ES2854708T3 - Anticuerpos dirigidos contra la cadena alfa del receptor de IL7: su uso para la preparación de fármacos candidatos - Google Patents

Anticuerpos dirigidos contra la cadena alfa del receptor de IL7: su uso para la preparación de fármacos candidatos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo que se une a la cadena alfa del receptor de IL-7 (designado CD127) y presenta actividad citotóxica contra células positivas para CD127 humanas, en particular linfocitos T humanos que expresan CD127 (células CD127+), la cual es citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), y que tiene propiedades antagonistas hacia la interleucina 7 (IL-7), antagonizando de este modo el acceso de la IL-7 a CD127 en células positivas para CD127, caracterizado por que el anticuerpo es producido por el hibridoma MD707-3 depositado en la CNCM con el N.º I-4532.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos dirigidos contra la cadena alfa del receptor de IL7: su uso para la preparación de fármacos candidatos Se divulgan anticuerpos dirigidos contra la cadena alfa del receptor de interleucina 7 (IL-7), especialmente el receptor de IL-7 humana expresado en células humanas (también designado IL-7Ralfa o IL-7Ra humano). La cadena alfa del receptor de interleucina 7 (IL-7) también se designa CD127. La invención se refiere a anticuerpos como se define en la reivindicación 1. La invención se define en las reivindicaciones adjuntas y cualquier materia objeto que no esté dentro del ámbito de las reivindicaciones es solo para información.
Los anticuerpos de la invención tienen actividad citotóxica contra células positivas para CD127.
Además, se divulga el uso de estos anticuerpos para disminuir las subpoblaciones de linfocitos u otras poblaciones celulares que expresen CD127 (entre ellas los linfocitos T, los linfocitos B, linfocitos NK y las células dendríticas), como resultado de la acción citotóxica de los anticuerpos, mediante ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) y opcionalmente mediante CDC (citotoxicidad dependiente del complemento). Por consiguiente, también se divulga el uso de anticuerpos en el tratamiento de afecciones patológicas que implican la alteración de la respuesta inmunitaria en un paciente humano que conducen a un estado tolerogénico dominante o, por el contrario, a la falta de tolerancia, en que sería necesario el control del nivel de la respuesta inmunitaria, así como la destrucción de células malignas positivas para CD127. La invención proporciona más particularmente medios adecuados para su uso en patologías tal como las inducidas por el rechazo de trasplantes, las enfermedades autoinmunitarias, el linfoma o el cáncer, cuando estas patologías están asociadas con células positivas para CD127. Los linfocitos T indiferenciados son parcialmente responsables del rechazo agudo de órganos y tejidos trasplantados. Estas células pueden controlarse mediante los fármacos inmunosupresores actuales (inhibidores de la calcineurina) y por anticuerpos monoclonales que bloquean la coestimulación (inhibidores de CD80/86 antiadhesión). Los linfocitos T de memoria también son responsables del rechazo de trasplantes. Los linfocitos T de memoria se acumulan en el hombre debido a la historia inmunitaria adquirida, principalmente reacciones anteriores contra virus. Se ha demostrado que los aloantígenos pueden reactivar los linfocitos T de memoria como resultado de la "inmunidad heteróloga", que es la reacción cruzada de nuestras defensas antivíricas con aloantígenos (Adams et al, Immunol Rev 2003, 196, 147-60). La inmunidad heteróloga representa una barrera potente para la inducción de tolerancia dado que los linfocitos T de memoria, a diferencia de los linfocitos T indiferenciados, están programados para activarse rápidamente, con un requisito reducido de señales coestimuladoras. Los linfocitos T de memoria también pueden estar implicados en el rechazo crónico. Además de su papel en el trasplante de órganos y tejidos, los linfocitos T indiferenciados y de memoria también son corresponsables de muchas enfermedades autoinmunitarias. Este es el caso de la colitis ulcerosa (Shinohara et al, J. Immunol. 2011, 186: 2623-32), artritis reumatoide, psoriasis o enfermedad del injerto contra el hospedador.
Adicionalmente, se ha demostrado que varias células malignas presentan IL-7R. Este es el caso del linfoma cutáneo de Sezary (el 60 % de ellos) o de la leucemia linfoblástica aguda infantil, en la que aproximadamente el 15 % de los casos desarrollan una mutación de ganancia funcional en CD127, haciendo que estos tumores sean parcialmente dependientes de IL-7 (Shochat et al, J Exp Med. 9 de mayo de 2011;208(5):901-8).
CD127 se expresa en diversas células, entre ellas los linfocitos T de memoria e indiferenciados. CD127 se expresa en particular en linfocitos T efectores (Tef), entre ellos los linfocitos T en reposo y de memoria, y en linfocitos B inmaduros, pero, en especial, no se expresa en linfocitos T reguladores naturales en reposo (Treg naturales). IL-7Ra es esencial para estimular la diferenciación de timocitos y la expansión clonal de linfocitos.
El papel de la ruta de IL-7/CD127 en el rechazo de trasplantes ha sido sugerido por el efecto de un Acm anti-IL-7 que, cuando se asocia con el bloqueo de la coestimulación, prolonga la supervivencia de aloinjertos de corazón en ratones (Wang et al, Am J Transplant 2006, 6 (12), 2851-60). El papel de la ruta de IL-7/CD127 en la autoinmunidad también ha sido sugerido por el efecto de un Acm anti-IL-7Ra bloqueante que previno la encefalomielitis experimental autoinmunitaria en ratones (Liu et al, Nature Medicine 2010, 16 (2), 191-198).
La disminución de linfocitos T ha sido un enfoque inmunosupresor obvio para contrarrestar el rechazo de aloinjertos o combatir la autoinmunidad. Sin embargo, la disminución total de linfocitos T podría no ser favorable para la inducción de tolerancia inmunológica. Tener como objetivo a subpoblaciones de linfocitos T o linfocitos T activados selectivamente, sin modificar los linfocitos Treg, podría constituir un enfoque pro-tolerogénico (Haudebourg et al. Transpl Int 2009, 22 (5), 509-18). Por tanto, CD127 puede considerarse una diana terapéutica potencialmente atractiva para los anticuerpos monoclonales (los Acm) destinados a modular respuestas inmunitarias, ya que tales anticuerpos monoclonales podrían tener el potencial de disminuir los linfocitos efectores, pero no los reguladores. Por consiguiente, se ha asumido que podrían mostrar eficacia en trasplantes, la autoinmunidad (Michel et al, J Clin Invest. octubre de 2008; 118(10):3411-9.) y en neoplasias malignas al antagonizar el acceso de la IL-7 a IL7-R y, de este modo, limitar la función y el crecimiento de los linfocitos T y B.
Una terapia con un anticuerpo monoclonal contra células CD127+ con actividad citotóxica podría cumplir ese objetivo mediante la eliminación/neutralización de linfocitos T indiferenciados y de memoria al tiempo que se conservan los linfocitos Treg o se eliminan las células malignas positivas para CD127.
En este contexto, en el documento WO2010/017468 se han divulgado anticuerpos monoclonales contra IL-7Ra que tienen propiedades antagonistas hacia IL-7Ra, con vistas a tratar enfermedades autoinmunitarias como la esclerosis múltiple. Se dice que los anticuerpos descritos son antagonistas de la unión de la IL-7 a su receptor y activos contra la expansión y supervivencia de linfocitos Th17 y Th1, que se dice que precisan la interacción de la IL-7 con su receptor CD127.
En una publicación (Racape M. et al, Arch. Immunol. Ther. Exp., 2009, 57, 253-261) los autores analizaron el interés del receptor de IL-7 alfa como posible diana terapéutica en el trasplante. Habiendo revisado la expresión de la IL-7Ralfa en diversos linfocitos T y células que responden a IL-7, los autores determinaron si el direccionamiento a los linfocitos T de memoria que expresan IL-7Ralfa podría prolongar la supervivencia de aloinjertos en ratones y concluyeron que el direccionamiento a IL-7 o IL-7Ralfa conservaría ventajosamente a los linfocitos Treg. Entre las perspectivas, los autores señalaron que el direccionamiento a IL-7 o IL-7Ralfa en el tratamiento terapéutico podría tener distintas consecuencias sobre la supervivencia de las células que expresan CD127 y podría suscitar distintos tipos de linfocitopenia. También se planteó desde un punto de vista conceptual la cuestión de los efectos de los anticuerpos que estarían dirigidos contra IL-7Ralfa dependiendo de si eran anticuerpos bloqueantes o neutralizantes, o citotóxicos. No obstante, los autores no demostraron haber obtenido y sometido a ensayo tales anticuerpos y más bien expresaron la necesidad de realizar estudios adicionales para evaluar la relevancia de la hipótesis.
Chung Brile et al., Blood, American Society of Hematology, vol. 110, n.° 8, páginas 2803-2810, 2007 investigan si la enfermedad de injerto contra el hospedador (EICH) puede prevenirse mediante la administración de anticuerpos capaces de bloquear el receptor CD127. Describe anticuerpos producidos por hibridomas, cuya actividad de ADCC no se somete a ensayo ni se contempla.
El documento WO 2011/094259 divulga anticuerpos anti-CD127 humano humanizados de secuencia particular, con propiedad de ADCC para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias o inflamatorias. Se divulgan propiedades de ADCC a una concentración de anticuerpo de 10 pg/ml y sin efecto de citotoxicidad a 0,1 pg/ml.
En vista de los inconvenientes de los enfoques terapéuticos disponibles en enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario, incluido el rechazo agudo o crónico de trasplantes, y otras enfermedades que implican a IL-7/IL-7Ralfa, tales como distintos tipos de cánceres, entre ellos algunos cánceres de mama, todavía existe la necesidad de fármacos candidatos adicionales, especialmente de candidatos activos con respecto a dianas más selectivas, con el fin de controlar, por ejemplo, modular, la activación inmunitaria en pacientes humanos.
Los inventores satisfacen esta necesidad al proporcionar anticuerpos que tienen la capacidad de disminuir las células efectoras agresivas al tiempo que conservan los linfocitos T reguladores pro-tolerogénicos, y que han demostrado tener capacidad para eliminar las células malignas en el linfoma CD127+. De forma más general, los inventores divulgan en el presente documento anticuerpos que presentan una actividad citotóxica contra células CD127+ humanas, especialmente linfocitos T o B CD127+ humanos.
Los inventores proporcionan medios adecuados en este contexto, ya que obtuvieron anticuerpos monoclonales contra IL-7Ra que también ejercen una acción citotóxica contra las células CD127+ diana y reducen físicamente su número (contracción de la subpoblación). En un aspecto adicional, los inventores también han obtenido los anticuerpos que combinan esta propiedad con una actividad antagonista hacia la interacción IL-7/IL7-R. Estos Acm con mecanismos de acción nuevos constituyen, por lo tanto, nuevos productos para evaluar los beneficios terapéuticos del direccionamiento a CD127.
Por lo tanto, se divulga un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que se une a la cadena alfa del receptor de IL-7 (designada CD127), especialmente a la cadena alfa del receptor de IL-7 expresado por células positivas para CD127 humanas, y que presenta actividad citotóxica contra linfocitos T humanos que expresan CD127 (células CD127+). En particular del receptor de IL-7 expresado por linfocitos T humanos.
La invención se refiere más particularmente a un anticuerpo que se une a la cadena alfa del receptor de IL-7 (designada CD127) y presenta actividad citotóxica contra células positivas para CD127 humanas, en particular linfocitos T humanos que expresan CD127 (células CD127+), la cual es citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), y que tiene propiedades antagonistas hacia la interleucina 7 (IL-7), antagonizando de este modo el acceso de la IL-7 a CD127 en células positivas para CD127, caracterizado por que el anticuerpo es producido por el hibridoma MD707-3 depositado en la CNCM con el N.° I-4532, como se define en la reivindicación 1.
En un aspecto particular, los anticuerpos de la invención, o sus fragmentos funcionales de la presente divulgación, se dirigen contra la molécula CD127 presente en el receptor de IL-7 y, por consiguiente, son citotóxicos contra células humanas, especialmente linfocitos T humanos que expresan dicho receptor.
En un aspecto particular, los anticuerpos de la invención, o fragmentos funcionales de los mismos de la divulgación, se dirigen y se unen a la misma cadena alfa de IL7-R cuando se combina con el receptor de TSLP (también conocido como CCRF2; Número de Referencia AF338733; Reche P.A. et al J Immunol.167(1), 336-343 (2001)) como receptor de TSLP (Reche P.A. et al, 2001). El TSLP humano (número de referencia AF338732) es un factor que ejerce la polarización de las células dendríticas, estimula la proliferación y diferenciación de linfocitos T y B y se ha demostrado que desempeña un papel en las enfermedades de la piel y los pulmones (Rui et al., Ann N Y Acad. Sci. 2010, 1183: 13-24). Por consiguiente, se ha demostrado que Ts lP se asocia con diversas patologías que incluyen enfermedades inflamatorias de las vías respiratorias y dermatitis atópica en humanos y ratones (Ying S. et al. (2008) J Immunol 181:2790-2798; Jariwala SP. et al. (2011) Clin Exp Allergy 14 de junio). Además, se ha demostrado que TSLP se asocia con la regulación de la inmunidad e inflamación intestinal (Taylor BC. et al. (2009) J Exp Med 206: 655-667).
Un "fragmento funcional" de un anticuerpo como se divulga es parte del anticuerpo, es decir, una molécula que corresponde a una parte de la estructura del anticuerpo de la invención que presenta capacidad de unión a antígeno (también designado como fragmento de unión a antígeno) para la cadena alfa del receptor de IL-7 para IL-7 humana, posiblemente, en su forma nativa; tal fragmento presenta en especial la misma o sustancialmente la misma especificidad de unión al antígeno por dicho antígeno en comparación con la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo de cuatro cadenas correspondiente. La capacidad de unión a antígeno se puede determinar midiendo la afinidad del anticuerpo y del fragmento considerado.
Los fragmentos funcionales de anticuerpos son fragmentos que comprenden sus dominios hipervariables, designados las CDR (regiones determinantes de complementariedad), o una parte (o partes) de los mismos que abarcan el sitio de reconocimiento para el antígeno, es decir, el IL-7Ra de IL-7 humana, definiendo de este modo la especificidad de reconocimiento del antígeno. Cada cadena ligera y pesada (respectivamente VL y VH) de una inmunoglobulina de cuatro cadenas tiene tres CDR, designadas VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3 y VH-c Dr 1, VH-CDR2, VH-CDR3, respectivamente.
Además, se divulgan fragmentos de anticuerpos de la invención, que comprenden o consisten en todas o en una selección de las CDR entre VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3 y VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3, o porciones funcionales de los mismas, es decir, porciones que presentan la capacidad de unión deseada, preferentemente con una alta afinidad por el IL-7Ra de IL-7 humana.
Los fragmentos que comprenden o consisten en VH-CDR3 y/o VL-CDR3, o porciones funcionales de las mismas, son especialmente preferidos cuando las regiones CDR3 parecen ser determinantes en la especificidad de reconocimiento del antígeno.
El experto en la materia podrá determinar la ubicación de las diversas regiones/dominios de anticuerpos por referencia a las definiciones convencionales a este respecto expuestas, incluyendo un sistema de numeración de referencia [Martin, A.C.R. (2001) Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. En: Antibody Engineering Lab Manual, ed.: Duebel, S. y Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg] o por referencia al sistema de numeración de Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1987) o mediante la aplicación del algoritmo de "collar de perlas" del IMGT (http://www.imgt.org/IMGTindex/Colliers.html). A este respecto, para la definición de las secuencias divulgadas en el presente documento, cabe señalar que la delimitación de las regiones/dominios puede variar de un sistema de referencia a otro. Por consiguiente, las regiones/dominios tal como se definen en la presente divulgación abarcan secuencias que muestran variaciones en la longitud o localización de las secuencias en cuestión dentro de la secuencia de longitud completa de los dominios variables de los anticuerpos, de aproximadamente /- el 10 %.
Basándose en la estructura de inmunoglobulinas de cuatro cadenas, los fragmentos funcionales pueden, por tanto, definirse por comparación con secuencias de anticuerpos en las bases de datos disponibles y en la técnica anterior (Martin A.C.R. et al.), y especialmente por comparación de la ubicación de los dominios funcionales en estas secuencias, señalando que las posiciones del armazón y los dominios constantes están bien definidas para diversas clases de anticuerpos, especialmente para la IgG, en particular para las IgG de mamíferos.
Para un fin ilustrativo, los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo que contienen los dominios variables que comprenden las CDR de dicho anticuerpo abarcan Fv, dsFv, scFv, Fab, Fab', F(ab ')2, que están bien definidos con referencia a Kabat (NIH 1987), Martin A.C.R. et al. y también Roitt I. et al. (Fundamental and Applied Immunology MEDSI/McGraw-Hill). Los fragmentos Fv consisten en los dominios VL y VH de un anticuerpo asociados entre sí por interacciones hidrófobas; en fragmentos dsFv, el heterodímero VH:VL se estabiliza mediante un enlace disulfuro; en fragmentos scFv, los dominios VL y VH están conectados entre sí a través de un conector peptídico flexible, formando así una proteína monocatenaria. Los fragmentos Fab son fragmentos monoméricos que se pueden obtener mediante digestión de un anticuerpo con papaína; comprenden toda la cadena L y un fragmento VH-CH1 de la cadena H, unidos entre sí a través de un enlace disulfuro. El fragmento F(ab')2 puede producirse por digestión de un anticuerpo con pepsina debajo del disulfuro de la bisagra; comprende dos fragmentos Fab', y adicionalmente una porción de la región bisagra de la molécula de inmunoglobulina. Los fragmentos Fab' se pueden obtener a partir de fragmentos F(ab')2 cortando un enlace disulfuro en la región bisagra. Los fragmentos F(ab')2 son divalentes, es decir, comprenden dos sitios de unión a antígeno, como la molécula de inmunoglobulina nativa; por otro lado, los fragmentos Fv (un dímero VH-VL que constituye la parte variable de Fab), dsFv, scFv, Fab y Fab' son monovalentes, es decir, comprenden un único sitio de unión a antígeno.
Estos fragmentos básicos de unión a antígeno pueden combinarse para obtener fragmentos de unión a antígeno multivalentes, tales como diacuerpos, tricuerpos o tetracuerpos. Estos fragmentos de unión a antígeno multivalentes también son parte de la presente divulgación.
Las células humanas que expresan CD127 como una cadena del receptor de IL-7, que son la diana de los anticuerpos de la invención, y de acuerdo con la presente divulgación, de fragmentos de la misma, son principalmente linfocitos T y, más precisamente, son subpoblaciones de linfocitos T efectores, entre ellos linfocitos T indiferenciados y de memoria, pero no son linfocitos T reguladores, especialmente no son Treg naturales en reposo. Los linfocitos T de memoria se generan como resultado de la sensibilización con antígenos y se definen principalmente por sus características funcionales, entre ellas la capacidad de experimentar una proliferación de recuerdo tras la reactivación y la diferenciación en células efectoras y de memoria secundarias. De forma similar, el receptor de TSLP que se tiene como objetivo (como una estructura de combinación con la cadena alfa de IL7-R) domina la regulación de la diferenciación de linfocitos T auxiliares, de linfocitos B y de células dendríticas.
De acuerdo con una realización de la invención, los anticuerpos que tienen "actividad citotóxica contra linfocitos T" o propiedades citotóxicas (anticuerpos citotóxicos) dan lugar a la disminución de la población de linfocitos T efectores al destruir estas células y, por consiguiente, reducen el número de estas células cuando se administran. Por el contrario, estos anticuerpos no alteran la subpoblación de linfocitos T reguladores o no la alteran de forma significativa, permitiendo que los linfocitos Treg realicen su función.
En este contexto, en una realización particular, se ha observado que la relación de linfocitos T reguladores (Treg) frente a linfocitos T efectores (Tef) se eleva después de la administración de anticuerpos citotóxicos de la invención. En una realización particular, los anticuerpos citotóxicos de la invención permiten elevar dicha relación en aproximadamente el 10 % o más. En una realización particular, la relación de Treg frente a Tef es de aproximadamente el 20 %.
De acuerdo con la invención, los anticuerpos citotóxicos muestran citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
Las propiedades de ADCC se pueden evaluar en un ensayo de ADCC tal como el ensayo descrito en los Ejemplos. Cuando el anticuerpo es un anticuerpo de rata, las células efectoras utilizadas en el ensayo ADCC son linfocitos LAK (citolíticos activados por linfocinas) de rata. Cuando los anticuerpos son humanizados, el ensayo de ADCC se puede llevar a cabo en linfocitos LAK humanos.
De acuerdo con una realización particular de la invención, la actividad de ADCC de los anticuerpos de la invención se consigue con una concentración de anticuerpos de al menos 10 ng/ml. La ADCC se puede someter a ensayo con anticuerpos quiméricos, es decir, con anticuerpos cuyo fragmento constante (Fc) es un fragmento Fc humano.
Cuando un anticuerpo alberga actividad de ADCC como resultado de su unión al antígeno, el fragmento Fc puede ayudar a cumplir esta actividad.
En este sentido, la invención proporciona anticuerpos MD707-3 o divulga anticuerpos derivados de MD707-3, en particular anticuerpos MD707-3 quiméricos que tienen un fragmento Fc humano, que tienen un nivel de actividad de ADCC de al menos el 80 %, cuando se evalúa con células diana que expresan CD127 humana recombinante.
De acuerdo con otro aspecto, un anticuerpo citotóxico de la invención, o un fragmento funcional del mismo de la presente divulgación, tiene además propiedades antagonistas hacia la interleucina 7 (IL-7), antagonizando de este modo el acceso, es decir, la unión de IL-7 a CD127 en las células positivas para CD127.
"Propiedades antagonistas" se refiere a que los anticuerpos de la invención, o fragmentos funcionales de los mismos de la divulgación, que se dirigen a IL-7Ralfa, tienen el efecto de impedir la accesibilidad del receptor de IL-7 expresado en células CD127, especialmente linfocitos T efectores humanos, en particular linfocitos T de memoria humanos, para su compañera de unión IL-7, especialmente IL-7 humana. Como resultado de antagonizar la unión de IL-7, los anticuerpos de la invención o sus fragmentos funcionales de la divulgación conducen a linfocitopenia al prevenir la generación tímica de linfocitos T dependientes de IL-7. En los Ejemplos se describe una prueba para la medición de las propiedades antagonistas de los anticuerpos de la invención o fragmentos funcionales de los mismos de la divulgación.
Los anticuerpos de la invención que tienen propiedades tanto citotóxicas como antagonistas para células positivas para CD127 permiten efectos acumulativos de estas propiedades con respecto a la disminución de linfocitos T efectores, especialmente de linfocitos T de memoria, especialmente, permitiendo de este modo una disminución más fuerte (agotamiento del conjunto de células CD127+) y la correspondiente reducción del número de linfocitos T diana.
De acuerdo con otro aspecto, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo se une al receptor de TSLP a través de su cadena alfa de IL-7R. Como consecuencia, el anticuerpo o el fragmento funcional del anticuerpo de la invención realiza la inhibición de TSLP como resultado de la modificación de la diferenciación de linfocitos T y B, especialmente afectando a la denominada diferenciación TH-2 observada en algunas enfermedades autoinmunitarias y en el asma.
Un anticuerpo de la invención o un fragmento funcional del mismo de la divulgación se produce en particular de forma ventajosa contra una molécula que es el CD127 expresado por linfocitos T humanos, posiblemente se produce a partir de una inmunización en forma de polipéptido nativo o de molécula recombinante
La inmunización puede llevarse a cabo de acuerdo con el protocolo desvelado a continuación en los Ejemplos: Se utilizó la quimera de Fc CD127 recombinante (10975-H03H Sino Biological, Pekín, China) para inmunizar ratas, tales como ratas de la cepa LOU/C IgkIA disponible en la Universidad de Lovaina). Los hibridomas se obtuvieron fusionando células mononucleares de bazo con el inmunocitoma de rata LOU IR983F, una línea celular resistente a azaguanina y no secretora, de acuerdo con un procedimiento descrito anteriormente (Chassoux et al, Immunology 1988 65 623-628). Los hibridomas se cribaron en primer lugar de acuerdo con la capacidad de los anticuerpos monoclonales secretados para unirse a la molécula CD127 recombinante (quimera de CD127 Fc; 10975-H03H, Sino Biological, Pekín, China). A continuación, se cribó el hibridoma en cuanto a la capacidad de sus anticuerpos monoclonales para unirse al CD127 expresado por linfocitos T humanos.
De acuerdo con un aspecto particular como se divulga, un anticuerpo citotóxico o un fragmento funcional del mismo se selecciona del grupo de:
a) anticuerpos producidos por el hibridoma MD707-1, depositado en la CNCM con el N.° I-4531, o fragmentos funcionales de los mismos, o;
b) anticuerpos expresados por células eucariotas recombinantes que se recombinan con una molécula (o moléculas) de ácido nucleico idéntica al ADNc correspondiente al ARN expresado en el hibridoma MD707-1 depositado en la CNCM con el N.° I-4531, que codifica un anticuerpo de a) o un fragmento funcional del mismo, y;
c) anticuerpos modificados con respecto a a) o b), que tienen regiones CDR modificadas en su cadena pesada variable (VH) y/o en su cadena ligera variable (VL), en particular, manteniendo opcionalmente al menos una región CDR3, CDR2 y/o CDR1 idéntica en cualquiera de VH o VL o ambas, y/o que tienen regiones marco conservadas (FR) y/o constante (CH) modificadas, teniendo dicho anticuerpo modificado más del 70 % de identidad, especialmente más del 75 %, más del 80 %, más del 85 %, más del 90 %, más del 95 % o hasta el 99 % de identidad en toda la longitud de su secuencia de aminoácidos, con el anticuerpo de a) o b), o es un fragmento funcional del mismo.
En otro aspecto como se divulga, el anticuerpo o un fragmento funcional del mismo es citotóxico y antagonista con respecto a IL-7 y se selecciona del grupo de:
a) anticuerpos producidos por el hibridoma MD707-3 depositado en la CNCM con el N.° I-4532 o el hibridoma MD707-13 depositado en la CNCM con el N.° I-4533, o fragmentos funcionales de los mismos, o;
b) anticuerpos expresados por células eucariotas recombinantes que se recombinan con una molécula (o moléculas) de ácido nucleico idéntica al ADNc correspondiente al ARN expresado en el hibridoma MD707-3 depositado en la CNCM con el N.° I-4532 o el hibridoma MD707-13 depositado en la CNCM con el N.° I-4533, que codifica un anticuerpo de a) o un fragmento funcional del mismo, y;
c) anticuerpos modificados con respecto a a) o b), que tienen regiones CDR modificadas en su cadena pesada variable (VH) y/o en su cadena ligera variable (VL), en particular, manteniendo opcionalmente al menos una región CDR3, CDR2 y/o CDR1 idéntica en cualquiera de VH o VL o ambas, y/o que tienen regiones marco conservadas (FR) y/o constante (CH) modificadas, teniendo dicho anticuerpo modificado más del 70 % de identidad, especialmente más del 75 %, más del 80 %, más del 85 %, más del 90 %, más del 95 % o hasta el 99 % de identidad en toda la longitud de su secuencia de aminoácidos, con el anticuerpo de a) o b), o es un fragmento funcional del mismo. Los depósitos de hibridoma con el N.° I-4531, I-4532 e I-4533 se realizaron el 28 de septiembre de 2011 en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, París, Francia) según lo dispuesto por el Tratado de Budapest.
Sin embargo, la invención se refiere a un anticuerpo que se une a la cadena alfa del receptor de IL-7 (designado CD127) y presenta actividad citotóxica contra células positivas para CD127 humanas, en particular linfocitos T humanos que expresan CD127 (células CD127+), la cual es citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), y que tiene propiedades antagonistas hacia la interleucina 7 (IL-7), antagonizando de este modo el acceso de la IL-7 a CD127 en células positivas para CD127, caracterizado por que el anticuerpo es producido por el hibridoma MD707-3 depositado en la CNCM con el N.° I-4532, como se define en la reivindicación 1.
"Células de hibridoma" de acuerdo con la divulgación o invención son células generadas a partir de la fusión de células productoras de anticuerpos (linfocitos B) de un animal previamente inmunizado con un inmunógeno seleccionado y un compañero de fusión que son células de mieloma que proporcionan inmortalidad a la célula de fusión resultante. Las células de mieloma y las células productoras de anticuerpos (linfocitos B, tales como esplenocitos) pueden ser del mismo origen y son células eucariotas, en particular células de mamífero del mismo animal. Como alternativa, pueden ser de distinto origen, dando así lugar a un heterohibridoma. Las células de mieloma tales como el inmunocitoma de rata LOU IR983F, una línea celular no secretora y resistente a la azaguanina, se eligen entre las células que no producen inmunoglobulinas para permitir que el hibridoma preparado secrete sólo anticuerpos monoclonales de la especificidad deseada. Para la preparación de los anticuerpos mediante la expresión en células recombinantes, en lugar del inmunocitoma de rata, pueden utilizarse otras células adecuadas para estimular la ADCC, tales como las descritas en las páginas siguientes. Ventajosamente, tales células son células que tienen una capacidad de fucosilación baja o nula.
La preparación de los hibridomas adecuados para llevar a cabo la invención se realiza de acuerdo con técnicas convencionales. Las realizaciones se describen en detalle en los Ejemplos de la presente solicitud, cuyas características particulares divulgadas pueden adaptarse a otras células utilizadas como compañeras de fusión. Los hibridomas particulares útiles para la preparación de los anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos son MD707-1, depositado en la CNCM el 28 de septiembre de 2011 con el N.° I-4531 o MD707-3, depositado en la CNCM el 28 de septiembre de 2011 con el N.° I-4532 o MD707-13, depositado en la CNCM el 28 de septiembre de 2011 con el N.° I-4533. La invención se refiere al MD707-3, depositado en la CNCM el 28 de septiembre de 2011 con el N.° I-4532.
En vista de la enseñanza proporcionada por la presente invención en relación con las propiedades de los anticuerpos monoclonales obtenidos del hibridoma depositado, para expresar los anticuerpos de la invención, el experto en la materia podrá utilizar tecnologías alternativas tales como bibliotecas de expresión y sistemas de expresión, seguido de la selección de anticuerpos que tengan la estructura de los secretados por el hibridoma y que tengan sus propiedades de unión y neutralización. Pueden prepararse adecuadamente bibliotecas de ADNc a partir del ARN expresado en el hibridoma de la invención y seleccionarse y expresarse las secuencias apropiadas.
Los fragmentos funcionales de anticuerpo pueden obtenerse a partir del anticuerpo, especialmente utilizando digestión enzimática de acuerdo con técnicas bien conocidas que incluyen digestión con papaína o pepsina, o utilizando cualquier técnica de escisión apropiada. Pueden expresarse alternativamente en células hospedadoras modificadas mediante recombinación con secuencias de ácido nucleico que codifican la secuencia de aminoácidos de dichos fragmentos, o pueden sintetizarse, especialmente sintetizarse químicamente.
Por consiguiente, los anticuerpos de la invención, incluyendo los anticuerpos modificados y los fragmentos funcionales de los anticuerpos de la presente divulgación, también se pueden preparar mediante técnicas clásicas de ingeniería genética, tales como las descritos por Sambrook et al. [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989) y versiones actualizadas].
En conformidad con la invención, "unión" a la proteína IL-7Ra se refiere a una interacción de tipo antígenoanticuerpo y la referencia a las propiedades de "unión específica" de los anticuerpos de la invención o fragmentos funcionales de los mismos de la divulgación significa que los anticuerpos de la invención o fragmentos funcionales de los mismos de la divulgación se unen a la proteína IL-7Ra y, además, no se unen o se unen con una afinidad significativamente más débil a otras proteínas (por ejemplo, la cadena y del receptor de citocinas común). La capacidad de unión puede someterse a ensayo en conformidad con las pruebas divulgadas en los Ejemplos y, en particular, puede someterse a ensayo mediante ELISA o análisis de transferencia de Western.
En un aspecto particular, un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo comprende en su sitio de unión a antígeno al menos uno de los siguientes polipéptidos:
1) MD707-1, de acuerdo con la presente divulgación
a) para la cadena pesada variable:
(i) VHCDR 1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6,
(ii) VHCDR 2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8,
(iii) VHCDR 3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10,
(iv) VH que tiene una secuencia de aminoácidos de la posición 19 a la posición 141 en la SEQ ID NO: 2; y/o
b) para la cadena ligera variable:
(i) VLCDR 1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12,
(ii) VLCDR 2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14,
(iii) VLCDR 3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16,
(iv) VL que tiene una secuencia de aminoácidos de la posición 21 a la posición 133 en la SEQ ID NO: 4.
2) MD707-3, de acuerdo con la presente invención
a) para la cadena pesada variable:
(i) VHCDR 1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22,
(ii) VHCDR 2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24,
(iii) VHCDR 3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26,
(iv) VH que tiene una secuencia de aminoácidos de la posición 19 a la posición 141 en la SEQ ID NO: 18; y/o
b) para la cadena ligera variable:
(i) VLCDR 1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28,
(ii) VLCDR 2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30,
(iii) VLCDR 3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32,
(iv) VL que tiene una secuencia de aminoácidos de la posición 21 a la posición 133 en la SEQ ID NO: 20.
3) MD707-13, de acuerdo con la presente divulgación
a) para la cadena pesada variable:
(i) VHCDR 1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38,
(ii) VHCDR 2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40,
(iii) VHCDR 3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42,
(iv) VH que tiene una secuencia de aminoácidos de la posición 22 a la posición 135 en la SEQ ID NO: 34; y/o
b) para la cadena ligera variable:
(i) VLCDR 1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44,
(ii) VLCDR 2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 46,
(iii) VLCDR 3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48,
(iv) VL que tiene una secuencia de aminoácidos de la posición 22 a la posición 129 en la SEQ ID NO: 36. Además, se divulgan las versiones de los polipéptidos VH y VL que abarcan el péptido señal y corresponden respectivamente a la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 20, la SEQ ID NO: 34 y la SEQ ID NO: 36.
En vistas de utilizar un anticuerpo o sus fragmentos funcionales para la administración a un paciente humano, podría ser beneficioso obtener anticuerpos monoclonales humanizados o anticuerpos monoclonales quiméricos y/o anticuerpos desinmunizados, a partir de anticuerpos como se divulgan, que serían anticuerpos que no son de primates tales como los ilustrados en los Ejemplos, especialmente para reducir la reacción inmunitaria del hospedador o paciente receptor contra dichos anticuerpos. Los fragmentos funcionales de estos anticuerpos variantes también pueden obtenerse como variantes humanizadas, quiméricas o desinmunizadas.
Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, que es un anticuerpo humanizado, se obtiene por sustitución de un resto (o restos) de aminoácido presente en la región constante (o regiones constantes) de la cadena variable de un anticuerpo no humano como se divulga, es decir, en las regiones marco conservadas de VH y/o VL, por el resto (o restos) de aminoácido humano que tiene una ubicación correspondiente en los anticuerpos humanos de acuerdo con la definición y numeración convencional, en donde el nivel de sustitución es del 1 % al 20 %, en particular del 1 % al 18 % de los restos en dichas regiones constantes, es decir, el armazón. Dichas regiones constantes incluyen regiones FR definidas en los anticuerpos de cuatro cadenas.
Los ejemplos particulares de anticuerpos modificados abarcan anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y/o anticuerpos desinmunizados.
Un anticuerpo modificado particular como se divulga tiene restos de aminoácido modificados en las regiones CDR, dando como resultado dicha modificación una desinmunización por pérdida de los epítopos de linfocitos T en el dominio variable del anticuerpo no humano. La desinmunización se puede realizar después de la determinación de los epítopos de linfocitos T en el dominio variable del anticuerpo, especialmente por predicción informática, seguido de una mutación puntual en la secuencia de las cadenas variables del anticuerpo que elimine los epítopos de linfocitos T funcionales. En un aspecto preferente, la modificación de las regiones de la CDR (o de las CDR), especialmente de las regiones CDR3, está limitada al punto necesario para la desinmunización con vistas a la administración al cuerpo humano, por ejemplo, para disminuir la afinidad de unión de los receptores de linfocitos T por los complejos de HLA-clase Il/péptido. En una realización particular, la región (o regiones) CDR3 de la VH y/o de la VL no está modificada. En otra realización, las regiones FR y/o las regiones CH también se modifican, en especial, se humanizan.
Los anticuerpos como se divulgan, abarcan por consiguiente un anticuerpo basado en las características definidas anteriormente en el presente documento, el cual es un anticuerpo humanizado, especialmente uno obtenido por sustitución de un resto (o restos) de aminoácido presente en una región constante (o regiones constantes) de un anticuerpo de la invención, por el resto (o restos) de aminoácido humano que tiene una ubicación correspondiente en los anticuerpos humanos de acuerdo con la definición y numeración convencional, en donde el nivel de sustitución es del 1 % al 20 %, en particular del 1 % al 18 % de los restos en dichas regiones marco conservadas y, cuando sea apropiado, que se sustituye para desinmunización en algunas o todas las regiones CDR. Como se ha mencionado anteriormente, la humanización principalmente tiene como objetivo las regiones marco conservadas de los anticuerpos originales. En algunos casos, la humanización puede afectar como alternativa o además a la región (o regiones) CDR, especialmente a la región (o regiones) CDR1 y/o CDR2.
Por lo tanto, la humanización puede lograrse teniendo en cuenta los armazones de la cadena ligera o cadena pesada de la línea germinal humana que muestran la mayor identidad de secuencia con la secuencia del anticuerpo o fragmento no humano, y seleccionando los restos de aminoácido, especialmente restos expuestos en la superficie del anticuerpo, a sustituir en dicho anticuerpo no humano o fragmento del mismo, para que estén de acuerdo con los restos humanos correspondientes. En una realización particular, algunas o todas las regiones FRL y/o algunas o todas las FRH son completamente humanas, es decir, son características de las secuencias marco conservadas humanas. En otra realización, se sustituyen los restos seleccionados en algunas de todas las regiones FR.
Los métodos para humanizar anticuerpos también son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Routledege et al. ["Reshaping antibodies for therapy", en Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man, 13-44, Academic Titles, Nottingham, Inglaterra (1993)] o por Roguska et al. Protein Engineering, 9(10), 895-904, (1996)]. Estos métodos también pueden aplicarse a fragmentos de unión a antígeno, tal como scFvs.
A modo de ejemplo, el método conocido como "rechapado" consiste en reemplazar el conjunto de restos superficiales en los armazones de la región variable de un anticuerpo no humano por un conjunto humano de restos superficiales, mientras que el método conocido como injerto de CDR consiste en transferir las CDR de un anticuerpo no humano a las regiones marco conservadas de un anticuerpo humano. El injerto de CDR generalmente se completa mediante la optimización del armazón, consistente en la sustitución de algunos restos del armazón humano, para optimizar la afinidad de unión.
La etapa de optimización del armazón se ha simplificado recientemente mediante el uso de bibliotecas combinatorias (Rosok. et al. J. Biol. Chem. 271, 22611-22618, 1996; Baca et al. J. Biol. Chem. 272, 10678-10684, 1997).
Otra estrategia reciente disponible para la humanización de anticuerpos conserva solo las secuencias de CDR3 no humanas originales de la cadena ligera y pesada, mientras que la secuencia restante se selecciona de bibliotecas de genes V humanos nativos (Rader et al, Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 95, 8910-8915, 1998).
De acuerdo con otro aspecto particular como se divulga, los anticuerpos están modificados y son, como resultado, anticuerpos quiméricos que comprenden dominios o una hebra (o hebras) de restos de aminoácidos de distintos anticuerpos, en particular anticuerpos obtenidos de distintas especies animales, combinados en un anticuerpo funcional.
Los anticuerpos quiméricos, humanizados y/o desinmunizados pueden pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulinas, como los anticuerpos no modificados. Preferentemente, pertenecen a una subclase de la clase IgG tal como IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
Los métodos para la preparación de fragmentos de unión a antígeno recombinantes o anticuerpos quiméricos mediante la combinación de las regiones variables de un anticuerpo con los conectores apropiados o con las regiones constantes de otro anticuerpo, son bien conocidos en la técnica.
Se dice que los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales, lo que significa que una composición de estos anticuerpos es homogénea, especialmente idéntica, en términos de especificidad de unión al antígeno y, por consiguiente, en términos de la composición de las regiones variables. Por lo tanto, los anticuerpos pueden calificar como monoclonales incluso si se obtienen mediante técnicas alternativas a la técnica del hibridoma.
De acuerdo con otro aspecto, también se divulga una molécula quimérica que comprende un anticuerpo de acuerdo con cualquier definición proporcionada en el presente documento o un fragmento funcional del mismo, en donde dicho anticuerpo monoclonal o fragmento funcional del mismo está asociado con una molécula funcionalmente distinta. Una molécula quimérica puede ser una proteína quimérica de fusión o un conjugado resultante de cualquier forma adecuada de unión, incluida la unión covalente, el injerto, el enlace químico con un grupo químico o biológico o con una molécula, tal como un polímero de PEG u otro grupo o molécula protectora adecuada para la protección contra la escisión por proteasas in vivo, para mejorar la estabilidad y/o la semivida del anticuerpo o fragmento funcional. Con técnicas similares, especialmente por acoplamiento químico o injerto, puede prepararse una molécula quimérica con una molécula biológicamente activa, escogiéndose dicha molécula activa, por ejemplo, entre toxinas, en particular, exotoxina A de Pseudomonas (Risberg et al, PLoS One. 2011;6(9):e24012), la cadena A de la toxina vegetal ricina (Van Oosterhout et al, Int J Pharm. 19 de junio de 2001;221(1-2):175-86.) o la toxina saporina (Flavell et al, Br J Haematol. julio de 2006;134(2):157-70)), especialmente un principio activo terapéutico, un vector (que incluye especialmente un vector de proteína) adecuado para dirigir al anticuerpo o los fragmentos funcionales a células o tejidos específicos del cuerpo humano, o puede estar asociada con un marcador o con un conector, especialmente cuando se utilizan fragmentos de anticuerpo.
La PEGilación del anticuerpo o los fragmentos funcionales del mismo es una realización particularmente interesante, ya que mejora las condiciones de suministro de la sustancia activa al hospedador, especialmente para una aplicación terapéutica. La PEGilación puede ser específica de sitio para prevenir la interferencia con los sitios de reconocimiento de los anticuerpos o fragmentos funcionales, y puede realizarse con PEG de alto peso molecular. La PEGilación se puede lograr mediante restos de cisteína libres presentes en la secuencia del anticuerpo o fragmento funcional, o mediante restos de cisteína libres añadidos en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento funcional.
Además, se divulga una composición que comprende anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos como se define en el presente documento, en donde los anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos son una población homogénea de anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos, o son anticuerpos monoclonales o fragmentos funcionales de los mismos.
Además, se divulga una composición o un conjunto de compuestos que comprenden anticuerpos como se divulga en el presente documento, o una molécula quimérica, que comprende:
a) anticuerpos que tienen actividad citotóxica contra células positivas para CD127, especialmente linfocitos T CD127+, y propiedades antagonistas hacia la IL-7 humana o,
b) una población de anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos que tienen actividad citotóxica contra células positivas para CD127, especialmente linfocitos T CD127+ y una población de anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos que tienen propiedades antagonistas hacia la IL-7 humana, estando estas poblaciones de anticuerpos combinadas en una mezcla o separadas y, en esta última opción, formuladas para administración combinada o secuencial.
Las definiciones proporcionadas en el presente documento, especialmente en referencia a los anticuerpos de la invención, se aplican de manera similar a los fragmentos funcionales de los mismos de la presente divulgación, excepto cuando obviamente no es pertinente desde el punto de vista técnico. Estas definiciones también se aplican a moléculas (en particular anticuerpos quiméricos o moléculas quiméricas) o composiciones que comprenden estos anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos u obtenidos de estos anticuerpos, como se divulga en la presente divulgación. Se especifica además que los fragmentos funcionales de anticuerpos se obtienen de los anticuerpos desde un punto de vista conceptual o de diseño, pero pueden prepararse mediante diversas técnicas, no necesariamente recurriendo a los anticuerpos como productos.
Además, se divulga una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las definiciones proporcionadas en el presente documento. La invención se refiere más particularmente a una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 2.
Dicho ácido nucleico adecuado para la preparación de anticuerpos de la invención o fragmentos funcionales de los mismos de la presente divulgación se puede elegir especialmente del grupo de:
1) MD707-1 de acuerdo con la divulgación
i. un polinucleótido que codifica la región VH que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1, o su fragmento de la posición 55 a la posición 423,
ii. un polinucleótido que codifica la región VL que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3, o su fragmento de la posición 61 a la posición 399,
iii. un polinucleótido que codifica la región VHCDR1 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 5,
iv. un polinucleótido que codifica la región VHCDR2 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 7,
v. un polinucleótido que codifica la región VHCDR3 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 9,
vi. un polinucleótido que codifica la región VLCDR1 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 11,
vii. un polinucleótido que codifica la región VLCDR2 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 13,
viii. un polinucleótido que codifica la región VLCDR3 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 15.
2) MD707-3 de acuerdo con la invención
i. un polinucleótido que codifica la región VH que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 17, o su fragmento de la posición 55 a la posición 423,
ii. un polinucleótido que codifica la región VL que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 19, o su fragmento de la posición 61 a la posición 399,
iii. un polinucleótido que codifica la región VHCDR1 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 21,
iv. un polinucleótido que codifica la región VHCDR2 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 23,
v. un polinucleótido que codifica la región VHCDR3 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 25,
vi. un polinucleótido que codifica la región VLCDR1 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 27,
vii. un polinucleótido que codifica la región VLCDR2 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 29,
viii. un polinucleótido que codifica la región VLCDR3 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 31.
3) MD707-13 de acuerdo con la divulgación
i. un polinucleótido que codifica la región VH que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 33, o su fragmento de la posición 64 a la posición 405,
ii. un polinucleótido que codifica la región VL que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 35, o su fragmento de la posición 67 a la posición 387,
iii. un polinucleótido que codifica la región VHCDR1 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 37,
iv. un polinucleótido que codifica la región VHCDR2 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 39,
v. un polinucleótido que codifica la región VHCDR3 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 41,
vi. un polinucleótido que codifica la región VLCDR1 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 43,
vii. un polinucleótido que codifica la región VLCDR2 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 45,
viii. un polinucleótido que codifica la región VLCDR3 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 47.
De acuerdo con un aspecto particular como se describe en el presente documento, los polinucleótidos tienen nucleótidos modificados con respecto a la secuencia de la SEQ ID No : 1, la SEQ ID NO: 3, la SeQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 21, la SEQ ID NO: 23, la SEQ ID NO: 25, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 29, la SEQ ID NO: 31, la SEQ ID NO: 33, la SEQ ID NO: 35, la SEQ ID NO: 37, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 41, la SEQ ID NO: 43, la SEQ ID NO: 45 y/o la SEQ ID NO: 47 y,
a) codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de respectivamente la SEQ ID NO: 2 o su fragmento de la posición 19 a la posición 141, la SEQ ID NO: 4 o su fragmento de la posición 21 a la posición 133, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 18 o su fragmento de la posición 19 a la posición 141, la SEQ ID NO: 20 o su fragmento de la posición 21 a la posición 133, la SEQ ID NO: 22, la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 28, la SEQ ID NO: 30, la s Eq ID NO: 32, la SEQ ID NO: 34 o su fragmento de la posición 22 a la posición 135, la SEQ ID NO: 36 o su fragmento de la posición 22 a la posición 129, la SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 46 y/o la SEQ ID NO: 48 y/o
b) tener al menos el 85 %, preferentemente al menos el 90 %, más preferentemente al menos el 95 % y muy preferentemente al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad en toda su longitud con uno de los polinucleótidos que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o su fragmento de la posición 55 a la posición 423, la SEQ ID NO: 3 o su fragmento de la posición 61 a la posición 399, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 17 o su fragmento de la posición 55 a la posición 423, la SEQ ID NO: 19 o su fragmento de la posición 61 a la posición 399, la SEQ ID nO: 21, la SEQ ID NO: 23, la SEQ ID NO: 25, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 29, la SEQ ID NO: 31, la SEQ ID NO: 33 o su fragmento de la posición 64 a la posición 405, la SEQ ID NO: 35 o su fragmento de la posición 67 a la posición 387, la SEQ ID NO: 37, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 41, la SEQ ID NO: 43, la SEQ ID NO: 45 y/o la SEQ ID NO: 47.
Otro polinucleótido como se describe en el presente documento es un fragmento del polinucleótido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 21, la SEQ ID NO: 23, la SEQ ID NO: 25, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 29, la SEQ ID NO: 31, la SEQ ID NO: 33, la SEQ ID NO: 35, la SEQ ID NO: 37, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 41, la SEQ ID NO: 43, la SEQ ID NO: 45 y/o la SEQ ID NO: 47 y codifica un fragmento funcional de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de respectivamente la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 20, la SEQ ID NO: 22, la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 28, la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO: 32, la SEQ ID NO: 34, la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 46 y/o la SEQ ID NO: 48.
Los polinucleótidos de la invención o divulgación pueden ser secuencias optimizadas, especialmente para la expresión en células hospedadoras. Las técnicas de optimización en este campo son las convencionales.
Con el fin de recuperar los anticuerpos de la invención o divulgación a partir de células productoras, el polinucleótido puede comprender, cadena arriba de la secuencia de nucleótidos que codifica las cadenas de anticuerpo, una secuencia que codifica un péptido señal para la secreción del anticuerpo expresado.
El fragmento de polinucleótido anterior tiene ventajosamente una secuencia de al menos 9 nucleótidos y es más corto que su secuencia de origen.
De acuerdo con un aspecto particular de la presente divulgación, los polinucleótidos de la invención pueden comprender ventajosamente, además de una secuencia que codifica un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, o una molécula quimérica que incluye al mismo, como se divulga en el presente documento, una secuencia que codifica un péptido señal que permita la secreción de dicha proteína cuando se expresa en una célula de producción. Pueden también comprender una o más secuencias que codifican uno o más péptido marcador para detectar y/o facilitar la purificación de dicha proteína.
Se divulga también un vector para la clonación y/o para la expresión de un polinucleótido divulgado en el presente documento, y es especialmente un plásmido adecuado para la clonación y/o la expresión en células de mamífero, que comprende secuencias de regulación para la transcripción y expresión.
Además, se divulgan células o líneas celulares recombinadas con un polinucleótido como se describe en el presente documento, especialmente una célula o línea celular de mamífero o aviar. Por ejemplo, células de ovario de hámster chino, modificadas genéticamente para reducir la fucosilación total. De hecho, los anticuerpos que carecen de fucosilación de la parte central muestran una citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) significativamente potenciada (von Horsten et al, Glycobiology. diciembre de 2010;20(12):1607-18). Otro ejemplo es la línea celular EB66 que tiene propiedades de baja fucosilación de forma natural (Olivier et al, MAbs. 16 de julio de 2010;2(4)).
Por tanto, también se divulga un método para la preparación de un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, que comprende:
a) la obtención de un hibridoma después de la inmunización de un animal, especialmente de un mamífero, con la cadena alfa humana del receptor de IL-7 humano y, cuando sea necesario, el refuerzo de dicho animal con el mismo inmunógeno, la recuperación de células de bazo o ganglios linfáticos del animal que responden a la inmunización y la fusión de dichas células con células de mieloma para aislar anticuerpos monoclonales y b) la expresión de genes que codifican dichos anticuerpos, en forma recombinante, en células que presentan una capacidad de fucosilación baja o nula, tales como las células aviares EB66, en condiciones que permitan la recuperación de los anticuerpos, y
c) la recuperación de los anticuerpos que tienen la afinidad de unión deseada contra la cadena alfa del receptor de IL-7 humano.
Otro objeto de la divulgación es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, o una molécula quimérica, con un vehículo farmacéutico, en donde dicha composición farmacéutica opcionalmente comprende además un principio activo distinto. Otro objeto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica como se define en la reivindicación 3.
Además, se divulga una composición que comprende como ingrediente activo, un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, o una molécula quimérica de acuerdo con las definiciones proporcionadas en el presente documento, o una composición farmacéutica, en una formulación adecuada para controlar la supervivencia o expansión de células positivas para CD127 humanas, en particular células efectoras positivas para CD127 humanas, especialmente la supervivencia o expansión de linfocitos T de memoria CD127+, especialmente linfocitos T de memoria que son tanto CD127+ como CD8+, o que son células tanto CD127+ como CD4+, cuando se administra a un paciente humano. Otro objeto de la presente invención se refiere a una composición como se define en la reivindicación 4.
Como se define en la reivindicación 5, tal composición puede comprender además un compuesto adicional que tenga un efecto inmunomodulador terapéutico, en particular en células implicadas en alergia o autoinmunidad. Con fines ilustrativos, los inmunomoduladores de interés son otros anticuerpos monoclonales dirigidos a linfocitos T, tal como anticuerpos anti-CD3, anti-ICOS o anti-CD28 o proteínas recombinantes o anticuerpos dirigidos a células accesorias tales como CTLA41g o anticuerpos anti-CD40.
Además, se divulga un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, o una molécula quimérica como se define o ilustra en el presente documento, para su uso como principio activo en una combinación o régimen terapéutico suplementario en un paciente que lo necesite. Otro objeto de la presente invención se refiere a un anticuerpo o una molécula quimérica para su uso como principio activo en una combinación o régimen terapéutico suplementario en un paciente que lo necesite, como se define en la reivindicación 6.
Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, o una molécula quimérica de acuerdo con la divulgación, una composición farmacéutica o una composición como se define en el presente documento, se proponen en particular para su uso en un paciente humano para el tratamiento de afecciones patológicas influenciadas por respuestas inmunitarias, especialmente mediante respuestas de linfocitos T de memoria. Por consiguiente, los inventores propusieron que el anticuerpo o fragmento funcional del mismo, la molécula quimérica de acuerdo con la invención, la composición farmacéutica o la composición como se define en el presente documento, se use para prevenir el rechazo de trasplantes de órganos o tejidos o para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias o alérgicas, o para el tratamiento de un cáncer tal como el cáncer de mama asociado con células CD127+, o para el tratamiento de un linfoma cutáneo de linfocitos T, tal como el linfoma de Sezary, o para el tratamiento de la leucemia linfoblastoide aguda con mutación de ganancia de la ruta de IL7-R/TSLP. Al interactuar con anticuerpos para TSPLR o los fragmentos funcionales, también pueden inhibirse reacciones alérgicas tales como el asma. La invención se refiere más en particular a las aplicaciones terapéuticas definidas en la reivindicación 7.
Por "tratamiento" o "tratamiento terapéutico", se entiende que las etapas de administración realizadas dan como resultado la mejora de la situación clínica de un animal o un paciente humano que lo necesite, que padece un trastorno (o trastornos) asociado con la ruta de IL-7, es decir; que implica la activación o proliferación de células positivas para CD127. Dicho tratamiento tiene como objetivo mejorar el estado clínico del paciente animal o humano, eliminando o reduciendo los síntomas asociados con el trastorno (o trastornos) relacionado con la ruta de IL-7 o TSLP, es decir; que implica la activación o proliferación de células positivas para CD127, y/o en una realización preferida, restablecer la salud.
Las características y propiedades adicionales de la invención resultarán evidentes a partir de los siguientes Ejemplos y figuras.
Leyenda de las Figuras:
Figura 1 Disminución selectiva de linfocitos T indiferenciados y de memoria con MD707.
Figura 2 Perfil de ELISA de anticuerpos de rata anti-CD127 humano en placa recubierta con receptor de IL-7 humano recombinante a 5 pg/ml.
Figura 3 Reactividad cruzada de anticuerpos de rata anti-CD127 humano analizados por citometría de flujo en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humanas, CMSP de babuino, CMSP de macacos y células de bazo de rata. IFM: Intensidad mediana de fluorescencia. Las coordenadas en la abscisa son 101, 102, 103, 104, 105.
Figura 4 Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de anticuerpos de rata anti-CD127 humano después de 4 h de incubación con linfocitos citolíticos activados por linfocinas (LAK) de rata como células efectoras (E) y linfocitos T humanos marcados con 51Cr como células diana (T, forma siglada de target) en diferentes relaciones: E:T = 30:1 (cuadrado), E:T = 10:1 (triángulo), E:T = 3:1 (círculo) y E:T = 1:1 (rombo). El porcentaje de citotoxicidad específica se determinó mediante liberación de 51Cr.
Figura 5 Inhibición de la proliferación inducida por IL-7 por anticuerpos de rata anti-CD127 humano. Se incubaron linfocitos T humanos con anticuerpos durante 3 días en una placa recubierta con OKT3 (1 pg/ml) y proteína IL-7 humana recombinante soluble (IL-7hr; Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 10975-H08H) a 100 Ul/ml (cuadrado), 50 Ul/ml (círculo) o 10 Ul/ml (triángulo). La proliferación se determinó durante las últimas 8 horas de incubación mediante la incorporación de 3H-timidina (1 pCi/pocillo). La proliferación de linfocitos T humanos incubados en ausencia de anticuerpos anti-CD127 en una placa recubierta con OKT3 con lL-7hr fue de aproximadamente 105 cuentas por minuto (cpm).
Figura 6 Secuencias de aminoácidos y nucleotídicas de los dominios variables VH y VL de MD707-1 (A), MD707-3 (B) y MD707-13 (C). La secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido señal en cada fragmento variable está subrayada. Las secuencias de aminoácidos de respectivamente los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 en cada uno de los VH y VL para MD707-1, MD707-3 y MD707-13, están subrayadas, en conformidad con las secuencias divulgadas como SEQ ID. Por lo tanto, las secuencias de ácido nucleico que codifican estas secuencias de CDR están ubicadas de manera coincidente con las secuencias de aminoácidos subrayadas en la figura.
Figura 7 Ratones Balb/c machos de 8 semanas de edad recibieron 400 pg de Acm anti-IL-7Ra (clon A7R34) i.p. cada dos días durante 21 días (n = 5) o control de isotipo con el mismo programa (n = 5). Los ratones se sacrificaron el día 21; se recogió sangre y bazo para el recuento absoluto de linfocitos T mediante microscopía convencional con un dispositivo Malassez.
Figura 8 Ratones Balb/c machos de 8 semanas de edad recibieron 400 pg de Acm anti-IL-7Ra (clon A7R34) i.p. cada dos días durante 21 días (n = 5) o control de isotipo con el mismo programa (n = 5). Los ratones se sacrificaron el día 21; se recogieron ganglios linfáticos mesentéricos y el bazo para el fenotipado de linfocitos mediante citometría de flujo. Los ratones tratados con anti-IL-7Ra tenían una frecuencia de linfocitos T reguladores CD3+CD4+CD25+FOXP3+ significativamente mayor que los ratones de control, ya sea en los ganglios linfáticos (21,4 frente al 12,5 %) o en el bazo (20,3 frente al 11,6 % de linfocitos T CD4+) (p<0,01). Figura 9 Ratones Balb/c (H-2b) machos de 7 a 9 semanas de edad se volvieron diabéticos por estreptozocina 250 mg/kg i.p., 5-10 días antes del injerto. Cada receptor recibió aproximadamente 500 islotes aislados de ratones C57BL/6 (H-2d) machos de 7 a 9 semanas de edad. El grupo de control no recibió tratamiento; el grupo tratado recibió 400 pg de anticuerpo monoclonal anti-IL-7Ra (clon A7R34) i.p. cada dos días, comenzando desde 21 días antes del injerto y continuando hasta el día 90 postrasplante. Los ratones de control tuvieron una mediana de supervivencia del injerto de 21 días (intervalo: 14-34 días), mientras que 5 de los 6 ratones tratados tuvieron una supervivencia indefinida del injerto (> 160 días) (p = 0,0002, prueba del orden logarítmico).
Figura 10 Se compraron ratones hembra diabéticos no obesos (DNO) de 6 semanas de edad en Charles-River, Francia, y se mantuvieron en el bioterio de los inventores. Cada semana se midió la glucosa en sangre a partir de las 10 semanas de edad. El grupo de tratamiento recibió 400 |jg de anticuerpo monoclonal anti-IL-7Ra (clon A7R34) i.p. 3 veces por semana, durante 8 semanas desde la semana 8 hasta la semana 16 de edad. El grupo de control recibió PBS en el mismo volumen y con el mismo programa. A las 52 semanas de edad, 5/8 (62,5 %) de los ratones de control desarrollan diabetes, mientras que 1/8 de los ratones tratados tuvieron diabetes (p = 0,028, prueba del orden logarítmico).
Figura 11 Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) del anticuerpo anti-CD127 humano quimérico clon 3 en la línea celular BA/F3 de ratón transfectada con CD127 humano. Los linfocitos NK humanos utilizados como efectores (E) se incubaron durante 4 horas con células BA/F3 de ratón transfectadas con CD127 marcadas con 51Cr como células diana (T) en distintas relaciones: E:T = 3:1 (círculo), 10:1 (triángulo) o 30:1 (cuadrado), y con distinta concentración de MD707-3 quimérico. El porcentaje de citotoxicidad específica se determinó mediante liberación de 51Cr.
Figura 12 Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) del anticuerpo anti-CD127 humano quimérico clon 3 en líneas celulares de leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T (LLA-T) humanos. Los linfocitos NK humanos utilizados como efectores (E) se incubaron durante 4 horas con dos líneas celulares de LLA-T marcadas con 51Cr como células diana (T) en distintas relaciones: E:T = 1:1 (círculo), 3:1 (triángulo) o 10:1 (cuadrado), y con distinta concentración de MD707-3 quimérico. El porcentaje de citotoxicidad específica se determinó mediante liberación de 51Cr. A/ Las células diana fueron la línea celular de LLA-T DND41 que sobreexpresa CD127, B/ Las células diana eran la línea celular de LLA-T Jurkat que expresa un nivel bajo de CD127.
Ejemplos
I) Preparación y caracterización de anticuerpos monoclonales
1. Preparación y selección de nuevos Acm anti-CD127 humano
Se inmunizaron ratas con CD127h-Ig recombinante (CD127h fusionado con un fragmento constante de una inmunoglobulina - Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 10975-H03H) y los anticuerpos monoclonales se obtuvieron de acuerdo con técnicas convencionales. El protocolo de inmunización utilizado fue el siguiente: se utilizó la quimera de Fc CD127 recombinante (10975-H03H Sino Biological, Pekín, China) para inmunizar ratas de la cepa LOU/C IgklA. Se suspendieron cincuenta microgramos de proteínas en adyuvante completo de Freund y se administraron s.c. Después de 20 días, se realizó una inyección de recuerdo de la proteína suspendida en adyuvante incompleto de Freund. Se realizó otra inyección de recuerdo similar a los 60 días y se realizó una inyección de refuerzo en el día 90 con 100 microgramos de proteínas, 4 días antes de la recolección de células del bazo.
Los hibridomas se obtuvieron fusionando células mononucleares de bazo con el inmunocitoma de rata LOU IR983F, una línea celular resistente a la azaguanina y no secretora, de acuerdo con un procedimiento descrito anteriormente (Chassoux et al, Immunology 1988 65 623-628). Los hibridomas se cribaron en primer lugar de acuerdo con la capacidad de los anticuerpos monoclonales secretados para unirse a la molécula CD127 recombinante (quimera de CD127 Fc; 10975-H03H, Sino Biological, Pekín, China). A continuación, se cribó el hibridoma en cuanto a la capacidad de sus anticuerpos monoclonales para unirse al CD127 expresado por linfocitos T humanos.
En primer lugar, se seleccionaron trece clones basándose en el reconocimiento de CD127 recombinante (Sino Biologicals) por los anticuerpos secretados, entre los que se seleccionaron 9 además en el reconocimiento de CD127 expresado por linfocitos T humanos
Se produjeron los anticuerpos y se caracterizó su isotipo, así como sus afinidades, mediante medición por resonancia de plasmones superficiales utilizando tecnología BIAcore (Tabla 1). La invención se refiere al clon MD707-3: otros ejemplos son solo ejemplos de referencia/comparativos.
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Tabla 1: Isotipos y afinidades de los Acm anti-CD127
Reconocimiento de CD127r de los Acm anti-CD127-h evaluado por ELISA
Se inmovilizó CD127h recombinante (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 10975-H08H) sobre plástico y se añadieron dosis crecientes de los Acm para medir la unión. Después de la incubación y el lavado, se añadieron anticuerpos anti-inmunoglobulina de rata marcados con peroxidasa y se revelaron mediante métodos convencionales. Los resultados revelaron una mejor unión de MD707-1, 2, 3, 4, 9, 13, una unión intermedia de MD707-5 y 12, y una unión débil de MD707-6
Reactividad cruzada de los Acm anti-CD127 humano con primates no humanos
Los Acm mostrados en la tabla 1 se utilizaron en ensayos de citometría de flujo para estudiar la unión en linfocitos T de primates en comparación con linfocitos T humanos. Se utilizaron linfocitos T de rata como control negativo, ya que no se espera que los Acm de origen en rata reconozcan moléculas de rata. Los datos (Figura 3) muestran que todos los Acm analizados también reconocen los linfocitos T de primate (macacos cinomolgos y babuinos). Los linfocitos T de rata fueron negativos.
Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de los Acm anti-CD127 humano
ADCC se refiere a la unión de un anticuerpo a un epítopo expresado en células diana y el posterior reclutamiento dependiente del Fc de células inmunitarias efectoras que expresan receptores de Fc (esencialmente linfocitos NK y linfocitos activados), dando como resultado la destrucción de las células diana principalmente por mecanismos basados en granzima/perforina. Los Acm mostrados en la tabla 1 se utilizaron en los ensayos de ADCC. Se utilizaron como células efectoras para destruir linfocitos T humanos diana que expresan CD127 células citolíticas activadas por linfocinas (LAK) de origen de rata (debido a que el Acm se obtuvo de esplenocitos de rata), en presencia de los Acm. Los datos mostrados en la Figura 4 revelaron que solo los Acm 7MD07-1, 3, 6, 9 y 13 suscitar una ADCC. De manera interesante, no existe una correlación directa entre las propiedades de afinidad, unión y ADCC, lo que indica que las propiedades de ADCC no se pudieron predecir a partir de los análisis de unión.
Propiedades antagonistas de los Acm anti-CD127 humano
La capacidad de un Acm dado dirigido a un receptor para antagonizar la unión de un ligando a ese receptor depende probablemente de la capacidad del Acm para dirigirse a un epítopo que es utilizado por el ligando para acoplarse al receptor. Además, podría depender de la capacidad del Acm para modificar la conformación de la diana y, por lo tanto, modificar las propiedades de unión del receptor. Los datos mostrados en la Figura 5 revelaron que los Acm MD707-1, 2, 3, 4, 5, 12 y 13 fueron capaces de impedir el crecimiento de linfocitos T mediado por IL-7 mientras que MD707-6 y 9 lo hicieron solo en un grado limitado.
Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los Acm anti-CD127 humano
Las regiones VH y VL de los clones MD707 se secuenciaron utilizando la tecnología de PCR RACE. Brevemente, se extrajo el ARN total, se realizó una transcripción inversa y el ADNc resultante se poliadeniló en el extremo 3' de las moléculas utilizando dATP y la enzima transferasa terminal. Se realizó una primera reacción de PCR de 35 ciclos utilizando un cebador de anclaje de oligo dT y enzima Herculease (Stratagene). Se realizó una segunda PCR de 35 ciclos utilizando cebadores de anclaje de PCR anidada. El producto de PCR resultante se clonó luego con TA en E. coli y después de la selección con ampicilina, las colonias resultantes se cribaron mediante la determinación del perfil por enzimas de restricción y se secuenció el ADNc insertado. Las secuencias nucleotídicas y las secuencias de aminoácidos deducidas se muestran en la Figura 6 y en el Listado de secuencias
2. Actividad de anticuerpos monoclonales anti-CD127 sustitutos en la disminución de linfocitos T
Los Acm anti-CD127 humano sustitutos disminuyen los linfocitos Tef y aumentan las relaciones de Treg/Tef Para ilustrar cómo el Acm anti-CD127 afecta a los linfocitos T, ratones Balb/c (H-2b) machos de 9 semanas recibieron 400 |jg de Acm anti-CD127 (clon A7R34 dirigido contra CD127 de ratón), i.p. cada dos días durante 21 días. Se observó que los linfocitos T, como resultado, habían disminuido en sangre y en el bazo (Figura 7) (así como en los ganglios linfáticos y el timo, datos no mostrados). De manera interesante, en las células remanentes, la relación de células Treg, normalmente de aproximadamente el 10 %, se elevó hasta el 20 %, lo que indica una disminución preferencial de los linfocitos Tef frente a los linfocitos Treg (Figura 8).
Los Acm anti-CD127 humanos sustitutos previenen el rechazo de injertos de islotes pancreáticos
Para comprender cómo los Acm anti-CD127 podrían modular el rechazo de aloinjertos, se volvieron diabéticos ratones Balb/c (H-2b) machos de 7 a 9 semanas de edad mediante estreptozotocina 250 mg/kg i.p. 5-10 días antes de la implantación de islotes pancreáticos de ratones C57BL/6 (H-2d). Se observó que los ratones de control tenían una mediana de supervivencia del injerto de 21 días (intervalo: 14-34 días), mientras que 5 de los 6 ratones tratados

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo que se une a la cadena alfa del receptor de IL-7 (designado CD127) y presenta actividad citotóxica contra células positivas para CD127 humanas, en particular linfocitos T humanos que expresan CD127 (células CD127+), la cual es citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), y que tiene propiedades antagonistas hacia la interleucina 7 (IL-7), antagonizando de este modo el acceso de la IL-7 a CD127 en células positivas para CD127, caracterizado por que el anticuerpo es producido por el hibridoma MD707-3 depositado en la CNCM con el N.° I-4532.
2. Una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, con un vehículo farmacéutico, en donde dicha composición farmacéutica opcionalmente comprende además un principio activo distinto.
4. Una composición que comprende como principio activo un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o una composición farmacéutica de la reivindicación 3, en una formulación adecuada para controlar la supervivencia o expansión de células CD127+, en particular, linfocitos T de memoria CD8+ y CD4+ cuando se administra a un paciente humano.
5. Una composición de las reivindicaciones 3 o 4, que comprende además un compuesto adicional que tiene un efecto inmunomodulador terapéutico, en particular sobre células implicadas en alergia o autoinmunidad.
6. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, para su uso en un método de tratamiento como principio activo en una combinación o régimen terapéutico suplementario en un paciente que lo necesite.
7. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, una composición farmacéutica de la reivindicación 3 o una composición de la reivindicación 4, para su uso en un método de tratamiento en un paciente humano para la prevención del rechazo de trasplantes de órganos o tejidos o para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o alérgica, o para el tratamiento de un cáncer tal como el cáncer de mama asociado con células CD127+, o para el tratamiento de un linfoma, tal como el linfoma de Sezary o la leucemia linfoblástica aguda con mutación de ganancia en la vía de señalización de IL7-R/TSLP.
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