HUT78050A

HUT78050A - Cukorbetegség kezelése KGF felhasználásával

Info

Publication number: HUT78050A
Application number: HU9901071A
Authority: HU
Inventors: Sharon Lea Aukerman; Glenn Francis Pierce
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 1999-07-28
Also published as: AU681546B2; SK284534B6; EE9700225A; ES2273338T3; CA2201940C; SK45597A3; FI971536A0; DK0804479T3; CZ297328B6; KR100278597B1; PL320484A1; BG101392A; BG101408A; NO971566L; EP0785948B1; JP4216329B2; ES2196082T3; JPH10507080A; HU226168B1; NZ505502A

Description

A találmány tárgya eljárás a keratinocita növekedési faktor alkalmazására a cukorbetegség kezelésében vagy kialakulásának megelőzésében.

A keratinocita növekedési faktor (KGF) az epiteliális sejtekre specifikus növekedési faktor, amit először humán » ' ·»· · · embrionális tüdő fibroblaszt sejtvonal kondicionált táptalajában azonosítottak [Rubin és mtsai: Proceedings of tfie National Academy of Sciences, USA 8 6, 802-806 (1989)] . A KGF mRNS-ének expresszióját számos, epiteliális sejtekből származó fibroblaszt sejtvonalban kimutatták a fejlődés különböző állomásaiban. A KGF mRNS jelenléte nyilvánvaló volt a normál felnőtt veséből és az emésztőrendszer szerveiből extrahált RNSben is [ Finch és mtsai: Science 245, 752-755 (1989)] . Az a megfigyelés, hogy a KGF szekretálódik tenyésztett fibroblasztokból és in vivő expresszálódik a dermiszben, de az epidermiszben nem, azt mutatja, hogy a KGF a keratinocita szaporodás fontos normális parakrin effektora lehet. A vizsgálatok igazolták, hogy a KGF ugyanolyan hatékony mint az EGF a primer vagy szekunder humán keratinociták szövettenyészetben való szaporodásának serkentésében [Marchese és mtsai: J. Cell. Phys. 144,

326-332 (1990)] .

Normális felnőtt állatok ex vívó és in vivő vizsgálata igazolta, hogy a KGF változásokat okoz a szőrtüsző morfogenezisében, a hepatociták szaporodásában, valamint a tüdő, a mell, a hasnyálmirigy, a gyomor, a vékonybél és a vastagbél epiteliális sejtjeinek szaporodásában [ Panos és mtsai: J. Clin. Invest. 92, 969-977 (1993); Ulrich és mtsai:

Am. J. Path. 144, 862-868 (1994); Yi és mtsai: Am. J. Path.

145, 80-85 (1994); Ulich és mtsai: J. Clin. Invest. 93, 12981306 (1994)] . A KGF fejlődésben még nem dokumentálták, hogy szerepét az embrionális vagy neonatális tanulmányozták részletesen; azt azonban a KGF fontos mediátora a szeminális «#* · · • · · · · · · • · · ·♦*♦·· • ···· · · ··· ···· · *·· · · · ' 3 vezikulum fejlődésének újszülött egerekben [ Alarid és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 91, 10741078 (19 94)] .

A publikált WO 90/08771 PCT bejelentésben leírják a KGF tisztítását humán embrionális fibroblaszt sejtvonal kondicionált táptalajából, a tisztított KGF részleges aminosav szekvenciáját, a gén klónozását, valamint a gén expresszióját bakteriális sejtekben, biológiailag aktív KGF előállítása céljából. Az előzőkben említett publikációban leírják azt, hogy a KGF vagy a KGF-szerű polipeptidek jól használhatók sebgyógyító ágensekként égési sebekhez, vagy transzplantált szaruhártya szövet serkentésére. Tény, hogy a KGF-ről igazolták, hogy fokozza a re-epitelizációt és fokozza az epitélium vastagságát, ha a rekombináns KGF-et topikálisan alkalmazzuk nyúlfülön vagy sertésbőrön sebészeti beavatkozással

okozott	sebekre [ Pierce és mtsai:	J.	Exp.	Med.	. 179,	831-840
(1994);	Staiano-Coico és mtsai:	J.	Exp .	Med.	178,	865-878
(1993)] . Azt	a felfedezést tettük,	hogy a	KGF	használható a

cukorbetegség néven ismert rendellenesség kezelésében.

Az 1. ábra egy oszlopdiagramm, ami a KGF hatását írja le patkányokban, napi 5 mg/testsúly-kilogrammot (mg/kg) szubkután beadva több mint 7 napig. A KGF kezelés megkezdését követően 55 mg/kg Streptozotocint adunk naponta egyszer intravénásán. A cukorbeteg patkányok KGF-fel kezelt csoportja az ábra jobb oldalán látható, a Strep + KGF szöveg fölött. A kontrollcsoportok ennek a bal és jobb oldalán láthatjuk: kezelés ·»·· « « · · · · « · • » · » * ·· * • ···· · · *· ···· · »·· · · hét napig nátrium-klorid oldattal, nincs cukorbetegség indukció (NaCl), kezelés hét napig nátrium-klorid oldattal a streptozotocinnal indukált cukorbetegség (Strep) előtt és után, valamint kezelés hét napig KGF-fel, és nincs cukorbetegség indukció (KGF). A függőleges tengelyen a nem-éheztető vércukorszintek láthatók milligramm per deciliter (mg/dl) dimenzióban, a cukorbetegség indukciója utáni ötödik napon (azaz hét nappal a KGF vagy nátrium-klorid kezelés megkezdése után). Csoportonként négy patkányt használunk.

A 2. ábra egy oszlopdiagram, ami a KGF hatását írja le ugyanazon a patkánymodellen, egyéb, a cukorbetegséggel kapcsolatban álló fiziológiai mérésekkel. A függőleges tengelyen az éhezés! vizelet giükózszint látható mg/dl dimenzióban, valamint az éhezési vizeletürítés ml-ben, amit a KGF vagy nátriumklorid kezelés hetedik napján huszonnégy óra alatt ürítenek, az ábra bal- illetve jobboldalán. Az ábrán szereplő szövegeknek (NaCl, Strep, Strep+KGF és KGF) ugyanaz az értelmük mint az 1. ábrán. Csoportonként négy patkányt használtunk.

A 3. ábrán a napi nem-éhezési vér glükózszintek láthatók mg/dl dimenzióban, a cukorbetegség azonos patkánymodelljében, a cukorbetegség indukcióját követő nyolcadik napon. Néhány állatot napi 3 mg/kg szubkután KGF dózissal kezelünk, egy nappal a betegség indukciója után kezdve (Strep + KGF), míg a többieket előtte és utána kezeljük nátrium-klorid oldattal mint kontrollal (Strep + NaCl). Az állatoknak egy nem-cukorbeteg csoportját kezelve (NaCl) kapunk egy másik kontrollcsoportot. Csoportonként hat patkányt használunk.

A 4. ábrán az éhezési vizelet glükózszinteket mutatunk be mg/dl dimenzióban, ugyanabban a patkánymodellben, a cukorbetegség indukciója utáni hatnapos periódusban, ebben az esetben a betegség indukciója utáni második napon kezdve. A KGF kezelést egy nappal a cukorbetegség indukálása után indítottuk. A grafikus jelek ugyanazt a három tesztcsoportot jelentik mint a 3. ábrán. Csoportonként hat patkányt használtunk.

Az 5. ábrán a vizeletürítést mutatjuk be, milliliter per 24 óra dimenzióban, ugyanabból a tesztcsoportból mint amelyeket a 3. és 4. ábrán mutattunk be, a cukorbetegség indukciója utáni 2., 5., 20. és 8.napon. A grafikus jelek ugyanazok mint a 3. és 4. ábrán. Csoportonként hat patkányt használtunk.

A 6. ábrán a kísérletben szereplő patkánycsoportok átlagos vízfelvételét látjuk. A patkányoknak tetszés szerint adtunk vizet, a felvételt a 24 óra alatt megivott térfogat milliliterében mérjük. Csoportonként hat patkányt használtunk.

A 7. ábrán egy KGF analógnak streptozotocinnal indukált cukorbetegségre gyakorolt hatását láthatjuk Sprague-Dawley patkányokban .

A 8. ábrán a természetes KGF nukleotid (1. számú szekvenciavázlat) és aminosav (2. számú szekvenciavázlat) szekvenciája látható (a természetes KGF érett formáját kódoló nukleotidok számozása az 1.számú szekvenciavázlaton 201-684, a KGF érett formáját a 2. számú szekvenciavázlaton a 32-194-es aminosavak képviselik).

A találmány szerinti eljárást a keratinocita növekedési faktor bármely olyan formáját használva alkalmazhatjuk, amely <4 · • · · ·· · · • « · ···«·· • «··* · ··«« ···· · ····· · rendelkezik a természetben előforduló polipeptid tulajdonságaival. Az ilyen formák közé tartoznak azok, amelyeket biológiai folyadékokból, sejtekből és szövetekből izolálunk, vagy amelyeket kémiai szintézissel vagy rekombináns módszerekkel állítunk elő, heterológ gazdasejtekben expresszálva, amelyeket a kódoló DNS-sel és RNS-sel transzformáltunk. A keratinocita növekedési faktor előállítására szolgáló rekombináns eljárást a korábban említett WO 90/08771 számú szabadalmi bejelentésben írták le. A szakterületen jártas szakember számára ismert, egyéb eljárások is adaptálhatók ugyanezzel a céllal.

A KGF fehérjét kódoló nukleinsav szekvenciát, vagy annak egy részét beilleszthetjük egy megfelelő expressziós vektorba, azaz egy olyan vektorba, amely tartalmazza a beépített fehérje transzkripciójához és transzlációjához szükséges elemeket. A szükséges transzkripciós és transzlációs jeleket is szolgáltathatja a természetes KGF gén és/vagy annak határoló régiói. Számos különböző gazda-vektor rendszer használható a fehérjét kódoló szekvencia expresszálására. Ezek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a vírussal (azaz például vakolnia vírussal, adenovírussal, stb.) fertőzött emlős sejtrendszerek,· vírussal (azaz például bakulovírussal) fertőzött rovarsejt rendszerek; mikroorganizmusok, azaz például élesztő, amely élesztő vektort tartalmaz, vagy bakteriofág DNS-sel, plazmid DNS-sel vagy kozmid DNS-sel transzformált baktériumok. Ezekben a vektorokban az expressziós elemek erőssége és specifitása változik. A használt gazdafcfr* «

vektortól függően, bármelyik megfelelő transzkripciós és transzlációs elem alkalmazható.

Ά nukleotid fragmensek vektorba építésére szolgáló, korábban ismertetett bármelyik módszer használható olyan expressziós vektorok előállítására, amelyek egy kiméra gént tartalmaznak, ami megfelelő transzkripciós/transzlációs kontroll szekvenciákat tartalmaz, valamint a fehérjét kódoló szekvenciákat.

Ezek közé a módszerek közé tartoznak az in vitro rekombináns

DNS és szintetikus technikák, valamint az in vivő rekombinációk (genetikai rekombináció). Egy KGF fehérjét vagy peptid fragmenst expresszáló nukleinsav szekvencia szabályozható egy második nukleinsav szekvenciával, oly módon, hogy a KGF fehérje vagy peptid expresszálódik egy, a rekombináns DNS molekulával transzformált gazdasejtben. A KGF expresszió ellenőrzéséra használt promóterek közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az SV40 promoter régió, a Rous szarkóma vírus 3' hosszú terminális ismétlődésében levő promoter, a herpesz timidin-kináz promotere, a metallotionéin gén szabályozó szekvenciái, a prokarióta expressziós vektorok, azaz például a béta-laktamáz promoter vagy a tac promoter, a növényi expressziós vektorok, amelyek tartalmazzák a nopalin szintetáz promotert [ Herrera-Estrella és mtsai.] , vagy a karfiol mozaikvírus 35S RNS promotere, és a ribulóz biszfoszfát karboxiláz fotoszintetikus enzim promotere, az élesztőből és egyéb gombákból származó promoter elemek, azaz például a Gal4 promoter, az ADC (alkohoz-dehidrogenáz) promoter, a PGK (foszfoglicerin-kináz) promoter, az alkalikus foszfatáz promo» ·'·*·· ·· « » « « ·<« ♦ * « · «·· tér, és az alábbi állati transzkripciós kontroll régiók egyike, amely szövetspecifitással rendelkezik és transzgenikus állatokban használták őket: elasztáz I gén kontroll régió, amely aktív a pankreatikus acinar sejtekben, az inzulin gén kontroll régió, amely a pankreatikus béta sejtekben aktív, az immunglobulin gén kontroll régiója, amely a limfoid sejtekben aktív [ Gosschedl és mtsai.] , az egér emlőtumos vírus kontroll régiója, amely aktív a here, az emlő, a limfoid- és mastsejtekben, az albumin gén kontroll régiója, amely aktív a májban, az α-fetoprotein gén kontroll régiója, amely aktív a májban, az α-1-antitripszin gén kontroll régiója, amely aktív a májban, a béta-globin gén kontroll régiója, amely aktív a mieloid sejtekben, a mielin bázikus fehérj gén kontroll régiója, amely aktív az oligodendrocita sejtekben az agyban, a miozin könnyű lánc-2 kontroll régió, amely aktív a vázízomban, és a gonadotróp release hormon gén kontroll régiója, amely aktív a hipotalamuszban.

A KGF gén inszerteket tartalmazó expressziós vektorok DNSDNS hibridizálással, marker gén funkciók jelenléte vagy hiánya alapján, valamint az iszertált szekvenciák expressziója révén azonosíthatók, ami nyilvánvaló, és a szakterületen jártas szakember számára ismert.

Számos, a szakterületen jártas szakember számára ismert módszer használható a KGF gén sokszorozására. Ha egyszer megállapítottuk a megfelelő gazda rendszert és növekedési körülményeket, akkor a rekombináns expressziós vektorok nagy mennyiségben szaporíthatok és előállíthatok.

Emellett választható egy olyan gazdasejt törzs, amely modulálja az inszertált szekvenciák expresszióját, illetve módosítja és feldolgozza a génterméket, a kívánt specifikus módon. Bizonyos promoterek esetében az expresszió fokozható bizonyos indukáló anyagok jelenlétében. Ezáltal a genetikailag módosított KGF fehérje expressziója szabályozható. Emellett, a különböző gazdasejtek jellemző és specifikus mechanizmussal rendelkeznek a fehérjék transzlációs és poszt-transzlációs processzálására és módosítására (például glikozilezésre, a glutaminsav csoportok gamma-karboxilezésére, proteolítikus hasítására) . Megfelelő sejtvonalak vagy gazdasejtek választhatók, az expresszált fehérje kívánt módosításának és processzálásának biztosítására.

Az nyilvánvaló, hogy a keratinocita növekedési faktor és KGF szakkifejezések jelentése ebben a leírásban felcserélhető egymással, hacsak a változást külön nem jelezzük, és vonatkozik a természetes KGF-re és KGF analóg fehérjékre (vagy muteinekre), amelyeket lényegében ugyanaz a peptidszekvencia jellemez mint a természetes KGF peptidszekvenciáját, és megtartják a természetes KGF összes, vagy néhány biológiai aktivitását, főleg a nem-fibroblaszt epiteliális sejt szaporodást (azaz például legalább körülbelül 500-szorosnál nagyobb mértékben serkentik a BALB/MK keratinocita. sejteket mint az NIH/3T3 fibroblaszt sejteket, és legalább 50-szer jobban serkentik a BALB/MK keratinocita sejteket mint a BS/589 epite3 liális sejteket vagy a CC1208 epiteliális sejteket, H-timidm beépülés alapján meghatározva). A lényegében ugyanazzal a pép•ί 10 tid szekvenciával jellemezhető mint a természetes KGF peptidszekvenciája szakkifejezés alatt egy olyan peptidszekvenciát értünk, amit egy olyan DNS szekvencia kódol, amely képes az 1. számú szekvencia 201-684-es nukleotidjaival hibridizálódni, előnyösen szigorú hibridizálási körülmények között.

Két aminosav szekvencia között egy megfelelő aminosav pozíciót úgy határozhatunk meg, hogy egymáshoz illesztjük a két szekvenciát, hogy maximális illeszkedést kapjunk, az aminovagy karboxil-vég eltolásával, szükség esetén megszakításokat bevíve, és/vagy kivágva csoportokat, amelyek a jelölt molekulában vannak jelen. Az adatbázisok átvizsgálását, a szekvenciák elemzését és manipulálását a számos jól ismert és rutinszerűen használt szekvencia homológia/azonosság pásztázó algoritmus programok felhasználásával végezhetjük el [ Person és Lipman: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 85, 24442448 (1988); Altschul és mtsai: J.Mól.Bioi. 215, 403-410 (1990); Lipman és Pearson: Science 222, 1435 (1985); Devereux és mtsai: Nucleic Acids Research 12, 387-395 (1984)] .

A. szigorú körülmények jelentése a hibridizáció esetében a sókoncentráció, a hőmérséklet, a szerves oldószerek és egyéb, a hibridizációs reakciók esetében általában szabályozott egyéb paraméterek szigorú kombinált körülményeit jelenti. A szigorú hibridizációs körülményekre példa lehet az alábbi kombináció: hibridizáció 4X SSC-ben 62-67 °C-on, ezt követi a mosás O,1X

SSC-ben 62-67 °C-on, körülbelül egy óra hosszat. Egy másik tipikus szigorú hibridizációs körülmény: hibridizáció 45-55%-os formamidban, 4X SSC-ben 40-45 °C-on [Sambrook és mtsai:

Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] .

A fehérjékben lehetnek tehát allél-variációk, vagy aminosav deléció(k), szubsztitúció(k) , inszerció(k) , beleértve a természetes KGF fragmenseit, kiméra vagy hibrid molekuláit. A KGF-re példák lehetnek az olyan fehérjék, amelyekben a 2. számú szekvenciában szereplő Cys¹ és Cys⁵¹ csoportoknak megfelelő csoportok helyettesítve vannak vagy ki vannak vágva, és ennek következtében a kapott molekulának megnőtt a stabilitása, a kiindulási molekulával összehasonlítva [U.S.S.N. 08/487,825,

1995. július 7.] . A KGF-re egy másik példacsoport lehet az olyan fehérjék csoport], amelyeknek megváltozott a töltésük, amelyekben a természetes KGF 41-154-es aminosavai közül egyet vagy többet (előnyösen az Arg¹¹, Gin¹³, Lys^Sj, Lys^9j, Lys“'ű

Asn

133 ,_η 138 _T 139 144 .In , Lys , Arg ,

14i 152 153 _m, 1 5 4 , ws , Gin , Lys vagy ihr ) kivágunk vagy egy semleges, illetve negatív töltésű csoporttal helyettesítünk, amit úgy választunk ki, hogy csökkentse a fehérje pozitív töltését [U.S.S.N. 08/323,337, 1994. október 13.] . A KGF-re még további példák lehetnek azok a fehérjék, amelyeket úgy állítottunk elő, hogy legalább egy, magasabb hurokképző képességgel rendelkező aminosavat helyettesítünk legalább egy aminosavval, a természetes KGF Asn¹¹⁵-His¹¹⁶-Tyr¹¹⁷Asn¹¹⁸-Thr¹¹⁹ hurokképző régióján belül [U.S.S.N. 08/323,473, 1994. október 13.] . További példák lehetnek az olyan fehérjék, amelyekben egy vagy több aminosavat helyettesítettünk, kivágtunk, vagy hozzáadtunk a fehérjét alkotó aminosavakhoz a természetes KGF 123-133-as régiójában (154-164-as aminosavak a • · ·

2. számú szekvenciában); ezeknek a fehérjéknek agonista vagy antagonista aktivitásuk lehet.

A részletesen ismertetett fehérjék közé tartoznak az alábbi KGF molekulák (a természetes fehérjében az adott pozícióban található csoportra hivatkozva (mínusz szignálszekvencia) , a 2. számú szekvenciavázlaton látható módon, ezt követi az aminosav pozíció zárójelben, majd vagy a helyettesített csoport, vagy követi, a deléció jelzésére): C(1,15)S, ΔΝ15ΔΝ24, AN3/C(15)S, ΔΝ3/Ο(15)-, ΔΝ8/Ο(15)Ξ, ΔΝ8/ό(15)-,

C(1,15)S/R(144)E, C (1,15)S/R(144)Q, ΔΝ23/R(144)Q, C(l,15,

40)S, C (1,15,102)S, C (1, 15, 102, 106)S, AN23/R(137)E,

ΔΝ23/Κ(139)Ε, Δ23/Κ(139)Ο, ΔΝ23/R(144)A,

ΔΝ23/R(144)L, ΔΝ23/K(147)Ε, ΔΝ23/K(147)Q,

AN23/R(144)E,

ΔΝ23/Κ(153)E,

ΔΝ23(153)0, ΔΝ23/Q(152)E/K(153)E; R(144)Q és H(116)G

Gyógyászati kezelésben való gyakorlati alkalmazáshoz a KGF-et megfelelő gyógyászati készítményekbe formulázhatjuk, bármely szokásos úton való beadáshoz, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a parenterális beadást, azaz a szubkután, intravénás vagy intramuszkuláris injekciót. Ezek a standard készítmények leggyakrabban megfelelő puffersókat, konzerváló és stabilizáló ágenseket tartalmaznak a folyadék készítményhez, vagy megfelelő puffersókat, stabilizáló ágenseket, konzerváló szereket és kitöltő anyagokat tartalmaznak, amelyek egy liofilezett készítményhez kellenek. Az is lehetséges, hogy a KGF beadható lassú felszabadulása formában, intradermális, szubkután vagy intra-abdominális depóval. A KGF• · · · · • · nek ezt a lassú felszabadulású formáját a szakterületen jártas szakember számára ismert standard módszerekkel szerelhetjük ki. A KGF leggyakoribb beadási tartományait használhatja a beteg otthon, szubkután injekciót vagy intradermális beadást használva, vagy a kezelőorvos, hosszú felszabadulási idejű készítményt használva, amit szubkután vagy a peritoneális üregbe építettek be.

A KGF dózistartományát a gyakorlott orvos tapasztalati úton határozhatja meg. Általában az várható, hogy a KGF napi 0,001-10 mg/testsúly-kilogramm mennyiségben hatásos, előnyösen 0,05-5 mg/kg/nap mennyiségben. A terápiás tartomány tartalmazhat egyszeri vagy ismételt injekciókat, vagy lassú, folyamatos felszabadulású alacsony dózisú KGF-et, az egyes betegek betegségének típusától és súlyosságától függően. A KGFfel való kezelés során elég pankreatikus bétasejt funkciót kell ahhoz generálni, hogy normalizáljuk a vércukor szintjét a különböző metabolikus igények során, és mégis elkerüljük a gyakori vagy mély hipoglikémiát. A cél az, hogy feltöltsük az I-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegek szigetsejt funkcióját, hogy elkerüljük az állandó exogén inzulinigényt. Az újonnan diagnosztizált I-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegek, akikben még megmaradt valamennyi szigetsejt funkció, lehetnek jelöltek a KGF terápiára. A KGF arra lehet használható, hogy fenntartsuk ezekben a betegekben a szigetsejt funkciót, hogy ezzel enyhítsük, késleltessük vagy megkerüljük a betegség állandó manifesztálódását. Az I-es típusú cukorbetegségről azt gondolják, hogy egy autoimmun betegség, és keze• * · lésére immunszuppresszív terápiát használnak. A jelen találmány szerinti KGF kezelés használható immunszuppresszánsokkal kombinálva a betegség kezelésére, beleértve szigetsejt transzplantáció kísérő terápiájaként való alkalmazását.

Az alábbi in vivő vizsgálatokban használt vizsgálati anyagok, amint azt az alábbiakban specifikusan ismertetjük, a természetes (természetben előforduló) szekvenciával, egy KGF analóg, amelyben a természetes aminosav szekvencia 1-es és 15ös pozíciójában levő ciszteincsoportot szerinnel helyettesítettünk, a helyspecifikus mutagenezis standard technikáinak alkalmazásával (azaz C(1,15)S), valamint egy olyan KGF analóg, amelyből a természetes KGF N-terminálisának első 23 aminosavát standard technikával kivágtuk (azaz ΔΝ23). Minden fehérjét

Escherichia coli-ban végzett rekombináns expresszióval állítunk elő, majd homogenitásig tisztítjuk, és mindegyik tartalmaz egy metionin csoportot (Met ¹) az N-termínálisán. Mindegyik fehérjét szubkután készítmény formájában adjuk be. Az előző kísérletek azt igazolták, hogy ezeknek a fehérjéknek, felnőtt patkányokban vizsgálva, összehasonlítható az aktivitásuk, ha szisztémásán adjuk be őket. A természetes szekvenciájú KGF és az analógjai mind összehasonlítható aktivitással rendelkeznek az alábbi vizsgálatokban használt cukorbeteg és nem-cukorbeteg patkányokban.

A cukorbetegség in vivő modellje

A különböző állatfajokban kémiai eszközökkel indukált cukorbetegség modelleket klasszikusan használtuk a betegség és kezelési módjai tanulmányozására. A streptozotocin cukorbetegséget indukál egérben, patkányban, hörcsögben, kutyában és majomban, jóllehet leginkább a patkányokban és egerekben végzett vizsgálatokat alkalmazzák [ Junod és mtsai: Proc. Soc. Exp. Pio. Med. 12 6, 210-205 (1967); Rerup: Pharm. Rév. 22, 485518 (1970); Rossini és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 7 4, 2485-2489 (1977); és Ar'Rajab és Ahren: Pancreas 8, 50-57 (1993)] . Patkányokban 45-70 mg/kg dózisú, egyetlen intravénás injekcióban beadott stretozotocin stabil betegséget indukál. A streptozotocin injekció beadása után egy nappal indukálódik a hiperglikémiás állapot. A vér inzulinszintje lényegében változatlan marad a normál patkányokkal összehasonlítva; azonban a hasnyálmirigyben az inzulin és C-peptid össz-mennyisége erősen lecsökken. A patkányokban az emberi cukorbetegség klasszikus tünetei és jelei manifesztálódnak: megnőtt vércukorszint (híperglikémia) , cukor a vizeletben (glükozuria), fokozódó szomjúság (polidipszia), fokozott vizelés (poliuria), fokozott étvágy (hiperfágia).

Az ebben a leírásban ismertetett vizsgálatokat SpragueDawley patkányokban végeztük, a streptozotocinnal indukált cukorbetegség modell alkalmazásával. A vizsgálat kezdetekor 203260 g súlyú hím patkányokat használunk. A cukorbetegséget egyetlen 50 mg/kg nagyságú intravénás streptozotocin injekcióval indukáljuk nátrium-citrát pufferben. A nem-cukorbeteg • · · • · · · • · · • · · · · • · · · · · kontroll patkányok egyetlen intravénás nátrium-citrát puffer injekciót kapnak, kontroll céljából. A KGF-et naponta adjuk be szubkután injekció formájában A KGF dózis 3 vagy 5 mg/kg, a kísérlettől függően. Az első kísérletben a KGF terápiát két nappal a cukorbetegség előtt indukáltuk, a cukorbetegség indukciója után összesen nyolc injekcióval indukáltuk és tartottuk fenn. A második és harmadik kísérletben a szubkután beadott KGF-fel végzett kezelést egy nappal a cukorbetegség streptozotocinnal való indukciója után indítjuk. A negyedik kísérletben hétnapos KGF terápiát indítunk a streptozotocin kezelés utáni 7 nappal, és az állatokat további 12 hétig megfigyelés alatt tartjuk. Mindegyik kísérletben (a negyedik kísérlet kivételével) a vércukorszintet, a vizelet glükózszintjét és a vizelet térfogatát használtuk az elemzés végpontjaiként. Emellett a vízfelvételt, a vizelet C-peptid szintjét vagy az összes hasnyálmirigy inzulin és C-peptid tartalmat is mértük néhány kísérletben. A negyedik kísérletben csak a vércukorszintet használtuk végpontként.

Mivel az inzulin nagy részét a máj eltávolítja a keringésből, a perifériális inzulin koncentráció inkább poszthepatikus metabolizmus eseményeket tükröz mint az inzulin szekrécióját a hasnyálmirigyből. Ezért gyakran a C-peptidet mérik, és az inzulin szekréció perifériális markereként használják. A C-peptid a pro-inzulin inzulinná való átalakításakor keletkezik. Az inzulin és a C-peptid ekvimoláris mennyiségben keletkezik a béta sejtekből, és a C-peptidnek csak egy kis mennyiségét vonja ki a máj.

• · » • · · ·

A KGF in vivő beadása

Első vizsgálat: Az ismertetett cukorbetegség modell használatával a KGF hatékonyságát a cukorbetegség kezelésében először a vizsgálati patkányok alábbi négy csoportjának felhasználásával értékeljük ki:

1. Kontroll (nem-cukorbeteg) patkányok szubkután beadott nátrium-klorid oldattal elő- és utókezelve, nincs streptozotocin;

2. Intravénásán beadott 50 mg/kg streptozotocinnal cukorbeteggé tett patkányok, elő- és utókezelve szubkután beadott nátrium-klorid oldattal;

3. Intravénásán beadott 50 mg/kg streptozotocinnal cukorbeteggé tett patkányok, elő- és utókezelve szubkután beadott természetes KGF-fel; és

4. Kontroll patkányok, szubkután beadott természetes KGF-fel kezelve, nincs streptozotocin.

A négy csoportban kezelt patkányoknak vagy természetes KGF-et adtunk be 5 mg/kg/nap dózisban, vagy azonos térfogatú nátrium-klorid oldatot, hét napig. Két nappal a KGF vagy nátrium-klorid beadása után a 2-es és 3-as csoportban levő patkányoknak egyetlen, 55 mg/kg dózisú streptozotocint adtunk be intravénásán. Erről a dózisról ismert, hogy közepes cukorbetegséget okoz patkányokban. Mindegyik patkánynak vizsgáljuk az éhezési vércukorszintjét, testsúlyát, az éhezési vizelet glükózszintet és a vizelet mennyiségét. Hét nappal azután, hogy a streptozotocint beadtuk a 2-es és 3-as csoport patkányainak • · * · (azaz kilenc nappal a vizsgálat megkezdése után) mindegyik csoportban éjszakán át éheztetjük a patkányokat, leöljük, majd felboncoljuk őket. A hasnyálmirigyet mindegyik esetben megőrizzük cink-formalinban, beágyazzuk és normál hisztopatológiai vizsgálatokhoz feldolgozzuk.

A streptozotocin beadása utáni ötödik napon a nem-éhezési vércukorszint jelentősen megnőtt a cukorbetegségben szenvedő kontroll patkányokban (2-es csoport), a nem-cukorbeteg kontroll patkányokhoz (l-es csoport) viszonyítva, amint az az 1. ábráról látható. Azoknak a cukorbeteg patkányoknak, amelyeket a streptozotocin beadása előtt elő- és utókezeltünk KGF-fel (3. csoport), jelentősen alacsonyabb volt a nem-éhezési vércukorszintje mint a KGF-fel nem kezelt cukorbeteg csoportnak (2-es csoport) , de még mindig magasabb vol a nem-cukorbeteg patkányokhoz (l-es csoport) viszonyítva, lásd az 1. ábrát. A 2es, cukorbeteg kontroll patkány csoport éhezési cukorszrntje és vizeletének mennyisége a vizsgálat hetedik napján (azaz a streptozotocin injekció utáni ötödik napon) jelentőén megnőtt, amint az a 2. ábrán látható. Ez az állapot annak következménye, hogy az inzulintermelő béta-sejtek tönkremennek a hasnyálmirigy szigeteiben, valamint annak, hogy súlyos zavar támad a cukor metabolizmusában, aminek az az eredménye, hogy glükóz választódik ki a vizeletbe. Ezzel szemben a 3-as csoportba tartozó cukorbeteg patkányoknál, amelyeket elő- és utókezeltünk KGF-fel, lényegesen kisebb mértékű az éhezési glükózszint növekedése mint a cukorbeteg kontroll csoportban (2-es csoport) . A KGF-fel kezelt csoport által termelt vizelet • ·

' 19 mennyisége is lényegesen kisebb mint a cukorbeteg kontroll csoporté, lásd a 2. ábrát.

Ezek az eredmények összhangban vannak azzal, hogy közepes cukorbetegség indukálható patkányokban, indukáló ágensként streptozotocint használva. Azok a cukorbeteg patkányok, amelyeket KGF-fel kezeltünk a cukorbetegség indukciója előtt, és amelyek az indukció ‘után is tovább kapták a KGF-et, a cukorbetegség enyhébb formájának tüneteit mutatták. Tehát az a következtetés vonható le, hogy a KGF kezelés vagy részlegesen megakadályozza a betegség indukcióját, vagy helyreállítja az inzulintermelő szigetsejteket a streptozotocinnal indukált béta-sejt roncsolódás után. Ahhoz, hogy megkülönböztethessük ezeket a lehetőségeket, a köveckezőkben a betegség megkezdése utáni KGF terápiát vizsgáltuk.

Második vizsgálat: Az előzőkben ismertetett cukorbeteg modellt használva, a KGF-nek a cukorbetegség kezelésében való hatékonyságát vizsgáljuk tovább, az alábbi három patkány vizsgálati csoportot alkalmazva:

1. Kontroll patkányok, szubkután beadott nátrium-klorid oldattal kezelve, streptozotocin nélkül;

2. Intravénásán beadott streptozotocinnal cukorbeteggé tett patkányok, utókezelve szubkután beadott nátrium-klorid oldattal; és

3. Intravénásán beadott streptozotocinnal cukorbeteggé tett patkányok, utókezelve szubkután beadott C(l,5)S-sel.

A vizsgálatban szereplő patkányoknak tizenhárom napig 3 mg/kg/nap dózisban adunk be nátrium-klorid oldatot, a cukorbe20 tegség indukciója után egy nappal. A vércukorszintet, a vizelet glükózszintjét, a termelt vizelet térfogatatát és az elfogyasztott víz mennyiségét feljegyezzük, mind éhezési, mind nem-éhezési körülmények között, a teljes vizsgálati periódusban. A patkányok cukorbeteggé váltak a 2-es és 3-as csoportban, a streptozotocin beadása utáni napon (3. ábra). A 3. csoportban a KGF terápia a streptozotocin beadása utáni napon kezdődik, és utána minden nap folytatódik. A nem-éhezési vércukorszintet az 1., 2., 4., 5. és 8. napon mérjük. Amint az a 3. ábráról látható, a 3-as csoportban a KGF kezeléssel a 4. napra a vércukorszintet közel arra a szintre lehetett csökkenteni, mint a kontroll csoportban (l-es csoport) levő patkányoké, és ez a 8. napig tartott. A glükóz vizeletbe való nem-éhezési kiválasztását is mértük a 2., 5. és 8. napon. A 4. ábráról láthacó, hogy a KGF kezelés körülbelül nyolcadrészére csökkenti a vizelet glükózszintjét. Hasonlóképpen a KGF-fel kezelt cukorbeteg állatokban a termelt vizelet mennyisége is normalizálódik, az 5. és 8. napon mérve (5. ábra). A vízfelvétel, milliliter per huszonnégy órában mérve, nem nőtt meg a KGF-fel kezelt cukorbeteg állatokban, ellentétben azokkal a cukorbeteg patkányokkal, amelyek kontrollként nátriumklorid oldatot kaptak (6. ábra). A patkányokat éjszakán át éheztetjük, a 8. napon és a 9. napon az éhezési vércukorszint nem tért el ebben a három csoportban. Az éhezési vízfogyasztás és vizelet-termelés a 9. napon lényegesen kisebb a KGF-fel kezelt cukorbeteg patkányok esetében, mint a cukorbeteg pat« · · · · kányok esetében, ami tovább igazolja, hogy enyhültek a betegség tünetei.

Harmadik vizsgálat: A harmadik vizsgálat a második vizsgálat megismétlése, és megerősíti a 3-6. ábrákon bemutatott adatokat. Emellett ebben a kísérletben, amikor a patkányokat felboncoltuk, a teljes hasnyálmirigyet eltávolítottuk minden egyes patkányból, az inzulint és a C-peptidet extraháltuk és mennyiségileg meghatároztuk. Az alábbi 1. táblázatban a három csoportban a hasnyálmirigyből kivonható inzulin vagy C-peptid átlagos mennyisége látható. A KGF terápiával lehetséges volt az inzulin és a C-peptid össz-mennyiségének növelése a cukorbeteg patkányok hasnyálmirigyében, a nátrium-kloriddal kezelt cukorbeteg patkányokhoz viszonyítva.

. Táblázat

A hasnyálmirigyben levő össz-mennyiség

Csoport¹	Inzulin (ptg)	C-peptid	(Umol)
Kontroll	83,7 ± 6,7²	3,5 ±	0,1
Cukorbeteg plusz
nátrium-klorid terápia	6,4 ± 3,3	0, 4 ±	0,1
Cukorbeteg plusz KGF	18,9 ±7,4	1,0 ±	0,3
terápia

n=3-4 patkány per csoport ² Átlag ± S.E.

A negyedik vizsgálatban a KGF hatását vizsgáltuk streptozotocinnal indukált cukorbetegségre Sprague-Dawley pat22 kányokban. A 0. napon a patkánycsoportokat 45 vagy 50 mg/kg streptozotocinnal (STZ) kezeltük. Ezeket a kezeléseket követően naponta követtük a nem-éhezési vércukorszinteket, hogy megbecsüljük a sziget sérülésének súlyosságát. Az 5. napon a az STZ-vel kezelt patkányokat két csoportba osztottuk (20/csoport) a híperglikémia nagyságától függó'en. A szétosztás határértéke 300 mg/dl vércukorszint. Az STZ-vel nem kezelt állatok szolgálnak kontrollként. A 7. naptól kezdve 7 napig mindegyik hiperglikémiás csoportból 10 állatnak adunk 3 mg/kg/nap ΔΝ23at, vagy PBS-t, szubkután injekció formájában. Naponta, minden második napon vagy hetente követjük a vércukorszinteket, amint az a 7. ábrán látható. Megjegyzendő, hogy mindkét csoportból a KGF-et kapott, STZ-vel kezelt állatokban jelentősen csökkent a vércukorszint a KGF beadásának idején. Lényeges, hogy a >300 mg/dl kiindulási vércukorszintű, STZ-vel kezelt csoportban az átlagos vércukorszint csökkenés körülbelül 150 mg/dl-nél stabilizálódott, míg a >300 mg/dl kiindulási vércukorszintű csoportban megfigyelt vércukorszint csökkenés csak ideiglenes volt. Felhívjuk a figyelmet, hogy a napokat nem lineárisan ábrázoltuk.

Claims

1. Eljárás cukorbetegség kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy, ebben a betegségben szenvedő emlősnek a keratinocita növekedési faktorból vagy annak analógjából terápiásán hatásos mennyiséget adunk be.

2. Az 1 . igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az emlős ember.

3. Az I. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a keratinocita növekedési faktor lehet C(1,15)S vagy

ΔΝ23 .

4. Az 1 . igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a keratinocita növekedési faktort vagy analógját egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmazó gyógyászati készítmény formájában adjuk be.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gyógyászati készítményt parenterális injekció formájában adjuk be.

6. Az 1 . igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a keratinocita növekedési faktort vagy analógját 0,001-10 mg/testsúly-kilogramm/nap mennyiségben adjuk be.

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mennyiség 0,05-5 mg/kg/nap között van.