KR20240014075A

KR20240014075A - 척수성 근육 위축을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 제약 조성물 및 그의 투여 방법

Info

Publication number: KR20240014075A
Application number: KR1020237045063A
Authority: KR
Inventors: 진동규
Original assignee: 노벨파마 주식회사
Priority date: 2022-07-19
Filing date: 2023-07-19
Publication date: 2024-01-31
Also published as: US11890314B1; WO2024019533A1; US20240024406A1

Abstract

본 개시내용은 척수성 근육 위축 (SMA)을 치료, 예방 및/또는 개선시키기 위한 제약 조성물 및 그의 투여 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 실시양태에 따른 SMA를 치료, 예방 및/또는 개선시키기 위한 제약 조성물은 SMA의 발병의 원인인 SMN 단백질을 포함할 수 있다. 제약 조성물은 SMA를 앓고 있는 대상체에게 뇌실내, 척수강내 또는 대수조내 투여를 통해 직접 투여되어, SMA를 치료 또는 예방하거나 또는 SMA의 증상을 개선시킬 수 있다. 본 개시내용의 한 실시양태에 따른 SMA를 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 제약 조성물은 다른 이전에 승인된 약물과 비교하여 안전하고/거나 비용-효과적이고/거나 접근가능하고, 실질적으로 동등한 치료 효과를 달성할 수 있다.

Description

척수성 근육 위축을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 제약 조성물 및 그의 투여 방법

본 개시내용은 척수성 근육 위축을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 제약 조성물 및 그의 투여 방법에 관한 것이다.

척수성 근육 위축 (SMA)은 운동 뉴런 세포의 생존에 요구되는 생존 운동 뉴런 (SMN) 단백질의 수가 감소함에 따라 운동 뉴런 세포의 점진적 사멸에 의해 유발되는 유전적 신경변성 질환이다. SMA는 인간에서 SMN 단백질을 코딩하는 생존 운동 뉴런 1 (SMN1) 유전자 내의 돌연변이에 의해 유발된다. SMN2 유전자는 또한 SMN 단백질을 코딩하지만, SMN1 유전자와 비교하여 SMN2 유전자의 단일 뉴클레오티드 다형성은 스플라이싱 조절제의 결합을 파괴하고, 효율적으로 올리고머화될 수 없으며 급속하게 분해되는 말단절단된 불안정한 단백질을 생성한다. SMA는 종종 영아기 또는 유아기에 진단되고, 치료되지 않는 경우, 호흡 근육의 약화에 의해 유발되는 호흡곤란으로 인해 2세 전에 결국 사망에 이르게 된다. SMA는 조기-발병의 상염색체 열성 질환으로, 신생아 6,000 내지 10,000명 중 1명의 높은 유병률 (35명 중 대략 1명의 보유자 빈도)을 갖고, 미국에서 영아 사망률의 가장 흔한 유전적 원인이자 소아 이환율의 주요 원인이다.

SMA는 일반적으로 근위 사지 근육에서 우세한 근육 약화 및 위축을 특징으로 하고, 발병 연령 및 운동 능력에 따라 4가지 주요 유형으로 분류되는 다양한 표현형을 나타낸다. 모든 SMA의 대략 50-60%를 차지하는 I형 SMA (영아-발병 SMA 또는 베르드니히-호프만병)는 출생 시 또는 출생 후 6개월 이내에 발생하는 가장 중증인 형태의 질환이고, 치료되지 않은 영아의 기대 수명은 2년 미만이다. I형 SMA 환자는 일반적으로 앉거나 걸을 수 없다. 후기-발병 SMA는 II형 SMA 및 III형 SMA (쿠겔베르그-벨란더병)로 카테고리화될 수 있다. II형 SMA는 통상적으로 생후 6개월 후 18개월 전에 진단되고, 중간 중증도를 나타낸다. II형 SMA 환자는 앉을 수 있지만, 스스로 서거나 걸을 수 없고, 치료되지 않는 경우, 대략 6-7세에 사망할 것으로 예상된다. III형 SMA 환자는 전형적으로 생후 18개월 후에 그의 증상을 나타낸다. 이들 환자는 독립적으로 걸을 수 있지만, 종종 척추측만증이 발생할 수 있고, 보행 능력을 잃을 경우, 환자는 비만 또는 골다공증이 발생할 수 있다. 성인-발병 또는 IV형 SMA는 18세 이후에 발생하고, 통상적으로 경도 운동 장애를 유발한다. IV형 환자는 걸을 수 있지만, 척추측만증 또는 관절 강직과 같은 합병증을 가질 수 있고/거나 30세 이후에 근육 약화를 나타낼 수 있다. IV형 환자는 정상 기대 수명을 갖는다.

SMA를 치료하는 다양한 방법, 예컨대 SMN 단백질을 발현하는 바이러스 벡터를 체내로 투여하는 것 (유전자 요법), SMN2 스플라이스 조절인자로서 작용하는 신규 화합물을 투여하는 것, 또는 SMN2 mRNA의 스플라이싱을 조절하여 체내에서 SMN 단백질의 생산을 증가시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것 (RNA 주사)이 시도되었다. 그러나, 바이러스 벡터를 사용하여 외래 유전자를 도입하는 방법은 아직 충분한 안전성을 확립하지 못했다. 추가로, 스플라이싱 기구를 표적화하는 약물이 다른 전사체에 영향을 미쳐 미지의 오프-타겟 부작용을 유발할 수 있고, 세포 분열에 영향을 미쳐 종양원성 부작용을 유발할 수 있다. 추가로, RNA 주사 또는 유전자 요법은 이들 치료가 부분적으로는 높은 비용으로 인해 많은 환자에 대해 널리 이용가능하지 않기 때문에 제한을 갖는다. 따라서, 보다 안전하고 보다 비용-효율적인 방식으로 SMA를 효과적으로 치료, 예방 또는 개선시킬 수 있는 조성물 및 방법을 개발하는 것이 관련 기술분야에 필요하다.

본 개시내용은 척수성 근육 위축 (SMA)을 치료, 예방 및/또는 개선시키기 위한 제약 조성물 및 그의 투여 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 실시양태에 따른 SMA를 치료, 예방 및/또는 개선시키기 위한 제약 조성물은 SMA의 발병의 원인인 SMN 단백질을 포함할 수 있다. 제약 조성물은 SMA를 앓고 있는 대상체에게 뇌실내, 척수강내 또는 대수조내 투여를 통해 직접 투여되어, SMA를 치료 또는 예방하거나 SMA의 증상을 개선시킬 수 있다.

본 개시내용은 SMA 또는 그의 증상 중 적어도 1종을 치료, 예방 및/또는 개선시키기 위한 제약 조성물에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 SMN 단백질 또는 재조합 SMN 단백질을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 뇌실내 (ICV) 주사, 척수강내 (IT) 주사, 대수조내 (ICM) 투여, 실질내 주사, 뇌내 (IC) 주사, 정맥내 (IV) 주사 또는 그의 조합을 통해 투여되도록 구성될 수 있다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 ICV 주사와 IV 주사의 조합을 통해 투여되도록 구성될 수 있다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 SMA를 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 다른 이전에 승인된 약물 또는 제약 조성물과 비교하여 안전하고/거나 비용-효과적이고/거나 접근가능할 수 있으면서, 실질적으로 동등한 치료 효과를 달성할 수 있다.

본 개시내용은 SMA 또는 그의 증상 중 적어도 1종의 치료, 예방 및/또는 개선에 사용하기 위한 SMN 단백질 또는 재조합 SMN 단백질을 제공한다. 한 실시양태에서, SMN 단백질 또는 재조합 SMN 단백질은 ICV, IT, ICM, 실질내, IC, IV 또는 그의 조합으로 투여되도록 구성될 수 있다. 한 실시양태에서, SMN 단백질 또는 재조합 SMN 단백질은 SMA를 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 이전에 승인된 약물 또는 제약 조성물과 비교하여 안전하고/거나 비용-효과적이고/거나 접근가능할 수 있으면서, 실질적으로 동등한 치료 효과를 달성할 수 있다.

본 개시내용은 SMA 또는 그의 증상 중 적어도 1종을 치료, 예방 및/또는 개선시키는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 한 실시양태에서, 방법은 SMA를 갖는 환자에게 SMN 단백질 또는 재조합 SMN 단백질을 포함하는 제약 조성물을 ICV, IT, ICM, 실질내, IC, IV 투여 또는 주사 또는 그의 조합을 통해 투여, 전달 또는 공급하는 단계를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 방법은 SMA를 치료 또는 예방하거나 또는 SMA를 갖는 환자에서 증상을 개선시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 방법은 SMA를 치료하기 위한 다른 이전에 승인된 약물 또는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 SMA의 치료, 예방 또는 개선 방법보다 환자에게 더 안전하고/거나 더 비용-효과적이고/거나 접근가능할 수 있으면서, 실질적으로 동등한 치료 효과를 달성할 수 있다. 본 개시내용의 한 실시양태에 따르면, 방법이 SMA를 갖는 환자에 대한 현재 이용가능한 치료보다 더 일찍 그의 치료 효과를 나타내기 때문에, 방법은 SMA를 갖는 환자에 대한 현재 이용가능한 치료에 대한 초기 보조 치료로서 또는 조기-발병 SMA를 갖는 환자에 대한 치료로서 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 SMA를 치료, 예방 또는 개선시키는 방법으로서, 이는 SMA를 갖는 환자에게 SMN 단백질을 포함하는 제약 조성물의 치료 유효량을 ICV 투여, IT 투여, ICM 투여, 실질내 주사, IC 주사, 정맥내 IV 주사 또는 그의 조합을 통해 투여하는 것을 포함하며, 여기서 치료 유효량의 제약 조성물의 투여 후에, SMA의 적어도 1종의 증상의 강도, 중증도 또는 빈도가 감소되거나 또는 그의 발병이 지연되는 것인 방법에 관한 것일 수 있다.

한 측면에서, SMN 단백질은 인간 SMN1 유전자에 의해 코딩될 수 있다.

한 측면에서, SMN 단백질은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

한 측면에서, SMN 단백질은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

한 측면에서, SMN 단백질은 재조합 인간 SMN 단백질일 수 있다.

한 측면에서, SMA를 갖는 환자는 SMA I형, SMA II형, SMA III형 또는 SMA IV형을 갖는 환자일 수 있다.

한 측면에서, SMA를 갖는 환자에게 치료 유효량의 제약 조성물을 투여하는 것은 SMA를 갖는 환자에게 치료 유효량의 제약 조성물을 1주 1회, 2주마다 1회, 1개월 2회 또는 1개월 1회 투여하는 것을 포함할 수 있다.

한 측면에서, ICV 투여는 SMA를 갖는 환자에게 하나 이상의 뇌실에 치료 유효량의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.

한 측면에서, ICV 투여는 SMA를 갖는 환자에게 저장소 및 저장소에 연결된 카테터를 포함하는 뇌실내 카테터 시스템을 통해 치료 유효량의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.

한 측면에서, SMA를 갖는 환자에게 치료 유효량의 제약 조성물을 투여하는 것은 SMA를 갖는 환자에게 제약 조성물을 약 0.0001 mg/kg 내지 약 150 mg/kg의 용량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.

한 측면에서, 제약 조성물은 스핀라자(SPINRAZA)®와 조합되어 투여된다.

한 측면에서, SMN 단백질은 SMN 단백질을 세포에 표적화하기 위한 기능적 부분을 추가로 포함하지 않을 수 있다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 척수성 근육 위축을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 제약 조성물로서, 이는 SMN 단백질을 포함하며, 여기서 제약 조성물은 ICV 투여, IT 투여, ICM 투여, 실질내 주사, IC 주사, IV 주사 또는 그의 조합을 통해 투여되는 것인 제약 조성물에 관한 것일 수 있다.

한 측면에서, SMN 단백질은 인간 SMN1 유전자에 의해 코딩된다.

한 측면에서, SMN 단백질은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

한 측면에서, 제약 조성물은 1주 1회, 2주마다 1회, 1개월 2회 또는 1개월 1회 투여될 수 있다.

한 측면에서, ICV 투여는 하나 이상의 뇌실에 제약 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.

한 측면에서, ICV 투여는 저장소 및 저장소에 연결된 카테터를 포함하는 뇌실내 카테터 시스템을 통해 투여하는 것을 포함할 수 있다.

한 측면에서, SMN 단백질은 약 0.0001 mg/kg 내지 약 150 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.

한 측면에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

한 측면에서, 제약 조성물은 스핀라자®와 조합되어 투여될 수 있다.

본 개시내용의 한 실시양태에 따른 SMA를 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 제약 조성물은 다른 이전에 승인된 약물과 비교하여 안전하고/거나 비용-효과적이고/거나 접근가능하고, 실질적으로 동등한 치료 효과를 달성할 수 있다.

도 1은 인큐베이션 제6일에 재조합 인간 SMN (rhSMN) 단백질을 발현하는 293F 세포의 세포 배양 상층액의 웨스턴 블롯 결과를 보여준다.
도 2는 단백질 A 수지로 정제된 rhSMN 단백질의 SDS-PAGE 결과 (10% 겔)를 보여준다.
도 3은 트리판 블루가 ICV 투여된 후 시간 경과에 따라 SMA를 앓고 있는 마우스의 뇌로 전달 및 분포된 사진을 보여준다. 보다 구체적으로, 도 3은 (A) 트리판 블루의 ICV 투여 직후, (B) 투여 15분 후 및 (C) 투여 24시간 후의 마우스 뇌를 보여준다.
도 4는 시간 경과 (즉, 생후 일수)에 따른 SMA를 갖는 마우스의 꼬리 길이의 변화의 측정 결과를 보여준다. 보다 구체적으로, 도 2는 담체, 누시너센(Nusinersen) 및 rhSMN 단백질로 치료된 SMA 마우스의 꼬리 길이의 변화를 시간 경과 (출생 후 일수)에 따라 예시한다.
도 5는 SMA 마우스에서의 귀 괴사 발생의 시기 (주령)를 보여준다. 보다 구체적으로, 도 5는 담체, 누시너센 및 rhSMN 단백질로 치료된 SMA 마우스에서의 귀 괴사의 시기 (주령)를 예시한다.
도 6은 시간 경과 (주령)에 따른 SMA 마우스에서의 귀 괴사의 사진을 보여준다. 보다 구체적으로, 도 6은 7 및 9주령에서 담체, 누시너센 및 rhSMN 단백질로 치료된 SMA 마우스에서의 귀 괴사를 예시한다.

본 개시내용의 다양한 실시양태 또는 실시예는 본 출원을 예시 및/또는 설명하려는 목적을 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 개시내용은 본 출원에 기재된 각각의 실시양태 또는 실시예의 다양한 변형, 등가물 및/또는 대안 및/또는 본 출원에 기재된 각각의 실시양태 또는 실시예의 모두 또는 일부의 임의의 가능한 조합을 포함한다. 본 개시내용의 권리의 범주는 하기 제시된 다양한 실시양태 또는 실시예 또는 실시양태 또는 실시예의 구체적 설명에 제한되지 않는다.

본 출원에 사용된 모든 기술 과학 용어는, 달리 정의되지 않는 한, 일반적으로 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 통상의 의미를 갖는다. 본 출원에 사용된 모든 용어는 본 개시내용을 기재 및/또는 설명하기 위한 목적으로 선택되고, 본 개시내용 하의 권리의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 개시내용의 조성물 및 방법을 기재 및/또는 설명하는 데 있어서 추가의 지침을 제공하기 위해 특정 용어가 본 출원에서 논의된다.

정의

본 개시내용에서 사용될 때마다, 단수 형태 및 단수 단어는 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수 지시대상을 포함하고, 이는 청구범위에 제시된 단수 형태 및 단어에 적용될 것이다. 예를 들어, "화합물"은 복수의 이러한 화합물을 포함하고, "화합물 A"는 복수의 화합물 A를 포함한다.

용어 "및/또는"은 이 용어와 연관된 항목 중 어느 하나 이상, 항목의 임의의 조합 또는 항목 모두를 의미한다. 용어 "함유하는", "함유하다", "함유한다", "포함한", "포함하다", "포함한다", "갖는", "갖다", "갖는다", "가진" 또는 그의 변형은 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포함적인 것으로 해석된다.

본 출원에서 언급된 모든 범위는 임의의 및 모든 가능한 하위범위 및 그의 하위범위의 조합을 포함할 수 있다. 언급된 범위는 범위 내의 각각의 구체적 값, 정수 또는 소수를 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 임의의 언급된 범위가 그의 하위범위를 충분히 기재하고/거나 가능하게 하며, 언급된 범위의 동등한 1/2, 1/3, 1/4, 1/5 또는 1/10을 포함하고 이에 제한되지는 않는다는 것을 용이하게 이해할 수 있다.

용어 "보다 큰", "초과", "적어도", "이상", "미만", "이하" 등은 언급된 수를 포함하고, 이러한 용어는 상기 논의된 바와 같은 하위범위로 분해될 수 있는 범위를 지칭한다. 범위에 대해 언급된 구체적 값은 단지 예시 목적을 위한 것이고, 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 이들은 범위 내의 다른 값을 배제하지 않는다.

달리 나타내지 않는 한, 용어 "약" 및 "대략"은 일반적으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 바와 같이, 언급된 범위에 근접한 값 또는 허용되는 오차 정도 내의 값을 포함한다. 허용되는 오차 정도는 측정의 성질 또는 정확도를 고려하여 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 허용되는 오차 정도는 조성물 또는 방법 또는 실시양태의 기능성의 관점에서 등가물에 기초하여 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시내용에 제시된 수치 값 또는 범위의 문맥에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 제공된 값의 ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±9%, ±8%, ±7%, ±6%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2% 또는 ±1%의 변동을 지칭할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 특히 생물학적 시스템에서, 용어 "약" 및 "대략"은 주어진 값의 한 자릿수 이내, 9배, 8배, 7배, 6배, 5배, 4배, 3배 또는 2배 이내인 값을 의미할 수 있다. 본 출원에 제공된 모든 수치 양은 달리 언급되지 않는 한 근사치이다. 추가로, 이들 양은 본질적으로 그의 측정으로부터 필수적으로 발생하는 가변성을 함유한다.

본 개시내용에서, 용어 "제약 조성물"은 조성물에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 제약 제제의 형태를 지칭할 수 있다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 환자에게 투여될 수 있는 1종 이상의 활성 성분을 포함하는 조성물이고 허용되지 않는 독성 성분을 추가로 포함하지 않는다.

본 개시내용에서, 용어 "제약상 허용되는"은 일반적으로 안전하고, 비-독성이며, 생물학적으로 또는 달리 바람직한 제약 조성물의 제조에 유용하고, 인간 제약 용도 및/또는 수의학적 용도에 허용되는 물질의 특성을 지칭할 수 있다. 한 실시양태에서, 용어 "제약상 허용되는"은 정부 규제 기관에 의해 승인되거나 승인가능하거나 또는 인간 및/또는 동물에서의 사용에 대해 일반적으로 인정된 약전에 열거된 것을 의미한다.

본 개시내용에서, 용어 "제약상 허용되는 부형제"는 치료 활성이 아니고 (불활성) 비-독성인 임의의 성분을 지칭한다. 한 실시양태에서, 제약상 허용되는 부형제는, 예를 들어 제약 제품의 제제화에 사용되도록 구성된 결합제, 충전제, 용매, 완충제, 장성 작용제, 안정화제, 항산화제, 계면활성제 또는 윤활제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 활성 성분 이외의 다른 제약 조성물의 성분으로, 대상체에게 비-독성인 성분을 지칭한다. 한 실시양태에서, 약리학상 허용되는 담체는, 예를 들어 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

본 개시내용에서, 제약 조성물의 용어 "제약 유효 용량", "제약 유효량", "투여 용량", "투여량", "치료 유효 용량", "치료 유효량", "유효 투여량" 또는 "유효량"은 치료 반응 또는 효과, 목적하는 국부 또는 전신 치료 결과 또는 목적하는 예방 결과를 달성하기에 충분한 (요구되는 지속기간 동안 투여될) 제약 조성물의 양을 지칭할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 용어는 대상체에게 투여되는 경우에, (i) 본원에 기재된 질환, 상태 또는 장애 (예를 들어, SMA)를 치료 또는 예방하거나, (ii) 그의 1종 이상의 증상을 완화, 감소, 중단, 약화, 개선 또는 제거하거나, 또는 (iii) 그의 1종 이상의 증상의 발병을 예방 또는 지연시키는 제약 조성물의 양을 지칭한다.

본 개시내용에서, 용어 "대상체"는 포유동물을 지칭한다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 대상체는 인간일 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체는 SMA를 갖는 인간일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 2개의 염색체 상의 SMN1 유전자의 불활성화 돌연변이 또는 결실에 의해 유발되어 SMN1 유전자 기능의 손실을 초래하는 SMA를 앓고 있는 인간일 수 있다.

본 개시내용에서, 용어 "척수성 근육 위축" (SMA)은 2개의 염색체 상의 SMN1 유전자의 불활성화 돌연변이 또는 결실에 의해 유발되어 SMN1 유전자 기능의 손실을 초래하는 질환에 관한 것이다. SMA의 증상은 근육 약화, 불량한 근긴장도, 약한 울음, 약한 기침, 기운이 없거나 쓰러지는 경향, 빨기 또는 삼키기 어려움, 호흡 곤란, 폐 또는 인후 내 분비물의 축적, 땀에 젖은 손으로 꽉 쥔 주먹, 혀의 움직거림/진동, 심지어 누워있는 경우에도 한 측면으로 종종 기울어지는 머리, 팔보다 더 약해지는 경향이 있는 다리, 빈번하게 "개구리 다리" 위치를 취하는 다리, 섭식 곤란, 호흡기도 감염에 대한 증가된 감수성, 장/방광 약화, 정상보다 낮은 체중, 지지 없이 앉을 수 없음, 보행 실패, 기어가기 실패, 및 저긴장증, 무반사, 및 전각 세포의 손실과 연관된 다중 선천성 구축 (관절만곡증)을 포함할 수 있다.

본 개시내용에서, 용어 "척수성 근육 위축 (SMA)을 치료하는 것" 또는 "척수성 근육 위축 (SMA)의 치료"는 하기 효과 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) SMA의 중증도의 감소 또는 개선; (ii) SMA의 발병의 지연; (iii) SMA의 진행의 억제; (iv) 대상체의 입원의 감소; (v) 대상체의 입원 기간의 감소; (vi) 대상체의 생존의 증가; (vii) 대상체의 삶의 질의 개선; (viii) SMA와 연관된 증상의 수의 감소; (ix) SMA와 연관된 1종 이상의 증상의 중증도의 감소 또는 개선; (x) SMA와 연관된 증상의 지속기간의 감소; (xi) SMA와 연관된 증상의 재발의 예방; (xii) SMA의 증상의 발생 또는 발병의 억제; 및/또는 (xiii) SMA와 연관된 증상의 진행의 억제.

본 개시내용에서, "SMA를 치료하는 것" 또는 "SMA의 치료"는 하기 유익한 효과 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: (i) 근육 강도 손실의 감소; (ii) 근육 강도의 증가; (iii) 근육 위축의 감소; (iv) 운동 기능 손실의 감소; (v) 운동 뉴런의 증가; (vi) 운동 뉴런 손실의 감소; (vii) SMN 결핍 운동 뉴런의 변성으로부터의 보호; (viii) 운동 기능의 증가; (ix) 폐 기능의 증가; 및/또는 (x) 폐 기능 손실의 감소.

본 개시내용에서, "SMA를 치료하는 것" 또는 "SMA의 치료"는 (i) 인간 영아 또는 인간 유아가 도움 없이 앉을 수 있는 기능적 능력 또는 이러한 기능적 능력의 유지 또는 (ii) 인간 영아, 인간 유아, 인간 소아 또는 인간 성인이 도움 없이 서거나, 도움 없이 걷거나, 도움 없이 달리거나, 도움 없이 호흡하거나, 도움 없이 수면 동안 몸을 돌리거나 또는 도움 없이 삼킬 수 있는 기능적 능력 또는 이러한 기능적 능력의 유지를 지칭한다.

용어 질환 상태의 "예방" 또는 질환 상태를 "예방하는 것"은 질환, 상태 또는 장애를 획득할 위험의 감소, 또는 질환에 노출되거나 질환에 대한 소인이 있을 수 있지만 아직 질환의 증상을 경험하거나 나타내지는 않는 대상체에서 질환의 임상 증상 중 적어도 1종이 발생하지 않도록 하는 것을 지칭할 수 있다.

본 개시내용의 한 실시양태에서, 용어 "재조합 인간 SMN 단백질" 또는 "rhSMN 단백질"은 유전자 재조합 기술을 통해 인간 SMN 단백질을 발현시킴으로써 수득된 단백질 발현 산물을 지칭할 수 있다. 한 실시양태에서, 용어 "재조합 인간 SMN 단백질" 또는 "rhSMN 단백질"은 재조합 수단 또는 유전자 재조합 기술에 의해 생산, 발현 또는 단리된 인간 SMN 단백질을 지칭할 수 있다.

생존 운동 뉴런 (SMN) 단백질

SMN 단백질 및 SMN 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 정보는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 본 개시내용은 SMN 단백질로 제한되는 것이 아니라, 본원에 기재된 SMN 단백질의 하나 이상의 활성을 갖는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 한 실시양태에서, SMN 단백질은 NCBI 수탁 번호 NP_000335.1의 서열 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_000335.1)에 기초한 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, SMN 단백질은 NCBI 수탁 번호 NM_000344.4의 서열 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000344)에 기초한 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.

한 실시양태에서, SMN 단백질은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, SMN 단백질은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 대해 상동성을 갖고 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 활성과 동일하거나 또는 실질적으로 동일하거나 또는 그에 상응하는 활성을 갖는 임의의 단백질 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, SMN 단백질은 1개 이상의 아미노산의 결실, 변형, 치환 또는 부가를 갖는 임의의 아미노산 서열을 포함할 수 있되, 단 아미노산 서열이 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 대해 상동성을 갖고/거나 아미노산 서열이 SMN 단백질의 하나 이상의 활성을 갖고/거나 이러한 변형, 치환 또는 부가가 SMN 단백질의 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는 한 그러하다. 예를 들어, 단백질의 발현 및 추출 과정의 최적화 및/또는 편의를 위해 1개 이상의 아미노산이 결실, 변형, 치환 또는 부가될 수 있다. 보다 구체적으로, SMN 단백질은, 예를 들어 서열식별번호: 2의 Fc 영역 (이뮤노글로불린 감마-1 중쇄의 힌지, CH2 영역 및 CH3 영역)을 포함함으로써 추가로 변형될 수 있다. 본 개시내용의 한 실시양태에서, SMN 단백질은 숙주 세포 (예를 들어, 293F 세포)에서 SMN 단백질의 발현 및 수율을 증진시키기 위해, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열의 N 말단 근처에 서열식별번호: 3의 신호 아미노산 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열의 C 말단 근처에 서열식별번호: 2의 Fc 영역을 부가함으로써 발현될 수 있다. 본 개시내용의 한 실시양태에서, SMN 단백질은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 본 개시내용의 한 실시양태에서, SMN 단백질은, 예를 들어 수용체-매개 세포내이입을 통해 SMN 단백질을 세포 (예를 들어, 뉴런)에 전달 또는 표적화하기 위한 기능적 부분 (예를 들어, 단백질 또는 폴리펩티드)을 추가로 포함하지 않을 수 있다. 본 개시내용의 SMN 단백질이 SMN 단백질을 세포에 표적화하기 위한 기능적 부분을 포함하지 않을 수 있지만, 본 개시내용의 제약 조성물, SMN 단백질 또는 재조합 SMN 단백질 또는 방법은, 본 개시내용의 SMN 단백질이 뇌실내 (ICV) 투여, 척수강내 (IT) 투여, 대수조내 (ICM) 투여, 실질내 주사, 뇌내 (IC) 주사, 정맥내 (IV) 주사 또는 그의 조합을 통해 환자에게 투여되는 경우에, SMA를 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 다른 이전에 승인된 약물의 치료 효과와 실질적으로 동등한 치료 효과를 달성할 수 있다.

본 개시내용에서, "상동성"은 단백질을 코딩하는 유전자의 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 있어서, 특정 비교 영역에서 2개의 서열이 가능한 한 많이 매칭되도록 정렬한 후 2개의 서열 사이의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일성 정도를 지칭할 수 있다. 2개의 유전자 사이의 상동성이 충분히 높은 경우에, 2개의 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 상기 서열 동일성의 백분율 (%)은 공개적으로 공지된 서열 비교 프로그램 (예를 들어, Blast (NCBI))을 사용하여 결정될 수 있다.

본 출원의 한 실시양태에서, SMN 단백질은 본 개시내용이 속하는 기술분야에 공지된 방법에 의해 발현되고 생산될 수 있다. 본 개시내용에 기재된 단백질의 발현 및 생산에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 바와 같은 척추동물 숙주 세포 및 진핵 세포를 포함한다. 배양 배지에서의 척추동물 세포의 증식은 상용적 기술이 되었다. 포유동물 숙주 세포주의 예는 원숭이 신장 세포 (CV1), SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 (COS-7), 인간 배아 신장 세포 (293 세포), 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK), 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO), 마우스 세르톨리 세포 (TM4), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76), 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA), 개 신장 세포 (MDCK), 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A), 인간 폐 세포 (W138), 인간 간세포 (Hep G2), 마우스 유방 종양 (MMT 060562), TRI 세포, MRC 5 세포 및 FS4 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

한 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, Ham F10 배지, 최소 필수 배지 (MEM), RPMI-1640, 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) 및 본 개시내용이 속하는 기술분야에서 사용되는 임의의 다른 배지를 포함하고 이에 제한되지는 않는 상업적으로 입수가능한 배지가 숙주 세포 배양에 사용될 수 있다. 임의의 이들 배지에는 필요하다면 1종 이상의 호르몬 및/또는 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 1종 이상의 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 또는 포스페이트), 1종 이상의 완충제 (예를 들어, HEPES), 1종 이상의 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 1종 이상의 항생제 (예를 들어, 겐타마이신(Gentamycin)™), 1종 이상의 미량 원소, 글루코스 및/또는 1종 이상의 동등한 에너지원이 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수/보조 보충제가 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 예를 들어, 온도, pH 및 CO₂ 농도를 포함하고 이에 제한되지는 않는 다른 배양 조건은 단백질 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 관련하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 적합한 조건으로 설정될 수 있다.

한 실시양태에서, SMN 단백질은 제약 조성물 중에, 비제한적으로, 약 0.001 내지 약 500 mg/ml의 농도로, 약 0.01 내지 약 400 mg/ml의 농도로, 약 0.1 mg 내지 약 300 mg/ml의 농도로, 약 1 mg 내지 약 200 mg/ml의 농도로, 약 1 mg 내지 약 100 mg/ml의 농도로, 약 5 mg 내지 약 70 mg/ml의 농도로, 약 5 mg 내지 약 50 mg/ml의 농도로, 약 10 mg 내지 약 50 mg/ml의 농도로, 약 10 mg 내지 약 30 mg/ml의 농도로 또는 약 10 mg 내지 약 20 mg/ml의 농도로 포함될 수 있다. 한 실시양태에서, SMN 단백질은 제약 조성물 중에, 비제한적으로, 약 0.001 mg/ml, 약 0.01 mg/ml, 약 0.1 mg/ml, 약 1 mg/ml, 약 2 mg/ml, 약 3 mg/ml, 약 4 mg/ml, 약 5 mg/ml, 약 6 mg/ml, 약 7 mg/ml, 약 8 mg/ml, 약 9 mg/ml, 약 10 mg/ml, 약 12 mg/ml, 약 14 mg/ml, 약 15 mg/ml, 약 20 mg/ml, 약 25 mg/ml, 약 30 mg/ml, 약 35 mg/ml, 약 40 mg/ml, 약 45 mg/ml, 약 50 mg/ml, 약 60 mg/ml, 약 70 mg/ml, 약 80 mg/ml, 약 90 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 200 mg/ml, 약 300 mg/ml, 약 400 mg/ml 또는 약 500 mg/ml (이들 수치 사이의 임의의 값 포함)의 농도로 포함될 수 있다.

제약 조성물 및 SMA의 치료

본 개시내용의 한 실시양태에서, SMN 단백질을 포함하는 제약 조성물은 의료 및 임상 실시와 일치하는 방식으로 제제화되고 투여될 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 인자는 치료될 질환, 치료될 특정 동물, 개별 대상체의 임상 상태, 질환의 원인, 물질의 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획 및 임상의에게 공지된 다른 인자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 제약 조성물의 제제는 액체 제제 또는 동결 건조 분말 제제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물은 앰플, 바이알, 병, 카트리지, 저장소, 리오-젝트(Lyo-Ject)® 또는 사전-충전 시린지의 형태로 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 단일 투여 형태 또는 다중 투여 형태로 제조될 수 있다.

대상체에게 투여되는 SMN 단백질의 용어 "제약 유효 용량", "제약 유효량", "투여 용량", "투여량", "치료 유효 용량", "치료 유효량", "유효 용량" 및/또는 "유효량"은 특정한 질환 (예를 들어, SMA)의 예방, 개선 또는 치료에 요구되는 최소의 양을 지칭하고, 상기 기재된 고려사항에 의해 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, SMN 단백질의 용어 "제약 유효 용량", "제약 유효량", "투여 용량", "투여량", "치료 유효 용량", "치료 유효량", "유효 용량" 및/또는 "유효량"은, 예를 들어 용량당 약 0.0001 mg/kg 내지 약 150 mg/kg, 용량당 약 0.001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 용량당 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 용량당 약 0.05 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 용량당 약 0.1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg 또는 용량당 약 1 mg/kg 내지 약 15 mg/kg일 수 있으나 이에 제한되지는 않거나; 또는 용량당 약 0.001 mg/kg, 용량당 약 0.01 mg/kg, 용량당 약 0.05 mg/kg, 용량당 약 0.1 mg/kg, 용량당 약 0.5 mg/kg, 용량당 약 1 mg/kg, 용량당 약 5 mg/kg, 용량당 약 10 mg/kg, 용량당 약 15 mg/kg, 용량당 약 20 mg/kg, 용량당 약 25 mg/kg, 용량당 약 30 mg/kg, 용량당 약 35 mg/kg, 용량당 약 40 mg/kg, 용량당 약 45 mg/kg, 용량당 약 50 mg/kg, 용량당 약 55 mg/kg, 용량당 약 60 mg/kg, 용량당 약 70 mg/kg, 용량당 약 80 mg/kg, 용량당 약 90 mg/kg, 용량당 약 100 mg/kg 또는 용량당 약 150 mg/kg (이들 수치 사이의 임의의 값 포함)일 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 제약 조성물은 단일 용량 중 SMN 단백질 약 0.001 mg, 약 0.01 mg, 약 0.05 mg, 약 0.1 mg, 약 0.5 mg, 약 1 mg, 약 5 mg, 약 10 mg, 약 15 mg, 약 30 mg, 약 50 mg, 약 100 mg, 약 200 mg, 약 300 mg, 약 400 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 약 700 mg, 약 800 mg, 약 900 mg 또는 약 1000 mg (이들 수치 사이의 임의의 값 포함)을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 제약 조성물은 경험이 있는 임상 진료의의 판단에 따라 주기적으로 (예를 들어, 1일 1회, 1주 3회, 1주 2회, 1주 1회, 2주마다 1회, 1개월 3회, 1개월 2회 또는 1개월 1회를 포함하나 이에 제한되지는 않음) 투여될 수 있고, 예를 들어 질환의 급성 진행을 포함하나 이에 제한되지는 않는 상황에서 비-주기적으로 투여될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물은 1종 이상의 기존 SMA 요법과 조합되어 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 제약 조성물은 승인된 약물인 스핀라자®, 졸겐스마(ZOLGENSMA)® 및/또는 에브리스디(EVRYSDI)®와 조합되어 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 조합은 동시 투여로서 제공되며, 여기서 SMN 단백질 및 적어도 1종의 승인된 약물은 동일한 조성물로 함께 투여되거나 또는 상이한 조성물로 동시에 투여된다. 한 실시양태에서, 조합은 개별 투여로서 제공되며, 여기서 SMN 단백질의 투여는 적어도 1종의 승인된 약물의 투여 전에, 그와 동시에 및/또는 그 후에 일어날 수 있다. 순차적 투여 사이의 간격은 적어도 수분, 수시간 또는 수일 (또는 대안적으로, 그 미만)의 기간일 수 있다.

본 출원의 한 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 방법을 사용하여, 예를 들어 목적하는 정도의 순도를 갖는 SMN 단백질을 제약상 또는 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 허용되는 담체는, 예를 들어 염수 또는 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산; 저분자량 폴리펩티드 (약 10개 미만의 아미노산 잔기를 포함함); 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예를 들어 나트륨; 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 PEG를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

한 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물은 제약상 허용되는 염을 대략 생리학적 농도로 함유할 수 있다. 임의로, 본 개시내용의 한 실시양태에 따른 제약 조성물의 제제는 제약상 허용되는 보존제를 함유할 수 있다. 구체적으로, 한 실시양태에서, 보존제 농도는 약 0.1% 내지 약 2.0% (전형적으로 v/v)일 수 있다. 한 실시양태에서, 보존제는 제약 산업에 일반적으로 공지된 보존제일 수 있고, 구체적으로 보존제는, 예를 들어 벤질 알콜, 페놀, m-크레졸, 메틸파라벤, 프로필파라벤 또는 그의 임의의 조합일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 계면활성제를 함유할 수 있다. 구체적으로, 한 실시양태에서, 계면활성제 농도는 약 0.005% 내지 약 0.02%일 수 있다.

본 개시내용의 한 실시양태에서, SMN 단백질 또는 그를 포함하는 제약 조성물은 ICV, IT, ICM, 실질내, IC, IV 투여 또는 그의 조합을 통해 대상체에게 투여될 수 있다. ICV, IT, ICM, 실질내, IC 또는 IV 투여를 위해, 본 개시내용의 관련 기술분야에 일반적으로 공지된 1종 이상의 방법이 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, SMN 단백질 또는 그를 포함하는 제약 조성물의 투여는 저장소 및 저장소에 연결된 카테터를 포함하는 뇌실내 카테터 시스템을 통해 수행될 수 있다. 하기 실시예에서는, 제약 조성물을 마우스에게 투여하였으므로, 별도의 입체정위 장치 및 입체정위 좌표계가 요구되었다. 그러나, 임상 적용에서는, 뇌실내 카테터 시스템을 통해 본 개시내용의 SMN 단백질 또는 제약 조성물을 투여할 수 있다.

한 실시양태에서, 제약 조성물의 투여는 1) 카테터 시스템을 외과적으로 삽입하는 단계로서, 여기서 저장소는 대상체의 두피 아래에 위치하고, 여기서 카테터의 단부는 대상체의 뇌실 (예를 들어, 측뇌실) 내에 위치하여 뇌실 중 어느 하나의 내부 공간이 카테터의 내부 공간을 통해 저장소의 내부 공간과 연결되도록 하며, 여기서 뇌척수액은 뇌실로부터 저장소 내로 흘러들어가 저장소를 채우는 것인 단계; 2) 저장소로부터 약 0.1 내지 약 5 ml의 뇌척수액을 약 0.1 내지 약 60 ml/분의 속도로 빼내는 단계; 3) 저장소 내로 약 0.1 내지 약 5 ml의 제약 조성물을 약 0.1 내지 약 60 ml/분의 속도로 주사하는 단계; 및 4) 제약 조성물이 카테터를 통해 저장소로부터 뇌실 내로 흘러들어가도록 하는 단계를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 ICV 투여를 위해 이식되는 저장소 및 카테터가 구비된 뇌실내 카테터 시스템 (예를 들어, 옴마야(Ommaya) 저장소)을 가질 수 있다. 한 실시양태에서, ICV 투여는 상기 언급된 제제를 약 0.1 내지 약 60 ml/분의 유량으로 저장소 내로 주사함으로써 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체의 뇌척수액 (CSF)은 제제의 ICV 투여 전에 저장소로부터 약 0.1 내지 약 60 ml/분의 유량으로 배출되어, ICV 투여 후에 대상체의 CSF 부피의 전체 증가가 없어, 두개내압의 증가를 방지한다. 한 실시양태에서, 저장소 내로 주사된 제제는 저장소를 약간 압축하고 해제함으로써 카테터를 통해 대상체의 뇌실 내로 전달될 수 있다.

본 개시내용의 한 실시양태는 SMN 단백질의 ICV, IT, ICM, 실질내, IC 및/또는 IV 투여를 포함하는, SMA를 치료, 예방 또는 개선시키는 방법에 관한 것일 수 있다.

본 개시내용의 한 실시양태는 SMA의 치료, 예방 또는 개선을 위한 ICV, IT, ICM, 실질내, IC 및/또는 IV 투여되는 SMN 단백질의 용도에 관한 것일 수 있다.

본 개시내용의 한 실시양태는 SMA를 치료, 예방 또는 개선시키는 방법에 사용하기 위한 SMN 단백질 또는 그를 포함하는 제약 조성물에 관한 것일 수 있다.

본원에 기재된 작업 실시예 및 실험 실시예는 본 개시내용의 조성물 및 효과를 매우 상세하게 설명하지만, 이들 실시예는 본 개시내용의 이해를 돕기 위해 단지 예시적 목적으로 제공되며, 본 개시내용의 카테고리 및/또는 범주가 실시예에 의해 제한되지는 않는다.

[실시예 1] SMN 단백질의 생산 및 수득

SMN 단백질을 생산하기 위해, pcDNA3.1 플라스미드를 백본으로서 사용하여 293F 세포에서의 SMN 단백질 발현에 대해 최적화된 플라스미드를 제조하였다. 따라서, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 SMN 단백질을 발현하는 플라스미드를 제조하였다.

본 실시예에서, N 말단 근처에 신호 아미노산 서열 및 C 말단 근처에 Fc 영역을 갖는 SMN 단백질을 발현시켰다. 발현 및 수율의 최적화를 위해 서열식별번호: 3의 신호 아미노산 서열을 SMN 단백질의 N 말단 근처에 부가하고, 단백질의 확인 및 수득을 위해 서열식별번호: 2의 Fc 영역 (이뮤노글로불린 감마-1 중쇄의 힌지, CH2 및 CH3)을 SMN 단백질의 C 말단 근처에 부가하였다. 수득된 rhSMN 단백질의 서열은 서열식별번호: 4의 아미노산 서열이다.

최종 단백질 생산을 위한 플라스미드는 (1) BamHI 및 EcoRI 제한 효소 인식 부위 및 (2) BamHI 및 EcoRI 제한 효소 인식 부위 사이에 위치하는 SMA 단백질의 발현을 위한 핵산 서열을 포함하고, (1) 및 (2)는 서열식별번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 서열식별번호: 5의 핵산 서열에서, 위치 1-6의 뉴클레오티드는 BamHI 제한 효소 인식 부위의 서열을 지칭하고, 위치 7-12의 뉴클레오티드는 코작 서열을 지칭하고, 위치 1654-1659의 뉴클레오티드는 EcoRI 제한 효소 인식 부위의 서열을 지칭한다. 서열식별번호: 5의 핵산 서열로부터, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 재조합 SMN 단백질을 발현시켰다.

상기 기재된 바와 같이 제조된 플라스미드를 폴리에틸렌이민을 사용하여 239F 세포 내로 형질전환시켰다. 이어서, 세포를 6일 동안 37℃의 온도 및 8%의 CO₂ 농도에서 배양하여 rhSMN 단백질을 발현시키고 수득하였다. 인큐베이션 제6일에, 세포 배양물의 상층액에 대해 웨스턴 블롯을 수행하여 rhSMN 단백질의 발현을 확인하였다 (도 1). Fc 단백질에 상응하는 밴드를 나타낸 대조군 (대조군_Fc)과 같이, rhSMN 단백질을 발현하는 세포에 대한 세포 배양 상층액은 rhSMN 단백질에 상응하는 밴드를 명확하게 나타냈다. 세포 배양물의 상층액 중 rhSMN 단백질을 단백질 A 수지를 사용하여 정제하였다. 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루 (CBB)로 염색하고, SDS-PAGE를 10% 겔 상에서 수행하여 rhSMN 단백질의 순도를 측정하였다 (도 2). 제조된 단백질의 농도는 1.66 mg/mL인 것으로 측정되었다. 상기 기재된 바와 같이 제조된 rhSMN 단백질을 농축시키고, 하기 실시예에서 사용하였다. rhSMN 단백질의 제조를 앱클론 인크.(AbClon Inc.)에 의해 수행하였다.

[실시예 2] SMA 마우스 모델에서의 SMN 단백질의 투여

상기 실시예 1에서 생산된 rhSMN 단백질을 SMA 마우스 모델에 투여하여 단백질의 치료 효과를 확인하였다.

동물

"Smn 대립유전자 C" (마우스 계통: B6.129-Smn1^{tm5(Smn1/SMN2)Mrph}/J; 문헌 [Osborne, M. et al., Characterization of behavioral and neuromuscular junction phenotypes in a novel allelic series of SMA mouse models, Hum Mol Genet 21(20):4431-47]) (일반 명칭: Smn1^c)로 명명된 마우스 모델을 잭슨 래보러토리(Jackson Laboratory) (미국)로부터 구입하고, 하기 기재된 바와 같이 사용하였다.

연구 설계

실험을 위한 각각의 군에 대한 투여 스케줄 및 마우스의 수는 하기 표 1에 제시된다. 누시너센은 바이오젠(Biogen)에 의해 스핀라자®로 시판되는 의약이다.

구체적으로, 2 μL의 각각의 투여 조성물을 생후 제1일의 마우스에게 ICV 투여하였다. 생후 제4일에, 확인을 위해 마우스의 발가락에 표시하고, 마우스의 발가락을 샘플링하여 유전자형결정을 수행하였다. 유전자형결정을 통해 확인된 동형접합 돌연변이체만을 선택하고, 생후 제8일에, 각각의 투여 조성물을 5 μL씩 추가로 ICV 투여하였다.

투여를 위한 조성물의 효과를 연구하기 위해 꼬리 길이 및 귀 괴사를 시각적으로 관찰하였다. 꼬리 길이는 생후 제4일부터 1주에 적어도 2회 관찰되었고, 귀 괴사는 생후 제7주부터 1주에 적어도 2회 관찰되었다.

[표 1]

투여 스케줄 및 마우스의 수

ICV 투여

생후 제1일 및 제8일의 마우스에 대해 하기와 같이 ICV 투여를 수행하였다.

투여 당일에, 마우스를 이소플루란 (하나 제약(Hana Pharm Co., Ltd.), 대한민국)으로 마취시키고, 입체정위 기기 (스토엘팅(Stoelting), 미국)에 고정시켰다. 생후 제1일에서의 투여를 마우스에 대해 임의의 추가의 외과적 절차 없이 수행하였다. 생후 제8일에, 마우스 머리의 피부를 최소로 벗겨내어 두개골을 노출시키고 세척한 후, 마우스에 대해 투여를 수행하였다. 상기 표 1에 기재된 바와 같은 투여 조성물을 일회용 플라스틱 시린지에 넣고, 31-게이지 바늘이 구비된 시린지 펌프 (KD 사이언티픽(KD Scientific), 스위스)를 사용하여 10 μL/분의 일정한 속도로 ICV 투여를 수행하였다. 투여 동안 시린지 바늘의 마우스 뇌 내 위치를 입체정위 좌표 (스토엘팅, 미국)를 사용하여 모니터링하였다. 투여 시 바늘의 좌표는 하기와 같았다: 브레그마에 대해 미측 0.58 mm, 시상 봉합에 대해 외측 1.25 mm 및 깊이 1.77 mm.

투여 부위에서 혈관 파열 또는 안면 부종을 모니터링하였다. 이어서, 플런저 동작을 중지하고, 15초 후에 바늘을 제거하여 역류를 방지하였다. 절개부를 상처 봉합 클립으로 봉합하고, 마우스를 37℃에서 등온 패드 상에 놓고, 수술 후 회복될 때까지 관찰하였다. 투여 과정은 마우스당 대략 전체 프로토콜에 대해 약 10 내지 15분이 걸렸다. 투여 후에 주사 부위를 포함한 노출된 피부 영역을 의료용 스테이플러로 간단히 봉합하였다.

상기 ICV 투여가 성공적으로 수행되었는지 여부를 결정하기 위해, 염료 용액을 상기와 동일한 방식으로 ICV 투여하였다. 구체적으로, 0.05% 트리판 블루를 상기와 동일한 방식으로 ICV 투여하고, 각각의 상이한 시점 (즉, 투여 15분 및 24시간 후)에 뇌를 수집하여 투여 조성물의 분포를 시각적으로 확인하였다. 도 3에 제시된 바와 같이, 트리판 블루를 뇌실에 투여한 후, 투여 15분 후에 염료 용액 (및 그에 따른 투여 조성물)이 뇌 전반에 걸쳐 퍼지고, 투여 24시간 후에 염료 용액 (및 그에 따른 투여 조성물)이 클리어런스된 상태라는 것을 시각적으로 확인하였다. 이로부터, 상기 기재된 ICV 투여는 마우스 뇌에 약물을 효과적으로 투여하는 방법인 것으로 제시된다.

결과

꼬리 길이 및 귀 괴사의 관찰이 도 4, 5 및 6에 제시된다. 도 4에 따르면, rhSMN 단백질을 ICV 투여한 실험군에서, 어떠한 약물도 투여하지 않은 음성 대조군과 비교하여, 꼬리가 단축되는 SMA 증상이 지연되거나 개선된다. 구체적으로, 음성 대조군에서는 생후 제16일에 꼬리 길이가 단축되기 시작하였지만, 실험군에서는 생후 제19일에 꼬리 길이가 단축되기 시작하였다.

rhSMN 단백질의 ICV 투여는 양성 대조군과 동등한 정도로 꼬리 길이의 단축을 지연시키거나 개선시키는 것으로 나타났다. 실험군에서는 rhSMN 단백질의 투여 후 꼬리 길이의 단축을 지연시키는 효과가 비교적 초기 단계에서 나타났다가 빠르게 사라진 반면, 양성 대조군에서는 투여 후 효과가 비교적 느리고 느리게 감소하였다. 이러한 현상은 투여 조성물의 상이한 특성으로 인한 것으로 이해된다. 실험군에서는 rhSMN 단백질이 체내에 투여되어 별도의 발현 과정 없이 최종 활성 성분으로서 즉시 작용하는 반면, 양성 대조군에서는 누시너센이 체내에서 SMN2 mRNA의 발현에 작용한다. 따라서, SMN 단백질 및 누시너센이 조합되어 투여되는 경우에, 2종의 약물은 서로 상보적인 방식으로 작용하여 보다 효과적으로 SMA를 치료 또는 예방하거나 또는 그의 증상을 지연, 개선 또는 개선시킬 것이다. 추가로, 실험군에서는 단백질 클리어런스로 인해 투여 조성물의 효과가 급속하게 감소하므로, 2주마다 투여했을 때에 그 효과가 계속될 것으로 예상된다.

도 5 및 6에 따르면, rhSMN 단백질을 ICV 투여한 실험군에서, 어떠한 약물도 투여하지 않은 음성 대조군과 비교하여 귀 괴사 발생의 시기가 지연되었으며, 이 효과는 양성 대조군의 효과와 동등하였다. 구체적으로, 음성 대조군에서는 생후 제7주에 귀 괴사가 나타났지만, 실험군 및 양성 대조군에서는 생후 제8주에 귀 괴사가 시작되었다.

상기 설명으로부터, 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용이 그의 기술적 사상 또는 본질적 특색을 변화시키지 않으면서 다른 구체적 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이와 관련하여, 상기 기재된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적이 아닌 것으로 이해된다. 본 개시내용의 범주는 청구범위의 의미 및 범주, 및 본 개시내용 및 그의 등가의 개념으로부터 유래된 모든 변형, 변경 또는 대안을 포함하는 것으로 해석된다.

Claims

척수성 근육 위축 (SMA)을 갖는 환자에게 생존 운동 뉴런 (SMN) 단백질을 포함하는 제약 조성물의 치료 유효량을 뇌실내 (ICV) 투여, 척수강내 (IT) 투여, 대수조내 (ICM) 투여, 실질내 주사, 뇌내 (IC) 주사, 정맥내 (IV) 주사 또는 그의 조합을 통해 투여하는 것을 포함하며,
여기서 치료 유효량의 제약 조성물의 투여 후에, SMA의 적어도 1종의 증상의 강도, 중증도 또는 빈도가 감소되거나 또는 그의 발병이 지연되는 것인,
SMA를 치료, 예방 또는 개선시키는 방법.
제1항에 있어서, SMN 단백질이 인간 SMN1 유전자에 의해 코딩되는 것인 방법.
제1항에 있어서, SMN 단백질이 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, SMN 단백질이 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, SMN 단백질이 재조합 인간 SMN 단백질인 방법.
제1항에 있어서, SMA를 갖는 환자가 SMA I형, SMA II형, SMA III형 또는 SMA IV형을 갖는 환자인 방법.
제1항에 있어서, SMA를 갖는 환자에게 치료 유효량의 제약 조성물을 투여하는 것이 SMA를 갖는 환자에게 치료 유효량의 제약 조성물을 1주 1회, 2주마다 1회, 1개월 2회 또는 1개월 1회 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, ICV 투여가 SMA를 갖는 환자에게 하나 이상의 뇌실에 치료 유효량의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, ICV 투여가 SMA를 갖는 환자에게 저장소 및 저장소에 연결된 카테터를 포함하는 뇌실내 카테터 시스템을 통해 치료 유효량의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, SMA를 갖는 환자에게 치료 유효량의 제약 조성물을 투여하는 것이 SMA를 갖는 환자에게 제약 조성물을 약 0.0001 mg/kg 내지 약 150 mg/kg의 용량으로 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 제약 조성물이 스핀라자(SPINRAZA)®와 조합되어 투여되는 것인 방법.
생존 운동 뉴런 (SMN) 단백질을 포함하며,
여기서 제약 조성물은 뇌실내 투여, 척수강내 투여, 대수조 투여, 실질내 주사, 뇌내 주사, 정맥내 주사 또는 그의 조합을 통해 투여되는 것인,
척수성 근육 위축을 치료, 예방 또는 개선시키기 위한 제약 조성물.
제12항에 있어서, SMN 단백질이 인간 SMN1 유전자에 의해 코딩되는 것인 제약 조성물.
제12항에 있어서, SMN 단백질이 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
제12항에 있어서, SMN 단백질이 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
제12항에 있어서, SMN 단백질이 재조합 인간 SMN 단백질인 제약 조성물.
제12항에 있어서, SMA를 갖는 환자가 SMA I형, SMA II형, SMA III형 또는 SMA IV형을 갖는 환자인 제약 조성물.
제12항에 있어서, 1주 1회, 2주마다 1회, 1개월 2회 또는 1개월 1회 투여되는 제약 조성물.
제12항에 있어서, ICV 투여가 하나 이상의 뇌실에 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것인 제약 조성물.
제12항에 있어서, ICV 투여가 저장소 및 저장소에 연결된 카테터를 포함하는 뇌실내 카테터 시스템을 통해 투여하는 것을 포함하는 것인 제약 조성물.
제12항에 있어서, SMN 단백질이 약 0.0001 mg/kg 내지 약 150 mg/kg의 용량으로 투여되는 것인 제약 조성물.
제12항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 제약 조성물.
제12항에 있어서, 스핀라자®와 조합되어 투여되는 제약 조성물.