TW202033553A - 抗體，包含該抗體的套組，以及其用途 - Google Patents

Abstract

本揭示內容是關於一種新穎抗體，其可展現出對半乳醣凝集素-7 (galectin-7)的結合親和力及專一性。本揭示內容亦涵蓋有關用以治療一個體之乾癬或癌症的方法，所述方法是對該個體投予一種運用本發明抗-半乳醣凝集素-7抗體所篩選出的藥物。

Description

抗體，包含該抗體的套組，以及其用途

本揭示內容整體上是關於乾癬(psoriasis)及癌症治療的技術領域。具體來說，本揭示內容是關於一新穎抗體，以及其作為一篩藥平台的用途，用以篩選出一候選藥物(drug candidate)以治療乾癬或癌症。

半乳醣凝集素是屬於一種β-半乳糖苷-結合蛋白(beta-galactoside-binding protein)家族的成員，這類蛋白雖可以在細胞外被發現，可能具有調節有關細胞-細胞及細胞-基質之間的交互作用，但是由於主要位於細胞質中，也具有調節細胞內訊息傳遞，與調節免疫系統等生理功能。在完成人類、小鼠及大鼠基因體定序後，顯示出哺乳類的基因體中約有15種的半乳醣凝集素及類半乳醣凝集素(galectin-like)蛋白，並在不同物種之間具有些微差異。有充分證據顯示半乳醣凝集素在許多疾病的發病機制中起到作用，特別是與發炎或癌症相關的疾病。舉例來說，半乳醣凝集素-3(galectin-3)已是現今已確立的甲狀腺癌組織化學標記；半乳醣凝集素-1(galectin-1)經常被發現在低度分化的癌細胞中有過量表現；而半乳醣凝集素-9 (galectin-9)或其相關蛋白(例如，半乳醣凝集素-4 (galectin-4)及半乳醣凝集素-8 (galectin-8)等)則會在特定的癌症種類中有被誘發表現。

由LGALS7基因所編碼的人類半乳醣凝集素-7 (galectin-7)可在許多組織中發現到，例如，大腦皮質、大腸、肝臟、腎臟、睪丸、皮膚及淋巴結等，並且在皮膚中具有最高的半乳醣凝集素-7表現量。據此，可凸顯出可將人類半乳醣凝集素-7作為一種重要標記，以研究在該些組織中不同疾病的發病機制。

有鑑於此，相關領域亟需發展一種新穎藥物，藉以有效且安全地治療與半乳醣凝集素-7表現相關的疾病及/或病症。

下文呈現本揭示內容的簡單概要，以利讀者對本揭示內容有基本的理解。本概要並非對本揭示內容的廣泛性概觀，也非用以鑑別本揭示內容的關鍵性/決定性元件，或勾勒本揭示內容的範圍。它唯一的目的在於以一種簡化的形式呈現本揭示內容某些概念，作為後續呈現更多詳細說明的序幕。

本揭示內容的目的在於提供一種篩藥平台，以篩選出一候選藥物，藉以治療乾癬或其他由半乳醣凝集素-7異常表現所引起及/或與之相關的疾病(例如，癌症)。如本揭示內容中具體實施及廣泛描述的，本揭示內容之一態樣乃是關於一種抗體，或其片段作為所述用以篩選該候選藥物的篩藥平台。所述抗體包含一重鏈變異區(heavy chain variable (VH) region)及一輕鏈變異區(light chain variable (VL) region)，其中該VH區包含一第一重鏈互補性決定區(complementarity determining region)(CDR-H1)、一第二重鏈CDR (CDR-H2)，以及一第三重鏈CDR (CDR-H3)；且該VL區包含一第一輕鏈CDR (CDR-L1)、一第二輕鏈CDR (CDR-L2)，以及一第三輕鏈CDR (CDR-L3)。

依據本揭示內容的實施方式，所述CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：1、2及3的胺基酸序列，且所述CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：4，5及6的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該重鏈變異區與序列編號：7具有至少85％的序列相似度，且該輕鏈變異區與序列編號：8具有至少85％的序列相似度。較佳地，該重鏈變異區與序列編號：7具有至少90％的序列相似度，且該輕鏈變異區與序列編號：8具有至少90％的序列相似度。更佳地，該重鏈變異區與序列編號：7具有至少95％的序列相似度，且該輕鏈變異區與序列編號：8具有至少95％的序列相似度。依據一操作實施例，該重鏈變異區具有序列編號：7的胺基酸序列，且該輕鏈變異區具有序列編號：8的胺基酸序列。

本揭示內容亦涵蓋一種用以篩選一候選藥物的套組，所述候選藥物係用以治療一種與半乳醣凝集素-7相關的疾病。所述套組包含本揭示內容抗體，以及一藥學上可接受的載劑。

所述與半乳醣凝集素-7相關的疾病可以是癌症、發炎性疾病，或過敏症。依據本揭示內容的某些實施方式，所述與半乳醣凝集素-7相關的疾病是乾癬。依據本揭示內容的其他實施方式，所述與半乳醣凝集素-7相關的疾病是癌症。

本揭示內容之另一態樣是關於一種用以篩選一用於治療一個體之乾癬或癌症之候選藥物的方法。依據本揭示內容的實施方式，所述方法包含以下步驟： (a)    使角質細胞與一或多待測藥物(candidate drug)反應； (b)    利用本發明抗體或套組來檢測步驟(a)之角質細胞中半乳醣凝集素-7的表現量；以及 (c)     基於步驟(b)中所檢測到的表現量，由該一或多待測藥物中篩選出該候選藥物，其中該候選藥物會增加半乳醣凝集素-7的表現量。

依據某些實施方式，所篩選出的候選藥物是斯他汀(statin)。在較佳的實施例中，當該個體罹患乾癬時，所述斯他汀是氟伐他汀(fluvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)，或辛伐他汀(simvastatin)；而當該個體罹患癌症時，所述斯他汀是氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、匹伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀(lovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、普伐他汀(pravastatin)，或羅蘇伐他汀(rosuvastatin)。

本揭示內容之另一態樣是關於一藥學組合物，以及其於治療乾癬或癌症的用途。

本揭示內容之另一態樣是關於一種用以治療一個體之乾癬或癌症的方法，包含： (1)    藉由以下步驟篩選出一用於治療該乾癬或該癌症的候選藥物： (1a) 使角質細胞與一或多待測藥物反應； (1b) 利用本發明抗體或套組來檢測步驟(1a)之角質細胞中半乳醣凝集素-7的表現量；以及 (1c) 基於在步驟(1b)中所檢測到的表現量，由該一或多待測藥物中篩選出該候選藥物，其中該候選藥物會增加半乳醣凝集素-7的表現量；以及 (2)    對該個體投予一有效量之藥學組合物以治療該個體，其中該藥學組合物包含在步驟(1c)中所篩選出的候選藥物；以及一藥學上可接受的載劑。

依據某些實施方式，在步驟(1c)中所篩選出的候選藥物是斯他汀。在較佳的實施例中，當該個體罹患乾癬時，所述斯他汀是氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、匹伐他汀，或辛伐他汀；而當該個體罹患癌症時，所述斯他汀是氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、匹伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、普伐他汀，或羅蘇伐他汀。

當該個體罹患乾癬時，所述藥學組合物包含該些藉由上述本發明方法所篩選出的候選藥物，以及一TNF-α抑制劑；以及一藥學上可接受的載劑。在較佳的實施方式中，該些藉由本發明方法所篩選出的候選藥物是斯他汀，據此，所述藥學組合物包含該斯他汀、該TNF-α抑制劑；以及一藥學上可接受的載劑。所述斯他汀可以是氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、匹伐他汀，或辛伐他汀的任一種。所述TNF-α抑制劑可以是一抗-TNF-α抗體或一TNF-α拮抗劑。

當該個體罹患癌症時，所述藥學組合物包含該些藉由上述本發明方法所篩選出的候選藥物，以及一腎素血管張力素系統(renin-angiotensin system，Ras)抑制劑；以及一藥學上可接受的載劑。在較佳的實施方式中，該些藉由本發明方法所篩選出的候選藥物是斯他汀，據此，所述藥學組合物包含該斯他汀、該Ras抑制劑；以及一藥學上可接受的載劑。所述斯他汀可以是氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、匹伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、普伐他汀，或羅蘇伐他汀的任一種。所述Ras抑制劑可以是法尼基硫代水楊酸(farnesyl thiosalicylic acid，FTS)、ARS-853，或ARS-162。

依據某些實施方式，該些可藉由本發明藥學組合物及/或方法來治療的癌症包括，但不限於，膀胱癌(bladder cancer)、膽管癌(biliary tract cancer)、骨癌(bone cancer)、腦瘤(brain tumor)、乳癌(breast cancer)、子宮頸癌(cervical cancer)、大腸直腸癌(colorectal cancer)、惡性胚胎瘤(dysgerminoma)、食道癌(esophageal cancer)、上皮癌(epidermal cancer)、胃癌(gastric cancer)、胃腸道基質瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)、神經膠質瘤(glioma)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、頭頸癌(head and neck cancer)、腸癌(intestinal cancer)、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、肝癌(liver cancer)、肺癌(lung cancer)、淋巴瘤(lymphoma)、淋巴性白血病(lymphoid leukemia)、黑色素瘤(melanoma)、骨髓性白血病(myeloid leukemia)、鼻咽癌(nasopharyngeal cancer)、口腔癌(oral cancer)、卵巢癌(ovary cancer)、胰臟癌(pancreatic cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、視網膜母細胞瘤(retinoblastoma)、腎細胞癌(renal cell carcinoma)、肉瘤(sarcoma)、精細胞瘤(seminoma)、皮膚癌(skin cancer)、脾臟癌(spleen cancer)、鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma)、畸胎瘤(teratoma)、畸胎上皮癌(teratocarcinoma)、甲狀腺癌(thyroid cancer)，或甲狀腺濾泡癌(thyroid follicular cancer)。在某些實施方式中，該癌症是食道癌。在其他實施方式中，該癌症是肺癌。在再其他實施方式中，該癌症是口腔癌。在再又其他實施方式中，該癌症是皮膚癌。

在參閱以下的詳細說明及附隨圖式後，本揭示內容諸多伴隨的特徵及優點當可輕易瞭解。

為使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

I. 定義

為方便起見，本說明書、實施例及所附申請專利範圍中所使用的特定專有名詞集中在此。除非本說明書另有定義，此處所使用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。並且，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所使用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型，而所使用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。具體而言，在本說明書與申請專利範圍中，單數形式「一」(a及an)包括複數參考值，但依據上下文而另有指示者除外。此外，在本說明書與申請專利範圍中，「至少一」與「一或多」表述方式的意義相同，兩者都代表包含了一、二、三或更多。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所導致的標準偏差。並且，在此處，「約」(about)一詞通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10％、5％、1％或0.5％之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除實施例以外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如，用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他類似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將此等數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。

「抗體」(antibody)一詞是以最廣泛的意義來使用，具體涵蓋單株抗體(包括全長的單株抗體)、多株抗體、多重專一性抗體(例如，雙專一性抗體)及抗體片段，只要其展現出欲求的生物學活性即可。「抗體片段」(antibody fragments)包含全長抗體的一部分，通常是其抗原結合區或變異區。抗體片段的實例，包括Fab、Fab’、F(ab’)2及Fv片段；雙體(diabodies)；線性抗體(linear antibodies)；單鏈抗體分子；以及由抗體片段所形成的多重專一性抗體。

「抗體片段」(antibody fragment)僅包含完整抗體的一部分，其中所述部分保留該部分存在於完整抗體中時通常與之有關的至少一項功能且可保留大多數或所有功能。在一實施方式中，抗體片段包含完整抗體的抗原結合位點，並因此保留結合抗原的能力。在另一實施方式中，抗體片段，例如包含Fc區的抗體片段，保留與所述Fc區存在於完整抗體中時通常與之有關的至少一項生物學功能，例如，新生兒Fc受體(neonatal Fc receptor，FcRn)結合、抗體半衰期調控、抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)功能，以及補體結合。在一實施方式中，抗體片段是一單價抗體，其在活體中的半衰期實質上與一完整抗體相似。舉例來說，這類抗體片段可包含一連結至Fc序列的抗原結合臂，所述Fc序列能夠提供所述抗體片段於活體中的穩定性。本發明抗體片段可以是不同形式，例如包括，變異片段(variable fragment、Fv)、單鏈變異片段(single-chain variable fragment，scFv)、抗原結合片段(Fab)及F(ab)₂ ，以及單鏈抗體(single chain antibodies)。

抗體的「變異區」(variable region)或「變異域」(variable domain)一詞是指該抗體之重鏈或輕鏈的胺端(amino-terminal)域。該些域通常是抗體中具有最多變異的部位，並含有抗原結合位點。

「變異的」(variable)一詞是指變異域中的某些部分在不同抗體之間其序列具有廣泛差異，並用於各特定抗體對其特定抗原的結合及專一性的事實。然而，變異性並非均勻分佈於抗體的整個變異域。其集中於輕鏈及重鏈變異區中稱為互補性決定區(complementarity-determining region，CDR)或高度變異區(hypervariable region)的三個區段。變異域中更高度保守的部分稱為框架區(framework，FR)。天然的重鏈及輕鏈變異域各包含四個FR區，其大多採取β-褶板構形，藉由三個CDR形成環狀連接，且在某些情形下會形成β-褶板結構的一部分。各鏈中的CDR藉由FR區在附近緊靠在一起，並與另一條鏈的CDR—起形成抗體的抗原結合位點(參見Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991))。恆定域不直接參與抗體與抗原的結合，但展現出多種效應器的功能，例如抗體參與在抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular toxicity)中的效應。

此處所使用之「互補性決定區」(complementarity determining region，CDR)一詞是指一抗體分子的高度變異區，其會形成一種與所結合之抗原的3維表面互補的表面。自N端往C端前進，各抗體的重鏈及輕鏈包含三個CDR(CDR1、CDR2及CDR3)。因此，一HLA-DR抗原結合位點，包括總共六個CDR，包含來自重鏈變異區的三個CDR，以及來自輕鏈變異區的三個CDR。

依據其重鏈恆定區的胺基酸序列，抗體(免疫球蛋白)可分為不同的類型。主要有五類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中一些更可進一步分成亞型(同種型(isotypes))，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgA2。對應於不同類型免疫球蛋白的重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同類型免疫球蛋白的次單位結構及三維構形為本領域人員所熟知，以及例如記載於Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000)。抗體可以是大型融合分子的一部分，其由該抗體以共價或非共價方式與一或多種其他蛋白或胜肽締合所形成。

如在本文中所討論的，在抗體或免疫球蛋白分子的胺基酸序列中的些微變異視為涵蓋在本發明所揭示及主張的發明概念中，條件是胺基酸序列中的變異維持在至少85％的序列相似度，例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％及99％的序列相似度。本揭示內容抗體可經由特定修飾以改變胜肽特徵而不影響其生理活性。舉例來說，某些胺基酸經改變及/或刪除後，不會影響本揭示內容抗體的生理活性(即，其用於治療及/或預防乾癬或癌症的功效)。具體來說，胺基酸的保守性置換是可預期的。所述保守性置換是指發生在同一胺基酸家族(具有關聯性的胺基酸側鏈)內的置換。編碼的胺基酸通常分為下列家族：(1)酸性胺基酸=天冬胺酸(aspartate)、麩胺酸(glutamate)；(2)鹼性胺基酸=離胺酸(lysine)、精胺酸(arginine)、組胺酸(histidine)；(3)非極性胺基酸=丙胺酸(alanine)、纈胺酸(valine)、白胺酸(leucine)、異白胺酸(isoleucine)、脯胺酸(proline)、苯丙胺酸(phenylalanine)、甲硫胺酸(methionine)、色胺酸(tryptophan)；以及(4)未帶電極性胺基酸=甘胺酸(glycine)、天冬醯胺酸(asparagine)、麩醯胺酸(glutamine)、半胱胺酸(cysteine)、絲胺酸(serine)、酥胺酸(threonine)、酪胺酸(tyrosine)。較佳的家族分類為：絲胺酸(S)及酥胺酸(T)為脂肪族羥基族(aliphatic-hydroxy family)；天冬醯胺酸(N)及麩醯胺酸(Q)為含醯胺族(amide-containing family)；丙胺酸(A)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)及異白胺酸(I)為脂肪族(aliphatic family)；以及苯丙胺酸(F)、色胺酸(W)及酪胺酸(Y)為芳香族(aromatic family)。舉例來說，可合理預期將白胺酸(L)置換成異白胺酸(I)或纈胺酸(V)，將天冬胺酸(D)置換成麩胺酸(E)，將酥胺酸(T)置換成絲胺酸(S)，或是將一胺基酸置換成一相關結構的胺基酸，此種置換不會對胺基酸分子的結合或其特性產生重大影響，特別是當所述置換並未包含胺基酸的框架區(framework site)時。可藉由分析胜肽衍生物的特定活性，確認胺基酸的改變是否影響一功能性胜肽。所屬技術領域中的普通技術人員可製備抗體的片段或類似物。較佳的片段或衍生物之胺端或羧端出現於功能域(functional domains)附近。在一實施例中，本發明抗體中的一個胺基酸殘基(例如，纈胺酸(V))發生保守性置換(例如，置換成白胺酸(L))。在其他實施例中，本發明抗體中的兩個胺基酸殘基被保守性置換成其他適當的胺基酸殘基，舉例來說，纈胺酸(V)及精胺酸(R)分別置換成一對胺基酸包括，但不限於，甲硫胺酸(M)及離胺酸(K)、離胺酸(K)及脯胺酸(P)、色胺酸(W)及異白胺酸(I)、異白胺酸(I)及脯胺酸(P)、天冬醯胺酸(N)及纈胺酸(V)，以及麩醯胺酸(G)及離胺酸(K)。

「序列相似度百分比(％)」(percentage (%) sequence identity)一詞是指候選胜肽序列的胺基酸殘基與特定胜肽序列的胺基酸殘基的一致性百分比；在比對時，是比對複數條序列，並視需要而引入間隙(gap)，藉以達到序列相似度的最大百分比，且不考慮任何保守性置換(conservative substitution)作為序列相似度的一部分。可利用各種本領域技術人員所熟知的方法來比對，並確認序列相似度百分比，舉例來說，可利用例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)等公開的電腦軟體來比對。本領域技術人員可決定測量比對的適當參數，包括任一種所需的演算法以利所比對的全長序列達到最大比對值。為達此目的，二條胺基酸序列之間的序列比對是利用國家生物技術訊息中心(Nation Center for Biotechnology Information，NCBI)於線上提供的電腦軟體Blastp(蛋白-蛋白BLAST)來分析。一特定胺基酸序列A與一特定胺基酸序列B之間的胺基酸序列相似度百分比(或說是一特定胺基酸序列A具有與一特定胺基酸序列B之某％的胺基酸序列相同度)是利用下列公式來計算：

其中X是胺基酸殘基數，其是藉由序列比對程式BLAST在比對A及B後得出一致性匹配數，而Y則是A或B序列中(取較短者)的胺基酸殘基總數。

「藥學上可接受的」(pharmaceutically acceptable)一詞是指「通常認為安全」(generally regarded as safe)的分子實體及組合物，例如，其是生理學上可耐受的，並且在投予至人類時，一般不產生過敏反應或類似的不良反應，例如反胃、頭暈等。較佳地，在此使用之「藥學上可接受的」一詞是指由聯邦政府或者州政府的管理機構所批准或是列於美國藥典或者其它普遍承認的藥典中，以用於動物，特別是用於人類。

在本揭示內容中，「癌症」(cancer)及「腫瘤」(tumor)一詞可交替使用，並且較佳地是指一在哺乳動物(特別是人類)之生理環境中，其特徵為細胞生長上升。癌症在此包括轉移癌(metastatic cancer)，及/或抗藥性癌症(drug-resistant cancer)。

II. 發明詳述

本揭示內容的目的在於提供一種新穎抗體或其片段，其可展現出對半乳醣凝集素-7的結合親和力及/或專一性，據以作為一種篩藥平台以篩選出一用於治療半乳醣凝集素-7相關疾病(例如，乾癬)的候選藥物。

(i) 抗 - 半乳醣凝集素 -7 抗體

為製備本發明抗體的目的，可利用常用方法來製備多肽(即，半乳醣凝集素-7或其片段作為抗原)，例如，加上α-胺基團之叔丁氧基羰基(tert-butyloxycarbonyl，t-BOC)，或芴甲氧羰基(fluorenylmethyloxycarbonyl，FMOC)保護基之合成方法。兩種合成方法皆是藉由將單一胺基酸以加至由胜肽C端起始的各步驟中的方式按步合成。本發明胜肽亦可由公知的固相胜肽合成法(solid phase peptide synthesis method)來製備。

接著，可藉由使一宿主動物(例如，小鼠、大鼠或兔)免疫該合成多肽來製備抗體。可依常規流程進行免疫。免疫的時程並無特別限制。免疫的時程可以是數天至數週的期間(較佳是每週)並進行2至10次，直到達到欲求的抗體效價。舉例來說，宿主動物可經由皮下注射接種合成多肽，並以每週為基礎連續施打8週。

在最終免疫後，移除脾臟細胞及區域淋巴結。在開始免疫後即須定期採集血液樣本，並離心以分離出血清。接著，將所得血清以適當方法測量抗體效價，所述方法包括，但不限於，酵素結合免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、酵素免疫測定法(enzyme immunoassay，EIA)或放射免疫測定法(radio immunoassay，RIA)。在一較佳實施例中，抗體效價是以ELISA測量。接著，對該些對合成多肽產生高抗體效價的動物給予最終免疫。自已經免疫的動物脾臟細胞或區域淋巴結等製備抗體生產(antibody-producing)細胞。在製備抗體生產細胞時，盡可能將組織碎片及紅血球移除。可利用市售的紅血球去除劑(erythrocyte remover)來達此目的。或者是，可製備及使用氯化銨(ammonium chloride)及Tris緩衝液。立即將上述製成的抗體生產細胞與不朽細胞(例如，骨髓瘤細胞(myeloma cell))融合以製備融合瘤細胞(hybridoma cell)，其可半永久地(semi-eternally)持續增生，同時產生抗體。可使用來自動物(例如，小鼠)的常用細胞株。可用於本發明的較佳細胞株應當無法存活於HAT選擇性培養液中，其成分包含次黃嘌呤(hypoxanthine)、胸苷(thymidine)及氨喋呤(aminopterin)；但當所述細胞與可生產抗體的細胞融合後，則應可存活於該培養液中。骨髓瘤細胞的實例包括，但不限於，小鼠骨髓瘤細胞株(mouse myeloma cell line)，例如骨髓瘤FO細胞(myeloma FO cell)、人類骨髓瘤細胞株(例如，Karpas 707H)。通常是藉由將脾臟細胞或淋巴結細胞與一市售的骨髓瘤細胞混合，並在一細胞融合促進劑中來進行細胞融合，其中所述細胞融合促進劑可以是例如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，具有200至20,000道耳吞(dalton)等的平均分子量。或者是，可利用市售的細胞融合裝置來進行細胞融合，其中所述細胞融合裝置是利用電流刺激的原理，例如，電穿孔(electroporation)。待細胞融合後，將所得細胞稀釋並培養在HAT培養基中。

接著，由該些融合細胞中選出特定的融合瘤。該些可存活於HAT培養基中的融合細胞會形成群落(colonies)。接著收集各培養孔的上清液，並檢測其存在或不存在對本發明多肽的抗體效價。可利用ELISA、EIA或RIA等作為確認方法。一旦找出抗體效價呈陽性的培養孔，將該細胞培養於HT培養基(不含氨喋呤)中。經過一段時間培養，再次確認其上清液的抗體效價。將最後選出的細胞進行選殖以獲得單一細胞群落。篩選出對本發明多肽展現出高度專一性的選殖株，並使其增生至一定程度以建立融合瘤。

可藉由任何已知方法來分離或製備以融合瘤所製備的單株抗體。舉例來說，可以將融合瘤細胞株培養於低血清濃度的培養液中，再由該培養的上清液來製備抗體。或者是，將融合瘤細胞株注射至動物的腹腔，收集腹水來製備抗體。可藉由任何方法來純化或分離抗體，所述方法包含應用親和性管柱、膠濾層析法、離子交換層析法等相關技術。可適當選擇並組合使用任何已知方法。

以此製備的抗體包含一VH區及一VL區，其中該VH區包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，且該VL區包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。

依據本揭示內容的某些實施方式，本發明抗體是衍生自一融合瘤選殖株8F4B11，並因此命名該抗體為8F4B11。在該些實施方式中，抗體8F4B11的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：1、2及3的胺基酸序列；且抗體8F4B11的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：4、5及6的胺基酸序列。

較佳地，抗體8F4B11的VH區與序列編號：7具有至少85％(即，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列相似度，且抗體8F4B11的VH區與序列編號：8具有至少85％(即，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列相似度。當可理解，VL及VH區的框架區序列可具有變異(例如，置換成保守性或非保守性的胺基酸殘基)而不會影響本發明抗體的結合親和力及/或專一性。較佳地，框架區的序列是被保守性置換成一或多種具有相似特性的適當胺基酸；舉例來說，將白胺酸(一種非極性胺基酸殘基)置換成異白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸或色胺酸(另一種非極性胺基酸殘基)；將天冬胺酸(一種酸性胺基酸殘基)置換成麩胺酸(另一種酸性胺基酸殘基)；或是將離胺酸(一種鹼性胺基酸殘基)置換成精胺酸或組胺酸(另一種鹼性胺基酸殘基)。更佳地，抗體8F4B11的VH及VL區分別與序列編號：7及序列編號：8具有至少90％的序列相似度。最佳地，抗體8F4B11的VH及VL區分別與序列編號：7及序列編號：8具有至少95％的序列相似度。在一特定的實施方式中，抗體8F4B11的VH及VL區分別具有序列編號：7及序列編號：8的胺基酸序列。

依據本揭示內容的某些實施方式，本發明抗體是衍生自一融合瘤選殖株7B12F11，並因此命名該抗體為7B12F11。

或者是，本發明抗體(即，抗體8F4B11或7B12F11)可藉由DNA選殖來製備。可容易地將編碼本發明抗體的DNA分離並序列利用常規步驟來定序，所述常規步驟例如利用能夠專一性結合至編碼本發明抗體重鏈及輕鏈基因的寡核苷酸探針。所述融合瘤細胞可作為這類DNA的較佳來源。一旦分離後，可將DNA置入表現載體中，接著將其轉染至宿主細胞例如E. Coli 細胞、類人猿(simian)COS細胞、中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞，或骨髓瘤細胞中，所述宿主細胞不會製造免疫球蛋白，據此可藉由重組宿主細胞來合成欲求的抗體。

在某些實施例中，抗體8F4B11的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別由序列編號：9、10及11的核苷酸序列所編碼，且抗體8F4B11的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別由序列編號：12，13及14的核苷酸序列所編碼。在一操作實施方式中，抗體8F4B11的VH及VL區分別由序列編號：15及16的核苷酸序列所編碼。所有的簡併核苷酸序列(degenerate nucleotide sequence)是涵蓋在本發明的範圍內，只要由該核苷酸序列所編碼的本發明胜肽/多肽/蛋白(例如，本發明CDR、VH區或VL區)保有欲求的活性或功能即可。「簡併核苷酸序列」一詞表示一種包括一或多種簡併密碼的核苷酸序列(相較於編碼一多肽的參考性多核苷酸分子)。簡併密碼可含有不同三聯體(triplet)的核苷酸，但編碼相同的胺基酸殘基(即，各編碼冬胺酸(Asp)的GAU及GAC三聯體)。

依據不同用途，本發明抗體或編碼該抗體的DNA可用於製備嵌合抗體(chimeric antibodies)(例如，雙專一性抗體)、人源化(或人類化)抗體，及/或其衍生的抗體片段。

(ii) 包含抗 - 半乳醣凝集素 -7 抗體的套組

依據本揭示內容的某些實施方式，相較於控制組(即，沒有任何乾癬症狀的健康皮膚)，乾癬皮膚病灶中半乳醣凝集素-7的表現量下降；因此該些會增強半乳醣凝集素-7表現的藥劑有潛力作為一種治療乾癬或癌症的手段。基於上述發現，本揭示內容之第二態樣乃是關於一種作為一篩藥平台的套組，其用以篩選乾癬或癌症藥物。本發明套組包含如本揭示內容第(I)章節所述的抗體，以及一藥學上可接受的載劑。

藥學上可接受的載劑可以是一溶劑、分散劑、抗菌劑、抗真菌劑、等滲劑，或其他生理學上可相容的藥劑。適用於本發明套組中的藥學上可接受的載劑實例包括，但不限於，水、食鹽水、磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline，PBS)、tris-緩衝液(tris-buffered saline，TBS)、甘油、乙醇及其組合。所述藥學上可接受的載劑可更包含少量的添加物，例如，潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩衝液，以增強抗體或其抗原-結合部分的穩定性或有效性。

實務上，本發明套組的抗體可作為一種檢測抗體以檢測半乳醣凝集素-7的表現。取決於不同的目的，本發明套組可更包含一專一對抗半乳醣凝集素-7的第二抗體、一阻斷劑(即，所述藥劑用於阻斷半乳醣凝集素-7與抗-半乳醣凝集素-7抗體之間的非專一性結合)，及/或一與抗-小鼠抗體偶聯的報導分子。舉例來說，當一樣本中半乳醣凝集素-7的表現量是藉由本發明套組，並經西方墨點法、流式細胞術、免疫化學測定法，或免疫螢光測定法所檢測時，則本發明套組可包含本發明抗體作為該用以檢測半乳醣凝集素-7的第一抗體，而與報導分子偶聯的抗-小鼠抗體則作為該用以檢測該第一抗體(即，本發明抗體)的第二抗體，以及可任選使用該阻斷劑。或者是，當本發明套組用於經ELISA檢測半乳醣凝集素-7表現量時，則其可包含本發明抗體作為捕捉抗體或檢測抗體，而抗-半乳醣凝集素-7的第二抗體則作為檢測抗體(當本發明抗體作為該捕捉抗體時)或捕捉抗體(當本發明抗體作為該檢測抗體時)，以及可任選使用該阻斷劑。

當可理解，除了乾癬以外，本揭示內容套組也可用於篩選一用於治療其他發炎性疾病(例如，硬化性苔藓症(lichen sclerosus)、異位性皮膚炎(atopic dermatitis)，或炎症性腸病(inflammatory bowel disease))，或與半乳醣凝集素-7之異常表現(例如，上升或下降)相關，及/或由其所引起的疾病(例如，過敏症)的候選藥物。

(iii) 本發明抗體或套組於篩選出一候選藥物的用途

本揭示內容之第三態樣是關於本發明抗體或套組，依據本揭示內容之任一種態樣或實施方式於篩選一用於治療一半乳醣凝集素-7相關疾病(例如，癌症、發炎性疾病(例如，乾癬)，或過敏症)之候選藥物的用途。

依據某些實施方式，所述用以篩選一用於治療一個體之乾癬或癌症之候選藥物的方法包含以下步驟： (a)    使角質細胞與一或多待測藥物反應； (b)    利用本發明抗體或套組來檢測步驟(a)之角質細胞中半乳醣凝集素-7的表現量；以及 (c)     基於步驟(b)中所檢測到的表現量，由該一或多待測藥物中篩選出該候選藥物，其中該候選藥物會增加半乳醣凝集素-7的表現量。

在步驟(a)中，角質細胞是以一或多種待測藥物處理一段時間。依據本揭示內容的一實施方式，所述角質細胞是不朽的(immortalized)角質細胞。依據本揭示內容的另一實施方式，所述角質細胞是初生的(primary)新生兒表皮角質細胞。

之後，步驟(a)之角質細胞中半乳醣凝集素-7的表現量是以步驟(b)中所述的本發明抗體或套組來檢測。為檢測在角質細胞中半乳醣凝集素-7的表現量的目的，首先將角質細胞以本領域技術人員所熟知的方法來裂解(lysed)，例如，凍溶法(freezing and thawing)、音波振動處理、加壓處理、酵素處理、清潔劑處理，或併用該些方法。接著將細胞溶胞物中的蛋白以本發明套組或抗體，並經適當的測定法來定量，例如，ELISA、西方墨點法，或流式細胞術。

或者是，已知半乳醣凝集素-7可被釋出至培養基中。因此，半乳醣凝集素-7的表現量是可直接收集培養基上清液，後續以本發明套組或抗體並經適當的測定法測量來定量。

如上文所述，相較於健康皮膚，乾癬中半乳醣凝集素-7的表現量下降，而該些會增強半乳醣凝集素-7表現的藥劑可用於治療乾癬。類似地概念，相較於非惡性的對應部分，癌症中半乳醣凝集素-7的表現量下降，而該些會增強半乳醣凝集素-7表現的藥劑可用於治療這類癌症。據此，基於步驟(b)的定量結果，如步驟(c)中所述，本領域技術人員可篩選出一適當的候選藥物以治療乾癬或癌症，其中所篩選出的候選藥物會增加半乳醣凝集素-7的表現量。

在某些實施例中，所篩選出的候選藥物是斯他汀，例如，將氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、匹伐他汀，或辛伐他汀用於治療乾癬，而將氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、匹伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、普伐他汀，或羅蘇伐他汀用於治療癌症。較佳地，所篩選出的候選藥物是氟伐他汀。

本發明方法可應用於篩選一用於治療其他半乳醣凝集素-7相關疾病(例如，過敏症)的候選藥物。

(iv) 藥學組合物及其用途

本揭示內容之第四態樣是關於一種用以治療乾癬或癌症的藥學組合物。本發明藥學組合物包含該些以上述本發明方法所篩選出的候選藥物；以及一藥學上可接受的載劑。在某些實施方式中，所篩選出的候選藥物是斯他汀，包括，但不限於，氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、匹伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、普伐他汀，以及羅蘇伐他汀。較佳地，所篩選出的候選藥物是氟伐他汀。

當個體罹患乾癬時，所述藥學組合物可更包含一TNF-α抑制劑，其可以是一抗-TNF-α抗體或一TNF-α拮抗劑。依據本揭示內容的某些實施方式，投予該斯他汀及該TNF-α抑制劑可經由增強半乳醣凝集素-7的表現來展現出治療乾癬的功效。在該些實施方式中，該斯他汀及該TNF-α抑制劑可加成或協同改善或緩解該些與乾癬相關的症狀。

當個體罹患癌症時，則所述藥學組合物可更包含一Ras抑制劑，其可以是法尼基硫代水楊酸(FTS)、ARS-853或ARS-162。依據本揭示內容的其他實施方式，投予該斯他汀及該Ras抑制劑可經由增強半乳醣凝集素-7的表現來展現出治療癌症的功效。在該些實施方式中，該斯他汀及該Ras抑制劑可加成地或協同地改善或緩解該些與癌症相關的症狀。

可藉由本發明藥學組合物及/或方法來治療的例示性癌症或腫瘤包括，但不限於，膀胱癌、膽管癌、骨癌、腦瘤、乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、惡性胚胎瘤、食道癌、上皮癌、胃癌、胃腸道基質瘤(GIST)、神經膠質瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、頭頸癌、腸癌、卡波西氏肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、淋巴性白血病、黑色素瘤、骨髓性白血病、鼻咽癌、口腔癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、腎細胞癌、肉瘤、精細胞瘤、皮膚癌、脾臟癌、鱗狀細胞癌、畸胎瘤、畸胎上皮癌、甲狀腺癌，以及甲狀腺濾泡癌。

據此，本發明方法包含對一有需要之個體投予一有效量之本發明藥學組合物。

所述個體是一哺乳類動物，包括大鼠、小鼠、人類、豬、猴子、山羊、綿羊、馬、貓，以及狗。較佳地，所述個體是人類。

下文提出多個實施例來說明本揭示內容的某些態樣，以利本發明所屬領域技術具有通常知識者實踐本發明。不應將此等實施例視為對本發明範圍的限制。據信本發明所屬領域技術具有通常知識者在閱讀此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本揭示內容。本文引用的所有公開文獻在此藉由引用而併入全文。

實施例

材料及方法

人類皮膚組織樣本

依據中山醫學大學人體試驗委員會所核准的實驗流程以及知情同意表，自乾癬病患(n = 27)及健康志願者(n = 75)取得人類皮膚組織。尋常型乾癬(psoriasis vulgaris)病患是已經接受臨床及組織病理準則的診斷，並排除該些已接受系統性療法的病患。人類組織樣本的分析已經中央研究院(臺灣)的人體試驗委員會所核准。

半乳醣凝集素 -7 的 IHC 定量

以電腦輔助方法進行免疫組織化學染色的定量。在100×放大倍率視野下檢驗組織切片(區域大小為1.5平方毫米)。篩選出各視野下的表皮區域，並以軟體定量表皮區域中各像素的半乳醣凝集素-7染色強度。為計算各皮膚切片中半乳醣凝集素-7染色的平均強度，將半乳醣凝集素-7染色強度除以表皮區域大小。所有的健康控制組(n = 75)及乾癬病患(n = 27)組織切片皆予以分析。

小鼠

將胚胎幹細胞株EPD0327_3_B05經由歐洲條件式小鼠突變誘發計畫(European Conditional Mouse Mutagenesis Program，EUCOMM)來製備具有C57BL/6背景的半乳醣凝集素-7^+/– 小鼠，並自維康桑格研究所(Wellcome Trust Sanger Institute)(劍橋，英國)取得之。所有的動物實驗是在無特定病原(specific pathogen-free)的設施中進行，並遵循生物醫學研究所實驗動物照護及使用委員會(中央研究院，臺北，臺灣)所核准的指導原則來操作。

角質細胞培養及製備敲落半乳醣凝集素 -7 的細胞

在37°C下，將人類角質細胞株HaCaT培養在達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)中，並補充10％之胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、2毫體積莫耳濃度之麩醯胺酸、100單位/毫升之青黴素及100微克/毫升之鏈黴素。自國家RNAi核心設施(中央研究院分子生物研究所及基因體研究中心，由科技部國家核心設施計畫生物技術經費所支持)取得小髮夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)試劑。四種shRNA(選殖株ID為TRCN0000057393、TRCN0000057394、TRCN0000057395及TRCN0000057396)用於製備穩定敲落半乳醣凝集素-7的HaCaT選殖株。將HaCaT細胞各別感染四種表現shRNA的慢病毒，並在感染3天後及施用嘌黴素(puromycin)以篩選出穩定的細胞選殖株。在以嘌黴素篩選後，將四種匯總的(pooled)選殖株個別培養在不含嘌黴素培養基中2週，接著進行進一步的分析。

自Gibco購買初生的新生兒人類表皮角質細胞(HEKn細胞)。在37°C下，將HEKn細胞培養在無血清的角質細胞培養基(keratinocyte serum-free medium，K-SFM)中，並補充相同廠商的30微克/毫升之牛腦下垂體萃取物及5奈克/毫升之重組人類表皮生長因子。相較於HaCaT細胞，HEKn細胞的增生能力有限，因此不適用於建立shRNA的穩定敲落細胞；因此，以短小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)寡核苷酸來暫時敲落半乳醣凝集素-7的表現。自Invitrogen購買SILENCER^® 篩選siRNA，包括負控制組#1，以及預先設計會標的至人類半乳醣凝集素-7的siRNA(型號：s230574，其會標的至NM_002307.3第3外顯子的序列)。依LIPOFECTAMINE 2000試劑的使用說明，在6孔盤的實驗安排中，將30皮莫耳之siRNA遞送至HEKn細胞中。

測量細胞激素的產量

為測量角質細胞所分泌的促炎性細胞激素濃度，將2×10⁴ 個細胞種在96孔盤中。使細胞生長24小時，接著在37°C下，以50微克/毫升之LPS、100奈克/毫升之人類TNF-α、100或200奈克/毫升之人類IL-17A、200奈克/毫升之人類IL-22、100奈克/毫升之人類IL-23，或50奈克/毫升之IFN-γ處理48小時。此外，將MEK抑制劑PD98059加至LPS或IL-17A所刺激的細胞中(48小時)。接著收集上清液並以ELISA分析，其中ELISA分析是利用成對抗體的特定組合(捕捉抗體及檢測抗體)來進行。

免疫墨點分析

採集細胞，以RIPA裂解液(包含1％之TRITON X-100及蛋白酶抑制劑混合物)裂解，並以蛋白測定套組測量總蛋白濃度。將溶胞物樣本中的蛋白(使具有相同量的總蛋白)以十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離，並以免疫墨點法分析。將抗-磷酸化的Erk1(pT202)/抗-磷酸化的Erk2(pT185)、抗-Erk1、抗-Erk2、抗-NF-κB p65、抗-磷酸化的NF-κB p65(pS536)、抗-IκBα、抗-磷酸化的IκBαpS32、β-actin，或抗-GAPDH的初級抗體用於檢測對應蛋白。接著使山葵過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)所偶聯的抗-小鼠、兔或山羊IgG二級抗體與膜反應，以及以化學發光(chemiluminescence)並依據使用說明來檢測蛋白。以軟體進行蛋白定量。

即時定量 RT-PCR(RT-qPCR)

將培養的細胞或小鼠耳部以TRIzol試劑萃取總RNA(包括mRNA及miRNA)。為測量人類半乳醣凝集素-7、IL-6、IL-8、IL-17A及IFN-γ的表現量，以cDNA合成套組將mRNA反轉錄成cDNA，並以會標的至人類半乳醣凝集素-7、IL-6及IL-8的專一性探針與附隨的引子並依據使用說明，來進行即時定量PCR。

為定量miR-146a，將總RNA樣本轉成cDNA，並以會標的至miR-146a的專一性引子進行即時定量PCR。選取人類GAPDH及U6的snRNA作為內部控制組以分別校正mRNA及miRNA的表現量。計算mRNA及miRNA的相對量，並以ΔΔCt法並與只有載體的控制組細胞比較來獲得倍數變化。

IL-23 所誘發的乾癬模式

本研究使用IL-23所誘發的小鼠類乾癬(psoriasis-like)模式。每隔一天以胰島素注射器進行皮內注射重組IL-23(1微克)(或PBS，作為控制組)至麻醉的小鼠右耳部，共持續16天。在皮內注射之前及之後測量耳部厚度，並利用攜帶式厚度儀測量耳部的中心位置。之後將小鼠安樂死，收集其耳部，以及將其中一半的耳部包埋在石蠟中以進行H&E、免疫組織化學及原位雜交法染色，而將另一半的耳部萃取RNA，並藉由RT-qPCR分析細胞激素及miRNA趨勢。

為研究斯他汀在本小鼠乾癬模式中的效應，利用口部胃管灌食法將30毫克/公斤/天之氟伐他汀或普伐他汀投予至小鼠14天。以食鹽水作為控制組。將實驗組設計並安排為PBS(n=2)、IL-23(n=3)、PBS+食鹽水(n=5)、IL-23+食鹽水(n=5)、PBS+氟伐他汀(n=3)、IL-23+氟伐他汀(n=4)、PBS+普伐他汀(n=4)、IL-23+普伐他汀(n=4)。以上文所述步驟來測量耳部厚度。在第15天，將小鼠安樂死，收集其耳部，以及將其中一半的耳部包埋在石蠟中以進行H&E染色、免疫組織化學染色，以及將另一半的耳部萃取RNA以分析半乳醣凝集素-7的表現。

動物實驗的實驗流程已經中央研究院實驗動物照護及使用委員會所評估並核准。

組織學及免疫組織化學

製備石蠟包埋的小鼠耳部切片並以H&E染色。在免疫組織化學染色的部分，將5微米厚的切片以4％之聚甲醛(paraformaldehyde)固定的小鼠耳部或人類皮膚進行脫蠟，並以蒸餾水復水。在98°C下，在檸檬酸緩衝液中反應10分鐘以進行熱誘發的表位回收(heat-induced epitope retrieval)，並以3％之H₂ O₂ (在PBS中)處理5分鐘去除內源性過氧化酶。之後，利用2.5％之馬血清來阻斷非專一性結合至組織切片並作用1小時。使切片與一山羊抗-半乳醣凝集素-7抗體(初級抗體)作用1小時，以檢測小鼠及人類皮膚兩者中的半乳醣凝集素-7。在以PBS清洗後，使組織切片與一聚合物HRP偶聯的馬抗-山羊IgG抗體(二級抗體)作用30分鐘。以過氧化酶基質套組檢測半乳醣凝集素-7的染色反應，並以3,3’-二胺基聯苯胺(3,3’-diaminobenzidine，DAB)色原質顯影，其陽性訊號為紅褐色沉澱物。將切片以蘇木精進行對比染色以檢測細胞核。

MiRNA 原位雜交法

依據使用說明來設計以LNA所修飾，並以長葉毛地黃配質(digoxigenin，DIG)-標定之與人類miR-146a互補的DNA探針，以用於小鼠及人類皮膚切片原位雜交法中。以亂碼序列miRNA探針作為負控制組，並以與U6 snRNA互補的探針作為正控制組。將所有的切片以二甲苯脫蠟，並在一系列之階梯濃度的乙醇溶液中復水。在試劑穿透的部分，在37°C下，將切片進行蛋白酶K(5-10微克/毫升)分解5分鐘，接著以4％之聚甲醛(在PBS中)處理15分鐘，並在50°C下，以預雜交溶液作用3-4小時。在53°C下，將組織樣本與專一性探針雜交過夜。將切片以一系列稀釋之SSC緩衝液清洗後，以與鹼性磷酸酶偶聯的抗-DIG抗體進行免疫學檢測。基於硝基氯化四氮唑藍(nitro blue tetrazolium chloride)/5-溴基-4-氯基-3-吲哚基磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)基質的反應來獲得檢測訊號，接著以核固紅(nuclear fast red)將細胞核進行對比染色。

抗體及化合物

可自各廠商購得吉非替尼(型號：G304000，Toronto Research Chemicals)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)抑制劑(型號：324674，Merck)、法尼基硫代水楊酸(FTS)(型號：10010501，Cayman)、山羊抗-半乳醣凝集素-7抗體(Novagen)、兔抗-磷酸化的EGFR抗體(Tyr1068)(型號：2234，Cell Signaling Technology)、兔抗-磷酸化的ERK抗體(型號：4370，Cell Signaling Technology)、兔抗-CDH1抗體(型號：3195，Cell Signaling Technology)、兔抗-VIM抗體(型號：5741，Cell Signaling Technology)、兔抗-EGFR抗體(型號：1902，Epitomics)，以及兔抗-磷酸化的Akt抗體(型號：2118，Epitomics)等。

癌細胞培養，以及製備過量表現、敲落及剔除半乳醣凝集素 -7 的穩定細胞

自楊泮池博士(國立臺灣大學，臺灣)獲得CL83、CL141、CL100、CL25、PC9、PC9-IR、CL97、H1975及H3255細胞，並自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)購買A-431(ATCC^® CRL-1555™)，H1650(ATCC^® CRL-5883™)及HCC827(ATCC^® CRL-2868™)細胞。將細胞培養在RPMI 1640培養基中，並補充10％之胎牛血清(Gibco)。以常規方法(例如，以本文所述的方法)製備A549、H23、H226BR、H358、H460、H661、H928、H1299、H1435及H1437細胞的mRNA。

將野生型半乳醣凝集素-7選殖至pEGFP-N1及p3×FLAG-CMV-14表現載體中。利用上文所述之jetPRIME轉染試劑(Polyplus)，將控制組及編碼半乳醣凝集素-7的質體轉染至肺癌細胞株中。在轉染後，利用G418來篩選出穩定的細胞選殖株。在以G418篩選後，可獲得過量表現半乳醣凝集素-7的細胞選殖株。將過量表現半乳醣凝集素-7的細胞選殖株培養在不含G418的RPMI 1640培養基中2週，接著進行進一步的分析。

如上文所述，利用由慢病毒所編碼的抗人類半乳醣凝集素-7(ID為TRCN0000057393、TRCN0000057394、TRCN0000057395及TRCN0000057396小髮夾RNA(shRNA)來製備穩定敲落半乳醣凝集素-7的肺癌細胞選殖株。在以攜帶shRNA的慢病毒感染3天後，給予嘌黴素以篩選出穩定的細胞選殖株。在以嘌黴素篩選後，可獲得敲落半乳醣凝集素-7的細胞選殖株。將敲落半乳醣凝集素-7的細胞選殖株培養在不含嘌黴素的RPMI 1640培養基中2週，接著進行進一步的分析。

在製備剔除半乳醣凝集素-7的細胞選殖株的部分，是將PC9-IR細胞以群聚且有規律間隔的短回文重複序列(CRISPR)技術處理。兩種單股DNA寡核苷酸，其中一股是半乳醣凝集素-7-特定的crRNA(5’-CTGCCCGAGGGCATCCGCCC-3’，序列編號：17)並具有GTTTT的3’端外伸段，而另一股則是其反向互補序列(5’-GGGCGGATGCCCTCGGGCAG-3’，序列編號：18)並具有CGGTG的3’端外伸段，將其選殖進GeneArt CRISPR技術核酸酶OFP載體(Invitrogen)中。將PC9-IR細胞以所製備的CRISPR技術質體轉染4小時，培養在新鮮培養基中2天，以及以FACSJazz細胞分選儀(BD biosciences)分選細胞以分離出單一的OFP轉染細胞。收集各單一細胞選殖株的細胞溶胞物及基因體DNA，並分別以免疫墨點及ABI PRISM 96-毛細管3730xl DNA分析儀分析之。將成功轉染，但不缺失半乳醣凝集素-7的細胞選殖株作為控制組的細胞選殖株。

RNA 萃取，以及 mRNA 及 miRNA 的即時定量 PCR

自各肺癌細胞選殖株以TRIzol試劑(Invitrogen)萃取總RNA，並f利用iScript cDNA合成套組(Bio-Rad)製備用於即時定量PCR的cDNA。利用TaqMan緩衝液(Roche)，以及利用Roche Universal Library(UPL)所設計的引子及探針進行即時定量PCR。本實驗使用下列正反向引子及探針：在半乳醣凝集素-7(NM_002307)的部分，正向引子為5’-CAGACGACGGCTTCAAGG-3’(序列編號：19)，反向引子為5’-AAGATCCTCACGGAGTCCAG-3’(序列編號：20)，以及探針為#10(型號：04685091001)；在半乳醣凝集素-3(NM_002306)的部分，正向引子為5’-GAGCCTACCCTGCCACTG-3’(序列編號：21)，反向引子為5’-AGGCAAAGGCAGGTTATAAGG-3’(序列編號：22)，以及探針為#3(型號：04685008001)；以及在甘油醛3-磷酸(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH)(NM_002046)的部分，正向引子為5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’(序列編號：23)，反向引子為5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’(序列編號：24)，以及探針為#33(型號：04687663001)。在即時定量PCR的部分，使用CFX Connect即時定量PCR系統(Bio-Rad)，並利用CFX Manager軟體分析實驗數據，其中以∆∆Ct法將實驗數據對內在控制GAPDH 校正。

在miRNA即時定量PCR的部分，依據使用說明來使用Mir-X miRNA第一股合成套組(Clontech)。依據miRbase(v16.0)，miR-203(MI0000283)引子是利用其成熟序列：hsa-miR-203a-5p (MIMAT0031890) AGUGGUUCUUAACAGUUCAACAGUU (序列編號：25)，以及hsa-miR-203a-3p (MIMAT0000264) GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG (序列編號：26)。利用CFX Connect即時定量PCR系統，並利用賽伯綠混合試劑(SYBR Green qRT-PCR master mix)(Applied Biosystems)來進行即時定量PCR，且利用CFX Manager軟體進行相對定量，其中以∆∆Ct法將實驗數據對內在控制U6校正。

免疫組織化學染色

依IRB所核准的實驗流程(IRB-TPEVGH No.：2017-03-001BC及IRB-AS No.：AS-IRB-BM-17022)取得歸檔在臺北榮民總醫院生物資料庫(臺灣)的第1期及不同期肺腺癌的組織陣列。依下列實驗流程，將組織切片進行免疫組織化學(IHC)來檢測半乳醣凝集素-7。簡言之，將組織切片與1微克/毫升之初級抗體山羊抗-半乳醣凝集素-7抗體(Novagen)反應。在反應後，利用ImmPRESS HRP-馬抗-山羊IgG(過氧化酶)聚合物檢測套組(Vector Laboratories)來檢測訊號。

穿透室移行及侵入測定法

利用一24孔穿透室培養盤(8.0微米PET膜，Corning)及塗布細胞外基質(matrigel)的侵入腔(invasion chamber)(8.0微米，BD biosciences)，並利用如公開文獻(Justus CR et al. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp 2014(88))中所述步驟來進行穿透室移行及侵入測定法。將5×10⁴ 個肺癌細胞以100微升之無血清的RPMI 1640培養基懸浮，並種在上層孔中，而將600微升之含有10％之FBS的培養基置於下層孔中。在反應18小時後，將穿透室膜以冰冷的甲醇固定，並以0.5％之結晶紫溶液染色。將穿透室膜上方的細胞以棉花棒移除，而在穿透室膜下方的細胞則以顯微鏡來計數。各樣本分別任選四個影像。

單一細胞移行測定法

利用Leica MDI600B延時(time-lapse)顯微鏡來監測單一細胞移行。將肺癌細胞以1×10⁴ 細胞/毫升的密度種在24孔盤中，並利用延時鏡檢術來檢視細胞運動。在10×物鏡下，每隔10分鐘自動捕捉細胞影像，共持續24小時。針對各細胞株，分別追蹤20–30個個別細胞的運動。利用MetaMorph軟體分析細胞移行。

傷口癒合刮痕測定法

將2×10⁵ 個細胞/孔的肺癌細胞種在24孔盤中，並培養過夜以形成融合的(confluent)細胞單層。將所述細胞單層以一1毫升之吸量管吸頭通過孔中心畫出刮痕，接著利用Leica MDI600B延時顯微鏡紀錄傷口區域的回復情形。在4×物鏡下，自動捕捉細胞影像24小時。利用MetaMorph軟體分析回復的表面區域。

在肺癌細胞中敲落及過量表現 miR-203

利用一過量表現miR-203的載體(PMIRH203AA-1，System Biosciences)及一亂碼序列髮夾控制載體(CD511B-1，System Biosciences)(在pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP中)來製備過量表現miR-203及控制組肺癌細胞。為下調肺癌細胞中的miR-203，則是利用一miR-203的反義載體(MZIP203-PA-1，System Biosciences)及一miRZip亂碼序列髮夾控制載體(MZIP000-PA-1，System Biosciences)。將肺癌細胞以個別載體並利用jetPRIME轉染試劑(Polyplus)轉染的。在轉染4小時後，將轉染細胞培養在新鮮培養基中24小時，接著進行進一步的分析。以即時定量PCR評估各樣本的miR-203量。

活體動物實驗

自國家實驗研究院國家實驗動物中心(臺灣)獲得的NOD.CB17-Prkdcscid/JNarl小鼠，以皮下植入2×10⁶ 個肺癌細胞於小鼠的左側及右側。在腫瘤生長10天後，將小鼠以口部胃管灌食法投予30毫克/公斤之氟伐他汀或洛伐他汀(在食鹽水溶液中)，或單獨的食鹽水溶液作為控制組，每天一次共持續21天。採集腫瘤硬塊，並將其各切為兩塊。其中一塊進行免疫墨點分析，而另一塊則是以10％之福馬林固定並包埋至石蠟塊中以進行IHC染色。所有的動物實驗均在中央研究院生物醫學科學研究所(臺北，臺灣)的實驗動物設施中執行，並均循實驗動物照護的規定及倫理原則來進行。

免疫墨點分析

自不同的肺癌細胞樣本來製備溶胞物，並將含有30微克之蛋白的各溶胞物等分樣品利用10％或12％之十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。利用聚偏二氟乙烯止動劑H鍵膜(polyvinylidene difluoride Immobilon H-bond membrane)(EMD Millipore)及抗半乳醣凝集素-7(Novagen)的初級抗體來進行免疫墨點分析。

Ras-GTP 拉下測定法

利用Ras拉下活化測定生化套組(Ras Pull-down Activation Assay Biochem Kit)(型號：BK008，Cytoskeleton)並依據使用說明進行被活化的GTP所結合的Ras拉下實驗並檢測之。

聚落形成測定法

將肺癌細胞以200個細胞/孔的密度種在24孔盤中。使細胞生長14天，接著以冰冷的甲醇固定10分鐘。在固定後，將細胞以0.05％之結晶紫溶液(0.5公克之結晶紫溶在1公升之20％之乙醇中)染色。

球體形成測定法

將肺癌細胞以胰蛋白酶消化(trypsinized)，並懸浮在無血清幹細胞培養基(DMEM/F12(Gibco)，並添加N2補充物(Thermo Fisher)、10奈克/毫升之人類EGF，以及10奈克/毫升之人類bFGF)中，並以10³ 個細胞/孔的密度種在超低貼附性的24孔盤(Corning)中。以每隔4天更換一半的培養基量來培養細胞。在生長12天後，計數球體數，並以顯微鏡分析其直徑。

統計分析

除非另有說明，否則所有定量的實驗數據皆是以平均值±SEM、SE或SD來呈現。利用Prism 6(GraphPad軟體)分析定量結果。利用費雪爾正確性檢定(Fisher’s exact test)分析EGFR突變與半乳醣凝集素-7表現之間關連性。利用對數－等級(曼特爾-考克斯)檢定(Log-rank (Mantel-Cox) test)分析在整體及無病存活率(disease-free survival)中的差異。利用單因子變異數分析(one-way analysis of variance，ANOVA)與杜凱氏事後檢定(Tukey’s post-hoc test)分析在組別之間及成對數據之間的差異。雙尾未配對的學生t檢驗用於比較不同樣本，且P值所代表的差異小於0.05視為具有統計學上的顯著意義。

實施例 1 在人類乾癬病灶及 IL-23 所誘發的小鼠乾癬樣皮膚炎 (psoriasiform dermatitis) 病灶中半乳醣凝集素 -7 的表現下降

以免疫組織化學染色檢驗在乾癬病患的皮膚病灶及健康控制組正常皮膚中半乳醣凝集素-7的蛋白量(第1圖，a小圖及b小圖)。實驗數據說明半乳醣凝集素-7大量表現在正常皮膚的所有表皮層中(第1圖，a小圖)，但在乾癬皮膚中顯著下降(第1圖，b小圖)。以電腦輔助定量法分析免疫組織化學染色的結果證明乾癬表皮中半乳醣凝集素-7的蛋白量降低(第1圖，b小圖)。

為測試小鼠乾癬模式中半乳醣凝集素-7的表現量是否降低，將IL-23以皮內注射至小鼠來誘發發炎。如所預期的，注射IL-23至野生型(WT)小鼠耳部可明顯誘發耳部腫脹。該反應是與表皮過度增生及淋巴球的浸潤相關，因為在注射PBS後未見到此現象(控制組；第1圖，c小圖)，所述結果是以測量表皮厚度及以蘇木精及伊紅(hematoxylin and eosin，H&E)染色來評估。注射IL-23的表皮也展現出半乳醣凝集素-7的表現急劇降低(第1圖，c小圖及d)。

接著，檢驗細胞激素(即，IL-17A，IL-23及TNF-α，已知其可促進乾癬發炎)不朽的人類角質細胞(HaCaT細胞)及初生新生兒表皮角質細胞(HEKn細胞)中半乳醣凝集素-7表現的效應。實驗數據說明單獨施用IL-17A即可降低HaCaT及HEKn細胞兩者中半乳醣凝集素-7的蛋白表現(第1圖，e小圖)。TNF-α可顯著降低HaCaT細胞中半乳醣凝集素-7的表現，而干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)，以及IL-23則是對該些細胞中半乳醣凝集素-7的表現僅具有中等效應。

實施例 2 抑制半乳醣凝集素 -7 表現可促進促炎性細胞激素及趨化介素的產生

依據微陣列分析顯示，相較於控制組細胞(數據未顯示)，敲落半乳醣凝集素-7的HaCaT細胞中數個趨化介素基因(CCL3、CCL4、CXCL2、CXCL3及其他基因)及與乾癬相關的基因(包括：絲胺酸蛋白酶抑制劑，SERPINA3及SERPINB4；S100蛋白，S100A7及S100A7A；以及防御素β4A，DEFB4A)表現上升。上述發現說明降低半乳醣凝集素-7表現可能會促進發炎，因而有助於乾癬的病程進展。以流式細胞術檢驗細胞表面受體(IL-17RA、TLR4及IFN-γR)的表現，但未發現在敲落半乳醣凝集素-7的細胞與控制組之間有顯著變化。據此，推測半乳醣凝集素-7可展現出抑制細胞發炎性反應訊息傳遞路徑的效應，亦即，半乳醣凝集素-7的表現下降有利於發炎時產生促炎性細胞激素。

接著，對HaCaT及HEKn細胞進行不同的免疫刺激，包括投予IL-17A、IL-21、IL-22、IL-23、TNF-α、LPS或IFN-γ等，並以酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)測量細胞激素的分泌。在該些刺激中，僅有IL-17A(第2圖)、TNF-α及LPS(數據未顯示)可誘發IL-6及IL-8的產生。相較於控制組細胞，敲落半乳醣凝集素-7的細胞分泌較多量的IL-6及IL-8，以回應IL-17A的刺激(第2圖)。此外，在未給予IL-17A刺激時，相較於控制組細胞，觀察到敲落半乳醣凝集素-7的細胞可較強烈且持續分泌IL-6及IL-8(第2圖)。

實施例 3 半乳醣凝集素 -7 會抑制角質細胞中 MiR-146a 的表現，而 IL-17A 則會誘發其表現

依據RNA微陣列分析、深度定序(deep sequencing)，以及即時定量PCR分析的結果(原始數據保留)發現到，在敲落半乳醣凝集素-7的HaCaT細胞中miR-146a表現上升。與上述結果類似地，在暫時敲落半乳醣凝集素-7的HEKn細胞中miR-146a也會明顯過量表現(數據未顯示)。利用鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)修飾的核苷酸探針進行原位雜交法，且實驗結果證明miR-146會表現在正常人類皮膚的表皮中，惟表現量較弱(第3圖，a小圖)。相較於健康人類皮膚，乾癬病灶的所有表皮層中miR-146a的表現會大量增加(第3圖，a小圖)。為檢測IL-17A是否會影響miR-146a表現，分別以IL-17A處理HaCaT及HEKn細胞。實驗數據說明IL-17A會誘發角質細胞中miR-146a的表現(第3圖，b小圖)。

之後，製備穩定過量表現miR-146a的角質細胞以利研究miR-146a在發炎性病狀下的效應。本研究注意到HaCaT細胞中過量表現miR-146a不會影響半乳醣凝集素-7的表現(數據未顯示)。相較於控制組細胞，過量表現miR-146a會明顯增強IL-17A刺激後IL-6及IL-8的產生(第3圖，c小圖及d小圖)。

實施例 4 敲落半乳醣凝集素 -7 會活化 IL-17 所誘發的 MAPK/ERK 訊息傳遞路徑

細胞為回應IL-17A的刺激，會活化MAPK及NF-κB兩條路徑以參與在角質細胞中促炎性細胞激素的產生。為進一步釐清在乾癬發病機制中半乳醣凝集素-7所牽涉的機制，本實施例研究IL-17A的訊息傳遞路徑。為分辨半乳醣凝集素-7是否會影響MAPK或NF-κB的活化，使HaCaT細胞於無血清的培養基中過夜，接著使細胞於存在或不存在IL-17A中培養。免疫墨點法分析結果證明靜止態的細胞含有少量磷酸化的胞外訊息相關激酶1(extracellular signal-related kinase 1，ERK1)及胞外訊息相關激酶2(extracellular signal-related kinase 2，ERK2)(分別為磷酸化的ERK1及磷酸化的ERK2；第4圖，a小圖)。相反地，在四種敲落半乳醣凝集素-7的細胞株(sh-1、sh-2、sh-3及sh-4)中，細胞暴露於IL-17A則會誘發強烈的磷酸化的ERK1及ERK2產生：相較於控制組細胞，會增加2.0至6.6倍的表現量(第4圖，a小圖)。ERK1及ERK2總蛋白表現量則在所有加入或不加入IL-17A刺激的細胞中彼此相當。

相反地，NF-κB路徑的上游組成分(包括磷酸化的NF-κB、總NF-κB、磷酸化的IκBα及總IκBα)對IL-17A刺激沒有產生變化(第4圖，a小圖)，說明半乳醣凝集素-7不參與NF-κB路徑的活化。在IL-17A刺激後，在敲落半乳醣凝集素-7的角質細胞中，利用特定的化學抑制劑，包括MAP激酶p38抑制劑(SB203580)、JNK抑制劑(SP600125)、NF-κB抑制劑(PDTC)、磷脂酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)抑制劑(LY294002)，以及MAPK/ERK抑制劑(PD98059)來標的至其對應路徑。在該些化合物中，只有MAPK/ERK抑制劑PD98059會顯著阻斷IL-17A誘發IL-6及IL-8的產生(原始數據保留)。IL-17A所誘發的IL-6及IL-8分泌不會被MAP激酶p38抑制劑(SB203580)、JNK抑制劑(SP600125)、NF-κB抑制劑(PDTC)等抑制劑所阻斷，或被磷脂酸肌醇3-激酶抑制劑(PI3K；LY294002；原始數據保留)所阻斷。上述數據說明在IL-17A所誘發的細胞激素表現中半乳醣凝集素-7起到調節的作用，其主要是藉由抑制ERK的磷酸化來影響MAPK/ERK訊息傳遞路徑。

實施例 5    MiR-146a 經由 MAPK/ERK 路徑來誘發角質細胞中的發炎介質

為找出在IL-17A刺激後，miR-146a增加促炎性細胞激素表現的胞內路徑，本實施例檢驗過量表現miR-146的角質細胞中MAPK路徑及NF-κB路徑的活化情形。如第4圖之b小圖所示，相較於控制組細胞，在過量表現miR-146a的細胞中，IL-17A會高度活化MAPK/ERK路徑。同時也發現到ERK磷酸化會顯著增強(大於4倍，P > 0.01；第4圖，b小圖)。與敲落半乳醣凝集素-7的細胞實驗數據一致的是，NF-κB及IκBα的磷酸化或其總蛋白量在過量表現miR-146a細胞與控制組細胞之間沒有明顯差異(第4圖，b小圖)。總結來說，該些實驗結果說明miR-146a可經由MAPK/ERK路徑促進IL-17A誘發IL-6及IL-8的產生。

實施例 6 缺失半乳醣凝集素 -7 的小鼠較易發生 IL-23 所誘發的乾癬樣皮膚炎，並呈現出劇烈的表皮過度增生及發炎的徵兆

為進一步評估活體內半乳醣凝集素-7是否參與在調節發炎性反應中，本實施例以缺失半乳醣凝集素-7的小鼠來研究，以確認半乳醣凝集素-7在IL-23所誘發的皮膚發炎中的作用。為回應IL-23的刺激，WT小鼠呈現出由表皮角質細胞過度增生所導致的耳部腫脹，且H&E染色並顯示出白血球浸潤的情形(第5圖，a小圖)。在注射IL-23的14天後，相較於同胎的WT控制組，缺失半乳醣凝集素-7的小鼠皮膚切片呈現出耳部及表皮厚度明顯增加(第5圖，b小圖及c小圖)。此外，在缺失半乳醣凝集素-7的小鼠中白血球浸潤的數目也會顯著增加(第5圖，d小圖)。在微陣列分析中，同時發現到相較於WT小鼠，在缺失半乳醣凝集素-7的小鼠中促炎性細胞激素mRNA(IL-17A、CXCL5及IL-19)的表現量上升(表1)。 表1 注射IL-23之WT小鼠的微陣列數據

PBS/WT	PBS/KO	IL-23/WT	IL-23/KO	基因名稱
1.00	-1.12	2.89	3.01	角質素6B
1.00	-1.80	1.33	2.54	介白素17A
1.00	2.47	1.06	3.38	趨化介素(C-X-C模體)配體5
1.00	1.60	8.83	9.50	S100鈣結合蛋白A8(鈣粒蛋白A)
1.00	1.35	5.05	5.31	S100鈣結合蛋白A9(鈣粒蛋白B)
1.00	1.52	5.92	14.61	介白素19

總結來說，上述實驗結果說明半乳醣凝集素-7具有抑制角質細胞所介導的發炎性反應的效應。

實施例 7 氟伐他汀會增加活體內半乳醣凝集素 -7 的表現量，並抑制角質細胞中促炎性細胞激素的產量，以及會減弱 IL-23 所誘發的表皮厚度

為確認所觀察到的半乳醣凝集素-7於抗發炎及抗增生的效應，發明人詳細檢查可用於誘發半乳醣凝集素-7表現的核准藥物微陣列資料庫。藉由關聯圖譜(connectivity map，cMAP)數據分析找出四種化合物：甲基培尼皮質醇、托普黴素、氟伐他汀，以及五甲六氯吡啶。在其中，僅有氟伐他汀可誘發半乳醣凝集素-7的mRNA及蛋白表現(第6圖，a小圖)，並降低S100A7的mRNA表現(第6圖，b小圖)。以延時分析氟伐他汀處理的角質細胞顯示出其可抑制細胞增生；所述抑制是與p21的過量表現相關(免疫墨點分析結果，數據未顯示)。之後檢驗其他斯他汀藥物的影響，相關實驗數據顯示阿托伐他汀、西立伐他汀、匹伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀及辛伐他汀全體皆可誘發半乳醣凝集素-7的表現(數據未顯示)。本實施例發現到氟伐他汀會減弱IL-17A所誘發的IL-6及IL-8分泌(第6圖，c小圖及d小圖)。進一步地，甚至存在會抑制半乳醣凝集素-7表現的細胞激素(TNF-α及IL-17A)時，氟伐他汀仍會增強半乳醣凝集素-7表現(高於基礎量)(第6圖，e小圖)。

氟伐他汀或普伐他汀在乾癬上的效應進一步在動物模式中確認，其中氟伐他汀(而非普伐他汀)會減弱IL-23所誘發的耳部皮膚增厚的及角質細胞過度增生的情形(第6圖，f小圖)。

總結上述，上述實驗結果證明斯他汀藥物(特別是氟伐他汀)，是一種半乳醣凝集素-7的潛在誘發劑，可用於抑制IL-17A及IL-23所誘發的細胞激素產生及皮膚過度增生。

實施例 8 半乳醣凝集素 -7 表現與肺癌中 EGFR 的突變相關

人類半乳醣凝集素-7是由半乳醣凝集素-7基因(galectin-7 gene，LGALS7)所編碼。本實施例主要是研究，在不同肺癌細胞株中半乳醣凝集素-7的表現量與EGRF訊息之間的相關性。

以即時定量PCR(qPCR)測量半乳醣凝集素-7在21種肺癌細胞株中mRNA的表現量。本實施例發現到大約三分之一的細胞株展現出半乳醣凝集素-7高於背景值；其中在六種細胞株中具有EGFR突變(即，缺失EGFR第19外顯子)中的三種細胞株中展現出極高量的半乳醣凝集素-7(第7圖，a小圖)。

為確認半乳醣凝集素-7的表現與EGFR訊息之間的相關性，對其中兩種細胞株CL25及CL100投予一酪胺酸激酶抑制劑(TKI)(例如，吉非替尼)及一EGFR抑制劑，以阻斷EGFR的活化。本實施例發現在投藥後，半乳醣凝集素-7的表現量下降(第7圖，b小圖)。與上述結果類似地，在具有異位性過量表現(ectopically overexpressed)半乳醣凝集素-7的細胞株(例如，CL83、CL141及PC9細胞)中，在投藥後，各細胞株中半乳醣凝集素-7的表現量也會下降(第7圖，c小圖)。相反地，在CL25、CL100、PC9及PC9-IR細胞中，由表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)活化EGFR的訊息傳遞則會暫時上調半乳醣凝集素-7的表現(第7圖，d小圖)。

以IHC染色檢測不同期的肺腺癌病患腫瘤中半乳醣凝集素-7的表現。本研究分析189位病患，其中35位病患展現出陽性染色(18.5％)。此外，半乳醣凝集素-7表現顯著與活化型的EGFR突變(包括，缺失第19外顯子及L858R突變)相關(P = 0.0025)(表2)。進一步地，在EGFR突變組中，102位病患中的27位的腫瘤(26.5％)是半乳醣凝集素-7陽性，但在野生型EGFR組中，87位病患中僅有8位(9.2％)是半乳醣凝集素-7陽性。此外，實驗數據說明半乳醣凝集素-7的表現與缺失EGFR第19外顯子(P = 0.0006)(而非與L858R突變(P=0.0824))顯著相關(表3)。 表2       189位病患中EGFR之突變分析的臨床特性

變因	EGFR突變 (–) N=87 (％)	EGFR突變 (+) N=102 (％)	pa
半乳醣凝集素-7
(–)	79 (90.8％)	75 (73.5％)	0.0025
(+)	8 (9.2％)	27 (26.5％)
a p 值獲自費雪爾正確性檢定。 b 病患涵蓋缺失第19外顯子或L858R突變兩者。

表3       189位肺腺癌病患中半乳醣凝集素-7的表現分析

變因	半乳醣凝集素-7 (–) N=154 (％)	半乳醣凝集素-7 (+) N=35 (％)	pa
EGFR突變
(–)	79 (51.3％)	8 (22.9％)
外顯子 19 缺失	30 (19.5％)	16 (45.7％)	0.0006
L858R	45 (29.2％)	11 (31.4％)	0.0824
a p 值獲自費雪爾正確性檢定。

實施例 9 半乳醣凝集素 -7 可負向調節肺癌細胞的進展

為研究半乳醣凝集素-7在肺癌中的作用，而檢驗半乳醣凝集素-7表現對數種細胞功能(包括：細胞增生、聚落形成、球體形成及細胞移行)的效應。細胞增生不會受半乳醣凝集素-7表現改變所影響(數據未顯示)，但聚落形成及球體形成的能力(即，聚落數及球體數兩者)在敲落半乳醣凝集素-7後均會增加(第8圖，a小圖及b小圖)。此外，敲落半乳醣凝集素-7組之肺癌幹細胞會產生較大的球體(第8圖，c小圖)。

在細胞移行的部分，將PC9-IR細胞種在穿透室培養盤中16小時。在培養後，分別收集上層孔及下層孔的細胞，並分別萃取及分析該些細胞的mRNA。相較於上層孔細胞，下層孔細胞中半乳醣凝集素-7的mRNA表現量降低(第9圖，a小圖)。

以免疫墨點分析檢驗E-鈣黏蛋白(E-cadherin)(或稱鈣黏蛋白1(cadherin 1，CDH1)及波形蛋白(vimentin，VIM)(為兩種典型的上皮細胞間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)標記)的表現。如第9圖之b小圖所示，在敲落半乳醣凝集素-7的肺癌細胞(即，CL100及PC9-IR細胞)中CDH1表現下降，而VIM表現卻上升。相反地，在過量表現半乳醣凝集素-7的PC9細胞中，發現到CDH1表現上升，但VIM的表現則是下降(第9圖，b小圖)。該些發現說明半乳醣凝集素-7可能會負向調節肺癌的細胞移行，說明半乳醣凝集素-7可抑制腫瘤轉移及復發。

本實施例亦同時評估半乳醣凝集素-7對肺癌細胞移動性的效應。依據第9圖之c小圖，敲落半乳醣凝集素-7會分別促進CL100及PC9-IR細胞2.9倍及1.48倍的細胞移行，而過量表現半乳醣凝集素-7則會降低A549及PC9細胞的細胞侵入及移行。此外，在單一細胞移行測定法及傷口癒合刮痕測定法中，相較於控制組細胞，敲落半乳醣凝集素-7的PC9-IR細胞展現出增加大約1.4倍的速度(第9圖，d小圖及e小圖)。

以PC9-IR細胞利用群聚且有規律間隔的短回文重複序列(CRISPR)技術來製備剔除半乳醣凝集素-7的細胞選殖株(第10圖，a小圖)，並以穿透室移行及傷口癒合刮痕測定法檢驗之。如第10圖之b小圖及c小圖所示，移除半乳醣凝集素-7表現會促進細胞移行的能力。進一步地，將半乳醣凝集素-7重新送入剔除半乳醣凝集素-7的PC9-IR細胞中，則會恢復半乳醣凝集素-7對細胞移行的抑制(第10圖，d小圖)。

實施例 10 半乳醣凝集素 -7 可經由 miR-203 來調節肺癌細胞的細胞移行

本實施例檢測肺癌細胞中miR-203與半乳醣凝集素-7之間的相關性。如第11圖所示，在敲落半乳醣凝集素-7的CL100及PC9-IR細胞中miR-203的表現下降，而在過量表現半乳醣凝集素-7的PC9細胞中則是表現上升(第11圖，a小圖及b小圖)。此外，在控制組及敲落半乳醣凝集素-7的PC9-IR細胞中過量表現miR-203，兩者均會造成細胞移行增強，說明敲落半乳醣凝集素-7的效應會受到過量表現miR-203而減弱(第11圖，c小圖)。進一步地，敲落miR-203則會恢復半乳醣凝集素-7對細胞移行的抑制(第11圖，d小圖)，此結果證明miR-203涉及半乳醣凝集素-7所介導的癌細胞移行抑制中。

實施例 11 斯他汀可經由調節甲羥戊酸 -Ras 路徑來增強肺癌細胞中半乳醣凝集素 -7 的表現

自關聯圖譜數據庫(cMAP，https://clue.io/cmap)中，選出四種化合物：甲基培尼皮質醇、托普黴素、氟伐他汀，以及五甲六氯吡啶，並預測其可誘發數株癌細胞株中半乳醣凝集素-7的表現。在進行實驗檢驗後，發現僅有氟伐他汀可誘發肺癌細胞株中半乳醣凝集素-7的表現(第12圖，a小圖)。之後，將肺癌細胞以臨床使用的數種斯他汀(包括，阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅蘇伐他汀，以及辛伐他汀)處理，則其中大多數的斯他汀均會增強半乳醣凝集素-7的表現(第12圖，b小圖)。本實施例使用甲羥戊酸，其為一種HMG-CoA還原酶路徑的主要下游產物，來作為HMG-CoA還原酶抑制劑(即，斯他汀)的拮抗劑。投予甲羥戊酸可逆轉斯他汀所誘發的半乳醣凝集素-7表現上升(第12圖，c小圖)。

藉由免疫墨點分析結果可知，在以氟伐他汀處理的數個肺癌細胞株中半乳醣凝集素-7蛋白量上升，並呈現出劑量依賴性的情形(第13圖，a小圖)。氟伐他汀在肺癌細胞的效應也在活體內進行評估。將NOD-SCID小鼠以皮下移植A549、PC9及PC9-IR細胞，並每天以口部胃管灌食法投予氟伐他汀及洛伐他汀。在第21天，採集腫瘤硬塊，並以IHC染色及免疫墨點法測量半乳醣凝集素-7的表現量。相較於食鹽水處理的控制組，氟伐他汀及洛伐他汀兩者均會增加所移植的腫瘤中半乳醣凝集素-7的表現(第13圖，b小圖)。與上述結果類似地，投予甲羥戊酸可逆轉斯他汀所誘發的半乳醣凝集素-7表現上升(第13圖，c小圖)。此外，共同投予GGPP及FPP(兩種HMG-CoA還原酶路徑的其他下游產物)則會阻斷氟伐他汀所誘發的半乳醣凝集素-7表現上升(第13圖，c小圖)。該些實驗結果說明斯他汀所誘發的半乳醣凝集素-7表現上升是經由甲羥戊酸路徑來達成。

GGPP及FPP是Ras聚異戊二烯化(prenylation)的兩種重要因子，並且對膜轉位(membrane-translocation)及活化Ras至關重要。在本研究中，利用Raf-RBD磁珠進行Ras-GTP拉下測定法，接著以免疫墨點分析來評估Ras在氟伐他汀-半乳醣凝集素-7軸線的情境中所起的作用。如第14圖之a小圖所示，投予氟伐他汀可抑制Ras聚異戊二烯化，以及後續的Ras-GTP形成。依據公開文獻，抑制Ras可促進半乳醣凝集素-7的表現，因此檢測抑制Ras(藉由Ras抑制劑(例如，法尼基硫代水楊酸(FTS)))對氟伐他汀所誘發的半乳醣凝集素-7表現的效應。投予氟伐他汀及FTS兩者均會增加PC9-IR細胞中半乳醣凝集素-7的表現，但共同投予該二種化合物僅會些微增加半乳醣凝集素-7表現，相當於單獨以氟伐他汀所誘發的表現量(第14圖，b小圖)。

實施例 12 半乳醣凝集素 -7 是氟伐他汀所誘發的細胞移行抑制中的關鍵決定因子

為確認半乳醣凝集素-7在氟伐他汀所誘發的肺癌細胞的細胞移行抑制中所起的作用，本實施例利用PC9-IR細胞來進行穿透室移行測定法。將控制組及敲落半乳醣凝集素-7的PC9-IR細胞以1微體積莫耳濃度之氟伐他汀前處理24小時，接著進行穿透室移行測定法。如第15圖之a小圖所示，敲落半乳醣凝集素-7可完全恢復氟伐他汀所誘發的細胞移行抑制與氟伐他汀可誘發EMT標記的變化。例如，在敲落半乳醣凝集素-7的PC9-IR細胞中，CDH1表現並未上升，而VIM表現也未下降(第15圖，b小圖)。上述實驗結果說明半乳醣凝集素-7有助於氟伐他汀所誘發的細胞移行抑制。

實施例 13 鱗狀癌細胞中半乳醣凝集素 -7 的表現量

本實施例提供在其他癌症(例如，食道癌、口腔癌或皮膚癌)中半乳醣凝集素-7的表現量。以整合分析(meta-analysis)方法檢查半乳醣凝集素在該些癌症中mRNA的相對表現，並發現到在該些癌症中所有半乳醣凝集素-7的表現量皆下降。實驗數據總結在在表4至表6中。 表4       相較於角質細胞HaCaT細胞，皮膚鱗狀癌細胞株(SSC)中半乳醣凝集素的mRNA表現量相對倍數變化 (GSE4975的數據整合分析)

ID 代碼	HaCaT	SSC-12	SSC-6	基因名稱
208450_at	1.00	5.15	2.53	半乳醣凝集素-2
220440_at	1.00	2.72	1.12	半乳醣凝集素-13
220158_at	1.00	1.36	1.27	半乳醣凝集素-14
203236_s_at	1.00	-1.10	1.40	半乳醣凝集素-9
204272_at	1.00	-1.15	1.37	半乳醣凝集素-4
210731_s_at	1.00	-1.34	-2.01	半乳醣凝集素-8
201105_at	1.00	-1.47	2.62	半乳醣凝集素-1
208949_s_at	1.00	-4.78	-1.01	半乳醣凝集素-3
206400_at	1.00	-9.40	-11.81	半乳醣凝集素-7/ 半乳醣凝集素-7B

表5       分析15組成對的食道鱗狀細胞癌(ESCC)樣本及其對應的非惡性黏膜中半乳醣凝集素mRNA的表現量相對倍數變化(GSE75241的數據整合分析)

轉錄本叢集Id	[ 正常組織]	[ESCC]	基因名稱
2386867	1	1.24	半乳醣凝集素-8|HEATR1
3333877	1	-1.19	半乳醣凝集素-12
3536706	1	-2.04	半乳醣凝集素-半乳醣凝集素-3
3715274	1	1.01	半乳醣凝集素-9
3832736	1	-2.17	半乳醣凝集素-7/ 半乳醣凝集素-7B
3833238	1	-1.13	半乳醣凝集素-14
3861557	1	-1.20	半乳醣凝集素-4
3944882	1	3.77	半乳醣凝集素-1
3960174	1	-1.11	半乳醣凝集素-2

表6 相較於正常的口部角質細胞(NK)的初生培養細胞，在八種口部鱗狀細胞癌(OSCC)細胞株(H系列及M9)中半乳醣凝集素mRNA的表現量相對倍數變化(GSE31853的數據整合分析)

探針組ID	[ 正常組織]	[OSCC]	基因名稱
201105_at	1.00	-2.20	半乳醣凝集素-1
203236_s_at	1.00	-1.12	半乳醣凝集素-9
204272_at	1.00	1.00	半乳醣凝集素-4
206400_at	1.00	-50.87	半乳醣凝集素-7/ 半乳醣凝集素-7B
208450_at	1.00	1.00	半乳醣凝集素-2
208933_s_at	1.00	1.83	半乳醣凝集素-8
208949_s_at	1.00	-2.13	半乳醣凝集素-3
210731_s_at	1.00	1.00	半乳醣凝集素-8
210732_s_at	1.00	1.27	半乳醣凝集素-8
219998_at	1.00	-1.51	半乳醣凝集素-L
220158_at	1.00	-1.01	半乳醣凝集素-14
220440_at	1.00	1.02	半乳醣凝集素-13

為證明氟伐他汀在該些癌細胞中上調半乳醣凝集素-7的效應，本實施例以皮膚癌A-431細胞作為一實例。將A-431細胞以氟伐他汀處理24小時及48小時，並以qPCR測定半乳醣凝集素-7的表現量。如第16圖所示，相較於DMSO及假實驗控制組，氟伐他汀會增加半乳醣凝集素-7的表現。

總結上述，本揭示內容證明半乳醣凝集素-7於治療乾癬及癌症上的功效，因此該些會增強半乳醣凝集素-7表現的藥劑(例如，該斯他汀藥物)可作為用於治療乾癬及癌症兩者的候選藥物。

當可理解，上文有關實施方式的敘述僅作為例示性的實施方式，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可對其進行各種更動與修飾。上文的說明書、實施例及實驗數據對本揭示內容作為例示性實施方式中的結構及使用方式做出完整的描述。儘管上文已描述本揭示內容中各樣的實施方式有一定程度的特性，或參照一或多個個別的實施方式，本發明所屬領域技術具有通常知識者仍可在不悖離本揭示內容精神及範圍情形下，對已揭示的實施方式進行眾多修改。

無

本專利或申請案包含至少一幅彩色圖式。在請求並支付必要費用後，專利局(Office)將提供帶有彩色圖式之本專利或專利申請公開的副本。

在參閱以下的詳細說明、申請專利範圍及附隨圖式後，本揭示內容及其他特徵、態樣及優點將更明顯易懂，其中：

第 1 圖 乾癬病患的表皮角質細胞中半乳醣凝集素 -7 的表現量下降。 a小圖：健康控制組及乾癬病灶之皮膚切片中半乳醣凝集素-7的免疫組織化學(Immunohistochemical，IHC)染色。比例尺：100微米。b小圖：健康控制組之正常皮膚切片(n = 75)及乾癬病患之含病灶的皮膚切片(n = 27)中半乳醣凝集素-7的免疫組織化學染色。以電腦輔助方法來定量免疫組織化學染色的方法如「材料及方法」中所述。y軸為任意選定的數字以代表表皮特定區域的平均強度(強度/區域(InteDen/Area))。c小圖：皮膚切片中半乳醣凝集素-7的免疫組織化學染色，所述切片分別取自皮內注射IL-23及PBS之小鼠。比例尺：100微米。d小圖：IL-23所誘發的小鼠乾癬模式之免疫組織化學定量的結果(PBS，n = 6；IL-23，n = 13)。e小圖：免疫墨點分析以特定細胞激素(例如，IFN-γ、LPS、TNF-α、IL-23或IL-17A)所刺激的HaCaT及HEKn細胞中半乳醣凝集素-7的表現量。兩組細胞均以100奈克/毫升之IFN-γ及50微克/毫升之LPS刺激。以細胞激素處理細胞2天，並製備細胞溶胞物以進行免疫墨點分析。在測定法中，以GAPDH作為上樣控制(loading control)。**P > 0.01，且***P > 0.001。

第 2 圖 角質細胞中半乳醣凝集素 -7 的表現下降會造成以 IL-17A 所刺激的角質細胞中促炎性細胞激素 (IL-6 及 IL-8) 的產量上升。 a小圖及b小圖：使敲落(knockdown)半乳醣凝集素-7的細胞株(sh-1、sh-2、sh-3，以及sh-4)及控制組於加入或不加入IL-17A中反應2天，並以ELISA測量IL-6及IL-8的表現量。所有的實驗皆重複三次。c小圖及d小圖：將HEKn細胞轉染siRNA來敲落半乳醣凝集素-7，接著使該些細胞於加入或不加入IL-17A中反應2天。收集上清液並以ELISA分析IL-6及IL-8。在統計分析的部分，假實驗組(mock)及IL-17處理組兩者中，各以shRNA或siRNA處理的細胞株均與其對應的控制組(V及si-NC)比較。以shRNA及siRNA敲落半乳醣凝集素-7表現的方法如「材料及方法」中所述；ns：無顯著性，*P > 0.05，**P > 0.01。

第 3 圖 微小 RNA-146a(microRNA-146a 或 miR-146a) 會促進 IL-6 及 IL-8 的表現量上升。 a小圖：以RNA原位雜交法(in situ hybridization，ISH)檢測正常表皮及乾癬病患角質細胞中的miR-146a。比例尺：100微米。b小圖：以即時定量PCR(real-time PCR)定量在以IL-17A所處理的HaCaT細胞中miR-146a的表現量。c小圖及d小圖：以25或100奈克/毫升之IL-17A刺激2天後，測量HaCaT細胞(以pmiR(控制組載體(control vector))或pmiR-146a載體穩定轉染)所分泌的細胞激素(IL-6及IL-8)。在統計分析的部分，各組與假實驗組(0奈克/毫升)pmiR組比較；ns：無顯著性，*P > 0.05。

第 4 圖 促炎性細胞激素的表現是受半乳醣凝集素 -7 及 miR-146a 經由 ERK1 及 ERK2 訊息傳遞路徑所調節。 a小圖：將敲落半乳醣凝集素-7的HaCaT細胞及控制組細胞以IL-17A處理5分鐘，並製備細胞溶胞物並以免疫墨點法分析之。以對應的抗體來檢測總體ERK1、ERK2、NF-κB及IκBα，以及其磷酸化形式。b小圖：將HaCaT細胞(以pmiR或pmiR-146a穩定轉染)以IL-17A處理。以a小圖中所述步驟來進行免疫墨點法。磷酸化的ERK1(phospho-ERK1，pERK1)及磷酸化的ERK2(phospho-ERK2，pERK2)的蛋白定量數據是對控制組細胞(以IL-17處理5分鐘)校正。NF-κB及IκBα的總蛋白量及磷酸化量，以及ERK1及ERK2的總蛋白量數據是對控制組細胞(以IL-17處理0分鐘)校正。

第 5 圖 缺失半乳醣凝集素 -7 的小鼠展現出角質細胞過度增生的情形，且會增加免疫細胞的浸潤。 a小圖：耳部切片的H&E染色，所述切片分別取自注射IL-23或注射PBS之野生型(wild-type，WT)或缺失半乳醣凝集素-7(剔除(knockout，KO))的小鼠。比例尺：50微米。b小圖：在注射IL-23或PBS後的15天內，每隔一天測量WT及缺失半乳醣凝集素-7(KO)的小鼠耳部厚度(WT-PBS，n = 5；WT-IL-23，n = 18；KO-PBS，n = 5；KO-IL-23，n = 19)。在統計分析的部分，將各時間點上的KO-IL-23耳部厚度與其對應的WT-IL-23組比較。c小圖：在注射IL-23或PBS後的15天內，將WT及KO小鼠(即b小圖中的小鼠)組織切片中的表皮厚度予以定量。d小圖：在400×放大倍率視野下計數白血球數目；組織切片取自注射IL-23的小鼠(WT，n= 6；KO，n= 5)；ns：無顯著性，**P > 0.01，***P>0.001。

第 6 圖 氟伐他汀會增加角質細胞中半乳醣凝集素 -7 的表現量，並會減弱 IL-23 所誘發的表皮厚度。 a小圖及b小圖：即時定量PCR分析HaCaT細胞中半乳醣凝集素-7及S100A7的mRNA表現，所述細胞是以甲基培尼皮質醇(methylprednisolone)(10.6微體積莫耳濃度)、托普黴素(tobramycin)(8.6微體積莫耳濃度)、氟伐他汀(9.2微體積莫耳濃度)、五甲六氯吡啶(pempidine)(13微體積莫耳濃度)，或載體控制組(vehicle control)(二甲亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO)處理24小時。以ΔΔCt法計算相對倍數變化；所有的樣本數據是對假實驗組樣本校正，並以GAPDH 作為內在控制。c小圖及d小圖：HaCaT細胞的IL-6及IL-8細胞激素產量，所述細胞是以氟伐他汀(fluva，9.2微體積莫耳濃度)於加入或不加入IL-17A(200奈克/毫升)中處理2天，再以ELISA測量之。在統計分析中，各組是與其假實驗處理控制組(不加入IL-17A、DMSO，或氟伐他汀處理)比較。此外，在統計分析的部分，在IL-17A存在時，假實驗組是與DMSO組及氟伐他汀組比較。e小圖：以免疫墨點法分析角質細胞中的半乳醣凝集素-7，所述細胞是以TNF-α及IL-17A於加入或不加入氟伐他汀中處理。f小圖：不同組的小鼠耳部厚度，所述小鼠是以皮內注射IL-23或PBS，並以氟伐他汀、普伐他汀，或食鹽水處理。ns：無顯著性，*P > 0.05，**P > 0.01，***P > 0.001。

第 7 圖 活化型的 EGFR 突變會增加肺癌中半乳醣凝集素 -7 的表現。 a小圖：以qPCR測量21種肺癌細胞株中半乳醣凝集素-7的mRNA表現量，所述部份細胞株具有特定的活化型EGFR突變(n=4)。以ΔΔCt法來計算mRNA的相對表現，並對內在控制(GAPDH )及假實驗組樣本的Ct值校正之。b小圖及c小圖：將肺癌細胞以10微體積莫耳濃度之酪胺酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)(吉非替尼，gefitinib)或EGFR抑制劑處理24小時。以免疫墨點測定法測量肺癌細胞株中內源性半乳醣凝集素-7中、p-EGFR、p-ERK、p-Akt (b小圖)與異位性過量表現(ectopically overexpressed)半乳醣凝集素-7 (c小圖)等蛋白表現。d小圖：將肺癌細胞置於無血清之細胞培養基中過夜，接著以10奈克/毫升之EGF刺激一段特定時間，再以免疫墨點測定法測量半乳醣凝集素-7的蛋白量。所有的免疫墨點實驗至少重複三次，且計算半乳醣凝集素-7的相對倍數變化，並對控制組校正之。

第 8 圖 敲落半乳醣凝集素 -7 會增強聚落形成 (colony formation) 及球體形成 (sphere formation) 。 a小圖：將控制組(shLuc)及敲落半乳醣凝集素-7(shLGALS7)組的CL100細胞以200細胞/孔的密度種在24孔盤中。培養14天後，將細胞固定並以0.05％之結晶紫溶液染色(n=5)。b小圖及c小圖：將控制組及敲落半乳醣凝集素-7組的CL100細胞懸浮在幹細胞培養基中，並種在超低貼附性(ultra-low attachment)的24孔盤中。在培養12天後，計數球體數並以顯微鏡分析其直徑(n=3)。

第 9 圖 半乳醣凝集素 -7 可抑制肺癌細胞移行 (migration) 。 a小圖：將10⁶ 個PC9-IR細胞種在穿透室(transwell)培養盤中培養16小時。在培養後，分別收集上層孔及下層孔中細胞的mRNA並以qPCR分析之(n=4)。以免疫墨點法測量CDH1、VIM及半乳醣凝集素-7的蛋白表現(b小圖)；以穿透室移行測定法(transwell migration assay)(c小圖)、單一細胞移行測定法(single cell migration assay)(n=3)(d小圖)，以及傷口癒合測定法(wound healing assay)(n=4)(e小圖)測量控制組(shLuc或EGFP-N1)、過量表現半乳醣凝集素-7(EGFP-LGALS7)之肺癌細胞，以及敲落半乳醣凝集素-7(shLGALS7)之肺癌細胞的移行能力。所有的免疫墨點實驗至少重複三次，且計算CDH1、VIM及半乳醣凝集素-7的相對倍數變化，並對控制組校正之。

第 10 圖 移除半乳醣凝集素 -7 可促進細胞移行能力。 a小圖：利用群聚且有規律間隔的短回文重複序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)技術來製備PC9-IR細胞的剔除半乳醣凝集素-7(LGALS7 KO)細胞選殖株。以穿透室移行測定法(n=6)(b小圖)及傷口癒合測定法(n=4)(c小圖)測量控制組及剔除半乳醣凝集素-7(LGAL7 KO)細胞選殖株的移行能力。d小圖：將各單一半乳醣凝集素-7的KO細胞選殖株再以控制組(p3×FLAG-CMV-14)或過量表現半乳醣凝集素-7(p3×FLAG-LGALS7)的質體轉染，並以穿透室移行測定法測量其移行能力(n=5)。

第 11 圖 miR-203 可協同促進半乳醣凝集素 -7 所誘發的癌細胞移行抑制。 a小圖及b小圖，以qPCR分析控制組(shLuc)、敲落半乳醣凝集素-7(shLGALS7)之肺癌細胞(n=4)(a小圖)，以及過量表現半乳醣凝集素-7(3×FLAG-LGALS7)之肺癌細胞(n=4)(b小圖)的miR-203表現。c小圖：將控制組(shLuc)及敲落半乳醣凝集素-7(shLGALS7)的PC9-IR細胞再以過量表現miR-203之載體(PMIRH203AA-1，PMIR-203)及其亂碼序列(scramble)控制組載體轉染，並以穿透室移行測定法測量(n=4)其移行能力。d小圖：將控制組(3×FLAG)及過量表現半乳醣凝集素-7(3×FLAG-LGALS7)的PC9細胞再以反義miR-203載體(MZIP203-PA-1，MZIP-203)或其亂碼序列控制組載體轉染，並以穿透室移行測定法測量其移行能力(n=4)。

第 12 圖 斯他汀會經由甲羥戊酸 (mevalonate) 路徑來增強肺癌細胞中半乳醣凝集素 -7 的表現。 a小圖：將CL100及PC9-IR細胞以甲基培尼皮質醇(10.6微體積莫耳濃度)、托普黴素(8.6微體積莫耳濃度)、氟伐他汀(9.2微體積莫耳濃度)，以及五甲六氯吡啶(13微體積莫耳濃度)處理24小時；以qPCR測量半乳醣凝集素-7的mRNA量(n=4)。b小圖：將肺癌細胞以10微體積莫耳濃度之阿托伐他汀(Atorva)、西立伐他汀(Ceriva)、氟伐他汀(Fluva)、洛伐他汀(Lova)、美伐他汀(Meva)、匹伐他汀(Pitava)、普伐他汀(Prava)、羅蘇伐他汀(Rosuva)、以及辛伐他汀(Simva)處理24小時，並以免疫墨點測定法測量半乳醣凝集素-7的蛋白量。c小圖：將10微體積莫耳濃度之斯他汀，包括阿托伐他汀(Atorva)、氟伐他汀(Fluva)、洛伐他汀(Lova)、羅蘇伐他汀(Rosuva)，以及辛伐他汀(Simva)，與200微體積莫耳濃度之甲羥戊酸共同投予PC9-IR細胞並作用24小時；以免疫墨點測定法測量半乳醣凝集素-7的表現量。所有的免疫墨點實驗至少重複三次，且計算半乳醣凝集素-7的相對倍數變化，並對DMSO控制組校正之。

第 13 圖 斯他汀會經由甲羥戊酸 -Ras 路徑來增強肺癌細胞中半乳醣凝集素 -7 的表現並抑制細胞移行。 a小圖：將肺癌細胞以一系列濃度之氟伐他汀(自0.1至10微體積莫耳濃度)處理24小時；收集細胞溶胞物並以免疫墨點法分析之。b小圖：將NOD-SCID小鼠以皮下移植A549、PC9及PC9-IR細胞，並每日以口部胃管灌食法投予30毫克/公斤之氟伐他汀及洛伐他汀(溶於食鹽水溶液中)。在第21天，採集腫瘤硬塊並以IHC染色及免疫墨點測定法測量半乳醣凝集素-7的表現量。計算半乳醣凝集素-7的相對倍數變化，並對食鹽水處理的控制組的平均表現校正之。c小圖：將氟伐他汀分別與200微體積莫耳濃度之甲羥戊酸(Mev)、20微體積莫耳濃度之香葉基香葉基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP)，以及20微體積莫耳濃度之法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate，FPP)共同投予PC9-IR細胞並作用24小時，並以免疫墨點測定法檢測半乳醣凝集素-7的蛋白量。所有的免疫墨點實驗至少重複三次，且計算半乳醣凝集素-7的相對倍數變化，並對控制組校正之。

第 14 圖 Ras 與氟伐他汀所誘發的半乳醣凝集素 -7 表現上升有關。 a小圖：將PC9-IR細胞以10微體積莫耳濃度之氟伐他汀處理24小時。將Ras-GTP以Raf-RBD磁珠拉下(pulled down)。b小圖：將1微體積莫耳濃度之氟伐他汀與50及100微體積莫耳濃度之FTS共同投予細胞並作用24小時。以免疫墨點測定法測量半乳醣凝集素-1(LGALS1)、半乳醣凝集素-7(LGALS7)及泛Ras(pan Ras)的蛋白表現。聚異戊二烯化(prenylated)Ras(P)對應至下方條帶，而上方條帶對應至非聚異戊二烯化(unprenylated，UP)團簇。所有的免疫墨點實驗至少重複三次，且計算半乳醣凝集素-7的相對倍數變化，並對控制組校正之。

第 15 圖 半乳醣凝集素 -7 會影響氟伐他汀所誘發的細胞移行抑制。 a小圖：將控制組及敲落半乳醣凝集素-7的PC9-IR細胞以1微體積莫耳濃度之氟伐他汀前處理24小時，並進行穿透室移行測定法(n=3)。b小圖：以免疫墨點測定法測量CDH1、VIM及半乳醣凝集素-7的蛋白表現。所有的免疫墨點實驗至少重複三次，且計算CDH1、VIM及半乳醣凝集素-7的相對倍數變化，並對控制組校正之。

第 16 圖 氟伐他汀會增加皮膚癌 A-431 細胞中半乳醣凝集素 -7 的表現量。 以即時定量PCR分析A-431細胞中半乳醣凝集素-7的mRNA表現，所述細胞是以氟伐他汀(9.2微體積莫耳濃度)、載體控制組(DMSO)，或假實驗組(即，未處理的控制組)(Mock)處理24小時或48小時。以ΔΔCt法計算相對倍數變化；所有的樣本數據是對假實驗組樣本校正，並以GAPDH 作為內在控制。

Claims (18)

1. 一種能結合至半乳醣凝集素-7 (galectin-7)的抗體或其片段，包含： 一重鏈變異區，包含序列編號：1、2及3的胺基酸序列；以及 一輕鏈變異區，包含序列編號：4、5及6的胺基酸序列。
2. 如請求項1所述之抗體，其中該重鏈變異區與序列編號：7具有至少85％的序列相似度，且該輕鏈變異區與序列編號：8具有至少85％的序列相似度。
3. 如請求項2所述之抗體，其中該重鏈變異區具有序列編號：7的胺基酸序列，且該輕鏈變異區具有序列編號：8的胺基酸序列。
4. 一種用以篩選一用於治療一個體之乾癬或癌症之候選藥物的方法，包含： (a)    使角質細胞與一或多待測藥物反應； (b)  利用如請求項1所述之抗體來檢測步驟(a)之角質細胞中半乳醣凝集素-7的表現量；以及 (c)   基於步驟(b)中所檢測到的表現量，由該一或多待測藥物中篩選出該候選藥物，其中該候選藥物會增加半乳醣凝集素-7的表現量。
5. 如請求項4所述之方法，其中該候選藥物是斯他汀。
6. 如請求項5所述之方法，其中該個體罹患乾癬，且該斯他汀是氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、匹伐他汀，或辛伐他汀。
7. 如請求項5所述之方法，其中該個體罹患癌症，且該斯他汀是氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、匹伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、普伐他汀，或羅蘇伐他汀。
8. 如請求項4所述之方法，其中該抗體的重鏈變異區與序列編號：7具有至少85％的序列相似度，且該抗體的輕鏈變異區與序列編號：8具有至少85％的序列相似度。
9. 如請求項8所述之方法，其中該抗體的重鏈變異區具有序列編號：7的胺基酸序列，且該抗體的輕鏈變異區具有序列編號：8的胺基酸序列。
10. 一種用以治療一個體之乾癬或癌症的方法，包含： (1)  藉由以下步驟篩選出一用於治療該乾癬或該癌症的候選藥物： (1a)  使角質細胞與一或多待測藥物反應； (1b)  利用如請求項1所述之抗體來檢測步驟(1a)之角質細胞中半乳醣凝集素-7的表現量；以及 (1c)   基於在步驟(1b)中所檢測到的表現量，由該一或多待測藥物中篩選出該候選藥物，其中該候選藥物會增加半乳醣凝集素-7的表現量；以及 (2)  對該個體投予一有效量之藥學組合物以治療該個體，其中該藥學組合物包含在步驟(1c)中所篩選出的候選藥物，以及一藥學上可接受的載劑。
11. 如請求項10所述之方法，其中在步驟(1c)中所篩選出的候選藥物是斯他汀。
12. 如請求項11所述之方法，其中該個體罹患乾癬，且該斯他汀是氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、匹伐他汀，或辛伐他汀。
13. 如請求項11所述之方法，其中該個體罹患癌症，且該斯他汀是氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、匹伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、普伐他汀，或羅蘇伐他汀。
14. 如請求項10所述之方法，其中該個體罹患乾癬，且該藥學組合物更包含一TNF-α抑制劑，其中該TNF-α抑制劑是一抗-TNF-α抗體或一TNF-α拮抗劑。
15. 如請求項10所述之方法，其中該個體罹患癌症，且該藥學組合物更包含一腎素血管張力素系統(renin-angiotensin system，Ras)抑制劑，其中該Ras抑制劑是法尼基硫代水楊酸(farnesyl thiosalicylic acid，FTS)、ARS-853，或ARS-162。
16. 如請求項10所述之方法，其中該個體是人類。
17. 如請求項10所述之方法，其中該癌症是膀胱癌、膽管癌、骨癌、腦瘤、乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、惡性胚胎瘤、食道癌、上皮癌、胃癌、胃腸道基質瘤、神經膠質瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、頭頸癌、腸癌、卡波西氏肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、淋巴性白血病、黑色素瘤、骨髓性白血病、鼻咽癌、口腔癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、腎細胞癌、肉瘤、精細胞瘤、皮膚癌、脾臟癌、鱗狀細胞癌、畸胎瘤、畸胎上皮癌、甲狀腺癌，或甲狀腺濾泡癌。
18. 如請求項17所述之方法，其中該癌症是食道癌、肺癌、口腔癌，或皮膚癌。

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