CN114712509A - Il-33拮抗剂的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了IL‑33拮抗剂的新用途，具体的，本发明提供了IL‑33拮抗剂在制备抗单增李斯特菌感染的药物中的应用；本发明还提供了IL‑33拮抗剂在制备预防或治疗流产的药物中的应用。

Description

IL-33拮抗剂的新用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体的，涉及IL-33拮抗剂的新用途。
背景技术
单核细胞增生性李斯特菌(简称单增李斯特菌)(Listeria monocytogenes， Lm)，是一种人畜共患的食源性感染性疾病的病原体，可引起严重的感染性疾病。Lm被认为是第三种最常见的食源性病原体，可在细胞免疫功能低下人群，如孕妇、老人、儿童等高危人群中引起感染。该感染可导致一种潜在致命疾病，即单增李斯特菌病。轻者可引起人类胃肠道症状，重者则会导致中枢神经系统感染和败血症等症状。孕妇患单增李斯特菌病可导致流产、死胎、早产和新生儿感染等严重妊娠不良结局。虽然其他的细菌感染亦能导致类似的不良妊娠结果，但Lm感染与其他病原体感染有显著区别，因Lm感染后，孕妇及其胎儿主要发生在没有明显病灶的情况下，所以有延迟有效医疗干预的风险。在过去几年中，一些与食用受Lm污染的肉类和肉制品等食物有关的暴发和散发病例有所增加，是一种严重的公共卫生问题。近年来，抗生素的大量使用导致细菌耐药率增高，已经发现多种临床分离菌株对四环素和环丙沙星等抗生素耐受严重，造成单增李斯特菌病的治疗面临无药可治的局面。因此，寻找新型、安全的治疗药物迫在眉睫。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种预防或治疗流产的药物；
本发明的第二目的是提供一种抗单增李斯特菌感染的药物；
本发明的第三目的是提供一种预防或治疗单增李斯特菌感染相关疾病的药物。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明第一个方面提供了一种用于抗单增李斯特菌感染的IL-33拮抗剂，所述的IL-33拮抗剂能够阻断IL-33/ST2信号通路。
在一个优选的实施方案中，所述的IL-33拮抗剂能够阻碍IL-33与其特异性受体ST2蛋白结合。在本发明的具体实施例中，所述的IL-33拮抗剂为 anti-IL-33Rα/ST2。
本发明第二方面提供了一种组合物，所述的组合物包含本发明第一方面所述的IL-33拮抗剂。
作为一种优选的实施方式，所述的组合物还包含药物上可接受的缓冲液、载体或赋形剂。
作为一种更为优选的实施方式，所述的缓冲液包括Trizma、Bicine、 Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐(glycolate)、乳酸盐、硼酸盐、ACES、 ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、卡可酸盐(cacodylate)、 CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、 SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO或TES。
作为一种更为优选的实施方式，所述的载体包括抗微生物剂、等渗试剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂、分散剂、乳化剂、螯合剂、增稠剂或增溶剂。
作为一种更为优选的实施方式，所述的赋形剂包括碳水化合物、聚合物、脂质或矿物。
本发明第三方面提供了如下任一项所述的应用：
(1)本发明第一方面所述的IL-33拮抗剂或本发明第二方面所述的组合物在制备预防或治疗流产的药物中的应用；
(2)本发明第一方面所述的IL-33拮抗剂或本发明第二方面所述的组合物在制备抗单增李斯特菌感染的药物中的应用；
(3)本发明第一方面所述的IL-33拮抗剂或本发明第二方面所述的组合物在制备预防或治疗单增李斯特菌感染相关疾病中的应用；
(4)IL-33在促进T淋巴细胞向Th2型分化中的应用；
(5)IL-33在调节细胞因子中的应用；
(6)ST2蛋白抑制剂在促进细胞凋亡中的应用；
(7)检测IL-33表达水平的试剂在制备诊断单增李斯特菌感染相关疾病的产品中的应用。
作为一种优选的实施方式，所述的流产为由单增李斯特菌感染引起的流产。
作为一种优选的实施方式，所述的单增李斯特菌感染相关疾病包括脑膜炎、败血症、流产、新生儿感染、单核细胞增多症。
作为一种优选的实施方式，所述的药物的剂型包括液体制剂、固体制剂或半固体制剂，更为优选的，所述的药物的剂型为液体制剂。
作为一种优选的实施方式，所述的ST2蛋白抑制剂包括抑制ST2蛋白活性的物质，或抑制或沉默il1rl1基因表达的物质。
作为一种更为优选的实施方式，所述的物质包括合成的小分子、化学试剂、反义寡核苷酸、siRNA、miRNA、核酶、多肽、蛋白质，优选的，所述的物质为siRNA。在本发明的具体实施例中，所述的siRNA包括如SEQ ID No.1-6所示的序列，优选的，所述的siRNA包括如SEQID No.3-4所示的序列。
作为一种优选的实施方式，所述的细胞因子包括IL-4、IL-10。
作为一种优选的实施方式，所述的试剂包括引物、探针或抗体。
作为一种优选的实施方式，所述的产品包括试剂盒、芯片或试纸条。
本发明第四方面提供了一种非治疗目的的提高细胞凋亡水平的方法，所述的方法包括向细胞施用ST2蛋白抑制剂。
作为一种优选的实施方式，所述的细胞为T淋巴细胞，更为优选的，所述的T淋巴细胞为H9细胞。
附图说明
图1是IL-33诱导T淋巴细胞分化为Th2型的实验结果图，其中，图A是 CCK-8法检测H9人T淋巴细胞增殖曲线，图B是CCK-8法检测IL-33和/ 或LPS对细胞增殖活性的影响统计图，图C是ELISA法检测细胞上清的IL-2 水平变化结果图，图D是ELISA法检测细胞上清的INF-γ水平变化结果图，图E是ELISA法检测细胞上清的IL-4水平变化结果图，图F是ELISA法检测细胞上清的IL-10水平变化结果图；
图2是Il1rl1 siRNA提高Annexin V阳性细胞比例和Cyt C还原酶水平的实验结果图，其中，图A是T细胞中il1rl1基因编码的ST2蛋白的Western blotting条带和定量结果图，图B是Annexin V-PE/7-AAD染色细胞、流式细胞仪分析染色阳性的比例结果，图C是凋亡细胞统计图，图D是ELISA 法检测各组细胞Cyt C还原酶水平统计图；
图3是经il1rl1 siRNA干预后凋亡蛋白水平显著增加的结果图，其中，图A 是Western blotting检测Bax和Bcl-2蛋白水平结果图，图B是Bax/β-actin 比值定量统计图，图C是Bcl-2/β-actin比值定量统计图，图D是Western blotting检测cleaved caspase-3和caspase-3蛋白水平结果图，图E是cleaved caspase-3/β-actin比值定量统计图，图F是caspase-3/β-actin比值定量统计图，图G是Western blotting检测cleaved caspase-9和caspase-9蛋白水平结果图，图H是cleaved caspase-9/β-actin比值定量统计图，图I是caspase-9/β-actin 比值定量统计图；
图4是IL-33在感染Lm的小鼠中上调的实验结果图，其中，图A是摸索 Lm感染BALB/c妊娠小鼠的最佳感染浓度的实验技术图，图B是胚胎吸收率统计图，图C是流产率统计图，图D是观察妊娠合并Lm感染小鼠胎盘细菌载量和炎症细胞因子水平动态变化的实验技术图，图E是妊娠合并Lm 感染小鼠胎盘细菌载量的动态变化统计图，图F是Lm感染妊娠小鼠IL-33 蛋白的表达水平动态变化统计图，图G是ELISA法检测孕鼠子宫匀浆IL-2 细胞因子水平动态变化统计图，图H是ELISA法检测孕鼠子宫匀浆IFN-γ细胞因子水平动态变化统计图，图I是ELISA法检测孕鼠子宫匀浆IL-4细胞因子水平动态变化统计图，图J是ELISA法检测孕鼠子宫匀浆IL-10细胞因子水平动态变化统计图；
图5是阻断IL-33/ST2信号通路显著抑制妊娠合并Lm感染小鼠体内T细胞向Th2型分化的实验结果图，其中，图A是研究IL-33对妊娠合并Lm感染小鼠体内免疫反应的调节作用及其机制的实验技术图，图B是胚胎吸收率统计图，图C是流产率统计图，图D是胎盘内细菌载量统计图，图E是ELISA 法检测小鼠子宫局部IL-2细胞因子水平结果图，图F是ELISA法检测小鼠子宫局部IFN-γ细胞因子水平结果图，图G是ELISA法检测小鼠子宫局部 IL-4细胞因子水平结果图，图H是ELISA法检测小鼠子宫局部IL-10细胞因子水平结果图。
具体实施方式
本发明通过将IL-33拮抗剂免疫小鼠，发现阻断IL-33/ST2轴显著降低了感染Lm的妊娠小鼠的胚胎吸收率和流产率以及胎盘细菌负荷，证明 IL-33拮抗剂具有抗李斯特菌感染以及预防或治疗流产的作用。
在本发明的说明书和权利要求书中，词语"包括"、"包含"和"含有"意指 "包括但不限于"，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。
IL-33拮抗剂
如本文所用，术语“IL-33拮抗剂”是指能够结合IL-33并阻断、减弱或以其它方式干扰IL-33信号传递和/或IL-33与细胞表面受体(例如，ST2)之间的相互作用的任何试剂。
组合物
本发明提供了一种组合物，所述的组合物包含所述的IL-33拮抗剂。
在本发明中，所述的组合物还包含药物上可接受的缓冲液、载体或赋形剂。
术语“药学上可接受的”在本文中被限定为指在合理医学判断的范围内适合用于与受试者的组织相接触而无过度毒性、刺激过敏反应和其他问题并发症，并且与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于，人类、非人灵长类、犬、猫、啮齿动物等。
药物
本发明的药物可通过包括肠道、粘膜、肠胃外和局部路径的本领域已知的任何路径施用到个体。所述肠道路径包括口服和包括自胃肠道吸收的任何路径。所述粘膜路径包括但不限于口腔、鼻、舌下、颊、经肺、经皮和经眼路径。所述肠胃外路径包括而不限于静脉内、皮内、肌肉内和皮下路径。
本发明所述的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定，本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
本发明所述的药物一般必须无菌且在生产储存条件下稳定。可以将该药物配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。通过将所需量的该IL-33拮抗剂与所需上述成分的一种或组合一起加入适当的溶剂中并接着进行除菌过滤制备无菌注射液。一般而言，通过将该IL-33拮抗剂加入含有基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌溶媒中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，推荐的制备方法是真空干燥和冷冻干燥剂。例如，通过诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以保持溶液的适当流动性。通过在该药物中包括延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐或明胶)可以达到注射药物的延长吸收。
预防、治疗
“预防”表示防止有患病风险的对象中的疾病的出现或者已消失的疾病的复发。“治疗”表示控制、减轻或缓解疾病的病理学进展和延长患病对象的存活期。
siRNA
本文中使用的术语“siRNA”指阻止靶基因的表达。使用将siRNA导入细胞的标准技术，包括其中以DNA为模板转录RNA的那些。所述siRNA 包括有义核酸序列(亦用“有义链”指代)、反义核酸序列(亦用“反义链”指代)或两者。所述siRNA可如此构建使得单个转录物具有靶基因的有义核酸序列与其互补的反义核酸序列，例如，发夹结构。所述siRNA可为dsRNA或shRNA。
siRNA的常规设计方法可参考文献(如：ReynoldsA等，自然生物技术， 2004年，22卷：326-330)或Amhion、Qiagen等公司网站的公开资料。miRNA 的常规设计方法可参考文献(Lo HL等，基因治疗，2007年，14卷：1503-1512 页)，选择靶序列的方法与siRNA的设计方法相似，例如可将设计的含有靶序列的正义链及相应的反义链替换到pri-microRNA上，使构建的miRNA 可阻止含有靶序列的mRNA的表达。核酶的常规设计方法可参考文献 (HaseloffJ等，自然，1988年，334卷：585-591页)，例如可将与靶序列的前后序列互补的核苷酸序列分别置于核酶保守性核心的序列(如锤头结构) 前后，使构建的核酶能在靶序列处切割含有靶序列的核酸。反义寡核苷酸的常规设计方法可参考文献(Matveeva OV等，核酸研究，2003年，31卷： 4989-4994页)。
术语“正义链”指的是，具有和基因编码链相同的序列的核苷酸链。
术语“反义链”是指siRNA的这样一条链，所述链包含与靶序列完全或基本互补的区域。其中，术语“互补区域”是指反义链上与靶mRNA序列完全或基本互补的区域。在互补区域与靶序列不完全互补的情况下，错配可以位于分子的内部或末端区域中。通常，最耐受的错配位于末端区域中，例如，在5’和/或3’端的5、4、3、2或1个核苷酸内。对错配最敏感的反义链部分被称为“种子区”。
引物、探针或抗体
术语“引物”是指寡核苷酸，它与靶核酸中的序列(“引物结合位点”)杂交并且能够用作在适用于合成的条件下沿着核酸的互补链启动该合成的点。
术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸 (往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其通过至少一个抗原结合位点识别并特异性结合靶标，诸如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合。如本文所用，该术语涵盖完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、单链抗体、抗体片段(诸如Fab、Fab′、F(ab ')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)抗体、多特异性抗体(诸如双特异性抗体)、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白，以及包含抗原结合位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要该抗体表现出所需的生物结合活性。抗体可以是五种主要类别的免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。不同类别的免疫球蛋白具有不同的和熟知的亚单位结构和三维构型。抗体可以是裸露的或与其他分子缀合，包括但不限于毒素和放射性同位素。
试剂盒、芯片
本发明提供了用于诊断受试者中的单增李斯特菌感染相关疾病的试剂盒，该试剂盒用于确定IL-33的水平(其中序列任选地包含尿嘧啶以代替所公开的胸腺嘧啶中的一种、多于一种或全部)及其组合。
在本发明中，“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实验材料和实验方法
一、本实验中使用的各种化学品、抗体和其他材料及其制造商如下:
单核细胞增生性李斯特菌(Lm)来自中国微生物培养采集中心(CGMCC， 1.10753)；人IL-33购自美国PeproTech公司(Cat#200-33)； Anti-IL-33Rα/ST2(Cat#146604)购自美国Biolegend公司；刀豆蛋白A，Ⅳ型购自中国索莱宝科技有限公司；Eschericha 0127：B8脂多糖(L4516)购自 Sigma-Aldrich(Merck KGaA，Darmstadt，德国)；il1rl1小干扰RNA寡核苷酸和转移酶(#E607402)购自上海生工生物工程有限公司；IL-33(Cat#580509)酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒购自美国Biolegend公司；IFN-γELISA试剂盒 (Cat#88-7316)购自美国Invitgen公司；cleaved caspase-3(ab32042),caspase-3 (ab184787),cleavedcaspase-9(ab2324),caspase-9(ab185719),Bax(ab182734), Bcl-2(ab117115),ST2(ab233433)、人细胞色素C(CytC)还原酶(复合体III)ELISA 试剂盒(Ab124537)购自美国Abcam公司；Annexin V PE Apop Dtec Kit(559763) 购自美国BD公司；细胞计数试剂盒-8(CCK-8，GK10001)购自美国Glpbio公司。
二、实验动物
本发明从北京维通利华实验动物技术有限公司购买了无特定病原体的妊娠BALB/c小鼠。本研究的实验程序和伦理要求符合《中华人民共和国实验动物管理条例》。所有实验程序均经首都医科大学动物实验委员会批准。本发明的研究是按照ARRIVEguidelines进行的。BALB/c小鼠被饲养在一个标准的气候控制的饲养室内，环境稳定，室内温度为22℃±1℃，光照-黑暗周期为12小时，喂食标准的实验室食物并随意加水。在被随机分配到不同的组之前，小鼠适应环境 1周。分别治疗3周后，各组中的所有小鼠都用过量的水合氯醛处死。药物干预后处死小鼠，取小鼠胎盘进行病理观察和细菌载量检测。
三、细胞培养和处理
H9人T淋巴细胞(BNCC339983)购自BeNa培养物保藏中心(中国北京)。在含5％CO2的潮湿空气中，37℃条件下，使用补充有10％胎牛血清、100U/mL 青霉素和100g/mL链霉素(完全培养基)的RPMI-1640培养基(购自美国Corning) 培养细胞。
四、细胞活力测定
将不同浓度的T淋巴细胞接种于96孔板中，用CCK-8法检测细胞生长曲线。接种于96孔板中的细胞(1×104个/孔)，每孔100μL完全培养基加 IL-33(10ng/mL或100ng/mL)和/或脂多糖(1μg/mL)处理。作用24小时后，加入10μL CCK-8溶液测定细胞存活率。37℃孵育6h后，由GloMax Discovery(Promega，纽约，美国)在450nm处记录吸光度。每个样本有6 个重复。
五、小干扰RNA
本发明设计了三种类型的il1rl1小干扰RNA(siRNA)寡核苷酸来沉默il1rl1编码蛋白ST2，该蛋白是IL-33的靶受体。用高效低毒的转染剂 TransMate作为siRNA的辅助转染剂。细胞在无血清、无抗生素的条件下培养24h后，在完全培养的条件下培养48h后，检测ST2蛋白的表达，以确定siRNA的转染率。
六、细胞因子和Cyt C表达水平的检测
将T淋巴细胞(1.5×105细胞/孔)接种到含有1mL完全培养基的12孔板中。24小时培养和药物干扰后，收集细胞上清液，按程序进行细胞因子检测。将细胞(每瓶3×106个细胞)接种到25cm2的细胞培养瓶中，用相应的药物干预后，弃去细胞上清液，收集沉淀物，按规程进行Cyt C还原酶(复合物III)检测。
七、Annexin V-PE染色和荧光激活细胞分选(FACS)分析
用Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒(Cat#559763，BD-Pharmingen)按照制造商的建议进行细胞染色。简而言之，将悬浮的人T细胞用PBS洗涤，然后再悬浮在结合缓冲液中(每毫升1×106/mL)。加入5μL AnnexinV-PE和5μL 7-AAD(7-氨基放线菌素-D)，室温黑暗中孵育15分钟，用流式细胞仪进行分析。
八、蛋白质印迹分析
用总蛋白提取试剂盒收集T淋巴细胞蛋白。用BCA蛋白检测试剂盒测定总蛋白浓度。然后，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白质并转移到PVDF膜上。首先将膜与5％脱脂乳孵育，然后与一抗(1：1 000) 在4℃孵育过夜。用Tris-Buffer生理盐水/Tween 20(TBST)洗涤3次后，与过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗孵育。再用TBST洗涤3次后，用ECL检测免疫反应条带，并用Image Lab软件对条带进行密度分析。
九、组织病理学分析
从石蜡包埋的胎盘组织切下横切面，然后用苏木精-伊红染色进行组织病理学评估。通过将胎盘表面划分为10个区域并独立评估每个区域，获得炎症浸润的形态学记录。组织学评分(每个项目0-3，代表不同的严重程度) 用于评估每只小鼠胎盘感染的病理严重程度。
十、统计分析
所有数据均表示为平均标准偏差(SD)。统计分析使用SPSS软件(ver. 27.0；SPSSInc.,Chicago,IL,USA)。单向方差分析(ANOVA)和Dunnett’s test 用于不同组之间的多重比较。P<0.05时，差异具有统计学意义。
实施例1IL-33诱导T淋巴细胞分化为Th2型
H9 T淋巴细胞增殖曲线如图1A所示。然后用IL-33和/或LPS刺激T 淋巴细胞。LPS单独刺激T细胞时，对T细胞的增殖活性发挥很显著的抑制作用，而加入IL-33刺激后，能够很明显的改善LPS对T细胞的抑制作用(图1B)。此外，通过测量上清液中的细胞因子水平来观察T淋巴细胞分化。H9人T淋巴细胞(1.5×105个/孔)接种于12孔板，每孔完全培养液1ml。细胞分为6组:con、ConcanavalinA(conA)、conA+IL-33(10ng/mL)、 conA+IL-33(100ng/mL)、conA+脂多糖(LPS)、conA+IL-33(10ng/mL)+LPS、 conA+IL-33(100ng/mL)+LPS。相应组给予10μg/mL conA和1μg/mL LPS。采用ELISA法检测细胞上清的细胞因子水平变化。本发明发现经IL-33刺激的细胞，无论有无LPS，都显著表达更多的IL-4和IL-10，而对IL-2和INF-γ的表达几乎没有影响。提示IL-33在T淋巴细胞向Th2型分化过程中起重要作用(图1C-F)。后续实验选用10ng/mL IL-33浓度。
实施例2敲低ST2蛋白促进细胞凋亡和提高细胞色素C还原酶水平本发明设计了三种类型的il1rl1 siRNA，旨在沉默IL-33特异性受体蛋白ST2。siRNA寡核苷酸序列如表1所示，siRNA降低ST2蛋白的效果如图2A所示。H9人T淋巴细胞分为3组：con、LPS+IL-33和il1rl1 siRNA+LPS+IL-33组。每组细胞用10μg/mL刀豆蛋白(conA)激活细胞。 IL-33和LPS给药浓度分别为10ng/mL和1μg/mL。il1rl1-2 siRNA干扰细胞24小时，抑制ST2受体。采用Annexin V-PE/7-AAD染色、流式细胞仪和ELISA法检测细胞凋亡率和细胞色素C还原酶水平。对照组细胞凋亡率为3.3％，LPS+IL-33处理组细胞凋亡率为7.7％，而il1rl1siRNA组Annexin V阳性细胞比例显著升高(13％)(图2B、C)。此外，敲低ST2蛋白后细胞色素C还原酶显著升高(p<0.05)(图2D)。
将细胞分为三组：对照组，未经过特殊处理的细胞；LPS+IL-33组，1 μg/mL LPS+10ng/mL IL-33作用24h；il1rl1 siRNA+LPS+IL-33，il1rl1 siRNA 转染24h后，正常培养2d，给予1μg/mL LPS和10ng/mL IL-33刺激24h 收集蛋白。各组均给予10μg/ml conA。结果显示，与对照组和LPS+IL-33 组相比，il1rl1 siRNA敲低ST2后促凋亡蛋白Bax、cleavedcaspase-3、 caspase-3、cleaved caspase-9和caspase-9显著升高(p<0.05)(图3A、B、D-I)，而促生存蛋白Bcl-2无明显变化(p>0.05)(图3A、C)。
表1.三种设计的靶向人il1rl1基因的siRNA及其阴性对照(FAM-NC)的寡聚核苷酸序列
Figure RE-GDA0003644419180000121
Figure RE-GDA0003644419180000131
实施例3IL-33在李斯特菌病孕鼠中表达上调
通过将Lm(104、105、106CFU(集落形成单位)/小鼠)注射到妊娠一周的 BALB/c小鼠的尾部来建立妊娠相关李斯特菌病体内模型。3天后处死小鼠 (图4A)。随着Lm浓度的增加，小鼠的胚胎吸收和流产率显著增加(图4B、 C)。对照组(Uninf.组)和5×104CFU Lm-inf.组胚胎吸收率和流产率均为0， 5×105CFU Lm-inf.组分为39.58％和20.87％，而5×106CFULm-inf.组则高达 63.56％和32.69％。为观察胎盘细菌载量和子宫角匀浆中细胞因子动态变化，将怀孕一周的BALB/c小鼠分为对照组和Lm感染组(图4D)。结果显示，孕鼠在Lm感染(5×105CFU)模型构建成功后胎盘组织中的细菌载量显著增高，并于感染后2天达到峰值(图4E)。IL-33蛋白质水平随时间的推移而增加，并在第7天达到峰值(图4F)。IL-2和IFN-γ在第3天达到高峰，而IL-4 和IL-10的最高水平在小鼠感染后的第7天达到最高水平(图4G-J)。
实施例4anti-IL-33Rα/ST2显著降低感染LM的妊娠小鼠的胚胎吸收率和流产率以及胎盘细菌负荷
anti-IL-33Rα/ST2可以与IL-33相结合，阻碍IL-33与其特异性受体ST2 蛋白结合，从而阻断小鼠体内IL-33/ST2信号通路。
为研究IL-33在妊娠李斯特菌病中的作用，将Anti-IL-33Rα/ST2免疫小鼠(图5A)。阻断IL-33/ST2轴显著降低了感染Lm的妊娠小鼠的胚胎吸收和流产率以及胎盘细菌负荷(图5B-D)。经Anti-IL-33Rα/ST2治疗后，小鼠子宫角部Th1型细胞因子(IL-2和IFN-γ)显著降低(P<0.05)，而Th2型细胞因子(IL-4和IL-10)无明显变化(P>0.05)。
此外，本发明将妊娠小鼠随机分为Lm感染组，和Lm+anti-IL-33Rα/ST2 组。分别在Lm感染后0d、1d、和3d处死小鼠，取胎盘组织制作成组织切片，苏木精-伊红(HE)染色后进行病理观察，结果表明，小鼠胎盘组织的炎症随着时间的推移而加重。与Lm感染组相比，Lm+anti-IL-33Rα/ST2 组在妊娠小鼠Lm感染后1d和3d，胎盘组织中的炎症反应明显恶化，炎性细胞的浸润明显增多。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京妇产医院
<120> IL-33拮抗剂的新用途
<141> 2022-04-01
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcaggugau uacaccugua att 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uuacaggugu aaucaccugc gtt 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgugaaggaa gaggauuuau utt 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aauaaauccu cuuccuucac gtt 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcagcaaagu uuaguaaaca att 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
uuguuuacua aacuuugcug ctt 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgugacacg uucggagaat t 21

Claims (10)

1.一种用于抗单增李斯特菌感染的IL-33拮抗剂，其特征在于，所述的IL-33拮抗剂能够阻断IL-33/ST2信号通路，优选的，所述的IL-33拮抗剂能够阻碍IL-33与其特异性受体ST2蛋白结合，优选的，所述的IL-33拮抗剂为anti-IL-33Rα/ST2。
2.一种组合物，其特征在于，所述的组合物包含权利要求1所述的IL-33拮抗剂，优选的，所述的组合物还包含药物上可接受的缓冲液、载体或赋形剂，
优选的，所述的缓冲液包括Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、卡可酸盐、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO或TES，
优选的，所述的载体包括抗微生物剂、等渗试剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂、分散剂、乳化剂、螯合剂、增稠剂或增溶剂，
优选的，所述的赋形剂包括碳水化合物、聚合物、脂质或矿物。
3.如下任一项所述的应用：
(1)权利要求1所述的IL-33拮抗剂或权利要求2所述的组合物在制备预防或治疗流产的药物中的应用；
(2)权利要求1所述的IL-33拮抗剂或权利要求2所述的组合物在制备抗单增李斯特菌感染的药物中的应用；
(3)权利要求1所述的IL-33拮抗剂或权利要求2所述的组合物在制备预防或治疗单增李斯特菌感染相关疾病中的应用；
(4)IL-33在促进T淋巴细胞向Th2型分化中的应用；
(5)IL-33在调节细胞因子中的应用；
(6)ST2蛋白抑制剂在促进细胞凋亡中的应用；
(7)检测IL-33表达水平的试剂在制备诊断单增李斯特菌感染相关疾病的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的流产为由单增李斯特菌感染引起的流产。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的单增李斯特菌感染相关疾病包括脑膜炎、败血症、流产、新生儿感染、或单核细胞增多症。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物的剂型包括液体制剂、固体制剂或半固体制剂，优选的，所述的药物的剂型为液体制剂。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的ST2蛋白抑制剂包括抑制ST2蛋白活性的物质，或抑制或沉默il1rl1基因表达的物质，优选的，所述的物质包括合成的小分子、化学试剂、反义寡核苷酸、siRNA、miRNA、核酶、多肽、蛋白质，优选的，所述的物质为siRNA，优选的，所述的siRNA包括如SEQ ID No.1-6所示的序列，优选的，所述的siRNA包括如SEQID No.3-4所示的序列。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的细胞因子包括IL-4、IL-10。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的试剂包括引物、探针或抗体，优选的，所述的产品包括试剂盒、芯片或试纸条。
10.一种非治疗目的的提高细胞凋亡水平的方法，其特征在于，所述的方法包括向细胞施用ST2蛋白抑制剂，优选的，所述的细胞为T淋巴细胞，优选的，所述的T淋巴细胞为H9细胞。
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