CN114466864A - 多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明尤其提供了能够抑制IL‑7和/或L‑TSLP与IL‑7R(IL‑7R)的结合的多肽，以及包含这些多肽的构建体和药物组合物。

Description

多肽
技术领域
本发明涉及能够抑制IL-7和/或L-TSLP结合至IL-7R的多肽，以及包含这些多肽的构建体和药物组合物。本发明还涉及编码此类多肽的核酸，用于制备此类多肽的方法，包含编码此类多肽的核酸的cDNA和载体，表达或能够表达此类多肽的宿主细胞以及此类多肽的用途。
背景技术
胃肠道的自身免疫疾病
胃肠道的自身免疫疾病包括炎性肠病诸如克罗恩氏病(CD)和其他自身免疫疾病诸如嗜酸细胞性食管炎(EoE)。克罗恩氏病(还被称为克罗恩综合征)和局限性肠炎导致各种各样的症状。它主要导致腹痛、腹泻、呕吐和/或体重减轻，但是也导致胃肠道(GIT)之外的并发症，诸如贫血、皮疹、关节炎、眼部炎症、疲劳和缺乏注意力(Baumgart等人2012)。克罗恩氏病目前是不可治愈的终身胃肠道疾病，其难以用常规疗法控制。EoE是通过局限于食管的显著病理性嗜酸性粒细胞浸润定义的慢性疾病，所述病理性嗜酸性粒细胞浸润导致食管功能障碍并且如果不进行治疗则导致纤维化。食管纤维化和食管狭窄是已知的EoE并发症。
基于抗体的治疗剂具有作为针对自身免疫疾病诸如IBD和EoE的有效治疗的显著潜力，因为它们具有针对它们的靶的高特异性和低固有毒性。三种抗TNF-α抗体英夫利昔单抗(商品名类克(Remicade))、阿达木单抗(商品名修美乐(Humira))和赛妥珠单抗(或‘赛妥珠单抗(certolizumab pegol)’，商品名希敏佳(Cimzia))在临床上用于治疗克罗恩氏病；然而这些抗体由于它们的固有不稳定性和易受由消化系统、肠道中病理位点处存在的炎性蛋白酶和肠道微生物菌群进行的蛋白水解降解影响的特性而通常被认为不适于作为口服治疗剂施用。因此这些剂必须通过静脉内输注或皮下注射施用，这需要专业训练以便正确且安全地使用皮下注射器或针头。这些剂还需要无菌设备、治疗性多肽的液体配制品、呈无菌且稳定形式的所述多肽的小瓶包装和受试者上用于插入针头的合适位点。受试者在接受注射之前通常经历心理应激并且在接受注射时经历疼痛。用这些系统性抗TNF-α抗体进行的长期治疗具有增加严重感染和癌症的风险。结合高生产成本，这些因素当前限制这些剂对于患有更多严重疾病的患者的使用。
若干小分子抗炎药物和免疫抑制性药物当前也用于针对克罗恩氏病的临床开发(Danese 2012，Shealy等人2010和Vetter&Neurath 2017)。虽然这些药物口服施用，但是许多在施用之后将被系统性吸收，并且因此可以具有与针对胃肠道病灶的作用不相关的系统性免疫抑制作用。此外，因为小分子缺乏抗体的特异性，所以保持高风险的显著脱靶副作用。
递送对于与胃肠道的自身免疫疾病相关联的靶具有高选择性但是具有限于胃肠道的暴露和活性的口服治疗剂的能力，结合由于系统性暴露减少而产生的显著安全性改善，可以提供与可注射抗体类似的功效。
白细胞介素-7(IL-7)和白细胞介素-7受体(IL-7R)
白细胞介素-7(IL-7)是包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-15和IL-21的细胞因子家族的成员。IL-7由淋巴器官、肠、皮肤和肝脏中的非造血基质细胞和上皮细胞组成性地产生，并且对于胸腺中的T淋巴细胞的发育和对于外周血T细胞的存活和稳态调节是必要的(Fry和Mackall，2002；Fry和Mackall 2005)。在肠粘膜中，IL-7还调节先天淋巴样细胞的在表型和功能上不同的群体，所述群体对于初始引发对于病理微生物刺激的免疫应答是重要的，还调节CD4+淋巴组织诱导(LTi)细胞，所述能够促进淋巴组织器官发生和一些树突细胞群体(Goldberg等人2015；Peters等人2015)。此外，IL-7诱导初始和记忆T细胞的增殖并且增强效应T细胞应答，优选辅助T细胞1(Th1)和Th17应答(Dooms，2013)。IL-7对于T细胞的功能性作用使IL-7成为保护性免疫性以及自身免疫性和炎症的关键增强剂。
IL-7对于不同靶细胞的作用通过IL-7R(包含IL-7Rα亚基(CD127)和共同细胞因子受体γ链(γc)(CD132)的异二聚体复合物)介导。全长人IL-7Rα由219个残基的细胞外结构域、25个残基的跨膜结构域和195个残基的细胞内结构域组成。认为IL-7诱导的受体活化涉及IL-7与IL-7Rα初始相互作用以形成复合物，其随后募集γc以形成活化受体信号传导复合物。通过IL-7进行的两个受体亚基的缔合作用通过JAK/Stat、PI3/Akt和SRC信号传导级联活化细胞内磷酸化事件(Walsh，2012)。
IL-7Rα不仅以细胞膜结合的形式存在，还作为可溶性形式(sIL-7Rα)存在。sIL-7R通过膜结合受体的脱落生成并且还通过导致缺乏跨膜结构域的蛋白质的(IL-7Rα外显子6的)选择性剪接产生；人血浆中存在的sIL-7Rα主要来源于选择性剪接(Rose等人2009)。已经鉴定了IL-7Rα的四种常见单倍型(Teutsch等人2003)。两种单倍型与可溶性形式的受体的改变表达和产生以及对于包括多发性硬化症和1型糖尿病的自身免疫疾病的易感性相关联(Hafler等人2007)。
除IL-7/IL-7Rα在人T细胞发育和稳态中发挥的作用之外，临床前研究证明了不同自身免疫疾病和炎性疾病的动物模型中涉及IL-7/IL-7Rα途径。这些研究鉴定了与疾病病理学相关联的另外IL-7依赖性机制，并且突出显示了作为用于治疗患有相关自身免疫病状和慢性炎性病状的患者的可能靶的IL-7/IL-7Rα相互作用。
临床前研究证明了IL-7Rα封闭抗体的短期系统性施用在自身免疫疾病和胃肠道炎症的模型中提供有效治疗。在IBD模型中，IL-7R拮抗剂处理后的功效的主要机制似乎涉及致结肠炎T细胞(IL-7R+效应/记忆T细胞)的功能抑制的局部缺失，所述结肠炎T细胞表达中等至高水平的IL-7Rα(CD127)，并且可以由于通过基质细胞和上皮细胞导致的IL-7产生增加而在发炎肠道中活化。在健康粘膜中，预期表达非常低水平的IL-7R的肠道驻留FOXP3+CD25+调节T细胞(Treg细胞)抑制对共生细菌的失调CD4+T应答。然而，Heninger等人2012表明，在IL-7丰富的环境中，FOXP3+CD25+Treg抑制常规T细胞增殖的能力被废止。在胃肠道疾病中，IL-7/IL-7R信号传导的阻断因此可以帮助通过抑制效应T细胞的活化并且通过恢复调节T细胞的抑制性功能两者来控制T细胞介导的炎症。来自鼠IBD模型和离体人组织研究的证据还表明，包括先天淋巴样细胞(ILC)的先天免疫细胞的IL-7/IL-7Rα依赖性活化有助于胃肠道炎性疾病中涉及的过程。
胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)和IL-7R
TSLP是通过皮肤、肺、肠和眼组织中的上皮细胞产生的细胞因子，其似乎参与调节身体粘膜表面处的发炎过程。TSLP刺激树突细胞(DC)和先天淋巴样细胞(ILC)，以诱导Th2细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)的分泌并且促进Th2型炎症的发展。现在认为TSLP是包括特应性皮炎、鼻炎的一些过敏性病症的发生的原因，并且还促进肠道病症，包括嗜酸细胞性食管炎(EoE)和溃疡性结肠炎(UC)。自相矛盾的是，还报告TSLP对于维持胃肠道中的免疫稳态和粘膜保护是重要的。最近，TSLP可以表达为两种不同的同种型的发现为此细胞因子的明显不同的活性提供了生物学解释(Fornasa等人2015；Tsilingiri等人2017)。分子研究还显示TSLP基因可以产生由两个不同的启动子区域调节的两种编码RNA。转录物中的一个编码159aa的TSLP的长同种型(L-TSLP)(UNIPROT条目Q969D9，SEQ ID NO：62)，并且第二转录物编码包含L-TSLP的C末端63aa的TSLP的短形式(S-TSLP)(UNIPROT条目Q969D9-2，SEQ IDNO：63)。L-TSLP经由包含TSLP特异性受体链(TSLPR)和IL-7Rα链的受体复合物作用于靶细胞。最近，结构研究显示IL-7和L-TSLP与TSLP-受体复合物的IL-7Rα链的相互作用涉及共同的IL-7Rα结合位点(Verstraete等人2017)。
S-TSLP不结合至TSLPR，并且它不能抑制L-TSLP与此受体的结合。就作者所知，目前为止还未鉴定S-TSLP的特异性受体。
重要的是，已经显示S-TSLP优选由健康皮肤表达并且在健康肠粘膜组织中由上皮细胞和固有层细胞表达。S-TSLP具有抗炎活性；体外S-TSLP通过单核细胞衍生的DC抑制促炎细胞因子的产生，并且有助于将CD103+DC调节至耐受性表型。因此，似乎由肠上皮产生的S-TSLP可以影响下面的免疫细胞，包括树突细胞和淋巴细胞，并且有利于健康人中的耐受性和调节性应答。S-TSLP还展示强效的抗微生物(细菌和真菌)活性，并且这对于防止粘膜上皮的微生物侵入可以是重要(Bjerkan等人2016)。健康组织中的S-TSLP表达是组成型的，但是可以通过维生素D3和PPARγ激动剂上调，或者通过促炎的病原菌下调。L-TSLP在健康组织中不存在，但是响应于促炎刺激表达并且通过活化DC和Th2细胞的效应子功能在促进Th2细胞因子相关联的炎症中发挥关键作用。暴露于L-TSLP活化的DC的天然CD4+T细胞经历Th2淋巴细胞的增殖和分化。L-TSLP还能够通过嗜碱性粒细胞、ILC(ILC2)和嗜酸性粒细胞的活化刺激Th2先天免疫应答。
最近的研究显示两种TSLP同种型的表达模式在肠道疾病包括炎性肠病和嗜酸细胞性食管炎(EoE)中相对于稳态明显变化。Rimoldi等人2005报告了TSLP(在这种情况下，其具体地可以是S-TSLP，与Fornasa等人2015的发现一致)由从健康结肠组织分离的原代上皮细胞组成型表达。然而，发现TSLP表达在来自患有CD的6/9患者的上皮细胞中是不可检测的。CD上皮细胞在患病粘膜中不能产生S-TSLP将导致通常通过生成非炎性环境帮助维持肠道稳态的机制失效。此机制的缺陷可以诱导不想要的Th1炎性应答，从而促进CD的发展。相比于在克罗恩氏病中主导的固有层Th1细胞，显示来自患有溃疡性结肠炎的患者的固有层T细胞产生Th2型细胞因子IL-5和IL-13，这些细胞仅显示低水平的IL-4产生，这表明它们不展示经典Th2细胞的所有特征。在功能上，显示IL-13促进纤维化并且导致肠上皮细胞中的紧密连接功能变化和肠上皮细胞的细胞凋亡，从而驱动粘膜溃疡。最近，Fornasa等人2015报告了与在健康结肠粘膜中检测的水平相比，用L-TSLP特异性抗体检测的TSLP表达在来自患有溃疡性结肠炎的患者的肠组织中显著上调。因为TSLP活化的树突细胞(DC)可以诱导初始CD4+T细胞分化为产生IL-5、IL-13和TNF的炎性Th2细胞(Liu 2006)，所以抑制在上皮细胞-树突细胞界面处作用的此上游细胞因子证明可以是用于治疗患有溃疡性结肠炎的患者的粘膜炎症的有效策略。
流行病学数据支持EoE的发展中涉及特应性机制和遗传因素。重要的是，全基因组关联研究的结果将TSLP及其受体TSLPR鉴定为EoE的发病机理中的候选基因(Cianferoni和Spergel，2015)。TSLP表达在EoE患者的食管活检标本中增加，并且通过免疫组织化学染色定位至复层鳞状上皮组织(Noti等人2013)。L-TSLP似乎是疾病病理学的主要上游驱动因素，因为它强烈地促进由Th2细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞产生促成炎症和组织重塑的细胞因子(包括CCL-26/嗜酸性粒细胞激活趋化因子-3、IL-4、IL-5、IL-9和IL-13)和促纤维化因子。
在EoE中，TSLP被认为在炎症级联一开始充当上游上皮‘主开关’，并且因此，此细胞因子的拮抗可以允许在比先前的靶向抗细胞因子疗法更上游处关闭炎性级联。来自在患有严重哮喘的患者中使用特折鲁单抗(tezepelumab，AMG 157，一流的TSLP拮抗剂mAb)的最近试验的阳性结果提供对于此概念的支持(Corren等人2017)。
根据以上内容，应认识到存在对于针对炎性疾病和/或自身免疫疾病诸如IBD和EoE的更有效疗法的未满足的需求。能够抑制IL-7和/或L-TSLP与IL-7R的结合、特别是能够口服施用的药剂可以代表这种疗法并且因此是非常希望的。
WO2013056984、WO2015189302、WO2011094259和WO2011104687公开了针对IL-7R的抗体。
发明内容
本发明人生产了能够抑制IL-7和/或L-TSLP与IL-7R的结合的多肽。这些多肽结合至IL-7Rα。这些多肽特别受益于意外高的功效。它们能够与食蟹猴IL-7Rα交叉反应并且在暴露于小肠和大肠的蛋白酶时保持稳定。在一个实施方案中，这些多肽已经通过工程化经历进一步增强。这些进一步增强的多肽包含已经人源化、但是仍基本上维持以上优点的序列。
已经显示在一些实施方案中，本发明的多肽在Biacore研究中以高亲和力结合IL-7R，并且在ELISA中是IL-7R与IL-7和IL-7相关细胞因子L-TSLP的相互作用的强效抑制剂。在基于细胞的功能性测定中，本发明的某些多肽以与临床抗IL-7R mAb829(还被称为“GSK2618960”，Ellis等人2019中公开的抗IL-7Rα单克隆抗体)类似的功效抑制两种细胞因子的生物作用(IL-7诱导的Stat5磷酸化；L-TSLP诱导的TARC产生)。
计算机模拟技术表明本发明的某些多肽的双重拮抗活性是由于多肽与IL-7R的也构成两种细胞因子的共享结合位点的表位的结合。在特异性研究中，本发明的某些多肽未显示与其他人IL-7R家族或其他细胞因子受体的结合活性。在交叉物种特异性测定中，本发明的某些多肽不结合小鼠IL-7R，但是以类似的功效结合至食蟹猴和人IL-7R；因此，食蟹猴可以是临床前开发研究的合适物种。
在发炎溃疡性结肠炎粘膜组织的离体培养物中，本发明的例示性多肽抑制信号传导蛋白的磷酸化以及与促炎和免疫调节途径相关联的细胞因子和趋化因子的产生。结果证明由此多肽拮抗粘膜IL-7R+ve T细胞可以在与疾病环境紧密相关的模型中至少与临床抗IL-7R mAb829同样有效地抑制炎性过程，从而提供本发明的多肽在尤其患有溃疡性结肠炎的患者中可以是有效的信心。在正常小鼠中体内口服给药本发明的某些多肽显示高水平的结肠腔暴露(微摩尔)，从而证明了在穿过整个GI系统期间耐受消化。
因此，可以预期这些多肽在预防或治疗自身免疫疾病和或炎性疾病诸如炎性肠病(例如，克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)或嗜酸细胞性食管炎中、特别是当口服施用时具有特定用途。
本发明提供了一种多肽，其能够抑制IL-7和/或L-TSLP与IL-7R的结合。本发明还提供了包含这些多肽的构建体和药物组合物。还提供了编码此类多肽的核酸，用于制备此类多肽的方法，包含编码此类多肽的核酸的cDNA和载体，能够表达此类多肽的宿主细胞以及此类多肽的用途。
为了避免关于以上术语‘和/或’的疑问，‘能够抑制IL-7与IL-7R的结合的多肽’涵盖能够抑制IL-7和L-TSLP与IL-7R的结合的多肽。类似地，‘能够抑制L-TSLP与IL-7R的结合的多肽’涵盖能够抑制IL-7和L-TSLP与IL-7R的结合的多肽。
在至少一些实施方案中，本发明的多肽与能够抑制IL-7和/或L-TSLP与IL-7R的结合的现有技术的物质相比具有以下优点中的一种或多种：
(i)对于IL-7Rα增加的亲和力；
(ii)对于IL-7Rα增加的特异性；
(iii)针对结合IL-7R的IL-7或L-TSLP增加的中和能力；
(iv)抑制IL-7和L-TSLP两者与IL-7R的结合；
(v)与来自不同物种诸如人和食蟹猴的IL-7Rα的增加的交叉反应性；
(vi)例如在施用于小鼠、食蟹猴或人时降低的免疫原性；
(vii)在蛋白酶的存在下，例如(a)在小肠和/或大肠中存在的蛋白酶和/或IBD炎性蛋白酶例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、MMP3、MMP12、其他MMP和组织蛋白酶的存在下和/或(b)在来自肠道共生微生物菌群和/或病原菌的蛋白酶、由小肠和/或大肠中存在的微生物细胞的裂解主动分泌和/或释放的蛋白酶的存在下增加的稳定性；
(viii)在生产期间对于蛋白酶降解的增加的稳定性(例如，对于酵母蛋白酶的耐受性)；
(ix)对于口服施用的增加的适用性；
(x)对于口服施用之后局部递送至肠道和固有层的增加的适用性；
(xi)对于口服施用之后局部递送至食管的增加的适用性；
(xii)对于在异源宿主诸如细菌诸如大肠肝菌(Escherichia coli)或属于曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、汉森酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属(Pichia)的酵母诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的增加的适用性；
(xiii)对于在药物中使用的适用性和改善的特性；
(xiv)对于在功能性食品中使用的适用性和改善的特性；
(xv)改善的组织渗透，诸如渗透发炎结肠粘膜上皮和粘膜下组织以到达粘膜下固有层；
(xvi)对于以多特异性形式格式化而言增加的适用性；
(xvii)结合至新型表位。
以上优点(i)至(xvii)可以潜在地通过呈单价形式或呈多价形式诸如双头形式(例如同双头或异双头形式)的本发明的多肽实现。
由于本发明的多肽特异性结合至IL-7R的IL-7Rα亚基，所以在适当情况下，在以上点中(并且在整个描述中)“IL-7R”的引用也可以用“IL-7Rα”替代。
附图说明
图1-人淋巴细胞中IL-7诱导的pSTAT-5的抑制
图2-人单核细胞中TSLP诱导的TARC分泌的抑制
图3-结合至IL-7Rα的V7R-2E9的模型结构
图4-人淋巴细胞中IL-7诱导的pSTAT5的A62U、A59U和mAb829抑制
图5-ID-A40U与物种IL-7Rα的交叉反应性
图6-ID-A59U和ID-A62U与人和食蟹猴IL-7Rα的交叉反应性
图7-ID-A40U对于人IL-7Rα的特异性
图8-消化基质中V7R-2E9、ID-A24U和ID-A40U的存活百分比图9-人粪便上清液中ID-A62U和ID-A41U的稳定性百分比
图10-MMP对依那西普、mAb829和A40U-F/H的消化
图11-未稀释粪便上清液中的预期浓度(ID-A24U相对于ID-A40U相对于ID-38F)
图12-GIT未稀释上清液中的预期浓度(ID-A24U相对于ID-A40U相对于ID-38F)
图13-未稀释粪便上清液中的预期浓度(ID-A40U相对于ID-38F)
图14-GIT未稀释上清液中的预期浓度(ID-A40U相对于ID-38F)
图15-18-人IBD组织蛋白磷酸化图谱
图19-总磷酸化水平
序列说明
SEQ ID NO：1-ID-A62U CDR1的多肽序列
SEQ ID NO：2-ID-A62U CDR2的多肽序列
SEQ ID NO：3-ID-A62U CDR3的多肽序列
SEQ ID NO：4-ID-A62U FR1的多肽序列
SEQ ID NO：5-ID-A62U FR2的多肽序列
SEQ ID NO：6-ID-A62U FR3的多肽序列
SEQ ID NO：7-ID-A62U FR4的多肽序列
SEQ ID NO：8-ID-A62U的多肽序列
SEQ ID NO：9-V7R-2B6的多肽序列
SEQ ID NO：10-V7R-2E5的多肽序列
SEQ ID NO：11-V7R-2E9的多肽序列
SEQ ID NO：12-V7R-2F6的多肽序列
SEQ ID NO：13-V7R-3B5的多肽序列
SEQ ID NO：14-V7R-4F6的多肽序列
SEQ ID NO：15-V7R-6C12的多肽序列
SEQ ID NO：16-ID-A2U的多肽序列
SEQ ID NO：17-ID-A3U的多肽序列
SEQ ID NO：18-ID-A4U的多肽序列
SEQ ID NO：19-ID-A5U的多肽序列
SEQ ID NO：20-ID-A6U的多肽序列
SEQ ID NO：21-ID-A7U的多肽序列
SEQ ID NO：22-ID-A8U的多肽序列
SEQ ID NO：23-ID-A9U的多肽序列
SEQ ID NO：24-ID-A10U的多肽序列
SEQ ID NO：25-ID-A11U的多肽序列
SEQ ID NO：26-ID-A12U的多肽序列
SEQ ID NO：27-ID-A13U的多肽序列
SEQ ID NO：28-ID-A14U的多肽序列
SEQ ID NO：29-ID-A15U的多肽序列
SEQ ID NO：30-ID-A16U的多肽序列
SEQ ID NO：31-ID-A17U的多肽序列
SEQ ID NO：32-ID-A18U的多肽序列
SEQ ID NO：33-ID-A19U的多肽序列
SEQ ID NO：34-ID-A20U的多肽序列
SEQ ID NO：35-ID-A21U的多肽序列
SEQ ID NO：36-ID-A23U的多肽序列
SEQ ID NO：37-ID-A24U的多肽序列
SEQ ID NO：38-ID-A25U的多肽序列
SEQ ID NO：39-ID-A26U的多肽序列
SEQ ID NO：40-ID-A27U的多肽序列
SEQ ID NO：41-ID-A28U的多肽序列
SEQ ID NO：42-ID-A29U的多肽序列
SEQ ID NO：43-ID-A30U的多肽序列
SEQ ID NO：44-ID-A31U的多肽序列
SEQ ID NO：45-ID-A32U的多肽序列
SEQ ID NO：46-ID-A33U的多肽序列
SEQ ID NO：47-ID-A34U的多肽序列
SEQ ID NO：48-ID-A35U的多肽序列
SEQ ID NO：49-ID-A36U的多肽序列
SEQ ID NO：50-ID-A37U的多肽序列
SEQ ID NO：51-ID-A38U的多肽序列
SEQ ID NO：52-ID-A39U的多肽序列
SEQ ID NO：53-ID-A40U的多肽序列
SEQ ID NO：54-ID-A43U的多肽序列
SEQ ID NO：55-ID-A50U的多肽序列
SEQ ID NO：56-ID-A52U的多肽序列
SEQ ID NO：57-ID-A53U的多肽序列
SEQ ID NO：58-ID-A54U的多肽序列
SEQ ID NO：59-ID-A55U的多肽序列
SEQ ID NO：60-ID-A57U的多肽序列
SEQ ID NO：61-ID-A59U的多肽序列
SEQ ID NO：62-L-TSLP的多肽序列
SEQ ID NO：63-S-TSLP的多肽序列
SEQ ID NO：64-全长人共同γ链受体的多肽序列
SEQ ID NO：65-全长人IL-7Rα的多肽序列
SEQ ID NO：66-全长食蟹猴IL-7Rα的多肽序列
SEQ ID NO：67-食蟹猴IL-7Rα细胞外结构域的多肽序列
SEQ ID NO：68-人IL-7Rα细胞外结构域的多肽序列
SEQ ID NO：69-编码ID-A59U的多核苷酸序列
SEQ ID NO：70-编码ID-A62U的多核苷酸序列
SEQ ID NO：71-V7R-2B6 CDR1的多肽序列
SEQ ID NO：72-V7R-2E9 CDR2的多肽序列
SEQ ID NO：73-V7R-2F6 CDR2的多肽序列
SEQ ID NO：74-V7R-4F6 CDR2的多肽序列
SEQ ID NO：75-V7R-2B6 CDR2的多肽序列
SEQ ID NO：76-ID-A14U CDR2的多肽序列
SEQ ID NO：77-V7R-6C12 CDR3的多肽序列
SEQ ID NO：78-V7R-2B6 CDR3的多肽序列
SEQ ID NO：79-合适地占据ID-A62U FR2(SEQ ID NO：5)的残基9-14的多肽序列
SEQ ID NO：80-合适地不占据ID-A62U FR2(SEQ ID NO：5)的残基9-14的多肽序列
SEQ ID NO：81-含有SpeI位点的3′引物的多核苷酸序列
SEQ ID NO：82-在SEQ ID NO：1的残基1处具有任选的保守取代的CDR1的多肽序列
SEQ ID NO：83-在SEQ ID NO：2的残基2、3、7、12和16处具有任选的保守取代的CDR2的多肽序列
SEQ ID NO：84-在SEQ ID NO：3的残基3和9处具有任选的保守取代的CDR3的多肽序列
SEQ ID NO：85-蛋白酶不稳定接头式1的多肽序列
SEQ ID NO：86-蛋白酶不稳定接头式2的多肽序列
SEQ ID NO：87-蛋白酶不稳定接头式1和2的优选变体的多肽序列
SEQ ID NO：88-非蛋白酶不稳定接头式3的多肽序列
SEQ ID NO：89-优选的非蛋白酶不稳定接头的多肽序列
具体实施方式
包含免疫球蛋白链可变结构域(ICVD)诸如VH和VHH的多肽诸如抗体和抗体片段
多肽是由在链中键合在一起的多个氨基酸残基组成的有机聚合物。如本文所用，‘多肽’与‘蛋白质’和‘肽’可互换使用。当多肽含有形成结合位点、从而能够以一定亲和力(合适地表达为Kd值、Ka值、kon速率和/或koff速率，如本文进一步描述)结合至靶上的表位的氨基酸残基的一个或多个区段时，将多肽称为结合多肽。
结合多肽包括诸如以下的多肽：DARPins(Binz等人2003)、AffimersTM(Johnson等人2012)、FynomersTM(Grabulovski等人2007)、Centyrins(Goldberg等人2016)、Affitins(例如，
Figure BDA0003513679060000131
，Krehenbrink等人2008)、环肽、抗体和抗体片段。结合多肽还包括诸如以下的多肽：亲合体(Nygren 2008)、Affilins(Ebersbach等人2007)、Alphabodies(Desmet等人2014)、Anticalins(Skerra等人2008)、高亲和性多聚体(Silverman等人2005)、Kunitz结构域肽(Nixon和Wood 2006)、Monobodies(Koide和Koide 2007)、nanoCLAMP(Suderman等人2017)、Adnectins(Lipovsek2011)和双环肽。
常规抗体或免疫球蛋白(Ig)是包含四个多肽链的蛋白质：两个重(H)链和两个轻(L)链。每个链被分为恒定区和可变结构域。重链可变结构域在本文中缩写为VHC，并且轻(L)链可变结构域在本文中缩写为VLC。这些结构域、与其相关的结构域和由其衍生的结构域在本文中被称为免疫球蛋白链可变结构域。VHC和VLC结构域可以进一步细分为具有高变性的区域，称为“互补决定区”(“CDR”)，散布有更保守的区域，称为“框架区”(“FR”)。已经准确定义了框架区和互补决定区(Kabat等人1991)。在常规抗体中，每个VHC和VLC由三个CDR和四个FR构成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。两个重免疫球蛋白链和两个轻免疫球蛋白链的常规抗体四聚体形成有通过例如二硫键内连的重免疫球蛋白链和轻免疫球蛋白链，并且重链类似地连接。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。轻链恒定区包含一个结构域，CL。重链的可变结构域和轻链的可变结构域是与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括各种免疫系统细胞(例如，效应细胞)或经典补体系统的第一组分(C1q)。术语抗体包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(以及其亚型)的免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是K类型或λ类型。由两个相同重(H)链和两个相同轻(L)链多肽组装的免疫球蛋白-γ(IgG)抗体的总体结构在哺乳动物中良好建立并且是高度保守的(Padlan1994)。
常规抗体结构的一个例外存在于骆驼科的血清中。除常规抗体以外，这些血清拥有特别IgG抗体。这些IgG抗体(被称为重链抗体(HCAb))缺乏L链多肽并且缺少第一恒定结构域(CH1)。在其N末端区域中，同二聚体蛋白的H链含有专用免疫球蛋白链可变结构域(被称为VHH)，其用于与其同源抗原缔合(Muyldermans 2013，Hamers-Casterman等人1993，Muyldermans等人1994)。
如本文所用，抗原结合片段(或“抗体片段”或“免疫球蛋白片段”)是指抗体的特异性结合至IL-7Rα的一部分(例如，其中一个或多个免疫球蛋白链不是全长但是特异性结合至IL-7Rα的分子)。涵盖在抗原结合片段内的结合片段的实例包括：
(i)Fab片段(由VLC、VHC、CL和CH1结构域组成的单价片段)；
(ii)F(ab′)2片段(包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段)；
(iii)Fd片段(由VHC和CH1结构域组成)；
(iv)Fv片段(由抗体的单臂的VLC和VHC结构域组成)；
(v)scFv片段(由使用重组方法通过合成接头接合的VLC和VHC结构域组成，所述合成接头使得VLC和VHC结构域能够被制成单一蛋白质链，其中VLC和VHC区配对以形成单价分子)；
(vi)VH(由VHC结构域组成的免疫球蛋白链可变结构域(Ward等人1989)；
(vii)VL(由VLC结构域组成的免疫球蛋白链可变结构域)；
(viii)V-NAR(由来自软骨鱼纲(chondrichthyes)IgNAR的VHC结构域组成的免疫球蛋白链可变结构域(Roux等人1998和Griffiths等人2013)
(ix)VHH。
VHH或VH中的氨基酸残基的总数可以在110-130的区域内，合适地是115-120，并且最合适是118。
本发明的免疫球蛋白链可变结构域可以例如通过以下获得：使用核酸合成的技术制备编码免疫球蛋白链可变结构域的核酸，接着表达由此获得的核酸。根据特定实施方案，本发明的免疫球蛋白链可变结构域不具有与天然存在的多肽的氨基酸序列(诸如天然存在的抗体的VH或VHH结构域)完全相同(即，与其共享100％序列同一性)的氨基酸序列。
本文提供的实例涉及本身结合至IL-7Rα的免疫球蛋白链可变结构域。然而，本文公开的本发明的原理同样适用于任何IL-7Rα结合多肽，诸如抗体和抗体片段。例如，本文公开的抗IL-7Rα免疫球蛋白链可变结构域可以并入多肽诸如全长抗体中。这种方法由McCoy等人2014证明，McCoy等人提供构造为与人Fc区(包含铰链、CH2和CH3结构域)的融合体的抗HIV VHH，作为二聚体构建体表达。
用来自人免疫球蛋白链可变结构域的对应残基取代非人免疫球蛋白链可变结构域的框架区中的至少一个氨基酸残基是人源化。可变结构域的人源化可以降低人中的免疫原性。
合适地，本发明的多肽包含免疫球蛋白链可变结构域。更合适地，本发明的多肽由免疫球蛋白链可变结构域，诸如免疫球蛋白重链可变结构域组成。合适地，本发明的多肽是抗体或抗体片段。更合适地，本发明的多肽是抗体片段。合适地，抗体片段是免疫球蛋白链可变结构域，诸如VHH、VH或VL。合适地，抗体片段是VHH、VH、VL、V-NAR、scFv、Fab片段或F(ab′)2片段。合适地，抗体片段是免疫球蛋白重链可变结构域。更合适地，抗体片段是VHH或VH，并且最合适是VHH。
特异性、亲和力、亲合力和交叉反应性
特异性是指特定抗原结合多肽可以与其结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。抗原结合多肽的特异性是抗原结合多肽将特定抗原识别为独特分子实体并且将其彼此区分的能力。
由靶与结合多肽解离的平衡常数(Kd)表示的亲和力是靶与结合多肽上的结合位点之间的结合强度的量度：Kd的值越小，靶与结合多肽之间的结合强度就越强(可替代地，亲和力还可以表达为亲和力常数(Ka)，其是1/Kd)。亲和力可以根据感兴趣的特定抗原通过已知方法确定。合适地，亲和力使用动态可切换生物表面(例如，“
Figure BDA0003513679060000161
”，参见Knezevic等人2012)或通过表面等离子体共振确定。
亲合力是抗原结合多肽与相关抗原之间的结合的量度。亲合力与抗原决定簇与其在抗原结合多肽上的抗原结合位点之间的亲和力和抗原结合多肽上存在的相关结合位点的数目两者相关。
合适地，本发明的多肽以10-7M或更小、更合适地10-8M或更小、更合适地10-9M或更小并且更合适地10-10M或更小的平衡解离常数(Kd)结合至IL-7Rα。
合适地，本发明的多肽以比相同测定中mAb829的平衡解离常数低的平衡解离常数结合至IL-7Rα。合适地，本发明的多肽以5.67x10-10M或更低、更合适地低于5.67x10-10M的平衡解离常数结合至IL-7Rα。mAb829还被称为“GSK2618960”，Ellis等人2019中公开的抗IL-7Rα单克隆抗体。
在一个实施方案中，本发明的多肽的亲和力通过直接涂覆在Biacore(或等效的)传感器板上或通过融合至Fc并用抗人IgG Fc捕获来建立，其中多肽流过板以检测结合。合适地，Biacore T200在25℃下在30ul/min下的HBS-EP+(GE Healthcare)运行缓冲液中使用。
抗IL-7Rα多肽、IL-7Rα结合多肽、与IL-7Rα相互作用的多肽或针对IL-7Rα的多肽全部是结合至IL-7Rα的有效多肽。本发明的多肽可以结合至IL-7Rα上的线性或构象表位。
合适地，本发明的多肽结合至人IL-7Rα。更合适地，本发明的多肽结合至人和至少一种另外的灵长类动物IL-7Rα两者，其选自狒狒IL-7Rα、狨猴IL-7Rα、食蟹猴IL-7Rα和恒河猴IL-7Rα。最合适地，本发明的多肽结合至人和食蟹猴IL-7Rα两者。
合适地，本发明的多肽中和人IL-7和/或人L-TSLP与人IL-7R的结合。更合适地，本发明的多肽中和人IL-7和/或人L-TSLP与人和至少一种另外的灵长类动物IL-7R两者的结合，其选自狒狒IL-7R、狨猴IL-7R、食蟹猴IL-7R和恒河猴IL-7R。最合适地，本发明的多肽中和人IL-7和人L-TSLP与人IL-7R的结合。
合适地，本发明的多肽结合至IL-7Rα(例如，人IL-7Rα，SEQ ID NO：65和/或食蟹猴IL-7Rα，SEQ ID NO：66)或结合至γ链受体(例如，人共同γ链受体，SEQ ID NO：64)。更合适地，本发明的多肽结合至IL-7Rα，最合适地人IL-7Rα。更具体地，本发明的多肽结合至IL-7Rα的细胞外区域(SEQ ID NO：67和68，分别是食蟹猴和人IL-7Rα的细胞外区域)，即缺乏跨膜螺旋和胞质结构域的IL-7Rα的多肽序列。
合适地，IL-7Rα是包含SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：66的多肽，更合适地，IL-7Rα是由SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：66组成的多肽。更合适地，IL-7Rα是包含SEQ ID NO：65的多肽，更合适地，IL-7Rα是由SEQ ID NO：65组成的多肽。成熟全长人IL-7Rα的多肽序列也可在UniProt条目P16871下获得。
能够与来自人的IL-7Rα和来自另一种物种的IL-7Rα诸如食蟹猴IL-7Rα反应(“交叉反应”)的多肽是有利的，因为它们允许更易于在动物模型中进行临床前研究。
合适地，本发明的多肽是针对IL-7Rα上位于IL-7和/或L-TSLP的一个或多个受体结合位点中和/或形成所述一个或多个受体结合位点的一部分的表位，使得本发明的所述多肽在结合至IL-7Rα后能够抑制或减少IL-7和/或L-TSLP信号传导。
本发明的多肽结合至IL-7Rα上的一个或多个表位。在本发明的一个方面，提供了一种多肽，其结合至IL-7Rα上与V7R-2E5、V7R-2E9、V7R-2F6、V7R-6C12、V7R-2B6、V7R-3B5或V7R-4F6相同的表位。
合适地，本发明的多肽是分离的。“分离”的多肽是从其原始环境除去的多肽。例如，如果本发明的天然存在的多肽与自然系统中共存的材料中的一些或全部分开，则所述多肽是分离的。
功效、抑制和中和
功效是以产生给定强度的作用所需的量表达的治疗剂的活性的量度。与在低浓度下引起更小应答的更低功效的剂相比，高功效剂在低浓度下引起更大的应答。功效与亲和力和有效性相关。有效性是指治疗剂在结合至靶配体后产生生物应答的能力和此应答的定量数级。术语半数最大有效浓度(EC50)是指在指定暴露时间之后引起在基线与最大之间一半的应答的治疗剂的浓度。治疗剂可以导致抑制或刺激。它通常作为功效的量度使用并且在本文中用作功效的量度。
用于本发明的目的的中和多肽是结合至IL-7Rα、从而抑制IL-7R与IL-7和/或L-TSLP的结合的多肽，如通过ELISA测量。在此上下文中适用于确定抑制水平的具体ELISA方法在以下实施例3中详细描述。
合适地，本发明的多肽以以下EC50中和IL-7R与IL-7的结合：2.00nM或更小，诸如1.50nM或更小，诸如1.00nM或更小，诸如0.90nM或更小，诸如0.80nM或更小，诸如0.70nM或更小，诸如0.65nM或更小，诸如0.60nM或更小，诸如0.55nM或更小，诸如0.50nM或更小，诸如0.45nM或更小，诸如0.4nM或更小，诸如0.35nM或更小，诸如0.30nM或更小。
合适地，EC50使用以下实施例3中详细描述的IL-7/IL-7R中和ELISA确定。
多肽和多核苷酸序列
出于比较两个紧密相关的多肽序列的目的，第一多肽序列与第二多肽序列之间的“序列同一性％”可以使用多肽序列的标准设定使用NCBI BLAST v2.0(BLASTP)计算。出于比较两个紧密相关的多核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间的“序列同一性％”可以使用核苷酸序列的标准设定使用NCBI BLAST v2.0(BLASTN)计算。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3和期望值(E)10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如，Karlin和Altschul，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(P(N))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2，更合适地小于约0.01，并且最合适地小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
如果多肽或多核苷酸序列与其他多肽或多核苷酸序列的整个长度共享100％序列同一性，则称它们为相同的。序列中的残基从左向右，即从多肽的N末端至C末端；从多核苷酸的5’末端至3’末端编号。
序列之间的“差异”是指与第一序列相比第二序列的一个位置中单个氨基酸残基的插入、缺失或取代。两个多肽序列可以含有一个、两个或更多个此类氨基酸差异。在其他方面与第一序列相同(100％序列同一性)的第二序列中的插入、缺失或取代导致序列同一性％降低。例如，如果相同序列的长度是9个氨基酸残基，则第二序列中的一个取代产生88.9％的序列同一性。如果相同序列的长度是17个氨基酸残基，则第二序列中的两个取代产生88.2％的序列同一性。如果相同序列的长度是7个氨基酸残基，则第二序列中的三个取代产生57.1％的序列同一性。如果第一多肽序列和第二多肽序列的长度是9个氨基酸残基并且共享6个相同的残基，则第一多肽序列和第二多肽序列共享大于66％的同一性(第一多肽序列和第二多肽序列共享66.7％的同一性)。如果第一多肽序列和第二多肽序列的长度是17个氨基酸残基并且共享16个相同的残基，则第一多肽序列和第二多肽序列共享大于94％的同一性(第一多肽序列和第二多肽序列共享94.1％的同一性)。如果第一多肽序列和第二多肽序列的长度是7个氨基酸残基并且共享3个相同的残基，则第一多肽序列和第二多肽序列共享大于42％的同一性(第一多肽序列和第二多肽序列共享42.9％的同一性)。
可替代地，出于将第一参考多肽序列与第二比较多肽序列进行比较的目的，可以确定对第一序列进行添加、取代和/或缺失以产生第二序列的数目。添加是将一个氨基酸残基添加到第一多肽的序列中(包括在第一多肽的任一末端处添加)。取代是用一个不同的氨基酸残基取代第一多肽的序列中的一个氨基酸残基。缺失是从第一多肽的序列缺失一个氨基酸残基(包括在第一多肽的任一末端处缺失)。
出于将第一参考多核苷酸序列与第二比较多核苷酸序列进行比较的目的，可以确定对第一序列进行添加、取代和/或缺失以产生第二序列的数目。添加是将一个核苷酸残基添加到第一多核苷酸的序列中(包括在第一多核苷酸的任一末端处添加)。取代是用一个不同的核苷酸残基取代第一多核苷酸的序列中的一个核苷酸残基。缺失是从第一多核苷酸的序列缺失一个核苷酸残基(包括在第一多核苷酸的任一末端处缺失)。
“保守”氨基酸取代是其中氨基酸残基被类似化学结构的另一个氨基酸残基替代并且预期对于多肽的功能、活性或其他生物特性具有微小影响的氨基酸取代。此类保守取代合适地是其中以下组内的一个氨基酸被来自相同组内的另一个氨基酸残基取代的取代：
Figure BDA0003513679060000211
合适地，疏水性氨基酸残基是非极性氨基酸。更合适地，疏水性氨基酸残基选自V、I、L、M、F、W或C。
如本文所用，多肽序列的编号以及CDR和FR的定义如根据Kabat系统(Kabat等人1991)定义。第一多肽序列与第二多肽序列之间的“对应”氨基酸残基是根据Kabat系统与第二序列中的氨基酸残基共享相同位置的第一序列中的氨基酸残基，同时第二序列中的氨基酸残基与第一序列中的氨基酸残基的身份可以不同。合适地，如果框架和CDR根据Kabat定义是相同长度，则对应残基将共享相同的编号(和字母)。比对可以手动实现或通过使用标准设定使用例如序列比对的已知计算机算法诸如NCBI BLAST v2.0(BLASTP或BLASTN)来实现。
Figure BDA0003513679060000221
Figure BDA0003513679060000231
Figure BDA0003513679060000241
优选地，本发明中使用的多核苷酸是分离的。“分离”的多核苷酸是从其原始环境除去的多核苷酸。例如，如果天然存在的多核苷酸与自然系统中共存的材料中的一些或全部分开，则所述多核苷酸是分离的。如果例如多核苷酸被克隆到不是其自然环境的一部分的载体中或者如果它包含在cDNA内，则所述多核苷酸被认为是分离的。
在本发明的一个方面，提供了一种多核苷酸，其编码本发明的多肽或构建体。合适地，多核苷酸包含与SEQ ID NO：69或70、最合适地SEQ ID NO：70共享70％或更大，诸如80％或更大，诸如90％或更大，诸如95％或更大，诸如99％或更大序列同一性的序列或由其组成。更合适地，多肽包含SEQ ID NO：69或70、最合适地SEQ ID NO：70或由其组成(最合适地由其组成)。在另一个方面，提供了一种cDNA，其包含所述多核苷酸。
在本发明的一个方面，提供了一种多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：69或70的编码所编码的免疫球蛋白链可变结构域的CDR1、CDR2或CDR3的部分中的任一个共享70％或更大，诸如80％或更大，诸如90％或更大，诸如95％或更大，诸如99％或更大序列同一性的序列或由其组成，所述序列。
合适地，本发明的多肽序列含有相对于天然序列的至少一个改变。合适地，本发明的多核苷酸序列含有相对于天然序列的至少一个改变。合适地，对多肽序列或多核苷酸序列进行改变以增加多肽或所编码的多肽对于肠道中存在的蛋白酶(例如，胰蛋白酶和糜蛋白酶)的稳定性。
本发明的多肽的CDR和框架的可能特征在下文中描述。
CDR1
合适地，本发明的多肽的CDR1包含与SEQ ID NO：1共享80％或更大序列同一性的序列或更合适地由其组成。
可替代地，本发明的多肽的CDR1包含具有与SEQ ID NO：1相比不超过2个、更合适地不超过1个添加的序列或更合适地由其组成。合适地，本发明的多肽的CDR1包含具有与SEQ ID NO：1相比不超过2个、更合适地不超过1个取代的序列或更合适地由其组成。合适地，本发明的多肽的CDR1包含具有与SEQ ID NO：1相比不超过2个、更合适地不超过1个缺失的序列或更合适地由其组成。
合适地，CDR1的与其在SEQ ID NO：1中的对应残基不同的任何残基是相对于其对应残基的保守取代。
合适地，CDR1的残基具有以下身份(SEQ ID NO：82)：
1 2 3 4 5
S/D D A M G
合适地，CDR1包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：71或由其组成。更合适地，CDR1包含SEQ ID NO：1或更合适地由其组成。
CDR2
合适地，本发明的多肽的CDR2包含与SEQ ID NO：2共享65％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大或90％或更大序列同一性的序列或更合适地由其组成。
可替代地，本发明的多肽的CDR2包含具有与SEQ ID NO：2相比不超过8个、更合适地不超过7个、更合适地不超过6个、更合适地不超过5个、更合适地不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个添加的序列或更合适地由其组成。合适地，本发明的多肽的CDR2包含具有与SEQ ID NO：2相比不超过8个、更合适地不超过7个、更合适地不超过6个、更合适地不超过5个、更合适地不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个取代的序列或更合适地由其组成。合适地，本发明的多肽的CDR2包含具有与SEQ ID NO：2相比不超过8个、更合适地不超过7个、更合适地不超过6个、更合适地不超过5个、更合适地不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个缺失的序列或更合适地由其组成。
合适地，CDR2的与其在SEQ ID NO：2中的对应残基不同的任何残基是相对于其对应残基的保守取代。
合适地，CDR2的残基具有以下身份(SEQ ID NO：83)：
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
A I/T G/N W S G A/T V T H Y S/G D S V Q/K G
合适地，对应于SEQ ID NO：2的残基编号16的CDR2的残基是Q或K，最合适地K。合适地，CDR2包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76或由其组成。更合适地，CDR2包含SEQ ID NO：2或更合适地由其组成。
CDR3
合适地，本发明的多肽的CDR3包含与SEQ ID NO：3共享60％或更大、70％或更大或80％或更大序列同一性的序列或更合适地由其组成。
可替代地，本发明的多肽的CDR3包含具有与SEQ ID NO：3相比不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个添加的序列或更合适地由其组成。合适地，本发明的多肽的CDR3包含具有与SEQ ID NO：3相比不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个取代的序列或更合适地由其组成。合适地，本发明的多肽的CDR3包含具有与SEQ ID NO：3相比不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个缺失的序列或更合适地由其组成。合适地，相对于其在SEQ ID NO：3中的对应残基，任何取代是保守的。
合适地，CDR3的与其在SEQ ID NO：3中的对应残基不同的任何残基是相对于其对应残基的保守取代。
合适地，CDR3的残基具有以下身份(SEQ ID NO：84)：
1 2 3 4 5 6 7 8 9
D Y D/V T D V W Q Y/H
合适地，CDR3的序列包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：78或由其组成。更合适地，CDR3包含SEQ ID NO：3或更合适地由其组成。
特定CDR
一些特别合适的CDR序列在下表中示出。合适地，本发明的多肽的CDRl是以下列出的CDR1序列中的一个。合适地，本发明的多肽的CDR2是以下列出的CDR2序列中的一个。合适地，本发明的多肽的CDR3是以下列出的CDR3序列中的一个。合适地，本发明的多肽包含以下列出的CDR序列中的两个或更合适地三个的组合。
本发明的多肽的特定CDR在下文中提供。‘实例’代表包含该CDR和该序列的对应序列标识符编号的示例性ICVD。
SEQ ID NO CDR1 实例
1 SDAMG ID-A62U
71 DDAMG V7R-2B6
SEQ ID NO CDR2 实例
72 AIGWSGAVTHYSDSVQG V7R-2E9
73 AIGWSGTVTHYSDSVQG V7R-2F6
2 AIGWSGAVTHYSDSVKG ID-A62U
74 ATGWSGAVTHYSDSVKG V7R-4F6
75 AINWSGAVTHYGDSVKG V7R-2B6
76 AIGWSGAVTHYSDSVKG ID-A14U
SEQ ID NO CDR3 实例
3 DYDTDVWQY ID-A62U
77 DYVTDVWQY V7R-6C12
78 DYDTDVWQH V7R-2B6
FR1
合适地，本发明的多肽的FR1包含与SEQ ID NO：4共享5％、12％、18％、26％、32％、38％、46％、52％、58％、62％、66％、68％、72％、75％、78％、82％、85％、90％、95％或更大序列同一性的序列或更合适地由其组成。
可替代地，本发明的多肽的FR1包含具有与SEQ ID NO：4相比不超过28个、更合适地不超过26个、更合适地不超过24个、更合适地不超过22个、更合适地不超过20个、更合适地不超过18个、更合适地不超过16个、更合适地不超过14个、更合适地不超过13个、更合适地不超过12个、更合适地不超过11个、更合适地不超过10个、更合适地不超过9个、更合适地不超过8个、更合适地不超过7个、更合适地不超过6个、更合适地不超过5个、更合适地不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个添加的序列或更合适地由其组成。合适地，本发明的多肽的FR1包含具有与SEQ ID NO：4相比不超过28个、更合适地不超过26个、更合适地不超过24个、更合适地不超过22个、更合适地不超过20个、更合适地不超过18个、更合适地不超过16个、更合适地不超过14个、更合适地不超过13个、更合适地不超过12个、更合适地不超过11个、更合适地不超过10个、更合适地不超过9个、更合适地不超过8个、更合适地不超过7个、更合适地不超过6个、更合适地不超过5个、更合适地不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个取代的序列或更合适地由其组成。合适地，本发明的多肽的FR1包含具有与SEQ ID NO：4相比不超过28个、更合适地不超过26个、更合适地不超过24个、更合适地不超过22个、更合适地不超过20个、更合适地不超过18个、更合适地不超过16个、更合适地不超过14个、更合适地不超过13个、更合适地不超过12个、更合适地不超过11个、更合适地不超过10个、更合适地不超过9个、更合适地不超过8个、更合适地不超过7个、更合适地不超过6个、更合适地不超过5个、更合适地不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个缺失的序列或更合适地由其组成。
合适地，FR1的与其在SEQ ID NO：4中的对应残基不同的任何残基是相对于其对应残基的保守取代。合适地，FR1的对应于SEQ ID NO：4的残基编号1的残基是D或E，最合适地D。合适地，FR1的对应于SEQ ID NO：4的残基编号1至5的残基是DVQLV。合适地，FR1包含SEQID NO：4或更合适地由其组成。合适地，FR1的对应于SEQ ID NO：4的残基编号24的残基是S。
FR2
合适地，本发明的多肽的FR2包含与SEQ ID NO：5共享10％、15％、25％、30％、40％、45％、55％、60％、70％、75％、85％、90％或更大序列同一性的序列或更合适地由其组成。
可替代地，本发明的多肽的FR2包含具有与SEQ ID NO：5相比不超过13个、更合适地不超过12个、更合适地不超过11个、更合适地不超过10个、更合适地不超过9个、更合适地不超过8个、更合适地不超过7个、更合适地不超过6个、更合适地不超过5个、更合适地不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个添加的序列或更合适地由其组成。合适地，本发明的多肽的FR2包含具有与SEQ ID NO：5相比不超过13个、更合适地不超过12个、更合适地不超过11个、更合适地不超过10个、更合适地不超过9个、更合适地不超过8个、更合适地不超过7个、更合适地不超过6个、更合适地不超过5个、更合适地不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个取代的序列或更合适地由其组成。合适地，本发明的多肽的FR2包含具有与SEQ ID NO：5相比不超过13个、更合适地不超过12个、更合适地不超过11个、更合适地不超过10个、更合适地不超过9个、更合适地不超过8个、更合适地不超过7个、更合适地不超过6个、更合适地不超过5个、更合适地不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个缺失的序列或更合适地由其组成。
合适地，FR2的与其在SEQ ID NO：5中的对应残基不同的任何残基是相对于其对应残基的保守取代。合适地，FR2的对应于SEQ ID NO：5的残基编号10的残基是R或L，最合适地L。合适地，FR2的对应于SEQ ID NO：5的残基编号8至11的残基是KEXE，其中X是R或L，最合适地L。可替代地，FR2的对应于SEQ ID NO：5的残基编号9至12的残基是GLEW。合适地，FR2包含SEQ ID NO：5或更合适地由其组成。合适地，FR2的对应于SEQ ID NO：5的残基编号2的残基是F，最合适地，另外，FR2的对应于SEQ ID NO：5的残基编号14的残基是A。合适地，FR2的对应于SEQ ID NO：5的残基9-14的残基是ELEFLA(SEQ ID NO：79)。合适地，FR2的对应于SEQID NO：5的残基9-14的残基不是GLEWVS(SEQ ID NO：80)。合适地，FR2的对应于SEQ ID NO：5的残基编号9的残基不是G。更合适地，FR2的对应于SEQ ID NO：5的残基编号9的残基是E。
FR3
合适地，本发明的多肽的FR3包含与SEQ ID NO：6共享8％、15％、20％、26％、32％、40％、45％、52％、58％、65％、70％、76％、80％、82％、90％、85％、92％、95％或更大序列同一性的序列或更合适地由其组成。
可替代地，本发明的多肽的FR3包含具有与SEQ ID NO：6相比不超过29个、更合适地不超过27个、更合适地不超过25个、更合适地不超过23个、更合适地不超过21个、更合适地不超过19个、更合适地不超过17个、更合适地不超过15个、更合适地不超过13个、更合适地不超过11个、更合适地不超过9个、更合适地不超过7个、更合适地不超过6个、更合适地不超过5个、更合适地不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个添加的序列或更合适地由其组成。合适地，本发明的多肽的FR3包含具有与SEQ ID NO：6相比不超过29个、更合适地不超过27个、更合适地不超过25个、更合适地不超过23个、更合适地不超过21个、更合适地不超过19个、更合适地不超过17个、更合适地不超过15个、更合适地不超过13个、更合适地不超过11个、更合适地不超过9个、更合适地不超过7个、更合适地不超过6个、更合适地不超过5个、更合适地不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个取代的序列或更合适地由其组成。合适地，本发明的多肽的FR3包含具有与SEQ ID NO：6相比不超过29个、更合适地不超过27个、更合适地不超过25个、更合适地不超过23个、更合适地不超过21个、更合适地不超过19个、更合适地不超过17个、更合适地不超过15个、更合适地不超过13个、更合适地不超过11个、更合适地不超过9个、更合适地不超过7个、更合适地不超过6个、更合适地不超过5个、更合适地不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个缺失的序列或更合适地由其组成。
合适地，FR3的与其在SEQ ID NO：6中的对应残基不同的任何残基是相对于其对应残基的保守取代。合适地，FR3包含SEQ ID NO：6或更合适地由其组成。合适地，FR3的对应于SEQ ID NO：6的残基编号18、19至20的残基是NSL。合适地，FR3的对应于SEQ ID NO：6的残基编号21的残基是R。合适地，FR3的对应于SEQ ID NO：6的残基编号22的残基是A。
FR4
合适地，本发明的多肽的FR4包含与SEQ ID NO：7共享5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大序列同一性的序列或更合适地由其组成。
可替代地，本发明的多肽的FR4包含具有与SEQ ID NO：7相比不超过10个、更合适地不超过9个、更合适地不超过8个、更合适地不超过7个、更合适地不超过6个、更合适地不超过5个、更合适地不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个添加的序列或更合适地由其组成。合适地，本发明的多肽的FR4包含具有与SEQ ID NO：7相比不超过10个、更合适地不超过9个、更合适地不超过8个、更合适地不超过7个、更合适地不超过6个、更合适地不超过5个、更合适地不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个取代的序列或更合适地由其组成。合适地，本发明的多肽的FR4包含具有与SEQ ID NO：7相比不超过10个、更合适地不超过9个、更合适地不超过8个、更合适地不超过7个、更合适地不超过6个、更合适地不超过5个、更合适地不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个缺失的序列或更合适地由其组成。
合适地，FR4的与其在SEQ ID NO：7中的对应残基不同的任何残基是相对于其对应残基的保守取代。合适地，FR4包含SEQ ID NO：7或更合适地由其组成。
完整多肽
合适地，本发明的多肽包含与SEQ ID NO：8共享50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的序列或更合适地由其组成。
可替代地，本发明的多肽包含具有与SEQ ID NO：8相比不超过20个、更合适地不超过15个、更合适地不超过10个、更合适地不超过9个、更合适地不超过8个、更合适地不超过7个、更合适地不超过6个、更合适地不超过5个、更合适地不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个添加的序列或更合适地由其组成。合适地，本发明的多肽包含具有与SEQ ID NO：8相比不超过20个、更合适地不超过15个、更合适地不超过10个、更合适地不超过9个、更合适地不超过8个、更合适地不超过7个、更合适地不超过6个、更合适地不超过5个、更合适地不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个取代的序列或更合适地由其组成。合适地，本发明的多肽包含具有与SEQ IDNO：8相比不超过20个、更合适地不超过15个、更合适地不超过10个、更合适地不超过9个、更合适地不超过8个、更合适地不超过7个、更合适地不超过6个、更合适地不超过5个、更合适地不超过4个、更合适地不超过3个、更合适地不超过2个、更合适地不超过1个缺失的序列或更合适地由其组成。
合适地，多肽的N末端是D。合适地，多肽包含SEQ ID NO：8或更合适地由其组成。
框架实施方案
在本发明的一个方面，提供了一种多肽，其包含四个框架区(FR1-FR4)，其中每个框架区是ID-A62U的对应框架区(即，SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ IDNO：7)的变体。合适地，每个变体框架区与其在ID-A62U中的对应框架区共享至少50％、更合适地至少60％、更合适地至少70％、更合适地至少80％或更合适地至少90％的同一性。更合适地，变体框架区包含ID-A62U的对应框架区或更合适地由其组成。合适地，包含四个框架区的多肽是抗体或抗体片段。合适地，抗体片段是VHH、VH、VL、V-NAR、scFv、Fab片段或F(ab′)2片段。更合适地，抗体片段是VHH或VH，并且最合适是VHH。
表位
实施例5详细描述了对本发明的多肽V7R-2E9进行的表位建模工作。此工作指示V7R-2E9结合至IL-7Rα的以下残基。覆盖界面处的特别显著的区域的残基以粗体突出显示。残基编号对应于SEQ ID NO：65。
Figure BDA0003513679060000341
因此，在本发明的一个方面，提供了一种多肽，其结合至IL-7Rα(SEQ ID NO：65)上的表位，所述表位包含IL-7Rα的选自Glu27、Ser31、Leu57、Val58、Glu59、Lys77、Lys78、Phe79、Leu80、Leu81、Ile82、Thr104、Lys137、Lys138、Tyr139、Lys141、His191、Tyr192和Phe193的至少一个残基。合适地，多肽结合至IL-7Rα上的包含IL-7Rα的选自此列表中的至少8个、更合适地至少15个、更合适地至少全部残基的表位。
可以注意到，IL-7Rα的某些残基与V7R-2E9覆盖界面处特别显著的区域。因此，在本发明的另一个方面，提供了一种多肽，其结合至IL-7Rα(SEQ ID NO：65)上的表位，所述表位包含IL-7Rα的至少一个选自以下残基：Ser31、Val58、Phe79、Leu80、Leu81、Ile82、Lys138、Tyr139和Phe193。合适地，多肽结合至IL-7Rα上的包含IL-7Rα的至少Val58、Leu80和Lys138的表位。更合适地，IL-7Rα的Val58、Leu80、Lys138、Ile82和Tyr139。更合适地，IL-7Rα的Val58、Leu80、Lys138、Ile82、Tyr139、Leu81和Phe79。合适地，多肽结合至IL-7Rα上的包含IL-7Rα的选自以下的至少5个、更合适地至少7个、更合适地全部残基的表位：Ser31、Val58、Phe79、Leu80、Leu81、Ile82、Lys138、Tyr139和Phe193。
合适地，此上下文中的‘结合至表位’可以被定义为在多肽结合时构成表位的IL-7Rα的相关残基，其具有至少在上表中关于相关残基引用的BSA。
接头和多聚体
根据本发明的构建体包含多个多肽并且因此可以合适地是多价的。这种构建体可以包含至少两个根据本发明的相同多肽。由两个根据本发明的相同多肽组成的构建体是“同双头”。在本发明的一个方面，提供了一种构建体，其包含两个或更多个本发明的相同多肽。
可替代地，构建体可以包含至少两个多肽，其是不同的但仍然均是根据本发明的多肽(“同双头”)。
可替代地，这种构建体可以包含(a)至少一个根据本发明的多肽和(b)至少一个不是本发明的多肽的多肽诸如抗体或其抗原结合片段(也是“异双头”)。(b)的至少一个多肽可以结合IL-7R(例如经由与(a)的表位不同的表位)，或可替代地可以结合至除IL-7R以外的靶。合适地，不同多肽(b)结合至例如：白细胞介素(诸如IL-1、IL-1ra、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17和IL-18)、白细胞介素受体(诸如IL-6R)、转录因子(诸如NF-kB)、细胞因子(诸如TNF-α、IFN-γ、TGF-β)、跨膜蛋白(诸如gp130和CD3)、表面糖蛋白(诸如CD4、CD20、CD40)、可溶性蛋白(诸如CD40L)、整联蛋白(诸如a4b7和AlphaEbeta7)、粘附分子(诸如MAdCAM)、趋化因子(诸如IP10和CCL20)、趋化因子受体(诸如CCR2和CCR9)、抑制性蛋白(诸如SMAD7)、激酶(诸如JAK3)、G蛋白偶联受体(诸如鞘氨醇-1-P受体)、人病理过程中涉及的其他炎性介质或免疫相关配体。因此，不同多肽(b)结合至例如IL-6R、IL-6、IL-12、IL-1-p、IL-17A、TNF-α或CD3；或人病理过程中涉及的其他炎性介质或免疫相关配体。
构建体可以是多价的和/或多特异性的。多价构建体(诸如二价构建体)包含两个或更多个结合多肽，因此呈现两个或更多个可以发生与一个或多个抗原的连接的位点。多价构建体的实例可以是同双头或异双头。多价构建体(诸如双特异性构建体)包含两个或更多个不同的结合多肽，其呈现两个或更多个(a)可以发生与两个或更多个不同抗原的连接或(b)可以发生与同一抗原上两个或更多个不同表位的连接的位点。多特异性构建体的实例可以是异双头。多特异性构建体是多价的。
合适地，构建体内包含的多肽是抗体片段。更合适地，构建体内包含的多肽选自VHH、VH、VL、V-NAR、scFv、Fab片段或F(ab′)2片段。更合适地，构建体内包含的多肽是VH或VHH，最合适地是VHH。
合适地，构建体内包含的多肽选自ICVD(诸如VHH、VH、VL)、V-NAR、scFv、Fab片段或F(ab′)2片段。更合适地，构建体内包含的多肽是ICVD，更合适地，构建体内包含的多肽是VH或VHH，最合适地VHH。
本发明的多肽可以彼此直接(即，不使用接头)或经由接头连接。合适地，接头是蛋白酶不稳定接头或非蛋白酶不稳定接头。接头合适地是多肽并且被选择来以便允许多肽与其表位的结合。如果用于治疗性目的，则接头合适地在多肽所施用于的受试者中是非免疫原性的。合适地，多肽全部通过非蛋白酶不稳定接头连接。合适地，蛋白酶不稳定接头具有式[-(GaS)x-BJB’-(GaS)y-]z，其中J是赖氨酸或精氨酸，B是0至5个选自以下的氨基酸残基：R、H、N、Q、S、T、Y、G、A、V、L、W、P、M、C、F、K或I，B’是0至5个选自以下的氨基酸残基：R、H、N、Q、S、T、Y、G、A、V、L、W、M、C、F、K或I，a是1至10，x是1至10；y是1至10并且z是1至10(SEQ ID NO：85)。合适地，a是4。最合适地，a是4，J是赖氨酸，B是0，x是1，y是1并且z是1。可替代地，蛋白酶不稳定接头具有式-(G4S)x-K-(G4S)y-，其中x和y各自独立地是1至5(SEQ ID NO：86)，更合适地-(G4S)2-K-(G4S)2-(SEQ ID NO：87)。
合适地，非蛋白酶不稳定接头具有式(G4S)x(SEQ ID NO：88)。更合适地，x是1至10，更合适地x是4至8，更合适地x是4、6或8。最合适地，x是6(SEQ ID NO：89)。
载体和宿主
如本文所用，术语“载体”意图是指能够转运其所连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，所述质粒是指可以将另外的DNA区段连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入到其中的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物和酵母载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以在引入到宿主细胞中之后整合到宿主细胞的基因组中，并且因此与宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简单地“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常呈质粒的形式。在本发明说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常使用的载体形式。然而，本发明旨在包括此类其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们具有相同的功能，以及还有噬菌体和噬菌粒系统。本发明还涉及核苷酸序列，其编码多肽序列或多价和/或多特异性构建体。如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简单地“宿主细胞”)意图是指已经将重组表达载体引入其中的细胞。此类术语不仅意图是指特定的受试者细胞，而且是指这种细胞的子代。
在本发明的一个方面，提供了一种载体，其包含编码本发明的多肽或构建体的多核苷酸或包含所述多核苷酸的cDNA。在本发明的另一个方面，提供了一种用所述载体转化的宿主细胞，其能够表达本发明的多肽或构建体。合适地，宿主细胞是细菌，诸如大肠杆菌，属于曲霉属、酵母属、克鲁维酵母属、汉森酵母属或毕赤酵母属的酵母诸如酿酒酵母或毕赤酵母。
自身免疫疾病和/或炎性疾病
当免疫系统对正常身体组织有不良应答时，自身免疫疾病发生。自身免疫障碍可以导致对身体组织的损害、异常器官生长和/或器官功能的变化。所述障碍可以仅影响一个器官或组织类型或者可以影响多个器官和组织。通常被自身免疫障碍影响的器官和组织包括血液成分诸如红细胞、血管、结缔组织、内分泌腺诸如甲状腺或胰腺、肌肉、关节和皮肤。炎性疾病是特征在于炎症的疾病。许多炎性疾病是自身免疫疾病并且反之亦然。
合适地，本发明的多肽、药物组合物或构建体用于用作药剂并且更合适地用于治疗自身免疫疾病和/或炎性疾病。
本发明的多肽(合适地，当口服递送时)理想地治疗炎性疾病，其中IL-7和/或L-TSLP有助于病理学的至少一部分，并且多肽可以到达IL-7和/或L-TSLP是生物活性的组织。
本发明的多肽结合至受体(IL-7R)。因此它可以破坏疾病中可能涉及的IL-7R的尚未发现的细胞因子或其他结合配偶体。
IL-7和L-TSLP与IL-7R结合的抑制
TSLP的不同同种型有差异地表达并且经由不同的信号传导途径起作用的证据表明，它可以选择性地靶向L-TSLP的疾病相关活性而不是此细胞因子的短同种型的生理有益作用。本发明的多肽抑制IL-7与IL-7R的结合。来自V7R-2E9分子与IL-7Rα相互作用的计算机模拟和TSLP：TSLPR：IL-7R复合物的最近公布的结构(Verstraete等人2017)的信息强烈地表明V7R-2E9和本发明的其他多肽抑制IL-7和L-TSLP两者与IL-7Rα的结合。现在已经确认了V7R-2E9强效地阻断IL-7(Il-7诱导的STAT5磷酸化)和L-TSLP(TSLP诱导的TARC分泌)两者的受体结合和基于细胞的生物活性的能力。因为V7R-2E9结合至IL-7Rα而非TSLP，所以预期V7R-2E9和相关ICVD仅阻断L-TSLP的促炎活性，并且S-TSLP的重要粘膜稳态功能不受影响。
炎性肠病(IBD)
折磨儿童和成年人的慢性炎性肠病克罗恩氏病和溃疡性结肠炎是GIT的自身免疫疾病和炎性疾病的实例(Hendrickson等人2002)。溃疡性结肠炎被定义为其中炎性应答和形态变化保持局限于结肠的病状。95％的患者中涉及直肠。炎症在很大程度上限于粘膜并且包括溃疡、水肿和出血的可变严重性以及结肠长度的连续损害(Hendrickson等人2002)。溃疡性结肠炎通常表现为存在粪便中混合血液和粘液以及较低的腹部绞痛，其在排便期间最严重。在临床上，腹泻存在血液和粘膜将溃疡性结肠炎与不存在血液的肠易激综合征区分开。与溃疡性结肠炎不同，克罗恩氏病的呈现通常较不明显，其导致晚期诊断。诸如损害的位置、程度和严重性的因素决定胃肠道症状的程度。具有回肠结肠损害的患者通常具有餐后腹痛以及右下腹压痛和偶发炎性肿块。与胃十二指肠克罗恩氏病相关联的症状包括早饱、恶心、呕吐、上腹部疼痛或吞咽困难。肛周疾病以及肛赘(anal tags)、深度肛裂和瘘是常见的(Hendrickson等人2002)。
合适地，本发明的多肽、药物组合物或构建体用于治疗其中IL-7和/或L-TSLP促成这种疾病的病理学的GI(胃肠)道自身免疫疾病和/或炎性疾病。
合适地，本发明的多肽、药物组合物或构建体用于治疗GI道的自身免疫疾病和/或炎性疾病，所述疾病选自克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、肠易激病、II型糖尿病、肾小球肾炎、自身免疫性肝炎、干燥综合征(Sjogren′s syndrome)、乳糜泻和药物或辐射诱导的粘膜炎(更合适地克罗恩氏病或溃疡性结肠炎，最合适地溃疡性结肠炎)。
嗜酸细胞性食管炎(EoE)
嗜酸细胞性食管炎(EoE，还拼写为eosinophilic oesophagitis并且还被称为过敏性食管炎)是涉及嗜酸性粒细胞(一种类型的白细胞)的食管的过敏性炎性病状。症状是吞咽困难、食物嵌塞、呕吐和胃灼热。
合适地，本发明的多肽、药物组合物或构建体用于治疗嗜酸细胞性食管炎。更合适地，多肽、药物组合物或构建体用于治疗嗜酸细胞性食管炎并且口服施用。
其他自身免疫疾病/炎性疾病
可以例如经由口服施用本发明的多肽治疗的其他GIT疾病包括例如炎性疾病粘膜炎(合适地，药物和辐射诱导的粘膜炎)、哮喘、特发性肺纤维化、特应性皮炎、过敏性结膜炎、过敏性鼻炎、内瑟顿综合征(Netherton syndrome)、食物过敏、过敏性腹泻、嗜酸细胞性胃肠炎、过敏性支气管肺曲霉病(ABPA)、过敏性真菌性鼻窦炎、癌症、COPD、瘢痕、慢性鼻鼻窦炎(CRS)、鼻息肉病、慢性嗜酸细胞性肺炎、嗜酸细胞性支气管炎、乳糜泻和查格-施特劳斯综合征(Churg-Strauss syndrome)。
在粘膜炎中，病灶可以发生在口部至肛门的任何地方，并且对于口部和食管病灶，可以使用含有可变结构域的漱口水或霜制剂。对于肛门和直肠病灶，含有可变结构域的栓剂、霜剂或泡沫将适于局部施加。免疫球蛋白链可变结构域将经由在炎症位点处被吸附到血流中或经由淋巴清除并随后进入血流中来从固有层或其他炎性位点处清除。结构域因此经由血流到达肺并且经由肾中的肾小球滤过来清除。因此结构域在诸如自身免疫疾病、II型糖尿病和肾小球肾炎的疾病中发挥治疗作用存在良好的基本原理。
在一个实施方案中，本发明的多肽或构建体用于合适地通过局部递送至和/或通过皮肤来治疗或预防特应性皮炎，合适地呈霜剂、纳米颗粒、软膏或水凝胶的形式。
合适地，多肽、药物组合物或构建体用于治疗其中IL-7和/或L-TSLP是所观察到的病理学的一部分的原因的其他自身免疫疾病/炎性疾病。
治疗用途和递送
本发明的多肽、药物组合物或构建体的治疗有效量是在单一或多个剂量施用于受试者后有效地以显著程度抑制受试者中IL-7和/或L-TSLP与IL-7R的结合的量。治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及多肽、药物组合物或构建体在个体中引发所需应答的能力的因素而变化。治疗有效量也是治疗有益效果超过本发明的多肽、药物组合物或构建体的任何毒性或有害作用的量。本发明的多肽或构建体可以并入到适用于施用于受试者的药物组合物中。本发明的多肽或构建体可以呈药学上可接受的盐的形式。
本发明的药物组合物可以合适地配制成用于口服、肌内、皮下或静脉内递送。本发明的药物组合物可以呈各种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，诸如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散体或悬浮剂、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。固体剂型是优选的。本发明的多肽、药物组合物或构建体可以并入有赋形剂，并且以可摄入的片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆、晶片等形式使用。为了治疗嗜酸细胞性食管炎，呈锭剂形式递送是特别优选的。为了治疗特应性皮炎，呈霜剂形式递送是特别优选的。
通常，药物组合物包含本发明的多肽或构建体和药学上可接受的稀释剂或载剂。药学上可接受的载剂的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合中的一种或多种。药学上可接受的载剂还可以包含少量增强本发明的多肽或构建体的存放期或有效性的辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。药物组合物可以包含抗粘剂、粘合剂、涂层、崩解剂、风味剂、着色剂、润滑剂、吸附剂、防腐剂、甜味剂、冻干赋形剂(包括冻干保护剂)或压缩助剂。
在患有EoE和UC的患者中，认为发炎的肠粘膜上皮屏障受损并且因此将有利于口服施用的本发明的多肽穿透到下面的粘膜组织中，从而潜在地抑制炎症位点处靶组织中的IL-7和L-TSLP活性两者。口服施用本发明的多肽应限制IL-7和L-TSLP活性的系统性抑制，从而降低与通过注射给予的常规IL-7和L-TSLP抗体相关联的一般免疫抑制的风险。可能的是，诸如动物模型中发生的短期抗IL-7R抗体治疗由于致病性T细胞的耗尽而提供延长时间段的临床作用(缓解)。然而，向患者重复系统性施用现有IL-7Rα封闭抗体可能导致胸腺T细胞发育的抑制和外周中T细胞的耗尽，从而导致显著的系统性免疫抑制。炎性肠病(克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)和EoE主要定位于胃肠道；因此，将本发明的多肽口服施用至发炎肠粘膜提供以有限的系统性暴露实现局部化作用、从而降低未患病的组织中的免疫抑制风险的潜力。
因此，合适地，本发明的多肽、药物组合物或构建体口服施用。多肽、药物组合物或构建体可以口服递送(诸如用于治疗EoE)至口腔、咽和食管(更合适地，食管)，或者可以口服递送(诸如用于治疗IBD)至十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠和/或肛管。
口服递送的关键问题是确保足够的多肽、药物组合物或构建体到达需要其的肠道的区域。阻止本发明的多肽、药物组合物或构建体到达需要其的肠道的区域的因素包括消化分泌物中存在蛋白酶，其可以降解本发明的多肽、药物组合物或构建体。合适地，本发明的多肽、药物组合物或构建体由于多肽或构建体本身的固有特性在此类蛋白酶中的一种或多种的存在下基本上是稳定的。合适地，本发明的多肽或构建体在并入到药物组合物中之前是冻干的。
本发明的多肽也可以提供有肠溶包衣。肠溶包衣是施加在口服药品上的聚合物阻隔物，其帮助防止多肽受胃的低pH的影响。用于肠溶包衣的材料包括脂肪酸、蜡、虫胶、塑料和植物纤维。合适的肠溶包衣组分包括丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、醋酸琥珀酸酯纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基酯纤维素、醋酸羟丙基甲基琥珀酸酯纤维素(醋酸琥珀羟丙甲纤维素)、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、海藻酸钠和硬脂酸。合适的肠溶包衣包括pH依赖性释放聚合物。这些是在胃中存在的高酸性pH下不可溶但是在较低酸性pH下快速溶解的聚合物。因此，合适地，肠溶包衣在胃的酸性胃液(pH～3)中不溶解，但是在小肠中(pH高于6)或在结肠中(pH高于7.0)存在的较高pH环境中溶解。pH依赖性释放聚合物被选择成使得本发明的多肽或构建体大约在剂量到达小肠的时间被释放。
如果口服施用以治疗IBD，本发明的多肽合适地提供有肠溶包衣。如果口服施用以治疗EoE，本发明的多肽合适地以压缩药锭的形式提供。
本发明的多肽、构建体或药物组合物可以局部递送。这种药物组合物可以合适地呈霜剂、软膏、洗液、凝胶、泡沫、经皮贴剂、粉剂、膏体或酊剂的形式，并且可以合适地包括维生素D3类似物(例如，钙泊三醇和马沙骨化醇)、类固醇(例如，丙酸氟替卡松、戊酸倍他米松和丙酸氯倍他索)、维甲酸(例如，他扎罗汀)、煤焦油和地蒽酚。局部药剂经常彼此组合(例如，维生素D3和类固醇)或与其他药剂诸如水杨酸组合使用。
本发明的多肽、构建体或药物组合物可以被配制成用于通过将它们溶解、悬浮或乳化在水性或非水性溶剂，诸如植物油或其他类似的油、脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸的酯或丙二醇中进行注射的制剂；并且如果需要的话，具有常规添加剂，诸如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。可接受的载剂、赋形剂和/或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对于接受者是无毒的，并且包括缓冲液，诸如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、蛋氨酸和柠檬酸；防腐剂(诸如乙醇、苄醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵或其组合)；氨基酸，诸如精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、脯氨酸及其组合；单糖、二塘和其他碳水化合物；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如明胶或血清白蛋白；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、氨基葡萄糖、N-甲基氨基葡萄糖、半乳糖胺和神经氨酸；和/或非离子表面活性剂，诸如聚山梨醇酯、POE醚、泊洛沙姆、Triton-X或聚乙二醇。
对于所有的递送模式，本发明的多肽、药物组合物或构建体可以在缓冲液中配制，以便在5-50g/l之间、或更合适地15-40g/l之间或更合适地25-30g/l之间的浓度下使组合物的pH稳定。合适的缓冲液组分的实例包括生理盐，诸如柠檬酸钠和/或柠檬酸。合适地，缓冲液含有100-200mM、更合适地125-175mM的生理盐，诸如氯化钠。合适地，缓冲液被选择成具有接近组合物的pH或患者的生理pH的pKa。
药物组合物中的示例性多肽或构建体浓度的范围可以是约1mg/mL至约200mg/ml、或约50mg/mL至约200mg/mL、或约150mg/mL至约200mg/mL。
本发明的多肽、构建体或药物组合物的水性配制品可以在pH缓冲溶液中，例如在范围是约4.0至约7.0、或约5.0至约6.0、或可替代地约5.5的pH下制备。合适的缓冲液的实例包括磷酸、组氨酸、柠檬酸、琥珀酸、醋酸缓冲液和其他有机酸缓冲液。根据例如缓冲液和配制品的所需张力，缓冲液浓度可以是约1mM至约100mM、或约5mM至约50mM。
药物组合物的张力可以通过包含张力调节剂来改变。此类张力调节剂可以带电的或不带电的化学物质。典型的不带电的张力调节剂包括糖或糖醇或其他多元醇，优选地海藻糖、蔗糖、甘露醇、甘油、1，2-丙二醇、棉子糖、山梨醇或乳糖醇(尤其是海藻糖、甘露醇、甘油或1，2-丙二醇)。典型的带电的张力调节剂包括盐，诸如钠、钾或钙离子与氯化物、硫酸盐、碳酸盐、亚硫酸盐、硝酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐或马来酸盐离子的组合(尤其是氯化钠或硫酸钠)；或氨基酸诸如精氨酸或组氨酸。合适地，水性配制品是等渗，虽然高渗或低渗溶液可以是合适的。术语“等渗”代表具有与它所比较的某一其他溶液相同的张力的溶液，诸如生理盐溶液或血清。张力剂可以约5mM至约350mM的量，例如以1mM至500nM的量使用。合适地，至少一种等渗剂包含在组合物中。
表面活性剂也可以添加到药物组合物中，以减少配制的多肽或构建体的聚集和/或使配制品中颗粒的形成最小化和/或减少吸附。示例性表面活性剂包括聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(Tween)、聚氧乙烯烷基醚(Brij)、烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆(Poloxamer)，普朗尼克(Pluronic))和十二烷基硫酸钠(SDS)。合适的聚氧乙烯山梨醇-脂肪酸酯的实例是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80。表面活性剂的示例性浓度的范围是约0.001％至约10％w/v。
还可以添加冻干保护剂，以便保护本发明的多肽或构建体在冷冻过程期间免受去稳定化条件的影响。例如，已知的冻干保护剂包括糖(包括葡萄糖、蔗糖、甘露糖和海藻糖)；多元醇(包括甘露醇、山梨醇和甘油)；以及氨基酸(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。可以包含约10mM至500mM的量的冻干保护剂。
用于施用本发明的多肽、本发明的药物组合物或构建体的剂量范围是产生所需治疗效果的那些剂量范围。所需的剂量范围取决于本发明的多肽、药物组合物或构建体的准确性质、施用途径、配制品的性质、患者的年龄、患者状况的性质、程度或严重性、禁忌症(如果有的话)以及主治医师的判断。这些剂量水平的变化可以使用标准经验惯例来调节以进行优化。
合适地，本发明的多肽、本发明的药物组合物或构建体的每日剂量的范围是50ng-50mg/kg，诸如50ug-40mg/kg，诸如5-30mg/kg。单位剂量可以从小于100mg变化，但是通常在250-2000mg/剂量的区域内，其可以每日施用或更频繁地施用，例如2、3或4次/天或更不频繁地施用，例如每两天一次或每周一次、每两周一次或每月一次。
在本发明的一个方面，提供了本发明的多肽、药物组合物或构建体在制造用于治疗自身免疫疾病的药剂中的用途。在本发明的另一个方面，提供了一种治疗自身免疫疾病的方法，其包括向有需要的人施用治疗有效量的本发明的多肽、药物组合物或构建体。
在本发明的一个方面，提供了本发明的多肽、药物组合物或构建体在制造用于治疗自身免疫疾病/炎性疾病的药剂中的用途。在本发明的另一个方面，提供了一种治疗自身免疫疾病/炎性疾病的方法，其包括向有需要的人施用治疗有效量的本发明的多肽、药物组合物或构建体。
词语‘治疗’旨在包括预防以及治疗性治疗。疾病的治疗还包括治疗恶化并且还包括治疗从疾病症状缓解的患者以防止疾病症状复发。
组合疗法
本发明的药物组合物还可以包含一种或多种活性剂(例如，适用于治疗本文提及的疾病的活性剂)。在本发明的范围内的是，在用于治疗自身免疫疾病的治疗性方法中使用本发明的药物组合物作为治疗自身免疫疾病中通常使用的其他建立疗法的附加或与其结合使用。
对于IBD(诸如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)的治疗，可能的组合包括与例如选自包括以下的列表中的一种或多种活性剂的组合：5-氨基水杨酸或其前药(诸如柳氮磺胺吡啶、奥柳氮或bisalazide)；皮质类固醇(例如，泼尼松龙、甲基泼尼松龙或布地奈德)；免疫抑制剂(例如，环孢菌素、他克莫司、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤或6-巯基嘌呤)；抗TNF-α抗体(例如，英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗或戈利木单抗)；抗IL12/IL23抗体(例如，乌司奴单抗)；抗IL6R抗体或小分子IL12/IL23抑制剂(例如，阿吡莫德)；抗α-4-β-7抗体(例如，维多珠单抗)；MAdCAM-1阻断剂(例如，PF-00547659)；针对细胞粘附分子α-4-整联蛋白的抗体(例如，那他珠单抗)；针对IL2受体α亚基的抗体(例如，达利珠单抗或巴利昔单抗)；JAK3抑制剂(例如，托法替尼或R348)；Syk抑制剂及其前药(例如，福坦替尼和R-406)；磷酸二酯酶-4抑制剂(例如，替托司特)；HMPL-004；益生菌；德沙拉秦；塞马莫德/CPSI-2364；以及蛋白激酶C抑制剂(例如，AEB-071)。最合适的组合剂是英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗或戈利木单抗。
因此，本发明的另一个方面提供了与一种或多种另外的活性剂，例如以上所述的一种或多种活性剂组合的本发明的药物组合物。
在本发明的另一个方面，多肽、药物组合物或构建体与选自以上列表中的至少一种活性剂顺序、同时或单独施用。
类似地，本发明的另一个方面提供了一种组合剂，其包含：
(A)本发明的多肽、药物组合物或构建体；和
(B)一种或多种其他活性剂，
其中组分(A)和(B)中的每一种与药学上可接受的助剂、稀释剂或载剂混合配制。在本发明的此方面中，组合产物可以是单一(组合)配制品或成套试剂盒(kit-of-parts)。因此，本发明的此方面涵盖一种组合配制品，其包含与药学上可接受的助剂、稀释剂或载剂混合的本发明的多肽、药物组合物或构建体和另一种治疗剂。
本发明还涵盖一种成套试剂盒，其包括以下组分：
(i)与药学上可接受的助剂、稀释剂或载剂混合的本发明的多肽、药物组合物或构建体；和
(ii)包含与药学上可接受的助剂、稀释剂或载剂混合的一种或多种其他活性剂的配制品，所述组分(i)和(ii)各自呈适于彼此组合施用的形式提供。
因此，成套试剂盒的组分(i)是与药学上可接受的助剂、稀释剂或载剂混合的以上组分(A)。类似地，组分(ii)是与药学上可接受的助剂、稀释剂或载剂混合的以上组分(B)。一种或多种其他活性剂(即，以上组分(B))可以是以上结合自身免疫疾病诸如IBD(例如，克罗恩氏病和/或溃疡性结肠炎)的治疗提及的剂中的任一种。如果组分(B)是多于一种另外的活性剂，这些另外的活性剂可以彼此配制或与组分(A)配制或者它们可以单独配制。在一个实施方案中，组分(B)是一种其他治疗剂。在另一个实施方案中，组分(B)是两种其他治疗剂。本发明的此方面的组合产物(组合制剂或成套试剂盒)可以用于自身免疫疾病(例如，本文提及的自身免疫疾病)的治疗或预防。
稳定性
在一个实施方案中，本发明的多肽或构建体口服递送。因此，本发明的多肽或构建体合适地在口服递送时基本上保留中和能力和/或功效。
合适地，本发明的多肽或构建体在口服递送时并且在暴露于肠道之后(例如，在暴露于小肠和/或大肠的蛋白酶和/或IBD炎性蛋白酶之后)保留中和能力和/或功效。此类蛋白酶包括肠肽酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和肠易激病炎性蛋白酶(诸如MMP3、MMP12和组织蛋白酶)。小肠和/或大肠的蛋白酶或在小肠和/或大肠中产生的蛋白酶包括来源于肠道共生微生物菌群和/或病原菌的蛋白酶，例如其中蛋白酶是细胞膜附接的蛋白酶、排泄的蛋白酶和细胞裂解释放的蛋白酶)。最合适地，蛋白酶是胰蛋白酶和糜蛋白酶。
合适地，肠道是狗、猪、人、食蟹猴或小鼠的肠道。更合适地，肠道是人、食蟹猴或小鼠，最合适地人的肠道。小肠合适地由十二指肠、空肠和回肠组成。大肠合适地由盲肠、结肠、直肠和肛管组成。与胃肠道相反，肠道仅由小肠和大肠组成。在一个实施方案中，本发明的多肽或构建体基本上耐受肠道，最合适地人肠道的蛋白酶。
在口腔、咽和食管中的稳定性
口腔、咽和食管在胃肠道中的胃前面。合适地，本发明的多肽或构建体在口服递送时并且在暴露于口腔、咽和食管之后(例如，在暴露于口腔、咽和食管的蛋白酶之后)基本上保留中和能力和/或功效。口腔、咽和食管的蛋白酶包括来源于共生微生物菌群和/或病原菌的蛋白酶，例如其中蛋白酶是细胞膜附接的蛋白酶、排泄的蛋白酶和细胞裂解释放的蛋白酶)。
合适地，口腔、咽和食管是狗、猪、人、食蟹猴或小鼠的那些。更合适地，口腔、咽和食管是人、食蟹猴或小鼠，最合适地人的那些。
在暴露于小肠和/或大肠中存在的蛋白酶和/或IBD炎性蛋白酶之后，当本发明的多肽或构建体的原始中和能力的合适地10％或更多、更合适地20％或更多、更合适地30％或更多、更合适地40％或更多、更合适地50％或更多、更合适地60％或更多、更合适地70％或更多、更合适地80％或更多、更合适地90％或更多、更合适地95％或更多、或最合适地100％被保留时，本发明的多肽或构建体基本上保留中和能力。
合适地，在37℃下暴露于小肠和/或大肠中存在的蛋白酶和/或IBD炎性蛋白酶例如至少2小时、更合适地至少3小时、更合适地至少4小时、至少5小时、更合适地至少5.5小时、更合适地至少6小时、更合适地至少6.5小时、更合适地至少7小时、更合适地至少7.5小时、更合适地至少10小时、更合适地至少13小时或更合适地至少16小时之后，本发明的多肽或构建体基本上保留中和能力。
在至少2小时、更合适地至少3小时、更合适地至少4小时、更合适地至少5小时、更合适地至少6小时、更合适地至少7小时、更合适地至少9小时、更合适地至少11小时、更合适地至少13小时或更合适地至少16小时暴露于肠道，更合适地小肠或大肠，更合适地人粪便提取物之后，本发明的多肽或构建体的中和能力的合适地10％或更多、更合适地20％或更多、更合适地30％或更多、更合适地40％或更多、更合适地50％或更多、更合适地60％或更多、更合适地70％或更多、更合适地80％或更多、更合适地90％或更多或更合适地95％被保留。
在合适地至少1小时、更合适地至少2小时、更合适地至少3小时、更合适地至少4小时、更合适地至少5小时或更合适地至少6小时暴露于小鼠小肠上清液之后，本发明的多肽或构建体的中和能力的合适地10％或更多、更合适地20％或更多、更合适地30％或更多、更合适地40％或更多、更合适地50％或更多、更合适地60％或更多、更合适地70％或更多、更合适地80％或更多、更合适地90％或更多或更合适地95％或更多被保留。
在施用之后至少2小时、更合适地至少3小时、更合适地至少4小时、更合适地至少5小时、更合适地至少6小时、更合适地至少7小时、更合适地至少9小时、更合适地至少11小时、更合适地至少13小时或更合适地至少16小时之后，本发明的多肽或构建体的施用剂量的合适地10％或更多、更合适地20％或更多、更合适地30％或更多、更合适地40％或更多、更合适地50％或更多、更合适地60％或更多、更合适地70％或更多保留针对IL-7和/或L-TSLP的中和能力并且保持在小鼠、食蟹猴和/或人的粪便(合适地排泄粪便或从肠道取出的粪便)中。
在暴露于小肠和/或大肠中存在的蛋白酶和/或IBD炎性蛋白酶之后，当本发明的多肽或构建体的施用量的合适地10％或更多、更合适地20％或更多、更合适地30％或更多、更合适地40％或更多、更合适地50％或更多、更合适地60％或更多、更合适地70％或更多、更合适地80％或更多、更合适地90％或更多、更合适地95％或更多、更合适地99％或更多、最合适地100％保持完整时，本发明的多肽或本发明的构建体基本上保持完整。
‘稳定性’和‘存活率’诸如‘稳定性％’和‘存活％’在本文中可互换使用。“基本上保留中和能力”和“基本上耐受”在本文中可互换使用。
在本发明的一个实施方案中，基于其在人粪便上清液消化物中的稳定性，提供了一种多肽，其包含如下引用的任一个ICVD的多肽序列或更合适地由其组成：
V7R-2E9、ID-A59U、ID-A2U、ID-A9U、ID-A10U、ID-A11U、ID-A12U、ID-A14U、ID-A15U、ID-A16U、ID-A17U、ID-A18A、ID-A19U、ID-A20U、ID-A21U、ID-A24U、ID-A43U、ID-A25U、ID-A30U、ID-A31U、ID-A50U、ID-A33U、ID-A52U、ID-A34U、ID-A53U、ID-A35U、ID-A54U、ID-A36U、ID-A55U、ID-A37U、ID-A38U、ID-A57U、ID-A39U、ID-A40U、V7R-2F6、V7R-6C12、V7R-2B6、V7R-3B5、V7R-4F6、V7R-2E5、ID-A3U、ID-A4U、ID-A5U、ID-A6U、ID-A7U、ID-A8U、ID-A13U、ID-A23U、ID-A26U、ID-A27U、ID-A28U、ID-A29U和ID-A32U。
还提供了一种多肽，其包含三个互补决定区(CDR1-CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)，其中CDR1包含以上ICVD中的任一个的CDR1序列或更合适地由其组成，CDR2包含以上ICVD中的任一个的CDR2序列或更合适地由其组成，并且CDR3包含以上ICVD中的任一个的CDR3序列或更合适地由其组成。最合适地，多肽包含来自以上单个ICVD的全部三个CDR。
基于其在人粪便上清液消化物中的稳定性，更合适地提供了一种多肽，其包含如下引用的任一个ICVD的多肽序列或更合适地由其组成：
V7R-2E9、ID-A59U、ID-A2U、ID-A9U、ID-A10U、ID-A11U、ID-A12U、ID-A14U、ID-A15U、ID-A16U、ID-A17U、ID-A18A、ID-A19U、ID-A20U、ID-A21U、ID-A24U、ID-A43U、ID-A25U、ID-A30U、ID-A31U、ID-A50U、ID-A33U、ID-A52U、ID-A34U、ID-A53U、ID-A35U、ID-A54U、ID-A36U、ID-A55U、ID-A37U、ID-A38U、ID-A57U、ID-A39U、ID-A40U、V7R-2F6、V7R-6C12、V7R-2B6、V7R-3B5、V7R-4F6和V7R-2E5。
还提供了一种多肽，其包含三个互补决定区(CDR1-CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)，其中CDR1包含以上ICVD中的任一个的CDR1序列或更合适地由其组成，CDR2包含以上ICVD中的任一个的CDR2序列或更合适地由其组成，并且CDR3包含以上ICVD中的任一个的CDR3序列或更合适地由其组成。最合适地，多肽包含来自以上单个ICVD的全部三个CDR。
基于其在人粪便上清液消化物中的稳定性，更合适地提供了一种多肽，其包含如下引用的任一个ICVD的多肽序列或更合适地由其组成：
V7R-2E9、ID-A59U、ID-A2U、ID-A9U、ID-A10U、ID-A11U、ID-A12U、ID-A14U、ID-A15U、ID-A16U、ID-A17U、ID-A18A、ID-A19U、ID-A20U、ID-A21U、ID-A24U、ID-A43U、ID-A25U、ID-A30U、ID-A31U、ID-A50U、ID-A33U、ID-A52U、ID-A34U、ID-A53U、ID-A35U、ID-A54U、ID-A36U、ID-A55U、ID-A37U、ID-A38U、ID-A57U、ID-A39U、ID-A40U。
还提供了一种多肽，其包含三个互补决定区(CDR1-CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)，其中CDR1包含以上ICVD中的任一个的CDR1序列或更合适地由其组成，CDR2包含以上ICVD中的任一个的CDR2序列或更合适地由其组成，并且CDR3包含以上ICVD中的任一个的CDR3序列或更合适地由其组成。最合适地，多肽包含来自以上单个ICVD的全部三个CDR。
制备方法
本发明的多肽可以使用例如Green和Sambrook 2012Molecular Cloning：ALaboratory Manual第4版Cold Spring Harbour Laboratory Press中公开的技术来获得并操纵。
单克隆抗体可以使用杂交瘤技术，通过将产生特异性抗体的B细胞与由于其在组织培养物中生长的能力并且不存在抗体链合成而被选择的骨髓瘤(B细胞癌)细胞融合来产生(
Figure BDA0003513679060000511
和Milstein 1975和Nelson等人2000)。
针对确定抗原的单克隆抗体可以例如通过以下获得：
a)将从先前用确定抗原免疫化的动物的外周血获得的淋巴细胞用永生细胞并且优选用骨髓瘤细胞永生化，以便形成杂交瘤，
b)培养形成的永生化细胞(杂交瘤)并且回收产生具有所需特异性的抗体的细胞。
可替代地，不需要使用杂交瘤细胞。因此，单克隆抗体可以通过包括以下步骤的方法获得：
a)将从动物的淋巴细胞、尤其是外周血淋巴细胞(合适地，先前用确定抗原免疫化)获得的DNA或eDNA序列克隆到载体中，尤其是克隆到噬菌体并且更特别地丝状噬菌体中，
b)在允许产生抗体的条件下用以上载体转化原核细胞，
c)通过将抗体经受抗原-亲和力选择来选择抗体，
d)回收具有所需特异性的抗体。
用于对骆驼进行免疫化、克隆在血液中循环的B细胞的VHH谱(Chomezynnski和Sacchi 1987)并且使用噬菌体、酵母或核糖体展示从免疫(Arbabi-Ghahroudi等人1997)和非免疫(Tanha等人2002)文库分离抗原特异性VHH的方法是已知的(WO92/01047，Nguyen等人2001和Harmsen等人2007)。
可以分离抗体的抗原结合片段诸如scFv和Fv片段并在大肠杆菌中表达(Miethe等人2013，Skerra等人1988和Ward等人1989)。
可以对编码多肽的DNA或cDNA进行突变，所述突变对于多肽的氨基酸序列是沉默的，但是对特定宿主的翻译提供优选密码子。用于核酸在例如大肠杆菌和酿酒酵母中的翻译的优选密码子是已知的。
多肽的突变可以例如通过对编码多肽的核酸进行取代、添加或缺失来实现。对编码多肽的核酸进行的取代、添加或缺失可以通过许多方法来引入，包括例如易错PCR、改组、寡核苷酸定向诱变、组装PCR、PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、循环总体诱变、指数整体诱变、位点特异性诱变(Ling等人1997)、基因重组装、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接重组装(SLR)或这些方法的组合。对核酸进行的修改、添加或缺失也可以通过包括以下的方法引入：重组、循环序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含有尿嘧啶的模板诱变、缺口二重诱变(gapped duplex mutagenesis)、点错配修复诱变(point mismatch repairmutagenesis)、修复-缺陷型宿主菌株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制-选择诱变、限制-纯化诱变、整体诱变、嵌合核酸多聚体产生或其组合。
具体地，可以使用人工基因合成(Nambiar等人1984，Sakamar和Khorana 1988，Wells等人1985和Grundstrom等人1985)。编码本发明的多肽的基因可以通过例如固相DNA合成来合成产生。整个基因可以从头合成而不需要前体模板DNA。为了获得所需的寡核苷酸，将构建嵌段按产物序列所需的顺序依次偶联至生长寡核苷酸链。在完成链组装后，将产物从固相释放至溶液，脱保护并收集。产物可以通过高效液相色谱法(HPLC)分离以获得所需的高纯度寡核苷酸(Verma和Eckstein 1998)
免疫球蛋白链可变结构域诸如VH和VHH的表达可以使用合适的表达载体诸如原核细胞诸如细菌，例如大肠杆菌来实现(例如根据WO94/04678中公开的方案，所述文献以引用的方式并入本文并且在下文进一步详细描述)。免疫球蛋白链可变结构域诸如VH和VHH的表达也可以使用真核细胞例如昆虫细胞、CHO细胞、Vero细胞或合适地酵母细胞，诸如属于曲霉属、酵母属、克鲁维酵母属、汉森酵母属或毕赤酵母属的酵母来实现。合适地，使用酿酒酵母(例如，根据WO94/025591中公开的方案，所述文献以引用的方式并入本文并且在下文进一步详细描述)。
具体地，VHH可以根据WO94/04678中公开的方法使用大肠杆菌，通过包括以下步骤的方法来制备：
a)在Bluescript载体(Agilent Technologies)中克隆编码VHH的DNA或cDNA序列(例如从骆驼的淋巴细胞获得或合成地产生)，任选地包含His-标签，
b)在扩增之后使用对于VHH具有特异性的含有XhoI位点的5’引物和含有SpeI位点的具有以下序列的3’引物回收克隆的片段，
TC TTA ACT AGT GAG GAG ACG GTG ACC TG(SEQ ID NO：81)，
c)在用XhoI和SpeI限制性酶消化载体之后在Immuno PBS载体中克隆在相中回收的片段(Huse等人1989)，
d)用步骤c的重组Immuno PBS载体通过转染转化宿主细胞，尤其是大肠杆菌，
e)例如通过亲和力纯化，诸如通过在使用蛋白质A、阳离子交换或镍-亲和力树脂(如果VHH包含His-标签)的柱上进行色谱法来回收VHH编码序列的表达产物。
可替代地，免疫球蛋白链可变结构域诸如VH和VHH可通过包括以下步骤的方法来获得：
a)获得编码VHH的具有确定的特异性抗原结合位点的DNA或cDNA序列，
b)使用含有起始密码子和Hindlll位点的5’引物和含有终止密码子的具有XhoI位点的3’引物扩增获得的DNA或cDNA，
c)将扩增的DNA或cDNA重组到质粒pMM984的Hindlll(位置2650)和XhoI(位置4067)位点中(Merchlinsky等人1983)，
d)用重组质粒转染容纳性细胞，尤其是NB-E细胞(Faisst等人1995)，e)回收获得的产物。
另外，免疫球蛋白链可变结构域诸如VHH或VH可以使用大肠杆菌或酿酒酵母根据Frenken等人2000和WO99/23221(以引用的方式整体并入本文)中公开的方法产生，如下所述：
在从免疫化美洲驼取血液样品并且经由Ficoll(中性的高度支化、高质量亲水性多糖，其在水溶液中快速溶解-Pharmacia)不连续梯度离心富集淋巴细胞群体、通过酸性硫氰酸胍萃取分离总RNA(Chomezynnski和Sacchi 1987)、和第一链cDNA合成(例如，使用cDNA试剂盒，诸如RPN 1266(Amersham))之后，使用在WO99/23221的第22页和23页上详细描述的特异性引物通过PCR扩增编码VHH和VH片段和短或长铰链区的一部分的DNA片段。在用PstI和HindIII或BstEII消化PCR片段之后，经由琼脂糖凝胶电泳纯化具有约300与450bp之间的长度的DNA片段，并且分别在大肠杆菌噬菌粒载体pUR4536或游离型酿酒酵母表达载体pUR4548中连接。pUR4536来源于pHEN(Hoogenboom等人1991)并且含有lacIq基因和独特限制性位点以允许美洲驼VHH和VH基因的克隆。pUR4548来源于pSY1(Harmsen等人1993)。经由PCR从此质粒去除leu2基因中的BstEII位点，并且替代SUC2信号序列与终止子之间的克隆位点以便有利于VH/VHH基因片段的克隆。VH/VHH在C末端处具有c-myc标签以用于检测。将各个大肠杆菌JM109菌落转移到含有增补有1％葡萄糖和100mg L-1氨苄西林的150ml 2TY培养基的96孔微量滴定板中。在过夜生长(37℃)之后，在含有100mg L-1氨苄西林和0.1mMIPTG的2TY培养基中重复板。在再次过夜温育并且任选地冷冻和解冻之后，将细胞离心并沉淀，并且可以在ELISA中使用上清液。将各个酿酒酵母菌落转移至含有选择性基本培养基(包含0.7％酵母氮基、2％葡萄糖，增补有必需氨基酸和碱)的测试管中，并且在30℃下生长48h。随后，将培养物在YPGal培养基(包含1％酵母提取物、2％细菌蛋白胨和5％半乳糖)中稀释十次。在生长24h和48h之后，将细胞沉淀并且可以在ELISA中分析培养上清液。任选地测量600nm处的吸光度(OD600)。
另外，可以使用如下程序使用酿酒酵母产生免疫球蛋白链可变结构域诸如VH/VHH：
分离编码VH/VHH的天然存在的DNA序列或获得编码VH/VHH的合成产生的DNA序列，包含5’-UTR、信号序列、终止密码子并且侧接SacI和HindIII位点(这种合成序列可以如上概述产生或者例如可以从商业供应商诸如Geneart(Life Technologies)订购)。
使用限制性位点将VH/VHH基因转移至多拷贝整合(MCI)载体pUR8569或pUR8542，如下所述。使用以下，用SacI和HindIII切割编码VHH的任选地包含在穿梭载体、盒或其他合成基因构建体和MCI载体内的DNA序列：25ul VHH DNA(Geneart质粒或MCI载体)、1ul SacI、1ul HindIII、3ul的用于双酶切反应的合适缓冲液诸如NEB缓冲液1(New EnglandBiolabs)，在37℃下进行过夜。用1xTAE缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上运行25ul的经消化的编码VHH的DNA和25ul的经消化的MCI载体，并且然后例如使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行凝胶提取。如下设定消化MCI载体和编码VH/VHH的消化DNA的连接：100ng载体，30ng VHH基因，1.5ul 10×连接酶缓冲液，1ul T4 DNA连接酶和ddH2O。然后在16℃下进行连接过夜。
接下来转化大肠杆菌细胞。对于化学感受态XL-1蓝色细胞，将200ul热感受态XL-1蓝色细胞解冻并且在冰上添加5ul连接混合物，持续约30分钟，接着在42℃下进行热休克，持续90秒。然后添加增补有2％葡萄糖的800ul Luria-Bertani低盐培养基，并且在37℃下恢复细胞，持续2小时。将细胞铺板在Luria-Bertani琼脂和氨苄西林(100ug/ml)板上并且在37℃下保持过夜。对于电感受态TG1大肠杆菌细胞，使用电穿孔杯。在电穿孔杯中：在冰上将50ul电感受态TGl细胞和1ul连接混合物解冻，持续约15分钟。将所述杯置于支撑物中并加脉冲。添加500ul的2TY培养基并且在37℃下恢复细胞，持续30分钟。将100ul细胞铺板在含有氨苄西林(100ug/ml)和2％葡萄糖的Luria-Bertani琼脂板上。将板在37℃下保持过夜。
如上详细描述将VH/VHH基因克隆到大肠杆菌中之后，可以用线性化的MCI载体转化酿酒酵母。在进行转化之前，进行一些步骤：(i)应通过消化将DNA从环状改变为线性的，否则DNA不能被整合到酵母基因组中，并且(ii)应通过乙醇沉淀将消化的DNA的杂质清除。另外，在转化过程期间，将酵母细胞制成半透性的，使得DNA可以穿过膜。
用于酵母转化进行的准备：对由表达VH/VHH基因的选择的大肠杆菌菌落制备的midi-prep进行HpaI消化，如下所述。制备含有20ng midi-prep、5ul HpaI、10ul适当缓冲液诸如NEB4缓冲液(BioLabs)和ddH2O的100ul溶液。
在室温下用HpaI切割DNA过夜。接下来进行乙醇沉淀(并且将来自HpaI消化的5ul样品置于一侧)。将300ul 100％乙醇添加到95ul HpaI消化的midiprep中，涡旋并在全速下旋转5分钟。当存在团粒时仔细倾析，添加100ul 70％乙醇，然后在全速下再次旋转5分钟。对样品再次进行倾析，并且保持在50-60℃下，直至团粒干燥。将团粒重悬浮在50ul ddH2O中。在5ul HpaI消化的样品旁边的凝胶上运行5ul。
酵母转化：制备YNBglu板。使用10g琼脂+425ml水(杀菌的)、25ml过滤20×YNB(3.35g YNB(酵母氮基)，在25ml杀菌H2O中)和50ml杀菌20％葡萄糖并且倒入皮氏培养皿中。从母板选取一个酵母菌落并在30℃下在3ml YSD(酵母浸出粉胨葡萄糖)中生长过夜。在第二天制备约600ml YSD并且用275ml、225ml和100ml YSD填充3个烧瓶。将27.5ul酵母YSD培养物添加到第一烧瓶中并轻微混合。从第一烧瓶中取75ml并将其置于第二烧瓶中，轻微混合。从第二烧瓶中取100ml并置于第三烧瓶中，轻微混合。生长，直至达到1与2之间的OD660。将达到此OD的烧瓶分配在4个Falcon管中，每个中±45ml。在4200rpm下旋转2分钟。丢弃上清液。将在两个Falcon管中的团粒溶解在45ml H2O中(将管的数量从4个降低至2个)。在4200rpm下旋转2分钟。将团粒溶解在45ml H2O中(从2个管至1个管)。在4200rpm下旋转2分钟。将团粒轻微溶解在5ml醋酸锂(LiAc)(100mM)中，并且旋转几秒。仔细丢弃一些LiAc，但是保留管中一半以上的LiAc。对细胞进行涡旋，将载体DNA煮沸5分钟并在冰水中快速冷却。添加到含有以下的15ml管中：240ul PEG、50ul细胞、36uLiAc(1M)、25ul载体DNA、45ul乙醇沉淀的VH/VHH。在每个步骤之后轻微混合(对空白样品进行同样处理，只是没有乙醇沉淀的VH/VHH)。在30℃下温育30分钟，将管轻微倒置3-4次，然后在42℃下热休克20-25分钟。在6000rpm下旋转短暂的时间。轻微取出上清液并且添加250ul ddH2O并混合。将它们全部在YNBglu板上划线，直至板干燥，并且在30℃下生长4-5天。最后，通过以下来制备YNBglu板：将板分为6个等份，将各份编号为1至6，接种最大菌落并且划出1号。从大到小从1至6对其他菌落重复以上过程。在30℃下生长，持续3-4天，直至产生菌落。使用葡萄糖作为碳源来生长VH/VHH菌落，并且通过添加0.5％半乳糖打开半乳糖-7-启动子来进行VH/VHH诱导。进行3mL小规模培养以测试菌落，并且选择示出VH或VHH的最佳表达的菌落。然后在纯化中使用此菌落。
纯化：通过用强阴离子树脂(诸如Capto S)进行阳离子交换色谱法来纯化VH/VHH。在第1天，在5ml YSD培养基(YS培养基+2％葡萄糖)中接种表达VH/VHH的选择的酵母菌落，并且在30℃下在25mL密封杀菌管中生长细胞(在180rpm下振荡)。在第2天，在50mL新鲜制备的YS培养基+2％葡萄糖+0.5％半乳糖中稀释5ml过夜培养物，在30℃下在250ml充气的带挡板烧瓶中生长细胞，持续两个晚上(在180rpm下振荡)。在第4天，在离心机中在4200rpm下旋转沉降细胞，持续20min。使用强阴离子树脂进行阳离子交换色谱法：将含有配体的上清液的pH调节至3.5。用50mL ddH2O洗涤0.75ml树脂(+/-0.5mL浆液)/50mL上清液，接着用结合缓冲液洗涤三次。将洗涤的树脂添加到上清液中并且在4℃下在振荡器上温育悬浮液1.5小时。通过在500g下离心2分钟将树脂结合的VH/VHH沉淀并且用洗涤缓冲液对其洗涤。倾析上清液并且用10mL结合缓冲液重悬浮树脂。将滤液置于PD-10柱中，将树脂倒入柱中并且使树脂沉淀一会，然后将滤液添加在树脂上。等到所有的结合缓冲液运行通过。用6x0.5ml洗脱缓冲液洗脱VH/VHH。在eppendorf管中收集洗脱级分。用Nanodrop测量6个洗脱级分的蛋白质浓度。汇集含有VHH的级分并且将溶液转移到3,500Da截留透析膜中。在4℃下用3L PBS透析纯化的蛋白质溶液过夜。在第5天，在4℃下用2L新鲜PBS透析纯化的蛋白质溶液，再持续2小时。最后，通过BCA计算最终浓度。
虽然在VH/VHH的情况下进行讨论，但是以上所述的技术也可以用于scFv、Fab、Fv和其他抗体片段(如果需要的话)。
多个抗原结合片段(合适地VH/VHH)可以通过使氨基酸残基与有机衍生剂反应进行化学交联来融合，诸如由Blattler等人1985所述。可替代地，抗原结合片段可以在DNA水平下在基因上融合，即所形成的多核苷酸构建体，其编码包含一个或多个抗原结合片段的完整多肽构建体。经由基因途径使多个抗原结合片段接合的一种方式是直接或经由肽接头使抗原结合片段编码序列连接。例如，第一抗原结合片段的羧基末端可以连接至下一个抗原结合片段的氨基末端。此连接模式可以延伸，以便连接抗原结合片段以用于构建三、四等功能构建体。用于产生多价(诸如二价)VHH多肽构建体的方法在WO 96/34103(以引用的方式整体并入本文)中公开。
合适地，根据WO02/48382中公开的方法，本发明的多肽(具体地，本发明的VHH)可以在真菌，诸如酵母(例如，酿酒酵母)中产生，其包括在包含碳源的培养基上生长真菌，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇。在酿酒酵母中大规模生产VHH片段在Thomassen等人2002中描述。
在本发明的一个方面，提供了一种用于制备本发明的多肽或构建体的方法，其包括以下步骤：
i)将本发明的多核苷酸克隆到载体，诸如质粒中，
ii)在允许产生多肽或构建体的条件下用所述载体转化能够产生本发明的多肽或构建体的细胞，诸如细菌细胞或酵母细胞，
iii)诸如通过亲和力色谱法回收所述多肽或构建体。
列出本发明的另外的实施方案的条款如下：
条款
1.一种多肽，其能够抑制IL-7和/或L-TSLP与IL-7R的结合。
2.根据条款1所述的多肽，其中所述多肽能够抑制IL-7与IL-7R的结合。
3.根据条款1所述的多肽，其中所述多肽能够抑制L-TSLP与IL-7R的结合。
4.根据条款1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽能够抑制IL-7与IL-7R的结合以及L-TSLP与IL-7R的结合。
5.根据条款1至4中任一项所述的多肽，其中所述多肽结合至IL-7Rα。
6.根据条款1至5中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含三个互补决定区(CDR1-CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)，其中CDR1包含与SEQ ID NO：1共享60％或更大序列同一性的序列，CDR2包含与SEQ ID NO：2共享60％或更大序列同一性的序列，并且CDR3包含与SEQID NO：3共享60％或更大序列同一性的序列。
7.根据条款6所述的多肽，其中CDR1包含与SEQ ID NO：1共享80％或更大序列同一性的序列，CDR2包含与SEQ ID NO：2共享80％或更大序列同一性的序列，并且CDR3包含与SEQ ID NO：3共享80％或更大序列同一性的序列。
8.根据条款7所述的多肽，其中CDR1包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：71；CDR2包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76，并且CDR3包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：78。
9.根据条款8所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO：8。
10根据条款1至9中任一项所述的多肽，其中所述多肽是抗体或抗体片段。
11.根据条款1至10中任一项所述的多肽，其中所述多肽以2nM或更小的EC50中和IL-7R与IL-7的结合。
12.根据条款1至11中任一项所述的多肽，其中所述多肽基本上耐受人肠道的蛋白酶。
13.根据条款1至12中任一项所述的多肽，其用作药剂。
14.根据条款13所述的多肽，其用于治疗自身免疫疾病和/或炎性疾病。
15.根据条款13或14所述的用于使用的多肽，其中所述多肽用于口服施用。
现在将通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
实施例1：免疫化和噬菌体文库构建
用可溶性人重组IL-7Rα对两只美洲驼各自免疫化。在免疫化期间在不同时间点处从两只美洲驼采集血液，并且测试IL-7Rα结合和中和以监测针对IL-7Rα的免疫应答的发展。分析显示仅一只美洲驼发展良好的抗IL-7Rα抗体滴度，而另一只美洲驼不能对IL-7Rα免疫化产生应答。在免疫化结束时从应答性美洲驼采集的白细胞分离的RNA用于生成十二个单独的噬菌体展示文库。
实施例2：具有人IL-7Rα结合活性的文库选择
开发文库选择策略以分离结合至IL-7Rα亚基的细胞外结构域上存在的表位的ICVD，包括干扰IL-7与IL-7R的结合的ICVD。使用若干方法来选择性富集展示具有IL-7Rα结合特征和其他所需特性，包括高结合亲和力和对于肠蛋白酶的耐受性的ICVD的噬菌体。使用来自不同文库选择的洗脱液中存在的噬菌体感染大肠杆菌，并且挑选各个菌落到母板中并繁殖以生成菌落培养物。使用含有所选择的单克隆ICVD的周质上清液用于初级评估研究以鉴定具有所需特征的那些。
从挑选到筛选的8个原始母板中的总共630个文库选择菌落中，选择7个原代克隆的最终组用于在大肠杆菌中生产，并且对ICVD进行亲和力纯化以用于更详细的评估研究。
将以上分离的7个原代克隆(V7R-2E5、V7R-2E9、V7R-2F6、V7R-6C12、V7R-2B6、V7R-3B5和V7R-4F6)的DNA序列重克隆到载体pMEK222中(由此引入C末端FLAG和6xHis标签)以用于在大肠杆菌中生产，接着进行亲和力纯化以用于更详细的评估研究。不包括FLAG和His标签的这些ICVD的多肽序列在以上标题为“多肽和多核苷酸序列”的部分中提供的比对中示出。产生临床抗IL-7R抗体mAb829(含有重链和轻链的150kDa抗体，还被称为“GSK2618960”，如Ellis等人2019中公开)并且用作多个以下实施例中的对比物。
以下实施例的关键目的是鉴定具有抑制IL-7与IL-7R的结合的能力并且对于通过小肠蛋白酶进行的失活具有一定程度的固有耐受性的那些ICVD克隆。
实施例3：原代克隆的功效和蛋白酶耐受性
功效
使用IL-7/IL-7R中和ELISA评估7个原代克隆的功效。
将原代克隆从噬菌粒亚克隆到pMEK222质粒中，以用于添加C末端FLAG-6xHis标签并在大肠杆菌中表达。由大肠杆菌TG1表达这些ICVD并经由6xHis标签纯化。
在300nM下开始并且使用3.2稀释因子，在1％BSA(在2x测定浓度下)中制备7点稀释系列的克隆。在ELISA中使用mAb829对比物抗体作为阳性对照，浓度范围在10nM与0.088nM(2x测定浓度)之间。针对每个克隆稀释液制备足够一式三份的体积，同时针对mAb829制备足够2个一式三份(2个板)的体积。将85μL(或170μl)的每个ICVD(或mAb829)稀释液与85μL(或170μL)的10ng/mL IL-7(2x测定浓度)混合。将85μL的IL-7与85μL的封闭缓冲液混合，以在每个板中具有IL-7(1x)完全结合信号。还将单独的封闭缓冲液添加到每个板中作为空白。然后使用生物素化抗hIL-7，接着用外抗生物素蛋白-HRP测量结合的IL-7。在30分钟之后停止TMB反应。
使用ELISA信号空白校正的A450数据和′log(抑制剂)相对于应答--可变斜率(四个参数)’拟合曲线并生成EC50来在Graphpad prism中生成EC50值。这些值在以下表1中示出。显示所有的ICVD在抑制hIL-7与hIL-7R的结合方面与对比物mAb829是一样有效的，并且它们中的大部分比mAb829稍微更强效。
蛋白酶耐受性
在小鼠小肠上清液(“小鼠SI”)和由汇集的人粪便样品(“HFP”)制备的上清液的存在下温育七个纯化的ICVD。
在含有1％BSA的1x PBS(30L最终体积)中以250g/mL制备所有ICVD的储备稀释液。然后在PCR条带中针对每个ICVD制备消化混合反应物，最终体积为60L，ICVD的最终浓度为20g/mL(55.2L的消化基质+4.8L的ICVD，250g/mL)。对于非ICVD对照使用4.8L的1x PBS。随后将25L的每个消化反应物转移到(i)含有冷停止缓冲液的新PCR管中(这些用作T＝0时间点)并在-80℃下冷冻；和(ii)新的空PCR管中并在37℃下在用于消化的PCR热循环仪中温育(消化的和非ICVD的对照样品)。在2h之后从热循环仪中取出在小鼠SI中消化的样品，而在4h之后取出在HFP中消化的样品。立即用25L的冷停止缓冲液停止样品并在-80℃下冷冻，直至分析。
使用1.8(针对消化样品)或2.1(针对未消化的样品)稀释因子，用随后的6个系列稀释液，在1∶100的最终起始稀释度下，在以上‘功效’中详细描述的ELISA中测试消化的样品，并且在每个板中的一式三份孔中测定。将未消化的样品(0h)视为标准曲线，因为理论上在这些样品中没有发生蛋白酶消化(因为它们在冰上处理，并且立即添加停止缓冲液，接着添加消化基质)。
如果在‘消化的’样品中发生了消化，则预期曲线将向左偏移(与T＝0h相比)。偏移越大，ICVD越不稳定。“存活％”表示消化之后保留的活性的水平。
所有的克隆对于在两种基质中的蛋白水解降解显示高水平的耐受性，并且V7R-2E9被鉴定为蛋白酶最耐受的ICVD，显示对于人粪便汇集消化持续高达4小时的完全耐受性。
这些结果在以下表1中总结。
表1
Figure BDA0003513679060000631
NT＝未测试
SI＝小肠上清液
本发明的这些多肽在消化基质中全部显示意外高的功效和存活率。可以注意到，虽然这些ICVD是明显相关的，但是这些多肽的CDR和框架彼此相差多个残基(参见以上“多肽和多核苷酸序列”中提供的比对)。
实施例4：对V7R-2E9和对比物mAb829进行的另外的功效测定
IL-7/IL-7R中和ELISA
再次对V7R-2E9和临床抗IL-7R对比物抗体mAb829进行在以上实施例3中描述的IL-7/IL-7R中和ELISA。结果在以下表2中示出。
TSLP/TSLPR/IL-7R ELISA
测试了V7R-2E9中和L-TSLP/TSLP-R复合物与IL-7Rα的结合的能力。将96孔板用0.25μg/mL重组人IL-7Rα-His6-Fc+5μg/mL BSA涂覆并且然后封闭。将V7R-2E9连续稀释并且与重组人L-TSLP(15ng/mL最终浓度)和人TSLP-R(20ng/mL最终浓度)1∶1∶1混合。然后将混合物温育30分钟以允许结合，之后添加到IL-7Rα涂覆的板上。在2小时温育后，用50μL/孔0.3μg/mL生物素化兔抗hTSLP抗体，并且然后用50μL/孔1/2000外抗生物素蛋白-HRP检测结合的L-TSLP，并且使用GraphPad Prism确定通过ICVD对L-TSLP/TSLP-R复合物与IL-7Rα的结合进行的中和的水平。结果在以下表2中示出。
hPBMC中IL-7诱导的pSTAT5
在人淋巴细胞中体外测试V7R-2E9抑制IL-7与IL-7Rα的结合并阻止STAT5磷酸化的能力。人外周血单核细胞(PBMC)通过IL-7R信号传导刺激细胞内STAT5磷酸化来对外源性IL-7产生应答，但是此应答可以通过阻止IL-7/IL-7R结合的IL-7Rα特异性ICVD来消除。
从人白膜层分离淋巴细胞富集群体并且储存在液氮中的90％FBS10％DMSO中。将细胞解冻并在完全RPMI-1640中静置以用于恢复。在恢复之后，将细胞以100μl 2.5x105个细胞/孔铺板在圆底96孔板中，并且在没有FBS的完全RPMI中饥饿1h。在饥饿之后，将所需的ICVD浓缩物添加到每个孔(50μL/孔)中，并且将板在室温下温育15min。然后将50μL/孔的IL-7添加到每个孔中，并且将板在37℃ 5％CO2下温育15min。通过将板在冰上快速冷却来停止反应，接着离心并取出上清液。然后对细胞进行处理以用于固定、透化和pSTAT5细胞内染色。将细胞在冰上用100μL/孔Cytofix/Cytoperm溶液(BD Bioscience#554722)温育20min，用150μl/孔1x Perm/洗涤缓冲液(BD Bioscience#554723)洗涤两次，在冰上用200μL/孔Perm缓冲液III(BD Bioscience#558050)温育30min并且用150μL/孔1x PBS 2％BSA(FACS缓冲液)洗涤两次。随后将细胞在室温下用25μL/孔pSTAT5抗体([47/Stat5(pY694)](A488)(BD Bioscience#612598))或同种型对照小鼠IgG1([B11/6](FITC)(Abcam#ab91356))染色1h。通过添加150μL/孔的FACS缓冲液来停止反应。在1次洗涤/离心步骤之后，将细胞最终重悬浮在200μL/孔的FACS缓冲液中，并且在CytoFlex流式细胞仪(BeckmanCoulter)中获取数据。使用FlowJo软件进行数据分析。结果在以下表2中示出。
人单核细胞中TSLP诱导的TARC分泌
还在详细描述的人单核细胞细胞测定中测试了V7R-2E9以确认IL-7R中和活性。由于TSLP/TSLP-R与细胞表面IL-7R接合，在用TSLP刺激后，人单核细胞在培养基中表现出TARC分泌应答。在人单核细胞中体外测试抗IL-7Rα ICVD抑制TSLP/TSLP-R与IL-7R的结合并阻止TARC分泌的能力。
从人白膜层分离单核细胞，并且以100μl/含有1x105个细胞的孔铺板在平底96孔板中的完全RPMI中。为了增加单核细胞纯度，将铺板的细胞在37℃ 5％CO2下静置2h，并且然后通过抽吸每个孔中的培养基，接着用温热cRPMI轻微2x洗涤来取出非粘附细胞。在TSLP存在下在37℃ 5％CO2下将细胞与所需浓度的ICVD温育24h(在完全RPMI中稀释，最终体积为100μL/孔)。在24h温育之后，采集75μL上清液/孔并在-80℃下储存，以用于进一步分析分泌的TARC。
测试通过抗IL-7Rα剂对人TSLP进行的中和水平。将96孔板用50μL/孔抗TARC抗体涂覆并且然后封闭。将人TARC标准物在测定稀释剂中连续稀释，并且然后将50μL/孔的标准物与50μL/孔的回收培养上清液一起添加到抗TARC涂覆板上。用生物素化抗人TARC多克隆抗体，并且然后用抗生物素蛋白-HRP检测结合的人TARC。确定通过所述剂对人TSLP进行的中和水平。结果在以下表2中示出。
表2
Figure BDA0003513679060000661
总之，V7R-2E9在ELISA和细胞测定两者中显示以与对比物临床抗IL-7R抗体mAb829类似的功效抑制IL-7和L-TSLP与IL-7R的结合。
实施例5：表位建模
计算机建立V7R-2E9的模型结构和表位。使用蛋白质数据库(PDB)‘4ybq’文件作为母板来开发此模型。4ybq是结合至大鼠GLUT5易化葡萄糖转运体成员5的FV的重链。在CDR3环长度和预期构象方面，4ybq模板与V7R-2E9特别类似。PDB条目‘3di3’是结合至IL-7Rα的IL-7的高分辨率结构。从此结构简单地缺失IL-7以提供用于与预测的V7R-2E9结构对接的靶受体。
因为所采用的HEX 8.0对接方法在每个结构域的表面上以局部化方式工作，所以在IL-7Rα结构上选择多个靶区域并且并联运行。V7R-2E9的最佳溶液代表46个溶液的集群，它在能量最小化之后具有-894的非常高的能量得分(DARS力场)并且没有‘隆起’(不允许接近的原子位置)。图3示出了在IL-7Rα靶上对接的V7R-2E9位置的带状示意图。V7R-2E9定位在N末端结构域与C末端结构域之间的界面处。
表3列出了IL-7Rα的接触V7R-2E9的表位残基。覆盖界面处的特别显著的区域的残基以粗体突出显示(参考SEQ ID NO：65)。
表3
Figure BDA0003513679060000662
Figure BDA0003513679060000671
实施例6：优化以降低免疫原性
将V7R-2E9的氨基酸序列与人VH3胚系抗体序列对齐，并且鉴定潜在的人源化变化。将框架2末端处/CDR2开头处的18个单一突变和2个变化组合的集合引入到V7R-2E9母体ICVD序列中，并且从大肠杆菌产生突变体。在IL-7/IL-7R中和ELISA中初始测试ICVD的功效。克隆展示与V7R-2E9类似或比其更大的IL-7R中和活性，从而指示引入到母体ICVD中的突变对于抗原结合均不具有有害作用。然后将所有的克隆在人粪便上清液材料中消化16小时以测量其相对存活率。(表4)。
表4
Figure BDA0003513679060000672
Figure BDA0003513679060000681
然后将在IL-7/IL-7Rα-His6-Fc ELISA中保留高功效并且维持对人粪便汇集物的类似耐受性的突变组合以产生19个人源化ICVD(表5)。
表5
Figure BDA0003513679060000682
Figure BDA0003513679060000691
在这19个人源化ICVD中，表6总结了维持功效和对于人粪便和小鼠小肠蛋白酶两者的耐受性的最有利的人源化ICVD。
表6
Figure BDA0003513679060000692
Figure BDA0003513679060000701
特别值得注意的ICVD是ID-A62U，其包含E1D(用于酵母表达，以避免生成具有环化N-末端谷氨酸盐的产物的可能性)和人源化突变R45L、Q65K、K87R和S88A。另一个特别值得注意的ICVD是ID-A59U，其包含E1D、Q65K、K87R和S88A。ID-A59U具有5.1的pI和12.966kDa的分子量(pI和分子量使用CLC Sequence Viewer计算)。
实施例7：对人源化V7R-2E9变体进行的功效测定
在人PBMC中在IL-7/IL-7R中和ELISA和IL-7诱导的STAT5磷酸化测定中体外确认ID-A40U(在大肠杆菌中产生)的抑制功效和有效性(最大抑制)。使用ELISA信号空白校正的A450数据和′log(抑制剂)相对于应答--可变斜率(四个参数)’拟合曲线并生成EC50来在Graphpad prism中生成EC50值。
结果以及对比物在以表7a中示出。
表7a
Figure BDA0003513679060000702
在单独实验中，对ID-A62U(在酿酒酵母中产生)以及对比物进行这些相同测定。结果在表7b和图4中示出。
表7b
Figure BDA0003513679060000703
Figure BDA0003513679060000711
与以上实施例4中描述的方式测试ID-A62U以及mAb829中和L-TSLP/TSLP-R复合物与IL-7Rα的结合的能力。结果在以下表7c中示出。对数据组进行扣除，之后进行绘图，这归一化至测试抗体的最高浓度(以克服板上高水平的背景)。
表7c
Figure BDA0003513679060000712
总之，证明了ID-A62U和ID-A40U具有与对比物临床抗IL-7R抗体mAb829相当或更大的功效。
实施例8：ICVD-IL-7R结合亲和力的Biacore估计
在Biacore研究中将ID-A40U的结合动力学与mAb829临床抗体进行比较。将IL-7Rα-His6-Fc直接涂覆在Biacore传感器板(用于mAb829分析)上或通过抗人IgG Fc(用于ICVD分析)捕获，并且将ICVD/Ab流过板以检测结合。ID-A40U具有7.8x10-11M的亲和力(KD)，并且mAb829具有5.67x10-10M的稍微更低的亲和力(KD)。结果指示ID-A40U显示与抗原的强烈结合。
实施例9：与来自毒理学物种的IL-7Rα的交叉反应性
研究ID-A40U、ID-A59U和ID-A62U与来自毒理学物种的IL-7Rα的交叉反应性。
将96孔板用0.5μg/mL重组人IL-7Rα His6-Fc+5μg/mL BSA涂覆并且然后封闭。将0.5nM的ICVD与在1％BSA中连续稀释的选择的测试化合物1∶1混合，然后温育30分钟以允许结合，之后添加到IL-7Rα涂覆板上。在2小时温育后，用50uL/孔1/20000抗FLAG-HRP山羊抗体(GeneTex，GTX21238)检测结合的ICVD，并且确定测试化合物对ICVD-IL-7Rα结合进行的中和水平。
在此测定中发现鼠IL-7Rα不干扰ICVD/IL-7Rα结合，从而指示小鼠或大鼠不是毒理学研究的合适物种。然而，食蟹猴IL-7Rα干扰这些ICVD与人IL-7Rα的结合(图5和图6)，从而使食蟹猴成为这些ICVD和相关ICVD的合适毒理学物种。
实施例10：针对非靶细胞因子的特异性
基本上以以上实施例9中描述的方式测试ID-A40U针对与人IL-7Rα相关的蛋白质的选择性。发现人IL-12Rβ1和人IL-12Rβ2是与使用NCBI BLASTp工具鉴定的IL-7Rα最紧密相关的人蛋白质，与IL-7Rα分别具有29％和30％的序列同一性。在竞争IL-7R结合ELISA测定中，测试hIL-12Rβ1和IL-7R家族内选择的受体(IL-2R、IL-21R和IL-9R)或非相关受体(TNFR-2和IL-6R)的抑制ID-A40U与板上固定的人IL-7Rα的结合的能力。人IL-12Rβ1、IL-2R、IL-21R、IL-9R、TNFR-2或IL-6R均不干扰ID-A40U与IL-7Rα的结合，而添加增加量的人IL-7Rα产生剂量依赖性曲线(图7)。这指示ID-A40U ICVD与脱靶分子的结合在人中非常不可能。
实施例11：对于胃肠道提取物的耐受性
肠上清液中的离体温育可以预测ICVD在食蟹猴和人的肠道中的稳定性。主要小肠蛋白酶胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性在哺乳动物物种中是保守的，而大肠中存在的蛋白酶可能通过宿主物种特异性肠道微生物菌群产生。为了生成反映这两种环境的测试基质，制备汇集的小鼠小肠上清液和汇集的粪便上清液。这两种基质对于非选择的非工程化ICVD是高度消化性的。
先前已经显示ICVD ID-38F在这些基质中具有高稳定性(参见WO2016/156465)，并且此特性预测ID-38F在运输通过肠道期间具有高稳定性。
测试V7R-2E9、ID-A24U和ID-A40U在来自鼠和人来源两者的胃肠道提取物中的存活率。将ICVD在37℃下用小鼠小肠上清液温育6小时，并且用人粪便上清液温育16小时。通过IL-7/IL-7R中和ELISA测量存活率。所有构建体在所测试的所有消化性基质中均显示良好的存活率(图8，其中“SI”＝小鼠小肠液，并且“HF”＝人粪便上清液)。ID-A40U含有与酵母产生的ID-A59U相同的功能突变。
在单独实验中，测试ID-A62U以及ID-A41U(不稳定的对比物ICVD)在相同人粪便上清液测定中的存活率。与ID-A41U的大约40％存活率相比，ID-A62U展示大约100％存活率(图9)。
这些是涉及延长温育时间段的严格测试。因此，预期这些ICVD中的任一个在胃肠道环境中存活非常良好。
实施例12：对于胃肠道基质金属蛋白酶的耐受性
活化基质金属蛋白酶(MMP)的水平在患有肠道疾病的患者的发炎粘膜中增加。这些MMP能够消化天然人IgG和含有人IgG支架的治疗剂(Biancheri等人2015)。在抗TNFα疗法依那西普的情况下，此消化导致TNFα中和功效显著降低。为了确认ID-A40U耐受MMP，通过在人MMP3、MMP12或TCNB缓冲液的存在下在37℃下温育22小时后进行蛋白免疫印迹检测ID-A40U以及mAb829和恩利(Enbrel)。通过对γ链具有特异性的过氧化物酶缀合的抗人IgG检测恩利和mAb829。用pAb1219初级兔α-ICVD和次级HRP缀合的pAb SwineαRabbit检测ID-A40U和仅TCNB缓冲液对照。
在温育后，ID-A40U未被MMP消化，如通过蛋白免疫印迹测量(图10)，从而显示具有对应于预期全长ICVD的分子量的带(缺乏Flag-His6标签，其在消化期间被切除)。然而，在相同的温育时间之后，MMP3和MMP12将全长依那西普和mAb829消化至更小的片段。在MMP温育后，显示ID-A40U在中和IL-7R方面是完全强效的，如使用IL7/IL-7R功能性ELISA测量。图10中的‘F/H’代表FLAG/His标签的存在。
实施例13：在小鼠胃肠道中的运输和存活
以上所述的体外研究的结果显示优化的V7R-2E9衍生物耐受通过由小鼠小肠内容物制备的上清液提取物中存在的蛋白酶导致的失活。进行随后的研究以研究ID-A24U和ID-A40U在穿过小鼠的胃肠道系统期间的稳定性。
在牛奶和碳酸氢盐混合物中与ID-38F(抗TNFα ICVD，参见WO2016/156465)配制ID-A24U和ID-A40U两者，以防止在低pH下的变性和胃中通过胃蛋白酶进行的消化。在通过口服管饲将ICVD施用至小鼠后，在给药后6小时处确定胃、小肠、盲肠和结肠中的ICVD的浓度。另外，测量以每小时一次的间隔采集的粪便团粒的ICVD浓度。
在给药后4h与6h之间从所有小鼠采集的粪便中测量ID-A24U和ID-A40U，其中还从2只小鼠在3h时间点中测量ID-A40U(图11)。相反，在第一个3小时期间在从小鼠6(M6)采集的粪便中测量ID-A24U，其指示与其他小鼠相比，运输在此小鼠中是特别快的。
这些结果表明ID-A24U和ID-A40U两者在运输通过小鼠GI道之后均存活。总之，ID-A24U和ID-A40U的运输时间看起来很类似，每个组内的1只小鼠(M6和M12)是例外。在宰杀时间处(6h)，ID-A24U和ID-A40U在所有小鼠的盲肠(CAE)和结肠(COL)中存在，在胃(STO)和小肠(SI)中仍测量到相当高的量。基于将用于浆液制备的稀释因子考虑在内计算的浓度，宰杀时间处ID-A24U和ID-A40U的预期浓度在粪便中分别在22.7μM-140μM之间和12μM-22.5μM之间(图11)。ID-A24U在盲肠和结肠中的预期浓度分别在2.9μM-8μM之间和9.7μM-16.5μM之间。ID-A40U在盲肠和结肠中的预期浓度分别在0.9μM-1.2μM之间和0.8μM-6.2μM之间(图12)。
在此研究中用作对照的ID-38F在所有的粪便和下GIT样品中以高水平测量到，如先前观察的。6h时间点处的ID-38F的预期浓度在6只小鼠中变化，在盲肠中在0.04μM-2.1μM之间，在结肠中在0.33μM-5.1μM之间并且在粪便中在4.9μM-48μM之间。对ID-A40U和ID-38F进行重复实验。获得类似的结果(图13和图14)。
总之，这些结果指示ID-A24U和ID-A40U在运输通过小鼠时良好地且与ID-38F类似地存活，从而将高浓度的活性ICVD递送至盲肠和结肠。这可能反映先前在体外观察到的每个ICVD在这些肠道区室中的相对稳定性。显示ID-A24U和ID-A40U在小鼠小肠中是稳定的。因此预期这些和相关的ICVD将在人GI道中具有高稳定性。
实施例14：人IBD组织研究
进行研究以研究V7R-2E9在重现炎性肠病组织环境的人离体模型中的活性。使用取自患有活性溃疡性结肠炎的四名患者的组织，在离体培养物中测试V7R-2E9和对照(ID-2A，抗艰难梭菌毒素ICVD；mAb829和IgG1k(非IL-7R结合纯化的IgG1k同种型对照重组抗体)对于组织磷蛋白水平和炎性细胞因子的产生的影响。
Pathscan磷蛋白阵列(图15-18)上的组织裂解液的分析显示，与对应的ID-2A处理的活检组织相比时，在来自四名UC患者中的三名的活检组织中，V7R-2E9治疗抑制阵列上检测的39个蛋白质的相当大部分的磷酸化。mAb829还抑制来自相同的三名UC患者的活检组织中的蛋白质磷酸化水平，并且所获得的抑制模式似乎与用V7R-2E9实现的那些类似。由阵列上的全部39个磷蛋白的强度计算每个活检组织的总磷酸化强度值。图19中呈现的结果显示V7R-2E9和mAb829抑制来自三名应答性UC患者的活检组织中的总磷酸化水平，但是对于来自患者UC2700的活检组织中的总磷酸化具有很少或没有影响。此患者在接受硫唑嘌呤(T细胞抑制剂)作为其药剂的一部分时具有活动性疾病，所以对于T细胞定向疗法的耐受性是缺乏对于靶向IL-7R介导的T细胞活化的抗体(V7R-2E9和mAb829)的应答的可能解释。
对来自患者UC2698、UC2701和UC2703活检组织的培养基的分析显示V7R-2E9治疗还抑制若干细胞因子(包括IL-1β、IL-6、IL-8和TNFα)的产生，但是对于抗炎细胞因子IL-10的产生没有影响(数据未示出)。与磷蛋白分析的结果一致，V7R-2E9不抑制患者UC2700的活检培养物中促炎细胞因子的产生。
总之，V7R-2E9对UC活检组织中的IL-7R的拮抗抑制信号传导蛋白的磷酸化以及与促炎和免疫调节途径相关联的细胞因子和趋化因子的产生。结果显示V7R-2E9(和mAb829)对粘膜IL-7R+ve T细胞的拮抗可以抑制与疾病环境紧密相关的模型中的炎性过程。
实施例15：发酵培养中的酵母生产力
将表达ID-A59U的酿酒酵母接种到5升乙醇进料的发酵物中。通过SDS-PAGE和IL-7/IL-7Rα-His6-Fc功能性ELISA分析发酵结束(EoF)液体培养基上清液的ID-A59U浓度。SDS-PAGE指示≤2g/L的高产率，并且功能性ELISA确认ID-A59U在EoF中是完全活性的并且最终产率至少为1.5g/L。将表达ID-A62U的酿酒酵母接种到50mL振荡烧瓶表达系统中。获得高产率的ICVD。
来自以上实施例的结论
鉴定了在测量IL-7Rα活性的中和的细胞测定系统中受益于高功效的多肽，包括抑制IL-7和/或L-TSLP与IL-7Rα的结合。这些多肽还在一些情况下受益于在小肠和/或人粪便上清液中的高稳定性。生产了一种特定多肽V7R-2E9的人源化衍生物，与未修饰的V7R-2E9相比，其基本上保留功效或受益于增加的功效-同时还保留对于肠蛋白酶的耐受性和在酿酒酵母中有效生产的能力。对于V7R-2E9的突变(R45L、Q65K、K87R、S88A)(包括E1D酵母生产突变)的最有利的组合通过ID-A62U体现。
其他方面
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序列表
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<120> 多肽
<130> VHS-P2585PCT
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<170> PatentIn版本3.5
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Arg Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Glu Asp Tyr Asp Thr Asp Val Trp Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 58
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 58
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ser Ser Ile Ser Thr Phe Ser Ser Asp
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Leu
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Gly Arg Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Glu Asp Tyr Asp Thr Asp Val Trp Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 59
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 59
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ser Ser Ile Ser Thr Phe Ser Ser Asp
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Leu
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Arg Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Glu Asp Tyr Asp Thr Asp Val Trp Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 60
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 60
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ser Ser Ile Ser Thr Phe Ser Ser Asp
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Leu
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Gly Arg Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Glu Asp Tyr Asp Thr Asp Val Trp Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 61
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 61
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ser Ser Ile Ser Thr Phe Ser Ser Asp
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Leu
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Arg Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Glu Asp Tyr Asp Thr Asp Val Trp Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 62
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 62
Met Phe Pro Phe Ala Leu Leu Tyr Val Leu Ser Val Ser Phe Arg Lys
1 5 10 15
Ile Phe Ile Leu Gln Leu Val Gly Leu Val Leu Thr Tyr Asp Phe Thr
20 25 30
Asn Cys Asp Phe Glu Lys Ile Lys Ala Ala Tyr Leu Ser Thr Ile Ser
35 40 45
Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr Lys Ser Thr Glu Phe Asn
50 55 60
Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu Thr Glu Ile Gln
65 70 75 80
Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala Ser Leu Ala Lys Glu
85 90 95
Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys Pro Gly
100 105 110
Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met Lys Lys Arg Arg
115 120 125
Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln Val Ser Gln Leu
130 135 140
Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu Lys Gln Gln
145 150 155
<210> 63
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 63
Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys Pro Gly
1 5 10 15
Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met Lys Lys Arg Arg
20 25 30
Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln Val Ser Gln Leu
35 40 45
Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu Lys Gln Gln
50 55 60
<210> 64
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 64
Met Leu Lys Pro Ser Leu Pro Phe Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gln Leu
1 5 10 15
Pro Leu Leu Gly Val Gly Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly
20 25 30
Asn Glu Asp Thr Thr Ala Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp
35 40 45
Ser Leu Ser Val Ser Thr Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val
50 55 60
Phe Asn Val Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro
65 70 75 80
Gln Pro Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn
85 90 95
Asp Lys Val Gln Lys Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr
100 105 110
Ser Gly Cys Gln Leu Gln Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe
115 120 125
Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln
130 135 140
Met Leu Lys Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu
145 150 155 160
Thr Leu His Lys Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn
165 170 175
Arg Phe Leu Asn His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp
180 185 190
Trp Asp His Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe
195 200 205
Ser Leu Pro Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg
210 215 220
Ser Arg Phe Asn Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp
225 230 235 240
Ser His Pro Ile His Trp Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe
245 250 255
Leu Phe Ala Leu Glu Ala Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu
260 265 270
Ile Ile Ser Leu Leu Cys Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro
275 280 285
Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His
290 295 300
Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser
305 310 315 320
Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro
325 330 335
Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn
340 345 350
Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu
355 360 365
Thr
<210> 65
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 65
Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp
1 5 10 15
Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln
20 25 30
His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Thr Thr Asn
35 40 45
Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Asn
50 55 60
Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu
65 70 75 80
Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu Lys Ser Leu
85 90 95
Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro
100 105 110
Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val
115 120 125
Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met
130 135 140
His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr His
145 150 155 160
Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu Gln
165 170 175
Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr
180 185 190
Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr
195 200 205
Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro Ile Leu Leu Thr
210 215 220
Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala
225 230 235 240
Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu
245 250 255
Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys
260 265 270
Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile
275 280 285
His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu
290 295 300
Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu
305 310 315 320
Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile
325 330 335
Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly
340 345 350
Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu
355 360 365
Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu
370 375 380
Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser
385 390 395 400
Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro
405 410 415
Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met
420 425 430
Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln
435
<210> 66
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 66
Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp
1 5 10 15
Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln
20 25 30
His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Thr Thr Asn
35 40 45
Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Ser
50 55 60
Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu
65 70 75 80
Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Gly Lys Ser Leu
85 90 95
Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro
100 105 110
Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val
115 120 125
Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met
130 135 140
His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Met His
145 150 155 160
Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Asn Leu Gln
165 170 175
Pro Glu Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr
180 185 190
Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr
195 200 205
Pro Glu Ile Asn Asn Ser Pro Gly Glu Met Asp Pro Ile Leu Leu Thr
210 215 220
Ile Ser Leu Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala
225 230 235 240
Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu
245 250 255
Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys
260 265 270
Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile
275 280 285
His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu
290 295 300
Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Lys Lys Gln Arg Leu
305 310 315 320
Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Ser Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile
325 330 335
Thr Pro Glu Ser Phe Glu Arg Asp Ser Ser Leu Arg Cys Leu Ala Gly
340 345 350
Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu
355 360 365
Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu
370 375 380
Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser
385 390 395 400
Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro
405 410 415
Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met
420 425 430
Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln
435
<210> 67
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 67
Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp
1 5 10 15
Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln
20 25 30
His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Thr Thr Asn
35 40 45
Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Ser
50 55 60
Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu
65 70 75 80
Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Gly Lys Ser Leu
85 90 95
Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro
100 105 110
Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val
115 120 125
Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met
130 135 140
His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Met His
145 150 155 160
Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Asn Leu Gln
165 170 175
Pro Glu Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr
180 185 190
Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr
195 200 205
Pro Glu Ile Asn Asn Ser Pro Gly Glu Met Asp Pro
210 215 220
<210> 68
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 68
Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp
1 5 10 15
Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln
20 25 30
His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Thr Thr Asn
35 40 45
Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Asn
50 55 60
Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu
65 70 75 80
Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu Lys Ser Leu
85 90 95
Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro
100 105 110
Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val
115 120 125
Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met
130 135 140
His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr His
145 150 155 160
Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu Gln
165 170 175
Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr
180 185 190
Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr
195 200 205
Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp
210 215
<210> 69
<211> 355
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 69
gatgttcaat tggttgaatc tggtggtggt ttggttcaag ccggtggttc tttgagattg 60
tcttgtgaat cttctatctc caccttctca tctgatgcta tgggttggtt tagacaagct 120
ccaggtaaag aaagagaatt tttggctgct attggttgga gtggtgctgt tactcattat 180
tccgattctg ttaaaggtcg tttcaccatt tctagagata acgctaagaa caccgtctac 240
ttgcaaatga actctttgag agctgaagat accggtagat attactgcgc tgaagattac 300
gatactgatg tttggcaata ttggggtcaa ggtactcaag ttactgtctc ctcat 355
<210> 70
<211> 355
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 70
gatgttcaat tggttgaatc tggtggtggt ttggttcaag ccggtggttc tttgagattg 60
tcttgtgaat cttctatctc caccttctca tctgatgcta tgggttggtt tagacaagct 120
ccaggtaaag aattggaatt tttggctgct attggttgga gtggtgctgt tactcattat 180
tccgattctg ttaaaggtcg tttcaccatt tctagagata acgctaagaa caccgtctac 240
ttgcaaatga actctttgag agctgaagat accggtagat attactgcgc tgaagattac 300
gatactgatg tttggcaata ttggggtcaa ggtactcaag ttactgtctc ctcat 355
<210> 71
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 71
Asp Asp Ala Met Gly
1 5
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 72
Ala Ile Gly Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 73
Ala Ile Gly Trp Ser Gly Thr Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 74
Ala Thr Gly Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 75
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 75
Ala Ile Asn Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 76
Ala Ile Gly Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 77
Asp Tyr Val Thr Asp Val Trp Gln Tyr
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 78
Asp Tyr Asp Thr Asp Val Trp Gln His
1 5
<210> 79
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 79
Glu Leu Glu Phe Leu Ala
1 5
<210> 80
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 80
Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5
<210> 81
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 81
tcttaactag tgaggagacg gtgacctg 28
<210> 82
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(1)
<223> Xaa为Ser或Asp
<400> 82
Xaa Asp Ala Met Gly
1 5
<210> 83
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> MISC_特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Ile或Thr
<220>
<221> MISC_特征
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为Gly或Asn
<220>
<221> MISC_特征
<222> (7)..(7)
<223> Xaa为Ala或Thr
<220>
<221> MISC_特征
<222> (12)..(12)
<223> Xaa为Ser或Gly
<220>
<221> MISC_特征
<222> (16)..(16)
<223> Xaa为Gln或Lys
<400> 83
Ala Xaa Xaa Trp Ser Gly Xaa Val Thr His Tyr Xaa Asp Ser Val Xaa
1 5 10 15
Gly
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> MISC_特征
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为Asp或Val
<220>
<221> MISC_特征
<222> (9)..(9)
<223> Xaa为Tyr或His
<400> 84
Asp Tyr Xaa Thr Asp Val Trp Gln Xaa
1 5
<210> 85
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(11)
<223> 所述残基可存在1至10次
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(25)
<223> 所述残基可存在1至10次
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(10)
<223> 所述Gly残基可不存在、存在一些或全部存在
<220>
<221> MISC_特征
<222> (12)..(12)
<223> Xaa为选自Arg, His, Asp,
Gln, Ser, Thr, Tyr, Gly, Ala, Val, Leu, Trp, Pro, Met, Cys, Phe,
Lys或Ile的0至5个氨基酸残基
<220>
<221> MISC_特征
<222> (13)..(13)
<223> Xaa为Lys或Arg
<220>
<221> MISC_特征
<222> (14)..(14)
<223> Xaa为选自Arg, His, Asp,
Gln, Ser, Thr, Tyr, Gly, Ala, Val, Leu, Trp, Pro, Met, Cys, Phe,
Lys或Ile的0至5个氨基酸残基
<220>
<221> MISC_特征
<222> (15)..(25)
<223> 所述残基可存在1至10次
<220>
<221> MISC_特征
<222> (16)..(24)
<223> 所述Gly残基可不存在、存在一些或全部存在
<400> 85
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Xaa Xaa Xaa Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 86
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(5)
<223> 所述残基可存在1至5次
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(11)
<223> 所述残基可存在1至5次
<400> 86
Gly Gly Gly Gly Ser Lys Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 87
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 87
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 88
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(5)
<223> 所述残基可存在1至10次
<400> 88
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 89
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 89
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30

Claims (32)

1.一种多肽，其能够抑制IL-7和/或L-TSLP与IL-7R的结合，其中所述多肽包含结合至IL-7Rα的免疫球蛋白链可变结构域，其中所述免疫球蛋白链可变结构域包含三个互补决定区(CDR1-CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)，其中CDR1包含与SEQ ID NO:1共享60％或更大序列同一性的序列，CDR2包含与SEQ ID NO:2共享60％或更大序列同一性的序列，并且CDR3包含与SEQ ID NO:3共享60％或更大序列同一性的序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽能够抑制IL-7与IL-7R的结合。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽能够抑制L-TSLP与IL-7R的结合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽能够抑制IL-7与IL-7R的结合以及L-TSLP与IL-7R的结合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中CDR1包含与SEQ ID NO:1共享80％或更大序列同一性的序列或由其组成，CDR2包含与SEQ ID NO:2共享80％或更大序列同一性的序列或由其组成，并且CDR3包含与SEQ ID NO:3共享80％或更大序列同一性的序列或由其组成。
6.根据权利要求5所述的多肽，其中CDR1包含SEQ ID NO:82或由其组成，CDR2包含SEQID NO:83或由其组成，并且CDR3包含SEQ ID NO:84或由其组成。
7.根据权利要求6所述的多肽，其中CDR1包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:71或由其组成，CDR2包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76或由其组成，并且CDR3包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78或由其组成。
8.根据权利要求7所述的多肽，其中CDR1包含SEQ ID NO:1或由其组成，CDR2包含SEQID NO:2或由其组成，并且CDR3包含SEQ ID NO:3或由其组成。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:8共享50％或更大序列同一性、诸如共享55％或更大序列同一性、诸如共享60％或更大序列同一性、诸如共享65％或更大序列同一性、诸如共享70％或更大序列同一性、诸如共享75％或更大序列同一性、诸如共享80％或更大序列同一性、诸如共享85％或更大序列同一性、诸如共享90％或更大序列同一性、诸如共享95％或更大序列同一性、诸如共享96％或更大序列同一性、诸如共享97％或更大序列同一性、诸如共享98％或更大序列同一性、诸如共享99％或更大序列同一性的序列或由其组成。
10.根据权利要求9所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:8。
11.根据权利要求10所述的多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO:8组成。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的多肽，其中所述多肽结合至IL-7Rα上的表位，所述表位包含IL-7Rα的选自Glu27、Ser31、Leu57、Val58、Glu59、Lys77、Lys78、Phe79、Leu80、Leu81、Ile82、Thr104、Lys137、Lys138、Tyr139、Lys141、His191、Tyr192和Phe193的至少一个残基。
13.一种多肽，其结合至IL-7Rα上的表位，其中所述表位包含IL-7Rα的选自Glu27、Ser31、Leu57、Val58、Glu59、Lys77、Lys78、Phe79、Leu80、Leu81、Ile82、Thr104、Lys137、Lys138、Tyr139、Lys141、His191、Tyr192和Phe193的至少一个残基。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的多肽，其中所述多肽是抗体或抗体片段。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的多肽，其中所述免疫球蛋白链可变结构域是VHH、VH或VL。
16.根据权利要求15所述的多肽，其中所述免疫球蛋白链可变结构域是VHH或VH。
17.一种构建体，其包含至少一个根据权利要求1至16中任一项所述的多肽和至少一个不同的多肽。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的多肽或构建体，其中所述多肽以以下EC50中和IL-7R与IL-7的结合：2.00nM或更小，诸如1.50nM或更小，诸如1.00nM或更小，诸如0.90nM或更小，诸如0.80nM或更小，诸如0.70nM或更小，诸如0.65nM或更小，诸如0.60nM或更小，诸如0.55nM或更小，诸如0.50nM或更小，诸如0.45nM或更小，诸如0.4nM或更小，诸如0.35nM或更小，诸如0.30nM或更小。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的多肽或构建体，其中所述多肽以10-7M或更小、诸如合适地10-8M或更小、诸如10-9M或更小、诸如10-10M或更小的平衡解离常数(Kd)结合至IL-7Rα。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的多肽或构建体，其基本上耐受胰蛋白酶和糜蛋白酶。
21.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至20中任一项所述的多肽或构建体和一种或多种药学上可接受的稀释剂或载剂。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其包含至少一种另外的活性剂。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的多肽、药物组合物或构建体，其用作药剂。
24.根据权利要求23所述的用于使用的多肽、用于使用的药物组合物或用于使用的构建体，其中所述多肽、药物组合物或构建体用于治疗自身免疫疾病和/或炎性疾病。
25.一种治疗自身免疫疾病和/或炎性疾病的方法，其包括向有需要的人施用治疗有效量的根据权利要求1至22中任一项所述的多肽、药物组合物或构建体。
26.根据权利要求1至22中任一项所述的多肽、药物组合物或构建体在制造用于治疗自身免疫疾病和/或炎性疾病的药剂中的用途。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的用于使用的多肽、用于使用的药物组合物、用于使用的构建体、方法或用途，其中所述自身免疫疾病和/或炎性疾病是克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。
28.根据权利要求24至26中任一项所述的用于使用的多肽、用于使用的药物组合物、用于使用的构建体、方法或用途，其中所述自身免疫疾病和/或炎性疾病是特应性皮炎。
29.根据权利要求23至28中任一项所述的用于使用的多肽、用于使用的药物组合物、用于使用的构建体、方法或用途，其中所述多肽、药物组合物或构建体用于口服施用。
30.根据权利要求23至28中任一项所述的用于使用的多肽、用于使用的药物组合物、用于使用的构建体、方法或用途，其中所述多肽、药物组合物或构建体用于局部施用。
31.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至20中任一项所述的多肽或构建体。
32.根据权利要求31所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:70或由其组成。
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