CZ297328B6 - Analog nativního keratinocytového rustového faktoru, zpusob jeho výroby a pouzití, farmaceutický prostredek, kit, nukleová kyselina, vektor, hostitelská bunka a in vitro zpusob stimulace produkce epithelových bunek - Google Patents

Abstract

Analog nativního keratinocytového rustového faktoru, KGF, odpovídající aminokyselinám 32 az 194 SEQID NO: 2, poprípade spolu se signální sekvencí odpovídající aminokyselinám 1 az 31 SEQ ID NO: 2, pricemz tento analog vykazuje alespon nejakou biologickou aktivitu a v podstate sestává z aminokyselinové sekvence KGF, v níz je az 24 aminokyselin v poloze 32 az 55 SEQ ID NO: 2 vypusteno, nahrazeno a/nebo vlozeno, pricemz cysteinový zbytek v aminokyselinové poloze 32 SEQ ID NO: 2 a cysteinový zbytekv aminokyselinové poloze 46 SEQ ID NO: 2 je vzdy bud vypusten nebo nahrazen jinou prirozenou aminokyselinou, pricemz tímto analogem není protein keratinocytového rustového faktoru sestávající z aminokyselin 55 az 194 SEQ ID NO: 2. Farmaceutický prostredek a kit na bázi tohoto analogu KGF. Zpusob jeho výroby a pouzití pro výrobu léciva pro stimulaci produkce nefibroblastových bunek epithelu. Molekula rekombinantní nukleové kyseliny kódující tentoanalog KGF, biologicky funkcní vektor zahrnující molekulu této nukleové kyseliny a prokaryontní nebo eukaryontní hostitelská bunka zahrnující molekulu uvedené nukleové kyseliny nebo uvedený biologicky funkcní vektor. In vitro zpusob stimulace produkce nefibroblastových epithelových bunek, zahrnující podání úcinného mnozství uvedeného analogu KGF nebo farmaceutického prostredku na jeho bázi.

Description

Vynález se týká analogu nativního keratinocytového růstového faktoru, KGF, způsob jeho výroby a použití, farmaceutického prostředku a kitu na jeho bázi, molekuly nukleové kyseliny kódující tento analog, biologicky funkčního vektoru zahrnujícího molekulu této nukleové kyseliny a prokaryotní nebo eukaryotní hostitelské buňky zahrnující molekulu uvedené nukleové kyseliny nebo uvedený biologicky funkční vektor. Konečně se vynález také týká in vitro způsobu stimulace produkce nefibroblastových epithelových buněk.

Dosavadní stav techniky

Komplexní proces vytváření a regenerace pletiv je zprostředkován řadou proteinových faktorů, které jsou někdy označované jako faktory růstu měkkých pletiv. Tyto molekuly jsou obecně uvolňovány jedním typem buněk a ovlivňují proliferaci jiných typů buněk. (Rubin et al. (1989), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86: 802-806). Některé růstové faktory měkkých pletiv jsou vylučovány specifickými typy buněk a ovlivňují proliferaci, diferenciaci a/nebo zrání cílových buněk při vývoji vícebuněčných organismů. (Finch et al. (1989), Science, 245: 752-755). Navíc kromě jejich úlohy ve vyvíjecích se organismech jsou některé důležité pro udržení zdravého stavu vyzrálejších systémů. Například u savců je mnoho systémů, kde dochází k rychlé obměně buněk. Takovéto systémy zahrnují kůži a gastrointestinální trakt, které jsou oba tvořeny epiteliálními buňkami.

Do této skupiny růstových faktorů měkkých pletiv patří také rodina fibroblastových růstových faktorů (FGF).

V současné době je známo osm členů rodiny FGF (fibroblast growth factors), které vykazují příbuznost v primární struktuře: základní fibroblastový růstový faktor (basic fíbrolast growth factor), bFGF (Abraham et al. (1986), EMBO J., 5:2523-2528); kyselý fibroblastový růstový faktor (acidic fíbrolast growth factor), a FGF (Jaye et al. (1986), Science, 233:541-545); produkt int-2 genu, int-2 (Dickson & Oeters (1987), Nátuře, 326:833); hst/kFGF (Delli-Bovi et al., (1987), Cell, 50: 729-737 a Yoshida et al. (1987), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84:7305-7309); FGF-5 (Zhan et al. (1988), Mol, Cell. Biol.; 8:3487-3495), FGF-6 (Marics et al. (1989), Oncogene, 4:335-340); keratinocytový růstový faktor (keratinocyte growth factor) (Finch et al. (1989) science, 24: 752—755) a hisactophilin (Habazzettl et al. (1992), Nátuře, 359:855—858).

V rodině FGF proteinů je keratinocytový růstový faktor („KGF“) specifickým efektorem proliferace nefibroblastových epiteliálních (zejména keratinocytových) buněk odvozených z mesenchymálních pletiv. Pojem „nativní KGF“ se vztahuje k přírodnímu lidskému (hKGF) nebo rekombinantnímu (rKGF) polypeptidu (se signální sekvencí nebo bez ní), jak je znázorněno sekvencí aminokyselin uvedených v SEQ ID NO:2 nebo v její alelické variantě. [Pokud není uvedeno jinak, číslování aminokyselin pro molekuly popsané v tomto dokumentu bude odpovídat prezentované konečné formě přirozené molekuly (tj. bez signální sekvence), jak je znázorněno aminokyselinami 32-194 SEQ ID NO:2],

Přirozený KGF může být izolován z přirozených lidských zdrojů (hKGF) nebo produkován technikami rekombinantní DNA (rKGF) (Finch et al. (1989), viz předchozí text; Rubin et al. (1989), viz předchozí text; Ron et al. (1993), The Joumal of Biological Chemistry, 268 (4): 2984-2988 a Yan et al. (1991), In Vitro Cell. Dev. Biol., 27A: 437-438.

-1 CZ 297328 B6

Je známé, že přirozený KGF je ve vodném stavu poměrně nestabilní a že podléhá chemické a fyzikální degradaci, mající za následek ztrátu biologické aktivity během zpracování a skladování (Chen et al. (1994), Pharmaceutical Research, 11: 1582-1589). Přirozený KGF je také při zvýšených teplotách náchylný k agregaci a v kyselém prostředí se inaktivuje (Rubín et al. (1989), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86: 802-806). Agregace nativního KGF ve výhodných roztocích má za následek inaktivaci proteinu. To je nevýhodné, protože takováto ztráta aktivity činí skladování vodných přípravků proteinů nativního KGF po delší časové období nebo manipulaci s proteiny v průběhu delšího období nepraktickým. Navíc tento fakt způsobuje problémy při přípravě farmaceutických přípravků, protože agregované proteiny působí jako imunogeny (Cleland et al. (1993), Crit Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 10:307-377; Robiins et al. (1987), Diabetes, 36: 838-845 a Pinckard et al. (1967), Clin. Exp. Immunol. 2: 331-340).

Přirozený KGF obsahuje pět cysteinových zbytků - konkrétně se jedná o aminokyseliny 1, 15, 40, 102 a 106 (Finch et al. (1989), Science, 24: 752-755). Ačkoliv byl popsán obsah cysteinu v přirozeném KGF, nebyla dosud popsána role, kterou mají cysteinové zbytky na aktivitu (tzn. jejich nezbytnost pro biologickou aktivitu) a terciární strukturu (tzn. náchylnost k tvorbě nežádoucích disulfidových vazeb mezi molekulami nebo uvnitř molekul). Není proto žádný vzor, ze kterého by šlo odvodit, který cysteinový zbytek (jestliže vůbec nějaký) je nezbytný, nebo jestli se účastní při tvorbě nežádoucích disulfidových vazeb, které způsobují náchylnost proteinu k nežádoucí agregaci a/nebo nestabilitě.

Pro vylepšení nebo změnu jedné nebo více charakteristik přirozeného KGF se může použít proteinové inženýrství. Pro modifikaci sekvence přirozeného KGF byla použita technologie rekombinantní DNA.

Ron et al. (1993), (J. Biol. Chem., 268(4): 2984-2988) popsali modifikované KGF polypeptidy bez 3, 8, 27, 38 nebo 49 aminokyseliny od N-konce. Peptidy postrádající 3, 8 nebo 27 residuum na N-konci byly plně aktivní, zatímco forma postrádající 27 residuum byla 10-20x méně mitogenní a formy bez aminokyselin 38 nebo 49 neměla mitogenní aktivitu. Stabilita modifikovaných polypeptidů nebyla diskutována nebo jinak popsána.

Publikovaná PCT přihláška WO 90/08771, viz předchozí text popisuje také tvorbu chimérického proteinu, zde zhruba prvních 40 aminokyselin z N-konce konečné formy přirozeného KGF bylo zkombinováno s částí C-konce a FGF (asi 140 aminokyselin). Bylo popsáno působení chiméry na keratinocyty jako u KGF, ale chiméra nebyla citlivá ne heparin, což je charakteristická vlastnost a FGF, ale ne KGF. Stabilita chiméry nebyla diskutována nebo jinak popsána.

Literatura tedy nepopisuje modifikovanou KGF molekulu s významně zlepšenou stabilitou v porovnání s přirozenou molekulou KGF. Navíc literatura nepopisuje dostatečné údaje nebo důkazy, které by opravňovaly očekávání, že tvorba molekul KGF s těmito žádoucími vlastnostmi bude úspěšná.

Obecně účinky změny aminokyselin na biologickou aktivitu proteinu budou záviset na řadě faktorů, včetně třírozměrné struktury proteinu a tom, jestli se modifikace dotknou vazebné oblasti pro receptor primární sekvence proteinu. Protože ani třírozměrná struktura ani oblast pro vázání receptorů v primární struktuře přirozeného KGF nebyly publikovány, znalosti v této oblasti neumožňují zevšeobecnění účinku změn aminokyselin přirozeného KGF a dokonce ani vliv modifikace proteinu u lépe charakterizovaných proteinů.

Cílem tohoto vynálezu je poskytnout polypeptidové molekuly kódující taková analoga, která vykazují zvýšenou stabilitu (například při vystavení působení typickému pH, teplotním a/nebo skladovacím podmínkám) při srovnání s přirozeným KGF.

-2CZ 297328 B6

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je analog nativního keratinocytového růstového faktoru, KGF, odpovídající aminokyselinám 32 až 194 SEQ ID NO:2, popřípadě spolu se signální sekvencí odpovídající aminokyselinám 1 až 31 SEQ ID NO:2, přičemž tento analog vykazuje alespoň nějakou biologickou aktivitu a v podstatě sestává z aminokyselinové sekvence KGF, v níž je až 24 aminokyselin v poloze 32 až 55 SEQ ID NO: 2 vypuštěno, nahrazeno a/nebo vloženo, přičemž cysteinový zbytek v aminokyselinové poloze 32 SEQ ID NO:2 a cysteinový zbytek v aminokyselinové poloze 46 SEQ ID NO: 2 je vždy buď vypuštěn nebo nahrazen jinou přirozenou aminokyselinou, přičemž tímto analogem není protein keratinocytového růstového faktoru sestávající z aminokyselin 55 až 194 SEQ ID NO: 2.

Předmětem vynálezu je také farmaceutický prostředek a kit, který zahrnuje terapeuticky účinné množství analogu KGF definovaného výše a farmaceuticky vhodný nosič.

Dalšími předměty vynálezu jsou molekula rekombinantní nukleové kyseliny kódující analog KGF definovaný výše, biologicky funkční vektor zahrnující takovou molekulu nukleové kyseliny a prokaryontní nebo eukaryontní hostitelskou buňku zahrnující molekulu takové nukleové kyseliny.

Předmětem vynálezu je i způsob výroby analogu KGF definovaného výše, který zahrnuje růst hostitelské buňky definované výše za vhodných nutričních podmínek způsobem umožňujícím expresi kódovaného analogu, a izolaci takto připraveného analogu.

Předmětem vynálezu je také použití účinného množství analogu KGF uvedeného výše pro výrobu léčiva pro stimulaci produkce nefíbroblastových buněk epithelu.

Ještě dalším předmětem je in vitro způsob stimulace produkce nefíbroblastových epithelových buněk, který zahrnuje podání účinného množství analogu KGF nebo farmaceutického prostředku, které jsou definovány výše.

Předkládaný vynález poskytuje nová biologicky aktivní peptidová analoga KGF. Pro účely tohoto vynálezu zahrnuje termín „KGF“ přirozený KGF a proteiny charakterizované peptidovou sekvencí v podstatě shodnou s přirozeným KGF, které si zachovávají cysteinová residua odpovídající Cys¹ a Cys¹⁵ přirozeného KGF (Cys³² a Cys⁴⁶ SEQ ID NO: 2) a které si zachovávají biologickou aktivitu přirozeného KGF, zejména vliv na proliferaci nefíbroblastových epiteliálních buněk. Výrazem „charakterizované peptidovou sekvencí v podstatě shodnou s přirozeným KGF“ se myslí peptidová sekvence, která je kódovaná DNA sekvencí schopnou hybridizace k nukleotidům 201 až 684 SEQ ID NO: 1, zejména za stringentních hybridizačních podmínek.

Odpovídající pozice aminokyseliny mezi dvěma sekvencemi aminokyselin může být určena přirozením dvou sekvencí tak, aby se maximalizovala shoda residuí, včetně posunu amino a/nebo karboxy konce, zavedení potřebných mezer a/nebo odstranění residuí přítomných ve formě insertů u možných kandidátů. Vyhledávání v databázích, analýza sekvence a manipulace se může provést s použitím některého dobře známého algoritmu - programu běžně používaného pro prohledávání na homologie/totožnost v sekvenci, (například Pearson a Lipman (1988), Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444-2448; Alschul et al. (1990), J. Mol Biol., 215:403-410; Lipman and Pearson (1985), Science, 222:1435 nebo Devereux et al. (1984), Nuc. Acids Res. 12: 387-395).

Stringentní podmínky (týkající se hybridizace) se dosáhnou kombinací koncentrace solí, teploty, organických rozpouštědel a ostatních parametrů běžně kontrolovaných v hybridizačních reakcích. Vzorové hybridizační podmínky představuje hybridizace v 4x SSC při 62-67 °C, následované promýváním v 0,lx SSC při 62-67 °C po dobu zhruba jedné hodiny. Jiné vzorové hybridizační podmínky představuje hybridizace v 45-55% formamidu, 4x SSC při 40—45 °C. [viz T. Maniatis

-3 CZ 297328 B6 et al., Molecular Cloning (A laboratory manual); Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Stránky

387-389],

Proteiny zahrnují variace alel, nebo deleci (delece), substituci (substituce) nebo inzerci inzerce) aminokyselin, včetně fragmentů, chimérických nebo hybridních molekul přirozeného KGF. Jeden příklad KGF zahrnuje proteiny se změněným nábojem, kde je jeden nebo více aminokyselinových zbytků na pozicích 41-154 nativního KGF (nejlépe residua Arg⁴¹, Gin⁴³, Lys⁵⁵, Lys⁹⁵, Lys¹²⁸, Asn¹³⁷, Gin¹³⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gin¹⁵², Lys¹⁵³ nebo Thr¹⁵⁴) odstraněn nebo vyměněn neutrálním nebo negativně nabitým zbytkem s cílem ovlivnit protein redukováním pozitivního náboje (jak je uvedeno v běžně přístupném U.S.S.N 08/323, 337, zařazeným 13. října 1994). Příkladem je například R (144)Q, což je KGF mající nahrazený glutamin za arginin na aminokyselinové pozici 144 přirozeného KGF. Jiný příklad KGF představuje proteiny vytvořené substituováním alespoň jedné aminokyseliny s velkým potenciálem tvořit smyčku, nebo alespoň jedné aminokyseliny uvnitř oblasti tvořící smyčku (Asn¹¹⁵ - His¹¹⁶ - Tyr¹¹⁷ - Asn¹¹⁸ - ThR¹¹⁹) u nativního KGF (jak je uvedeno v běžně přístupném U.S.S.N. 08/323, 473, zařazeným 13. října 1994). Konkrétně je to např. H(116)G, KGF s glycinem nahrazeným histidinem na aminokyselinové pozici 116 přirozeného KGF. Další příklad zahrnuje proteiny mající jednu nebo více aminokyselin uvnitř oblasti 123-133 (aminokyseliny 154-164 SEQ ID NO:2) nativního KGF nahrazenou, odstraněnou nebo přidanou; tyto proteiny můžou mít agonistickou nebo antagonistickou aktivitu.

Překvapující bylo zjištění, že když má molekula KGF (tj. rodičovská molekula) cysteinový zbytek odpovídá (jak bylo určeno s použitím technik popsaných výše) Cys¹ a Cys¹⁵ přirozeného KGF (cysteinové zbytky 32 a 46 SEQ ID NO:2) modifikován nahrazením odpovídajícího cysteinu, má výsledný analog KGF ve srovnání s rodičovskou molekulou zlepšenou stabilitu. Vynález je navíc přednostně zaměřen na ta analoga, která kromě zlepšené stability vykazují plnou biologickou aktivitu (tj. minimálně značně podobnou vazbu na receptor nebo afinitu k němu) při porovnání s přirozeným KGF.

Dalším aspektem vynálezu je popis purifikovaných a izolovaných molekul nukleových kyselin, kódujících různá biologicky aktivní peptidová analoga KGF. V jednom případě takové nukleové kyseliny zahrnují DNA molekuly klonované do biologicky funkčních plazmidů nebo virových vektorů. V jiném případě mohou být konstrukty nukleových kyselin použity pro stabilní transformaci prokaryontních nebo eukaryontních hostitelských buněk. V dalším případě vynález popisuje proces, kde buď prokaryotická (nejlépe E. coli) nebo eukaryotická hostitelská buňka, stabilně transformovaná molekulou nukleové kyseliny, vyrůstá za vhodných nutričních podmínek způsobem umožňujícím expresi analoga KGF. Po expresi může následovat izolace a purifikace rekombinantního polypeptidu.

Další aspekt vynálezu se zabývá farmaceutickými formami, které zahrnují terapeuticky účinná množství analoga KGF a přijatelného farmaceutického nosiče. Takovéto formy budou užitečné při léčení pacientů postižených epiteliálním onemocněním nebo poškozením.

V tomto duchu se další aspekt vztahuje k metodám stimulace růstu epiteliálních buněk podáváním terapeuticky účinných dávek analoga KGF pacientům. V jednom praktickém případě jsou to nefibroblastové epiteliální buňky, které jsou stimulovány. Takovéto epiteliální buňky zahrnují různé sousední buňky, pankreatické buňky, jatemí buňky a mukózový epitel v respiračním a gastrointestinálním traktu.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje nukleotidové (SEQ ID NO:1) a aminokyselinové (SEQ ID NO:2) sekvence nativního KGF (nukleotidy kódující konečnou formou nativního KGF jsou popsány bázemi 201 až 684 SEQ ID NO:1 a konečná forma KGF je určená aminokyselinovými zbytky 32 až 194 SEQ ID NO:2).

-4CZ 297328 B6

Obrázky 2A, 2B a 2C ukazují mapy plazmidů pCFMÍ 156, pCFM1656 a pCFM3102.

Obrázek 3 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:3) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:4) sekvenci konstruktu obsaženého v konstruktu RSH-KGF.

Obrázek 4 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:5) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:6) sekvenci konstruktu obsaženého v plazmidu KGF.

Obrázek 5 ukazuje chemicky syntetizované OLIGO (OLIGO č. 6 až oligo č. 11; SEQ ID NO: 12-17) použití k náhradě DNA sekvence mezi místy KpnI a EcoRI v konstruktu plazmidu KGF (pozice aminokyselin 46 až 85 v SEQ ID NO:6), aby se vytvořil konstrukt v plazmidu KGF (dsd).

Obrázek 6 ukazuje chemicky syntetizované OLIGO (OLIGO ě. 12 až 24; SEQ ID NO: 18-30) použité pro tvorbu KGF (optimalizovaný kodon).

Obrázek 7 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:31) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:32) sekvenci c (1,15)S, analogu KGF se substitucí šeřinu místo cysteinu v pozici aminokyselin 1 a 15 nativního KGF.

Obrázek 8 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:33) a aminokyselinovou (SEQ ID NO: 34) sekvenci AN3/C(15)S, analogu KGF s delecí prvních třech aminokyselin na N-konci a náhradou Cysteinu serinem na aminokyselinové pozici 15 přirozeného KGF.

Obrázek 9 ukazuje nukleotidovou (SED ID NO: 35) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:36) sekvenci AN3/C(15)-, analogu KGF s delecí prvních třech aminokyselin na N-konci a delecí cysteinu na aminokyselinové pozici 15 přirozeného KGF.

Obrázek 10 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:37) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:38) sekvenci AN8/C(15)S, analogu KGF s delecí prvních osmi aminokyselin na N-konci a náhradou cysteinu serinem na aminokyselinové pozici 15 přirozeného KGF.

Obrázek 11 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO: 39) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:40) sekvenci AN8/C(15)-, analogu KGF s delecí prvních osmi aminokyselin na N-konci a delecí cysteinu na aminokyselinové pozici 15 přirozeného KGF.

Obrázek 12 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:41) a aminokyselinovou (SEQ ID NO: 42) sekvenci ΔΝ15, analogu KGF s delecí prvních patnácti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 13 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO: 43) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:44) sekvenci ΔΝ16, analogu KGF s delecí prvních šestnácti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 14 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:45) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:46) sekvenci ΔΝ17, analogu KGF s delecí prvních sedmnácti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 15 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO: 47) a aminokyselinovou (SEQ ID NO: 48) sekvenci ΔΝ18, analogu KGF s delecí prvních osmnácti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

-5CZ 297328 B6

Obrázek 16 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO: 49) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:50) sekvenci ΔΝ19, analogu KGF s delecí prvních devatenácti aminokyselin na N-konci přirozeného

KGF.

Obrázek 17 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO: 51) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:52) sekvenci ΔΝ20, analogu KGF s delecí prvních dvaceti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 18 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:53) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:54) sekvenci ΔΝ21, analogu KGF s delecí prvních jednadvaceti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 19 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO: 55) a aminokyselinovou (SEQ ID NO: 56) sekvenci ΔΝ22, analogu KGF s delecí prvních dvaadvaceti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 20 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:57) a aminokyselinovou (SEQ ID NO: 58) sekvenci ΔΝ23, analogu KGF s delecí prvních třiadvaceti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 21 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:59) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:60) sekvenci ΔΝ24, analogu KGF s delecí prvních čtyřiadvaceti aminokyselin na N-konci přirozeného KGF.

Obrázek 22 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:61) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:62) sekvenci C(1,15)S/R(144)E analogu KGF s náhradou cysteinu serinem v pozicích aminokyselin 1 a 15 a náhradou argininu kyselinou glutamovou na aminokyselinové pozici 144 nativního KGF.

Obrázek 23 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:63) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:64) sekvenci C( 1,15)S/R( 144)Q, analogu KGF s náhradou cysteinu serinem na pozicích 1 a 15 a náhradou argininu glutaminem na aminokyselinové pozici 144 nativního KGF.

Obrázek 24 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO: 65) a aminokyselinovou (SEQ ID NO: 66) sekvenci AN23/R(144)Q, analogu KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a náhradou na aminokyselinové pozici 144 nativního KGF.

Obrázek 25 ukazuje množství zbývajícího rozpustného proteinu, když byl přirozený KGF aC(l,15) skladován v 20 mM fosforečnanu sodném, 0,15 M NaCl, pH 7,0 při 37 °C po dobu 27 hodin.

Obrázek 26 ukazuje množství zbývajícího rozpustného proteinu, když byl přirozený KGF a C(1,15)S skladován v 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,0 při 37 °C po dobu 27 hodin.

Obrázek 27 ukazuje množství zbývajícího rozpustného proteinu, když byl přirozený KGF, ΔΝ15 a C(1,15)S skladován v 50 mM NaPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,0 při 37 °C po dobu 27 hodin.

Obrázek 28 ukazuje množství rozpustného proteinu stanoveného pomocí HPLC (size exclusion) v závislosti na čase při 37 °C.

Obrázek 29 ukazuje předpokládanou denaturační teplotu (T_m) jako funkci pH pro přirozený KGF, C( 1,15)S/R( 144)Q a C( 1,15)S/R( 144)E.

-6CZ 297328 B6

Obrázek 30 ukazuje typický tvar průběh mitogenní aktivity C(1,15)S stanovené měřením inkorporace [³H]-thymidinu během syntéze DNA porovnáním se standardní křivkou pro přirozený

KGF.

Obrázek 31 ukazuje typický průběh mitogenní aktivity ΔΝ15 stanovené měřením inkorporace [³H]-thymidinu během syntézy DNA porovnáním se standardní křivkou pro přirozený KGF.

Obrázek 32 ukazuje typický průběh mitogenní aktivity ΔΝ23 stanovené měřením inkorporace [³H]-thymidinu během syntézy DNA porovnáním se standardní křivkou pro přirozený KGF.

Obrázek 33 ukazuje typický průběh mitogenní aktivity AN23PR(144)Q stanovené měřením inkorporace [³H]-thymidinu během syntézy DNA porovnáním se standardní křivkou pro přirozený KGF.

Obrázek 34 ukazuje typický průběh mitogenní aktivity C(l, 15)S/R(144)Q stanovené měřením inkorporace [³H]-thymidinu během syntézy DNA porovnáním se standardní křivkou pro přirozený KGF.

Obrázek 35 ukazuje typický průběh mitogenní aktivity C(1,15)S/R(144)E stanovené měřením inkorporace [³H]-thymidinu během syntézy DNA porovnáním se standardní křivkou pro přirozený KGF.

Obrázek 36 ukazuje vliv C(1,15)S a ΔΝ23 na schematické vlastnosti séra.

Obrázek 37 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:77) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:78) sekvenci C(1,15,40)S analoga KGF s náhradou cysteinu serinem na pozicích aminokyselin 1,15 a 40 přirozeného KGF.

Obrázek 38 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:79) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:80) sekvenci C(1,15,102)S, analoga KGF s náhradou cysteinu serinem na pozicích aminokyselin 1,15 a 102 přirozeného KGF.

Obrázek 39 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO: 81) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:82) sekvenci (C1,15,102,106)S, analoga KGF s náhradou cysteinu serinem na pozicích aminokyselin 1, 15, 102 a 106 přirozeného KGF.

Obrázek 40 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:83) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:84) sekvenci ΔΝ23/Ν(137)Ε, analoga (KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a náhradou asparaginu kyselinou glutamovou na aminokyselinové pozici 137 přirozeného KGF.

Obrázek 41 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO: 85) a aminokyselinovou (SEQ ID NO: 86) sekvenci ΔΝ23/Κ(139)Ε, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a náhradou lysinu kyselinou glutamovou na aminokyselinové pozici 139 přirozeného KGF.

Obrázek 42 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:87) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:88) sekvenci AN23/K(139)Q, analogu KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci s náhradou lysinu glutaminem na aminokyselinové pozici 139 přirozeného KGF.

Obrázek 43 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:89) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:90) sekvenci AN23/R(144)A, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a náhradou argininu alaninem na aminokyselinové pozici 144 přirozeného KGF.

-7CZ 297328 B6

Obrázek 44 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:91) a aminokyselinovou (SEQ ID NO: 92) sekvenci AN23/R(144)E, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a náhradou argininu kyselinou glutamovou na aminokyselinové pozici 144 přirozeného KGF.

Obrázek 45 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO: 93) a aminokyselinovou (SEQ ID NO: 94) sekvenci AN23/R(144)L, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a náhradou argininu leucinem na aminokyselinové pozici 144 přirozeného KGF.

Obrázek 46 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO: 95) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:96) sekvenci AN23/R(144)E, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a náhradou lysinu kyselinou glutamovou na aminokyselinové pozici 147 přirozeného KGF.

Obrázek 47 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:97) a aminokyselinovou (SEQ ID NO: 98) sekvenci AN23/K(147)Q, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselina N-konci a náhradou lysinu glutaminem na aminokyselinové pozici 147 přirozeného KGF.

Obrázek 48 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:99) a aminokyselinovou (SEQ ID NO: 100) sekvenci ΔΝ23/Κ(153)Ε, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a náhradou lysinu kyselinou glutamovou na aminokyselinové pozici 153 přirozeného KGF.

Obrázek 49 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO: 101) a aminokyselinovou (SEQ ID NO: 102) sekvenci AN23/K(153)Q, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a náhradou lysinu glutaminem na aminokyselinové pozici 153 přirozeného KGF.

Obrázek 50 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO: 103) a aminokyselinovou (SEQ ID NO: 104) sekvenci AN23PQ(152)E/K(153)E, analoga KGF s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a náhradou glutaminu kyselinou glutamovou na aminokyselinové pozici 152 přirozeného KGF a glutamové kyseliny za lysin na aminokyselinové pozici 153 přirozeného KGF.

Obrázek 51 ukazuje vliv ΔΝ23 na diabetes indukovaný streptozotocinem u Sprague-Dawley Krys.

Detailní popis vynálezu

V souladu s tímto vynálezem jsou předkládaná nová analoga KGF. Zjistilo se, že čtyři z cysteinových residuí přirozeného KGF (Cys¹ a Cys¹⁵, Cys¹⁰² a Cys¹⁰⁶) se účastní tvorby dvou disulfidových vazeb. Cys⁴⁰ se neúčastní disulfidových vazeb uvnitř molekuly. Proto obsahuje KGF dvě malé disulfidové smyčky oddělené téměř 90 aminokyselinami. Tak je možné určit, který cysteinový zbytek se účastní na disulfidových vazbách a který je volný pro tvorbu nežádoucích vazeb uvnitř molekuly. Tyto vazby způsobují vytvoření nežádoucí terciární struktury (tj. konformace, která snižuje aktivitu proteinu).

Překvapující bylo zjištění, že modifikace KGF delece nebo substitucí aminokyselinových zbytků odpovídajících na KGF pozici 1 a 15 (pozice 32 a 46 SEQ ID NO: 2) vede ke vzniku analogů KGF v podstatě zlepšenou stabilitou (tj. s menšími problémy způsobenými nesprávným prostorovým uspořádáním, tvorbou disulfidových útvarů a/nebo agregací proteinu). Například analoga KGF budou obecně purifíkovány s větším výtěžkem rozpustného proteinu se správnou konfigurací. Navíc jakmile je materiál purifikován, bude odolnější vůči pH, teplotě atd. při porovnání se stabilitou rodičovské molekuly. I když není cílem zabývat se příliš teorií, předpokládá se, že Cys¹ a Cys¹⁵ KGF kromě tvorby intramolekulámího disulfidového můstku, existují za určitých podmínek i ve formě volných cysteinů, které jsou schopné tvořit mezimolekulámí disulfidové vazby, vedoucí k nestabilitě proteinu a k tvorbě agregátů. Navíc bylo zjištěno, že delece disulfidové smyčky na N-konci není významná pro vázání receptoru nebo mitogenní aktivitu.

-8CZ 297328 B6

V tomto vynálezu výraz „analog KGF“ nebo „polypeptidový analog KGF“ označuje jakýkoliv popsaný přirozeně nebo uměle se vyskytující polypeptid lišící se strukturou od KGF díky modifikaci peptidové sekvence odpovídající 24 aminokyselinovému N-konci KGF (aminokyseliny 32 až 55 SEQ ID NO:2), kde Cys¹ a Cys¹⁵ v KGF (aminokyseliny 32 až 46 SEQ ID NO:2) jsou vyměněny nebo odstraněny. Způsob, kterým jsou cysteiny odstraněny nebo změněny není důležitý a zahrnuje například polypeptidová analoga obsahující deleci a/nebo substituci jedné nebo více aminokyselin. Vynález tedy poskytuje rodiny nových proteinů keratinocytových růstových faktorů. Tato rodina zahrnuje několik skupin proteinů.

Jedna skupina analogů KGF zahrnuje molekuly, ve kterých je cystein na pozicích KGF 1 a 15 nahrazen aminokyselinami, včetně těch, které se v proteinu normálně nevyskytují. Strategie pro tvorbu substitučních analog zahrnuje místně zaměřenou tvorbu mutací (Ho et al. (1989), Gene, 77:51-59; Innis et al. „PCR Protocols“, Academie Press, lne., San Diego, CA), [analoga KGF zahrnující náhradou aminokyseliny jsou uvedena podle zbytku nacházejícím se na té které pozici v hotovém proteinu (bez signální sekvence) uvedeném v SEQ ID NO: 2, následovaném aminokyselinovou pozicí v závorkách a novou aminokyselinovou. Například analog zahrnující náhradu cysteinu za serin na aminokyselinové pozici 15 KGF (pozici 46 SEQ ID NO:2) je uváděn jako „C(15)S“]. Cystein je přednostně změněn na neutrální aminokyselinu jako je například glycin, valin, alanin, leucin, isoleucin, tyrosin, fenylalanin, histidin, tryptofan, serin, threonin a methionin (přednostně serinem threoninem a alaninem pro jejich chemickou podobnost s cysteinem). Příklad 1 podrobně popisuje tvorbu C(1,15)S použitím částečně syntézy genu (ve spojení s ostatními rekombinantními technikami) a s následnou expresí konstruktu v stabilně transformovaném bakteriálním hostiteli.

Jiná skupina analogů KGF zahrnuje molekuly, které mají cysteiny v pozici 1 a 15 z molekuly KGF odstraněny. K tvorbě takovýchto analogů KGF mohou být použity různé strategie, jako například zkrácení N-konce, místní specifické delece či kombinace obou metod.

Pojem „zkrácení N-konce“ označuje takovou modifikaci KGF, kde jsou N-koncová aminokyselinová residua KGF 1 až 24 (aminokyseliny 32 až 55 SEQ ID NO: 2) odstraněna, včetně Cys¹ a Cys¹⁵ [analoga KGF zahrnující zkrácení aminokyselin budou uváděna odstraněným residuem na pozici hotového proteinu (bez signální sekvence) uvedené v SEQ ID NO:2, začínající místem delece a počtem odstraněných residuí. Například analog KGF se zkrácením na N-konci o 24 zbytků (zbytky 1-55 v SEQ ID NO:2) bude označován jako analog „AN24“]. Konkrétně jsou v této skupině analoga ΔΝ23 přirozeného KGF, kde jsou jeden nebo více aminokyselinových zbytků 41-154 [(aminokyseliny 72-185 SEQ ID NO:2), včetně aminokyselinových zbytků 123— 133 (aminokyseliny 154-164 SEQ ID NO: 2)], odstraněny nebo nahrazeny neutrálními zbytky nebo negativně nabitými zbytky vybranými tak, aby se zmenšily pozitivní náboj. Přednostně se pro modifikaci používající Arg⁴¹, Gin⁴³, Lys⁵⁵, Lys⁹⁵, Lys¹²⁸, Asn¹³⁷, Gin¹³⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gin¹⁵², Lys¹⁵², Lys¹⁵³ nebo Thr¹⁵⁴, které jsou nahrazené přednostně Gin¹³⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gin¹⁵² nebo Lys¹⁵³, přičemž Arg¹⁴⁴ je nejpreferovanější. V této skupině jsou také zahrnuta ΔΝ23 analoga přirozeného KGF s modifikací uvnitř oblasti vytvářející smyčku Asn¹¹⁵-His¹¹⁶-Tyr¹¹⁷Asn¹¹⁸-Thr¹¹⁹ (aminokyseliny 146-150 SEQ ID NO:2) v přirozeném KGF.

Příklad 1 uvádí podrobnosti o systematickém zkracování N-konce provedeném částečnou syntézou genu ve spojení s ostatními rekombinantními technikami a následujícími expresi konstruktu ve stabilně transformovaném bakteriálním hostiteli. Příkladem může být zkracování N-konce u ANI5 až ΔΝ24. Navíc příklad 3 uvádí podrobnosti o expresi DNA kódující přirozený KGF a různorodé na N-konci glykosylované izoformy v kultuře savčích buněk a purifikaci zejména glykosylovaných izoforem s N-koncem zkráceným o aminokyseliny 1-23 konečné formy přirozeného KGF.

-9CZ 297328 B6

Naproti tomu místně specifické delece se vztahují na modifikace KGF, kde je odstraněn jeden nebo více navíc aminokyselinových zbytků (například Cys¹ a Cys¹⁵). Když je v KGF specificky odstraněn Cys¹ nebo Cys¹⁵, je analog o jednu aminokyselinu kratší než KGF. [Analoga KGF s delecí aminokyseliny jsou uváděna podle zbytku nacházejícího se v dané pozici v hotovém proteinu (bez signální sekvence) uvedeném v SEQ ID NO:2, následovaném pozicí aminokyseliny v závorkách a negativním znaménkem. Například analog v této skupině s delecí cysteinu na pozici 15 KGF (pozice 36 SEQ ID NO:2) je označen jako ,,C(15)—„.] Místně specifické delece mohou být generovány s použitím místně zaměřené mutageneze, jak je to popsáno výše.

Do této skupiny také patří analoga, kde je Cys¹ a Cys¹⁵ KGF odstraněn díky zkrácení nebo deleci. Například charakteristická analoga KGF zahrnují zkrácení KGF o první tři aminokyselinové zbytky (Cys-Asn-Asp) nebo zkrácení KGF o osm prvních aminokyselin (Cys-Asn-Asp-metThr-Pro-Glu-Gln) spojených s delecí cysteinu na aminokyselinové pozici KGF 15 (tato analoga jsou uváděna jako AN3/C(15)- a AN8C(15)~). Protože se methioninový zbytek objevuje přirozeně na čtvrté a deváté aminokyselinové pozici v přirozeném KGF, není nutný další Met Kodon pro správnou iniciaci translace.

Jiná skupina zahrnuje molekuly, u kterých jsou cysteiny na pozicích 1 a 15 KGF nahrazeny díky zkrácení a substituci. Například charakteristickými analogy KGF jsou AN3/C(15)S aAN8/C(15)S. Takováto analoga zahrnují zkrácení tří prvních koncových aminokyselinových zbytků KGF nebo odstranění prvních osmi koncových amino zbytků KGF společně s náhradou cysteinu na aminokyselinové pozici 15 jinou aminokyselinovou, například serinem.

Když jsou analoga KGF tvořena biologicky, tj. jsou produkty exprese v buňkách a ne výsledky syntézy na pevné fázi, proteolytické nebo enzymatické úpravy přirozeně se vyskytujících produktů atd., nukleové kyseliny kódující takovéto polypeptidy se liší v jednom nebo více nukleotidech ve srovnání s přirozenou nukleotidovou sekvencí KGF. Tyto nukleotidy mohou být exprimovány a výsledný polypeptid purifíkován jednou z mnoha metod rekombinantní technologie, které jsou odborníkům známy.

DNA sekvence, kódující celý nebo část analogů KGF, mohou zahrnovat kromě jiných věcí inkorporaci kodonů „preferovaných“ pro expresi ve vybraných hostitelských buňkách (např. „expresní kodony E. coli“)', zajišťujících místa pro štěpení restrikčními enzymy; zajišťujících další inicializační, koncové nebo mezilehlé nukleotidové sekvence (např. inicializační methoninový aminokyselinový zbytek pro expresi v buňkách E. coli) pro usnadnění konstrukce snadno exprimovatelných vektorů.

Předkládaný vynález také poskytuje rekombinantní molekuly nebo vektory pro použití v metodách pro expresi polypeptidů. Takovéto vektory se mohou skládat z DNA nebo RNA a mohou být kruhové, lineární, jednopramenné nebo dvoupramenné a mohou se vyskytovat přirozeně, nebo mohou být složeny z řady komponent a vyskytovat se pak přirozeně nebo mohou být syntetické.

Je známo mnoho příkladů takovýchto expresních vektorů. Komponenty vektorů, tj. replikony, selekční geny, zesilovače (enhancers), promotory a podobné komponenty mohou být získány z přírodních zdrojů nebo známými postupy syntetizovány. V každém případě expresní vektory užitečné v tomto vynálezu obsahují alespoň jeden prvek řídící expresi, funkčně spjatý s vloženou molekulou nukleové kyseliny kódující polypeptidový analog KGF. Tyto řídicí elementy jsou odpovědné za regulaci exprese polypeptidů z molekul nukleových kyselin tohoto vynálezu. Užitečné řídicí elementy zahrnují například lac systém, trp systém, operátory a promotory z fága lambda, glykolytický kvasinkový promotor, promotor z kvasinkového genu pro kyselou fosfatázu, kvasinkový faktor pro alfa párování (alpha mating factor) a promotor odvozené z adenovirů, viru Epstein-Barové, polyomy, opičích virů a rozličných retrovirů. Pro účely tohoto vynálezu může být ale použita řada jiných vektorů a řídicích prvků vhodných pro expresi v prokaryontech nebo eukaryontech.

-10CZ 297328 B6

Příklady vhodných prokaryontních klonovacích vektorů zahrnují plazmidy z£. coli (např. pBR322, coli El, pUC a F-faktor), přičemž preferovány jsou plazmidy pCFM1156 (ATCC 69702), pCFM1656 (ATCC 69576) a pCFM3102 (popsaný dále v části Příklady). Pro tyto účely může být také použita řada dalších vhodných expresních vektorů, z nichž jsou mnohé známé ze savčí, hmyzí, kvasinkové, houbové nebo bakteriální exprese. Transfekce příslušných hostitelských buněk těmito vektory může vést k expresi polypeptidových analogů KGF.

Hostitelské mikroorganismy užitečné pro tento vynález mohou být buď prokaryontní nebo eukaryontní. Mezi vhodné prokaryotní hostitele patří £. coli (např. FM5, BH101, HD5oc, DH10 aMCIOól), kmeny Pseudomonas, Bacillus a Streptomyces, přičemž preferovaným organismem je £. coli. Mezi vhodné eukaryontní hostitelské buňky patří kvasinky a jiné houby, hmyzí buňky, rostlinné buňky a živočišné buňky, jako například COS (tj. COS-1 a COS-7) a opičí buněčné linie CV-1, dále 3T3 linie odvozené od Swiss, Balb-c nebo NIH buňky, myší HeLa a L-0929 buňky, a křeččí CHO, BHK nebo HaK buňky. V závislosti na použitém hostiteli bude produkovaný rekombinantní polypeptid glykosylovaný savčími nebo jinými eukaryotními uhlovodíky nebo může být neglykosylovaný.

Preferovaná produkční metoda bude závist na mnoha faktorech a úvahách; optimální produkční postup pro danou situaci bude odborníkům po minimálních experimentech jasný. Výsledný produkt exprese může být potom purifíkován do téměř homogenního stavu s použitím známých technik. Typická purifíkační procedura stavu s použitím známých technik. Typická purifikační procedura při produkci v prokaryontních buňkách zahrnuje rozrušení buněčné stěny vysokým tlakem nebo jinými způsoby, centrifugaci nebi filtraci k odstranění buněčných zbytků s následnou iontoměničovou chromatografií supematantu nebo filtrátu a nakonec hydrofobní chromatografií. Jestliže je analog produkován v nerozpustné formě, používá se jiná purifikační technika skládající se z rozpuštění příslušných částic obsahujících analoga s následnou iontoměničovou chromatografií, dále rekonformaci proteinu a nakonec chromatografií využívající hydrofobní interakce. Vzorové purifikační techniky jsou uvedeny v běžně přístupném U.S.S.N. 08/323, 329, uvedeném 13. října 1994. Obecně U.S.S.N 08/323, 329 ukazuje metodu pro purifikaci keratinocytových růstových faktorů zahrnující: (a) získání roztoku obsahujícího KGF; (b) navázání KGF z roztoku z části a) na kationtový výměnný nosič; (c) vymytí KGF z kationtového iontového nosiče; (d) průchod eluovaného roztoku z (c) vhodnou kolonou s molekulárním sítem nebo provedení hydrofobní chromatografie vymytého roztoku z (c); a (e) získání KGF z molekulárního síta nebo po hydrofobní chromatografií.

Pochopitelně, že u analogů může být provedena rychlá analýza jejich fyzikálních vlastností. Část Příklady uvádí různé dobře známé zkoušky stability, ačkoliv specifický test pro analoga není kritický. Navíc úroveň biologické aktivity (např. vazba receptorů a/nebo afinita, mitogenní buněčné proliferační a/nebo in vivo aktivita) může být také testována s použitím různých zkoušek, z nichž jsou některé popsány v části Příklady. Pro zjištění, jestli analoga KGF vykazují dostatečnou biologickou aktivitu, se může použít řada dobře známých testů. Jeden takovýto test specificky zjišťuje u analogů KGF jejich schopnost kompetičně se vázat na receptor KGF (KGFR) s navázaným ¹²⁵I-KGF (Bottaro et al. (1990), J. Biol. Chem., 265:12767-12770; Ron et al. (1993), J. Biol. Chem., 268:2984-2988). Alternativní metoda pro testování interakce KGFR s analogy KGF zahrnuje použití technik jako je analýza biospecifíckých interakcí v reálném čase (BIA) (Felder et al. (1993), Molecular & Cellular Biology, 13:1449-1455). Navíc mohou být pro testování schopnosti analogů KGF stimulovat syntéza DNA použity mitogenní testy (Rubín et al. (1989), viz předchozí text). Konečně mohou být analoga KGF testována na schopnost stimulovat buněčnou proliferaci pomocí proliferačních testů (Falco et al. (1988), Oncogene, 2:573-578). Použitím jakéhokoliv shora zmíněného testovacího systému můžou být analoga KGF rychle otestována na jejich biologickou aktivitu.

V předkládaném vynálezu je pozornost zaměřena především na analoga, která si zachovávají plnou biologickou aktivitu KGF (tj. minimálně značně podobnou) in vitro nebo in vivo. Příklad

- 11 CZ 297328 B6

KGF analogů s těmito vlastnostmi (jak bylo určeno jedním nebo více výše zmíněnými testy) jsou

C(1,15)S, AN3/C(15)S, AN3/C(15)-, AN8/C(15)S, AN8/C(15)-, ΔΝ15, ΔΝ16, ΔΝ17, ΔΝ18,

ΔΝ19, ΔΝ20, ΔΝ21, ΔΝ22, ΔΝ23, ΔΝ24 nebo AN23/R(144)Q.

Analoga KGF mohou být dále modifikována, aby obsahovala dodatečné chemické struktury, které nejsou normálně částí peptidu. Takovéto odvozené struktury, které nejsou normálně částí peptidu. Takovéto odvozené struktury mohou zlepšit rozpustnost, absorpci, biologický poločas rozpadu, a podobné vlastnosti analoga KGF. Struktury mohou případně eliminovat nebo zeslabit jakékoliv nežádoucí vedlejší účinky proteinu. Struktury schopné zprostředkovat takovéto účinky jsou uvedené například v REM1NGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 18^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Do molekuly mohou být včleněny kovalentní modifikace reakcí cílového aminokyselinového zbytku peptidu s organickým pozměňovacím činidlem, které je schopné reakce s vybraným postranním řetězcem nebo terminálním zbytkem (T.E. Creghton (1983), PROTEINS: STRUCTURE AND MOLECULE PROPERTIES, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86). Polyetylenglykol („PEG“) je jednou takovou chemickou strukturou, které bylo použito při přípravě terapeutických proteinových produktů. U některých produktů bylo ukázáno, že připojení polyetylenglykolu je chrání před proteolýzou (Sada et al. (1991), J. Fermentation Blongineering, 71:137-139); metody pro připojení určitých polyetylenglykolových struktur jsou k dispozici. Viz US patent 4,179,337, David et al., „Non-Imunogenic Polypeptides,“ vydané 18. prosince 1979 a US Patent 4,002,531, Proyer, „Modifying enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby“, vydané 11. ledna 1977. Přehled obsahuje práce Abuchowski et al., v Enzymes as Drugs. (Holcerberg and Roberts, (eds.) pp. 367-382 (1981)). Při připojení molekuly PEG k proteinu byla použita řada metod. Obecně jsou molekuly polyetylenglykolu připojené k proteinu přes reaktivní skupinu nacházející se na proteinu. Vhodné aminoskupiny pro takovéto připojení jsou například na lysinových zbytcích nebo na N-konci. Například Royer (US Pat. 4 002 531, viz výše) použil pro připojení polyetylenglykolových molekul k enzymu redukující alkylaci. Podle EP 0 539 167, publikovaného 28. dubna 1993, Wright, „Pet Imidates and Protein Derivatives Thereof‘ peptidy a organické sloučeniny svolnou aminoskupinou (či aminoskupinami) jsou modifikovány odvozeninou PEGu nebo příbuzného ve vodě rozpustného organického polymeru. K modifikaci řady lysinových zbytků v proteinech pro připojení PEG molekuly přes reaktivní aminoskupinu se vztahuje US Patent 4 904 584 Shaw, vydaný 27. února 1990.

Předkládaný vynález je dále zaměřený na složení jedné dávky účinné látky, která může být bezpečně aplikována orálně nebo neorálně pro léčení chorob u teplokrevných živočichů (jako například člověka). Takováto účinná látka může být ve formě lyofílizováného nebo jinak dehydratovaného terapeutika nebo diagnostika, které může být rekonstituováno přidáním fyziologicky vhodného rozpouštědla. Tím může být jakékoliv médium, jako je sterilní voda, fyziologický roztok, glukózový roztok, nebo jiný vodný uhlovodík (např. polyoly, jako manitol, xylitol, nebo glycerol), které je schopno rozpustit sucho směs, které je slučitelné s vybraným aplikačním způsobem a které neinterferuje negativně s aktivními principy a použitými rekonstitučními stabilizátory. Ve specifickém případě je předkládaný vynález zaměřen na soupravu pro produkci jednodávkové aplikační jednotky. Souprava obsahuje jednak obal se sušeným proteinem a pak druhý obal, s vodnou složkou, která obsahuje také rekonstituční stabilizátor. Co se týče koncentrace proteinu v roztoku - množství roztoku v každém obalu a obsah obalů (jedná se o vzájemně závislé parametry, které mohou být vhodně upraveny v závislosti na požadované koncentraci aktivní látky v aplikované jednotce dávky) může kolísat v širokém rozsahu, který bude jasný odborníkům.

Podle vynálezu mohou být KGF analoga užitečná jako terapeutické nebo diagnostické látky a nebo jako činidla pro výzkum. Mohou být tedy použita v in vitro a/nebo in vivo diagnostických testech pro kvantifikaci KGF ve vzorcích pletiv nebo orgánů, nebo určení a/nebo izolaci buněk, které produkují KGFR (Bottaro et al. (1990), J. Biol. Chem. 265:12767-12770; Ron et al. (1993), J. Biol. Chem., 268:2984-2988). Při testech pletiv nebo orgánů se zjistí méně radioaktivity ¹²⁵I-KGF analogu vázajícího se na KGFR (při srovnání se standardní vazebnou křivkou analoga

- 12CZ 297328 B6 ¹²⁵I-KGF) a to díky vazbě přirozeného KGF na KGFR. ¹²⁵1-KGF analog může být podobně použit pro detekci přítomnosti KGFR v různých typech buněk.

Tento vynález také předpokládá použití analoga KGF pro tvorbu protilátek proti peptidů

- protilátek, které se také váží na přirozená KGF. V tomto případě se jedná o monoklonální nebo polyklonální protilátky, které jsou připraveny proti analogu KGF. Výsledné protilátky váží přednostně přirozený KGF, zejména když je tento protein ve své přírodní (biologicky aktivní) konformaci. Tyto protilátky se mohou použít pro detekci nebo purifikaci přírodního KGF.

Vynález navíc předpokládá použití analogů KGF pro nalezení molekul vázajících s vysokou nebo nízkou afinitou KGF (využitelných pro terapeutické aplikace) například pro účinné dodání KGF nebo jako inhibitor KGF aktivity. Pro identifikaci takovýchto vazebních molekul za fyziologických podmínek (tj. při 37 °C) je důležitá teplotní stabilita analogů KGF, protože jejich afinita vůči KGF může být silně závislá na teplotě a může se lišit oproti afinitě pozorované při 4 °C.

Pro použití in vivo mohou být KGF analoga doplněna aditivy. Mezi ně patří pufry, nosiče, stabilizátory, excipienty, ochranné látky, látky upravující tonus, antioxidandy atd. (např. látky ovlivňující viskozitu nebo plnidlo). Výběr konkrétních aditiv bude záviset na skladovací formě (tekutá nebo lyofílizovaný) a způsobu aplikace analoga KGF. Vhodnou formu je možné nalézt v REMINGTONE PHARMACEUTICAL SCIENCES (poslední vydání), Mack Publishing Company, Easton, PA.

Analoga KGF mohou být aplikována v terapeuticky účinných dávkách na konkrétně poškozená pletiva, nebo při klinicky nedostatečném počtu nefibroblastových epiteliálních buněk. Oblasti, kde mohou být analoga KGF úspěšně použita zahrnují (ale nejsou omezena pouze na ně):

- stimulace, proliferace a diferenciace adnexálních struktur (adnexal strukctures), jako jsou například vlasové folikuly, potní žlázy nebo tukové žlázy u pacientů s popáleninami a jinými částečnými nebo vážnými poškozeními urychlená reepitelizace lézí způsobených (epidermolysis bullosa), což je defekt v přilnavosti epidermis na vespod ležící kůži (dermis) vedoucí často k otevřeným bolestivým puchýřům, které mohou způsobit vážná onemocnění

- k prevenci vypadávání vlasů způsobeného chemoterapií a k ošetření mužské plešatosti nebo progresivní ztrátě vlasů u mužů i žen pro ošetření žaludečních a dvanáctníkových vředů

- pro ošetření zánětlivých střevních onemocnění, jako např. Crohnova choroba (postihující především tlusté střevo)

- prevenci nebo zmírnění toxických vlivů radiačních nebo chemoterapeutických ošetření (tj. předběžné ošetření a/nebo ošetření po vlastním léčení) pro indukci faktorů působících na ochranu buněk nebo regeneraci nebo oboje

- stimulace produkce slizu v celém gastrointestinálním traktu

- indukce proliferace a diferenciace pneumocytů typu II, což může pomoci při léčbě nebo prevenci chorob jak oje například „sklovitá“ membrána (hyaline membrane disease), tj. syndrom kojeneckých dýchacích problémů a průduškové a plicní displasie (infant respirátory distress syndrome and bronchopulmonary displasia) u nedonošených dětí

- stimulace proliferace a diferenciace průduškového a/nebo alveolámího epitelu s akutním nebo chronickým poškozením plic nebo insuficiencí kvůli dýchacím potížím (včetně vysokých hladin kyslíku), rozedmě plic (emhysema) nebo užívání chemoterapeutik poškozujících plíce, traumatům způsobeným respirátorem (ventilátor trauma) nebo jiným činitelům poškozujícím plíce

- zvýšená činnost jater k léčbě nebo prevenci hepatické cirrhosy, akutní selhání jater, škody způsobené akutní virovou hepatitidou a/nebo toxické poškození jater

- 13CZ 297328 B6

- indukce regenerace buněk rohovky, například při léčbě odřenin rohovky indukce regenerace epiteliálních buněk při léčbě pokračující choroby dásní (progressive gum disease)

- indukce regenerace bubínkových epiteliálních buněk při léčbě poškození ušního bubínku a léčbě nebo prevenci počátku diabetes mellitus nebo jako doplněk úpravy při transplantaci ostrůvku buněk (an adjunct in the setting of islet cell transplantation)

Pacient, který potřebuje proliferující nefibroblastové epiteliální buňky bude ošetřen účinným množstvím analogu KGF. Pojem „účinné množství“ je takové množství analogu KGF, které je nezbytné pro vyvolání požadované odpovědi u ošetřeného pacienta a bude zpravidla určeno ošetřujícím lékařem. Mezi faktory ovlivňující množství aplikovaného analoga KGF bude patřit věk, všeobecný stav pacienta, léčiva choroba atd. Typická dávka se bude pohybovat v rozmezí 0,001 mg až 500 mg na 1 kg tělesné hmotnosti.

Analog KGF může být podán teplokrevným živočichům (kam patří i člověk) ne-orálně (tj. IV, IT, IM, SC nebo IP cestou), orálně nebo lokálně. Analog KGF může být použit jednorázově nebo opakovaně v závislosti na nemoci a stavu pacienta. V některých případech může být analog KGF podáván jako adjuvans k jiné léčbě a také v kombinaci s jinými farmaceutickými preparáty.

Následující příklady slouží k lepší ilustraci předkládaného vynálezu. Je jasné, že uvedené postupy mohou být modifikovány bez toho, aby byl ovlivněn „duch vynálezu“.

Příklady provedení vynálezu

Standardní metody používající postupy v následujících příkladech (nebo vhodné alternativní postupy) jsou uvedeny v běžně používaných manuálech pro molekulární biologii, jako například Molecular Cloning, Second Edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) a Current Protocol in Molecular Biology, Ausabel et al., Greene Publishing Associates/Wilely-interscience, New York (1990).

Příklad 1: Příprava DNA kódující KGF a analoga KGF

Klonování celého genu lidského KGF (kódujícího polypeptid se sekvencí nativního KGF) bylo provedeno jednak polymerázou řetězovou reakcí (PCR) s RNA z živočišných buněk a pomocí PCR chemicky syntetizovaných (optimalizovaných kodon E. coli) oligonukleotidů („OLIGA“). Obě procedury jsou popsány dále:

Byla provedena amplifikace s použitím RNA izolovaných z buněk (o kterých víme, že produkují polypeptid) pomocí PCR. Nejprve se provede rozrušení buněk z buněčné linie lidských fibroblastů AG1523A (získané od Human Genetic Mutant Cell Culture, Repository Institute For Medical Research, Camden, New Jersey) pomocí guanidin thiokyanátu; pak následuje extrakce (podle metody popsané v práci Chomzynski et al. (1987), Anal. Biochem., 172:156). S použitím standardního protokolu pro reverzní transkripci z celkové RNA byla vytvořena cDNA pro KGF. PCR amplifikace (PCR č. 1) genu KGF byla provedena s použitím cDNA KGF jako templátu a primerů OLIGO č. 1 a OLIGO č. 2, které kódují DNA sekvence bezprostředně na 5' a 3' genu KGF [teplotní cyklátor model 9600 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT); 28 cyklů, každý zahrnující denaturaci - jednu minutu při 94 °C, annealling - dvě minuty při 60 °C a elongaci - tři minuty při 72 °C]. Malé alikvotní části produktu první PCR reakce byly potom použity jako templát pro druhou KGF PCR amplifíkaci (PCR č. 2) za podmínek shodných s první reakcí kromě teploty pro annealing, který byla 50 °C. Pro expresní klonování genu KGF byly dále použity primery pro „nested PCR“ generující vhodná restrikční místa na obou koncích genu KGF - k modifikaci KGF DNA produktu z PCR č. 2 byly tak použity OLIGO č. 3 a OLIGO č. 4

- 14CZ 297328 B6 (začlenění restrikčních míst pro Mlul a BamHI na 5' a 3' konci genu) [PCR 3; 30 cyklů, každý zahrnující denaturaci - jedna minuta při 94 °C, annealing - dvě minuty při 60 °C a elongaci - tři minuty při 72 °C], Tato DNA byla následně štěpena restrikčními enzymy Mlul a BamHI, extrahovaná fenolem a precipitována etanolem. Poté byla resuspendována a ligována (s použitím T4 ligázy) do plazmidu pCFM1156 (otázek 2A), který obsahuje „RSH“ signální sekvenci, čímž vznikl konstrukt RSH-KGF (obrázek 3).

Tímto ligačním produktem byly transformovány (podle metody popsané Hanahanem (1983) J. Mol. Biol., 166:557) buňky E. coli (k FM5 - ATCC: 53911) a následně vysety na LB médium s kanamycinem při 28 °C. Několik vybraných transformátorů bylo dále pěstováno v malým tekutých kulturách obsahujících kanamycin v koncentraci 20 pg/ml. Z každé kultury byl izolován RSH-KGF plazmid ajeho DNA byla sekvenována. Vzhlede k vnitřnímu Mfe/restrikčnímu místu v genu KGF nebylo možné přímo klonovat nativní sekvenci genu do příslušného expresního vektoru do míst ohraničeních Ndel a BamHI. Toho se dosáhlo trojcestnou ligací. Plazmid RSHKGF byl štěpen v jedinečných restrikčních místech BsmI a Sstl a fragment DNA asi 3 kb velký (obsahující 3' konec KGF genu) byl izolován následnou elektroforézou v 1% agarózovém genu. Další PCR (PCR č. 4) byla provedena za stejných podmínek jako PCR č. 3 s primerem OLIGO č. 5 místo OLIGO č. 3. DNA produkt PCR reakce byl pak štěpen enzymy Ndel a BsmI a pomocí elektroforézy ve 4% agaróze byl izolován DNA fragment 311 párů bází dlouhý. Třetí fragment použitý v ligaci byl fragment DNA 1,8 kilobází dlouhý z pCFMl 156 vyštěpený s Ndel a Sstl a izolovaný elektroforézou v 1% agarózovém gelu. Po následující ligaci (T4 ligáza), transformaci, selekci na kanamycinu a sekvenování DNA (jak je popsáno výše) byl vybrán klon obsahující konstrukt na obrázku 4 a tento plazmid byl označený jako KGF. Vzhledem k internímu ribosomálnímu vazebnímu místu, které vede k tvorbě zkrácených produktů, byla sekvence KGF DNA mezi jedinečnými KpnI a EcoRI místy nahrazena chemicky syntetizovanými OLIGO (OLIGO 6 až OLIGO 11) tak, aby se minimalizovalo použití interního startovacího místa (obrázek 5).

- 15 CZ 297328 B6

OLIGO (SEQ

ID

N0:7):

5'-CAATGACCTAGGAGTAACAATCAAC-3’

OLIGO (SEQ

ID

N0:8):

5'-AAAACAAACATAAATGCACAAGTCCA-3’

OLIGO

ID

NO:9):

5’-ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA-3’

OLIGO (SEQ

ID

5’-ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA-3'

OLIGO

5’-ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA-3’

OLIGO

5’-CTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCC-3’

OLIGO ’ -AAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTT-3 ’

OLIGO (SEQ ID NO:14):

5’-GCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTG-3¹

OLIGO

5'-TCTTGGGTGCCCTTGACTTTGCCGCGTTTGTCGATACGCAGGTAC-3'

OLIGO ^T-ACAGCAACAGTACGGATTTCCATAATATTGTAGTTGTTTTTCATC-3’

OLIGO

OLIGA byla fosforylována T4 polynukleotid kinázou a poté tepelně denaturována. Jednopramenné (ss - single stranded) OLIGA potom byla ponechána vytvořit dvoupramenné (ds) 5 fragmenty DNA pomalým snížením teploty na úroveň laboratoře. Poté byla použita T4 ligáza ke kovalentnímu připojení jak interního OLIGO shodných (sticky) konců tak celého ds OLIGO fragmentu do KGF plazmidu štěpeného enzymu KpnI a EcoRI. Nový plazmid byl označen jako KGF (dsd).

KGF gen s úplně optimalizovaným E. coli kodonem byl vytvořen amplifíkací pomocí PCR s chemicky syntetizovanými OLIGO č. 12 až 24.

-16CZ 297328 B6

OLIGO 12 (SEQ ID N0:18): 5'-AGTTTTGATCTAGAAGGAGG-3’

OLIGO 13 (SEQ ID N0:19): 5'-TCAAAACTGGATCCTATTAA-3’

OLIGO 14 (SEQ ID N0:20):

5’-AGTTTTGATCTAGAAGGAGGAATAACATATGTGCAACGACATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTGCTCCAGCCCGGAACGT-3'

OLIGO 15 (SEQ ID N0:21):

5'-CACACCCGTAGCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGTGTTCGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAA-3’

OLIGO 16 (SEQ ID NO:22):

5'-CGTGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTACAACATCATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAA’3' OLIGO 17 (SEQ ID N0:23):

5'-GGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGC GAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAA-3'

OLIGO 18 (SEQ ID NO:24):

5'-CTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGT-3’

OLIGO 19 (SEQ ID N0:25):

5'-ATCCCGGTTCGTGGT CCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAATAGGATCCAGTTTTGA-3’

OLIGO	20	(SEQ	ID
OLIGO	21	(SEQ	ID
OLIGO	22	(SEQ	ID
OLIGO	23	(SEQ	ID
OLIGO	24	(SEQ	ID

NO:26):5'-TACGGGTGTGACGTTCCGGG-3¹

NO:28):5'-ATTCAACACCTTTGATTGCA-3'

NO : 29) :5'-CCAGGATCAGTTCTTTGAAG-3’

NO :30) : 5 '-GAACCGGGATACCTTTCTGG-3’

OLIGA 12 až 24 byla navržena tak, aby celá DNA sekvence kódující nativní KGF byla reprezentována OLIGY z „Watsonova“ nebo „Crickova“ pramene a byl po PCR by poskytla žádanou dvoupramenou DNA sekvenci (obrázek 6) [PCR č. 5, teplotní cyklátor model 9600 (Perkin5 Elmer Cetus); 21 cyklů skládajících se z denaturace - 31 vteřin při 49 °C, annealingu

- 31 vteřin při 50 °C a elongace - 73 °C po 31 vteřin; po těchto 21 cyklech byla PCR reakce zakončena závěrečným sedmi minutovým elongačním krokem]. Po PCR amplifikaci byl výsledný DNA fragment štěpen enzymy Xbal a BamHI a fragment 521 bp byl ligován do expresního plazmidu pCFMl 156, který byl štěpen stejnými enzymy. PCR č. 5 používala vnější primery io (100 pmolů/100 μΐ rxn) OLIGO č. 12 a OLIGO č. 13 a lul/100 μΐ rxn KGF templátu odvozeného ligací (T4 ligázou) OLIGO č. 14 až 19 (OLIGO č. 15 až 18 byly fosforylovány T4 polynukleotid kinázou) za použitím OLIGO č. 20 až 24 jako pomocných oligonukleotidů (band-aid oligos) pro ligaci (Jayraman et al. (1992), Biotechniques, 12:392). Konečný produkt byl označen jako KGF (optimalizovaný kodon).

Všechna zde popsaná analoga KGF jsou složena z částí DNA sekvencí nalézajících se KGF (dsd) nebo KGF (optimalizovaný kodon) nebo z kombinace obou. Tyto sekvence jsou dále modifíko- 17CZ 297328 B6 váné inzercí do vhodných restrikčních míst DNA sekvencí, které kódují specifická aminokyselinová KGF analoga, s použitím jedné nebo více technik pro syntézu DNA fragmentů popsaných výše. Jakákoliv analoga může být vytvořen v celém svém rozsahu jednou z výše popsaných technik. Obecně se při konstrukci OLIGO používali optimalizované E. coli kodony tam, kde to bylo vhodné, i když přítomnost optimalizovaných E. coli kodonů (v části nebo v celku jakéhokoliv z genů, kde byl tento vliv zjišťován) nezvýšila významně výnos proteinu, který mohl být získán z kultivovaných bakteriálních buněk. Obrázky 7-24 a 37-50 jsou uvedené jako vhodný příklad specifické nukleotidové a aminokyselinové sekvence konstruktu analoga KGF: C (1,15)S, (obrázek 7).

Příklad 2: Produkce v E. coli

Při klonování analogů genu KGF byly použity tři různé expresní plazmidy. Jednalo se o pCFM1156 (ATCC 69702), pCFM1656 (ATCC 69576) a pCFM3102 (obrázek 2A, 2B a 2C). Plazmid p3102 může být odvozen z plazmidu pCFM1656 sérií místních mutagenezí (změn bází) pomocí PCR s přesahujícími oligo (PCR overlaping oligo mutagenesis). Začíná se na Bglll (v plazmidu pCFM1656, 180 pár bází) bezprostředně u 5' respiračních promotoru plazmidu, PcopB, a pokračuje se směrem ke genům replikace plazmidu, přičemž dochází k těmto změnám:

PCFM1656 bp # 204	bp do pCFM1656 T/A	bp ligace do pCFM31O2 C/G
428	A/T	G/C
509	G/C	A/T
617	—	připojení dvou G/C bp
677	G/C	T/A
978	T/A	C/G
992	G/C	A/T
1002	A/T	C/G
1005	C/G	T/A
1026	A/T	T/A
1045	C/G	T/A
1176	G/C	T/A
1464	G/C	T/A
2026	G/C	bp delece
2186	C/G	T/A
2479	A/T	T/A
2498-2501	AGTG TCAC	GTCA CAGT
2641-2647	TCCGAGC AGGCTCG	bp delece
3441	G/C	A/T
3452	G/C	A/T
3649	A/T	T/A
4556	—	připojení bps

(SEQ ID NO:43) 5'-GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG-3' (SEQ ID NO:44) 5'-CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC-3'

Jak je vidě zvýše uvedeného, plazmidy pCFM1156, pCFM1656 a pCFM3102 jsou si vzájemně velmi podobní a obsahují mnoho stejných restrikčních míst. Plazmidy byly vybrány podle jejich vhodnosti a části vektorové DNA mohou být jednoduše změněny pro potřeby nových konstruktů.

-18CZ 297328 B6

Hostitelským organismem použitým pro všechna klonování byla E. coli, kmen FM5 (ATCC:

53911) a transformace byla prováděna podle metody Hanahana (1983, viz předchozí text) nebo elektroelucí s použitím přístroje Gene Pulser transfection apparatus (BioRad Laboratories,Inc.,

Hercules, CA, USA), podle protokolu dodaného výrobcem.

Nejprve bylo připraveno malé čerstvé inokulum žádaného rekombinantního klonu E. coli, obsahujícího na jednom ze tří pCFM vektorů žádaný konstrukt. Do dvoulitrové lahve obsahující 500 ml Luriova bujónu bylo přeneseno 0,1 ml zmražené zásobné kultury vhodného kmene v glycerolu. Kultura byla třepána při 30 C po 16 hodin. Poté byla kultura přenesena do 15 1 fermentoru obsahujícího 8 1 sterilního média používaného pro fermentace ve větších objemech (Tsai, et al. (1987), J. Industrial Microbiol., 2: 181-187).

Na začátku fermentace bylo dodáváno živné médium Feed 1 (Tsai, et al. (1987), viz předchozí text). V okamžiku kdy hodnota OD600 dosáhla hodnoty 35, byla rychlým zvýšením teploty kultury na 37 °C inkubována exprese žádaného analogu KGF. Při této teplotě se plazmid amplifikuje. Po dvou hodinách při 37 °C byla teplota kultury dále rychle zvýšena na 42 °C, čímž byl denaturován Cl represor. Přidávání Feed 1 bylo přerušeno a místo něj bylo poté přidáno živné médium Feed 2 v množství 300 ml za hodinu. Feed 2 obsahovalo 175g/l peptonu (trypticasepeptone), 87,5 g/1 kvasničného extraktu a 260 g/1 glukosy. Po jedné hodině kultivace při 42 °C byla teplota kultury snížena na 36 °C a tato teplota byla dále udržována po následujících šest hodin.

Fermentor byl poté zastaven a buňky byly koncentrovány centrifugací v plastikových pytlích vložených do jednolitrových centrifugačních kyvet. Médium bylo centrifugováno 60 minut při 400 otáčkách za minut. Supematant byl poté odebrán a pelet (sedimentované buňky) byl zmražen při -90 °C.

Následujícím způsobem byla purifikována tato analoga KGF (získána expresí v E. Coli)·. přirozený KGF, C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)E, C(1,15)S/R(144)Q, ΔΝ15, ΔΝ23 a AN23/R(144)Q. Pelet (hustá buněčná suspenze) získaný z vysokohustotní fermentace byl resuspendováním pomocí vhodného výkonného (poskytujícího velké střižné síly) mixeru při 4 °C v roztoku 0,2 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5 tak, byl výsledná suspenze byla 10 až 20% (hm./obj.). Resuspendované buňky byly poté lysovány trojitým homogenizováním v homogenizéru (APV Gualin, lne., Everett, MA, USA). Homogenát vytékající z homogenizátoru byl ochlazován na 4 až 8 °C pomocí vhodného chladicího zařízení. Zbytky buněk byly odstraněny centrifugací lysátu při 4200 otáčkách za minut, 4 °C, po dobu 30 až 60 minut v centrifuze J-6B (Beckman Instruments, lne., Brea, CA, USA, použitý rotor JS 4.2). Supematant byl poté opatrně dekantován a nanesen na předem připravenou kolonu (450 ml, 5 cm x 23 cm) S-Sepharosy Fast Flow (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA). Kolona byla ekvilibrována roztokem 0,2 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5, při 4 °C. Poté byla kolona promyta 2250 ml (pětinásobný objem kolony) roztoku 0,4 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5, při 4 °C. Purifikovaný protein byl eluován z kolony 5 1 roztoku 0,5 NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5. Absorbance eluátu při 280nm byla kontinuálně zaznamenávána a eluát byl jímán do frakcí o objemu 50 ml. Frakce obsahující eluované látky (identifikované pomocí absorbance při 280 nm) byly dále analyzovány pomocí SDS-PAGE elektroforázy (14% gel). Touto metodou byla potvrzena přítomnost požadovaného proteinu ve frakcích.

Frakce obsahující požadované proteiny byly spojeny a následně k nim byla přidána destilovaná voda v poměru 1:1. Zředěný roztok byl poté nanesen na předem připravenou kolonu (450ml, 5 cm x 23 cm) S-Sepharosy Fast Flow ekvilibrovanou roztokem 0,4 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 6,8, při 4 °C. Kolona byla poté promyta 2250 ml roztoku 0,4 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 6,8. Proteiny byly poté eluovány dvacetinásobným objemem kolony pomocí lineárního gradientu roztoku NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 6,8. Koncentrace NaCl se pohybovala od 0,4 M do 0,6 M. Opět byly jímány 50 ml frakce, při současném měření absorbance eluátu při 280 nm. Frakce obsahující purifikovaný protein (stanoveno pomocí 14% SDS PAGE) byly spojeny a zkoncentrovány filtrací přes membránu (YM-10, 10000 molecular weight cutoff) v 350 ml

-19CZ 297328 B6 nádobách za současného míchání (Amicon, lne. Mayberry, MA, USA) na výsledný objem 3040 ml.

Koncentrát byl poté nanesen na předem připravenou kolonu (1300 ml, 4,4 cm x 85 cm) Superdex-75 (Pharmacia) ekvilibrovanou pufrem obsahujícím IX PBS (Dulbecco's Phosphate Bufered Salině, „D-PBS“, bez obsahu vápenatých a hořečnatých iontů) nebo 0,15 M roztokem NaCl v 20 mM NaPO.i, pH 7,0. Po nanesení vzorku byly proteiny eluovány z kolony použitím kolonového pufru. Byly jímány desetimililitrové frakce a ty, které obsahovaly požadovaný analog (stanoveno pomocí 14% SDS-PAGE) byly spojeny. Koncentrace proteinů v takto získané frakci byla běžně asi 5 až 10 mg/ml. Pokud není uvedeno jinak byly všechny výše uvedené kroky prováděny při 4 °C až 8 °C.

Alternativní postup purifikace byl použit v případě přirozeného KGF, C(1,15)S a ΔΝ23. Pokud není uvedeno jinak byly všechny kroky prováděny při 23 ± 5 °C; tuto teplotu měly i veškeré použité roztoky a zařízení.

Po dokončení produkční fáze bakteriální fermentace byla buněčná kultura ochlazena na 4 až 8 °C a buňky byly izolovány centrifugací či jiným podobným způsobem. Na základě očekávaného výtěžku proteinu na jednotku buněčné hmoty a množství požadovaného purifikovaného proteinu bylo přiměřené množství buněčné hmoty resuspendováno v pětinásobku (váhově) slabého pufru (0,2 M NaCl, 20 mM NaPO₄, pH 7,5). Buňky byly resuspendovány na homogenní suspenzi pomocí vysokoobrátkového (high shearing) mixeru. Teplota buněčné suspenze byla během homogenizace udržována na 4 až 8 °C.

Buňky byly poté lysovány tlakem, např. dvojnásobnou homogenizací buněčné suspenze ve vhodně velkém buněčném homogenizátoru. Homogenát byl udržován chladný (5 ± 3 °C). K vyčištění buněčného lysátu byl použit předem připravený „hluboký“ filtr (depth filtr housing, Cuno, lne., Meriden. CT, USA) vybavený filtrem s odpovídající plochou. Filtr byl ekvilibrován přiměřeným množstvím 0,2 M NaCl, připraveného na 20 mM NaPO₄, pH 7,5. Ekvilibrace a promytí bylo prováděno při 5 ± 3 °C. Po vyčištění lysátu filtrací přes vhodně upravený filtr byl tento promyt roztokem 0,2 M NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5. Filtrát a všechny další promývací roztoky byly jímány do chlazené nádoby odpovídajícího objemu. Všechny operace byly prováděny při teplotě nižší než 10 °C.

Lysát byl dále přečištěn na předem připravené koloně SP-Sepharosy Fast Flow obsahující minimálně 1 ml Sepharosy na 2 g buněk. Kolona SP-Sepharosy Fast Flow byla ekvilibrována vychlazeným (5 ± 3 °C) 0,2 M roztoku NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5. Teplota kolony byla udržována na hodnotě nižší než 10 °C. Přečištěný lysát (5 ± 3 °C) byl poté nanesen na kolonu iontoměniče a absorbance eluátu při 280nm byla kontinuálně monitorována. Po nanesení vzorku byla kolona promyta vychlazeným 0,2 M roztokem NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5 a následně ještě promyta 0,3 M roztokem NaCl v 20 mM NaPO₄, pH 7,5 při teplotě 23 ± 5 °C.

Požadovaný protein byl eluován pomocí lineárního gradientu NaCl o koncentraci 0,2 až 1 M, připraveného v 20 mM NaPO₄, pH 7,5. Převážná část produktu byla sebrána v několika frakcích na základě měření absorbance při 280 nm.

K oxidaci volných SH skupin byl proveden oxidační krok. U proteinů se změněným obsahem cysteinu, (v porovnání s přírodním KGF) bylo přidáno oxidační činidlo (např. cystamin dihydrochlorid, nebo jiné vhodné oxidační činidlo, například cystein, oxidovaný glutathion nebo ionty Cu²⁺) tak, aby výsledná koncentrace byla 1-20 mM a pH bylo upraveno na 7-9,5. V případě, že byl použit cystamin dihydrochlorid, bylo pH upraveno na 9,0 ± 0,3. Oxidace byla prováděna při 10 až 30 °C po vhodnou dobu. V případě přírodního KFG byla oxidace provedena přídavkem vhodného množství (NH₄)₂SO₄, např. 1 až 2 M (NFL^SOzi a pH bylo upraveno na hodnotu 7,5-9,5, přičemž teplota byla udržována na 23 ± 5°C po přiměřenou dobu.

-20CZ 297328 B6

Po oxidaci bylo pH upraveno na hodnotu pohybující se mezi 6,5 a 9,5. V případě potřeby byl do roztoku přidán pevný (NH4)₂SO₄ tak, aby jeho výsledná koncentrace nepřesáhla 2 M koncentraci.

Roztok byl zbaven pevných částic přečištěním filtrací přes vhodný filtr.

Filtrát - oxidovaný produkt, byl dále dělen pomocí HIC (hydrophobic interaction chromatography). Jako matrice pro HIC byl použit Butyl-650M Toyopearl (Tosohaas, lne., Montgomeryville, PA, USA). Roztok obsahující protein byl nanesen na kolonu, která byla předem ekvilibrována roztokem obsahujícím 2 M (NH₄)₂SO₄, 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO₄, pH 7,0. Po nanesení vzorku byla kolona promyta roztokem 2 M (NH₄)₂SO₄, 0,15 NaCl a 20 mM NaPO₄, pH 7,0. Požadovaný protein byl poté eluován snižujícím se lineárním gradientem 2 až 0 M (NH₄)₂SO₄, který byl rozpuštěn v roztoku 0,15 M NaCl a 20 mM NaPO₄, pH 7,0. V okamžiku, kdy se začal požadovaný protein z kolony vymývat, což bylo indikováno zvyšující se absorbancí eluátu při 280 nm, byly jímány frakce. Část každé frakce byla poté analyzována pomocí SDSPAGE. Frakce obsahující požadovaný protein byly spojeny, dobře promíchány a byl stanoven objem takto získané spojené frakce a koncentrace proteinů v této spojené frakci.

Spojený eluát po HIC, obsahující protein, byl poté zkoncentrován a eluční pufr výměně. Běžně byly proteiny zkoncentrovány na 5,0 až 10,0 mg/ml. Ultrafíltrace byla provedena s použitím ultrafiltračního zařízení vybaveného kazetovým systémem PTGC Pellicon (Millipore, lne., Bedford, MA, USA) s membránami o vhodné velikosti pórů.

Po zkoncentrování byl vzorek diafíltrován proti vhodnému pufru. Vzorek vyšlý z koncentračního kroku byl diafíltrován proti roztoku obsahujícím 0,15 M NaCl a 20 mM NaPO₄, pH 7,0, a to tak dlouho, dokud se nelišila vodivost koncentrátu od vodivosti roztoku 0,15 M NaCl a 20 mM NaPO₄, pH 7,0 o méně než 5%.

Kromě toho byl koncentrovaný a diafíltrovaný vzorek obsahující proteiny přefiltrován přes filtry Posidyne s velikostí pórů 0,1 pm (Pall, lne., Cortland, NY, USA). Důvodem bylo odstranění vysráženého materiálu a bakteriálních endotoxinů, které se mohou ve vzorku vyskytovat. Po stanovení koncentrace proteinů v roztoku a na základě požadavku na konečnou koncentraci produktu byl roztok zředěn roztokem 0,15 M NaCl a 20 mM fosforečnanu draselného, pH 7,0. Závěrem byla provedena sterilizace filtrací přes 0,22 pm filtr. Konečný produkt byl přenesen do apyrogenní nádoby ke skladování (cc při 5 °C) před dalším zpracováním.

B. Analýza

Analýza byla provedena s použitím přirozeného KGF, C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)Q, ΔΝ15, ΔΝ23 a AN23/R(144)Q. Všechny tyto látky byly připraveny s použitím E-coli.

Konformační stabilita

Polypeptidy byly porovnávány vzhledem ke své stabilitě během skladování, teplotě „tepelného rozbalení“ (thermal unfolding transition temperatures) T_m a stabilitě v širokém spektru pH.

Stabilita během skladování

Nativní KGF a C(1,15)S byly inkubovány při 37 °C po dobu cca 24 hodin a poté byl stanoven obsah zbylých protein. Výsledky jsou shrnuty na obrázcích 24 až 26.

Na obrázku 25 je porovnáván nativní KGF s C(1,15)S při skladování v 20 mM roztoku fosforečnanu sodné, 0,15 M NaCl, pH 7,0 při 37 °C po 27 hodin. C(1,15) vykazuje signifíkanční nárůst množství rozpuštěného proteinu relativně vůči nativnímu KGF.

-21 CZ 297328 B6

Na obrázku 26 je porovnáván nativní KGF s C(1,15)S při skladování v 0,15 M NaCl, 20 mM

NaPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,0 při 37 °C. Opět zde C(1,15)S vykazuje relativně zvýšenou stabilitu vůči nativnímu KGF.

Na obrázku 27 je porovnáván stabilita nativního KGF, ΔΝ15 a C(1,15)S při skladování v PBS a v 50 mM NaPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,0 při 37 °C po 18 hodin. Množství rozpuštěného proteinu je mnohem vyšší v roztoku s vysokým obsahem fosforečnanu než v roztoku PBS (100 versus 65%). ΔΝ15 a také C(1,15)S vykazují jasně zvýšenou stabilitu v porovnání s nativním KGF. ΔΝ15 a C(1,15)S dáván také 100% výtěžnost v roztoku s vysokým obsahem fosforečnanů jak lze očekávat z výsledků s nativním KGF.

Bylo též provedeno jedno předběžné srovnání stability během skladování mezi C(l,15,40)S a C(40)S (který je kódován bázemi 201 až 684 sekvence SEQ ID NO: 1, s výjimkou, že Ser⁴⁰ je kódován AGA) a mezi C(l,l5,1021) a C(102)S (který je kódován bázemi 201 až 684 sekvence SEQ ID NO:1, s výjimkou, že Ser¹⁰² je kódován AGG). Výsledky (data nejsou ukázána) naznačují sníženou stabilitu (např. méně rozpustného proteinu po inkubaci při 37 °C). Nicméně množství rozpustného správně sbaleného C(l,15,40)S proteinu, který byl purifikován z média bylo vyšší než množství C(40)S, což předpokládá, že C(1,15,40)S může být ve skutečnosti stabilnější a že výsledky porovnávacího pokusu jsou neprůkazné. Předkládaný vynález zahrnuje přednostně analoga KGF, která mají jiné substituce než substituce na Cys⁴⁰, Cys¹⁰² a Cys¹⁰⁶ a přednostně vylučují C( 1,5,40)S, C( 1,15,102)S a C( 1,15,40,102,016).

Schopnost C(1,15)S/R(144)Q a AN23/R(144)Q zamezit agregaci při zvýšené teplotě byla též testována. Vzorek obsahující 0,5 mg/ml proteinu byl připraven v D-PBS. 0,5 ml každého ve vzorku bylo přeneseno do třímililitrových skleněných lahviček typu 1 (type-1 glass vials). Lahvičky byly uzavřeny gumovou zátkou a 13 mm hliníkovým snadno vyjímatelným těsněním (flip— off aluminium seal). Tyto lahvičky byly poté vloženy do inkubátoru s teplotou 37 °C. V předem stanovené časové intervaly byly lahvičky odebrány a vzorky byly analyzovány vzhledem ke ztrátě rozpustných proteinů. Viditelná sraženina byla odstraněna centrifugací 250μ1 každého vzorku přes 0,22 μπι filtr Spin-X^(tm) (Costar, Combridge, MA, USA). Rozpustné proteiny ve z filtrovaném roztoku byly následně analyzovány pomocí HPLC (size exclusion). Množství rozpustného proteinu bylo stanoveno integrací plochy píku na chromatogramu HPLC a vynesením výsledků jako funkce závislosti na době inkubace při 37 °C. Výsledky jsou ukázány na obrázku 27.

Poločasy ztráty rozpustných monomemích proteinů byly odhadnuty z těchto kinetických křivek. Tabulka 1 ukazuje poločasy „rozpadu“ pro zbývající rozpustné KGF při skladování při 37 °C pro tyto proteiny.

Tabulka 1

Poločas rozpadu rozpustných, monomemích proteinů.

Protein	tl/2 (dny)
Nativní KGF	0,6
ΔΝ23	1,1
Cíl,15)	1,2
C(1,15)S/R(144)Q	13,3
AN23/R144Q	22,3
C(1,15)S/R(144)E	38,0

-22CZ 297328 B6

Jak je vidět z výše uvedené tabulky 1 a obrázek 28, je nativní KGF agregován nejrychleji s poločasem rozpustnosti 0,6 dne. C(1,15)S/R(144)Q, AN23/R(144)Q a C(1,15)S/R(144)E vykazují značný nárůst rozpustného poločasu a to 13,3, 22,3 a 38 dní.

Teplotní rozbalení

Teplotní rozvinutí bylo monitorováno pomocí cirkulámího dicroismu (CD) při 23 nm s použitím spektropolarimetru J-720 (Jasco, lne., Easton, MD, USA) vybaveného teplotním kontrolním systémem typu PTC-343 Peltier. Pro analýzu CD byly jednotlivé vzorky obsahujíc 0,1 mg/ml polypeptidů, které měly být analyzovány, připraveny v D-PBS (Life Technologies, lne., Grans Island, NY, USA). 2,5 ml každého ze vzorků bylo přeneseno do pravoúhlé křemenné (Suprasil - Heraeus Quarzschmelze, GmbH, Hnau, Germany) desetimilimetrové fluorescenční kyvety (Helma Cells, lne., Jamaica, NY, USA). Kyveta byla vložena do teplotně kontrolovaného systému spektropolarimetru typu Peltier. Teplotní rozvinutí bylo prováděno rychlostí 50 °C za hodinu. Změny v elipticitě byly monitorovány při 230 nm jako indikátoru rozvinutí. Teplota T_m byla pro každý vzorek stanovena změřením teploty při které bylo 50% molekul proteinu v roztoku rozvinutých (Biophysical Chemistry, Cantor and Schimmel (eds), W.H. Freeman and Co. San Francisco (1980). Hodnoty Tm každého ze tří proteinů jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

Hodnoty teplot tání (melting temperature)

Protein	Tm (°C)
Nativní KGF	54,0
ΔΝ15	55,0
C(l,15)	55,0
ΔΝ23	56,0
C(1,15)S/R(144)Q	62,5
ÚN23/R144Q	63,0
C(l,15)S/R(144)E	63,5

Jak ukazují tyto výsledky, C(1.,15)S a ΔΝ15 mají hodnotu Tm o jeden stupeň vyšší v porovnání s nativním KGF. ΔΝ23 má Tm opět o jeden stupeň vyšší. Nicméně substituce R144Q na C(1,15)S/R(144)Q či ΔΝ23 přidá zvýšení Tm o více než 6°C a více než 7 °C v porovnání s nativním KGF. Kromě toho je Tm u C(l,l5)S/R(14)E o více než 9 °C vyšší než Tm nativního KGF.

pH

Stabilita v rozmezí pH byla porovnávána u C(1,15)S/R(144)Q a C(1,15)S/R(144)E s nativním pH. Rozdílné pH bylo upravováno v roztocích D-PBS přídavkem koncentrované HC1 nebo NaOH. Přibližně 2,35 ml D-PBS s rozdílnou hodnotu pH bylo smícháno s 100 μΐ 2,45 mg/ml proteinu KGF v křemenné kyvety. Tyto vzorky byly teplotně rozvinuty rychlostí 50°za hodinu a monitorovány s použitím CD při 230 nm. Obrázek 29 ukazuje T_m jako funkci pH pro nativní KGF, C(1,15)S/R(144)Q a C(1,15)S/R(144)E. V testovaném rozmezí pH mají C(1,15)S/R(144)Q a C(1,15)S/R(144)E vždy vyšší T_m než nativní KGF.

-23 CZ 297328 B6

Biologická aktivita in vitro

Mitogenní aktivita C(1,15)S, ΔΝ15, ΔΝ23, AN23/R144Q, C(1,15)S/R(144)Q a C(1,15)S/R(144)E byla stanovena in vitro jako funkce koncentrace proteinů a polovičky maximálních koncentrací. Tato funkce byla stanovena měřením příjmu [³H] thymidinu buňkami Balb/MK (podle metody Rubina et al. (1989, viz předchozí text). Obecně byla koncentrace každého z analogů KGF stanovena s použitím in vitro biologického testu a vztažena vůči známému standardu nativního KGF. Každý analog KGF byl poté zředěn a testován na biologickou aktivitu s použitím Balb/MK biologického testu. Vzorky byly nejdříve naředěny pomocí Média složeného z 50% Eagle'S MEM média (připraveného na zakázku), 50% F12 taktéž připraveného na zakázku, 5 pg/ml transferrinu, 5 ng/ml seleničitanu sodného, 0,005% HSA a 0,05% Tween 20. Vzorky KGF byly poté přidány do 96 jamkových destiček Falcon Primeria, v kterých byly již Balb/MK buňky, bylo měřeno zabudovávání [³H] thymidinu během syntézy DNA. Tato inkorporace byla poté přepočítána na vliv přirozeného KGF porovnáním se standardní křivkou pro přirozený KGF. Výsledky jsou prezentovány na obrázky 30 až 35. Jak je z těchto obrázků vidět, testovaná analoga KGF popsaná na obrázcích 29 až 34 mají s nativním KGF srovnatelnou aktivitu.

Příklad 3: Produkce v savčích buněčných kulturách.

Tento příklad popisuje expresi, izolaci a charakterizaci dvou biologicky aktivních rekombinantních KGF (rKGF), produkovaných v savčím expresním systému.

Lidský gen pro KGF byl izolován pomocí PCR, amplifíkací cDNA získané z buněk normálních kožních lidských fibrolastů (Clonetec, Inc., palo Alto, CA, USA). cDNA byla připravena pomocí reverzní transkriptázi a poté byla použita PCR k amplifikaci genu pro KGF. OLIGO 25 a OLIGO 26 byly použity k amplifikaci genu z cDNA a OLIGO 27 a OLIGO 28 byly pomocí druhé PCR amplifíkace použity k vnesení restrikčních míst Hinc\\\ a BgU na konce fragmentu, tak jak je vidět na obrázku 1.

OLIGO	25	ÍSEQ	ID	NO:69)
OLIGO	2δ	(SEQ	ID	N0:70)
OLIGO	27	(SEQ	ID	N0:71)
OLIGO	28	(SEQ	ID	NO:72)

5’-CAATCTACAATTCACAGA-3’

5¹-TTAAGTTATTGCCATAGG-3’

5'-AACAAAGCTTCTACAATTCACAGATAGGA-3’

5'-AACAAGATCTTAAGTTATTGCCATAGG-3'

Následovalo klonování a potvrzení sekvence DNA. Poté byl gen pro KGF použit. Amplifíkace byla provedena s použití OLIGO 29 a OLIGO30.

OLIGO 29 (SEQ. ID. N0:73):

5'-CGGTCTAGACCACCATGCACAAATGGATACTGACATGG-3'

OLIGO 30 (SEQ. ID. NO:74):

5¹-GCCGTCGACCTATTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3'

Primer - OLIGO 29 (sense primer) obsahoval místo Xbail a Kozákovu translační sekvenci (5'-CCACC-3') (consensud Kozák translationn sequence) před startovacím kodonem ATG ve směru k 5' konci. Antisence primer - OLIGO 30 - obsahoval klonovací místo Sal\ a další stop kodon. Po 18 cyklech amplifíkace PCR (30 sekund denaturace při 94 °C, 40 sekund annaeling při 55 °C a 40 sekund elongace při 72 °C) byl produkt štěpen ΑΖιαΙ a Sal\ a ligován se stejně vyštěpenou DNA z pDSRcc2 (podle metody Bourdrela et al. (1993), Protein Exp. and Purif, 4:130-140 a Lu et al. (1992), Arch. Biochem. Biophys. 298: 150-158). Výsledkem byl plazmid KGF/pDSRa2, v kterém byl lidský gen pro KGF umístěn mezi časný promotor SV40 a a-SSH

-24CZ 297328 B6 polyadenylovou sekvencí. Byly vybrány dva klony a analýzou sekvence DNA se potvrdila konstrukce žádaného vektoru.

Dva mikrogramy DNA KGF/pDSRa2 byly poté linearizovány s použitím Pvu\. CHO buňky (Chinese hamster overy cells) byly den před použitím vysety v množství 0,8 x 10⁶ buněk na 60 mm Petriho misku. Takto připravená vajíčka byla transfekována připravenou DNA s použitím standardní metody vysrážením pomocí vápenatých a fosfátových iontů (Bourdrel et al., viz předchozí text). Po dvou týdnech byly vybrány jednotlivé kolonie a přeneseny na 24 jamkové destičky. Upravená média se po dosažení konfluence považovala za prostá séra a aliquoty byly analyzovány s využitím Western blotů a s použitím polyklonálního králičího antiséra proti lidském KGF exprimovanému v E-coli.

Western bloty byly provedeny nanesením vzorku na 12,5 % (hm./obj.) SDS polyakrylamidové gely a následnou elektroforézou. Poté následovalo přenesení proteinů pomocí semidry elektroblotovacího zařízení (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA, USA) na nitrocelulózovou membránu. Přenesení probíhalo jednu hodinu při 400 mA. Jako přenosový pufr byl použit 20 mM Tris, 150 mM glycin a 20% metanol. Nitrocelulózové membrány byly blokovány inkubací v roztoku 10% normálního kozího séra v PBS. Jako primární protilátky bylo použito králičí antiserum připravené proti KGF z E-coli. Pro použití byly protilátky ředěny 1:10 000 v normálním kozím séru v PBS a inkubovány 12 hodin při pokojové teplotě s blokovanými nitrocelulózovými membránami. Nenavázané protilátky byly poté odstraněny třemi třicetiminutovými promytími v PBS.

Nitrocelulózové membrány byly poté inkubovány ve 100 ml roztoku 1% normálního kozího séra v PBS obsahujícího sekundární protilátky (Vectastain biotinylované kozí protilátky proti králičímu IgG, Vector Labs, Burlingame, USA). Inkubace probíhala 30 minut při pokojové teplotě. Následovalo trojnásobné desetiminutové promytí v PBS a poté 30 minutové inkubace při pokojové teplotě s 100 ml roztoku 1% normálního kozíko séra obsahujícího streptavidin s biotynylovanou peroxidázou, připravenou podle nároku výrobce (Vector Labs). Opět následovalo trojnásobné promytí v PBS. Látky křížově reagující s protilátkami proti KGF byly vizalizovány inkubací membrán ve směsi 60 μΐ 30% (hm./obj.) H₂O₂ ve 100 ml PBS a 50 mg 4-chlomaftolu ve 20 ml metanolu. Reakce byla zastavena po 10 minutách opláchnutím membrán ve vodě.

Analýza blotů ukázala, že specifické protilátky proti KGF reagují se třemi zřetelně oddělenými proužky proteinů. Dva z nich byly blízko sebe s molekulovou hmotností okolo 25 000 až 29 000 a jeden měl přibližnou molekulovou hmotnost 17 000, přičemž předpokládaná molekulová hmotnost konečného proteinu o 163 aminokyselinách byla 18 800. Několik vysoce exprimovaných klonů sekretujících více než 2,0 mg rKGF na litr (jak bylo možné odhadnout z analýzy Western blotů), bylo dále vyčleněno a přeneseno (podle metody Lu, et al., viz předchozí test) do lahví, kde byly pěstovány tak, aby výsledkem bylo velké množství média bez séra, vhodného k purifikaci KGF pomocí iontoměničové chromatografie s využitím katexu a následně gelové chromatografie podle postupu popsaného dále.

KGF bylo purifikováno ze třech litrů upraveného bezsérového média tak, že médium bylo přímo naneseno na iontoměničovou kolonu (5 x 24 cm) naplněnou 450 ml sulfoetyl SP-Sepharosy Fast Flow (Pharmacia), ekvilibrovanou 20 mM fosforečnanem sodným, pH 7,5. Po promytí kolony pětinásobným objemem kolony roztokem 20 mM fosforečnanu sodného, 0,2M NaCl, pH 7,5 byl rKGF vymyt lineárním gradientem od 0,2 do 1,0 M NaCl rozpuštěného v 20 mM fosforečnanu sodném (pH 7,5). Objem použitého roztoku se rovnal dvacetinásobku objemu kolony. Byly sbírány 50 ml frakce a byla průběžně monitorována absorbance při 280 nm. Protein KGF byl detekován analýzou částí každé frakce pomocí SDS-PAGE. SDS-PAGE byla prováděna s použitím předpřipravených 14% Tris-glycin gelů (podle metody Leamliho (1970), Nátuře, 227:680-685). Vzorky byly smíchány s neredukujícím SDS vzorkovým pufrem bez zahřívání před nanášením. Proteiny byly detekovány barvením Coomassie blue nebo barvením stříbrem. Dva píky, které byly eluovány později, obsahovaly proteinové proužky, odpovídající molekulové hmotnosti

-25 CZ 297328 B6

000 až 29 000 a proužky o hmotnosti 17 000, který byl detekován Western blotem. Frakce obsahující každý z těchto dvou píků byly separátně koncentrovány na objem menší než 1 ml a poté byly dále děleny gelovou filtrací.

Ke gelové filtraci byly použity kolony Superdexu-75 (HR 10/30 Pharmacia) ekvilibrované PBS o pH 7,2. Kolona byla nakalibrována s použitím následujících známých standardů molekulových vah (BioRad, San Francisco, CA, USA): thyroglobulin (670 000), gamaglobulin (158 000), ovalbumin (44 000), myoglobin (17 000) a vitamín B-12 (1400). Tyto purifikační kroky vedly k přibližně 2000 násobnému obohacení o rKGF, zvláště o 17 000 a 30 000 proteiny, jak ukázaly barvení stříbrem.

V případě látky s vyšší molekulovou hmotností, byl rKGF eluován jako celý symetrický pík (dle absorbance při 280 m), který byl nazýván KGF-a. Jestliže bylo pomocí SDS-PAGE analyzováno menší množství látek z této frakce (3pg/linii oproti 6pg/linii) objevily se dva proužky s rozdílem molekulových hmotností 1000 až 2000. V případě látek s nižší molekulové hmotnosti, které byly nazýváni KGF-b, vedla gelová filtrace k přípravě proteinu majícího předpokládanou pohyblivost. Pro oba typy proteinů (KGF-a i KGF-b) byla celková výtěžnost purifikace asi 30 až 40%.

Dále bylo analyzováno aminokyselinové složení KGF-a i KGF-b. Tyto analýzy byly provedeny na automatickém sekvenátoru (Model 477A nebo 470A, Applied Biosystm. Inc., Foster City, CA, USA) vybaveném on-lin PTH aminoanalyzátorem (Model 120A) a systémem sběru dat (Model 900A) (podle metody Lu et al., (1997), J. Biol. Chem., 266: 8102-8107). Edmanovy sekvenční analýzy KGF-a ukázaly N-terminální sekvenci X1-N-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-A-V-X2-X3S- (SEQ ID NO: 75). Minoritní sekvence začínající od třetí N-terminální aminokyseliny - kyseliny aspartamové - byly přítomny v množství 1,6% celkového sekvenovatelného proteinu. XI, X2 a X3 nebyly určeny z důvodů nepřítomnosti PTH (phenylthiohydantoinyl) aminokyselinového signálu během sekvenční analýzy.

Je zajímavé, že analýza sekvence N-terminálového konce KGF-b odhalila sekvenci S-Y-D-YM-E-G-G-D-l-R-V- (SEQ ID NO: 76), naznačující, že se jedná o formu KGF zkrácenou na N-terminálovém konci, kde byl KGF proteolyticky rozštěpen v peptidové vazbě Arg²³-Ser²⁴.

K další charakterizaci purifikovaných KGF-a a KGF-b byly proteiny za použití známých technik vystaveny působení glykosidáz (neuraminidáze, O-glycanáze a/nebo N-glykanáze) (Sasaki et al. (1987, J. Biol. Chem. 262-12059-12076; Takuchi et al. (1988), J. Biol. Chem. 263:3657-3663, Szebo et al. (1990), Cell, 63:195-201). Výsledky ukazují, že KGF-a obsahuje N- a O- vázané cukry, ačkoliv forma KGF-a s nižší molekulovou hmotností obsahuje pravděpodobně pouze N-vázané cukry. Použití glykosidáz nezpůsobilo snížení molekulové hmotnosti u KBF-b, což naznačuje, že molekula není glykosilovaná.

Glykosilace KGF-a byla dále charakterizována pomocí hmotové spektrometrie peptidů vzniklých působením endoproteázy Glu-C. Objasnění cukerné struktury glykopeptidů pomocí metody hmotové spektrometrické analýzy (stepped orifíce method) bylo s úspěchem použito na další proteiny (Huddleston et al. (1993), Anal. Chem., 65: 877-884; Carr et al. (1993), Prot. Sci., 2:183-196). Zdá se, že Thr²² je částečně glykosilovaný, což bylo potvrzením izolací neglykosylovaných peptidů. Podobná hmotová spektrometrická analýza Asn¹⁴ předpokládá mikroheterogenity v glykosilaci s bi, tri a tetra anténními strukturami, s různým stupněm sialylace.

Tabulka 3 shrnuje koncentrace KGF stimulující inkorporaci [³H]thymidinu keratinocytů právě poloviční rychlostí maximální rychlosti (podle metody Rubina et al. (1989, viz předchozí text). Interakce s receptory pro KGF byla stanovena s použitím membránové frakce obsahující receptory pro KGF byla stanovena s použitím membránové frakce obsahující receptory pro KGF. Tato frakce byla připravena z myších (Balb/MK) epidermálních keratinocytů (podle postupu popsaného Massaguem (19932), J. Biol. Chem., 258: 13614-13620). Konkrétně byly různé formy KGF zředěny 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, obsahujícím 0,2% hovězího serumalbuminu tak, aby koncent

-26CZ 297328 B6 race KGF byla v rozmezí od 0,8 ng do 100 ng na 50 μΐ. Poté byly jednotlivě inkubovány s membránovou frakcí (75 ng/ml) a KGF získaným z E—coli a značených ^l25I (1,5 ng). Experimenty s vazbou na receptor a kompetiční experimenty byly prováděny při 4 °C po dobu 16 hodin. Po této době byly vzorky odebrány, centrifugovány a promyty dvakrát výše uvedeným zřeďovacím pufrem. Účelem tohoto promytí bylo odstranění nenavázaného a nespecificky vázaného značeného KGF. Poté byla ve vzorcích měřena zbylá radioaktivita. Kompetiční křivky pro vazbu mezi KGF a značeným KGF byly vyneseny jako množství nevytěsněného KGF (v procentech) versus koncentrace každého vzorku KGF. Tabulka 3B shrnuje koncentrace KGF (v ng/ml) potřebné k dosažení 60% nevytěsnění proti značenému KGF (připravenému z £-co/z'.).

Tabulka 3 A

Koncentrace KGF stimulující inkorporaci [³H]thymidinu do keratinocytů při rychlosti rovnající se polovině rychlosti maximální

Formy	ng/ml
E-coli KGF	10
KGF - a	30
KGF - b	30

Tabulka 3B

Koncentrace KGF potřebné k dosažení 60% nevytěsnění proti značenému KGF získanému v E-coli.

Forma	ng/ml
KGF z E. coli	65,8
KGF-a	93,5
KGF-b	89,1

Jak je vidět v tabulce 3A KGF—a a KGF—b stimulují zabudovávání [³H] thymidinu srovnatelně přičemž koncentrace potřebná k dosažení poloviční rychlosti maximální rychlosti zabudovávání je pro oba analogy cca 30 ng/ml. Znamená to, že zkrácení molekuly nesnižuje jejich biologickou aktivitu. Tato dvě analoga mají přibližně třikrát nižší aktivitu než KGF získané z E-coli - KGF plné délky. Jak je vidě v tabulce 3B, kompetiční experimenty s použitím radioreceptorového testu ukazují, že KGF získané z E-coli, KGF-a KGF-b mají podobnou vazebnou aktivitu na receptor.

Příklad 4: Biologický test in vivo KGF polypeptidů produkovaných v savčích buněčných kulturách a buněčných kulturách E. coli

Bylo ukázáno, že jedna subkutánní dávka KGF vede u myši během čtyřiadvaceti hodin ke zvýšení koncentrace cholesterolu v séru a to v závislosti na velikosti dávky. Také nativní KGF, KGF-a, C(1,15)S. ΔΝ15 a ΔΝ23 zvyšují sérové cholesterol v závislosti na výšce dávky.

-27CZ 297328 B6

Každá testovací skupina obsahovala pět samic Balb/c myší (18-20 gm) získaných zCRL. Proteiny byly naředěny pomocí 0,9% izotonického roztoku tak, aby výsledný injektovaný objem byl

100 μΐ na myš. Každá myš byla ošetřena jednou podkožní injekcí obsahující následující dávky:

Skupina	Injekovaná látka	Velikost dávky (mg/kg)
1	Nativní KGF	0,1
	Nativní KGF	0,25
	Nativní KGF	0,5
	Nativní KGF	1
	Nativní KGF	5
2	C(1,15)S	0,1
	C(1,15)S	0,25
	C(1,15)S	0,5
	C(1,15)S	1
	C(1,15)S	5
3	ΔΝ15	0,25
	ΔΝ15	0,5
	ΔΝ15	1
	ΔΝ15	5
4	ΔΝ23	0,1
	ΔΝ23	0,5
	ΔΝ23	1
	ΔΝ23	5
5	KGF-a	0,01
	KGF-a	0,05
	KGF-a	0,1
	KGF-a	0,5
6	Kontrola (izoton. roztok)	-

Čtyřiadvacet hodin po injekci byly myši usmrceny a vykrváceny propíchnutím srdce. Ve vzorcích krve byl stanoven sérový cholesterol. Jak je vidět z obrázku 35, každý z testovaných analogů KGF měl účinek na zvýšení sérového cholesterolu v závislosti na velikosti dávky. Nebyl nalezen zřejmý rozdíl v bioaktivně mezi kterýmkoliv z testovaných analogů KGF.

In vivo model diabetů

Chemicky indukované modely diabetes mellitus v různých živočišných druzích byly klasicky používány ke stadiu této nemoci a k její ošetření. Streptozotocin indukuje diabates u myši, krysy,

-28CZ 297328 B6 křečka, psa a opice, ačkoliv studie používající krysy a myši jsou nečastější (Junod et al., Proč. Soc. Exp. Pio. Med. 126: 210-205 (1967); Rerup, Pharm. Rev. 22:485-518 (1970); Rossini et al., P:N:A:A: 74:2485-2489 (1977); Ar'Rajab and Ahren, Pancreas 8:50-57 (1993). Dávka streptozotocinu (45 až 70mg/kg) podaná jako jedna podkožní injekce vyvolává u krys stabilní onemoc5 nění. Dávky pod 45 mg/kg vyvolávají přechodný stav, který je vratný. Během jednoho dne po podání straptozotocinu je indukován hyperglykemický stav. Hladina inzulínu v krvi zůstává v podstatě nezměněna v porovnání s normálními krysami, ale celkový obsah inzulínu a C-peptidu v pankreasu je velice snížen. Krysy manifestují klasické znaky a symptomy diabetů lidí: zvýšená hladina glukózy v krvi (hyperglykémie), glukóza v moči (glukosurie), zvýšená žíznivost 10 (polydipsie), zvýšená tvorba moči (polyurie), zvýšená chuť k jídlu (hyperphagie).

Studie popisované v tomto vynálezu byly prováděny na modelových krysách Sprague-Dawley s streptozotocinem indukovaným diabetem. Na počátku pokusu byly použity samci krys vážící 200-260 gramů. Diabetes byl indukován jedinou intravenózní injekcí streptozotocinu rozpuště15 ného v citrátovém pufru (sodná sůl kys. citrónové) (dávka byla 50 mg streptozotocinu na kg tělesné váhy). Zdravé kontrolní krysy byly ošetřeny jednou intravenózní injekcí pufru citrátu sodného jako kontroly. KGF byl podáván denně jako podkožní injekce. Dávka byla 3 nebo 5 mg/kg/den v závislosti na experimentu. V prvním experimentu byla terapie pomocí KGF započata dva dny před indukcí diabetů a pokračovala po indukci až do celkového množství osmi 20 injekcí. Ve druhém a třetím experimentu byla KGF terapie (podávána podkožně) započata jeden den po indukci diabetů streptozotocinem. Ve čtvrtém experimentu byla sedmidenní KGF terapie zahájena sem dní po aplikaci streptozotocinu a zvířata byla poté sledována dalších 12 týdnů. Ve všech experimentech s výjimkou čtvrtého experimentu byly pro analýzy určeny hladina glukózy v krvi, hladina glukózy v moči a množství moči. Navíc byly v některých experimentech sledo25 vány příjem vody, hladina C-peptidu v moči nebo celkové množství inzulínu nebo C-peptidu v pankresu. Ve čtvrtém experimentu byla jako jediná hodnota sledována hladina glukózy v krvi. Protože je velká frakce inzulínu odstraněna z krevního oběhu játry je měření koncentrací periferního inzulínu odkazem dějů post-hepatitického metabolismu, spíše než sekrece insulinu z pakreasu. Proto je měření C-peptidu často děláno a používáno jako periferní markér sekrece 30 inzulínu. C-peptid je produkován při procesu tvorby inzulínu z pro-inzulínu. Inzulín a C-peptid jsou extrahovány játry.

Tato studie se zabývala vlivem rKGF na diabetes indukovaný streptozotocinem u krys Sprague-Dawley. V den 0 byla skupina krys exprimována dávce 45 nebo 50 mg/kg streptozoto35 činu (STZ) Po tomto zákroku byla u krys denně sledována hladina glukózy s cílem stanovit rozsah indukce diabetes. Pátý den byla zvířata ošetřená STZ rozdělena do dvou skupin v závislosti na rozsahu hyperglykémie. Dělící bod byl stanoven na hladinu glukózy v krvi rovnající se 300 mg/dl. Skupina zvířat nevystavených působení STZ sloužila jako kontrolní. Sedmý den byla deseti zvířatům z každé hyperglykemické skupiny podána dávka ΔΝ23 (3 mg/kg/den) nebo PBS 40 ve formě podkožní inekce. Hladina glukózy byla poté sledována denně, každý druhý den nebo týdně (výsledky jsou zobrazeny na obrázku 51). Je vidět, že u zvířat vystavených působení STZ zobou skupin signifikantně poklesla hladina glukózy po dobu podávání ΔΝ23. Je důležité, že průměrná hladina glukózy poklesla u zvířat, která měla na počátku hladiny glukózy vyšší než 300 mg/dl na stabilní hodnotu okolo 150 mg/dl, kdežto u zvířat, která měla na počátku hladinu 45 glukózy nižší než 300 mg/dl, klesla hladina glukózy pouze přechodně. Je třeba si též všimnout, že denní rozsah není lineární.

Předkládaný vynález byl výše popsán obecně i na konkrétních příkladech. Je zřejmé, že odborníci odhalí další obměny a modifikace výše popsaných postupů.

-29CZ 297328 B6

Seznam sekvencí (1) Základní informace:

(i) Žadatel: Amgen lne.

(ii) Název vynálezu: Analoga keratinocytových růstových faktorů (iii) Počet sekvencí: 104 (iv) Korespondenční adresa:

(A) Adresát: Amgen lne.

(B) Ulice: 1840 Dehavilland Drive (C) Město: Thousand Oaks (D) Stát: Califomia (E) Země: U.S.A.

(F) ZIP:91320-1789 (v) Forma vhodná pro počítačové zpracování (A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release 1.0, Version 1.30 (vi) Současné údaje o žádosti (A) Číslo žádosti: PCT/IB95/00971 (B) Datum registrace. 12.10.1995 (C) Klasifikace:

(vii) Předchozí údaje o žádosti (A) Číslo žádosti: 08,487,825 (B) Datum registrace: 7.6. 1995 (C) Klasifikace:

(vii) Předchozí údaje o žádosti (A) Číslo žádosti: 08/323,475 (B) Datum registrace: 13.10. 1994 (C) Klasifikace:

(vii) Předchozí údaje o žádosti (A) Číslo žádosti: 08/323,340 (B) Datum registrace: 13.10. 1994 (C) Klasifikace:

(viii) Právní zástupce/zástupce pro informace (A) Jméno: Zindrick, Thomas D.

(B) Registrační číslo: 32,185 (C) Číslo spisu: A-315 (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 862 párů bází

-30CZ 297328 B6 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

CAATCTACAA	TTCACAGATA	GGAAGAGGTC	AATGACCTAG	GAGTAACAAT	CAACTCAAGA	60
TTCATTTTCA	TTATGTTATT	CATGAACACC	CGGAGCACTA	CACTATAATG	CACAAATGGA	120
TACTGACATG	GATCCTGCCA	ACTTTGCTCT	ACAGATCATG	CTTTCACATT	ATCTGTCTAG	130
TGGGTACTAT	ATCTTTAGCT	TGCAATGACA	TGACTCCAGA	GCAAATGGCT	ACAAATGTGA	240
ACTGTTCCAG	CCCTGAGCGA	CACACAAGAA	GTTATGATTA	CATGGAAGGA	GGGGATATAA	300
GAGTGAGAAG	ACTCTTCTGT	CGAACACAGT	GGTACCTGAG	gatcgataaa	AGAGGCAAAG	360
TAAAAGGGAC	CCAAGAGATG	AAGAATAATT	ACAATATCAT	GGAAATCAGG	ACAGTGGCAG	420
TTGGAATTGT	GGCAATCAAA	GGGGTGGAAA	GTGAATTCTA	TCTTGCAATG	AACAAGGAAG	480
GAAAACTCTA	TGCAAAGAAA	GAATGCAATG	AAGATTGTAA	CTTCAAAGAA	CTAATTCTGG	540
AAAACCATTA	CAACACATAT	GCATCAGCTA	AATGGACACA	CAACGGAGGG	GAAATGTTTG	600
TTGCCTTAAA	TCAAAAGGGG	ATTCCTGTAA	GAGGAAAAAA	AACGAAGAAA	GAACAAAAAA	660
CAGCCCACTT	TCTTCCTATG	GCAATAACTT	AATTGCATAT	GGTATATAAA	GAACCCAGTT	720
CCAGCAGGGA	GATTTCTTTA	AGTGGACTGT	TTTCTTTCTT	CTCAAAATTT	TCTTTCCTTT	730
TATTTTTTAG	TAATCAAGAA	AGGCTGGAAA	AACTACTGAA	AAACTGATCA	AGCTGGACTT	340
GTGCATTTAT	GTTTGTTTTA	AG				362

-31 CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 194 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein o

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

Met 1

His

Lys Trp Ile Leu 5

Thr Trp

Ile Leu 10

Pro Thr

Leu

Leu

Tyr 15

Arg

Ser

Cys

Phe

His

Ile

ile

Cys

Leu

Val

Gly

Thr

Ile

Ser

Leu

Ala

Cys

20

25

30

Asn

Asp

Met

Thr

Pro

Glu

Gin

Met

Ala

Thr

Asn

val

Asn

Cys

Ser

Ser

35

40

45

Pro

Glu

Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

Gly

Asp

Ile

50

55

60

Arg

Val

Arg

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

65

70

75

00

Lys

Arg

Gly

Lys

val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

85

90

95

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

100

105

110

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

115

120

125

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

ile

Leu

130

135

140

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

145

150

155

160

Gly

Glu

Met

Phe

Vel

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

165

170

175

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

180 185 190

Ile Thr

-32CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 595 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámu (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

ATCGATTTGA	TTCTAGAAGG	AGGAATAACA	tatgaaaaag	CGCGCACGTG	CTATCGCCAT	60
TGCTGTGGCT	CTGGCAGGTT	TCGCAACTAG	TGCACACGCG	TGCAATGACA	TGACTCCAGA	120
GCAAATGGCT	ACAAATGTGA	ACTGTTCCAG	CCCTGAGCGA	CACACAAGAA	GTTATGATTA	130
CATGGAAGGA	GGGGATATAA	GAGTGAGAAG	ACTCTTCTGT	CGAACACAGT	GGTACCTGAG	240
GATCGATAAA	AGAGGCAAAG	TAAAAGGGAC	CCAAGAGATG	AAGAATAATT	ACAATATCAT	300
GGAAATCAGG	ACAGTGGCAG	TTGGAATTGT	GGCAATCAAA	GGGGTGGAAA	GTGAATTCTA	360
TCTTGCAATG	AACAAGGAAG	GAAAACTCTA	TGCAAAGAAA	GAATGCAATG	AAGATTGTAA	420
CTTCAAAGAA	CTAATTCTGG	AAAACCATTA	CAACACATAT	GCATCAGCTA	AATGGACACA	480
CAACGGAGGG	GAAATGTTTG	TTGCCTTAAA	TCAAAAGGGG	ATTCCTGTAA	GAGGAAAAAA	540
AACGAAGAAA	GAACAAAAAA	CAGCCCACTT	TCTTCCTATG	GCAATAACTT	AATAG	595

(2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 186 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

Met

Lys

Lys

Arg

Ala

Arg

Ala

Ile

Ala

ile

Ala

Val

Ala

Leu

Ala

Gly

1

5

10

15

Phe

Ala

Thr

Ser

Ala

His

Ala

Cys

Asn

Asp

Met

Thr

Pro

Glu

Gin

Met

20

25

30

Ala

The

Asn

Val

Asn

Cys

Ser

Ser

Pro

Glu

Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

35

40

45

CL 297328 B6

A3p

Tyr Met 50

Glu

Gly Gly

A3p 55

Ile

Arg

Val

Arg Arg 60

Leu Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ila

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

6 S

70

75

80

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

85

90

95

Val

Gly

Ila

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

100

105

110

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

115

120

125

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

130

135

140

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

145

150

155

160

Gin

Lys

Gly

Ila

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

165

170

175

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

180

185

(2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 499 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá o

(ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

TATGTGCAAT GACATGACTC CAGAGCAAAT GGCTACAAAT	GTGAACTGTT CCAGCCCTGA	60
GCGACACACA AGAAGTTATG ATTACATGGA AGGAGGGGAT	ATAAGAGTGA GAAGACTCTT	120
CTGTCGAACA CAGTGGTACC TGAGGATCGA TAAAAGAGGC	AAAGTAAAAG GGACCCAAGA	130
GATGAAGAAT AATTACAATA TCATGGAAAT CAGGACAGTG	GCAGTTGGAA TTGTGGCAAT	240
CAAAGGGGTG GAAAGTGAAT TCTATCTTGC AATGAACAAG	GAAGGAAAAC TCTATGCAAA	300

-34CZ 297328 B6 gaaagaatgc

AATGAAĚATT

GTAACTTCAA

AGAACTAATT

CTGGAAAACC

ATTACAACAC

360 atatgcatca

GCTAAATGGA

CACACAACGG

AGGGGAAATG

TTTGTTGCCT

TAAATCAAAA

420

GGGGATTCCT

GTAAGAGGAA

AAAAAACGAA

GAAAGAKCAA

AAAACAGCCC

ACTTTCTTCC

480

TATGGCAATA

ACTTAATAG

499 (2) Informace o SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 164 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý ío (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

Met 1

Cys

Asn

Asp Met Thr 5

Peo Glu

Gin

Met Ala 10

Thr

Asn Val

Asn 15

Cys

Ser

Ser

Pro

Glu 20

Arg His

Thr

Arg

Ser 25

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu 30

Gly

Gly

Asp

Ile

Arg 35

Val

Arg Arg

Leu

Phe 40

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp 45

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp 50

Lys

Arg

Gly Lys

Val 55

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu 60

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr 65

Asn

11·

Mat

Glu Ile 70

Arg

Thr

Val

Ala

Val 75

Gly

Ile

Val

Ala

Ile 80

Lys

Gly

Val

Glu

Ser Glu 95

Phe

Tyr

Leu

Ala 90

Met

Asn

Lys

Glu

Gly 95

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys 100

Lys Glu

Cys

Asn

Glu 105

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys 110

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu 115

Asn

His Tyr

Asn

Thr 120

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys 125

Trp

Thr

His

Asn

Gly 130

Gly

Glu

Met Phe

val 135

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys 140

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Lys

Thr Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

	145	150	155	160
15	Met Ala Ile Thr

-35i (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 25 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

CAATGACCTA GGAGTAACAA TCAAC 25 (2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 26 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

AAAACAAACA TAAA7GCACA AGTCCA (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 26 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

ACAACGCGTG CAATGACATG ACTCCA 26 (2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 31 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA

-36CZ 297328 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

ACAGGATCCT ATTAAGTTAT TGCCATAGGA A (2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 27 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

ACACATATGT GCAATGACAT GACTCCA 27 (2) Informace o SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 37 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

CTGCGTATCG ACAAACGCGG CAAAGTCAAG GGCACCC (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 44 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (íí) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

AAGAGATGAA AAACAACTAC AATATTATGG AAATCCGTAC TGTT (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i) Charakteristika sekvence

-37CZ 297328 B6 (A) Délka: 37 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:

GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT GAATCTG (2) Informace o SEQ ID NO: 15:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 45 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

“CTTGGGTGC CCTTGACITT GCCGCGTTTG TCGATACGCA GGTAC 45 (2) Informace o SEQ ID NO: 16:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 45 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

ACAGCAACAG TACGGATTTC C AT AAT ATT G TAGTTGTTTT TCATC (2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 36 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

-38CZ 297328 B6

AATTCAGATT CAACACCTTT GATTGCAACG ATACCA (2) Informace o SEQ ID NO: 18:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

AGTTTTGATC TAGAAGGAGG (2) Informace o SEQ ID NO: 19:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

TCAAAACTGG ATCCTATTAA (2) Informace o SEQ ID NO: 20:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 91 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:

AGTTTTGATC TAGAAGGAGG AATAACATAT GTGCAACGAC ATGACTCCGG AACAGATGGC

TACCAACGTT AACTGCTCCA GCCCGGAACG T (2) Informace o SEQ ID NO: 21:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 90 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý

-39CZ 297328 B6 (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:

CACACCCGTA GCTACGACTA CATGGAAGGT GGTGACATCC GTGTTCGTCG TCTGTTCTGC 60

CGTACCCAGT GGTACCTGCG TATCGACAAA ⁹⁰ (2) Informace o SEQ ID NO: 22:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 90 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:

CGTGGTAAAG TTAAAGGTAC CCAGGAAATG AAAAACAACT ACAACATCAT GGAAATCCGT 60

ACTGTTGCTG 1TGGTATCGT TGCAATCAAA 90 (2) Informace o SEQ ID NO: 23:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 90 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:

GGTGTTGAAT CTGAAITCTA CCTGGCAATG AACAAAGAAG GTAAACTGTA CGCAAAAAAA 60

GAATGCAACG AAGACTGCAA CTTCAAAGAA 50 (2) Informace o SEQ ID NO: 24:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 90 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA

-40CZ 297328 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:

CTGATCCTGG aaaaccacta caacacctac gcatctgcta aatggaccca CAACGGTGGT eo

GAAATGTTCG TTGCTCTGAA CCAGAAAGGT (2) Informace o SEQ ID NO: 25:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 88 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:

ATCCCGGTTC GTGGTAAAAA AACCAAAAAA GAACAGAAAA CCGCTCACTT CCTGCCGATG 60

GCAATCACTT AATAGGATCC AGTTTTGA gg (2) Informace o SEQ ID NO: 26:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:

TACGGGTGTG ACGTTCCGGG (2) Informace o SEQ ID NO: 27:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 27:

CTTTACCACG TTTGTCGATA

-41 CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 28:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 28:

ATTCAACACC TTTGATTGCA (2) Informace o SEQ ID NO: 29:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 29:

CCAGGATCAG TTCTTTGAAG (2) Informace o SEQ ID NO: 30:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 30:

GAACCGGGAT ACCTTTC7GG (2) Informace o SEQ ID NO: 31:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 495 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA

-42CZ 297328 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 31:

ATGTCTAATG	ATATGACTCC	GGAACAGATG	GCTACCAACG	TTAACTCCTC	CTCCCCGGAA	60
CGTCACACGC	GTTCCTACGA	CTACATGGAA	GGTGGTGACA	TCCGCGTACG	TCGTCTGTTC	120
TGCCGTACCC	AGTGGTACCT	GCGTATCGAC	AAACGCGGCA	AAGTCAAGGG	CACCCAAGAG	iao
ATGAAAAACA	ACTACAATAT	TATGGAAATC	CGTACTGTTG	CTGTTGGTAT	CGTTGCAATC	240
AAAGGTGTTG	AATCTGAATT	CTACCTGGCA	ATGAACAAAG	AAGGTAAACT	GTACGCAAAA	300
AAAGAATGCA	ACGAAGACTG	CAACTTCAAA	GAACTGATCC	TGGAAAACCA	CTACAACACC	360
TACGCATCTG	CTAAATGGAC	CCACAACGGT	GGTGAAATGT	TCGTTGCTCT	GAACCAGAAA	420
GGTATCCCGG	TTCGTGGTAA	AAAAACCAAA	AAAGAACAGA	AAACCGCTCA	CTTCCTGCCG	490
ATGGCAATCA	CTTAA					495

(2) Informace o SEQ ID NO: 32:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 164 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 32:

Met Ser Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Ser

10 15

Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser

Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly

-43 CZ 297328 B6

Asp

Ile

Arg 35

Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg

40

45

Ile

Asp

Lys

Arg Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

50

55

60

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

65

70

75

80

Lys

Gly

val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

85

90

95

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

100

105

110

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

115

120

125

Asn

Gly

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

130

135

140

Arg

Gly

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

145

150

155

160

Met Ala Ile Thr (2) Informace o SEQ ID NO: 33:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 483 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 33:

ATGACTCCGG AACAGATGGC TACCAACGTT AACTCCTCCT CCCCGGAACG TCACACGCGT	60
TCCTACGACT ACATGGAAGG TGGTGACATC CGCGTACGTC GTCTGTTCTG CCGTACCCAG	120
TGGTACCTGC GTATCGACAA ACGCGGCAAA GTCAAGGGCA CCCAAGAGAT GAAAAACAAC	180
TACAATATTA TGGAAATCCG TACTGTTGCT GTTGGTATCG TTGCAATCAA AGGTGTTGAA	240
TCTGAATTCT ACCTGGCAAT GAACAAAGAA GGTAAAČTGT ACGCAAAAAA AGAATGCAAC	300
GAAGACTGCA ACTTCAAAGA ACTGATCCTG GAAAACCACT ACAACACCTA CGCATCTGCT	360
AAATGGACCC ACAACGGTGG TGAAATGTTC GTTGCTCTGA ACCAGAAAGG TATCCCGGTT	420
CGTGGTAAAA AAACCAAAAA AGAACAGAAA ACCGCTCACT TCCTGCCGAT GGCAATCACT	480

TAA 433

-44CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 34:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 160 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 34:

Met Thr 1

Pro Glu

Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Ser Ser Ser Pro Glu

5

10

15

Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

Gly

Asp

Ile

Arg

Val

20

25

30

Arg Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

ASp

Lys

Arg

35

40

45

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

50

55

60

Glu

11«

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

ile

Val

Ala

Ile

Lya

Gly

Val

Glu

65

70

75

80

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

85

90

95

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

ile

Leu

Glu

Asn

100

105

110

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly

Glu

115

120

125

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Lys

130

135

140

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

145

150

155

160

(2) Informace o SEQ ID NO: 35:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 480 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: .35:

atgactccgg	AACAGATGGC	TACCAACGTT	AACTCTTCTC	CTGAACGTCA	TACGCGTTCC	60
TACGACTACA	TGGAAGGTGG	TGACATCCGC	GTACGTCGTC	TGTTCTGCCG	TACCCAGTGG	120
TACCTGCGTA	TCGACAAACG	CGGCAAAGTC	AAGGGCACCC	AAGAGATGAA	AAACAACTAC	180
AATATTATGG	AAATCCGTAC	TGTTGCTGTT	GGTATCGTTG	CAATCAAAGG	TGTTGAATCT	240
GAATTCTACC	TGGCAATGAA	CAAAGAAGGT	AAACTGTACG	CAAAAAAAGA	ATGCAACGAA	300
GACTGCAACT	TCAAAGAACT	GATCCTGGAA	AACCACTACA	ACACCTACGC	ATCTGCTAAA	3 60
TGGACCCACA	ACGGTGGTGA	AATGTTCGTT	GCTCTGAACC	AGAAAGGTAT	CCCGGTTCGT	420
GGTAAAAAAA	CCAAAAAAGA	ACAGAAAACC	GCTCACTTCC	TGCCGATGGC	AATCACTTAA	480

(2) Informace o SEQ ID NO: 36:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 159 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein

(xi)

Popis

sekvence: SEQ ID NO: 36:

Met

Thr

Pro Glu

Gin Met Ala

Thr

Asn

Val

Asn

Ser

Ser

Pro

Glu

Arg

1

5

10

15

His

Thr

Arg Ser

Tyr Asp Tyr

Met

Glu

Gly

Gly

Asp

Ile

Arg

Val

Arg

20

25

30

-46CZ 297328 B6

Arg Leu Phe 35

Cys

Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly

40

45

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

50

55

60

Ile

Arg

Thr

val

Ala

val

Gly

ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

65

70

75

80

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

85

90

95

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

100

105

110

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly

Glu

Met

115

120

125

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly Lys

Lys

Thr

130

135

140

Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

145

150

155

(2) Informace o SEQ ID NO: 37:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 468 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá o

(ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 37:

atggctacta atgttaactc CTCTTCTCCT GAACGTCATA CGCGTTCCTA CGACTACATG 60 GAAGGTGGTG ACATCCGCGT ACGTCGTCTG TTCTGCCGTA CCCAGTGGTA CCTGCGTATC 120 GACAAACGCG GCAAAGTCAA GGGCACCCAA GAGATGAAAA ACAACTACAA TATTATGGAA 180 ATCCGTACTG TTGCTGTTGG TATCGTTGCA ATCAAAGGTG TTGAATCTGA ATTCTACCTG 240 GCAATGAACA AAGAAGGTAA ACTGTACGCA AAAAAAGAAT GCAACGAAGA CTGCAACTTC 300 AAAGAACTGA TCCTGGAAAA CCACTACAAC ACCTACGCAT CTGCTAAATG GACCCACAAC 360 GGTGGTGAAA TGTTCGTTGC TCTGAACCAG AAAGGTATCC CGGTTCGTGG TAAAAAAACC 420 AAAAAAGAAC AGAAAACCGC TCACTTCCTG CCGATGGCAA TCACTTAA ⁴⁶⁸

-47CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 38:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 155 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 38:

Met

Ala

Thr

Asn

Val

Asn

Ser

Ser

Ser

Pro

Glu

Arg

His

Thr

Arg

Ser

1

5

10

15

Tyr

ASp

Tyr

Met

Glu

Gly

Gly

Asp

Ile

Arg

Val

Arg

Arg

Leu

Phe

Cys

20

25

30

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

35

40

45

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

50

55

60

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

65

70

75

80

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

85

90

95

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

100

105

110

Ala

Ser

Al*

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

115

120

125

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin

130

135

140

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

145 150 155 (2) Informace o SEQ ID NO: 39:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 465 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 39:

ATGGCTACTA ATGTTAACTC TTCTCCTGAA CGTCATACGC GTTCCTACGA CTACATGGAA	60
GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC	120
AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG ATGAAAAACA ACTACAATAT TATGGAAATC	180
CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC AAAGGTGTTG AATCTGAATT CTACCTGGCA	240
ATGAACAAAG AAGGTAAACT GTACGCAAAA AAAGAATGCA ACGAAGACTG CAACTTCAAA	300
GAACTGATCC TGGAAAACCA CTACAACACC TACGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT	360
GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA GGTATCCCGG TTCGTGGTAA AAAAACCAAA	420
AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG ATGGCAATCA CTTAA	465

(2) Informace o SEQ ID NO: 40:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 154 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 40:

Met

Ala

Thr

Asn

Val

Asn Ser

Ser

Pro

Glu

Arg His

Thr

Arg

Ser

Tyr

1

5

10

15

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

Gly Asp

Ile

Arg

Val

Arg Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

20

25

30

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg Ile

Asp

Lys

Arg

Gly Lys

Val

Lys

Gly

Thr

35

40

45

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn Tyr

Asn

Ile

Met

Glu Ile

Arg

Thr

Val

Ala

55 60

-49CZ 297328 B6

Val 65

Gly Ile Val

Ala

Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala 80

70

75

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

85

90

95

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

100

105

110

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

115

120

125

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

130

135

140

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

145 150 (2) Informace o SEQ ID NO: 41:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 450 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý ío (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 41:

ATGTCTTCTC CTGAACGTCA TACGCGTTCC TACGACTACA TGGAAGGTGG TGACATCCGC	60
GTACGTCGTC TGTTCTGCCG TACCCAGTGG TACCTGCGTA TCGACAAACG CGGCAAAGTC	120
AAGGGCACCC AAGAGATGAA AAACAACTAC AATATTATGG AAATCCGTAC TGTTGCTGTT	iao
GGTATCGTTG CAATCAAAGG TGTTGAATCT GAATTCTACC TGGCAATGAA CAAAGAAGGT	240
AAACTGTACG CAAAAAAAGA ATGCAACGAA GACTGCAACT TCAAAGAACT GATCCTGGAA	300
AACCACTACA ACACCTACGC ATCTGCTAAA TGGACCCACA ACGGTGGTGA AATGTTCGTT	360
GCTCTGAACC AGAAAGGTAT CCCGGTTCGT GGTAAAAAAA CCAAAAAAGA ACAGAAAACC	420
GCTCACTTCC TGCCGATGGC AATCACTTAA	450

-50CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 42:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 149 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein o

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 42:

Met Ser Ser Pro 1

Glu 5

Arg His Thr

Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly

10

15

Gly

Asp

Zle

Arg

Val

Arg

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

20

25

30

Arg

Zle

Asp

Lys

Arg Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

35

40

45

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

50

55

60

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

65

70

75

ao

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

85

90

95

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

100

105

110

His

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

ile

Pro

115

120

125

Val

Arg

Gly Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

130

135

140

Pro Met Ala Ile Thr

145

-51 CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 43:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 447 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 43:

ATGTCTCCTG AACGTCATAC GCGTTCCTAC GACTACATGG AAGGTGGTGA CATCCGCGTA	60
CGTCGTCTGT TCTGCCGTAC CCAGTGGTAC CTGCGTATCG ACAAACGCGG CAAAGTCAAG	120
GGCACCCAAG AGATGAAAAA CAACTACAAT ATTATGGAAA TCCGTACTGT TGCTGTTGGT	180
ATCGTTGCAA TCAAAGGTGT TGAATCTGAA TTCTACCTGG CAATGAACAA AGAAGGTAAA	240
CTGTACGCAA AAAAAGAATG CAACGAAGAC TGCAACTTCA AAGAACTGAT CCTGGAAAAC	300
CACTACAACA CCTACGCATC TGCTAAATGG ACCCACAACG GTGGTGAAAT GTTCGTTGCT	360
CTGAACCAGA AAGGTATCCC GGTTCGTGGT AAAAAAACCA AAAAAGAACA GAAAACCGCT	420
CACTTCCTGC CGATGGCAAT CACTTAA	447

(2) Informace o SEQ ID NO: 44:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 148 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 44:

Met Ser Pra Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly

1

5

10

15

Asp

11·

Arg

Val

Arg

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

20

25

30

lle

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

35

40

45

Tyr

Asn

lle

Met

Glu

lle

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

lle

Val

Ala

lle

50

55

60

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lya

65

70

75

80

-52CZ 297328 B6

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys 85

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp 90

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu 95

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn 100

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr 105

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp 110

Thr

His

Asn

Gly

Gly 115

Glu

Met

Phe

val

Ala 120

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly 125

Ile

Pro

Val

Arg

Gly 130

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys 135

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala 140

His

Phe

Leu

Pro

Met Ala Ile Thr

145 (2) Informace o SEQ ID NO: 45:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 444 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 45:

ATGCCTGAAC GTCATACGCG TTCCTACGAC TACATGGAAG GTGGTGACAT CCGCGTACGT 60 CGTCTGTTCT GCCGTACCCA GTGGTACCTG CGTATCGACA AACGCGGCAA AGTCAAGGGC 120 ACCCAAGAGA TGAAAAACAA CTACAATATT ATGGAAATCC GTACTGTTGC TGTTGGTATC 130 GTTGCAATCA AAGGTGTTGA ATCTGAATTC TACCTGGCAA TGAACAAAGA AGGTAAACTG 240 TACGCAAAAA AAGAATGCAA CGAAGACTGC AACTTCAAAG AACTGATCCT GGAAAACCAC 300 TACAACACCT ACGCATCTGC TAAATGGACC CACAACGGTG GTGAAATGTT CGTTGCTCTG 360 AACCAGAAAG GTATCCCGGT TCGTGGTAAA AAAACCAAAA AAGAACAGAA AACCGCTCAC 420 TTCCTGCCGA TGGCAATCAC TTAA 444 (2) Informace o SEQ ID NO: 46:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 147 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 46:

-53 CZ 297328 B6

Mac Pro 1

Glu

Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp

Tyr

Met Glu Gly

Gly 15

Asp

5

10

Ile

Arg

Val

Arg

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

ile

20

25

30

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

35

40

45

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ila

Val

Ala

Ile

Lys

50

55

60

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

65

70

75

80

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

85

90

95

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

100

105

110

Gly

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ila

Pro

Val

Arg

115

120

125

Gly

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

130

135

140

Ala Ila Thr

145 (2) Informace o SEQ ID NO: 47:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 441 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá ío (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 47:

ATGGAACGTC ATACGCGTTC CTACGACTAC ATGGAAGGTG GTGACATCCG CGTACGTCGT

CTGTTCTGCC GTACCCAGTG GTACCTGCGT

ATCGACÁAAC GCGGCAAAGT CAAGGGCACC

120

-54CZ 297328 B6

CAAGAGATGA	AAAACAACTA	CAATATTATG	C-AAATCCGTA	CTGTTGCTGT	TGGTATCGTT	iao
GCAATCAAAG	GTGTTGAATC	TGAATTCTAC	CTGGCAATGA	ACAAAGAAGG	TAAACTGTAC	2 40
GCAAAAAAAG	AATGCAACGA	AGACTGCAAC	TTCAAAGAAC	TGATCCTGGA	AAACCACTAC	300
AACACCTACG	CATCTGCTAA	ATGGACCCAC	AACGGTGGTG	AAATGTTCGT	TGCTCTGAAC	360
CAGAAAGGTA	TCCCGGTTCG	TGGTAAAAAA	ACCAAAAAAG	AACAGAAAAC	CGCTCACTTC	420
CTGCCGATGG	CAATCACTTA	A				441

(2) Informace o SEQ ID NO: 48:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 146 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 48:

Met 1

Glu Arg

His

Thr Arg Ser Tyr Asp 5

Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile

10

15

Arg

Val

Arg

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

20

25

30

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

35

40

45

Ile

Met

Glu

XI·

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

val

Ala

Ile

Lys

Gly

50

55

60

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

65

70

75

80

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

85

90

95

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

100

105

110

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

C-ln

Lys

Gly

Ile

Pra

Val

Arg

Gly

15

115

120

125

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

130	135	140
Ile Thr 145

-55CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 49:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 438 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 49:

ATGCGTCATA CGCGTTCCTA CGACTACATG

TTCTGCCGTA CCCAGTGGTA CCTGCGTATC

GAGATGAAAA ACAACTACAA TATTATGGAA

ATCAAAGGTG TTGAATCTGA ATTCTACCTG

AAAAAAGAAT GCAACGAAGA CTGCAACTTC

ACCTACGCAT CTGCTAAATG GACCCACAAC

AAAGGTATCC CGGTTCGTGG TAAAAAAACC

CCGATGGCAA TCACTTAA (2) Informace o SEQ ID NO: 50:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 145 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 50:

GAAGGTGGTG ACATCCGCGT ACGTCGTCTG60

GACAAACGCG GCAAAGTCAA GGGCACCCAA120

ATCCGTACTG TTGCTGTTGG TATCGTTGCA130

GCAATGAACA AAGAAGGTAA ACTGTACGCA2 40

AAAGAACTGA TCCTGGAAAA CCACTACAAC300

GGTGGTGAAA TGTTCGTTGC TCTGAACCAG360

AAAAAAGAAC AGAAAACCGC TCACTTCCTG420

438

-56CZ 297328 B6

Met ·< k

Arg

His

Thr Arg 5

Ser Tyr Asp

Tyr Met Glu 10

Gly

Gly

Asp

Ile 15

Arg

Val

Arg

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

20

25

30

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

Ile

35

40

45

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

50

55

60

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

65

70

75

80

Lys

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

95

90

95

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Gly

100

105

110

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg Gly

Lys

115

120

125

Lys

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

130 135 140

Thr

145

-57CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 51:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 435 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 51:

ATGCATACTC GTTCCTACGA CTACATGGAA GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC	60
TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG	120
ATGAAAAACA ACTACAATAT TATGGAAATC CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC	180
aaaggtgttg AATCTGAATT CTACCTGGCA ATGAACAAAG AAGGTAAACT GTACGCAAAA	240
AAAGAATGCA ACGAAGACTG CAACTTCAAA GAACTGATCC TGGAAAACCA CTACAACACC	300
tacgcatctg ctaaatggac ccacaacggt ggtgaaatgt tcgttgctct GAACCAGAAA	360
GGTATCCCGG TTCGTGGTAA AAAAACCAAA AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG	420
ATGGCAATCA CTTAA	435

-58CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 52:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 144 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein o

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 52:

Met 1

His

Thr

Arg

Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val

5

10

15

Arg

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

20

25

30

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

35

40

45

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

50

55

60

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

65

70

75

80

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

05

90

95

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly

Glu

100

105

110

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly Lys

Lys

115

120

125

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

ile

Thr

130 135 140

-59CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 53:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 432 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 53:

ATGACTCGTT CCTACGACTA CATGGAAGGT GGTGACATCC GCGTACGTCG TCTGTTCTGC 60 CGTACCCAGT GGTACCTGCG TATCGACAAA CGCGGCAAAG TCAAGGGCAC CCAAGAGATG 120 AAAAACAACT ACAATATTAT GGAAATCCGT ACTGTTGCTG TTGGTATCGT TGCAATCAAA 180 GGTGTTGAAT CTGAATTCTA CCTGGCAATG AACAAAGAAG GTAAACTGTA CGCAAAAAAA 240 GAATGCAACG AAGACTGCAA CTTCAAAGAA CTGATCCTGG AAAACCACTA CAACACCTAC 300 GCATCTGCTA AATGGACCCA CAACGGTGGT GAAATGTTCG TTGCTCTGAA CCAGAAAGGT 3 60 ATCCCGGTTC GTGG7AAAAA AACCAAAAAA GAACAGAAAA CCGCTCACTT CCTGCCGATG 420 GCAATCACTT AA 432 (2) Informace o SEQ ID NO: 54:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 143 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein

(xi)	Popis	sekvence: 5	IEQ ID NO: 54:
Met	Thr	Arg Ser	Tyr Asp Tyr Met	Glu	Gly	Gly	Asp	Ile	Arg	Val	Arg
1			5		10					15
Arg	Leu	Phe Cys	Arg Thr Gin Trp	Tyr	Leu	Arg	Tle	Asp	Lys	Arg	Gly
		20		25					30

-60CZ 297328 B6

Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met

Lys Asn

Asn Tyr

Asn 45

Ile

Met Glu

35

40

ile

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

50

55

60

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

65

70

75

30

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

85

90

95

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Gly

Glu

Met

100

105

110

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg Gly

Lys

Lys

Thr

115

120

125

Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130 135 140 (2) Informace o SEQ ID NO: 55:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 429 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá o

(ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 55:

ATGCGTTCCT	ACGACTACAT	GGAAGGTGGT	GACATCCGCG	tacgtcgtct	GTTCTGCCGT	60
ACCCAGTGGT	acctgcgtat	cgacaaacgc	GGCAAAGTCA	AGGGCACCCA	AGAGATGAAA	120
AACAACTACA	ATATTATGGA	AATCCGTACT	GTTGCTGTTG	GTATCGTTGC	AATCAAAGGT	180
GTTGAATCTG	AATTCTACCT	GGCAATGAAC	AAAGAAGGTA	AACTGTACGC	AAAAAAAGAA	240
TGCAACGAAG	ACTGCAACTT	CAAAGAACTG	ATCCTGGAAA	ACCACTACAA	CACCTACGCA	30C
TCTGCTAAAT	GGACCCACAA	CGGTGGTGAA	ATGTTCGTTG	CTCTGAACCA	GAAAGGTATC	360
CCGGTTCGTG	GTAAAAAAAC	CAAAAAAGAA	cagaaaaccg	CTCACTTCCT	gccgatggca	420

ATCACTTAA

-61 CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 56:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 142 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein o

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 56:

Met Arg 1

Ser

Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly

Asp

Ile Arg Val

Arg Arg 15

5

10

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

20

25

30

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

35

40

45

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

50

55

60

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

65

70

75

80

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

35

90

95

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Gly

Glu

Met

Phe

100

105

.110

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Lys

Thr

Lys

115

120

125

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Zle

Thr

130

135

140

-62CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 57:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA o

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 57:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT ia0 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCG 360 GTTCGTGGTA AAAAAACCAA AAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426

-63 CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 58:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein o

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 58:

Met Ser 1

Tyr

Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp

Ile

Arg Val Arg

Arg 15

Leu

5

10

Ph·

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

(2) Informace o SEQ ID NO: 59:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 423 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA o

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 59:

ATGTACGACT	ACATGGAAGG	TGGTGACATC	CGCGTACGTC	GTCTGTTCTG	CCGTACCCAG	60
TGGTACCTGC	GTATCGACAA	ACGCGGCAAA	GÍCAAGGGCA	CCCAAGAGAT	GAAAAACAAC	120
TACAATATTA	TGGAAATCCG	TACTGTTGCT	GTTGGTATCG	TTGCAATCAA	AGGTGTTGAA	180
TCTGAATTCT	ACCTGGCAAT	GAACAAAGAA	GGTAAACTGT	ACGCAAAAAA	AGAATGCAAC	240
GAAGACTGCA	ACTTCAAAGA	ACTGATCCTG	GAAAACCACT	ACAACACCTA	CGCATCTGCT	300
AAATGGACCC	ACAACGGTGG	TGAAATGTTC	GTTGCTCTGA	ACCAGAAAGG	TATCCCGGTT	360
CGTGGTAAAA	AAACCAAAAA	AGAACAGAAA	ACCGCTCACT	TCCTGCCGAT	GGCAATCACT	420
TAA						423

-65CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 60:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 140 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein o

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 60:

Met Tyr Asp Tyr 1

Met 5

Glu Gly Gly

Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe

10

15

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg Gly

Lys

val

Lys

20

25

30

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

35

40

45

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

50

55

60

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

Asn

65

70

75

80

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

8S

90

95

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

100

105

110

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg Gly

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

Glu

115

120

125

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

-66CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 61:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 495 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA o

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 61:

ATGTCTAATG	ATATGACTCC	GGAACAGATG	GCTACCAACG	TTAACTCCTC	CTCCCCGGAA	60
CGTCACACGC	GTTCCTACGA	CTACATGGAA	GGTGGTGACA	TCCGCGTACG	TCGTCTGTTC	120
TGCCGTACCC	AGTGGTACCT	GCGTA7CGAC	AAACGCGGCA	AAGTCAAGGG	CACCCAAGAG	19 0
ATGAAAAACA	ACTACAATAT	TATGGAAATC	CGTACTGTTG	CTGTTGGTAT	CGTTGCAATC	240
aaaggtgttg	AATCTGAATT	CTATCTTGCA	ATGAACAAGG	AAGGAAAACT	CTATGCAAAG	300
AAAGAATGCA	ATGAAGATTG	TAACTTCAAA	GAACTAATTC	TGGAAAACCA	TTACAACACA	360
TATGCATCTG	CTAAATGGAC	CCACAACGGT	GGTGAAATGT	TCGTTGCTCT	GAACCAGAAA	420
GGTATCCCTG	TTGAAGGTAA	GAAAACCAAG	AAAGAACAGA	AAACCGCTCA	CTTCCTGCCG	480
ATGGCAATCA	CTTAA					495

-67CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 62:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 164 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein o

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 62:

Met

Ser

Asn

Asp

Met

Thr

Pro

Glu

Gin

Met

Ala

Thr

Asn

Val

Asn

Ser

1

5

10

15

Ses

Ser

Pro

Glu

Arg

HiS

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

Gly

20

25

30

Asp

Ile

Arg

Val

Arg

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

35

40

45

Ile

ASp

Lys

Arg

Gly

Lys

val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

50

55

60

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

65

70

75

80

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

85

90

95

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

100

105

110

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

115

120

125

Asn

Gly

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

130

135

140

Glu

Gly

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

145 150 155 160

Met Ala Ile Thr

-68CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 63:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 495 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 63:

ATGTCTAATG	ATATGACTCC	GGAACAGATG	GCTACCAACG	TTAACTCCTC	CTCCCCGGAA	60
CGTCACACGC	GTTCCTACGA	CTACATGGAA	GGTGGTGACA	TCCGCGTACG	TCGTCTGTTC	120
TGCCGTACCC	AGTGGTACCT	GCGTATCGAC	AAACGCGGCA	AAGTCAAGGG	CACCCAAGAG	180
ATGAAAAACA	ACTACAATAT	TÁTGGAAATC	CGTACTGTTG	CTGTTGGTAT	CGTTGCAAIC	240
AAAGGTGTTG	AATCTGAATT	CTATCTTGCA	ATGAACAAGG	AAGGAAAACT	CTATGCAAAG	300
AAAGAATGCA	ATGAAGATTG	TAACTTCAAA	GAACTAATTC	TGGAAAACCA	TTACAACACA	360
TATGCATCTG	CTAAATGGAC	CCACAACGGT	GGTGAAATGT	TCGTTGCTCT	GAACCAG AAA	420
GGTATCCCTG	TTCAAGGTAA	GAAAACCAAG	AAAGAACAGA	AAACCGCTCA	CTTCCTGCCG	480
ATGGCAATCA	CTTAA					495

-69CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 64:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 164 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein o

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 64:

Met Ser 1

Asn Asp

Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Ser

5

10

15

Ser

Ser

Pro

Glu

Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

Gly

20

25

30

ASp

lle

Arg

Val

Arg

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

35

40

45

lle

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

50

55

60

Tyr

Asn

lle

Met

Glu

lle

Arg

Thr

Val

Ala

val

Gly

lle

Val

Ala

lle

65

70

75

80

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

85

90

95

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

100

105

110

lle

Leu

G1U

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

115

120

125

Asn

Gly

Gly

Glu

Met

Phe

val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

lle

Pro

Val

130

135

140

Gin

Gly

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

145

150

155

160

Met Ala II· Thr

-70CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 65:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 65:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT ctgccgtacc	60
CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC	120
aactacaata ttatggaaat ccgtactgtt gctgttggta TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT	190
gaatctgaat TCTATCTTGC aatgaacaag gaaggaaaac tctatgcaaa GAAAGAATGC	240
aatgaagatt GTAACTTCAA AGAACTAATT CTGGAAAACC ATTACAACAC ATATGCATCT	300
GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT	360
GTTCAAGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC	420
ACTTAA	42 6

(2) Informace o SEQ ID NO: 66:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 66:

-71 CZ 297328 B6

Met Ser Tyr Asp 1

Tyr 5

Met Glu Gly

Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

10

15

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Gin

Gly

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

(2) Informace o SEQ ID NO: 67:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 67:

GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG (2) Informace o SEQ ID NO: 68:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 68:

CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC

-72CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 69:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 18 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 69:

CAATCTACAA TTCACAGA 19 (2) Informace o SEQ ID NO: 70:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 18 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 70:

TTAAGTTATT GCCATAGG i q (2) Informace o SEQ ID NO: 71:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 29 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 71:

AACAAAGCTT CTACAATTCA CAGATAGGA (2) Informace o SEQ ID NO: 72:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 27 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA

-73 CZ 297328 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 72:

AACAAGATCT TAAGTTATTG CCATAGG (2) Informace o SEQ ID NO: 73:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 38 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 73:

CGGTCTAGAC CACCATGCAC AAATGGATAC TGACATGG (2) Informace o SEQ ID NO: 74:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 33 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 74:

GCCGTCGACC TATTAAGTTA TTGCCATAGG AAG (2) Informace o SEQ ID NO: 75 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 16 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 75:

Xaa Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Xaa Xaa Ser 15 10 15

-74CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 76:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 12 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 76:

Ser Tyr Aap Tyr Met Glu. Gly Gly Asp Ile Arg Val 15 10 (2) Informace o SEQ ID NO: 77:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 517 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 77:

CTAGAAGGAG	GAATAACATA	TGTCTAATGA	TATGACTCCG	GAACAGATGG	CTACCAACGT	60
TAACTCCTCC	TCCCCGGAAC GTCACACGCG	TTCCTACGAC	TACATGGAAG	GTGGTGACAT	120
CCGCGTACGC	CGTTTGTTCT	CTCGTACCCA	GTGGTACCTG	CGTATCGACA	AACGCGGCAA	180
AGTCAAGGGC	ACCCAAGAGA	TGAAAAACAA	CTACAATATT	ATGGAAATCC	GTACTGTTGC	240
TGTTGGTATC	GTTGCAATCA	AAGGTGTTGA	ATCTGAATTC	TATCTTGCAA	TGAACAAGGA	300
AGGAAAACTC	TATGCAAAGA	AAGAATGCAA	TGAAGATTGT	AACTTCAAAG	AACTAATTCT	350
GGAAAACCAT	TACAACACAT	ATGCATCAGC	TAAATGGACA	CACAACGGAG	GGGAAATGTT	420
TGTTGCCTTA	AATCAAAAGG	GGATTCCTGT	AAGAGGAAAA	AAAACGAAGA	AAGAACAAAA	480
AACAGCCCAC	TTTCTTCCTA	TGGCAATAAC	TTAATAG			517

(2) Informace o SEQ ID NO: 78:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 164 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein

-75CZ 297328 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 78:

Met Ser 1

Asn Asp

Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Ser

5

10

15

Ser

Ser

Pro

Glu

Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

Gly

20

25

30

Asp

Xxe

Arg

Val

Arg

Arg

Leu

Phe

Ser

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

35

40

45

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

50

55

60

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

65

70

75

SO

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Θ5

90

95

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

100

105

110

Ile

Leu

Glu

Asn

HiS

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

115

120

125

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

130

135

140

Arg

Gly Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

145

150

155

160

Met Ala Ile Thr (2) Informace o SEQ ID NO: 79:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 517 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý io (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 79:

-76CZ 297328 B6

CTAGAAGGAG	GAATAACATA	TGTCTAATGA	TATGACTCCG	GAACAGATGG	CTACCAACGT	60
TAACTCCTCC	TCCCCGGAAC	GTCACACGCG	TTCCTACGAC	TACATGGAAG	GTGGTGACAT	120
CCGCGTACGT	CGTCTGTTCT	GCCGTACCCA	GTGGTACCTG	CGTATCGACA	AACGCGGCAA	180
AGTCAAGGGC	ACCCAAGAGA	TGAAAAACAA	CTACAATATT	ATGGAAATCC	GTACTGTTGC	240
TGTTGGTATC	GTTGCAATCA	AAGGTGTTGA	ATCTGAATTC	TACCTGGCTA	TGAACAAAGA	300
AGGTAAACTG	TACGCTAAAA	AAGAATCCAA	TGAAGATTGT	AACTTCAAAG	AACTAATTCT	360
GGAAAACCAT	TACAACACAT	ATGCATCAGC	TAAATGGACA	CACAACGGAG	GGGAAATGTT	420
TGTTGCCTTA	AATCAAAAGG	GGATTCCTGT	AAGAGGAAAA	AAAACGAAGA	AAGAACAAAA	480
AACAGCCCAC	TTTCTTCCTA	TGGCAATAAC	TTAATAG			517

(2) Informace o SEQ ID NO: 80:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 164 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 80:

Met Ser Asn Asp

Met Thr Pro

Glu Gin

Met Ala Thr

Asn Val

Asn

Ser

Ser Ser Pro Glu

Arg His Th

Arg Ser

Tyr Asp Tyr

Met Glu

Gly Gly

-77CZ 297328 B6

Asp Ile Arg 35

Val

Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg

40

45

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

50

55

60

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

ile

Val

Ala

Ile

65

70

75

80

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

85

90

95

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Ser

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

100

105

110

Ile

Leu

Glu

Asn

HiS

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

115

120

125

Asn

Gly

Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

val

130

135

140

Arg

Gly

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

145

150

155

160

Mat Ala Ile Thr (2) Informace o SEQ ID NO: 81:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 517 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá o

(ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 81:

CTAGAAGGAG GAATAACATA TGTCTAATGA TATGACTCCG GAACAGATGG CTACCAACGT 60 TAACTCCTCC TCCCCGGAAC GTCACACGCG TTCCTACGAC TACATGGAAG GTGGTGACAT 120 CCGCGTACGT CGTCTGTTCT GCCGTACCCA GTGGTACCTG CGTATCGACA AACGCGGCAA 180 AGTCAAGGGC ACCCAAGAGA TGAAAAACAA C7ACAATATT ATGGAAATCC GTACTGTTGC 240 TGTTGGTATC GTTGCAATCA AAGGTGTTGA ATCTGAATTC TACCTGGCTA TGAACAAAGA 300 AGGTAAACTG TACGCTAAAA AAGAATCCAA TGAAGATTCT AACTTCAAAG AACTAATTCT 360 GGAAAACCAT TACAACACAT ATGCATCAGC 7AAATGGACA CACAACGGAG GGGAAATGTT 420 TGTTGCCTTA AATCAAAAGG GGATTCCTGT AAGAGGAAAA AAAACGAAGA AAGAACAAAA 480 AACAGCCCAC TTTCTTCCTA TGGCAATAAC TTAATAG «17

-78CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 82:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 164 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 82:

Met Ser 1

Asn Asp

Met Thr Pro Glu Gin Met

Ala

Thr Asn

Val

Asn Ser 15

5

10

Ser

Ser

Pro

Glu

Arg

His

Thr

Arg

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

Gly

20

25

30

Asp

Ile

Arg

Val

Arg

Arg

Leu

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

35

40

45

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

50

55

60

Tys

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

65

70

75

30

Lys

Gly

val

Glu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

35

90

95

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Ser

Asn

Glu

Asp

Ser

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

100

105

110

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

115

120

125

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

130

135

140

Arg

Gly Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

145

150

155

160

Met Ala Ile Thr (2) Informace o SEQ ID NO: 83:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA

-79CZ 297328 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 83:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 130 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGGAACAGAA AGGTATCCCT 3 60 GTTCGTGGTA AGAAAÁCCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426 (2) Informace o SEQ ID NO: 84:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý io (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 84:

Met Ser Tyr 1

Asp

Tyr Met Glu Gly Gly Asp

lle Arg Val Arg Arg 15

Leu

5

10

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

lle

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

20

25

30

LyS

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

lle

Met

Glu

lle

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

val

Gly

lle

val

Ala

lle

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

lle

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Glu

Gin

Lys

Gly

lle

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

lle

Thr

130

135

140

-80CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 85:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 85:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGGA AGGTATCCCT 360 GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA ⁴²⁶ (2) Informace o SEQ ID NO: 86:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 86:

-81 CZ 297328 B6

Met 1

Ser

Tyr

Asp

Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

5

10

15

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

ASp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Glu

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lya

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130 135 140 (2) Informace o SEQ ID NO: 87:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá ío (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 87:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGCA AGGTATCCCT 360 GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426

-82CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 88:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 88:

Met Ser 1

Tyr Asp

Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

5

10

15

Phe

Cye

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

T y

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

95

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Gin

Gly

ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

(2) Informace o SEQ ID NO: 89:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 89:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60

CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC120

AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT180

GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC2 40

AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT300

GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT360

GTTGCTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC420

ACTTAA426 (2) Informace o SEQ ID NO: 90:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá io (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 90:

Met Ser Tyr Asp 1

Tyr 5

Met Glu Gly

Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

10

15

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Mat

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Lau

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

30

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Ala

Gly Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

-84CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 91:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 91:

ATGTCCTACG	ACTACATGGA	AGGTGG7GAC	ATCCGCGTAC	GTCGTCTGTT	CTGCCGTACC	60
CAGTGGTACC	TGCGTATCGA	CAAACGCGGC	AAAGTCAAGG	GCACCCAAGA GATGAAAAAC	120
aactacaata	TTATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	CAAAGGTGTT	130
GAATCTGAAT	TCTATCTTGC	AATGAACAAG	GAAGGAAAAC	TCTATGCAAA	GAAAGAATGC	240
aatgaagatt	GTAACTTCAA	AGAACTAATT	CTGGAAAACC	ATTACAACAC	ATATGCATCT	300
GCTAAATGGA	CCCACAACGG	TGGTGAAATG	TTCGTTGCTC	TGAACCAGAA	AGGTATCCCT	360
GTTGAAGGTA	AGAAAACCAA	GAAAGAACAG	AAAACCGCTC	ACTTCCTGCC	GATGGCAATC	420
ACTTAA						426

(2) Informace o SEQ ID NO: 92:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 92:

-85CZ 297328 B6

Met

Ser

Tyr

Asp

Tyr

Met

Glu

Gly

Gly

Asp

Ile

Arg

Val

Arg

Arg

Leu

1

5

10

15

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ha

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Gly

Glu

Met

Phe

val

100

105

110

Ala

Leu

Aan

Gin

Lys

Gly

ile

Pro

Val

Glu

Gly

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130 135 140 (2) Informace o SEQ ID NO: 93:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá ío (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 93:

atgtcctacg	ACTACATGGA	AGGTGGTGAC	ATCCGCGTAC	GTCGTCTGTT	CTGCCGTACC	60
CAGTGGTACC	TGCGTATCGA	CAAACGCGGC	AAAGTCAAGG	GCACCCAAGA	GATGAAAAAC	120
AACTACAATA	TTATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	CAAAGGTGTT	180
GAATCTGAAT	TCTACCTGGC	AATGAACAAA	GAAGGTAAAC	TGTACGCAAA	AAAAGAATGC	240
AACGAAGACT	GCAACTTCAA	AGAACTGATC	CTGGAAAACC	ACTACAACAC	CTACGCATCT	300
GCTAAATGGA	CCCACAACGG	TGGTGAAATG	TTCGTTGCTC	TGAACCAGAA	AGGTATCCCT	360
GTTCTGGGTA	AGAAAACCAA	GAAAGAACAG	AAAACCGCTC	ACTTCCTGCC	GATGGCAATC	420
ACTTAA						426

(2) Informace o SEQ ID NO: 94:

-86CZ 297328 B6 (i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 94:

Met Ser

Tyr Asp Arg Thr 20

Tyr Met 5 Gin Trp

Glu Tyr

Gly Gly Asp Ile

Arg Val Arg Arg Leu

1 Phe

Cys

10 Leu Arg Ile 25

Asp

Lys Arg

15

Gly 30

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

ile

Lys

Gly

val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Leu

Gly Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

(2) Informace o SEQ ID NO: 95:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 95:

-87CZ 297328 B6

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGÁCT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATTCCT 360 GTTCGTGGTA AC-GAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426 (2) Informace o SEQ ID NO: 96:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá ío (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 96:

Met Ser Tyr Asp 1

Tyr 5

Met Glu Gly

Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

10

15

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Het

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Glu

Thr

Lys

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

-88CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 97:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 97:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 130 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT 360 GTTCGTGGTA AGCAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426 (2) Informace o SEQ ID NO: 98:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 98:

Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

1

5

10

15

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

65

70

75

30

-89CZ 297328 B6

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Gin

Thr

Lys

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Lys

Thr

Ala

HÍS

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

(2) Informace o SEQ ID NO: 99:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 99:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT 360 GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG GAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426 (2) Informace o SEQ ID NO: 100:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 100:

-90CZ 297328 B6

Met 1

Ser

Tyr Asp Tyr 5

Met Glu Gly Gly

Asp 10

Ile

Arg

Val Arg

Arg Leu 15

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

ile

Lys

Gly

val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

HiS

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Glu

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

(2) Informace o SEQ ID NO: 101:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá ío (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 101:

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGGGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC60

CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC120

AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG ACTTAA

GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT180

GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC240

CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT300

TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT360

CAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC420

426

-91 CZ 297328 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 102:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 102:

Met Ser Tyr Asp 1

Tyr 5

Mat Glu Gly

Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

10

15

Phe

Cys

Arg

Thr

Gin

Trp

Tyr

Leu

Arg

Ile

Asp

Lys

Arg

Gly

Lys

Val

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gin

Glu

Met

Lys

Asn

Asn

Tyr

Asn

Ile

Met

Glu

Ile

Arg

35

40

45

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg Gly

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

115

120

125

Glu

Gin

Gin

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Mat

Ala

Ile

Thr

130

135

140

(2) Informace o SEQ ID NO: 103:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 426 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 103:

-92CZ 297328 B6

ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAAGAG ACTTAA

ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC SO

AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC120

GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT180

GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC240

CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT300

TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT3 60

GAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC420

426 (2) Informace o SEQ ID NO: 104:

(i) Charakteristika sekvence (A) Délka: 141 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: neznámý (D) Topologie: neznámá o

(ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 104:

Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Axg Val Arg Arg Leu 15 10 15

Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val . 20 25 3Ό

Lys

Gly Thr Gin Glu Met 3S

Lys

Asn Asn 40

Tyr Asn

Ile

Met 45

Glu Ile Arg

Thr

Val

Ala

Val

Gly

Ile

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Phe

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Gly

Lys

Leu

Tyr

Ala

Lys

Lys

Glu

Cys

65

70

75

80

Asn

Glu

Asp

Cys

Asn

Phe

Lys

Glu

Leu

Ile

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ala

Lys

Trp

Thr

His

Asn

Gly

Gly

Glu

Met

Phe

Val

100

105

110

Ala

Leu

Asn

Gin

Lys

Gly

Ile

Pro

Val

Arg

Gly

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

115

120

125

Glu

Glu

Glu

Thr

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Met

Ala

Ile

Thr

130

135

140

Claims (33)

1. Analog nativního keratinocytového růstového faktoru, KGF, odpovídající aminokyselinám 32 až 194 SEQ ID NO:2, popřípadě spolu se signální sekvencí odpovídající aminokyselinám 1 až

31 SEQ ID NO;2, přičemž tento analog vykazuje alespoň nějakou biologickou aktivitu a v podstatě sestává z aminokyselinové sekvence KGF, v níž je až 24 aminokyselin v poloze 32 až 55 SEQ ID NO: 2 vypuštěno, nahrazeno a/nebo vloženo, přičemž cysteinový zbytek v aminokyselinové poloze 32 SEQ ID NO:2 a cysteinový zbytek v aminokyselinové poloze 46 SEQ ID NO:2 je vždy buď vypuštěn nebo nahrazen jinou přirozenou aminokyselinou, přičemž tímto analogem není protein keratinocytového růstového faktoru sestávající z aminokyselin 55 až 194 SEQ ID NO:2.

2. Analog podle nároku 1, v němž jsou cysteinový zbytek v poloze aminokyseliny 32 SEQ ID NO:2 a cysteinový zbytek v poloze aminokyseliny 46 SEQ ID NO:2 deletovány.

3. Analog podle nároku 1, v němž jsou všechny aminokyseliny 32 až 55 SEQ ID NO:2 deletovány.

4. Analog podle nároku 1, v němž je cysteinový zbytek v poloze aminokyseliny 32 SEQ ID NO:2 deletován a cysteinový zbytek v poloze aminokyseliny 46 SEQ ID NO: 2 je nahrazen jinou přirozenou aminokyselinou.

5. Analog podle nároku 1, v němž je alespoň jedna aminokyselina z aminokyselin v polohách

32 až 55 podle SEQ ID NO:2 deletována a cysteinový zbytek v aminokyselinové poloze 46 SEQ ID NO:2 je nahrazen jinou přirozenou aminokyselinou.

6. Analog podle nároku 1, v němž jsou cysteinový zbytek v poloze aminokyseliny 32 SEQ ID NO:2 a cysteinový zbytek v poloze aminokyseliny 46 SEQ ID NO:2 nahrazeny jinou přirozenou aminokyselinou.

7. Analog podle kteréhokoliv z nároků 4 až 6, v němž je cysteinový zbytek nahrazen zbytkem aminokyseliny zvolené ze souboru sestávající z alaninu, leucinu a šeřinu.

8. Analog podle nároku 7, v němž je cysteinový zbytek nahrazen zbytkem šeřinu.

9. Analog podle některého z nároků 1 až 8, který dále zahrnuje substituci v poloze aminokyseliny zvolené ze souboru sestávajícího z argininového zbytku v poloze aminokyseliny 72 SEQ ID NO:2, zbytku glutaminu v poloze aminokyseliny 74 SEQ ID NO:2, lysinového zbytku v poloze aminokyseliny 86 SEQ ID NO:2, lysinového zbytku v poloze aminokyseliny 126 SEQ ID NO:2, asparaginového zbytku v poloze aminokyseliny 168 SEQ ID NO:2, zbytku glutaminu v poloze aminokyseliny 169 SEQ ID NO:2, zbytku lysinu v poloze aminokyseliny 170 SEQ ID NO:2, argininového zbytku v poloze aminokyseliny 175 SEQ ID NO:2, lysinového zbytku v poloze aminokyseliny 178 SEQ ID NO:2, zbytku glutaminu v poloze aminokyseliny 183 SEQ ID NO:2, lysinového zbytku v poloze aminokyseliny 184 SEQ ID NO:2 a threoninového zbytku v poloze aminokyseliny 185 SEQ ID NO:2.

10. Analog podle některého z nároků 1 až 9, který dále zahrnuje modifikaci histidinového zbytku v aminokyselinové poloze 147 SEQ ID NO:2.

11. Analog podle nároku 10, v němž je histidinový zbytek nahrazen glycinovým zbytkem.

12. Analog podle některého z nároků 9 až 11, v němž jsou aminokyselinové zbytky v polohách 32 až 55 SEQ ID NO: 2 vypuštěny.

-94CZ 297328 B6

13. Analog podle nároku 1, kterým je analog C(32,46)S SEQ ID NO:2, odpovídající SEQIDNO:32, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v poloze „0“ a jedná se o zbytek fakultativní; C(32,46,71)S SEQ ID NO:2, odpovídající SEQ ID NO:78, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v poloze „0“ a jedná se o zbytek fakultativní; C(32,46,133)S SEQ ID NO:2, odpovídající SEQ ID NO:80, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v poloze „0“ a jedná se o zbytek fakultativní; C(31,46,133,137)S SEQ ID NO:2, odpovídající SEQ ID NO:82, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v poloze „0“ a jedná se o zbytek fakultativní; delta N15, odpovídající SEQ ID NO:42, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v poloze „0“ a jedná se o zbytek fakultativní; delta NI6, odpovídající SEQ ID NO:44, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v poloze „0“ a jedná se o zbytek fakultativní; delta NI 7, odpovídající SEQ ID NO;46, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v poloze „0“ a jedná se o zbytek fakultativní; delta N18, odpovídající SEQ ID NO:48, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v poloze „0“ a jedná se o zbytek fakultativní; delta N19, odpovídající SEQ ID NO:50, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v poloze „0“ a jedná se o zbytek fakultativní; delta N20, odpovídající SEQ ID NO:52, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v poloze „0“ a jedná se o zbytek fakultativní; delta N21, odpovídající SEQ ID NO:54, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v poloze „0“ a jedná se o zbytek fakultativní; delta N22, odpovídající SEQ ID NO:56, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v poloze „0“ a jedná se o zbytek fakultativní; delta N24, odpovídající SEQ ID NO:60, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v „0“ a jedná se o zbytek fakultativní; delta N3/C(46)S SEQ ID NO:2, odpovídající SEQ ID NO:34, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v poloze „0“ a jedná se o zbytek fakultativní; delta N3/C(46) SEQ ID NO:2, odpovídající SEQ ID NO:36, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v poloze „0“ a jedná se o zbytek fakultativní; delta N8/C(46)S SEQ ID NO:2, odpovídající SEQ ID NO:38, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v poloze „0“ a jedná se o zbytek fakultativní; delta N8/C(46) SEQ ID NO:2, odpovídající SEQ ID NO:40, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v poloze „0“ a jedná se o zbytek fakultativní a delta N23/H(147)G SEQ ID NO:2, který odpovídá aminokyselinám v poloze 54 až 194 SEQ ID NO:2, přičemž histidinový zbytek v aminokyselinové poloze 147 je nahrazen glycinem.

14. Analog podle nároku 13, kterým je analog delta NI 6, odpovídající SEQ ID NO:44, v kteréžto sekvenci je počáteční methioninový zbytek považován za zbytek v poloze „0“ a jedná se o zbytek fakultativní.

15. Analog podle některého znároků 1 až 14, který obsahuje signální sekvenci nebo aminoterminální methioninový zbytek.

16. Analog podle nároku 15, v němž signální sekvenci tvoří aminokyseliny 1 až 31 SEQ ID NO:2.

17. Analog podle některého z nároků 1 až 16, který je kovalentně připojen k polyethylenglykolu nebo podobnému vodorozpustnému organickému polymeru.

18. Analog podle nároku 17, který je připojen k polyethylenglykolu.

19. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že zahrnuje terapeuticky účinné množství analogu KGF podle některého z nároků 1 až 18 a farmaceuticky vhodný nosič.

20. Molekula rekombinantní nukleové kyseliny kódující analog podle některého znároků 1 až 16.

-95CZ 297328 B6

21. Biologicky funkční vektor zahrnující molekulu nukleové kyseliny podle nároku 20.

22. Prokaryontní nebo eukaryontní hostitelská buňka zahrnující molekulu nukleové kyseliny podle nároku 20 nebo biologicky funkční vektor podle nároku 21.

23. Prokaryontní hostitelská buňka podle nároku 22, kterou je E. coli.

24. Eukaryontní hostitelská buňka podle nároku 22, kterou je buňka savčí, přednostně buňka vaječníků čínského křečka.

25. Způsob výroby analogu KGF podle některého z nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že zahrnuje růst hostitelské buňky podle některého z nároků 22 až 24 za vhodných nutričních podmínek způsobem umožňujícím expresi kódovaného analogu, a izolaci takto připraveného analogu.

26. Použití účinného množství analogu KGF podle některého z nároků 1 až 18 pro výrobu léčiva pro stimulaci produkce nefíbroblastových buněk epithelu.

27. Použití podle nároku 26, kde nefibroblastové buňky epithelu jsou zvoleny z adnexálních struktur, jatémích buněk, mukosálního epithelu respiračního a gastrointestinálního traktu, komeálních buněk nebo tympánových epithelových buněk.

28. Použití účinného množství analogu KGF podle některého z nároků 1 až 18 pro výrobu léčiva pro stimulaci produkce nefíbroblastových epithelových buněk u pacienta za účelem prevence nebo léčení stavu zvoleného ze souboru sestávajícího z popálenin a jiných poranění, epidermolysis bullosa, alopecie indukované chemotherapií, plešatosti mužského typu, progresivní ztráty vlasů u mužů a žen, žaludečních a dvanáctníkových vředů, zánětlivých chorob střev, jako je Crohnova choroba a vředová kolitida, toxicity spojené s radiačním a chemotherapeutickým ošetřením, choroby hyalinní membrány, akutního a chronického poškození plic, cirrhosy jater; prudkého selhání jater, akutní virové hepatitidy, toxických napadení jater, abraze rohovky, progresivní choroby dásní a poškození ušního bubínku.

29. In vitro způsob stimulace produkce nefíbroblastových epithelových buněk, vyznačující se tím, že se příslušné kultuře podá účinné množství analogu KGF podle některého z nároků 1 až 18 nebo farmaceutický prostředek podle nároku 19.

30. Použití podle nároku 26, kde nefibroblastové epithelové buňky jsou stimulovány v pacientovi, který to potřebuje.

31. Způsob podle nároku 29, kde nefibroblastové buňky epithelu jsou zvoleny z adnexálních struktur, jatemích buněk, mukosálního epithelu respiračního a gastrointestinálního traktu, korneálních buněk nebo tempánových epithelových buněk.

32. Použití podle některého z nároků 26, 27, 30 a způsob podle nároku 31, kde analog KGF se podává intravenosní, intrathekální, intramuskulámí, subkutánní nebo intaperitoneální cestou.

33. Kit. vyznačující se tím, že obsahuje analog KGF podle některého z nároků 1 až 18 nebo farmaceutický prostředek podle nároku 19.