JP2015510889A - 中枢神経系障害を治療するための核酸ナノ粒子を中枢神経系へ送達する方法 - Google Patents

中枢神経系障害を治療するための核酸ナノ粒子を中枢神経系へ送達する方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2015510889A
JP2015510889A JP2014561186A JP2014561186A JP2015510889A JP 2015510889 A JP2015510889 A JP 2015510889A JP 2014561186 A JP2014561186 A JP 2014561186A JP 2014561186 A JP2014561186 A JP 2014561186A JP 2015510889 A JP2015510889 A JP 2015510889A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
nanoparticles
disease
polypeptide
therapeutic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2014561186A
Other languages
English (en)
Inventor
ハーモン，ブレンダン
ヴァシュチャック，バーバラ，リー
クーパー，マーク
Original Assignee
ノースイースタン・ユニバーシティ
コペルニクス セラピューティクス インコーポレイテッド
コペルニクス セラピューティクス インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ノースイースタン・ユニバーシティ, コペルニクス セラピューティクス インコーポレイテッド, コペルニクス セラピューティクス インコーポレイテッド filed Critical ノースイースタン・ユニバーシティ
Publication of JP2015510889A publication Critical patent/JP2015510889A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2999/00—Further aspects of viruses or vectors not covered by groups C12N2710/00 - C12N2796/00 or C12N2800/00
    • C12N2999/007—Technological advancements, e.g. new system for producing known virus, cre-lox system for production of transgenic animals

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Addiction (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)

Abstract

本発明は、核酸ナノ粒子で中枢神経系の疾患を治療するための方法および組成物を開示する。本明細書では、パーキンソン病等の病態を治療するために核酸ナノ粒子を使用する組成物も開示する。さらに、脳内の治療目的で、圧縮された核酸ナノ粒子を鼻腔内に投与する方法を開示する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれ、２０１２年３月９日に提出した米国仮出願第６１／６０９，０４２号、２０１２年１１月１３日に提出した６１／７２５，６６２号、および２０１３年２月２５日に提出した６１／７６８，８９５号の利益を主張するものであり、該仮出願は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
本発明は、医薬分野に関する。より具体的には、本発明は中枢神経系の疾患を治療し、または予防するために、遺伝子治療および当該治療薬を中枢神経系に送達することに関する。
大部分の中枢神経系（「ＣＮＳ」）疾患の治療は２つの事柄に直面している。それは、（１）疾患の実際の原因を治療する治療薬の開発および（２）血液脳関門（「ＢＢＢ」）を通って、ＣＮＳに治療薬を届けることである。最初の事柄については、大部分の薬剤は、病態の実際の原因を治療するより、正常な脳機能に必要な特定のニューロンの喪失、または異常な活動であったりし得る特定の疾患の影響を寛解しようと努力している。例えば、パーキンソン病について市場で利用可能な薬剤は、失われたドーパミンを模倣し、または置き換えるが、ドーパミンニューロンの進行性の喪失という問題の核心に触れない（例えば、ＬｅＷｉｔｔ ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ，（２００８）Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．５：２１０−２２５を参照のこと）。このように、ニューロン集団の喪失に対抗して保護する療法は、多くの疾患に利用可能な現行の療法より進歩したものになると思われる。
可能性のある療法の１つは遺伝子治療である。遺伝子治療は、異常な細胞を正常に機能させることによって、特定の疾患を治療するのに効果的であることが示されている。当該療法は遺伝子置換であり得、疾患原因の遺伝子の正常なコピーが、疾患に冒された細胞に導入される。このような疾患原因の遺伝子は遺伝子変異によって典型的に異常であるが、遺伝子発現制御領域、または転写因子の変異による遺伝子発現のレベルは、疾患を発症することになり得る。あるいは、遺伝子治療は、疾患の遠因を修正することなく、疾患の経過に対して脆弱な細胞の生存または機能を向上させる治療的タンパク質を発現する核酸を導入することができる。このような疾患を修正する核酸は遺伝子置換ではない。遺伝子治療は、アンチセンス部分を導入しまたは発現させることもでき、疾患を誘導するＲＮＡおよびタンパク質のレベルを減少させることもできる。遺伝子置換治療の例は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子を、当該遺伝子の正常なコピーを有さない肺細胞に与えることによって、嚢胞性繊維症を治療することである（Ｇｒｉｅｓｅｎｂａｃｈら（２００４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：Ｓ４３−Ｓ５０；Ｋｏｎｓｔａｎ ＭＷ、Ｄａｖｉｓ ＰＢ、Ｗａｇｅｎｅｒ ＪＳ、Ｈｉｌｌｉａｒｄ ＫＡ、Ｓｔｅｒｎ ＲＣ、Ｍｉｌｇｒａｍ ＬＪＨ、Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ ＴＨ、Ｈｙａｔｔ ＳＬ、Ｆｉｎｋ ＴＬ、Ｇｅｄｅｏｎ ＣＲ、Ｏｅｔｔｅ ＳＭ、Ｐａｙｎｅ ＪＭ、Ｍｕｈａｍｍａｄ Ｏ、Ｚｉａｄｙ ＡＧ、Ｍｏｅｎ ＲＣ、ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ ＭＪ．（２００４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１５：１２５５−１２６９を参照のこと）。脆弱または損傷を受けた細胞の生存を向上させる遺伝子治療の例は、神経栄養因子に関する遺伝子でパーキンソン病を治療することである（Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄら，（２０００）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．８８６：８２−９８；Ｈｕｒｅｌｂｒｉｎｋ ａｎｄ Ｂａｒｋｅｒ，（２００４）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８５：１−６を参照のこと）。それでもやはり、治療薬を適切な細胞に届けることに対する障壁として作用するＢＢＢが無くとも、これらの療法は、遺伝子治療を適切な細胞に届け、適切なレベルで治療的タンパク質を細胞に生成させるというハードルに直面した（同書）。
ＢＢＢの事柄に関して、先行技術に使用された技術の１つは、治療薬の脳への頭蓋内注入であった。例えば、グリア細胞株由来神経栄養因子（「ＧＤＮＦ」）タンパク質をパーキンソン病患者の脳に注入した（例えば、Ｇｉｌｌら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：５８９−５９５；Ｌａｎｇら（２００６）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．５９：４５９−４６６を参照のこと）。同様に、ＧＤＮＦ類似体のニュールツリンについての遺伝子もパーキンソン病患者の脳に注入した（例えば、Ｍａｒｋｓ Ｊｒら（２０１０）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ９：１１６４−１１７２を参照のこと）。大部分の遺伝子治療では、ニュールツリン遺伝子を細胞に届けることを助けるウイルスベクターに同遺伝子を挿入した。頭蓋内注入の技術およびウイルスベクターの使用は、脳組織への潜在的損傷、出血、ウイルスベクターへの免疫反応、および感染に関係する事柄、および脳手術に関連する固有の外傷等の安全性リスクを提起する。さらに、当該注入は、注入トラックの数ミリメートルの範囲の細胞しか治療しないことが多い。より広範囲を治療するためには複数の注入トラックが必要となり、これは出血および脳組織への損傷等の特定の安全性リスクの可能性を増加させることになる。ＣＮＳの広い切片を治療する必要のある疾患の場合、特に、小脳、脳幹、および大脳等の複数の構築物を含む１つ以上の広い領域を治療する必要がある場合に、多くの注入リスクが懸念される。
したがって、脳への直接注入（小さく定められた治療領域であっても複数の注入トラックが必要とされる）またはウイルスベクターを必要としないで、神経変性疾患の原因を治療することのできる方法および製剤が必要とされている。さらに、ＣＮＳに安全、効果的に治療薬を届けるために、ＢＢＢを回避することのできる方法および製剤が必要とされている。
ＬｅＷｉｔｔ ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ，（２００８）Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．５：２１０−２２５ Ｇｒｉｅｓｅｎｂａｃｈら（２００４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：Ｓ４３−Ｓ５０ Ｋｏｎｓｔａｎ ＭＷ、Ｄａｖｉｓ ＰＢ、Ｗａｇｅｎｅｒ ＪＳ、Ｈｉｌｌｉａｒｄ ＫＡ、Ｓｔｅｒｎ ＲＣ、Ｍｉｌｇｒａｍ ＬＪＨ、Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ ＴＨ、Ｈｙａｔｔ ＳＬ、Ｆｉｎｋ ＴＬ、Ｇｅｄｅｏｎ ＣＲ、Ｏｅｔｔｅ ＳＭ、Ｐａｙｎｅ ＪＭ、Ｍｕｈａｍｍａｄ Ｏ、Ｚｉａｄｙ ＡＧ、Ｍｏｅｎ ＲＣ、ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ ＭＪ．（２００４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１５：１２５５−１２６９ Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄら，（２０００）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．８８６：８２−９８；Ｈｕｒｅｌｂｒｉｎｋ ａｎｄ Ｂａｒｋｅｒ，（２００４）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８５：１−６ Ｇｉｌｌら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：５８９−５９５；Ｌａｎｇら（２００６）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．５９：４５９−４６６ Ｍａｒｋｓ Ｊｒら（２０１０）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ９：１１６４−１１７２
本開示はＣＮＳへ遺伝子配列を送達するための方法および組成物を提供する。具体的には、開示される方法および組成物は鼻腔内投与ができる。本明細書に開示の方法および組成物は、ＧＤＮＦ活性をコードする遺伝子等の遺伝子治療を、ＢＢＢを横切って通過すること、および発現することを改善することができる。さらに、本明細書に開示の方法および組成物は、パーキンソン病等の疾患の治療を改善することができる。
本明細書に開示の態様は、核酸配列を脳内に送達し、発現する方法に関する。方法は、核酸ナノ粒子の鼻腔内投与を含み、ナノ粒子は１つのナノ粒子あたり約１つの比率で核酸分子を含む。
ある実施形態では、核酸配列は治療的タンパク質をコードする。他の実施形態では、核酸配列は治療的アンチセンス部分をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は治療的アンチセンス部分を含む。ある実施形態では、核酸ナノ粒子はポリカチオンをさらに含む。特定の実施形態では、ポリカチオンはポリリジンである。
いくつかの実施形態では、核酸ナノ粒子はプラスミドＤＮＡを含む。特定の実施形態では、核酸配列は配列番号１の核酸配列を含む。より特定の実施形態では、核酸配列はＧＤＮＦ活性を有するポリペプチドをコードする。より特定の実施形態では、ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を有する。
さらなる態様では、開示の方法は対象のニューロンを細胞死から保護することに関する。方法は、有効量の治療的核酸ナノ粒子を対象に投与することを含み、ナノ粒子は、ニューロンを細胞損傷から保護し、または細胞損傷からの回復を促進する生成物を発現する。ある実施形態では、生成物はポリペプチドである。特定の実施形態では、ポリペプチドはＧＤＮＦ活性を有するポリペプチドである。更なる実施形態では、ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＳＤＦ−１、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；活性依存性神経栄養因子（ＡＤＮＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）；インスリン、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、オキシトシン、ニューロテンシン；コレシストキニン；神経ペプチドＹ；黄体形成ホルモン放出ホルモン；成長ホルモン；アルギニンバソプレシン；インターフェロン；ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ、およびＴＧＦを含むサイトカイン；抗−ＶＥＧＦポリペプチド；抗腫瘍活性を有するペプチド；並びに直接的に細胞成分そのものを標的にすること、または神経系細胞、およびサイトカイン若しくはオートクリン因子等の非神経系細胞の両方の様々なシグナル伝達機構と相互作用することによって、様々な生物学的機能を調節することのできるｓｃＦｖペプチドから成る群から選択される活性を有するポリペプチドである。
他の実施形態では、対象のニューロンはドーパミン作動性神経である。さらなる実施形態では、対象のニューロンは黒質に位置する。さらなる実施形態では、対象のニューロンは海馬に位置する。さらなる実施形態では、対象のニューロンは、内側前頭葉前部皮質を含む大脳皮質に位置する。他の実施形態では、対象のニューロンは運動ニューロンである。当該技術分野に周知の神経栄養因子は他にも多くあり、当該因子は開示の方法の範囲内にある。
ある実施形態では、ナノ粒子はポリカチオンをさらに含む。特定の実施形態では、ポリカチオンはポリリジンである。より特定の実施形態では、ナノ粒子はＣＫ−ＰＥＧ−ＧＤＮＦナノ粒子である。
他の実施形態では、有効量のナノ粒子の鼻腔内投与は、パーキンソン病を罹患している対象を治療する。その他の実施形態では、有効量のナノ粒子の鼻腔内投与は、ハンチントン病、アルツハイマー病、痴呆、バッテン病、テイ・サックス病、多発性硬化症、うつ病、アルコール依存症、物質依存症、自閉症圏障害、心的外傷後ストレス症候群（ＰＴＳＤ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、中枢神経系ループス、中枢神経系の自己免疫疾患、てんかん、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、疼痛性障害、および神経筋疾患から成る群から選択される疾患を罹患している対象を治療する。
ある実施形態では、治療的核酸ナノ粒子の有効量は０．１ｎｇ〜１．０ｕｇである。いくつかの実施形態では、核酸ナノ粒子有効量は１．０μｇ〜１ｍｇである。追加の実施形態では、治療的核酸ナノ粒子有効量は１．０ｍｇ〜１ｇｍである。
特定の実施形態では、治療的核酸ナノ粒子の投与量は、液滴として、スプレーミストとしてエアロゾル化され、数分から数時間で送達するためにポンプを使用して鼻腔内投与される。より特定の実施形態では、治療的核酸ナノ粒子の投与量は、定められた時間経過にわたって複数回、鼻腔内投与される。さらに特定の実施形態では、各ＣＫ−ＰＥＧ−ＧＤＮＦナノ粒子は、配列番号１の核酸配列を有するプラスミドを含む。さらに特定の実施形態では、配列番号１は配列番号２のアミノ酸配列でポリペプチドを発現する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドはニューロンを細胞死から保護する。ある実施形態では、生成物はアンチセンスＲＮＡである。
本明細書に開示されるさらなる態様は、脳または脳幹障害を罹患している対象を治療する方法に関する。当該方法は、有効量の圧縮された核酸ナノ粒子を対象に鼻腔内投与することを含み、ナノ粒子の集団は、１つのナノ粒子あたり約１つの比率で核酸分子を含み、当該核酸は治療的部分をコードし、または含む。ある実施形態では、ナノ粒子は脳または脳幹障害を治療する。
特定の実施形態では、ナノ粒子は生成物をコードする核酸を含む。より特定の実施形態では、生成物はポリペプチドである。ある実施形態では、生成物は、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン、ＳＤＦ−１、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、神経成長因子（ＮＧＦ）、活性依存性神経栄養因子（ＡＤＮＰ）、インスリン、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、オキシトシン、およびβインターフェロン、ニューロテンシン、コレシストキニン、神経ペプチドＹ、黄体形成ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、アルギニンバソプレシン、インターフェロン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ、およびＴＧＦを含むサイトカイン、抗−ＶＥＧＦポリペプチド；抗腫瘍活性を有するペプチド；並びに直接的に細胞成分そのものを標的にすること、または神経系細胞、およびサイトカイン若しくはオートクリン因子等の非神経系細胞の両方の様々なシグナル伝達機構と相互作用することによって、様々な生物学的機能を調節することのできるｓｃＦｖペプチドから成る群から選択される活性を有するポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、生成物はアンチセンスＲＮＡである。さらに他の実施形態では、ナノ粒子はＲＮＡ分子を含む。さらなる実施形態では、ナノ粒子はｍＲＮＡ分子を含む。さらなる実施形態では、ナノ粒子はアンチセンス分子を含む。
ある実施形態では、脳または脳幹障害は、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、痴呆、バッテン病、テイ・サックス病、多発性硬化症、うつ病、アルコール依存症、物質依存症、自閉症圏障害、心的外傷後ストレス症候群（ＰＴＳＤ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、中枢神経系ループス、中枢神経系の自己免疫疾患、てんかん、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、疼痛性障害、および神経筋疾患から成る群から選択される。
特定の実施形態では、治療的核酸ナノ粒子の有効量は１．０μｇ〜１ｍｇである。より特定の実施形態では、治療的核酸ナノ粒子の有効量は１．０ｍｇ〜１ｇｍである。より特定の実施形態では、治療的核酸ナノ粒子の投与量は、液滴として、スプレーミストとしてエアロゾル化され、数分から数時間で送達するためにポンプを使用して鼻腔内投与される。ある実施形態では、治療的核酸ナノ粒子の投与量は、定められた時間経過にわたって複数回、鼻腔内投与される。
以下の図は説明のためだけにあるものであり、限定することを意図しない。
ラットの実験に使用されたｐＧＤＮＦ−１ｂプラスミドの構造を示す。 ラットの実験に使用されたｐＵＧＧプラスミドの構造を示す。 屠殺される７日前にｐＵＧＧの鼻腔内投与を受けたラットから調製された組織ブロックの図を示す。「Ａ」から「Ｆ／Ｇ」と示される脳ブロックは、プレキシガラスのラットの脳マトリックスを用いて前頭面に沿ってレーザーカットすることによって調製された。黒い線によって切断部の位置を示した。各ブロックの脳領域を図の下に挙げる。 切片ＡのＧＦＰ発現のグラフを示し、８８ｕｇの圧縮されたｐＵＧＧナノ粒子（ｎ＝４個体）と裸のｐＵＧＧ（ｎ＝４個体）を鼻腔内投与されてから７日後のラットの嗅球（ＯＢ）および前頭皮質に対応する。ＧＦＰ発現はＥＬＩＳＡで確認した。 鼻腔内投与（８８ｕｇ）から７日後の切片ＢからＦ／ＧについてＧＦＰ−ＥＬＩＳＡ結果を示す。２要因分散分析では、治療（ｐ＜０．０００１）および切片（ｐ＜０．００５６）による有意な効果を示す。ボンフェローニポストテストでは、圧縮されたｐＵＧＧナノ粒子と裸のｐＵＧＧとの間に有意差を示す（＊ｐ＜０．０１、＃ｐ＜０．０５）。 アンフェタミン投与後３０分間の６−ヒドロキシドパミン（６−ＯＨＤＡ）損傷ラットの同側性回転を示す。ラットは、左内側前脳束に６−ＯＨＤＡ（２ｍｇ／ｍＬの４μＬ；総用量８μｇ）を片側注射される１週間前に、生理食塩水、裸のｐＧＤＮＦ−１ｂ、または圧縮されたｐＧＤＮＦ−１ｂナノ粒子（ＮＰ）の鼻腔内投与を受けた。３〜４週間後、損傷のあるラットに５ｍｇ／ｋｇ用量のｄ−アンフェタミンを与えた。ｐＧＤＮＦ−１ｂ（裸またはＮＰ）は、生理食塩水の対照群と比較して同側性回転が有意に減少した。１要因分散分析では、群間に有意差を示した（ｐ＝０．０１）。ダネットポストテストでは、ｐＧＤＮＦ ＮＰ対生理食塩水（＊ｐ＜０．０５）、および裸のｐＧＤＮＦ対生理食塩水（＊ｐ＜０．０５）について差を示した。 ６−ＯＨＤＡ病変から３〜４週間後のラットの体重増加の差を示す。実験条件は図５と同じであった。 ６−ＯＨＤＡ注射の７日前に、生理食塩水（上）若しくは８８ｕｇの裸のｐＧＤＮＦ−１ｂ（中）、またはｐＧＤＮＦ−１ｂ ＮＰ（下）の鼻腔内（ＩＮ）投与を受けたラットの損傷（左）および非損傷（右）黒質（ＳＮ）の代表的な脳切片を示す。ラットは６−ＯＨＤＡ注射を受けてから３〜４日後に屠殺された。茶色の染色は、ドーパミンニューロンのチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫組織化学的染色を示す。 裸または圧縮されたｐＧＤＮＦ−１ｂの鼻腔内投与を受けたラット、および生理食塩水の鼻腔内投与を受けた対照の６−ＯＨＤＡ損傷黒質（ＳＮ）内の病変の割合を示す。実験条件は図５、６、７と同じであった。１治療群あたり７〜８個体のラットの左側（損傷）と右側（非損傷）のチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）染色密度を比較することによって、病変重症度（％病変）を評価した。１要因分散分析では、治療による有意な効果を示した（ｐ＝０．００８１）。チューキーポストテストでは、ｐＧＤＮＦ−１ｂ ＮＰと生理食塩水との間に有意差を示した（＊ｐ＜０．０１）。 裸または圧縮されたｐＧＤＮＦ−１ｂの鼻腔内投与を受けたラット、および生理食塩水の鼻腔内投与を受けた対照の６−ＯＨＤＡ損傷黒質（ＳＮ）内の細胞喪失の割合を示す。実験条件は図５、６、７、８と同じであった。１治療群あたり７〜８個体のラットの損傷ありと無傷の黒質内のＴＨポジティブ（ドーパミン）ニューロンの数を比較することによって、病変重症度（％細胞喪失）を評価した。１要因分散分析では、治療による有意な効果を示した（ｐ＝０．０００８）。チューキーポストテストでは、ｐＧＤＮＦ−１ｂ ＮＰ対生理食塩水（＊ｐ＜０．００１）、および裸のｐＧＤＮＦ−１ｂ対生理食塩水との間に有意差を示した（＃ｐ＜０．０５）。 ＰＥＧ化ポリリジンＤＮＡナノ粒子（左）の電子顕微鏡写真を示す（スケールバー＝２００ｎｍ）。さらに、どのようにしてこれらのナノ粒子が細胞に入りこんだのかを説明した理論を示す（右）。 ｐＧＤＮＦ−１ｂの配列（配列番号１）を示す。 ＧＤＮＦ−１ｂのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
ＧｅｎＢａｎｋデータベースを含む刊行物、特許出願、および本明細書に言及されるその他の参考文献は全て、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。矛盾が生じる場合は、定義を含む本発明の明細書が調整する。さらに、材料、方法、および例は、説明のためだけにあるものであり、限定することを意図しない。
他に定義されない限り、本明細書に使用される技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものとほぼ同じまたは等価の方法および材料を、本発明を実践または試験するために使用することができるが、以下に適切な方法および材料を記す。
１．定義
便宜上、明細書、実施例および請求項に使用される用語をここにまとめる。他に定義されない限り、本明細書に使用される技術用語および科学用語は全て、本開示が属する技術分野の当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本開示内で提供される群または用語にあてがわれる最初の定義は、個々に本開示全体にわたる群または用語に、または他に断りがない限り、別の群の一部として適用される。
用語「グリア細胞株由来神経栄養因子」および「ＧＤＮＦ」は、本開示に使用されるとき、グリア細胞株由来神経栄養因子活性を表すポリペプチド配列または部分的なポリペプチド配列を意味する。さらに、用語は自然発生する遺伝子の核酸配列を含み、プロモーターおよびその他の制御配列を含むことができ、グリア細胞株由来神経栄養因子活性を有するポリペプチドをコードする。用語は組換え核酸配列、およびグリア細胞株由来神経栄養因子活性を表すポリペプチドをコードするＰＣＲによって生成された核酸配列を含む。
本開示では、物品の「１つ」（英語の「ａ」および「ａｎ」）は、物品の文法的な対象の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を意味する。実施例では、「１つの要素」は１つの要素または複数の要素を意味する。
用語「または」は、本開示に使用されるとき、他に断りがない限り、用語「および／または」を意味し、それと互換的に使用される。
用語「約」は、本開示に使用されるとき、所与の数値の−（マイナス）または＋（プラス）２０％を意味する。そのため、「約６０％」は６０の６０マイナス１２％、および６０の６０プラス１２％の間の値（すなわち４８％と７２％の間）を意味する。
２．ナノ粒子の投与方法
本開示は、部分的に、対象のニューロンを細胞死から保護する方法を提供する。本明細書に開示のある実施形態では、方法は、有効量のＣＫ−ＰＥＧ−ＧＤＮＦナノ粒子を対象に鼻腔内投与することを含む。「ＣＫ−ＰＥＧ−ＧＤＮＦナノ粒子」は、本明細書に使用されるとき、プラスミドがＧＤＮＦ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を運ぶポリカチオン性のペプチドを含むナノ粒子に圧縮されたプラスミドＤＮＡである。ある実施形態では、ＣＫ−ＰＥＧ−ＧＤＮＦナノ粒子は、システイン残基を含み、ＰＥＧと結合するポリリジンペプチドをさらに含む。様々な方法で、圧縮されたプラスミドＤＮＡナノ粒子の鼻腔内投与を実施することができる。例えば、ポンプまたはナノ粒子をミストにエアロゾル化するスプレーを送るその他の機器を使用して、ナノ粒子を鼻腔に投与することができる。さらに、点滴器、またはシリンジ、またはナノ粒子を分散し、鼻腔に直接適用する機器を使用して、液滴としてナノ粒子を投与することができる。
特定の理論に縛られることを望むものではないが、本明細書に開示のナノ粒子は、細胞の表面でヌクレオリン受容体と結合することによって、細胞に入り込むことができる（図１０；Ｃｈｅｎ Ｘ、Ｋｕｂｅ ＤＭ、Ｃｏｏｐｅｒ ＭＪ、ａｎｄ Ｄａｖｉｓ ＰＢ．（２００８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１６（２）：３３３−３４２；Ｃｈｅｎ Ｘ、Ｓｈａｎｋ Ｓ、Ｄａｖｉｓ ＰＢ、ａｎｄ Ｚｉａｄｙ ＡＧ．（２０１１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９（１）：９３−１０２も参照のこと）。ナノ粒子は、核膜孔複合体（「ＮＰＣ」）によって、微小管を経由して細胞核に内部移行および輸送される（同書）。しかしながら、ナノ粒子に圧縮されていない裸のプラスミドは、ヌクレオリンに結合せず、容易に細胞に形質移入しない。したがって、圧縮されたナノ粒子が、目的の遺伝子の有用な治療的送達剤になり得る。しかしながら、その他の内部移行および細胞輸送経路が、様々な組織に適用されるナノ粒子にとって、有効になり得ることを注意することが重要である。ＤＮＡナノ粒子のヌクレオリン媒介性内部移行および輸送経路は、肺遺伝子の移動に最適であると評され、ＣＮＳ細胞内の厳密な機序は、ヌクレオリン媒介性であってもよく、またはその他の取り込みおよび内部移行経路を経由してもよい。
本明細書に開示されるある実施形態では、ナノ粒子は、対象に治療効果をもたらすために有効量を投与される。対象に投与されるナノ粒子の量は、遺伝子によって生成される望ましい量のタンパク質を必要なだけ脳内の所望の位置に産生するように、対象の年齢、体重、およびその他の因子を考慮して調節することができる。例えば、いくつかの実施形態では、約０．０１ｎｇのナノ粒子〜約１００ｎｇのナノ粒子の有効量のナノ粒子を、対象に投与する。他の実施形態では、約０．１ｎｇのナノ粒子〜約１０ｎｇのナノ粒子の有効量の核酸ナノ粒子を、対象に投与する。特定の実施形態では、有効量の核酸ナノ粒子は、約１００ｎｇのナノ粒子〜約１．０μｇのナノ粒子、約１．０μｇのナノ粒子〜約１００μｇのナノ粒子、または約１００μｇのナノ粒子〜約１．０ｍｇのナノ粒子である。ある例では、有効量の核酸ナノ粒子は約１．０ｍｇのナノ粒子〜約１０ｍｇのナノ粒子、約１０ｍｇのナノ粒子〜約１００ｍｇのナノ粒子であり、および有効量の核酸ナノ粒子は約１００ｍｇのナノ粒子〜１．０ｇのナノ粒子である。
さらなる実施形態では、有効量のナノ粒子を、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１．０μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、または約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する。
本明細書に開示の方法の態様は、液体の形態で有効量の核酸ナノ粒子を対象に提供することを含む。特定の実施形態では、核酸ナノ粒子はＣＫ−ＰＥＧ−ＧＤＮＦナノ粒子を含む。ある実施形態では、有効量のナノ粒子は水溶液中に提供される。水溶液の例は純水である。いくつかの実施形態では、水溶液は生理食塩水溶液である。溶液を血液と等張させる量で、塩化ナトリウムを提供することができる（例えば約３００ｍＯｓ／Ｌ）。
より多くの実施形態では、ＮａＣｌ溶液をブドウ糖またはその他の糖類と組み合わせて使用することができる。特定の実施形態では、ブドウ糖は５％の濃度で溶液中にある。より特定の実施形態では、生理食塩水溶液は３９ｍＥｑ／ＬのＮａおよびＣＩおよび５％のブドウ糖を含む。他の実施形態では、生理食塩水溶液は７７ｍＥｑ／ＬのＮａおよびＣＩ、並びに最大５０ｇ／Ｌのグルコースを含む。
追加の水溶液は、水溶液のｐＨを６．５〜７．５に保つ緩衝液である。緩衝液の例として、当該技術分野に周知のトリス緩衝またはリン酸緩衝塩類溶液が挙げられる。
溶液は、ニッキングを減少させることによって、ナノ粒子内のＤＮＡの統合性を保持する剤を含むことができる。当該剤として、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはジエチレントリアミペンタアセテート酸（ＤＴＰＡ）等の抗酸化剤およびキレート剤が挙げられる。
開示される方法の態様は、ＧＤＮＦ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列の少なくとも１つのコピーを含む圧縮されたプラスミドＤＮＡのナノ粒子を投与することを含む。特定の実施形態では、核酸配列は配列番号１である。他の実施形態では、核酸配列はＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ００１１９０４６８、ＮＭ０００５１４、ＮＭ００１１９０４６９、ＮＭ＿１９９２３１、およびＮＧ＿０１１６７５から成る群から選択される。
ある実施形態では、核酸配列は配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。他の実施形態では、核酸配列は、寄託番号Ｐ３９９０５、ＮＰ＿０００５０５、ＮＰ＿００１１７７３９７、ＮＰ＿００１１７７３９８、およびＮＰ＿９５４７０１から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
方法の態様は、プラスミドＤＮＡがＧＤＮＦ活性を有するポリペプチドを発現することができるＣＫ−ＰＥＧ−ＧＤＮＦナノ粒子を、対象に投与することを含む。ある実施形態では、核酸は配列番号１の配列を有する。ＣＫ−ＰＥＧ−ＧＤＮＦナノ粒子から治療上の利益を得るために、本明細書に開示の任意のＧＤＮＦ配列と同一の絶対配列を必要としない。例えば、ＧＤＮＦ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１から選択される配列と８５％〜９５％の同一性を有することができる。他の実施形態では、核酸は、ＮＭ＿００１１４３８０５，ＮＭ＿００１１４３８０６、ＮＭ＿００１１４３８０８、ＮＭ＿００１１４３８０９、ＮＭ＿００１１４３８１０、ＮＭ＿００１１４３８１１、ＮＭ＿００１１４３８１２、ＮＭ＿００１１４３８１３、ＮＭ＿００１１４３８１４、ＮＭ＿００１１４３８１６、ＮＭ＿００１７０９，ＮＭＪ７０７３１、ＮＭＪ７０７３２、ＮＭＪ７０７３３、ＮＭＪ７０７３４、ＮＭ００１１９０４６８、ＮＭ＿０００５１４、ＮＭ００１１９０４６９、ＮＭｌ９９２３１、およびＮＧ０１１６７５から成る群から選択される配列と８５％〜９５％の同一性を有することができる。これは、部分的に、当該技術分野によく述べられるように、アミノ酸をコードする核酸配列内に「ゆらぎ」が存在することに起因する。
開示の方法の態様は、配列番号２の部分配列をコードする核酸配列も許容する。さらに、本明細書に開示のポリペプチド配列のアミノ酸配列からの偏差も許容されることも認識されるべきである。例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書に開示の配列と８５％〜９５％の同一性を有することができる。
３．疾患の治療
開示される方法の態様は治療的ナノ粒子を使用して神経疾患を治療することに関する。方法は、疾患を罹患している対象を治療するために、有効量の圧縮された核酸ナノ粒子を鼻腔内投与することを含む。特定の実施形態では、圧縮されたプラスミドＤＮＡナノ粒子が、ポリペプチドをコードするＤＮＡで細胞を形質移入（トランスフェクト）する。ポリペプチドは正常な細胞機能または健康に必要な活性を有するポリペプチドを含むことができる。例えば、ポリペプチドはＧＤＮＦ活性を有することができる。ポリペプチドは、損傷を受けた、または死んでいる細胞が位置する脳の領域に、内因性ＧＤＮＦ活性を交換し、または補うことができ、そうすることによって、正常な機能を回復し、取り戻すことを促進する。ある実施形態では、ＧＤＮＦ活性を有するポリペプチドは、ニューロンを細胞死から保護し、それによって疾患を治療する。神経幹細胞を脳に補充するのに、ＧＤＮＦまたはその他のタンパク質も効果的であり得る。
他の実施形態では、核酸ナノ粒子は、損傷を受けた、または死んでいる細胞の遺伝子生成物の活性を補う。当該生成物の例として、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＳＤＦ−１、神経成長因子（ＮＧＦ）、活性依存性神経栄養因子（ＡＤＮＰ）、インスリン、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、オキシトシン、およびβインターフェロン、ニューロテンシン、コレシストキニン、神経ペプチドＹ、黄体形成ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、アルギニンバソプレシン、インターフェロン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ、およびＴＧＦを含むサイトカイン、抗−ＶＥＧＦポリペプチド；抗腫瘍活性を有するペプチド；並びに直接的に細胞成分そのものを標的にすること、または神経系細胞、およびサイトカイン若しくはオートクリン因子等の非神経系細胞の両方の様々なシグナル伝達機構と相互作用することによって、様々な生物学的機能を調節することのできるｓｃＦｖペプチドが挙げられる。
いくつかの態様では、核酸はｍＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ等のＲＮＡである。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子からの核酸切片は、プラスミドＤＮＡ分子等のＤＮＡを含むナノ粒子から発現し、そのため、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写される。他の実施形態では、ナノ粒子はアンチセンスＲＮＡそのものを含む。当該アンチセンスＲＮＡが遺伝子機能を抑圧できることは当該技術分野で周知である。例えば、ハンチントン病をアンチセンスＲＮＡ技術で治療した（例えば、Ｅｖｅｒｓら（２０１１）ＰＬｏＳ ＯＮＥ．６（９）：ｅ２４３０８、１−１１；ＭｃＢｒｉｄｅら（２０１１）１９（１２）：２１５２−２１６２を参照のこと）。当該実施形態では、アンチセンスＲＮＡは、抑圧される遺伝子の配列全体に相補的である必要はないが、抑圧される遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一である。一般的に、相同性が高いものほど、より短い配列の使用を代償して使用することができる。ある実施形態では、少なくとも３０ヌクレオチドの配列を使用する（例えば、少なくとも４０、５０、８０、１００、２００、５００ヌクレオチドまたはそれ以上）。
本明細書に開示の方法は、失われた遺伝子機能を補い、または遺伝子の遺伝子異常発現を抑圧することのいずれかによって、疾患を治療する。本開示の方法によって治療される疾患の例として、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、痴呆、うつ病、アルコール依存症、物質依存症、自閉症圏障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、中枢神経系ループス、中枢神経系の自己免疫疾患、てんかん、脳卒中、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、疼痛性障害、および神経筋疾患が挙げられる。具体的には、遺伝子疾患は、開示される方法による治療を受け入れられる。中枢神経系の症状を伴う遺伝子疾患の例として、アイカルディ症候群、アルパーズ症候群、バース症候群（ＢＴＨＳ）、バッテン病、脳梁欠損、ファーブリ病、ファール症候群、ガラクトース血症、２型または３型ゴーシェ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、リー症候群、レッシュ・ナイハン症候群、メープルシロップ病、メンケス病、モヤモヤ病、ニーマン・ピック病、レット症候群、尿素回路障害、およびテイ・サックス病，およびツェルベルガー症候群が挙げられる。ここに挙げられていない、またはまだ記載されていない多くの疾患は、本開示の方法による治療に奏効し得る。本開示の方法によって、腫瘍の治療も効果的であり得る。当該腫瘍はニューロンおよびグリア細胞に由来する。さらに、神経またはグリア細胞起源の腫瘍は、悪性または良性の可能性がある。ある実施形態では、腫瘍は、その他の組織からの転移性細胞の増殖したものである。転移は、肺、骨、膵臓、結腸、胃、皮膚、および血液等のその他の組織から拡散する可能性がある。追加の実施形態では、方法によって治療されるニューロンは、ドーパミン作動性神経、コリン作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロンＧＡＢＡ作動性ニューロンおよびセロトニン作動性ニューロンから成る群から選択される。他の実施形態では、特定のタイプのニューロン、星状細胞、またはグリア細胞等の特定の細胞タイプの発現は、遺伝子発現制御成分を適切に使用することによって選択され得る。制御成分の例として、ドーパミン作動性神経に対してＴＨプロモーターが、グリア細胞に対してグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターが発現を抑制するはずである。
本開示の方法の態様は、併用療法を含む。当該併用療法として、第二治療薬と共に、ナノ粒子を鼻腔内投与することを含む。治療薬として、神経疾患または精神疾患を治療するのに有用な薬剤が挙げることができる。例えば、パーキンソン病を治療するために、対象にレボドパを投与しながら、ＧＤＮＦ活性を有するポリペプチド（例えば、ＣＫ−ＰＥＧ−ＧＤＮＦ）をコードする核酸を含む圧縮されたプラスミドＤＮＡナノ粒子を投与することができる。併用療法では、圧縮されたプラスミドＤＮＡナノ粒子の鼻腔内投与の前、同時、または後に、第二治療薬を投与することができる。
４．組成物
本明細書に開示の態様は、核酸ナノ粒子を含む組成物に関する。当該ナノ粒子は、本質的に、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡ等の単一の核酸分子を含む。ナノ粒子は、ホストｍＲＮＡおよび／またはタンパク質を減少させるために、アンチセンス部分を含む、または発現し得る。
１つのベクター（ｐＧＤＮＦ−１ｂ）を図１に示す。ｐＧＤＮＦ−１ｂプラスミドは、複製起源（Ｒ６Ｋ ｏｒｉ）、ＳＶ４０ポリ−Ａ末端コード配列（ＳＶ４０ｐＡ）、およびプラスミドを含む細菌のｚｅｏｃｉｎ（商標）抵抗性（ＺｅｏＲ）を与える遺伝子を含む。さらに、プラスミドはｈＧＤＮＦ−１ｂ遺伝子配列を含む。プラスミドは、ｈＧＤＮＦ核酸配列を恒常的に発現するために、ＵｂＣプロモーター（ＵｂＣ ｐｒｏｍ）も含む。
図１に示されるように、本開示の範囲のプラスミドは、追加の配列を含むこともできる。例えば、プラスミドはスキャフォールド／マトリックス付着領域（"Ｓ／ＭＡＲ"または"ＭＡＲ"）を含むことができる（図１；Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ＡＭ、Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ ＴＨ、Ｐａｄｅｇｉｍａｓ Ｌ、Ｃｏｏｐｅｒ ＭＪ、ａｎｄ Yｕｒｅｋ ＤＭ．（２０１１）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１９４：２２０−２２６も参照のこと）。当該領域はクロマチンの構造組織化を仲介し、遺伝子発現の役割を担うことができる。
ＣＫ−ＰＥＧ−ＧＤＮＦナノ粒子等のＣＫ−ＰＥＧナノ粒子の作製方法は、米国特許第８，０１７，５７７号、６，５０６，８９０号、６，２８１，００５号、５，８４４，１０７号、５，８７７，３０２号、６，００８，３３６号、６，０７７，８３５号、５，９７２，９０１号、６，２００，８０１号、および５，９７２，９００号に開示され、その全ては参照により取り込まれる。注目すべきことは、ＣＫ−ＰＥＧ−ＧＤＮＦナノ粒子が、ポリリジンおよびポリリジンの誘導体を含むことができることである。ある実施形態では、ポリリジンは１５〜６０個のリジン残基を含む。特定の実施形態では、ポリリジンは、それぞれ、１５〜３０、３０〜４５、または４５〜６０個の残基の範囲のリジン残基を含む。特定の実施形態では、ＣＫ−ＰＥＧ−ＧＤＮＦナノ粒子のポリリジンの誘導体は、それぞれ、長さが１５、３０、および４５個の残基のポリリジンポリマーに付着される追加のシステイン残基を有する、ＣＫ１５、ＣＫ３０、ＣＫ４５である。その他のアミノ酸は、本発明の精神から逸脱することなく、ポリリジンに容易に付着することができる。
本明細書に開示の組成物の態様は、代替の修飾された、または代替のアミノ酸を含むポリリジンペプチドを含むＣＫ−ＰＥＧ−ＧＤＮＦナノ粒子を含む。例えば、ポリリジンの個々のリジン残基は、アセチルリジンへのアセチル化，メチルリシンへのメチル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＮＥＤＤ化、ビオチン化、ＰＵＰ化、およびカルボキシル化によって修飾することができる。
さらに、ポリエチレングリコールに結合したシステイン−ポリリジンペプチドを有するＣＫ−ＰＥＧ−ＧＤＮＦナノ粒子の作製方法は、当該技術分野に周知である（例えば、Ｌｉｕら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３５）：３２５７８−３２５８６を参照のこと）。本明細書に開示のナノ粒子の酸性のために、ポリリジンを含むポリペプチドのＰＥＧ化は、単一のシステイン（ＣＫ）およびメトキシＰＥＧ１０Ｋ−マレイミドで終止する精製ポリペプチドを混合することを含む（同書）。マレイミドおよびシステイン残基は、ペグ化ペプチドを形成する。
ある実施形態では、ＣＫ−ＰＥＧ−ＧＤＮＦナノ粒子は、１．０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌのポリエーテル結合ポリペプチドに加えられた、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌのＤＮＡを使用して作製される。特定の実施形態では、最終混合物のＤＮＡ濃度は０．０５ｍｇ／ｍｌ〜２．０ｍｇ／ｍｌである。より特定の実施形態では、正電荷と負電荷の比は約２：１である（米国特許第８，０１７，５７７号参照；Ｆｉｎｋ ＴＬ、Ｋｌｅｐｃｙｋ ＰＪ、Ｏｅｔｔｅ ＳＭ、Ｇｅｄｅｏｎ ＣＲ、Ｈｙａｔｔ ＳＬ、Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ ＴＨ、Ｍｏｅｎ ＲＣ、ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ、ＭＪ．（２００６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１３：１０４８−１０５１；Ｚｉａｄｙ ＡＧ、Ｇｅｄｅｏｎ ＣＲ、Ｍｉｌｌｅｒ Ｔ、Ｑｕａｎ Ｗ、Ｐａｙｎｅ ＪＭ、Ｈｙａｔｔ ＳＬ、Ｆｉｎｋ ＴＬ、Ｍｕｈａｍｍａｄ Ｏ、Ｏｅｔｔｅ Ｓ、Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ Ｔ、Ｐａｓｕｍａｒｔｈｙ ＭＫ、Ｍｏｅｎ ＲＣ、Ｃｏｏｐｅｒ ＭＪ、ａｎｄＤａｖｉｓ ＰＢ：（２００３）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、８：９３６−９４７も参照のこと）。
さらなる実施形態では、二官能性ＰＥＧ化をポリペプチド上で実施する。当該二官能性ＰＥＧ化は、ＰＥＧ−［ＯＰＳＳ］２（二硫化オルト−ピリジル）を使用して実施することができる（例えば、Ｓｕｎ Ｗ ａｎｄ Ｚｉａｄｙ ＡＧ．（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．５４４：５２５−５４６を参照のこと）。当該二官能性ＰＥＧ化は、標的薬剤をＰＥＧ化ポリペプチドに結合させることができる。標的薬剤として、リガンド、ペプチド模倣化合物、受容体刺激薬、受容体遮断薬、および低分子化合物が挙げられる。標的薬剤の例は、ナノ粒子をドーパミン受容体に向けるために、二官能性ＰＥＧに付着されたドーパミンである。
本明細書に開示の組成物の態様は、サイズが５００ナノメートル以下のナノ粒子を含む。他の実施形態では、ナノ粒子は１００ナノメートル以下である。特定の実施形態では、ナノ粒子は５０ナノメートル以下である。さらに特定の実施形態では、ナノ粒子は２５ナノメートル以下である。これらの実施形態で使用される棒状形態（図１０）等、使用されることの多いナノ粒子の最小の断面径は、約９〜１１ｎｍである（Ｆｉｎｋ ＴＬ、Ｋｌｅｐｃｙｋ ＰＪ、Ｏｅｔｔｅ ＳＭ、Ｇｅｄｅｏｎ ＣＲ、Ｈｙａｔｔ ＳＬ、Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ ＴＨ、Ｍｏｅｎ ＲＣ、ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ、ＭＪ．（２００６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１３：１０４８−１０５１を参照のこと）。
等価物
当業者は、通例に過ぎない実験を使用して、本明細書に詳細に記載された特定の実施形態と等価な多くのものを認識し、または確認することができるだろう。当該等価物は、以下の請求項の範囲に包含されることを意図する。
本開示に記載の非限定的な代表的ナノ粒子を調製し、使用した。
材料と機器
ヒトＧＤＮＦ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡの本質的に単一の分子から成るＣＫ３０ＰＥＧ１０ｋナノ粒子をＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社（クリーブランド、オハイオ州）から入手した（図１、２、および１０を参照）。Ｃｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社は、この調査のために２つの発現プラスミドを提供してくれた：ｐＵＧＧ（ポリユビキチンＣプロモーターによる転写制御の下、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）に結合されたｈＧＤＮＦバリアントｌｂ）およびｐＧＤＮＦ−１ｂ（同プロモーターの下、ｈＧＤＮＦ−１ｂ）（同書）。ｐＵＧＧはＧＦＰ−ＧＤＮＦ融合タンパク質を生成し、脳内の形質移入および発現を検出することができる。ＧＦＰ配列を欠損するｐＧＤＮＦ−１ｂを、６−ＯＨＤＡ神経保護の試験に使用した。実験に使用されるＳＤ系ラットは、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ、ジャーマンタウン、ニューヨーク州から入手した。
ＣＫ ３０ ＰＥＧ１０Ｋナノ粒子の分析
ＰＥＧ化ポリリジンＤＮＡナノ粒子の電子顕微鏡写真は、ナノ粒子が溶解素について対イオン酢酸塩を使用して形成した場合に、ロッド様形状を有することを示し（図１０；スケールバー＝２００ｎｍ）、Ｆｉｎｋ ＴＬ、Ｋｌｅｐｃｙｋ ＰＪ、Ｏｅｔｔｅ ＳＭ、Ｇｅｄｅｏｎ ＣＲ、Ｈｙａｔｔ ＳＬ、Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ ＴＨ、Ｍｏｅｎ ＲＣ、ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ、ＭＪ．（２００６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１３：１０４８−１０５１を参照されたい。
ラットの脳のプラスミドナノ粒子の形質移入および発現の試験
ラットに、５ｍｍの長さのポリエチレン管を備えた１０マイクロメーターのハミルトン・シリンジを使用して、ｐＵＧＧナノ粒子または裸のプラスミドを鼻腔内投与した（８８μｇのＤＮＡ；両側交互に２．５μｌずつ増加して２０μｌ）。７日後、動物を屠殺し、脳を冠状の切片に切り分けた。脳切片のそれぞれの発現はＧＦＰ−ＥＬＩＳＡによって確認された。捕捉抗体はマウスの抗ＧＦＰ抗体であった（ＳｉｇｍａＧ６５３９、１：４０００）。ｅＧＦＰ標準および脳のホモジネートを加え、プレートを室温で２時間インキュベートした。ウサギ抗ＧＦＰ抗体（Ａｂｃａｍ２９０，１：４，０００）およびＨＲＰに結合された抗ウサギ第二抗体（ＧＥ ＮＡ０３４０、１：４，０００）を使用してｅＧＦＰの検出を行った。発色させるためにＳｕｒｅＢｌｕｅＴＭＢ基質（ＫＰＬ＃５２−００−０１）を加えた。Ｇｅｎ５ソフトウェアを備えたＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ８００プレートリーダーに光学濃度を読んだ。鼻腔内投与から７日後、ｐＵＧＧナノ粒子を与えられたラットの脳の吻側-尾側軸の全てに沿ってＧＦＰが検出され、鼻腔のちょうど背後にある前頭皮質および嗅球で値が最も高かった（図３Ａおよび３Ｂ）。この結果は、ｐＵＧＧナノ粒子が鼻腔内送達の後に、首尾よく脳内の細胞を形質移入することを示し、この形質移入がコードされたタンパク質を発現させる。
前頭皮質に対して尾側の脳領域では、一般的にＧＦＰ値が低かったが、圧縮されたｐＵＧＧナノ粒子を与えられたラットの方が、裸のプラスミドを与えられたラットよりＧＦＰ値は有意に高いままであった（図４）。重要なことに、ｐＵＧＧナノ粒子を与えられたラットの線条体および中脳の両方で、ＧＦＰ値が有意に上昇した。この領域は、パーキンソン病の治療について、タンパク質が発現されなければならない脳領域である。
パーキンソン病モデルのｐＧＤＮＦナノ粒子の効果の試験
ラット６−ＯＨＤＡモデルでパーキンソン病の試験を行った。ラットにｐＧＤＮＦ−１ｂナノ粒子ナノ粒子（ＮＰ）、若しくは裸のプラスミド（８８μｇのＤＮＡ；両側交互に２．５μｌずつ増加させて２０μｌ、ｎ＝７〜８／群）、またはリン酸緩衝塩類溶液のいずれかを鼻腔内投与した。７日後、ＧＤＮＦが発現しているときに、ラットに麻酔をかけ、６−ＯＨＤＡ（２ｍｇ／ｍｌの４μｌ；総用量８μｇ）を、左内側前脳束に外科的注入した。以下の定位座標に注入した：−１．２ｍｍ側部、ラムダ縫合に対して＋０．４４ｍｍ前部、および頭蓋表面に対して−８．３ｍｍ腹部。
ノルエピネフリンニューロンに神経毒が及ばないようにするために、手術３０分前にデシプラミン（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を投与した。この手順は、黒質（ＳＮ）ドーパミンニューロンの片側の病変を産生した。動物はさらに３〜４週間で回復し、その後、アンフェタミン曝露を用いて行動的評価をした。アンフェタミン（５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）は、損傷を受けた側と受けていない側に放出されるドーパミンとに不均衡が生じるために、片側６−ＯＨＤＡ病変のあるラットに回転行動を引き起こす。重症病変のあるラットは、病変に対して（反時計回りに）同側で回転し、その回転頻度は通常、病変の重症度に相関した。図５は、アンフェタミンを与えてから３０分間隔のラットの正味の同側回転数を示す。生理食塩水を鼻腔内投与されたラットが多く回転する傾向があった（病変の重症度もそれだけ大きい）。このことは、ｐＧＤＮＦ−１ｂを鼻腔内投与されたラットの損傷を受けた側で、ドーパミンニューロンが保護されていたことを示唆する。
体重増加はもう１つ別の神経保護の考えられる指標であり（すなわち病変の重症度を減少させる）、ｐＧＤＮＦ−１ｂ ＮＰ治療群の方が、生理食塩水対照群および裸のｐＧＤＮＦ−１ｂ群より、６−ＯＨＤＡ病変から屠殺される間の３〜４週間で、体重増加が大きかった（図６）。一方向分散分析では、治療による有意性を示し（ｐ＝０．００３５）、テューキーポストテストでは、生理食塩水とｐＧＤＮＦ−１ｂ ＮＰとの間（ｐ＜０．０５）、並びに裸のｐＧＤＮＦ−１ｂとｐＧＤＮＦ−１ｂ ＮＰとの間に有意差が示された（同書）。
治療を受けたラットの脳切片のｐＧＤＮＦナノ粒子の効果の根拠
アンフェタミン曝露の完了後、ラットに深く麻酔をかけ、４％のパラホルムアルデヒドの経心腔的灌流によって、屠殺した。チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫組織化学（ＩＨＣ）のために、各ラットの線条体および黒質（ＳＮ）から切片を回収した。ＴＨはドーパミンニューロンのためのマーカーである。代表的なＳＮ切片を図７に示す。ＢＩＯＱＵＡＮＴ画像分析ソフトウェアを使用して、％病変を計算するために１００から減算されたパーセンテージで、各ラットの損傷を受けたＳＮと損傷を受けていないＳＮの両方のＴＨ免疫染色密度を測定した。各動物について、当該値は、吻側に沿った６つの切片からＳＮの尾側の軸までの平均の染色を示す。
結果は、損傷の前に１週間、圧縮されたｐＧＤＮＦ−１ｂを鼻腔内投与されたラットの方が、裸のｐＧＤＮＦ−１ｂまたは鼻腔内に生理食塩水を与えられたラットより、ＳＮのＴＨ染色密度が有意に高いことを示した。これらの結果は、６−ＯＨＤＡモデルの鼻腔内ｐＧＤＮＦ−１ｂナノ粒子の神経保護効果と一致している（図８および９）。
ｐＧＤＮＦ−１ｂを鼻腔内（ＩＮ）投与されたラットの６−ＯＨＤＡ−損傷ＳＮの方が、生理食塩水を鼻腔内（ＩＮ）投与された対照群よりも、ＴＨ染色密度が高く、ドーパミン細胞数が多かった。病変の重症度は、左側（損傷を受けた）対右側（無傷）のＴＨ染色密度を比較することによって評価した（図８）。生理食塩水を鼻腔内（ＩＮ）投与されたラットの平均病変は７７．７％であり、裸のｐＧＤＮＦ−１ｂおよびｐＧＤＮＦ−１ｂＮＰを鼻腔内（ＩＮ）投与されたラットの病変は、それぞれ、たったの４５．０％と２８．９％であった。一方向分散分析では、治療群から有意な効果を示し（ｐ＝０．００８１）、テューキーポストテストでは、ｐＧＤＮＦ−１ｂ ＮＰと生理食塩水との間に有意差が示された（＊ｐ＜０．０１）（同書）。
損傷を受けたＴＨポジティブの（すなわちドーパミン）ニューロンと無傷のＳＮの数を比較することによって、病変の重症度も評価した（図９）。鼻腔内にｐＧＤＮＦ−１ｂを与えられたラットの損傷を受けたＳＮの％ドーパミン細胞喪失が有意に低かった。保護効果は、鼻腔内ｐＧＤＮＦ−ｌナノ粒子を与えられたラットの方が、裸のプラスミドを与えられたラットより大きかった。一方向分散分析では、治療群から有意な効果を示し（ｐ＝０．０００８）、テューキーポストテストでは、ｐＧＤＮＦ−１ｂ ＮＰ対生理食塩水について（＊ｐ＜０．００１）、および裸のｐＧＤＮＦ−１ｂ対生理食塩水について（＃ｐ＜０．０５）、有意差を示した（同書）。

Claims (53)

  1. 脳内に核酸を送達し発現させる方法であって、核酸ナノ粒子を鼻腔内投与することを含み、投与されるナノ粒子は、１つのナノ粒子あたり約１つの比率で核酸分子を含む、前記方法。
  2. 核酸配列は治療的タンパク質をコードする請求項１に記載の方法。
  3. 核酸配列は治療的アンチセンス部分をコードする請求項１に記載の方法。
  4. 核酸配列は治療的アンチセンス部分を含む請求項１に記載の方法。
  5. 核酸ナノ粒子はポリカチオンをさらに含む請求項１に記載の方法。
  6. ポリカチオンはポリリジンである請求項５に記載の方法。
  7. 核酸ナノ粒子はプラスミドＤＮＡを含む請求項１に記載の方法。
  8. 核酸配列は配列番号１の核酸配列を含む請求項１に記載の方法。
  9. 核酸配列はＧＤＮＦ活性を有するポリペプチドをコードする請求項８に記載の方法。
  10. ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を有する請求項９に記載の方法。
  11. 対象のニューロンを細胞死から保護する方法であって、有効量の治療的核酸ナノ粒子を対象に鼻腔内投与することを含み、該ナノ粒子は細胞損傷からニューロンを保護し、または細胞損傷からの回復を促進する生成物を発現しまたは含む、前記方法。
  12. 生成物はポリペプチドである請求項１１に記載の方法。
  13. ポリペプチドはＧＤＮＦ活性を有するポリペプチドである請求項１２に記載の方法。
  14. ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を有する請求項１２に記載の方法。
  15. ポリペプチドは、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン、ＢＤＮＦ、ＳＤＦ−１、神経成長因子（ＮＧＦ）、活性依存性神経栄養因子（ＡＤＮＰ）、インスリン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、オキシトシン、βインターフェロン、ニューロテンシン、コレシストキニン、神経ペプチドＹ、黄体形成ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、アルギニンバソプレシン、インターフェロン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ、およびＴＧＦ、抗−ＶＥＧＦ、サイトカインまたはオートクリン因子から成る群から選択される活性を有するポリペプチドである、請求項１２に記載の方法。
  16. 対象のニューロンはドーパミン作動性神経である請求項１１に記載の方法。
  17. 対象のニューロンは黒質に位置する請求項１６に記載の方法。
  18. 対象のニューロンは海馬に位置する請求項１１に記載の方法。
  19. 対象のニューロンは大脳皮質に位置する請求項１１に記載の方法。
  20. 対象のニューロンは運動ニューロンである請求項１１に記載の方法。
  21. ナノ粒子はポリカチオンをさらに含む請求項１１に記載の方法。
  22. ポリカチオンはポリリジンである請求項２１に記載の方法。
  23. ナノ粒子はＣＫ−ＰＥＧ−ＧＤＮＦナノ粒子である請求項１３に記載の方法。
  24. 有効量のナノ粒子を鼻腔内投与することによってパーキンソン病を罹患している対象を治療する、請求項１１に記載の方法。
  25. 有効量のナノ粒子を鼻腔内投与することによって、ハンチントン病、アルツハイマー病、痴呆、バッテン病、テイ・サックス病、多発性硬化症、うつ病、アルコール依存症、物質依存症、自閉症圏障害、心的外傷後ストレス症候群（ＰＴＳＤ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、中枢神経系ループス、中枢神経系の自己免疫疾患、てんかん、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、疼痛性障害、および神経筋疾患から成る群から選択される疾患に罹患している対象を治療する、請求項１１に記載の方法。
  26. 治療的核酸ナノ粒子の有効量は０．１ｎｇ〜１．０μｇである請求項１１に記載の方法。
  27. 治療的核酸ナノ粒子の有効量は１．０μｇ〜１ｍｇである請求項１１に記載の方法。
  28. 治療的核酸ナノ粒子の有効量は１．０ｍｇ〜１ｇｍである請求項１１に記載の方法。
  29. 治療的核酸ナノ粒子の投与量が、液滴として、スプレーミストとしてエアロゾル化され、または数分から数時間で送達するためにポンプを用いて、鼻腔内投与される、請求項１１に記載の方法。
  30. 治療的核酸ナノ粒子の投与量が、定められた時間経過にわたって複数回、鼻腔内投与される、請求項１１に記載の方法。
  31. 各ナノ粒子は、配列番号１の核酸配列を有するプラスミドを含む、請求項１１に記載の方法。
  32. 配列番号１は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現する請求項１１に記載の方法。
  33. ポリペプチドはニューロンを細胞死から保護し、またはその回復および再生を促進する、請求項１または１１のいずれかに記載の方法。
  34. 生成物はアンチセンスＲＮＡである請求項１１に記載の方法。
  35. 脳または脳幹障害を罹患している対象を治療する方法であって、有効量の圧縮された核酸ナノ粒子を対象に鼻腔内投与することを含み、投与されるナノ粒子は、１つのナノ粒子あたり約１つの比率で核酸分子を含み、当該核酸は治療的部分をコードしまたは含み、ここでナノ粒子は脳または脳幹障害を治療する、前記方法。
  36. ナノ粒子は生成物をコードする核酸を含む請求項３５に記載の方法。
  37. 生成物はポリペプチドである請求項３６に記載の方法。
  38. 生成物は、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン、活性依存性神経栄養因子（ＡＤＮＰ）、インスリン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、オキシトシン、およびβインターフェロン、ＢＤＮＦ、ＳＤＦ−１、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロテンシン、コレシストキニン、神経ペプチドＹ、黄体形成ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、アルギニンバソプレシン、インターフェロン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ、およびＴＧＦ、抗−ＶＥＧＦ、サイトカインまたはオートクリン因子から成る群から選択される活性を有するポリペプチドである、請求項３７に記載の方法。
  39. ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を有する請求項３７に記載の方法。
  40. 生成物はアンチセンスＲＮＡである請求項３５に記載の方法。
  41. ナノ粒子はＲＮＡ分子を含む請求項３５に記載の方法。
  42. ナノ粒子はｍＲＮＡ分子を含む請求項３５に記載の方法。
  43. ナノ粒子はアンチセンス分子を含む請求項３５に記載の方法。
  44. 脳または脳幹障害は、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、痴呆、バッテン病、テイ・サックス病、多発性硬化症、うつ病、アルコール依存症、物質依存症、自閉症圏障害、心的外傷後ストレス症候群（ＰＴＳＤ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、中枢神経系ループス、中枢神経系の自己免疫疾患、てんかん、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、疼痛性障害、および神経筋疾患から選択される、請求項３５に記載の方法。
  45. 治療的核酸ナノ粒子の有効量は１．０ｎｇ〜１ｍｇである請求項３５に記載の方法。
  46. 治療的核酸ナノ粒子の有効量は１．０ｍｇ〜１ｇｍである請求項３５に記載の方法。
  47. 治療的核酸ナノ粒子の投与量が、液滴として、スプレーミストとしてエアロゾル化され、または数分から数時間で送達するためにポンプを用いて、鼻腔内投与される、請求項３５に記載の方法。
  48. 治療的核酸ナノ粒子の投与量が、定められた時間経過にわたって複数回、鼻腔内投与される、請求項３５に記載の方法。
  49. 脳または脳幹障害が腫瘍によって引き起こされる請求項３５に記載の方法。
  50. 腫瘍は神経性またはグリア細胞の増殖である請求項４９に記載の方法。
  51. 腫瘍は臓器からの転移である請求項４９に記載の方法。
  52. 核酸ナノ粒子は組織特異的プロモーターによって制御される生成物を発現する、請求項２、１１、または３５のいずれかの方法。
  53. プロモーターは、ＴＨプロモーターまたはグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターである、請求項５２に記載の方法。
JP2014561186A 2012-03-09 2013-03-11 中枢神経系障害を治療するための核酸ナノ粒子を中枢神経系へ送達する方法 Pending JP2015510889A (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261609042P 2012-03-09 2012-03-09
US61/609,042 2012-03-09
US201261725662P 2012-11-13 2012-11-13
US61/725,662 2012-11-13
US201361768895P 2013-02-25 2013-02-25
US61/768,895 2013-02-25
PCT/US2013/030264 WO2013134777A1 (en) 2012-03-09 2013-03-11 Methods for delivery to the central nervous system of nucleic acid nanoparticles to treat central nervous system disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2015510889A true JP2015510889A (ja) 2015-04-13

Family

ID=49117428

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014561186A Pending JP2015510889A (ja) 2012-03-09 2013-03-11 中枢神経系障害を治療するための核酸ナノ粒子を中枢神経系へ送達する方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9486540B2 (ja)
EP (1) EP2822600A4 (ja)
JP (1) JP2015510889A (ja)
WO (1) WO2013134777A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015059701A1 (en) * 2013-10-24 2015-04-30 Medgenics Medical Israel Ltd. Micro-organs providing sustained delivery of a therapeutic polypeptide and methods of use thereof
WO2016069760A1 (en) * 2014-10-31 2016-05-06 Steven Yu Method of treating dementia by intranasal administration of vegf gene therapy
WO2020014394A1 (en) * 2018-07-10 2020-01-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Intranasal vasopressin treatment of social deficits in autism
EP3849594A2 (en) * 2018-09-13 2021-07-21 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase complex e1-alpha, e1-beta, and e2 subunits for the treatment of maple syrup urine disease

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004532849A (ja) * 2001-04-20 2004-10-28 カイロン コーポレイション 中枢神経系へのポリヌクレオチド薬剤の送達
JP2005505529A (ja) * 2001-08-14 2005-02-24 テルアビブ・ユニバーシティ・フューチャー・テクノロジー・デベロップメント・エルピー 脂質化グリコサミノグリカン粒子ならびに診断及び処置のための薬物及び遺伝子送達におけるその使用
JP2009530257A (ja) * 2006-03-17 2009-08-27 シレンティス・エセ・ア・ウ Ｃｎｓ状態の治療

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6407061B1 (en) 1989-12-05 2002-06-18 Chiron Corporation Method for administering insulin-like growth factor to the brain
US5624898A (en) 1989-12-05 1997-04-29 Ramsey Foundation Method for administering neurologic agents to the brain
US5844107A (en) 1994-03-23 1998-12-01 Case Western Reserve University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
AU696455C (en) 1994-03-23 2006-03-02 Case Western Reserve University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
US5972901A (en) 1994-03-23 1999-10-26 Case Western Reserve University Serpin enzyme complex receptor--mediated gene transfer
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
US7273618B2 (en) 1998-12-09 2007-09-25 Chiron Corporation Method for administering agents to the central nervous system
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
DE60021760T2 (de) 1999-12-09 2006-06-08 Chiron Corp., Emeryville Verfahren zur verabreichung von wirkstoffen in das zentrale nervensystem oder lymphsystem
US20020042388A1 (en) 2001-05-01 2002-04-11 Cooper Mark J. Lyophilizable and enhanced compacted nucleic acids
US20040038303A1 (en) 2002-04-08 2004-02-26 Unger Gretchen M. Biologic modulations with nanoparticles
US20060258576A1 (en) * 2003-09-05 2006-11-16 Licentia, Ltd Gdnf-related neuropeptides
US7618615B2 (en) 2004-08-13 2009-11-17 Healthpartners Research Foundation Methods for providing neuroprotection for the animal central nervous system against neurodegeneration caused by ischemia
WO2006023286A2 (en) 2004-08-19 2006-03-02 Alza Corporation Controlled release nanoparticle active agent formulation dosage forms and methods
US7404969B2 (en) * 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
WO2007016501A2 (en) 2005-08-01 2007-02-08 The University Of Chicago Compositions and method for brain specific targeted delivery of therapeutic agents
WO2010088927A1 (en) * 2009-02-09 2010-08-12 Curevac Gmbh Use of pei for the improvement of endosomal release and expression of transfected nucleic acids, complexed with cationic or polycationic compounds
AU2011205629B2 (en) 2010-01-18 2015-01-29 Board Of Regents, University Of Texas System Methods and compositions for nanoparticle-mediated cancer cell-targeted delivery

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004532849A (ja) * 2001-04-20 2004-10-28 カイロン コーポレイション 中枢神経系へのポリヌクレオチド薬剤の送達
JP2005505529A (ja) * 2001-08-14 2005-02-24 テルアビブ・ユニバーシティ・フューチャー・テクノロジー・デベロップメント・エルピー 脂質化グリコサミノグリカン粒子ならびに診断及び処置のための薬物及び遺伝子送達におけるその使用
JP2009530257A (ja) * 2006-03-17 2009-08-27 シレンティス・エセ・ア・ウ Ｃｎｓ状態の治療

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MOLECULAR THERAPY, vol. 17, no. 4, JPN6016047176, 2009, pages 641 - 650, ISSN: 0003455906 *
PHARM RES, vol. 28, no. 9, JPN6016047179, 2011, pages 2130 - 2139, ISSN: 0003455907 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20150111946A1 (en) 2015-04-23
US9486540B2 (en) 2016-11-08
EP2822600A4 (en) 2016-04-06
EP2822600A1 (en) 2015-01-14
WO2013134777A1 (en) 2013-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nagahara et al. Potential therapeutic uses of BDNF in neurological and psychiatric disorders
Simonato et al. Progress in gene therapy for neurological disorders
Domanskyi et al. Prospects of neurotrophic factors for Parkinson's disease: comparison of protein and gene therapy
Kanter-Schlifke et al. Seizure suppression by GDNF gene therapy in animal models of epilepsy
US20160193251A1 (en) Method for treating als via the increased production of factor h
ES2968038T3 (es) Agonista GLP-1R de acción prolongada como terapia de afecciones neurológicas y neurodegenerativas
JP2015510889A (ja) 中枢神経系障害を治療するための核酸ナノ粒子を中枢神経系へ送達する方法
CN113679850B (zh) 一种被靶向修饰且装载有药物的外泌体及其制备方法和应用
US8329654B2 (en) Use of IL-6/IL-6 chimera in Huntington's disease
Fang et al. The neuroprotective effects of reg‐2 following spinal cord transection injury
EP3533471B1 (en) Composition for alleviating or treating pain
US20070275926A1 (en) Treatment of disorders of the peripheral nervous system
Kumar et al. Gene therapy for chronic neuropathic pain: how does it work and where do we stand today?
US20220152222A1 (en) Gene Therapy for Addiction Disorders
US20220324921A1 (en) Methods and compositions for the treatment of als
US20220280657A1 (en) Genetic Construct
CA3190597A1 (en) Compositions and methods for the treatment of ocular neuroinflammation
US11890314B1 (en) Pharmaceutical composition for treating, preventing or ameliorating spinal muscular atrophy and administration method thereof
US11873505B2 (en) Compositions and methods for regulating production of a precursor protein
KR20210120561A (ko) 운동 신경 손상 억제용 조성물 및 이를 이용한 손상억제 방법
Emborg et al. Viral vector-mediated gene therapy for Parkinson's disease
Aly An Intranasal GDNF Gene Therapy Approach for Treating Parkinson's Disease
WO2024100176A1 (en) Controlled gene therapy of ocular diseases
WO2023158300A1 (en) Polyomaviral gene delivery vector particle comprising a nucleic acid sequence encoding a phosphatase activity-possessing polypeptide
Laing et al. 508. The HSV-2 Gene ICP10PK Inhibits Development/Progression of Disease Markers in the G93A and G85R SOD-1 Models of ALS

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20160310

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20161121

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20161213

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20170313

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20170508

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170613

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20170613

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20171128

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20180703