KR20080032046A

KR20080032046A - 항-인터루킨2 항체

Info

Publication number: KR20080032046A
Application number: KR1020077030731A
Authority: KR
Inventors: 파트리크 보이알레; 존 람스덴; 슈테판 플란쯔; 토비아스 라움; 요르그 폴클란드
Original assignee: 마이크로메트 에이지
Priority date: 2005-06-01
Filing date: 2006-05-31
Publication date: 2008-04-14
Also published as: JP2008542321A; EP1888644A1; CN101189265A; WO2006128690A1; NZ563213A; US20080317746A1; ZA200709456B; AU2006254333A1; CA2609234C; AU2006254333B2; RU2007143996A; IL187316A0; US7964707B2; RU2425054C2; MX2007014565A; KR101340559B1; CA2609234A1; CN101189265B; NO20076568L; JP5414271B2

Abstract

본 발명은 인간 인터루킨-2(IL2)에 특이적으로 결합하는 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편에 관한 것으로, 상기 인간화 모노클로날 항체는 인간 IL2가 인간 IL2-수용체에 결합하기 전, 결합하는 동안, 및/또는 결합 후에 인간 IL2에 결합함으로써 인간 IL2의 활성을 중화시키고, 상기 인간화 모노클로날 항체의 경쇄 가변 영역은 그 제2 골격 영역에 아미노산 위치 42-46에 인접하는 아미노산 서열 KAPKA를 포함한다.

인간 인터루킨-2 중화 항체, 아미노산 서열 KAPKA

Description

항-인터루킨2 항체{Anti-IL2 antibodies}

본 발명은 인간 사이토킨 IL2에 특이적으로 결합하는 항체 및 그 단편에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 항체 및 그 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 항체 및 그 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 상기 항체 및 그 단편의 의학적 사용에 관한 것이다.

인간 IL2는 어떤 다른 인자와도 실질적인 서열 상동성을 갖지 않는 133개의 아미노산으로 된 단백질(15.4 kDa)이다. IL2는 소수성 분비 시그널 서열로 기능하는 처음 20개의 말단 아미노산을 갖는 153 개의 아미노산의 전구체로 합성된다. 상기 단백질은 생물학적 활성에 필수적인 요소인 단일 디설파이드 결합(결합 위치 Cys58/105)를 갖는다.

IL2의 생물학적 활성은 휴지(resting) 상태의 T-세포에서는 발현되지 않고, 거의 주로 활동성인 T-세포에서 발현되는 막 수용체에 의해 매개 된다. 전체 IL2 수용체는 3개의 타입 I 막-통과 단백질 서브유닛들: 알파, 베타 및 감마로 이루어지며; 낮은 친화성의 기능 수용체는 베타 및 감마 수용체 단백질에 의해서만 구성 될 수 있다. 휴지 상태의 B-세포 및 휴지 상태의 단핵백혈구는 이러한 수용체를 거의 발현하지 않는다. IL2 수용체의 발현은 특히 알파 서브유니트의 발현은 복수 인자, 예를 들면 IL5, IL6 및 L2R/p55 유도 인자 등에 의해 조절된다.

쥐 및 인간의 양 IL2은 높은 효율로 동종의 T-세포들의 증식을 유발한다. 인간 IL2은 마우스 세포에서도 기능적이나, 마우스 IL2은 인간 세포에서는 기능적이지 않다. IL2은 T-림프구의 모든 하위 집단에 대한 성장인자이다. IL2은 휴지기 세포 내에서 세포 주기의 진전을 유도하는 T-세포에 대한 항원-비특이적 증식인자이며 활성화된 T-림프구의 클론확장을 허용한다. IL2은 또한 활성화된 B-세포의 증식 및 분화를 촉진한다. T-세포의 증식에서와 마찬가지로, 이 활성은 또한 부가적 인자, 예를 들면 IL4의 존재를 필요로한다.

이러한 T-세포 및 B-세포에의 효과 덕분에, IL2은 면역 반응에서 중심 조절자이다. 적응 면역 반응의 개시 및 증폭에 있어서, IL2의 중심적인 중요성은 이식 거부와 같은 바람직하지 못한 면역 반응에 가장 자주 사용되는 약물의 임상적 효능에 의해 잘 표현된다. 면역억제 약물 사이클로스포린 A 및 FK506(타크로리무스)는 T-세포 수용체를 통한 신호화를 방해함으로써 IL2 생산을 억제하며, 라파마이신(시로리무스)는 IL2 수용체를 통한 신호화를 억제한다. 사이클로스포린 A 및 라파마이신은 IL2에 의한 T-세포 클론 확장을 방지함으로써 면역 반응을 상승적으로 제한한다. 그러나, 이러한 모든 화합물은 세포내 신호화 과정을 표적으로 하며, 이러한 과정은 IL2만을 배타적으로 저해하는 것이 아니라 다른 인자들도 저해한다. 이는 이러한 약물들의 임상적 적용은 그 제한된 표적 특이성으로 인하여 바람직하지 못 한 상당한 정도의 부작용을 일으킬 위험이 있음을 내포한다.

IL2 활성을 억제하는 항체의 여러 예가 본 기술분야에 알려져 있고, 예를 들면 시판 항체 다클리주마브(daclizumab; Zenapax® Protein Design Lab, Inc.)를 들 수 있다. 그러나, 공지된 IL2 활성 저해 항체는 항원 그 자체에 대한 결합에 의해서가 아니라, IL2 수용체에의 결합에 의해 그 생물학적 활성을 나타낸다. IL2 활성 억제제의 중요한 임상적 응용에 있어서, 본 발명은 IL2 활성의 대체적인 특이적 억제제를 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명의 한 측면은 인간 인터루킨-2(IL2)에 특이적으로 결합하는 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편을 제공하는 것이며, 상기 인간화 모노클로날 항체는 인간 IL2가 상기 인간 IL2-수용체에 결합하기 전, 결합하는 동안, 및/또는 결합 후에 상기 인간 IL2에 결합함으로써 인간 IL2 활성을 중화시키며, 상기 인간화 모노클로날 항체의 경쇄 가변영역은 그 제2 골격 영역에, 바람직하게는 아미노산 위치 42-46에 인접하는 아미노산 서열 KAPKA을 포함한다.

본 발명에 있어서, "인간화된 모노클로날 항체," 또는 "인간화 항체," 또는 "인간화 면역 글로불린", 또는 이들과 문법적으로 관련 있는 변형된 표현들은 상호 교환적으로 하나 이상의 비인간 면역글로불린에서 유래된 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 지칭하고, 상기 분자는 부가적으로 하나 이상의 인간 면역 글로불린 또는 이들의 배선 서열(germline sequence)에서 유도된 적어도 한 부분, 예를 들면 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인의 최소한 한 골격 영역을 포함한다. 본 명세서에서 "인간화 항체"는 인간화 경쇄 가변 도메인 면역 글로불린 및 인간화 중쇄 가변 도메인 면역글로불린을 포함한다. 인간화 항체는 하나 이상의 인간 유전자 서열에서 부분적으로 또는 전체로 유도된 일정 영역(합성 아날로그 포함)을 포함할 수 있다. 인간화 항체는 CDR을 제공하는 공여자 항체와 동일한 표적 항원에 결합할 것으로 기대된다. 통상, 인간화 항체 또는 면역글로불린의 모든 세그먼트 또는 부분은, CDR을 제외하고, 자연발생 또는 보존(consensus) 인간 면역글로불린 서열의 대응하는 세그먼트 또는 부분과 실질적으로 동일하거나 실질적으로 동종성이다.

상기 인간화 모노클로날 항체의 경쇄 가변영역(VL)은 제2 골격영역에, 바람직하게는 아미노산 위치 42-46에 인접하는 아미노산 서열 KAPKA을 포함한다. 이러한 바람직한 서열 넘버링, 즉 위치 42-46은 인터넷 주소 http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk.에서 입수가능한 "V Base" 데이타베이스(ⓒMRC Centre for Protein Engineering)에 규정된 넘버링이다. 명확하게 하기 위하여, 인간 배선 VL의 골격 영역(V-카파 및 V-람다 서열) 및 VH 영역의 서열 정렬을 Vbase에 나타나 있는 대로 본 명세서에 개시하였다(각각 도 7, 8 및 9 참조; 특히 인간 배선 V-카파 및 V-람다 서열에서의 제2 경쇄 골격 영역의 넘버링은 도 8a 및 9a 참조).

바람직한 넘버링(즉, 아미노산 위치 42-46)의 아미노산 서열 KAPKA (즉, Lys-Ala-Pro-Lys-Ala)은 상기 인용된 참조와 용이하게 연관될 수 있도록 본 명세서에서 제공되며, 본 발명의 인간화 모노클로날 항체의 활성에 있어 결정적인 것은 그 서열 넘버링이 아니라 이러한 부분 서열내 아미노산의 정체성(identities)임이 이해되어야 한다. 본 기술분야의 기술자는 인간 배선 항체 서열의 넘버링에 있어서 복수의 규약이 존재하고, 상기 인용한 참조(VBase)는 이들 중 하나에 지나지 않음을 잘 알고 있다. 따라서, 어떤 배선 경쇄 가변 영역의 제2 골격 영역내 포함된 부분 아미노서열 KAPKA은 상기 인용에 특정된 것과 다른 넘버링 규약에 따라 상이한 넘버링이 할당될 수 있다. 이러한 경우, 상기 부분 아미노산 서열 KAPKA은 상기 바람직한 아미노산 위치 42-46이외의 다른 넘버링을 가질 수 있으며, 이러한 상이한 넘버링 규약하에서 상기 바람직한 아미노산 위치 42-46에 상당하는 서열은 KAPKA이 아닌 다른 아미노 서열일 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 기술자는 본 발명의 본질적 특징이 "올바른" 번호(바람직한 아미노산 위치 42-46)이나 그 정체성이 KAPKA 가 아닌 서열에 있는 것이 아니라, 변형된 번호(바람직한 아미노산 위치 42-46가 아닌 다른 것)를 가지지만 "올바른" 서열(KAPKA)을 갖는 부분 아미노산 서열에 있음을 이해할 것이다.

놀랍게도 제2 경쇄 골격 영역에 보존 서열 KAPKA이 없는, 특히 이 스트레치(stretch)내 말단 알라닌 잔기가 없는 항체 또는 그 단편은 특이적으로 IL2에 결합할 수 있으나, 그 활성을 중화시킬 수 없다는 것을 발견하였다. 이는 특히, 인간화 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 포함된 CDR 영역이 서열번호: 1-3(각각 경쇄 가변 영역 CDR 1-3), 및 서열번호:4-6(각각 중쇄 가변 영역 CDR 1-3)인 경우 그러하다. 학설에 구애받음 없이, 이러한 중화활성의 소실은 보존 서열 KAPKA의 생략, 특히 본 스트레치의 말단 알라닌 잔기의 알라닌 이외의 다른 아미노산으로의 치환에 의해 결합 활성에는 아무런 영향을 미침 없이 그 중화활성에 대해서는 반대 작용을 갖는 탈안정화 및/또는 구조적으로 재배열되는 것에 기인하는 것으로 생각된다.

본 명세서에서 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적 결합", "특이적으로 결합하는", "특이적 결합자" 등과 같은 관련된 표현은 인간 IL2와 수개의 인간 IL2와 상이한 기타 잠재적 항원을 구별할 수 있는 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편의 능력을 지칭하는 것이며, 상기 구별은 복수의 상이한 항원 풀에서 잠재적 결합 파트너로서 오직 인간 IL2와 결합하거나 상당한 정도로 결합하는 정도로 이루어진다. 여기에서 IL2와 상당한 정도로 결합한다는 것은, 복수의 동등하게 접근가능한 상이한 항원 풀에서 잠재적 결합 파트너로서 인간 IL2가 인간 IL2이 아닌 다른 항원보다 적어도 10배, 바람직하게는 50배, 가장 바람직하게는 100배 또는 더 이상 자주(동력학적 의미에서) 결합함을 의미한다. 이러한 동력학적 측정은 비아코르 장치에서 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 인간화 항체 또는 그 단편들은 모노클로날이다. 본 발명에서 "모노클로날"은 본 기술분야에서 통상 사용되는 의미로 사용되며, 결합된 항원상의 단일 에피토프를 인식하는 항체이다. 이점이 동일한 항원에 결합하나 그 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 구별되는 항체들의 집합을 뜻하는 폴리클로날 항체와 대비되는 점이다. 이러한 이유로 단일 항원 분자는 복수의 폴리클로날 항체들에 의해 동시에 결합될 수 있으나, 이 항원에 특이적인 특정 모노클로날 항체는 오직 한 분자만에 의해 결합될 수 있다; 단일 모노클로날 항체 분자에 의해 결합된 후, 결합된 에피토프는 차단되고 따라서 더이상 다른 동일한 모노클로날 항체에 의해 결합될 수 없다. 항체의 모노클로날 성질은 치료제로서의 사용에 특히 적합하며, 이는 이러한 항체가 단일, 동종성 분자종이기 때문에 매우 잘 특성화될 수 있고 재현가능하게 제조되고 정제가능하기 때문이다. 이러한 요인들은 생물학적 활성이 매우 높은 수준의 정밀성으로 예측될 수 있는 제품을 생산 가능하게 하고, 이러한 분자는 포유류, 특히 인간에서의 치료적 투여에 대해 관청에서의 허가를 얻어야 하기 때문에 상기 요인들은 특히 중요하다.

본 발명2에서, "중화", "중화제", "중화하는" 및 문법적으로 관련 있는 이들의 변형된 표현들은 IL2의 생물학적 효과를 부분적으로 또는 완전히 약화시키는 것을 지칭한다. IL2의 생물학적 효과의 부분 또는 완전한 약화는 IL2-매개 신호 전달의 변경, 방해 및/또는 철폐로부터 결과되며, 이는 예를 들면 세포내 신호전달, 세포 증식 또는 가용성 물질의 방출, 예를 들면 IL2가 아닌 리간드에 대한 표면 수용체의 발현을 초래하는 세포내 유전자 활성의 상향 또는 하향 조절 등으로 발현된다. 본 기술분야의 기술자는 어떤 물질이, 예를 들면 문제의 항체 또는 그 단편이 중화제로 분류될 것인가를 결정하는 데는 여러 모드가 존재함을 이해할 것이다. 일반적으로 이는 하기와 같이 수행되는 인 비트로 표준 시험에 의해 수행된다: 첫번째 증식 실험에서, 증식 정도가 IL2의 활성에 의존함이 알려져 있는 세포주를 IL2의 농도를 다양하게 한 일련의 샘플내에 인큐베이션하고, 이어서 상기 세포주의 증식 정도를 측정한다. 이러한 측정으로부터, 상기 세포의 50% 최대 증식을 유도하는 IL2 농도를 구한다. 이후 두번째 증식실험은 일련의 각 샘플에서 첫번째 증식 실험에 사용된 것과 동일한 세포수 및 상기 측정된 농도의 IL2 농도를 사용하고, 이번에는 IL2의 중화제일 것으로 생각되는 항체 또는 그 단편의 농도를 변경시켜 수행한다. 다시 세포 증식을 측정하여 50% 최대 성장 억제를 유발하는 항체 또는 그 단편의 농도를 결정한다. 만약 성장 억제 대 항체(또는 그 단편) 농도 결과 곡선이 S자 형태의 곡선인 경우, 항체(또는 그 단편)의 농도가 증가함에 따라 세포 증식이 감소하며, 어느 정도의 항체 의존적 성장 억제가 이루어짐, 즉 IL2의 활성이 어느 정도 중화됨을 뜻한다. 이러한 경우, 항체 또는 그 단편은 본 발명의 의미에서의 "중화제"로 간주된다. 증식 정도가 IL2의 활성에 의존하는 것으로 알려진 세포주의 예로서는 LGC Promochem에 의해 시판되는 CTLL-2 세포주이다. 다른 적당한 세포주 예는 NK92(DSMZ)이다.

놀랍게도, 본 발명의 인간화 모노클로날 항체는 인간 IL2가 인간 IL2 수용체에 결합하기 전, 결합하는 동안, 및/또는 결합한 후, 인간 IL2와 결합함으로써 인간 IL2의 활성을 중화시킨다. 이러한 중화 모드는 전혀 예측되지 않은 것이다. 수용체에 결합하여 생물학적 활성을 나타내는 리간드의 생물학적 활성을 항체-매개로 중화하는 것은 통상적으로 리간드-수용체 복합체의 형성을 방지함으로써 효과를 나타낸다. 중화에 대한 이러한 고전적인 시나리오에 따르면, 중화 항체는 리간드-수용체 경계면의 위치에서 리간드 또는 수용체와 결합한다. 이러한 방식으로 항체의 존재는 리간드-수용체 복합체의 형성을 공간적으로 및/또는 정전기적으로 방지한다:리간드-수용체 복합체는 형성되지 않으며, 리간드에 의한 결합에 의해 통상적으로 발생되는 생물학적 활성은 나타나지 않는다.

본 발명에 따른 인간화 모노클로날 항체에서 관찰되는 중화 모드는 통상적으로 IL2에 기인하는 생물학적 활성의 소실이 IL2 및 그 수용체간의 복합체 형성의 방지에 의존하지 않는다는 점에서 전통적인 시나리오와 전혀 상이하다. 이는 IL2가 이미 IL2 수용체에 결합되어 있는지 여부를 불문하고 IL2의 생물학적 활성이 폐기되는 것을 의미하며, 이는 본 발명의 인간화 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프가 IL2 수용체와 상호작용하는 IL2의 부분에 위치하고 있지 않음을 내포한다. 본 발명의 인간화 모노클로날 항체에 의한 IL2 중화는 몇가지 모드로 성취될 수 있다.

제1 모드에 따르면, IL2와 그 수용체간에 복합체가 형성되기 전에 항체가 용액내 IL2와 결합하여, IL2가 그 수용체에 결합하여 발생하는 IL2-매개 신호 전달이 일어나지 않는다.

제2 모드에 따르면, IL2가 수용체와 복합체를 형성할 때 항체가 IL2에 결합한다. 여기에서 다시 수용체-IL2-항체 3원 복합체의 동시 형성은 어떠한 중요한 신호전달을 생성하지 않거나, 또는 최소한으로 생성시킨다.

제3 모드에 따르면, IL2는 이미 그 수용체와 복합체를 형성하고, 항체는 IL2 수용체를 갖는 세포의 표면에 그 수용체와 복합체로 존재하는 IL2에 결합한다. 이 세 번째 시나리오에서는 항체가 IL2에 결합되기 이전에 이미 일어난 모든 IL2-매개신호전달이 항체가 결합할 때 폐지된다.

이러한 비전형적인 중화, 즉 본 발명의 인간화 모노클로날 항체에 의해 발생되는 중화는 매우 놀라운 일이며, 이는 여러가지의 치료적 장점을 갖는다.

첫째, 본 발명의 인간화 모노클로날 항체는 IL2 수용체와 접촉하여 직접 참여하는 것이 아닌 IL2의 에피토프를 인식하기 때문에, 한편으로는 치료적 항체 및 다른 한편의 IL2 수용체간에 어떠한 경쟁도 발생하지 않는다. 따라서 항체와 IL2 수용체간에 동일한 에피토프에 대해 결합 경쟁이 존재하는 경우보다 더 낮은 농도의 치료항체를 환자에 투여하여도 효과를 나타낸다. 이는 본 발명의 모노클로날 항체의 치료적 효능을 효과적으로 증가시키게 되는 것이며, 생물학적 효과의 상실없이 투여 농도(전통적인 중화 모드에서 필요한 양에 비해)를 경감할 수 있다. 소량의 치료제의 투여는 환자의 내약성의 측면에서 바람직할 뿐 아니라, 치료 요법의 경비 부담을 줄이거나, 주어진 양의 치료 항체로 더 많은 수의 환자가 혜택을 볼 수 있다는 측면에서 바람직하다.

둘째, 본 발명의 인간화 모노클로날 항체는 이미 수용체와 복합체로 존재하는 IL2와 결합하고 그 활성을 중화할 수 있기 때문에 먼저 IL2를 그 결합 파트너인 수용체와 해리시킬 필요없이 이미 진행중인 IL2-매개된 신호 전달을 차단시킬 수 있는 매우 큰 장점을 갖는다. 따라서, IL2상의 결합 에피토프를 위해 먼저 IL2 수용체와 경쟁해야만 치료적 효과를 나타낼 수 있는 다른 "전통적인" 항체보다 본 발명의 인간화 모노클로날 항체는 인 비보에서 더욱 빠르게 요망되는 중화능의 생물학적 효과를 실현할 수 있는 매우 첨단적인 효과를 갖는다. 이러한 작용의 신속성은 항-IL2 치료분야에 공지되어 있는 기관 이식의 면역 거부와 같은 급성 시나리오에서 특히 유용하다.

전술한 이러한 비전형적인 중화 모드의 세번째 이점은 IL2 수용체가 T-세포의 표면에 위치하는 사실과 관련되어 있다. T 세포는 그 자체가 IL2를 생성하며, IL2에 대해 증식으로 반응하며, 따라서 그 자신의 증식을 증강한다. 이식 수술후 조직 거부와 같은 급성 염증성 반응의 경우, 존재하는 T 세포에 기인되는 염증 반응의 정도를 경감시킬 필요가 있고, 또한 면역 반응을 생성하는 T 세포의 수를 경감할 필요가 있다. 본 발명의 인간화 모노클로날 항체는 특히 이 목적을 성취하는데 효과적이다. 이미 설명한 바와 같이, T 세포의 표면상에서 그 수용체와 이미 결합한 IL2의 생물학적 활성이 폐쇄된다. 그러나, 이러한 폐쇄 후, 본 발명의 인간화 모노클로날 항체는 통상 어느 정도의 기간동안 IL2(IL2 수용체에 결합된 것)에 결합된 채로 존재하여, 항체-의존적 세포성 세포독성("ADCC")에 대해 T 세포를 표적화시킨다. ADCC에서, 면역 글로불린으로 코팅된 표적 세포는 표적 세포를 코팅하고 있는 면역글로불린의 Fc 부분을 인식하는 Fc 수용체를 갖는 효과 세포에 의해 살해된다. 대부분의 경우, ADCC에 참여하는 효과 세포는 그 표면에 Fc 수용체 Fc-gamma-RIII를 갖는 자연 살해세포(natural killer; "NK")이다. 이러한 식으로, 오직 면역글로불린에 의해 코팅된 세포만이 살해되고, 이러한 세포 살해의 특이성은 항체의 결합 특이성과 직접적으로 관련된다. 본 발명의 맥락에서, 이후 T 세포는 수용체와의 복합체내 IL2를 통해 본 발명의 인간화 모노클로날 항체에 의해 수식되어 표적 세포로 되고, 이후 예를 들어 NK 세포에 의해 용해된다. 띠라서, T 세포와 같이 IL2 수용체를 갖는 세포에 기인되는 면역 반응을 신속하고 효과적으로 완화하는 효과를 나타낸다.

본 발명의 실시형태에 따르면, 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편에 포함된 최소한 하나의 제1, 제3 및/또는 제4 경쇄 골격 영역은 각각의 영역에 대한 인간 배선 서열에 대응한다.

본 발명의 추가적인 일 실시형태에 따르면, 본 발명의 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편의 경쇄 가변 영역은 그 CDR1 영역에 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 추가적인 일 실시형태에 따르면, 본 발명의 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편의 경쇄 가변 영역은 그 CDR2 영역에 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 추가적인 일 실시형태에 따르면, 본 발명의 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편의 경쇄 가변 영역은 그 CDR3 영역에 서열번호: 3의 아미노산서열을 포함한다.

본 발명의 추가적인 일 실시형태에 따르면, 본 발명의 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편의 경쇄 가변 영역은 그 CDR1 영역에 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하고, 그 CDR2 영역에 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하고, 그 CDR3 영역에 서열번호: 3의 아미노산서열을 포함한다.

본 발명의 추가적인 일 실시형태에 따르면, 중쇄 가변영역은 그 CDR1 영역에 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 추가적인 일 실시형태에 따르면, 중쇄 가변영역은 그 CDR2 영역에 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 추가적인 일 실시형태에 따르면, 중쇄 가변영역은 그 CDR3 영역에 서열번호: 6의 아미노산서열을 포함한다.

본 발명의 추가적인 일 실시형태에 따르면, 중쇄 가변영역이 그 CDR1 영역에 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 그 CDR2 영역에 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하고, 그 CDR3 영역에 서열번호: 6의 아미노산서열을 포함한다.

본 발명의 추가적인 일 실시형태에 따르면 본 발명의 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편의 경쇄 가변 영역은 추가적으로 그 CDR1 영역에 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하고, 그 CDR2 영역에 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하고, 그 CDR3 영역에 서열번호: 3의 아미노산서열을 포함하고, 중쇄 가변영역은 그 CDR1 영역에 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 그 CDR2 영역에 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하고, 그 CDR3 영역에 서열번호: 6의 아미노산서열을 포함한다. 이러한 CDR 영역은 전술한 방식으로 IL2과 결합하고, 그 생물학적 효과를 중화하는데 특히 유용하다.

본 발명의 추가적인 일 실시형태에 따라, 제1 경쇄 골격 영역의 아미노산 서열, 제2 경쇄 골격 영역의 잔여하는 아미노산 서열, 제3 경쇄 골격 영역의 아미노산 서열은 유전자좌 O12, O2, O18, O8, A30, L1, L15, L4, L18, L5, L19, L8, L23, L9, L11 또는 L12의 인간 배선 하위 그룹 VKI 중 어느 하나; 유전자좌 1a의 인간 배선 하위 그룹 VL1 중 어느 하나; 또는, 유전자좌 2c, 2e, 2a2 또는 2b2의 인간 배선 하위 그룹 VL2 중 어느 하나에 대응한다. 이 실시형태에서, 상기 "제2 경쇄 골격 영역의 잔여 아미노산 서열"은 상기 제2 경쇄 골격 영역에서 KAPKA 서열이 아닌 아미노산들을 지칭하는 것이다. VBase 데이타베이스의 넘버링을 사용하는 경우, 상기 "제2 경쇄 골격 영역의 잔여 아미노산 서열"은 경쇄 골격 영역이 V-카파 또는 V-람다 골격 영역이든 여부에 관계없이, 제2 경쇄 골격 영역의 위치 35-41 및 47-49에 포함되는 아미노산들을 지칭한다(각각 V-카파 또는 V-람다 골격 영역에 관련된 인간 배선 서열의 넘버링에 대한 도 7a 및 도 8a 참조). 바람직하게 본 실시형태는 제4 경쇄 골격 영역내에 인간 배선 서열 JK4에서 발견되는 서열, 특히 FGGGTKVEIK을 추가적으로 포함하고 있다. 제4 경쇄 골격 영역으로서 사용하기에 적합한 다른 아미노산 서열로는 비제한적 예시로서, FGQGTKVEIK, FGQGTKLEIK, FGPGTKVDIK, FGQGTRLEIK, FGTGTKVTVL, FGGGTKLTVL 및 FGGGTQLTVL을 들 수 있다.

추가적인 실시형태에 따르면, 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편에 포함된 제1, 제2 및/또는 제3 중쇄 골격 영역은 이들 영역에 대한 인간 배선 서열에 대응한다.

추가적인 실시형태에 따르면, 제1 중쇄 골격 영역의 아미노산 서열, 제2 중쇄 골격 영역의 아미노산 서열, 및 제3 중쇄 골격 영역의 아미노산 서열은 인간 배선 하위 그룹 VH3중 어느 하나, 특히 유전자좌 3-07에서의 것이며, 제1 중쇄 골격 영역의 아미노산 서열이 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS이고, 제2 중쇄 골격 영역의 아미노산 서열이 WVRQAPGKGLEWVA이고, 제3 중쇄 골격 영역의 아미노산 서열이 RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR이다. 제4 중쇄 골격 영역의 아미노산 서열은 예를 들어 상기 언급된 배선 유전자좌 3-07내의 세개의 골격 서열과 하기 서열 중 어느 하나: WGQGTLVTVSS, WGRGTLVTVSS, WGQGTMVTVSS, WGQGTLVTVSS, WGQGTLVTVSS 및 WGQGTTVTVSS을 조합하여 선택될 수 있다.

바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편은 서열번호: 7의 아미노산서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 8의 아미노산서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함한다. 더욱 바람직하게는 서열번호: 9의 아미노산서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 10의 아미노산서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 모노클로날 항체이다. 아래에서, 서열번호: 9 및 서열번호: 10 및/또는 서열번호: 7 및 서열번호: 8을 포함하는 본 발명의 인간화 항-IL2 IgG1 항체는 "항-IL2"로 지칭된다.

본 발명의 인간화 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편은 IgG 항체의 형태, 특히 IgG1 또는 IgG4 항체의 형태일 수 있다. 본 기술분야에서 잘 알려진 바와 같이, IgG는 매우 구별적인 항원 인식 및 결합을 담당하는 가변 항체 영역을 포함하고 있을 뿐 아니라, 내인성으로 제조된는 항체에 일반적으로 존재하는 중쇄 및 경쇄 항체 폴리펩타이드의 일정 정역을 포함하며, 어떤 경우에는, 하나 이상의 부위에 탄수화물에 의한 수식(이러한 당화는 통상 IgG의 Fc 부분에 존재한다)를 포함한다. 이러한 Fc 부분은 생체 내에서 ADCC 및 보체-의존적 세포독성("CDC")와 같은 다양한 효과 작용을 유발한다. ADCC의 기전은 전술한 바와 같다. CDC에서, 두개의 동일한 면역글로불린은 두개의 동일한 항원(예, 여기에서는 T 세포상의 IL2)에 표적 세포의 표면상에서 결합하고, 이들 각각의 Fc 부분은 서로 매우 근거리에 위치하게 된다. 이러한 시나리오는 보체 단백질, 특히 예를 들면 C1q, C3, C4 및 C9에 대한 보체 단백질을 끌어당기고, 표적 세포에서 포어를 형성시킨다. 이러한 천공에 의해 표적 세포는 살해된다. 동시에 표적 세포들은 그 표면상의 다른 위치에서 수식된다. 이러한 수식은 효과 세포를 끌어당기고, 이후 이들 효과세포는 ADCC 기전과 유사한 방식으로 표적 세포들을 살해한다(예를 들면, Gelderman et al. (2004), Trends Immunology 25, 158-64 참조).

바람직하게 상기 IgG 항체는 인 비보 작용기전이 특히 잘 규명되고 이해되어져 있는 IgG1 항체 또는 IgG4 항체이며, 특히 IgG1 항체가 바람직하다.

본 발명의 추가적인 실시형태에 있어서, 인간화 모노클로날 항체의 단편은 scFv, 단일 도메인 항체(single domain antibody), Fv, 디아체(diabody), 탠덤 디아체(tandem diabody), Fab, Fab' 또는 F(ab)2이다. 이러한 단편들은 통상 두개의 하위클래스로 분류되는데, 즉 단일 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 것과, 적어도 두개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 것이다. 전자의 하위클래스 구성원은 scFv (하나의 VH 영역 및 하나의 VL 영역이 폴리펩타이드 링커를 통해 하나의 단일 폴리펩타이드 사슬로 결합한다); 단일 도메인 항체(인간 IL2에 특이적으로 결합하는 단일 항체 가변 도메인을 포함)이다. 후자의 하위 클래스 구성원은 Fv (하나의 VH 영역 및 하나의 VL 영역을 독립된 폴리펩타이드 사슬로서 포함하며, 상기 독립된 폴리펩타이드 사슬은 서로 비-공유적으로 연합한다; 디아체(두개의 비공유적으로 연합한 폴리펩타이드 사슬을 포함하며, 이들 각각은 두개의 항체 가변 영역- 통상 폴리펩타이드 사슬 당 하나의 VH 및 하나의 VL-을 포함하며 이들은 한 폴리펩타이드 사슬 상의 VH가 다른 폴리펩타이드 사슬의 VL과 비공유적으로 결합하거나, 그 역으로 되어 이가 항체 분자를 산출한다); 탠덤 디아체(4개의 공유 결합된 두 상이한 특이성의 면역 글로불린 가변 영역(VH 및 VL 영역)을 포함하고, 전술한 디아체보다 두배로 큰 호모다이머를 형성하는 이중특이적 단일 사슬 Fv 항체); Fab (한 폴리펩타이드 사슬로서 그 자체가 VL 영역 및 전체 경쇄 일정 영역을 포함하는 전체 항체 경쇄를 포함하고, 다른 폴리펩타이드 사슬로서, 전체 VH 영역 및 중쇄 일정 영역의 일부를 포함하는 항체 중쇄의 일부분을 포함하며, 상기 두 폴리펩타이드 사슬이 사슬간 디설파이드결합을 통해 분자간으로 결합된다); Fab'(상기 Fab에서 항체 중쇄상에 포함된 디설파이드 결합을 추가적으로 환원시킨 것); 및 F(ab)2 (두개의 Fab' 분자를 포함하고, 각 Fab' 분자는 사슬간 디설파이드 결합에 의해 각각의 다른 Fab' 분자에 연결된다)을 포함한다. 통상적으로 전술한 형태의 항체 단편은 예를 들면 특정 긴급상태에의 치료적 투여를 위해 요망되는 항체의 약동력적 성질 등을 매우 유연성있게 테일러링(tailoring)할 수 있다. 예를 들면, 혈관 분포가 좋지 않은 것으로 알려진 치료 조직(예, 관절)을 치료할 때, 조직 침투도를 증가시키기 위해 투여되는 항체의 크기를 줄이는 것이 바람직하다. 어떤 경우에는 치료 항체의 몸에서의 제거 속도를 증가시키는 것이 바람직할 수 있으며, 이 경우 상기 속도는 통상 투여되는 항체의 크기를 줄임으로써 가속화될 수 있다.

본 발명의 추가적인 실시형태에 따라, 본 발명의 인간화 모노클로날 항체는 1가 단일특이적 또는 다가 단일 또는 다가특이적, 특히 이가 단일 또는 이가 이중특이적 형태로 존재할 수 있다. 통상적으로, 다가 단일특이적, 특히 이가 단일 측이적 항체는 치료학적 이점을 갖는데, 이러한 항체에 의해 발휘되는 중화는 결합성 효과(avidity effects), 즉 동일 항원(본 발명에서는 인간 IL2)의 다수 분자에 대한 동일 항체에 의한 결합에 의해 증강되는 이점을 갖는다. 본 발명의 항체의 수개의 1가 단일특이적 형태는 전술되었다(예, scFv, Fv, 또는 단일 도메인 항체). 본 발명의 이가 이중 특이적 형태의 인간화 모노클로날 항-인간 IL2 항체는 전체 IgG를 포함할 수 있으며, 전체 IgG에서 하나의 결합 암이 인간 IL2에 결합하고 다른 결합 암은 인간 IL2과 상이한 항원에 결합한다. 추가적인 다가 다중특이적, 특히 2가 이중 특이적 형태는 바람직하게 인간화 단일 사슬 이중 특이적 항체, 즉 본 분야에 통상적으로 알려진 바와 같이 두개의 scFv 본체 사이에 짧은 삽입 폴리펩타이드 스페이서에 의하여 하나의 인접하는 폴리펩타이드 사슬로 연결된, 전술한 바와 같은 두개의 scFv 본체를 포함하는 재조합 인간 항체 구축물(consruct)일 수 있다. 여기에서, 이중 특이적 단일 사슬 항체내에 포함된 이중 특이적 단일 사슬 항체의 한 scFv 부분은 특이적으로 전술한 인간 IL2와 결합하며, 이 이중특이적 단일 사슬 항체의 다른 scFv 부분은 치료적 효과를 내는 다른 항원과 결합한다.

본 발명의 다른 실시 형태에 따르면, 본 발명의 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편들은 예를 들어 하나 이상의 분자의 폴리에틸렌글리콜("PEG")분자와 같은 유기 폴리머로 유도체화될 수 있다. 본 기술분야에 알려진 바와 같이, 이러한 유도체화는 항체 또는 그 단편의 약동력적 성질을 조절하는데 유리하다.

특히 바람직한 1가 단일 특이적 항체 단편은 scFv이고, 특히 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 아미노산서열을 포함하는 scFv이 바람직하다.

본 발명의 추가적인 측면은 서열번호: 1-12 중 어느 하나의 아미노산 서열과 각각 70% 이상의 상동성, 바람직하게 80%, 90%, 가장 바람직하게 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 모노클로날 항체 또는 단편을 제공한다. 상동성은 Vector NTI (InforMax^TM, Maryland, USA)와 같은 표준 시퀀스 정렬 프로그램에 의해 결정될 수 있다. 이러한 프로그램은 아미노산-대-아미노산 베이스로 정렬된 서열을 비교하며, 비교를 위해 다양한 수준의 스트린전시로 세팅될 수 있다(예, 동일 아미노산, 보존적 아미노산 치환 등). 상기 용어는 본 발명에서, 문제의 두 아미노산이 동일한 주 그룹에 속하는 경우, 서로에 대해 "보존적 치환"으로 간주된다. 비제한적 예로서, 비극성 아미노산 그룹에 속하는 두 상이한 아미노산은 비록 이들 두 아미노산이 동일하지 않더라도 서로의 "보존적 치환"으로 간주되며, 반면 하나는 비극성 아미노산이고 다른 하나는 염기성 아미노산인 경우 이들은 서로의 "보존적 치환"으로 간주되지 않는다. Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts 및 Walter 그룹의 "Molecular Biology of the Cell", 4th Edition (2002)의 패널 3.1을 참조하면, 아미노산은 4개의 주 그룹으로 분류된다: 산성, 비극성, 비전하 극성 및 염기성. 이러한 그룹화는 본 발명의 목적을 위하여 특정 아미노산이 문제의 다른 아미노산의 보존적 치환인지 여부를 결정하는 목적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 폴리뉴클레오티드 분자를 제공하는 것이다. 이 폴리뉴클레오티드 분자는 서열번호: 1-12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 60% 이상, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 95% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 여기에서 상기 상동성은 대상 뉴클레오티드 서열("테스트 서열")을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 서열번호: 1-12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 시퀀스 정렬에 의해 비교하고, 테스트 서열내 뉴클레오티드가 서열번호: 1-12 중 어느 하나의 대응하는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열내 대응하는 뉴클레오티드와 서로 동일하거나, 또는 테스트 뉴클레오티드와 서열번호: 1-12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열내 대응하는 하나 이상의 뉴클레오티드과의 하나 이상의 차이가 하나의 뉴클레오티드 트리플릿(triplet)이 되고, 이는 번역되었을 때, 서열번호: 1-12 중 어느 하나의 대응하는 아미노산 서열내 대응하는 아미노산의 보존적 치환 또는 퇴화 트리플릿으로 인해 동일한 아미노산을 결과하는 경우, 상기 테스트 서열내 뉴클레오티드는 상동성으로 간주된다. 여기에서, "보존적 치환"은 전술된 의미로 이해되어야 한다.

본 발명의 추가적인 측면으로, 본 발명의 인간화 모노클로날 항체 또는 단편 또는 서열번호: 1-12 중 어느 하나의 아미노서열을 코딩하거나, 또는 상기 서열번호: 1-12 중 어느 하나의 아미노서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 여기에서 "상동성"은 전술한 바와 동일한 의미로 사용된다.

본 발명에 따라, "약학적 조성물"은 포유류 환자, 바람직하게는 인간 환자에 투여하기 위한 조성물을 의미한다. 바람직한 실시 형태에서, 약학적 조성물은 비경구적 주사 또는 주입용 조성물을 포함한다. 이러한 비경구적(parenteral) 주사 또는 주입은 예를 들면, 경피, 피하, 근육내 및/또는 복강내 주사 또는 주입 형태의 재흡수 과정의 이점을 가질 수 있다. 또는 이러한 비경구적 주사 또는 주입은 우회적 재흡수 과정일 수 있으며, 예를 들면 심장내, 경동맥, 정맥, 또는 요추내 주사 또는 주입의 형태일 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 약학적 조성물은 피부를 경유한 투여용 조성물을 포함한다. 피부를 통한 투여의 일예로서, 에피큐테니어스 투여(epicutaneous)를 들 수 있으며, 이는 약학적 조성물이, 예를 들면 용액, 현탁액, 에멀젼, 폼제(foam), 웅구언트(unguent), 연고, 페이스트 및/또는 피부에 부착하는 패치의 형태로 적용된다. 또는 상기 약학적 조성물의 투여는 하나 이상의 점막을 통해 효과를 나타낼 수 있다. 예를 들면, 부칼, 혀, 설하, 즉 입 및/또는 혀의 점막을 통해 투여될 수 있으며, 정제, 로진저, 당의정(즉, 드래그) 및/또는 가글링용 용액으로 적용될 수 있다. 또는 위 및/또는 창자의 점막을 통한 경구적 투여일 수 있으며, 예를 들어, 정제, 당의정(예, 드래그), 캡슐, 용액제, 현탁제, 및/또는 에멀젼제일 수 있다. 또는 좌약, 직장용 캡슐 및/또는 연고 또는 웅구언트 등의 형태로 적용하여 직장으로 투여할 수 있다. 또는 드롭, 연고 및 웅구언트 및/또는 스프레이로 적용하여 비강으로 투여할 수 있다. 또는 기관지 및/또는 폐포의 점막을 통해 폐를 경유하여 투여할 수 있으며, 예를 들어 에어로솔 및/또는 흡입제로 적용할 수 있다. 또는 안약, 안연고 및/또는 안 세척액 등의 형태로 결막을 통해 투여될 수 있다. 또는 질내 또는 요관내와 같은 요로생식기관의 점막을 통해 투여될 수 있으며, 예를 들어 좌약, 연고 및/또는 스타일러스 등으로 적용될 수 있다. 상기의 대체적 투여수단은 서로 배타적인 것이 아니며, 이들을 조합하여 효과적인 치료 계획을 수립할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 추가적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 인산 버퍼 식염수, 물, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼, 다양한 형태의 습윤제, 멸균 용액, 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함한 조성물은 공지된 종래 방법에 의해 포뮬레이션될 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 개체에 적합한 용량으로 투여된다. 투여 계획은 주치의 및 임상적 요인에 의해 결정된다. 의학 분야에서 잘 알려져 있는 바와 같이 환자에 대한 용량은 환자의 크기, 체표면적, 나이, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적 건강 상태 및 동시에 투여되는 다른 약물 등과 같은 수많은 인자에 의존한다. 예를 들어 비경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 에멀젼 및 리포좀 등을 포함한다. 비경구 용매의 예로서는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르를 들 수 있다. 수성 담체는 물, 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함하며, 식염수 및 완충 매질을 포함한다. 일반적인 비경구용 매질은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로즈, 덱스트로즈 및 염화나트륨, 유당화된 링거액, 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥 또는 경동액 투여에 적합한 매질은 액상 영양성 보충액, 전해질 보충액(예, 링거 덱스트로즈에 기초한 것들) 등을 포함한다. 보존제 및 기타 첨가제는 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제, 불활성 가스 등이다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 단백질성 담체, 예를 들면 혈청 알부민 또는 면역 글로불린 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게 상기 단백질성 담체는 인간 기원이다. 본 발명의 약학적 조성물은 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편(본 발명에 기재한)이외에, 추가적으로 상기 약학적 조성물을 사용하고자 하는 용도에 따라, 생물학적으로 활성인 약제를 포함할 수 있다. 이러한 약제는 위장관 시스템에 작용하는 약물, 세포증식억제제로서 작용하는 약물, 고요산혈증을 방지하는 약물, 면역 반응을 억제하는 약물(예, 코티코스테로이드), 염증 반응을 조절하는 약물, 순환계에 작용하는 약물, 및/또는 본 분야에 공지된 사이토킨 등이다.

본 발명의 또 다른 측면은 전술한 바와 같은 본 발명의 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편 또는 전술한 폴리뉴클레오티드 분자를 경우에 따라 하나 이상의 부가적 항염증제를 포함하는 포유류, 바람직하게 인간의 염증성 질환 치료용 의약품의 제조에 사용하는 방법을 제공하는 것이다. 바람직하게 상기 염증성 질환은 류마티스성 관절염(RA), 천식, 다발성 경화증(MS), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 특발성 폐섬유화증(IPF), 염증성 장질환(IBD), 포도막염, 황반변성, 대장염, 건선, 왈더변성, 항인지질증후군(APS), 급성 관상 동맥 증후군, 레스티노시스(restinosis), 죽상동맥경화증, 재발성 다발 신경병증(RP), 급성 또는 만성 간염, 실패한 정형외과적 임플란트, 사구체신염, 루프스, 자가 면역 질환, 급성 췌장염 및 강직척추염(AS)으로 구성된 군에서 선택된다.

본 발명의 또 다른 측면은 전술한 바와 같은 본 발명의 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편 또는 전술한 폴리뉴클레오티드 분자를 경우에 따라 하나 이상의 부가적 항암제를 포함하는 포유류, 바람직하게 인간의 종양성 질환 또는 지연된 세포 아폽토시스, 증강된 세포 생존 또는 증식을 수반하는 다른 상태의 치료용 의약품의 제조에 사용하는 방법을 제공하는 것이다. 바람직하게 상기 종양성 질환은 암이며, 상기 암은 바람직하게 백혈병, 다발골수종, 위암 또는 피부암이다.

본 발명의 또 다른 측면은 전술한 바와 같은 본 발명의 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편 또는 전술한 폴리뉴클레오티드 분자를 포유류, 바람직하게 인간 개체에 염증성 질환의 예방 및/또는 경감에 충분한 양과 시간으로 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다. 바람직하게 상기 염증성 질환은 류마티스성 관절염(RA), 천식, 다발성 경화증(MS), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 특발성 폐섬유화증(IPF), 염증성 장질환(IBD), 포도막염, 황반변성, 대장염, 건선, 왈더변성, 항인지질증후군(APS), 급성 관상 동맥 증후군, 레스티노시스(restinosis), 죽상동맥경화증, 재발성 다발 신경병증(RP), 급성 또는 만성 간염, 실패한 정형외과적 임플란트, 사구체신염, 루프스, 자가 면역 질환, 급성 췌장염 및 강직척추염(AS)으로 구성된 군에서 선택된다.

본 발명의 또 다른 측면은 전술한 바와 같은 본 발명의 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편 또는 전술한 폴리뉴클레오티드 분자를 포유류, 바람직하게 인간 개체에 종양성 질환 또는 지연된 세포 아폽토시스, 증강된 세포 생존 또는 증식을 수반하는 다른 상태의 예방 및/또는 경감에 충분한 양과 시간으로 투여하는 단계를 포함하는 종양성 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다. 바람직하게 상기 종양성 질환은 암이며, 상기 암은 바람직하게 백혈병, 다발골수종, 위암 또는 피부암이다.

이하, 본 발명을 실시예와 도면을 통하여 상세히 설명하며, 본 발명은 하기 실시예에 의해 제한되지 않는다.

도 1은 VL 영역의 인간화 후 항원 결합력이 계속 유지됨을 나타낸 것이고,

도 2는 VL 영역의 인간화 후 중화 활성이 소실됨을 나타낸 것이고,

도 3은 VL 영역내 인간/마우스 골격의 교환에 의해 IL2의 결합이 영향을 받지 않음을 나타낸 것이며,

도 4는 인간 제2 경쇄 골격의 삽입에 따른 중화 활성의 소실을 나타낸 것이고,

도 5는 VL 영역(제2 경쇄 골격)의 42-46위치에서 아미노산 변경이 항원 결합에 영향을 미치지 않음을 나타낸 것이며,

도 6은 제2 경쇄 골격의 46위치에서 루이신의 알라닌으로의 돌연변이에 의해 중화 활성을 다시 갖게 됨을 나타낸 것이며,

도 7a는 제1 및 제2 경쇄 골격 영역(V-카파)에 대한 인간 배선 아미노산 서열을 나타낸 것이며, 여기에서 CDR 영역은 생략되고; 나머지 골격 영역의 넘버링은 온라인 "Vbase"데이타베이스에서 간행된 것과 동일하며(전술한 웹 링크 참조),

도 7b는 제3 경쇄 골격 영역(V-카파)에 대한 인간 배선 아미노산 서열을 나타낸 것이며, 여기에서 CDR 영역은 생략되고; 나머지 골격 영역의 넘버링은 온라인 "Vbase"데이타베이스에서 간행된 것과 동일하며(전술한 웹 링크 참조),

도 8a는 제1 및 제2 경쇄 골격 영역(V-람다)에 대한 인간 배선 아미노산 서열을 나타낸 것이며, 여기에서 CDR 영역은 생략되고; 나머지 골격 영역의 넘버링은 온라인 "Vbase"데이타베이스에서 간행된 것과 동일하며(전술한 웹 링크 참조),

도 8b는 제3 경쇄 골격 영역(V-카파)에 대한 인간 배선 아미노산 서열을 나타낸 것이며, 여기에서 CDR 영역은 생략되고; 나머지 골격 영역의 넘버링은 온라인 "Vbase"데이타베이스에서 간행된 것과 동일하며(전술한 웹 링크 참조),

도 9a는 제1 및 제2 중쇄 골격 영역에 대한 인간 배선 아미노산 서열을 나타낸 것이며, 여기에서 CDR 영역은 생략되고; 나머지 골격 영역의 넘버링은 온라인 "Vbase"데이타베이스에서 간행된 것과 동일하며(전술한 웹 링크 참조),

도 9b는 제3 중쇄 골격 영역에 대한 인간 배선 아미노산 서열을 나타낸 것이며, 여기에서 CDR 영역은 생략되고; 나머지 골격 영역의 넘버링은 온라인 "Vbase"데이타베이스에서 간행된 것과 동일하며(전술한 웹 링크 참조),

도 10은 자연 살해 림프구 세포주 NKL에 대한 인간화 항-IL2 항체 "항-IL2"의 결합 특이성을 나타낸 것이고,

도 11은 항-IL2이 CTLL-2 세포상의 CD124 세포 표면 발현의 IL2-의존적 상향 조절을 폐기함을 나타낸 것이고,

도 12는 항-IL2이 IL2 수용체의 IL2 신호 전달 하향 스트림을 특이적으로 차단함을 나타낸 것이고,

도 13은 항-IL2의 효능과 다클리주마브의 효능이 CD25 발현 수준에 의해 상이하게 영향을 받음을 나타낸 것이고,

도 14는 원발성 인간 NK 세포의 IL-의존적 증식에 대한 항-IL2 및 다클리주마브의 효과를 나타낸 것이고,

도 25는 NK 세포에 의한 IFN-감마의 IL2-의존적 방출에 대한 항-IL2 및 다클리주마브의 효과를 나타낸 것이다.

실시예 1: 인간 IL2 (" hIL2 ")항원의 획득

하기 실시예 1a, 1b 및 1c의 실험 목적은 상이한 공급원들에서 유래된 재조합 IL2 항원물질을 제공하는 것이다: 원핵 세포에서 발현된 항원, 진핵 세포에서 발현된 항원 및 공인된 치료제로서 시판 중인 재조합 단백질 항원.

실시예 1a: 대장균으로부터의 재조합 발현

성숙 hIL2 (즉 인코딩 아미노산 잔기 APTSSS......IISTLT)을 단일 오픈 리딩 프레임("ORF")으로서 표준 PCR 및 분자생물학 기술을 사용하여 원핵 발현 벡터 pBAD (Invitrogen)내로 클로닝하였다. 5'-말단에 메티오닌을 코딩하는 세개의 뉴클레오티드가 추가되고, 3'말단상에 종지코돈전에 단백질의 C-말단에 헥사히스티딘-태그를 융합하는 뉴클레오티드 서열이 삽입되었다.

이러한 구축물을 사용하여 콤피텐트 대장균(BL21(DE3)균주, Stratagene)을 제조자 지시에 따라 형질전환하였다. 박테리아는 표준 LB 매질에서 밀도 OD(600 nm) = 0.5까지 성장시키고, L-아라비노스를 농도 0.2 % w/v로 첨가하여 5시간 동안 발현을 유발시켰다. 15분간 10,000 g에서 원심분리하여 대장균을 수확하였다. 이후 제조자 지시에 따른 프로토콜(Novagen)에 따라 버그부스터 시약(BugBuster)을 사용하여 불용성 분획(봉입체)를 제조하였다.

봉입체를 6 M 구아니딘-염산("GuHCl")에 용해시키고, 이후 2 M GuHCl (pH = 8.0) / 1 mM Glutathione-ox / 10 mM Glutathione-red 함유 버퍼로 0.1 mg/ml로 희 석시키고, 20℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션후, 격렬하게 교반하면서 빙초산을 천천히 적가하여 pH를 6.0으로 맞추었다. 최종적으로 세개의 연속적인 크로마토그래피를 적용하여 고순도의 동종성 hIL2his 단백질 제제를 수득하였다:고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC), 역상 HPLC, 이온교환 크로마토그래피. 정제된 단백질의 기능은 하기의 세포증식 실험으로 검증하였다.

실시예 1b: 포유세포로부터의 재조합 발현

성숙 hIL2 (즉 인코딩 아미노산 잔기 APTSSS......IISTLT)을 표준 PCR 및 분자생물학 기술을 사용하여 진핵 발현 벡터 pEFdhfr (Mack M. et al. (1995) PNAS 92, 7021-5)내로 클로닝하였다. 5'-말단에 인간 IgG의 리더 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가하여 효과적으로 프로세싱 및 분비가 되도록 하고, 3'-말단 상에는 종지 코돈앞에 단백질의 C-말단에 헥사히스티딘-태그를 융합하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하였다.

293 세포(DSMZ, 오더 코드 ACC305)를 플레이트 표면 커버리지 25-35%의 밀도로 시딩하고, 24시간동안 배양하였다. 이후 제조자 지시에 따라 "트랜스패스트"시약(Promega)을 사용하여 pEFdhfr-hIL2 발현 벡터로 상기 세포를 형질 감염시켰다. 추가적으로 60시간 동안 배양 기간을 가진 후, 세포 상등액을 수확하고, IMAC를 수행하고, 뒤이어 이온-교환 크로마토그래피에 의해 hIL2-his 단백질을 정제하였다. 정제 단백질의 기능을 세포 증식 실험으로 검증하였다.

실시예 1c: 프로루킨의 구매

프로루킨(Proleukin; 대장균에서 발현된, 포뮬레이션된 재조합 hIL2)은 키론사에서 구매하였다.

상기 방법으로 세개의 상이한 공급원의 완전히 기능적인 재조합 hIL2 항원을 얻을 수 있다.

실시예 2: 인간화 모노클로날 항- hIL2 항체의 생성

특히 바람직한 작용 모드를 갖는, 인간 hIL2을 특이적으로 표적하고 그 생활성을 중화시키는 인간화 모노클로날 항체("mAb")가 요망되었다. 일반적으로 사이토킨 hIL2와 같이 분비 가용성 단백질을 표적하는 중화 mAb들은 대응하는 사이토킨 수용체의 구성요소에 의해 인식되는 에피토프와 최소한 부분적으로 오버래핑하는 에피토프를 인식한다. 따라서, mAb는 직접적으로 사이토킨에 대한 결합에 대하여 수용체와 경쟁한다. 이러한 작용 기전은 중화가 효과적으로 달성될 수 있음을 의미한다. mAb는 사이토킨 수용체를 경쟁에서 완전히 이길 수 있도록 충분히 높은 용량으로 적용되어야 한다.

실시예 2a: 개시점 ---->단백질로서 시판 모노클로날 항- hIL2 항체

전술한 바와 같이 상이한 항-hIL2 mAb들의 중화 범위에 대한 이해를 얻기 위하여, 표준 프로토콜에 따라 마우스의 면역 반응 및 후속의 비장세포 수확 및 히브리도마 융합에 의해 항-hIL2 mAb들을 제조하였다. 또한, 시판 항-hIL2 mAb들을 구 매하였다. 가능한 mAb 풀을 사용하여 세개의 시험에서 상이한 항체의 특징을 비교하였다: 가용성 항원에 대한 결합을 ELISA로 시험하였고, 세포 표면-결합 항원에의 결합을 FACS에 의해 시험하였으며, hIL2 생활성에 대한 중화능은 세포 증식 시험에 의해 수행하였다.

ELISA시험은 아래와 같이 시행되었다:

모든 인큐베이션은 20℃에서 수행되었다. 스트렙트아비딘-코팅된 96-웰 ELISA 플레이트(Nunc)을 사용하여 웰당 100㎕ PBS-TB (인산염 버퍼 식염수, pH = 7.4, 0.05% v/v 트윈-20, 1 % w/v BSA)내 PEG-비오티닐화 프로루킨 0.1㎍을 30분간 부착시켰다. 이후 상기 플레이트를 웰당 200㎕ PBS-T (인산염 버퍼 식염수, pH = 7.4, 0.05% v/v 트윈-20)로 3회 세척하였다. 상이한 mAb 샘플을 웰당 100㎕ 가하고, 1시간 동안 샘플들을 인큐베이션하였다. 이후 플레이트를 웰당 200㎕ PBS-T로 3회 세척하였다. 적용된 검출 항체는 고우트 항-인간 IgG HRP-콘쥬게이트 mAb(Jackson Immunoresearch)이었으며, 이는 1:1000로 PBS-TB내에 희석되고, 웰당 100㎕ 씩 사용되어 1 시간동안 인큐베이션하였다. 이후 상기 플레이트를 웰당 200㎕의 PBS-T로 3회 세척하였다. 최종적으로 항원에 결합한 항체를 HRP 기질과의 인큐베이션으로 정량하였다: 100㎕ 2,2'-아지노-다이 [3-에틸-벤즈티아졸린-6-설폰산] ("ABTS") 기질 버퍼(Roche Diagnostics, ABTS 정) 및 플레이트를 녹색 염료가 발색될 때 까지 5 내지 10분간 인큐베이션하였다. 염색을 405 nm에서 96-웰 플레이트 리더상에서 측정하였다.

FACS 시험은 아래와 같이 수행되었다:

인간 자연 살해 림프구 세포주 NKL는 세포 배양 조건하 최적 성장을 위하여, 배지(Basal Iscove 배지(Biochrom AG); 10% v/v 소태아혈청 (Biochrom AG) ; 100 ㎍/ml 페니실린/스트렙토마이신(Biochrom AG))내 약 5 ng/ml hIL2의 존재에 의존한다. 웰당 1 x 10⁶ 의 NKL 세포를 hIL2가 없는 배지에서 24시간 동안 배양하여 hIL2를 공급하지 않았다. 실험 직전, 상기 세포를 hIL2가 없는 배지로 세척하였다. 모든 하기 인큐베이션은 4℃에서 30분간 시행되었다: 세척을 위해서, PBS-F 버퍼(인산염 버퍼 식염수, 3% v/v 소태아혈청)가 4℃에서 사용되었다. 먼저 2 x 10⁵ NKL 세포를 200㎕ 배지내에 1㎍의 재조합 인간 hIL2과 함께 인큐베이션하거나 또는 hIL2 없이 동일한 조건하에 두었다. 후속하여, 세포를 2 ml PBS-F로 3회 세척하였다. 이후 2 x 10⁵ 세포를 상이한 마우스 항-hIL2 mAb들(배지 200㎕ 내 1㎍)으로 4℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 상기 세포들을 전술한 바와 같이 다시 3회 세척하고, 마지막으로 200㎕ PBS-F내 1:1000로 희석한 FITC-콘쥬게이트된 고우트-마우스 IgG 검출 mAb (Jackson Immunoresearch)와 인큐베이션하였다. 세번 더 세척하고, 그 표면상에 hIL2을 보유하는 세포의 세포 형광을 플레인 세포(plain cells)에 대하여 FACS 머쉰으로 분석하였다.

증식 시험은 아래와 같이 수행되었다:

쥐 CTL 세포주 CTLL-2 (LGCPromochem)은 세포 배양 조건하 최적 성장을 위하여, 배지(Basal Iscove 배지(Biochrom AG); 10% v/v 소태아혈청 (Biochrom AG) ; 100 ㎍/ml 페니실린/스트렙토마이신(Biochrom AG); 0.5 mM 2-머캅토에탄올 (Gibco))내 약 5 ng/ml hIL2의 존재에 의존한다. 마우스 및 인간 hIL2 양자는 CTLL-2 세포의 생존 및 증식을 거의 동등한 정도로 유지시킨다. ml 당 CTLL-2 세포 1 x 10⁶ 을 hIL2-가 없는 배지에서 12시간 동안 배양하여 hIL2를 공급하지 않았다.

실험 직전에, 상기 세포를 hIL2가 없는 배지로 세척하였다. 96-웰 조직 배양 플레이트를 사용하여 증식 실험을 수행하고, 상이한 mAb들에 의한 hIL2 생활성의 저해를 평가하였다. 웰당 최종 분석 부피 200㎕을 가하고, 이는 5 x 10⁴ CTLL-2 세포, 2 ng/ml hIL2 (약 50% 최대 증식을 위한) 및 상이한 농도 즉 농도 5000 ng/ml, 1000 ng/ml, 200 ng/ml 및 40 ng/ml의 항-hIL2 mAb들을 포함하였다. 모든 샘플은 3벌로 준비되었다. 각 혼합물은 5% 이산화탄소 존재하 습기찬 챔버내에서 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션되었다. 이후 제조자 지시에 따라 알라마블루 형광 염료 판독기 (Biosource International) 및 96-웰 형광 플레이트 리더기를 사용하여 살아있는 세포를 검출하였다.

mAb202 (R&D 시스템스사 시판)은 (i)가용성 항원에 결합하고, (ii) 세포 표면-결합 항원에 결합하고, (iii) 효율적으로 hIL2 생활성을 중화하는 것으로 밝혀졌다. 테스트된 항체 중에서, 오직 mAb 202안이 모든 세개의 실험에서 점수를 얻었고, 따라서 상기에서 정의된 특징에 따라 유망한 후보로서 간주되어 후속 실험의 개시점(starting point)으로 선택되었다.

실시예 2b: 시퀀싱에 의한 항-hIL2 항체의 일차 서열의 결정: 중쇄 가변 영 역("VH") 및 경쇄 가변 영역("VL")에서의 서열 동정

mAb202 히브리도마 클론의 접근성 부족으로 인하여, mAb을 시퀀싱하여 VH 및 VL 아미노산 서열을 확인하였다. 이를 위하여, mAb202의 Fab 단편을 제조하였다. 상기 단편을 펩티드 분리를 위한 온라인 HPLC로 단백분해 소화를 시행하였다. 이어서, 각 펩티드를 MS/MS 질량 분석기로 아미노산 조성 및 서열에 대해 분석하였다. 이로써 VH 및 VL 단백질 서열을 확인할 수 있었다.

실시예 2c: 보유된 기능의 제어: 시퀀싱된 VH / VL 영역과 기지의 마우스 일정 영역과의 융합

전술한 mAb202 단백질 시퀀싱에서 수득한 시퀀싱 결과의 기능적 검증이 요망되었다. 따라서, 시퀀싱된 VH를 코딩하는 유전자를 합성하고 이를 마우스 IgG1의 일정 영역을 제공하는 발현 벡터내로 클로닝하였다. 유사하게 시퀀싱된 VL을 인코딩하는 유전자를 합성하고 이를 마우스 C 카파 도메인을 제공하는 발현 벡터내로 클로닝하였다. 이들 두 발현 벡터는 이상적으로 원래의 mAb202의 재구축을 허용하며, 그 기능성이 전술한바 같이 다시 검사될 수 있다. 293세포내에 양 벡터를 공발현시킨 후, 세포 상등액에서 원래의 mAb202에서 관찰되는 특징과 유사한 특징을 갖는 항-IL2 mAb이 검출되었다. ELISA 및 CTLL-2 세포주를 사용한 증식실험에서, 모 mAb202의 단백질 시퀀싱에 따라 재구축된 mAb이 동일한 활성을 확인함에 따라 이 항체의 VH 및 VL 영역에 대해 결정된 서열이 올바름을 확인할 수 있었다.

실시예 2d: 중쇄의 인간화

인간화의 목적은 mAb내 존재하는 비-인간 서열의 함량을 최소화하면서, 항체의 결합 특이성 및 생물학적 활성은 완전히 보유하고자 함이다. 비인간 서열의 함량을 최소화함으로써 원래의 비인간 기원의 모 항체보다 인간 개체에 투여시 면역반응을 덜 유발시킨다. 초기에 인간 IgG1 이소타입의 C1, C2 및 C3 도메인을 함께 갖는 원래 마우스 VH를 포함하는 키메라 중쇄용 발현 벡터가 생성되었다. 키메라 중쇄의 발현 후, 키메라 경쇄(이하 참조)와 결합될 때, 원래 마우스 mAb의 특징이 재생산될 수 있다(이하 참조). 다음의 논리적 단계는 VH를 인간화하는 것이다. 특이성이 변경되는 것을 피하기 위하여, CDR 서열은 변경되지 않은채 남아있었다. 따라서, 원래 마우스 VH를 기초하여, 가장 근접하게 관련된 인간 VH 골격 서열을 검색하였다. 모든 인간 VH 골격중에, 인간 골격 1-3/3-07/J6가 원래 쥐 골격에 가장 높은 정도의 동종성을 가지는 것을 발견하였다. 인간 골격 1-3/3-07/J6는 대응하는 마우스 VH 골격에서 16개의 아미노산 잔기가 상이함을 발견하였다. 이하 정렬은 원래 마우스 및 인간 1-3/3-07/J6 VH 골격간의 직접적인 대비를 보여준다; 원래 CDR 서열을 밑줄로 표시하였으며, 양 서열간 아미노산 동일성은 별표로 표시하였다.

원래 마우스 VH 또는 인간화 VH를 함유하는 구축물은 하기에서 각각 cHC(마 우스 VH 및 인간 C1, C2, C3를 포함하는 키메라 중쇄) 및 hHC (인간 VH 골격내 마우스 CDR 영역 및 인간 C1, C2, C3를 포함하는 인간화 중쇄)로 표시된다. 인간화 중쇄의 재조합 단백질 발현을 위하여, 인간 IgG1 이소타입의 C1, C2 및 C3와 조합된 인간화 VH를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 적합한 벡터(Raum T et al. (2001) Cancer Immunol Immunother. 50, 141-50)내로 클로닝하였다.

실시예 2e: 경쇄의 인간화

인간화는 전술한 중쇄에 대한 방법과 유사하게 수행되었다. 간략하게, 인간 Ck 도메인을 함께 갖는 원래 마우스 VL을 포함하는 키메라 경쇄에 대한 발현 벡터를 생성하고 키메라 중쇄와의 공발현후 테스트하였다(위 참조). 다시, 두번째 단계로서, 원래 마우스 VL을 기초로 가장 근접하게 관련된 인간 VL 골격 서열이 검색되었다. 모든 세개의 CDR들은 그대로 보유되었다. 인간 VL 골격 O12/Jk4가 서열상 가장 가까운 것으로 판명되었다. 모두 22개의 아미노 잔기가 마우스 VL 및 인간 O12/Jk4의 VL 골격 서열상 상이하였다. 하기 정렬은 원래 마우스 및 인간 O12/Jk4 골격을 직접 비교하여 나타낸 것이다; 원래 CDR 서열을 밑줄로 표시하였으며, 양 서열간 아미노산 동일성은 별표로 표시하였다.

원래 마우스 VL 또는 인간화 VL를 함유하는 구축물은 하기에서 각각 cLC(마우스 VL 및 인간 Ckappa을 포함하는 키메라 경쇄) 및 hLC (인간 VL 골격내 마우스 CDR 영역 및 인간 Ckappa를 포함하는 인간화 경쇄)로 표시된다. 인간화 경쇄의 재조합 단백질 발현을 위하여, 인간 Ck 도메인와 조합된 인간화 VL을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 적합한 벡터(Raum T et al. (2001) Cancer Immunol Immunother. 50, 141-50)내로 클로닝하였다.

실시예 2e.1: 전체 골격 영역으로서 인간 및 마우스 서열의 치환; 증식 시험에 의한 결합 및 중화의 평가

중쇄 및 경쇄 양자의 성공적인 인간화가 수행된 후, 결과되는 인간화 mAb들의 특징을 키메라 mAb 즉 전체적으로 쥐 가변 도메인을 함유하는 항체 분자와 비교하여 테스트하였다. 키메라 mAb는 원래의 mAb와 유사한 정도의 IL2 생활성의 증화능을 나타내었기 때문에, 이들 실험에 기준으로서 사용되었다. 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 발현 벡터쌍을 293세포의 일시적 공-형질감염에 사용하였다(세포에 두개의 플라스미드로 동시에 형질감염시키는 것을 제외하고는, 실시예 1b에 전술한 형질 감염과 동일한 프로토콜을 적용함).

293 세포에서의 발현 후, 세포 상등액에 동등량의 상이한 mAb들을 항-hIgG ELISA을 사용하여 검증하였으며, 그 구체적인 과정은 다음과 같다:

96-웰 ELISA 플레이트(Nunc)를 웰당 PBS내 1:2,000로 희석한 항-hIgG mAb (Abcam LTD) 100㎕로 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 200㎕의 PBS-T 버퍼로 3회 세척하고, 이후 깨끗한 상등액 100㎕을 293 cells에서 수확하여 상등액을 배지내 단계 희석하여 각 웰을 채우고, 20℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다시 각 웰을 200㎕의 PBS-T 버퍼로 3회 세척하였다. PBS-TB 내 1:1,000 희석한 고우트 항-인간 IgG HRP-콘쥬게이트된 mAb (Jackson Immunoresearch)를 각 웰 당 100㎕로 가하고, 1시간동안 20℃에서 인큐베이션하였다. 이후 상기 플레이트를 웰당 200㎕의 PBS-T 버퍼로 3회 세척하였다. 최종적으로 hIgG에 대한 항체 결합을 HRP 기질과의 인큐베이션에 의해 정량화하였다: 100㎕ ABTS 기질 버퍼 (Roche Diagnostics, ABTS 정) 및 플레이트를 녹색 염료가 발색될 때까지 5 내지 10분간 인큐베이션하였다. 상기 염색을 405 nm에서 96-웰 플레이트 리더기 상에서 측정하였다. 동일량의 mAb를 갖는 상등액만을 모든 팔로업 실험에 사용하였다. 다양한 mAbs의 항원-결합이 ELISA에 의해 테스트되었다 (위 참조).

생성된 mAbs의 가용성 항원에 대한 결합 특성 및 IL2 생활성에 대한 중화 특성이 각각 ELISA 및 CTLL-2 증식 실험(자세한 실험 프로토콜은 실시예 2a 참조)에 의해 분석하였다. ELISA 실험에서, 흡광도 단위의 증가는 hIL2 항원에 결합하는 mAb의 증가량을 나타낸다. CTLL-2 증식 실험에서, 형광 단위의 증가는 대사적으로 활성인 세포(= 살아있는 세포)의 수가 증가됨을 나타낸다. 상이한 mAb를 함유하는 모든 세포 상등액("SN")은 하기 실험을 수행하기 전에 항-hIgG ELISA에 의해 고른 mAb 농도를 갖도록 조절되었다. 대표적 실험 결과를 도 1에 도시하였다. 여기에서, hLC+hHC (hLC = 인간화 경쇄, hHC = 인간화 중쇄) 및 cLC+hHC (cLC = 키메라 경쇄)의 양 조합은 hIL2 항원에 대해 유사한 결합을 나타내었다. CTLL-2 시험 결과(도 2 참조), hLH+hHC는 검출된 형광이 대조 SN과 다르지 않았으며, 이로써 어떠한 검출가능한 hIL2 생활성에 대한 중화를 초래하지 않음을 보여준다. 반면, cLH+hHC는 mAb 농도-의존적 형광의 감소에서 알 수 있는 바와 같이 살아있는 세포수를 경감시킨다. 본 실험에서 두개의 각 사슬 cLC 또는 hHC는 hIL2-의존성 세포 생존에 아무런 영향을 미치지 않았다(데이타 미도시). 도 2에서 나타낸 대표적 실험의 각 데이타는 두개의 샘플의 평균 결과이다. 시험 결과를 하기 표 1에 요약하였다:

[표 1]

경쇄	중쇄	항원결합	중화
hLC	HHC	+	-
cLC	HHC	+	+

이러한 결과들로부터, 가용성 항원에 대한 결합이 다르지 않음에도 불구하고, hLC가 인간화 중쇄 가변체와 사용되자마자 중화능이 소실됨을 알 수 있다. 즉 VL의 인간화는 mAb에 대해 어떤 기능적 손상을 수반한다는 결론이 도출된다.

이러한 손상이 어디에서, 즉 어떤 골격 영역에서 도입된 것인지를 알아내기 위하여, cLC의 VL 골격의 인간화를 상이한 세그먼트에서, 한번에 모든 세개의 골격을 마우스에서 인간으로 변경하기 보다는 한번에 하나의 골격을 변경하여(즉, 골격 영역 1, 골격 영역 2, 골격 영역 3) 수행하였다. 이러한 인간화 변형체를 명시하기 위하여 축약 명명법을 개발하여 사용하였다. 이러한 명명법에 따르면, 세개의 대문자를 사용하여 처음 세개의 골격 영역 1,2 및 3의 각각을 명시하는 트리플렛을 만들고, 상기 트리플렛의 첫번째 위치는 골격 영역 1의 성질을 명시하며, 트리플렛의 두번째 위치는 골격 영역 2의 성질을 명시하며, 트리플렛의 세번째 위치는 골격 영역 3의 성질을 명시한다. 예를 들면, "HMM"은 VL내 인간 골격 영역 1이고 나머지는 쥐 기원을 가리키며, "MHM"은 골격 영역 2만이 인간이고, 골격 영역 1 및 3이 쥐 기원인 것을 가리킨다.

서로 다른 인간/마우스 히브리드 VL 도메인의 특징을 그 효과에 대해 분석하였다. hIL2 항원에 대한 결합과 IL2 생활성에 대한 중화를 각각 ELISA 및 CTLL-2 증식 시험으로 분석하였다(자세한 실험 프로토콜은 실시예 2a 참조). ELISA 실험에서, 흡광도 단위의 증가는 hIL2 항원에 결합하는 mAb의 증가량을 나타낸다. CTLL-2 증식 실험에서, 형광 단위의 증가는 대사적으로 활성인 세포(= 살아있는 세포)의 수가 증가됨을 나타낸다. 상이한 mAb를 함유하는 모든 세포 상등액("SN")은 하기 실험을 수행하기 전에 항-hIgG ELISA을 사용하여 균일한 mAb 농도를 갖도록 조절된다. 대표적 실험 결과를 도 3에 도시하였다. 여기에서, 모든 인간/마우스 히브리드 VL들은 hHC와 조합되었을 때 hIL2 항원에 대해 유사한 결합을 나타내었다. CTLL-2 시험 결과(도 4 참조), hIL2 생활성에 대한 중화는 오직 VL 골격영역 2가 쥐 기원인 경우에 한해서 관찰되며; MHM+hHC는 대조 SN과 비하여 살아있는 세포수를 변경시키지 않았다. 도 4에서 나타낸 대표적 실험의 각 데이타는 두개의 샘플의 평균 결과이다. 시험 결과를 하기 표 2에 요약하였다:

[표 2]

경쇄	중쇄	항원결합	중화
HMM	HHC	+	+
MHM	HHC	+	-
MMH	HHC	+	+
HMH	HHC	+	+

이러한 실험은 mAb가 IL2 생활성을 중화시킬수 있는 지 여부는 VL의 골격2가 결정함을 명백히 보여준다. 마우스 및 인간 서열의 골격 2을 보다 자세히 비교한 결과 이들 서열은 3개의 아미노산이 서로 다름을 보여주었다. 특히, 마우스 골격 2는 부분 아미노산 서열 QSPKA을 포함하는 반면, 대응하는 인간 서열은 KAPKL이다 (인간 및 마우스 종 사이에 서로 다른 아미노산을 밑줄로 표시하였다).

실시예 2e.2: 골격 2내에서 인간 및 마우스 서열의 치환; 증식 시험 및 표적 유전자 유도 시험에 의한 결합 및 중화의 평가

중화 mAb를 제공함에 있어서, 세개의 아미노산 모두가 변경되어야 하는지 아니면 오직 일부가 결정적인 것인지를 결정하기 위하여, 부가적인 실험을 수행하였다. 이를 위하여, 마우스-유도 아미노산 잔기 QS 또는 A를 hLC내로 재도입하였다.

생성되는 mAb들의 가용성 항원에 대한 결합과 IL2 생활성에 대한 중화를 각각 ELISA 및 CTLL-2 증식 시험으로 분석하였다(자세한 실험 프로토콜은 실시예 2a 참조). ELISA 실험에서, 흡광도 단위의 증가는 hIL2 항원에 결합하는 mAb의 증가량을 나타낸다. CTLL-2 증식 실험에서, 형광 단위의 증가는 대사적으로 활성인 세포(= 살아있는 세포)의 수가 증가됨을 나타낸다. 상이한 mAb를 함유하는 모든 세포 상등액("SN")은 하기 실험을 수행하기 전에 항-hIgG ELISA을 사용하여 균일한 mAb 농도를 갖도록 조절된다. 대표적 실험 결과를 도 5에 도시하였다. 여기에서, 명백히 알 수 있는 바와 같이, QSPKL+hHC 및 KAPKA+hHC은 hIL2 항원에 대해 유사한 결합을 나타내었다. CTLL-2 시험 (도 6)은 QSKPL+hHC의 경우 검출 형광이 대조 SN가 다르지 않았으므로, 어떠한 검출가능한 hIL2 생활성의 중화를 나타내지 않았다. 반면, KAPKA+hHC는 mAb 농도 의존적 형광의 감소를 나타내는 것으로 알 수 있는 바와 같이, 살아있는 세포의 수를 경감시킨다. 도 6에서 나타낸 대표적 실험의 각 데이타는 두개의 샘플의 평균 결과이다. 시험 결과를 하기 표 3에 요약하였다:

[표 3]

경쇄	중쇄	항원결합	중화
hLC	HHC	+	-
hLC_QSPKL	HHC	+	-
hLC_KAPKA	HHC	+	+

이는 VL 골격 2에 위치된 단일 아미노산 잔기가 mAb가 IL2 생활성을 중화시킬 지 여부를 결정함을 보여준다: 이 위치에서 마우스 골격 2에서 유래된 알라닌 잔기가 중화를 허용하며, 인간 골격 2에서 유래된 루이신 잔기는 중화를 허용하지 않는다.

실시예 3: 중화 모드의 결정

하기에서, "항-IL2"는 서열번호: 9(그자체가 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 포함함)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 10(그 자차게 서열번호: 8의 아미노산을 갖는 VL 영역을 포함함)을 포함하는 중쇄를 포함하 는 인간화된 항-IL2 항체를 지칭한다. 항-IL2의 VL은 실시예 2e.2에서 설명한 바와 같이, 아미노산 서열 "KAPKA"를 포함한다.

항-IL2에 의한 hIL2의 중화 모드를 더욱 잘 이해하는 것이 요망되었다. 이를 위하여, 한편으로는 항-IL2 수용체의 구성요소에의 hIL2 결합 성질을 연구하고, 다른 한편으로 항-IL2에의 hIL2 결합 성질을 연구하기 위한 시험을 수행하였다.

NKL세포는 생존을 위해 IL2를 필요로 하므로, 이들 세포들이 IL2에 대한 기능적 수용체를 발현함을 추론할 수 있다. FACS 실험을 전술한 과정에 의해 수행하였다. 간략하게, 상기 세포를 항-hIL2 mAb 및 종-특이적 제2 검출 항체("프리믹스") 혼합물과 인큐베이션하였다. 상기 제2 항체는 형광 라벨로 콘쥬게이트되었다. hIL2 존재하 및 비존재하에서 FACS을 사용하여 세포 형광을 측정하였다. 하기 실험 시나리오를 수행하여 효과 관찰을 위해 특정 순서의 인큐베이션이 요구되는지 여부를 알아보았다.

제1 시나리오에서, 프리믹스는 hIL2와 함께 또는 hIL2없이 30분간 인큐베이션하였다. 이후, NKL 세포를 가하였다. 세포 형광은 hIL2-의존성으로 관찰되었다. 두번째 시나리오에서는 NKL세포를 hIL2와 함께 또는 hIL2없이 30분간 인큐베이션하고 이후, 프리믹스를 가하였다. 이 경우에도, 세포 형광은 hIL2-의존성으로 관찰되었다. 이러한 실험 결과, hIL2는 항-IL2에 결합된 때도 여전히 그 수용체에 결합할 수 있으며, 나아가 hIL2는 그 수용체와 결합된 때에도 여전히 항-IL2과 상호작용할 수 있음을 알 수 있었다.

이러한 결과는 전술한 바와 같이 생성된 항-IL2에 의해 결합된 hIL2의 에피 토프는 hIL2 수용체에 의해 결합된 hIL2의 에피토프와 명백히 구분(최소한 부분적으로)됨을 알 수 있다. 이러한 중화 모드는 매우 주목할 만한데, hIL2의 중화가 가용성 또는 수용체-결합된 형태의 이들 분자와의 결합에 의해 수행될 수 있음을 의미하기 때문이다. 시간순서로 보았을 때, hIL2 및 항-IL2의 결합이 hIL2 및 hIL2-수용체간의 복합체가 형성되기 전에 또는 그 이후에 일어날 수 있음을 의미한다; 어떤 경우이든 hIL2의 생활성에 대한 중화 효과를 나타낸다. 따라서, 이러한 결과에서 두 개의 관련 결합 즉 hIL2 및 hIL2-수용체간의 복합체 형성과 hIL2 및 항-IL2의 복합체 형성이 동시에 일어나는 경우에도 중화 효과가 나타남을 추정할 수 있다.

이러한 항-IL2에 대하여 관찰된 중화 모드는 중화 항-리간드 항체 및 리간드 수용체에 의해 결합되는 에피토프가 하나이며 동일한 다른 알려진 중화 모드와 매우 뚜렷하게 대비된다는 점에 주목하여야 한다: 종래의 시나리오에서는 리간드, 리간드-수용체 및 중화 항-리간드 항체간의 3원 복합체가 존재할 수 없었다. 달리 표현하면, 종래의 중화 모드에서는, 리간드는 반드시 리간드가 가용성 형태로 존재할 때 중화 항-리간드 항체에 의해 결합되어야 하며, 이로써 리간드 및 리간드-수용체간의 복합체 형성은 배제된다.

실시예 4: 인간 자연 살해 림프구 세포주 NKL 에 대한 IL2 -의존적 항- IL2 결합

본 실험에서는 세포 표면 결합된 hIL2에 대한 항-IL2 결합의 특이성을 연구 하였다. 항-IL2 모체 Ab (mAb202)는 NKL 세포의 세포 표면에 대한 매우 엄격한 IL2-의존성 결합을 나타내었다. 따라서 이러한 특징이 항-IL2에도 나타나는지 확인해보았다.

NKL 세포는 시험전에 24시간 동안 hIL2를 공급하지 않았다. 항-IL2 또는 인간 IgG1 이소타입 대조 항체를 2배 몰 과량의 hIL2의 존재 또는 비존재하에 20℃에서 60 분간 인큐베이션하였다. 이후 각각의 혼합물을 NKL 세포에 가하고 (샘플당 10⁵ 세포수) 얼음상에서 30분간 더 인큐베이션하였다. 이어서, 상기 세포를 세척하고, 형광-라벨된 고우트 항-인간 IgG 검출 항체를 가하고, 이어서 얼음상에서 30분간 인큐베이션하였다. 다시 세포를 세척하고, 세포-결합된 형광을 분석하기 위해 FACS 분석을 수행하였다.

예상된 대로 hIL2가 존재하지 않는 경우에는 항-IL2 또는 대조 항체의 어떤 경우에서도 유의성있는 세포-결합 형광이 검출되지 않았다(도 10, 좌측). hIL2이 존재하는 경우, 대조 항체에서는 세포 결합 형광이 변경되지 않았다(도 10, 우측, 쉐이드 피크). 반면에, hIL2 및 항-IL2로 인큐베이션한 경우 형광에 있어 상당한 증가가 나타났으며 (도 10, 우측, 검은 실선 피크), 이는 세포표면에 특이적 IL2-의존성 항-IL2 결합이 나타남을 지시한다. 따라서, 세포 표면-결합 hIL2을 인식할 수 있는 능력은 항-IL2 에서 보존돤다. 이 실험은 항-IL2가 용액중의 IL2를 인식할 수 있을 뿐 만 아니라, 그 수용체 구성요소의 하나 또는 수개와 결합되어 있는 IL2도 인식함을 입증한다. 결과적으로 hIL2는 항-IL2 및 IL2 수용체 구성요소와 비배 타적인 방식으로 결합할 수 있다.

실시예 5: 항- IL2 는 CTLL -2 세포상의 CD124 세포 표면 발현의 IL2 -의존적 상향 조절을 폐지한다.

hIL2에 의한 자극에 따라, CTLL-2 세포가 증식되고, CD124 (IL-4R alpha)의 세포 표면 발현이 상향-조절된다(Puri, R. K., et al. (1990). Immunology 70, 492). 결과적으로 CTLL-2 세포는 IL2 자극을 경유하여 IL-4을 통한 동시적 자극에 증가된 민감성을 획득한다. 따라서, 항-IL2는 IL2 매개 증식을 제한할 뿐 아니라 CD124 발현에도 영향을 미친다.

이러한 가설을 검증하기 위하여, CTLL-2 세포를 실험전 12시간 동안 hIL2 없이 배양하고, 이후 적정된(titrated) 농도의 항-IL2 존재 또는 비존재하에 0.5 ng/ml의 hIL2로 5시간 동안 자극하였다. CD124 발현 수준을 형광 라벨된 CD124-특이적 항체를 사용하여 FACS 분석으로 평가하였다. 검출된 평균 형광을 다양한 항-IL2 농도로 플로팅하였다(도 11, 검은 실선처리된 열린 사각); Anti-IL2 비존재하 기록된 평균 형광값 (도 11, 다이아몬드) 또는 IL2 비존재하 기록된 평균 형광값 (도 11, 삼각)이 대조로서 포함되었다. 도 11에서 알 수 있는 바와 같이 항-IL2은 용량-의존적으로 CD124 발현을 감소시켰다: 이 실험에서 산출된 IC50는 약 3.3 x 10^-10 M이었다. 이러한 데이타값은 항-IL2이 CTLL-2 세포 증식에 영향을 미칠 뿐 아니라, CD124 발현과 같은 다른 IL2- 의존적 세포 반응에도 영향을 미침을 의미한 다.

실시예 6: 항- IL2 는 특이적으로 IL2R 의 IL2 신호 전달 하향 스트림을 차단한다.

이 실험은 항-IL2이 어떤 세포독성 기전에 의해 부분적으로 hIL2-의존적 세포 반응에 대한 그 효과를 매개할 가능성을 추가적으로 배제하고, 항-IL2 활성 기전이 hIL2-구동되는 신호에 대해 매우 특이적이며 관련 경로에는 영향을 미치지 않음을 확인하기 위해 수행되었다. IL2-매개 세포 반응의 가장 신속한 세포 반응 중의 하나는 전사 인자 STAT3의 티로신 인산화반응이다 (Leonard, W. J. 2000. IL2 Family Cytokines and their Receptors). IL-6 등과 같은 다른 시토킨은 부분적으로 오버래핑 세포 신호 경로를 유발하고, 이는 또한 STAT3와 관련되어있다 (Hemmann, U., et al. (1996). J Biol Chem 271, 12999; Stahl, N., et al. (1995). Science 267, 1349).

따라서, IL2- 및 IL6-구동된 STAT3 티로신 인산화에 대한 항-IL2 효과를 테스트하였다. 신선한 공여자 혈액에서 말초 혈액 림프구를 분리하고, 2 x 10⁶ 세포/ml로 인큐베이션하고, 렉틴으로 48시간 동안 미리 자극시킨 후, 이후 자극 전에 24시간 동안 배지내에 두었다. 이후 세포를 포화 농도의 IL2 또는 IL6/sIL6Rα로 mAb없이 또는 항-IL2 존재하 또는 아이소타입 모노클로날 항체 존재하에서 15분간 자극하였다. SDS-PAGE에 의해 세포질 추출물을 분리한 후, STAT3의 인산화 상태를 STAT3 티로신 인산화-특이적 항체를 사용하여 면역 블롯팅으로 조사하였다(도 12, 상부 패널). 동등한 로딩량의 대조에 전체 STAT3 단백질 블롯을 수행하였다(도 12, 하부 패널). 표준 단백질의 전기영동 운동성을 도 12의 각 패널의 좌측에 표시하였다.

IL2 및 IL-6 자극은 모두 항-IL2가 존재하지 않는 상태에서 STAT3의 세포 티로신 인산화를 크게 증강시켰다 (도 12, 2 및 3 레인 대 1 레인, 또는 6 및 7 레인 대 1 레인). 항-IL2은 IL2 자극후에는 STAT3 티로신 인사화에 특이적으로 영향을 미치나, IL6 자극후에는 그렇지 않았다(도 12, 4 레인 대 5 레인). 이들 결과는 항-IL2가 hIL2 생물학에 대해서는 매우 특이적으로 방해하지만, 다른 인자에 조절되는 경로에 대해서는 영향을 미치지 않으며, 항-IL2은 명백한 세포독성 효과를 갖지 않음을 보여준다.

실시예 7: 항- IL2 및 다클리쥬마브의 효능은 CD25 발현 수준에 의해 상이하게 영향을 받는다.

다클리주마브, 인간화 항-CD25 mAb의 저해 활성을 항-IL2 및 아이소타입 대조 항체의 저해활성과 병렬적으로 비교하였으며, IL2-의존성 세포주 NKL을 사용하여 증식 시험으로 수행하였다(도 13).

항-IL2 또는 다클리주마브에 의한 IL2-유도된 세포 증식의 저해에 대한 CD25 세포 표면 발현 수준의 효과를 조사하기 위하여, NKL 세포들을 고발현수준의 CD25 또는 저발현 수준의 CD25로 FACS-소팅하고, 양 세포 집단에 대해 본 실험에서 병렬 적으로 연구하였다. FACS 소팅에 사용된 항-CD25 mAb는 CD25에 대한 IL2 또는 다클리주마브의 결합을 저해하지 않았다(데이타 미도시). 소팅 직후에는 FACS에 의해 매우 분명하게 CD25^low 및 CD25^high 집단을 구분할 수 있었으나, 5일간의 실험 중에 두 집단은 소팅전의 집단과 거의 동등한 CD25 발현 수준으로 되었다. 이는 이러한 시험에서 얻어진 결과가 실험의 초기 상에 대한 분리된 CD25^low 대 CD25^high 집단을 반영할 뿐, 이 실험의 후기 상에 대해서는 반영하지 않음을 의미한다. 따라서, CD25^low 및 CD25^high 집단을 비교하는 항-IL2 또는 다클리주마브에 의한 증식 억제에 관해 관찰된 차이는 안정하지 않은 CD25 발현 수준 때문에 제한된다; 그래도 다클리주마브 및 항-IL2 활성의 상이한 CD25 의존성을 의미하는 명백한 경향은 이들 데이타에서 연역될 수 있다. NKL 세포는 실험 준비에서 hIL2가 없는 배지에서 16시간 배양하였다. 웰당 최종 분석 부피 200 ㎕이 적용되었으며, 이는 1 x 10⁴ NKL 세포, 2 ng/ml hIL2 (50% 최대 증식을 허용함), 및 상이하게 적정된 농도의 모노클로날 항체를 포함하였다. 모든 샘플은 두벌씩 준비하였다. 각 혼합물의 인큐베이션은 120 시간 동안 이루어졌으며, 이후 살아있는 세포는 형광염료를 사용하여 가시화되었다.

본 시험에서 일반적으로 항-IL2이 다클리주마브에 비교하여 IL2-매개된 증식의 중화에 더욱 효과적이었다. 기대한 대로, 항-IL2의 효능은 CD25 발현 수준에 영향받지 않았다: CD25^low 및 CD25^high NKL 세포에서, 항-IL2에 의해 얻어진 커브가 가 장 상부에 있었다. 반면, 다클리주마브에 의해 얻어진 곡선은 CD25^low NKL 세포에서와 CD25^high NKL 세포에서 매우 다른 차이를 나타내었다. 아이소타입 대조 Ab는 아무런 효과를 나타내지 않았다(도 13). 요약하면, 본 실험은 다클리주마브의 효능은 CD25 수준에 의존적이나, 항-IL2는 그렇지 않다는 인 비트로 증거를 제공한다.

실시예 8: 원발성 인간 NK 세포의 IL2 -의존적 증식에 대한 항- IL2 또는 다클 리주마브의 영향

원발성 T 세포 뿐 아니라, 원발성 NK 세포도 IL2 자극에 반응하여 증식할 수 있다. 따라서, 추가적인 실험에서, 막 분리된 인간 NK 세포의 IL2-유발 증식의 저해를 조사하였다.

공여자 혈액에서 음성 분리로 세포들을 수득하고, 이들 세포들을 적정된 항-IL2 또는 다클리주마브의 존재 또는 비존재하에 hIL2 (5.5 ng/ml)와 인큐베이션하였다. 대조 항체는 가장 높은 농도로 적용하였다: 다른 대조로서 IL2 및 항체가 존재하지 않는 세포로 수행하였다. 일주일간의 인큐베이션 기간의 끝에 형광 염료를 사용하여 살아있는 세포를 정량하였다. 항-IL2는 이 실험에서 IL2-구동의 원발성 인간 NK 세포의 증식을 상당히 경감시켰다. 높은 항-IL2 농도에서, 증식은 실질적으로 IL2가 없는 상태에서 관찰되는 수준으로까지 제한되었는데, 이는 이 시험에 존재하는 모든 IL2-반응성 NK 세포에 항-IL2가 영향을 미침을 의미한다. 대조적으로, 다클리주마브는 상당히 감소된 정도의 효과만을 나타내었으며, 이는 오직 일부 의 NK 세포만이 이들 항체의 존재에 의해 영향을 받음을 제시한다(도 14). 이러한 발견을 보다 자세히 조사하기 위하여, IL2 및 항체들과의 1주일간의 인큐베이션 동안 CD25의 발현 수준을 모니터하였다: 공여자로부터의 전체 NK 세포의 오직 11% 만이 3일째 최대 CD25 발현을 획득하였으며, 7일에는 2%로 격감하였다. 이러한 결과와 일치되게, 모든 공여자로부터 막 분리된 NK 세포는 검출가능한 CD25 발현이 없었으며, 비숫한 수준의 CD25 발현 및 키네틱이 모든 분석된 공여자의 NK 세포에서 발견되었다(데이타 미도시). 이로부터 다클리주마브가 왜 오직 일부의 NK 세포의 증식만을 저해하는지가 설명된다(도 14). 항-IL2은 CD25 발현 수준의 독립성을 보였으며, 약 3 x 10^-10 M의 IC50 값으로 모든 NK 세포의 증식을 차단하였다. 이러한 결과는 항-IL2은 CD25에 독립적으로, 중간 친화성 IL2 수용체 CD122/CD132을 통해 IL2-매개신호를 저해할 수 있으나, 다클리주마브는 그렇지 않음을 보여준다.

실시예 9: NK 세포에 의한 IL2 - 의존적 IFN -감마 방출에 대한 항- IL2 또는 다 클리주마브의 영향

증식이외에도, 시토킨 자극에 대한 원발성 NK 세포의 전형적이고 신속한 반응은 INF-감마의 방출이다. 이러한 방출은 아래 실험에서, 항-IL2 및 다클리주마브 양자에 대해 의존적으로 측정되었다.

본 시험에서, 막 분리된 인간 NK 세포는 hIL2 (5.5 ng/ml), hIL12 (5 ng/ml) 및 hIL18 (5 ng/ml)을 포함하는 칵테일로 자극시켜 이들 세포에 의한 INF-감마의 효과적인 생산 및 방출을 유발시켰다. 인큐베이션 처음 48시간 동안의 적정된 항-IL2, 다클리주마브 및 아이소타입 대조 항체의 IFN-감마 방출에 대한 효과를 비교하였다. 항-IL2 및 다클리주마브는 모두 용량-의존적으로 IFN-감마의 발현을 감소시켰으나, 대조 항체는 아무런 효과를 나타내지 않았다(도 15). 항-IL2는 IC50가 약 1.3 x 10^-10 M로서 약 1.1 x 10^-9 M의 IC50을 나타내는 다클리주마브 보다 더 강력한 IFN-감마 방출 저해를 나타내었다(도 15). 전 실시예에서의 실험과 대조적으로 이 실험에서는 모든 NK 세포가 실험 조건에서 CD25 발현을 획득하였으며(데이타 미도시), 이는 다클리주마브가 NK 세포 증식에 비해 IFN-감마에 더욱 충분한 효과를 나타내는 이유를 설명한다.

표 4에 항-IL2 및 다클리주마브의 평형 결합 상수(K_D)를 요약하였다. 또한, 실시예 8 및 9에서 기재한 바와 같이 양 항체(Abs)을 사용한 병렬 비교 실험에서 수득한 IC50을 요약하여 기재하였다.

[표 4]

특징	단위	항-IL2	다클리주마브
결합 친화성	평형 해리 상수(K_D)	6.8±6.1×10^-10M (비아코르) 2.5±1.6×10^-9M (세포 표면)	3.0 ×10^-9M^＃
인간 원발성 NK 세포의 증식	IC50	1.0±0.6×10^-10M	1.4±0.4×10^-9M^＊
인간 NK 세포에 의한 INF-감마 생산	IC50	1.3±1.0×10^-10M	1.0±0.8×10^-9M

＃: Junghans, R. P., et al. (1990). Cancer Res 50, 1495에 따름

＊: CD25 발현된, 전체 NK 세포 집단의 ~10%에 기초함

SEQUENCE LISTING <110> Micromet AG <120> Anti-IL2 antibodies <130> IP20071026 <140> <141> <150> EP 05 011 845.4 <151> 2005-06-01 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-L1 <400> 1 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-L2 <400> 2 Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-L3 <400> 3 Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H1 <400> 4 Ser Tyr Thr Leu Ala 1 5 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H2 <400> 5 Ala Ile Asp Ser Ser Ser Tyr Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Val Arg Gly 1 5 10 15 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 <400> 6 Asp Ser Asn Trp Asp Ala Leu Asp Tyr 1 5 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> VL <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 117 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> VH <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Leu Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asp Ser Ser Ser Tyr Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Val Arg 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Ser Asn Trp Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 214 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> LC <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 10 <211> 447 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> HC <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Leu Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asp Ser Ser Ser Tyr Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Val Arg 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Ser Asn Trp Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 11 <211> 239 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> scFv VL-VH <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 130 135 140 Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Leu Ala Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ala Ile Asp Ser Ser 165 170 175 Ser Tyr Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser 180 185 190 Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 195 200 205 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Trp Asp 210 215 220 Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 12 <211> 239 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> scFv VH-VL <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Leu Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asp Ser Ser Ser Tyr Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Val Arg 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Ser Asn Trp Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 130 135 140 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn 145 150 155 160 Val Gly Thr Asn Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 165 170 175 Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser 180 185 190 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 195 200 205 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr 210 215 220 Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235

Claims

인간 인터루킨-2(IL2)와 특이적으로 결합하는 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편으로서,

- 상기 인간화 모노클로날 항체는 인간 IL2가 인간 IL2-수용체에 결합하기전, 결합하는 동안, 및/또는 결합후에 인간 IL2에 결합함으로써, 인간 IL2의 활성을 중화시키고,

- 상기 인간화 모노클로날 항체의 경쇄 가변영역은 제2 골격영역에 인접하는 아미노산 서열 KAPKA을 포함하는, 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편.
제1항에 있어서,

상기 인접하는 아미노산 서열 KAPKA는 상기 제2 골격 영역의 아미노산 위치 42-46에 위치하는 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서,

제1, 제3 및/또는 제4 경쇄 골격영역의 하나 이상이 각각의 영역에 대한 인간 배선서열에 대응하는 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 경쇄 가변 영역이 추가적으로 그 CDR1 영역에 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하고, CDR2 영역에 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하고, CDR3 영역에 서열번호: 3의 아미노산서열을 포함하고; 중쇄 가변영역이 그 CDR1 영역에 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하고, CDR2 영역에 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하고, CDR3 영역에 서열번호: 6의 아미노산서열을 포함하는 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

제1, 제3 및/또는 제4 경쇄 골격영역의 하나 이상이 각각의 영역에 대한 인간 배선서열에 대응하는 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

제1 경쇄 골격 영역의 아미노산 서열, 제2 경쇄 골격 영역의 잔여 아미노산 서열(즉, 아미노산 위치 35-41 및 47-49 포함하는 아미노산 서열), 제3 경쇄 골격 영역의 아미노산 서열이, 유전자좌 O12, O2, O18, O8, A30, L1, L15, L4, L18, L5, L19, L8, L23, L9, L11 또는 L12의 인간 배선 하위 그룹 VKI 중 어느 하나; 유전자좌 1a의 인간 배선 하위 그룹 VL1 중 어느 하나; 또는, 유전자좌 2c, 2e, 2a2 또는 2b2의 인간 배선 하위 그룹 VL2 중 어느 하나에 대응하는 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

제1 중쇄 골격 영역의 아미노산 서열, 제2 중쇄 골격 영역의 아미노산 서열, 및 제3 중쇄 골격 영역의 아미노산 서열이 독립적으로 인간 배선 하위그룹 VH3 중 어느 하나에 대응하는 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편.
제7항에 있어서,

제1 중쇄 골격 영역의 아미노산 서열, 제2 중쇄 골격 영역의 아미노산 서열, 및 제3 중쇄 골격 영역의 아미노산 서열이 인간 배선 하위그룹 VH3의 유전자좌 3-07 내의 것인 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,

제4 경쇄 골격 영역의 아미노산 서열이 인간 JK4(FGGGTKVEIK)에 대응하는 것인 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,

서열번호: 7의 아미노산서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 8의 아미노산서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 것인 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,

서열번호: 9의 아미노산서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 10의 아미노산서 열을 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항체가 IgG인 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편.
제12항에 있어서,

상기 IgG가 IgG1 또는 IgG4인 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 단편이 scFv, 단일도메인항체, Fv, 디아체, 탠덤디아체, Fab, Fab' 또는 F(ab)2인 인간화 모노클로날 항체의 단편.
제14항에 있어서,

상기 단편이 scFv이고, 특히 상기 scFv은 그 경쇄 가변영역에 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, 그 중쇄 가변영역에 서열번호: 8의 아미노산서열을 포함하는 인간화 모노클로날 항체의 단편.
제15항에 있어서,

상기 scFv은 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 아미노산서열을 포함하는 인간화 모노클로날 항체의 단편.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,

서열번호: 1-12 중 어느 하나의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성, 바람직하게 80%, 90%, 가장 바람직하게 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 모노클로날 항체 또는 단편.
서열번호: 1-12 중 어느 하나의 아미노산서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 상기 뉴클레오티드서열과 60% 이상, 바람직하게는 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자로서,

상기 상동성은 서열번호: 1-12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자와 대상 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 시퀀스 정렬에 의해 비교함으로써 결정되고,

대상 서열내 뉴클레오티드가 서열번호: 1-12 중 어느 하나의 대응하는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열내 대응하는 뉴클레오티드와 서로 동일하거나, 또는 대상 서열내 뉴클레오티드와 서열번호: 1-12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열내 대응하는 하나 이상의 뉴클레오티드와의 하나 이상의 차이가 하나의 뉴클레오티드 트리플릿이 되고, 이는 번역되었을 때, 서열번호: 1-12 중 어느 하나의 대응하는 아미노산 서열내 대응하는 아미노산의 보존적 치환 또는 퇴화 트리플릿으로 인해 동일한 아미노산을 결과하는 경우, 대상 서 열내 뉴클레오티드는 상동성으로 간주되는 것인, 폴리뉴클레오티드 분자.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편 또는 제18항에 따른 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 약학적 조성물.
제19항에 있어서,

하나 이상의 항염증제 또는 항암제 의약품을 추가적으로 포함하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제17항의 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편 또는 제18항에 따른 폴리뉴클레오티드 분자를 경우에 따라 하나 이상의 부가적 항염증제를 포함하는 포유류, 바람직하게는 인간의 염증성 질환 치료용 의약품의 제조에 사용하는 방법.
제21항에 있어서,

상기 염증성 질환이 류마티스성 관절염(RA), 천식, 다발성 경화증(MS), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 특발성 폐섬유화증(IPF), 염증성 장질환(IBD), 포도막염, 황반변성, 대장염, 건선, 왈더변성, 항인지질증후군(APS), 급성 관상 동맥 증후군, 레스티노시스(restinosis), 죽상동맥경화증, 재발성 다발 신경병증(RP), 급성 또는 만성 간염, 실패한 정형외과적 임플란트, 사구 체신염, 루프스, 자가 면역 질환, 급성 췌장염 및 강직척추염(AS)으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편 또는 제18항에 따른 폴리뉴클레오티드 분자를 경우에 따라 하나 이상의 부가적 항암제를 포함하는 포유류, 바람직하게는 인간의 종양성 질환 또는 지연된 세포 아폽토시스, 증강된 세포 생존 또는 증식을 수반하는 다른 상태의 치료용 의약품의 제조에 사용하는 방법.
제23항에 있어서,

상기 종양성 질환이 암인 방법.
제24항에 있어서,

상기 암이 백혈병, 다발골수종, 위암 또는 피부암인 방법.
제1항 내지 제17항의 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편 또는 제18항에 따른 폴리뉴클레오티드 분자를 포유류, 바람직하게는 인간 개체에 염증성 질환의 예방 및/또는 경감을 위하여 충분한 양과 시간으로 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 치료 방법.
제26항에 있어서,

상기 염증성 질환이 류마티스성 관절염(RA), 천식, 다발성 경화증(MS), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 특발성 폐섬유화증(IPF), 염증성 장질환(IBD), 포도막염, 황반변성, 대장염, 건선, 왈더변성, 항인지질증후군(APS), 급성 관상 동맥 증후군, 레스티노시스(restinosis), 죽상동맥경화증, 재발성 다발 신경병증(RP), 급성 또는 만성 간염, 실패한 정형외과적 임플란트, 사구체신염, 루프스, 자가 면역 질환, 급성 췌장염 및 강직척추염(AS)으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 인간화 모노클로날 항체 또는 그 단편 또는 제18항에 따른 폴리뉴클레오티드 분자를 포유류, 바람직하게는 인간 개체에 종양성 질환 또는 지연된 세포 아폽토시스, 증강된 세포 생존 또는 증식을 수반하는 다른 상태의 예방 및/또는 경감을 위하여 충분한 양과 시간으로 투여하는 단계를 포함하는 종양성 질환의 치료 방법.
제28항에 있어서,

상기 종양성 질환이 암인 방법.
제29항에 있어서,

상기 암이 백혈병, 다발골수종, 위암 또는 피부암인 방법.