KR102226574B1 - 글루타르산뇨증 치료용 조성물 및 이의 투여방법 - Google Patents

글루타르산뇨증 치료용 조성물 및 이의 투여방법 Download PDF

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Abstract

본 개시는 글루타르산뇨증 치료용 조성물 및 이의 투여방법에 관한 것으로, 구체적으로 재조합 인간 글루타릴 CoA 탈수소효소(recombinant human Glutaryl-CoA dehydrogenase; rhGCDH)를 포함하는 글루타르산뇨증 치료용 약제학적 조성물, 및 상기 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 글루타르산뇨증 치료 방법에 관한 것이다.
본 개시의 일측면에 따른 재조합 인간 글루타릴-CoA 탈수소효소(rhGCDH)를 포함하는 글루타르산뇨증 치료용 약제학적 조성물 및 상기 약제학적 조성물을 체내(정맥 내 및 피하 내; i.v. 및 s.c.) 투여하는 것을 통하여 글루타르산뇨증에 대한 새로운 치료방법을 제공한 것이며, 뇌실 내 투여보다 현저히 용이한 체내 투여를 통해서도 우수한 효과를 보이는 바, 보다 효과적으로 글루타르산뇨증을 조절 및 치료할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

글루타르산뇨증 치료용 조성물 및 이의 투여방법 {Composition for treating Glutaric aciduria and administrating method thereof}
본 개시는 글루타르산뇨증 치료용 조성물 및 이의 투여방법에 관한 것으로, 구체적으로 재조합 인간 글루타릴 CoA 탈수소효소(recombinant human Glutaryl-CoA dehydrogenase; rhGCDH)를 포함하는 글루타르산뇨증 치료용 약제학적 조성물, 및 상기 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 글루타르산뇨증 치료 방법에 관한 것이다.
글루타르산뇨증(Glutaric aciduria) 또는 글루타르산혈증은 체내에서 아미노산인 라이신, 하이드록시라이신(hydroxylysine), 트립토판(tryptophan)을 분해하지 못하여 그 중간 대사 산물, 예를 들면, 글루타르산이나 3-히드록시글루타르산 등이 체내에 축적되는 질환이다. 글루타르산뇨증은 1형(Glutaric aciduria type 1; GA-1)과 2형(Glutaric aciduria type 2; GA-2)으로 나누어지고 상염색체 열성 선천성 이상(autosomal recessive inborn error)에 의한 질환이다.
글루타르산뇨증을 앓는 대부분의 환아에서 대두증이 발생하고, 그 외에도 다양한 정도의 신경학적 증상이 나타날 수 있는데, 예를 들어, 보챔, 후궁반장, 저긴장성, 이긴장성, 무도병, 경련, 발달지연 등의 증상을 보일 수 있다. 많은 환아들이 출생 시 이미 대두증을 보이거나 출생 직후부터 대두증을 보이고, 대개 생후 수 주일에서 수개월 사이에 머리둘레가 증가하는 증상을 보인다. 다만, 환아에 따라 2세까지 정상적으로 발달하는 경우도 있고 6세 이후에 후기발병(late-onset)하는 경우도 있다.
글루타르산뇨증 1형(GA-1)은 미토콘드리아의 글루타릴-CoA 탈수소효소 (Glutary-CoA Dehydrogenase; GCDH)의 결함 또는 결핍이 원인으로 알려져 있고, 글루타르산뇨증 2형(GA-2)은 ETFA, ETFB 및 ETFDH 유전자의 돌연변이에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다.
글루타르산뇨증은 치료를 하지 않으면 10세 이내에 사망에 이를 수 있는 치명적인 질환이나, 조기에 진단하여 치료 및 관리를 한 경미한 증상의 환자의 경우에는 단백질 제한과 카르니틴, 리보플라빈 보충요법을 통해 정상적인 발달이 이루어질 수도 있다. 그러나, 이미 손상된 뇌에 대해서는 치료 효과가 매우 저조하므로 조기 진단과 치료 및 관리가 필수적이다. 치료에는 응급치료, 식이요법, 아르기닌, 카르니틴, 클로피브레이터(clofibrate) 및/또는 리보플라빈 보충요법, 신경약물, 및 다방면의 지지요법이 사용된다.
글루타르산뇨증을 앓는 환아들은 저단백이나 라이신이 없는 식이를 해야하고, 트립토판 역시 감소시켜야 하나 트립토판이 아예 없는 식이는 심각한 부작용을 일으킬 수 있어 저트립토판 식이를 해야한다. 식이요법과 카르니틴의 보충은 신경학적 증상이 있는 환아의 주된 임상증상을 호전시키지는 못하지만, 질병의 진행은 조절할 수 있는 것으로 알려져 있다.
단일 효소 결함 또는 결핍에 의한 질병에 대해서 해당 결핍된 효소를 체내에 투여하여 치료를 도모하는 효소 대체 요법(Enzyme Replacement Treatment)을 고려해 볼 수 있다. 그러나, 뇌의 손상을 일으키는 많은 질환들은 치료제를 뇌실 내 직접 투여하지 않는 이상 뇌손상 방지 효과를 보이지 못하는 경우가 많다. 이는 뇌실질조직과 혈액 사이에 물질 교환을 제한하는 혈액 뇌 장벽(blood-brain barrier; BBB) 때문으로, 분자량이 큰 대부분의 단백질들과 성분들은 해당 장벽을 통과하지 못한다.
예를 들어, 뮤코다당체 침착증(mucopolysaccharidosis) 중 헌터 증후군(Hunter's syndrome)이나 헐러 증후군(Hurler's syndrome), 상피리포 증후군 등은 본 발명의 글루타르산뇨증 1형과 유사하게 특정 효소가 결핍하여 전구물질이 분해되지 못해 뇌손상이 일어나는 질환이다. 이 경우 혈관 내에 해당 결핍된 효소를 주사해도 혈액 뇌 장벽을 통과하지 못해 연부조직만 좋아지고 뇌손상과 뇌기능이 떨어지는 것은 막지 못하였다(Lamp, C. 등, J. Inherit. Metab. Dis., 2014; Bradley, L.A. 등, Genet. Med., 2017; Sohn, Y.B. 등, Orphanet J. Rare Dis., 2013; Muenzer, J. 등, Genet. Metab., 2007; Muenzer, J. 등, Genet. Med., 2006; Muenzer, J. 등, Genet. Med., 2011). 이러한 경우 뇌기능 저하를 막는 유일한 방법은 결핍 효소를 뇌실 내로 직접 투여하는 것으로, 뇌 수술을 통해 특정 장치를 삽입(Ommaya device)하고 이를 통해 결핍 효소를 직접 투여해야만 뇌에 쌓여 있는 전구물질을 분해할 수 있었다(Sohn, Y.B. 등, J. Inherit. Metab. Dis., 2018; Giugliani, R. 등, Expert Opin. Orphan Drugs, 2018). 이러한 질환으로는 상기 나열한 질환 외에도 GM1 강글리오시드증(GM1-gangliosidosis)나 크라베병(Krabbe Disease) 등 다양한 질환이 있다.
한편, 글루타르산뇨증은 극도의 식이제한에 의해서 조절하더라도 예후가 좋지 않으며, 해당 질환을 효과적으로 조절할 수 있는 치료제는 아직 개발되지 않은 상태이다. 이를 효과적으로 치료하기 위한 치료제 및 치료 방법의 개발이 요구되고 있으며, 종래 뇌손상을 일으키는 질환들처럼 뇌실 내에 직접 투여해야하는 번거로움 없이, 정맥 투여나 피하 투여로 치료 효과를 보일 수 있는 치료제 및 치료 방법이 개발되어야 할 필요가 있다.
국제특허공개공보 WO2013133691 A1 국제특허공개공보 WO2013133711 A1
Kolker et al., "Diagnosis and management of glutaric aciduria type I - revised recommendations"; Journal of Inherited Metabolic Disease, Published online Mar 23, 2011; 34(3): pp 677-694.
본 개시의 발명자들은 글루타르산뇨증을 효과적으로 치료할 수 있는 치료제를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 재조합 인간 글루타릴-CoA 탈수소효소(rhGCDH)를 포함하는 글루타르산뇨증 치료용 약제학적 조성물 및 상기 약제학적 조성물을 체내(정맥 내 및 피하; i.v. 및 s.c.) 투여하는 방법을 개발하였고, 이를 이용할 경우 글루타르산뇨증 동물 모델인 마우스(mouse)에서 글루타르산(GA)의 유의적인 감소를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 개시의 일 측면은 재조합 인간 글루타릴-CoA 탈수소효소(rhGCDH)를 포함하는 글루타르산뇨증 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 개시의 조성물은 체내 투여를 위한 글루타르산뇨증 치료용 약제학적 조성물일 수 있으며, 특히 정맥 내 또는 피하 투여를 위한 치료용 약제학적 조성물일 수 있다.
본 개시의 다른 측면은 상기 약제학적 조성물을 정맥내 또는 피하내 투여하는 단계를 포함하는, 글루타르산뇨증 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 개시의 일측면에 따른 재조합 인간 글루타릴-CoA 탈수소효소(rhGCDH)를 포함하는 글루타르산뇨증 치료용 약제학적 조성물 및 상기 약제학적 조성물을 체내(정맥 내 및 피하 내; i.v. 및 s.c.) 투여하는 것을 통하여 글루타르산뇨증에 대한 새로운 치료방법을 제공한 것이며, 뇌실 내 투여보다 현저히 용이한 체내 투여를 통해서도 우수한 효과를 보이는 바, 보다 효과적으로 글루타르산뇨증을 조절 및 치료할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 정제된 재조합 인간 글루타릴-CoA 탈수소효소(recombinant human Glutaryl-CoA dehydrogenase; rhGCDH)의 순도를 Coomassie Blue 염색(도 1의 A)과 Western blot(도 1의 B)으로 확인한 도면이다.
도 2는 정상 마우스와 GCDH KO 마우스의 소변 내 글루타르산(GA) 및 3-히드록시글루타르산(3-Hydroxyglutaric acid; 3-OHGA) 농도를 GC-MSD (기체 크로마토그래피 질량 분석법)를 이용하여 측정하여 제조된 GCDH KO 마우스가 글루타르산뇨증 동물 모델임을 확인한 결과이다. 도면에서 적색 박스 안에 있는 왼쪽 피크는 글루타르산(Glutaric acid) 피크이고, 오른쪽 피크는 히드록시글루타르산(Hydroxyglutaric acid) 피크이다.
도 3은 글루타르산뇨증 동물 모델인 GCDH KO 마우스에 대한 1차 동물 실험의 개요도로써, 재조합 인간 GCDH 50 및 100 μg를 꼬리 정맥을 통해 단회 투여하되 투여 전 1주, 및 투여 후 2일 소변 채취하여 글루타르산 수치를 LC-MS로 측정하였다.
도 4는 글루타르산뇨증 동물 모델인 GCDH KO 마우스에 재조합 인간 GCDH를 투여한 1차 동물 실험의 결과로써, 투여 전 1주 및 투여 후 2일 소변 채취하여 글루타르산 수치를 LC-MS로 측정하여 개시한 그래프이다.
도 5는 글루타르산뇨증 동물 모델인 GCDH KO 마우스에 재조합 인간 GCDH를 투여한 1차 동물 실험의 결과로써, 투여 전 1주 및 투여 후 2일 소변 채취하여 글루타르산 수치를 LC-MS로 측정하되 투여 전을 기준(100%)으로 백분율로 계산한 그래프이다.
도 6은 글루타르산뇨증 동물 모델인 GCDH KO 마우스에 대한 2차 동물 실험의 개요도로써, 재조합 인간 GCDH를 꼬리 정맥을 통해서는 50 및 100 μg, 피하에는 50, 150, 및 250 μg 단회 투여하되 투여 전 3일, 투여 후 2일, 및 투여 후 1주일에 소변 채취하여 글루타르산 수치를 LC-MS로 측정하였다.
도 7은 글루타르산뇨증 동물 모델인 GCDH KO 마우스에 재조합 인간 GCDH를 정맥 내 투여한 2차 동물 실험의 결과로써, 투여 전 3일, 투여 후 2일, 및 투여 후 1주일 소변 채취하여 글루타르산 수치와 투여 전을 기준(100%)으로 백분율로 계산한 그래프이다.
도 8은 글루타르산뇨증 동물 모델인 GCDH KO 마우스에 재조합 인간 GCDH를 피하 투여한 2차 동물 실험의 결과로써, 투여 전 3일, 투여 후 2일, 및 투여 후 1주일 소변 채취하여 글루타르산 수치와 투여 전을 기준(100%)으로 백분율로 계산한 그래프이다.
본 개시의 실시예 또는 일 측면들은 본 개시의 기술적 사상을 설명하기 위한 목적으로 예시된 것이다. 본 개시에 따른 권리범위가 이하에 제시되는 실시예 또는 일측면들이나 이들에 대한 구체적 설명으로 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 개시가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 이러한 등가물은 본 개시에 포함되는 것으로 의도된다.
본 개시에 사용되는 모든 기술적 용어들 및 과학적 용어들은, 달리 정의되지 않는 한, 본 개시가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본 개시에 사용되는 모든 용어들은 본 개시를 더욱 명확히 설명하기 위한 목적으로 선택된 것이며 본 개시에 따른 권리범위를 제한하기 위해 선택된 것이 아니다.
본 개시에서 사용되는 "포함하는", "구비하는", "갖는" 등과 같은 표현은, 해당 표현이 포함되는 어구 또는 문장에서 달리 언급되지 않는 한, 다른 실시예를 포함할 가능성을 내포하는 개방형 용어(open-ended terms)로 이해되어야 한다.
본 개시에서 사용되는 해당 구성 "만으로 구성되는" 등과 같은 표현은, 해당 구성 외에 다른 구성을 포함할 가능성을 배제하는 폐쇄형 용어(closed-ended terms)로 이해되어야 한다.
본 개시에서 기술된 단수형의 표현은 달리 언급하지 않는 한 복수형의 의미를 포함할 수 있으며, 이는 청구범위에 기재된 단수형의 표현에도 마찬가지로 적용된다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 용어 "재조합 인간 글루타릴-CoA 탈수소효소(recombinant human glutaryl-CoA dehydrogenase; rhGCDH)를 포함하는 조성물"은 인간 글루타릴-CoA 탈수소효소 유전자를 유전자재조합 기술로 발현시켜 얻어진 단백질 발현산물을 포함하는 조성물을 말한다. 본 개시의 약제학적 조성물은 본 개시의 rhGCDH를 포함하는 것을 제한없이 포함한다. 본 개시의 일 양태로, 본 개시의 약제학적 조성물은 약제학적 유효량의 본 개시의 rhGCDH를 포함하고, 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있다.
본 개시에서 글루타르산뇨증은 글루타르산뇨증 제1형을 의미하며, 이는 GCDH 결함 또는 결핍에 의해 체내에서 아미노산인 라이신, 하이드록시라이신(hydroxylysine), 트립토판(tryptophan)을 분해하지 못하여 그 중간 대사 산물이 체내에 축적되는 것에 의해 다양한 증상을 나타내는 질병이다. 대부분의 환아에서 대두증을 비롯한 다양한 정도의 신경학적 증상(보챔, 후궁반장, 저긴장성, 이긴장성, 무도병, 경련, 발달지연 등)을 보인다.
본 개시에서 글루타릴-CoA 탈수소효소(glutaryl-CoA dehydrogenase; GCDH)는 리신 또는 트립토판의 분해경로에서 생성되는 글루타릴-CoA의 산화적 탈탄산에 의한 클로트노일 CoA 생성을 촉매하는 효소로서, 국제 생화학·분자생물학 연합의 효소번호 EC 1.3.99.7.의 GCDH일 수 있다. 본 개시에서 GCDH는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 아미노산 서열은 NCBI accession No. NP_000150.1의 Homo sapiens GCDH 서열을 기반으로 한다(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_000150.1).
상기 아미노산은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 약 80% 이상, 구체적으로 약 90% 이상, 보다 구체적으로는 약 95% 이상, 보다 더 구체적으로는 약 97% 이상, 가장 구체적으로는 약 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 동일하거나 상응하는 활성을 가지는 단백질을 나타내는 아미노산 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열도 본 개시의 범위에 포함됨은 자명하다. 예를 들어, 단백질의 발현 및 수득 과정의 최적화를 위해 일부 아미노산 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가될 수 있으며, 구체적으로 서열번호 2의 시그널 아미노산 서열 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 개시에서 GCDH는 CHO 세포에서의 발현 및 수득 향상을 위해 서열번호 1의 아미노산 서열의 N 말단 부근에 서열번호 2의 시그널 아미노산 서열을 부가하여 발현되었다.
본 개시에서 "상동성"은 단백질을 코딩하는 유전자의 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 있어서, 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 정렬(align)시킨 후 서열 간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 상기 서열 동일성의 백분율(%)은 공지의 서열 비교 프로그램(예를 들어, Blast(NCBI) 등)을 사용하여 결정될 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 용어 "약"은 구체적 수치에 포함되는 제조 공정상의 오차나 본 개시의 기술적 사상의 범주에 포함되는 약간의 수치 조정을 포함하는 의도로 사용되었다. 예를 들어, 용어 "약"은 그것이 지칭하는 값의 ±10％, 일 측면에서 ±5％, 또 다른 측면에서 ±2％의 범위를 의미한다. 이 개시 내용의 분야에 있어서, 값이 구체적으로 보다 좁은 범위를 요구하는 것으로 언급되지 않는다면 이 수준의 근사치가 적절하다.
본 개시에서 단백질은 본 개시가 속하는 기술 분야에 공지된 방법을 통해 발현 및 생산될 수 있다. 본 개시에서 단백질을 발현 및 생산하기 위해 적합한 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포를 비롯하여 본원에 기재된 고등 진핵 세포를 포함한다. 배양액에서 척추동물 세포의 증식은 일반적인 기술이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예로서, 원숭이 신장 세포(CV1), SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1주(COS-7), 인간 배아 신장주(293 세포), 새끼 햄스터 신장 세포(BHK), 차이니즈 햄스터 난소세포 (CHO), 마우스 세르톨리 세포(TM4), 아프리카 초록 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부 암종 세포(HELA), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간세포(BRL 3A), 인간 폐세포 (W138), 인간 간세포(Hep G2), 마우스 유방 종양(MMT 060562), TRI 세포, MRC 5 세포, 및 FS4 세포 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 개시의 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예를 들어 햄(Ham) F10 배지, 최소 필수 배지, RPMI-1640, Dulbecco 개질 Eagle 배기(DMEM) 등과 그 외 본 개시가 속하는 기술 분야에서 사용되는 임의의 배지를 숙주 세포 배양을 위해 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지에는 필요하다면 호르몬 및/또는 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, 젠타마이신 (GENTAMYCIN)TM 약물), 미량 원소, 및 글루코스 또는 동등 에너지원 등이 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수/보조 보충물을 또한 관련 기술 분야에서 통상의 기술자에게 알려진 적절한 농도로 포함시킬 수 있다. 그 외 온도, pH, CO2 농도 등의 배양 조건은 단백질 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 관련하여 알려진 적절한 조건으로 설정될 수 있고, 이는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
본 개시에서 단백질은 본 개시가 속하는 기술 분야에 공지된 임의의 단백질 정제 방법으로 정제될 수 있다. 예를 들어, 소수성 상호작용, 면역 친화도 또는 이온-교환 칼럼 상의 분획, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 또는 음이온 또는 양이온-교환 수지 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 겔 여과, 또는 유전공학적 방법(tag 등) 등을 포함하는 다양한 공지의 정제방법을 사용할 수 있으며, 단백질의 순도를 높이기 위해 복수개의 정제방법을 임의로 조합하여 사용할 수 있다.
본 개시에서 상기 방법을 통해 정제된 단백질은 동물, 특히 인간에게 실험, 임상, 및 치료 목적으로 투여될 수 있는 수준으로 높은 순도를 가질 수 있다.
본 개시에서 재조합 인간 GCDH는 약 0.001 내지 약 500 mg/ml의 농도로 조성물에 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 개시에서 재조합 인간 GCDH를 포함하는 약제학적 조성물은 의료 실무에 일치하는 방식으로 제형화되고, 투여될 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 인자는 치료되는 질환, 치료되는 특정 동물, 개별 대상체의 임상 병태, 질환의 원인, 물질의 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획, 및 임상의에게 알려진 다른 인자를 포함한다. 본 개시에서 제형은 액체 제형, 또는 동결 건조 분말 제형 등을 포함할 수 있다. 본 개시의 약제학적 조성물은 앰플, 바이알, 병, 카트리지, 저장고, 리오젝트, 또는 사전충전형 주사기 등의 형태로 제조될 수 있고, 단회 투여형 또는 다회 투여형 등으로 제조될 수 있다.
투여되는 재조합 인간 GCDH의 "약제학적 유효량", "투여 용량", "치료 유효량" 또는 "효과 투여량"은 상기 고려사항에 의해 결정될 것이고, 특정 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위해 필요한 최소량이다. 본 개시에서 재조합 인간 GCDH의 "약제학적 유효량", "투여 용량", "치료 유효량" 또는 "효과 투여량"은 예를 들어 1회 약 0.0001mg/kg 내지 약 100 mg/kg일 수 있다. 이에 따라, 본 개시의 조성물은 1회 투여량으로 약 0.001 내지 약 1000 mg의 재조합 인간 GCDH를 포함할 수 있다. 본 개시의 약제학적 조성물은 경험이 있는 임상의의 판단에 의해 일 1회, 주3회, 주2회, 주1회, 월3회, 월2회, 또는 월1회 등으로 주기적으로 투여될 수 있고, 질환의 급성 진행 등의 상황에 비주기적으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 개시에서 약제학적 조성물은 기존의 글루타르산뇨증 치료요법과 병행하여 환자에 투여되기 위한 것일 수 있다. 구체적으로, 본 개시의 약제학적 조성물은 기존의 글루타르산뇨증 치료로 통상적으로 진행되는 라이신-산화의 감소와 글루타릴-CoA의 생리학적 제독화(physiologic detoxification)를 증가시기키 위한 요법, 아르기닌, 카르니틴, 클로피브레이트(clofibrate) 및/또는 리보플라빈 보충요법, 저단백 식이나 저-라이신/라이신 제거 식이 등의 식이조절 등과 병행하여 환자에 투여될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 개시의 약제학적 조성물은 일상적으로 진행되는 식이조절과 병행하여 환자에 투여되기 위한 것일 수 있다.
본 개시에서 약제학적 조성물은 목적하는 정도의 순도를 갖는 재조합 인간 GCDH를 약제학적으로 또는 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합되어 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 허용되는 담체는 염수 또는 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산; 저분자량 폴리펩티드(약 10개 미만의 아미노산 잔기 포함); 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예를 들어, 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEENTM, PLURONICSTM, 또는 PEG를 포함한다.
본 개시의 약제학적 조성물은 제약상 허용되는 염을 대략 생리학적 농도로 함유할 수 있다. 임의로, 본 발명의 제형은 제약상 허용되는 보존제를 함유할 수 있다. 구체적으로, 보존제 농도는 0.1 내지 2.0% (전형적으로 v/v)일 수 있다. 본 개시에서 보존제는 제약업계에 공지된 것일 수 있으며, 구체적으로 벤질 알콜, 페놀, m-크레졸, 메틸파라벤, 프로필파라벤 또는 이들의 조합일 수 있다. 본 개시의 약제학적 조성물은 제약상 허용되는 계면활성제를 0.005 내지 0.02%의 농도로 포함할 수 있다.
본 개시에서 약제학적 조성물은 글루타르산뇨증 치료에 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 구체적으로 재조합 인간 GCDH와 서로 유해한 영향을 주지 않는 상보적인 활성을 갖는 활성 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 상기 화합물은 조성물에 의도하는 목적을 달성하기 위한 효과적인 양으로 함유될 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 재조합 인간 GCDH를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 글루타르산뇨증 치료 방법을 제공한다. 본 개시의 용어 "재조합 인간 GCDH", "재조합 인간 GCDH를 포함하는 약제학적 조성물" 및 "글루타르산뇨증"은 상기에서 기재된 바와 같다.
본 개시에서 재조합 인간 GCDH를 포함하는 약제학적 조성물은 공지된 방법에 따라, 정맥 내, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 경막내, 경구, 국소, 피하, 또는 흡입 경로 등에 의해 인간 또는 동물 대상체에게 투여될 수 있다.
하기 실시예에서 보인 바와 같이, 본 개시의 재조합 인간 GCDH를 포함하는 약제학적 조성물은 정맥 내 또는 피하 내 투여에 의해 우수한 효과를 보이므로, 정맥 내 또는 피하 내 투여가 특히 바람직하다.
이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 개시의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 개시에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 개시의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 재조합 인간 글루타릴-CoA 탈수소효소(GCDH) 제조 및 정제
재조합 인간 글루타릴-CoA 탈수소효소(Glutaryl-CoA Dehydrogenase; GCDH)를 생산하기 위해, pcDNA3.4-TOPO을 백본으로 한 플라스미드로부터 CHO 세포(Cricetulus griseus; Chinese Hamster 세포)에서의 GCDH 발현에 적절할 수 있도록 최적화 플라스미드를 제작하였다. 이에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 GCDH 단백질을 발현하는 플라스미드를 제작하였다(p18AFUOQC_GCDH_pcDNA3.4-TOPO). 본 실시에서는 발현 및 수득 최적화를 위해 시그널 서열인 서열번호 2의 아미노산 서열을 N 말단 부근에 부가한 GCDH 단백질을 발현하여 수득하였다.
상기 제조한 p18AFUOQC 플라스미드를 CHO 세포(ExpiTM CHO 세포)에 형질전환하여 37℃, 8% CO2 농도 조건에서 5일간 배양 및 발현시킨 후 세포를 채취하였다.
이를 면역 친화도 컬럼(HisTrap column)을 이용해 정제하였고, 이의 정제를 Coomassie Blue 염색과 Western blot으로 순도를 확인하였다(도 1). 이에 제조된 단백질 농도는 7.06 mg/ml였다.
실시예 2. 글루타르산뇨증 동물 모델
글루타르산뇨증 질환 모델 마우스로 사용되는 GCDH KO 마우스는 이미 널리 상용화된 마우스 strain이다(예를 들어, Cyagen 사, strain name : KO - C57BL/6J-Gcdhem1cyagen; Conditional KO -C57BL/6J-Gcdhem1.1cyagen). 한편, 본 개시에서는 발명자들이 별도로 크리스퍼(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; CRISPR) 유전자 가위 기술을 이용하여 GCDH KO 마우스를 제작하였다. 마우스 GCDH의 Exon 2 부분을 타겟팅하여 KO 마우스를 제작하였고, 구체적인 제작은 마크로젠(사)에 의뢰하였다. 제조한 글루타르산뇨증 질환 모델 마우스(GCDH KO 마우스)의 낙아웃(Knock-out; KO) 여부를 확인하는 T7 엔도뉴클레아제 I 반응을 통한 유전자형 검사(Genotyping)를 수행하였다. Genotyping을 통해 KO된 마우스를 1차적으로 동정하였다(표 1).
GCDH 개체 수 개체 번호
(F0 #)
T7E1 분석 21 1 ~ 21
T7E1 양성 21 1 ~ 21
WT mix T7E1(homo mutant 예상됨) 4 4, 9, 13, 20
대규모 삽입/결실 (예상됨) 6 4, 5, 11, 14, 17, 18
총 변이체 21 1 ~ 21
변이 효율(%) (21/21) 100%
Homo KO mutant 제작 효율 (%) (4/21) 19%
구체적으로, 21마리의 F0 변이 유도 마우스에 대해 T7 엔도뉴클레아제 I 반응으로 변이 여부를 확인해본 결과, 21마리의 마우스 전부에서 변이가 일어났음을 확인하였고, 특히 F0 #4, #9, #13 및 #20 개체들이 양 염색체에서 KO 변이가 일어난 homo mutant일 것으로 추정되었다. 이 중에 F0 #4 개체를 선택하고 유지 번식하여 이후 실험에 사용하였다.
제조된 GCDH KO 마우스가 글루타르산뇨증 질환 동물 모델임을 아래와 같이 확인하였다. 구체적으로 정상 마우스와 GCDH KO 마우스를 소변 내 글루타르산(GA) 및 3-히드록시글루타르산(3-Hydroxyglutaric acid; 3-OHGA) 농도와 혈액 내 글루타릴카르니틴(glutarylcarnitine; C5DC)의 농도를 측정하였다.
GA 및 3-OHGA 수치는 마우스 소변을 GC-MS 이용 유기산 분석하여 확인하였고, C5DC 수치는 건조 혈반(Dried-blood spot) 분석을 통해 확인하였다. 해당 결과는 아래 표 2 및 도 2와 같다.
건조혈반(DBS;μM) 소변 (mmol/mol Crea.)
평균 C5DC GA 3-OHGA
정상 마우스 1 0.055 21.55 17.1
정상 마우스 2
GCDH KO 마우스 1 0.145 3206.8 20.8
GCDH KO 마우스 2
상기 결과에서 확인할 수 있듯이, 제조된 GCDH KO 마우스는 C5DC와 글루타르산 등의 수치가 현저히 높아 글루타르산뇨증 1형 환자와 매우 유사한 증상을 보이는 바 GA1의 동물 모델로써 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 글루타르산뇨증 1형 동물 모델에서 재조합 인간 글루타릴-CoA 탈수소효소 투여 실험
상기 실시예 1에서 생산한 재조합 인간 글루타릴-CoA 탈수소효소(GCDH)를 상기 실시예 2에서 생산/확인한 글루타르산뇨증 1형 동물 모델에 투여하여 치료 효과를 2차에 걸쳐 확인하였다.
실시예 3-1. 1차 in vivo 실험
5주령 GCDH KO 마우스에 꼬리 정맥을 통해 재조합 인간 GCDH를 단회 투여하는 실험을 진행하였다. 구체적으로, rhGCDH를 50 및 100 μg의 단회 투여하고, 소변 내 글루타르산(GA) 수치를 LC-MS/MS 방법으로 측정하였다. GA 수치는 rhGCDH 투여 전 1주, 및 투여 후 2일에 각 실험군 별 소변을 채취하여 측정하였다. 1차 동물 실험의 대략적인 개요는 도 4와 같고, 각 실험군 및 개체의 수는 아래 표 3과 같다.
마우스 유전형 투여 조성물 개체 수
야생형(WT) 담체(vehicle) 2
GCDH KO 담체(vehicle) 3
GCDH KO rhGCDH 50 μg 4
GCDH KO rhGCDH 100 μg 3
상기 설명한 방식으로 채취된 소변 내 글루타르산 수치를 LC-MS/MS 분석으로 측정한 결과는 아래 표 4와 같다. 한편, LC-MS/MS 분석시에 요구되는 소변양이 많아, 실험군 별 모든 개체의 소변 샘플을 통합하여 1개의 샘플로 분석하였다.
실험군 글루타르산(GA; mmol/mol creatinine)
투여 전 1주 투여 후 2일
WT + Veh 100.1 46.0
GCDH KO + Veh 7357.4 7097.2
GCDH KO + rhGCDH 50 μg 7484.0 4073.2
GCDH KO + rhGCDH 100 μg 6389.1 4599.9
4주령 GCDH KO 마우스의 GA 평균값 7420.7 -
상기 표 4와 도 4 및 도 5에서 확인할 수 있듯이, 야생형 마우스는 글루타르산 수치가 약 100 mmol/mol 이하로 유지되는 반면, GCDH KO 마우스에서는 rhGCDH를 투여하지 않은 상태로는 글루타르산 수치 약 6400 내지 7500 mmol/mol을 보였다. rhGCDH를 투여한 군에서는 용량과 무관하게 2일 후 글루타르산 수치가 약 30~45 % 정도 감소됨을 확인하였다.
실시예 3-2. 2차 in vivo 실험
5 내지 6주령 GCDH KO 마우스에 재조합 인간 GCDH를 꼬리 정맥(i.v.) 또는 피하(s.c.)에 단회 투여하는 실험을 진행하였다. 구체적으로, 꼬리 정맥은 rhGCDH를 50 및 100 μg의 단회 투여하고, 피하에는 rhGCDH를 50, 150, 및 250 μg의 단회 투여하였다. 일반적으로 피하 투여 용량은 정맥 투여에 비해 생체 이용율 (bioavailability; BA)이 20%이므로(대한민국 공개특허 제2017-0004814호 참고), 정맥 투여 50 μg 대비 1, 3, 및 5배로 용량 설정하였다.
소변 내 글루타르산(GA) 수치를 LC-MS/MS 방법으로 측정하였다. GA 수치는 rhGCDH 투여 전 3일, 투여 후 2일 및 투여 후 1주일에 각 실험군의 개체별 소변을 채취하여 측정하였다. 2차 동물 실험의 대략적인 개요는 도 6과 같고, 각 실험군 및 개체의 수는 아래 표 5 및 표 6과 같다.
i.v. 투여 실험군
마우스 유전자형 투여 조성물 개체 수
야생형(WT) 담체(vehicle) 4
GCDH KO 담체(vehicle) 4
GCDH KO rhGCDH 50 μg 4
GCDH KO rhGCDH 100 μg 4
s.c. 투여 실험군
마우스 유전자형 투여 조성물 개체 수
야생형(WT) 담체(vehicle) 5
GCDH KO 담체(vehicle) 5
GCDH KO rhGCDH 50 μg 5
GCDH KO rhGCDH 150 μg 5
GCDH KO rhGCDH 250 μg 5
상기 설명한 방식으로 채취된 소변 내 글루타르산 수치를 LC-MS/MS 분석으로 측정한 결과는 아래 표 7과 같다. 2차 실험에서는 개체 별로 수치를 측정한 후 평균값을 계산하였다.
i.v.
투여		 글루타르산(GA) 감소 % (평균값±SEM)
투여 전 투여 후
2일		 투여 후
7일
WT +Veh - - -
GCDH KO+ Veh 100 87.86±6.015 82.71±7.579
GCDH KO+ rhGCDH 50 μg 100 63.45±17.642 72.67±21.116
GCDH KO+ rhGCDH 100 μg 100 68.40±9.985 59.57±5.687
s.c.
투여		 글루타르산(GA) 감소 %
투여 전 투여 후
2일		 투여 후
7일
WT +Veh - - -
GCDH KO+ Veh 100 90.60±8.735 127.32±16.785
GCDH KO+ rhGCDH 50 μg 100 72.94±11.503 87.25±10.317
GCDH KO+ rhGCDH 150 μg 100 72.87±4.858 88.90±0
GCDH KO+ rhGCDH 250 μg 100 64.49±17.421 79.94±9.677
야생형 마우스는 글루타르산 수치가 평균 약 100 mmol/mol 또는 그 이하로 유지되어 유의미한 글루타르산 감소를 보이지 않는 반면('-'로 표기), GCDH KO 마우스에서는 rhGCDH를 투여하지 않은 상태로는 글루타르산 수치가 평균 약 3600 내지 10000 mmol/mol의 범위를 보였다. rhGCDH를 투여한 군에서는 용량과 무관하게 2일 후 글루타르산 수치가 약 30~40 % 정도 감소됨을 확인하였다.
한편, 정맥 투여와 피하 투여의 효과를 비교하면 하기 표 9와 같다.
실험순 글루타르산 감소 백분율(%)
투여 전 투여 후 2일 투여 후 7일
GCDH KO + Veh i.v. 100 87.9 ± 6.015 82.7 ± 7.579
s.c. 100 90.6 ± 8.735 127.3 ± 16.785
GCDH KO +
rhGCDH 50μg
(①)		 i.v. 100 63.5 ± 17.64 72.7 ± 21.12
GCDH KO + rhGCDH 50μg s.c. 100 73.0 ± 11.50 87.3 ± 10.32
GCDH KO + rhGCDH 100μg i.v. 100 68.4 ± 9.99 59.6 ± 5.69
GCDH KO + rhGCDH 150μg s.c. 100 72.9 ± 4.96 88.9
GCDH KO + rhGCDH 250μg
(②)		 s.c. 100 64.5 ± 17.42 79.9 ± 9.68
피하 투여의 생체 이용율이 일반적으로 정맥 투여의 20%인 것을 고려할 때(대한민국 공개특허 제2017-0004814호 참고), ① GCDH KO + rhGCDH 50μg i.v. 실험군과 ② GCDH KO + rhGCDH 250μg s.c. 실험군에서 투여 후 2일 및 투여 후 7일에 유사한 GA 감소 효과를 보이는 것을 확인할 수 있다.
상기 데이터를 통해 확인할 수 있듯이, 글루타르산뇨증 동물모델에 GCDH를 투여한 결과 글루타르산 수치를 유효한 정도로 조절할 수 있었다. 해당 효과는 투여 후 일주일에 이르도록 유효하게 유지되었음을 알 수 있다.
이를 통해, 본 개시의 재조합 인간 글루타릴 CoA 탈수소효소(recombinant human Glutaryl-CoA dehydrogenase; rhGCDH)를 포함하는 약제학적 조성물이 뇌실에 직접 투여되지 않아도 통상적으로 사용되는 체내 투여 경로를 통해서 글루타르산 수치를 치료상 유의미하게 감소 및 유지시켜 글루타르산뇨증 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 개시가 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시의 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 개시의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 개시의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> NovaZyme Inc. <120> Composition for treating Glutaric aciduria and administrating method thereof <130> KC201014 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 438 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Ala Leu Arg Gly Val Ser Val Arg Leu Leu Ser Arg Gly Pro Gly 1 5 10 15 Leu His Val Leu Arg Thr Trp Val Ser Ser Ala Ala Gln Thr Glu Lys 20 25 30 Gly Gly Arg Thr Gln Ser Gln Leu Ala Lys Ser Ser Arg Pro Glu Phe 35 40 45 Asp Trp Gln Asp Pro Leu Val Leu Glu Glu Gln Leu Thr Thr Asp Glu 50 55 60 Ile Leu Ile Arg Asp Thr Phe Arg Thr Tyr Cys Gln Glu Arg Leu Met 65 70 75 80 Pro Arg Ile Leu Leu Ala Asn Arg Asn Glu Val Phe His Arg Glu Ile 85 90 95 Ile Ser Glu Met Gly Glu Leu Gly Val Leu Gly Pro Thr Ile Lys Gly 100 105 110 Tyr Gly Cys Ala Gly Val Ser Ser Val Ala Tyr Gly Leu Leu Ala Arg 115 120 125 Glu Leu Glu Arg Val Asp Ser Gly Tyr Arg Ser Ala Met Ser Val Gln 130 135 140 Ser Ser Leu Val Met His Pro Ile Tyr Ala Tyr Gly Ser Glu Glu Gln 145 150 155 160 Arg Gln Lys Tyr Leu Pro Gln Leu Ala Lys Gly Glu Leu Leu Gly Cys 165 170 175 Phe Gly Leu Thr Glu Pro Asn Ser Gly Ser Asp Pro Ser Ser Met Glu 180 185 190 Thr Arg Ala His Tyr Asn Ser Ser Asn Lys Ser Tyr Thr Leu Asn Gly 195 200 205 Thr Lys Thr Trp Ile Thr Asn Ser Pro Met Ala Asp Leu Phe Val Val 210 215 220 Trp Ala Arg Cys Glu Asp Gly Cys Ile Arg Gly Phe Leu Leu Glu Lys 225 230 235 240 Gly Met Arg Gly Leu Ser Ala Pro Arg Ile Gln Gly Lys Phe Ser Leu 245 250 255 Arg Ala Ser Ala Thr Gly Met Ile Ile Met Asp Gly Val Glu Val Pro 260 265 270 Glu Glu Asn Val Leu Pro Gly Ala Ser Ser Leu Gly Gly Pro Phe Gly 275 280 285 Cys Leu Asn Asn Ala Arg Tyr Gly Ile Ala Trp Gly Val Leu Gly Ala 290 295 300 Ser Glu Phe Cys Leu His Thr Ala Arg Gln Tyr Ala Leu Asp Arg Met 305 310 315 320 Gln Phe Gly Val Pro Leu Ala Arg Asn Gln Leu Ile Gln Lys Lys Leu 325 330 335 Ala Asp Met Leu Thr Glu Ile Thr Leu Gly Leu His Ala Cys Leu Gln 340 345 350 Leu Gly Arg Leu Lys Asp Gln Asp Lys Ala Ala Pro Glu Met Val Ser 355 360 365 Leu Leu Lys Arg Asn Asn Cys Gly Lys Ala Leu Asp Ile Ala Arg Gln 370 375 380 Ala Arg Asp Met Leu Gly Gly Asn Gly Ile Ser Asp Glu Tyr His Val 385 390 395 400 Ile Arg His Ala Met Asn Leu Glu Ala Val Asn Thr Tyr Glu Gly Thr 405 410 415 His Asp Ile His Ala Leu Ile Leu Gly Arg Ala Ile Thr Gly Ile Gln 420 425 430 Ala Phe Thr Ala Ser Lys 435 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 2 Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly 1 5 10 15 Ser Thr Gly

Claims (7)

  1. 재조합 인간 글루타릴-CoA 탈수소효소(recombinant human Glutaryl-CoA dehydrogenase; rhGCDH)를 포함하고, 정맥 내 투여 또는 피하 투여되는 것인 글루타르산뇨증 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 rhGCDH가 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 것인, 글루타르산뇨증 치료용 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 글루타르산뇨증은 글루타르산뇨증 제1형인 것인, 글루타르산뇨증 치료용 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 주1회, 월2회, 또는 월1회 투여되는 것인, 글루타르산뇨증 치료용 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 글루타르산뇨증을 위한 식이조절과 함께 투여되는, 글루타르산뇨증 치료용 약제학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 글루타르산뇨증을 위한 식이조절은 저단백 식이, 저-라이신 식이, 라이신 제거 식이, 아르기닌, 카르니틴, 클로피브레이트(clofibrate) 및/또는 리보플라빈 보충요법 또는 이의 조합인 것인, 글루타르산뇨증 치료용 약제학적 조성물.
  7. 삭제
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JP2005522517A (ja) * 2002-04-16 2005-07-28 敬也 小澤 組み換えアデノ随伴ウイルスビリオンを使用したアミノ酸代謝に関与する酵素を搬送するための組成物、およびそのようなアデノ随伴ウイルスビリオンを用いてアミノ酸代謝疾患を治療するための使用方法
WO2013133711A1 (en) 2012-03-09 2013-09-12 N.V. Nutricia Liquid nutritional composition comprising free amino acids

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