ES2655079T3

ES2655079T3 - Uso de antagonistas de IL-33 para tratar enfermedades fibróticas

Info

Publication number: ES2655079T3
Application number: ES10815921.1T
Authority: ES
Inventors: Andrew L. Rankin; Stefan Pflanz; John Mumm
Original assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2009-09-10
Filing date: 2010-09-01
Publication date: 2018-02-16
Anticipated expiration: 2030-09-01
Also published as: US20120263709A1; EP2475388A4; US20140212412A1; WO2011031600A1; EP2475388B1; EP2475388A1

Abstract

Un antagonista de IL-33 para su uso en el tratamiento de la escleroderma en un sujeto, en donde dicho antagonista se selecciona de entre: un anticuerpo antagonista, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente a IL-33 (SEQ ID NO: 6); un polipéptido ST2 soluble; un ácido nucleico antisentido que bloquee específicamente la producción de IL-33 (SEQ ID NO: 6); y un ARNip que bloquee específicamente la producción de IL-33 (SEQ ID NO: 6).

Description

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DESCRIPCION

Uso de antagonistas de IL-33 para tratar enfermedades fibróticas Campo de la invención

La presente divulgación se refiere en general a métodos para tratar enfermedades fibróticas que implican los agentes que antagonizan la IL-33.

Antecedentes de la invención

La fibrosis se caracteriza por el exceso de acumulación de componentes de la matriz extracelular (ECM) que incluyen colágeno. Wynn (2008) J. Pathol. 214:199-210; Sivakumar y Das (2008) Inflamm. Res. 57:410-418. Se piensa que la fibrosis es una consecuencia de una irritación o daño tisular crónicos. Wynn (2008) J. Pathol. 214:199- 210; Friedman (2008) Gastroenterology 134:1655-1669; Trojanowska y Varga (2007) Curr. Opin. Rheumatol. 19:568- 573; Selman y Pardo (2006) Proc. Am. Thorac. Soc. 3:364-372. El remplazo progresivo con ECM de los tejidos parenquimatosos se observó en las enfermedades fibróticas tales como la esclerosis sistémica, fibrosis pulmonar idiopática y cirrosis hepática, dando lugar a la alteración de la función del órgano. Se estima que la fibrosis contribuye a casi un 45 % de las muertes en el mundo desarrollado. Sin embargo, los factores celulares y moleculares que sostienen la cascada fibrótica siguen estando poco entendidos.

La fibrosis pulmonar idiopática (IPF) es una enfermedad pulmonar no neoplásica caracterizada por la excesiva fibrosis (formación de tejido cicatricial) en el pulmón. Meltzer y Noble (2008) Orphanet J. Rare Dis. 3:8. Se estima que la IPF afecta a cinco millones de personas en el mundo, con una edad media de presentación de 66 años. La IPF normalmente es progresiva, con una supervivencia media de 2 a 5 años desde el diagnóstico. Id. El trasplante de pulmón es la única terapia eficaz actualmente. Véase también, Mendelian Inheritance in Man N° 178500, disponible en el sitio de internet de los Institutos Nacionales de la Salud de EE. UU. NCBI/OMIM. La etiología de la IPF no se entiende completamente.

La escleroderma (a la que también se hace referencia como esclerosis sistémica, o SSC) es una enfermedad autoinmunitaria del tejido conjuntivo que se caracteriza por una fibrosis extensa de la piel y órganos viscerales, así como la obliteración de la luz de pequeñas arterias. Gabrielli et al. (2007) Curr. Op. Immunol. 19:640. La progresión puede dar lugar a rigidez de la piel y daño del tracto gastrointestinal, pulmones, corazón y riñones. Se estima que 300.000 personas tienen escleroderma en los Estados Unidos, superando las mujeres a los hombres 4:1, y con una media de edad al diagnóstico a los 40. Se han observado comúnmente autoanticuerpos contra varios antígenos intracelulares (nucleares), y aunque su presencia es útil para el diagnóstico, no hay todavía una prueba directa que una estos anticuerpos a la patogénesis de la enfermedad. No hay actualmente una cura para la escleroderma, aunque a menudo está disponible el tratamiento se sus distintos síntomas.

Existe una necesidad de métodos mejorados para tratar las enfermedades fibróticas, tales como fibrosis pulmonar idiopática y escleroderma.

Sumario de la invención

La presente divulgación cumple con estas necesidades y más proporcionando métodos para tratar las enfermedades fibróticas que comprenden la administración de un antagonista de la IL-33.

En una realización, la fibrosis es una fibrosis de un tejido de la barrera epitelial, tal como la piel, pulmón o intestino. En distintas realizaciones, la enfermedad fibrótica se selecciona de entre el grupo que consiste en esofagitis eosinofílica, síndromes hipereosinofílicos (HES), endomiocarditis de Loeffler, fibrosis endomiocárdica, fibrosis pulmonar idiopática, y escleroderma. En realizaciones específicas, la enfermedad fibrótica es la fibrosis pulmonar idiopática y escleroderma.

En distintas realizaciones, el antagonista de la IL-33 se selecciona de entre el grupo que consiste en un anticuerpo antagonista (o fragmento de unión al antígeno del mismo), una molécula pequeña, un polipéptido ST2 soluble, o un inhibidor de la expresión de un ácido nucleico (tal como un ácido nucleico antisentido o una molécula de ARNip). En una realización específica, el antagonista de la IL-33 des un anticuerpo antagonista o un fragmento de unión al antígeno del mismo.

Breve descripción de los dibujos

Las FIG. 1A-D presentan los resultados obtenidos cuando se inyectaba por vía subcutánea la IL-33 en ratones, como se describe con más detalle en el Ejemplo 3.

La FIG. 1A presenta fotomicrografías de secciones de piel representativas obtenidas de ratones inyectados con albúmina sérica (MSA) (control) o ratones inyectados con IL-33 (IL-33) teñidas con H-E. En esta y otras figuras del presente documento, la letra “A” en la fotomicrografía indica el tejido adiposo subcutáneo y “F” indica una

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región más oscura de alguna manera del tejido subcutáneo fibrótico, que está presente solo en el tejido tratado con IL-33. En esta y otras figuras del presente documento, la barra de escala indica 200 mm.

La FIG. 1B muestra el contenido de colágeno (mg) en punciones dérmicas aisladas de ratones inyectados con MSA-(control) o IL-33. Los símbolos indican los valores obtenidos de ratones individuales y las líneas indican los valores medios a lo largo de las figuras. ***, p = 0,001; Ensayo t de Student.

La FIG. 1C muestra el número de eosinófilos en secciones de piel obtenidas de ratones inyectados con MSA- (círculos huecos) o IL-33 (círculos sólidos). ***, p = 0,001; Ensayo t de Student.

La FIG. 1D muestra el número de células CD3+ en secciones de piel obtenidas de ratones inyectados con MSA- (control) o IL-33 (círculos sólidos). Los experimentos se repitieron independientemente al menos dos veces con resultados comparables.

La FIG. 2 presenta fotomicrografías de secciones de piel representativas teñidas con H-E obtenidas de ratones B6/129F2 y C57B1/6 de tipo silvestre (fila superior), así como ratones IL-1RAcP'/'B6/129F2 y ST2'/_ C57B1/6 (fila inferior), que se habían inyectado todos ellos con IL-33. Los experimentos se llevaron a cabo al menos con 5 ratones por grupo y se repitieron independientemente al menos dos veces con resultados comparables. Véase el Ejemplo 4.

Las FIG. 3A-3D presenta el análisis TAQman® de expresión genética en tiempo real de la expresión de ARNm de distintos genes en las muestras de piel obtenidas de ratones inyectados con MSA-(círculos huecos) o IL-33 (círculos sólidos). La FIG. 3A muestra los resultados para las citocinas Th2 IL-4, IL-5 e IL-13. Las FIG. 3B y 3C muestran los resultados de distintos genes asociados con la ECM (colágeno VIa, colágeno IIIa, fibronectina, TIMP1, MMP-12 y MMP-13). La FIG. 3D muestra los resultados del TGF-p. Los puntos de datos individuales representan valores obtenidos de ratones individuales; las líneas indican el resultado medio. Los experimentos se repitieron independientemente al menos dos veces con resultados comparables. ***, p = 0,008; **, p = 0,016; *, p = 0,032; Ensayo U de Mann-Whitney. Véase el Ejemplo 5.

La FIG. 4 proporciona los niveles de expresión media (y errores estándar) de distintos genes asociados con la matriz extracelular (ECM) en las muestras de piel obtenidas de ratones inyectados con MSA-(“control”) o IL-33 (N = 5 ratones/afección). Los niveles de expresión se determinaron por un análisis TAQman® de expresión genética en tiempo real. La FIG. 4 también proporciona la relación de expresión en células KO a IL-33 y los niveles de la expresión en controles calculados utilizando el ensayo U de Mann-Whitney.

Las FIG. 5A-5G presentan los resultados de los experimentos para evaluar el papel de la IL-13 en las respuestas a IL-33, como se describe con más detalle en el Ejemplo 6.

La FIG. 5A presenta fotomicrografías de secciones de piel representativas obtenidas de ratones de tipo silvestre (TS) o IL-13 KO (IL-13_/") inyectados con IL-33, teñidas con H-E.

La FIG. 5B muestra el contenido de colágeno (mg) en punciones dérmicas obtenidas de ratones tratados con MSA-(control) y con IL-33 (IL-33) de tipo silvestre (TS) y IL-13-/- (KO). Los símbolos representan los valores obtenidos de ratones individuales y las líneas indican los valores medios a lo largo de la figura. ***, p<0,0001; Ensayo t de Student.

La FIG. 5C muestran el análisis TAQman® de expresión genética en tiempo real de los genes de colágeno VIa y colágeno IIIa en ratones de tipo silvestre e IL-13_/_ (KO) tratados con IL-33.

La FIG. 5D muestra un análisis TAQman® de expresión genética en tiempo real de los genes MMP12, MMP13 y TIMP1 en ratones de tipo silvestre (TS) e IL-13_/_ (KO) tratados con IL-33. ***, p = 0,008; *, p = 0,016. Ensayo U de Mann-Whitney.

La FIG. 5E muestra un análisis TAQman® de expresión genética en tiempo real de fibronectina en muestras de piel individuales obtenidas de ratones tratados con MSA-(control) o de tipo silvestre (TS) e I L-13_/" (KO) tratados con IL-33.

La FIG. 5F muestra el número de eosinófilos en secciones de piel obtenidas de ratones de tipo silvestre (TS) o IL-13_/_ (KO) inyectados con IL-33.

Descripción detallada

. Los números de registro de GenBank de las secuencias de ácido nucleico y proteínas a los que se hace referencia en el presente documento se refiere a los contenidos de la base de datos a la fecha de presentación de la presente solicitud. Aunque dichas entradas de la base de datos se pueden modificar posteriormente, el GenBank mantiene un registro público de todas las versiones anteriores de las secuencias en función de la fecha, haciendo que dichas entradas en la base de datos sea una referencia sin ambigüedad para una secuencia específica.

. La cita de referencias en el presente documento no tiene la intención de ser una admisión de que la referencia sea una técnica anterior relevante, ni constituye una admisión de los contenidos o fecha de estas publicaciones o documentos.

I. Definiciones

Como se utiliza en el presente documento, incluyendo las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de palabras tales como “un”, “una”, y “el”, incluyen sus correspondientes referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente otra cosa.

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“Aproximadamente” como se utiliza en el presente documento, se refiere al valor de un parámetro medido con el grado de precisión que se típico en la técnica. Específicamente, se refiere a un valor que estaría en las tolerancias típicas de dicho parámetro, como entiende un experto en la técnica.

Como se utiliza en el presente documento, a menos de que se indique otra cosa (por ejemplo, IL-33), la forma “madura” de una proteína se refiere a la cadena polipeptídica que permanece después de retirar la secuencia de señal (péptido líder), por ejemplo, la forma de la proteína que se secreta de la célula. Las secuencias de señal de las proteínas desveladas en el presente documento se enumeran en el Listado de Secuencias.

como se utiliza en el presente documento, “tejido de barrera epitelial” se refiere a los tejidos que tienen un contacto regular con el ambiente externo y proporciona una función de barrera. Los tejidos de barrera epitelial a modo de ejemplo incluyen la piel, pulmón e intestino.

Como se utiliza en el presente documento, el término “anticuerpo” puede referirse a cualquier forma de anticuerpo que presenta la actividad biológica deseada. Por lo tanto, se utiliza en un amplio sentido y específicamente cubre los anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos completamente humanos, etc., a condición de que presenten la actividad biológica deseada.

Como se utiliza en el presente documento, cuando se hace referencia a anticuerpos, las expresiones “fragmento de unión del mismo” o fragmento de unión al antígeno del mismo” engloba un fragmento o un derivad de un anticuerpo que mantiene aun sustancialmente la capacidad de unirse a su diana. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena sencilla, por ejemplo, scFv; y anticuerpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticuerpo. Normalmente, un fragmento de unión o derivado mantiene al menos un 10 % de su afinidad por su diana, por ejemplo, no más de un cambio de 10 veces en la constante de unión en equilibrio (Kd). Preferentemente, un fragmento de unión o derivado mantiene al menos un 25 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % (o más) de su afinidad de unión, aunque cualquier fragmento de unión con afinidad suficiente para ejercer el efecto biológico deseado será útil. También se tiene la intención de que, cuando se especifique, un fragmento de unión puede incluir variantes de secuencia con sustituciones de aminoácidos conservadoras.

Se une “específicamente” o “selectivamente”, cuando se hace referencia a la unión de un anticuerpo a su antígeno, indica una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros agentes biológicos. Como se entiende comúnmente en el campo, y se reitera en el presente documento por énfasis, un anticuerpo que se dice que se une específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia determinada (por ejemplo, IL-33) se une a los polipéptidos que comprenden la secuencia de IL-33 pero no se une a proteínas que carecen de la secuencia de IL-33. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido comprende IL-33 puede unirse a una forma marcada con FLAG® de IL-33, pero no se unirá a otras proteínas marcadas con FLAG®.

La expresión “anticuerpo monoclonal”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único epítopo antigénico. Por el contrario, las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) normalmente incluyen una multitud de anticuerpos dirigidos (o específicos para) diferentes epítopos. El adjetivo “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo de que se obtiene de una población de anticuerpo sustancialmente homogénea, y no se tiene que considerar que necesitan la producción del anticuerpo por cualquier método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a utilizar de acuerdo con la presente divulgación se pueden producir por el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al. (1975) Nature 256: 495, o se puede producir por métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la Pat. de EE. UU. N° 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” también se pueden aislar de bibliotecas de fagos utilizando las técnicas descritas, por ejemplo, en Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 y Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597.

Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen específicamente los anticuerpos “quiméricos” (inmunoglobulinas)en los que una parte de cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga con secuencias

correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie en particular o que pertenecen a una clase o

subclase de anticuerpo particular, aunque el resto de la cadena es idéntico u homólogo a las secuencias

correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de

anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, a condición de que presenten la actividad biológica deseada. Pat. de EE. UU. N° 4.816.567; Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855.

Como se utiliza en el presente documento, el término “anticuerpo humanizado” se refiere a formas de anticuerpos que contienen secuencias de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) así como secuencias de anticuerpos humanos. Dichos anticuerpos contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En

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general, los dominios variables de un anticuerpo humanizado comprenderán al menos una, y hasta seis de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) (a las que también se hace referencia como bucles hipervariables) de una inmunoglobulina no humana, con todas o sustancialmente todas las regiones marco conservadas (FR) derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana.

La expresión “anticuerpo completamente humano” se refiere a un anticuerpo que solo comprende secuencias proteicas de inmunoglobulina humana. Un anticuerpo completamente humano puede contener cadenas de carbohidrato murinas si se produce en un ratón, en una célula de ratón, o en un hibridoma derivado de una célula de ratón. De manera similar, un “anticuerpo de ratón” o un “anticuerpo de rata” se refieren a un anticuerpo que comprende solamente secuencias de inmunoglobulina de ratón o de rata, respectivamente. Un anticuerpo completamente humano se puede generar en un ser humano, en un animal transgénico que tenga secuencias de la línea germinal de inmunoglobulina humana, por fago de presentación u otros métodos de biología molecular.

“IL-33” se refiere a la interleucina-33 humana, y también se muestra con los alias IL-1F11, NF-HEV, y C9orf26. La IL- 33 se describe adicionalmente en internet en Mendelian Inheritance in Man (OMIM) entrada 608678 y con el ID Genético N° 90865, y las secuencias a modo de ejemplo de ácido nucleico y proteína de origen natural para la IL-33 humana se encuentran con los N° de registro en el GenBank NM_033439.2 (SEQ ID NO: 5) y AY905581 (SEQ ID NO: 6), respectivamente, todas ellas disponibles en el sitio de internet del NCBI. Véase también Schmitz et al. (2005) Immunity 23: 479-490. Una forma madura de IL-33 comprende los restos 112-270 de la SEQ ID NO: 6 se ha propuesto que es la forma activa de IL-33. Schmitz et al. (2005) Immunity 23: 479-490.

“ST2” como se utiliza en el presente documento es sinónimo de proteína T1/ST2, y también se conoce como IL- 1RL1, DER-4, IL-1R4, Fit-1 e IL-1RL1. El ST2 se describe adicionalmente en el OMIM con la entrada 601203 e ID Genético N° 9173. El “ST2 soluble” (sST2) se refiere a una variante extracelular de la forma unida a la membrana de ST2 (ST2L). Las secuencias de origen natural a modo de ejemplo de sST2 humano se encuentran con los N° de registro en el GenBank NM_003856.2 (SEQ ID NO: 7) / NP_003847 (SEQ ID NO: 8), y secuencias de origen natural a modo de ejemplo del ST2L humano se encuentran como NM_016232.4 (SEQ iD NO: 9) / NP_057316 (SEQ ID NO: 10), todos los cuales están disponibles a través del sitio de internet del NCBI. Como es evidente por la comparación de las SEQ ID NO: 8 y 10, sST2 que comprende los restos 1-323 de ST2L y cinco restos de aminoácidos (SKECF) adicionales en el extremo C.

“IL-1RAcP” significa la proteína accesoria del receptor de interleucina-1, también conocida como IL-1R3 e IL-1RAP. La IL-1RAcP se describe adicionalmente en internet en el OMIM con la entrada 602626 e ID Genético N° 3556, y las secuencias de origen natural para la IL-1RAcP humana se encuentra con los N° de registro en el GenBank NM_134470.2 (SEQ ID NO: 1) / NP_608273 (SEQ ID NO: 2), y NM_002182.2 (SEQ ID NO: 3) / NP_002173 (SEQ ID NO: 4), los cuales están disponibles en el sitio de internet del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI).

II. Tratamiento de enfermedades fibróticas con antagonistas de IL-33

La IL-33 es el miembro descubierto más recientemente de la familia de citocinas IL-1. Schmitz et al. (2005) Immunity 23:479-490. La IL-33 se expresa constitutivamente en los tejidos barrera tales como la piel donde se encuentra localizada preferentemente en el núcleo de las células epiteliales o endoteliales. Baekkevold et al. (2003) Am. J. Pathol. 163:69-79; Carriere et al. (2007) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 104:282-287; Kuchler et al. (2008) Am. J. Pathol. 173:1229-1242; Moussion et al. (2008) PLoS ONE 3:e3331. El receptor de la IL-33 está compuesto por dos subunidades, IL-1RAcP y ST2. Schmitz et al. (2005) Immunity 23:479-490; Chackerian et al. (2007) J Immunol 179:2551-2555; Pat. de EE. UU. N° 7.560.530.

La IL-1RAcP es expresa ampliamente, mientras que la expresión de ST2 se restringe a los tipos celulares que incluyen células Th2, eosinófilos, basófilos, células T NK y mastocitos. Schmitz et al. (2005) Immunity 23:479-490; Lohning et al. (1998) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 95:6930-6935; Suzukawa et al. (2008) Lab. Invest. 88:1245-1253; Kondo et al. (2008) Int. Immunol. 20:791-800; Cherry et al. (2008) J. Allergy Clin. Immunol. 121:1484-1490; Smithgall (2008) Int. Immunol. 20:1019-1030. Consistente con la expresión de ST2 por los tipos celulares asociados con Th2, la administración sistémica in vivo de IL-33 recombinante induce la producción de citocinas Th2, eosinofilia e hipersecreción mucosa en el pulmón y el intestino. Schmitz et al. (2005) Immunity 23:479-490; Kondo et al. (2008) International Immunology 20:791-800. La IL-33 se libera por las células que sufren muerte celular necrótica y a este respecto se cree que la IL-33 funciona como un patrón molecular asociado al daño (DAMP). Cayrol y Girard (2009) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 106:9021-9026; Haraldsen et al. (2009) Trends Immunol. 30:227-233; Lüthi et al. (2009) Immunity 31: 84.

Estudios recientes han revelado una asociación entre la ST2 y el desarrollo de múltiples enfermedades. Se descubrió un único polimorfismo nucleotídico en el promotor del gen de ST2 que se asocia con dermatitis atópica. Shimizu et al. (2005) Hum. Mol. Genet. 14:2919-2927. Además, los sueros obtenidos de pacientes con esclerosis sistémica y pacientes con fibrosis pulmonar idiopática que presentan una exacerbación aguda contenían niveles elevados de sST2. Kuroiwa et al. (2001) Biochem. Biophys. Res. Comm. 284:1104-1108; Tajima et al. (2003) Chest 124:1206-1214. La expresión de ST2 (ARNm) también se descubrió que estaba aumentada significativamente en el tejido hepático fibroso. Marvie et al. (2010) J. Cell. Mol. Med. 14(6b): 1726. Sorprendentemente, la administración de

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una proteína de fusión sST2-Fc exacerbaba las manifestaciones de enfermedad en un modelo de fibrosis hepática en el ratón. Amatucci et al. (2007) J. Leukocyte Biol. 82:124; WO 2007/140205.

La IL-44 se ha asociado con enfermedades fibróticas. El aumento de expresión de mensaje de IL-33 se observó en lesiones fibróticas y cirróticas adyacentes a las masas tumorales hepáticas. Marvie et al. (2010) J. Cell. Mol. Med. 14(6b): 1726. Además, la administración de IL-33 limitaba el desarrollo de fibrosis cardíaca en un modelo de hipertrofia cardíaca en el ratón (Sanada et al. (2007) J. Clin. Invest. 117:1538-1549), sugiriendo que la IL-33 se podría utilizar para tratar la fibrosis cardíaca (Pub. Sol. Pat. EE. UU. N° 2008/0003199). Los anticuerpos anti-IL-33, o variantes de los mismos, también se han propuesto para el tratamiento de trastornos inflamatorios, tales como el asma. Documento WO 2008/144610.

A pesar de estas observaciones, las consecuencias de la actividad sostenida de IL-33 en la piel no se habían comunicado anteriormente. Para determinar los efectos de la señalización mal regulada en la piel, se administró IL- 33 repetidamente por vía subcutánea y se controlaron los efectos en el sitio de inyección.

Los resultados que se presentan en el presente documento demuestran que la inyección subcutánea de rIL-33 puede inducir la acumulación de la matriz extracelular (colágeno) y abundante inflamación comprendida principalmente por eosinófilos, macrófagos y células T. Véase el Ejemplo 3 y las FIG. 1A-1D. Estos efectos mediados por IL-33 eran dependientes de ST2 e IL-1RAcP (Ejemplo 4 y FIG. 2), consistente con un mecanismo en el que la acumulación de ECM e inflamación resulta de la señalización de IL-33 mediante su receptor.

Los cambios patológicos inducidos por la IL-33 se asociaron con la expresión alterada de los genes de la ECM en las familias del colágeno, MMP, TIMP, y BMP. Véase el Ejemplo 5 y las FIG. 3A-3D y 4. En particular los niveles de expresión del colágeno VIa y colágeno IIIa aumentaban significativamente en las muestras de piel obtenidas de ratones inyectados con IL-33 sugiriendo que estos subtipos de colágeno pueden contribuir al aumento de la deposición de colágeno en la piel tratada con IL-33. La expresión de TIMP-1 y TIMP -2 también aumentaba con el tratamiento de IL-33. Los miembros de la familia TIMP pueden inhibir la actividad de colagenasa mediada por MMP, que puede promover la acumulación de colágeno inducida por IL-33 disminuyendo el remplazo de colágeno. Lambert et al. (2004) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 49:187-198.

Los datos adicionales indican que la IL-33 regula la expresión de estos genes mediante una ruta dependiente de IL- 13. Véase el Ejemplo 6 y FIG. 5A-5F. De manera interesante, la expresión de fibronectina-1 aumentaba independientemente de IL-13 en las muestras de piel inyectadas con IL-33, sugiriendo que la expresión de algunos componentes de la ECM puede que se regulen directamente mediante la IL-33 u otros mediadores independientes, corriente abajo, de IL-13. La FIG. 5E. Los datos totales de los inventores resaltan alteraciones mediadas por IL-33 en los niveles de expresión de distintos subtipos de colágeno así como enzimas que se sabe que afectan el remodelado de la ECM.

Los resultados de los experimentos presentados en el presente documento establecen que la IL-33 induce fibrosis cutánea e intensa inflamación, e identifican que la IL-33 es un nuevo factor suficiente para inducir fibrosis cutánea. Estos efectos profibróticos se observaron por primera vez en la piel de ratones que recibían múltiples inyecciones subcutáneas de IL-33, en los que la piel en el sitio de la inyección se engrosaba en los animales tratados con IL-33 pero no en los controles. Los experimentos presentados en el presente documento se llevaron a cabo entonces para investigar adicionalmente los efectos de la señalización mal regulada de la IL-33 en la piel. Se administró por vía subcutánea IL-33 y se controlaron sus efectos en el sitio de la inyección. La administración de IL-33 resultaba en una acumulación de eosinófilos, linfocitos CD3+, células mononucleares F4/80+ dependientes de IL-33R, que aumentaba la expresión de ARNm de IL-13, y el desarrollo de fibrosis cutánea. Esta fibrosis cutánea e inflamación era dependiente de ST2. Consistente con la remodelación tisular cutánea extensa, la IL-33 daba como resultado la modulación significativa de varios genes asociados con la matriz extracelular, incluyendo los del Colágeno VI, Colágeno III y TIMP1. La dependencia de la fibrosis inducida por IL-33 tanto de IL-13 como de eosinófilos se estableció utilizando ratones deficientes genéticamente. Los datos indican que los eosinófilos derivados de médula ósea secretan IL-13 en respuesta a la estimulación con IL-33, sugiriendo que esta IL-13 derivada de eosinófilos puede promover la fibrosis cutánea inducida por la IL-33, es decir, que a IL-13 es un mediador corriente abajo crítico de la fibrosis cutánea inducida por IL-33. En conjunto, estos resultados identifican la IL-33 como un mediador profibrótico no reconocido previamente y resalta las rutas celulares y moleculares por las que se desarrolla esta patología. Los datos también sugieren que la IL-33 puede funcionar como un DAMP endógeno implicado en el inicio de la enfermedad fibrótica. Véase Rankin et al. (2010) J. Immunol. 184:1526.

La IL-13 es una citocina profibrótica que es suficiente para la inducción de fibrosis en la piel y el pulmón. Zheng et al. (2009) J. Invest. Dermatol. 129:742-751; Zhou et al. (1999) J. Clin. Invest. 103:779-788. Además, la IL-13 es necesaria para el desarrollo de fibrosis en algunos modelos animales. Aliprantis et al. (2007) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 104:2827-2830; Liu et al. (2004) J. Immunol. 173:3425-3431; Kolodsick et al. (2004) J. Immunol. 172:4068- 4076; Chiaramonte et al. (1999) J. Clin. Invest. 104:777-785. La IL-13 han demostrado que modulan directamente la expresión de Colágeno VIa, Colágeno III y TIMP-1 en estudios previos. Syed et al. (2005) Resp. Res. 6:9; Leonardi et al. (2003) Invest. Ophthalmol. & Visual Sci. 44:183-189. Los resultados presentados en el presente documento muestran que la fibrosis inducida por IL-33 necesita la IL-13.

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La acumulación anormal de matriz extracelular es una característica que define las enfermedades fibróticas. En consecuencia, a la luz de estos resultados, neutralizando la actividad de IL-33, por ejemplo, por bloqueo con anticuerpos, moléculas pequeñas, o el receptor soluble, puede ser eficaz en el tratamiento de las enfermedades fibróticas tales como la esclerodermia y la fibrosis pulmonar idiopática. Además, el reclutamiento prominente de eosinófilos a los sitios de inyección de IL-33 sugiere que las enfermedades ricas en eosinófilos, tales como la esofagitis eosinofílica y los síndromes hipereosinofílicos pueden beneficiarse del bloqueo de la IL-33. El bloqueo de la actividad de IL-33 en los síndromes tales como la endomiocarditis de Loeffler y la fibrosis endomiocárdica también puede ser eficaz ya que estas enfermedades presentan tanto eosinofilia como fibrosis.

III. Antagonistas de IL-33

En distintas realizaciones, el antagonista de la IL-33 de la presente divulgación es un anticuerpo antagonista (o un fragmento de unión al antígeno del mismo), una molécula pequeña, un polipéptido soluble ST2, o un inhibidor de la expresión de ácido nucleico (tal como un ácido nucleico antisentido o una molécula de ARNip).

En realizaciones basadas en anticuerpos, los anticuerpos anti-IL-33 de la presente divulgación comprende anticuerpos de longitud completa o fragmentos de unión al antígeno tales como, pero sin limitarse a, Fab, Fab', Fab'- SH, Fv, scFv, F(ab')2, y diacuerpos. El uso de anticuerpos anti-IL-33 en el tratamiento de distintas enfermedades inflamatorias, tales como el asma, se desvelan en el documento WO 2008/144610.

Se puede utilizar cualquier método adecuado para generar anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, se puede inmunizar un receptor con la IL-33 o un fragmento antigénico de la misma. Se puede utilizar cualquier método adecuado de inmunización. Dichos métodos pueden incluiré adyuvantes, otros inmunoestimulantes, inmunizaciones de refuerzo repetidas, y el uso de una o más vía de inmunización. El antígeno producido puede ser un solo epítopo, múltiples epítopos. o solo la proteína completa o en combinación con uno o más agentes potenciadores de la inmunogenicidad conocidos en la técnica.

Se puede utilizar cualquier método adecuado para producir un anticuerpo con la propiedad biológica deseada de inhibición de la actividad de IL-33. Es deseable para preparar anticuerpos monoclonales (mAb) de varios huéspedes mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, seres humanos, etc. Se pueden encontrar técnicas para la preparación de dichos anticuerpos monoclonales, por ejemplo, en Stites et al. (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4a ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias citadas en el mismo; Harlow y Lane (1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL CSH Press; Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES: PRInCiPLES AND PRACTICE (2a ed.) Academic Press, New York, NY. Por lo tanto, se pueden obtener anticuerpos monoclonales por varias técnicas familiares para los investigadores expertos en la técnica. Normalmente, las células esplénicas de un animal inmunizado con el antígeno deseado se inmortalizan, comúnmente mediante la fusión con una célula de mieloma. Véase, Kohler y Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519. Los métodos alternativos de inmortalización incluyen la transformación con el virus de Epstein Barr, oncogenes, o retrovirus, u otros métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Doyle et al. (eds. 1994 y suplementos periódicos) CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDUrEs, John Wiley y Sons, New York, NY. Las colonias que aparecen de las células inmortalizadas únicas se exploran en cuanto a la producción de anticuerpos con la especificidad deseada y la afinidad por el antígeno, y se puede aumentar el rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidas por dichas células mediante distintas técnicas, que incluyen la inyección en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado. De manera alternativa, se pueden aislar secuencias de ADN que codifican un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo explorando una biblioteca de ADN a partir de célula B humanas de acuerdo, por ejemplo, con el protocolo general ideado por Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281.

Otras técnicas adecuadas implican la selección de bibliotecas de anticuerpos en fagos o vectores similares. Véase, por ejemplo, Huse et al. (1989) Science 246:1275; y Ward et al. (1989) Nature 341:544. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente divulgación se pueden utilizar con o sin modificación, incluyendo los anticuerpos quiméricos o humanizados. También se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes, véase Cabilly Pat. de EE. Uu. N° 4.816.567; y Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; o producidos en ratones transgénicos, véase Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; véase también las tecnologías Abgenix y Medarex®.

También se contemplan los anticuerpos quiméricos. Como se ha señalado anteriormente, los anticuerpos quiméricos típicos comprenden un parte de cadena pesada y/o ligera idéntica u homóloga con secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie en particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes de los anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como los fragmentos de dichos anticuerpos, a condición de que presenten la actividad biológica deseada (Pat. de EE. UU. N° 4.816.567; y Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).

Los antagonistas de la señalización de IL-33 también incluyen moléculas de ácido nucleico antisentido y de interferencia, tales como moléculas de ARNip. Las moléculas antisentido y de ARNip que reducen la expresión de IL-33 se pueden diseñar basándose en la secuencia codificante para la IL-33, como se desvela en el presente

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documento en la SEQ ID NO: 5. Los métodos para producir y utilizar el ARNip se desvelan, por ejemplo, en las Pat. de EE. UU. N° 6.506.559 (WO 99/32619); 6.673.611 (WO 99/054459); 7.078.196 (WO 01/75164); 7.071.311 y las publicaciones PCT WO 03/70914; WO 03/70918; WO 03/70966; WO 03/74654; WO 04/14312; WO 04/13280; WO 04/13355; WO 04/58940; WO 04/93788; WO 05/19453; WO 05/44981; WO 03/78097 (las patentes de EE. UU. se enumeran con las publicaciones PCR relacionadas). Los métodos a modo de ejemplo de utilización del ARNip en silenciamiento genético y tratamiento terapéutico se desvelan en las publicaciones PCT WO 02/096927 (VEGf y receptor de VEGF); WO 03/70742 (telomerasa); WO 03/70886 (proteína tirosina fosfatasa tipo IVA (Prl3)); wO 03/70888 (Chk1); WO 03/70895 y WO 05/03350 (enfermedad de Alzheimer); WO 03/70983 (proteína cinasa C alfa); WO 03/72590 (Map cinasas); wO 03/72705 (ciclina D); WO 05/45034 (enfermedad de Parkinson). Los experimentos a modo de ejemplo relacionados con los usos terapéuticos del ARNip también se han desvelado en Zender et al. (2003) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 100:7797; Paddison et al. (2002) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 99:1443; y Sah (2006) Life Sci. 79:1773. Las moléculas de ARNip también se han utilizado en ensayos clínicos, por ejemplo, de leucemia mieloide crónica (CML) (Clin-icalTrials.gov Identificador: NCT00257647) y degeneración macular relacionado con la edad (AMD) (ClinicalTrials.gov Identificador: NCT00363714).

Aunque el término “ARNip” se utiliza en el presente documento para referirse a moléculas que se utilizan para inducir el silenciamiento genético mediante la ruta de interferencia de ARN (Fire et al. (1998) Nature 391:806), dichas moléculas de ARNip no necesitan ser estrictamente polirribonucleótidos, sino que pueden contener a su vez una o más modificaciones del ácido nucleico para mejorar sus propiedades como agente terapéutico. Ocasionalmente, se hace referencia a dichos agentes como “ANip” para los ácidos nucleicos de interferencia cortos. Aunque dichos cambios pueden mover formalmente la molécula fuera de la definición de “ribo”nucleótido, no obstante se hace referencia a dichas moléculas como “ARNip” en el presente documento. Por ejemplo, algunos dúplex de ARNip comprenden dos cadenas de 19-25 nt (por ejemplo, 21 nt) que se emparejan para formar un polirribonucleótido dúplex de 17-23 pares de bases (por ejemplo, 19 pares de bases) con protuberancias TT (desoxirribonucleótido) 3' en cada cadena. Se utilizan otras variantes de ácidos nucleicos para inducir un silenciamiento genético mediante la ruta de interferencia de ARN incluyen los ARN horquillados cortos (“ARNhc”), por ejemplo, como se desvela en la Publicación de Sol. de Pat. de EE. UU. N° 2006/0115453.

Se cree que el ST2 soluble se une a IL-33 en solución, y por lo tanto actúa como un antagonista natural de la IL-33 bloqueando la unión al receptor de IL-33 de las superficies celulares. Chackerian et al. (2007) J Immunol 179:2551- 2555; Leung et al. (2004) J. Immunol. 173:145-150. El sST2 humano comprende la secuencia de restos de aminoácidos 19-328 de la SEQ ID NO: 8. El uso de una proteína de fusión sST2-Fc en el tratamiento de la fibrosis pulmonar se desvela en el documento WO 2007/140205.

El amplio alcance de la presente invención se comprende mejor en referencia a los siguientes ejemplos, que no tienen la intención de limitar las invenciones a las realizaciones específicas.

Ejemplos

Ejemplo 1

Métodos generales

Se describen los métodos convencionales de biología molecular. Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA. También aparecen métodos convencionales en Ausbel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley y Sons, Inc. New York, NY, que describe la clonación en células bacterianas y mutagénesis de ADN (Vol. 1), la clonación en células de mamífero y levaduras (Vol. 2), glicoconjugados y expresión de proteínas (Vol. 3), y bioinformática (Vol. 4).

Se han descrito los métodos para la purificación proteica incluyen la inmunoprecipitación, cromatografía, electroforesis, centrifugación y cristalización. Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley y Sons, Inc., New York. Se han descrito el análisis químico, modificación química, modificación post- traduccional, producción de proteínas de fusión glicosilación de proteínas. Véase, por ejemplo, Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley y Sons, Inc., New York; Ausubel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley y Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391. Se han descrito la producción, purificación, y fragmentación de anticuerpos policlonales y monoclonales. Coligan et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, John Wiley y Sons, Inc., New York; Harlow y Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow y Lane, supra. Las técnicas convencionales para la caracterización de las interacciones ligando/receptor están disponibles. Véase, por ejemplo, Coligan et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York.

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Los métodos de citometría de flujo, incluyendo los sistemas de detección por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS®), están disponibles. Véase, por ejemplo, Owens et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley y Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2a ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley y Sons, Hoboken, NJ. Los reactivos fluorescentes adecuados para modificar ácidos nucleicos, incluyendo los cebadores de ácido nucleico y las sondas, polipéptidos, y anticuerpo, para su uso, por ejemplo como reactivos de diagnóstico, están disponibles. Molecular Probes (2003) Catalog, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalog, St. Louis, MO.

Los métodos convencionales de histología del sistema inmunitario se han descrito. Véase, por ejemplo, Muller- Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, y Wilkins, Phila., PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, Ny.

Se pueden llevar a cabo análisis estadísticos utilizando un software disponible en el mercado, incluyendo pero sin limitarse a JMP® Statistical Discovery Software, SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, USA.

Los medios de crecimiento y los métodos se han proporcionado, por ejemplo, en Int'l. Pub. Sol. Pat. N° WO 90/03430 y Pat. de EE. UU. N° 5.830.761.

Ejemplo 2

Métodos relacionados específicamente con los experimentos descritos en el presente documento

Los animales y experimentos con animales eran los siguientes. B6/129.IL-1RAcP"/", B6.IL-1 R1-/-, B6.RAG-/" y 129S6.IL-13-/- los ratones se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos en Schering-Plough Biopharma de acuerdo con las directrices del IACUC. Cullinan (1998) J. Immunol. 161:5614-5620; Mombaerts et al. (1992) Cell 68:869-877; Glaccum et al. (1997) J. Immunol. 159:3364-3371; McKenzie et al. (1998) Curr. Biol. 8:339-342. Los ratones B6.ST2'/_ fueron un amable regalo del Neurath lab, University of Mainz; Hoshino et al. (1999) J. Exp. Med. 190:1541-1547. Los ratones BALB/c.AdblGATA, WB/B6F1.cKitw/v, B6.IL-4'/' y los de control apropiados se obtuvieron de los Jackson laboratories. Yu et al. (2002) J. Exp. Med. 195:1387-1395; Metwali et al. (1996) J. Immunol. 157:4546-4553. Los ratones B6/129 se obtuvieron de los Jackson laboratories. Los ratones C57B1/6 y 129S6 se obtuvieron en Taconic. La edad y sexo de los ratones coincidentes de 8 a 16 semanas de edad se utilizaron para los experimentos descritos.

Se inyectó a los ratones por vía subcutánea diariamente durante 7 días con 5 mg de MSA o mIL-33 recombinante. La IL-33 recombinante (AA1122-270) se produjo en E. coli por Aragen Biosciences y contenía < 0,5 QUE/ml de endotoxina. Veinticuatro horas después de la inyección final, se recolectó el sitio de la inyección para los análisis. Los protocolos experimentales se aprobaron por el Schering-Plough Biopharma IACUC.

Se llevó a cabo una RT-PCR de la siguiente manera. Se llevó a cabo el aislamiento de ARN por técnicas convencionales y se calculó la expresión genética utilizando el método A-ACt (utilizando el valor medio del umbral de ciclo para ubiquitina y el gen de interés de cada muestra). Se obtuvieron los cebadores en el mercado en Applied Biosystems (Foster City, CA) o se diseñaron utilizando un Primer Express (PE Biosystems, Foster City, cA). La ecuación 1,8e (Ct ubiquitina - Ct gen de interés) x 104 se utilizó para obtener los valores normalizados.

Se llevó a cabo la histología de la siguiente manera. Las muestras de piel del sitio de la inyección se recolectaron y se fijaron en formalina durante 24 horas. Las muestras se embebieron entonces en parafina y se cortó en secciones de 5 mm. Las secciones se tiñeron con H-E, tricrómica de Masson, o azul astra y violeta rojo según las directrices del fabricante (American MasterTech). Para cuantificar la infiltración con mastocitos y eosinófilos de la piel, las secciones teñidas con azul astra y violeta rojo se exploraron utilizando un escáner de portaobjetos Mirax Midi (Zeiss). Los mastocitos se identificaron basándose en las características de la tinción con astra azul de los gránulos de los mastocitos y la presencia de un núcleo único, mientras que los eosinófilos se identificaron por la tinción citoplasmática violeta rojo co-localizada con un núcleo bilobulado. Se seleccionó aleatoriamente un área mínima de 0,5 mm2 de piel por ratón y se vigiló para obtener cuentos celulares manuales. Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio de campo brillante (Olympus Modelo BX51) con una cámara digital acoplada (Q Imaging Model Retiga 2000R) y con equilibrado de blancos utilizando Adobe Photoshop Elements (v.2.0)

Se llevó a cabo la inmunohistoquímica (IHC) de la siguiente manera. Los estudios inmunohistoquímicos se llevaron a cabo en secciones de tejido fijados con formalina y embebidos en parafina utilizando un anticuerpo policlonal de conejo contra la anti-CD3 humano (n° de Catálogo A0452, Dalo Corp., dilución 1:200) y un anticuerpo monoclonal de rata contra anti-F4/80 humano (Clon BM8, eBioscience, dilución 1:400). Los tejidos embebidos en parafina se seccionaron con 5 mm de grosor, se desparafinaron y se templó con peróxido de hidrógeno durante 10 minutos. los portaobjetos se recuperaron por calor con tampón citrato a un pH 5,1 (n° Cat. S1699, Dako Corp.) durante 4 minutos a 123 °C utilizando una cámara Biocare Decloaker, después se enfrió durante 15 minutos seguido por un aclarado en agua corriente del gripo. Los portaobjetos se montaron en un DAKO Autostainer y se cubrieron con TBS recién preparado para evitar el secado de las secciones. Las secciones se incubaron entonces con los anticuerpos anti-

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CD3 o anti-F4/80 a temperatura ambiente durante 60 minutos y se aclararon con TBS. Las secciones CD3 teñidas se incubaron durante 30 minutos en Rabbit Envision-Plus (n° de Catálogo K4011, Dako Corp.). Las secciones con F4/80 teñido se incubaron durante 30 minutos con Rat Probe y después con Rat Polymer-HRP (n° de Catálogo RT517L, Biocare Medical). Los portaobjetos se aclararon con TBS y se desarrollaron con DAB-Plus (Dako Corp.), se contra-tiñeron en Hematoxilina modificada de Mayer y azulado en 0,3 de agua amoniacada seguido por un aclarado en agua del grifo. Las células CD3+ y F4/80+ se contaron como se ha descrito anteriormente.

El colágeno se cuantificó de la siguiente manera. Los niveles de colágeno soluble de la piel se cuantificaron utilizando el Ensayo Sricol™ de acuerdo con las directrices del fabricante (BioColor Ltd.). En resumen, se aisló una biopsia de punción de 6 mm del sitio de inyección y se retiró la grasa subcutánea. Las muestras se homogeneizaron en 3 ml de 0,5 M de ácido acético suplementado con inhibidores de proteasa Complete™ (Roche). Después de una noche de extracción a 4 °C, las muestras se centrifugaron y se ensayaron 0,2 ml del extracto para determinar el contenido de colágeno. Los resultados se presentan como los microgramos totales de colágeno extraído de 6 mm de biopsias dérmicas por punción.

Se llevó a cabo el análisis estadístico de la siguiente manera. Los análisis estadísticos para comparar el contenido de colágeno en la piel y el número de células entre los grupos experimental y de control se llevaron utilizando el ensayo t de Student, considerando los valores de p < 0,05 como significativos. Se analizaron los estudios que utilizaban los análisis de TAQman para comparar los niveles de expresión genética entre los grupos de control y experimental utilizando el ensayo U de Mann-Whitney. Se consideraba que los valores de p < 0,05 como significativos. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando el GraphPad Prism versión 4.02 para Windows (Software GraphPad).

Ejemplo 3

Inducción de fibrosis cutánea e inflamación mediada por IL-33

Para evaluar las consecuencias de la liberación de IL-33 mal reglada en la piel, se inyectó IL-33 o proteína de control (MSA) por vía subcutánea cada día durante 7 días. Los ratones inyectados con IL-33 y MSA no presentaban cambios discernibles en el comportamiento durante el curso de la serie de inyección (por ejemplo, prurito) ni se observó ninguna patología cutánea evidente. No obstante, el análisis histológico de la piel de los ratones inyectados con IL-33 pero no en los inyectados con MSA revelaba una inflamación y edema prominentes en el sitio de inyección (FIG. 1A) y el desarrollo de una fibrosis subcuticular como se demostraba por la tinción tricrómica de Masson (no mostrado). los niveles de colágeno solubles estaban aumentados aproximadamente 4 veces en las biopsias cutáneas por punción obtenidas de los ratones inyectados con IL-33 (FIG. 1B). La mayoría de los leucocitos infiltrados consistía en leucocitos granulocitos con agrupamientos densos de estas células ocasionalmente observados en el tejido adiposo subcutáneo (FIG. 1A). La tinción histoquímica revelaba que la mayoría de los leucocitos infiltrados eran eosinófilos y que la inyección subcutánea de IL-33 producía una acumulación significativa de estas células en comparación con la piel inyectada con MSA (FIG. 1C). Los niveles de expresión de proteína básica principal de eosinófilo en la piel de los ratones tratados con IL-33 y con el control MSA producían un patrón similar de resultados (datos no mostrados). Las células mononucleares CD3+ también aumentaban significativamente en la piel obtenida de los ratones inyectados con IL-33 (FIG. 1D) mientras que los mastocitos y células B220+ estaban presentes en cantidades similares en las secciones de piel obtenidas de ratones inyectados con IL-33 o MSA (datos no mostrados). No se observaron cambios patológicos en las secciones de piel adyacentes al sitio de inyección (datos no mostrados).

Ejemplo 4

El papel de ST2 e IL-1RAcP en la patología de piel inducida por IL-33

Para determinar si la inflamación inducida por IL-33 es dependiente de la señalización mediante el receptor IL-33, es está comprendido por ST2 e IL-1RAcP, se inyectaron ratones ST2'/_ e IL-1RAcP'/_ por vía subcutánea con IL-33. Ni los ratones IL-1RAcP'/_ ni los ST2'/_ presentaban signos histológicos de inflamación ni fibrosis subcuticular después de recibir las inyecciones de IL-33 (FIG. 2). La IL-1RAcPes una subunidad compartida de la IL-33 que también se empareja con IL-1R1 para formar el receptor heteromérico para IL-1 a e IL-p. Cullinan (1998) J. Immunol. 161:5614- 5620. Para determinar si la señalización mediante IL-1R1 es necesaria para el desarrollo de fibrosis cutánea e inflamación inducida por IL-33 los inventores trataron ratones IL-1R1'/_ por vía subcutánea con IL-33. Los ratones IL- 1R1-/- inyectados con IL-33 desarrollaron inflamación y fibrosis subcuticular de una manera que era indistinguible de los ratones de control, indicando que la señalización de IL-1 a/p no es necesaria para la patología cutánea inducida por IL-33 (datos no mostrados). Colectivamente, esos resultados demuestran que la administración subcutánea repetida de IL-33 induce una inflamación y fibrosis cutánea dependiente de ST2/ IL-1RAcP.

Ejemplo 5

Modulación de Th2 inducida por IL-33 y expresión genética asociada con la matriz extracelular

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Se examinó la expresión genética en la piel obtenida de los ratones inyectados con IL-33. Los ratones inyectados con IL-33 tenían una expresión significativamente aumentada de citocinas Th2 IL-4, IL-5 e IL-13 (FIG. 3A), mientras que la expresión de citocinas asociadas con Th1 y Th17, IFN-y e IL-17, respectivamente, permanecían sin cambios (datos no mostrados). Como la inyección repetida de IL-33 inducía el desarrollo de fibrosis subcuticular localmente, los inventores también examinaron la expresión de un panel de los genes asociados con la matriz extracelular (ECM) (FIG. 4). La piel inyectada con IL-33 presentaba un aumento sustancial de la expresión de distintos componentes de la ECM, tal como el colágeno VIa, colágeno IIIa y fibronectina-1 (FIG. 3B y 4). Además, la expresión de componentes de modificación de la ECM, tal como TIMP-1, MMP-12 Y MMP-13 también estaban significativamente elevados (FIG. 3C). De manera interesante, el tratamiento IL-33 también daba como resultado una reducción significativa de la expresión de varias isoformas de colágeno, incluyendo los colágenos II, IV, XI, XIII, XVI y XVIII (FIG. 4). Por lo tanto, estos resultados resaltan la nueva observación de que IL-33 puede modular la expresión de genes asociados a la ECM en la piel.

El TGF-p e IL-13 son dos citocinas conocidas por que tienen un papel crítico en la promoción de la enfermedad fibróticas en múltiples modelos animales. Wynn (2008) J. Pathol. 214:199-210. La piel aislada de ratones inyectados con IL-33 expresaban niveles de TGF-p que eran similares a los observados en las muestras de piel inyectadas con MSA (FIG. 3D). Debido a la expresión de IL-13 (FIG. 3A), pero no el TGF-p (FIG. 3D), estaba aumentada significativamente en las muestras de piel inyectadas con IL-33, parece que la fibrosis inducida por IL-33 puede desarrollarse de manera dependiente de la IL-13.

Ejemplo 6

Papel de IL-13 en la actividad de IL-33

Para determinar si la patología cutánea inducida por IL-33 necesita IL-13. Se inyectaron ratones IL-13-/- con IL-33 por vía subcutánea diariamente durante 7 días, se examinaron las muestras cutáneas histológicamente (FIG. 5A) y se cuantificó el contenido de colágeno. Las secciones cutáneas preparadas a partir de ratones IL-13_/" inyectados con IL-33 revelaban solo una tinción tricrómica menor en el subcutis (resultados no mostrados), y se descubrió que el contenido de colágeno en la piel obtenida de los ratones IL-13''- inyectados con IL-33 estaba significativamente reducido en comparación con los animales de tipo silvestre tratados con IL-33 (FIG. 5B) Sorprendentemente, el contenido de colágeno soluble en la piel obtenida de los ratones IL-13-'- inyectados con IL-33 era similar a los niveles observados en los animales tratados con la proteína de control, indicando colectivamente que la IL-13 actúa como mediador crítico de la fibrosis cutánea inducida por IL-33. Los niveles de expresión de Colágeno VIa, Colágeno IIIa, MMP12, MMP13 y TIMP1 estaban reducidos en la piel obtenida en ratones IL-13-'- inyectados con IL-33 en comparación con los ratones de tipo silvestre (FIG. 5C y 5D), mientras que la expresión de fibronectina estaba inducida de manera similar por IL-33 en ratones de tipo silvestre e IL-13-'- (FIG. 5E), indicando que la expresión de fibronectina dependiente de IL-33 se producía mediante un mecanismo independiente de IL-13.

Además, los ratones IL-13-'- inyectados con IL-33 presentaban una tendencia no significativa a reducir los infiltrados eosinofílicos en comparación con los ratones de tipo silvestre inyectados con IL-33 (FIG. 5F).

La Tabla 1 proporciona una breve descripción de las secuencias del listado de secuencias.

Tabla 1

Identificadores de secuencia

SEQ ID NO:: Descripción

1: isoforma de IL-1RAcP 2 ácido nucleico

2: Isoforma de IL-1RAcP 2 polipéptido

3: Isoforma de IL-1RAcP 1 ácido nucleico

4: Isoforma de IL-1RAcP 1 polipéptido

5: ácido nucleico de IL-33

6: IL-33 polipéptido

7: Isoforma de ST2 2 ácido nucleico

8: Isoforma de ST2 2 polipéptido

9: Isoforma de ST2 1 ácido nucleico

10: ST2 isoforma 1 polipéptido

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Schering Corporation Rankin, Andrew L. Pflanz, Stefan Mumm, John

5 <120> USO DE ANTAGONISTAS DE LA IL-33 PARA TRATAR UNA ENFERMEDAD FIBRÓTICA

<130> BP2009.7052

<150> 61/241.324 10 <151 >

<160> 10

<170> PatentIn versión 3.5 15

<210> 1 <211 > 2063 <212> ADN <213> Homo sapiens

20

<400> 1

tgccgggatc: caggtctccg gggtccgctt tggccagagg cgcggaagga agcagtgccc 60

ggcgacactg: oaccoatccc ggctgctttt gctgcgocct ctcagcttco caagaaaggc 120

atcgtcatgt: gatcatcacc taagaactag aacatcagca ggccctagaa gcctcactct 180

tgcccctccc: tttaatatct caaaggatga cacttctgtg gtgtgtagtg agtctctact 240

tttatggaat: cctgcaaagt gatgcctcag aacgctgcga tgactgggga ctagacacca 300

tgaggcaaat: ccaagtgttt gaagatgagc cagctcgcat caagtgccca ctctttgaac 360

acttcttgaa: attcaactac agcacagccc attcagctgg ccttactctg atctggtatt 420

ggactaggca: ggaccgggac cttgaggagc caattaactt ccgoctccco gagaaccgca 480

ttagtaagga: gaaagatgtg ctgtggttcc ggcccactct cctcaatgac actggcaact 540

atacctgcat: gttaaggaac actacatatt gcagcaaagt tgcatttccc ttggaagttg 600

ttcaaaaaga: cagctgtttc aattccccca tgaaactccc agtgcataaa ctgtatatag 660

aatatggcat: tcagaggatc acttgtccaa atgtagatgg atattttcct tccagtgtca 720

aaccgactat: oacttggtat atgggctgtt ataaaataca gaattttaat aatgtaatac 780

ccgaaggtat: gaacttgagt ttcotcattg octtaatttc aaataatgga aattacacat 840

gtgttgttac: atatccagaa aatggacgta cgtttcatct caccaggact ctgactgtaa 900

aggtagtagg: ctctccaaaa aatgcagtgc cccctgtgat ccattcacct aatgatcatg 960

tggtctatga: gaaagaacca ggagaggagc tactcattcc ctgtacggtc tattttagtt 1020

ttctgatgga: ttctcgcaat gaggtttggt ggaccattga tggaaaaaaa cctgatgaca 1080

tcaotattga: tgtcaccatt aacgaaagta taagtcatag tagaacagaa gatgaaacaa 1140

gaactcagat: tttgagcatc aagaaagtta octctgagga tctoaagcgo agctatgtct 1200

gtcatgctag: aagtgccaaa ggcgaagttg ccaaagcagc caaggtgaag cagaaaggta 1260

5

atagatgcgg: tcagtgatga atctctcagc tccaaattaa cattgtggtg aataaggaca 1320

aaaggagaga: ttgagaacaa gagagctcca gcacctagcc cgacggcatc taacccatag 1380

taatgaatca: aacttaaatg aaaaatatga aagttttcat ctatgtaaga tactcaaaat 1440

attgtttctg: atattgttag taccgtaatg cccaaatgta gctaaaaaaa tcgacgtgag 1500

tacagtgaga: cacaattttg tgtctgtaca attatgaaaa attaaaaaca aagaaaatat 1560

tcaaagctac: caaagataga aaaaactggt agagccacat attgttggtg aattattaag 1620

acccttttaa: aaatcattca tggtagagtt taagagtcat aaaaaagatt gcatcatctg 1680

acctaagact: ttcggaattt ttcctgaaca aataacagaa agggaattat atacctttta 1740

atattattag: aagcattatc tgtagttgta aaacattatt aatagcagcc atccaattgt 1800

atgcaactaa: ttaaggtatt gaatgtttat tttccaaaaa tgcataatta taatattatt 1860

ttaaacacta: tgtatcaata tttaagcagg tttataatat accagcagcc acaattgcta 1920

aaatgaaaat: catttaaatt atgattttaa atggtataaa catgatttct atgttgatag 1980

tactatatta: ttctacaata aatggaaatt ataaagcctt cttgtcagaa gtgctgctcc 2040

taaaaaaaaa: aaaaaaaaaa aaa 2063

<210>2 <211> 356 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>2

imagen1

Claims

5

10

15

20

25

30

REIVINDICACIONES

1. Un antagonista de IL-33 para su uso en el tratamiento de la escleroderma en un sujeto, en donde dicho antagonista se selecciona de entre:

un anticuerpo antagonista, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente a IL-33 (SEQ ID NO: 6); un polipéptido ST2 soluble;

un ácido nucleico antisentido que bloquee específicamente la producción de IL-33 (SEQ ID NO: 6); y un ARNip que bloquee específicamente la producción de IL-33 (SEQ ID NO: 6).
2. El antagonista para su uso de acuerdo con la Reivindicación 1, que es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se unen específicamente a la IL-33 (SEQ ID NO: 6).
3. El antagonista para su uso de acuerdo con la Reivindicación 2, en el que el anticuerpo, o el fragmento de unión al antígeno, son un fragmento de anticuerpo Fab, Fab', F(ab')2 o Fv.
4. El antagonista para su uso de acuerdo con la Reivindicación 1, que es un polipéptido ST2 soluble.
5. El antagonista para su uso de acuerdo con la Reivindicación 1, que es un ácido nucleico antisentido que bloquea específicamente la producción de IL-33 (SEQ ID NO: 6).
6. El antagonista para su uso de acuerdo con la Reivindicación 1, que es un ARNip que bloquea específicamente la producción de IL-33 (SEQ ID NO: 6).
7. El antagonista para su uso de acuerdo con la Reivindicación 1, que bloquea la unión de IL-33 a su receptor, receptor que comprende ST2 e IL-1RAcP.
8. El antagonista para su uso de acuerdo con cualquier Reivindicación anterior, en donde el sujeto es un ser humano y la IL-33 es la IL-33 humana (SEQ ID NO: 6).
9. Uso de un antagonista de IL-33 como se define en cualquier reivindicación anterior para la fabricación de un medicamento para tratar la escleroderma.

imagen1

imagen2

imagen3

B6/129F2 C57BI/6

IL-1 RAcP -/-

ST2-/-

imagen4

Fig. 2

co

-vj

imagen5

cp

co

DO

imagen6

co

o

o

o

o

_I

n

o

OK CTQ fD 3 * O *_

5T

imagen7

Fig. 3A

-i ro

o o

o o

________I_________I________

CJ

o

o

J

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imagen11

co

00

TI

(O

%

00

O

■V

ro w ■u OI

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

J___

__i__ __i___ __1___ __t

o o| o

t

TGF-pi

Fig. 3C

to <*) OI

o

o

o

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o

o

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o

o

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o

o

o

o

J___

__1___ ___1___ ___i___ «

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O

*

*

*

• %*

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imagen14

o

imagen15

o

_i_

O

imagen16

ro

o

i

imagen17

imagen18

COUA'I

COJ.3A1

COL1A1

COL14A1

COL10A1

COL9A1

MMP-3

MMP-20

TIMP-3

BMP4

10955,462

Control

IL-33

Media

Media

valor p

SEM

SEfvl

veces de ñ

761,419

139,112

3,126

19519,941

2751,498

2,176

9456,125

1311,370

1,769

515,309

1,661

0,056

COL4A5

9,013

10,089

1,000

COL12A1

C0L15A1

37,011

COL8A1

C0L17A1

COL7A1

98,811

0,468

COL19A1

1,317

0,463

COL16A1

191,405

0,455

28,342

COL4A1

0,422

0,469

0,282

0,008

COL2A

1,469

0,383

i uL i mi

1,732

7,444

0,947

0,372

50,161

7,910

COL18A1

24,400

39,187

8,464

0,582

C0L11A1

7,098

MMP-12

297,557

MivlP-25

3,361

1,316

MMP-7

1,301

MMP-19

MMP-24

1,051

MmP-17

0,410

0,382

0,076

,0.548

0,932

0,182

0,160

0,010

0,222

0,880

MMP-21

3,323

0,421

0,781

0,695

0,222

2,467

0,689

MMP-17

0,421

0,507

MMP.11

0,016

TIMP-?

1,451

0,440

4,440

BMP2

0,795

BMP 6

18,181

0,008

0,491

Fig.4

imagen19

imagen20

ti

cq'

CJ1

O

imagen21

o

J-

o

imagen22

imagen23

2250t *** íOt *** 12000

MMP12 MMP13 TIMP1

<Q

CJl

O

o

o

00

o

o

NJ

O

O

imagen24

n

o_

aj

ero

n>

3

O

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ST

n

o_

aj

ero

ÍD

fij

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