CN115916244A

CN115916244A - 用于治疗戊二酸尿症的组合物及其给药方法

Info

Publication number: CN115916244A
Application number: CN202080101896.6A
Authority: CN
Inventors: 陈东奎
Original assignee: New Pharmaceutical Co
Current assignee: New Pharmaceutical Co
Priority date: 2020-06-16
Filing date: 2020-06-16
Publication date: 2023-04-04
Also published as: EP4166157A4; WO2021256579A1; CA3180563A1; EP4166157A1; JP2023529686A; US20230210959A1; AU2020454140A1

Abstract

本公开涉及用于治疗戊二酸尿症的组合物及其给药方法，具体涉及用于治疗戊二酸尿症的含有重组人戊二酰‑CoA脱氢酶(rhGCDH)的药物组合物和用于治疗戊二酸尿症的方法，所述方法包括所述药物组合物的给药步骤。根据本公开的方面提供了一种药物组合物，其包含用于治疗戊二酸尿症的重组人戊二酰‑CoA脱氢酶(rhGCDH)和通过体内施用药物组合物(静脉内和皮下；i.v.和s.c.)治疗戊二酸尿症的新方法。因此，比脑室内给药明显更容易的体内给药产生了优异的效果，预期更有效地调节和治疗戊二酸尿症。

Description

用于治疗戊二酸尿症的组合物及其给药方法

技术领域

本公开涉及一种用于治疗戊二酸尿症的组合物及其给药方法，具体地，涉及一种用于治疗戊二酸尿症的含有重组人戊二酰-CoA脱氢酶(rhGCDH)的药物组合物以及一种用于治疗戊二酸尿症的方法，包括所述药物组合物的给药步骤。

背景技术

戊二酸尿症或戊二酸血症是一种身体不能完全分解氨基酸赖氨酸、羟基赖氨酸和色氨酸并在其中积累过量的它们的中间分解产物，例如戊二酸或3-羟基戊二酸的疾病。戊二酸尿症是一种由戊二酰-CoA脱氢酶缺乏引起的常染色体隐性遗传性代谢缺陷，分为戊二酸尿症1型(GA-1)和戊二酸尿症2型(GA-2)。

在大多数患有戊二酸尿症的婴儿中，均可发现大头畸形(macrocephaly)。此外，婴儿还可能表现出不同程度的神经系统症状，例如，哀鸣、角弓反张、张力减退、肌张力障碍、舞蹈病、惊厥、发育迟缓等。许多患有戊二酸尿症的婴儿出生时头部异常大，或出生后立即表现出大头畸形。通常，这类婴儿在出生后数周至数月内头围会增大。然而，一些婴儿可能正常地发育到两岁，并可能在六岁后出现晚发型。

已知1型戊二酸尿症(GA-1)是由线粒体戊二酰-CoA脱氢酶(GCDH)缺陷或不足引起的，而ETFA、ETFB和ETFDH基因突变引起2型戊二酸尿症(GA-2)。

戊二酸尿症是一种致命性疾病，如果不治疗，可在10岁内导致死亡，但早期诊断、治疗和管理的轻度症状患者通常可通过蛋白质限制和肉碱及核黄素补充治疗而正常发育。然而，早期诊断、治疗和管理至关重要，因为对于已经受损的大脑来说，治疗的效果非常低。治疗包括紧急治疗、饮食治疗、精氨酸、肉碱、氯贝丁酯和/或核黄素替代治疗、神经药理学治疗和多学科支持治疗。

戊二酸尿症患儿应采用低蛋白或不含赖氨酸的饮食，并且饮食中还应减少色氨酸。然而，不含色氨酸的饮食会导致严重的副作用，因此应向儿童提供低色氨酸饮食。饮食和补充肉碱不能改善有此类神经系统症状的儿童的主要临床症状，但已知可控制疾病进展。

对于由单一酶缺陷或不足引起的疾病，可以考虑酶替代疗法，其将所述缺陷酶施用到体内。然而，对许多导致脑损伤的疾病的治疗通常不能防止脑损伤，除非直接对脑室给药。这是由于血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)限制了脑实质与血液之间的物质交换，大部分蛋白质及高分子量成分都无法通过该屏障。

在粘多糖沉积症中，亨特综合征(Hunter's syndrom)、赫尔勒综合征(Hurler'ssyndrome)和桑菲利波综合征(Sanfilippo syndrome)主要影响大脑，并且由于缺乏特定酶类导致身体不能适当分解前体的疾病，如1型戊二酸尿症。在这种情况下，将缺陷酶注射到血管中未能成功通过血脑屏障，伴随着未能防止脑损伤和脑功能恶化的结果，尽管仅改善了软组织(Lamp,C.et al.,J.Inherit.Metab.Dis.,2014；Bradley,L.A.et al.,Genet.Med.,2017；Sohn,Y.B.et al.,Orphanet J.Rare Dis.,2013；Muenzer,J.et al.,Genet.Metab.,2007；Muenzer,J.et al.,Genet.Med.,2006；Muenzer,J.et al.,Genet.Med.,2011)。防止脑功能恶化的唯一方法是直接向脑室中给予缺乏酶，这需要通过脑外科手术插入某种装置(Ommaya装置)，并直接给予缺乏酶以分解大脑中积累的前体(Sohn,Y.B.et al.,J.Inherit.Metab.Dis.,2018；Giugliani,R.et al.,ExpertOpin.Orphan Drugs,2018)。此类疾病除上述疾病外，还包括GM1-神经节苷脂贮积症和克拉伯病(Krabbe disease)。

即使通过极端的饮食限制来控制，戊二酸尿症预后也很差，并且还没有开发出能够有效地控制该疾病的治疗剂。因此，需要开发一种对其进行有效治疗的治疗剂和方法，并且需要开发能够通过静脉内或皮下给药产生治疗效果的治疗剂和治疗方法，而不必像引起脑损伤的传统疾病中那样直接给药到脑室。

【相关技术文件】

(专利文献1)国际专利号WO2013133691 A1

(专利文献2)国际专利号WO2013133711 A1

(非专利文献1)Kolker et al.,"Diagnosis and management of glutaricaciduria type I-revised recommendations"；Journal of Inherited MetabolicDisease,Published online Mar 23,2011；34(3):pp 677-694.

发明内容

本公开提供一种能够有效治疗戊二酸尿症的治疗剂及其给药方法。

本发明人对能够有效治疗戊二酸尿症的治疗剂的开发进行了深入和彻底的研究因此得到本公开的内容，从而开发了一种用于治疗戊二酸尿症的含有重组人戊二酰-CoA脱氢酶(rhGCDH)的药物组合物和用于在体内(静脉内(i.v.)和皮下(s.c.)施用所述药物组合物的方法，并且发现应用所述药物组合物和施用方法导致小鼠动物模型中戊二酸(GA)的显著减少。

本发明的一个方面是提供一种用于治疗戊二酸尿症的含有重组人戊二酰-CoA脱氢酶(rhGCDH)的药物组合物。

本公开的组合物可以是用于治疗戊二酸尿症的一种药物组合物，其设计为体内给药，特别是静脉内或皮下给药。

本公开的另一方面是提供一种治疗戊二酸尿症的方法，包括静脉内或皮下施用所述药物组合物的步骤。

根据本公开的一些方面，用于治疗戊二酸尿症的含有重组人戊二酰-CoA脱氢酶(rhGCDH)的药物组合物和用于在体内(静脉内(i.v.)和皮下(s.c.))施用该药物组合物的方法可以提供一种戊二酸尿症的新疗法，并且在比脑室内给药明显更容易的体内给药时也显示出优异效果，因此发现了用于控制和治疗戊二酸尿症的有效应用。

附图说明

图1显示通过考马斯蓝染色(图A)和Western blot(图B)测定的分离的重组人戊二酰-CoA脱氢酶(rhGCDH)的纯度。

图2显示正常小鼠和GCDH KO小鼠中尿戊二酸(GA)和3-羟基戊二酸(3-OHGA)水平的气相色谱-质谱(GC-MSD谱)，表明所建立的GCDH KO小鼠可用作戊二酸尿症的动物模型。在光谱的红框中，左峰代表戊二酸，右峰代表羟基戊二酸。

图3显示GCDH KO小鼠的初级动物实验的方案，所述小鼠是戊二酸尿症的动物模型，其中在以50或100μg的单剂量经尾静脉施用重组人GCDH之前一周和之后两天采集尿液样本，并通过LC-MS测量戊二酸水平。

图4显示通过LC-MS测量的在初级动物实验中对戊二酸尿症动物模型GCDH KO小鼠施用重组人GCDH之前一周和之后两天采集的尿样品中的戊二酸水平。

图5显示通过LC-MS测量的在初级动物实验中对戊二酸尿症动物模型GCDH KO小鼠施用重组人GCDH之前一周和之后两天采集的尿样品中的戊二酸水平，以基于施用前水平(100％)的百分比计算。

图6显示GCDH KO小鼠的次级动物实验的方案，所述小鼠是戊二酸尿症的动物模型，其中在以50或100μg的单剂量经尾静脉和以50、150或250μg的单剂量经皮下途径施用重组人GCDH之前三天和之后两天及一周采集尿液样本，并通过LC-MS测量戊二酸水平。

图7显示在次级动物实验中通过尾静脉将重组人GCDH给药于戊二酸尿动物模型GCDH KO小鼠之前三天和之后两天和一周所采集的尿液样品中的戊二酸水平，以基于给药前水平的百分比(100％)表示。

图8显示在次级动物实验中通过皮下途径向戊二酸尿症动物模型GCDH KO小鼠施用重组人GCDH之前三天和之后两天和一周所采集的尿液样品中的戊二酸水平，以基于施用前水平(100％)的百分比计算。

具体实施方式

为了描述本公开的技术精神，对本公开的实施例进行了说明。本公开所述的权利要求的范围不限于下面描述的实施例或这些实施例的详细描述。

此外，本公开所属领域的技术人员将认识到，或者能够通过不超过常规的实验来确定本发明所述的特定实施方案的许多等同方案。此外，这些等同方案应被解释为落入本发明的范围内。

除非另外提及，否则本文所用的所有技术或科学术语都具有本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义。这里使用的术语仅仅是为了更清楚地说明本公开而选择的，并不旨在限制本公开所述的权利要求的范围。

这里使用的表达“包括(含有/包含)”、“提供有”、“具有”等应该被理解为开放式术语，其意味着包括其他实施方案的可能性，除非在包括这些表达的短语或句子中另外提及。

在理解本公开的范围时，如这里使用的术语“由……组成”所述要素及其派生词，旨在作为封闭式术语指明所述要素的存在的，并且还排除了其他未说明的要素的存在。

除非另外提及，单数表达可以包括复数含义，并且同样适用于权利要求中所述的单数表达。

在本公开的一个方面，术语“含有重组人戊二酰-CoA脱氢酶的组合物”(rhGCDH)是指含有通过基因重组技术表达戊二酰-CoA脱氢酶而获得的蛋白质产物的组合物。本发明的药物组合物包括但不限于本发明的rhGCDH。在本公开的一个实施方案中，本公开的药物组合物含有药学有效量的本公开的rhGCDH，并且可以进一步包括药学上可接受的载体。

如本文所用，术语“戊二酸尿症”是指戊二酸尿症1型，其是由于身体不能完全分解氨基酸赖氨酸、羟基赖氨酸和色氨酸并在其中累积过量水平的它们的中间分解产物，因此由于GCDH的缺陷或不足而出现各种症状的疾病。大多数戊二酸尿症婴儿表现出大头畸形和不同程度的神经系统症状(哀鸣、角弓反张、张力减退、肌张力障碍、舞蹈病、惊厥、发育迟缓等)。

在本发明中，戊二酰-CoA脱氢酶(GCDH)是一种在赖氨酸或色氨酸代谢的降解途径中催化戊二酰-CoA氧化脱羧为巴豆酰-CoA的酶，根据国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(Enzyme Nomenclature Committee of the International Union ofBiochemistry and Molecular Biology)，可将GCDH分类为EC 1.3.99.7.。在本发明中，GCDH可以包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其基于NCBI登录号NP_000150.1的人GCDH序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_000150.1)。

或者，氨基酸序列可以包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有约80％或更高、特别是约90％或更高、更特别是约95％或更高、甚至更特别是约97％或更高、最特别是约99％或更高同源性的氨基酸序列。如果其所占的蛋白质具有与包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质基本相同或相应的活性，则可以无限制地包括具有这种同源性的任何氨基酸序列。此外，显而易见的是，由具有这种同源性的氨基酸序列通过删除、修饰、取代或添加而衍生的氨基酸序列也落入本公开的范围内。例如，为了优化表达和获得过程，氨基酸序列的一部分可以进行删除、修饰、取代或添加。具体地，可以进一步包括SEQ ID NO:2的信号氨基酸序列，但不限于此。在本公开中，将SEQ IDNO:2的信号氨基酸序列添加到SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N末端以增强GCDH在CHO细胞中的表达和获得。

本发明中使用的术语“同源性”是指将编码多肽的基因的氨基酸序列或碱基序列在特定比较区中的尽可能相互匹配之后，序列之间的碱基或氨基酸残基的同一性程度。当同源性足够高时，相应基因的表达产物可以具有相同或相似的活性。序列同一性的百分比可以使用已知的序列比较程序(例如BLAST(NCBI)等)确定。

如本文所使用的，术语“大约”旨在包括鉴于制造过程的可接受误差范围，或在本公开的技术精神的范围内对特定值的轻微数值修改。例如，术语“大约”表示一个方面中给定值的±10％、给定值的±5％以及另一方面中给定值的±2％的范围。对于本公开的领域，这种近似水平是适当的，除非特别说明所述值需要更窄的范围。

在本公开中，蛋白质可以通过本公开所属领域中已知的方法表达和生产。在本发明中，适合于表达和生产该蛋白的宿主细胞包括本申请中公开的高等真核细胞。脊椎动物细胞在培养基中增殖为一项常规技术。有用的脊椎动物宿主细胞的实施例包括猴肾细胞(CV1)、SV40转化的猴肾细胞系CV1(COS-7)、人胚胎肾细胞(293细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、中华仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠支持细胞(TM4)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)、TRI细胞、MRC 5细胞和FS4细胞，但不限于此。

用于产生本公开的蛋白质的宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售的培养基如Ham's F10、最小必需培养基(Minimal Essential Medium,MEM)、RPMI-1640和杜尔伯科改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium，DMEM)，以及本公开所属领域中使用的可用于培养宿主细胞的任何培养基。这些培养基中的任一种可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素(GENTAMYCIN^TM)、微量元素和葡萄糖或等效能源等。还可以包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其它必需的/辅助的补充物。本发明的宿主细胞的培养条件，例如温度、pH值、CO₂浓度等，为先前为蛋白质表达所选择的宿主细胞所使用的培养条件，并且对于普通技术人员是显而易见的。

本公开的蛋白质可以使用本公开所属领域中已知的任何蛋白质纯化方法来纯化。例如，用于蛋白质纯化的各种已知技术，如通过疏水作用或免疫亲和作用或在离子交换柱上进行的分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、阴离子或阳离子交换树脂色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、凝胶过滤或基因工程技术(tag等)也可以使用。可以采用多种纯化方法的任何组合以提高蛋白质的纯度。

在本公开内容中，通过所述方法纯化的蛋白质可以具有足够高水平的纯度，以允许用于以实验、临床和治疗目的对动物、特别是人给药。

在本公开内容中，可以以约0.001至约500mg/ml的浓度包含重组人GCDH，但不限于此。

根据本公开内容，含有重组人GCDH的药物组合物将以符合医学惯例的方式配制和计量，将考虑到待治疗的疾病、待治疗的特定动物、个体受试者的临床状况、疾病的原因、给药部位、给药方法、给药时间安排以及执业医师已知的其他因素。本公开中的制剂可以包括液体制剂或冻干粉等。本公开的药物组合物可以配制成可容纳在容器中的剂型，例如安瓿、小瓶、瓶、药盒、储器、Lyo-Ject或预填充的注射器，并且可以制备成单剂量形式或多剂量形式。

重组人GCDH的“药物有效量”、“剂量”、“治疗有效量”或“有效剂量”将在考虑上述因素的情况下确定，并且可以是预防、减轻或治疗特定疾病所需的最小量。根据本公开的重组人GCDH的“药物有效量”、“剂量”、“治疗有效量”或“有效剂量”可以是例如每剂量约0.0001mg/kg至约100mg/kg。因此，本公开内容的组合物可以含有约0.001至约1000mg量的重组人GCDH作为单剂量。根据有经验的执业医师的判断，本公开的药物组合物可以一天一次、一周三次、一周两次、一周一次、一月三次、一月两次或一月一次定期给药，并且可以在诸如疾病的急性进展的情况下不定期给药，但不限于此。

另一方面，在本公开内容中，药物组合物可用于与现有的戊二酸尿症疗法并行地给予患者。具体而言，本公开的药物组合物可以与典型的戊二酸尿症疗法联合施用给患者，例如用于减少赖氨酸氧化和增加戊二酰-CoA的生理解毒的疗法，精氨酸、肉碱、氯贝丁酯和/或核黄素的补充疗法，饮食控制例如低蛋白饮食或低赖氨酸/不含赖氨酸的饮食。更具体地，本公开的药物组合物可以与常规进展的饮食控制并行地给予患者。

本公开内容中的药物组合物可以通过根据本领域已知的标准方法将具有所需纯度的重组人GCDH与药学上或生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备。可接受的载体可以包括生理盐水或缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；成盐反离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，例如吐温(TWEEN^TM)、普朗尼克(PLURONICS^TM)或PEG。

本公开的药物组合物可含有约生理浓度的药学上可接受的盐。任选地，本公开的制剂可以包含药学上可接受的防腐剂。具体而言，防腐剂浓度范围为0.1至2.0％(通常为v/v)。防腐剂包括制药领域已知的防腐剂。具体地，可以使用苯甲醇、苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或其组合。本公开的药物组合物可以包括浓度为0.005至0.02％的药学上可接受的表面活性剂。

在本公开内容中，所述药物组合物可以进一步包含治疗戊二酸尿症所需的一种或多种活性化合物，具体地，具有互补活性的活性化合物，所述活性化合物与重组人GCDH不会相互不利地影响。组合物中所含化合物的量可有效实现预期目的。

根据本公开的一个方面，提供了一种治疗戊二酸尿症的方法，包括施用所述含重组人GCDH的药物组合物的步骤。如本文所用，术语“重组人GCDH”、“含有重组人GCDH的药物组合物”和“戊二酸尿症”如上文所定义。

根据本公开的含有重组人GCDH的药物组合物可以通过静脉内、肌内、腹膜内、脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径给予人或动物受试者。

如以下实施例所示，本公开的包含重组人GCDH的药物组合物更优选地通过静脉内或皮下注射给药，因为静脉内或皮下途径导致优异的效果。

在下文中，将通过参考实施例和测试实施例更具体地描述本公开的组成和效果。然而，阐述它们仅仅是为了说明本公开以支持对它的理解，而不是解释为为了限制本公开的范围。

实施例

实施例1.重组人戊二酰-CoA脱氢酶(GCDH)的制备及纯化

从pcDNA3.4-TOPO的骨架构建经优化在CHO细胞(灰仓鼠Cricetulus griseus；中华仓鼠细胞)中表达GCDH的质粒，用于生产重组人戊二酰-CoA脱氢酶(GCDH)。因此，构建了用于表达GCDH蛋白的表达质粒(p18AFUOQC_GCDH_pcDNA3.4-TOPO)，所述表达质粒包括SEQIDNO:1的氨基酸序列。在本实施例中，将具有信号序列功能的SEQ ID NO:2的氨基酸序列添加到GCDH蛋白的N末端，以使质粒能够最佳地表达和分泌。

将这样构建的p18AFUOQC质粒转化到CHO细胞(Expi^TM CHO细胞)中，然后在37℃，8％ CO₂环境下培养5天以表达蛋白。

收获细胞后，借助免疫亲和柱(HisTrap柱)纯化蛋白。通过考马斯蓝染色和Western blotting鉴定蛋白纯度(图1)。如此获得的蛋白质的浓度为7.06mg/ml。

实施例2.戊二酸尿症动物模型

市售的GCDH KO小鼠品系可用作戊二酸尿症小鼠模型(例如，赛业生物(Cyagen)，品系名称：KO-C57BL/6J-Gcdh^em1cyagen，条件性KO-C57BL/6J-Gcdh^em1.1cyagen)。另一方面，本发明人在本公开中使用CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)基因剪刀技术产生GCDHKO小鼠。通过靶向小鼠GCDH的外显子2产生KO小鼠。委托Macrogen公司生产特定一代。通过T7核酸内切酶I反应进行基因分型，以检查所生成的戊二酸尿症小鼠模型(GCDH KO小鼠)中的GCDH是否被敲除(KO)。首要选择通过基因分型鉴定的KO小鼠(表1)。

表1

GCDH	小鼠数量	小鼠编号(F0#)
			T7E1分析	21	1～21
T7E1阳性	21	1～21
			WT混合T7E1(预测同型突变体)	4	4,9,13,20
大量插入/缺失(预测)	6	4,5,11,14,17,18
			总突变体	21	1～21
突变效率(％)	(21/21)100％
			同源KO突变体产生效率(％)	(4/21)19％

具体而言，进行T7核酸内切酶反应，以检查21只F0突变诱导的小鼠是否发生突变。结果，在所有的21只小鼠中诱导了突变。特别地，F0#4、#9、#13和#20被认为是其中KO突变发生在两个等位基因上的同源突变体。其中，F0#4经选育、维护、繁育，届时用于后续试验。

将如此获得的GCDH KO小鼠按如下鉴定为戊二酸尿症动物模型。具体而言，测定了正常小鼠和GCDH KO小鼠的尿液中戊二酸(GA)和3-羟基戊二酸(3-OHGA)水平以及血液中戊二酰肉碱(C5DC)水平。

通过GC-MS分析尿液中的有机酸测定GA和3-OHGA水平，通过干血斑分析获得C5DC水平。结果如下表2中所述，并如图2所示。

表2

从上述数据可以看出，所产生的GCDH KO小鼠的C5DC和戊二酸等非常高，因此表现出与戊二酸尿症1型患者非常相似的症状，证明了其作为GA1动物模型的可用性。

实施例3.1型戊二酸尿症动物模型中重组人戊二酰-CoA脱氢酶的给药

将实施例1中制备的重组人戊二酰-CoA脱氢酶(GCDH)施用于实施例2中产生/建立的戊二酸尿症1型动物模型，并两次确认治疗效果。

实施例3-1.初级体内试验

通过尾静脉向5周龄的GCDH KO小鼠给予单剂量的重组人GCDH。具体而言，rhGCDH以50或100μg单剂量给药，然后进行尿戊二酸(GA)水平的LC-MS/MS分析。在rhGCDH给药前一周和给药后两天，测量了从每个实验组采集的尿液中的GA水平。初级动物实验方案见图4，各实验组及其受试者数量见表3。

表3

小鼠基因型	给药组合物	受试者数量
			野生型(WT)	溶媒	2
GCDH·KO	溶媒	3
			GCDH·KO	rhGCDH 50μg	4
GCDH·KO	rhGCDH 100μg	3

通过LC-MS/MS分析测得的以上述方式采集的尿液中的戊二酸水平见表4。由于LC-MS/MS分析需要大量尿液，因此整合了每个实验组所有受试者的尿液样本，并作为一个样本进行分析。

表4

如表4以及图4和图5中所示，野生型小鼠将戊二酸维持在约100mm ol/mol或更低的水平，而GCDH KO小鼠在用rhGCDH处理之前表现出约6400至7500mmol/mol的戊二酸水平。不考虑剂量，rhGCDH给药可使戊二酸水平降低约30-45％。

实施例3-2.次级体内实验

通过尾静脉(i.v.)或皮下(s.c)途径向5至6周龄的GCDH KO小鼠给予单剂量的重组人GCDH。具体而言，rhGCDH通过尾静脉途径以50或100μg单剂量给药，皮下以50、150和250μg单剂量给药。通常，皮下给药的生物利用度(BA)为静脉给药的生物利用度的20％(参见韩国专利号2017-0004814A)，因此，与静脉给药的50μg相比，剂量设定为1、3和5倍。

通过LC-MS/MS法测定尿戊二酸(GA)水平。在rhGCDH给药前3天和rhGCDH给药后2天和1周测定了每个实验组小鼠的尿中GA水平。次级动物实验的方案如图6所示，各实验组及其受试者数量列于表5和6中。

表5

表6

通过LC-MS/MS分析测得的以上述方式采集的尿液中的戊二酸水平见下表7。在次级实验中，测量每只小鼠的水平，然后计算测量值的平均值。

表7

表8

野生型小鼠未表现出戊二酸的显著减少，平均戊二酸水平维持在或低于约100mmol/mol(以“-”号标出)。相反，在用rhGCDH治疗之前，测量GCDH KO小鼠的戊二酸水平平均为约3600至10000mmol/mol。不考虑剂量，rhGCDH给药可使戊二酸水平降低约30-40％。

下表9比较了静脉给药和皮下给药的效果。

表9

考虑到皮下给药的生物利用度一般为静脉给药的20％(参见韩国专利号2017-0004814A)，发现①GCDH KO+rhGCDH 50μg静脉注射实验组和②GCDH KO+rhGCDH 250μg皮下注射实验组在给药后2天和给药后7天表现出相似的GA减少效应。

从以上数据可以看出，对戊二酸尿症动物模型给予GCDH能够显著控制戊二酸水平。还可以看出，所述效应在给药后一周内仍然有效。

综上所述，数据表明，含有本公开的重组人戊二酰-CoA脱氢酶(rhGC DH)的药物组合物，即使不直接给药至脑室，在治疗上也显著降低了戊二酸尿症，并通过常见的体内给药途径维持降低的水平，从而发现了在戊二酸尿症治疗中的有利应用。

根据以上描述，本公开所属领域的技术人员将理解，本公开可以在不改变其技术思想或基本特征的情况下以其他特定形式实施。在这点上，应当理解，上述实施例是示例性的，并且在所有方面都不是限制性的。本公开的范围被解释为包括权利要求的含义和范围以及从本公开及其等同概念中得出的所有修改或替换方案。

SEQUENCE LISTING

<110> 新型医药公司

<120> 用于治疗戊二酸尿症的组合物及其给药方法

<130> P22118599WP

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 438

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 1

Met Ala Leu Arg Gly Val Ser Val Arg Leu Leu Ser Arg Gly Pro Gly

1 5 10 15

Leu His Val Leu Arg Thr Trp Val Ser Ser Ala Ala Gln Thr Glu Lys

20 25 30

Gly Gly Arg Thr Gln Ser Gln Leu Ala Lys Ser Ser Arg Pro Glu Phe

35 40 45

Asp Trp Gln Asp Pro Leu Val Leu Glu Glu Gln Leu Thr Thr Asp Glu

50 55 60

Ile Leu Ile Arg Asp Thr Phe Arg Thr Tyr Cys Gln Glu Arg Leu Met

65 70 75 80

Pro Arg Ile Leu Leu Ala Asn Arg Asn Glu Val Phe His Arg Glu Ile

85 90 95

Ile Ser Glu Met Gly Glu Leu Gly Val Leu Gly Pro Thr Ile Lys Gly

100 105 110

Tyr Gly Cys Ala Gly Val Ser Ser Val Ala Tyr Gly Leu Leu Ala Arg

115 120 125

Glu Leu Glu Arg Val Asp Ser Gly Tyr Arg Ser Ala Met Ser Val Gln

130 135 140

Ser Ser Leu Val Met His Pro Ile Tyr Ala Tyr Gly Ser Glu Glu Gln

145 150 155 160

Arg Gln Lys Tyr Leu Pro Gln Leu Ala Lys Gly Glu Leu Leu Gly Cys

165 170 175

Phe Gly Leu Thr Glu Pro Asn Ser Gly Ser Asp Pro Ser Ser Met Glu

180 185 190

Thr Arg Ala His Tyr Asn Ser Ser Asn Lys Ser Tyr Thr Leu Asn Gly

195 200 205

Thr Lys Thr Trp Ile Thr Asn Ser Pro Met Ala Asp Leu Phe Val Val

210 215 220

Trp Ala Arg Cys Glu Asp Gly Cys Ile Arg Gly Phe Leu Leu Glu Lys

225 230 235 240

Gly Met Arg Gly Leu Ser Ala Pro Arg Ile Gln Gly Lys Phe Ser Leu

245 250 255

Arg Ala Ser Ala Thr Gly Met Ile Ile Met Asp Gly Val Glu Val Pro

260 265 270

Glu Glu Asn Val Leu Pro Gly Ala Ser Ser Leu Gly Gly Pro Phe Gly

275 280 285

Cys Leu Asn Asn Ala Arg Tyr Gly Ile Ala Trp Gly Val Leu Gly Ala

290 295 300

Ser Glu Phe Cys Leu His Thr Ala Arg Gln Tyr Ala Leu Asp Arg Met

305 310 315 320

Gln Phe Gly Val Pro Leu Ala Arg Asn Gln Leu Ile Gln Lys Lys Leu

325 330 335

Ala Asp Met Leu Thr Glu Ile Thr Leu Gly Leu His Ala Cys Leu Gln

340 345 350

Leu Gly Arg Leu Lys Asp Gln Asp Lys Ala Ala Pro Glu Met Val Ser

355 360 365

Leu Leu Lys Arg Asn Asn Cys Gly Lys Ala Leu Asp Ile Ala Arg Gln

370 375 380

Ala Arg Asp Met Leu Gly Gly Asn Gly Ile Ser Asp Glu Tyr His Val

385 390 395 400

Ile Arg His Ala Met Asn Leu Glu Ala Val Asn Thr Tyr Glu Gly Thr

405 410 415

His Asp Ile His Ala Leu Ile Leu Gly Arg Ala Ile Thr Gly Ile Gln

420 425 430

Ala Phe Thr Ala Ser Lys

435

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 信号肽

<400> 2

Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly

1 5 10 15

Ser Thr Gly

Claims

1.一种治疗戊二酸尿症的药物组合物，所述药物组合物含有重组人戊二酰-CoA脱氢酶(rhGCDH)。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述rhGCDH包括如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物是静脉内或皮下给药。

4.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述戊二酸尿症为戊二酸尿症1型。

5.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物一周给药一次，或一个月给药一次或两次。

6.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物的给药与针对戊二酸尿症的饮食控制治疗组合进行。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述针对戊二酸尿症的饮食控制治疗是低蛋白饮食，低赖氨酸饮食，无赖氨酸饮食，精氨酸、肉碱、氯贝丁酯和/或核黄素补充治疗，或前述饮食控制治疗的组合。

8.一种治疗戊二酸尿症的方法，所述方法包括给予用于戊二酸尿症的包含重组人戊二酰-CoA脱氢酶(rhGCDH)的药物组合物的步骤。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述rhGCDH包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述药物组合物是静脉内或皮下给药。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述戊二酸尿症为戊二酸尿症1型。

12.如权利要求8所述的方法，其中所述药物组合物一周给药一次，或一个月给药一次或两次。

13.如权利要求8所述的方法，其中所述药物组合物的给药与针对戊二酸尿症的饮食控制治疗组合进行。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述针对戊二酸尿症的饮食控制治疗是低蛋白饮食，低赖氨酸饮食，无赖氨酸饮食，精氨酸、肉碱、氯贝丁酯和/或核黄素的补充治疗，或前述饮食控制治疗的组合。