TWI825025B

TWI825025B - 包含il-33拮抗劑的子宮內膜異位症治療劑

Info

Publication number: TWI825025B
Application number: TW107130594A
Authority: TW
Inventors: 善本知広; 約瑟夫Ｍ帕倫波; 維歐雷塔Ｉ史東; 加藤徹; 安田好文
Original assignee: 日商田邊三菱製藥股份有限公司; 學校法人兵庫醫科大學
Priority date: 2017-08-31
Filing date: 2018-08-31
Publication date: 2023-12-11
Also published as: IL272864B1; AU2018325645B2; TW202306586A; WO2019045075A1; JP2024045481A; JP7177446B2; AU2018325645A1; BR112020003458A2; MX2020002086A; US20220372130A1; CN111107875A; CA3074421A1; TW201919706A; KR20200044812A; RU2020108574A3; CN115920031A; JPWO2019045075A1; CN115920041A; ZA202001256B; EP3677281A4

Abstract

本發明提供子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療劑。

本發明係具體指定出IL-33為子宮內膜異位症或子宮腺肌症的惡化因子，並發現可抑制IL-33之作用的IL-33拮抗劑在子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療、預防、或減輕上有用。

Description

包含IL-33拮抗劑的子宮內膜異位症治療劑

本發明係關於以介白素-33(IL-33)拮抗劑作為有效成分的子宮內膜異位症治療劑。

子宮內膜異位症為在偏離子宮腔之部位(異位性地)子宮內膜組織增殖的良性(非癌性)疾病，所有生育年齡之女性中約有10%罹患子宮內膜異位症。不孕症女性中則約有25至50%罹患子宮內膜異位症。

子宮內膜異位症之發病原因有各種說法，不過子宮內膜細胞隨著月經血到達其他組織，子宮內膜組織異位性地產生及增殖被認為係原因之一。

子宮腺肌症為在子宮肌層見到類似子宮內膜之病變的疾病。其雖為與子宮內膜異位症具有組織學類似性的疾病，然而由於與子宮內膜異位症之產生機制或臨床現象不同，故而被當作另一種疾患來處理。40歲世代為發病年齡之高峰期，出現月經困難症、下腹部痛、腰痛、不孕、過多月經等。典型之臨床症狀有月經時之疼痛，亦有許多抱怨達到妨礙日常生活之強度的疼痛。子宮腺肌症患者有時亦合併發生子宮內膜異位症及子宮肌瘤。

子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療方法，有手術療法及藥物療法，然而此等之任一者均為對症療法，不存在根本之治療方法。在選擇手術療法之情況，為了保存懷孕能力，無法完全根治，為了防止再發，多併用術後之藥物療法。就藥物療法而言，可列舉低用量避孕劑、性腺刺激荷爾蒙釋出荷爾蒙(GnRH)促效劑(柳菩林(leuplin)等)、男性荷爾蒙類(達爾諾(danazol)等)及黃體荷爾蒙類(地諾孕素(dienogest)等)。然而，任一者均有因影響荷爾蒙平衡而導致的副作用。亦即，已知藉由將地諾孕素投與至妊娠大鼠，使得胚死亡率增加。因此，任一種藥劑均成為孕婦使用之禁忌。又，多種藥物由於伴隨擬閉經或擬妊娠之症狀，有不孕或潮熱(hot flash)、骨質疏鬆症等如更年期障礙般的副作用。因此，期待安全性高，對妊娠無影響之子宮內膜異位症或子宮腺肌症之預防劑、或治療劑的登場。

介白素-33(IL-33)為屬於介白素-1家族的細胞激素，該介白素-1家族被認為在炎症性狀態中擔任要角。IL-33在上皮細胞或血管內皮細胞之核內恆常地表現，在因感染或物理性‧化學性壓力造成組織傷害，而細胞破壞的同時被釋出，具有作為警報素(alarmin)之功能。又，IL-33的表現藉由脂多糖等之刺激而上升，亦有人認為此係其分泌之機轉。釋放至細胞外之IL-33，藉由與細胞上所表現之IL-33受體結合，可將細胞內信號活化。IL-33受體於各種免疫系細胞或上皮細胞等中表現，在此等細胞中，產生 IL-33誘導性之細胞內信號傳達。

研判IL-33於表現IL-33受體之免疫系細胞內，藉由誘導來自Th2細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、NK(自然殺手)T細胞或第2組天然淋巴球之Th2細胞激素(IL-4、IL-5、IL-6、IL-13等)的產生，而誘導過敏性炎症(氣喘、異位性皮膚炎、花粉症、過敏性休克等)(非專利文獻1：Tatsukuni Ohno et al.,Allergy,2012,Vol.67,p1203)。近年，為IL-33拮抗劑之抗IL-33抗體或抗IL-33受體抗體以氣喘、異位性皮膚炎、花生過敏作為適應症，並進行臨床試驗。

Mbarik氏等人報告：藉由解析子宮內膜異位症患者之血清或腹水可知，IL-33於子宮內膜異位症之腹水等中，會隨著病態(階段)之進行而同時增加，故可作為替代標記使用(非專利文獻2：Maroua Mbarik et al.,Immunolo.Lett.2015,Vol.166,p1)。若依照Mbarik氏等之報告，有作為IL-33之拮抗劑功能的可溶性IL-33受體(sST2)於腹水中之濃度為IL-33之約100倍的濃度，其與IL-33同樣地，隨著子宮內膜異位症之進行而同時增加。因此，子宮內膜異位症中表現增加之IL-33為疾病之原因或為結果，以及如何對病態發揮功能，依然不明。

據報導IL-33拮抗劑被用於局部纖維症之治療(專利文獻1：國際公開第2016/140921號)。專利文獻1雖述及子宮內膜異位症為局部纖維症之一例，然而在其實施例中，並未調查子宮內膜異位症之治療效果。專利文獻1只不過將子宮內膜異位症列舉作為纖維症之一態樣，並未發現在子宮內膜異位症等中IL-33之角色。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第2016/140921號

[專利文獻2]國際公開第2014/164959號

[專利文獻3]國際公開第2015/099175號

[非專利文獻]

[非專利文獻1]Tatsukuni Ohno et al., Allergy, 2012, Vol. 67, p1203

[非專利文獻2]Maroua Mbarik et al., Immunolo. Lett. 2015, Vol. 166, p1

尋求用於治療子宮內膜異位症或子宮腺肌症之安全性高，不影響妊娠的藥劑。

本發明人等為解決上述問題，專心檢討之結果，具體指定出IL-33為子宮內膜異位症或子宮腺肌症之惡化因子。又，本發明人等發現可阻礙IL-33之作用的IL-33拮抗劑，對子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療、預防、或減輕有用，於是完成本發明。

因此，本發明係關於以下之項目：

[1]一種子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療劑，其係以IL-33拮抗劑作為有效成分。

[2]如項目1記載之治療劑，其緩和子宮內膜異位症或子宮腺肌症之疼痛。

[3]如項目1或2記載之治療劑，其抑制子宮內膜異位症或子宮腺肌症的異位性子宮內膜組織(包含囊胞)之成長。

[4]如項目1至3中任一項記載之治療劑，其抑制子宮內膜異位症或子宮腺肌症之異位性子宮內膜組織(包含囊胞)的血管新生。

[5]如項目1至4中任一項記載之子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療劑，其抑制異位性子宮內膜組織(包含囊胞)的纖維化或增殖。

[6]如項目1至5記載之治療劑，其抑制子宮內膜異位症的異位性子宮內膜組織(包含囊胞)與各種臟器之黏連。

[7]如項目1至6中任一項記載之子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療劑，其中IL-33拮抗劑為抗IL-33抗體、抗IL-33受體抗體或可溶性IL-33受體。

[8]如項目7記載之子宮內膜異位症或子宮腺肌症治療劑，其中抗IL-33抗體為A10-1C04、A23-1A05、A25-2C02、A25-3H04、或A26-1F02。

[9]如項目7記載之子宮內膜異位症或子宮腺肌症治療劑，其中可溶性IL-33受體為sST2-Fc。

[10]一種子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療方法，其包含投與IL-33拮抗劑。

[11]一種IL-33拮抗劑之使用，其係用於製造子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療劑。

[12]一種IL-33拮抗劑，其係用於子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療。

[13]如項目10至12中任一項記載之治療方法、使用、或IL-33拮抗劑，其緩和子宮內膜異位症或子宮腺肌症之疼痛。

[14]如項目10至12中任一項記載之治療方法、使用、或IL-33拮抗劑，其抑制子宮內膜異位症或子宮腺肌症中的異位性子宮內膜組織(包含囊胞)之成長。

[15]如項目10至12中任一項記載之治療方法、使用、或IL-33拮抗劑，其抑制子宮內膜異位症或子宮腺肌症的異位性子宮內膜組織(包含囊胞)之血管新生。

[16]如項目10至12中任一項記載之治療方法、使用、或IL-33拮抗劑，其抑制異位性子宮內膜組織(包含囊胞)之纖維化或增殖。

[17]如項目10至16中任一項記載之治療方法、使用、或IL-33拮抗劑，其中IL-33拮抗劑為抗IL-33抗體、抗IL-33受體抗體或可溶性IL-33受體。

本發明之子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療劑，具有子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療效果。又，本發明之子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療劑，可發揮選自下列作用所構成之群組中的至少1種作用：伴隨子宮內膜異位症或子宮腺肌症之疼痛的緩和、異位性子宮內膜組織(包含囊胞)之成長的抑制、異位性子宮內膜組織(包含囊胞)之血管新生的抑制、及異位性子宮內膜組織(包含囊胞)之纖維化或增殖的抑制。

第1圖為展示在子宮內膜異位症模型中，IL-33基因剔除小鼠(IL-33KO)，與野生型之對照小鼠(control)相較，為異位性子宮內膜組織之囊胞病變的成長受到抑制的圖。

第2圖為展示在子宮內膜異位症模型中，IL-33投與小鼠(IL-33 ip)，與對照小鼠(control)相較，促進為異位性子宮內膜組織之囊胞病變之成長的圖。

第3圖為展示在子宮內膜異位症模型中，IL-33拮抗劑投與小鼠(sST2-Fc)，與對照小鼠(cont Fc)相較，為異位性子宮內膜組織之囊胞病變之成長受到抑制的圖。

第4圖為展示在子宮內膜異位症模型中，IL-33拮抗劑投與小鼠(sST2-Fc)，與對照小鼠(cont Fc)相較，為異位性子宮內膜組織之囊胞病變之纖維化受到抑制的偶氮卡紅(Azan)染色圖。

第5圖為展示在IL-33投與子宮內膜異位症模型中，藉由抗IL-33抗體(Anti-IL-33投與)，與對照抗體(Control Ab)相較，囊胞病變之成長受到抑制的圖。

第6圖為展示在IL-33投與子宮內膜異位症模型中，藉由抗IL-33抗體(Anti-IL-33 Ab)投與，與對照抗體(Control Ab)相較，囊胞病變之細胞增殖(Ki-67陽性細胞之比率)受到抑制的圖。

為使本發明之理解變得容易，以下將本發明所用之術語加以說明。

[IL-33]

IL-33為屬於IL-1家族之細胞激素，人類IL-33如序列表之序列編號1所示，係由270個胺基酸所構成，將其mRNA之序列示於序列編號2。IL-33在N末端側具有染色質(chromatin)結合結構域，在C末端側具有保持12個β股且分子量為18kDa的類IL-1細胞激素結構域，再者，在95位及109位具有組織蛋白酶G切斷部位，在99位具有彈性蛋白酶切斷部位及178位具有胱天蛋白酶(caspase)切斷部位。研判IL-33在細胞發生壞死(necrosis)之過程中，被來自溶酶體(lysosome)等之彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、或蛋白酶3等酵素切斷，形成成熟型IL-33，例如包含IL-33(殘基95至殘基270)(將以序列表之序列編號1之從N末端95位至270位之胺基酸序列所表示的IL-33標示為「IL-33(殘基95至殘基270)」；以下以同樣方式標示)、IL-33(殘基99至270)、IL-33(殘基109至殘基270)、IL-33(殘基112至殘基270位)等各種斷片，此等具有作為細胞激素之功能。另一方面，在細胞死亡為細胞凋亡 (apoptosis)之情況，研判於細胞凋亡之過程中，藉由活化之胱天蛋白酶，將IL-33於178位切斷，形成不活性型IL-33，例如IL-33(殘基179至殘基270)。

IL-33若作為細胞激素被釋放至細胞外，與IL-33受體結合，在表現該IL-33受體之細胞中，具有「開始細胞內信號傳達」之功能。藉由IL-33誘導之信號傳達，非限定地，有NF-κB途徑及MAPKKs途徑，最後引起各種細胞激素、趨化因子、炎症性介質之產生。就被IL-33誘導的細胞激素之例子而言，可列舉TNF-α、IL-Iβ、IFN-γ、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13等。就被IL-33誘導的趨化因子之例子而言，可列舉CXCL2、CCL2、CCL3、CCL6、CCL17、CCL24等。就被IL-33誘導的炎症性介質之例子而言，可列舉PGD2、LTB4等。被IL-33誘導之細胞激素、趨化因子、炎症性介質，參與免疫系細胞之遊走、細胞激素之產生、去顆粒(degranulation)而引起炎症。在本發明中，IL-33若為與後述之IL-33受體結合而作用者，可意指全長IL-33或其活性型斷片之任一種，亦可為彼等之衍生物或變異體。又，本發明之IL-33可為人類IL-33，亦可為來自其他生物之IL-33。本發明之IL-33中，以序列表之序列編號1之胺基酸序列所表示的人類IL-33為較佳。

IL-33所結合之IL-33受體，由ST2與IL-1RAcP(IL-1受體輔助蛋白質)之異二聚體構成。在IL-33受體中，特異地識別IL-33而與其結合之部位存在於ST2之細胞外區域。IL-33之受體，在各種免疫系細胞(Th2 細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、巨噬細胞、樹狀細胞、NK細胞、NKT細胞、第2組天然淋巴球(天然輔助細胞)、諾金細胞(nuocyte)、Ih2(先天輔助型2)細胞等)或上皮細胞等中表現，不過不限定於此等細胞。

[IL-33拮抗劑]

本案中「拮抗劑」意指對目的之標的或其配體或者其受體或此等之基因(包含mRNA)直接地作用，而具有其功能之中和作用的物質的總稱。因此，拮抗劑除包含單純具有直接中和標的之功能之作用的物質外，亦包含藉由與標的蛋白質相互作用之物質之功能中和，或抑制標的蛋白質之基因表現，而具有間接中和標的之功能之作用的物質。亦即，「IL-33拮抗劑」可為能與IL-33結合，阻礙IL-33之任一種功能的物質，亦可為能與IL-33受體結合，阻礙IL-33之功能的物質。再者，抑制IL-33或IL-33受體之基因表現的反義(antisense)及siRNA亦包含於IL-33拮抗劑中。就IL-33拮抗劑而言，可列舉例如抗IL-33抗體、抗IL-33受體抗體、可溶性IL-33受體、及對IL-33或IL-33受體之適體(aptamer)等，不過無意限定於此等。抗IL-33抗體及抗IL-33受體抗體、以及與IL-33及IL-33受體結合之適體，藉由與分別為標的分子之IL-33及IL-33受體結合，可妨礙IL-33與IL-33受體之間的會合。另一方面，可溶性IL-33受體藉由與游離之IL-33結合，可妨礙IL-33與細胞表面上之IL-33受體的會合。

[IL-33受體]

編碼IL-33之受體之次單元的ST2基因，雖然編碼膜貫通型(ST2L)蛋白質，但藉由選擇性剪接，亦編碼欠缺膜貫通區域及細胞內區域之分泌型蛋白質。人類ST2L之全長胺基酸序列，以序列表之序列編號3表示。其中，在經由ST2L與其他IL-33受體次單元，例如IL-1RAcP會合而形成之IL-33受體(異二聚體)，藉由IL-33之結合，使細胞內信號傳達系統活化。IL-33與ST2L之細胞外區域結合。因此，亦將ST2L單獨地稱為IL-33受體。

[可溶性IL-33受體]

本發明中可溶性IL-33受體，只要為包含ST2L蛋白質之細胞外區域(序列表之序列編號3之殘基19至殘基328)之一部分或全部的蛋白質，且藉由與IL-33結合，形成具有作為IL-33拮抗劑之功能者即可。可溶性IL-33受體可經任何修飾，例如可為結合有聚乙二醇或抗體之恆定區域者。尤其，將結合有免疫球蛋白之恆定區域的可溶性IL-33受體稱為sST2-Fc。就較佳之sST2-Fc而言，可列舉人類ST2L蛋白質之細胞外區域與人類IgG抗體之恆定區域的融合蛋白質，即以序列表之序列編號5表示的融合蛋白質。

[抗體]

本發明中所謂「抗體」之術語，係以最廣的意義來使用，只要顯示期望之特異結合性，可包含單株抗體、多株抗體。在本發明中之抗體，可為小鼠抗體、人類抗體、大鼠抗體、兔抗體、山羊抗體、駱駝抗體等來自任何動物的抗體。

[單株抗體]

本發明之抗體中之單株抗體，意指在設計上之胺基酸序列中，只由單一純系(單種分子)構成的抗體集團之抗體。單株抗體包含嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、多特異性抗體、及人造抗體、以及彼等之功能改變抗體、以及彼等之複合抗體(conjugated antibody)、以及彼等之片段。本發明之單株抗體可使用融合瘤法、噬菌體展示法、及基因工程法等任何周知之手法生成。

[嵌合抗體]

嵌合抗體意指輕鏈、重鏈、或其兩者係由來自非人類之免疫球蛋白之可變區域，及來自人類之免疫球蛋白之恆定區域所構成的抗體。

[人源化抗體]

人源化抗體意指由包含來自非人類免疫球蛋白之互補性決定區域及來自人類免疫球蛋白之框架區域的可變區域，以及來自人類免疫球蛋白之恆定區域所構成的抗體。

[人類抗體]

人類抗體意指輕鏈、重鏈同為來自人類免疫球蛋白之抗體。人類抗體藉由重鏈之恆定區域的不同，包含：具有γ鏈之重鏈的IgG(包含IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)、具有μ鏈之重鏈的IgM、具有α鏈之重鏈的IgA(包含IgA1、IgA2)、具有δ鏈之重鏈的IgD、或具有ε鏈之重鏈的IgE。又，原則上，輕鏈包含κ鏈及λ鏈之任一者。

[多特異性抗體]

多特異性抗體意指具有2種以上相異之抗原特異性，持有2個以上獨立抗原識別部位之能成為非對稱的抗體，可列舉具有2種抗原特異性之雙特異性抗體、具有3種抗原特異性之三特異性抗體等。本發明之多特異性抗體能識別之1種以上抗原為IL-33分子或IL-33受體分子。

[人造抗體]

人造抗體意指，例如，為蛋白質支架，雖不具有免疫球蛋白之構造，但具有與免疫球蛋白同樣之功能的人造抗體。就蛋白質支架而言，只要利用人類之絲胺酸蛋白酶阻礙劑之Kunitz結構域或人類之纖維連接蛋白之細胞外結構域、錨蛋白、脂質運載蛋白等，改變支架上之標的結合部位的序列，即可生成與本發明之表位結合的蛋白質支架(Clifford Mintz et.al BioProcess International,2013,Vol.11(2),pp40-48)。

[功能改變抗體]

本案中，功能改變抗體意指藉由改變免疫球蛋白之主要恆定區域之胺基酸或糖鏈，而調節抗體所具有之抗原結合功能以外之細胞殺傷功能、補體活化功能或血中半衰期等的抗體。

[複合抗體]

本案中，複合抗體意指以化學方式或基因工程方式使聚乙二醇(PEG)等非胜肽性聚合物、放射性物質、毒素、低分子化合物、細胞激素、白蛋白、酵素等抗體以外之功能分子結合於抗體而成的抗體。

[片段]

在本案中，抗體之片段意指包含抗體之一部分的蛋白質，且可與抗原結合者。就抗體之片段之例子而言，可列舉Fab片段、Fv片段、F(ab’)₂片段、Fab’片段、或scFv。

再者，此等抗體之片段，亦可與聚乙二醇(PEG)等非胜肽性聚合物、放射性物質、毒素、低分子化合物、細胞激素、白蛋白、酵素等抗體以外之功能分子，以化學方式或基因工程方式結合。

[人類單株抗體]

人類單株抗體，意指具有來自人類生殖系列之免疫球蛋白之序列之可變區域及恆定區域的單株抗體。亦包含來自經導入人類抗體基因之基因轉殖(transgenic)小鼠的單株抗體，或來自人類抗體基因庫之抗體。

[中和]

在本案中，「中和」意指可阻礙其標的之任一種功能的作用。就IL-33之功能(生物學上活性)之阻礙而言，包含IL-6等IL-33誘導性細胞激素之產生的阻礙，然而不以此為限。IL-33之生物學上活性之指標，可藉由在該領域已知之數種試管內(in vitro)或活體內(in vivo)分析之1種或以上來評價。

[互補性決定區域]

互補性決定區域意指在免疫球蛋白分子之可變區域中形成抗原結合部位的區域，亦稱為超可變區域，意指免疫球蛋白分子之胺基酸序列的變化特別大的部分。在互補性決定區域中，輕鏈、重鏈分別具有3個互補性決定區域(互補性決定區域1、互補性決定區域2及互補性決定區域3)。在本案中，免疫球蛋白分子之互補性決定區域係依據卡巴特(Kabat)之編號系統(Kabat氏等，1987,Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Department of Health and Human Services,NIH,USA)來決定。

[適體(aptarmer)]

適體意指與特定之物質特異地結合的核酸分子，在本案中，適體意指結合於IL-33或IL-33受體，發揮拮抗劑功能的分子。本案中之適體，除天然之核酸分子以外，亦可包含人造之核酸分子。

[反義]

反義意指可與標的基因RNA雜交之反義核酸(RNA或者DNA)，為具有抑制基因功能表現之功能者。在本案中，反義意指可與IL-33或IL-33受體之mRNA結合並抑制基因表現，而發揮拮抗劑功能的分子。本案中之反義，除天然之核酸分子以外，亦可包含人造之核酸分子。

[siRNA]

siRNA(small interfering RNA)意指由15至30鹼基對構成之低分子雙股RNA。siRNA參與被稱為RNA干擾之現象，藉由標的基因之mRNA之破壞，序列特異地抑制基因之表現。本案中，siRNA意指破壞IL-33或IL-33受體之mRNA，抑制基因之表現，具有作為拮抗劑之功能的分子。本案中，siRNA除天然之核酸分子以外，亦包含人工之核酸分子。

[子宮內膜異位症]

子宮內膜異位症為在偏離子宮腔之部位(異位性)，有子宮內膜組織增殖之良性(非癌性)疾病，就偏離之部位而言，如卵巢、腹腔、腹膜、道格拉斯陷凹、S狀結腸、直腸、骶骨子宮韌帶、陰道、外陰部、膀胱、腹壁、肚臍等。異位性之子宮內膜組織發生與各種臟器之黏連。卵巢中形成之子宮內膜組織之血腫，被稱為巧克力囊胞。就子宮內膜異位症之確定診斷而言，有腹腔鏡檢，可直接觀察異位性子宮內膜組織。就子宮內膜異位症之臨床進行期分類而言，有Re-ASRM分類法，其係依據病灶部位、表在性或深在性、或與各種臟器之黏連程度來計分，分為第1期至第4期。就子宮內膜異位症之經過觀察而言，有Beecham分類法，其係依據病態之進行而分為第1期至第4期。

[子宮腺肌症]

子宮腺肌症為子宮內膜組織出現於子宮之肌層內的疾病，藉由MRI之診斷，分類為限定於子宮之一部分的部分性子宮腺肌症、散佈子宮全體之全面性子宮腺肌症。

以下，說明本發明之實施態樣。再者，以下之實施之態樣，係用於說明本發明之例示，本發明並不僅只限定於該實施之態樣。

本發明係關於以IL-33拮抗劑作為有效成分的子宮內膜異位症或子宮腺肌症的治療劑。治療劑可藉由投與至罹患子宮內膜異位症或子宮腺肌症之患者，而根治、減輕症狀、或預防惡化。就IL-33拮抗劑而言，可列舉抗IL-33抗體、抗IL-33受體抗體、IL-33受體結合適體或可溶性IL-33受體。

在其他態樣方面，本發明係關於含有IL-33拮抗劑的子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療用、預防用、或減輕用之醫藥組成物。又，在進一步其他態樣方面，本發明係關於子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療、預防或減輕方法，其包含投與IL-33拮抗劑。又，關於本發明之IL-33拮抗劑之使用，其係用於製造子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療、預防或減輕用醫藥。又，亦關於IL-33拮抗劑，其係用於子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療、預防或減輕。

子宮內膜異位症為子宮內膜組織在子宮內膜以外之場所繁殖的疾病。將子宮之肌層內有子宮內膜組織存在者稱為子宮腺肌症。此等異位性之子宮內膜組織，與子宮之內膜同樣地，隨同月經週期，重複發育及出血，然而由於沒有如經血之出口，有時亦會形成血腫。將此種方式形成之血腫稱為巧克力囊胞。囊胞形成之結果，組織纖維化而形成黏連或硬塊。異位性之子宮內膜組織若與各種臟器(腹膜、腸、卵巢等)黏連，將成為疼痛之原因。又，若與卵管黏連，將成為不孕之原因。對於子宮內膜異位症，通常進行荷爾蒙療法，或藉由外科手術進行切除。藉由子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療、減輕、預防，可發揮選自下列作用所構成之群組中的至少1種作用：伴隨子宮內膜異位症或子宮腺肌症之疼痛的緩和、異位性之子宮內膜組織(包含囊胞)之成長的抑制、異位性之子宮內膜組織(包含囊胞)之血管新生的抑制、異位性之子宮內膜組織(包含囊胞)與各種臟器之黏連的抑制及異位性之子宮內膜組織(包含囊胞)之纖維化或細胞增殖的抑制。

罹患子宮內膜異位症及子宮腺肌症之患者，伴隨月經週期之變動，具有經血量增加、月經痛增強等症狀。因此，對於具有伴隨月經週期之變動而症狀變化的對象，或抱怨伴隨月經週期之變動而愁苦的對象，投與包含IL-33拮抗劑之治療劑或者治療、預防、或減輕用醫藥組成物。此種對象，可與單純具有局部纖維症之對象區別。

在本發明之其他態樣中，本發明亦關於含有IL-33拮抗劑作為有效成分之伴隨子宮內膜異位症或子宮腺肌症之疼痛的緩和劑、含有IL-33拮抗劑作為有效成分之子宮內膜異位症中之異位性子宮內膜組織(包含囊胞)與各種臟器黏連的抑制劑、含有IL-33拮抗劑作為有效成分的子宮內膜異位症或子宮腺肌症中之異位性子宮內膜組織(包含囊胞)之成長的抑制劑、含有IL-33拮抗劑作為有效成分的子宮內膜異位症或子宮腺肌症之異位性子宮內膜組織(包含囊胞)的血管新生抑制劑、含有IL-33拮抗劑作為有效成分的子宮內膜異位症或子宮腺肌症之異位性子宮內膜組織(包含囊胞)的子宮內膜基質細胞之纖維化抑制劑、含有IL-33拮抗劑作為有效成分的子宮內膜異位症或子宮腺肌症之異位性子宮內膜組織(包含囊胞)的細胞增殖抑制劑、含有IL-33拮抗劑作為有效成分的表在性子宮內膜異位症治療劑、含有IL-33拮抗劑作為有效成分的深在性子宮內膜異位症治療劑、含有IL-33拮抗劑作為有效成分的部分性子宮腺肌症治療劑、或含有IL-33拮抗劑作為有效成分的全面性子宮腺肌症治療劑。

本發明之IL-33拮抗劑，以緩和子宮內膜異位症或子宮腺肌症患者月經時間之腰痛、下腹部痛或排便痛或者月經以外時間之腰痛、下腹部痛或排便痛為較佳，以消除該疼痛為更佳。

本發明之IL-33拮抗劑，以緩和子宮內膜異位症患者之骨盆、卵巢、腹腔、腹膜、道格拉斯陷凹、S狀結腸、直腸、骶骨子宮韌帶、陰道、外陰部、膀胱、腹壁及/或肚臍的疼痛為較佳，以消除該疼痛為更佳。

本發明之IL-33拮抗劑之緩和疼痛，可藉由例如Biberoglu及Behrman量規(Biberoglu KO,Behrman SJ,Am J Obstet Gynecol.,139：645(1981))來評價，該量規將伴隨疼痛之生活品質(QOL)予以計分。該量規係以月經以外時間之骨盆痛、月經困難性疼痛、及性交痛等作為自覺症狀來進行評價。

本發明之IL-33拮抗劑之緩和疼痛，可藉由鎮痛劑之服用次數或量減少來進行評價。就鎮痛劑而言，以非類固醇系之消炎鎮痛劑為較佳，例如可列舉洛索洛芬鈉(loxoprofen sodium)水合物、待克菲那鈉(diclofenac sodium)、阿斯匹靈。

本發明之IL-33拮抗劑，以抑制子宮內膜異位症患者之骨盆、卵巢、腹腔、腹膜、道格拉斯陷凹、S狀結腸、直腸、骶骨子宮韌帶、陰道、外陰部、膀胱、腹壁及/或肚臍中的異位性子宮內膜組織(包含囊胞)之黏連為較佳，以消除該黏連為更佳。本發明之IL-33拮抗劑以抑制子宮之黏連，緩和子宮可動性之限制為較佳。

本發明之IL-33拮抗劑，以抑制子宮內膜異位症患者之骨盆、卵巢、腹腔、腹膜、道格拉斯陷凹、S狀結腸、直腸、骶骨子宮韌帶、陰道、外陰部、膀胱、腹壁及/或肚臍中的異位性子宮內膜組織(包含囊胞)之成長為較佳，以使該異位性子宮內膜組織(包含囊胞)縮小為更佳。

本發明之IL-33拮抗劑，以抑制子宮內膜異位症患者之骨盆、卵巢、腹腔、腹膜、道格拉斯陷凹、S狀結腸、直腸、骶骨子宮韌帶、陰道、外陰部、膀胱、腹壁及/或肚臍中的異位性子宮內膜組織(包含囊胞)之血管新生為較佳。

本發明之IL-33拮抗劑，以抑制子宮內膜異位症患者之骨盆、卵巢、腹腔、腹膜、道格拉斯陷凹、S狀結腸、直腸、骶骨子宮韌帶、陰道、外陰部、膀胱、腹壁及/或肚臍中的異位性子宮內膜組織(包含囊胞)之纖維化或細胞增殖為較佳。

本發明之IL-33拮抗劑，以抑制子宮內膜異位症患者之骨盆、卵巢、腹腔、腹膜、道格拉斯陷凹、S 狀結腸、直腸、骶骨子宮韌帶、陰道、外陰部、膀胱、腹壁及/或肚臍中的異位性子宮內膜組織(包含囊胞)之細胞激素及/或介質的產生為較佳，以抑制IL-6、TNF-α、IL-8及/或前列腺素之產生為更佳。

本發明之IL-33拮抗劑，以藉由依照Beecham分類之診察，治療第1期、第2期、第3期及/或第4期之子宮內膜異位症的患者為較佳，以藉由依照Re-ASRM分類之分數的評價，治療第1期、第2期、第3期及/或第4期之子宮內膜異位症之患者為較佳。

本發明之IL-33拮抗劑，以能改善伴隨子宮內膜異位症之QOL為較佳。QOL之改善，例如，可藉由Endometriosis Health Profile-30(EHP-30)(Jones G等，Obstet Gynecol；98：258(2001))、EQ-5D(Brooks,R等，Health Policy,37：53(1997))或Endometriosis Treatment Satisfaction Questionnaire(ETSQ)(Deal LS等，Qual Life Res.；19(6)：899(20101))之問診來評價。就QOL之改善而言，可列舉例如改善直立困難、就坐困難、步行困難、食慾、睡眠困難、沮喪、憂鬱、脆弱流淚、悲哀感、躁鬱、壞脾氣、暴力、孤獨感、自信喪失、性交困難。

使用IL-33拮抗劑的子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療劑，與一般使用的荷爾蒙調節劑之藥物療法不同，可緩和不孕或更年期障害般之副作用。因此，本發明之IL-33拮抗劑，以維持可妊娠之狀態，且無妊娠時之胎兒毒性的子宮內膜異位症或子宮腺肌症治療劑為較佳，以係未伴隨更年期障害般之副作用的子宮內膜異位症或子宮腺肌症治療劑為較佳。就更年期障害般之副作用而言，可列舉例如不孕、潮熱、骨質疏鬆症、抑鬱狀態等，然而不以此等為限。

抗IL-33抗體及抗IL-33受體抗體方面，包含單株抗體、多株抗體。本發明中之抗體，可為小鼠抗體、人類抗體、大鼠抗體、兔抗體、山羊抗體、駱駝抗體等來自任何動物之抗體。本發明之抗IL-33抗體及抗IL-33受體抗體以係單株抗體為較佳，本發明之抗IL-33抗體及抗IL-33受體抗體以屬嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體的單株抗體為更佳。

本發明之抗IL-33抗體、抗IL-33受體抗體，可藉由本技術領域中已知之任何方法取得。在關於單株抗體之情況，可使用融合瘤法、噬菌體展示法、及基因工程手法等中的任何手法取得。

融合瘤法方面，可使從用免疫原免疫之動物(尤其是大鼠或小鼠)之脾臟或淋巴節採取的B細胞，與永生化細胞，例如骨髓瘤細胞融合，製成融合瘤，篩選生成具有期望結合性之抗體的融合瘤，使用被篩選出之融合瘤來生成。又，藉由使用導入人類抗體基因的小鼠，可取得人類抗體。在從融合瘤取得單株抗體方面，可採用將該融合瘤依照通常之方法培養，得到其培養上清液的方法，或將融合瘤投與至與其有適合性之哺乳動物，使其增殖，得到其腹水的方法等。前者之方法，適合得到高純度之抗體，另一方面，後者之方法適合抗體之大量生產。製作單株抗體之技術，只要使用周知之技術即可，例如可依照Current Protocols in Immunology,Wiley and Sons Inc.之Chapter 2的記載生成。

噬菌體展示法方面，將任何從噬菌體抗體庫選出之噬菌體，使用目的之抗原(本案中為IL-33或IL-33受體)進行篩選，選擇對抗原具有期望之結合性的噬菌體。繼而，將噬菌體內所含之抗體對應序列單離或決定序列，基於單離之序列或決定之序列資訊，構築包含編碼單株抗體之核酸分子的表現載體。接著藉由培養轉染有該表現載體之細胞株，使單株抗體產生。就噬菌體抗體庫而言，藉由使用人類抗體庫，可生成具有期望之結合性的人類抗體。

在基因工程手法方面，在編碼抗體之基因序列中，於對應於互補性決定區域(CDR)之序列或其他序列導入變異，將該序列組入表現載體，並使其於宿主細胞中轉形，可製作與抗原之親和性提高，及/或改變功能的抗體(例如，參照Borrebaeck C.A.K.and Larrick J.W.THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES,Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD,1990)。

在本發明中，為了使對人類之異種抗原性降低，或附加其他功能等目的，例如亦可使用嵌合抗體、人源化抗體、多特異性抗體、人造抗體，此等抗體可使用基因工程手法等已知之方法而製造。

嵌合抗體可藉由、編碼非人類免疫球蛋白之可變區域的DNA與編碼人類免疫球蛋白之恆定區域的DNA連結，將其組入表現載體，再導入宿主使其產生而得到(參照EP125023、國際公開第92/19759號)。使用此已知之方法，可得到對本發明有用之嵌合抗體。

人源化抗體，可藉由將編碼來自非人類免疫球蛋白之互補性決定區域(CDR)的DNA與編碼來自人類免疫球蛋白之CDR以外區域的DNA連結，將其組入表現載體，再導入宿主，使其生產而得到。

人類抗體，可使用例如以下所提供之實施例記載的順序而調製。又，人類抗體亦可使用三瘤(trioma)技術、人類B-細胞融合瘤技術(Kozbor等，1983 Immunol Today 4：p72)及用於生成人類單株抗體之EBV融合瘤技術(Cole等，1985,MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,p.77)等而調製。再者，藉由以抗原蛋白質(本案中為IL-33或IL-33受體)使導入人類抗體基因之基因轉殖小鼠免疫，製作融合瘤，亦可生成人類抗體。就基因轉殖小鼠而言，可列舉HuMab(註冊商標)小鼠(Medarex)、KMTM小鼠(Kirin Pharma)、KM(FCγRIIb-KO)小鼠、VelocImmune小鼠(Regeneron)等。

多特異性抗體，可利用2種以上之單株抗體的抗原結合區域，藉由基因工程手法而製作。該基因工程之手法，在此領域中已經確立。例如，若利用將2種單株抗體之抗原結合區域以串聯方式連結之DVD-Ig(Wu等，Nature Biotechnology 25(11),1290(2007))技術，或藉由改變免疫球蛋白之恆定區域，將結合於不同抗原之2種抗體的重鏈加以組合的ART-Ig技術(Kitazawa等，Nature Medicine 18(10),1570(2012))，可取得期望之雙特異性抗體。

就人造抗體而言，可利用例如人類纖維連接蛋白第III型結構域之第10號單元(FNfn10)，藉由對該單元之BC、DE、及/或FG環(loop)進行變異，可取得與期望之標的結合的人造抗體。就人造抗體而言，除纖維連接蛋白之細胞外結構域以外，可利用絲胺酸蛋白酶阻礙劑之Kunitz結構域或錨蛋白、脂質運載蛋白等胜肽。此等人造抗體可藉由將包含編碼該胜肽之核酸分子的載體導入大腸菌或酵母或動物細胞等，從培養該宿主細胞之培養上清液精製，以基因工程方式製造(專利文獻4、Clifford Mintz et.al BioProcess International,2013,Vol.11(2),pp40-48)。

就人造抗體而言，亦可不利用如上述之特定蛋白質、或其一部分胺基酸序列，而從將胺基酸隨機組合所得之隨機序列庫，探索可如抗體般與本發明之表位特異地結合的低分子量胜肽分子(例如，Hipolito et al.,Current Opinion in Chemical Biology,2012 Vol 16：196,Yamagishi et al.,Chemistry & Biology,2011 Vol 18：1562)。此種胜肽，除可藉由基因工程之方法製造以外，亦可藉由茀基甲氧基羰基法、第三丁氧基羰基法等化學合成法製造。

使用於本發明之單株抗體，亦可為例如與聚乙二醇(PEG)等非胜肽性聚合物、放射性物質、毒素等各種分子結合的複合抗體。此種複合抗體可藉由對所得到之抗體施行化學修飾而得到。再者，化學修飾方法在此領域中已經確立。本發明中之單株抗體，亦包含此等複合抗體(D.J.King.,Applications and Engineering of Monoclonal antibodies.,1998 T.J.International Ltd,Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer.,1998 Marcel Dekker Inc；Chari et al.,Cancer Res.,1992 Vol 152：127；Liu et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,1996 Vol 93：8681)。

本發明中，如上述之全抗體外，只要具有抗原結合性，且能發揮拮抗劑活性，亦可為單株抗體之片段或其修飾物。例如，就抗體之片段而言，可列舉Fab片段、Fv片段、F(ab’)₂片段、Fab’片段、或將H鏈與L鏈之Fv藉由適當連接子連結而成的單鏈Fv(scFv)。再者，此等抗體之片段，亦可與聚乙二醇(PEG)等非胜肽性聚合物、放射性物質、毒素、低分子化合物、細胞激素、白蛋白、酵素等抗體以外之功能分子以化學方式或基因工程方式結合。

用於製造株抗體之產生系統，為本技術領域所周知，可根據目的製劑之品質適宜選擇。就一例而言，可利用試管內(in vitro)或活體內(in vivo)之產生系統之任一種。就試管內之產生系統而言，可列舉使用真核細胞，例如動物細胞、植物細胞、或真菌細胞之生產系，或使用原核細胞，例如大腸菌、枯草菌等細菌細胞的產生系統。就所使用細胞而言，可使用哺乳動物細胞，例如所謂之CHO、COS、骨髓瘤、BHK、HeLa、Vero之一般使用的細胞、昆蟲細胞、植物細胞等。就活體內之產生系統而言，可列舉使用動物之產生系統或使用植物之產生系統。在使用動物之情況，例如使用哺乳類動物、昆蟲之產生系統等。就哺乳類動物而言，例如可使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser,SPECTRUM Biotechnology Applications,1993)。又，就昆蟲而言，例如可使用蠶。在使用植物之情況，例如可使用煙草。

如上述之試管內或活體內之產生系統中，產生單株抗體之情況，可將編碼免疫球蛋白之重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA分別組入表現載體，同時使宿主轉形，或者亦可藉由將編碼H鏈及L鏈之DNA組入單一之表現載體，使宿主轉形(參照國際公開第94/11523號)。

所得到之單株抗體，可精製至變得均勻為止。單株抗體之分離、精製，只要使用通常之蛋白質所使用的分離、精製方法即可。例如只要適宜選擇親和性層析等層析管柱、過濾器、超過濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳等並加以組合，可將單株抗體分離、精製(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)，然而不以此等為限。就親和性層析所用之管柱而言，可列舉蛋白質A管柱、蛋白質G管柱。例如，就使用蛋白質A 管柱之管柱而言，可列舉Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Amersham Biosciences)等。

為本發明之適體、反義或siRNA之核酸分子，係以單體核酸分子作為材料，可藉由例如亞磷醯胺法來合成。就亞磷醯胺法而言，可依照例如以國際公開第2014/046212號記載之方法為基準的方法進行。本發明之適體以與人類IL-33蛋白質(序列表之序列編號1)、或人類IL-33受體蛋白質(序列表之序列編號3)結合為較佳，反義或siRNA以與人類IL-33mRNA(序列表之序列編號2)或人類IL-33受體mRNA(序列表之序列編號4)結合為較佳。為本發明之適體、反義或siRNA的核酸分子亦可包含人工核酸，就人工核酸而言，為硫代磷酸酯(Phosphorothioate：S-PO₃)型寡核苷酸(S-Oligo)、2’,4’-橋聯核酸(bridged nucleic acid)(BNA)/2’,4’-鎖核酸(locked nucleic acid)(LNA)(國際公開第98/39352號、國際公開第2005/021570號、國際公開第2003/068795號、國際公開第2011/052436號)等。

就本發明之較佳IL-33拮抗劑態樣而言，例如，只要能與人類IL-33受體結合，可將IL-33之作用中和的適體即可，例如可列舉RBM-009。

包含本發明之IL-33拮抗劑的治療劑或醫藥組成物，除為有效成分之關於人類IL-33拮抗劑的抗IL-33抗體、抗IL-33受體抗體、或可溶性IL-33受體等、或其鹽之外，亦可包含藥理學上可容許之載劑、稀釋劑或賦形劑。再者，亦可包含本發明之IL-33拮抗劑以外之其他活性成分，例如抗炎症性藥劑或免疫抑制劑等。此種組成物能以非經口投與或適合經口之劑型提供，而以非經口投與為較佳。就非經口投與而言，例如可列舉靜脈內、動脈內、皮下、局部、腹腔內、肌肉內、經鼻、點眼、經皮、經黏膜、髓膜內、經直腸、肌內、陰道內投與等，然而不以此等為限。

本發明之治療劑或醫藥組成物，可依據其投與途徑而選擇適宜劑型，例如可為注射劑、粉末劑、輸液製劑等之任一種，然而就非經口投與之觀點而言，以注射劑、輸液製劑、用時溶解之粉末劑等為較佳。又，此等製劑亦可含有醫藥用之各種輔助劑，亦即，載劑或其他助劑，例如安定劑、防腐劑、無痛化劑、乳化劑等添加劑。

本發明之IL-33拮抗劑，例如，可以1日、1週、1月1次或者1年間1至7次之間隔藉由連續輸注，或快速注射而提供。投藥可藉由靜脈內、腹腔內、皮下、局部、經口、經鼻、經直腸、經肌內、經陰道內提供。較佳之用量規程，包含能避免不期望發生之重大副作用的最大用量或投藥頻率。1次之投與量，一般至少約0.05μg/kg體重，更通常為至少約0.2μg/kg，最通常為至少約0.5μg/kg，代表性地為至少約1μg/kg，更代表性地為至少約10μg/kg，最代表性地為至少約100μg/kg，較佳為至少約0.2mg/kg，更佳為至少約1.0mg/kg，最佳為至少約2.0mg/kg，更適當為至少約10mg/kg，進一步更適當為至少約25mg/kg，最適當為至少約50mg/kg。

就本發明之較佳IL-33拮抗劑之態樣而言，可列舉為人類抗IL-33單株抗體的A10-1C04、A23-1A05、A25-2C02、A25-3H04及A26-1F02。此等單株抗體之輕鏈及重鏈的胺基酸序列，分別為序列表之序列編號7及序列編號8(A10-1C04)、序列編號9及序列編號10(A23-1A05)、序列編號11及序列編號12(A25-2C02)、序列編號13及序列編號14(A25-3H04)、序列編號15及序列編號16(A26-1F02)。此等抗體之恆定區域以人類抗體之恆定區域為較佳，以人類IgG1之恆定區域為更佳。

就本發明之其他IL-33拮抗劑態樣而言，例如，只要能與人類IL-33結合，將IL-33之作用中和的抗體即可，例如可列舉愛托卡單抗(etokimab(亦稱為ANB-020))、REGN-3500(亦稱為SAR-440340)、MEDI-3506、PF-06817024及CBP-233。

就本發明之其他IL-33拮抗劑態樣而言，例如，只要能與人類IL-33受體結合，並可將IL-33之作用中和的抗體即可，例如，可列舉RG-6149(亦稱為AMG-282、MSTT1041A或RO-7187807)、GSK-3772847(亦稱為CNTO-7160)及LY-3375880。

可溶性IL-33受體，為具有序列表之序列編號3之ST2L的細胞外區域(殘基19至殘基328)之一部分或全部胺基酸序列的蛋白質，然而只要發揮IL-33拮抗劑作用，亦可進行胺基酸之置換、刪除或插入。從無損於IL-33 拮抗劑作用之觀點而言，置換、刪除或插入的胺基酸之數目，以1或數個為較佳，1至9之任何數目的胺基酸可被置換、刪除或插入。在其他態樣中，可溶性IL-33受體只要能發揮IL-33拮抗劑作用，對於序列表之序列編號3之ST2L的細胞外區域(殘基19至殘基328)之胺基酸序列，可具有至少80%，更佳至少90%，進一步更佳為至少95%，又更佳至少98%的相同性。又，從改善藥物動態之觀點而言，對於可溶性IL-33受體，可融合免疫球蛋白之恆定區域、聚乙二醇等。融合有抗體之恆定區域的可溶性IL-33受體，可稱為sST2-Fc。能用於結合之免疫球蛋白的恆定區域，雖可為來自任何種類之恆定區域，然而從擔保低抗原性之觀點，以人類恆定區域為較佳。就較佳之人類sST2-Fc而言，可列舉序列表之序列編號5所表示的融合蛋白質。

sST2-Fc，可與免疫球蛋白同樣地形成二聚體。sST2-Fc對於原本之胺基酸序列，例如序列編號5或6之胺基酸序列，只要能發揮IL-33拮抗劑作用，可進行胺基酸之置換、刪除或插入。從無損於IL-33拮抗劑作用之觀點，置換、刪除或插入的胺基酸之數目以1或數個為較佳，1至9之任何數之胺基酸可被置換、刪除或插入。在其他態樣中，sST2-Fc只要能發揮IL-33拮抗劑作用，對於序列表之序列編號5或6之胺基酸序列，可具有至少80%，更佳至少90%，進一步更佳至少95%，再更佳至少98%的相同性。此等之sST2-Fc以進一步維持二聚體形成能力為較佳。

sST2-Fc等可溶性IL-33受體，可利用試管中之產生系統製造，其中使用包含編碼可溶性IL-33受體蛋白質之核酸的載體。就試管中之產生系統而言，可列舉使用真核細胞，例如動物細胞、植物細胞或真菌細胞質之產生系統，或使用原核細胞，例如大腸菌、枯草菌等細菌細胞之產生系統等。就所使用之細胞而言，可使用哺乳動物細胞，例如所謂CHO、COS、骨髓瘤、BHK、HeLa、Vero、293、NS0、Namalwa、YB2/0之一般使用的細胞、昆蟲細胞、植物細胞等。藉由將此種方法所產生之蛋白質進一步精製，可單離出可溶性IL-33受體。

以下，將藉由實施例詳細地說明本發明，不過若未特別述及，本發明非限定於以下實施例。在本說明書中所述及之全部文獻，其全文以引用方式納入本說明書中。

實施例1：子宮內膜異位症模型中的IL-33基因缺損之影響

就子宮內膜異位症之動物模型而言，使用投與雌激素之子宮移植小鼠(Ricci et al.,Reprod.Sci.2011,vol.18,p614)。對為野生型之6週齡雌性Balb/c小鼠(日本Charles River)或Balb/c-背景IL-33基因剔除小鼠(Yasuda et al.,PNAS,2012,Vol.109,p3451、Haenuki et al.,J.Allergy Clin.Immunol.,2012,Vol.130,p184)(以下，表記為「IL-33KO小鼠」)，藉由導入異氟醚(於異氟醚濃度：3.0%，空氣流量：約300至400之條件下維持麻醉)吸入麻醉後，在小鼠下腹部正中約略左側處施加小切口，從腹部開孔依序拉出左右之子宮，摘出子宮前端所附著之卵巢。對於此等之小鼠，使用22G注射針將用玉米油Corn oil(Wako純藥工業)溶解成濃度5μg/mL之雌二醇纈草酸酯注射液(富士製藥)(雌激素)，以0.5μg/100μL/個體之量皮下注射至小鼠後頸部皮下，共施行2週(1次/週)，製作成供與者小鼠及接受者小鼠。2週後使供與者小鼠頸椎脫臼，剖腹，摘出子宮。在培養皿上，將摘出子宮切斷，使其重量統一成為40mg。其後，將摘出子宮與400μL之溶解有抗生素安比西林(ampicillin)(1mg/mL)的PBS一起加入25mL廣口圓底尖形試管中，用外科手術剪刀細細切碎成2mm四方型之片狀。將經細碎的子宮片用2.5mL之注射器吸引。與卵巢摘出術時同樣地，將施行吸入麻醉之接受者小鼠之腹部正中切開一小切口，使注射器內之子宮組織散布於腹腔內，將切開部用3至0 Monocryl縫合。移植子宮片後，進一步藉由皮下注射雌激素而投與至接受者小鼠，共施行2週(1次/週)。移植2週後，使小鼠安樂死，切開腹部。將在腹腔內所形成之異位性子宮內膜組織(囊胞)病變以儘可能不造成傷害的方式摘出，並測定各個之重量及體積。囊胞病變之體積，用V=(4/3)πb²A(b：小徑、A：大徑)算出。

如第1圖所示，在供與者、接受者皆使用IL-33KO小鼠之情況，囊胞病變之體積與使用野生型的情況相比，有意義地減少。又，IL-33KO小鼠之囊胞病變，與對照小鼠之囊胞病變相比，於摘出之時，對腹膜等之黏連受到抑制。再者，IL-33KO小鼠之囊胞病變，與對象小鼠之囊胞病變相比，外觀上之血管之數目減少。此結果顯示IL-33在子宮內膜異位症模型中，參與囊胞病變之成長、對各種臟器之黏連(對各種臟器之黏連為疼痛之原因)、及血管新生，以及藉由阻礙IL-33，可抑制囊胞病變之成長、對各種臟器之黏連(疼痛)、及血管新生。

實施例2：IL-33投與對於子宮內膜異位症模型的影響

使用野生型6週齡雌性Balb/c小鼠，藉由在實施例1中所記載之方法，製作子宮內膜異位症模型。對於IL-33投與群，從移植子宮片之時，將用PBS溶解之重組人類IL-33蛋白質(殘基112至殘基270)(Kondo et al.,Int.Immunol.2008,vol.20,p791)以1次100ng/200μL/個體之量投與至腹腔內，每週3次，施行2週、共計6次。於移植2週後，使小鼠安樂死，切開腹部，摘出於腹腔內所形成之囊胞病變，並測定各個之體積。如第2圖所示，人類IL-33投與群與媒劑投與群相比，囊胞病變之體積顯著地增大。該結果顯示IL-33參與囊胞病變之成長。又，由於IL-33之濃度在子宮內膜異位症患者之腹水及血清中上升(非專利文獻2)，投與人類IL-33之子宮內膜異位症模型可反映子宮內膜異位症之病態，被認為是有用的疾病模型。

實施例3：IL-33拮抗劑

藉由重組CHO細胞製作5種人類抗IL-33抗體 (A10-1C04、A23-1A05、A25-2C02、A25-3H04、A26-1F02)、以及小鼠sST2-Fc，其中該小鼠sST2-Fc為小鼠ST2與人類IgG1恆定區域之融合蛋白(國際公開第2015/099175號)。此等之胺基酸序列如下表所示，藉由KinExA測定5種人類抗IL-33抗體對於人類IL-33蛋白質(殘基112至殘基270)(ATGen,ILC0701)的親和性，結果就A10-1C04而言，Kd=100.3pM；就A23-1A05而言，Kd=195.3pM；就A25-2C02而言，Kd=700fM，就A25-3H04而言，Kd=7.7pM；就A26-1F02而言，Kd=5.3pM。

實施例4：IL-33拮抗劑sST2-Fc對於異位性子宮內膜組織之成長的效果

在子宮內膜異位症模型中，IL-33參與囊胞病變之增殖，藉由阻礙IL-33，顯示可以治療子宮內膜異位症。因此，投與IL-33之拮抗劑，可治療子宮內膜異位症。就IL-33之拮抗劑而言，使用在實施例3中所調製之小鼠sST2-Fc。使用藉由實施例1所示之方法製作之子宮內膜異位症模型小鼠，各群6隻，子宮片於移植後，藉由靜脈內投與將sST2-Fc投與至小鼠，每次20mg/kg，毎2週投與3日。對於對照群之小鼠，以對照Fc(InVivoMAb重組人類Fc-G1(Bio X Cell公司Cat# BE0096)代替小鼠sST2-Fc進行投與。使用小鼠sST2-Fc治療後，使小鼠安樂死，切開腹部，摘出在腹腔內所形成之囊胞病變，針對摘出時之囊胞病變之黏連程度、囊胞病變之體積、囊胞病變之血管進行解析。如第3圖所示，與對照Fc投與群相比，在小鼠sST2-Fc投與群中囊胞病變之體積顯著地減少。又，隨著囊胞病變之體積減少，小鼠sST2-Fc投與小鼠之囊胞病變，與對照小鼠之囊胞病變相較，摘出時對腹膜等之黏連受到抑制。再者，小鼠sST2-Fc投與小鼠之囊胞病變，與對照小鼠之囊胞病變相比，外觀上之血管數目減少。

從以上之結果可知，藉著小鼠sST2-Fc之投與可治療子宮內膜異位症，可抑制子宮內膜異位症之異位性子宮內膜組織之成長、黏連(對各種臟器之黏連成為疼痛之原因)、及血管新生。

實施例5：IL-33拮抗劑sST2-Fc對異位性子宮內膜組織之纖維化的效果

在實施例4中所摘出之囊胞病變用三聚甲醛固定後，包埋於石蠟中，製作8μm厚之石蠟切片。使用Mallory苯胺藍橙G液(武藤化學)之染色液，依照武藤化學之推薦規程將纖維化之組織染成藍色。纖維化之程度，用1(淡)至 3(濃)點之分數來評價偶氮卡紅染色之藍色之濃淡度。如表2所示，與對照Fc投與群相比，在小鼠sST2-Fc投與群中，囊胞病變之纖維化受到抑制。在第4圖中，展示在各群中平均的染色圖(對照Fc投與群個體編號D及小鼠sST2-Fc投與群個體編號C)。

從以上之結果可知，藉由小鼠sST2-Fc之投與，可治療子宮內膜異位症，並可抑制子宮內膜異位症之異位性子宮內膜組織之纖維化。

實施例6：抗IL-33單株抗體對異位性子宮內膜組織之成長的效果

在以IL-33KO小鼠製作之子宮內膜異位症模型中，顯示藉由投與重組人類IL-33增大囊胞病變(實施例2)。使用該模型，調查在實施例3中所調製之人類抗IL-33單株抗體(A10-1C04、A23-1A05、A25-2C02、A25-3H04、A26-1F02)的效果。使用藉由實施例2所示之方法製作之IL-33投與子宮內膜異位症模型，於子宮片之移植後以10mg/kg之量經由靜脈內投與人類抗IL-33抗體，每週1次。對於對照群之小鼠，以對照抗體(全人類IgG1同型對照組PC級(EUREKA公司Cat#ET901))代替人類抗IL-33抗體進行投與。使用人類抗IL-33抗體治療後，使小鼠安樂死，切開腹部，摘出在腹腔內所形成之囊胞病變，針對摘出時之囊胞病變之黏連之程度、囊胞病變之體積、囊胞病變之血管進行解析。如第5圖(展示A10-1C04之結果)所示，與PBS投與群相比，在人類IL-33投與群中，囊胞病變之體積增加，縱使投與對照抗體囊胞病變之體積仍然顯著地增加。囊胞病變之體積增加藉由投與抗IL-33抗體而顯著地被阻礙。又，隨著囊胞病變之體積減少，抗IL-33抗體投與小鼠之囊胞病變與對照抗體投與小鼠之囊胞病變相比，於摘出之時對於腹膜等之黏連受到抑制。再者，抗IL-33抗體投與小鼠之囊胞病變與對照小鼠之囊胞病變相比，外觀上之血管數減少。

從以上之結果可知，藉由抗IL-33抗體之投與可治療子宮內膜異位症，並可抑制子宮內膜異位症之異位性子宮內膜組織之成長、黏連(對各種臟器之黏連成為疼痛之原因)、及血管新生。

實施例7：抗IL-33單株抗體對於異位性子宮內膜組織之細胞增殖的效果

將在實施例6中所摘出之囊胞病變用三聚甲醛固定後，包埋於石蠟中並製作8μm厚之石蠟切片。為了調查囊胞病變之增殖，使用抗Ki-67抗體[SP6](Abcam公司，ab16667)及Dako Envision+Dual link(Agilent公司，K4063)，依照Abcam公司之推薦規程，進行為細胞增殖標記之Ki-67抗原的免疫組織染色。算出切片之顯微鏡每一視野的細胞核之Ki-67陽性率。算出每一切片3處之Ki-67陽性率，並求出其平均值。如第6圖(顯示A10-1C04之結果)所示，與PBS投與群相比，人類IL-33投與使得在子宮內膜異位症囊胞病變之細胞中，為細胞增殖標記之Ki-67陽性細胞數目之比率增大，縱使投與對照抗體，Ki-67陽性細胞數之比率仍然增大，不過藉由抗IL-33抗體投與，該增大受到抑制。

從以上之結果可知，藉由抗IL-33抗體之投與，可治療子宮內膜異位症，並可抑制子宮內膜異位症之異位性子宮內膜組織之細胞增殖。

實施例8：抗IL-33單株抗體對於子宮內膜異位症之疼痛的效果

藉由將抗IL-33單株抗體投與至子宮內膜異位症及子宮腺肌症患者，可治療子宮內膜異位症及子宮腺肌症。可以緩和伴隨子宮內膜異位症或子宮腺肌症之骨盆痛、月經困難性疼痛、性交痛等疼痛。又，可改善與伴隨子宮內膜異位症或子宮腺肌症之步行困難、性交困難等有關的生活品質(QOL)。

[產業上之可利用性]

本發明之以IL-33拮抗劑作為有效成分的治療劑，可使用作為子宮內膜異位症或子宮腺肌症之診斷、治療、預防或減輕用之醫藥組成物。

<110> 日商田邊三菱製藥股份有限公司(MITSUBISHI TANABE PHARMA CORPORATION)

<120> 包含IL-33拮抗劑的子宮內膜異位症治療劑

<130> P180453

<150> US 62/552,594

<151> 2017-08-31

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 270

<212> PRT

<213> 智入

<400> 1

<210> 2

<211> 2689

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 556

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 2573

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

<210> 5

<211> 541

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 5

<210> 6

<211> 537

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 6

<210> 7

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體之輕鏈

<400> 7

<210> 8

<211> 465

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體之重鏈

<400> 8

<210> 9

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體之輕鏈

<400> 9

<210> 10

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體之重鏈

<400> 10

<210> 11

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體之輕鏈

<400> 11

<210> 12

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體之重鏈

<400> 12

<210> 13

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體之輕鏈

<400> 13

<210> 14

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體之重鏈

<400> 14

<210> 15

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體之輕鏈

<400> 15

<210> 16

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體之重鏈

<400> 16

Claims

一種IL-33拮抗劑的用途，係用以製造子宮內膜異位症或子宮腺肌症之治療或減輕劑，其中，前述IL-33拮抗劑為屬於抗IL-33抗體之A10-1C04(序列編號7及8)、A23-1A05(序列編號9及10)、A25-2C02(序列編號11及12)、A25-3H04(序列編號13及14)、或A26-1F02(序列編號15及16)。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，前述治療或減輕劑係緩和子宮內膜異位症或子宮腺肌症之疼痛。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，前述治療或減輕劑係抑制子宮內膜異位症或子宮腺肌症中的異位性子宮內膜組織之成長。
如申請專利範圍第3項所述之用途，其中，前述異位性子宮內膜組織係包含囊胞。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，前述治療或減輕劑係抑制子宮內膜異位症或子宮腺肌症之異位性子宮內膜組織的血管新生。
如申請專利範圍第5項所述之用途，其中，前述異位性子宮內膜組織係包含囊胞。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，前述治療或減輕劑係抑制異位性子宮內膜組織的纖維化或細胞增殖。
如申請專利範圍第7項所述之用途，前述異位性子宮內膜組織係包含囊胞。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，前述治療或減輕劑係抑制子宮內膜異位症中的異位性子宮內膜組織與各種臟器之黏連。
如申請專利範圍第9項所述之用途，其中，前述異位性子宮內膜組織係包含囊胞。