAGG AGGAATAACA TATGAAAAAG CGCGCACGTG CTATCGCCAT 60

TGCTGTGGCT CTGGCAGGTT TCGCAACTAG TGCACACGCG TGCAATGACAJGACTCCAGA120

GCAAATGGCT ACAAATGTGA ACTGTTCCAG CCCTGAGCGA CACACAAGAA GTTATGATTA 180

CATGGAAGGA GGGGATATAA GAGTGAGAAG ACTCTTCTGT CGAACACAGT GGTACCTGAG 240

GATCGATAAA AGAGGCAAAG TAAAAGGGAC CCAAGAGATG AAGAATAATT ACAATATCAT 300

GGAAATCAGG ACAGTGGCAG TTGGAATTGT GGCAATCAAA GGGGTGGAAA GTGAATTCTA 360

TCTTGCAATG AACAAGGAAG GAAAACTCTA TGCAAAGAAA GAATGCAATG AAGATTGTAA 420

CTTCAAAGAA CTAATTCTGG AAAACCATTA CAACACATAT GCATCAGCTA AATGGACACA 480

CÁACGGAGGG GAAATGTTTG TTGCCTTAAA TCAAAAGGGG ATTCCTGTAA GAGGAAAAAA 540

AACGAAGAAA GAACAAAAAA CAGCCCACTT TCTTCCTATG GCAATAACTT AATAG 595 (2)Informace o SEQ ID NO:4:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 186 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina.

(C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii.) Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:4:

Met Lys Lys Arg Ala Arg Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly 15 10 15

Phe Ala Thr Ser Ala His Ala Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met 20 25 30

Ala Thr Asn Val Asn Cys Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr 35 40 45 * 4

« v « • · · · · 4 4 · · : 4 4 » « · v · · 4 4 « • 4 • 4 4 4 4 4 • 4 4 4 Aap Tyr Met Glu Gly Gly A3p Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg 50 55 60 Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr 65 70 75 90 Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met .Glu Ile,Arg. -Thr, ,Val,Ala, ' 85 90 95 Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala 100 105 110 Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp 11S 120 125 Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala 130 135 140 Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn 145 150 155 160 Gin Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys 165 170 175 Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr

180 185 (2)Informace o SEQ ID NO:5:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 499 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá {ií)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:5:

• — TATGTGCAAT GACATGACTC CAGAGCAAAT ‘ GGCTACAAAT' GTGAACTGTT' CCAGCCCTGA........6 0

GCGACACACA AGAAGTTATG ATTACATGGA AGGAGGGGAT ATAAGAGTGA GAAGACTCTT 120

CTGTCGAACA CAGTGGTACC TGAGGATCGA TAAAAGAGGC AAAGTAAAAG GGACCCAAGA 130

GATGAAGAAT AATTACAATA TCATGGAAAT CAGGACAGTG GCAGTTGGAA TTGTGGCAAT 240

GAAAGGGGTG GAAAGTGAAT TCTATCTTGC AATGAACAAG GAAGGAAAAC TCTATGCAAA 300

(2) Informace o SEQ ID NO:2:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 194 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá · t * · · ··«· • * *·· · * »♦ * · ·· • · ♦ « » · » · ·· »·· · • · · · ···· ♦ · * (ií) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:2:

Met 1 His Lys Trp Ile Leu Thr 5 Trp Ile Leu 10 Pro Thr Leu Leu Tyr Arg 15 Ser Cys Phe His 20 Ile Ile Cys Leu Val 25 Gly Thr Ile Ser Leu 30 Ala Cys Asn Asp Met 35 Thr Pro Glu Gin Met 40 Ala Thr Asn Val Asn Cys 45 Ser Ser Pro Glu Arg 50 His Thr Arg Ser 55 Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly 60 Asp Ile Arg 65 Val Arg Arg Leu Phe Cys 70 Arg Thr Gin Trp 75 Tyr Leu Arg Ile Asp 80 Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly 95 Thr Gin Glu 90 Met Lys Asn¹ Asn Tyr Asn 95 ile Met Glu ile 100 Arg Thr Val Ala Val 105 Gly Ile val Ala Ile 110 Lys Gly val Glu Ser 115 Glu Phe Tyr Leu Ala 120 Met Asn Lys Glu Gly Lys 125 Leu Tyr Ala Lys Lys 130 Glu Cys Asn Glu 135 Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu 1 4 A Ile Leu Glu 145 Asn His Tyr Asn Thr Tyr 150 Ala Ser Ala Lys 155 Trp Thr His Asn Gly 160 Gly Glu Met Phe Val Ala Leu 165 Asn Gin Lys 170 Gly Ile Pro Val Arg Gly 175 Lys Ile. Lys Thr Thr Lys 130 Lys Glu Gin Lys . Λν. Thr 185 Ala His Phe Leu Pro 190 Met Ala

2. Polypeptidový analog podle nároku 1, v kterém jsou odstraněny Cys¹ a Cys¹⁵;

3. Polypeptidový analog podle nároku 1,' v kterém je prvních 15 až 24 aminokyselin z N-konce odstraněno.

4 4 4 «4 «4 4 *

4 « « 4 4 4 4

4 4

44

4 4

4 4 «4 aggtaaactg TACGCTAAAA AAGAATCCAA TGAAGATTCT áacttcaaag AACTAATTCT ggaaaaccat tacaacacat atgcatcagc taaatggaca cacaacggag GGGAAATGTT TGTTGCCTTA AATCAAAAGG GGATTCCTGT AAGAGGAAAA AAAACGAAGA AAGAACAAAA aacagcccac tttcttccta TGGCAATAAC ttaatag

360

420

480 rjrx*. . „

517 (2)Informace o SEQ ID NO:82:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 164 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence SEQ ID NO: 82:

Met Ser Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Ser 1 5 10 15 Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly. Gly 20 25 30 Asp Ile Arg Val. Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg 35 40 45 Ile Asp Lys Arg Gly Lys val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn 50 55 60 Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile 65 70 75 80 Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys

90 95

Leu - Tyr Ala ’ Lys Lys Glu-Ser-As nGlu-Asp-Se r=Asn’ P.he⁼ Lys = Glu - Leu—

100 105 110 Ile Leu Glu 115 Asn His Tyr Asn Thr 120 Tyr Ala Ser Ala Lys 125 Trp Thr His Asn Gly Gly 130 Glu Met Phe Val 135 Ala Leu Asn Gin Lys 140 Gly Ile Pro val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro

145 150 155 160

Met Ala Ile Thr

0·· 0 0 (2)Informace o SEQ ID NO:83:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý {D)Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:83:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGGAACAGAA AGGTATCCCT 360 GTTCGTGGTA AGAAAÁCCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 42 6 )Informace o SEQ ID NO :84 : T·

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii)Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:84:

Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

4 44 • 44 4 4 4

4 * 4 • · · 4

44 » · 4 4

4· Β * · 44

444 4 * 4 4 4 * * · · 4 4 4 •4 ·· 4« 44 [2)Informace ο SEQ ID NO:78:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka; 164 amiokyselin (B) Typ:aminokyseliny (C) Počet řetězců: neznámý 'i ' ¹ ^{ΙΊΙΙΓ111L}'(ĎJ Ťopologie^ňeŽnámá (ii)Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:78

Mat Ser Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Ser 1 5 10 15 Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly 20 25 • 30 Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Ser Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg 35 40 45 Ile Asp Lys Arg· Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn 50 55 60 Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile val Ala Ile 65 70 75 00 Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys 35 90 95 Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu 100 105 110 Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His 115 120 125 Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val 130 135 140 Arg Gly Lys 1Λ6 Lys Thr Lys Lys 1 II 1 i ι 1 Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro • 1 ffrt*

Met Ala Ile Thr * · ·«« · · • · * · « » · ft I • e » · ft · « I »· ·· M ·· • · ·· ··· · a « a a a« «· (2)Informace o SEQ ID NO:79:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 517 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý mmmmmm (D) Topologie :«i ne známá w·** mu (ii)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:79:

CTAGAAGGAG GAATAACATA TGTCTAATGÁ TATGACTCCG GAACAGATGG CTACCAACGT 60

TAACTCCTCC TCCCCGGAAC GTCACACGCG TTCCTACGAC TACATGGAAG GTGGTGACAT ' 120

CCGCGTACGT CGTCTGTTC7 GCCGTACCCA GTGGTACCTG CGTATCGACA AACGCGGCAA 130

AGTCAAGGGC ACCCAAGAGA TGAAAAACAA CTACAATATT ATGGAAATCC GTAC7G7TGC 240

TGTTGGTATC GTTGCAATCA- AAGGTGTTGA ATCTGAATTC TACCTGGCTA TGAACAAAGA 300

AGGTAAACTG TACGCTAAAA AAGAATCCAA TGAAGATTGT AACTTCAAAG AACTAATTCT 360

GGAAAACCAT TACAACACAT ATGCATCAGC TAAATGGACA CACAACGGAG GGGAAATGTT 420

TGTTGCCTTA AATCAÁAAGG GGATTCCTGT AAGAGGAAAA AAAACGAAGA AAGAACAAAA 480

AACAGCCCAC'TTTCTTCCTA TGGCAATAAC TTAATAG 517 (2)Informace o SEQ ID NO:80:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 164 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá [ii)Typ molekuly: proteim (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:80:

Met Ser Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Ser

4* ·4 (2)Informace o SEQ ID NO:56:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 142 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina(C) Počet řetězců: neznámý

............................... -I I , . - ibiímm Hi.lt in t..

(D) Topologie: neznáma (ii) Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:56:

Met 1 Arg Ser Tyr ASp 5 Tyr Met Glu Leu Phe Cys Arg 20 Thr Gin Trp Tyr Val Lys Gly 35 Thr Gin Glu Met Lys 40 Arg Thr 50 Val Ala Val Gly Zle 55 Val Phe 65 Tyr Leu Ala Met Asn 70 Lys Glu z^-».- — νγ o α3Π Í-»S .x uau 4 —— a 35 4 — rupii nu* e 110 ▼ J «Ρ Asn Thr Tyr Ala 100 Ser Ala Lys Trp Val Ala Leu 115 Asn Gin Lys Gly Ile 120 Lys Glu 130 Gin Lys Thr Ala His 135 Phe

Gly Gly Aap Ile Arg Val Arg Arg 10 15

Leu Arg Ile Aap Lys Arg Gly Lys 25 30

Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile 45

Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu 60

Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu 75 ao

ΖΪ1·. T .... Tl„ Ta., rtl., Ϊ·Λ U4« r.řr· M * J “

95

Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe 105 110

Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys 125

Leu Pro Met Ala Ile Thr 140 (2)Informace o SEQ ID NO:57:

(i) Charakteristika sekvence (A)Délka: 426 párů bází (B}Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:57:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC fiOCAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 12 0 ¹AACTACAATATTATGGAAAT 'CCGTACTGŤT’'3CTGTTGGTÍ* TCGTTGCAAT *CAAAGGTGTT ''’igo GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240

AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300

GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGŤTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCG 360

GTTCGTGGTA AAAAAACCAA AAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420

ACTTAA 426 (2)Informace o SEQ ID NO:58:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein

(xí: 1 Popis sekvence: SEQ ID fc 10:58 Met Ser Tyr ASp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu 1 5 10 15 Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val 20 25 30 Lys Gly The Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg 35 40 '45 Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe 50 55 60 Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys 65 70 75 80 Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn 85 90 . 95

4 «

4·4 4 ί

4« 44

I 4 44

4 444 « 44 · · 4 4 4 ·· 44 44 4 • 444 4444 4 4 4

44 44 44 44 44

Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn phe Lys Glu Leu 85 90 95

Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala .Lys Trp Thr His 100 105 110 _Asn Gly_Gly Glu Met Ehe,Val,Ala.LeurAsn.»Gln*Lys*Gl'y*lle-*Pro*Val¹'·*’· *115 120 125

Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pra . 130 135 140

Met Ala Ile Thr 145 (2)Informace q SEQ ID NO:45:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 444 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá {ií)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:45:

ATGCCTGAAC GTCATACGCG TTCCTACGAC TACATGGAAG GTGGTGACAT CCGCGTACGT SO

CGTCTGTTCT GCCGTACCCA GTGGTACCTG CGTATCGACA AACGCGGCAA AGTCAAGGGC 120

ACCCAAGAGA TGAAAAACAA CTACAATATT ATGGAAATCC GTACTGTTGC TGTTGGTATC 180

GTTGCAATCA ÁAGGTGTTGA ATCTGAATTC TACCTGGCAA TGAACAAAGA AGGTAAACTG 240

Γ

TACGCAAAAA AAGAATGCAA CGAAGACTGC AACTTCAAAG AACTGATCCT GGAAAACCAC 300

TACAACACCT ACGCATCTGC TAAATGGACC CACAACGGTG GTGAAATGTT CGTTGCTCTG 360

AÁCCAGAAAG GTATCCCGGT TCGTGGTAAA AAAACCAAAA AAGAACAGAA AACCGCTCAC 420 _ TTCCTGCCGA .TGGCAATCAC-TTAA ......... · ¹ - 444 (2)Informace o SEQ ID NO:46:

{i)Charakteristika sekvence .(A}Délka: 147 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá « « · * Β Β Β · Β Β Β • « ΒΒΒ · Β Β· ΒΒΒ·

Β Β Β Β ♦ · «β · Β «ΒΒ Β Β

Β Β Β Β Β Β Β Β ··· ·· ΒΒ ΒΒ Β· Β* ·» (ii)Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:46:

Met Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp .15,

Nutilo

Ik i,, ikj

Ile Arg Val Arg 20 Arg Leu Phe Cys Arg 25 Thr Gin Trp Tyr Leu 30 Arg Ile Asp Lys Arg Gly 35 Lys Val Lys Gly 40 Thr Gin Glu Met Lys 45 Asn Asn Tyr Asn Ile 50 Met Glu Ile Arg Thr 55 Val Ala Val Gly ile 60 Val Ala ile Lys Gly 65 Val Glu Ser Glu Phe 70 Tyr Leu Ala Met Asn 75 Lys Glu Gly Lys Leu 80 Tyr Ala Lys Lys· Glu 85 Cys Asn Glu Asp Cys 90 Asn Phe Lys 'Glu Leu 95 Ile Leu Glu Asn His 100 Tyr Asn Thr Tyr Ala 105 Ser Ala Lys Trp Thr 110 His Asn Gly Gly Glu 115 Met Phe Val Ala Leu 120 Asn Gin Lys Gly Ile 125 Pro Val Arg Gly Lys 1 4 w v Lys Thr Lys Lys Glu 135 Gin Lys Thr Ala His 140 Phe Leu Pro Met

Ala Ile Thr 145 (2)Informace o SEQ ID NO:47:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 441 párů bází [B) Typ: nukleová kyselina (C ] _Poč e t ~ ře t ě zců: _ ne známý _ ...... ,--- . _ — - —-—.

(D)Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:47:

ATGGAACGTC ATACGCGTTC CTACGACTAC'ATGGAAGG7S GTGACATCCG CGTACGTCGT £0

CTGTTCTGCC GTACCCAGTG GTACCTGCGT ATCGACÁAAC GCGGCAAAGT CAAGGGGACC , 120 * *#·

130

240

CAAGAGATGA AAAACAACTA CAATATTATG GAAATCCGTA CTGTTGCTGT TGGTATCGTT GCAATCAAAG GTGTTGAATC TGAATTCTAC CTGGCAATGA ACAAAGAAGG TAAACTGTAC

GCAAAAAAAG AATGCAACGA AGACTGCAAC TTCAAAGAAC TGATCCTGGA AAACCACTAC —— AACACCTACG¹CATCTGCTAA ATGGACCCACAACGGTGGTG AAATGŤTCGT’ TGCTCTGAAC ^U 360 j

CAGAAAGGTA TCCCGGTTCG TGGTAAAAAA ACCAAAAAAG AACAGAAAAC CGCTCACTTC 420 CTGCCGATGG CAATCACTTA A ₄₄₁ ;

4. Polypeptidový analog podle nároku 1, v kterém Cys¹ je odstraněn a Cys¹⁵nahrazen jinou aminokyselinou.

5 10 ¹⁵

Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Aap Lys Arg Gly Lys Val

25 30

ΒΒΒ

Β Β Β Β

Β « Β ·

ΒΒ ΒΒ

Β Β ΒΒ Β Β ΒΒ Β Β Β · · ΒΒΒ · · • Β Β * · · ·

Lys Thr Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn 40 Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg 45 val 50 35 Xle Ala Val Gly Val 55 Ala ile Lys Gly Val 60 Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys 65 70 75 90 Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn $5 90 95 Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val 100 105 110 Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Leu Gly.Lys Lys Thr Lys Lys 115 120 125 Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 130 135 140

5 10 15

Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val

25' 30

Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Aan Aan Tyr Aan Ile Met Glu Ile Arg 35 40 45

Thr Val Ala Val Gly Ile val Ala Ile Lys Gly val Glu Ser Glu Phe 5° ,, 55 60 Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys 65 70 75 30 Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn 35 90 95 Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr KiS Asn Gly Gly Glu Met Phe Val 100 105 110 Ala Leu Glu Gin Lys Gly ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys • 115 120 125 Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 130 135 140

5 10 - 15

Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly

25 30 '

·· ·· ·* Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg 35 40 45 Ile Asp Lya Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn 50 55. 60 Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile 65 ' '' . r ... i_T . - —“ 70 ¹ J5¹ ^J ··' - ......BU* Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys 85 90 95 Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Ser Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu 100 105 110 Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His 115 120 125 Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro val 130 135 140 Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro 145 150 155 160

Met Ala Ile Thť (2)Informace o SEQ ID NO:81:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 517 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ií)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:81:

CTAGAAGGAG GAATAACATA TGTCTAATGA TATGACTCCG GAACAGATGG CTACCAACGT 60 TAACTCCTCC'TČCCCGGAAC’GTCACÁCGCG'TTCCTACGAC‘TAČATGGAAG'GTGGTGACAT’'™“12O CCGCGTACGT CGTCTGTTCT GCCGTACCCA GTGGTACCTG CGTATCGACA AACGCGGCAA 180 AGTCAAGGGC ACCCAAGAGA TGAAAAACAA CTACAATATT ATGGAAATCC GTACTGTTGC 240 TGTTGGTATC GTTGCAATCA AAGGTGTTGA ATCTGAATTC TACCTGGCTA TGAACAAAGA 300 • · 444

5 10 15

Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly . 25 · 30

Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg 35 40 45

Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn 50 55 60

Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile

70 75 80

Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys — · - ..... -85— — .......... 90 .................... 95

Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu 100 105 lio

Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His 115 120 125

Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val 130 135 ·’ 140 v-vv v V W ^w * · ··· · * ·· * • * * · · · · » · « «·· · »»·» · · a · * · ·

Glu Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro ¹⁴⁵ 150 155 ISO

Met Ala Ile Thr lilii I» Ul· «H w—> .· I . » I» Ι«Μ·*···1Ι«ΗΙΙ·Ί I··............ ! i;

5 10 15

Asp Zle Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg

25 30 _Ile,Asp.Lys,Arg.Gly-Lys-Val_s Lys - GlyThr Gin-Glu-Met“LysAsnAsn¹ '

40 45

Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile 50 55 50

Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys

70 75 80 β · * 4 • 4 44 • 4 • 4« • » * *

5. Polypeptidový analog podle nároku 1, v kterém je prvních čtrnáct aminokyselin na N-koncí odstraněno a Cys¹⁵ je nahrazen jinou aminokyselinou.

6. Polypeptidový analog podle nároku 1, v kterém Cys¹ a Cys¹⁵ jsou nahrazeny jinou aminokyselinou.

7. Polypeptidový analog podle kteréhokoliv z nároků 4,5,6, v kterých je jakákoliv aminokyselina ze skupiny alanin, leucín a serin nahrazena cysteinem.

8. Polypeptidový analog podle nároku 7, v kterém je serin nahrazen cysteinem,

9 9 » » 9 · 9 9 · » a 9 999 9 · 99 9 9· * 9 9 9 9 > 9 9 9· 9 9 9 9 ·

9999 9999 999 (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:60:

Met Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe 15 10 15

Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys 20 25 30 *Ρ·9«««·ΙΙ·*·99*9·*·Μ·9«··9ΙΜΙ9··Ι9|ΙΜ9|Μ·ηΜ9^|ΜΜ^ «Κ*^49Μ*·4^Νΐΐ9ΙΜ»9Μΐφΐ«·4·ΐ(^_νΜ9- *4·*9ΜΝ*Φ·«Μ·Μ··Ι·»«μ-·99·9··99ΜΗ·ηρ·9

Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr 35 40 45

Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr 50 55 60

Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn

70 75 30

Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr

90 95

Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala 100 105 110

Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu 115 120 125

Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 130 135 140 (2)Informace o SEQ ID NO:61:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 495 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii)Typ molekuly: cDNA _________(xi) Popis,sekvence SEQ.ID.NO·: 61:^.,__- ....... ...

ATGTCTAATG ATATGACTCC GGAACAGATG GCTACCAACG TTAACTCCTC CTCCCCGGAA

CGTCACACGC GTTCCTACGA CTACATGGAA GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC

TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAC-GG CACCCAAGAG ATGAAAAACA ACTACAATAT TATGGAAATC CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC * * v «««« « φ ·«· « · ·· · · ·· • « « * + Φ ** * · »♦· · 1 ··*» · · · · · t ·

AAAGGTGTTG AATCTGAATT CTATCTTGCA ATGAACAAGG AAGGAAAAC.T CTATGCAAAG 300

AAAGAATGCA ATGAAGATTG TAACTTCAAA GAACTAATTC TGGAAAACCA TTACAACACA 360

TATGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA ’ 420.

^rGGŤATCCCTGTTGAAGGTAA GAÁAACCÁAG ÁAAGÁACAGÁ’AAACCGCTCA' CTTCCTGCCG' *480

ATGGCAATCA CTTAA 495 (2)Informace o SEQ ID NO:62:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka:164 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii)Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:62:

Met Ser Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Ser

9 9 · 9··· *

99 99 99 99 (2)Informace o SEQ ID NO:53:

(i

Charakteristika sekvence (A) Délka: 432 párů bázi (B) Typ: nukleové kyselina (C) Počet řetězců: neznámý .λ „ -u.rym ww (D) Topologie: neznámá

- **!

(ii)Typ molekuly: cDNA.

(xi)Popis sekvence: ATGACTCGTT CCTACGACTA SEQ ID NO:53: CATGGAAGGT GGTGACATCC GCGTACGTCG TCTGTTCTGC 60 CGTACCCAGT GGTACCTGCG TATCGACAAA CGCGGCAAAG TCAAGGGCAC CCAAGAGATG 120 AAAAACAACT ACAATATTAT GGAAATCCGT ACTGTTGCTG TTGGTATCGT TGCAATCAAA 1Θ0 GGTGTTGAAT CTGAATTCTA CCTGGCAATG AACAAAGAAG GTAAACTGTA CGCAAAAAAA 240 GAATGCAACG AAGACTGCAA CTTCAAAGAA CTGATCCTGG AAAACCACTA CAACACCTAC 300 GCATCTGCTA AATGGACCCA CAACGGTGGT GAAATGTTCG TTGCTCTGAA CCAGAAAGGT 360 ATCCCGGTTC GTGGTAAAAA AACCAAAAAA GAACAGAAAA CCGCTCACTT CCTGCCGATG 420 GCAATCACTT AA 432 2)Informace o SEQ ID NO:54:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 143 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:54:

Met Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg 15 10 15

Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Xle Asp Lys Arg Gly 20 25 30

I · · Φ « · ·· «· e»

Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu 35 40 ⁴⁵ Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser ,50^ •a—ú,. 55 60 Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys 65 70 75 80 Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His 85 90 95 Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met 100 105 110 Phe val Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr • 115 120 125 Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr

130 135 140 (2)Informace o SEQ ID NO:55:

íi)Charakteristika sekvence (A) Délka: 429 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:55:

ATGCGTTCCT ACGACTACAT GGAAGGTGGT GACATCCGCG TACGTCGTCT GTTCTGCCGT

ACCCAGTGGT ACCTGCGTAT CGACAAACGC GGCAAAGTCA AGGGCACCCA AGAGA1GAAA

AACAACTACA ATATTATGGA AATCCGTACT GTTGCTGTTG GTATCGTTGC AATCAAAGGT

.................... I .Λ . ......... . f I........... I _ _ - . . . . _ ,

GTTGAATCTG AATTCTACCT GGCAATGAAC AAAGAAGGTA AACTGTACGC AAAAAAAGAA TGCAACGAAG ACTGCAACTT CAAAGAACTG ATCCTGGAAA ACCACTACAA CACCTACGCA

TCTGCTAAAT GGACCCACAA CGGTGGTGAA ATGTTCGTTG CTCTGAACCA GAAAGGTATC

CCGGTTCGTG GTAAAAAAAC CAAAAAAGAA CAGAAAACCG CTCACTTCCT GCCGATGGCA

ATCACTTAA

120

180

240

300 !

360 ί

420

429 • 4

9 9 99 9 · »9 * * « 99 999 · · 9 9 ·9·

9·» w » ’ » w

9· 99 99 ·· ·· (2)Informace o SEQ ID NO:42:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 149 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý ^^^^^^^^^^D^opologie: neznámá _r - ,-· ' - . — (ii)Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:42

Met Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly 1 5 10 15 Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu 20 25 30 Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn 35 40 45 Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala 50 55 60 Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly 65 • 70 75 80 Lys Leu Tyr Ala Lys Lys. Glu Cys Asn Glu Asp Cva Aan Phe Lys Glu 35 90 95 Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr 100 105 110 His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro 115 120 125 Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu 130 135 140 Pro Met Ala Ile Thr 145

9 • 9 9 9 9 9 9 ' 9 9 99 9 9 9 * · 9 9 9 « • 9 9 9 9 · 9 9 9 99 9 9 • 9 9 Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe 35 40 Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg 45 Ile Asp Lys 50 Arg Gly Lys Val Lys 55 Gly Thr Gin Glu 60 Met Lys Asn Asn *Tyr«Asn,Ile, 65 MetíGlu_tIleiArg Thr. 70 Val Ala, ,Val 75 Gly * I le rVd-lri Ais·»Ί-1β i 80 Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr 85 Leu Ala 90 Met Asn Lys Glu Gly Lys 95 Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn 100 Glu 105 Asp Cys Asn Phe Lys 110 Glu Leu Ile Leu Glu 115 Asn His Tyr Asn Thr 120 Tyr Ala Ser Ala Lys Trp 125 Thr His Asn Gly Gly 130 Glu Met Phe Val Ala 135 Leu Asn Gin Lys 140 Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys 145 Lys Thr Lys Lys Glu 150 Gin Lys Thr 155 Ala His Phe Leu Pro ISO

Met Ala Ile Thr (2)Informace o SEQ ID NO:33:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 483 párů bází (B) Typ: nukleové kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis Sekvence: SEQ ID NO:33:

ATGACŤCCGG AACAGATGGC TACCAACGTT AACTCCTCCT CCCCGGAACG TCACACGCGT SO

TCCTACGACT ACATGGAAGG TGGTGACATC CGCGTACGTC GTCTGTTCTG CCGTACCCAG 120

TGGTACCTGC GTATCGACAA ACGCGGCAAA GTCAAGGGCA CCCAAGAGAT GAAAAACAAC 130

TACAATATTA TGGAAATCCG TACTGTTGCT GTTGGTATCG TTGCAATCAA AGGTGTTGAA 240

TCTGAATTCT ACCTGGCAAT GAACAAAGAA GGTAAAČTGT ACGCAAAAAA AGAATGCAAC 300 ♦ · · · • · ··· 4 • 4 • 44 • 44 4 ·44·

44 44 44 ·*

GAAGACTGCA acttcaaaga actgatcctg gaaaaccact AAATGGACCC ACAACGGTGG TGAAATGTTC GTTGCTCTGA

CGTGGTAAAA AAACCAAAAA AGAACAGAAA ACCGCTCACT

................. > . .........*»'*'TAA

ACAACACCTA CGCATCTGCT 360 ACCAGAAAGG TATCCCGGTT 420 TCCTGCCGAT GGCAATCACT , 490 493

9 9 9 9 9 9

9999 99 99 (2)Informace o SEQ ID NO:19:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý „ —- (D) Topologie : ne známá 'w»*'***¹» μ»*·. τ -l .. m ....«-γ.ί:·ιίι . .r·'.

(ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:19:

TCAAAACTGG ATCCTATTAA 20 {,2} Informace o SEQ· ID NO: 20:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 91 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý {D)Topologie: neznámá (Íi)Typ molekuly: cDNA (xijPopis sekvence: SEQ ID NO:20:

AGTTTTGATC TAGAAGGAGG AATAACATAT GTGCAACGAC ATGACTCCGG AACAGATGGC

TACCAACGTT AACTGCTCCA GCCCGGAACG T (2)Informace o SEQ ID NO:21:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 90 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet_řetězců: ne z námý , (D) Topologie: neznámá (ÍÍ)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:21:

CACACCCGTA GCTACGACTA CATGGAAGGT GGTGACATCC GTGTTCGTCG TCTGTTCTGC S0

CGTACCCAGT GGTACCTGCG TATCGACAAA 90 • Β · · · · · Β Β Β * • Β ··* « Β «· Β · Β· • Β Β · · Β ·« · Β ΒΒ· · · ··«·'»»»» Β « · (2)Informace ο SEQ ID ΝΟ:22:

(i) Charakteristika sekvence (A)Délka: 90 párů bází (8)Typ: nukleová kyselina m (C) Počet řetězců: neznámý ·-“·»- ·., (D)Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:22:

CGTGGTAAAG TTAAAGGTAC CCAGGAAATG AAAAACAACT ACAACATCAT GGAAATCCGT

ACTGTTGCTG TTGGTATCGT TGCAATCAAA (2)Informace o SEQ ID NO:23:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 90 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis- sekvence: SEQ ID NO-:-2-3:

GGTGTTGAAT CTGAATTCTA CCTGGCAATG AACAAAGAAG GTAAACTGTA CGCAAAAAAA

GAATGCAACG AAGACTGCAA CTTCAAAGAA )Informace_o_SEQ ID NO:24:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 90 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii)Typ molekuly: cDNA »·· β « · » · » · · * ·♦ · · * » · · • · · · · · ·· ♦ » β ·« · » • · « · · * · · · · · (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:24:

CTGATCCTGG AAAACCACTA CAACACCTAC GCATCTGCTA AATGGACCCÁ CAACGGTGGT ' 60

GAAATGTTCG TTGCTCTGAA CCAGAAAGGT 90 (2)Informace o SEQ ID NO;25:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 88 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet- řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá

Iii)Typ molekuly: cDNA [xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:25:

ATCCCGGTTC GTGGTAAAAA AACCAAAAAA GAACAGAAAA CCGCTCACTT CCTGCCGATG 50

GCAATCACTT AATAGGATCC AGTTTTGA gg(2)Informace o SEQ ID NO:26:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů. bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (Íi)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:26:

TACGGGTGTG ACGJTCCGGG (2)Informace o SEQ ID NO:27:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA • » · ···· « t » 4 * · ··» » · « · · ·* β · · · « · · « · · ··· · · • 4 ♦ < * · · « ··· ·· ·· »· *· e* 99 (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:27:

CTTTACCACG TTTGTCGATA 20 (2)Informace o SEQ ID NO:28:

mmm(í) Charakteristika .sekvence· ·>«·>ιιι·»ιιι,·χ··*·*·***··*ι - ..............................................*«' (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá .(ii)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:28:

ATTCAACACC TTTGATTGCA (2)Informace o SEQ ID NO:29:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:29:

CCAGGATCAG TTCTTTGAAG 20 (2)Informace o SEQ ID NO:30:

(i) Charakteristika sekvence, (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:30:

GAACCGGGAT ACCTTTCTGG φ”* *' · « φ ··· · • φ φ φ · · φ φ φ φ φ ► Φ 9

ΦΦ Φ Φ Φ » (2) Informace ο SEQ ID Ν0-.31:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 495 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý ι·.μ..' lh.j·..- · — -(q) Topologieneznámá’ (ii)Typ molekuly: cDNA (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:31:

.ATGTCTAATG ATATGACTCC GGAACAGATG GCTACCAACG TTAACTCCTC CTCCCCGGAA 60

CGTCACACGC GTTCCTACGA CTACATGGAA GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC 120

TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG 190

ATGAAAAACA ACTACAATAT TATGGAAATC CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC 240

AAAGGTGTTG AATCTGAATT CTACCTGGCA ATGAACAAAG AAGGTAAACT GTACGCAAAA 300

AAAGAATGCA ACGAAGACTG CAACTTCAAA GAACTGATCC TGGAAAACCA CTACAACACC 360

TACGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA 420

GGTATCCCGG TTCGTGGTAA AAAAACCAAA AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG 490

ATGGCAATCA CTTAA 495 (2) Informace o SEQ' ID NO: 32:

(i)Charakteristika sekvence (A) Délka: 164 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii)Typ molekuly: protein (xi)Popis sekvence: SEQ ID NO:32:

Met Sec Asn Asp Met The Pro Glu Gin Met Ala The Asn Val Asn Sec

9 99 9 · 99

99 99 9999 9

9. Polypeptidový analog podle nároku 1, vybraný ze skupiny obsahující C(1,15)S, ΝΔ15, ΝΔ16, ΝΔ17, ΝΔ18, ΝΔ19, ΝΔ20, ΝΔ21, ΝΔ22, ΝΔ23, ΝΔ24, NÚ3/C(.15)S, Nú3/C(15)-, NA8/C(15)S, ΝΔ8/Ο(15)-, C (1,15) S/R(144) E,

C(l, 15)S/R(144)Q a AN23/R(144)Q.

10. Farmaceutická forma obsahující terapeuticky efektivní množství polypeptidového analogu podle nároku 1 a farmaceuticky akceptovatelný nosič.

• · ··· » φ • · · · · * · • φ · · φ ·

Φ· ·· ·* ·· φ φ 1 · φ φ φφ ·*Ι i * • · « ♦ · ··

11. Farmaceutická forma obsahující terapeuticky efektivní množství lyofilizovaného polypeptidového analogu podle nároku 1.

12. Farmaceutická forma podle nároku 11 dále obsahující farmaceuticky akceptovatelný nosič..

13. Molekula nukleové kyseliny vybraná ze skupiny obsahující DNA a RNA, v které molekula nukleové kyseliny kóduje polypeptidový analog KGF mající až prvních 24 aminokyselin na N-konci modifikovaných a v kterém cysteinová rezidua korespondující s pozicemi 1 a 15 KGF (pozice aminokyselin 32 a 46 SEQ ID NQ:2, (Cys¹ a Cys¹⁵, v tomto pořadí)) jsou odstraněna nebo nahrazena jinou aminokyselinou.

14. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 13 kódující polypeptidový analog KGF, v kterém jsou odstraněny Cys¹ a Cys¹⁵.

15. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 13 kódující polypeptidový analog KGF, v kterém je prvních 15 až 24 aminokyselin z N-konce odstraněno.

16. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 13 kódující polypeptidový analog KGF, v kterém CyS¹ je odstraněn a Cys¹⁵ nahrazen jinou aminokyselinou.

17'. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 13 kódující polypeptidový analog KGF, v kterém je prvních čtrnáct aminokyselin na N-konci odstraněno a Cys¹⁵ je nahrazen jinou aminokyselinou.

18. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 13 kódující polypeptidový analog KGF, v kterém Cys¹ a Cys¹⁵ jsou nahrazeny jinou aminokyselinou.

19. Molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 16,17,18 v které je jakákoliv aminokyselina ze skupiny alanin, leucin a serin nahrazena cysteinem.

20. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 19, v které je kodon kódující serin nahrazen kodonem kódujícím cystein.

v v - « » · · · · » • · *·· » · · ··, · * · ·. · · · · · 999 · * • · · · ·»«» ··· ·· ·« ·« ·· *· ··

21. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 13, ve které je polypeptidový analog vybrán ze skupiny obsahující C(l,15)S, ΝΔ15, ΝΔ16, ΝΔ17, ΝΔ18, ΝΔ19, ΝΔ20, ΝΔ21, ΝΔ22, ΝΔ23, ΝΔ24, NA3/C(15)S, NŮ3/C(15)-, Nů8/C(15)S, NA8/C(15)- a ŮN23/R{144}Q.

22. Biologicky funkční plasmid nebo virový vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle nároku 13.

23. Prokaryotická nebo eukariotické hostitelská buňka stabilně transformovaná nebo transfektovaná biologicky funkčním vektorem podle nároku 22.

24. Prokaryotická hostitelská buňka podle nároku 23, která je E-coli.

25. Eukariotícká hostitelská buňka podle nároku 23, která je savčí buňka.

26. Eukariotícká hostitelská buňka podle nároku 25, která je CHO buňka (Chinese hamster ovary).

27. Proces produkce polypeptidového analoga KGF zahrnující růst prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky stabilně transformované molekulou nukleové kyseliny podle nároku 13 ve vhodných nutričních podmínkách a způsobem dovolujícím expresi kódovaného polypeptidového analoga .a .proces izolace takto · produkovaného polypeptidového analoga.

28. Způsob stimulující produkci nefibroblastových epiteliálních buněk zahrnující styk takovýchto buněk s efektivním množstvím polypeptidového analoga KGF podle nároku 1.

t * · ·» • * « * » « »· ·· * · * • ·· *** · * * ·· ··

Seznam sekvencí (1) Základní informace:

(i) Žadatel; Amgen lne.

(ii) Název vynálezu; Analoga keratinocytových růstových faktorů (iii) Počet sekvencí: 104 (iv) Korespondenční adresa:

(A) Adresát: ňmgen lne.

(B) Ulice: 1840 Dehavilland Drive (C) Město: Thousand Oaks (D) Stát: California (E) Země: U.S.A, (F) ZIP: 91320-1789 (v) Forma vhodná pro počítačové zpracování (A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (vi) Současné údaje o žádosti (A) Číslo žádosti: PCT/IB95/00971 (B) Datum registrace: 12,10.1995 (O)Klasifikace:

(vii) Předchozí údaje o žádosti (A,Číslo žádosti: 08,487,825 (B) Datum registrace-: 7.6.19-95 (C) Klasifikace:

(vii) Předchozí údaje o žádosti (A) Číslo žádosti: 08/323,475 (B) .Datum registrace: 13.10.1994 (C) Klasifikace:

(vii) Předchozí údaje o žádosti (A) Číslo žádosti: 08/323,340 (B) Datum registrace: 13.10.1994 (C) Klasifikace:

(viii) Právní zástupce/zástupce pro informace (A) Jméno: Zindrick, Thomas D.

(B) Registrační číslo: 32,185 (C) Číslo spisu: A-315 • •0 • 0 000

0 0 0 0

0 0 0

00

0 00 » > 0 0

0 0 0

25 30 • ···· · · ·· * • ·· · ·

Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg 35 40 45 Thr Val Ala Val Gly Ile* Val Ala*Ile’ Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe 50 55 60 Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys 65 70 75 80 Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn 85 90 95 Thr Tyr Ala Ser Ala. Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val 100 105 110 Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys 115 ¹²⁰ 125 Glu Glu Glu Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 130 135 140

/ φ φφφ • * ·.