FI120040B - Keratinosyytti-kasvutekijän analogeja - Google Patents
Keratinosyytti-kasvutekijän analogeja Download PDFInfo
- Publication number
- FI120040B FI120040B FI971536A FI971536A FI120040B FI 120040 B FI120040 B FI 120040B FI 971536 A FI971536 A FI 971536A FI 971536 A FI971536 A FI 971536A FI 120040 B FI120040 B FI 120040B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- glu
- lys
- kgf
- gly
- thr
- Prior art date
Links
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 title claims abstract description 334
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 title claims abstract description 314
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 194
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 145
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 145
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 88
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 74
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 72
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 68
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 68
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 68
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 31
- DVLHKUWLNKDINO-PMVMPFDFSA-N Trp-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DVLHKUWLNKDINO-PMVMPFDFSA-N 0.000 claims description 25
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 25
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 108010035534 tyrosyl-leucyl-alanine Proteins 0.000 claims description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 21
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 claims description 21
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 20
- GAOJCVKPIGHTGO-UWVGGRQHSA-N Lys-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O GAOJCVKPIGHTGO-UWVGGRQHSA-N 0.000 claims description 19
- HHRAXZAYZFFRAM-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HHRAXZAYZFFRAM-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 18
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 16
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 16
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 14
- OSBADCBXAMSPQD-YESZJQIVSA-N Phe-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N OSBADCBXAMSPQD-YESZJQIVSA-N 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 13
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 13
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 claims description 12
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 12
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 10
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 9
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 9
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 claims description 8
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 7
- LGEYOIQBBIPHQN-UWJYBYFXSA-N Tyr-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 LGEYOIQBBIPHQN-UWJYBYFXSA-N 0.000 claims description 7
- ZNFPUOSTMUMUDR-JRQIVUDYSA-N Tyr-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZNFPUOSTMUMUDR-JRQIVUDYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 7
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 7
- JWUZOJXDJDEQEM-ZLIFDBKOSA-N Ala-Lys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 JWUZOJXDJDEQEM-ZLIFDBKOSA-N 0.000 claims description 6
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 claims description 6
- NADWTMLCUDMDQI-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Cys Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N NADWTMLCUDMDQI-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 claims description 6
- SVZIKUHLRKVZIF-GUBZILKMSA-N Glu-Asn-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N SVZIKUHLRKVZIF-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 5
- KLJMRPIBBLTDGE-ACZMJKKPSA-N Glu-Cys-Asn Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KLJMRPIBBLTDGE-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims description 5
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 5
- 108010080488 arginyl-arginyl-leucine Proteins 0.000 claims description 5
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 claims description 5
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- 208000032571 Infant acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 claims description 4
- 206010028974 Neonatal respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- WWXNZNWZNZPDIF-SRVKXCTJSA-N Pro-Val-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 WWXNZNWZNZPDIF-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 4
- GSCVDSBEYVGMJQ-SRVKXCTJSA-N Ser-Tyr-Asp Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O GSCVDSBEYVGMJQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 4
- STGXWWBXWXZOER-MBLNEYKQSA-N Thr-Ala-His Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 STGXWWBXWXZOER-MBLNEYKQSA-N 0.000 claims description 4
- VUSAEKOXGNEYNE-PBCZWWQYSA-N Thr-His-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)O VUSAEKOXGNEYNE-PBCZWWQYSA-N 0.000 claims description 4
- COYSIHFOCOMGCF-UHFFFAOYSA-N Val-Arg-Gly Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CCCN=C(N)N COYSIHFOCOMGCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 4
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 4
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 claims description 4
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 4
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 201000002652 newborn respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 4
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims description 3
- QIQABBIDHGQXGA-ZPFDUUQYSA-N Glu-Ile-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O QIQABBIDHGQXGA-ZPFDUUQYSA-N 0.000 claims description 3
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 claims description 3
- FCPSGEVYIVXPPO-QTKMDUPCSA-N His-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FCPSGEVYIVXPPO-QTKMDUPCSA-N 0.000 claims description 3
- 208000000203 Hyaline Membrane Disease Diseases 0.000 claims description 3
- PULPZRAHVFBVTO-DCAQKATOSA-N Pro-Glu-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PULPZRAHVFBVTO-DCAQKATOSA-N 0.000 claims description 3
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 claims description 3
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 claims description 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 claims description 3
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 claims description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 claims description 3
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 claims description 2
- BYALSSDCQYHKMY-XGEHTFHBSA-N Cys-Arg-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CS)N)O BYALSSDCQYHKMY-XGEHTFHBSA-N 0.000 claims description 2
- DEVDFMRWZASYOF-ZLUOBGJFSA-N Cys-Asn-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DEVDFMRWZASYOF-ZLUOBGJFSA-N 0.000 claims description 2
- MIIGESVJEBDJMP-FHWLQOOXSA-N Glu-Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 MIIGESVJEBDJMP-FHWLQOOXSA-N 0.000 claims description 2
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 claims description 2
- 210000003454 tympanic membrane Anatomy 0.000 claims 4
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims 3
- 208000007788 Acute Liver Failure Diseases 0.000 claims 2
- 206010014989 Epidermolysis bullosa Diseases 0.000 claims 2
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims 2
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 claims 2
- 208000024693 gingival disease Diseases 0.000 claims 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims 2
- RVLOMLVNNBWRSR-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-aminopropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O RVLOMLVNNBWRSR-KNIFDHDWSA-N 0.000 claims 1
- XQNRANMFRPCFFW-GCJQMDKQSA-N Ala-Thr-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O XQNRANMFRPCFFW-GCJQMDKQSA-N 0.000 claims 1
- IIAXFBUTKIDDIP-ULQDDVLXSA-N Arg-Leu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O IIAXFBUTKIDDIP-ULQDDVLXSA-N 0.000 claims 1
- ISVACHFCVRKIDG-SRVKXCTJSA-N Arg-Val-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O ISVACHFCVRKIDG-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- FBODFHMLALOPHP-GUBZILKMSA-N Asn-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FBODFHMLALOPHP-GUBZILKMSA-N 0.000 claims 1
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000016952 Ear injury Diseases 0.000 claims 1
- SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N 0.000 claims 1
- ABHIXYDMILIUKV-CIUDSAMLSA-N Lys-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ABHIXYDMILIUKV-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- XKWABWFMQXMUMT-HJGDQZAQSA-N Thr-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XKWABWFMQXMUMT-HJGDQZAQSA-N 0.000 claims 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 claims 1
- DCOOGDCRFXXQNW-ZKWXMUAHSA-N Val-Asn-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N DCOOGDCRFXXQNW-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims 1
- OQWNEUXPKHIEJO-NRPADANISA-N Val-Glu-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N OQWNEUXPKHIEJO-NRPADANISA-N 0.000 claims 1
- DIOSYUIWOQCXNR-ONGXEEELSA-N Val-Lys-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O DIOSYUIWOQCXNR-ONGXEEELSA-N 0.000 claims 1
- IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N Valylglycine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NCC(O)=O IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims 1
- 238000009104 chemotherapy regimen Methods 0.000 claims 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims 1
- 210000000624 ear auricle Anatomy 0.000 claims 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 claims 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 claims 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 abstract description 14
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 131
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 120
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 118
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 65
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 61
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 41
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 41
- KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 35
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 35
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 32
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 32
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 31
- GMVCSRBOSIUTFC-FXQIFTODSA-N Glu-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GMVCSRBOSIUTFC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 29
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- SOEPMWQCTJITPZ-SRVKXCTJSA-N Glu-Met-Lys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N SOEPMWQCTJITPZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 27
- HGCNKOLVKRAVHD-UHFFFAOYSA-N L-Met-L-Phe Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HGCNKOLVKRAVHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 27
- 108010068488 methionylphenylalanine Proteins 0.000 description 27
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 27
- CANPXOLVTMKURR-WEDXCCLWSA-N Lys-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN CANPXOLVTMKURR-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 26
- GDOZQTNZPCUARW-YFKPBYRVSA-N Gly-Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O GDOZQTNZPCUARW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 24
- PLOUVAYOMTYJRG-JXUBOQSCSA-N Lys-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PLOUVAYOMTYJRG-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 23
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 23
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 23
- SVVULKPWDBIPCO-BZSNNMDCSA-N His-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SVVULKPWDBIPCO-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 22
- RIHIGSWBLHSGLV-CQDKDKBSSA-N Leu-Tyr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RIHIGSWBLHSGLV-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 22
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 22
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 22
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 22
- PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N Arg-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 21
- DTUZCYRNEJDKSR-NHCYSSNCSA-N Lys-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN DTUZCYRNEJDKSR-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 21
- LXXCHJKHJYRMIY-FQPOAREZSA-N Thr-Tyr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O LXXCHJKHJYRMIY-FQPOAREZSA-N 0.000 description 21
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 20
- YKBHOXLMMPZPHQ-GMOBBJLQSA-N Arg-Ile-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YKBHOXLMMPZPHQ-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- MPYZGXUYLNPSNF-NAZCDGGXSA-N Trp-Thr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N)O MPYZGXUYLNPSNF-NAZCDGGXSA-N 0.000 description 19
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 19
- KRGZZKWSBGPLKL-IUCAKERBSA-N Glu-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N KRGZZKWSBGPLKL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 18
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 18
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 18
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 17
- RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N H-Lys-Trp-OH Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N Lys-Thr-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N 0.000 description 17
- 108010087066 N2-tryptophyllysine Proteins 0.000 description 17
- WTUJZHKANPDPIN-CIUDSAMLSA-N Ser-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N WTUJZHKANPDPIN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 17
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 16
- ZYNBEWGJFXTBDU-ACRUOGEOSA-N Phe-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N ZYNBEWGJFXTBDU-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 16
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- BVLIJXXSXBUGEC-SRVKXCTJSA-N Asn-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O BVLIJXXSXBUGEC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 15
- HUORUFRRJHELPD-MNXVOIDGSA-N Ile-Leu-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N HUORUFRRJHELPD-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 15
- RCMNUBZKIIJCOI-ZPFDUUQYSA-N Ile-Met-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N RCMNUBZKIIJCOI-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 15
- DRXODWRPPUFIAY-DCAQKATOSA-N Met-Asn-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN DRXODWRPPUFIAY-DCAQKATOSA-N 0.000 description 15
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 14
- LVHMEJJWEXBMKK-GMOBBJLQSA-N Asn-Ile-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N LVHMEJJWEXBMKK-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 14
- WOKXEQLPBLLWHC-IHRRRGAJSA-N Asp-Tyr-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WOKXEQLPBLLWHC-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 14
- QTUSJASXLGLJSR-OSUNSFLBSA-N Ile-Arg-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N QTUSJASXLGLJSR-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 14
- HBBBLSVBQGZKOZ-GUBZILKMSA-N Pro-Met-Ala Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HBBBLSVBQGZKOZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 14
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 14
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 14
- OAGVHWYIBZMWLA-YFKPBYRVSA-N Glu-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O OAGVHWYIBZMWLA-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 13
- UQRZFMQQXXJTTF-AVGNSLFASA-N Lys-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UQRZFMQQXXJTTF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 13
- HUKLXYYPZWPXCC-KZVJFYERSA-N Met-Ala-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HUKLXYYPZWPXCC-KZVJFYERSA-N 0.000 description 13
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- CEXFELBFVHLYDZ-XGEHTFHBSA-N Thr-Arg-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CEXFELBFVHLYDZ-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 13
- XDGPTBVOSHKDFT-KKUMJFAQSA-N Tyr-Met-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XDGPTBVOSHKDFT-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 13
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 13
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 13
- HCAUEJAQCXVQQM-ACZMJKKPSA-N Asn-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HCAUEJAQCXVQQM-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 12
- SFUUYRSAJPWTGO-SRVKXCTJSA-N Cys-Asn-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O SFUUYRSAJPWTGO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 12
- PARSHQDZROHERM-NHCYSSNCSA-N Ile-Lys-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)O)N PARSHQDZROHERM-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 12
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- DCRWPTBMWMGADO-AVGNSLFASA-N Lys-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DCRWPTBMWMGADO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 12
- SOAYQFDWEIWPPR-IHRRRGAJSA-N Met-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O SOAYQFDWEIWPPR-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- PDUVELWDJZOUEI-IHRRRGAJSA-N Phe-Cys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PDUVELWDJZOUEI-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 12
- GULIUBBXCYPDJU-CQDKDKBSSA-N Tyr-Leu-Ala Chemical compound [O-]C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 GULIUBBXCYPDJU-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 12
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- GBSUGIXJAAKZOW-GMOBBJLQSA-N Asp-Ile-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O GBSUGIXJAAKZOW-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 11
- GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N Lys-Glu-Gly Chemical compound [NH3+]CCCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C(=O)NCC([O-])=O GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N 0.000 description 11
- QGQGAIBGTUJRBR-NAKRPEOUSA-N Met-Ala-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC QGQGAIBGTUJRBR-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 11
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 11
- WQLJRNRLHWJIRW-KKUMJFAQSA-N Asn-His-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O WQLJRNRLHWJIRW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 10
- CUXJENOFJXOSOZ-BIIVOSGPSA-N Ser-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O CUXJENOFJXOSOZ-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- RZZMZYZXNJRPOJ-BJDJZHNGSA-N Ala-Ile-Lys Chemical group CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N RZZMZYZXNJRPOJ-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 9
- NTOWAXLMQFKJPT-YUMQZZPRSA-N Gly-Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)CN NTOWAXLMQFKJPT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 9
- CRNNMTHBMRFQNG-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Cys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N CRNNMTHBMRFQNG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 9
- YORIKIDJCPKBON-YUMQZZPRSA-N Met-Glu-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O YORIKIDJCPKBON-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 9
- WLYPRKLMRIYGPP-JYJNAYRXSA-N Phe-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 WLYPRKLMRIYGPP-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 9
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 9
- RAAWHFXHAACDFT-FXQIFTODSA-N Ala-Met-Asn Chemical compound CSCC[C@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RAAWHFXHAACDFT-FXQIFTODSA-N 0.000 description 8
- XEPSCVXTCUUHDT-AVGNSLFASA-N Arg-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XEPSCVXTCUUHDT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 8
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 8
- SXGAGTVDWKQYCX-BQBZGAKWSA-N Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SXGAGTVDWKQYCX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 8
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 8
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 8
- YESNGRDJQWDYLH-KKUMJFAQSA-N Leu-Phe-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N YESNGRDJQWDYLH-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010079547 glutamylmethionine Proteins 0.000 description 8
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 8
- 108010029560 keratinocyte growth factor receptor Proteins 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 7
- SHBKFJNZNSGHDS-FGPLHTHASA-N Asp-Met-Thr-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O SHBKFJNZNSGHDS-FGPLHTHASA-N 0.000 description 7
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 7
- MGJLBZFUXUGMML-VOAKCMCISA-N Thr-Lys-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O MGJLBZFUXUGMML-VOAKCMCISA-N 0.000 description 7
- TZXFLDNBYYGLKA-BZSNNMDCSA-N Tyr-Asp-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 TZXFLDNBYYGLKA-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- ZRAOLTNMSCSCLN-ZLUOBGJFSA-N Asp-Cys-Asn Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)C(=O)O ZRAOLTNMSCSCLN-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 6
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 6
- KLLFLHBKSJAUMZ-ACZMJKKPSA-N Cys-Asn-Glu Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CS)N KLLFLHBKSJAUMZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 6
- BHPQOIPBLYJNAW-NGZCFLSTSA-N Gly-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN BHPQOIPBLYJNAW-NGZCFLSTSA-N 0.000 description 6
- VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCCN VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 6
- KUIDCYNIEJBZBU-AJNGGQMLSA-N Leu-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KUIDCYNIEJBZBU-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 6
- VUTWYNQUSJWBHO-BZSNNMDCSA-N Lys-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O VUTWYNQUSJWBHO-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 6
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 6
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 6
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 6
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 6
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 5
- VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 5
- DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 5
- XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N Arg-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 5
- RVHGJNGNKGDCPX-KKUMJFAQSA-N Asn-Phe-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N RVHGJNGNKGDCPX-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 5
- KZYSHAMXEBPJBD-JRQIVUDYSA-N Asn-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KZYSHAMXEBPJBD-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 5
- VGBSZQSKQRMLHD-MNXVOIDGSA-N Glu-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O VGBSZQSKQRMLHD-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 5
- XBWMTPAIUQIWKA-BYULHYEWSA-N Gly-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CN XBWMTPAIUQIWKA-BYULHYEWSA-N 0.000 description 5
- UFPXDFOYHVEIPI-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O UFPXDFOYHVEIPI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- SWBUZLFWGJETAO-KKUMJFAQSA-N His-Tyr-Asn Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)O SWBUZLFWGJETAO-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 5
- YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 5
- BIWVMACFGZFIEB-VFAJRCTISA-N Lys-Trp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O BIWVMACFGZFIEB-VFAJRCTISA-N 0.000 description 5
- JQTOSAPHLXRNAH-BWJWTDLKSA-N Met-Glu-Ile-Arg Chemical compound N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JQTOSAPHLXRNAH-BWJWTDLKSA-N 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- YBRHKUNWEYBZGT-WLTAIBSBSA-N Trp-Thr Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(O)=O)=CNC2=C1 YBRHKUNWEYBZGT-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- ZSOICJZJSRWNHX-ACZMJKKPSA-N Ala-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](C)[NH3+] ZSOICJZJSRWNHX-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- PBEQPAZRHDVJQI-SRVKXCTJSA-N Glu-Arg-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N PBEQPAZRHDVJQI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 4
- QSPLUJGYOPZINY-ZPFDUUQYSA-N Ile-Asp-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N QSPLUJGYOPZINY-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- HUURTRNKPBHHKZ-JYJNAYRXSA-N Met-Phe-Val Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HUURTRNKPBHHKZ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 4
- WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N Met-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- NDJSSFWDYDUQID-YTWAJWBKSA-N Met-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N)O NDJSSFWDYDUQID-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MTEQZJFSEMXXRK-CFMVVWHZSA-N Tyr-Asn-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N MTEQZJFSEMXXRK-CFMVVWHZSA-N 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- -1 amino- Chemical class 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 4
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 4
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- BECXEHHOZNFFFX-IHRRRGAJSA-N Arg-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O BECXEHHOZNFFFX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 3
- SYOJVRNQCXYEOV-XVKPBYJWSA-N Gly-Val-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SYOJVRNQCXYEOV-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 3
- NOQPTNXSGNPJNS-YUMQZZPRSA-N His-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O NOQPTNXSGNPJNS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- TZCGZYWNIDZZMR-NAKRPEOUSA-N Ile-Arg-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N TZCGZYWNIDZZMR-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- DSGYZICNAMEJOC-AVGNSLFASA-N Ser-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O DSGYZICNAMEJOC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- ONWMQORSVZYVNH-UWVGGRQHSA-N Tyr-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ONWMQORSVZYVNH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- CVKOQHYVDVYJSI-QTKMDUPCSA-N Arg-His-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O CVKOQHYVDVYJSI-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 2
- SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N Asn-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- RTFXPCYMDYBZNQ-SRVKXCTJSA-N Asn-Tyr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RTFXPCYMDYBZNQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- UZFHNLYQWMGUHU-DCAQKATOSA-N Asp-Lys-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O UZFHNLYQWMGUHU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N Glu-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- XEKAJTCACGEBOK-KKUMJFAQSA-N Glu-Met-Phe Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N XEKAJTCACGEBOK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N Glu-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- HGCNKOLVKRAVHD-RYUDHWBXSA-N Met-Phe Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HGCNKOLVKRAVHD-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- PCTFVQATEGYHJU-FXQIFTODSA-N Met-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PCTFVQATEGYHJU-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 101100446506 Mus musculus Fgf3 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- CDHURCQGUDNBMA-UBHSHLNASA-N Phe-Val-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 CDHURCQGUDNBMA-UBHSHLNASA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- AWJGUZSYVIVZGP-YUMQZZPRSA-N Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 AWJGUZSYVIVZGP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013011 aqueous formulation Substances 0.000 description 2
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 2
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003345 hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 2
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 2
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 2
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-5-amino-2-[[2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N 0.000 description 1
- JFOWDKWFHZIMTR-RUCXOUQFSA-N (2s)-2-aminopentanedioic acid;(2s)-2,5-diamino-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JFOWDKWFHZIMTR-RUCXOUQFSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JEPVUMTVFPQKQE-AAKCMJRZSA-N 2-[(1s,2s,3r,4s)-1,2,3,4,5-pentahydroxypentyl]-1,3-thiazolidine-4-carboxylic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C1NC(C(O)=O)CS1 JEPVUMTVFPQKQE-AAKCMJRZSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150066375 35 gene Proteins 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- HFBFSOAKPUZCCO-ZLUOBGJFSA-N Ala-Cys-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N HFBFSOAKPUZCCO-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- BLIMFWGRQKRCGT-YUMQZZPRSA-N Ala-Gly-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN BLIMFWGRQKRCGT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LXAARTARZJJCMB-CIQUZCHMSA-N Ala-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LXAARTARZJJCMB-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 1
- CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N Ala-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- FSHURBQASBLAPO-WDSKDSINSA-N Ala-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N FSHURBQASBLAPO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N Arg-Ala-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- FYRVDDJMNISIKJ-UWVGGRQHSA-N Asn-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FYRVDDJMNISIKJ-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 235000002568 Capsicum frutescens Nutrition 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010010984 Corneal abrasion Diseases 0.000 description 1
- 208000028006 Corneal injury Diseases 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 1
- 206010053177 Epidermolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000272184 Falconiformes Species 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000380 Fibroblast growth factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 102100028073 Fibroblast growth factor 5 Human genes 0.000 description 1
- 108090000382 Fibroblast growth factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 102100028075 Fibroblast growth factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- JRCUFCXYZLPSDZ-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JRCUFCXYZLPSDZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- PABVKUJVLNMOJP-WHFBIAKZSA-N Glu-Cys Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PABVKUJVLNMOJP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- CUXJIASLBRJOFV-LAEOZQHASA-N Glu-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CUXJIASLBRJOFV-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- HZISRJBYZAODRV-XQXXSGGOSA-N Glu-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HZISRJBYZAODRV-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- DTLLNDVORUEOTM-WDCWCFNPSA-N Glu-Thr-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O DTLLNDVORUEOTM-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- HUFUVTYGPOUCBN-MBLNEYKQSA-N Gly-Thr-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HUFUVTYGPOUCBN-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 206010018473 Glycosuria Diseases 0.000 description 1
- MLZVJIREOKTDAR-SIGLWIIPSA-N His-Ile-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O MLZVJIREOKTDAR-SIGLWIIPSA-N 0.000 description 1
- 206010020710 Hyperphagia Diseases 0.000 description 1
- UWBDLNOCIDGPQE-GUBZILKMSA-N Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN UWBDLNOCIDGPQE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- TUYOFUHICRWDGA-CIUDSAMLSA-N Ile-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCSC TUYOFUHICRWDGA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N L-Prolyl-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N L-tryptophan-L-tyrosine Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N Leu-Ala-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UILIPCLTHRPCRB-XUXIUFHCSA-N Leu-Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N UILIPCLTHRPCRB-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- PLDJDCJLRCYPJB-VOAKCMCISA-N Lys-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PLDJDCJLRCYPJB-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010038049 Mating Factor Proteins 0.000 description 1
- VIZLHGTVGKBBKO-AVGNSLFASA-N Met-Arg-His Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N VIZLHGTVGKBBKO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- AHZNUGRZHMZGFL-GUBZILKMSA-N Met-Arg-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CCCNC(N)=N AHZNUGRZHMZGFL-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- NDYNTQWSJLPEMK-WDSKDSINSA-N Met-Cys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NDYNTQWSJLPEMK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- KQBJYJXPZBNEIK-DCAQKATOSA-N Met-Glu-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N KQBJYJXPZBNEIK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- SCKPOOMCTFEVTN-QTKMDUPCSA-N Met-His-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CCSC)N)O SCKPOOMCTFEVTN-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- BQHLZUMZOXUWNU-DCAQKATOSA-N Met-Pro-Glu Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N BQHLZUMZOXUWNU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PHURAEXVWLDIGT-LPEHRKFASA-N Met-Ser-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N PHURAEXVWLDIGT-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- MIXPUVSPPOWTCR-FXQIFTODSA-N Met-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MIXPUVSPPOWTCR-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- KSIPKXNIQOWMIC-RCWTZXSCSA-N Met-Thr-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N KSIPKXNIQOWMIC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- OOLVTRHJJBCJKB-IHRRRGAJSA-N Met-Tyr-Asp Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N OOLVTRHJJBCJKB-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 101100446513 Mus musculus Fgf4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100030856 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- BKWJQWJPZMUWEG-LFSVMHDDSA-N Phe-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BKWJQWJPZMUWEG-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000004880 Polyuria Diseases 0.000 description 1
- NMELOOXSGDRBRU-YUMQZZPRSA-N Pro-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 NMELOOXSGDRBRU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- KHRLUIPIMIQFGT-AVGNSLFASA-N Pro-Val-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KHRLUIPIMIQFGT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000219492 Quercus Species 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CO SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- XSYJDGIDKRNWFX-SRVKXCTJSA-N Ser-Cys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O XSYJDGIDKRNWFX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 208000032023 Signs and Symptoms Diseases 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N Sulfisoxazole Chemical compound CC1=NOC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=C1C NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- YKRQRPFODDJQTC-CSMHCCOUSA-N Thr-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN YKRQRPFODDJQTC-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 206010069363 Traumatic lung injury Diseases 0.000 description 1
- TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N Trp-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWZOCUWOXSDYFZ-CQDKDKBSSA-N Tyr-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZWZOCUWOXSDYFZ-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710201961 Virion infectivity factor Proteins 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 206010069351 acute lung injury Diseases 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002588 alveolar type II cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SJSWRKNSCWKNIR-UHFFFAOYSA-N azane;dihydrochloride Chemical compound N.Cl.Cl SJSWRKNSCWKNIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 206010006475 bronchopulmonary dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000035567 cellular accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 208000022605 chemotherapy-induced alopecia Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 1
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000000613 ear canal Anatomy 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 230000009786 epithelial differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000008508 epithelial proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000007565 gingivitis Diseases 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000035780 glucosuria Effects 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 102000057239 human FGF7 Human genes 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 206010021654 increased appetite Diseases 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010027338 isoleucylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 231100000515 lung injury Toxicity 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000027939 micturition Effects 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 231100000989 no adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000000849 parathyroid Effects 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000004197 pelvis Anatomy 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 206010036067 polydipsia Diseases 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 108010005636 polypeptide C Proteins 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000001732 sebaceous gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- NGDIAZZSCVVCEW-UHFFFAOYSA-M sodium;butyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCOS([O-])(=O)=O NGDIAZZSCVVCEW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 210000000106 sweat gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000035922 thirst Effects 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/16—Otologicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
- A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Obesity (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Keratinosyytti-kasvutekijän analogeja Keksinnön ala
Keksintö liittyy yhdistelmä-DNA-tekniikkaan ja pro-5 teiinien muokkaukseen. Tarkemmin sanottuna keksinnössä on sovellettu yhdistelmä-DNA-menetelmiä sellaisten ei-fibroblast ityyppiä olevien epiteelisolujen kasvun voimakkaan mitogeenin, keratinosyyttikasvutekijän (KGF) polypeptidi-analogien valmistamiseen, jotka ovat alkuperäistä KGF:ää 10 stabiilimpia.
Keksinnön tausta
Kudoksen monimutkaiseen muodostumis- ja uudistumis-tapahtumaan osallistuu useita proteiinitekijöitä, joista toisinaan käytetään nimitystä pehmytkudoksen kasvutekijät. 15 Näitä molekyylejä vapautuu tavallisesti yhdestä solutyypistä ja ne vaikuttavat muiden solutyyppien lisääntymiseen. [Rubin, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 802 - 806]. Tietyt nimenomaiset solutyypit erittävät tiettyjä pehmytkudoksen kasvutekijöitä ja ne vaikuttavat niil-20 le reagoivien solujen lisääntymiseen, erilaistumiseen ja/ tai kypsymiseen monisoluisten organismien yksilönkehityksessä [Finch, et ai., Science 245 (1989) 752 - 755]. Sen lisäksi, että näillä tekijöillä on tehtäviä organismien ·.·.· yksilönkehityksessä, jotkin niistä ovat tärkeitä kehitys- • · · • \· 25 vaiheeltaan kypsempien järjestelmien ylläpidolle pysymi- : selle jatkuvasti toimintakunnossa. Esimerkiksi nisäkkäillä ·;··· on useita järjestelmiä, joissa solujen uusiutuminen on nopeaa. Tällaisia järjestelmiä ovat iho ja gastrointesti- • naalikanava, jotka kumpikin koostuvat epiteelisoluista.
• · · 3 0 Tähän pehmytkudoksen kasvutekijöiden ryhmään kuuluu fibro- .. blastikasvutekijoiden (FGF-molekyylien) proteiiniryhmä.
• ·
Nykyisin tunnetaan kahdeksan FGF-ryhmän jäsentä, • · · *·[ * jotka primaarirakenteeltaan muistuttavat toisiaan ja jotka : ovat: emäksinen fibroblastikasvutekijä, bFGF [Abraham, et.
• · · :1: 35 ai., EMBO J. 5 (1986) 2523 - 2528]; hapan fibroblastikas- • · · • · · • ♦ · • · · • · • · • · · 2 vutekijä, aFGF [Jaye, et ai., Science 233 (1986) 541 - 545]; int-2-geenin tuote, int-2 [Dickson & Peters, Nature 326 (1987) 833]; hst/kFGF [Delli-Bovi, et ai., Cell 50 (1987) 729 - 737 ja Yoshida, et ai., Proc. Natl. Acad.
5 Sei. USA 84 (1987) 7305 - 7309]; FGF-5 [Zhan, et ai., Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 3487 - 3495]; FGF-6 [Maries, et ai., Oncogene 4 (1989) 335 - 340]; keratinosyyttikasvutekijä [Finch, et ai., Science 24 (1989) 752 - 755]; ja hisakto-filiini [Habazzettl, et ai., Nature 359 (1992) 855 - 858]. 10 Keratinosyyttikasvutekijä ("KGF") on FGF-proteiini- ryhmässä mesenkyymikudoksista peräisin olevien ei-fibro-blastityyppisten epiteeli (erityisesti keratinosyytti) -solujen lisääntymisen ainutlaatuinen efektorimolekyyli. Termi "natiivi KGF" tarkoittaa luonnossa esiintyvää humaa-15 nipolypeptidiä (hKGF) tai yhdistelmäpolypeptidiä (rKGF) (jossa mahdollisesti esiintyy signaalisekvenssi) sekvenssissä nro 2 esitetyn aminohapposekvenssin kuvaamassa muodossa, tai tämän alleelista varianttia. [Ellei toisin ole mainittu, vastaa tässä keksinnössä kuvattujen molekyylien 20 aminohappojen numerointi natiivin molekyylin kypsälle muodolle esitettyä numerointia (toisin sanoen ilman signaali-sekvenssiä) sekvenssin nro 2 aminohappojen 32 - 194 kuvaamassa muodossa.]
Natiivi KGF voidaan eristää luonnossa esiintyvistä :***: 25 humaanilähtömateriaaleista (hKGF) tai sitä voidaan tuottaa • 1 • ;1; yhdistelmä-DNA-menetelmin (rKGF) [Finch, et ai. (1989), • · · edellä; Rubin, et ai. (1989), edellä; Ron, et ai., The • · ;·. Journal of Biological Chemistry 268(4) (1993) 2984 - 2988; • ·· ja Yan, et ai., In Vitro Cell. Dev. Biol. 27A (1991) 437 -• · · w V 1 30 438] .
Natiivin KGF:n tiedetään olevan suhteellisen epä- • » ; 1' stabiili vesipitoisessa tilassa ja pilkkoutuvan kemialli- • · · • · · * sesti ja fysikaalisesti, mikä johtaa biologisen aktiivi- ; j1j suuden häviämiseen molekyylin teollisen valmistuksen ja ·«« .1··. 35 varastoinnin aikana [Chen, et ai., Pharmaceutical Research • · · • · · • · ♦ • · · · · • · • · • · · 3 11 (1994) 1582 - 1589]. Natiivi KGF aggregoituu myös helposti korkeissa lämpötiloissa ja se inaktivoituu happamis-sa olosuhteissa [Rubin, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 802 - 806] . Natiivin KGF:n aggregoituminen vesi-5 pitoisessa liuoksessa johtaa myös inaktiivisen proteiinin muodostumiseen. Tämä on epäedullista, koska tällaisen aktiivisuuden häviämisen johdosta ei ole käytännössä mahdollista varastoida natiiveja KGF-proteiineja sisältäviä vesipitoisia formulaatioita pitkiä aikoja tai antaa proteii-10 nia pitkän ajan kuluessa. Lisäksi tämä on erityisen ongelmallista farmaseuttisten formulaatioiden valmistuksessa, koska aggregoituneiden proteiinien tiedetään olevan immu-nogeenisiä [Cleland, et. ai., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10 (1993) 307 - 377; Robbins, et ai., Dia-15 betes 36 (1987) 838 - 845; ja Pinckard, et ai., Clin. Exp. Immunol. 2 (1967) 331 - 340].
Natiivi KGF sisältää viisi kysteiiniryhmää, nimittäin aminohapot 1, 15, 40, 102 ja 106 [Finch, et ai.,
Science 24 (1989) 752 - 755]. Vaikkakin tästä raportista 20 kävi selville natiivin KGF:n kysteiinipitoisuus, ei ole kuitenkaan julkaistu raportteja kysteiiniryhmien osuudesta aktiivisuuden suhteen (esimerkiksi siitä, miten välttämättömiä ne ovat biologiselle aktiivisuudelle) eikä tertiää-. risen rakenteen suhteen (esimerkiksi siitä, miten helposti • 25 ne muodostavat molekyylien välisiä tai molekyylin sisäisiä • · : haitallisia disulfidisidoksia) . Tällä alalla ei siten ole • · · • · · aikaisemmin esitetty, mitkä kysteiiniryhmistä ovat mahdol- • · lisesti välttämättömiä tai mitkä liittyvät sellaisen hai- • · · *... tallisen disulfidisidoksen muodostumiseen, joka tekee pro- | · · * 30 teiinista helposti aggregoituvan ja/tai epäpysyvän.
Yrityksiin, joilla natiivin KGF:n yhtä tai useampaa • · • ♦ : 1’ ominaisuutta pyritään parantamaan tai muuttamaan jollakin • · · · muulla tavoin, voidaan käyttää proteiinien muokkausta. Na- . .1. tiivin KGF:n sekvenssejä voidaan modifioida käyttämällä • · · ,···. 35 yhdistelmä-DNA-menetelmiä.
• · • · · • · ·
» · I
• · · · · • · • · • · · 4
Ron, et ai., J. Biol. Chem. 268(4) (1993) 2984 - 2988, ovat raportoineet modifioiduista KGF-polypeptideis-tä, joiden N-terminaalisesta päästä on deletoitu 3, 8, 27, 38 tai 49 aminohappoa. Polypeptidit, joista puuttuu 3, 8 5 tai 27 N-terminaalista ryhmää, kykenivät vielä sitomaan hepariinia; muut eivät tähän pystyneet. Myös polypepti-dien, joista puuttui 3 ja 8 ryhmää, raportoitiin myös olevan täydellisesti aktiivisia, kun taas muoto, josta puuttui 27 ryhmää, oli 10 - 20-kertaisesti vähemmän mitogeeni-10 nen, ja muodoilla, joista puuttui 38 tai 49 aminohappoa, ei ollut mitogeenistä aktiivisuutta. Raportissa ei tarkasteltu näiden modifioitujen KGF-polypeptidien pysyvyyttä eikä tästä ollut mitään muutakaan mainintaa.
PCT-hakemusjulkaisussa 90/08 771, edellä, raportoi-15 tiin myös sellaisen kimeerisen proteiinin valmistamisesta, joka oli sellainen, että natiivin KGF:n kypsän muodon noin 40 ensimmäistä N-terminaalista aminohappoa oli yhdistetty aFGF:n C-terminaaliseen osaan (noin 140 aminohappoa). Ki-meeran raportoitiin KGF:n tavoin hakeutuvan keratinosyyt-20 teihin mutta siitä puuttui herkkyys hepariinille, mikä on aFGF:n mutta ei KGF:n ominaisuus. Kimeeran pysyvyyttä ei tarkasteltu eikä tästä ollut mitään muutakaan mainintaa.
Siten tämän alan ammattikirjallisuudessa ei ole käytettävissä raportteja modifioidusta KGF-molekyylistä, : 1 : 25 joka olisi stabiilisuudeltaan merkittävästi natiivia • :1: KGF:ää parampi. Lisäksi alan ammattikirjallisuudessa ei • · · ole raportoitu riittävän yksityiskohtaisia menettelytapo- ;·. ja eikä todisteita, joiden perusteella olisi perusteltua • · · ·;·. odottaa, että voitaisiin valmistaa myönteisin tuloksin 2 · · 30 KGF-molekyylejä, joilla olisi tällaisia haluttavia ominaisuuksia.
t · • Minkä tahansa proteiinimolekyylissä tapahtuvan ami- • · · *·1 ’ nohappomuutoksen vaikutukset biologiseen aktiivisuuteen : ovat yleensä erilaiset useiden tekijöiden mukaan, joita • · · ,1·1. 35 ovat tämän proteiinin kolmiulotteinen rakenne sekä se, • · · • · · • · · • · · · · • · • · • · · 5 kohdistuvatko nämä muutokset mahdollisesti proteiinin primaarisen sekvenssin reseptoria sitovaan alueeseen. Koska natiivin KGF:n kolmiulotteista rakennetta eikä primaarisessa rakenteessa esiintyvää reseptoria sitovaa aluetta 5 ole julkaistu, ei tällä alalla vallitsevan tiedon valossa ole mahdollista tehdä yleistyksiä natiiviin KGF:ään tehtyjen aminohappomodifikaatioiden vaikutuksista edes niiden vaikutusten perusteella, joita aminohappomodifikaatioilla on tämän kanssa samaan ryhmään luokiteltuihin proteiinei-10 hin.
Tämän keksinnön tavoitteena on saattaa käyttöön sellaisia analogeja koodaavia polypeptidimolekyylejä, jotka ovat natiivia KGF:ää pysyvämpiä (esimerkiksi saatettuna pH: n, lämpötilan ja/tai muiden varastointiolosuhteiden 15 suhteen tyypillisiin olosuhteisiin).
Keksinnön yhteenveto Tästä keksinnöstä saadaan käyttöön KGF:n uusia biologisesti aktiivisia polypeptidianalogeja. Tämän keksinnön tarkoituksia varten termi "KGF" sisältää natiivin KGF:n ja 20 proteiinit, joiden luonteenomaisena piirteenä on peptidi- sekvenssi, joka on olennaisesti samanlainen kuin natiivin KGF:n peptidisekvenssi, jossa ovat jäljellä kysteiiniryh-mät, jotka vastaavat natiivin KGF:n Cys^tä ja Cys15:tä (sekvenssin nro 2 Cys 32 ja 46) , ja jossa on säilynyt 25 tietty osa natiivin KGF:n biologisesta aktiivisuudesta, • · j erityisesti ei-fibroblastiepiteelisolujen lisääntymiseen • · · vaikuttava aktiivisuus, tai tämä aktiivisuus kokonaisuu- • « j·. dessaan. Ilmaisu "joille tyypillisenä piirteenä on pepti- ♦ · · *... disekvenssi, joka on olennaisesti samanlainen kuin natii- f · · • « « ‘ 30 vin KGF:n peptidisekvenssi" tarkoittaa peptidisekvenssiä, jota koodaa DNA-sekvenssi, joka kykenee, edullisesti ra- • · : ** joittavissa hybridisaatio-olosuhteissa, hybridisoitumaan »« ♦ V * sekvenssin nro 1 nukleotideihin 201 - 684.
• Vastaava aminohappoasema kahden aminohapposekvens-• · · ,···. 35 sin välillä voidaan määrittää kohdistamalla nämä kaksi i · • · · • · · • · · • · % φ · · • · • · • · · 6 sekvenssiä toistensa suhteen siten, että yhteensopivien ryhmien määrä saadaan mahdollisimman suureksi, mikä sisältää aminoterminaalisen ja/tai karboksiterminaalisen pään siirron, tarvittaessa aukkojen jättämisen ja/tai ehdolla 5 olevissa molekyyleissä insertioina esiintyvien ryhmien poiston. Tietokantahaut, sekvenssin analyysi ja muokkaus voidaan suorittaa jollakin tunnetuista ja rutiinikäytössä olevista sekvenssien homologiaa/identiteettiä hakeviin algoritmeihin perustuvista ohjelmista [esimerkiksi Pearson 10 ja Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85 (1988) 2444 -2448; Altschul, et ai., J. Mol. Biol. 215 (1990) 403 - 410; Lipman ja Pearson, Science 222 (1985) 1435 tai Deve-reux, et ai., Nuc. Acids Res. 12 (1984) 387 - 395].
Rajoittavat olosuhteet ovat hybridisaation yhtey-15 dessä rajoittavia olosuhteita, joissa on yhdistetty suola, lämpötila, orgaaniset liuottimet ja muut hybridisaatio-reaktioissa tyypillisesti kontrolloidut muuttujat. Esimerkkejä rajoittavista hybridisaatio-olosuhteista ovat hybridisaatio 4 x SSCrssa 62 - 67 °C:ssa ja tämän jälkeen 20 suoritettu pesu 0,1 x SSCrssa 62 - 67 °C:ssa noin tunnin ajan. Vaihtoehtoisesti kuvaavana esimerkkinä rajoittavista hybridisaatio-olosuhteista ovat hybridisaatio 45 - 55-prosenttisessa formamidissa, 4 x SSC:ssa 40 - 45 °C:ssa. [Tä-·.·.· tä kysymystä on käsitelty teoksessa Maniatis, T., et ai., • 25 Molecular Cloning (A Laboratory Manual); Cold Spring Har- : bor Laboratory (1982), sivuilla 387 - 389.] • · · ·;··· Siten proteiinit sisältävät alleelisia variaatioita j1. tai aminohappodeleetion(itä) , -substituution(itä) tai -in- sertion(itä) , mukaan lukien natiivin KGF:n fragmentit, ki- 30 meeriset tai hybridimolekyylit. Yksi esimerkki KGF:sta si- .. sältää varaukseltaan muuttuneita polypeptidejä, joissa yk- * · · *,,, si tai useampi natiivin KGF:n aminohappo ryhmistä 41 - 154 ’ (edullisesti ryhmät Arg41, Gin43, Lys55, LyS95, Lys128, Asn137,
Gin138, LyS139, Argl44, Lys147, Gin152, Lys153 tai Thr154) on de-Γ”: 35 letoitu tai korvattu neutraalilla ryhmällä tai negatiivi- • 1 · • % · II» · · • · • · • · · 7 sesti varautuneella ryhmällä, joka on valittu siten, että saadaan muodostumaan proteiini, jonka positiivinen varaus on lähtömuotoa pienempi (tämän keksinnön tekijöiden nimissä olevassa julkaisussa USSN 08/323 337, joka on jätetty 5 13.10.1994, esitetyllä tavalla), erityisesti mukaan lukien R(144)Q:n, joka on KGF, jossa natiivin KGF:n aminohappo-asemassa 144 esiintyvä arginiini on korvattu glutamiinil-la. Vielä yksi esimerkki KGF:stä sisältää proteiineja, jotka on valmistettu käyttämällä natiivin KGF:n silmukkaa 10 muodostavalla AsnI15-His116-Tyr117-Asn118-Thr119-alueella esiinty vän vähintään yhden aminohapon tilalla vähintään yhtä aminohappoa, jolla on voimakkaampi silmukkaa muodostava potentiaali (tämän keksinnön tekijöiden nimissä olevassa julkaisussa USSN 08/323 473, joka on jätetty 13.10.1994, 15 esitetyllä tavalla), erityisesti lukien mukaan H(116)G:n, joka on KGF, jossa natiivin KGF:n aminohappoaseman 116 kohdalla olevan histidiinin tilalla on käytetty glysiiniä. Vielä yksi esimerkki sisältää proteiinit, joissa natiivin KGF:n alueella 123 - 133 (sekvenssin nro 2 aminohapot 20 154 - 164) on yksi tai useampi aminohapposubstituutio, -deleetio tai -additio; näillä proteiineilla voi olla ago-nistista tai antagonistista aktiivisuutta.
Tässä keksinnössä on tehty se yllättävä löytö, että • t *·ί·* kun KGF-molekyyliä (toisin sanoen lähtömuotoa olevaa mole- » \ 25 kyyllä) , joka sisältää kysteiiniryhmät, jotka vastaavat « · ·,* · (edellä kuvatuilla menetelmillä määritettynä) natiivin *:·*: KGF:n Cys!:tä ja Cys15:tä (sekvenssin nro 2 kysteiiniryhmät Γ'.. 32 ja 46) , modifioidaan korvaamalla näitä vastaavat kys- .’j‘; teiinit muilla ryhmillä, on tulokseksi saatavan KGF-analo- 30 gin pysyvyys lähtömuotoisen molekyylin pysyvyyttä parempi.
j*. Tämä keksintö kohdistuu edullisesti lisääntyneen pysyvyy- * ·· den saavuttamisen lisäksi niihin analogeihin, joissa bio-
• ♦ S
*. loginen aktiivisuus on täydellistä (toisin sanoen sitoutu- « \l.: minen reseptoriin tai affiniteetti ovat vähintään huomat- 35 tavassa määrin samanlaisia) natiiviin KGF:ään verrattuna.
• · · 9 · * » *·· • · f · 8
Vielä yhdessä tämän keksinnön kohteessa kuvataan puhdistettuja ja eristettyjä nukleiinihappomolekyylejä, jotka koodaavat KGF:n useita erilaisia biologisesti aktiivisia polypeptidianalogeja. Yhdessä sovellutusmuodossa 5 nämä nukleiinihapot sisältävät DNA-molekyylejä, jotka on kloonattu biologisesti toiminnallisiin plasmidi- tai vi-rusvektoreihin. Vielä yhdessä sovellutusmuodossa voidaan nukleiinihappokonstruktioita tämän jälkeen käyttää pro-karyoottisen tai eukaryoottisen isäntäsolun stabiiliin 10 transformointiin. Vielä yhdessä sovellutusmuodossa tämä keksintö sisältää menetelmän, jossa joko prokaryoottis-ta isäntäsolua (edullisesti E. colia) tai eukaryoottista isäntäsolua, joka on transformoitu stabiilisti nukleiini-happomolekyylillä, kasvatetaan sopivissa elatusolosuhteis-15 sa tavalla, joka mahdollistaa KGF-analogin ilmentymisen. Tulokseksi saatu yhdistelmä-polypeptidi voidaan ilmentämisen jälkeen eristää ja puhdistaa.
Vielä yksi tämän keksinnön kohde koskee farmaseuttisia formulaatioita, jotka sisältävät terapeuttisesti 20 tehokkaan määrän KGF-analogia ja hyväksyttävää farmaseuttista kantaja-ainetta. Nämä formulaatiot ovat käyttökelpoisia sellaisten potilaiden hoidossa, joilla on epiteelissä esiintyviä sairauksia ja vammoja.
·,·,· Jatkona edellisille liittyy vielä yksi kohde mene- | 25 telmiin, joilla epiteelisolujen kasvua stimuloidaan anta- I maila potilaalle terapeuttisesti tehokas määrä KGF-analo- * % · *«··· gia. Yhdessä sovellutusmuodossa lisääntymisen stimulointi kohdistetaan juuri ei-fibroblastisiin epiteelisoluihin.
·«·, Näitä epiteelisoluja ovat useat sivuelinten solut, haima- • · · 30 solut, maksasolut ja hengitys- ja hengitystiehyeiden ja ,, gastrointestinaalikanavan limakalvon epiteeli.
• · *w** Piirustusten lyhyt kuvaus * m ·
Kuvio 1 esittää natiivin KGF:n nukleotidisekvenssiä ; ·’: (sekvenssi nro 1) ja aminohapposekvenssiä (sekvenssi nro «·· j**'· 35 2) (natiivin KGF:n kypsää muotoa kuvaavia nukleotideja « · » » M· • · » 4 · 4 444 4 » * t 144 9 esittävät sekvenssin nro 1 mukaiset emäkset 201 - 684 ja KGF:n kypsää muotoa esittävät sekvenssin nro 2 aminohappo-ryhmät 32 - 194).
Kuviot 2A, 2B ja 2C esittävät plasmidien pCFM1156, 5 pCFM1656 ja pCFM3102 karttoja, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna.
Kuvio 3 esittää konstruktion RSH-KGF nukleotidisek-venssiä (sekvenssi nro 3) ja aminohapposekvenssiä (sekvenssi nro 4).
10 Kuvio 4 esittää plasmidin KGF sisältämän konstruk tion nukleotidisekvenssiä (sekvenssi nro 5) ja aminohappo-sekvenssiä (sekvenssi nro 6).
Kuvio 5 esittää kemiallisesti syntetoituja oligo-nukleotideja (Oligo#6 - Oligo#ll; sekvenssit nro 12 - 17, 15 mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna), joita käytettiin plasmidin KGF sisältämässä konstruktiossa Kpnl-kohdan ja EcoRI-kohdan välisen DNA-sekvenssin tilalla plasmidissa KGF(dsd) käytetyn konstruktion aikaansaamiseksi.
Kuvio 6 esittää kemiallisesti syntetoituja oligo-20 nukleotidejä (Oligo#12 - Oligo#24; sekvenssit nro 18 - 30, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna), joita käytettiin • · · KGF (codon optimized) :n konstruointiin.
• · · J ·’ Kuvio 7 esittää KGF-analogin C(l,15)S:n nukleoti- • · · ··’ · disekvenssiä (sekvenssi nro 31) ja aminohapposekvenssiä 10 pään 3 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu ja aminohappo-asemassa 15 esiintyvä kysteiini on deletoitu.
Kuvio 10 esittää KGF-analogin AN8/C(15)S:n nukleo-tidisekvenssiä (sekvenssi nro 37) ja aminohapposekvenssiä 5 (sekvenssi nro 38) , jossa natiivin KGF:n N-terminaalisen pään 8 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu ja aminohappo-asemassa 15 esiintyvä kysteiini korvattu seriinillä.
Kuvio 11 esittää KGF-analogin AN8/C(15)-:n nukleo-tidisekvenssiä (sekvenssi nro 39) ja aminohapposekvenssiä 10 (sekvenssi nro 40), jossa natiivin KGF:n N-terminaalisen pään 8 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu ja aminohappo-asemassa 15 esiintyvä kysteiini on deletoitu.
Kuvio 12 esittää KGF-analogin ΔΝ15:n nukleotidisek-venssiä (sekvenssi nro 41) ja aminohapposekvenssiä (sek-15 venssi nro 42), jossa natiivin KGF:n N-terminaalisen pään 15 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu.
Kuvio 13 esittää KGF-analogin ΔΝ16: n nukleotidisek-venssiä (sekvenssi nro 43) ja aminohapposekvenssiä (sekvenssi nro 44), jossa natiivin KGF:n N-terminaalisen pään 20 16 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu.
. Kuvio 14 esittää KGF-analogin ΔΝ17:η nukleotidisek- • · !**·1 venssiä (sekvenssi nro 45) ja aminohapposekvenssiä (sek- • · · • ·1 venssi nro 46), jossa natiivin KGF:n N-terminaalisen pään • · : 17 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu.
25 Kuvio 15 esittää KGF-analogin ΔΝ18 : n nukleotidisek- { venssiä (sekvenssi nro 47) ja aminohapposekvenssiä (sek- venssi nro 48) , jossa natiivin KGF:n N-terminaalisen pään 18 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu.
;·. Kuvio 16 esittää KGF-analogin ΔΝ19: n nukleotidisek- 30 venssiä (sekvenssi nro 49) ja aminohapposekvenssiä (sek- • · · venssi nro 50), jossa natiivin KGF:n N-terminaalisen pään 19 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu.
• · ·
Kuvio 17 esittää KGF-analogin ΔΝ20:n nukleotidisek-venssiä (sekvenssi nro 51) ja aminohapposekvenssiä (sek- • · · · · • · • · • · · 11 venssi nro 52), jossa natiivin KGF:n N-terminaalisen pään 20 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu.
Kuvio 18 esittää KGF-analogin ΔΝ21:η nukleotidisek-venssiä (sekvenssi nro 53) ja aminohapposekvenssiä (sek-5 venssi nro 54) , jossa natiivin KGF:n N-terminaalisen pään 21 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu.
Kuvio 19 esittää KGF-analogin ΔΝ22:η nukleotidisek-venssiä (sekvenssi nro 55) ja aminohapposekvenssiä (sekvenssi nro 56), jossa natiivin KGF:n N-terminaalisen pään 10 22 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu.
Kuvio 20 esittää KGF-analogin ΔΝ23:η nukleotidisek-venssiä (sekvenssi nro 57) ja aminohapposekvenssiä (sekvenssi nro 58) , jossa natiivin KGF:n N-terminaalisen pään 23 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu.
15 Kuvio 21 esittää KGF-analogin ΔΝ24:η nukleotidisek- venssiä (sekvenssi nro 59) ja aminohapposekvenssiä (sekvenssi nro 60), jossa natiivin KGF:n N-terminaalisen pään 24 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu.
Kuvio 22 esittää KGF-analogin C(1,15)S/R(144)E:n 20 nukleotidisekvenssiä (sekvenssi nro 61) ja aminohapposekvenssiä (sekvenssi nro 62) , jossa natiivin KGF:n arainohap- • · *·:·1 poasemissa 1 ja 15 esiintyvä kysteiini on korvattu serii- • · · : .1 nillä ja aminohappoasemassa 144 esiintyvä arginiini kor- • · : vattu glutamiinihapolla.
*:2: 25 Kuvio 23 esittää KGF-analogin C (1,15) S/R (144) Q:n i1·.. nukleotidisekvenssiä (sekvenssi nro 63) ja aminohapposek- venssiä (sekvenssi nro 64) , jossa natiivin KGF:n aminohap- poasemissa 1 ja 15 esiintyvä kysteiini on korvattu serii- ;·. nillä ja aminohappoasemassa 144 esiintyvä arginiini kor- • · · 30 vattu glutamiinilla.
*. Kuvio 24 esittää KGF-analogin AN23/R(144)Q:n nuk- •,i.: leotidisekvenssiä (sekvenssi nro 65) ja aminohapposekvens- J : siä (sekvenssi nro 66) , jossa natiivin KGF:n N-terminaali- .···. sen pään 23 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu ja amino-
• · I
· · • · * · 2 • · · 12 happoasemassa 144 esiintyvä arginiini korvattu glutamii-nilla.
Kuvio 25 esittää jäljellä olevan liukoisen proteiinin määrää, kun natiivia KGF:ää ja C(l,15)S:ää oli säi-5 lytetty 37 °C:ssa 27 tunnin ajan 20 mM Na-fosfaatin ja 0,15 M NaCl:n seoksessa, jonka pH oli 7,0.
Kuvio 26 esittää jäljellä olevan liukoisen proteiinin määrää, kun natiivia KGF:ää ja C(l,15)S:ää oli säilytetty 37 °C:ssa 27 tunnin ajan 0,15 M NaCl:n, 20 mM Na-10 fosfaatin ja 0,15 M NaCl:n seoksessa, jonka pH oli 7,0.
Kuvio 27 esittää jäljellä olevan liukoisen proteiinin määrää, kun natiivia KGF:ää ja C(l,15)S:ää oli säilytetty 37 °C:n lämpötilassa 27 tunnin ajan 50 mM NaP04:n ja 0,15 M NaCl:n seoksessa, jonka pH oli 7,0.
15 Kuvio 28 esittää liukoisen proteiinin määrää määri tettynä kokoekskluusio-HPLCm perusteella 37 °C:ssa inku-bointiajan funktiona.
Kuvio 29 esittää natiivin KGF:n, C(1,15)S/R(144)Q:n ja C (1,15) S/R (144) E :n arvioitua sul amis lämpötilaa (Tm) pH: n 20 funktiona.
. Kuvio 30 esittää C(l,15)S:n tyypillistä mitogeeni- sen aktiivisuuden profiilia, joka on määritetty määrittä- • · · | ·* maila [3H] -tymidiinin kerääntyminen soluihin DNA-synteesin • · · : aikana ja vertaamalla tätä natiivin KGF:n standardikäy- 25 rään.
• · * *·· Kuvio 31 esittää tyypillistä ΔΝ15:η mitogeenisen aktiivisuuden profiilia, joka on määritetty määrittämällä [3H] -tymidiinin kerääntyminen soluihin DNA-synteesin aikana ja vertaamalla tätä natiivin KGF:n standardikäyrään.
30 Kuvio 32 esittää tyypillistä ΔΝ23:η mitogeenisen • · · • aktiivisuuden profiilia, joka on määritetty määrittämällä • · · - rHJ -tymidiinin kerääntyminen soluihin DNA-synteesin aikana • · · ja vertaamalla tätä natiivin KGF:n standardikäyrään.
:*r. Kuvio 33 esittää tyypillistä AN23/R(144)Q:n mito- .···. 35 geenisen aktiivisuuden profiilia, joka on määritetty mää-• ♦ ··· 13 rittämällä 1¾]-tymidiinin kerääntyminen soluihin DNA-syn-teesin aikana ja vertaamalla tätä natiivin KGF:n standardi käyrään .
Kuvio 34 esittää tyypillistä C(1,15)S/R(144)Q:n mi-5 togeenisen aktiivisuuden profiilia, joka on määritetty määrittämällä [3H]-tymidiinin kerääntyminen soluihin DNA-synteesin aikana ja vertaamalla tätä natiivin KGF:n stan-dardikäyrään.
Kuvio 35 esittää tyypillistä C(1,15)S/R(144)E:n mi-10 togeenisen aktiivisuuden profiilia, joka on määritetty määrittämällä (¾] -tymidiinin kerääntyminen soluihin DNA-synteesin aikana ja vertaamalla tätä natiivin KGF:n stan-dardikäyrään.
Kuvio 36 esittää C(l,15)S:n ja ΔΝ23:η vaikutuksia 15 seerumin kemioihin.
Kuvio 37 esittää KGF-analogin C(l,15,40)S:n nukleo-tidisekvenssiä (sekvenssi nro 77) ja aminohapposekvenssiä (sekvenssi nro 78) , jossa natiivin KGF:n aminohappoasemissä 1, 15 ja 40 esiintyvä kysteiini on korvattu seriinillä. 20 Kuvio 38 esittää KGF-analogin C(1,15,102)S:n nuk- . leotidisekvenssiä (sekvenssi nro 79) ja aminohapposekvens- • · · .;** siä (sekvenssi nro 80) , jossa natiivin KGF:n aminohappo- • · · • ·’ asemissa 1, 15 ja 102 esiintyvä kysteiini on korvattu se- • · · :** : riinillä.
*·**· 25 Kuvio 39 esittää KGF-analogin C (1,15,102,106) S :n • · J *·· nukleotidisekvenssiä (sekvenssi nro 81) ja aminohapposek- venssiä (sekvenssi nro 82) , jossa natiivin KGF:n aminohap-poasemissa 1, 15, 102 ja 106 esiintyvä kysteiini on kor-vattu seriinillä.
• · · 30 Kuvio 40 esittää KGF-analogin ΔΝ23/Ν(137)E:n nuk- • · · leotidisekvenssiä (sekvenssi nro 83) ja aminohapposekvens-siä (sekvenssi nro 84) , jossa natiivin KGF:n N-terminaali- • · · ‘..,* sen pään 23 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu ja amino- happoasemassa 137 esiintyvä asparagiini korvattu glutamii- .···. 35 nihapolla.
• · ··· 14
Kuvio 41 esittää KGF-analogin ΔΝ23/Ν(139)E:n nuk-leotidisekvenssiä (sekvenssi nro 85) ja aminohapposekvenssiä (sekvenssi nro 86) , jossa natiivin KGF:n N-terminaalisen pään 23 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu ja amino-5 happoasemassa 137 esiintyvä lysiini korvattu glutamiiniha-polla.
Kuvio 42 esittää KGF-analogin ΔΝ23/Κ(139)Q:n nuk-leotidisekvenssiä (sekvenssi nro 87) ja aminohapposekvenssiä (sekvenssi nro 88), jossa natiivin KGF:n N-terminaali-10 sen pään 23 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu ja ami-nohappoasemassa 139 esiintyvä lysiini korvattu glutamii-nilla.
Kuvio 43 esittää KGF-analogin ΔΝ23/ΙΙ(144)A:n nukleotidi sekvenssiä (sekvenssi nro 89) ja aminohapposekvens-15 siä (sekvenssi nro 90) , jossa natiivin KGF:n N-terminaalisen pään 23 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu ja ami-nohappoasemassa 144 esiintyvä arginiini korvattu alanii-nilla.
Kuvio 44 esittää KGF-analogin AN23/R(144)E:n nuk-20 leotidisekvenssiä (sekvenssi nro 91) ja aminohapposekvens- , siä (sekvenssi nro 92) , jossa natiivin KGF:n N-terminaali- • · [··;1 sen pään 23 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu ja amino- • · · • ·1 happoasemassa 144 esiintyvä arginiini korvattu glutamiini- • · : hapolla.
25 Kuvio 45 esittää KGF-analogin AN23/R(144)L:n nuk- j leotidisekvenssiä (sekvenssi nro 93) ja aminohapposekvens- j1:1: siä (sekvenssi nro 94) , jossa natiivin KGF:n N-terminaali- sen pään 23 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu ja ami-nohappoasemassa 144 esiintyvä arginiini korvattu leusii-30 nilla.
• · ·
Kuvio 46 esittää KGF-analogin ΔΝ23/Κ(147)E:n nuk-leotidisekvenssiä (sekvenssi nro 95) ja aminohapposekvens- • · · siä (sekvenssi nro 96) , jossa natiivin KGF:n N-terminaali-sen pään 23 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu ja amino- • · · · · • · • · • · 1 happoasemassa 147 esiintyvä lysiini korvattu glutamiiniha- polla.
15
Kuvio 47 esittää KGF-analogin ΔΝ23/Κ(147)Q:n nuk-leotidisekvenssiä (sekvenssi nro 97) ja aminohapposekvens-5 siä (sekvenssi nro 98) , jossa natiivin KGF:n N-terminaali-sen pään 23 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu ja ami-nohappoasemassa 147 esiintyvä lysiini korvattu glutamii-nilla.
Kuvio 48 esittää KGF-analogin ΔΝ23/Κ(153)E:n nuk-10 leotidisekvenssiä (sekvenssi nro 99) ja aminohapposekvens siä (sekvenssi nro 100), jossa natiivin KGF:n N-terminaa-lisen pään 23 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu ja ami-nohappoasemassa 153 esiintyvä lysiini korvattu glutamiini-hapolla.
15 Kuvio 49 esittää KGF-analogin ÄN23/K(153)Q:n nuk- leotidisekvenssiä (sekvenssi nro 101) ja aminohapposekvenssiä (sekvenssi nro 102), jossa natiivin KGF:n N-ter-minaalisen pään 23 ensimmäistä aminohappoa on deletoitu ja aminohappoasemassa 153 esiintyvä lysiini korvattu gluta-20 miinihapolla.
Kuvio 50 esittää KGF-analogin ΔΝ23/Q(152)E/ K(153)E:n nukleotidisekvenssiä (sekvenssi nro 103) ja ami- • · · • V nohapposekvenssiä (sekvenssi nro 104), jossa natiivin :: : KGF:n N-terminaalisen pään 23 ensimmäistä aminohappoa on ·;··· 25 deletoitu ja aminohappoasemassa 152 esiintyvä glutamii- ni korvattu glutamiinihapolla ja aminohappoasemassa 153 • j·;·. esiintyvä lysiini korvattu glutamiinihapolla.
Kuvio 51 esittää ΔΝ23:η vaikutusta streptotsooto- .. siinillä aikaansaatuun diabetekseen Sprague-Dawley-rotis- •‘..1’ 30 sa.
• · · '·] * Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus ij*: Tämän keksinnön mukaisesti siitä saadaan käyttöön »*’*: uusia KGF:n analogeja. Tässä keksinnössä on saatu selvil- • · · le, että neljä kysteiiniryhmää (Cys1 ja Cys15, ja Cys102 ja • · · "... 35 Cys106) natiivin KGF :n kysteiiniryhmistä osallistuvat kahden • · • · ··· 16 disulfidisillan muodostamiseen. Cys40 ei osallistu molekyylien välisen disulfidisillan muodostamiseen. KGF sisältää siten kaksi pientä disulfidisilmukkaa, jotka ovat lähes 90 aminohapon päässä toisistaan. Kun disulfidisiltojen 5 muodostamiseen osallistuvat kysteiiniryhmät on saatu selville, on tärkeysjärjestyksen perusteella saatavissa viitteitä siitä, mitkä kysteiinit ovat vapaita muodostamaan molekyylien välisiä haitallisia siltoja tai molekyylin sisäisiä sidoksia, joiden vaikutuksesta proteiinille syn-10 tyy haitallinen tertiäärinen rakenne (esimerkiksi proteiinin aktiivisuutta alentava konformaatio).
Tässä keksinnössä on tehty se hämmästyttävä löytö, että kun KGFrää modifioidaan poistamalla KGF:n asemia 1 ja 15 (sekvenssin nro 2 asemia 32 ja 46) vastaavat kysteiini-15 ryhmät tai korvaamalla nämä muilla aminohapporyhmillä, saadaan muodostumaan KGF-analogi, joka on huomattavasti lähtömuotoa pysyvämpi (toisin sanoen tällä esiintyy vähemmän molekyylin väärin tapahtuneesta uudelleenlaskostumi-sesta, molekyylien välisten disulfidien muodostumisesta 20 ja/tai proteiinin aggregaatiosta johtuvia ongelmia). Esi- . merkiksi KGF-analogeja puhdistettaessa on liukoisen oi- • · *···’ kealla tavalla laskostuneen proteiinin saanto tavallisesti • · · • ·' natiivin molekyylin saantoa parempi. Lisäksi materiaali on • · : puhdistamisen jälkeen stabiilimpi pH:n, lämpötilan ja mui- “**! 25 den vastaavien muuttujien suhteen lähtömolekyylin stabii- j lisuuteen verrattuna. Mihinkään teoriaan rajoittumatta voidaan todeta, että sen lisäksi, että KGF:n Cys1 ja Cys15 muodostavat molekyylin sisäisen disulfidisillan ja N-ter- minaalisen disulf idi silmukan, ne esiintyvät luultavasti • ♦ · ** 30 tietyissä olosuhteissa myös vapaina kysteiineinä, jotka • · · kykenevät muodostamaan molekyylien välisiä disulfidisil-toja, jotka saavat aikaan proteiinin pysymättömyyden ja • · · aggregoitumisen. Lisäksi on tehty se löytö, että N-termi-naalisen disulf idi silmukan deleetio ei ole tärkeä sitou- • · · .···. 35 tumiselle reseptoriin tai mitogeeniselle aktiivisuudelle.
• · • · · 17 Tässä keksinnössä "KGF-analogi" tai "KGF:n polypep-tidianalogi" tarkoittaa mitä tahansa kuvatuista luonnossa esiintyvistä po lypep ti deist ä ja sellaisista polypeptideis-tä, jota ei esiinny luonnossa, joka eroaa rakenteeltaan 5 KGFrsta sen perusteella, että siinä esiintyy sellaiseen peptidisekvenssiin tehtyjä modifikaatioita, joka vastaa 24 aminohapon suuruista osaa KGF:n N-terminaalista päästä (sekvenssin nro 2 aminohapot 32 - 55), jossa KGF:n Cys1 ja Cys15 (sekvenssin nro 2 aminohapot 32 - 46) on korvattu 10 muilla aminohapoilla tai ne on deletoitu. Se tapa, millä kysteiinit korvataan muilla aminohapoilla tai deletoidaan, ei ole merkittävä ja tähän sisältyvät esimerkiksi polypep-tidianalogit, joissa on tehty yhden tai useamman aminohapon suuruisia deleetioita ja/tai substituutioita. Tämän 15 mukaisesti tästä keksinnöstä saadaan ryhmä uusia keratino-syyttikasvutekijäproteiineja. Tämä ryhmä sisältää useita proteiinien ryhmiä.
Yksi KGF-analogien ryhmä sisältää molekyylejä, joissa KGF:n asemissa 1 ja 15 esiintyvät kysteiinit on 20 korvattu aminohapoilla, mukaan lukien sellaisilla amino- . hapoilla, joita ei proteiineissa luonnossa esiinny. Subs- • · ];*** tituutioanalogien valmistamiseen soveltuvia strategioita • · · : ·* ovat kohdemutageneesin käyttö [Ho, et ai., Gene 77 (1989) • · : 51 - 59; Innis, et ai., "PRC Protocols", Academic Press, 25 Inc., San Diego, CA] . [Aminohapposubstituution sisältävis- • · * *·· tä KGF-analogeista käytetään nimitystapaa, jossa esitetään ΓΓ: kyseessä olevassa asemassa sekvenssissä nro 2 esitetyssä kypsässä proteiinissa (ilman signaalisekvenssiä) esiintyvä ryhmä, jota seuraavat tämä aminohappoasema sulkuihin mer-30 kittynä ja uusi aminohappo. Esimerkiksi analogista, joka • · · sisältää KGF:n aminohappoasemaan 15 tehdyn substituution kysteiinistä seriiniksi, käytetään nimitystä "C(15)S".] • ♦ ♦ :...· Kysteiini muutetaan edullisesti neutraaliksi aminohapoksi, » kuten glysiiniksi, valiiniksi, alaniiniksi, leusiiniksi, • · · ,···. 35 isoleusiiniksi, tyrosiiniksi, fenyylialaniiniksi, histi- • 0 • · · 18 diiniksi, tryptofääniksi, seriiniksi, treoniiniksi ja me-tioniiniksi ja seriini, freoniini ja alaniini ovat edullisimpia, koska ne muistuttavat kemiallisesti kysteiiniä. Esimerkissä 1 on esitetty yksityiskohdittain C(l,15)S:n 5 valmistus käyttäen osittaista geenin synteesiä (muiden yhdistelmä-DNA-menetelmien yhteydessä), ja tämän jälkeen suoritettua yhdistelmä-molekyylin ilmentämistä pysyvästi transformoidussa bakteeri-isännässä.
Toinen KGF-analogien ryhmä sisältää molekyylejä, 10 joissa KGF:sta on deletoitu asemissa 1 ja 15 esiintyvät kysteiinit. Tällaisten KGF-analogien kehittämisessä voidaan käyttää erilaisia strategioita, kuten typistämistä N-terminaalisesta päästä ja kohdedeleetioita tai näiden molempien yhdistelmiä.
15 "Typistäminen N-terminaalisesta päästä" tarkoittaa KGF: n modifiointia, jossa KGF:n 1-24 N-terminaalista aminohapporyhmää (sekvenssin nro 2 mukaiset aminohapot 32 - 55) , mukaan lukien Cys1 ja Cys15, on deletoitu. [KGF- analogeja, joista aminohappoja on typistetty, nimitetään 20 deleetiokohdasta lukien sen ryhmän perusteella, joka . esiintyy kyseessä olevassa asemassa sekvenssissä nro 2 • ♦ ]···* esitetyssä kypsässä proteiinissa (ilman signaalisekvens- : siä), sekä deletoitujen ryhmien lukumäärän perusteella.
« · I Esimerkiksi sellaisesta KGF-analogista, jossa KGF:ää on 25 typistetty N-terminaalisesta päästä 24 ryhmää (sekvenssin j nro 2 ryhmät 1 - 55), käytetään nimitystä "ΔΝ24"-analogi . ] :T: Tähän ryhmään sisältyvät erityisesti sellaiset natiivin « KGF:n ΔΝ23-analogit, joissa yksi tai useampi aminohappo-ryhmistä 41 - 154 (sekvenssin nro 2 aminohapot 72 - 185) , • «♦ • j*. 3 0 erityisesti ne, jotka sisältävät aminohapporyhmät 123 -• · · 133 (sekvenssin nro 2 aminohapot 154 - 164) on deletoitu tai korvattu neutraalilla ryhmällä tai negatiivisesti va- • · · rautuneella ryhmällä, joka on valittu siten, että se tuot-taa proteiinin, jonka positiivinen varaus on lähtömuotoa • « · #···. 35 pienempi. Edullisia modifiointiin sopivia ryhmiä ovat • · ··· 19
Arg41, Gin43, Lys55, Lys95, Lys128, Asn137, Gin138, Lys139, Arg144, Lys147, Gin152, Lys153 tai Thr154 ja edullisempia ovat Gin138, Lys139, Arg144, Lys147, Gin152 tai Lys153 ja edullisin on Arg144. Tähän ryhmään sisältyvät myös sellaiset natiivin KGF:n 5 ΔΝ23-analogit, joissa esiintyvät ryhmät Asn115-His116-Tyr117-Asn118-Thr119 (sekvenssin nro 2 aminohapot 146 - 150) sisältävässä silmukkaa muodostavassa alueessa esiintyvät silmukkaa muodostavat modifikaatiot, joihin edullisesti sisältyvät aminohappo ryhmän 116 varausta muuttava modifikaa-10 tio, ja edullisemmin asemassa 116 esiintyvän Gly:n substituutio. Tähän ryhmään sisältyvät vielä lisäksi sellaiset natiivin KGF:n ΔΝ23-analogit, joissa natiivin KGF:n alueeseen 123 - 133 (sekvenssin nro 2 aminohapot 154 - 164) sisältyy yksi tai useampi aminohapposubstituutio, -delee-15 tio tai -additio.
Esimerkissä 1 on esitetty yksityiskohdittain sellaisten N-terminaalisen pään systemaattisten typistysten valmistusta, jotka on saatu aikaan käyttämällä osittaista geenien synteesiä yhdistettynä muihin yhdistelmä-DNA-mene-20 telmiin, minkä jälkeen yhdistelmämolekyyliä on ilmennetty stabiilisti transformoidussa bakteeri-isännässä. Tälläisi- ’·*·’ na kuvaavina esimerkkeinä käytettäviä N-terminaalisia ty- • · · : .* pistettyjä muotoja ovat ΔΝ15 - ΔΝ24. Lisäksi esimerkissä 3 t · · on esitetty yksityiskohdittain sellaisen DNA:n ilmentämis- *ί**ί 25 tä soluviljelmässä viljellyissä nisäkässoluissa, joka koo-daa natiivia KGF:ää ja heterogeenisiä N-terminaalisia gly-·*·': kosyloituja isomuotoja, sekä sellaisen edullisesti glyko- m syloidun isomuodon puhdistamista, josta natiivin KGF: n ;·, kypsän muodon 1-23 N-terminaalista aminohappoa on typis- * · · 30 tetty.
• · · Tästä poiketen tarkoittaa kohdedeleetio sellaista KGF:n modifikaatiota, jossa yksi tai useampi aminohappo-ryhmä (esimerkiksi Cys1 tai Cys15) on poistettu. Kun KGF:n Cys1 tai Cys15 deletoidaan spesifisesti, on analogi yhden 4 · · 35 aminohapon verran KGF:ää lyhyempi. [KGF-analogeja, jotka • ♦ »« · 20 sisältävät aminohappodeleetion, nimitetään sen ryhmän perusteella, joka esiintyy tässä asemassa sekvenssissä nro 2 esitetyssä kypsässä proteiinissa (ilman signaalisekvens-siä), minkä jälkeen tulevat kyseessä oleva aminohappoasema 5 ja miinusmerkki. Esimerkiksi tässä ryhmässä esiintyvää analogia, joka sisältää KGF:n asemassa 15 (sekvenssin nro 2 asemassa 36) olevan kysteiinin deleetion, nimitetään "C (15) - " :ksi. ] Kohdedeleetioita voidaan valmistaa kohdemu-tageneesillä edellä kuvatulla tavalla.
10 Tähän ryhmään kuuluvat myös analogit, joissa KGF:n
Cys1 ja Cys15 on poistettu typistämällä tai deletoimalla. Edustavat KGF-analogit sisältävät esimerkiksi KGF:n ensimmäisen kolmen aminoterminaalisen ryhmän (Cys-Asn-Asp) typistyksen tai KGF:n kahdeksan ensimmäisen aminohapon 15 (Cys-Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln) typistyksen yhdistettynä KGF:n asemassa 15 esiintyvän kysteiinin deleetioon (näitä analogeja nimitetään AN3/C(15)-:ksi ja AN8/C(15)-:ksi, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna). Koska metioniini-ryhmä esiintyy luonnossa natiivin KGF:n neljännessä ja 20 yhdeksännessä aminohappoasemassa, ei oikean tuloksen tuot- . tavaan translaatioon tarvita ylimääräistä Met-kodonia.
• *
Vielä yksi ryhmä sisältää molekyylejä, joissa KGF:n ♦ · · ; ·* asemissa 1 ja 15 esiintyvät kysteiinit on korvattu typis- • · · ϊ·* : tämällä tai korvaamalla. Esimerkiksi edustavia KGF-analo- :**· 25 geja ovat AN3/(C15)S, ja AN8/C(15)S. Nämä analogit sisäl- Λ * ’·· tävät KGF:n ensimmäisen kolmen aminoterminaalisen ryhmän tT: typistyksen tai KGF:n ensimmäisen kahdeksan aminoterminaa lisen ryhmän deleetion yhdistettynä aminohappoasemassa 15 esiintyvän kysteiinin korvaamiseen jollakin muulla amino- ,*·*. 30 hapolla, esimerkiksi seriinillä.
e · ·
Silloin kun KGF-analogeja valmistetaan biologises- * · · ’.ί·* ti, eli silloin kun nämä ovat soluissa suoritetun ilmentä- « » · *...· misen tuotteita vastakohtana tuotteille, jotka on synte- toitu kiinteässä olomuodossa, muokattu proteolyyttisesti « .···. 35 tai entsymaattisesti luonnossa esiintyvistä tuotteista tai • · »«« 21 valmistettu muilla näitä vastaavilla tavoilla, poikkeavat näitä polypeptidejä koodaavat nukleiinihapot yhden tai useamman nukleotidin verran KGF:n natiivista nukleotidi-sekvenssistä. Näitä nukleotidejä voidaan ilmentää ja tu-5 lokseksi saatavia polypeptidejä puhdistaa millä tahansa useista tämän alan ammattikokemuksen perusteella tunnetuista yhdistelmä-DNA-tekniikan menetelmistä.
KGF-analogeja joko kokonaisuudessaan tai osittain koodaavat DNA-sekvenssit voivat sisältää muun muassa nii-10 hin liitettyjä kodoneja, jotka ovat "ensisijaisia" ilmentämiselle valituissa isäntäsoluissa (esimerkiksi "E. colin ilmentämiskodonit") ; niissä voidaan käyttää restriktioent-syymien pilkkomiskohtia; ja niissä voidaan käyttää muita aloitus-, lopetus- tai välinukleotidisekvenssejä (esimer-15 kiksi sekvenssin aloittavaa metioniiniaminohapporyhmää sekvenssin ilmentämiseksi E. coli -soluissa), joilla on tarkoituksena edistää vaikeuksitta ilmennettävien vektorien konstruointia.
Tästä keksinnöstä saadaan myös käyttöön polypepti-20 dien ilmentämismenetelmässä käytettäväksi tarkoitettuja . yhdistelmämolekyylejä tai vektoreita. Tällaiset vektorit • m · .ΓΊ voivat sisältää DNA:ta tai RNA:ta ja ne voivat olla luon- i « · ] ·* teeltaan rengasmaisia, lineaarisia, yksijuosteisia tai • · 4 ··' ϊ kaksijuosteisia ja ne voivat olla luonnossa esiintyviä tai *”*· 25 useista eri komponenteista yhdistettyjä kokoonpanoja, kat- • *·· somatta siihen, ovatko ne luonnossa esiintyviä vai syn- • ί ϊ teettisiä.
Tunnetaan monia esimerkkejä näistä ilmentämisvekto- l*· reistä. Näiden vektorien komponentit, esimerkiksi repliko- ,'i’. 3 0 nit, selektiogeenit, käynnistäjät, promoottorit ja muut * näitä vastaavat komponentit, voidaan hankkia luonnosta pe- « * · '*!·’ räisin olevista materiaalilähteistä tai syntetoida tunne- »«« *...· tuin menetelmin. Joka tapauksessa tässä keksinnössä käyt- » .'Γ. tökelpoiset ilmentämisvektorit sisältävät vähintään yhden « ·♦·. 35 ilmentämistä ohjaavan elementin, joka on liittynyt toimin- »9* 22 nallisesti vektoriin liitettyyn KGF-polypeptidianalogia koodaavaan nukleiinihappomolekyyliin. Tämän keksinnön mukaisista nukleiinihappomolekyyleistä tapahtuvan polypepti-dien ilmentämisen säätely perustuu tähän ohjausyksikköön.
5 Käyttökelpoisia ohjausyksiköltä ovat esimerkiksi lac-jär-jestelmä, trp-järjestelmä, λ-faagista peräisin olevat operaattorit ja promoottorit, hiivan glykolyyttinen promoottori, hiivan happamen fosfataasin geenistä ja hiivan alfa-mating-tekijästä peräisin olevat promoottorit ja adenovi-10 ruksesta, Epstein-Barr-viruksesta, polyomasta ja simian viruksesta peräisin olevat promoottorit sekä useista erilaisista retroviruksista peräisin olevat promoottorit. Tällä alalla tunnetaan kuitenkin useita muita vektoreita ja ohjausyksiköltä, jotka soveltuvat ilmentämiseen proka-15 ryoottisissa tai eukaryoottisissa soluissa, ja näitä voidaan käyttää tätä keksintöä käytettäessä.
Esimerkkejä sopivista prokaryoottisista kloonaus- vektoreista voivat olla plasmidit, jotka ovat peräisin E.
colista (esimerkiksi pBR322, col El, pUC ja F-tekijä), ja 20 edullisia plasmideja ovat pCFM1156 (ATCC 69702), pCFM1656 (ATCC 69576) ja pCFM102 (näitä on kuvattu alla olevassa . esimerkkejä käsittelevässä kappaleessa) . Tähän tarkoituk- • · · IV. seen voidaan myös käyttää muita sopivia ilmentämisvekto- • · : .·. reita, joita nisäkkäissä, hyönteisissä, hiivoissa ja sie- • · · ....· 25 nissä sekä bakteereissa suoritettavan ilmentämisen alalla • · tiedetään olevan lukuisia tyyppejä. Kun näitä vektoreita * · · *... transfektoidaan sopiviin isäntäsoluihin, voi tuloksena • · · *·* * olla näiden KGF-analogipolypeptidien ilmentyminen.
Tässä keksinnössä käyttökelpoiset isäntämikro-or- • · : *·· 30 ganismit voivat olla joko prokaryoottisia tai eukaryoot- • · · : tisia. Sopivia prokaryoottisia isäntiä ovat useat eri E.
. .·. coli -kannat (esimerkiksi FM5, HB101, DH5a, DH10 ja • · · .···. MC1061) , Pseudomonas-, Bacillus- ja Streptomyces-kannat, • · ”* ja edullinen on E. coli. Sopivia eukaryoottisia isäntäso- • · · *.* ’ 35 luja ovat hiiva ja muut sienet, hyönteissolut, kasvisolut • · · • · • · • · · 23 ja eläinsolut, kuten COS- (esimerkiksi COS-1 ja COS-7) ja CV-l-apinasolulinjat, Swiss-, Balb-c- tai NIH-soluista peräisin olevat 3T3-solulinjat, HeLa ja L929-hiirisolut ja CHO-, BHK- tai HaK-hamsterisolut. Tämän keksinnön mukai-5 sesti tuotetut yhdistelmäpolypeptidit ovat käytetyn isännän mukaan glykosyloituja nisäkkäiden tai muiden euka-ryoottien hiilihydraateilla tai ne voivat olla glykosyloi-tumattomia.
Edullinen valmistusmenetelmä on erilainen useiden 10 tekijöiden ja harkinnanvaraisten seikkojen mukaisesti; optimaalinen valmistusmenetelmä tietyn nimenomaisen tilanteen kyseessä ollessa on alan ammattikokemuksen perusteella ilmeinen vähäisiksi jäävien kokeilujen perusteella. Tämän jälkeen voidaan tulokseksi saatu ilmentämistuote puh-15 distaa lähes homogeeniseksi käyttäen tällä alalla tunnettuja menetelmiä. Tyypillinen puhdistusmenetelmä proka-ryoottisessa solussa tapahtuvan tuotannon kyseessä ollessa sisältää sen, että solun seinämät hajotetaan korkean paineen tai jonkin muun keinon avulla, solujätteet poistetaan 20 sentrifugoimalla tai suodattamalla ja supernatantti tai suodos käsitellään sitten ioninvaihtokromatografiällä ja lopuksi hydrofobiseen vuorovaikutukseen perustuvalla kro-matografiällä. Jos analogi ilmentyy liukenemattomassa muo- • · |dossa, sisältää toinen puhdistusmenetelmä sen, että analo-• · · 25 gia sisältävät inkluusiokappaleet solubilisoidaan, minkä :·. jälkeen suoritetaan ioninvaihtokromatograf ia, ja tämän • · · jälkeen proteiinin uudelleenlaskostaminen, ja lopuksi hyd- • · · rofobiseen vuorovaikutukseen perustuva kromatografia. Esimerkkejä puhdistusmenetelmistä on esitetty tämän keksinnön • · • ** 3 0 tekijöiden patenttioikeuksien haltijoiden nimissä olevassa : julkaisussa USSN 08/323 339, joka on jätetty 13.10.1994.
; Julkaisussa USSN 08/323 339 esitetään menetelmä keratino- • · · ,1··. syyttikasvutekijän puhdistamiseksi, joka menetelmä käsit- • · · tää sen, että: (a) hankitaan käyttöön KGF:ää sisältävä • · · ’·1 1 35 liuos; (b) sidotaan KGF osan (a) mukaisesta liuoksesta • · · • · • · • · · 24 kationinvaihtohartsiin; (c) eluoidaan KGF kationinvaihto-hartsista eluaattiliuokseen; (d) suoritetaan toimenpiteet, joissa osasta (c) peräisin oleva eluaattiliuos johdetaan sopivan molekyylipainoekskluusiomatriisin läpi tai suori-5 tetaan osan (c) eluaattiliuokselle hydrofobiseen vuorovaikutukseen perustuva kromatografia; (e) otetaan KGF talteen molekyylipainoekskluusiomatriisista tai hydrofobiseen vuorovaikutukseen perustuvasta kromatografiästä.
Analogit voidaan luonnollisesti seuloa nopeasti 10 niiden fysikaalisten ominaisuuksien määrittämiseksi. Esimerkkejä käsittelevässä kappaleessa esitetään useita erilaisia tunnettuja pysyvyysmäärityksiä, vaikka ei olekaan ratkaisevaa, mitä tiettyä nimenomaista määritystä analogin tutkimiseen käytetään. Lisäksi biologisen aktiivisuuden 15 tasoa (esimerkiksi sitoutumista reseptoriin ja/tai affiniteettia reseptorin suhteen, mitogeenistä aktiivisuutta, solujen lisääntymistä aikaansaavaa aktiivisuutta ja/tai aktiivisuutta in vivo -olosuhteissa) voidaan myös tutkia useilla erilaisilla määrityksillä, joista joitakin on esi-20 tetty esimerkkejä käsittelevässä kappaleessa. Useat määritykset ovat tunnettuja ja niitä voidaan käyttää KGF-analo- . gien nopeaan seulontaan sen määrittämiseksi, onko niiden • · · biologinen aktiivisuus hyväksyttävää luokkaa. KGF-analo- * · : .·. geista tutkitaan yhdellä tällaisella määrityksellä nimen- • · · 25 omaisesti niiden kykyä sitoutua spesifisesti KGF-resepto- • · .. riin (KGFR) sen perusteella, että ne kilpailevat 125I-KGF:n • ♦ • · 9 kanssa sitoutumisesta reseptoriin [Bottaro, et ai., J.
: Biol. Chem. 265 (1990) 12767 - 12770; Ron, et ai., J.
Biol. Chem. 268 (1993) 2984 - 2988]. Vaihtoehtoiseen mene- • · : ’·· 30 telmään KGFR:n ja KGF-analogin välisten vuorovaikutusten ··· ' määrittämiseksi sisältyy sellaisten menetelmien, kuten to- . .·. siaikaisen biospesifisen vuorovaikutuksen analyysin (BIA) , • · · käyttö [Felder, et ai., Molecular & Cellular Biology 11 1 Γ (1993) 1449 - 1455] . Lisäksi sen määrittämiseksi, miten • · · · 35 KGF-analogit kykenevät stimuloimaan DNA-synteesiä, voidaan • · · • · • · • · · 25 lisäksi käyttää mitogeenisyysmääritystä (Rubin, et ai., (1989) , edellä). Lopuksi voidaan käyttää solujen lisään-tymismäärityksiä sen tutkimiseksi, kuinka KGF-analogit kykenevät stimuloimaan solujen lisääntymistä [Falco, et ai., 5 Oncogene 2 (1988) 573 - 578]. KGF-analogeista voidaan nopeasti seuloa esiin niiden biologinen aktiivisuus käyttäen mitä tahansa edellä mainituista määritysjärjestelmistä.
Edullisessa sovellutusmuodossa tämä keksintö kohdistuu KGF-analogeihin, joissa biologinen aktiivisuus in 10 vitro -olosuhteissa tai in vivo -olosuhteissa natiiviin KGF:ään verrattuna on säilynyt täydellisesti (toisin sanoen vähintään huomattavissa määrin samanlaisena). Kuvaavia esimerkkejä KGF-analogeista, jotka sisältävät näitä ominaisuuksia yhdellä tai useammalla edellä olevista mää-15 rityksistä määritettynä, ovat C(1,15)S, AN3/C(15)S, ΔΝ3/ C(15)-, ΔΝ8/0(15)S, ΔΝΒ/C(15)-, AN15, ΔΝ16, ΔΝ17, ΔΝ18, ΔΝ19, ΔΝ20, ΔΝ21, ΔΝ22, ΔΝ23, ΔΝ24 tai AN23/R(144)Q.
KGF-analogeja voidaan modifioida edelleen muodoiksi, jotka sisältävät peptideihin normaalisti kuulumattomia 20 muita kemiallisia ryhmiä. Nämä johdannaisryhmät voivat parantaa KGF-analogin liukoisuutta, absorboitumista, biolo-.·. gista puoliintumisaikaa ja muita näitä vastaavia ominai- t · · • · · suuksia. Ryhmät voivat vaihtoehtoisesti poistaa proteiinin • · I l kaikki mahdolliset haitalliset sivuvaikutukset ja muut • · · *99 ** ) 25 vastaavantyyppiset vaikutukset tai vähentää niitä. Ryhmiä, * joilla tällaisia vaikutuksia voidaan saada aikaan, on ku- * · • *’ vattu esimerkiksi teoksessa Remington's Pharmaceutical • · ·
V ' Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA
(1990) . Molekyyliin voidaan muodostaa kovalenttisia modi- • · • 30 fikaatioita saattamalla reagenssien vaikutuskohteiksi va- litut aminohapporyhmät reagoimaan orgaanisen johdannaisen valmistamiseen käytettävän reagenssin kanssa, joka kykenee • · · I" reagoimaan valittujen sivuketjujen tai terminaalisten ryh- | · ·;·’ mien kanssa [Creighton, T.E., Proteins: Structure And :i : 35 Molecule Properties, W.H. Freeman & Co., (1983) San Fran- • · · • · • · ··· 26 cisco, s. 79 - 86] . Yksi tällainen kemiallinen ryhmä on polyetyleeniglykoli ("PEG"), jota on käytetty terapeuttisten proteiinituotteiden valmistamisessa. Tiettyjen proteiinien kyseessä ollessa on polyetyleeniglykolin liittä-5 misen osoitettu suojaavan proteolyysiltä, Sada, et ai., J. Fermentation Bioengineering 21 (1991) 137 - 139, ja on olemassa menetelmiä tiettyjen polyetyleeniglykoliryhmien kiinnittämiseksi. Näitä on käsitelty Davis, et ai.:n US-patenttijulkaisussa nro 4 179 337, "Non-Immunogenic Poly-10 peptides," joka on julkaistu 18.12.1979; ja Royerin US-pa-tenttijulkaisussa nro 4 002 531, "Modifying enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby", joka on julkaistu 11.1.1977. Katsauksen tältä alalta ovat esittäneet Abuchowski, et ai., teoksessa Enzymes as Drugs. [Hol-15 cerberg ja Roberts, (eds.) s. 367 - 383 (1981)]. Polyetyleeniglykolin kyseessä ollessa on käytetty useita keinoja polyetyleeniglykolimolekyylien liittämiseksi proteiiniin. Polyetyleeniglykolimolekyylit liitetään tavallisesti proteiiniin proteiinissa esiintyvän reagoivan ryhmän välityk-20 sellä. Tällaiseen kiinnittämiseen soveltuvat aminoryhmät, kuten lysiiniryhmissä esiintyvät aminoryhmät tai N-ter-minaalisessa päässä esiintyvät aminoryhmät. Esimerkiksi • · ·
Royer (US-patenttijulkaisu nro 4 002 531, edellä) mainit- • · • S, see pelkistävää alkylointia käytetyn polyetyleeniglykoli- • · · I 25 molekyylien kiinnittämiseksi entsyymiin. Wrightin julkai- .. sussa EP 0 539 167, joka on julkaistu 28.4.1993 ja jonka | · # • 1’ otsikko on "Peg Imidates and Protein Derivates Thereof", • ·· • · · *·1 ’ mainitaan, että vapaan(ita) ami no ryhmän (mi ä) sisältäviä peptidejä ja orgaanisia yhdisteitä modifioidaan PEG:n tai • · • ’·· 3 0 tätä muistuttavien vesiliukoisten orgaanisten polymeerien : imidaatti johdannaisella. Shaw'n US-patentti julkaisu nro , |·> 4 904 584 liittyy proteiineissa olevien useiden lysiini- • ♦ · “I ryhmien modifiointiin polyetyleeniglykolimolekyylien liit- *;1 tämiseksi reagoivien amiiniryhmien välityksellä.
• · · • · · • · · · · • · • · • · · 27
Vielä yhdessä sovellutusmuodossa tämä keksintö kohdistuu sellaisen lääkeformulaation kerta-annoksen antamiseen, jota voidaan antaa turvallisesti parenteraalisesti tai oraalisesti tasalämpöisellä eläimellä (kuten ihmisel-5 lä) esiintyvän sairauden hoitamiseen. Tämä 1ääkeformulaa-tio voi olla lyofilisoidun tai jollakin muulla tavoin de-hydroidun terapeuttisen tai diagnostisen aineen muodossa, joka voidaan saattaa alkuperäiseen tilaansa lisäämällä fysiologisesti hyväksyttävää liuotinta. Liuotin voi olla 10 mikä tahansa medium, kuten steriili vesi, fysiologinen suolaliuos, glukoosiliuos tai jokin muu vesipitoinen hiilihydraatti, esimerkiksi jokin polyoli, kuten mannitoli, ksylitoli tai glyseroli), joka kykenee liuottamaan kuivatun koostumuksen, joka on yhteensopiva valitun annostelu-15 tien suhteen ja joka ei ole negatiiviseen suuntaan vaikuttavaa haittavaikutusta käytettyyn aktiiviseen aineeseen ja rekonstituointiin käytettyyn stabilointiaineeseen. Yhdessä erityisessä sovellutusmuodossa tämä keksintö kohdistuu yhden kerta-annoksen valmistamiseen soveltuvaan lääkepak-20 kaukseen. Lääkepakkaus sisältää sekä kuivattua proteiinia sisältävän ensimmäisen säiliön että sellaista vesipitoista formulaatiota sisältävän toisen säiliön, joka sisältää
• · · · <J
• · · rekonstituoinnissa käytettävää stabilointiainetta. Liuok- • · ; sen proteiinikonsentraation, kuhunkin säiliöön lisättävän • · · ' 25 liuostilavuuden ja säiliöiden vetoisuuden kyseessä ollessa • · ,, näitä voidaan vaihdella alan ammattikokemuksen perusteella tunnettujen kaukana toisistaan olevien raja-arvojen sisäl- { · · ·* * lä (kyseisten muuttujien välillä vallitsee keskinäinen riippuvuus ja niitä voidaan modifioida halutulla tavalla • · • ’·· 30 lopulliseen kerta-annokseen halutun aktiivisen aineen kon- :T: sentraation mukaan).
. |·. Tämän keksinnön mukaiset KGF-analogit voivat olla • · t käyttökelpoisia terapeuttisina ja diagnostisina aineina t · *;* sekä tutkimusreagensseina. Siten KGF-analogej a voidaan • · · V · 35 käyttää in vitro -olosuhteissa ja/tai in vivo -olosuhteis-
Ml • · • · • · · 28 sa suoritettavissa diagnostisissa määrityksissä kudos- tai elinnäytteessä esiintyvän KGF:n määrän kvantitointiin tai KGFR:ää ilmentävien solujen määrittämiseen ja/tai eristämiseen [Bottaro, et ai., J. Biol. Chem. 265 (1990) 12767 -5 12770; Ron, et ai., J. Biol. Chem. 268 (1993) 2984 - 2988] . Kudoksista tai elimistä tehtävissä määrityksissä esiintyy 125I-KGF-analogin sitoutumisen standardikäyrään verrattuna vähemmän radioaktiivisuutta, joka on peräisin 125I-KGF-analogin sitoutumisesta KGFR:ään, mikä johtuu 10 leimalla varustamattoman natiivin KGF:n sitoutumisesta KGFR:ään. Samalla tavoin voidaan KGFR havaita 125I-KGF-ana-login avulla useissa erilaisissa solutyypeissä.
Tässä keksinnössä ajatellaan myös käytettäväksi KGF-analogia sellaisten peptidiä vastaan valmistettavien 15 vasta-aineiden muodostamisessa, jotka vasta-aineet sitoutuvat myös natiiviin KGF:ään. Tässä sovellutusmuodossa vasta-aineet ovat alkuperältään monoklonaalisia tai poly-klonaalisia ja ne valmistetaan KGF-analogia käyttäen. Tulokseksi saatavat vasta-aineet sitoutuvat ensisijaisesti 20 natiiviin KGF:ään edullisesti silloin, kun proteiini on natiivissa (biologisesti aktiivisessa) konformaatiossa. Näitä vasta-aineita voidaan käyttää natiivin KGF:n havait- • · · j·.·. semiseen tai puhdistamiseen.
: .·. KGF-analogeja ajatellaan tässä keksinnössä käytet- • · · “ I 25 tävän lisäksi sellaisten KGF:ää sitovien molekyylien ha-• · .. vaitsemiseksi, joiden affiniteetti on suuri tai pieni ja i joilla on terapeuttisia sovellutuksia, esimerkiksi keinona J · · ·1 2 KGF:n annostelemiseksi tehokkaasti tai KGF-aktiivisuuden inhibiittorina. KGF-analogien terminen stabiilisuus on • · • ’·· 30 tärkeä tällaisten sitovien molekyylien tunnistamiselle • · · ϊ#ί ϊ fysiologisissa olosuhteissa (toisin sanoen 37 °C:ssa), , ,·, koska niiden affiniteetti KGF:ää kohtaan voi olla voimak- • · · kaasti lämpötilasta riippuvaista ja sitä ei voida ennustaa t · 4 °C:ssa havaitun affiniteetin perusteella.
• · · • · · • · · · · • · • · 2 · 29
In vivo -olosuhteissa käytettäviä käyttömuotoja varten voidaan KGF-analogeja formuloida lisäaineita käyttäen. Tällaisia lisäaineita ovat puskurit, kantaja-aineet, stabilointiaineet, lisäaineet, säilyteaineet, tonisuuden 5 säätöön käytettävät aineet, antioksidantit ja muut näitä vastaavat aineet (esimerkiksi viskositeettiä säätävät aineet tai täyteaineet). Tiettyjen nimenomaisten lisäaineiden valinta on riippuvainen varastointimuodosta (esimerkiksi neste tai lyofilisoitu materiaali) ja KGF-analogin 10 annostelutavoista. Julkaisussa Remington's Pharmaceutical Sciences (viimeisin laitos), Mack Publishing Company, Easton, PA, on esitetty tällä alalla tunnettuja sopivia for-mulaatioita.
Kudoksia, joille on erityisesti ominaista se, että 15 ne ovat vaurioituneet tai joissa ei-fibroblastityyppiä olevien epiteelisolujen määrä on niin pieni, ettei se ole kliinisesti riittävää luokkaa, voidaan käsitellä terapeuttisesti tehokkailla määrillä KGF-analogeja. Hoitoaloja, joilla KGF-analogien antaminen voi tuottaa suotuisia tu-20 loksia, ovat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, sivu-elinrakenteiden, kuten hiustuppien, hikirauhasten ja tali-rauhasten, stimulointi, solujen lisääntymisen ja erilais-
• M
j*.·. tumisen aikaansaaminen potilailla, joilla on palovammoja * · I ja muita ihoa osaksi tai sen koko paksuudelta vahingoitta- • · · ** I 25 via vammoja; epiteelin uudelleenmuodostumisen kiihdyttämi-m[ * nen leesioissa, joiden aiheuttajana on epidermolysis bul- • ’* losa, jossa epidermis kiinnittyy vaillinaisesti alapuolel- • · · V · laan olevaan dermikseen, mistä on seurauksena usein kivu liaita avorakkuloita, jotka voivat saada aikaan vakavan »· •30 sairauden; kemoterapian aikaansaaman alopesian ja miehillä ΓΓ: esiintyvän kaljuuntumisen parantaminen tai miehillä tai naisilla esiintyvän etenevän hiustenlähdön parantaminen; • · · III maha- ja pohjukaissuolihaavaumien hoito; tulehduksellisen i : ·;* suolistosairauden, kuten Crohnin taudin (tämä vaikuttaa • · · : 35 pääasiassa ohutsuoleen) , parantaminen ja ulseratiivisen • · · • • · · 30 koliitin (tämä vaikuttaa pääasiassa paksusuoleen) hoito; suoleen kohdistuvan toksisuuden ehkäiseminen tai vähentäminen sädehoito-ohjelmissa ja kemoterapeuttisissä hoito-ohjelmissa (esimerkiksi ennen hoitoa ja/tai hoidon jäl-5 keen) soluja suojaavan vaikutuksen tai solujen uudistumisen tai näiden molempien aikaansaamiseksi; liman muodostumisen edistäminen gastrointestinaalikanavassa; tyypin II pneumosyyttien lisääntymisen ja erilaistumisen indusointi, jotka solut voivat edistää sellaisten tautien hoitoa tai 10 ehkäistä sellaisia tauteja, kuten hyaliinimembraanitauti (toisin sanoen pikkulasten hengitysvaikeusoireyhtymä ja bronkopulmonaarinen dysplasia) keskosilla; keuhkoputkien ja/tai keuhkorakkuloiden epiteelin lisääntymisen ja erilaistumisen stimulointi keuhkojen akuutissa tai kroonises-15 sa vaurioitumisessa tai toimintavajauksessa, joka johtuu keuhkoihin hengittämisestä seuraavista vaurioista (mukaan lukien suuret happipitoisuudet), emfyseema, keuhkoja vaurioittavien kemoterapeuttisten aineiden käyttö, hengitys-konetrauma tai jotkin muut keuhkoja vaurioittavat olosuh-20 teet; maksan toiminnan tehostaminen maksakirroosin hoitamiseksi tai ehkäisemiseksi, maksan tulehduksellinen toi-minnanvaj aus, virushepatiitin ja/tai maksaan kohdistuvien ··« toksisten vaikutusten aikaansaama vaurioituminen; sarveis- • · • · ; #·. kalvon solujen uudistumisen aikaansaaminen esimerkiksi * · · 25 sarveiskalvoabraasion hoidossa; epiteelisolujen uudistumi- • · .. sen aikaansaaminen etenevän ientaudin hoitamiseksi; korva- ’’ käytävän epiteelisolujen uudistumisen aikaansaaminen täry- • · · ·* ’ kalvon vaurioitumisen hoitamiseksi sekä diabetes mellituk- sen käynnistymisen ehkäiseminen tai käyttö tukihoitona • · • *·· 3 0 haiman solusaarekkeiden siirron yhteydessä.
ij*: Potilaalle, jolla on tarpeellista saada aikaan ei- . fibroblastityyppisten epiteelisolujen lisääntymistä, anne- • · · V.’ taan tehokas määrä KGF-analogia. "Tehokas määrä" on se < : *1' KGF-analogin määrä, joka tarvitaan halutun vasteen aikaan- • · · ί.ί · 35 saamiseksi hoidettavassa potilaassa ja tämän määrää siten M· • · • · »«· 31 tavallisesti hoitava lääkäri. Annettavan KGF-analogin määrään vaikuttavia tekijöitä ovat potilaan ikä ja yleiskunto, hoidettava sairaus ja muut näitä vastaavat tekijät. Tyypilliset annokset ovat 0,001 - 500 mg ruumiinpainokiloa 5 kohti.
KGF-analogia voidaan antaa tasalämpöisille eläimille (kuten ihmisille) turvallisesti parenteraalisesti (esimerkiksi käyttäen annosteluteitä i.v., i.t., i.m., s.c.
tai i.p.), oraalisesti tai paikallisesti. KGF-analogia 10 voidaan käyttää kerran tai antaa toistuvasti taudin ja potilaan kunnon mukaisesti. Joissakin tapauksissa KGF-analogia voidaan antaa muuta hoitoa tukevana hoitona ja myös muiden farmaseuttisten valmisteiden yhteydessä.
Seuraavat esimerkit on liitetty tähän keksintöön 15 sen tarkempaa kuvaamista varten. On selvää, että esitettyihin toimenpiteisiin voidaan tehdä modifikaatioita keksinnön hengestä poikkeamatta.
Esimerkit
Moniin seuraavissa esimerkeissä kuvattuihin toimen-20 piteisiin tai sopiviin vaihtoehtoisiin toimenpiteisiin soveltuvia vakiomenetelmiä on esitetty molekyylibiologian alan yleisteoksissa, kuten esimerkiksi teoksissa Molecular • · ·
Cloning, Second Edition, Sambrook, et ai., Cold Spring S * · * \ Harbor Laboratory Press (1987) ja Current Protocols in • t · *·* I 25 Molecular Biology, Ausabel, et al., Greene Publishing * ’ Associates/Wiley Interscience, New York (1990).
» · ! *** Esimerkki 1 • *· *.! · KGF:ää ja KGF-analogeja koodaavan DNA:n valmistus Täysimittainen humaani-KGF-geeni (tämä koodasi po- 30 lypeptidiä, jonka sekvenssi oli natiivin KGF:n sekvenssi) ;‘j*. kloonattiin sekä eläinsolusta peräisin olevalle RNA:lle *. suoritetulla polymeraasiketjureaktiolla (PCR) että kemial- « « « '’•Σ·* lisesti syntetoiduille (E. colin suhteen optimoitu kodo- | · ··»* nien käyttö) oligonukleotideille ("oligoille") suoritetul- ;*♦*: 35 la PCRrllä. Molemmat menetelmät on kuvattu seuraavaksi: « ··· • · ··« 32
Suoritettiin PCR-monistus, jossa käytettiin sellaisista soluista eristettyä RNA:ta, joiden tiedettiin tuottavan tätä polypeptidiä. Humaanitibroblastisolulinjasta AG1523A (tämä oli saatu laitoksesta Human Genetic Mutant 5 Cell Culture Repository Institute For Medical Research, Camden, New Jersey) peräisin olevat solut hajotettiin ensimmäiseksi guanidiumtiosyanaatilla, minkä jälkeen seos uutettiin [Chomyzinski, et al.:n, Anal. Biochem. 172 (1987) 156, menetelmällä]. KGF:n cDNA valmistettiin koko-10 nais-RNA:lle käytettävällä käänteistranskriptaasiin perus tuvalla vakiomenetelmällä. KGF-geenin PCR-monistus (PCR#1) suoritettiin käyttäen mallijuosteena KGF:n cDNA:ta ja alukkeita Oligo#l ja Oligo#2, jotka koodaavat KGF-geenistä 5'-puolelle ja 3'-puolelle välittömästi jatkuvia DNA-sek-15 venssejä [mallin 9600 thermocycler-laite, (Perkin-Elmer
Cetus, Norwalk, CT); 28 sykliä; kukin sykli koostui yhdestä minuutista 94 °C:ssa denaturoitumisen aikaansaamiseksi, 2 minuutista 60 °C:ssa yhdistymisen aikaansaamiseksi ja 3 minuutista 72 °C:ssa pidentymisen aikaansaamiseksi]. 20 Pientä määrää PCR#1-tuotetta käytettiin tämän jälkeen mal- lijuosteena toiselle KGF:n PCR-monistukselle (PCR#2, joka .·. oli identtinen syklissä käytetyiltä olosuhteiltaan edellä •V. kuvattujen olosuhteiden suhteen lukuun ottamatta sitä, * · \ Ιψ että yhdistymislämpötilana käytettiin 50 °C. KGF-geenin 4 · « ’* \ 25 ilmentämiskloonausta varten käytettiin sisäkkäisiä PCR- »«!«· * * alukkeita sopivien restriktiokohtien muodostamiseksi KGF- t * • “ geenin kumpaankin päähän. 01igo#3:a ja 0ligo#4:ää käytet- *.· * tiin PCR#2:sta peräisin olevan KGF-DNA-tuotteen modifioin tiin muotoon, jossa geenin 5'- ja 3'-päihin oli muodostet- • · • *.. 3 0 tu MluI- ja BamHI-restriktiokohdat, mainitussa järjestyk- :’Γ: sessä ilmoitettuna [PCR#3; 30 sykliä; kukin sykli koostui yhdestä minuutista 94 °C:ssa denaturaation aikaansaamisek- « « « si, 2 minuutista 60 °C:ssa yhdistymisen aikaansaamiseksi * : ja 3 minuutista 72 °C:ssa pidentymisen aikaansaamiseksi].
* « · ::: 35 Tämä DNA pilkottiin myöhemmässä vaiheessa MluI:11a ja « · · • · <>«· 33
BamHI:lla, uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla. Tämän jälkeen se suspendoitiin uudelleen ja ligatoitiin (käyttäen T4-ligaasia) PCFM1156-plasmidiin (kuvio 2A), joka sisälsi "RSH"-signaalisekvenssin RSH-KGF-konstruktion 5 valmistamiseksi (kuvio 3).
Ligaatiotuotteet transformoitiin [Hanahanin, J. Mol. Biol. 166 (1983) 557, menetelmän mukaisesti] E. coli -kantaan FM5 (ATCC:53911) ja maljättiin LB + kanamysiini -maljoille 28 °C:ssa. Valittiin useita transformantteja ja 10 niitä kasvatettiin pienissä nesteviljelmissä, jotka sisälsivät 20 μg/ml kanamysiiniä. RSH-KGF-plasmidi eristettiin kunkin viljelmän soluista ja DNA sekvensoitiin. KGF-geenin sisältämän sisäisen Ndel-kohdan vuoksi natiivia geenisekvenssiä ei ollut mahdollista kloonata suoraan haluttuun 15 ilmentämisvektoriin muodossa, jossa tämä sisälsi molemminpuoliset Ndel- ja BamHI-restriktiokohdat. Tämä suoritettiin kolmen osapuolen ligaationa. Plasmidi RSH-KGF pilkottiin käyttämällä hyväksi yhden kerran esiintyviä BsmI- ja Sstl-restriktiokohtia ja l-%:isessa agaroosigeelissä suo-20 ritetun elektroforeesin jälkeen eristettiin ~3 kepin suuruinen DNA-fragmentti (tämä sisälsi KGF-geenin 3'-puolei- .·. sen pään) . PCR (PCR#4) suoritettiin samoin kuin mitä oli • · » · · •V, kuvattu PCR#3:n kyseessä ollessa lukuun ottamatta sitä, • ’ · ^ että Oligo#3:n tilalla käytettiin Oligo#5:tä. Tämän jäl- ” ’ 25 keen PCR-DNA-tuote pilkottiin Ndel:11a ja BsmI:11a ja 311 • ep:n suuruinen DNA-fragmentti eristettiin 4-prosenttisessa I* agaroosigeelissä suoritetun elektroforeesin jälkeen. Kol- V * mas ligaatiokappale on 1,8 kep:n suuruinen Ndel:lla ja
Sstl:lla pilkotun pCFM1156:n DNA-fragmentti, joka eristet- i · • *.. 30 tiin l-%:isessa agaroosigeelissä suoritetun elektroforee- }“i*: sin jälkeen. Ligaation (T4-ligaasi) , transformaation, ka- *. namysiiniselektion ja DNA-sekvenssoinnin jälkeen, jotka t « · I!” suoritettiin edellä kuvatulla tavalla, poimittiin klooni, t i ·;* joka sisälsi kuviossa 4 esitetyn konstruktion ja plasmi- • i· ί 35 dille annettiin nimitys KGF. Typistyneitä tuotteita muo-
»M
• · * · 34 dostavan sisäisen ribosomia sitovan kohdan vuoksi korvattiin yhden kerran esiintyvien Kpnl- ja EcoRI-kohtien välinen KGF-DNA-sekvenssi kemiallisesti syntetoiduilla oligo-nukleotideilla (0ligo#6 - Oligo#ll) sisäisen aloituskohdan 5 käytön minimoimiseksi (kuvio 5).
Oligo#l (sekvenssi nro 7): 5'-CAATGACCTAGGAGTAACAATCAAC-3' 01igo#2 (sekvenssi nro 8): 5' - AAAACAAACATAAATGCACAAGTCCA- 3 ' 10 Oligo#3 (sekvenssi nro 9): 5'-ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA-3'
Oligo#4 (sekvenssi nro 10): 5'-ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA-3'
Oligo#5 (sekvenssi nro 11): 15 5' -ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA- 3 '
Oligo#6 (sekvenssi nro 12) : 5 ' -CTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCC-3'
Oligo#7 (sekvenssi nro 13): 5 ' - AAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTT - 3 ' 20 Oligo#8 (sekvenssi nro 14): 5'-GCTGTTGGTATCGTG-3'
Oligo#9 (sekvenssi nro 15) : 5'-TCTTGGGTGCCCTTGACTTTGCCGCGTTTGTCGATACGCAGGTAC-3' Oligo#10 (sekvenssi nro 16) : I'.·' 25 5 ' - ACAGCAACAGTACGGATTTCCATAATATTGTAGTTGTTTTTCATC - 3 ' j Oligo#ll (sekvenssi nro 17) : ·: *: 5' -AATTCAGATTCAACACCTTTGATTGCAACGATACCA-3 ' •\# Oligonukleotidit fosforyloitiin T4-polynukleotidi- kinaasilla, minkä jälkeen ne lämpödenaturoitiin. Tämän 30 jälkeen yksijuosteisten (ss) oligonukleotidien annettiin .. muodostaa kaksijuosteinen DNA-fragmentti antamalla lämpö- • · · *... tilan laskea hitaasti huoneenlämpöön. Tämän jälkeen T4-li- • · · ·) * gaasia käytettiin yhdistämään sekä sisäiset oligonukleoti- din tarttuvat päät että koko kaksi juosteinen oligo-frag- « · · • · • · • · · * · · • · • · · 1 • · • · • · · mentti KGF-plasmidiin, joka oli pilkottu Kpnl:lla ja
EcoRI:11a. Uudelle plasmidille annettiin nimitys KGF(dsd).
35
Konstruoitiin täydellinen E. colin kodonien suhteen optimoitu KGF-geeni käyttämällä kemiallisesti syntetoitu-5 jen oligonukleotidien #12 - 24 PCR-monistusta.
01igo#12 (sekvenssi nro 18): 5'-AGTTTTGATCTAGAAGGAGG-3' 01igo#13 (sekvenssi nro 19): 5'-TCAAAACTGGATCCTATTAA-3' 10 Oligo#14 (sekvenssi nro 20): 5' -AGTTTTGATCTAGAAGGAGGAATAACATATGTGCAACGACATGACTCCGGAACA-GATGGCTACCAACGTTAACTGCTCCAGCCCGGAACGT-3'
Oligo#15 (sekvenssi nro 21): 5 ' -CACACCCGTAGCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGTGTTCGTCGTCT-15 GTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAA-3'
Oligo#16 (sekvenssi nro 22): 5 ' - CGTGGTAAAGTTAAAGGTACCGAGGAAATGAAAAACAACTACAACATCATGGAA -ATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAA-3'
Oligo#17 (sekvenssi nro 23): 20 5' - GGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGAA - TGCAAC@GACTGCAACTTCAAAGAA-3'
Oligo#18 (sekvenssi nro 24) : 5' -CTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAAC--.0 GGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGT-3' : 25 Oligo#19 (sekvenssi nro 25): • :1: 5' -ATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAACAACAGAAAACCGCTCACTTCCTG- • · · CCGATGGCAATCACTTAATAGGATCCAGTTTTGA-3' • · f. Oligo#20 (sekvenssi nro 26): • · · *.♦;·. 5' - TACGGGTGTGACGTTCCGGG - 3 ' • · · 30 Oligo#21 (sekvenssi nro 27): .. 5'-CTTTACCACGTTTGTCGATA-3' • · • ^ Oligo#22 (sekvenssi nro 28) : **.’· 1' 5' -ATTCAACACCTTTGATTGCA-3' : Oligo#23 (sekvenssi nro 29) : • · · . 1 1 1. 35 5'-CCAGGATCAGTTCTTTGAAG-3' • · · • · · • · · • · · · · • · • · • · · 36
Oligö#24 (sekvenssi nro 30): 5'-GAACCGGGATACCTTTCTGG-3'
Oligonukleotidit #12 - 24 suunniteltiin sellaisiksi, että joko "Watson"- tai "Crick"-juosteesta peräisin 5 olevat oligonukleotidit edustivat natiivia KGF:ää koodaa-vaa kokonaista DNA-sekvenssiä ja PCR-monistuksen jälkeen tuottaisivat halutun kaksijuosteisen DNA-sekvenssin (kuvio 6) (PCR#5, mallin 9600 thermocycler-laite, Perkin-Elmer
Cetus]; 21 sykliä, kukin sykli muodostui 31 sekunnista 10 94 °C:ssa denaturoitumisen aikaansaamiseksi, 31 sekunnista 50 °C:ssa yhdistymisen aikaansaamiseksi ja 31 sekunnista 73 °C:ssa pidentymisen aikaansaamiseksi; näiden 21 syklin jälkeen PCR lopetettiin käyttäen viimeistä seitsemän minuutin mittaista pidennysvaihetta. DNA-fragmentti pilkot-15 tiin PCR-monistuksen jälkeen Xbal:lla ja BamHIrlla ja 521 ep:n suuruinen fragmentti ligatoitiin näillä samoilla entsyymeillä pilkottuun ilmentämisplasmidiin pCFM1156. PCR#5:ssa käytettiin hyväksi ulkopuolisia alukkeita (100 pmol/100 μΐ rxn) Oligo#12 ja Oligo#13 ja 1 μ1/100 μΐ rxn 20 KGF-templaattia, joka oli peräisin oligonukleotidien Oli-go#14 - 0ligo#19 ligatoinnista (T4-ligaasia käyttäen) (oligonukleotidit Oligo#15 - Oligo#18 oli fosforyloitu T4-polynukleotidikinaasilla) käyttäen ligaatiota varten laas-. Γ: tarioligonukleotideina (band-aid oligos) [Jayaraman, et ·1·1; 25 ai., Biotechniques 12 (1992) 392] oligonukleotideja Oli- • · : go#20 - 0ligo#24. Lopulliselle konstruktiolle annettiin • · · nimitys KGF(codon optimized).
• ·
Kaikki tässä keksinnössä kuvatut KGF-analogit muo- • · · *... dostuvat osaksi KGF(dsd):ssa tai KGF (codon optimized) : ssa
III
• 30 esiintyvistä DNA-sekvensseistä tai näiden kahden yhdistel mästä. Sekvenssejä modifioidaan edelleen liittämällä näitä • · : 2 sellaisten DNA-sekvenssien sopiviin restriktiokohtiin, • · · V 1 jotka koodaavat tiettyjä nimenomaisia KGF-analogin amino- . .·; happoja ja jotka on valmistettu käyttäen yhtä tai useampaa • · · ,···. 35 edellä kuvatuista DNA-fragmenttien synteesimenetelmistä. • · • · · • · · • · · • · · · · • · • · 2 • · m 37
Mikä tahansa analogeista voidaan valmistaa kokonaisuudessaan edellä kuvatuilla menetelmillä. Osana yleistä oligo-nukleotidien suunnittelua käytettiin optimoituja E. coli -kodoneja kuitenkin siellä, missä niiden käyttö oli sopi-5 vaa, vaikkakaan E. colin suhteen optimoitujen kodonien käyttö joissakin paikoissa tai kaikissa mahdollisissa paikoissa minkä tahansa näiden geenien kyseessä ollessa ei tätä kysymystä tutkittaessa lisännyt merkittävästi viljellyistä bakteerisoluista saadun proteiinin saantoa. Kuviot 10 7 - 24 ja 37 - 50 esittävät sopivan esimerkin avulla tie
tyn nimenomaisen KGF-analogin nukleotidi- ja aminohappo-sekvenssikonstruktioita: C(1,15)S (kuvio 7); AN3/C(15)S
(kuvio 8); ΔΝ3/0(15); (kuvio 9); AN8/C(15)S (kuvio 10); ÄN8/C(15)- (kuvio 11); ΔΝ15 (kuvio 12); ΔΝ16 (kuvio 13); 15 ΔΝ17 (kuvio 14) ; ΔΝ18 (kuvio 15) ; ΔΝ19 (kuvio 16) ; ΔΝ20 (kuvio 17) ; ΔΝ21 (kuvio 18) ; ΔΝ22 (kuvio 19) ; ΔΝ23 (kuvio 20) ; ΔΝ24 (kuvio 21); C(1,15)S/R(144)E (kuvio 22); C(1,15)S/R(144)Q (kuvio 23); AN23/R(144)Q (kuvio 24); C(1,15,40)S (kuvio 37); C(1,15,102)S (kuvio 38); C(l,15,-20 102,106)S (kuvio 39); ΔΝ23/Ν(137)Ε (kuvio 40); ΔΝ23/ K(139)E (kuvio 41); AN23/K(139)Q (kuvio 42); AN23/R(144)A (kuvio 43); AN23/R(144)E (kuvio 44); AN23/R(144)L (kuvio 45); ΔΝ23/Κ(147) E (kuvio 46); M23/K(147)Q (kuvio 47); ΔΝ23/Κ(153)Ε (kuvio 48); ÄN23/K(153)Q (kuvio 49) ja ΔΝ23/ | 25 Q (152) E/K(153) E (kuvio 50). Kaikki tässä keksinnössä ku- : vattujen KGF-analogikonstruktioiden DNA-sekvenssi oli var- • · · ·:··· mistettu.
Esimerkki 2 i · · *;·. Valmistus E. colissa iti 30 KGF-analogin geenien kloonaukseen käytettiin kolmea .. erilaista ilmentämisplasmidia. Ne olivat pCFM1156 (ATCC#
69702) , pCFM1656 (ATCC# 69576) ja pCFM3102 (kuviot 2A, 2B
iti * ja 2C mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna) . Plasmidi : p3102 voidaan johtaa plasmidista pCFM1656 valmistamalla t1 2’1; 35 sarja kohde-emäsmuutoksia käyttäen limittäisten oligonuk- • · · • · · • · · • · · · · • · • · 2 · 38 leotidien PCR-mutageneesiä. Emäsparimuutokset lähtien plasmidin replikaation promoottoria, P^itä, välittömästi edeltävästä BglII-kohdasta (pCFM1656-plasmidi bp # 180) ja etenemällä plasmidin replikaatiogeenien suuntaan, ovat 5 seuraavat: pCFMl:n ep# ep plasmidissa ep, joksi muutettu pCFM1656 DCFM3102:ssa
# 204 T/A C/G
10 # 428 A/T G/C
# 509 G/C A/T
# 617 -- kahden G/C-ep:n insertio
# 677 G/C T/A
# 978 T/A C/G
15 # 992 G/C A/T
# 1002 A/T C/G
# 1005 C/G T/A
# 1026 A/T T/A
# 1045 C/G T/A
20 # 1176 G/C T/A
# 1464 G/C T/A
.·. # 2026 G/C ep:n deleetio • · · 1 2 • · ·
# 2186 C/G T/A
• · : :·; # 2479 a/t t/a • · ·
♦:♦·· 25 # 2498-2501 AGTG GTCA
.. TCAC CAGT
*... # 2641-2647 TCCGAGC emäsparideleetio
: AGGCTCG
# 3441 G/C A/T
• ·
*** # 3452 G/C A/T
• · ·
: # 3649 A/T T/A
30 # 4556 -- emäsparien insertio J3: (sekvenssi nro 67) 5' -GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG-3' (sekvenssi nro 68) 3'-CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC-5' • · · • · · • · · · · • · 2 • · 3 M· 39
Kuten edeltä voidaan havaita, ovat pCFM1156, pCFM1656 ja pCFM3102 hyvin samanlaisia toisiinsa verrattuna ja ne sisältävät monia samanlaisia restriktiokohtia. Plasmidit valittiin niiden helppokäyttöisyyden perusteella 5 ja vektorin DNA-komponentit ovat vaikeuksitta vaihdettavissa uusien konstruktioiden valmistustarkoituksia varten. Kaikkiin kloonauksiin käytetty isäntä oli E. coli -kanta FM5 (ATCC: 53911) ja suoritettiin transformaatioita [Hana-hanin (1983), ks. edellä, menetelmän mukaisesti) tai käy-10 tettiin elektroeluointia Gene Pulser™ -transfektiolait-teella (BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Aluksi valmistettiin viljelemällä pieni tuore ymppi haluttua E. coli -yhdistelmäkloonia, joka sisälsi halutun 15 konstruktion yhdessä kolmesta pCFM-vektorista, siirtämällä 0,1 ml asiaankuuluvan kannan pakastettua glyserolikanta-liuosta 2 l:n pulloon, joka sisälsi 500 ml Luria-lihalien-tä. Viljelmää ravisteltiin 30 °C:ssa 16 tuntia, minkä jälkeen viljelmä siirrettiin 15 l:n fermentoriin, joka sisäl-20 si 8 1 steriiliä panoskasvatusmediumia [Tsai, et ai., J.
Industrial Microbiol. 2 (1987) 181 - 187].
Panos-syöttöfermentaatio aloitetaan syöttämällä syöte #1 -mediumia [Tsai, et ai. (1987), edellä]. Kun OD600 saavutti arvon 35, indusoitiin halutun KGF-analogin ·· · • 25 ilmentyminen nostamalla viljelmän lämpötila 37 °C:ksi kahili : den tunnin ajaksi ja se nostettiin tämän jälkeen lämpöti- ·;1·: laan 42 °C CI-repressorin denaturoimiseksi. Syötteen 1 }1.,, lisäys keskeytettiin ja ryhdyttiin syöttämään syötettä 2, j1:1. jonka lisäysnopeus oli aluksi 300 ml/h. Syöte 2 sisälsi 30 175 g/1 trypticase-peptonea, 87,5 g/1 hiivauutetta ja 260 .. g/1 glukoosia. Kun viljelmä oli pidetty 42 °C:ssa 1 tunti, • · · *... lämpötila laskettiin 36 °C:seen, jossa arvossa lämpötila • · · * pidettiin tämän jälkeen vielä 6 tunnin ajan.
Tämän jälkeen fermentaatio keskeytettiin ja solut I1'1: 35 koottiin talteen sentrifugoimalla 1 1 sentrifugipulloihin • · · • · · • · · · · • · • · • · · 40 asetettuihin muovipusseihin. Solut sentrifugoitiin napeiksi nopeudella 400 kierrosta minuutissa 60 minuutin ajan, minkä jälkeen supernatantit poistettiin ja solutahna pakastettiin -90 °C:ssa.
5 Kun useita eri KGF-analogeja oli ilmennetty E. co- lissa, puhdistettiin natiivi KGF-, C(1,15)S-, C(1,15)S/ R(144)E-, C(l,15)S/R(144)Q-, ΔΝ15-, ΔΝ23- ja AN23/R(144)Q-proteiini käyttäen seuraavaa menetelmää. Suurella soluti-heydellä suoritetusta fermentaatiosta peräisin oleva solu-10 tahna suspendoitiin 4 °C:ssa 0,2 M NaCl:n ja 20 mM NaP04:n seokseen, jonka pH oli 7,5, 10 - 20-prosenttisena liuoksena (paino/tilavuus) käyttäen sopivaa suurella leikkausvoi-malla toimivaa sekoitinta. Suspendoidut solut hajotettiin käsittelemällä liuos kolme kertaa homogenointilaitteessa 15 (APV Gaulin Inc., Evered, MA). Ulos tuleva homogenaatti jäähdytettiin 4-8 °C:seen käyttämällä sopivaa lämmön-vaihdinta. Solujäte poistettiin tämän jälkeen sentrifugoi-malla lysaatti J-6B™-sentrifugissa (Beckman Instruments, Inc., Brea, CA) , joka oli varustettu JS4.2-roottorilla, 20 nopeudella 4 200 kierrosta minuutissa 30 - 60 minuutin ajan 4 °C:ssa. Tämän jälkeen supernatantit dekantoitiin varovasti ja ne pipetoitiin etukäteen valmistettuun 450 ml:n suuruiseen (5 x 23 cm) S-Sepharose Fastflow™ -hartsia (Pharmacia, Piscataway, NJ) sisältävään kolonniin, jota • · · • 25 pidettiin 4 °C:ssa ja joka oli tasapainotettu 0,2 M NaClrn · ja 20 mM NaP04:n seoksella, jonka pH oli 7,5. Kolonni pes- *:**: tiin seuraavaksi 4 °C:ssa kolonnin tilavuutta viisinker- J\. taisesti vastaavalla tilavuudella (2250 ml) 0,4 M NaCl:n ja 20 mM NaP04:n seosta, jonka pH oli 7,5. Haluttu proteii-30 ni eluoitiin pesemällä kolonnia 5 1:11a 0,5 M NaCl:n ja ym 20 mM NaP04:n seosta, jonka pH oli 7,5. Kolonnista koottiin • · · talteen 50 ml:n suuruisia fraktioita ja efluentin A^aa • · · *. seurattiin jatkuvasti. Tämän jälkeen fraktiot, joiden A280:n perusteella oli todettu sisältävän eluoitunutta materiaa- • · · 35 lia, analysoitiin SDS-PAGE:lla 14-%:isessa geeleissä sen • · · • · · • · · «·« • · • · • · · varmistamiseksi, että niissä esiintyi haluttua polypepti- diä.
41
Tämän jälkeen haluttuja proteiineja sisältävät fraktiot yhdistettiin, minkä jälkeen niihin lisättiin 5 fraktion omaa tilavuutta vastaava määrä tislattua vettä. Tämän jälkeen laimennettu näyte pipetoitiin etukäteen valmistettuun 450 ml:n suuruiseen (5 x 23 cm) S-Sepharose Fast Flow -kolonniin, jota pidettiin 4 °C:ssa ja joka oli tasapainotettu 0,4 M NaClrn ja 20 mM NaP04:n seoksella, 10 jonka pH oli 6,8. Kolonni pestiin 2 250 ml :11a 0,4 M
NaCl:n ja 20 mM NaP04:n seosta, jonka pH oli 6,8, ja proteiini eluoitiin käyttäen 20 kertaa kolonnin omaa tilavuutta vastaava määrä lineaarista gradienttia, joka alkutilanteessa sisälsi 0,4 M NaCl:n ja 20 mM NaP04:n seosta, 15 jonka pH oli 6,8, ja lopputilanteessa 0,6 M NaClrn ja 20 mM NaP04:n seosta, jonka pH oli 6,8. Tälläkin kerralla koottiin talteen 50 ml:n suuruisia fraktioita seuraten jatkuvasti efluentin A2g0-arvoa. Tämän jälkeen proteiinia sisältävät fraktiot (määritettynä 14-prosenttisella SDS-20 PAGE:11a) yhdistettiin, ja fraktiot konsentroitiin sitten 30 - 40 ml:n tilavuuteen YM-10-membraanin avulla (molekyy-lipainon katkaisuraja 10 000), sekoitettavassa kammiossa, jonka tilavuus oli 350 cm3 (Amicon, Inc., Mayberry, MA).
• · *·ί·* Tämän jälkeen konsentraatti pipetoitiin etukäteen • · · : V 25 valmistettuun 1 300 ml:n suuruiseen (4,4 x 85 cm) Super- • · · dex-75™-hartsia (Pharmacia) sisältävään kolonniin, joka
*:··: oli tasapainotettu kolonnipuskurissa, joka sisälsi IX
Γ·.. PBS:ää (Dulbeccon fosfaatilla puskuroitu fysiologinen suo- • ,‘j*. laliuos, "D-PBS", ilman kalsiumia ja magnesiumia) tai 30 0,15 M NaCl:n ja 20 mM NaP04:n seosta, jonka pH oli 7,0.
;·. Kun näytteen oli annettu imeytyä kolonniin, proteiini • · · eluoitiin kolonnipuskurilla geelisuodatusmatriisista. Tä- S · · *. män jälkeen otettiin talteen 10 ml:n suuruisia fraktioita ja analogia sisältävät fraktiot (määritettynä 14-%:isella 35 SDS-PAGE: 11a) yhdistettiin. Tuloksena olevassa yhdistetys- • · · • · · « · · 1 • · • · • · · 42 sä seoksessa oli proteiinikonsentraatio tyypillisesti noin 5-10 mg/ml. Kaikki edellä olevat toimenpiteet suoritettiin 4-8 °C:ssa, ellei toisin ole mainittu.
Natiivin KGF:n, C(l,15)S:n ja ΔΝ23:η puhdistamiseen 5 käytettiin vaihtoehtoista puhdistusmenetelmää. Menetelmä sisältää seuraavat vaiheet ja, ellei toisin ole mainittu, kaikkia toimenpiteitä, liuoksia ja materiaaleja käytettiin 23 ± 5 °C:ssa.
Kun bakteerifermentaation tuotantovaihe oli mennyt 10 loppuun, soluviljelmä jäähdytettiin 4-8 °C:seen ja solut koottiin talteen sentrifugoimalla tai tätä vastaavalla menetelmällä. Sopiva painomäärä solutahnaa, joka määrä perustui odotettavissa olevaan proteiinisaantoon solutahnan painoyksikköä kohti sekä tarvittavaan puhdistetun proteii-15 nin määrään, suspendoitiin laimeaan puskuriliuokseen, joka sisälsi 20 mM NaP04:n ja 0,2 M NaCl:n seosta, jonka pH oli 7,5 ja jonka paino oli noin 5 kertaa suspendoitävän solu-tahnan paino. Solut dispergoitiin homogeeniseksi liuokseksi käyttäen suurella leikkausvoimalla toimivaa sekoitinta. 20 Solutahnadispersion lämpötila pidettiin homogenoinnin aikana 4-8 °C:ssa.
Tämän jälkeen solut hajotettiin paineen avulla, esimerkiksi käsittelemällä solutahnadispersiota kaksi ker-taa sopivan kokoisella soluhomogenisaattorilla. Homoge-: *#! 25 naatti pidettiin jäähdytettynä 5 ± 3 °C:ssa. Solulysaatin • selkeyttämiseksi käytettiin etukäteen valmistettua syvyys- • · · .;··· suodattimen pidikettä (Kuno, Inc., Meriden, CT), johon oli j*. asetettu suodatuspinta-alaltaan sopivan suuruinen suoda- •
·;·. tin, joka oli tasapainotettu sopivalla määrällä 0,2 M
f · ♦ 30 NaClm ja 20 mM NaP04:n seosta, jonka pH oli 7,5. Tasapai-notus ja selkeytys suoritettiin 5+3 °C:ssa. Ennen solu- • · • · ♦ *... lysaatin selkeyttämistä lisättiin varsinaisen suodattimen * · · *·] * pinnalle sopiva määrä sopivaa suodatinapua kerrokseksi, : joka sekoitettiin huolellisesti solulysaattiin, minkä jäl- I1: 35 keen lysaatti selkeytettiin imemällä liuos suodatinlait- « · « • · · • · » ««« • · • ♦ 43 teen läpi. Suodatin pestiin 0,2 M NaCl:n ja 20 mM NaP04:n seoksella, jonka pH oli 7,5. Suodos ja kaikki myöhemmät pesuliuokset koottiin vetoisuudeltaan sopivaan jäähdytettyyn säiliöön ja kokonaisuutta pidettiin alle 10 °C:ssa.
5 Lysaattia käsiteltiin selkeyttämisen jälkeen seu- raavaksi etukäteen valmistetussa SP-Sepharose Fast Flow -kolonnissa, joka sisälsi vähintään 1 ml:n hartsia kutakin solutahnan 2 g:aa kohti. SP-Sepharose Fast Flow -kolonni tasapainotettiin kylmällä (5 ±3 °C) 0,2 M NaCl:n ja 20 mM 10 NaP04:n seoksella, jonka pH oli 7,5. Kolonnin lämpötila pidettiin alle 10 °C:ssa. Tämän jälkeen selkeytetty lysaatti (5 ± 3 °C) pipetoitiin ioninvaihtokolonniin, ja eluaatin absorbanssia 280 nm:n kohdalta (A280) seurattiin jatkuvasti. Kolonnia pestiin näytteen imeyttämisen jälkeen kylmällä 15 0,2 M NaCl:n ja 20 mM NaP04:n seoksella, jonka pH oli 7,5, minkä jälkeen kolonnia pestiin 23 + 5 °C:ssa 0,3 M NaCl-.n ja 20 mM NaP04:n seoksella, jonka pH oli 7,5.
Halutun proteiinin eluointiin käytettiin lineaarista gradienttia, jonka NaCl-konsentraatio oli 0,2 - 1 M ja 20 joka sisälsi 20 mM NaP04:ää, jonka pH oli 7,5. Eluaatin A^-arvon perusteella pääosa tuotteista saatiin talteen useisiin fraktioihin. Nämä fraktiot yhdistettiin eluoinnin jälkeen ja tilavuus rekisteröitiin.
• · *·ϊ·* Vapaiden sulfhydryyliryhmien hapettamiseksi suori- • · · : V 25 tettiin hapetusvaihe. Niiden proteiinien kyseessä ollessa, • · · joiden kysteiinejä oli muutettu natiiviin KGF-.ään verrat- *:**: tuna, reaktioseokseen lisättiin sellainen määrä hapetinta **·.. (esimerkiksi kystamiinidihydrokloridia tai jotakin muuta • sopivaa hapetinta, esimerkiksi kystiiniä, hapetettua glu- 30 tationia tai divalenttista kuparia) , että tämän lopulli- ;·. seksi konsentraatioksi saatiin 1-20 mM ja pH säädettiin • · · *... alueella 7-9,5 olevaan arvoon ja edullinen pH arvo kyst- • · · *. amiinidihydrokloridia käytettäessä oli 9,0 ± 0,3. Hapetus \j.: suoritettiin 10 - 30 °C:ssa sopivan mittaisen ajan. Natii- • · · 35 vin KGF-proteiinin kyseessä ollessa hapetus suoritettiin • · · • * * • · · 1 • · • · • · · 44 lisäämällä reaktioseokseen sopiva määrä (NH4)2S04:ää, kuten 1 - 2 M (NH4)2S04:ää, säätämällä pH arvoon 7,5 + 9,5 ja pitämällä lämpötila 23 ± 5 °C:ssa sopivan ajan.
Liuoksen pH säädettiin hapetuksen jälkeen arvoon 5 6,5-9,5. Liuokseen lisättiin tarvittaessa sellainen mää rä kiinteää (NH4)2S04:ää, että tämän lopulliseksi konsent-raatioksi tuli 2 M. PartikkelimuotoiSten materiaalien poistamiseksi liuos suodatettiin sopivalla selkeytyssuo-dattimella.
10 Tämän jälkeen suodatetulle hapetetulle tuotteelle suoritettiin hydrofobiseen vuorovaikutukseen perustuva kromatografia (HIC). HIC-matriisi oli Butyl-650M Toyo-Pearl™-hartsi (Tosohaas, Inc., Montgomeryville, PA). Proteiinia sisältävä liuos pipetoitiin kolonniin, joka oli 15 tasapainotettu etukäteen seoksella, jonka koostumus oli 2 M (NH4)2S04, 0,15 M NaCl, 20 mM NaP04 ja jonka pH oli 7,0.
Kun näyte oli pipetoitu, kolonni pestiin seoksella, jonka koostumus oli 2 M (NH4)2S04, 0,15 M NaCl, 20 mM NaP04 ja jonka pH oli 7,0. Tämän jälkeen haluttu proteiini eluoi- 20 tiin käyttäen laskevaa lineaarista (NH4)2S04-gradienttia, jonka konsentraatio oli alueella 2 - 0 M ja joka oli valmistettu 0,15 M NaCl:n ja 20 mM NaP04:n seokseen, jonka pH oli 7,0. Fraktioita ryhdyttiin keräämään halutun proteii-nin alkaessa eluoitua, mistä osoituksena oli A^-arvon ko- #· » • V 25 hoaminen eluaatissa. Seuraavaksi kustakin fraktiosta peti j räisin olevat näytteet analysoitiin SDS-PAGE:lla. Tämän »:*·; jälkeen haluttua proteiinia sisältävät fraktiot yhdistet- J\# tiin, sekoitettiin huolellisesti ja yhdistetyn liuoksen f*:\ tilavuus sekä sen proteiinikonsentraatio määritettiin.
30 Tämän jälkeen yhdistetty HIC-proteiinia sisältävä eluaatti konsentroitiin ja eluointipuskuri vaihdettiin.
• · · *... Proteiinit konsentroitiin tyypillisesti konsentraatioon \ * 5,0-10,0 mg/ml. Suoritettiin ultrasuodatus käyttäen ult- rasuodatusjärjestelmää, joka oli varustettu PTGC-Pelli- Γ“: 35 con™-kasettijärjestelmällä (Millipore, Inc., Bedford, MA) »»· ♦ • · · t · · ··· • ♦ ♦ « • · » 45 ja jossa käytettiin leikkausrajaltaan sopivaa suuruusluokkaa olevaa membraania.
Konsentroinnin jälkeen näytteille suoritettiin dia-filtraatio sopivaa puskuria vastaan. Konsentrointivaihees-5 ta peräisin oleva retentaattia diafiltroitiin 0,15 M NaCl:n ja 20 mM NaP04:n seosta vastaan, jonka pH oli 7,0, siihen asti kunnes retentaatin konduktiviteetti oli 5 % 0,15 M NaCl:n ja 20 mM NaP04:n seoksen, jonka pH oli 7,0, konduktiviteetista.
10 Lisäksi konsentroitu ja diafiltroitu proteiinia si sältävä näyte suodatettiin saostumien ja mahdollisen bak-teeriendotoksiinin poistamiseksi 0,1 μπι Posidyne™-suodattimena (Pali, Inc., Cortland, NY). Kun liuoksen proteii-nikonsentraatio oli määritetty, se laimennettiin haluttuun 15 lopulliseen konsentraatioon 0,15 M NaCl:n ja 20 mM nat-riumfosfaatin seoksella, jonka pH oli 7,0, lopullisen bulkkituotteen halutun konsentraation perusteella. Tämän jälkeen suoritettiin viimeinen aseptinen suodatus 0,22 μπκη suodattimen läpi, koska lopullinen bulkkituote siir-20 rettiin pyrogeenittömään säiliöön varastoitavaksi (noin 5 °C) jatkoformulointia varten.
B. Analyysi
Analyysi suoritettiin käyttäen E. colista peräisin *.ί.* olevaa natiivia KGF:ää; C(l,15)S:ää; C(l,15)S/R(144)Q:ta; • V 25 ΔΝ15:ttä; AN23:a ja ÄN23/R(144)Q:ta.
• ‘ i Konforinationaalinen stabiilisuus ·· · *:**: Polypeptidejä verrattiin toisiinsa tutkimalla nii- t*·.. den stabiilisuutta varastoitaessa, lämmön aikaansaaman a laskostuneisuuden purkautumisen siirtymälämpötiloja (Tm) ja 30 stabiilisuutta olosuhteissa, joissa käytetty pH-arvo oli valittu laajalta alueelta.
• ♦ ·
Stabiilisuus varastoitaessa c · · \ Natiivia KGF:ää ja C(l,15)S:ää inkuboitiin 37 °C:n « lämpötilassa noin 24 tuntia ja jäljelle jääneen liukoisen ··« t : ··· ·#· ♦ ♦ · 4. · · ··♦ • · « · • · · proteiinin määrä määritettiin. Tulokset on esitetty yh teenvetona kuvioissa 24 - 26.
46
Kuviossa 25 on verrattu toisiinsa natiivia KGF:ää ja C(1,15)S:ää varastoituna 27 tuntia 37 °C:ssa 20 mM Na-5 fosfaatin ja 0,15 M NaClrn seoksessa, jonka pH oli 7,0. C(l,15)S:llä osoittautui esiintyvän huomattavasti suurempi määrä liukoista proteiinia kuin natiivilla KGF:11a.
Kuviossa 26 on verrattu toisiinsa natiivia KGF:ää ja C(l,15)S:ää varastoituna 37 °C:ssa 0,15 M NaCl:n, 20 mM 10 Na-fosfaatin ja 0,15 M NaCl:n seoksessa, jonka pH oli 7,0. Tässäkin tapauksessa C(1,15)S oli stabiilisuudeltaan natiivia KGF:ää parempi.
Kuviossa 27 on verrattu natiivin KGF:n, ΔΝ15:η ja C(l,15)S:n stabiilisuutta PBS:ssa ja 50 mM NaP04:n ja 15 0,15 M NaCl:n seoksessa, jonka pH on 7,0, varastoituna 37 °C:ssa 18 tunnin ajan. Talteen saadun liukoisen proteiinin määrä on paljon suurempi suuressa fosfaattipitoi-suudessa kuin PBS:ssa (100 vs. 65 %). ΔΝ15 sekä C(1,15)S osoittautuivat olevan stabiilisuudeltaan merkittävästi na-20 tiivia KGF:ää parempia. AN15:lla ja C(l,15)S:lla saatiin myös ~100-%:inen saanto suuressa fosfaattipitoisuudessa, kuten natiivilla KGF:11a saatujen tulosten perusteella oli odotettua.
Suoritettiin kuitenkin yksi varastoinnin aikaista ·» * • 25 stabiilisuutta koskeva alustava vertailuesimerkkitutkimus, : jossa C(l,15,40)S:ää verrattiin C(40)S:ään (joka on muilta ····* osin sekvenssin nro 1 emästen 201 - 684 koodaama muoto, paitsi että Ser40:tä koodaa AGA); sekä vastaava tutkimus, * .*}·. jossa C(1,15,102) :ta verrattiin C(102)S:ään (joka on muil- • « · 30 ta osin sekvenssin nro 1 emästen 201 - 684 koodaama muoto, ,, paitsi että Serl02:ta koodaa AGG). Tulokset (näitä ei ole esitetty) viittasivat stabiilisuuden pienenemiseen (toisin • · · *·* * sanoen liukoista proteiinia oli 37 °C:ssa suoritetun va- \ Il rastoinnin jälkeen vähemmän). Elatusaineesta puhdistetun i*'*: 35 liukoisen oikein laskostuneen C (1,15,40) S-proteiinin määrä « ♦ · • • M • · I i · » »·· , 1 9 9 * Λ * 47 oli C(40)S:n määrää suurempi, mikä viittaa siihen, että C (1,15,40)S voi itse asiassa olla pysyvämpi ja että ver-tailuesimerkkitutkimuksesta saadut tulokset ovat sellaiset, ettei niiden perusteella voida tehdä johtopäätöksiä.
5 Tämä keksintö sisältää edullisesti KGF-analogin, jolla on muita substituutioita kuin Cys^rssä, Cys102:ssa Cys106:ssa esiintyviä substituutioita ja sen ulkopuolelle jäävät edullisemmin C(1,15,40)S, C(1,15,102)S ja 0(1,15,40,102,-106) .
10 Tutkittiin myös C (1,15)S/R(144)Q:n ja ΔΝ23/ R(144)Q:n kykyä estää aggregoituminen korkeissa lämpötiloissa. 0,5 mg/ml proteiinia sisältäviä näytteitä valmistettiin D-PBS:ään. 0,5 ml kutakin näytettä pipetoitiin näytteiksi 3 cm3:n vetoisiin tyypin 1 lasipulloihin. Pul-15 lot suljettiin kumitulpilla ja niiden päälle puristettiin 13 mm:n repäisemällä avattavat alumiinikapselit. Nämä pullot asetettiin tämän jälkeen 37 °C:n inkubaattoriin. Pullot poistettiin ennakolta määrätyin aikavälein ja niistä tutkittiin liukoisen proteiinin määrän väheneminen. Näky-20 vät saostumat poistettiin sentrifugoimalla 250 μΐ kutakin näytettä 0,22 μπΐ:η Spin-X™-suodatusyksikön läpi (Costar, Cambridge, MA) . Suodatetuissa liuoksissa oleva liukoisen proteiinin määrä analysoitiin jälkeenpäin kokoekskluusio- * •J.; HPLCrlla. Liukoisen proteiinin määrä määritettiin integ- I’·’: 25 roimalla HPLC-piikin pinta-ala ja esittämällä tulokset ; 37 °C:ssa suoritetun inkuboinnin keston funktiona. Tulok- • w » ..«.j set on esitetty kuviossa 27.
Näistä kineettisistä käyristä arvioitiin sitten % 1 · liukoisen, monomeerisen proteiinin häviämisen puoliintu- $ 1 · 30 misajat. Taulukossa 1 on esitetty näistä proteiineista „ jäljellä olevan liukoisen KGF:n määrä 37 °C:ssa suoritetun • · • 2 3 varastoinnin jälkeen.
• 4 fr « · « · « « > «·« «»· • : <»« 2 t 3 • t · • · § «·· • · 111 48
Taulukko 1
Liukoisten, monomeeristen proteiinien häviämisen puoliintumisaika
Proteiini t& (päivää) 5 natiivi KGF 0,6 ΔΝ23 1,1 C(l,15) 1,2 C(1,15)S/R(144)Q 13,3 10 AN23/R144Q 22,3 C(1,15)S/R(144)E 38
Kuten edellä olevasta taulukosta 1 ja kuviosta 28 havaitaan, aggregoitui natiivi KGF nopeimmin ja liukoisuu-15 den puoliintumisaika oli 0,6 päivää. Taulukosta havaitaan huomattava liukoisuuden puoliintumisajan pidentyminen C(l, 15)S/R(144)Q:lla, ΔΝ23/R(144) Q : 1 la ja C(1,15)S/ R(144)E:llä 13,3:ksi, 22,3:ksi ja 38:ksi päiväksi, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna.
20 Terminen laskostuneisuuden purkautuminen
Termistä laskos tune isuuden purkautumista seurattiin sirkulaarisen dikroismin (CD) määrityksellä 230 nm:n koh-dalta käyttäen J-720™-spektropolarimetriä (Jasco, Inc., s*·*: Easton, MD) , joka oli varustettu Peltier-tyyppisellä läm- ·:*: 25 pötilansäätöjärjestelmällä PTC-343. CD-analyysiä varten • · · ....j valmistettiin 0,1 mg/ml polypeptidiä sisältäviä erilli- :·. siä näytteitä D-PBS:ään (Life Technologies, Inc., Grand • ··
Island, NY) . Kutakin näytettä pipetoitiin noin 2,5 ml suo- • · · rakulmaiseen Suprasil™-kvartsista (Heraeus Quarzschmelze, .. 30 GmbH, Hanau, Saksa) valmistettuun fluoresenssin määritys- t · kyvettiin (Hellma Cells, Inc., Jamaica, NY), jonka valo- • · · *·* * tien pituus oli 10 mm. Kyvetti asetettiin tämän jälkeen : spektropolarimetrissä olevaan Peltier-tyyppiseen lämpöti- • · · .1. lansäätöjärjestelmään. Terminen laskostuneisuuden purkami- « · · 35 nen suoritettiin kohottamalla lämpötilaa 50 °C/tunti. El- • · · • · · • · • · ·«· 49 liptisyyden muutoksia monitoroitiin 230 nm:n kohdalta las-kostuneisuuden purkautumisen osoittamiseksi. Kunkin näytteen Tm-arvo arvioitiin toteamalla se lämpötila, jossa 50 % liuoksessa esiintyvistä proteiinimolekyyleistä oli laskos-5 tuneisuudeltaan purkautunut [Biophysical Chemistry, Cantor ja Schimmel (toim.), W.H. Freeman and Co., San Francisco (1980)3. Kunkin kolmen proteiinin arvioitu Tm on esitetty taulukossa 2.
10 Taulukko 2
Arvioidut sulamislämpötilat
Proteiini Tm (°C) natiivi KGF 54 15 ΔΝ15 55 C(1,15)S 55 ΔΝ23 56,6 C(1,15)S/R(144)Q 62,5 AN23/R144Q 63 20 C(l,15)S/R(144)E 63,5
Kuten nämä tulokset osoittavat, nousevat C(l,15)S:n ·.·.· ja ΔΝ15:η Tm-arvot 1 °C:lla natiiviin KGF:ään verrattuna.
• · · • ΔΝ23:η Tra nousee vielä tästäkin yhden asteen verran.
: : : 25 R144Q:n substituointi C(1,15)S/R(144)Qrksi tai Ä23:ksi saa • · · ·:··· Tm:n nousemaan yli 6 °C ja yli 7 °C natiiviin KGF:ään ver- i\. rattuna. Lisäksi C(l, 15) S/R(144) E on yli 9 °C stabiilimpi • kuin natiivi KGF.
» · ·
pH
30 C(1,15)S/R(144)Q:n ja C(1,15)S/R(144)E:n Stabiili- • · • ♦ ♦ suuksia happamissa oloissa verrattiin myös natiivin KGF:n • ♦ « stabiilisuuteen säätämällä D-PBS:n pH-arvo erisuuruisek- : si väkevää HCl:ää tai NaOH:ta lisäämällä. Noin 2,35 ml i’*‘: D-PBS:ää, joka oli valmistettu eri pH-arvoihin, yhdistet- • · · • · · • · · • · · 1 • ♦ • · • · · 50 tiin kvartsikyvetissä 100 ^l:aan KGF-proteiinia, jonka konsentraatio oli 2,45 mg/ml. Näille näytteille suoritettiin laskostuneisuuden purkaminen termisesti nostamalla lämpötilaa 50 °C/tunti ja reaktiota seurattiin CD:n avul-5 la 230 nm:n kohdalta. Kuviossa 29 on esitetty Tm pH:n funktiona natiivin KGF:n, C(l, 15)S/R(144)Q:n ja C(1,15)S/ R(144)E:n kyseessä ollessa. C(1,15)S/R(144)Q:n ja C(1,15)S/R(144)E:n Tm oli tutkitulla pH alueella aina korkeampi kuin natiivin KGF:n Tm.
10 Biologinen aktiivisuus in vitro -olosuhteissa Määritettiin myös C(l,15)S:n, ΔΝ15:η, ΔΝ23:η, ΔΝ23/ R(144)Q:n, C(1,15)S/R(144)Q:n ja C(1,15)S/R(144)E:n mito-geeninen aktiivisuus in vitro -olosuhteissa proteiinikon-sentraation funktiona sekä puolimaksimaaliset konsentraa-15 tiot määrittämällä (¾]-tymidiinin kerääntyminen Balb/MK-soluihin [Rubin, et al.:n (1989), edellä, menetelmien mukaisesti] . Kunkin KGF-analogin konsentraatiot verrattuna tunnettuun natiivia KGF:ää sisältävään standardiin määritettiin tavallisesti käyttäen biologista määritystä in 20 vitro -olosuhteissa. Tämän jälkeen kukin KGF-analogi laimennettiin ja niistä määritettiin biologinen aktiivisuus käyttäen Balb/MK-soluihin perustuvaa mitogeenistä määri- .·. tystä. Näytteet laimennettiin ensiksi biologiseen määri- • · · tysmediumiin, jonka koostumus oli 50 % asiakkaan valmista- • · I l' 25 maa Eaglen MEM:ää, 50 % asiakkaan valmistamaa F12:ta, • · · ' ; 5 μg/ml transferriinia, 5 ng/ml natriumseleniittiä, 0,005 % HSA:ta ja 0,005 % Tween 20:tä. Tämän jälkeen KGF- i · • ** näytteet lisättiin 96-kuoppaisiin Falcon primeria -levyi- • ·· J.: : hin, joihin oli lisätty kasvatusta varten Balb/MK-soluja.
30 Määritettiin [3H]-tymidiinin kerääntyminen soluihin DNA- • · • 1.· synteesin aikana ja tämä muunnettiin lisätyn natiivin KGF:n konsentraatioksi vertaamalla natiivin KGF:n standar- • dikäyrään. Tulokset on esitetty kuvioissa 30 - 35. Kuten • · · I” kuvioista havaitaan, on kuvioissa 29 - 34 kuvattujen tut- i : • · · • · · • · · • · · · · • · • · • · · 51 kittujen KGF-analogien aktiivisuus verrattavissa natiivin KGF:n aktiivisuuteen.
Esimerkki 3
Tuotanto nisäkässoluviljelmässä 5 Tämä esimerkki kuvaa nisäkäsilmentämisjärjestelmäs sä valmistetun kahden biologisesti aktiivisen yhdistelmä-KGF (rKGF) -muodon ilmentämistä, eristystä ja luonnehtimista.
Humaani-KGF-geeni eristettiin monistamalla PCR:n 10 avulla normaaleista ihmisen dermiksen fibroblastisoluista (Clonetec, Inc., San Diego, CA) peräisin olevaa cDNA:ta. Kun cDNA oli valmistettu käänteistranskriptaasin avulla, käytettiin PCR:ää KGF-geenin monistamiseen. Oligo#25:tä ja Oligo#26:ta käytettiin geenin monistamiseen cDNA:sta ja 15 Oligo#27:ää ja Oligo#28:aa käytettiin Hindlll- ja Bglll-restriktiokohtien sijoittamiseen fragmentin päihin käyttämällä toista PCR-monistusta kuviossa 1 esitetyllä tavalla. Oligo#25 (sekvenssi nro 69): 5'-CAATCTACAATTCACAGA-3' 20 Oligo#26 (sekvenssi nro 70): 5'-TTAAGTTATTGCCATAGG-3'
Oligo#27 (sekvenssi nro 71): 5'-AACAAAGCTTCTACAATTCACAGATAGGA-3' • · ·
Oligo#28 (sekvenssi nro 72) : ! 25 5'-AACAAGATCTTAAGTTATTGCCATAGG-3' • · · ·· \ KGF-geenin DNA:ta käytettiin sen kloonauksen ja DNA-sekvenssin varmistuksen jälkeen. Monistus suoritettiin • · ί ** käyttäen Oligo#29:ää ja Oligo#30:tä.
* · · *.· : Oligo#29 (sekvenssi nro 73) : 30 5'-CGGTCTAGACCACCATGCACAAATGGATACTGACATGG-3' 01igo#30 (sekvenssi nro 74) : : 1: 1: 5'-GCCGTCGACCTATTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3.
* *. Sense-aluke, Oligo#29, sisälsi Xbal-kohdan ja Ko- • » · zakin konsensus-translaatiosekvenssin (5'-CCACC-3'), joka i · ···’ 35 sijaitsi vastasuuntaan ATG-aloituskodonin suhteen. Anti- • · · • · · • · · · · • · • · • · · 52 sense-aluke, Oligo#30, sisälsi Sall-kloonauskohdan ja ylimääräisen lopetuskodonin. 18 PCR-monistussyklin jälkeen (30 sekunnin mittainen denaturointi 94 °C:ssa, 40 sekunnin mittainen yhteenliittyminen 55 °C:ssa ja 40 sekunnin mit-5 täinen pidentäminen 72 °C:ssa), tuote pilkottiin Xbal:lla ja Sällillä ja ligatoitiin samalla tavoin pilkottuun pDSRa2:n DNA:hän [Bourdrel, et ai.:n, Protein Exp. & Purit. 4 (1993) 130 - 140 ja Lu et al.:n, Arch. Biochem. Biophys. 298 (1992) 150 - 158 menetelmien mukaisesti]. 10 Tästä saatiin tulokseksi plasmidi KGF/pDSRa2, jossa humaa-ni-KGF-geeni oli sijoitettu SV40:n varhaisen promoottori-sekvenssin ja a-FSH:n polyadenylaatiosekvenssin väliin. Poimittiin kaksi kloonia ja halutun vektorin konstruoituminen varmistettiin DNA-sekvenssin analysoinnilla.
15 Tämän jälkeen 2 μπι KGF/pDSRce2:n DNA:ta linearisoi- tiin Pvul:lla. Tämän jälkeen kiinanhamsterin munasarja (CHO) -solut, jotka oli lisätty päivää aikaisemmin elatus-mediumeihin kasvatusta varten solutiheyteen 0,8 x 106 so-lua/60 mm:n viljelymalja, transfektoitiin käsitellyllä 20 DNA: 11a käyttäen normaalia kalsiumfosfaattisaostusmenetel-mää (Bourdrel, et ai., edellä). Kahden viikon kuluttua poimittiin yksittäisiä pesäkkeitä ja ne siirrettiin 24-kuoppaisille levyille. Solujen kasvatukseen käytetyt elä- ··· tusaineet katsottiin seerumittomiksi, silloin kun solut • · | S' 25 olivat yhteenkasvaneet, ja näistä otetut näytteet analy-• · · I soitiin Western-blottauksella käyttäen kanissa tehtyä po- • · .. lyklonaalista antiseerumia, joka oli reagointikykyinen E.
| · • " colissa ilmennettyä humaani-KGF:ää vastaan.
• · · V 1 Western-blottaukset suoritettiin erottamalla näyt- 30 teet komponentteihinsä 12,5-%:isissä (w/v) SDS-polyakryy- • · • 1·· liamidigeeleissä, minkä jälkeen suoritettiin elektroblot- taus 1 tunnin ajan 400 mA:n virranvoimakkuudella nitrosel-luloosamembraaneille käyttäen puolikuiviin olosuhteisiin • · · ::: perustuvaa siirtolaitetta (Hoefer Scientific Instruments, t :
*;· 35 San Francisco, CA) . Siirtopuskurina oli 20 mM Tris, 150 mM
• · · • · · • · t · · • · • · • · · 53 glysiini, 20-%:inen metanoli. Nitroselluloosa-arkit tehtiin reagoimattomiksi inkuboimalla niitä PBS:ään valmistetun 10-%:isen normaalin vuohenseerumin kanssa. Primaarisena vasta-aineena käytettiin E. colista peräisin olevaa 5 KGF:ää vastaan suunnattua kanissa tehtyä antiseerumia. Tämä laimennettiin käyttöä varten suhteessa 1/10 000 PBS:ään valmistettuun normaaliin 10-%:iseen vuohenseerumiin ja in-kuboitiin reagoimattomaksi tehtyjen nitroselluloosa-ark-kien kanssa 12 tuntia huoneenlämmössä, minkä jälkeen yli-10 määräinen vasta-aine poistettiin kolmella 30 minuutin mittaisella pesulla PBSrssa. Tämän jälkeen nitroselluloosa-membraaneja inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämmössä 100 mlrssa PBSrään valmistettua normaalia l-%:ista vuohen-seerumia, joka sisälsi biotinyloitua vuohessa tehtyä Vec-15 tastain™-anti-kani-IgG:tä (sekundaarinen vasta-aine, Vector Labs, Burlingame, CA). PBS:ssa suoritetun 30 minuutin mittaisen pesun jälkeen suoritettiin 30 minuutin mittainen inkubointi huoneenlämmössä 100 ml:ssa liuosta, joka oli valmistettu l-%:isesta normaalista vuohen seerumista, joka 20 sisälsi streptavidiiniä ja biotinyloitua peroksidaasia ja joka oli valmistettu valmistajan ohjeiden mukaisesti (Vector Labs). Kolmen PBSrssa suoritetun pesun jälkeen visua- .·. lisoitiin KGF:n suhteen ristireagoiva materiaali suoritta- • · · .!1! maila inkubointi seoksessa, joka sisälsi 60 ui 30-%:ista ‘ I 25 (w/v) H202:ta 100 ml:ssa PBSrää ja 50 mg 4-kloorinaftolia • · · ··’ ; 20 ml:ssa metanolia. Reaktio lopetettiin huuhtelemalla ve dessä 10 minuutin kuluttua.
• · ! 2 Blottien analyysista kävi ilmi, että KGF-spesifinen • · · !.: : vasta-aine assosioitui kolmeen erilliseen proteiinivyöhyk- 30 keeseen, joista kaksi muistutti läheisesti toisiaan ja joiden suhteelliset moolimassat olivat noin 25 - 29 kDa, ja joista yhden arvioitu suhteellinen moolimassa oli noin *. 17 kDa verrattuna 163 aminohapon pituisen kypsän proteii- • · · *···’ nin noin 18,8 suuruiseen odotettuun suhteelliseen mooli- • · · | ···' 35 massaan. Lisäksi valittiin useita voimakkaasti ilmentäviä • · · • · · • · · · · • 1 • · 2 • · · 54 klooneja, jotka Western-analyysin perusteella määritettynä erittivät yli 2,0 mg rKGF:ää litraa kohti, ja näitä jat-kokasvatettiin elatuspulloissa (roller bottles) Lu, et al.:n, edellä, menetelmän mukaisesti), minkä tarkoituksena 5 oli tuottaa suuria määriä solujen kasvatukseen käytettyä seerumitonta elatusainetta, josta KGF saataisiin puhdistettua kationinvaihtokromatografiällä ja geelisuodatuksel-la edempänä esitettävällä tavalla.
KGF, joka oli peräisin 3 l:sta seerumitonta solujen 10 kasvatukseen käytettyä elatusainetta, puhdistettiin johtamalla medium suoraan kationinvaihtokolonniin (5 x 24 cm), joka oli pakattu 450 ml :11a sulfoetyyli-S-Sepharose Fast Flowia (Pharmacia), joka oli tasapainotettu etukäteen 20 mM natriumfosfaatilla, jonka pH oli 7,5. Kun kolonni 15 oli pesty viisi kertaa sen tilavuutta vastaavalla määrällä 20 mM natriumfosfaatin ja 0,2 M NaCl:n seosta, jonka pH oli 7,5, eluoitiin rKGF käyttäen kolonnin tilavuutta 20-kertaisesti vastaavalla määrällä lineaarista gradienttia, jossa NaCl-konsentraatio oli aluksi 0 ja lopuksi 1,0 M ja 20 joka oli valmistettu 20 mM natriumfosfaattiin, jonka pH oli 7,5. Koottiin 50 ml:n suuruisia fraktioita seuraten jatkuvasti A280-arvoa. KGF-proteiini havaittiin analysoimalla kustakin fraktiosta otettuja näytteitä SDS-PAGE:11a.
• · · SDS-PAGE suoritettiin elektroforeesijärjestelmässä (Novex, • · · * \ 25 San Diego, CA) käyttäen etukäteen valettuja 14-%:isiä • · · :·* | tris-glysiinigeelejä (Laemmlin, Nature 227 (1970) 680 - ' * 685, mukaisella menetelmällä]. Näytteet yhdistettiin pel- • · \ ’** kestämättömään SDS-näytepuskuriin eikä niitä kuumennettu • ·· : ennen pipetointia. Proteiinit havaittiin joko Coomassie- 30 sini- tai hopeavärjäyksellä. Kahden myöhään eluoituvan piikin havaittiin sisältävän' proteiinivyöhykkeitä, jotka vastasivat Western-blotilla havaittuja 25 - 29 kDa:n ja ·, 17 kDa:n vyöhykkeitä. Kutakin näitä piikkejä sisältäviä • · · *·:·* fraktioita konsentroitiin erikseen alle 1,0 ml:n tilavuu- • · · 35 teen ja niille suoritettiin geelisuodatus.
• · · • · · ♦ · · ··· • · • · »«· 55
Geelisuodatuksiin käytettiin Superdex-75™-hartsia (HR10/30, Pharmacia) sisältäviä kolonneja, jotka oli tasapainotettu etukäteen PBS:11a, jonka pH oli 7,2 ja kalibroitu seuraavilla tunnetuilla suhteellisen moolimassan 5 standardeilla (BioRad, San Francisco, CA): tyroglobuliini (670 kDa), g-globuliini (158 kDa), ovalbumiini (44 kDa) , myoglobiini (17 kDa) ja B12-vitamiini (1,4 kDa). Näiden puhdistusvaiheiden tuloksena saatiin rKGF puhdistettua noin 2 000-kertaisesti, ja tämä sisälsi hopeavärjäyksen 10 perusteella arvioituna erityisesti 17 kDa:n ja 30 kDa:n suuruista materiaalia.
Suurimoolimassaisen materiaalin kyseessä ollessa rKGF eluoitui symmetrisenä pääpiikkinä (A^m perusteella) , josta käytettiin nimitystä KGF-a. Kun pienehkö määrä tätä 15 materiaalia, 3 ^g/kanava versus 6 ^g/kanava, oli analysoitu SDS-PAGE:11a, saatiin erottumaan kaksi vyöhykettä, joiden suhteelliset moolimassat erosivat 1-2 kDa. Pienemmän moolimassan mukaisen materiaalin kyseessä ollessa, josta käytettiin nimitystä KGF-b, tuotti geelisuodatus tuloksek-20 si proteiinipreparaatin, jonka mobiliteetti oli odotettua luokkaa. Sekä KGF-a että KGF-b:n kyseessä ollessa oli kokonaissaanto puhdistuksen jälkeen noin 30 - 40 %.
.·. KGF-a:sta ja KGF-b:stä analysoitiin myös aminohap- • · · ."I posekvenssit. Nämä analyysit suoritettiin automaattisella \ * 25 sekvensointilaitteella (malli 477A tai 470A, Applied Bio- • · · systems, Inc., Foster City, CA) , joka oli varustettu laitteeseen yhdistetyllä mallin 120A PTH-aminohappoanalysaat- • · ! **· torilla ja mallin 900A koetulosten keräysjärjestelmällä : [Lu, et al.:n, J. Biol. Chem. 266 (1991) 8102 - 8107, me- 3 0 netelmän mukaisesti] . KGF-a:n analyysistä Edman-menetel-·*·.. mällä saatiin selville päämateriaalin N-terminaalinen sek- venssi, joka oli X1-N-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-N-V-X2-X3-S- [sek- *. venssi nro 75] . Sekvensoitavissa olevan proteiinin koko- • · · ’···* määrästä esiintyi myös 1,6 % sivumateriaalia, jonka sek- | · ···* 35 venssi alkoi kolmannesta N-terminaalisesta aminohaposta, • · · « · · • · · ··· • « • · · 56 asparagiinihaposta. Koska sekvensoinnin aikana ei X^stä, X2:sta eikä X3:sta saatu fenyylitiohydantoinyyli (PTH) -arainohapposignaaleja, ne jätettiin määräämättä. cDNA-sek-venssistä ennustetun KGF:n N-terminaalinen aminohapposek-5 venssi viittaa siihen, että Xj ja X3 ovat Cys-ryhmiä ja X2 on asparagiini. Xt:n ja X3:n puuttuminen viittaa siihen, että nämä kysteiinit voivat muodostaa disulfidisiltoja. N:n välityksellä tapahtuvan glykosyloitumisen konsensus-sekvenssin Asn-X-Ser perusteella viittaa X2:ta vastaavan 10 ennustetun Asn-ryhmän puuttuminen siihen, että se on mahdollinen N: n välityksellä tapahtuvan glykosyloitumisen kohta.
On mielenkiintoista panna merkille, että KGF-b:n N-terminaalisen sekvenssin analysoinnista kävi ilmi, että 15 N-terminaalinen aminohapposekvenssi oli S-Y-D-Y-M-E-G-G-D-I-R-V- (sekvenssi nro 76), mikä viittaa siihen, että se on KGF:n N-terminaalisesti typistynyt muoto, joka on pilkkoutunut proteolyyttisesti Arg23-Ser24-peptidisidoksen kohdalta.
20 Puhdistettujen KGF-a:n ja KGF-b-.n luonnehtimiseksi täydellisemmin proteiinia käsiteltiin glykosidaaseilla (neuraminidaasi, O-glykanaasi ja/tai N-glykanaasi) käyt-täen tunnettuja menetelmiä [Sasaki, et ai., J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059 - 12076; Takeuchi, et ai., J. Biol. Chem.
« · I .·. 25 263 (1988) 3657 - 3663; Zsebo, et ai., Cell 63 (1990) • · · m" I 195 - 201] . Nämä koetulokset viittaavat siihen, että KGF-a • · sisältää N:stä ja 0:sta kytkeytyviä hiilihydraatteja, • ]1 vaikkakin KGF-a:n pienemmän moolimassan muoto sisältää • · · ·1 ’ otaksuttavasti ainoastaan N:stä kiinnittynyttä sokeria.
30 KGF-b:n suhteellinen moolimassa ei pienentynyt glykosidaa- • ♦ • 1·· sikäsittelyllä, mikä viittaa siihen, että tämä molekyyli on glykosyloitumaton.
• KGF-a:n glykosyloitumistapaa luonnehdittiin tarkem- • · · ‘.V. min edellä kuvattujen Glu-C-endoproteinaasilla valmistet- t : “· 35 tujen peptidien massaspektroskopialla. Glykopeptidien hii- • · · • · · • · · · · • · • · • ·· 57 lihydraattirakenteen selvittäminen askelittain muutettavan aukon käyttöön (stepped orifice) perustuvalla massaspekt-rometrianalyysimenetelmällä, on käytetty suotuisin tuloksin muihin proteiineihin [Huddleston, et ai., Anal. Chem.
5 65 (1993) 877 - 884; Carr, et ai., Prot. Sei. 2 (1993) 183 - 196]. Kuten ei-glykosyloitumattoman peptidin eristämisellä oli saatu varmistettua, näyttää Thr22 olevan osittain glykosyloitunut. Asnw:n analysointi samalla tavoin massaspektrometrillä viittaa glykosyloitumisessa esiinty-10 vään mikroheterogeenisyyteen, jossa esiintyy bi-, tri- ja tetra-antennaarisia rakenteita, joissa sialyloituminen on eriasteista.
Taulukossa 3A on esitetty yhteenveto kokeista, joista käy ilmmi se KGF-konsentraatio, joka stimuloi (¾] -15 tymidiinin kerääntymistä keratinosyytteihin puolimaksimaa- lisella nopeudella [Rubin, et al.:n (1989), edellä, menetelmän mukaisesti]. Vuorovaikutus KGF-reseptorin kanssa tutkittiin käyttäen eristettyjä KGF-reseptorin membraani-preparaatteja, jotka oli valmistettu Balb/MK-hiiren epi-20 dermaalisista keratinosyyteistä [käyttäen Massaguen, J.
Biol. Chem. 258 (19932) 13614 - 13620, kuvaamaa menetel mää] . Tässä meneteltiin yksityiskohtaisesti siten, että ,·. useita erilaisia KGF:n muotoja laimennettiin 50 mM Tris- • · · HCl:lla, jonka pH oli 7,5 ja joka sisälsi 0,2 % naudansee- S · \ ; 25 rumialbumiinia siten, että konsentraatioalue oli 0,8 - 100 • · · ··* ; ng 50 μΐ-.ssa. Näitä inkuboitiin yksittäin membraaniprepa- ' ’ raatin (75 ng/ml) ja 125I-leimalla varustetun E. colista • · i ’·' peräisin olevan KGF:n (1,5 ng) kanssa. Reseptoriin sitou- • ·· : tumista ja kompetitiota koskevat kokeet suoritettiin läm- 30 pötilassa 4 °C 16 tunnin ajan, jonka ajan kuluttua umpeen otettiin näytteet, nämä sentrifugoitiin ja pestiin kaksi kertaa edellä olevalla laimennuspuskurilla sitoutumattoman ·. ja epäspesifisesti sitoutuneen leimalla varustetun KGF:n • · · poistamiseksi. Tämän jälkeen näytteistä laskettiin niihin | · ···* 35 jäänyt radioaktiivisuus. KGF-näytteiden ja leimalla varus- • · · • · · • · t 1 • · « · ··· 58 tetun KGF:n välisen reseptoriin sitoutumista koskevat kom-petitiokäyrät valmistettiin laatimalla kuvaaja unkompeti-tio-%:sta suhteessa kunkin KGF-näytteen konsentraatioon. Taulukossa 3B on esitetty yhteenvetona KGF-konsentraatio, 5 joka tarvitaan 60-%:isen unkompetitioasteen saavuttamiseksi leimalla varustettua E. colista peräisin olevaa KGF:ää vastaan ilmoitettuna yksiköissä ng/ml.
Taulukko 3A
10 Puolimaksimaalisesti E3!!] -tymidiinin kerääntymistä kerati-nosyytteihin stimuloiva KGF-konsentraatio
Muodot ng/ml E. coli -KGF 10 15 KGF-a 30 KGF-b 30
Taulukko 3B
KGF-konsentraatio, joka tarvitaan kilpailuun I125-leimalla 20 varustetun KGF:n kanssa sitoutumisesta reseptoriin 60-pro-senttisella unkompetitioasteella
Muodot ng/ml • · • · · ♦ ·· E. coli -KGF 65,8 • · : ϊ*ϊ 25 KGF-a 93,5 *:**i KGF-b 89,1 • ·
Kuten taulukossa 3A on esitetty, stimuloivat KGF-a | · · ·* ’ ja KGF-b vertailukelpoisella tavalla 1¾]-tymidiidin ke- 30 rääntymistä soluihin ja jommankumman analogin konsentraa- ·· : ’·· tio noin 30 ng/ml stimuloi kerääntymistä puolimaksimaali- ··· V : sella tasolla. Siten typistäminen ei pienennä tämän mole- . ,·. kyylin biologista aktiivisuutta. Näiden kahden analogin • · · ^1# aktiivisuus on kuitenkin kolme kertaa pienempi kuin E.
*Γ 35 colista peräisin olevan täysimittaisen KGF:n aktiivisuus. ··· • ♦ * • · · ··« • · • · ·»· 59
Kuten taulukossa 3B on esitetty, viittaavat määritykset, joissa määritetään unkompetitiota radioaktiivisuuden kiinnittymisessä reseptoriin, siihen, että E. colista peräisin olevan KGF:n, KGF-a:n ja KGF-b:n aktiivisuudet reseptoriin 5 sitoutumisessa ovat samanlaiset.
Esimerkki 4 E. colissa ja nisäkässoluviljelmässä tuotettujen KGF-polypeptidien biologinen määritys in vitro -olosuhteissa 10 Yhden ihonalaisen KGF-annoksen on osoitettu joh tavan hiirillä 24 tunnin kuluessa annoksesta riippuvaiseen seerumin kolesterolipitoisuuden nousuun. Natiivista KGF:sta KGF-a:sta, C(1,15)S:stä, ÄN15:tä ja AN23:sta määritettiin myös niiden kyky kohottaa seerumin kolesteroli-15 pitoisuutta annoksesta riippuvaisella tavalla.
Kussakin käsittelyryhmässä oli 5 naaraspuolista CRL:sta saatua Balb/C-hiirtä (18 - 20 g) . Proteiini laimennettiin 0,9-%:isella fysiologisella suolaliuoksella siten, että lopulliseksi injektiotilavuudeksi saatiin 100 20 μΐ/hiiri. Kullekin hiirelle annettiin yksi ihonalainen injektio käyttäen annoksia, jotka olivat: • · • · · • · · »· · : · : • · • · * · · • · · • · · • · * · t ·..
m • ·· f * * * · · • · • · • ·« • · · • · ♦ • · · * · · • · · ··· • · · t : ··· ··· • · · « · · 1 • · • · ··· 60
Ryhmä Käsittely Annos (mg/kg) 1 Natiivi KGF 0,1
Natiivi KGF 0,25
Natiivi KGF 0,5 5 Natiivi KGF 1
Natiivi KGF 5 2 C(1,15)S 0,1 C(1,15)S 0,25 C(1,15)S 0,5 10 C(1,15)S 1 C (1,15)S 5 3 ΔΝ15 0,25 ΔΝ15 0,5 ΔΝ15 1 15 ΔΝ15 5 4 ΔΝ23 0,1 ΔΝ23 0,5 ΔΝ23 1 ΔΝ23 5 . 20 5 KGF-a 0,01 ·« · :*·*: KGF-a 0,05 • · : KGF-a 0,1 • · · * *:**i KGF-a 0,5 » * ! *·· 6 Fysiologinen suola- *:*. liuos, kontrolli i * · * 25
Hiiret lopetettiin 24 tuntia injektion jälkeen ja • · ί ·.. niistä otettiin verta sydänpunktiolla. Verinäytteet käsi- **;*; teltiin seerumin kolesterolipitoisuuden määrittämiseksi.
*, Kuten kuviossa 35 on esitetty, havaittiin kunkin • » » 30 tutkitun KGF-analogin kohottavan seerumin kolesterolipi- | ···* toisuutta annoksesta riippuvaisella tavalla. Ei myöskään ··· ♦ · ♦ * · · ··« ♦ · • ♦ ··♦ 61 esiintynyt minkäänlaista ilmeistä eroa minkään tutkitun KGF-analogin biologisen aktiivisuuden kesken.
In vivo -diabetesmalli
Kemiallisesti aikaansaatuja diabetes mellitus -mal-5 leja useissa erilaisissa eläinlajeissa on käytetty klassi-sesti tämän taudin ja sen hoidon tutkimiseen. Streptotsoo-tosiini saa aikaan diabeteksen hiiressä, rotassa, hamsterissa, koirassa ja apinassa, vaikkakin rotilla ja hiirillä suoritettuja tutkimuksia on käytetty eniten. Junod, et 10 ai., Proc. Soc. Exp. Pio. Med. 126 (1967) 210 - 205; Re- rup, Pharm. Rev. 22 (1970) 485 - 518; Rossini, et ai., P.N.A.S. 74 (1977) 2485 - 2489; ja Ar'Rajab ja Ahren,
Pancreas 8 (1993) 50 - 57. Rotilla saavat suuruudeltaan 45 - 70 mg/kg olevat streptotsootosiiniannokset yhtenä 15 suonensisäisenä annoksena aikaan pysyvän taudin. Annokset, jotka ovat alle 45 mg/kg, saavat aikaan väliaikaisen tautitilan, joka on palautuva. Hyperglykeminen tila indusoituu yhdessä päivässä streptotsootosiinin injektiosta. Veren insuliinipitoisuudet pysyvät olennaisesti muuttumat-20 tornina normaaleihin rottiin verrattuina, insuliinin ja C-peptidin kokonaispitoisuus haimassa pienenee huomattavasti. Rotilla esiintyy ihmisillä esiintyvän diabeteksen klassiset oireet ja sairauden merkit: veren glukoosipitoi- i i i .**! suuksien kohoaminen (hyperglykemia) , glukoosin erittyminen • · · ’ 1 2 3 25 virtsaan (glukosuria) , janon lisääntyminen (polydipsia), • Il *·1 j virtsaamisen lisääntyminen (polyuria) , ruokahalun lisään- * 1 tyminen (hyperfagia). Tässä patenttiselityksessä esitetyt » · i 1·· tutkimukset suoritettiin käyttäen streptotsootosiinilla • ·· · aikaansaatua diabetesmallia Sprague-Dawley-rotilla. Käy- 30 tettiin koiraspuolisia rottia, jotka painoivat koetta }1·.. aloitettaessa 200 - 260 g. Diabetes aiheutettiin injektoi- ♦ maila eläimiin yksi suonensisäinen injektio streptotsooto- t siinia käyttäen 50 mg streptotsootosiinia natriumsitraat- « · · 2 :·1 tipuskurissa ruumiinpainokiloa kohti. Ei-diabeettisille • ·· *...· 35 kontrollirotille annettiin yksi suonensisäinen injektio 3 • « · • · · * *·« » · * ·
Mt 62 natriumsitraattipuskuria kontrollitarkoituksiin. KGF:ää annettiin päivittäin ihonalaisena injektiona. KGF-annos oli 3 tai 5 mg/kg päivässä sen mukaan, mikä koe oli kysymyksessä. Ensimmäisessä kokeessa aloitettiin KGF-käsittely 5 kaksi päivää ennen diabeteksen käynnistämistä ja sitä jatkettiin diabeteksen käynnistymisen jälkeen yhteensä kahdeksan injektion ajan. Toisessa ja kolmannessa kokeessa aloitettiin KGF-hoito ihonalaisin injektioin yksi päivä streptotsootosiinilla aikaansaadun diabeteksen käynnisty-10 misen jälkeen. Neljännessä kokeessa aloitettiin 7 päivän mittainen KGF-käsittely 7 päivää streptotsootosiinikäsit-telyn jälkeen ja eläimiä seurattiin vielä 12 viikon ajan. Kaikissa kokeissa käytettiin neljättä koetta lukuun ottamatta analyysin loppupisteinä veren glukoosipitoisuuksia, 15 virtsan glukoosipitoisuuksia ja virtsan tilavuutta. Lisäksi joissakin kokeissa määritettiin nautitun veden määrää, virtsan C-peptidipitoisuuksia tai haiman kokonaisinsuliinia ja C-peptidipitoisuutta. Neljännessä kokeessa ainoa määritetty loppupiste oli veren glukoosipitoisuus. Koska 20 maksa poistaa suurimman osan insuliinia verenkierrosta, heijastavat periferaalisen veren insuliinikonsentraatiot maksan jälkeen tapahtuvia metabolisia ilmiöitä pikemminkin kuin insuliinin erittymistä haimasta. Tästä syystä insu- t · · .**! liinin erittymisen periferaalisena markkerina käytetään • * · • · 25 usein C-peptidimäärityksiä. C-peptidi muodostuu proinsu- • · · : liinin muokkautuessa insuliiniksi. Beeta-solut erittävät insuliinia ja C-peptidiä vastaavansuuruisina moolimäärinä * 4 • *'· ja maksa poistaa ainoastaan pienen määrän C-peptidiä.
* : ϊ Tässä tutkimuksessa tutkittiin rKGF:n vaikutusta 30 streptotsootosiinilla aikaansaatuun diabetekseen Sprague-Dawley-rotissa. 0. päivänä käsiteltiin rotista koottuja ryhmiä joko 45 tai 50 mg/kg streptotsootosiinilla (STZ) . Näiden käsittelyjen jälkeen seurattiin solusaarekkeiden λ m · *·ϊ·* vaurion vakavuuden määrittämiseksi päivittäin veren glu- ··« 35 koosipitoisuuksia eläimissä, joilta ravinnonsaantia ei « « · • * · «·« • * * · ·«· 63 ollut rajoitettu. STZ:lla käsitellyt eläimet jaettiin 5. päivänä jompaankumpaan kahdesta ryhmästä (20/ryhmä) hyper-glykemian voimakkuuden mukaisesti. Jakopiste asetettiin veren glukoosipitoisuuden 300 mg/dl kohdalle. STZ:lla kä-5 sittelemättömistä eläimistä koottu ryhmä toimi kontrolleina. 7. päivänä annettiin kullekin kustakin hyperglykemi-sestä ryhmästä peräisin olevalle 10 eläimelle AN23:a (3 mg/kg päivässä) tai PBS:ää injektoimalla tätä ihonalaisesti 7 päivän ajan. Tämän jälkeen veren glukoosipitoi-10 suuksia seurattiin päivittäin, joka toinen päivä tai viikoittain ja ne on esitetty kuviossa 51. On pantava merkille, että STZ:lla käsitellyistä eläimistä, jotka ovat peräisin molemmista niistä ryhmistä, joille annettiin AN23:a, esiintyi merkittäviä veren glukoosipitoisuuden 15 pienenemisiä ΔΝ23:η annosten antamisen aikana. On tärkeää panna merkille, että veren glukoosipitoisuuden keskiarvon lasku niillä STZ:lla käsitellyillä eläimillä, jotka olivat peräisin ryhmästä, jossa veren glukoosipitoisuus oli kokeen alkaessa < 300 mg/kg, stabiloitui arvoon noin 150 mg/ 20 dl, kun taas veren glukoosipitoisuuden lasku, joka havaittiin ryhmässä, jossa veren glukoosipitoisuus oli kokeen alussa > 300 mg/dl, oli ainoastaan väliaikainen. On panta-va merkille, että päiväasteikko on epälineaarinen.
« · ·
Vaikka tämä keksintö on kuvattu edellä sekä ylei- « * · * • * ’ * 25 sesti että sen edullisten sovellutusmuotojen muodossa, on w * · | selvää, että siitä on oivallettavissa alan ammattikoke- t« ·· · muksen perusteella muita variaatioita ja modifikaatioita
r -J
i ·· edellä olevan patenttiselityksen valossa.
·«« *9 · • · »· * ·
• M
• · « • · · « · « ···
Ml x : »li • •I I 9 · • · t • m • * » · ··· 64
Sekvenssilistaus (1) YLEISET TIEDOT: (i) HAKIJA: Amgen Inc.
(ii) KEKSINNÖN NIMITYS : Keratinosyytti-kasvutekijän analogeja (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 104 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE: (A) VASTAANOTTAJA: Amgen Inc.
(B) KATU: 1840 Dehavilland Drive (C) KAUPUNKI: Thousand Oaks (D) OSAVALTIO TAI LÄÄNI: Kalifornia
(E) MAA: USA
(F) POSTINUMERO: 91320-1789 (v) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC -yhteensopiva
(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS
(D) OHJELMISTO: Patentin Release #1.0, versio #1.30 (vi) NYKYISEN HAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: PCT/IB95/00 971 (B) JÄTTÖPÄIVÄMÄÄRÄ: 12.10.1995 (C) LUOKITUS: (vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: 08/487 825 (B) JÄTTÖPÄIVÄMÄÄRÄ: 7.6.1995 . (C) LUOKITUS: • · · j’\: (vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: | .·. (A) HAKEMUSNUMERO: 08/323 475 :·· : (B) JÄTTÖPÄIVÄMÄÄRÄ: 13.10.1994 ·:··! (C) LUOKITUS: | 1·· (viii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: 08/323 340 '·1 ' (B) JÄTTÖPÄIVÄMÄÄRÄ: 13.10.1994 (C) LUOKITUS: • · • 1·· (viii) ASIAMIEHEN TIEDOT: (A) NIMI: Zindrick, Thomas D.
*·1 1 (B) REKISTERINUMERO: 32 185
(C) VIITE/LUETTELONUMERO: A-315C
• · · • · · • · « • · • · • · · • · · • · · • · · · · • · • · • · · 65 (2) SEKVENSSIN NRO 1 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 862 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(i i) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 1: CAATCTACAA TTCACAGATA GGAAGAGGXC AATGACCTAG GAGTAACAAT CAACTCAAGA 60 TTCATTTTCA TTATGTTATT CATGAACACC CGGAGCACTA CACTATAATG CACAAATGGA 120 TACTGACATG GATCCTGCCA ACXXXGCXCX ACAGATCATG CXXXCACAXX ATCTGTCTAG 180 TGGGTACTAT ATCTTTAGCT TGCAATGACA TGACTCCAGA GCAAAXGGCX ACAAATGTGA 240 ACXGXXCCAG CCCTGAGCGA CACACAAGAA GXXAIGAXXA CATGGAAGGA GGGGAXAXAA 300 GAGTGAGAAG ACXCTTCXGT CGAACACAGT GGTACCTGAG GATCGATAAA AGAGGCAAAG 360 XAAAAGGGAC CCAAGAGAXG AAGAAXAAXX ACAAXAXCAX GGAAAXCAGG ACAGTGGCAG 420 XXGGAAIXGX GGCAATCAAA GGGGXGGAAA GTGAAXXCTA XCXXGCAATG AACAAGGAAG 480 GAAAACXCXA XGCAAAGAAA GAAXGCAAXG AAGAXXGXAA CXXCAAAGAA CXAAXXCXGG 540 AAAACCAXTA CAACACATAT GCAXCAGCXA AATGGACACA CAACGGAGGG GAAAXGXXTG 600 XXGCCXXAAA XCAAAAGGGG AXXCCXGXAA GAGGAAAAAA AACGAAGAAA GAACAAAAAA 660 . CAGCCCACXX XCXXCCXAIG GCAAIAACXX AAXXGCAXAI GGXAXAXAAA GAACCCAGXX 720 • · · • · · : V CCAGCAGGGA GAIXXCXTXA AGXGGACXGX XXXCXXXCXX CICAAAAIXX XCXXXCCXXX 780 • · • · · '** i XATXXXXXAG XAAICAAGAA AGGCXGGAAA AACTACTGAA AAACXGAXCA AGCXGGACXX 840 • · GXGCAXXXAX GXXXGXXXXA AG 862 • ·« (2) SEKVENSSIN NRO 2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: • (A) PITUUS: 194 aminohappoa : ** (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon *. (D) TOPOLOGIA: tuntematon • · · **j;1 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini • · • · • · φ • · · • · · • · · · · • · • · • · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 2: 66
Met Hia Lys Trp Ile Leu Thr Trp Ile Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Arg 15 10 15
Ser Cys Phe His Ile Ile Cys Leu vai Gly Thr Ile Ser Leu Ala Cys 20 25 30
Aan Aap Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Aan Vai Aan Cya Ser Ser 35 40 45
Pro Glu Arg Hia Thr Arg Ser Tyr Aap Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile 50 55 60
Arg Vai Arg Arg Leu Phe Cya Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp 65 70 75 80
Lys Arg Gly Lys Vai Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Aan Tyr Aan 85 90 95
Ile Met Glu Ile Arg Thr Vai Ala vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly 100 105 110
Vai Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr 115 120 125
Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu 130 135 140
Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly 145 150 155 160
Gly Glu Met Phe Vai Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Vai Arg Gly . 165 170 175 • · • e · e e e
Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lya Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala • ·1 180 185 190 • · e · · • · ·
He • · (2) SEKVENSSIN NRO 3 TIEDOT: • e · e (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: * (A) PITUUS: 595 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo :·. (C) JUOSTEISUUS: tuntematon : 2 (D) TOPOLOGIA: tuntematon «·· • « »
\ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA
• · · • · ♦ ·♦· • · · t : • · · • · e • · · • · · · · • · • · 2 • · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 3: 67 ATCGATTTGA TTCTAGAAGG AGGAATAACA TATGAAAAAG CGCGCACGXG CTATCGCCAT 60 TGCTGTGGCT CTGGCAGGTT TCGCAACTAG TGCACACGCG TGCAAXGACA TGACTCCAGA 120 GCAAATGGCT ACAAATGTGA ACTGTTCCAG CCCTGAGCGA CACACAAGAA GTTAXGATTA 180 CAXGGAAGGA GGGGAXAXAA GAGXGAGAAG ACXCXXCXGX CGAACACAGX GGXACCXGAG 240 GAXCGAXAAA AGAGGCAAAG XAAAAGGGAC CCAAGAGAXG AAGAAXAAXX ACAAXAXCAX 300 GGAAAXCAGG ACAGXGGCAG XXGGAAXXGX GGCAAXCAAA GGGGXGGAAA GXGAAXXCXA 360 TCXXGCAAXG AACAAGGAAG GAAAACXCXA XGCAAAGAAA GAAXGCAAXG AAGAXXGXAA 420 CXXCAAAGAA CXAAXXCXGG AAAACCAXXA CAACACATAT GCATCAGCXA AAXGGACACA 480 CAACGGAGGG GAAAXGXXXG TTGCCXXAAA TCAAAAGGGG AXXCCXGXAA GAGGAAAAAA 540 AACGAAGAAA GAACAAAAAA CAGCCCACXX XCXXCCXAXG GCAAXAACXT AAXAG 595 (2) SEKVENSSIN NRO 4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 186 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 4: • · '···’ Met Lya Lya Arg Ala Arg Ala Ile Ala Ile Ala Vai Ala Leu Ala Gly Γ·’: 15 10 15 • · • · : Phe Ala Thr Ser Ala Hia Ala Cys Asn Aap Met Xhr Pro Glu Gin Met 20 25 30 • · j 1·· Ala Thr Aan Vai Aan Cya Ser Ser Pro Glu Arg Hia Thr Arg Ser Tyr 35 40 45 • · • · • · · • · · • · · · « • « · • · · • · · « · · t : • · · • · · • · · • · · m · · • · • · • · · 68
Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Vai Arg Arg Leu Phe Cys Arg 50 55 60
Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Vai Lys Gly Thr 65 70 75 80
Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Vai Ala 85 90 95
Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala 100 105 110
Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp 115 120 125
Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala 130 135 140
Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Vai Ala Leu Asn 145 150 155 160
Gin Lys Gly Ile Pro vai Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys 165 170 175
Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 180 185 (2) SEKVENSSIN NRO 5 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 499 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo . (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
: V
• .·. (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
• · · ·« · ·:··· (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 5: • e • ** TATGTGCAAT GACATGACTC CAGAGCAAAT GGCTACAAAT GTGAACTGTT CCAGCCCTGA 60 ··· i : : GCGACACACA AGAAGTTATG ATTACATGGA AGGAGGGGAT ATAAGAGTGA GAAGACTCTT 120 CTGTCGAACA CAGTGGTACC TGAGGATCGA TAAAÄGAGGC AAAGTAAAAG GGACCCAAGA 180 e • e · : GATGAAGAAT AATTACAATA TCATGGAAAT CAGGACAGTG GCAGTTGGAA TTGTGGCAAT 240 CAAAGGGGTG GAAAGTGAAT TCTATCTTGC AATGAACAAG GAAGGAAAAC TCTATGCAAA 300 e e e t : • e e e e e * e e · ee· e M* e · e · e e · 69 GAAAGAATGC AATGAAGATT GTAACTTCAA AGAACTAATT CTGGAAAACC ATTACAACAC 360 ATATGCATCA GCTAAATGGA CACACAACGG AGGGGAAATG TTTGTTGCCT TAAATCAAAA 420 GGGGATTCCT GTAAGAGGAA AAAAAACGAA GAAAGAACAA AAAACAGCCC ACTTTCTTCC 480 TATGGCAATA ACTTAATAG 499 (2) SEKVENSSIN NRO 6 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 164 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 6:
Met Cys Aan Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Aan Vai Aan Cya 15 10 15
Ser Ser Pro Glu Arg Hia Thr Arg Ser Tyr Aap Tyr Met Glu Gly Gly 20 2S 30
Aap Ile Arg Vai Arg Arg Leu Phe Cya Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg 35 40 45
Ile Aap Lya Arg Gly Lya Vai Lya Gly Thr Gin Glu Met Lya Aan Aan 50 55 60 . Tyr Aan Ile Met Glu Ile Arg Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile 65 70 75 80 • · · i * * | ·* Lya Gly Vai Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Aan Lya Glu Gly Lya : 85 90 95 • · · * * Leu' Tyr Ala Lya Lya Glu Cya Aan Glu Aap Cya Aan Phe Lya Glu Leu 100 105 110 • ·· *.· · Ile Leu Glu Aan Hia Tyr Aan Thr Tyr Ala Ser Ala Lya Trp Thr Hia 115 120 125
Aan Gly Gly Glu Met Phe Vai Ala Leu Aan Gin Lya Gly He Pro Vai 130 135 140 • · · • e ·
Arg Gly Lya Lya Thr Lya Lya Glu Gin Lya Thr Ala Hia Phe Leu Pro :.j.: 145 150 155 160 »»· i : **· Met Ala Ile Thr • e · • · · • e · ··♦ • · • · • · · (2) SEKVENSSIN NRO 7 TIEDOT: 70 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 25 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(i i) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 7: CAATGACCTA GGAGTAACAA TCAAC 25 (2) SEKVENSSIN NRO 8 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 26 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 8: AAAACAAACA TAAATGCACA AGTCCA 2 6 (2) SEKVENSSIN NRO 9 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 26 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon . (D) TOPOLOGIA: tuntematon • · ·
j*V (ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA
• · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 9: m • · .. ACAACGCGTG CAATGACATG ACTCCA 26 1 ·.. m (2) SEKVENSSIN NRO 10 TIEDOT: 9 · · (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 31 emäsparia : 1 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon *. (D) TOPOLOGIA: tuntematon
*·:·* (ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA
• · · i : « · · »·· • · · • · · • · • · «·· (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 10: 71 ACAGGATCCT ATTAAGTTAT TGCCATAGGA A 31 (2) SEKVENSSIN NRO 11 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 11: ACACATATGT GCAATGACAT GACTCCA 27 (2) SEKVENSSIN NRO 12 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 37 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(i i) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 12: 37 CTGCGTATCG ACAAACGCGG CAAAGTCAAG GGCACCC (2) SEKVENSSIN NRO 13 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 44 emäsparia :V (B) TYYPPI: nukleiinihappo • ;*· (C) JUOSTEISUUS: tuntematon ** \ (D) TOPOLOGIA: tuntematon • ·
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
I ·· ΓΓ: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 13: AAGAGATGAA AAACAACTAC AATATTATGG AAATCCGTAC TGTT 44 ·· • *’ (2) SEKVENSSIN NRO 14 TIEDOT: ·«« i : : (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: : (A) PITUUS: 37 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon • » · • ♦ · « 1 • · • · ·»· 72
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 14: GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT GAATCTG 37 (2) SEKVENSSIN NRO 15 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 45 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 15: TCTTGGGTGC CCTTGACTTT GCCGCGTTTG TCGATACGCA GGTAC 45 (2) SEKVENSSIN NRO 16 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 45 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 16: ACAGCAACAG TACGGATTTC CATAATATTG TAGTTGTTTT TCATC 45 . (2) SEKVENSSIN NRO 17 TIEDOT: • · · • V (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: : (A) PITUUS: 36 emäsparia ··’| (B) TYYPPI: nukleiinihappo ·:·1: (C) JUOSTEISUUS: tuntematon .. (D) TOPOLOGIA: tuntematon « \.
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 17: • · • · AATTCAGATT CAACACCTTT GATTGCAACG ATACCA 36 • · · • · · • « « • · · ··· • · · i : • · · ··· • · · • · · · · • · • i • · · (2) SEKVENSSIN NRO 18 TIEDOT: 73 (i) SEKVENS SIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 18: AGXTTTGATC TAGAAGGAGG 20 (2) SEKVENSSIN NRO 19 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(i i) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 19: TCAAAACTGG ATCCTATTAA 20 (2) SEKVENSSIN NRO 20 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 91 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon . (D) TOPOLOGIA: tuntematon ···
• V (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
• ♦ • · · ·*·* ; (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 20: ’ * AGXTTTGATC TAGAAGGAGG AATAACATAT GTGCAACGAC ATGACTCCGG AACAGATGGC 60 !**..
TACCAACGTT AACTGCTCCA GCCCGGAACG T 91 » : : 1 SEKVENSSIN NRO 21 TIEDOT: • · : 2 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 90 emäsparia *. (B) TYYPPI: nukleiinihappo . .·. (C) JUOSTEISUUS: tuntematon *··** (D) TOPOLOGIA: tuntematon i : « ·♦· • « « • · · 9 9·· • · • · ♦ ·· 2 74
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 21: CACACCCGTA GCTACGACTA CATGGAAGGT GGTGACATCC GTGTTCGTCG TCTGTTCTGC 60 CGTACCCAGT GGTACCTGCG TATCGACAAA 90 (2) SEKVENSSIN NRO 22 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 90 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 22: CGTGGTAAAG TTAAAGGTAC CCAGGAAATG AAAAACAACT ACAACATCAT GGAAATCCGT 60 ACTGTTGCTG TTGGTATCGT TGCAATCAAA 90 (2) SEKVENSSIN NRO 23 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 90 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 23: ·«· GGTGTTGAAX CTGAATTCTA CCTGGCAATG AACAAAGAAG GTAAACTGTA CGCAAAAAAA 60 • · • · :/ : GAATGCAACG AAGACTGCAA CTTCAAAGAA 90 * (2) SEKVENSSIN NRO 24 TIEDOT: l \·γ, (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: ·* ’ (A) PITUUS: 90 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon i *·* (D) TOPOLOGIA: tuntematon • · ·
* (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
• · · • · · ··· ··· i : ··♦ • · · • · · 1 • · • ♦ ·♦· (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 24: 75 CTGATCCTGG AAAACCACTA CAACACCTAC GCATCTGCTA AATGGACCCA CAACGGTGGT 60 GAAATGTTCG TTGCTCTGAA CCAGAAAGGT 90 (2) SEKVENSSIN NRO 25 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 88 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 25: ATCCCGGTTC GTGGTAAAAA AACCAAAAAA GAACAGAAAA CCGCTCACTT CCTGCCGATG 60 GCAATCACTT AATAGGATCC AGTTTTGA 88 (2) SEKVENSSIN NRO 26 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 26: .·. TACGGGTGTG ACGTTCCGGG 20 • · · ··· j1V (2) SEKVENSSIN NRO 27 TIEDOT: • · :.! : (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: ····; (A) PITUUS: 20 emäsparia .. (B) TYYPPI: nukleiinihappo • 1·· (C) JUOSTEISUUS: tuntematon /:·. (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
·· • 1·· (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 27: »·· • 1 · • · · * *. CTTTACCACG TTTGTCGATA 20 • · · • · · ··· • · ♦ i : ··· • · · • · « • · · 2 2 • · • · ··· (2) SEKVENSSIN NRO 28 TIEDOT: 76 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLI TYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 28: ATTCAACACC TTTGATTGCA 20 (2) SEKVENSSIN NRO 29 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 29: CCAGGATCAG TTCTTTGAAG 20 (2) SEKVENSSIN NRO 30 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon .11 (D) TOPOLOGIA: tuntematon ··· ·· ·
: (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
• · • · ♦ ; (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 30: . GAACCGGGAT ACCTTTCTGG 20 (2) SEKVENSSIN NRO 31 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: p. (A) PITUUS: 495 emäsparia • ** (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon • · ·
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
t : ·«· ·«· * · · • · · 1 · · • · « · ·«· (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 31: 77 ATGTCTAATG ATAXGACTCC GGAACAGATG GCTACCAACG TTAACTCCTC CTCCCCGGAA 60 CGTCACACGC GTTCCTACGA CTACATGGAA GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC 120 TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG 180 ATGAAAAACA ACTACAATAT TATGGAAATC CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC 240 AAAGGTGTTG AATCTGAATT CTACCTGGCA ATGAACAAAG AAGGTAAACT GTACGCAAAA 300 AAAGAATGCA ACGAAGACTG CAACTTCAAA GAACTGATCC TGGAAAACCA CTACAACACC 360 TACGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA 420 GGTATCCCGG TTCGTGGTAA AAAAACCAAA AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG 480 ATGGCAATCA CTTAA 495 (2) SEKVENSSIN NRO 32 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 164 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 32:
Met Ser Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Aan Vai Aan Ser 15 10 15 e · • · * • ee JV. Ser Ser Pro Glu Arg Hia Thr Arg Ser Tyr Aap Tyr Met Glu Gly Gly : ·’ 20 25 30 • · • · · • · * e · ·
Aap Ile Arg Vai Arg Arg Leu Phe Cya Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg 35 40 45 ·’* e ♦· ···, He Aap Lya Arg Gly Lya Vai Lya Gly Thr Gin Glu Met Lya Aan Aan * 50 55 60 .. Tyr Aan Ile Met Glu Ile Arg Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile l *·* 65 70 75 80 • · e f · · *, Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Aan Lya Glu Gly Lya 85 90 95 • « « • ee I*”: Leu Tyr Ala Lya Lya Glu Cya Aan Glu Aap Cya Aan Phe Lya Glu Leu *** 100 105 110 ··· • » e • « » ee e • · a · e· e 78
Ile . Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His HS 120 12S
Asn Gly Gly Glu Met Phe Vai Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Vai 130 135 140
Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro 145 150 155 150
Met Ala Ile Thr (2) SEKVENSSIN NRO 33 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 483 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 33: ATGACTCCGG AACAGATGGC TACCAACGTT AACTCCTCCT CCCCGGAACG TCACACGCGT 60 TCCTACGACT ACATGGAAGG TGGTGACATC CGCGTACGTC GTCTGTTCTG CCGTACCCAG 120 TGGTACCTGC GTATCGACAA ACGCGGCAAA GTCAAGGGCA CCCAAGAGAT GAAAAACAAC 130 TACAATATTA TGGAAATCCG TACTGTTGCT GTTGGTATCG TTGCAATCAA AGGTGTTGAA 240 TCTGAATTCT ACCTGGCAAT GAACAAAGAA GGTAAACTGT ACGCAAAAAA AGAATGCAAC 300 GAAGACTGCA ACTTCAAAGA ACTGATCCTG GAAAACCACT ACAACACCTA CGCATCTGCT 360 e · « < » ·*/, AAATGGACCC ACAACGGTGG TGAAATGTTC GTTGCTCTGA ACCAGAAAGG TATCCCGGTT 420 e e » e : il CGTGGTAAAA AAACCAAAAA AGAACAGAAA ACCGCTCACT TCCTGCCGAT GGCAATCACT 480 M · e TAA 483 , e Ϊ *'* (2) SEKVENSSIN NRO 34 TIEDOT: t * * ** * (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 160 aminohappoa ·/. (B) TYYPPI: aminohappo " (C) JUOSTEISUUS: tuntematon :*:*! (D) TOPOLOGIA: tuntematon ψ * . (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini eee «e< e « • e ► e · e ··* e e e • e e e m ·· • * » * • ee (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 34: 79
Met Thr Pro GIu Gin Met Ala Thr Aan Vai Aan Ser Ser Ser Pro Glu 1 5 '10 IS
Arg His Thr Arg Ser Tyr Aap Tyr Met Glu Gly Gly Aap He Arg Vai 20 25 30
Arg Arg Leu Phe Cya Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Aap Lya Arg 35 40 45
Gly Lys Vai Lys Gly Thr Gin Glu Met Lya Aan Aan Tyr Aan Ile Met 50 55 60
Glu Ile Arg Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly Vai Glu 65 70 75 80
Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Aan Lya Glu Gly Lya Leu Tyr Ala Lya 85 90 95
Lys Glu Cya Asn Glu Asp Cya Aan Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Aan 100 105 110
Hia Tyr Aan Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Aan Gly Gly Glu 115 120 125
Met Phe Vai Ala Leu Aan Gin Lya Gly Ile Pro Vai Arg Gly Lya Lys 130 135 140
Thr Lys Lys Glu Gin Lya Thr Ala Hia Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 145 150 155 160 (2) SEKVENSSIN NRO 35 TIEDOT: , (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 480 emäsparia : V (B) TYYPPI: nukleiinihappo i .·« (C) JUOSTEISUUS: tuntematon *** \ (D) TOPOLOGIA: tuntematon e ·
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
m ee .'f*; (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 35: ATGACTCCGG AACAGATGGC TACCAACGTT AACTCTTCTC CTGAACGTCA TACGCGTTCC 60 ·% » e * #· TACGACTACA TGGAAGGTGG TGACATCCGC GTACGTCGTC TGTTCTGCCG TACCCAGTGG 120 ::: # TACCTGCGTA TCGACAAACG CGGCAAAGTC AAGGGCACCC AAGAGATGAA AAACAACTAC 180 • · ···. AATATTATGG AAATCCGTAC TGTTGCTGTT GGTATCGTTG CAATCAAAGG TGTTGAATCT 240 I · »9* • I · · • · · e» s x : ee« 80 GAATTCTACC TGGCAATGAA CAAAGAAGGT AAACTGTACG CAAAAAAAGA ATGCAACGAA 300 GACTGCAACT TCAAAGAACT GAXCCTGGAA AACCACTACA ACACCTACGC ATCTGCTAAA 360 TGGACCCACA ACGGTGGTGA AATGTTCGTT GCTCTGAACC AGAAAGGTAT CCCGGTTCGT 420 GGTAAAAAAA CCAAAAAAGA ACAGAAAACC GCTCACTTCC TGCCGATGGC AATCACTTAA 480 (2) SEKVENSSIN NRO 36 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 159 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 36:
Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Aan Vai Aan Ser Ser Pro Glu Arg 15 10 15
Hia Thr Arg Ser Tyr Aap Tyr Met Glu Gly Gly Aap Ile Arg Vai Arg 20 25 30
Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Aap Lya Arg Gly 35 40 45
Lya Vai Lya Gly Thr Gin Glu Met Lya Aan Aan Tyr Aan Ile Met Glu 50 55 60
Ile Arg Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lya Gly Vai Glu Ser . 65 70 75 80 • · • e · • · ·
Glu Phe Tyr Leu Ala.Met Aan Lya Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lya Lya : .1 85 90 95 • · e · « e e · I Glu Cya Aan Glu Aap Cya Aan Phe Lya Glu Leu Ile Leu Glu Aan Hia 100 105 110 • · • · *Tyr Aan Thr Tyr Ala Ser Ala Lya Trp Thr Hia Aan Gly Gly Glu Met 115 120 125
Phe Vai Ala Leu Aan Gin Lya Gly Ile Pro Vai Arg Gly Lya Lya Thr 130 135 140 • · ♦ e • e · · Lya Lya Glu Gin Lya Thr Ala Hia Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 145 150 155 e * · · • e · • · « e · · • · • · • · · e e e • · · e · ♦ e · · e ♦ • · • · · (2) SEKVENSSIN NRO 37 TIEDOT: 81 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 468 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 37: ATGGCTACTA ATGTTAACTC CTCTTCTCCT GAACGTCATA CGCGTTCCTA CGACTACATG 60 GAAGGTGGTG ACATCCGCGT ACGTCGTCTG TTCTGCCGTA CCCAGTGGTA CCTGCGTATC 120 GACAAACGCG GCAAAGTCAA GGGCACCCAA GAGATGAAAA ACAACTACAA TATTATGGAA 180 ATCCGTACTG TTGCTGTTGG TATCGTTGCA ATCAAAGGTG TTGAATCTGA ATTCTACCTG 240 GCAATGAACA AAGAAGGTAA ACTGTACGCA AAAAAAGAAT GCAACGAAGA CTGCAACTTC 300 AAAGAACTGA TCCTGGAAAA CCACTACAAC ACCTACGCAT CTGCTAAATG GACCCACAAC 360 GGTGGTGAAA TGTTCGTTGC TCTGAACCAG AAAGGTATCC CGGTTCGTGG TAAAAAAACC 420 AAAAAAGAAC AGAAAACCGC TCACTTCCTG CCGATGGCAA TCACTTAA 468 (2) SEKVENSSIN NRO 38 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 155 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon • · · ··· (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini • · : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 38: • · · ' 9 • 1
Met Ala Thr Aan vai Aan Ser Ser Ser Pro Glu Arg Hia Thr Arg Ser j 1·· 15 10 15 • · · • · · *·1 1 Tyr Aap Tyr Met Glu Gly Gly Aap Ile Arg Vai Arg Arg Leu Phe Cya 20 25 30 • · • 1·· Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Aap Lya Arg Gly Lya Vai Lya Gly 35 40 45 • · · . .·. Thr Gin Glu Met Lya Aan Aan Tyr Aan Ile Met Glu Ile Arg Thr Vai ·:·1 50 55 60 • · · t : • · · • · · • · · e · · · · • · • · • · · 82
Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe Tyr Leu 65 70 75 80
Ala Met Aan Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu 85 90 95
Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn Hls Tyr Asn Thr Tyr 100- 105 110
Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Vai Ala Leu 115 120 125
Asn Gin Lys Gly Ile Pro Vai Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin 130 135 140
Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 145 150 155 (2) SEKVENSSIN NRO 39 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 465 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(i i) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 39: ATGGCTACTA ATGTTAACTC TTCTCCTGAA CGTCATACGC GTTCCTACGA CTACATGGAA 60 GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC 120 . AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG ATGAAAAACA ACTACAATAT TATGGAAATC 180 • · • · « • · ♦ CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC AAAGGTGTTG AATCTGAATT CTACCTGGCA 240 • · • · : atgaacaaag aaggtaaact gtacgcaaaa aaagaatgca acgaagactg caacttcaaa 300 • · · GAACTGATCC TGGAAAACCA CTACAACACC TACGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT 360 e · • · : ** GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA GGTATCCCGG TTCGTGGTAA AAAAACCAAA 420 • · · ♦ · · • · e AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG ATGGCAATCA OTTAA 465 (2) SEKVENSSIN NRO 40 TIEDOT: • · · : (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: *. (A) PITUUS: 154 aminohappoa Ϊ.·.· (B) TYYPPI: aminohappo ···. (C) JUOSTEISUUS: tuntematon ···* (D) TOPOLOGIA: tuntematon • · · • e · • · · e e · • · • · • · # 83 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 40:
Met Ala Thr Aan Vai Aan Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr 15 10 15
Aap Tyr Met Glu Gly Gly Aap Ile Arg Vai Arg Arg Leu Phe Cya Arg 20 25 30
Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Aap Lya Arg Gly Lya Vai Lya Gly Thr 35 40 45
Gin Glu Met Lya Aan Aan Tyr Aan Ile Met Glu Ile Arg Thr Vai Ala 50 55 60 vai Gly Ile Vai Ala Ile Lya Gly Vai Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala 65 70 75 - 80
Met Aan Lya Glu Gly Lya Leu Tyr Ala Lya Lya Glu Cya Aan Glu Aap 85 90 95
Cya Aan Phe Lya Glu Leu Ile Leu Glu Aan Hia Tyr Aan Thr Tyr Ala 100 105 110
Ser Ala Lya Trp Thr Hia Aan Gly Gly Glu Met Phe Vai Ala Leu Aan 115 120 125
Gin Lya Gly Ile Pro Vai Arg Gly Lya Lya Thr Lya Lya Glu Gin Lya 130 135 140
Thr Ala Hia Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 145 150 ... (2) SEKVENSSIN NRO 41 TIEDOT: • · · e e · (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: \ : (A) PITUUS: 450 emäsparia *·.: · (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon ’* * (D) TOPOLOGIA: tuntematon
*... (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
i: : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 41: • e : *·· ATGTCTTCTC CTGAACGTCA TACGCGTTCC TACGACTACA TGGAAGGTGG TGACATCCGC 60 eee e e e *·* GTACGTCGTC TGTTCTGCCG TACCCAGTGG TACCTGCGTA TCGACAAACG CGGCAAAGTC 120 e e · · *·:·* AAGGGCACCC AAGAGATGAA AAACAACTAC AATATTATGG AAATCCGTAG TGTTGCTGTT 180 e · · GGTATCGTTG CAATCAAAGG TGTTGAATCT GAATTCTACC TGGCAATGAA CAAAGAAGGT 240 eee e e · eee e eee e · e · eee 84 AAACTGTACG CAAAAAAAGA ATGCAACGAA GACTGCAACT TCAAAGAACT GATCCTGGAA 300 AACCACTACA ACACCTACGC ATCTGCTAAA TGGACCCACA ACGGTGGTGA AATGTTCGTT 360 GCTCTGAACC AGAAAGGTAT CCCGGTTCGT GGTAAAAAAA CCAAAAAAGA ACAGAAAACC 420 GCTCACTTCC TGCCGATGGC AATCACTTAA 450 (2) SEKVENSSIN NRO 42 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 149 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 42:
Met Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly 15 10 15
Gly Asp Ile Arg Vai Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu 20 25 30
Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Vai Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn 35 40 45
Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala 50 55 60
Ile Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly . 65 70 75 80 • e e ·« · • · · t .* Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu : ;·; 85 90 95 e · · *·**: Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr .·. 100 105 110 t e · e l*:‘: His Asn Gly Gly Glu Met Phe Vai Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro 115 120 125
Vai Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu ; ** 130 135 140 eee e e · eee e \ Pro Met Ala Ile Thr :: : 145 eee eee I : • e · e eee eee eee e eee e e e e eee (2) SEKVENSSIN NRO 43 TIEDOT: 85 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 447 eraäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 43: ATGTCTCCTG AACGTCATAC GCGTTCCTAC GACTACATGG AAGGTGGTGA CATCCGCGTA 60 CGTCGTCTGT TCTGCCGTAC CCAGTGGTAC CXGCGXAICG ACAAACGCGG CAAAGTCAAG 120 GGCACCCAAG AGATGAAAAA CAACTACAAT ATTATGGAAA TCCGTACTGT XGCXGXXGGX 180 AXCGXXGCAA TCAAAGGTGT XGAAXCXGAA XXCXACCXGG CAAXGAACAA AGAAGGTAAA 240 CTGTACGCAA AAAAAGAATG CAACGAAGAC TGCAACTTCA AAGAACTGAX CCXGGAAAAC 300 CACXACAACA CCXACGCAXC XGCXAAAXGG ACCCACAACG GXGGXGAAAT GXXCGXXGCT 360 CXGAACCAGA AAGGTAXCCC GGIXCGXGGT AAAAAAACCA AAAAAGAACA GAAAACCGCT 420 CACXXCCXGC CGAXGGCAAT CACTTAA 447 (2) SEKVENSSIN NRO 44 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 148 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon . (D) TOPOLOGIA: tuntematon • · · • · · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini • · : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 44: • · .. Met Ser Pro Glu Arg His Xhr Arg Ser Xyr Asp Xyr Met Glu Gly Gly \ 1·· 1 5 10 15 • ·· I · · *’ 1 Asp He Arg Vai Arg Arg Leu Phe Cya Arg Xhr Gin Xrp Xyr Leu Arg 20 25 30 • · • 1’ Ile Asp Lys Arg Gly Lys Vai Lys Gly Xhr Gin Glu Met Lys Asn Aan *5 40 45 .1· Xyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Xhr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile so 55 eo 1 : • · · '1, Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe Xyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys 65 70 75 80 • a · • · • · • · · 86
Leu Tyr Ala Lys Lya Glu Cya Aan Glu Aap Cys Aan Phe Lya Glu Leu 85 90 95 lie Leu Glu Aan Hia Tyr Aan Thr Tyr Ala Ser Ala Lya Trp Thr His 100 105 110
Aan Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly lie Pro Val 115 120 125
Arg Gly Lya Lys Thr Lys Lya Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro 130 135 140
Met Ala He Thr 145 (2) SEKVENSSIN NRO 45 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 444 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 45: ATGCCTGAAC GTCATACGCG TTCCTACGAC TACATGGAAG GTGGTGACAT CCGCGTACGT 60 CGTCTGTTCT GCCGTACCCA GTGGTACCTG CGTATCGACA AACGCGGCAA AGTCAAGGGC 120 ACCCAAGAGA TGAAAAACAA CTACAATATT ATGGAAATCC GTACTGTTGC TGTTGGTATC 180 GTTGCAATCA AAGGTGTTGA ATCTGAATTC TACCTGGCAA TGAACAAAGA AGGTAAACTG 240 . TACGCAAAAA AAGAATGCAA CGAAGACTGC AACTTCAAAG AACTGATCCT GGAAAACCAC 300 ··« • · 1 2 3 : TACAACACCT ACGCATCTGC TAAATGGACC CACAACGGTG GTGAAATGTT CGTTGCTCTG 360 • · • · · I AACCAGAAAG GTATCCCGGT TCGTGGTAAA AAAACCAAAA AAGAACAGAA AACCGCTCAC 420 • · TTCCTGCCGA TGGCAATCAC TTAA 444 t · · ΓΓ: (2) SEKVENSSIN NRO 46 TIEDOT: • (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: ·1·.. (A) PITUUS: 147 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo v: (c) JUOSTEISUUS: tuntematon ·. (D) TOPOLOGIA: tuntematon • · · • · · • · · • · · i : • · · ··· • · · • · · · · • · 2 • · 3 87 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 46:
Met Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp 1 510 15
Ile Arg Vai Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile 20 25 30
Asp Lys Arg Gly Lys Vai Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr 35 40 45
Ash Ile Met Glu Ile Arg Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys 50 55 60
Gly Vai Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu 65 70 75 80
Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile 85 90 95
Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn 100 105 110
Gly Gly Glu Met Phe Vai Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Vai Arg 115 120 125
Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met 130 135 140
Ala Ile Thr 145 (2) SEKVENSSIN NRO 47 TIEDOT: e e · • · e Γ·*: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: I *. (A) PITUUS: 441 emäsparia ·.· · (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
» : : e (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 47: • · e · : *' ATGGAACGTC ATACGCGTTC CTACGACTAC ATGGAAGGTG GTGACATCCG CGTACGTCGT 60 • e e e · · e e e CTGTTCTGCC GTACCCAGTG GTACCTGCGT ATCGACÄAAC GCGGCAAAGT CAAGGGCACC 120 e e e · e e · tee e e · t : e e e e e e e e e · e · ♦ e ee e e · e · eee 88 CAAGAGATGA AAAACAACTA CAATATTATG GAAATCCGTA CTGTTGCTGT TGGTATCGTT 180 GCAATCAAAG GTGTTGAATC TGAATTCTAC CTGGCAATGA ACAAAGAAGG TAAACTGTAC 240 GCAAAAAAAG AATGCAACGA AGACTGCAAC TTCAAAGAAC TGATCCTGGA AAACCACTAC 300 AACACCTACG CATCTGCTAA ATGGACCCAC AACGGTGGTG AAATGTTCGT TGCTCTGAAC 360 CAGAAAGGTA TCCCGGTTCG TGGTAAAAAA ACCAAAAAAG AACAGAAAAC CGCTCACTTC 420 CTGCCGATGG CAATCACTTA A 441 (2) SEKVENSSIN NRO 48 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 146 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 48:
Met Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile 15 10 15
Asg Vai Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp 20 25 30
Lys Arg Gly Lys Vai Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Aan Asn Tyr Aan 35 40 45
Ile Met Glu Ile Arg Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly . 50 55 60 • e · ·« · • · · • »’ Vai Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Aan Lys Glu Gly Lys Leu Tyr • 65 70 75 80 • · · *·’** Ala Lys Lys Glu Cys Aan Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu 85 90 95 » · · Iί Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly 100 105 110 *·*·.. öly Glu Met Phe Vai Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Vai Arg Gly *... 115 120 125 I I · • e · • e · · • · · • e · • e · t : • · e e · · • · · • · · 1 e · • e
«M
89
LyS ί?!! Thr LyS Ly3 Glu Gln Ly3 Thr Ala Hia Phe Leu Pro Met Ala 130 135 140 lie Thr 145 (2) SEKVENSSIN NRO 49 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 438 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 49: ATGCGTCATA CGCGTTCCTA CGACTACATG GAAGGTGGTG ACATCCGCGT ACGTCGTCTG 60 TTCTGCCGTA CCCAGTGGTA CCTGCGTATC GACAAACGCG GCAAAGTCAA GGGCACCCAA 120 GAGATGAAAA ACAACTACAA TATTATGGAA ATCCGTACTG TTGCTGTTGG TATCGTTGCA 180 ATCAAAGGTG TTGAATCTGA ATTCTACCTG GCAATGAACA AAGAAGGTAA ACTGTACGCA 240 AAAAAAGAAT GCAACGAAGA CTGCAACTTC AAAGAACTGA TCCTGGAAAA CCACTACAAC 300 ACCTACGCAT CTGCTAAATG GACCCACAAC GGTGGTGAAA TGTTCGTTGC TCTGAACCAG 360 AAAGGTATCC CGGTTCGTGG TAAAAAAACC AAAAAAGAAC AGAAAACCGC TCACTTCCTG 420 CCGATGGCAA TCACTTAA 438 (2) SEKVENSSIN NRO 50 TIEDOT: *· · : 1 : I : (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: ·.1 t (A) PITUUS: 145 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo * ’ (C) JUOSTEISUUS: tuntematon t (D) TOPOLOGIA: tuntematon • ·1 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini ·· • · • · · ··· • · · • · · • ♦ · • · · ··· ··· t : ·· e ··· • · · • · · e·· • · • · ··· (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 50: 90
Met Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg 1 5 10 15
Vai Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys 20 25 30
Arg Gly Lys Vai Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile 35 40 45
Met Glu Ile Arg Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly Vai SO 55 60
Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala 65 70 75 80
Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu 85 90 95
Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr Hls Asn Gly Gly 100 105 110
Glu Met Phe Vai Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Vai Arg Gly Lys 115 120 125
Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala Hls Phe Leu Pro Met Ala Ile 130 135 140
Thr 145 (2) SEKVENSSIN NRO 51 TIEDOT: . (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 435 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo : ·' (C) JUOSTEISUUS: tuntematon • (D) TOPOLOGIA: tuntematon ee · e
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
*. . (Xl) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 51: Γ5: e ATGCATACTC GTTCCTACGA CTACATGGAA GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC 60 e# : ’·· TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG 120 • ee • e · * ATGAAAAACA ACTACAATAT TATGGAAATC CGTACTGTTG GTGTTGGTAT CGTTGCAATC 180 • • e · • e · • ee • e e t : ··· • e e • · · • e e e 1 e · e · e · • e e 91 AAAGGTGTTG AATCTGAATT CTACCTGGCA ATGAACAAAG AAGGTAAACT GTACGCAAAA 240 AAAGAATGCA ACGAAGACTG CAACTTCAAA GAACTGATCC TGGAAAACCA CTACAACACC 300 TACGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA 360 GGTATCCCGG TTCGTGGTAA AAAAACCAAA AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG 420 ATGGCAATCA OTTAA 435 (2) SEKVENSSIN NRO 52 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 144 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 52:
Met His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu. Gly Gly Asp Ile Arg Vai 1.5 10 15
Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg 20 25 30
Gly Lys Vai Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met 35 40 45
Glu Ile Arg Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly Vai Glu 50 55 60 . : Ϊ Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys ,Vl 65 70 75 80 : * : e · j ·*· Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn : 85 90 95 e e :·. His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu • '* 100 105 110 e e e :
Met Phe Vai Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Vai Arg Gly Lys Lys 115 120. 125 • · e ·
Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr V *· 130 135 140 • e · · a e · ·· · • · · t : • · · e • e· ♦ · · e e e • lit e · e e eee (2) SEKVENSSIN NRO 53 TIEDOT: 92 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 432 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 53: ATGACTCGTT CCTACGACTA CATGGAAGGT GGTGACATCC GCGTACGTCG TCTGTTCTGC 60 CGTACCCAGT GGTACCTGCG TATCGACAAA CGCGGCAAAG TCAAGGGCAC CCAAGAGATG 120 AAAAACAACT ACAATATTAT GGAAATCCGT ACTGTTGCTG TTGGTATCGT TGCAATCAAA 180 GGTGTTGAAT CTGAATTCTA CCTGGCAATG AACAAAGAAG GTAAACTGTA CGCAAAAAAA 240 GAATGCAACG AAGACTGCAA CTTCAAAGAA CTGATCCTGG AAAACCACTA CAACACCTAC 300 GCATCTGCTA AATGGACCCA CAACGGTGGT GAAATGTTCG TTGCTCTGAA CCAGAAAGGT 360 ATCCCGGTTC GTGGTAAAAA AACCAAAAAA GAACAGAAAA CCGCTCACTT CCTGCCGATG 420 GCAATCACTT AA 432 (2) SEKVENSSIN NRO 54 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 143 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon .·, (D) TOPOLOGIA: tuntematon • · · 4»» :*·*: (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini * · :/· (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 54: t • * · * · • · . Met Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Vai Arg 5 ’·· 15 10 15 e »e • * * I e « • Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly 20 25' 30 « ·
T
r »e· I » « e e e e • e , f · a · · • · · ie· t : • · · * • «· • t · • · · e 1 e · • · • · · 93
Lys Vai Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Aan Aan Tyr Aan Ile Met Glu 35 40 45
Ile Arg Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lya Gly Val Glu Ser 50 55 60
Glu Phe Tyr Leu Ala Met Aan Lya Glu Gly Lya Leu Tyr Ala Lya Lya 65 70 75 80
Glu Cys A an Glu Aap Cya Aan Phe Lya Glu Leu He Leu Glu Aan Hia 85 90 95
Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lya Trp Thr His Aan Gly Gly Glu Met 100 105 110
Phe Val Ala Leu Aan Gin Lys Gly He Pro Val Arg Gly Lya Lys Thr - 115 120 125
Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala He Thr 130 135 140 (2) SEKVENSSIN NRO 55 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 429 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 55: . atgcgttcct acgactacat ggaaggtggt gacatccgcg TACGTCGTCT GTTCTGCCGT 60
Ml e» ♦ : V ACCCAGTGGT ACCTGCGTAT CGACAAACGC GGCAAAGTCA AGGGCACCCA AGAGATGAAA 120 • 1 « · · '1 ’ · AACAACTACA ATATTATGGA AATCCGTACT GTTGCTGTTG GTATCGTTGC AATCAAAGGT 180 e «e··· • · . GTTGAATCTG AATTCTACCT GGCAATGAAC AAAGAAGGTA AACTGTACGC AAAAAAAGAA 240
X
• ,1·1. TGCAACGAAG ACTGCAACTT CAAAGAACTG ATCCTGGAAA ACCACTACAA CACCTACGCA 300 « TCTGCTAAAT GGACCCACAA CGGTGGTGAA ATGTTCGTTG CTCTGAACCA GAAAGGTATC 360 9 9 m · J 2 CCGGTTCGTG GTAAAAAAAC CAAAAAAGAA CAGAAAACCG CTCACTTCCT GCCGATGGCA 420 »·· s : : *. ATCACTTAA 429 , · · » · · *« · a · v x : % · · a «a· • t · • e · e 1 j · • % 2 • a · (2) SEKVENSSIN NRO 56 TIEDOT: 94 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 142 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 56:
Met Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Vai Arg Arg 1 5 10 15
Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys 20 25 30
Vai Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile 35 40 45
Arg Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly Vai Glu Ser Glu 50 55 60
Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu 65 70 75 80
Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr 85 90 95
Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe 100 105 110
Vai Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Vai Arg Gly Lys Lys Thr Lys „ 115 120 125 e · ··,1 2 3· Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr • »· 130 135 140 : *·1 · (2) SEKVENSSIN NRO 57 TIEDOT: ^ (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: 1 1·· (A) PITUUS: 426 emäsparia .T. (B) TYYPPI: nukleiinihappo ·1 1 (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon * 1
! '·· (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
fr·1 φ · · • 1 Ψ « * c , « · • e · ··· ; : 1»· • · 1 • 1 » • e · e 2 r · 3 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 57: 95 ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AAXGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCG 360 GTTCGTGGTA AAAAAACCAA AAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426 (2) SEKVENSSIN NRO 58 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 141 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 58:
Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Vai Arg Arg Leu 15 10 15
Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Vai . 20 25 30 e e · ·· · l .1 Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg : 35 40 45 • e · e
Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe ' 50 55 60 • · · :1! : Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys 65 70 75 80
Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn 85 90 95 • · · • · · • · · • · · ··« • · · : : • t · • I1 • · · • · · · · • · • · • · · 96
Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val 100 105 110
Ala Leu Asn Gin Lys Gly lie Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys 115 120 125
Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala He Thr 130 135 140 (2) SEKVENSSIN NRO 59 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 423 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(i i) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 59: ATGTACGACT ACATGGAAGG TGGTGACATC CGCGTACGTC GTCTGTTCTG CCGTACCCAG 60 TGGTACCTGC GTATCGACAA ACGCGGCAAA GTCAAGGGCA CCCAAGAGAT GAAAAACAAC 120 TACAATATTA TGGAAATCCG TACTGTTGCT GTTGGTATCG TTGCAATCAA AGGTGTTGAA 180 TCTGAATTCT ACCTGGCAAT GAACAAAGAA GGTAAACTGT ACGCAAAAAA AGAATGCAAC 240 GAAGACTGCA ACTTCAAAGA ACTGATCCTG GAAAACCACT ACAACACCTA CGCATCTGCT 300 AAATGGACCC ACAACGGTGG TGAAATGTTC GTTGCTCTGA ACCAGAAAGG TATCCCGGTT 360 CGTGGTAAAA AAACCAAAAA AGAACAGAAA ACCGCTCACT TCCTGCCGAT GGCAATCACT 420 e · TAA 423 • · · : (2) SEKVENSSIN NRO 60 TIEDOT: • · · • · · e · · (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 140 aminohappoa j *·· (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon *.* * (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini • · • · · • · · e · ♦ • · · • • e · e e · • · · • · · : : ··· e • e « • · · • · · eee • · • * ··· (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 60: 97
Met Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Vai Arg Arg Leu Phe 1 5 10 15
Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Vai Lys 20 25 30
Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr 35 40 45
Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe Tyr 50 55 60
Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn 65 70 75 80
Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr 85 90 95
Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Vai Ala 100 105 110
Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Vai Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu 115 120 125
Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 130 135 140 (2) SEKVENSSIN NRO 61 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 495 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo .·. (C) JUOSTEISUUS: tuntematon *·:·* (D) TOPOLOGIA: tuntematon • · · • · ·
I : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
• e · • · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 61: • · • · • ATGTCTAATG ATATGACTCC GGAACAGATG GCTACCAACG TTAACTCCTC CTCCCCGGAA 60 • · · i : : * CGTCACACGC GTTCCTACGA CTACATGGAA GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC 120 TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG 180 • e · atgaaaaaca actacaatat tatggaaatc CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC 2 40 • e e · e · · e e e • · e t : e e · e · · • · · e · · e e · · e · e · e e · 98 aaaggtgttg aatctgaatt ctatcttgca atgaacaagg aaggaaaact CTATGCAAAG 300 AAAGAATGCA ATGAAGATTG TAACTTCAAA GAACTAATTC TGGAAAACCA TTACAACACA 360 TATGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA 420 GGTATCCCTG TTGAAGGTAA GAAAACCAAG AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG 480 ATGGCAATCA CTTAA 495 (2) SEKVENSSIN NRO 62 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 164 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 62:
Met Ser Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Vai Asn Ser 1.5 10 15
Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly 20 25 - 30
Asp Ile Arg Vai Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg 35 40 45
Ile Asp Lys Arg Gly Lys Vai Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn 50 55 60 • ·.·.· Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile 65 70 75 80 • · • · : : : Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys 85 90 95 e ·
Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu 100 105 110 i : : e
Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His 115 120 125 • e • ♦ e · ·
Asn Gly Gly Glu Met Phe Vai Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Vai : 130 135 140 • · · • · · • · · • · · t : • · · • · · • · · • · · ··· • · • · • · · 99
Glu Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro 145 150 155 160
Met Ala lie Thr (2) SEKVENSSIN NRO 63 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 495 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 63: ATGTCTAATG ATATGACTCC GGAACAGATG GCTACCAACG TTAACTCCTC CTCCCCGGAA 60 CGTCACACGC GTTCCTACGA CTACATGGAA GGTGGTGACA TCCGCGTACG TCGTCTGTTC 120 TGCCGTACCC AGTGGTACCT GCGTATCGAC AAACGCGGCA AAGTCAAGGG CACCCAAGAG 180 ATGAAAAACA ACTACAATAT TATGGAAATC CGTACTGTTG CTGTTGGTAT CGTTGCAATC 240 AAAGGTGTTG AATCTGAATT CTATCTTGCA ATGAACAAGG AAGGAAAACT CTATGCAAAG 300 AAAGAATGCA ATGAAGATTG TAACTTCAAA GAACTAATTO TGGAAAACCA TTACAACACA 360 TATGCATCTG CTAAATGGAC CCACAACGGT GGTGAAATGT TCGTTGCTCT GAACCAGAAA 420 GGTATCCCTG TTCAAGGTAA GAAAACCAAG AAAGAACAGA AAACCGCTCA CTTCCTGCCG 480 . ATGGCAATCA OTTAA 495 e e e e e e e e (2) SEKVENSSIN NRO 64 TIEDOT: e e (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 164 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo ;·... (C) JUOSTEISUUS: tuntematon *... (D) TOPOLOGIA: tuntematon i : : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini e e e · • e · e eee • e e eee e e e eee e e · eee eee t : eee e eee eee eee e eee e e e e eee (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 64: 100
Met Ser Aan Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Vai Asn Ser 15 10 15
Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly 20 25 30
Asp Ile Arg Vai Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg 35 40 45
Ile Asp Lys Arg Gly Lys Vai Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn 50 S5 60
Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile 65 70 75 80
Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys 85 90 95
Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu 100 105 110
Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His 115 120 125
Asn Gly Gly Glu Met Phe Vai Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Vai 130 135 140
Gin Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro 145 150 155 160
Met Ala Ile Thr (2) SEKVENSSIN NRO 65 TIEDOT: • · · • · · (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: | : (A) PITUUS: 426 emäsparia ; (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon * 1 (D) TOPOLOGIA: tuntematon • · : ·..
*... (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
c : : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 65: ·· : ’2 ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 • · · • · · CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 • · · • · · • · · • · · t : • · · • · 1 • · · • · · · · e · e · 2 • · · 101 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTATCTTGC AATGAACAAG GAAGGAAAAC TCTATGCAAA GAAAGAATGC 240 AAXGAAGATT GTAACTTCAA AGAACTAATT CTGGAAAACC ATTACAACAC ATATGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT 360 GTTCAAGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426 (2) SEKVENSSIN NRO 66 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 141 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 66:
Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Vai Arg Arg Leu 1.5 10 15
Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Vai 20 25 30
Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg 35 40 45
Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe . 50 55 60 ee · ·· · • *.· Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys : .·. 65 70 75 80 • · ♦ ee e *;**: Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn Hls Tyr Asn .. 85 90 95 t ·..
•
Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Vai ·* * 100 105 110 ;·. Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Vai Gin Gly Lys Lys Thr Lys Lys : ·* 115 120 125 • · · e · · • * ·
Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr : 130 135 140 e · · • e · 1 : • ee e • e e • e e • · · • e·· • e e · e·· 102 (2) SEKVENSSIN NRO 67 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 67: GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG 24 (2) SEKVENSSIN NRO 68 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(IX) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: sekalaiset piirteet (B) ASEMA: komplementti (1 - 24) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 68: CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC 24 (2) SEKVENSSIN NRO 69 TIEDOT: e .·. (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 18 emäsparia :***: (B) TYYPPI: nukleiinihappo I ‘1m (C) JUOSTEISUUS: tuntematon : (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 69: I · · 18
CAATCTACAA TTCACAGA
• · • · • · · • · · • · · • · · • · · t · · • · · • · · i : ··· • · · • · · • · · · · • · · «·· 103 (2) SEKVENSSIN NRO 70 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 18 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 70: TTAAGTTATT GCCATAGG 18 (2) SEKVENSSIN NRO 71 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 29 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 71: AACAAAGCTT CTACAATTCA CAGATAGGA 29 (2) SEKVENSSIN NRO 72 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon . (D) TOPOLOGIA: tuntematon « · • ♦ ·
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA
• ♦ ♦ · • (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 72: ·· · AACAAGATCT TAAGTTATTG CCATAGG 27 • ** (2) SEKVENSSIN NRO 73 TIEDOT: t :: * (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 38 emäsparia :·. (B) TYYPPI: nukleiinihappo **..** (C) JUOSTEISUUS: tuntematon it · (D) TOPOLOGIA: tuntematon
: (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
··· ·«· t : • · · • · · • · · • ♦ · 1 • · • · • · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 73: 104 CGGTCTAGAC CACCATGCAC AAATGGATAC TGACATGG 38 (2) SEKVENSSIN NRO 74 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 33 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 74: GCCGTCGACC TATTAAGTTA TTGCCATAGG AAG 33 (2) SEKVENSSIN NRO 75 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 16 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 75:
Xaa Aan Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Aan Vai Xaa Xaa Ser 15 10 15 (2) SEKVENSSIN NRO 76 TIEDOT: • (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa • ·1 (B) TYYPPI: aminohappo (c) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon • e (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini I1:1: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 76: ;·. Ser Tyr Aap Tyr Met Glu Gly Gly Aap Ile Arg Vai : 2 3 l 5 ίο • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · t : ♦ ·· ··· ♦ · · • · · · 2 • · 3 105 (2) SEKVENSSIN NRO 77 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 517 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 77: CTAGAAGGAG GAATAACATA TGTCTAATGA TATGACTCCG GAACAGATGG CTACCAACGT 60 TAACTCCTCC TCCCCGGAAC GTCACACGCG TTCCTACGAC TACATGGAAG GTGGTGACAT 120 CCGCGTACGC CGTTTGTTCT CTCGTACCCA GTGGTACCTG CGTATCGACA AACGCGGCAA 180 AGTCAAGGGC ACCCAAGAGA TGAAAAACAA CTACAATATT ATGGAAATCC GTACTGTTGC 240 TGTTGGTATC GTTGCAATCA AAGGTGTTGA ATCTGAATTC TATCTTGCAA TGAACAAGGA 300 AGGAAAACTC TATGCAAAGA AAGAATGCAA TGAAGATTGT AACTTCAAAG AACTAATTCT 360 GGAAAACCAT TACAACACAT ATGCATCAGC TAAATGGACA CACAACGGAG GGGAAATGTT 420 TGTTGCCTTA AATCAAAAGG GGATTCCTGT AAGAGGAAAA AAAACGAAGA AAGAACAAAA 480 AACAGCCCAC TTTCTTCCTA TGGCAATAAC TTAATAG 517 (2) SEKVENSSIN NRO 78 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 164 aminohappoa .·. (B) TYYPPI: aminohappo *·:·* (C) JUOSTEISUUS: tuntematon ·'·*: (D) TOPOLOGIA: tuntematon e e 1.· · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini ’* * (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 78: • · t •
Met Ser Aan Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Aan Vai Aan Ser • 1.5 10 15
Ser Ser Pro Glu Arg Hia Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly : ’·* 20 25 . 30 ti* • e · e e e *. Asp Ile Arg Vai Arg Arg Leu Phe Ser Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg . 35 40 45 • e · e e · e e e t : e·· e e e· • · · e e e e ee e e · • e eee 106
Ile Asp Lys Arg Gly Lys Vai Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn 50 55 60
Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile 65 70 75 80
Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys 85 90 95
Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu 100 105 110
Ile Leu Glu Asn Hls Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His 115 120 125
Asn Gly Gly Glu Met Phe Vai Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Vai 130 135 140
Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro 145 150 155 160
Met Ala Ile Thr (2) SEKVENSSIN NRO 79 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 517 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 79: • e • · ♦ .!’! CTAGAAGGAG GAATAACATA TGTCTAATGA TATGACTCCG GAACAGATGG CTACCAACGT 60 » · « • * e e : .·. TAACTCCTCC TCCCCGGAAC GTCACACGCG TTCCTACGAC TACATGGAAG GTGGTGACAT 120 e · · ee · ·:**: CCGCGTACGT CGTCTGTTCT GCCGTACCCA GTGGTACCTG CGTATCGACA AACGCGGCAA 180 ·· i ’·* AGTCAÄGGGC ACCCAAGAGA TGAAAAACAA CTACAATATT ATGGAAATCC GTACTGTTGC 240 e ♦♦ i : : * TGTTGGTATC GTTGCAATCA AAGGTGTTGA ATCTGAATTC TACCTGGCTA TGAACAAAGA 300 :·. AGGTAAACTG TACGCTAAAA AAGAATCCAA TGAAGATTGT AACTTCAAAG AACTAATTCT 360 ♦ ee e :Y: GGAAAACCAT TACAACACAT ATGCATCAGC TAAATGGACA CACAACGGAG GGGAAATGTT 420 : TGTTGCCTTA AATCAäAAGG GGATTCCTGT AAGAGGAAAA AAAACGAAGA AäGAACAAAA 480 • •e eee s...: AACAGCCCAC TTTCTTCCTA TGGCAATAAC TTAATAG 517 • ee ♦ · · ee» e eee e e e e eee 107 (2) SEKVENSSIN NRO 80 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 164 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 80:
Met Ser Aan Aap Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Aan Vai Aan Ser 15 10 15
Ser Ser Pro Glu Arg Hia Thr Arg Ser Tyr Aap Tyr Met Glu Gly Gly 20 25 30
Asp Ile Arg Vai Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg 35 40 45
Ile Aap Lya Arg Gly Lya Vai Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Aan Aan 50 55 60
Tyr Aan Ile Met Glu Ile Arg Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile 65 70 75 80
Lya Gly Vai Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Aan Lys Glu Gly Lys 85 90 95
Leu Tyr Ala Lya Lya Glu Ser Aan Glu Asp Cys Aan Phe Lys Glu Leu 100 105 110
Ile Leu Glu Aan Hia Tyr Aan Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His 115 120 125 • e« • *t* Aan Gly Gly Glu Met Phe Vai Ala Leu Aan Gin Lya Gly Ile Pro Vai 1 * 130 135 140 « · · • · · I» · ..*·· Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro 145 150 155 160 ·< **· Met Ala Ile Thr t : : ” (2) SEKVENSSIN NRO 81 TIEDOT: S*.t< (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: J (A) PITUUS: 517 emäsparia Γ:*: (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon ♦ (D) TOPOLOGIA: tuntematon ·»# «·» t · li* e ♦ ·« * 1 · • · · * ··· ϊ : M* 108
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 81: CTAGAAGGAG GAATAACATA TGTCTAATGA TATGACTCCG GAACAGATGG CTACCAACGT 60 TAACTCCTCC TCCCCGGAAC GTCACACGCG TTCCTACGAC TACATGGAAG GTGGTGACAT 120 CCGCGTACGT CGTCTGTTCT GCCGTACCCA GTGGTACCTG CGTATCGACA AACGCGGCAA 180 AGTCAAGGGC ACCCAAGAGA TGAAAAACAA CTACAATATT ATGGAAATCC GTACTGTTGC 240 TGTTGGTATC GTTGCAATCA AAGGTGTTGA ATCTGAATTC TACCTGGCTA TGAACAAAGA 300 AGGTAAACTG TACGCTAAAA AAGAATCCAA TGAAGATTCT AACTTCAAAG AACTAATTCT 360 GGAAAACCAT TACAACACAT ATGCATCAGC TAAATGGACA CACAACGGAG GGGAAATGTT 420 TGTTGCCTTA AATCAAAAGG GGATTCCTGT AAGAGGAAAA AAAACGAAGA AAGAACAAAA 480 AACAGCCCAC TTTCTTCCTA TGGCAATAAC TTAATAG 517 (2) SEKVENSSIN NRO 82 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 164 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 82: , ·*» Met Ser Aan Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Aan Vai Aan Ser 1 5 10 15 m * * • · • t • Ser Ser Pro Glu Arg Hia Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly *·* : 20 25 30 • ·
Asp Ile Arg Vai Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg ! *·* 35 · 40 45 « • a ·
Ile Aap Lya Arg Gly Lya Vai Lya Gly Thr Gin Glu Met Lya Aan Aan 50 55 60 ·· * ’* Tyr Aan Ile Met Glu Ile Arg Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile 65 70 75 80 a a . j‘. Lya Gly Vai Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Aan Lya Glu Gly Lya 85 90 95 : *, • · · i **· • » · ♦ · · a ··« Λ « • · • · » 109
Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Ser Aan Glu Asp Ser Asn Phe Lys Glu Leu 100 105 110
He Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His 115 120 125
Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly He Pro Val 130 135 140
Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro 145 150 155 160
Met Ala He Thr (2) SEKVENSSIN NRO 83 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 426 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(i i) MOLEKYYLI TYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 83: ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 . AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 • · e • · e • GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGGAACAGAA AGGTATCCCT 360 • · • · · **·’ | GTTCGTGGTÄ AGAAAÄCCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 e · ;·. ACTTAA 426 • · · e (2) SEKVENSSIN NRO 84 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: ··. (A) PITUUS: 141 aminohappoa ·* ·* (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon e * # (li) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini • · e · e · · • e · e • · · • · · e · · • · • · e · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 84: 110
Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Vai Arg Arg Lea 15 10 15
Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Vai 20 25' 30
Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg 35 40 45
Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe 50 55 60
Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys 65 70 75 80
Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn 85 90 95
Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Vai 100 105 110
Ala Leu Glu Gin Lys Gly Ile Pro Vai Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys . 115 120 125
Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 130 135 140 (2) SEKVENSSIN NRO 85 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 426 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo . (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon • · · • ·
! .·. (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
• · · • · · ·:··* (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 85: : ’*· ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 • e· • · · CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 ·.·. AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 e e · gaatctgaat tctacctggc aatgaacaaa gaaggtaaac tgtacgcaaa aaaagaatgc 240 e : aacgaagact gcaacttcaa agaactgatc ctggaaaacc actacaacac ctacgcatct 300 ··· e · · GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGGA AGGTATCCCT 360 : gttcgtggta agaaaaccaa gaaagaacag aaaaccgctc acttcctgcc gatggcaatc 42o ·· · • · ·...' ACTTAA 426 (2) SEKVENSSIN NRO 86 TIEDOT:
Ill (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 141 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 86:
Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Vai Arg Arg Leu 1 5 10 15
Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Vai 20 25 .30
Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg 35 40 45
Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe 50 55 60
Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys 65 70 75 80
Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn Hls Tyr Asn 85 90 95
Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Vai 100 105 110 . Ala Leu Asn Gin Glu Gly Ile Pro Vai Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys 115 120 125 ·« « • ♦ · • ** Glu Gin Lys Thr Ala Hls Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr : 130 135 140 • · · ·:·*: (2) SEKVENSSIN NRO 87 TIEDOT: • · : (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 426 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon .. (D) TOPOLOGIA: tuntematon • · • · · e
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
e e e • e e e · • e e eee e · · • e • · eee • eee eee eee e eee e · e e eee (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 87: 112 ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT'CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GAXGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGCA AGGTATCCCT 360 GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426 (2) SEKVENSSIN NRO 88 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 141 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 88:
Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Vai Arg Arg Leu IS 10 15
Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Vai 20 25 30 • e · e e · e · • .·. Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg :·* · 35 40 45 • · ' .. Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe • *·* 50 55 60 e ee e · ·
Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys 65 70 75 80 e · • · • e * e e · · e e · • e · • • e e · e e · • · · • · · e · e · ♦ e· • ♦ * · • e e • • e e e · e · «»· 113
Aan Glu Aap Cya Aan Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Aan Hia Tyr Aan 85 90 95
Thr Tyr Ala Ser Ala Lya Trp Thr Hia Aan Gly Gly Glu Met Phe Vai 100 105 110
Ala Leu Aan Gin Gin Gly Ile Pro Vai Arg Gly Lya Lya Thr Lya Lya 115 120 125
Glu Gin Lya Thr Ala Hia Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 130 135 140 (2) SEKVENSSIN NRO 89 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 426 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 89: ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT 360 • · · • « · :***: GTTGCTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 • · • · : ACTTAA 426 " (2) SEKVENSSIN NRO 90 TIEDOT: « · • · · (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 141 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon : *** (D) TOPOLOGIA: tuntematon • · · • · · • · · • · · • · · • · e • e e : : ··* • · · • e · • · · 1 · • · • · • · · 114 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 90:
Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Vai Arg Arg Leu 15 10 15
Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Vai 20 25 30
Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg 35 40 45
Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe 50 55 60
Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys 65 70 75 80
Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn 85 90 95
Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Vai 100 105 110
Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Vai Ala Gly Lys Lys Thr Lys Lys 115 ' 120 125
Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 130 135 140 (2) SEKVENSSIN NRO 91 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: _ (A) PITUUS: 426 emäsparia ’···1 (B) TYYPPI: nukleiinihappo :1·1: (C) JUOSTEISUUS: tuntematon I 1 (D) TOPOLOGIA: tuntematon • · · • · · • · e (ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA • · ' # (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 91: e ·· • · · • · · ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 ·1·.. CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 • · · • · · • · e e • e • · · • · · e · · e · e j : • e · • e e e e · · e e « • e e e · • ♦ ··» 115 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT' TCTATCTTGC AATGAACAAG GAAGGAAAAC TCTATGCAAA GAAAGAATGC 240 AATGAAGATT GTAACTTCAA AGAACTAATT CTGGAAAACC ATTACAACAC ATATGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT 360 GTTGAAGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426 (2) SEKVENSSIN NRO 92 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 141 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 92:
Met Sec Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg vai Arg Arg Leu 15 10 15
Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Vai 20 25 30
Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg 35 40 45
Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe . 50 55 60 • e e • · · • 1.· Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys : 65 70 75 80 e · # e· · ·:1·; Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn .· 85 90 95
J
e • T: Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Vai • 100 105 110 ;·. Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Vai Glu Gly Lys Lys The Lys Lys : " 115 120 125
• M
e e · • e ·
Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr : 130 135 140 eee ·1· > : • e · ··· • e · • ♦ · e · • · • · ·«· 116 (2) SEKVENSSIN NRO 93 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 426 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 93: AXGXCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GXCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACXACAAXA TTAXGGAAAT CCGXACXGXX GCXGXTGGXA ICGXXGCAAT CAAAGGIGIX 180 GAAXCXGAAX XCXACCTGGC AAXGAACAAA GAAGGXAAAC XGXACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACXTCAA AGAACXGAIC CXGGAAAACC ACXACAACAC CXACGCATCT 300 GCXAAAIGGA CCCACAACGG IGGXGAAAXG XXCGXXGCXC XGAACCAGAA AGGXAICCCT 360 GXXCXGGGXA AGAAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACXXCCTGCC GATGGCAATC 420 ACXTAA 426 (2) SEKVENSSIN NRO 94 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 141 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon . :1: (D) TOPOLOGIA: tuntematon • · · : V (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini • · • « · :·1 I (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 94: e a t ·.. Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Vai Arg Arg Leu IS 10 15 • · · a · · e
Phe Cys Arg Xhr Gin Xrp Xyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Vai 20 25 30 • · a · · e * · · • · · a 1 · e a a e • a a aaa a a a t : aaa a aaa aaa aaa a • a a • · • a • a a 117
Lys Gly Thr Gin Glu Met Lya Aan Aan Tyr Aan Ile Met Glu Ile Arg 35 40 45
Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lya Gly Val Glu Ser Glu Phe 50 55 60
Tyr Leu Ala Met Aan Lya Glu Gly Lya Leu Tyr Ala Lya Lys Glu Cya 65 70 75 80
Aan Glu Aap Cya Aan.Phe Lya Glu Leu lie Leu Glu Asn His Tyr Aan 85 90 95
Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val 100 105 110
Ala Leu Asn Gin Lys Gly lie Pro Val Leu Gly Lys Lys Thr Lys Lys 115 120 125
Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala lie Thr 130 135 140 (2) SEKVENSSIN NRO 95 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 426 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 95: . ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 • e • i · CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 • · • · : aactacaata ttatggaaat ccgtactgtt gctgttggta tcgttgcaat caaaggtgtt iso 9 9 · gaatctgaat tctacctggc aatgaacaaa gaaggtaaac TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 *(<I AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 «Ti GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATTCCT 360 ·*·.. GTTCGTGGTA AGGAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 • a · V : ACTTAA 426 • e e · · • » · • a* • · · i : • · · • ·· e · · • · · 1 · • · • · • · · 118 (2) SEKVENSSIN NRO 96 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 141 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 96:
Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Vai Arg Arg Leu 15 10 15
Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Lea Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Vai 20 25 30
Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Aan Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg 35 40 45
Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe 50 55 60
Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys 65 70 75 80
Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn Hls Tyr Asn 85 90 95
Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Vai 100- 105 110
Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Vai Arg Gly Lys Glu Thr Lys Lys . 115 120 125 e·· • e e : V Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr : 130 135 140 • · e • e · ·:··· (2) SEKVENSSIN NRO 97 TIEDOT: • 1·· (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: *··. (A) PITUUS: 426 emäsparia ·1 1 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon .. (D) TOPOLOGIA: tuntematon ;
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
see * • • e · e · e » · · 9 9 · i : e · · * » · 1 • · · e · · ·« · > · · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 97: 119 ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT 360 GTTCGTGGTA AGCAAACCAA GAAAGAACAG AAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426 (2) SEKVENSSIN NRO 98 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 141 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 98:
Met Ser Tyr Asp Xyc Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Vai Arg Arg Leu 15 10 15
Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Vai . :‘i 20 25 30 i·· M · *» .* Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys As n Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg ; ;*· 35 40 45 **»*” Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe 50 55 60 f ·» • **t : Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys * 65 70 75 80 «· *·· * e · s · ·
P
t » e · i « a ··· * : • # # » • e· » · ♦ » · * e «e» 4 e e ·«« 120
Aan Glu Aap 'Cya Aan Phe Lya Glu Leu Ile Leu Glu Aan Hia Tyr Aan 85 90 95
Thr Tyr Ala Ser Ala Lya Trp Thr Hia Aan Gly Gly Glu Met Phe Vai 100 105 110
Ala Leu Aan Gin Lya Gly Ile Pro Vai Arg Gly Lya Gin Thr Lya Lya 115 120 125
Glu Gin Lya Thr Ala Hia Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 130 135 140 (2) SEKVENSSIN NRO 99 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 426 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 99: ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 e e ♦ ’••f GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT 360 e e · e · • .·. GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG GAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 e e · ·· · ·;··: ACTTAA 426 :1·.· (2) SEKVENSSIN NRO 100 TIEDOT: • e · (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 141 aminohappoa .. (B) TYYPPI: aminohappo • 1·· (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon e e e e e e e e e e e ♦ e e e e e e e ♦ e ♦ e e e ee e e · • e · e • e e e · • · e e · 121 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 100:
Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Vai Arg Arg Leu 1 5 10 15
Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Vai 20 25 30
Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg 35 40 45
Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe 50 55 60
Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys 65 70 75 80
Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn 85 90 95
Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Vai 100 105 110
Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Vai Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys 115 ' 120 125
Glu Gin Glu Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 130 135 140 (2) SEKVENSSIN NRO 101 TIEDOT: . (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: *:1: (A) PITUUS: 426 emäsparia j (B) TYYPPI: nukleiinihappo ; .·. (C) JUOSTEISUUS: tuntematon :.· 1· (D) TOPOLOGIA: tuntematon e
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA
• # • ♦· (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 101: • · · ♦ atgtcctacg actacatgga AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 e · 1 2 3 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 • · · • · · e · · e • e · · • ♦ ♦ ·♦· e e · t : • · · • e · · e · · • · · · · e · 2 • · 3 122 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGTGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG XTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT 360 GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAACAG CAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426 (2) SEKVENSSIN NRO 102 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 141 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 102:
Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Vai Arg Arg Leu 1 5 10 . 15
Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Vai 20 25 30
Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg 35 40 45
Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly Vai Glu Ser Glu Phe 50 55 60 • · • · • · : : ) Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys 65 70 75 80 • · ·1 2 3·.. Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn *... 85 90 95 • · · ♦ · ·
Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Vai 100 105 110 ♦ · • · • · · .··_ Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro vai Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys : 115 120 125 • ·.1..· Glu Gin Gin Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr ,···; 130 135 140 • · · • · · ♦ · · • · · · · • · 2 ♦ · 3 (2) SEKVENSSIN NRO 103 TIEDOT: 123 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 426 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: tuntematon (D) TOPOLOGIA: tuntematon
(i i) MOLEKYYLI TYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 103: ATGTCCTACG ACTACATGGA AGGTGGTGAC ATCCGCGTAC GTCGTCTGTT CTGCCGTACC 60 CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA GATGAAAAAC 120 AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT CAAAGGXGTT 180 GAATCTGAAT TCTACCTGGC AATGAACAAA GAAGGTAAAC TGTACGCAAA AAAAGAATGC 240 AACGAAGACT GCAACTTCAA AGAACTGATC CTGGAAAACC ACTACAACAC CTACGCATCT 300 GCTAAATGGA CCCACAACGG TGGTGAAATG TTCGTTGCTC TGAACCAGAA AGGTATCCCT 360 GTTCGTGGTA AGAAAACCAA GAAAGAAGAG GAAACCGCTC ACTTCCTGCC GATGGCAATC 420 ACTTAA 426 (2) SEKVENSSIN NRO 104 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 141 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo . (C) JUOSTEISUUS: tuntematon .•.‘I (D) TOPOLOGIA: tuntematon • · · • · • .·. (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini • · · • · · ·:··: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 104: • · • ·
Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Aap Ile Arg Vai Arg Arg Leu : l 5 10 15
Phe Cya Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lya Arg Gly Lya Vai 20 25 30 • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · 1 · · • · • · • · · 124
Lya Gly Thr Gin Glu Met Lys Aan Aan Tyr Aan Ile Met Glu Ile Arg 35 40 45
Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lya Gly Val Glu Ser Glu Phe 50 55 60
Tyr Leu Ala Met Aan Lya Glu Gly Lya Leu Tyr Ala Lya Lya Glu Cya 65 70 75 80
Aan Glu Aap Cya Aan Phe Lya Glu Leu lie Leu Glu Aan Hia Tyr Aan 85 90 95
Thr Tyr Ala Ser Ala Lya Trp Thr Hia Aan Gly Gly Glu Met Phe Val 100 105 110
Ala Leu Aan Gin Lya Gly lie Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lya 115 120 125
Glu Glu Glu Thr Ala Hia Phe Leu Pro Met Ala lie Thr 130 135 140 • e · e e e e · · ·· · • e e • e • · • · # · · # · · e · · • · e · • · • ·· • # · e · · e e · e • · e e • · · e • e · • e · e e · • • • e e • e · • e e e · · I : • e · • • e e e e · e · · • • e e • · • · • · e
Claims (39)
1. Luonnon keratinosyyttikasvitekijän "KGF" poly-peptidianalogi, jossa luonnon KGF vastaa seuraavaa sek- 5 venssiä: Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Vai Asn Cys Ser Ser 1 5 10 15 2Q Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile 20 25 30 Arg Vai Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg Ile Asp 35 40 45 Lys Arg Gly Lys Vai Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn 50 55 60 65 Ile Met Glu Ile Arg Thr Vai Ala Vai Gly Ile Vai Ala Ile Lys Gly 70 75 80 20 Vai Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr . 85 90 95 • · · • · · • · · ·· · : ·* Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu :.:: 100 105 no 25 e e Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly 115 120 125 • · · e .. Gly Glu Met Phe Vai Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Vai Arg Gly 30 130 135 140 145 • e • · ♦ ·· ·*.*. Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala .···. 150 155 160 • · e e · • e i *·* 35 He Thr, • · • · · • · e • e 126 signaalisekvenssillä tai ilman, tunnettu siitä, että analogi sisältää KGF:n aminohapposekvenssin, joka käsittää yhden tai useamman aminohapon 1-24 poiston, korvauksen, ja/tai lisäyksen, jolloin kysteiiniryhmä ami-5 nohappoasemässä 1 ja kysteiiniryhmä aminohappoasernassa 15 ovat kukin joko poistettu tai korvattu toisella aminohapolla, ja jossa analogissa mahdollisesti lisäksi on N-terminaalinen metioniiniryhmä ja/tai joka lisäksi käsittää varausmuutoskorvauksen aminohappoasernassa, joka valitaan 10 ryhmästä Arg{41}, Glu(43), Lys{55), Lys(95), Asn{137), Gin(138), Lys(139), Arg(144), Lys(147), Gln(152), Lys(153) tai Thr{154) tai jos kyseessä on Ä23-KGF, jossa on varaus-muutosmodifikaatio kohdassa His{116), tai jos luonnon KGF:n molemmat Cys{l) ja Cys(15) on korvattu aminohapolla 15 Ser, jolloin mahdollisesti myös Cys(40) tai Cys(102) tai molemmat Cys(102) ja Cys(106) on korvattu aminohapolla Ser edellyttäen, että analogi ei ole keratinosyyttikasvuteki-jäproteiini, joka koostuu aminohapoista 24-163.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen analogi, t u n- 20. e t t u siitä, että aseman 1 kysteiiniryhmä ja aseman 15 . .·. kysteiiniryhmä on poistettu, • · · .1*1
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen analogi, t u n - • · · • · II n e t t τα siitä, että aminohapot 1-24 on poistettu. • · · *·· j
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen analogi, t u n - * 25 n e t t u siitä, että aseman 1 kysteiiniryhmä on poistettu • · : ·* ja aseman 15 kysteiiniryhmä on korvattu toisella aminoha- V*·* polla.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen analogi, t u n - n e t t u siitä, että ainakin yksi aminohapoista 1-24 on ;***. 30 poistettu ja aseman 15 kysteiiniryhmä on korvattu toisella • · · *. aminohapolla.
• · · ·*” 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen analogi, t u n - • · ’···* n e t t u siitä, että aseman 1 kysteiiniryhmä ja aseman 15 : kysteiiniryhmä on korvattu toisella aminohapolla. ··· ·:··· 35
7. Jonkin patenttivaatimuksen 4-6 mukainen ana logi, tunnettu siitä, että kysteiiniryhmä on kor- 127 vattu aminohapporyhmällä, joka on alaniini, leusiini, tai seriini.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen analogi, tunnettu siitä, että kysteiiniryhmä on korvattu se- 5 riiniryhmällä.
9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen analogi, tunnettu siitä, että se käsittää varausmuu-toskorvauksen aminohappoasemassa, joka valitaan ryhmästä aminohappoaseman 41 arginiiniryhmä, aminohappoaseman 43 10 glutamiiniryhmä, aminohappoaseman 55 lysiiniryhmä, amino happoaseman 95 lysiiniryhmä, aminohappoaseman 137 aspara-giiniryhmä, aminohappoaseman 138 glutamiiniryhmä, aminohappoaseman 139 lysiiniryhmä, aminohappoaseman 144 arginiiniryhmä, aminohappoaseman 147 lysiiniryhmä, aminohap-15 poaseman 152 glutamiiniryhmä, aminohappoaseman 153 lysiiniryhmä, tai aminohappoaseman 154 treoniiniryhmä.
10. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen analogi, tunnettu siitä, että se käsittää varausmuu-tosmodifikaation aminohappoaseman 116 histiidiiniryhmässä.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen analogi, tunnettu siitä, että histidiiniryhmä on korvattu ; ;1. glysiiniryhmällä. • · ·
12. Jonkin patenttivaatimuksen 9-11 mukainen • · • · : .·. analogi, tunnettu siitä, että aminohapot 1-24 on • · · 25 poistettu.
* · .. 13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen analogi, t u n- • · n e t t u siitä, että se on C(1,15)S; C(1,15,40)S; :·1 1’ C (1,15,102) S; C (1,15,102,106) S; ΔΝ15; ΔΝ16; ΔΝ17; ΔΝ18; ΔΝ19; ΔΝ20; ΔΝ21; ΔΝ22; ΔΝ24; ÄN3/C(15)S; ÄN3/C15-; • · : 1·· 30 ÄN8/C(15)S; AN8C(15)-; ja ΔΝ23/H(116)G, joka vastaa amino- • · · happoja 23-163, jossa aminohappoaseman 116 histidiini on korvattu glysiinillä.
• · · • · .···. 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen analogi, • · *·’ tunnettu siitä, että se on ΔΝ16. • · • · • · · · • · · • · · • · 128
15. Jonkin patenttivaatimuksen 1-14 mukainen analogi, tunnettu siitä, että analogissa on signaa-lisekvenssi tai aminoterminaalinen metioniiniryhmä.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen analogi, 5 tunnettu siitä, että mainittu signaalisekvenssi vastaa kuvion 1 aminohappoja 1-31.
17. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen analogi, tunnettu siitä, että analogi on kovalentti-sesti liitetty polyetyleeniglykoliin tai sentyyppiseen ve- 10 siliukoiseen orgaaniseen polymeeriin.
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen analogi, tunnettu siitä, että analogi on liitetty polyetyleeniglykoliin .
19. Patenttivaatimuksen 1 mukainen analogi, t u n-15 n e t t u siitä, että se on ΔΝ23, joka on kovalenttisesti liitetty polyetyleeniglykoliin tai sentyyppiseen vesiliuo-koiseen polymeeriin.
20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen analogi, t unn e t t u siitä, että analogi on liitetty polyety-20 leeniglykoliin.
21. Jonkin patenttivaatimuksen 1-20 mukainen : analogi, tunnettu siitä, että se on lyof ilisoitu.
• · · :*·*· 22. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu sii- • · : .·. tä, että se sisältää terapeuttisesti tehokkaan määrän jon- • · · 25 kin patenttivaatimuksen 1-21 mukaista KGF-analogia ja • · farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa.
• · · *... 23. Rekombinanttinukleiinihappomolekyyli, t u n - • · · n e t t u siitä, että se koodaa jonkin patenttivaatimuksen 1-16 mukaista analogia. ί *’ 30
24. Biologisesti toiminnallinen vektori, t u n - • · · n e t t u siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 23 mukaisen nukleiinihappomolekyylin.
• · .···. 25. Prokaryoottinen tai eukaryoottinen isäntäsolu, • · tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuk- • · : ** 35 sen 23 mukaisen nukleiinihappomolekyylin tai patenttivaa- • · • · · *. *: timuksen 24 mukaisen biologisesti toiminnallisen vektorin. 129
26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen prokaryootti-nen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on E. coli.
27. Patenttivaatimuksen 25 mukainen eukaryoottinen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on nisäkkään 5 solu, edullisesti kiinalaisen hamsterin munasarjasolu.
28. Menetelmä KGF-analogin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään sopivissa ravinto-olosuhteissa jonkin patenttivaatimuksen 25 - 27 mukaista isäntäsolua siten, että sallitaan koodatun analogin ilmen- 10 tämisen, ja eristetään näin tuotettu analogi.
29. Jonkin patenttivaatimuksen 1-21 mukaisen KGF-analogin käyttö tehokkaana määränä lääkkeen tuottamiseksi ei-fibroblastityyppisten epiteelisolujen tuoton sti-muloimiseksi.
30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että ei-fibroblastityyppiset solut ovat sivuelinten rakenteita, maksasoluja, hengitystiehyeiden tai ruuansulatuskanavan limakalvoepiteeliä, sarveiskalvon soluja tai korvakäytävän epiteelisoluja.
31. Jonkin patenttivaatimuksen 1-21 mukaisen KGF-analogin käyttö tehokkaana määränä lääkkeen tuottami- : :*j seksi ei-f ibroblastityyppisten epiteelisolujen tuoton sti- • · · muloimiseksi potilaassa tilan ennaltaehkäisemiseksi tai • · • · ; .·. hoitamiseksi, joka tila valitaan joukosta palovammat ja • · · "^1 25 muut ihoa osaksi tai kokonaan vahingoittavat vahingot, • · .. epidermolysis bullosa, kemiterapian aikaansaama alopecia, • · miehillä esiintyvä kaljuuntuminen, miehillä tai naisilla ♦ · ♦ esiintyvä etenevä hiustenlähtö, maha- ja pohjukaissuoli-haavaumat, tulehdukselliset suolistosairaudet kuten Crohnin • · : ’·· 30 tauti ja ulseratiivinen koliitti, säteily- ja kemoterapian φ · · •mmm· hoidon aiheuttama suoleen kohdistuva toksisuus, hyaliini- membraanitauti, akuutti tai krooninen keuhkovamma, maksa- • · · .···. kirroosi, maksan tulehduksellinen toiminnanvajaus, akuutti • 9 '·' virushepatiitti, maksaan kohdistuvat toksiset vaikutukset, • · : ** 35 sarveiskalvon abraasio, etenevä ientauti tai tärykalvon • · ·.*·: vaurio. 130
32. In vitro menetelmä ei-fibroblastityyppisten epiteelisolujen tuoton stimuloimiseksi, tunnettu siitä, että annetaan tehokas määrä jonkin patenttivaatimuksen 1-21 mukaista KGF-analogia tai patenttivaatimuk- 5 sen 22 mukaista farmaseuttista koostumusta.
33. Patenttivaatimuksen 29 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että ei-fibroblastityyppiset epiteelisolut stimuloidaan potilaassa, joka on sellaisen tarpeessa.
34. Patenttivaatimuksen 32 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ei-fibroblastityyppiset epiteelisolut ovat sivuelinten rakenteita, maksasoluja, hengi tystiehyeiden tai ruuansulatuskanavan limakalvoepitee-liä, sarveiskalvon soluja tai korvakäytävän epiteelisolu-15 ja.
35. AN23-analogin käyttö tehokkaana määränä lääkkeen tuottamiseksi ei-fibroblastityyppisten epiteelisolujen tuoton stimuloimiseksi potilaassa, joka on sellaisen tarpeessa, jolloin ei-fibroblastityyppiset solut ovat si-20 vuelinten rakenteita, maksasoluja, hengitystiehyeiden li- makalvoepiteeliä tai korvakäytävän epiteelisoluja.
. 36. In vitro menetelmä ei-f ibroblastityyppisten • · « epiteelisolujen tuoton stimuloimiseksi, tunnettu • · • .·. siitä, että annetaan tehokas määrä ΔΝ23 tai sen farmaseut- • · · 25 tista koostumusta, jolloin ei-fibroblastityyppiset solut • · .. ovat sivuelinten rakenteita, maksasoluja, hengitystiehyei- • · •<t|1 den limakalvoepiteeliä tai korvakäytävän epiteelisoluja.
• · · ’·' 37. AN23-analogin käyttö tehokkaana määränä lääk keen tuottamiseksi ei-fibroblastityyppisten epiteelisolu- • · • 1·· 30 jen tuoton stimuloimiseksi potilaassa tilan ennaltaehkäi- • · · Σ.,.ί semiseksi tai hoitamiseksi, joka tila valitaan joukosta palovammat ja muut ihoa osaksi tai kokonaan vahingoittavat • · · .···. vahingot, epidermolysis bullosa, kerni terapian aikaansaama • · alopecia, miehillä esiintyvä kaljuuntuminen, tai miehillä • · : ’** 35 tai naisilla esiintyvä etenevä hiustenlähtö, maha- ja pöh- • · ·.1·· jukaissuolihaavaumat, tulehdukselliset suolistosairaudet 131 kuten Crohnin tauti ja ulseratiivinen koliitti, säteily- ja kemoterapian hoidon aiheuttama suoleen kohdistuva toksisuus, hyaliinimembraanitauti, akuutti tai krooninen keuhko-vamma, maksakirroosi, maksan tulehduksellinen toiminnanva-5 jaus, akuutti virushepatiitti, maksaan kohdistuvat toksiset vaikutukset, etenevä ientauti tai tärykalvon vauriot.
38. Jonkin patenttivaatimuksen 29, 30, 31, 33, 35 tai 37 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että KGF-analogi annetaan IV-, IT-, IM-, SC- tai IP-reittiä.
39. Testipakkaus, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksen 1 - 21 mukaista KGF-analogia tai patenttivaatimuksen 22 mukaista farmaseuttista koostumusta. • · · • · · ··· ·· · • · · • · • · • · • · · • · · »M · • · • · • ·· • · · • · · • · · ·· • · • ·· • t· • · • · ··· • · • · · • · · • · ··· • · • · • · · • · • · • ·· 1 · • · · • ·· • · 132
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US32334094A | 1994-10-13 | 1994-10-13 | |
| US32347594A | 1994-10-13 | 1994-10-13 | |
| US32347594 | 1994-10-13 | ||
| US32334094 | 1994-10-13 | ||
| US48782595A | 1995-06-07 | 1995-06-07 | |
| US48782595 | 1995-06-07 | ||
| IB9500992 | 1995-10-12 | ||
| PCT/IB1995/000992 WO1996011950A1 (en) | 1994-10-13 | 1995-10-12 | Method of treating diabetes mellitus using kgf |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI971536A0 FI971536A0 (fi) | 1997-04-11 |
| FI971536A FI971536A (fi) | 1997-06-09 |
| FI120040B true FI120040B (fi) | 2009-06-15 |
Family
ID=27406268
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI971420A FI971420A (fi) | 1994-10-13 | 1997-04-04 | Menetelmä diabetes mellituksen hoitamiseksi KGF:ää käyttämällä |
| FI971536A FI120040B (fi) | 1994-10-13 | 1997-04-11 | Keratinosyytti-kasvutekijän analogeja |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI971420A FI971420A (fi) | 1994-10-13 | 1997-04-04 | Menetelmä diabetes mellituksen hoitamiseksi KGF:ää käyttämällä |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0785948B1 (fi) |
| JP (2) | JP4216329B2 (fi) |
| KR (1) | KR100278597B1 (fi) |
| CN (1) | CN1168678A (fi) |
| AT (2) | ATE342278T1 (fi) |
| AU (1) | AU3707795A (fi) |
| BG (2) | BG101392A (fi) |
| BR (2) | BR9509329A (fi) |
| CA (2) | CA2201940C (fi) |
| CZ (3) | CZ297329B6 (fi) |
| DE (2) | DE69535264T2 (fi) |
| DK (2) | DK0785948T3 (fi) |
| EE (2) | EE9700225A (fi) |
| ES (2) | ES2273338T3 (fi) |
| FI (2) | FI971420A (fi) |
| HU (2) | HU226168B1 (fi) |
| NO (2) | NO971566L (fi) |
| NZ (2) | NZ505502A (fi) |
| PL (2) | PL320484A1 (fi) |
| PT (2) | PT804479E (fi) |
| SI (2) | SI0804479T1 (fi) |
| SK (2) | SK43197A3 (fi) |
| WO (2) | WO1996011950A1 (fi) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990008771A1 (en) | 1989-01-31 | 1990-08-09 | Rubin Jeffrey S | Dna encoding a growth factor specific for epithelial cells |
| US7084119B2 (en) | 1993-06-29 | 2006-08-01 | Chiron Corporation | Truncated keratinocyte growth factor (KGF) having increased biological activity |
| SK153295A3 (en) | 1993-06-29 | 1996-11-06 | Chiron Corp | A truncated keratinocyte growth factor (kgf) having increased biological activity |
| DK0785949T3 (da) * | 1994-10-13 | 2003-08-18 | Amgen Inc | Fremgangsmåde til oprensning af keratinocytvækstfaktorer |
| US7232667B2 (en) | 1995-02-14 | 2007-06-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 polynucleotides |
| US6077692A (en) * | 1995-02-14 | 2000-06-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 |
| US6693077B1 (en) | 1995-02-14 | 2004-02-17 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 |
| DE69603269T3 (de) * | 1995-04-27 | 2007-02-22 | Coöperatie Cosun U.A. | Derivate von inulin |
| EP1473366A1 (en) * | 1996-10-15 | 2004-11-03 | Amgen Inc. | Keratinocyte growth factor-2 products |
| US6743422B1 (en) | 1996-10-15 | 2004-06-01 | Amgen, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 products |
| JP2001506975A (ja) * | 1996-10-15 | 2001-05-29 | アムジェン インコーポレイテッド | ケラチノサイト増殖因子―２産物 |
| US20080076706A1 (en) | 1997-07-14 | 2008-03-27 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of Growth Hormone and Related Proteins, and Methods of Use Thereof |
| WO1999003887A1 (en) | 1997-07-14 | 1999-01-28 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of growth hormone and related proteins |
| US7153943B2 (en) | 1997-07-14 | 2006-12-26 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof |
| US7495087B2 (en) | 1997-07-14 | 2009-02-24 | Bolder Biotechnology, Inc. | Cysteine muteins in the C-D loop of human interleukin-11 |
| EP1041996A4 (en) | 1997-12-22 | 2003-05-14 | Human Genome Sciences Inc | KERATINOCYTE GROWTH FACTOR-2 FORMULATIONS |
| US6869927B1 (en) | 1997-12-22 | 2005-03-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 formulations |
| US6242666B1 (en) * | 1998-12-16 | 2001-06-05 | The Scripps Research Institute | Animal model for identifying a common stem/progenitor to liver cells and pancreatic cells |
| US8288126B2 (en) | 1999-01-14 | 2012-10-16 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
| IL144259A0 (en) * | 1999-01-14 | 2002-05-23 | Bolder Biotechnology Inc | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
| US6248725B1 (en) | 1999-02-23 | 2001-06-19 | Amgen, Inc. | Combinations and methods for promoting in vivo liver cell proliferation and enhancing in vivo liver-directed gene transduction |
| MXPA03006988A (es) * | 2001-02-06 | 2003-11-18 | Merck Patent Gmbh | Factor de crecimiento de queratinocitos (kgf) modificado con inmunogenicidad reducida. |
| PL374269A1 (en) * | 2001-08-21 | 2005-10-03 | Chiron Corporation | Kgf polypeptide compositions |
| AU2007214362B2 (en) * | 2001-08-21 | 2009-11-26 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | KGF polypeptide compositions |
| US8304387B2 (en) | 2004-12-15 | 2012-11-06 | Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) | Therapeutic formulations of keratinocyte growth factor |
| CN102242124B (zh) * | 2010-05-10 | 2013-05-22 | 齐鲁制药有限公司 | 改造的角化细胞生长因子基因及其在酵母中的表达 |
| KR102440312B1 (ko) * | 2020-08-28 | 2022-09-05 | 한국해양과학기술원 | 온도안정성을 향상시킨 fgf7 폴리펩타이드 및 그 용도 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4959314A (en) * | 1984-11-09 | 1990-09-25 | Cetus Corporation | Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins |
| JPH01137994A (ja) * | 1987-08-10 | 1989-05-30 | Shionogi & Co Ltd | ｒｅｇ蛋白質 |
| WO1990000877A1 (en) * | 1988-07-27 | 1990-02-08 | Marjan International Pty Ltd | Carpet stretcher |
| WO1990008771A1 (en) * | 1989-01-31 | 1990-08-09 | Rubin Jeffrey S | Dna encoding a growth factor specific for epithelial cells |
| JP3303211B2 (ja) * | 1991-04-26 | 2002-07-15 | 武田薬品工業株式会社 | ｂＦＧＦムテインおよびその製造法 |
| CA2159109C (en) * | 1993-03-26 | 2004-11-16 | Glenn F. Pierce | Therapeutic uses of keratinocyte growth factor |
| US5348563A (en) * | 1993-06-29 | 1994-09-20 | Honeywell Inc. | Air purifying apparatus |
| SK153295A3 (en) * | 1993-06-29 | 1996-11-06 | Chiron Corp | A truncated keratinocyte growth factor (kgf) having increased biological activity |
| GB9315501D0 (en) * | 1993-07-27 | 1993-09-08 | Ici Plc | Surfactant compositions |
| WO1995003831A1 (en) * | 1993-08-02 | 1995-02-09 | Prizm Pharmaceuticals, Inc. | Monogenous preparations of cytotoxic conjugates |
-
1995
- 1995-10-12 AT AT95934808T patent/ATE342278T1/de active
- 1995-10-12 AT AT95934793T patent/ATE237633T1/de active
- 1995-10-12 PT PT95934808T patent/PT804479E/pt unknown
- 1995-10-12 HU HU9901255A patent/HU226168B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-10-12 DK DK95934793T patent/DK0785948T3/da active
- 1995-10-12 DE DE69535264T patent/DE69535264T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 JP JP51307796A patent/JP4216329B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-10-12 SK SK431-97A patent/SK43197A3/sk unknown
- 1995-10-12 JP JP51307696A patent/JP4426646B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-10-12 WO PCT/IB1995/000992 patent/WO1996011950A1/en active IP Right Grant
- 1995-10-12 KR KR1019970702343A patent/KR100278597B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-10-12 SI SI9530728T patent/SI0804479T1/sl unknown
- 1995-10-12 SI SI9530654T patent/SI0785948T1/xx unknown
- 1995-10-12 CN CN95196410A patent/CN1168678A/zh active Pending
- 1995-10-12 PT PT95934793T patent/PT785948E/pt unknown
- 1995-10-12 SK SK455-97A patent/SK284534B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1995-10-12 EP EP95934793A patent/EP0785948B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 CZ CZ20023953A patent/CZ297329B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-10-12 AU AU37077/95A patent/AU3707795A/en not_active Abandoned
- 1995-10-12 BR BR9509329A patent/BR9509329A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-10-12 DE DE69530403T patent/DE69530403T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 CZ CZ0105097A patent/CZ297328B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-10-12 CA CA002201940A patent/CA2201940C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-10-12 WO PCT/IB1995/000971 patent/WO1996011949A2/en active IP Right Grant
- 1995-10-12 DK DK95934808T patent/DK0804479T3/da active
- 1995-10-12 HU HU9901071A patent/HUT78050A/hu unknown
- 1995-10-12 ES ES95934808T patent/ES2273338T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 CA CA002202075A patent/CA2202075C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-10-12 BR BR9509269A patent/BR9509269A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-10-12 ES ES95934793T patent/ES2196082T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 CZ CZ97981A patent/CZ98197A3/cs unknown
- 1995-10-12 NZ NZ505502A patent/NZ505502A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-10-12 EE EE9700225A patent/EE9700225A/xx unknown
- 1995-10-12 PL PL95320484A patent/PL320484A1/xx unknown
- 1995-10-12 EP EP95934808A patent/EP0804479B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 PL PL95319784A patent/PL182888B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-10-12 EE EE9700081A patent/EE03975B1/xx not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-04-04 NO NO971566A patent/NO971566L/no unknown
- 1997-04-04 NO NO19971568A patent/NO318761B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-04-04 FI FI971420A patent/FI971420A/fi unknown
- 1997-04-07 BG BG101392A patent/BG101392A/xx unknown
- 1997-04-11 FI FI971536A patent/FI120040B/fi not_active IP Right Cessation
- 1997-04-11 BG BG101408A patent/BG63167B1/bg unknown
-
1999
- 1999-04-09 NZ NZ335109A patent/NZ335109A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI120040B (fi) | Keratinosyytti-kasvutekijän analogeja | |
| US8741841B2 (en) | Fibroblast growth factor 21 proteins | |
| US6767894B1 (en) | Use of ciliary neurotrophic factor | |
| JP2007020575A (ja) | ケラチノサイト増殖因子アナログ | |
| JP2010248207A (ja) | 貧血の予防および治療用の方法および組成物 | |
| US6191106B1 (en) | Muteins of epidermal growth factor exhibiting enhanced binding at low pH | |
| US5158935A (en) | Human epidermal growth factor having substitution at position 11 | |
| SK43097A3 (en) | Method for purifying keratinocyte growth factors | |
| AU745815B2 (en) | Analogs of keratinocyte growth factor, nucleic acids encoding such analogs, processes of making and methods of using | |
| RU2198180C2 (ru) | Аналог природного фактора роста кератиноцитов (варианты), фармацевтическая композиция, рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая аналог, экспрессионный вектор, штамм e.coli, трансформированный вектором, способ получения аналога и способ стимулирования образования нефибробластных эпителиальных клеток | |
| AU5068502A (en) | Analogs of keratinocyte growth factor | |
| PL184188B1 (pl) | Sposób stymulacji produkcji niefibroblastowych komórek nabłonkowych |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: BIOVITRUM AB (PUBL) Free format text: BIOVITRUM AB (PUBL) |
|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 120040 Country of ref document: FI |
|
| MM | Patent lapsed |