KR20210120561A - 운동 신경 손상 억제용 조성물 및 이를 이용한 손상억제 방법 - Google Patents

운동 신경 손상 억제용 조성물 및 이를 이용한 손상억제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 운동 신경 손상 억제용 조성물 및 손상억제 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자를 포함하는 조성물은 신경세포의 손상을 억제하고 치료하는 효과가 우수하여, 다양한 운동 신경 손상 질환을 완화, 억제, 치료 또는 개선에 유용한 약제학적 조성물 또는 식품 조성물로 이용될 수 있다.

Description

운동 신경 손상 억제용 조성물 및 이를 이용한 손상억제 방법 {Composition for inhibiting motor neuron damage and method for inhibiting damage using same}
본 발명은 운동 신경 (motor neuron) 손상 억제용 조성물 및 이를 이용한 손상억제 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 Nurr1 및 Foxa2 유전자를 세포에 도입하여 발현을 유도함으로써 운동 신경의 손상을 억제하고 치료하는 방법에 관한 것이다.
운동 신경는 척수나 뇌와 같은 중추 신경계에서 전달되는 자극을 반응기로 전달하는 신경이다. 운동 신경은 중추신경계에서 전달되는 신호들을 각각의 반응기에 전달해서 자극에 대한 반응을 일으키는 역할을 수행한다. 반응기의 종류에는 비단 근육뿐만이 아니라 내분비선, 외분비선도 역시 포함된다.
신경계의 뇌, 척수 등에 위치하는 이러한 운동 신경이 불특정한 어떤 원인에 의해 진행성 및 퇴행성 손상 과정을 밟는 일련의 신경계 질환을 운동 신경 질환이라 한다. 운동 신경 질환에는 근위축성 측삭 경화증 (Amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 원발성 측삭 경화증 (Primary Lateral Sclerosis), 베르드니히-호프만 병 (Werdnig-Hoffman disease), 쿠겔베르그-벨란더 증후군(Kugelberg-Welander syndrome), 진행성 척수성 근육위축 (Progressive spinal muscular atrophy), 진행성 구마비 (Progressive bulbar palsy), 가족성 운동신경원 병 (Familial motor neuron disease) 등이 있다. 이 중 상위 운동 신경과 하위운동 신경이 함께 침범되어 발병하는 근위축성 측삭 경화증이 가장 대표적이다.
근위축성 측삭 경화증은 운동 신경 손상이 발생하는 질환으로 1869년 프랑스의 의사 장마르틴 샤콧 (Jean-Martin Chartcot)에 의해 최초로 보고되었다. 이후 1939년 미국의 유명한 야구 선수인 루게릭 (Lou Gehrig)이 이 질환을 앓게 되면서 일반 사람들에게 알려졌으며, 이때부터 일반적으로 루게릭병 (Lou Gehrig`s disease)이라고도 불리게 되었다. 근위축성 측삭 경화증은 뇌의 신경세포, 특히 운동 신경세포의 퇴행이 진행되어 뇌의 신경이 완전히 파괴되면서 나타나며, 뇌의 신경 세포뿐 아니라, 뇌간과 척수의 신경체계와 전신에 분포한 수의근을 담당하는 신경세포에도 영향을 미친다.
1990년대 이후, 근위축성 측삭 경화증에 대한 발병기전 규명과 치료방법 개발에 대한 많은 연구가 이루어져 왔으며, 일부 연구성과들이 보고되기도 하였다. 근위축성 측삭 경화증에 대한 일부 치료방법으로, 신경보호효과를 보이는 약물 복용, 호흡보조기 사용, 위루술시행, 다학제적 접근, 또는 말기환자에서 통증 완화를 위한 진통제와 항불안제 등이 도움이 된다고 알려져 있다.
하지만, 상기 치료방법들은 근위축성 측삭 경화증에 대한 근본적인 치료방법이 아니며, 아직까지 근위축성 측삭 경화증의 완치나 진행을 멈출 수 있는 치료방법은 알려져 있지 않은 실정이다.
이에 본 발명자들은 Nurr1 및 Foxa2 유전자를 포함하는 조성물을 제조하였고, 본 발명에 따른 조성물의 운동 신경 (motor neuron)에 손상에 대한 치료 및 억제효과가 월등히 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자를 포함하는 운동 신경 손상의 치료 또는 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 운동 신경 손상의 치료 또는 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자가 도입된 신경세포 (neurons)를 포함하는 운동 신경 손상의 치료 또는 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 운동 신경 손상 질환의 치료 또는 예방방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자가 도입된 신경세포를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 운동 신경 손상 억제용 조성물 및 손상억제 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 Nurr1 및 Foxa2 유전자를 포함하는 조성물은 운동 신경 손상에 대한 높은 치료 및 억제능을 나타낸다.
본 발명자들은 이에 Nurr1 및 Foxa2 유전자를 포함하는 조성물은, 운동 신경의 손상에 대해 치료 및 억제능을 가지고 있음을 확인하였고, 특히, Nurr1의 단독 발현보다는 보조 활성제 (coactivator)인 Foxa2가 병합 발현되었을 때 시너지 효과를 통한 운동 신경 손상의 치료 및 억제효과가 우수한 것을 확인하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는, Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자를 포함하는 운동 신경 손상의 치료 또는 억제용 조성물이다.
본 발명에 따른 조성물을 통해 Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자가 동물의 세포, 예를 들어, 신경세포 (neuron), 교질세포 (glia), 운동 신경 (motor neuron)에 도입될 수 있다. 그리고, 본 발명에서 "도입"은 Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자를 암호화하는 핵산을 세포로 형질도입하는 것을 의미한다.
Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자는 각각 별도로 또는 동시에 도입될 수 있다.
본 발명에서 Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자를 도입하기 위해 DNA-칼슘 침전법, 리포좀을 이용하는 방법, 폴리아민 계열을 사용하는 방법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 벡터 (vector) 등의 당해 기술분야에 공지된 유전자 세포내 도입방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는, Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 운동 신경 손상의 치료 또는 억제용 조성물이다.
본 발명의 일 구현예에서, Nurr1 및 Foxa2 유전자는 하나의 벡터에 동시에 탑재된 것일 수 있고, 또는, Nurr1 및 Foxa2 유전자는 각각의 벡터에 동시에 탑재된 것일 수 있다.
본 명세서상의 용어, "벡터 (vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 벡터는 목적 유전자 발현을 위한 요소 (elements)를 포함하는 것으로, 복제원점 (replication origin), 프로모터, 작동 유전자 (operator), 전사 종결 서열 (terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위 (ribosome binding site; RBS), IRES (Internal Ribosome Entry Site) 등을 추가로 포함할 수 있다. 벡터는 상기 프로모터 이외의 전사 조절 서열 예를 들어, 인핸서 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 벡터는 유전자 치료용 발현벡터를 의미한다. 용어 "유전자 치료 (gene therapy)"는 유전자 이상에 의하여 유발되는 각종 유전병을 치료하기 위하여, 유전자 이상이 있는 세포에 정상 유전자를 삽입하거나 새로운 기능을 제공하여 그의 기능을 정상화시키는 방법을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA, 비바이러스성 벡터, 바이러스성 벡터 및 유전자 발현 유도 벡터 시스템 (inducible gene expression vector system)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 예를 들어, 바이러스성 벡터일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 바이러스성 벡터는 레트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus), 아데노 부속 바이러스 (adeno associated virus; AAV), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus), 렌티바이러스 (lentivirus) 및 백시니아바이러스 (vaccinia virus) 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 예를 들어, 바이러스성 벡터는 아데노 부속 바이러스 또는 렌티바이러스일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자는 유전자 편집기술에 의해 벡터에 탑재될 수 있고, 예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 작동자 뉴클레아제 (TALEN) 및 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문 구조의 반복 서열 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/CRISR 관련 시스템 (CRISPR/Cas9)으로 도입될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
Nurr1 및 Foxa2를 암호화하는 각 핵산은 당업계에 공지된 Nurr1 및 Foxa2를 암호화하는 염기서열을 가지는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있고, 핵산은 Nurr1 및 Foxa2의 각 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다.
기능적 동등물을 암호화하는 염기서열은 Nurr1 및 Foxa2의 아미노산서열과 적어도 70％ 이상, 80％ 이상, 또는 90％ 이상의 서열 상동성을 가질 수 있고, 예를 들어, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물 내의 유효성분으로서의 벡터의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절될 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 99.99 중량%, 또는 0.1 내지 99.9 중량%, 예를 들어 1 내지 99 중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물 내의 Nurr1 유전자의 농도는 Foxa2 유전자의 농도대비 0.001 내지 10000 배, 0.01 내지 1000배, 0.1 내비 100배, 1 내지 10배, 예를 들어, 1배 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물 내의 유효성분으로서의 Nurr1 유전자의 농도는 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절될 수 있으며, 1 x 1013 내지 1 x 106 GC/㎕ (GC: genome copy), 1 x 1012 내지 1 x 107 GC/㎕, 1 x 1011 내지 1 x 108 GC/㎕, 예를 들어, 1 x 1010 내지 1 x 109 GC/㎕ 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물 내의 유효성분으로서의 Foxa2 유전자의 농도는 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절될 수 있으며, 1 x 1013 내지 1 x 106 GC/㎕ (GC: genome copy), 1 x 1012 내지 1 x 107 GC/㎕, 1 x 1011 내지 1 x 108 GC/㎕, 예를 들어, 1 x 1010 내지 1 x 109 GC/㎕ 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물의 1일 투여량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절될 수 있으며 유효성분 함량 기준으로 0.001 내지 10000 ㎍/ml일 수 있고, 예를 들면 1 내지 1000 ㎍/ml 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 운동 신경 손상의 치료 또는 억제용 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연고제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 경피제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 조성물은 혼합 추출물 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
제제화할 경우에는 당업계에서 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있고, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
경구를 위한 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 연고제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 경피제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
좌제의 제제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 운동 신경 손상의 치료 또는 억제용 조성물은 식품 조성물일 수 있다.
식품 조성물은 각종 식품, 음료, 식품 첨가제 등 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 식품 조성물에 포함될 수 있는 탄수화물로는 포도당 과당 등의 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스, 올리고당 등의 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 폴리사카라이드 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 식품 조성물에 포함될 수 있는 향미제는 타우마틴, 스테비아 추출물 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파탐 등의 합성 향미제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또는 다른 양태는, Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자가 도입된 세포를 포함하는 운동 신경 손상의 치료 또는 억제용 조성물이다.
본 발명의 일 구현예에서, 세포는 신경세포일 수 있고, 예를 들어, 운동 신경 (motor neuron)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자를 포함하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법에 의해 세포내로 도입될 수 있고, 예를 들어, 일시적 형질감염 (transient transfection), 미세주사, 형질도입 (transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염 (liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염 (DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염 (polybrene-mediated transfection), 전기침공법 (electroporation), 유전자 총 (gene gun), 벡터로 세포내로 도입될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 도입은 선형 DNA, 플라스미드 DNA, 비바이러스성 벡터, 바이러스성 벡터 및 유전자 발현 유도 벡터 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 바이러스성 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스 및 백시니아바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 예를 들어, 바이러스성 벡터는 아데노바이러스 또는 렌티바이러스일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 조성물에 포함되는 신경세포의 수는 당업자의 통상의 지식 내에서 대상체 또는 환자에 맞추어 적절히 조절될 수 있으며, 10 내지 1,000,000,000 세포, 1000 내지 100,000,000 세포, 예를 들어, 100,000 내지 50,000,000일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태는, Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 운동 신경 손상 질환의 완화, 억제, 치료 또는 예방용 약제학적 조성물이다.
운동 신경 손상 질환은, 근위축성 측삭 경화증 (Amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 원발성 측삭 경화증(Primary Lateral Sclerosis), 베르드니히-호프만 병 (Werdnig-Hoffman disease), 쿠겔베르그-벨란더 증후군(Kugelberg-Welander syndrome), 진행성 척수성 근육위축 (Progressive spinal muscular atrophy), 진행성 구마비 (Progressive bulbar palsy), 가족성 운동신경원 병 (Familial motor neuron disease) 등일 수 있고, 예를 들어, 근위축성 측삭 경화증일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태는, 다음 단계를 포함하는 Nurr1 및 Foxa2 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 운동 신경 손상의 치료 또는 억제용 조성물의 제조방법이다:
Nurr1 및 Foxa2를 암호화하는 핵산을 포함하는 DNA 구조물 (construct)을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제조하는 벡터 제조 단계.
제조 단계에서, Nurr1 및 Foxa2 유전자는 유전자 편집기술에 의해 벡터에 탑재될 수 있고, 예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제, 전사 활성인자-유사 작동자 뉴클레아제 및 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문 구조의 반복 서열 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/CRISR 관련 시스템 (CRISPR/Cas9)으로 도입될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태는, 다음 단계를 포함하는 Nurr1 및 Foxa2 유전자가 도입된 신경세포를 포함하는 운동 신경 손상의 치료 또는 억제용 조성물의 제조 방법이다:
Nurr1 및 Foxa2를 암호화하는 핵산을 포함하는 DNA 구조물을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제조하는 벡터 제조 단계;
재조합 바이러스 벡터를 바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 Nurr1 및Foxa2 발현 재조합 바이러스를 제조하는 바이러스 제조 단계; 및
Nurr1 및 Foxa2 발현 재조합 바이러스로 신경세포를 감염시키는 감염 단계.
본 발명에 따른 조성물 제조방법은, 예를 들어, Nurr1 및 Foxa2 유전자를 아데노 관련 바이러스 또는 렌티바이러스 벡터에 삽입하여 발현벡터를 제작한 후, 이 벡터를 포장 (packaging) 세포에 형질도입하고, 형질도입된 포장세포를 배양한 후 여과하여 아데노 관련 바이러스 또는 렌티바이러스 용액을 얻고, 이를 이용하여 신경세포를 감염시켜 신경세포에 Nurr1 및 Foxa2 유전자를 도입함으로써 수행될 수 있다. 그리고, 아데노 관련 바이러스 또는 렌티바이러스 벡터에 포함된 선별마커를 이용하여 Nurr1 및 Foxa2를 동시 발현하는 것을 확인 후 원하는 신경세포를 수득할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는, 다음의 단계를 포함하는 운동 신경 손상 질환의 치료 또는 예방방법이다:
Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태는, 다음의 단계를 포함하는 운동 신경 손상 질환의 치료 또는 예방방법이다:
Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자가 도입된 신경세포를 대상에 투여하는 단계.
본 명세서에서 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 대상에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미한다. 본 발명의 Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있고, 예를 들어, 뇌 내 투여, 뇌실 내 투여, 척추강 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물은, 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있고, 예를 들어, 정위고정기 (Stereotactic System)를 이용한 해마 (hippocampus) 주사제, 뇌실 주사제, 중뇌 (midbrain) 주사제, 뇌척수액 주사제, 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제 또는 점적 주사제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
주사제는 생리식염액 또는 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르 (예로, 올레인산에칠 등), 알코올류 (예로, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜 또는 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제 (예로, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예로, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "대상"은, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 예를 들어, 포유류, 구체적으로는 인간을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물은 개체에 치료학적 유효량에 따라 개체에 투여될 수 있고, 본 명세서상의 용어 "치료학적 유효량"은 운동 신경의 손상을 치료하거나 억제하기 위해 충분한 양을 의미하며, 이는 대상 (환자)의 필요성, 대상 (환자)의 연령, 생리학적 상태 및 건강, 소정의 치료 효과, 치료에 표적하고자 하는 조직의 크기 및 면적, 병변의 정도 및 선택된 전달 경로에 따라 적절히 조절될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는, Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자가 탑재된 벡터를 포함하는 조성물의 운동 신경 손상 질환의 완화, 억제, 치료 또는 예방 용도이다.
본 발명의 또 다른 양태는, Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자가 도입된 신경세포를 포함하는 조성물의 운동 신경 손상 질환의 완화, 억제, 치료 또는 예방 용도이다.
본 발명은 운동 신경 손상 억제용 조성물 및 이를 이용한 손상억제 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 Nurr1 및/또는 Foxa2 유전자를 포함하는 조성물은 신경세포의 손상을 억제하고 치료하는 효과가 우수하여, 다양한 운동 신경 손상 질환을 완화, 억제, 치료 또는 개선에 유용한 약제학적 조성물 또는 식품 조성물로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예 따른 Nurr1 및 Foxa2 유전자가 탑재된 바이러스 벡터 조성물을 G93A-SOD1 마우스에 투여하였을 때, 실험군 1 (Vehicle), 실험군 2 (AAV-2), 실험군 3 (AAV-1)의 전체 보행 판별 점수를 나타내는 그래프이다.
도 2는 Saline 만을 투여한 대조군과 본 발명의 일 실시예 따른 Nurr1 및 Foxa2 유전자가 탑재된 바이러스 벡터 조성물을 G93A-SOD1 마우스에 투여하였을 때의, 개별 보행 판별 점수를 나타내는 그래프이다.
도 3은 Nurr1 및 Foxa2 유전자가 탑재된 바이러스 벡터 조성물을 G93A-SOD1 마우스에 투여하여 측정한 보행 판별 점수를 10개의 주성분 (Principal components; PCs)을 사용한 주성분 분석 (Principal component analysis; PCA)하여 나타낸 히트맵이다 (붉은 색 = 양의 상관 관계, 푸른 색 = 음의 상관 관계, 검정 = 상관 관계 없음).
도 4는 Nurr1 및 Foxa2 유전자가 탑재된 바이러스 벡터 조성물을 G93A-SOD1 마우스에 투여하여 측정한 보행 판별 점수를 주성분 분석하여 얻은 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예 따른 Nurr1 및 Foxa2 유전자가 탑재된 바이러스 벡터 조성물을 G93A-SOD1 마우스에 투여하였을 때의, 실험군 1 (Vehicle), 실험군 2 (AAV-2), 실험군 3 (AAV-1)의 평균 꼬리 끝 (Tail tip)의 높이를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예 따른 Nurr1 및 Foxa2 유전자가 탑재된 바이러스 벡터 조성물을 G93A-SOD1 마우스에 투여하였을 때의, 실험군 1 (Vehicle), 실험군 2 (AAV-2), 실험군 3 (AAV-1)의 평균 꼬리 기부 (Tail base)의 높이를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예 따른 Nurr1 및 Foxa2 유전자가 탑재된 바이러스 벡터 조성물을 G93A-SOD1 마우스에 투여하였을 때의, 실험군 1 (Vehicle), 실험군 2 (AAV-2), 실험군 3 (AAV-1)의 평균 보행 속도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합벡터 제조
CMV 촉진유전자 (promoter)의 통제하에 Nurr1 또는 Foxa2을 발현하는 렌티바이러스성 벡터들을 생성하기 위해 각각의 cDNA를 pCDH (System Biosciences, USA)의 다중클로닝 부위에 삽입하였다. pGIPZ-shNurr1과 pGIPZ-shFoxa2 렌티바이러스성 벡터들은 Open Biosystems사 (Rockford; IL)로부터 구입하였다. 공 (empty) 백본 벡터들 (pCDH 또는 pGIPZ)이 음성제어로서 사용되었다. 생체 외 배양들을 형질 도입하기 위해 렌티 바이러스들을 제조하여 사용하였다 (Yi SH, He XB, Rhee YH, Park CH, Takizawa T, Nakashima K, Lee SH (2014) Foxa2 acts as a co-activator potentiating expression of the Nurr1-induced DA phenotype via epigenetic regulation. Development 141: 761-772). 렌티바이러스들의 역가는 QuickTiterTM HIV 렌티바이러스 정량 키트 (Cell Biolabs사, USA)를 이용하여 측정되었고, 106개의 형질 도입 유닛 (transducing unit, TU)/ml (60 내지 70ng/ml)을 포함한 200μl/well(24 well 접시) 또는 2ml/6cm 접시가 각각의 형질 도입 반응에 사용되었다.
정위기방법 (stereotaxic) 주사에 의해 생체 내 발현을 유도하기 위해, CMV 촉진자의 통제하에 Nurr1 또는 Foxa2 [적혈구응집소 (hemagglutinin; HA)로 태그됨]를 발현하는 AAV들을 각각의 cDNA들을 pAAV-MCS 벡터 (Addgene사, USA)로 서브클로닝함으로써 생성하였다. 전이 유전자 발현의 효율을 평가하기 위하여, 녹색형광단백질 (green fluorescent protein; GFP)를 발현하는 AAV들도 생성하였다. AAV들 (혈청형 2)의 포장 및 생성은 한국 과학기술연구원 (KIST, 대한민국 서울)에서 수행하였다. AAV 역가는 QuickTiterTM AAV 정량 키트 (Cell Biolabs)로 측정되었다. 공동 발현 연구는 개별 바이러스 제제의 혼합물 (1:1, virus genome copy(gc) : virus gc)로 세포를 감염시켜 수행되었다.
실시예 2: 동물 관리 및 실험
1-1. 실험동물
모든 동물 실험은 핀란드 국립 동물 실험위원회 (National Animal Experiment Board)가 승인 한 라이센스 및 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 미국 국립 보건원 (National Institutes of Health, USA) 지침에 따라 수행되었다.
실험동물로 잭슨 연구소 (Jackson Laboratory, USA)에서 구입한 G93A-SOD1 형질전환 (transgenic) 마우스 (strain B6SJLTg(SOD1*G93A)1Gur/J) 수컷 총 45 마리를 준비하였다. 실험에 사용한 마우스는 루게릭병 마우스 모델 (Gurney et. Al, (1994) Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation, Science 264, 1772-1775) 로 인간 SOD1-G93A 유전자가 형질변형된 것이다. 마우스는 온도 (22 ± 1 ° C)와 빛이 조절 (오전 7시부터 오후 8시까지 점등)되고, 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 통제된 환경에 수용하였다. 그리고, 실험 시작 1 주일 전에 마우스를 시험 바이러스에 적응시켰다.
실험은 하기와 같이 마우스를 3가지 그룹으로 나누어 진행하였다.
실험군 1: AAV 벡터 조성물을 포함하지 않는 부형제 (Vehicle)만을 8주령 내지 17주령의 형질전환 마우스에 처리
실험군 2: AAV 벡터 조성물을 낮은 용량으로 8주령 내지 17주령의 형질전환 마우스에 처리
실험군 3: AAV 벡터 조성물을 높은 용량으로 8주령 내지 17주령의 형질전환 마우스에 처리
상기 실험군 1은 Nurr1 및 Foxa2 유전자를 주입하지 않고 부형제 (0.9% Saline)만을 주사하였으며, 실험군 2 및 실험군 3은 Nurr1 유전자와 Foxa2 유전자를 각각 포함하는 AAV9-CMV-mNurr1-flag 및 AAV9-CMV-rFoxa2-HA 재조합벡터를 각각의 용량에 따라 주사하였고, 이때 투여한 조성물 및 그 용량은 표 1에 나타내었다.
실험군 투여 조성물 부형제 벡터 용량 투여 경로 실험군 크기 1 개체당 총 투여횟수
(titer GC/animal) (μL,total)
1 부형제 0.9% saline 0 5 경막내 15 1
2 AAV 벡터 0.9% saline 4.375 x 1010 5 경막내 15 1
3 AAV 벡터 0.9% saline 1.094 x 1010 5 경막내 15 1
1-2. 마우스 경막내 AAV 주사
바이러스 벡터의 경막내 (Intrathecal) 투여를 위해, 마우스를 먼저 2 내지 5 % 이소플루레인 (isoflurane)을 사용하여 마취시키고 수술 플랫폼에 놓았다. 수술은 마우스의 신체를 45°로 기울인채 진행하였다.
8주령 마우스의 피부를 면도한 후, Xylocain® 겔 (2 % 리도카인)을 해당 부위에 도포했다. 5분 후, 겔을 제거하고 피부 절개를 위한 멸균제로서 요오드 (베타 딘, 1:10 희석)로 절개 부위를 문질렀다. 이 후, 척추후궁절제술 (Laminectomy)을 위해 척추를 노출시켰다. 척추후궁절제술은 경막을 교란하지 않으면서 제대를 노출시키는 요추 (L5)에서 수행되었다.
경막이 가시화된 후, 멸균된 30 게이지 바늘을 사용하여 경막 및 지주막에 작은 구멍을 뚫었다. 그리고, 구멍을 뚫은 부위를 통해 뇌척수액 누출을 관찰함으로써, 척추 지주막하 공간이 관통되었음을 확인하였다.
이후, 미세 주입 시스템에 장착된 10 μL 주사기 (Hamilton, USA)에 부착된 캐뉼라를 지주막하 공간에 삽입하고, 경막 아래에서 약 5mm로 조심스럽게 진행시켜 바늘의 개구부가 원하는 위치에 있도록 함으로써 L5의 요추로 전진시켰다. 그리고, 바늘과 경막 개구부 사이의 접합부를 티슈 실란트 접착제 (Baxter, USA)로 밀봉하고 Nurr1 유전자 및 Foxa2 유전자를 포함하는 AVV 조성물 주입을 시작하였다.
5 ㎕의 AAV 조성물을 10 분에 걸쳐 0.5 ㎕/분의 속도로 주입한 후, 5 분의 안정화 기간을 거쳐 캐뉼라를 척수강 내 공간으로부터 회수하였다. 캐뉼라 회수 직후에, 밀봉 접착제를 사용하여 경막의 개구를 폐쇄하였다. 그 후, 근육과 피부를 층으로 막고 소독하였다. 그리고, 마우스를 하우징 케이지로 돌려보내기 전에 1시간 동안 케이지에서 회복시켰다.
1-3. 마우스 보행 분석
마우스의 미세 운동 및 보행을 측정하기 위해 14주령 마우스의 운동을 미세 운동 운동학적 분석 장치인 MotoRater (TSE Systems, Germany)으로 평가하였다. 분석은 데이터 분석 과정을 용이하게하기 위해 마우스의 관절 및 꼬리 부분과 같은 신체 부위에 특정 표지를 한 후 진행되었다.
움직임 데이터는 3 차원의 고속 카메라 (300프레임/초)를 사용하여 마우스의 아래 및 좌우에서 영상을 캡처하여 획득하였다. 캡쳐된 각 마우스의 영상은 SimiMotion 소프트웨어로 변환하여 표지된 신체 지점을 추적하였다. 이후, 다양한 걸음 걸이 패턴과 움직임을 맞춤형 자동화 분석 시스템을 사용하여 아래의 파라미터들을 분석하였다.
1) 일반 보행 패턴 파라미터 (보행 시간 및 속도, 보폭, 보폭 조정 및 자세)
2) 신체 자세 및 균형 (발가락, 장골 높이 및 엉덩이 높이, 뒷다리 끌림과 수축, 꼬리의 위치 및 움직임)
3) 미세 운동 능력 (보폭 중 스윙 속도, 스윙 단계 중 스윙 속도, 각 관절의 각도 범위 및 편차, 수직 및 수평 헤드 이동).
분석결과, 도 1 내지 도 2에서 확인할 수 있듯이 AAV 재조합 벡터를 처리한 실험군 2 및 실험군 3 모두 부형제만을 처리한 실험군 1에 비해 평균적인 보행 능력이 월등하게 개선된 것을 확인하였다. 특히, 도 2에 나타난 바와 같이, 실험군 2 및 실험군 3의 마우스는 꼬리의 높이 (Tail tip)가 실험군 1 보다 유의미하게 높은 것을 확인하였다.
또한, 상기 실험과 함께 10개의 주성분 (Principal components; PCs)를 사용한 주성분 분석 (Principal component analysis; PCA)를 수행하였고, 그 결과로 도 3의 히트맵을 작성하였다.
그리고, 주성분 분석 결과 10개의 주성분 중 PC#5는 도 3에 나타난 바와 같이 꼬리 높이를 측정하는 보행 매개 변수와 상관관계가 크게 나타났다.
한편, G93A-SOD1 형질전환 (transgenic) 마우스의 경우, 운동 신경의 손상에 의한 영향으로 성별에 관계없이 생후 약 30일부터 꼬리가 내려가기 시작하는 것으로 알려져 있다 (Chrystian Junqueira Alves, Luana Pereira de Santana, Angιlica Angelica Janaina Dias dos Santos et. Al, (2011) Early motor and electrophysiological changes in transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis and gender differences on clinical outcome. Brain Research 1394: 90-104).
그리고, 도 4 내지 도 7에 나타난 바와 같이 G93A-SOD1 형질전환 마우스에 AAV 재조합 벡터가 처리된 실험군 2 및 실험군 3의 14주령 마우스는 꼬리 높이를 측정하는 보행 매개 변수와 상관관계가 큰 PC#5의 점수가 실험군 1에 비해 아주 우수했으며, 실제로 실험군 1에 비해서 기부와 끝 부분 모두에서 꼬리가 유의미하게 높았다.
따라서, 전술한 바와 같이 G93A-SOD1 형질전환 마우스의 꼬리가 운동 신경의 손상에 의한 영향으로 내려가는 점을 고려했을 때, 실험군 2 및 실험군 3의 마우스는 운동 신경 손상의 유의한 개선을 가져오는 것을 동물모델에서 행동학적으로 확인하였다.
결론적으로, Nurr1 및 Foxa2 유전자 또는 이를 포함하는 조성물은 운동 신경의 손상을 개선함에 따라, 근위축성 측삭 경화증 (Amyotrophic lateral sclerosis; ALS)의 치료효과를 가져올 뿐만 아니라, 기타 다양한 운동신경원 질환에 대한 치료효과를 가져올 것으로 기대된다.

Claims (8)

  1. Nurr1 및 Foxa2 유전자가 탑재된 벡터;
    를 포함하는 운동 신경 손상의 치료 또는 억제용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA, 비바이러스성 벡터, 바이러스성 벡터 및 유전자 발현 유도 벡터 시스템 (inducible gene expression vector system)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인,
    운동 신경 손상의 치료 또는 억제용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 바이러스성 벡터는 레트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus), 아데노 부속 바이러스 (adeno associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus), 렌티바이러스 (lentivirus) 및 백시니아바이러스 (vaccinia virus) 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 운동 신경 손상의 치료 또는 억제용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스 또는 렌티바이러스인 것인, 운동 신경 손상의 치료 또는 억제용 조성물.
  5. Nurr1 및 Foxa2 유전자가 도입된 신경세포 (neurons);
    를 포함하는 운동 신경 손상의 치료 또는 억제용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 신경세포는 운동 신경 (motor neuron)인 것인, 운동 신경 손상의 치료 또는 억제용 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 도입은 선형 DNA, 플라스미드 DNA, 비바이러스성 벡터, 바이러스성 벡터 및 유전자 발현 유도 벡터 시스템 (inducible gene expression vector system)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터에 의한 것인, 운동 신경 손상의 치료 또는 억제용 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스 또는 렌티바이러스인 것인, 운동 신경 손상의 치료 또는 억제용 조성물.
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